JPH02280061A - 微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法および測定用器材 - Google Patents
微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法および測定用器材Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[a業上の利用分野]
本発明は、超微量の乳頭分泌液検体中の腫瘍関連抗原で
あるCA15−3、CA125、CA72−4、CA5
4/61、CA602、CA19−9、TPA、MCA
、MSAおよびATM−1の測定方法、およびその方法
を実施するための測定用器材に関する。
あるCA15−3、CA125、CA72−4、CA5
4/61、CA602、CA19−9、TPA、MCA
、MSAおよびATM−1の測定方法、およびその方法
を実施するための測定用器材に関する。
[従来の技術]
現在、きわめて多数の腫瘍マーカー 即ち、腫瘍関連抗
原が報告され、その血中濃度の測定が実施されている。
原が報告され、その血中濃度の測定が実施されている。
なかでも、Gold等(J。
Exp、 Med、、 121.439.1965)に
より報告されたC E A (carcinoembr
yonic antigen)は、最も広く用いられて
いる腫瘍関連抗原であり、CEAの血中濃度の測定は、
癌患者の術後追跡や各種治療の効果判定などに有効であ
るとされている。現在、これらの腫瘍関連抗原の血中濃
度測定には、radio immunoassay
(RI A )やenzyme la+munoass
ay (E I A )による定量反応が用いられてい
る。しかしながら、CEAを始めとして他のいずれの腫
瘍関連抗原の血中濃度測定によっても、早期の癌を発見
することは非常に困難である。特に、現在までに知られ
ている腫瘍関連抗原は、いずれもその特異性が高いとは
言えず、従って、単一の腫瘍関連抗原の血中濃度測定で
は、診断に正確を期することは困難であった。
より報告されたC E A (carcinoembr
yonic antigen)は、最も広く用いられて
いる腫瘍関連抗原であり、CEAの血中濃度の測定は、
癌患者の術後追跡や各種治療の効果判定などに有効であ
るとされている。現在、これらの腫瘍関連抗原の血中濃
度測定には、radio immunoassay
(RI A )やenzyme la+munoass
ay (E I A )による定量反応が用いられてい
る。しかしながら、CEAを始めとして他のいずれの腫
瘍関連抗原の血中濃度測定によっても、早期の癌を発見
することは非常に困難である。特に、現在までに知られ
ている腫瘍関連抗原は、いずれもその特異性が高いとは
言えず、従って、単一の腫瘍関連抗原の血中濃度測定で
は、診断に正確を期することは困難であった。
乳癌は、増加傾向にある主要な癌の1つでありながら、
血中の腫瘍関連抗原の測定では、乳癌の腫瘍関連抗原で
あるCA15−3を測定しても、早期価での陽性率が4
〜8%と極めて低く、原発性の早期乳癌の発見は非常に
困難であフた(セントコアCA15−3RIAキツト研
究会集計資料)。その為、発見時には癌が進行していた
り、リンパ節などに転移を起こしている症例が多く、や
むをえず乳房切除術などの治療を必要とする場合が多か
った。
血中の腫瘍関連抗原の測定では、乳癌の腫瘍関連抗原で
あるCA15−3を測定しても、早期価での陽性率が4
〜8%と極めて低く、原発性の早期乳癌の発見は非常に
困難であフた(セントコアCA15−3RIAキツト研
究会集計資料)。その為、発見時には癌が進行していた
り、リンパ節などに転移を起こしている症例が多く、や
むをえず乳房切除術などの治療を必要とする場合が多か
った。
稲治等(医学のあゆみ、154,575゜1985)は
、乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原であるCEAの測定を行
い、乳癌早期診断が可能であることを報告している。こ
の方法は、EIA(エルモチツク−CEA、持出製薬(
株))で乳頭分泌液中CEAを測定するものである。
、乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原であるCEAの測定を行
い、乳癌早期診断が可能であることを報告している。こ
の方法は、EIA(エルモチツク−CEA、持出製薬(
株))で乳頭分泌液中CEAを測定するものである。
ここで行われているCEAの測定方法は、反応装置や反
応の結果を測定するための分光光度計などの機器を必要
とするため、どの施設でも簡便に測定できるというもの
ではなかフた。さらに、この方法では、検体数の多い少
ないにかかわらず、その都度検量線を作成する必要があ
るため、乳頭異常分泌症のように検体数が比較的少ない
場合には、効率の悪い方法であった。さらに、現在のC
EA測定用EIA試薬は、検体量が最も少量で済むエル
モチツク−CEAでさえ、50μLは必要である。しか
し、乳頭分泌液は、通常、分泌液量が少なく、採取でき
る量は多くともせいぜいlOμL程度にすぎない、また
、血清検体と異なり、その性状も多種多様であり、特に
その粘稠度の差異が大きく、採取が困難な症例もある。
応の結果を測定するための分光光度計などの機器を必要
とするため、どの施設でも簡便に測定できるというもの
ではなかフた。さらに、この方法では、検体数の多い少
ないにかかわらず、その都度検量線を作成する必要があ
るため、乳頭異常分泌症のように検体数が比較的少ない
場合には、効率の悪い方法であった。さらに、現在のC
EA測定用EIA試薬は、検体量が最も少量で済むエル
モチツク−CEAでさえ、50μLは必要である。しか
し、乳頭分泌液は、通常、分泌液量が少なく、採取でき
る量は多くともせいぜいlOμL程度にすぎない、また
、血清検体と異なり、その性状も多種多様であり、特に
その粘稠度の差異が大きく、採取が困難な症例もある。
そのため、検体量が微量すぎて測定できない場合も多く
、超微量でも実施可能な測定手段の開発が望まれている
。
、超微量でも実施可能な測定手段の開発が望まれている
。
こうした背景にあって、乳癌に対する検出力および特異
性の高い診断法の開発に対する社会的要求は非常に高く
、とりわけ、集団検診や乳腺外来などでの乳癌のマスス
クリーニングに容易に利用できる腫瘍関連抗原測定手段
の開発が切望されている。そして、この分野で乳頭分泌
液中のllf[瘍関連抗原を測定することは意義が大き
く、誰にでも簡便な手法で乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原
が的確に測定できるようになれば、臨床上非常に有意義
である。
性の高い診断法の開発に対する社会的要求は非常に高く
、とりわけ、集団検診や乳腺外来などでの乳癌のマスス
クリーニングに容易に利用できる腫瘍関連抗原測定手段
の開発が切望されている。そして、この分野で乳頭分泌
液中のllf[瘍関連抗原を測定することは意義が大き
く、誰にでも簡便な手法で乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原
が的確に測定できるようになれば、臨床上非常に有意義
である。
[発明が解決しようとする課題]
本発明者らは、上述の乳癌診断における問題点に鑑み、
これらの問題点を解決し、検体量が微量でも測定可能で
あること、集団検診やマススクリーニングで容易に利用
可能であること、測定操作が簡便であることといった社
会的要求を満たす乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原(cA1
5−3、CA125、CA72−4、CA54/61、
CA602、CA19−9、TPA、MCA%MSAお
よびATM−1からなる群から選ばれた成分)の測定手
段を開発すべく研究を重ねた結果、従来のEIA法にお
ける不溶化抗体の担体および反応の場として、シート状
の材料を用いることにより、前記の問題点を克服できる
ことを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成する
に至った。
これらの問題点を解決し、検体量が微量でも測定可能で
あること、集団検診やマススクリーニングで容易に利用
可能であること、測定操作が簡便であることといった社
会的要求を満たす乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原(cA1
5−3、CA125、CA72−4、CA54/61、
CA602、CA19−9、TPA、MCA%MSAお
よびATM−1からなる群から選ばれた成分)の測定手
段を開発すべく研究を重ねた結果、従来のEIA法にお
ける不溶化抗体の担体および反応の場として、シート状
の材料を用いることにより、前記の問題点を克服できる
ことを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成する
に至った。
本発明の目的は、生体分泌液、特に微量の乳頭分泌液中
の腫瘍関連抗原であるCA15−3、CA125、CA
72−4、CA54/61、CA602、CA19−9
、TPA、MCA%MSAおよびATM−1からなる群
から選ばれた成分を、抗原抗体反応を用いた免疫測定法
によって簡便に検出または定量する方法およびこの方法
を実施するに必要な測定用器材を提供することにある。
の腫瘍関連抗原であるCA15−3、CA125、CA
72−4、CA54/61、CA602、CA19−9
、TPA、MCA%MSAおよびATM−1からなる群
から選ばれた成分を、抗原抗体反応を用いた免疫測定法
によって簡便に検出または定量する方法およびこの方法
を実施するに必要な測定用器材を提供することにある。
そして、これらの方法および器材を用いることによって
、特に乳癌の早期診断を可能にし、社会的要求に応える
