ES2283343T3

ES2283343T3 - Metodos y materiales relacionados con polipeptidos y polinucleotidos similares al factor de crecimiento de celulas madre.

Info

Publication number: ES2283343T3
Application number: ES00990346T
Authority: ES
Inventors: Ivan Labat; Y. Tom Tang; Radoje T. Drmanac; Chenghua Liu; Juhi Lee; Nancy K. Mize; John Childs; Cheng-Chi Chao
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-23
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2020-12-23
Also published as: US20030211987A1; EP1248848A4; ATE355305T1; DE60033695T2; WO2001053500A1; EP1248848B1; CA2395443A1; MX245947B; WO2001053500A8; EP1248848A1; DE60033695D1; EP1683809A1; MXPA02006193A; US7317099B2

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, consistiendo dicho polipéptido en la secuencia aminoácida de SEQ ID NO: 25, o en un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 25, que tiene actividad de factor de crecimiento de células madre.

Description

Métodos y materiales relacionados con polipéptidos y polinucleótidos similares al factor de crecimiento de células madre.

1. Antecedentes 1.1 Campo técnico

La presente invención se refiere a nuevos polinucleótidos y proteínas codificadas por tales polinucleótidos, junto con usos para estos polinucleótidos y proteínas, por ejemplo en métodos terapéuticos, diagnósticos y de investigación. En particular, la invención se refiere a un nuevo polipéptido análogo a un factor de crecimiento de una célula madre.

1.2 Antecedentes de la técnica

Las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas identificadas tienen numerosas aplicaciones, por ejemplo en diagnóstico, medicina forense, mapeo génico, identificación de mutaciones responsables de trastornos genéticos u otras características, para valorar la biodiversidad y para producir muchos otros tipos de datos y productos dependientes de secuencias de ADN y aminoácidas. Se sabe que las proteínas tienen actividad biológica, por ejemplo en virtud de su naturaleza secretada en el caso de clonación de la secuencia guía, en virtud de su fuente celular o tisular en el caso de técnicas basadas en PCR, o en virtud de su similitud estructural respecto a otros genes de actividad biológica conocida. A estos polipéptidos y a los polinucleótidos que los codifican es a los que se dirige la invención. En particular, esta invención se dirige a nuevos polinucleótidos y polipéptidos análogos al factor de crecimiento de células madre.

Las células madre se definen como células con capacidad de autorrenovación ilimitada o prolongada, que pueden producir al menos un tipo de descendiente muy diferenciado. Se cree que entre las células madre y su progenie diferenciada hasta el final, hay una población intermedia de progenitores comprometidos con capacidad limitada y potencial de diferenciación restringido (Watt y Hogan, (2000) Science 287, 1427-1430). La división y diferenciación de las células madre embrionarias originan todas las células y órganos de un organismo multicelular. Durante la vida adulta de un organismo se mantiene una reserva de células madre a fin de reponer las poblaciones diferenciadas hasta el final, como las células hematopoyéticas. Se asume generalmente que las células madre adultas se derivan de las células madre embrionarias, y tienen sólo un potencial de diferenciación limitado. Las células madre han sido en general extremadamente difíciles de cultivar y mantener in vitro, y más aún de dirigirlas a una vía de diferenciación predeterminada.

Sin embargo, más recientemente nuevas investigaciones han demostrado que las células madre adultas poseen un potencial para diferenciación mucho más amplio de lo que se había pensado previamente. Se demostró que células madre neuronales adultas, cuando se trasplantaban a un huésped irradiado, eran capaces de poblar la médula ósea y producir células mieloides, linfoides y hepatopoyéticas tempranas (Bjornson et al, (1999) Science, 283, 534-537). También, por primera vez, los investigadores han sido capaces de cultivar células madre embrionarias humanas in vitro. Los autores mostraron que se pueden cultivar blastocitos humanos durante un tiempo prolongado y se podrían diferenciar en diversos tipos celulares diferentes (Thomson et al. (1998), Science, 282, 1145-1147). Esto ha abierto las puertas para el uso de trasplante autólogo y regeneración orgánica para tratamiento de insuficiencias orgánicas y enfermedades degenerativas. Se requieren interacciones precisas de múltiples receptores sobre las células madre con factores solubles y expresados por las células estromales, para que una célula madre se divida y se destine a la diferenciación. Se ha puesto de manifiesto que los nichos tisulares y el microambiente que proporciona los factores son de la máxima importancia. Se ha demostrado que las citoquinas como IL-3, IL-6 e IL-7, y las proteínas hidrosolubles de ese tipo, y flt-3, eritropoyetina y factor de células madre, actúan todos de acuerdo para lograr la diferenciación bajo una vía específica. Se cree que combinaciones precisas de factores de crecimiento, citoquinas y localización tisular podrían producir diferentes poblaciones de células madre diferenciadas.

Por tanto, los polipéptidos y polinucleótidos análogos al factor de crecimiento de células madre de la invención, se pueden usar para inducir la diferenciación de células madre embrionarias y adultas, para producir diferentes tipos celulares. También se pueden usar en el tratamiento de la leucemia, hemofilia y enfermedades degenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden usar además para generar nuevos tejidos y órganos que pueden ayudar a pacientes que precisen tejidos trasplantados.

