肿瘤相关抗原72-4化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域,具体地,本发明提供了一种肿瘤相关抗原72-4化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
胃癌病死率居各种恶性肿瘤之首,亦是我国常见的恶性肿瘤之一。如果能对该疾病进行即时的筛查,那么就会极大降低胃癌病死率的发生率。肿瘤相关抗原72-4(CA72-4)属糖蛋白类癌胚抗原,主要存在于人腺癌组织中,是胃肠道肿瘤的标志物,在健康人和良性疾病患者血液中极少出现,并且CA72-4水平与肿瘤发展过程、肿瘤大小有很好的相关性。因此,CA72-4对于胃癌的诊断、治疗过程的监测和术后疗效判断的意义重大。
1981年由Colcher通过乳腺癌肝转移细胞的细胞膜成分免疫小鼠得到其单抗,为其免疫学检测开辟新篇章。迄今为止,CA72-4的检测方法主要有:放射免疫分析,酶联免疫吸附实验以及化学发光免疫分析等。放射免疫分析,因其使用放射性元素作为标记物,因此对环境有一定污染性,并存在仪器成本贵,灵敏度不高,操作复杂,测定结果不稳定,试剂保存时间短等缺点。酶免疫分析法灵敏度低,影响因素较多,易造成假阴性和假阳性。
现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系统,需要昂贵的全自动化学发光测量仪,从而限制了推广使用,无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明是在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物,通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物,因而其灵敏度大大提高,并且操作简便适用性广,既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪,也可用于全自动的测量系统,可实现大批量快检测,使用成本低,更易推广应用。
发明内容
本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明。
本发明的目的是提供一种肿瘤相关抗原72-4化学发光免疫分析定量测定试剂盒。
本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。
根据本发明的肿瘤相关抗原72-4化学发光免疫分析定量测定试剂盒包括:
1)肿瘤相关抗原72-4校准品;
2)肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体包被的固相载体;
3)肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体酶标记物;以及
4)上述酶所作用的化学发光底物。
根据本发明的试剂盒,其中,所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
根据本发明的试剂盒,其中,所述标记酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
根据本发明的试剂盒,其中,所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。
优选地,上述试剂盒中,所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。
本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法,包括以下步骤:
1)配制肿瘤相关抗原72-4校准品;
2)以肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体包被固相载体;
3)以酶标记肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体;
4)分装上述肿瘤相关抗原72-4校准品、酶标记的肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物;以及
5)组装为成品。
根据本发明的方法,优选,所述包被固相载体的步骤2)包括以下步骤:
I)包被
采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;
II)用生理盐水洗涤上述固相载体;以及
III)封闭
配制封闭液,基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH2PO4·2H2O、2.9gNaH2PO4·12H2O、10g BSA和1mL生物防腐剂,所述封闭液的pH值为7.0~7.6,然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。
具体地,所述包被方法可以包括:
I)包被
采用1000mL的0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液包含1.59g的无水碳酸钠和2.94g的碳酸氢钠去离子水溶液,或1000mL的0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液包含4.44g的柠檬酸和7.3g的柠檬酸三钠去离子水溶液制成缓冲液,与适当浓度的肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;
II)用生理盐水洗涤上述固相载体;以及
III)封闭
配制封闭液,基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH2PO4·2H2O、2.9gNaH2PO4·12H2O、10g BSA和1mL生物防腐剂,所述封闭液的pH值为7.0~7.6,然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。
在上述方法中,优选,所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
在上述方法中,优选,所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
在上述方法中,优选,所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。
在上述方法中,优选,所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。
肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体酶标记物为辣根过氧化物酶标记的肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体时,采用的是过碘酸钠法进行标记,其具体原理为:辣根过氧化物酶为一种分子量为44,000的糖蛋白,含糖量达到18%。本发明使用过碘酸钠氧化与酶活性无关的糖基,生成的醛基与抗体上的氨基形成Sciff’s碱,接着加入硼氢化钠将其还原成稳定的结合物,最后往加入酶标记抗体中加入等量的甘油进行保存。
肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体酶标记物为碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体时,采用戊二醛法连接。
肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体包被固相通过物理吸附作用完成。本发明人考察了不同缓冲体系对肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体在固相上的物理吸附效率。
本发明利用酶催化化学发光底物,生成中间态物质。根据中间激发态物质回到基态时候发射的光子数进行定量。化学发光酶免疫分析通过化学发光增强剂的使用,增强了化学发光的强度,延长发光时间。本发明避免放射性元素污染同时,较酶联免疫吸附实验的灵敏度有了大幅度的提高。