ものである。
、特に乳癌の早期診断を可能にし、社会的要求に応える
ものである。
[課題を解決するための手段]
すなわち、本発明の第一の態様は、微量の乳頭分泌液中
のCA15−3、CA125、CA72−4、CA 5
4/61、CA602、CA 19−9、T P A
(Ti5sue PolypeptideAntige
n ) 、 MCA (Mucinous Carci
noma−associated Antigen )
M S A (MammarySerum An
tigen )およびATM−1からなる群から選ばれ
た成分の濃度を、その選ばれた成分に対する抗体または
抗体分画を用いた抗原抗体反応により測定する方法であ
って、シート状固相上で前記抗原抗体反応を行うことを
コートする微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方
法を提供するものである。
のCA15−3、CA125、CA72−4、CA 5
4/61、CA602、CA 19−9、T P A
(Ti5sue PolypeptideAntige
n ) 、 MCA (Mucinous Carci
noma−associated Antigen )
M S A (MammarySerum An
tigen )およびATM−1からなる群から選ばれ
た成分の濃度を、その選ばれた成分に対する抗体または
抗体分画を用いた抗原抗体反応により測定する方法であ
って、シート状固相上で前記抗原抗体反応を行うことを
コートする微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方
法を提供するものである。
また、本発明の第二の態様は、シート状固相であって、
該固相上に、乳頭分泌液中のCA15〜3 、 CA1
25 、 CA72−4 、 CA5 4/6 1
、 CA602、 CA19−9 、 TPA、M
CA、MSAおよびATM−1からなる群から選ばれた
1種以上の成分に対する抗原抗体反応のための少なくと
も1つの反応領域を有することをコートする微量の乳頭
分泌液中の腫瘍関連抗原の測定用器材を提供するもので
ある。
該固相上に、乳頭分泌液中のCA15〜3 、 CA1
25 、 CA72−4 、 CA5 4/6 1
、 CA602、 CA19−9 、 TPA、M
CA、MSAおよびATM−1からなる群から選ばれた
1種以上の成分に対する抗原抗体反応のための少なくと
も1つの反応領域を有することをコートする微量の乳頭
分泌液中の腫瘍関連抗原の測定用器材を提供するもので
ある。
ここで、前記シート状固相が、実質的に液体不透過性の
プラスチック製シートであり、前記プラスチックが、ポ
リエステル、ポリプロピレンまたはポリエチレンである
ことが好ましい。
プラスチック製シートであり、前記プラスチックが、ポ
リエステル、ポリプロピレンまたはポリエチレンである
ことが好ましい。
以下に、本発明の構成を詳細に説明する。
本発明の測定方法は、微量の乳頭分泌液中のCA15−
3、CA125、CA72−4、CA54/61、CA
602、CA 19−9、TPA、MCA、MSAおよ
びATM−1からなる群から選ばれた1種以上の成分(
以下、単に腫瘍関連抗原ということがある)の濃度を、
抗原抗体反応により測定する方法であり、この測定をシ
ート状固相上で行うことに特徴がある。
3、CA125、CA72−4、CA54/61、CA
602、CA 19−9、TPA、MCA、MSAおよ
びATM−1からなる群から選ばれた1種以上の成分(
以下、単に腫瘍関連抗原ということがある)の濃度を、
抗原抗体反応により測定する方法であり、この測定をシ
ート状固相上で行うことに特徴がある。
本発明法では、後述するシート状固相を用いるので、微
量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定が初めて可能と
なった。ここで、微量とは、0.2〜50μL程度の液
量をいう。また、本発明法では、患者らから採取した乳
頭分泌液を、そのままの濃度で用いてもよいし、2〜1
00倍程度に希釈して用いてもよい。
量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定が初めて可能と
なった。ここで、微量とは、0.2〜50μL程度の液
量をいう。また、本発明法では、患者らから採取した乳
頭分泌液を、そのままの濃度で用いてもよいし、2〜1
00倍程度に希釈して用いてもよい。
本発明の好ましい方法は、検出または定量しようとする
乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原に対する抗体または抗体分
画(以下、両者を含めて単に抗体という)を結合させた
実質的に液体不透過性のシート状固相に乳頭分泌液を塗
布し、検体と不溶化抗体とを反応させた後、これに前記
腫瘍関連抗原に対する抗体に適当な手段で識別可能な標
識剤を結合させた標識物を反応させ、その後、固相上に
不溶化させた抗体に結合しなかった乳頭分泌液成分およ
び標識物を、洗浄操作により除去し、該シート状固相に
結合した標識物の量から腫瘍関連抗原の濃度を測定する
、いわゆるサンドイツチ法を基本構成とする。しかし、
サンドイツチ法に限定されるものではない サンドイツチ法に基づかない変法として、例えば、抗体
を不溶化させていないシート状固相を用いる方法も可能
である。この場合には、採取した検体を抗体を不溶化さ
せていない固相上の所定の領域内に塗布し、検体が固相
上で乾固した後、または乾固する前に、これに、抗体に
識別可能な標識剤を結合させた標識物を反応させる。次
いで、この固相を洗浄し、固相に結合しなかった検体成
分および標識物を除去し、固相上の所定の領域内に結合
した標識物の量から、検体中の腫瘍関連抗原の有無また
は量を測定する。
乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原に対する抗体または抗体分
画(以下、両者を含めて単に抗体という)を結合させた
実質的に液体不透過性のシート状固相に乳頭分泌液を塗
布し、検体と不溶化抗体とを反応させた後、これに前記
腫瘍関連抗原に対する抗体に適当な手段で識別可能な標
識剤を結合させた標識物を反応させ、その後、固相上に
不溶化させた抗体に結合しなかった乳頭分泌液成分およ
び標識物を、洗浄操作により除去し、該シート状固相に
結合した標識物の量から腫瘍関連抗原の濃度を測定する
、いわゆるサンドイツチ法を基本構成とする。しかし、
サンドイツチ法に限定されるものではない サンドイツチ法に基づかない変法として、例えば、抗体
を不溶化させていないシート状固相を用いる方法も可能
である。この場合には、採取した検体を抗体を不溶化さ
せていない固相上の所定の領域内に塗布し、検体が固相
上で乾固した後、または乾固する前に、これに、抗体に
識別可能な標識剤を結合させた標識物を反応させる。次
いで、この固相を洗浄し、固相に結合しなかった検体成
分および標識物を除去し、固相上の所定の領域内に結合
した標識物の量から、検体中の腫瘍関連抗原の有無また
は量を測定する。
サンドインチ法では、固相上の抗体を不溶化させである
領域に、乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原を抗原抗体反応に
より結合させるので、乳頭分泌液中の該腫瘍関連抗原以
外の成分の影響を受けにくい。さらに、抗体を不溶化し
ていない固相を用いる方法に比して、測定感度が高い。
領域に、乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原を抗原抗体反応に
より結合させるので、乳頭分泌液中の該腫瘍関連抗原以
外の成分の影響を受けにくい。さらに、抗体を不溶化し
ていない固相を用いる方法に比して、測定感度が高い。
また、測定感度または測定可能な濃度範囲を調節するの
が容易である。従って、固相担体上に抗体が不溶化され
ているサンドイツチ法が望ましい。
が容易である。従って、固相担体上に抗体が不溶化され
ているサンドイツチ法が望ましい。
また、本発明に用いるサンドイツチ法は、シート状固相
上に不溶化させた抗体゛と検体と標識物との3成分の反
応の順序の相違に関し、3種の変法が可能である。
上に不溶化させた抗体゛と検体と標識物との3成分の反
応の順序の相違に関し、3種の変法が可能である。
第一の方法は、検出または定量しようとする乳頭分泌液
中の腫瘍関連抗原に対する抗体を結合させたシート状固
相に乳頭分泌液検体を塗布し、検体と不溶化抗体とを反
応させた後、これに前記腫瘍関連抗原に対する抗体に適
当な手段で識別可能な標識剤を結合させた標識物を反応
させ、その後、同相上に不溶化させた抗体に結合しなか
った乳頭分泌液成分および標識物を、洗浄操作により除
去し、該シート状固相に結合した標識物の量から腫瘍関
連抗原の濃度を測定する。
中の腫瘍関連抗原に対する抗体を結合させたシート状固
相に乳頭分泌液検体を塗布し、検体と不溶化抗体とを反
応させた後、これに前記腫瘍関連抗原に対する抗体に適
当な手段で識別可能な標識剤を結合させた標識物を反応
させ、その後、同相上に不溶化させた抗体に結合しなか
った乳頭分泌液成分および標識物を、洗浄操作により除
去し、該シート状固相に結合した標識物の量から腫瘍関
連抗原の濃度を測定する。
第二の方法は、抗体を不溶化させたシート状固相上に、
抗体に識別可能な標識剤を結合した標識物を予め塗布し
ておき、このように処理した固相上の所定の領域内に乳
頭分泌液検体を塗布し、検体成分と不溶化抗体との反応
および検体成分と標識物との反応を同時に行なわせる方
法である。この場合、必要であれば、抗体を不溶化させ
た固相に標識物を塗布した後に凍結乾燥を行うと、標識
物等の試薬の安定性を増加させつる。
抗体に識別可能な標識剤を結合した標識物を予め塗布し
ておき、このように処理した固相上の所定の領域内に乳
頭分泌液検体を塗布し、検体成分と不溶化抗体との反応