2. Sumario de la invención

Esta invención se basa en el descubrimiento de nuevos polipéptidos análogos al factor de crecimiento de células madre, nuevos polinucleótidos aislados que codifican tales polipéptidos, incluyendo moléculas de ADN recombinantes, genes clonados o sus variantes degeneradas, especialmente variantes existentes en la naturaleza, como variantes alélicas, moléculas de polinucleótido antisentido, y anticuerpos que reconocen específicamente uno o más epítopes presentes en tales polipéptidos, así como hibridomas que producen tales anticuerpos. Específicamente, los polinucleótidos de la presente invención están basados en polinucleótidos aislados de bibliotecas de ADNc preparadas a partir de hígado fetal humano, bazo, ovario, cerebro adulto, tumor pulmonar, médula espinal, cuello uterino, ovario, células endoteliales, cordón umbilical, linfocito, fibroblastos pulmonares, cerebro fetal y testículos.

Según la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, consistiendo dicho polipéptido en la secuencia aminoácida SEQ ID NO: 25 o un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 25, que tiene actividad de factor de crecimiento de células madre.

Preferiblemente, el polinucleótido es una secuencia de ADN.

Asimismo, se proporciona por este aspecto de la presente invención un polinucleótido aislado que comprende el complemento de un polinucleótido de la invención.

Asimismo, la presente invención proporciona un vector que comprende el complemento de un polinucleótido de la invención, un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la invención, así como una célula hospedadora obtenida mediante ingeniería genética para expresar un polinucleótido de la invención. Con respecto a las células hospedadoras, el polinucleótido está preferiblemente en asociación operativa con una secuencia reguladora que controla la expresión del polinucleótido en la célula hospedadora.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido aislado que tiene actividad de factor de crecimiento de células madre, consistiendo dicho polipéptido en la secuencia aminoácida de SEQ ID NO: 25, o un polipéptido que tiene al menos 90% de homología con la misma.

Asimismo, este aspecto de la presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención y un vehículo.

Además, la presente invención proporciona un método in vitro para detectar un polinucleótido de la invención en una muestra, que comprende:

(a): poner en contacto la muestra, bajo condiciones de hibridación estrictas, con cebadores de ácido nucleico que hibridan con el polinucleótido de la invención bajo tales condiciones;

(b): amplificar un producto formado por el polinucleótido de la invención; y

(c): detectar dicho producto y, por tanto, el polinucleótido de la invención, en la muestra.

Preferiblemente, el polinucleótido comprende una molécula de ARN y el método comprende además transcribir inversamente una molécula de ARN hibridada, produciendo un polinucleótido de ADNc.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método in vitro para detectar un polipéptido de la invención en una muestra, que comprende:

(a): poner en contacto la muestra con un compuesto que se une al polipéptido y forma un complejo con el mismo, bajo condiciones y durante un período suficiente para formar el complejo, siendo el compuesto un anticuerpo específico para un polipéptido de la invención; y

(b): detectar la formación del complejo de forma que, si se detecta la formación de un complejo, se detecta un polipéptido de la invención.

La presente invención proporciona además un método in vitro para identificar un compuesto que se une a un polipéptido de la invención, que comprende:

(a): poner en contacto el compuesto con el polipéptido de la invención bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para formar un complejo polipéptido/compuesto; y

(b): detectar el complejo, de forma que si se detecta el complejo polipéptido/compuesto, se identifica un compuesto que se une al polipéptido de la invención.

Según este aspecto de la presente invención, se proporciona además un método in vitro para identificar un compuesto que se une a un polipéptido de la invención, que comprende:

(a): poner en contacto el compuesto con el polipéptido de la invención en una célula durante un tiempo suficiente para formar un complejo polipéptido/compuesto, en el que el complejo dirige la expresión de una secuencia génica informadora en la célula; y

(b): detectar el complejo detectando la expresión de la secuencia génica informadora, de forma que si se detecta el complejo polipéptido/compuesto, se identifica un compuesto que se une al polipéptido de la invención.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método in vitro para producir un polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre, que comprende:

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(a): cultivar una célula hospedadora de la invención bajo condiciones suficientes para expresar el polipéptido en dicha célula; y

(b): aislar el polipéptido del cultivo celular o células de la etapa (a).

Según aspectos adicionales de la invención, se proporciona un kit que comprende un polipéptido de la invención y una matriz de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido de la invención unido a una superficie. Preferiblemente, la matriz detecta apareamientos totales con el polinucleótido de la invención, o la matriz detecta desapareamientos con el polinucleótido de la invención.

Según la presente invención, se proporciona además una composición que comprende:

(a): una cantidad terapéutica de un polipéptido según la invención; o

(b): una cantidad terapéutica de un polinucleótido que codifica un polipéptido según la invención, en una forma y bajo condiciones tales que se produzca el polipéptido, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para uso como medicamento. Preferiblemente, el medicamento está destinado a incrementar la actividad o expresión del polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre de la invención.