本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点,其各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。并且,根据本发明的检测系统为开放式操作,简便快速,不需要昂贵的全自动化学发光测量仪,特别适合广大的中小医院推广使用,为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒,既有效地利用了化学发光技术原理,又确保了检测的灵敏度。另外,这种模式还便于操作和生产。
本发明的试剂盒应用了酶催化发光底物,通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物,因而具有与酶联免疫分析同等的特异性,而灵敏度大大提高,比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约10倍,可为胃癌的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。
具体实施方式
实施例1肿瘤相关抗原72-4化学发光免疫分析定量测定试剂盒的制备
一、酶标抗体制备
(1)辣根过氧化物酶标记肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体的制备
溶解4.4mg HRP于1mL蒸馏水中,加入0.4mL过碘酸钠(50mmol/L)室温搅拌20min,经1mmol/L醋酸钠缓冲液,pH值为4.4透析后加入8mg肿瘤相关抗原72-4单抗,搅拌2h,最后用200mmol/L NaBH4进行还原,经0.02M PBS缓冲液透析后,加等体积甘油,—20℃以下保存。
(2)碱性磷酸酶标记肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体的制备
CA72-4单抗用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联,对PBS充分透析,加等体积甘油,—20℃以下保存。
二、肿瘤相关抗原72-4校准品的配制
以动物血清或蛋白缓冲液为基质,加入肿瘤相关抗原72-4纯品配制而成。制备的最终浓度为:0U/mL、3U/mL、15U/mL、50U/mL、100U/mL。
三、固相包被板的制备
(1)包被
采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;
具体地,所述包被方法可以包括:
无水碳酸钠 1.59g
碳酸氢钠 2.94g
去离子水 1000mL
溶解混匀后,调整pH值至9.6,加入5.0mg肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体混匀,然后加入微孔板各孔中,每孔110μL,4℃过夜。
或者,
柠檬酸 4.44g
柠檬酸三钠 7.3g
去离子水 1000mL
溶解混匀后,调整pH值至4.6,加入5.0mg肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体混匀,然后加入微孔板各孔中,每孔110μL,4℃过夜。
(2)洗涤:用生理盐水洗三次。
(3)封闭
NaH2PO4·2H2O 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
牛血清白蛋白 10g
Proclin300 1mL
双蒸水 定容至1000mL
将上述试剂称量好放入洁净容器中,加双蒸水定容,溶解混匀,测定pH值为7.0。每孔分别加入封闭液300μL,室温放置3小时。甩掉封闭液,在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气,如果有漏气需重新封袋。贴签后置2~8℃保存。
四、酶标单抗稀释液
Tris 12.120g
BSA 5g
Proclin 1mL
双蒸水 1000mL
五、抗体浓度选择
采用方阵法选择肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原72-4单克隆抗体的工作浓度分别大于1:3000或者1:4000,肿瘤相关抗原72-4单克隆包被抗体使用工作浓度大于1:5000。
六、化学发光底物液
本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法:
A液:在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成0.1M pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对碘苯酚。
B液:在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸,配制成0.1M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液,在此溶液中加入200mg/mL的过氧化氢溶液。
使用方法:使用前将A液与B液按1:1比例混合后使用。
本发明所使用的碱性磷酸酶(ALP)的化学发光底物液的配制方法:
Tris 24g
HCl 15mL
NaCl 160g
KCl 4g
Proclin300 1mL
双蒸水 1000mL
AMPPD 200mL
七、洗涤缓冲液
Tris 24g
HCl 15mL
NaCl 160g
KCl 4g
去离子水 1000mL
调整pH值至7.4。
八、半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成定量测定试剂盒。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。
综上,在本发明的研究过程中,本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定,然后对包被方法进行了研究,选择出最适合的包被缓冲液和封闭液,找到最佳的浓度条件,并且,配制出了能够使酶标记物长期保持活性的稀释液。
实施例2~3 制备本发明的肿瘤相关抗原72-4化学发光免疫分析定量测定试剂盒
除分别以塑料珠、磁性颗粒作为载体外,其余均以与实施例1相同的方法制备本发明的定量测定试剂盒。
实施例4 本发明的试剂盒的使用方法
以上实施例1制备的试剂盒的具体操作如下:
1)平衡所有检测试剂和样本至室温;
2)取需用量的板条;
3)每孔、管依次加入50μL酶标抗体、校准品/待测样本,于微量振荡器上振荡30秒使其混合均匀;
4)室温温育60min;
5)用自动酶标洗板机进行洗板,将固定在固相载体上的包被抗体—抗原—酶标抗体复合物与未结合物分离;
6)每孔/管加入体积为100μL的化学发光底物液,室温温育5min,在5~15min内利用化学发光检测仪进行检测;
7)使用Log(x)-Log(y)的双对数数据拟合方式,进行标准曲线的建立,计算实验测定结果。
实施例5 本发明的试剂盒的方法学鉴定
本发明的试剂盒可以达到方法学指标如下所示:
灵敏度(与零剂量可以区分开的点)小于0.20U/mL;
标准曲线范围为0~100U/mL;
精密度:批内(N=30)与批间变异均小于10%;
准确度:分别进行低中高三个浓度血清(浓度分别10U/mL、25U/mL和65U/mL)的回收实验平均为101%、112%和93%(三次平均值);
特异性:与其类似物的交叉反应率≤0.01%;
稳定性:各试剂组分置37℃,考察6天后,各组分仍稳定。
实施例6 本发明的肿瘤相关抗原72-4化学发光免疫分析定量测定试剂盒与Hamburg(Germany)诊断公司的酶联试剂盒比较
取用医院临床收集肿瘤病人血清标本100份,正常人血清标本200份。分别使用本发明实施例1的试剂盒和Hamburg试剂盒进行血样检测,统计实验结果并进行相关分析,这两种方法高度相关(相关系数为0.9809)。
本发明试剂盒的临床实验比对,实验结果见下表:
其中200份正常人血样的CA72-4平均值为0.41U/mL,阳性界值定为3.5U/mL。CA72-4是胃癌结肠癌一个较敏感的指标,本法的阳性率与Hamburg试剂盒的接近,且均在文献报道范围之内,这亦可证实本试剂盒的临床使用价值。