および検体成分と標識物との反応を同時に行なわせる方
法である。この場合、必要であれば、抗体を不溶化させ
た固相に標識物を塗布した後に凍結乾燥を行うと、標識
物等の試薬の安定性を増加させつる。
第三の方法として、採取した乳頭分泌液検体と、抗体に
識別可能な標識剤を結合させた標識物とをあらかじめ混
合した後に、これを、抗体を不溶化させた固相上の所定
の反応領域内に塗布して反応させる方法も可能である。
識別可能な標識剤を結合させた標識物とをあらかじめ混
合した後に、これを、抗体を不溶化させた固相上の所定
の反応領域内に塗布して反応させる方法も可能である。
本発明の測定方法の対象は、腫瘍関連抗原であるCA1
5−3、CA125、CA72−4、CA54/61、
CA602、CA19−9、TPA、MCA、MSAお
よびATM−1であるが、その他に、人乳社中脂肪球被
膜上の糖蛋白質、例えばMAM−6やGCDFP−15
なども、本発明と同様の原理で測定できる。
5−3、CA125、CA72−4、CA54/61、
CA602、CA19−9、TPA、MCA、MSAお
よびATM−1であるが、その他に、人乳社中脂肪球被
膜上の糖蛋白質、例えばMAM−6やGCDFP−15
なども、本発明と同様の原理で測定できる。
次に、前記腫瘍関連抗原について、さらに詳細に説明す
る。
る。
CA15−3は、Hilkens等により見いだされた
人乳の脂肪球被膜上の糖蛋白質MAM−6に対するモノ
クローナル抗体(11508)と、にufe等により見
いだされた人乳癌細胞の膜成分に対するモノクローナル
抗体(DF3)によって認識される腫瘍関連抗原である
。
人乳の脂肪球被膜上の糖蛋白質MAM−6に対するモノ
クローナル抗体(11508)と、にufe等により見
いだされた人乳癌細胞の膜成分に対するモノクローナル
抗体(DF3)によって認識される腫瘍関連抗原である
。
CA125は、Ba5t等により見いだされた大卵巣漿
液性嚢胞腺癌培養細胞0VCA433に対するモノクロ
ーナル抗体(0C125)により認識される腫瘍関連抗
原である。
液性嚢胞腺癌培養細胞0VCA433に対するモノクロ
ーナル抗体(0C125)により認識される腫瘍関連抗
原である。
CA72−4は、Co1cher等により見いだされた
人乳癌肝転移癌細胞の膜成分分画に対するモノクローナ
ル抗体(872,3)と、人結腸癌培養細胞株LST1
74Tより精製されたTAG−72に対するモノクロー
ナル抗体(cC49)によって認識される腫瘍関連抗原
である。
人乳癌肝転移癌細胞の膜成分分画に対するモノクローナ
ル抗体(872,3)と、人結腸癌培養細胞株LST1
74Tより精製されたTAG−72に対するモノクロー
ナル抗体(cC49)によって認識される腫瘍関連抗原
である。
CA54/61は、野澤等により見いだされた人肺腺癌
由来細胞株C1509に対するモノクローナル抗体(M
^54、M^61)によって認識される腫瘍関連抗原で
ある。
由来細胞株C1509に対するモノクローナル抗体(M
^54、M^61)によって認識される腫瘍関連抗原で
ある。
CA602は、野澤等により見いだされた大卵巣類中腎
癌培養細胞株RM G −IIに対するモノクローナル
抗体(F2O3−1,6)により認識される腫瘍関連抗
原である。
癌培養細胞株RM G −IIに対するモノクローナル
抗体(F2O3−1,6)により認識される腫瘍関連抗
原である。
CA19−9は、にoprowski等により見いださ
れた人肺腺癌由来細胞株SWI 116に対するモノク
ローナル抗体(1116NS19−9)により認識され
る腫瘍関連抗原である。
れた人肺腺癌由来細胞株SWI 116に対するモノク
ローナル抗体(1116NS19−9)により認識され
る腫瘍関連抗原である。
T P A (Ti5sue Po1ypeptide
Antigen)は、B jerk fund等によ
り見いだされた分子量約22kDaの1本鎖のポリペプ
チドで、腫瘍細胞、胎盤、胎児等の増殖細胞の主として
細胞膜に局在している癌胎児性抗原である。
Antigen)は、B jerk fund等によ
り見いだされた分子量約22kDaの1本鎖のポリペプ
チドで、腫瘍細胞、胎盤、胎児等の増殖細胞の主として
細胞膜に局在している癌胎児性抗原である。
M CA (Mucinous Carcino
ma−associatedAntigen )は、S
tMhli等により見いだされた人乳癌細胞株Hs05
78T、5K−BR−3、MCF−7、ZR−75−1
に対するモノクローナル抗体(b−12,b−8,b−
15)により認識される腫瘍関連抗原である。
ma−associatedAntigen )は、S
tMhli等により見いだされた人乳癌細胞株Hs05
78T、5K−BR−3、MCF−7、ZR−75−1
に対するモノクローナル抗体(b−12,b−8,b−
15)により認識される腫瘍関連抗原である。
M S A (Mammary Serum An
tigen )は、5tacker等により見いださ
れた大乳癌組織より分離した癌細胞に対するモノクロー
ナル抗体(3E1.2)によって認識される腫瘍関連抗
原である。
tigen )は、5tacker等により見いださ
れた大乳癌組織より分離した癌細胞に対するモノクロー
ナル抗体(3E1.2)によって認識される腫瘍関連抗
原である。
ATM−1は、海江田等により樹立された活性化キラー
T細胞5B5の認識する抗原であり、大乳癌由来細膓株
NBT−2に対するモノクローナル抗体(N1977)
によって認識される腫瘍関連抗原である。
T細胞5B5の認識する抗原であり、大乳癌由来細膓株
NBT−2に対するモノクローナル抗体(N1977)
によって認識される腫瘍関連抗原である。
これらの腫瘍関連抗原に対する抗体は、市販のものを利
用することもできるが、常法に従って作製することもで
きる。
用することもできるが、常法に従って作製することもで
きる。
本発明の方法において、抗体とは、精製抗体に限定され
るものではなく、該腫瘍関連抗原との結合活性を有する
抗体を含有する抗血清もしくは塩析抗体等の粗精製物も
含む、抗体分画として使用できるのは、該腫瘍関連抗原
との結合活性を有する抗体分子の部分成分で、例えば、
Fab、F (ab’ )2が使用できる。また、抗体
は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体
であってもよい、測定対象の腫瘍関連抗原の性状に応じ
、適切な抗体を選択すればよい。
るものではなく、該腫瘍関連抗原との結合活性を有する
抗体を含有する抗血清もしくは塩析抗体等の粗精製物も
含む、抗体分画として使用できるのは、該腫瘍関連抗原
との結合活性を有する抗体分子の部分成分で、例えば、
Fab、F (ab’ )2が使用できる。また、抗体
は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体
であってもよい、測定対象の腫瘍関連抗原の性状に応じ
、適切な抗体を選択すればよい。
抗体を固相に結合させるには、物理的に結合させても化
学的に結合させてもよい。例えば、抗体溶液中に固相を
浸し、4〜56℃で0.5〜24時間、好ましくは37
〜50℃で1〜2時間インキュベートして物理的に結合
させる。
学的に結合させてもよい。例えば、抗体溶液中に固相を
浸し、4〜56℃で0.5〜24時間、好ましくは37
〜50℃で1〜2時間インキュベートして物理的に結合
させる。
用いる抗体の濃度は、精製抗体または精製抗体分画の場
合、1 μg 〜100 m g / m Lであれば
よく、1〜100μg / m Lが好ましい。固相の
抗体溶液への浸漬後の乾燥手段は、風乾燥でも、凍結乾
燥でもよい。しかしながら、抗体を固相上へ不溶化する
方法はこれに限定されるものではなく、塗布操作および
洗浄操作などの通常の測定操作によって固相上から抗体
が実質的に脱離しないように、固相上に抗体を固定化す
る手段をすべて含む。
合、1 μg 〜100 m g / m Lであれば
よく、1〜100μg / m Lが好ましい。固相の
抗体溶液への浸漬後の乾燥手段は、風乾燥でも、凍結乾
燥でもよい。しかしながら、抗体を固相上へ不溶化する
方法はこれに限定されるものではなく、塗布操作および
洗浄操作などの通常の測定操作によって固相上から抗体
が実質的に脱離しないように、固相上に抗体を固定化す
る手段をすべて含む。
抗体をシート状固相に不溶化させた後、チトクロームC
溶液を加熱変性させたものや、BSA(ウシ血清アルブ
ミン)、HSA (ヒト血清アルブミン)、動物血清、
脱脂粉乳など、乳頭分泌液中の前記腫瘍関連抗原との抗
原抗体反応には全く関与しない物質で固相をコートする
ことにより、非特異的な反応を抑制でき、結果の判定が
容易となる。
溶液を加熱変性させたものや、BSA(ウシ血清アルブ
ミン)、HSA (ヒト血清アルブミン)、動物血清、
脱脂粉乳など、乳頭分泌液中の前記腫瘍関連抗原との抗
原抗体反応には全く関与しない物質で固相をコートする
ことにより、非特異的な反応を抑制でき、結果の判定が
容易となる。
領域内に不溶化させる抗体の量は、乳頭分泌液中におい
て測定すべき前記腫瘍関連抗原の濃度に対して決定する
。例えば、ある濃度(カットオフ濃度)以上の前記M!
瘍関連抗原が検体中に含有されている場合にはすべて陽
性と判定される測定系では、反応領域内に不溶化されて
いる抗体の総抗原結合部位が、そのカットオフ濃度の前
記腫瘍関連抗原で実質的に飽和されるような量の抗体を
この領域内に不溶化すると、判定を容易にかつ厳密に行
うことができる。別の例として、検体中に含有されてい
る前記腫瘍関連抗原をある濃度範囲で定量もしくは半定
量する必要がある場合には、その必要な濃度範囲の上限
濃度で、領域内に不溶化されている抗体の総抗原結合部
位が実質的に飽和されるような量の抗体を該領域内に不
溶化すると、判定を容易にかつ厳密に行うことができる
。
て測定すべき前記腫瘍関連抗原の濃度に対して決定する
。例えば、ある濃度(カットオフ濃度)以上の前記M!