Según este aspecto de la presente invención, se proporciona asimismo una composición que comprende una cantidad terapéutica de un polinucleótido que inhibe la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de la invención, para uso como medicamento. Preferiblemente, el medicamento está destinado a inhibir la actividad o expresión del polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre de la invención.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de una composición seleccionada del grupo formado por:

a): una composición que comprende una cantidad terapéutica de un polipéptido que tiene actividad de factor de crecimiento de células madre, y que comprende la secuencia aminoácida de SEQ ID NOs: 25, 28, 31, 34 o 35; y

b): una composición que comprende una cantidad terapéutica de un polinucleótido que codifica dicho polipéptido, en una forma y bajo condiciones tales que se produzca ese polipéptido

en la fabricación de un medicamento para incrementar la actividad del factor de crecimiento de células madre, en un sujeto que lo precise.

Según este aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una composición que comprende una cantidad terapéutica de un polinucleótido que inhibe la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene actividad de factor de crecimiento de células madre y que comprende la secuencia aminoácida de SEQ ID NOs: 25, 28, 31, 34 o 35, en la fabricación de un medicamento para inhibir la actividad de factor de crecimiento de células madre, en un sujeto que lo precise.

Las composiciones aquí descritas, incluyen adicionalmente vectores, como vectores de expresión, que contienen los polinucleótidos descritos, células obtenidas mediante ingeniería genética que contienen tales polinucleótidos, y células obtenidas mediante ingeniería genética para expresar tales polinucleótidos.

Se describen aquí polinucleótidos aislados que incluyen, pero no están limitados a, un polinucleótido que comprende la secuencia nucleotídica indicada en SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 O 33; o un fragmento de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33; un polinucleótido que comprende la secuencia codificadora de la proteína completa de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 O 33 (por ejemplo, SEQ ID NO: 23, 25 o 28); y un polinucleótido que comprende la secuencia nucleotídica de la secuencia codificadora de la proteína madura de cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33. Los polinucleótidos aquí descritos incluyen también, pero no están limitados a, un polinucleótido que hibrida, bajo condiciones de hibridación estrictas, con: (a) el complemento de cualquiera de las secuencias nucleotídicas indicadas en SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33; (b) una secuencia nucleotídica que codifica cualquiera de SEQ ID NO: 23, 25, 28, 30-32, 34 o 35; un polinucleótido que es una variante alélica de cualquiera de los polinucleótidos citados anteriormente, que tenga al menos 70% de identidad de secuencia polinucleotídica respecto a dichos polinucleótidos; un polinucleótido que codifica un homólogo específico (p.ej. ortólogos) de cualquiera de los polipéptidos citados anteriormente; o un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un dominio específico o truncamiento del polipéptido que comprende SEQ ID NO: 23, 25, 28 o 31.

Una colección según se usa en esta solicitud, puede ser una colección de sólo un polinucleótido. La colección de información de secuencia o información de identificación única de cada secuencia se puede proporcionar en una matriz de ácidos nucleicos. En una realización de la invención, se proporcionan segmentos de información de secuencia sobre una matriz de ácidos nucleicos para detectar el polinucleótido que contiene el segmento. La matriz se puede diseñar para detectar apareamiento total o desapareamiento del polinucleótido que contiene el segmento. La colección se puede proporcionar también en un formato legible por ordenador.

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Además, se describen vectores de clonación o expresión que comprenden al menos un fragmentos de los polinucleótidos indicados anteriormente y células hospedadoras u organismos transformados con estos vectores de expresión. Vectores útiles incluyen plásmidos, cósmidos, derivados de fagos lambda, fagémidos y análogos, que se conocen bien en la técnica. Consecuentemente, también se describe un vector que incluye un polinucleótido descrito y una célula hospedadora que contiene el polinucleótido. En general, el vector contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios para endonucleasas de restricción convenientes, y un marcador seleccionable para la célula hospedadora. Los vectores aquí descritos incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de producción de sondas, y vectores de secuenciación. La célula hospedadora puede ser una célula procariótica o eucariótica y puede ser un organismo unicelular o parte de un organismo multicelular.

Las composiciones aquí descritas incluyen polipéptidos que comprenden, pero no están limitados a, un polipéptido aislado seleccionado del grupo que comprende la secuencia aminoácida de SEQ ID NO: 23, 25, 28, 30-32, 34 o 35; o la correspondiente proteína completa o madura. Los polipéptidos aquí descritos también incluyen polipéptidos con actividad biológica codificados por (a) cualquiera de los polinucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica indicada en SEQ ID NO: 1-22, 34, 26-27, 29 o 33; o (b) polinucleótidos que hibridan con el complemento de los polinucleótidos de (a), bajo condiciones de hibridación estrictas. También se consideran variantes biológica o inmunológicamente activas de cualquiera de las secuencias de proteínas enumeradas como SEQ ID NO: 23, 25, 28, 30-32, 34 o 35, y sus equivalentes sustanciales que mantengan actividad biológica o inmunológica. Los polipéptidos se pueden sintetizar químicamente parcial o totalmente, pero se producen preferiblemente mediante métodos recombinantes, usando las células aquí descritas, obtenidas mediante ingeniería genética (p.ej. células hospedadoras).

También se describen composiciones que comprenden un polipéptido descrito. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender el polipéptido descrito y un vehículo aceptable, como p.ej un vehículo hidrófilo, farmacéuticamente aceptable.