瘍関連抗原が検体中に含有されている場合にはすべて陽
性と判定される測定系では、反応領域内に不溶化されて
いる抗体の総抗原結合部位が、そのカットオフ濃度の前
記腫瘍関連抗原で実質的に飽和されるような量の抗体を
この領域内に不溶化すると、判定を容易にかつ厳密に行
うことができる。別の例として、検体中に含有されてい
る前記腫瘍関連抗原をある濃度範囲で定量もしくは半定
量する必要がある場合には、その必要な濃度範囲の上限
濃度で、領域内に不溶化されている抗体の総抗原結合部
位が実質的に飽和されるような量の抗体を該領域内に不
溶化すると、判定を容易にかつ厳密に行うことができる
。
本発明法に用いる標識物は、乳頭分泌液中の前記腫瘍関
連抗原に対する抗体または抗体分画に、識別可能な標識
剤を結合させたものである。
連抗原に対する抗体または抗体分画に、識別可能な標識
剤を結合させたものである。
抗体に付ける識別可能な標識剤として、色素、放射性同
位体元素、酵素、もしくは蛍光物質が使用できるが、安
定性、検出感度、安全性、および取り扱いが容易である
点などから、酵素が好適である。酵素としては、西洋わ
さびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなど
一般に酵素免疫測定法において用いられている酵素が使
用できる。尚、後述する本発明の測定用器材を用い、多
項目同時測定を行う場合も、標識剤は単一のものを用い
ると、測定手技が簡便となる。
位体元素、酵素、もしくは蛍光物質が使用できるが、安
定性、検出感度、安全性、および取り扱いが容易である
点などから、酵素が好適である。酵素としては、西洋わ
さびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなど
一般に酵素免疫測定法において用いられている酵素が使
用できる。尚、後述する本発明の測定用器材を用い、多
項目同時測定を行う場合も、標識剤は単一のものを用い
ると、測定手技が簡便となる。
反応結果は、免疫仄応後に固相上の腫瘍関連抗原に結合
した標識物の量または活性を測定することにより得られ
る。識別可能な標識剤が酵素の場合には、この標識物の
測定は、標識酵素の酵素反応の結果により生じる物質量
を測定することにより、簡便に行うことができる。物質
量の測定は、反射率計、蛍光光度計、発光光度計などの
測定機器を用いて物理的に定量的に行なうこともできる
。あるいは、該測定機器による物理的測定の結果を、カ
ットオフ値や数値範囲を設定することによって装置に解
析させ、定性的、半定量的に表してもよい。また、該物
質が発色物質の場合には、発色の度合を色の濃さにより
いくつかの段階に分けて肉眼的に半定量してもよいし、
陰性・陽性のみの定性で判定すれば、より簡便である。
した標識物の量または活性を測定することにより得られ
る。識別可能な標識剤が酵素の場合には、この標識物の
測定は、標識酵素の酵素反応の結果により生じる物質量
を測定することにより、簡便に行うことができる。物質
量の測定は、反射率計、蛍光光度計、発光光度計などの
測定機器を用いて物理的に定量的に行なうこともできる
。あるいは、該測定機器による物理的測定の結果を、カ
ットオフ値や数値範囲を設定することによって装置に解
析させ、定性的、半定量的に表してもよい。また、該物
質が発色物質の場合には、発色の度合を色の濃さにより
いくつかの段階に分けて肉眼的に半定量してもよいし、
陰性・陽性のみの定性で判定すれば、より簡便である。
酵素反応によって発色する発色剤としては、−性的に酵
素免疫測定法で使用されている発色剤が使用可能である
。例えば、ペルオキシダーゼに対しては、2.2°−ア
ジノジ(3−エチルベンズチアゾリン)−6°−スルホ
ン酸(ABTS)、O−フェニレンジアミン(OPD)
、テトラメチルベンジジン(TMB)、5−アミノサリ
チル酸などがあり、アルカリフォスファターゼに対して
は、p−ニトロフェノールりん酸、もしくは、フェニル
りん酸を基質として用い、酵素反応によって生成するフ
ェノールを4−アミノアンチピリンとの酸化的共役によ
って呈色させてもよい。
素免疫測定法で使用されている発色剤が使用可能である
。例えば、ペルオキシダーゼに対しては、2.2°−ア
ジノジ(3−エチルベンズチアゾリン)−6°−スルホ
ン酸(ABTS)、O−フェニレンジアミン(OPD)
、テトラメチルベンジジン(TMB)、5−アミノサリ
チル酸などがあり、アルカリフォスファターゼに対して
は、p−ニトロフェノールりん酸、もしくは、フェニル
りん酸を基質として用い、酵素反応によって生成するフ
ェノールを4−アミノアンチピリンとの酸化的共役によ
って呈色させてもよい。
また、シート状固相上に沈着する性質を有している発色
物質で、その色調が経時的に大きく変化しない場合には
、判定後も結果を残すことが可能であり、さらに有用で
ある。このような発色剤の例として、ペルオキシダーゼ
に対するジアミノベンジジン、アルカリフォスファター
ゼに対する5−プロモー4−クロロ−3−インドリルり
ん酸塩(BCIP)など、多種知られている。
物質で、その色調が経時的に大きく変化しない場合には
、判定後も結果を残すことが可能であり、さらに有用で
ある。このような発色剤の例として、ペルオキシダーゼ
に対するジアミノベンジジン、アルカリフォスファター
ゼに対する5−プロモー4−クロロ−3−インドリルり
ん酸塩(BCIP)など、多種知られている。
本発明では、乳頭分泌液の採取は、通常は吸引ピペット
またはキャピラリで行い、採取した検体を固相上の所定
の反応領域に塗布する。この方法であると、検体を採取
した乳腺の位置により、疾患の位置を推定できる。また
、必要な場合には、超微量の乳頭分泌液を、乳頭から固
相上の反応領域に直接採取することも可能である。
またはキャピラリで行い、採取した検体を固相上の所定
の反応領域に塗布する。この方法であると、検体を採取
した乳腺の位置により、疾患の位置を推定できる。また
、必要な場合には、超微量の乳頭分泌液を、乳頭から固
相上の反応領域に直接採取することも可能である。
本発明は、被測定物質である前記腫瘍関連抗原に対する
抗体を不溶化する担体として、また、抗原抗体反応およ
び標識物定量を行なう場として、実質的に液体不透過性
のシート状固相を用いる。このような固相の材質として
は、ポリエステル、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリ
エチレン、ポリメチルペンテンなどのプラスチックや、
ナイロン膜、ニトロセルロース膜などの合成膜などが挙
げられ、紙を上記の材料でコートしたものなども使用可
能であるが、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチ
レンなどのプラスチックやナイロン膜などが、乳頭分泌
液中の被測定物質である前記腫瘍関連抗原以外の成分の
非特異的な吸着が少なく、洗浄操作が容易であるなど、
取り扱いに便利であるので特に好ましい。また、シート
状固相が液体不透過性であると、検体量が超微量であっ
ても固相上の比較的広い面積に検体を塗布することがで
き、そのため、検体がより多くの抗体と接触することが
でき、同時に、検体液相の厚みを薄くすることができる
ため、反応効率が高まるとともに、検体の粘稠性の測定
結果への影響を極小に抑えられるという利点も有する。
抗体を不溶化する担体として、また、抗原抗体反応およ
び標識物定量を行なう場として、実質的に液体不透過性
のシート状固相を用いる。このような固相の材質として
は、ポリエステル、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリ
エチレン、ポリメチルペンテンなどのプラスチックや、
ナイロン膜、ニトロセルロース膜などの合成膜などが挙
げられ、紙を上記の材料でコートしたものなども使用可
能であるが、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチ
レンなどのプラスチックやナイロン膜などが、乳頭分泌
液中の被測定物質である前記腫瘍関連抗原以外の成分の
非特異的な吸着が少なく、洗浄操作が容易であるなど、
取り扱いに便利であるので特に好ましい。また、シート
状固相が液体不透過性であると、検体量が超微量であっ
ても固相上の比較的広い面積に検体を塗布することがで
き、そのため、検体がより多くの抗体と接触することが
でき、同時に、検体液相の厚みを薄くすることができる
ため、反応効率が高まるとともに、検体の粘稠性の測定
結果への影響を極小に抑えられるという利点も有する。
さらに、シート状固相に塗布された検体の非特異的吸着
は少なく、非吸着成分は、シート状固相上で乾固する前
であっても、乾固した後であっても、また、その粘稠性
の度合に拘らず、洗浄操作によって容易に除去できるた
め、乾固の有無や検体の性状の測定結果への影響を極小
に抑えられる。これにより、マススクリーニングの場合
のように、多数の検体が不定期に生じるような場合には
、検体採取時には検体を反応面に塗布するだけで放置し
、後でまとめて反応を行えるという自由度が付加された
。これらの効果は、シート状固相の材質を実質的に液体
不透過性のプラスチックとすることにより、さらに効果
的となる。
は少なく、非吸着成分は、シート状固相上で乾固する前
であっても、乾固した後であっても、また、その粘稠性
の度合に拘らず、洗浄操作によって容易に除去できるた
め、乾固の有無や検体の性状の測定結果への影響を極小
に抑えられる。これにより、マススクリーニングの場合
のように、多数の検体が不定期に生じるような場合には
、検体採取時には検体を反応面に塗布するだけで放置し
、後でまとめて反応を行えるという自由度が付加された
。これらの効果は、シート状固相の材質を実質的に液体
不透過性のプラスチックとすることにより、さらに効果
的となる。
本発明の測定方法は、木質的には、検体は乳頭分泌液に
限定されず、他の生物学的液体、例えば、血清、血漿、
尿、唾液、涙、汗、スメアなどにも応用可能であるが、
上記の効果から明らかなように、乳頭分泌液のように極
微量の検体に対して最も利用価値が高い。
限定されず、他の生物学的液体、例えば、血清、血漿、
尿、唾液、涙、汗、スメアなどにも応用可能であるが、
上記の効果から明らかなように、乳頭分泌液のように極
微量の検体に対して最も利用価値が高い。
前記腫瘍関連抗原に対する抗体を用い、本発明の測定方
法によって乳頭分泌液中の前記腫瘍関連抗原の測定を行
うと、従来の血中測定では前記腫瘍関連抗原が検出され
なかった早期乳癌患者でも、乳頭分泌液中の前記腫瘍関
連抗原濃度は異常高値を示す場合が多く、この乳頭分泌
液中の腫瘍関連抗原の測定は、乳癌の重要な補助診断手
段となることが明らかとなった。
法によって乳頭分泌液中の前記腫瘍関連抗原の測定を行
うと、従来の血中測定では前記腫瘍関連抗原が検出され
なかった早期乳癌患者でも、乳頭分泌液中の前記腫瘍関
連抗原濃度は異常高値を示す場合が多く、この乳頭分泌
液中の腫瘍関連抗原の測定は、乳癌の重要な補助診断手
段となることが明らかとなった。
例えば、乳癌の場合、従来法による血中CA15−3の
陽性率は、再発乳癌や原発性乳癌のs t a g e
IVというような末期癌では38〜54%であったが
、原発性乳癌stageIおよびs t a g e
11では、10%以下の陽性率を示すに過ぎなかった(
セントコアCA15−3RIAキット研究会1985−
19116年集計資料)。
陽性率は、再発乳癌や原発性乳癌のs t a g e
IVというような末期癌では38〜54%であったが
、原発性乳癌stageIおよびs t a g e
11では、10%以下の陽性率を示すに過ぎなかった(
セントコアCA15−3RIAキット研究会1985−
19116年集計資料)。
ところが、本発明法による乳頭分泌液中のCA15−3
の測定では、3000 U / m 1をカットオフ値
とした場合、原発性乳癌でも4例中4例が陽性を示し、
特異性も83%(5/6)と高く、正診率は90%(9