Se describen métodos para producir los polipéptidos descritos, que comprenden cultivar células hospedadoras que comprenden un vector de expresión que contiene al menos un fragmento de un polinucleótido que codifica el polipéptido de interés, en un medio de cultivo adecuado, bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido deseado, y purificar la proteína o péptido a partir del cultivo o de las células hospedadoras. Realizaciones preferidas incluyen aquéllas en las que la proteína producida mediante tal procedimiento es una forma madura de la proteína.

Los polinucleótidos según la invención tienen numerosas aplicaciones en diversas técnicas conocidas por los expertos en la técnica de la biología molecular. Estas técnicas incluyen el uso como sondas de hibridación, como oligómeros o cebadores para PCR, en matrices, en medios legibles por ordenador, para mapeo cromosómico y génico, en la producción recombinante de proteína y en la producción de ADN o ARN antisentido, sus análogos químicos y similares. Por ejemplo, cuando la expresión de un ARNm está altamente restringida a una célula o tipo de tejido particular, los polinucleótidos de la invención se pueden usar como sondas de hibridación para detectar la presencia del ARNm de la célula o tejido particular en una muestra, usando, p.ej., hibridación in situ.

En otras realizaciones ejemplares, los polinucleótidos se usan en diagnóstico, como marcadores de secuencia expresada para identificar genes expresados o, según se conoce bien en la técnica y se ejemplifica por Vollrath et al, Science 258:52-59 (1992), como marcadores de secuencia expresada para mapeo físico del genoma humano.

Los polipéptidos según la invención se pueden usar en diversos procedimientos y métodos convencionales, que se aplican actualmente a otras proteínas. Por ejemplo, un polipéptido de la invención se puede usar para producir un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido. Tales anticuerpos, particularmente los anticuerpos monoclonales, son útiles para detectar o cuantificar el polipéptido en el tejido. Los polipéptidos de la invención se pueden usar asimismo como marcadores de peso molecular, y como complementos alimentarios.

Se describen también métodos para prevenir, tratar o mejorar un estado médico, que comprenden la etapa de administrar a un sujeto mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un péptido aquí descrito, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En particular, los polipéptidos y polinucleótidos análogos al factor de crecimiento de las células madre, se pueden usar para inducir la diferenciación de células madre embrionarias y adultas, para originar diferentes tipos celulares. También se pueden usar en el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, leucemia, hemofilia y enfermedades degenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden utilizar adicionalmente para producir nuevos tejidos y órganos que pueden ayudar a pacientes que precisen tejidos trasplantados.

También se describen métodos para el tratamiento de trastornos según se enumeran aquí, que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un polinucleótido o polipéptido de la memoria descriptiva y un vehículo farmacéuticamente aceptable, a un sujeto mamífero que presenta síntomas o tendencias relacionadas con los trastornos según se enumeraron aquí. Además, se consideran métodos para tratar enfermedades o trastornos según se enumeraron aquí, que comprenden la etapa de administrar una composición que comprende compuestos y otras sustancias que modulen la actividad total de los productos génicos afectados, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Compuestos y otras sustancias pueden efectuar tal modulación, bien en el nivel de la expresión del gen/proteína afectado, o bien en la actividad de la proteína afectada. Específicamente, se describen métodos para prevenir, tratar o mejorar un estado médico, incluyendo enfermedades víricas, que comprenden administrar a un sujeto mamífero, incluyendo pero no limitado a seres humanos, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un polipéptido descrito aquí, o una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende una pareja de unión (p.ej., anticuerpo específicamente reactivo para) polipéptidos aquí descritos, análogos al factor de crecimiento de células madre. La mecánica del estado o patología particular dictará si los polipéptidos o parejas de unión (o inhibidores) de éstos, serían beneficiosos para el individuo que precisa el tratamiento.

Según este método, los polipéptidos se pueden administrar para producir una inhibición in vitro o in vivo de la función celular. El polipéptido se puede administrar in vivo, solo o como auxiliar a otras terapias. Inversamente, se pueden incluir proteínas u otros ingredientes activos descritos aquí, en formulaciones de una sustancia particular, para minimizar los efectos secundarios de tal sustancia.

La invención describe asimismo métodos para fabricar medicamentos útiles en los métodos descritos anteriormente.

La presente invención se refiere asimismo a métodos para detectar la presencia de los polinucleótidos o polipéptidos aquí descritos, en una muestra (p.ej., tejido o muestra). Tales métodos se pueden utilizar, p.ej., como parte de la evaluación prognóstica y diagnóstica de trastornos según se enumeraron aquí, y para la identificación de sujetos que presentan una predisposición a tales trastornos.

Se describe aquí un método para detectar un polipéptido de la solicitud en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con un compuesto que se une al polipéptido y forma un complejo con el mismo, bajo condiciones y durante un período suficiente para formar el complejo, y detectar la formación del complejo, de forma que, si se forma un complejo, se detecta el polipéptido.

La invención se refiere asimismo a kits que comprenden sondas polinucleotídicas y/o anticuerpos monoclonales y, opcionalmente, estándares cuantitativos, para realizar los métodos aquí descritos. Asimismo, se describen métodos para evaluar la eficacia de fármacos y controlar el progreso de pacientes, implicados en ensayos clínicos para el tratamiento de trastornos según se enumeraron anteriormente.