/10)であつた。
の測定では、3000 U / m 1をカットオフ値
とした場合、原発性乳癌でも4例中4例が陽性を示し、
特異性も83%(5/6)と高く、正診率は90%(9
/10)であつた。
本発明法は、検体採取から測定までを同一固相上で行う
こともできるため、操作が簡便であり、検体保存および
測定の自由度が高く、感度も良好であり、病院・診療所
の外来患者および健康診断などで乳頭異常分泌の認めら
れる患者が発見された場合、ただちに乳頭分泌液中の腫
瘍関連抗原の測定を行うことを可能にし、その乳頭異常
分泌症の原因を医師が早期に把握し、適切な処置を施す
ことを可能にするものである。すなわち、本発明法は、
従来性われていた血中腫瘍関連抗原の測定方法のように
、測定機器を必要とせず、簡便な方法で乳頭分泌液を採
取して腫瘍関連抗原を測定できるので、どのような施設
でも測定が可能であり、臨床的意義が大きい。
こともできるため、操作が簡便であり、検体保存および
測定の自由度が高く、感度も良好であり、病院・診療所
の外来患者および健康診断などで乳頭異常分泌の認めら
れる患者が発見された場合、ただちに乳頭分泌液中の腫
瘍関連抗原の測定を行うことを可能にし、その乳頭異常
分泌症の原因を医師が早期に把握し、適切な処置を施す
ことを可能にするものである。すなわち、本発明法は、
従来性われていた血中腫瘍関連抗原の測定方法のように
、測定機器を必要とせず、簡便な方法で乳頭分泌液を採
取して腫瘍関連抗原を測定できるので、どのような施設
でも測定が可能であり、臨床的意義が大きい。
従来、早期乳癌の発見は非常に困難であったため、発見
時には既に癌が進行していたり、リンパ節に転心を起こ
している症例が多く、やむを得ず乳房切除術などの大手
術が必要であったが、本発明の測定方法による乳頭分泌
液中の前記腫瘍関連抗原の測定によって早期に発見され
る乳癌症例では、乳房を切除することなく、micro
dochectomyなどの比較的簡単な手術での治療
が可能となり、予後も良好である。
時には既に癌が進行していたり、リンパ節に転心を起こ
している症例が多く、やむを得ず乳房切除術などの大手
術が必要であったが、本発明の測定方法による乳頭分泌
液中の前記腫瘍関連抗原の測定によって早期に発見され
る乳癌症例では、乳房を切除することなく、micro
dochectomyなどの比較的簡単な手術での治療
が可能となり、予後も良好である。
次に、本発明法に用いるシート状の固相である本発明の
測定用器材について、図面に示す好適実施例に基づいて
説明する。
測定用器材について、図面に示す好適実施例に基づいて
説明する。
シート状固相の形状は、所定の面積を有する1つ以上の
反応領域を設けることができるシート状であれば特に限
定されず、実施上便利な形状、大きさとすることができ
る。ここでは、4種の好適実施例について述べるが、本
発明は、これらの例に限定されない。
反応領域を設けることができるシート状であれば特に限
定されず、実施上便利な形状、大きさとすることができ
る。ここでは、4種の好適実施例について述べるが、本
発明は、これらの例に限定されない。
% i a図に平面図を示し、第1b図に断面図を示す
例には、反応領域2を1つ有するシート1を示している
。シート1の厚さは、0.1〜2mmが好ましく、シー
トの面積は、取り扱いに便利な大きさであればよい。
例には、反応領域2を1つ有するシート1を示している
。シート1の厚さは、0.1〜2mmが好ましく、シー
トの面積は、取り扱いに便利な大きさであればよい。
第2a図に平面図を示し、第2b図に断面図を示す例に
は、シート1が反応領域2を複数固有し、この反応領域
2は、シート1に設けられた凹部5である例に示す 第3a図に平面図を示し、第3b図に断面図を示す例に
は、シート1が反応領域2を複数固有し、この反応領域
2は、シート1上に設けられた凸状の枠6で囲まれてい
る例に示す。
は、シート1が反応領域2を複数固有し、この反応領域
2は、シート1に設けられた凹部5である例に示す 第3a図に平面図を示し、第3b図に断面図を示す例に
は、シート1が反応領域2を複数固有し、この反応領域
2は、シート1上に設けられた凸状の枠6で囲まれてい
る例に示す。
第4a図に平面図を示し、第4b図に断面図を示す例に
は、シート1上に設けられた凸部7が、反応領域以外の
シート1表面すべてを覆う形状である例を示す。
は、シート1上に設けられた凸部7が、反応領域以外の
シート1表面すべてを覆う形状である例を示す。
反応領域の大きさおよび形状は、塗布可能な乳頭分泌液
検体量と測定の容易さから適当なものを選びつる。例え
ば、検体量が5μLであると、通常は0.01〜3.0
cm’の面積に塗布可能である。形状を円形とした場合
、約1〜20mm直径がこれに相当するが、塗布および
洗浄などの測定操作の簡便性および測定の容易さから、
約2〜15mmの直径が好ましい。しかしながら、測定
に供する検体量を増減すれば、これらの値はそれに応じ
て変動しうろことは容易に推測できる。また、検体量は
、測定感度もしくは測定濃度範囲によっても変動しつる
ため、それらに応じて該面積の大きさも変動しつる。反
応領域の形状は、塗布および洗浄などの測定操作の簡便
性および判定の容易さから、円形、楕円形、正方形、長
方形、もしくは他の四辺形が好ましいが、これらに限定
されるものではない。
検体量と測定の容易さから適当なものを選びつる。例え
ば、検体量が5μLであると、通常は0.01〜3.0
cm’の面積に塗布可能である。形状を円形とした場合
、約1〜20mm直径がこれに相当するが、塗布および
洗浄などの測定操作の簡便性および測定の容易さから、
約2〜15mmの直径が好ましい。しかしながら、測定
に供する検体量を増減すれば、これらの値はそれに応じ
て変動しうろことは容易に推測できる。また、検体量は
、測定感度もしくは測定濃度範囲によっても変動しつる
ため、それらに応じて該面積の大きさも変動しつる。反
応領域の形状は、塗布および洗浄などの測定操作の簡便
性および判定の容易さから、円形、楕円形、正方形、長
方形、もしくは他の四辺形が好ましいが、これらに限定
されるものではない。
この反応領域を規定する方法としては、固相上の所定の
限定された領域にのみ前記腫瘍関連抗原に対する抗体を
不溶化するだけでも実施可能であるが、シート状固相上
の所定の反応領域が、固相上に設けられた凸状の枠また
は凸部で囲まれているか、もしくは、シート状固相の凹
部であることが好ましい。シート状固相を実質的に液体
不透過性のプラスチック製シートとすることにより、上
記加工もしくは成形が容易となる。
限定された領域にのみ前記腫瘍関連抗原に対する抗体を
不溶化するだけでも実施可能であるが、シート状固相上
の所定の反応領域が、固相上に設けられた凸状の枠また
は凸部で囲まれているか、もしくは、シート状固相の凹
部であることが好ましい。シート状固相を実質的に液体
不透過性のプラスチック製シートとすることにより、上
記加工もしくは成形が容易となる。
なお、固相上の所定の限定された領域にのみ前記腫瘍関
連抗原に対する抗体を不溶化することによって反応領域
を規定する場合、1枚のシート状固相に複数の腫瘍関連
抗原に対する抗体を不溶化し、他項目間時測定が可能な
測定用器材とすることもできる。
連抗原に対する抗体を不溶化することによって反応領域
を規定する場合、1枚のシート状固相に複数の腫瘍関連
抗原に対する抗体を不溶化し、他項目間時測定が可能な
測定用器材とすることもできる。
シート状固相上の所定の反応領域を、固相上に設けられ
た凸状の枠で囲う方法としては、プレス加工などで凸状
部を成形するか、撥水性のペイントで固相上に枠を印刷
する方法が可能である。また、凸部で囲う方法としては
、反応領域以外の部分を適当な手段(第4a図および第
4b図に示す例えばアルミ箔4など)で被覆して凸部と
し、反応領域を区分する方法が可能である。具体的には
、所定の反応領域の大きさおよび形状と同じ穴をあけた
適度な厚さ(0、05〜1 、 0 m m )を有す
るアルミ箔を、ホットメルト接着剤で固相上に加熱接着
することにより、反応領域を設定できる。固相上の反応
領域を、固相に設けられた凹部とする方法としては、第
2b図に示すように、プレス加工などで固相表面をへこ
ませればよい。なお、シート状固相上に一定面積の反応
領域を設ける方法は、これら例示した方法に限定される
ものではない。
た凸状の枠で囲う方法としては、プレス加工などで凸状
部を成形するか、撥水性のペイントで固相上に枠を印刷
する方法が可能である。また、凸部で囲う方法としては
、反応領域以外の部分を適当な手段(第4a図および第
4b図に示す例えばアルミ箔4など)で被覆して凸部と
し、反応領域を区分する方法が可能である。具体的には
、所定の反応領域の大きさおよび形状と同じ穴をあけた
適度な厚さ(0、05〜1 、 0 m m )を有す
るアルミ箔を、ホットメルト接着剤で固相上に加熱接着
することにより、反応領域を設定できる。固相上の反応
領域を、固相に設けられた凹部とする方法としては、第
2b図に示すように、プレス加工などで固相表面をへこ
ませればよい。なお、シート状固相上に一定面積の反応
領域を設ける方法は、これら例示した方法に限定される
ものではない。
[実施例〕
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
(実施例1)抗体を結合させたポリエステルシートを用
いた乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定 一従来法との比較− 各腫瘍関連抗原に対する抗体が不溶化されたシートを作
製し、乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定を行った。ま
た、同一検体につき、従来法で測定を行った。
いた乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定 一従来法との比較− 各腫瘍関連抗原に対する抗体が不溶化されたシートを作
製し、乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定を行った。ま
た、同一検体につき、従来法で測定を行った。
1)抗体不溶化シートの作製
ポリエステルシート(ソマール社;N
500)上に、内径10mmの円形の孔を15mmの間
隔をおいて打ち抜いたアルミシール(Jgさ約100μ
m)を、ホットメルト接着剤で密着接合した。このシー
トを、十分に水洗・乾燥した。次に、76mMりん酸緩
衝生理食塩水pH6,4(以下、PBSという)で01
〜5 m g / m 1の濃度に調製した抗体の溶液
中にポリエステルシートを浸し、45℃で1時間インキ
ュベートした後、蒸留水で洗浄した。水を良く切り、1
0%BSA加PBSに浸して室温で1時間インキュベー
トした後、液を良く切り、風乾燥し、抗体不溶化シート
を得た。
隔をおいて打ち抜いたアルミシール(Jgさ約100μ
m)を、ホットメルト接着剤で密着接合した。このシー
トを、十分に水洗・乾燥した。次に、76mMりん酸緩
衝生理食塩水pH6,4(以下、PBSという)で01
〜5 m g / m 1の濃度に調製した抗体の溶液
中にポリエステルシートを浸し、45℃で1時間インキ
ュベートした後、蒸留水で洗浄した。水を良く切り、1
0%BSA加PBSに浸して室温で1時間インキュベー
トした後、液を良く切り、風乾燥し、抗体不溶化シート
を得た。
なお、使用した抗体(不溶化抗体)は第1表に示した。
2)酵素標識抗体の調製
ここでは、CA15−3に対する酵素標識抗体を調製す
る方法を示すが、この方法により、他の腫瘍関連抗原に
対する酵素標識抗体も調製1表に示した。
る方法を示すが、この方法により、他の腫瘍関連抗原に
対する酵素標識抗体も調製1表に示した。
した。
西洋わさびペルオキシダーゼ(TOYOBO社、グレー
ド1−01以下、HRPOという)5mgを0,3M炭
酸水素ナトリウム水溶液1mLに溶解し、これに、0.
1mLの1%ジニトロフルオロベンゼンのエタノール溶
液を加え、室温で1時間反応させた。さらに、60mM
過ヨウ素酸ナトリウム溶液1mLを加えて30分間反応
させ、次に、0.16Mエチレングリコール溶液1mL
を加えて1時間反応させた後、0.01M炭酸緩衝液p
H9,5(以下、SCBという)に対して透析した。こ
の溶液に、抗CA15−3抗体(DF3)5mgを加え
、室温で3時間反応させ、次に、5mgの水酸化ホウ素
ナトリウムを加え、4℃で1晩反応させた後、PBSに
対して透析し、HRPO標識抗CA15−3抗体を得た
。
ド1−01以下、HRPOという)5mgを0,3M炭
酸水素ナトリウム水溶液1mLに溶解し、これに、0.
1mLの1%ジニトロフルオロベンゼンのエタノール溶
液を加え、室温で1時間反応させた。さらに、60mM
過ヨウ素酸ナトリウム溶液1mLを加えて30分間反応
させ、次に、0.16Mエチレングリコール溶液1mL
を加えて1時間反応させた後、0.01M炭酸緩衝液p
H9,5(以下、SCBという)に対して透析した。こ
の溶液に、抗CA15−3抗体(DF3)5mgを加え
、室温で3時間反応させ、次に、5mgの水酸化ホウ素
ナトリウムを加え、4℃で1晩反応させた後、PBSに
対して透析し、HRPO標識抗CA15−3抗体を得た
。
なお、使用した抗体(標識抗体用抗体)は第3)標準液
の調製 (a)CA15−3標準液の調製 人乳を超遠心(40000xg)L、、脂肪分を除去し
た後、蛋白分解酵素阻害剤としてPMSFとアプロチニ
ンを添加し、限外ろ過器を用いて濃縮した。得られた濃
縮液を適宜希釈し、第4表に示す従来法により、CA1
5−3濃度の測定を行りた。これを、10%BSA加P
BSを用いて目的の濃度に希釈し、標準液とした。
の調製 (a)CA15−3標準液の調製 人乳を超遠心(40000xg)L、、脂肪分を除去し
た後、蛋白分解酵素阻害剤としてPMSFとアプロチニ
ンを添加し、限外ろ過器を用いて濃縮した。得られた濃
縮液を適宜希釈し、第4表に示す従来法により、CA1
5−3濃度の測定を行りた。これを、10%BSA加P
BSを用いて目的の濃度に希釈し、標準液とした。
(b)癌細胞培養液からの標準液の調製CA15−3を
除く腫瘍関連抗原の標準液は、第2表に示す癌細胞培養
株の培養液より、以下に示す方法により調製した。
除く腫瘍関連抗原の標準液は、第2表に示す癌細胞培養
株の培養液より、以下に示す方法により調製した。
癌細胞培養液中の細胞を、濾紙(アトパンチツク東洋製
、No、131)を用いて除去し、培養上清を得た。こ
の培養上清を、限外ろ過器(ミリポア製)を用いて濃縮
した後、ACA22(ファルマシアーLKB製)を用い
たゲルろ過カラムクロマトグラフィーで精製した。
、No、131)を用いて除去し、培養上清を得た。こ
の培養上清を、限外ろ過器(ミリポア製)を用いて濃縮
した後、ACA22(ファルマシアーLKB製)を用い
たゲルろ過カラムクロマトグラフィーで精製した。
これを、限外ろ過器を用いて濃縮し、得られた濃縮液に
ついて、第4表に示す従来法により、腫瘍関連抗原濃度
の測定を行った。10%BSA加PBSを用いて目的と
する濃度に希釈し、標準液とした。
ついて、第4表に示す従来法により、腫瘍関連抗原濃度
の測定を行った。10%BSA加PBSを用いて目的と
する濃度に希釈し、標準液とした。
なお、調製された各標準液の濃度は、第3表に示した。
4)本発明法による腫瘍関連抗原の測定乳頭異常分泌症
の患者から採取した乳頭分泌液各10例を、検体として
用いた。
の患者から採取した乳頭分泌液各10例を、検体として
用いた。
1)で調製した抗体不溶化シートの各円形枠内全体に、
採取直後の検体各5μLを塗り広げ、乾燥させた後、1
%BSA加PBSで100倍に希釈したHRPO標識抗
体溶液各25μLを滴下し、室温で30分間反応させた
。反応液を蒸留水で洗い流した後、シートを洗浄液(0
,05%Tween20加IM食塩水)が入っている密
封容器に入れ、激しく撹拌して洗浄した。水分を良く切
った後、基質溶液(0,5mM TMB、0.01%
H2O2含有)各25μLを滴下し、10分間反応させ
た。検体の替わりに標準液を塗布した反応領域における
呈色を対照とし、各検体中の腫瘍関連抗原濃度を半定量
した。
採取直後の検体各5μLを塗り広げ、乾燥させた後、1
%BSA加PBSで100倍に希釈したHRPO標識抗
体溶液各25μLを滴下し、室温で30分間反応させた
。反応液を蒸留水で洗い流した後、シートを洗浄液(0
,05%Tween20加IM食塩水)が入っている密
封容器に入れ、激しく撹拌して洗浄した。水分を良く切
った後、基質溶液(0,5mM TMB、0.01%
H2O2含有)各25μLを滴下し、10分間反応させ
た。検体の替わりに標準液を塗布した反応領域における
呈色を対照とし、各検体中の腫瘍関連抗原濃度を半定量
した。
結果は第5表に示した。
また、測定値を疾患によって分類した結果を、第5図〜
第11図に示した。
第11図に示した。
5)従来法による腫瘍関連抗原の測定
第4表に示すキットを用い、4)と同一検体について、
腫瘍関連抗原の測定を行った。
腫瘍関連抗原の測定を行った。
結果は第5表に示した。
第5表から明らかなように、両方法における測定値は良
く相関した。
く相関した。
第5図〜第11図から明らかなように、腫瘍関連抗原が
高値を示したものは、金側乳癌であり、良性疾患は金側
低値であった。
高値を示したものは、金側乳癌であり、良性疾患は金側
低値であった。
(実施例2)検体塗布後の保存日数の影響の検討
乳頭異常分泌症の患者から採取した乳頭分泌液各3例(
実施例1で用いた10例のうちの3例)を検体として用
いた。
実施例1で用いた10例のうちの3例)を検体として用
いた。
実施例1−1)で調製した抗体不溶化シートの円形枠内
全体に、採取直後の検体各5μLを塗り広げ、乾燥させ
た後、4℃に保存し、逐次別個に、実施例1−4)と同
様の方法で、腫瘍関連抗原濃度の測定を行った。
全体に、採取直後の検体各5μLを塗り広げ、乾燥させ
た後、4℃に保存し、逐次別個に、実施例1−4)と同
様の方法で、腫瘍関連抗原濃度の測定を行った。
結果は第6表に示した。
保存による測定値の変化は殆どなかった。
(実施例3)測定方法の比較
1)抗体不溶化シートの作製
ポリエステルシート(ソマール社;N
500)上に、幅1mm、内径6mmの円形の枠を、1
0mmの間隔をおいて、白色の撥水性ペイントでシルク
印刷した。このシートを十分に水洗・乾燥した後、実施
例1−1)の方法で抗体を不溶化し、抗体不溶化シート
を作製した。
0mmの間隔をおいて、白色の撥水性ペイントでシルク
印刷した。このシートを十分に水洗・乾燥した後、実施
例1−1)の方法で抗体を不溶化し、抗体不溶化シート
を作製した。
2)酵素標識抗体の調製
tomg/mLf!4度のウシ小腸アルカリフォスファ
ターゼ(ベーリンガー・マンハイム社、以下、ALPと
いう)と抗体(5m g / m L )との混合溶液
に、最終濃度が0.2%となるようにグルタルアルデヒ
ドを添加し、4℃で2時間反応を行わせた後、0.1M
塩化ナトリウム、1mM塩化マグネシウム、0.1%ア
ジ化ナトリウムを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH
8,0)に対し、4℃で透析し、ALP標識抗体を得た
。
ターゼ(ベーリンガー・マンハイム社、以下、ALPと
いう)と抗体(5m g / m L )との混合溶液
に、最終濃度が0.2%となるようにグルタルアルデヒ
ドを添加し、4℃で2時間反応を行わせた後、0.1M
塩化ナトリウム、1mM塩化マグネシウム、0.1%ア
ジ化ナトリウムを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH
8,0)に対し、4℃で透析し、ALP標識抗体を得た
。
3)腫瘍関連抗原の測定
乳頭異常分泌症の患者から採取した乳頭分泌液、各3例
を、検体として用いた。
を、検体として用いた。