Se describen asimismo métodos para la identificación de compuestos que modulan (p.ej. incrementan o disminuyen) la expresión o actividad de los polinucleótidos y/o polipéptidos aquí descritos. Tales métodos se pueden utilizar, por ejemplo, para la identificación de compuestos que mejoran los síntomas de trastornos según se enumeraron aquí. Tales métodos pueden incluir, pero no están limitados a, ensayos para identificar compuestos y otras sustancias que interaccionan con (p.ej. se unen a) polipéptidos de la solicitud.

Se describe un método para identificar un compuesto que se une a un polipéptido de la solicitud, que comprende poner en contacto el compuesto con el polipéptido, bajo condiciones y durante suficiente tiempo para formar un complejo polipéptido/compuesto, y detectar el complejo, de forma que, si se detecta el complejo polipéptido/compuesto, se identifica un compuesto que se une al polipéptido.

Asimismo, se describe un método para identificar un compuesto que se une al polipéptido, que comprende poner en contacto el compuesto con el polipéptido en una célula, durante un tiempo suficiente para formar un complejo polipéptido/compuesto, en el que el complejo dirige la expresión de una secuencia génica informadora en la célula, y detectar el complejo detectando expresión de la secuencia génica informadora, de forma que, si se detecta el complejo polipéptido/compuesto, se identifica un compuesto que se une al polipéptido.

3. Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el alineamiento esquemático de SEQ ID NO: 24 con SEQ ID NO: 1-21.

La Figura 2 muestra el alineamiento de secuencia aminoácida de BLASTX entre el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre SEQ ID NO: 28, y la proteína precursora del marcador 7 de tumor endotelial SEQ ID NO: 36 (St. Croix et al, Science 289, 1197-1201), indicando que las dos secuencias comparten 72% de similitud sobre 441 residuos aminoácidos, y 57% de identidad sobre los mismos 441 residuos aminoácidos; en la que A = alanina,
C = cisteína, D = ácido aspártico, E = ácido glutámico, F = fenilalanina, G = glicina, H = histidina, I = isoleucina, K = lisina, L = leucina, M = metionina, N = asparagina, P = prolina, Q = glutamina, R = arginina, S = serina, T = treonina, V = valina, W = triptófano, Y = tirosina. Los apareamientos se representan como guiones.

4. Descripción detallada de la invención

El polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre de SEQ ID NO: 28 es una proteína de aproximadamente 529 aminoácidos, con una masa molecular predicha de aproximadamente 59,2 kDa, no glicosilada. Búsquedas en la base de datos de proteínas con el algoritmo BLASTP (Altschul S.F. et al. J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993) y Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol. 21:403-10 (1990), incorporados aquí mediante referencia), indican que la SEQ ID NO: 28 es homóloga a la proteína precursora del marcador 7 de tumor endotelial.

La Figura 2 muestra el alineamiento de secuencia aminoácida de BLASTX entre la proteína codificada por el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre SEQ ID NO: 28 y la proteína precursora del marcador 7 de tumor endotelial SEQ ID NO: 36 (St. Croix et al, Science, 289, 1197-1201), indicando que las dos secuencias comparten 72% de similitud sobre 441 residuos aminoácidos y 57% de identidad sobre los mismos 441 residuos aminoácidos.

Aproximadamente desde el residuo 1 hasta el residuo 30 de SEQ ID NO: 28 (SEQ ID NO: 30) se codifica un péptido señal predicho de aproximadamente treinta residuos. La parte extracelular es útil por sí misma. Esto se puede confirmar mediante expresión en células de mamíferos y secuenciación del producto escindido. La región del péptido señal se predijo usando el programa Neural Network SignalP V1.1 (Nielsen et al, (1997) Int. J. Neurl Syst. 8, 581) (del Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University de Dinamarca), y análisis de hidrofobicidad usando el algoritmo de Kyte/Doolittle (Kyte y Doolittle (1982), J. Mol. Biol. 157, 105). Un experto en la técnica reconocerá que el sitio de escisión puede ser diferente del predicho por el programa de ordenador. SEQ ID NO: 31 es el péptido resultante cuando el péptido señal se elimina de SEQ ID NO: 28.

Desde aproximadamente el residuo 452 hasta el residuo 479 de SEQ ID NO: 28 (SEQ ID NO: 32) se codifica una región transmembranar predicha de aproximadamente veintiocho residuos. Esto se puede confirmar mediante expresión en células de mamíferos. La región transmembranar se predijo usando el programa Neural Network Signal P V1.1 (Nielsen et al., (1997) Int. J. Neur. Syst. 8, 581) (de Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University de Dinamarca), y análisis de hidrofobicidad usando el algoritmo de Kyte/Doolittle (Kyte y Doolittle (1982), J. Mol. Biol. 157, 105). Un experto en la técnica reconocerá que la región transmembranar puede ser diferente de la predicha por el programa de ordenador.

El polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre SEQ ID NO: 25 (idéntico a SEQ ID NO: 23) es una proteína de aproximadamente 392 aminoácidos, con una masa molecular predicha de aproximadamente 50 kDa, sin glucosilar. Búsquedas en bases de datos de proteínas con el algoritmo BLASTP (Altschul S.F. et al., J. Mol. Evol., 36:290-300 (1993) y Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol., 21:403-10 (1990), incorporados aquí mediante referencia), indican que SEQ ID NO: 25 es homóloga a la proteína precursora del marcador 7 de tumor endotelial.

Aproximadamente desde el residuo 315 hasta el residuo 342 de SEQ ID NO: 25 (SEQ ID NO: 32) se codifica una región transmembranar de aproximadamente veintiocho residuos. Esto se puede confirmar mediante expresión en células de mamíferos. La región transmembranar se predijo usando el programa Neural Network SignalP V1.1 (Nielsen et al, (1997) Int. J. Neurl Syst. 8, 581) (del Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University de Dinamarca), y análisis de hidrofobicidad usando el algoritmo de Kyte/Doolittle (Kyte y Doolittle (1982), J. Mol. Biol. 157, 105). Un experto en la técnica reconocerá que la región transmembranar puede ser diferente de la predicha por el programa de ordenador.

En particular, los polipéptidos y polinucleótidos de la invención análogos al factor de crecimiento de células madre, se pueden usar para inducir la diferenciación de células madre embrionarias y adultas, para producir diferentes tipos celulares. También se pueden usar en el tratamiento de la leucemia, hemofilia y enfermedades degenerativas análogos a la enfermedad de Alzheimer. Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden usar asimismo para producir nuevos tejidos y órganos que pueden ayudar a pacientes que precisen tejidos trasplantados.

4.1 Definiciones

Es necesario destacar que, según se usan en la presente memoria descriptiva, y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un/a" "el/la", incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

El término "activa" se refiere a aquellas formas del polipéptido que mantienen las actividades biológicas y/o inmunológicas de cualquier polipéptido presente en la naturaleza. Según la invención, los términos "biológicamente activo" o "actividad biológica", se refieren a una proteína o péptido que tiene las funciones estructurales, reguladoras o bioquímicas de una molécula presente en la naturaleza. Igualmente, "biológicamente activo" o "actividad biológica" se refiere a la capacidad del polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre natural, recombinante o sintético, o a cualquiera de sus péptidos, para inducir una respuesta biológica específica en animales o células apropiados, y de unirse con anticuerpos específicos. El término "actividad biológica análoga al factor de crecimiento de células madre" se refiere a una actividad biológica que es similar a la actividad biológica de un análogo al factor de crecimiento de células madre.

El término "células activadas", según se usa en esta solicitud, se refiere a aquellas células que están implicadas en el tráfico extracelular o intracelular de la membrana, incluyendo la exportación de moléculas secretoras o enzimáticas, como parte de un proceso normal o de enfermedad.

Los términos "complementario" o "complementariedad" se refieren a la unión natural de polinucleótidos mediante apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia 5'-AGT-3' se une a la secuencia complementaria 3'-TCA-5'. La complementariedad entre dos moléculas monocatenarias puede ser "parcial", de forma que sólo parte de los ácidos nucleicos se une, o puede ser "completa", de forma que existe una complementariedad total entre las moléculas monocatenarias. El grado de complementariedad entre las hebras de ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficiencia y fuerza de la hibridación entre las hebras de ácido nucleico.

El término "células madre embrionarias (ES)" se refiere a una célula que puede originar muchos tipos celulares diferenciados en un embrión o en un adulto, incluyendo las células germinales. El término "células madre de la línea germinal (GSCs)" se refiere a células madre derivadas de células madre primarias, que proporcionan una fuente continua y constante de células germinales para la producción de gametos. El término "células germinales primordiales (PGCs)" se refiere a una pequeña población de células apartadas de otros linajes celulares particularmente procedentes del saco vitelino, mesentéreo o surcos gonadales durante la embriogénesis, que tienen el potencial de diferenciarse en células germinales y otras células. Las PGCs son la fuente de la que derivan las células GSCs y ES. Las células PGCs, GSCs y ES son capaces de autorrenovarse. Por tanto, estas células no solo pueblan la línea germinal y originan una pluralidad de células diferenciadas terminalmente comprendidas en los órganos especializados adultos, sino que son capaces de regenerarse a sí mismas. El término "totipotente" se refiere a la capacidad de una célula de diferenciarse en todos los tipos celulares de un organismo adulto. El término "pluripotente" se refiere a la capacidad de una célula de diferenciarse en diversos tipos celulares diferenciados que están presentes en un organismo adulto. Una célula pluripotente está restringida en su capacidad de diferenciación, en comparación con una célula totipotente.

El término "fragmento modulador de expresión", EMF, significa una serie de nucleótidos que modulan la expresión de un ORF ligado operativamente, u otro EMF.

Según se usa aquí, se dice que una secuencia "modula la expresión de una secuencia ligada operativamente", cuando la expresión de la secuencia se altera por la presencia del EMF. Los EMFs incluyen, pero no están limitados a, promotores y secuencias moduladoras de promotores (elementos inducibles). Una clase de EMFs son fragmentos de ácidos nucleicos que inducen la expresión de un ORF ligado operativamente, en respuesta a un factor regulador específico o a un suceso fisiológico.