(a)測定方法1
1)で調製した抗体不溶化シートの円形枠内全体に、検
体各5μLを塗り広げ、乾燥させた後、ALP標識抗体
各10μLを滴下し、室温で30分間反応させた。反応
液を蒸留水で洗い流した後、洗浄液(0,05%Twe
en20加IM食塩水)が入っている密封容器に入れ、
激しく撹拌して洗浄した。水分を良く切った後、基X溶
液(1m g / m L 5−ブロモ−4−クロロ−
3−インドリルりん酸塩(BCIP)、1mM塩化マグ
ネシウム、0.1Mはう酸−炭酸ナトリウム緩衝液(p
H9,8)含有)各10μLを滴下し、乾燥するまで約
30分間、室温に放置した。円形枠内の反射率を、反射
率計(color measuring system
5Z−80(日本電色工業株式会社))で測定し、検
体の替わりに標準液(実施例1と同様)を塗布した円形
枠内の反射率を対照とし、各検体中のIli!瘍関連抗
原濃度を定量した。
体各5μLを塗り広げ、乾燥させた後、ALP標識抗体
各10μLを滴下し、室温で30分間反応させた。反応
液を蒸留水で洗い流した後、洗浄液(0,05%Twe
en20加IM食塩水)が入っている密封容器に入れ、
激しく撹拌して洗浄した。水分を良く切った後、基X溶
液(1m g / m L 5−ブロモ−4−クロロ−
3−インドリルりん酸塩(BCIP)、1mM塩化マグ
ネシウム、0.1Mはう酸−炭酸ナトリウム緩衝液(p
H9,8)含有)各10μLを滴下し、乾燥するまで約
30分間、室温に放置した。円形枠内の反射率を、反射
率計(color measuring system
5Z−80(日本電色工業株式会社))で測定し、検
体の替わりに標準液(実施例1と同様)を塗布した円形
枠内の反射率を対照とし、各検体中のIli!瘍関連抗
原濃度を定量した。
結果は第7表に示した。
(b)測定方法2
1)で調製した抗体不溶化シートの円形枠内に、ALP
標識抗体各10μLをあらかじめ滴下しておき、ここに
、測定方法1と同じ検体各5μLを塗り広げ、室温で3
0分間反応させた。反応液を蒸留水で洗い流した後、洗
浄液で洗浄を行い、以下、測定方法1と同様の方法で各
検体中の腫瘍関連抗原濃度を定量した。
標識抗体各10μLをあらかじめ滴下しておき、ここに
、測定方法1と同じ検体各5μLを塗り広げ、室温で3
0分間反応させた。反応液を蒸留水で洗い流した後、洗
浄液で洗浄を行い、以下、測定方法1と同様の方法で各
検体中の腫瘍関連抗原濃度を定量した。
結果は第7表に示した。
(c)測定方法3
測定方法1と同じ検体各5μLとALP標識抗体各10
μLとをあらかじめ混合し、その全量を、1)で調製し
た抗体不溶化シートの円形枠内に各々塗り広げ、室温で
30分間反応させた。反応液を蒸留水で洗い流した後、
洗浄液で洗浄を行い、以下、測定方法1と同様の方法で
各検体中の腫瘍関連抗原濃度を定量した。
μLとをあらかじめ混合し、その全量を、1)で調製し
た抗体不溶化シートの円形枠内に各々塗り広げ、室温で
30分間反応させた。反応液を蒸留水で洗い流した後、
洗浄液で洗浄を行い、以下、測定方法1と同様の方法で
各検体中の腫瘍関連抗原濃度を定量した。
結果は第7表に示した。
第7表から明らかなように、3方法の測定結果は良く一
致した。
致した。
(実施例4)抗体不溶化ポリプロピレンシートに直接孔
頭分?1)液を採取する方法を用いた乳頭分泌液中の腫
瘍関連抗原の測定 1)抗体不溶化シートの作製 ポリプロピレンシート(サンプラチック社;PP)を用
いた以外は、実施例1−1)の方法で抗体を不溶化し、
抗体不溶化シートを作製した。
頭分?1)液を採取する方法を用いた乳頭分泌液中の腫
瘍関連抗原の測定 1)抗体不溶化シートの作製 ポリプロピレンシート(サンプラチック社;PP)を用
いた以外は、実施例1−1)の方法で抗体を不溶化し、
抗体不溶化シートを作製した。
2)本発明法による腫瘍関連抗原の測定検体は、乳頭異
常分泌症の患者の乳頭から直接採取した。検体数は、各
10例である。
常分泌症の患者の乳頭から直接採取した。検体数は、各
10例である。
ポリプロピレンシートの抗体不溶化部分を直接乳頭にあ
て、検体を採取、塗布した後、37℃で1時間インキュ
ベートした。このポリプロピレンシートを、0.5%脱
脂粉乳加PBSに浸して4℃で一晩インキユベートした
後、濾紙を用いて水分を良く除いた。次に、1%BSA
加PBSで100〜1000倍に希釈したHRPO標識
抗体溶液(実施例1に従って調製したもの)に上記のポ
リプロピレンシートを浸し、室温で1時間インキュベー
トした。シートの水分を除去した後、洗浄液(005%
Twe e n 20加IM食塩水)が人っている密封
容器に入れ、攪拌しながら1時間洗浄した。
て、検体を採取、塗布した後、37℃で1時間インキュ
ベートした。このポリプロピレンシートを、0.5%脱
脂粉乳加PBSに浸して4℃で一晩インキユベートした
後、濾紙を用いて水分を良く除いた。次に、1%BSA
加PBSで100〜1000倍に希釈したHRPO標識
抗体溶液(実施例1に従って調製したもの)に上記のポ
リプロピレンシートを浸し、室温で1時間インキュベー
トした。シートの水分を除去した後、洗浄液(005%
Twe e n 20加IM食塩水)が人っている密封
容器に入れ、攪拌しながら1時間洗浄した。
洗浄液は、15分おきに交換した。洗浄したポリプロピ
レンシートの水分を良く切り、基11 i8γ夜 (0
,5mM TMB、 0. 01 %
H202含有)を滴下し、室温で15分間インキュベー
トした。呈色したものを+(プラス)、呈色しなかった
ものを−(マイナス)として判定した。
レンシートの水分を良く切り、基11 i8γ夜 (0
,5mM TMB、 0. 01 %
H202含有)を滴下し、室温で15分間インキュベー
トした。呈色したものを+(プラス)、呈色しなかった
ものを−(マイナス)として判定した。
結果は第8表に示した。
3)従来法による腫瘍関連抗原の測定
第4表に示すキットを用い、2)と同一検体について、
腫瘍関連抗原の測定を行った。
腫瘍関連抗原の測定を行った。
結果は第8表に示した。
第8表から明らかなように、両方法における測定結果は
良く相関した。。
良く相関した。。
第1表 測定に使用する抗体の組み合わせマーカー
A15−3
A125
A72−4
CA54/61
A602
A19−9
PA
酵素標識用抗体 不溶化用抗体
F3
C125
B72. 3
A54
1116NS19−9
T 162
1 1 5D8
C125
C49
A61
1116NS19−9
T 162
第2表
マーカー
標準液調製に用いる癌細胞株
癌 細 胞 株
A125
A72−4
CA54/61
A602
A19−9
PA
卵巣類中腎癌培養細胞株RM G −II肺腺癌由来細
胞株C1509 肺腺癌由来細胞株C1509 卵巣類中腎癌培養細胞株RM G −II結腸癌由来細
胞株SWI 116 卵巣類中腎癌培養細胞株RM G −II第3表 測定に使用する標準液濃度 マーカー CA 1 5−3 A125 CA72−4 CA 54/61 CA602 A19−9 PA 標準液濃度(x s o’ U/m I )2、 4.
8 4.8,16 5、1. 2. 4 2、 4. 8 751.5.3 5、 3. 6. 12 マ ーカー 第4表 従来の測定方法 キ ト CA15−3RIAキツト (セントコア社) 第6表 保存後の測定値 マーカー 測定値(X103U/ml) 保存日数 検体 01714 A15−3 OOOO A125 D 0 0 0 0E ・
4 4 4 4F 16
16 16 16A72−4 OOOO CA54/61 OOOO CA602 M O. O O O
A19 pooo。
胞株C1509 肺腺癌由来細胞株C1509 卵巣類中腎癌培養細胞株RM G −II結腸癌由来細
胞株SWI 116 卵巣類中腎癌培養細胞株RM G −II第3表 測定に使用する標準液濃度 マーカー CA 1 5−3 A125 CA72−4 CA 54/61 CA602 A19−9 PA 標準液濃度(x s o’ U/m I )2、 4.