Los términos "secuencia nucleotídica" o "ácido nucleico" o "polinucleótido" u "oligonucleótido", se usan indistintamente, y se refieren a un heteropolímero de nucleótidos o a la secuencia de estos nucleótidos. Estas frases se refieren también a ADN o ARN de origen genómico o sintético, que puede ser monocatenario o bicatenario y puede representar la hebra sentido o antisentido, a ácido nucleico peptídico (PNA), o a cualquier material análogo a ADN o ARN. En las secuencias, A es adenina, C es citosina, G es guanina y T es timina, mientras que N es A, T, G o C. Se considera que, cuando el polinucleótido es ARN, la T (timina) en la secuencia se puede reemplazar por U (uracilo). Generalmente, los segmentos de ácidos nucleicos aquí descritos se pueden ensamblar a partir de fragmentos del genoma y conectores oligonucleotídicos cortos, o a partir de series de oligonucleótidos, o de nucleótidos individuales, para proporcionar un ácido nucleico sintético que es capaz de expresarse en una unidad transcripcional recombinante que comprende elementos reguladores derivados de un operón microbiano o vírico, o de un gen eucariotico.

Los términos "fragmento oligonucleotídico" o "fragmento polinucleotídico", "parte", o "segmento" o "sonda" o "cebador", se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de residuos nucleotídicos que son al menos aproximadamente 5 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 7 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 9 nucleótidos, más preferiblemente aproximadamente 11 uncleótidos, y con la máxima preferencia aproximadamente 17 nucleótidos. El fragmento es preferiblemente inferior a aproximadamente 500 nucleótidos, preferiblemente inferior a aproximadamente 200 nucleótidos, más preferiblemente inferior a aproximadamente 100 nucleótidos, más preferiblemente inferior a aproximadamente 50 nucleótidos y, con la máxima preferencia, inferior a 30 nucleótidos. Preferiblemente, la sonda es de aproximadamente 6 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos, más preferiblemente de aproximadamente 17 a 30 nucleótidos y, con la máxima preferencia, de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos. Preferiblemente, los fragmentos se pueden usar en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), diversos procedimientos de hibridación o procedimientos de micromatrices para identificar o amplificar partes idénticas o relacionadas de moléculas de ARNm o ADN. Un fragmento o segmento puede identificar de forma unívoca cada secuencia polinucleotídica de la presente solicitud. Preferiblemente, el fragmento comprende una secuencia sustancialmente similar a una porción de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33.

Las sondas se pueden usar, por ejemplo, para determinar si moléculas de ARNm específicas están presentes en una célula o tejido, o para aislar secuencias de ácido nucleico similares de ADN cromosómico, según se describe por Walsh et al. (Walsh, P.S. et al., 1992, PCR Methods Appl., 1:241-250). Se pueden marcar mediante traslación de corte, reacción de relleno de Klenow, PCR u otros métodos bien conocidos en la técnica. En Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. o Ausubel F. M. et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, se estudian en detalle sondas, su preparación y/o marcaje.

Las secuencias de ácidos nucleicos aquí descritas también incluyen la información de secuencia de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33. La información de secuencia puede ser un segmento de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, que identifica o representa de manera unívoca la información de secuencia de SEQ ID NO: 1-22,24, 26-27, 29 o 33. Uno de tales segmentos puede ser una secuencia de ácido nucleico de 20 nucleótidos, porque la probabilidad de que una secuencia de 20 nucleótidos se aparee totalmente con el genoma humano es 1 de 300. En el genoma humano hay tres billones de pares de bases en un juego de cromosomas. Debido a que existen 4^{20} secuencias de 20 nucleótidos, hay 300 veces más secuencias de 20 unidades que pares de bases, en un juego de cromosomas humanos. Usando el mismo análisis, la probabilidad de que una secuencia de diecisiete nucleótidos se aparee totalmente con el genoma humano es aproximadamente 1 de 5. Cuando estos segmentos se usan en matrices para estudios de expresión, se pueden usar fragmentos de quince nucleótidos. La probabilidad de que la secuencia de quince nucleótidos se aparee totalmente en las secuencias expresadas es también aproximadamente una de cinco,
porque las secuencias expresadas comprenden menos de aproximadamente 5% de la secuencia genómica entera.

De forma similar, cuando se usa información de secuencia para detectar un único desapareamiento, un segmento puede ser una secuencia de veinticinco nucleótidos. La probabilidad de que la secuencia de veinticinco nucleótidos aparezca en un genoma humano con un único desapareamiento se calcula multiplicando la probabilidad para un apareamiento total (1/4^{25}) veces, por la probabilidad incrementada para desapareamiento en cada posición de nucleótido (3 x 25). La probabilidad de que una secuencia de dieciocho nucleótidos con un único desapareamiento se pueda detectar en una matriz para estudios de expresión es aproximadamente una de cinco. La probabilidad de que se puede detectar una secuencia de veinte nucleótidos con un solo desapareamiento en un genoma humano, es aproximadamente una de cinco.

El término "marco de lectura abierto", ORF, significa una serie de tripletes de nucleótidos que codifican aminoácidos sin ningún codón de terminación, y es una secuencia que se puede traducir en una proteína.