8 4.8,16 5、1. 2. 4 2、 4. 8 751.5.3 5、 3. 6. 12 マ ーカー 第4表 従来の測定方法 キ ト CA15−3RIAキツト (セントコア社) 第6表 保存後の測定値 マーカー 測定値(X103U/ml) 保存日数 検体 01714 A15−3 OOOO A125 D 0 0 0 0E ・
4 4 4 4F 16
16 16 16A72−4 OOOO CA54/61 OOOO CA602 M O. O O O
A19 pooo。
Q 1.5 1.5 1.5
1.5PA sooo。
1.5PA sooo。
U 12 12 12 12第7表
測定方法の比較
マーカー
測定値(xlo’U/ml)
測定方法
検体 (1) (2) (3)A15−3
A125
CA72−4
CA 5 4/6 1
CA602
PA
3、0 3.1 3.+12、2
12.1 12.0[発明の効果コ 本発明により、@量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原(c
A15−3、CA125、CA72−4、CA 54/
61、CA601、CA19−9、TPA、MCA、M
SAおよびATM−1)の測定方法および測定用器材が
提供される。
12.1 12.0[発明の効果コ 本発明により、@量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原(c
A15−3、CA125、CA72−4、CA 54/
61、CA601、CA19−9、TPA、MCA、M
SAおよびATM−1)の測定方法および測定用器材が
提供される。
本発明の測定方法および測定用器材は、検体量が微量で
も測定可能であり、測定操作が簡便である。また、定性
または半定量反応を行う場合は、測定用機器がなくても
実施しつるので、集団検診やマススクリーニングで容易
に利用できる。
も測定可能であり、測定操作が簡便である。また、定性
または半定量反応を行う場合は、測定用機器がなくても
実施しつるので、集団検診やマススクリーニングで容易
に利用できる。
本発明の測定方法および測定用器材を用いることにより
、多項目同時測定が可能となる。
、多項目同時測定が可能となる。
また、本発明の測定方法および測定用器材を用いること
により、特に乳癌の早期診断が可能となる。
により、特に乳癌の早期診断が可能となる。
第1a図は、本発明の測定用器材の一実施例の平面図、
第1b図はその断面図を表わす。 第2a図は、本発明の測定用器材の他の実施例の平面図
、第2b図はその断面図を表わす。 第3a図は、本発明の測定用器材の他の実施例の平面図
、第3b図はその断面図を表わす。 第4a図は、本発明の測定用器材の他の実施例の平面図
、第4b図はその断面図を表わす。 第5図は、実施例1における疾患別のCA15−3Qf
A度を表わすグラフである。 第6図は、実施例1における疾患別のCA125濃度を
表わすグラフである。 第7図は、実施例1における疾患別のCA72−4濃度
を表わすグラフである。 第8図は、実施例1における疾患別のCA54/61濃
度を表わすグラフである。 第9図は、実施例1における疾患別のCA602濃度を
表わすグラフである。 第10図は、実施例1における疾患別のCA19−9
!1度を表わすグラフである。 第11図は、実施例1における疾患別のTPA濃度を表
わすグラフである。 符号の説明 1・・・シート、 2・・・反応領域、 4・・・アルミ箔、 5・・・凹部、 6・・・凸状の枠、 7・・・凸部
第1b図はその断面図を表わす。 第2a図は、本発明の測定用器材の他の実施例の平面図
、第2b図はその断面図を表わす。 第3a図は、本発明の測定用器材の他の実施例の平面図
、第3b図はその断面図を表わす。 第4a図は、本発明の測定用器材の他の実施例の平面図
、第4b図はその断面図を表わす。 第5図は、実施例1における疾患別のCA15−3Qf
A度を表わすグラフである。 第6図は、実施例1における疾患別のCA125濃度を
表わすグラフである。 第7図は、実施例1における疾患別のCA72−4濃度
を表わすグラフである。 第8図は、実施例1における疾患別のCA54/61濃
度を表わすグラフである。 第9図は、実施例1における疾患別のCA602濃度を
表わすグラフである。 第10図は、実施例1における疾患別のCA19−9
!1度を表わすグラフである。 第11図は、実施例1における疾患別のTPA濃度を表
わすグラフである。 符号の説明 1・・・シート、 2・・・反応領域、 4・・・アルミ箔、 5・・・凹部、 6・・・凸状の枠、 7・・・凸部
Claims (22)
- (1)微量の乳頭分泌液中に含まれるCA15−3、C
A125、CA72−4、CA54/61、CA602
、CA19−9、TPA(Tissue Polype
ptide Antigen)、MCA(Mucino
us Carcinoma−associated A
ntigen)、MSA(Mammary Serum
Antigen)およびATM−1からなる群から選
ばれた成分の濃度を、該選ばれた成分に対する抗体また
は抗体分画を用いた抗原抗体反応により測定する方法で
あって、シート状固相で前記抗原抗体反応を行うことを
特徴とする微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方
法。 - (2)前記シート状固相に、前記CA15−3、CA1
25、CA72−4、CA54/61、CA602、C
A19−9、TPA、MCA、MSAおよびATM−1
からなる群から選ばれた成分に対する抗体または抗体分
画が不溶化されている請求項1に記載の微量の乳頭分泌
液中の腫瘍関連抗原の測定方法。 - (3)(a)前記シート状固相上に、前記CA15−3
、CA125、CA72−4、CA54/61、CA6
02、CA19−9、TPA、MCA、MSAおよびA
TM−1からなる群から選ばれた成分に対する抗体また
は抗体分画を不溶化させて固定し、 (b)乳頭分泌液検体を採取し、該検体を前記固相上の
所定の反応、領域内に塗布することにより、前記領域内
に不溶化されている前記抗体または抗体分画と接触させ
、 (c)前記検体と前記抗体または抗体分画との反応物が
該固相上で乾固した後、もしくは乾固する前に、該反応
物に、前記選ばれた成分に対する抗体または抗体分画に
識別可能な標識剤を結合させた標識物を接触させ、 (d)前記固相を洗浄することにより、固相に不溶化さ
せた抗体または抗体分画に結合しなかった検体成分およ
び標識物を除去し、(e)前記固相に結合した前記標識
物の 量から、乳頭分泌液中の前記選ばれた成分の濃度を測定
する、請求項1または2に記載の微量の乳頭分泌液中の
腫瘍関連抗原の測定方法。 - (4)前記シート状固相に不溶化させた前記CA15−
3、CA125、CA72−4、CA54/61、CA
602、CA19−9、TPA、MCA、MSAおよび
ATM−1からなる群から選ばれた成分に対する抗体ま
たは抗体分画と検体との接触、および検体と標識物との
接触を同時に行なわせる請求項1または2に記載の微量
の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法。 - (5)乳頭分泌液検体と、該乳頭分泌液検体中の前記C
A15−3、CA125、CA72−4、CA54/6
1、CA602、CA19−9、TPA、MCA、MS
AおよびATM−1からなる群から選ばれた成分に対す
る抗体または抗体分画に識別可能な標識剤を結合させた
標識物とを混合した後、該混合物を前記シート状固相に
不溶化させた前記選ばれた成分に対する抗体または抗体
分画と接触させる請求項1または2に記載の微量の乳頭
分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法。 - (6)前記乳頭分泌液検体の採取が、該シート状固相を
直接乳頭へ接触させることにより行なわれる請求項1〜
3のいずれかに記載の微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗
原の測定方法。 - (7)前記乳頭分泌液検体の採取が、採取用用具を介し
て行なわれる請求項1〜5のいずれかに記載の微量の乳
頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法。 - (8)前記シート状固相が、実質的に液体不透過性のプ
ラスチック製シートである請求項1〜7のいずれかに記
載の微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法。 - (9)前記プラスチックが、ポリエステル、ポリプロピ
レンまたはポリエチレンである請求項8に記載の微量の
乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法。 - (10)前記シート状固相に、CA15−3、CA12
5、CA72−4、CA54/61、CA602、CA
19−9、TPA、MCA、MSAおよびATM−1か
らなる群から選ばれた1種以上の成分に対する抗体また
は抗体分画を不溶化させた後、該抗体または抗体分画と
、被測定物質である該選ばれた1種以上の成分との間の
抗原抗体反応には全く関与しない物質でシート状固相を
コートする請求項2〜9のいずれかに記載の微量の乳頭
分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法。 - (11)前記識別可能な標識剤が酵素であり、前記標識
物の測定が、該酵素の酵素反応の結果、増加するか、も
しくは、減少する物質量の測定によってなされる請求項
1〜10のいずれかに記載の微量の乳頭分泌液中の腫瘍
関連抗原の測定方法。 - (12)前記特定物質濃度の測定が、肉眼または物理的
方法を用いて半定量的にもしくは定性的に行なわれる請
求項1〜11のいずれかに記載の微量の乳頭分泌液中の
腫瘍関連抗原の測定方法。 - (13)前記特定物質濃度の測定が、物理的に定量的に
行なわれる請求項1〜11のいずれかに記載の微量の乳
頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法。 - (14)シート状固相であって、該固相に、乳頭分泌液
中のCA15−3、CA125、CA72−4、CA5
4/61、CA602、CA19−9、TPA、MCA
、MSAおよびATM−1から選ばれた1種以上の成分
に対する抗原抗体反応のための少なくとも1つの反応領
域を有することを特徴とする微量の乳頭分泌液中の腫瘍
関連抗原の測定用器材。 - (15)前記反応領域に、前記CA15−3、CA12
5、CA72−4、CA54/61、CA602、CA
19−9、TPA、MCA、MSAおよびATM−1か
ら選ばれた1種以上の成分に対する抗体または抗体分画
が不溶化されている請求項14に記載の微量の乳頭分泌
液中の腫瘍関連抗原の測定用器材。 - (16)前記シート状固相が、さらに、前記選ばれた1
種以上の成分に対する抗体または抗体分画に識別可能な
標識剤を結合させた標識物を有する請求項15に記載の
微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定用器材。 - (17)前記シート状固相が、実質的に液体不透過性の
プラスチック製シートである請求項14〜16のいずれ
かに記載の微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定用
器材。 - (18)前記プラスチックが、ポリエステル、ポリプロ
ピレンまたはポリエチレンである請求項17に記載の微
量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定用器材。 - (19)前記シート状固相の前記反応領域が、該シート
状固相に設けられた凸部の枠で囲われている請求項14
〜18のいずれかに記載の微量の乳頭分泌液中の腫瘍関
連抗原の測定用器材。 - (20)前記シート状固相の前記反応領域が、該シート
状固相に設けられた凹部である請求項14〜18のいず
れかに記載の微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定
用器材。 - (21)前記識別可能な標識剤が、色素、放射性同位体
元素、酵素または蛍光物質のいずれかである請求項16
〜20のいずれかに記載の微量の乳頭分泌液中の腫瘍関
連抗原の測定用器材。 - (22)前記反応領域が、さらに、前記抗体または抗体
分画と被測定物質である前記選ばれた1種以上の成分と
の間の抗原抗体反応には実質上関与しない物質でコート
されてなる請求項15〜21のいずれかに記載の微量の
乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定用器材。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10104889A JPH02280061A (ja) | 1989-04-20 | 1989-04-20 | 微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法および測定用器材 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10104889A JPH02280061A (ja) | 1989-04-20 | 1989-04-20 | 微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法および測定用器材 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02280061A true JPH02280061A (ja) | 1990-11-16 |
Family
ID=14290241
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10104889A Pending JPH02280061A (ja) | 1989-04-20 | 1989-04-20 | 微量の乳頭分泌液中の腫瘍関連抗原の測定方法および測定用器材 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02280061A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999013917A1 (en) * | 1997-09-16 | 1999-03-25 | The Regents Of The University Of California | Methods and kits for identifying ductal orifices in a nipple |
WO1999055384A1 (en) * | 1998-04-28 | 1999-11-04 | The Regents Of The University Of California | Method and kit for obtaining fluids and cellular material from breast ducts |
FR2829579A1 (fr) * | 2001-09-11 | 2003-03-14 | Endogenics | Procede pour evaluer l'etat biologique d'un patient |
CN101377502A (zh) * | 2007-08-31 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 肿瘤相关抗原72-4化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
JP2012198125A (ja) * | 2011-03-22 | 2012-10-18 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法 |
-
1989
- 1989-04-20 JP JP10104889A patent/JPH02280061A/ja active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999013917A1 (en) * | 1997-09-16 | 1999-03-25 | The Regents Of The University Of California | Methods and kits for identifying ductal orifices in a nipple |
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FR2829579A1 (fr) * | 2001-09-11 | 2003-03-14 | Endogenics | Procede pour evaluer l'etat biologique d'un patient |
WO2003025564A1 (fr) * | 2001-09-11 | 2003-03-27 | Endogenics | Procede pour evaluer l'etat biologique d'un patient |
CN101377502A (zh) * | 2007-08-31 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 肿瘤相关抗原72-4化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
JP2012198125A (ja) * | 2011-03-22 | 2012-10-18 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法 |
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