Los términos "ligado operativamente" o "asociado operativamente", se refieren a secuencias de ácidos nucleicos relacionadas funcionalmente. Por ejemplo, un promotor está asociado operativamente o ligado operativamente con una secuencia codificadora si el promotor controla la transcripción de la secuencia codificadora.

Mientras que las secuencias de ácidos nucleicos ligadas operativamente pueden ser contiguas y estar en el mismo marco de lectura, ciertos elementos génicos, p.ej. genes represores, no están ligados contiguamente a la secuencia codificadora, y sin embargo controlan la transcripción/traducción de la secuencia codificadora.

El término "pluripotente" se refiere a la capacidad de una célula de diferenciarse en varios tipos celulares diferenciados que están presentes en un organismo adulto. Una célula pluripotente está restringida en su capacidad de diferenciación respecto a una célula totipotente.

Los términos "polipéptido" o "péptido" o "secuencia aminoácida", se refieren a un oligopéptido, péptido, polipéptido o secuencia de proteína o uno de sus fragmentos, y a moléculas existentes en la naturaleza o sintéticas. Un "fragmento", "porción" o "segmento" polipeptídico es una extensión de residuos aminoácidos de al menos aproximadamente 5 aminoácidos, preferiblemente al menos 7 aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 9 aminoácidos y con la máxima preferencia al menos aproximadamente 17 o más aminoácidos. El péptido, preferiblemente, no es mayor que aproximadamente 200 aminoácidos, más preferiblemente menor que 150 aminoácidos, y con la máxima preferencia menor que 100 aminoácidos. Preferiblemente, el péptido es de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 aminoácidos. Para ser activo, cualquier polipéptido tiene que tener suficiente longitud para mostrar actividad biológica y/o inmunológica.

El término "polipéptido presente en la naturaleza" se refiere a polipéptidos producidos por células que no se han producido mediante ingeniería genética y, específicamente, considera diversos polipéptidos que surgen de las modificaciones postraducción del polipéptido incluyendo, pero no limitadas a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación.

El término "porción codificadora de proteína traducida" indica una secuencia que codifica la proteína completa, que puede incluir cualquier secuencia guía o una secuencia de procesamiento.

El término "secuencia codificadora de proteína madura" se refiere a una secuencia que codifica un péptido o proteína sin ninguna secuencia guía/señal. La "porción de proteína madura" se refiere a aquella porción de la proteína sin la secuencia guía/señal. Las secuencias guía del péptido se pueden eliminar durante el procesamiento en la célula, o la proteína puede haberse producido sintéticamente o usando un polinucleótido que sólo codifique la secuencia codificadora de la proteína madura. Se considera que la porción de proteína madura puede incluir o no un residuo de metionina inicial. La metionina inicial a menudo se elimina durante el tratamiento del péptido.

El término "derivado" se refiere a polipéptidos modificados químicamente mediante técnicas tales como ubiquitinación, marcaje (p.ej., con readionucleidos o diversas enzimas), unión covalente de polímeros, como pegilación (derivatización con polietilenglicol) e inserción o sustitución de aminoácidos como ornitina, que no están presentes normalmente en proteínas humanas, mediante síntesis química.

El término "variante" (o "análogo") se refiere a cualquier polipéptido que difiera de los polipéptidos presentes en la naturaleza en inserciones, eliminaciones y sustituciones de aminoácidos, creado usando, p.ej., técnicas de ADN recombinante. Se puede encontrar orientación para determinar qué residuos aminoácidos se pueden reemplazar, añadir o eliminar sin eliminar actividades de interés, comparando la secuencia del polipéptido particular con la de péptidos homólogos, y minimizando el número de cambios de secuencia aminoácida realizados en regiones de alta homología (regiones conservadas) o reemplazando aminoácidos con secuencias consenso.

Alternativamente, se pueden sintetizar o seleccionar variantes recombinantes que codifican polipéptidos iguales o similares, usando la "redundancia" del código genético. Se pueden introducir varias sustituciones de codones, como los cambios silentes que producen diversos sitios de restricción, para optimizar la clonación en un vector plasmídico o vírico, en un sistema procariótico eucariótico particular. Se pueden reflejar mutaciones en la secuencia polinucleotídica en el polipéptido o en dominios de otros péptidos añadidos al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido, para modificar características como las afinidades de unión a ligando, afinidades intercatenarias o velocidad de degradación/renovación.

Preferiblemente, las "sustituciones" de aminoácidos son el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, es decir, sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones "conservativas" de aminoácidos se pueden realizar basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenil-alanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las "inserciones" o "eliminaciones" están preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, más preferiblemente de 1 a 10 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar experimentalmente realizando sistemáticamente inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en una molécula polipeptídica, usando técnicas de ADN recombinante y analizando las variantes recombinantes resultantes para actividad.

Alternativamente, cuando se desea una alteración de función, se pueden producir inserciones, eliminaciones o alteraciones no conservativas mediante ingeniería genética, para producir polipéptidos alterados. Tales alteraciones pueden alterar, por ejemplo, una o más de las funciones biológicas o características bioquímicas de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, tales alteraciones pueden cambiar las características del polipéptido, como afinidades de unión a ligando, afinidades intercatenarias, o velocidad de degradación/renovación. Además, tales alteraciones se pueden seleccionar para producir polipéptidos que estén mejor adaptados para expresión, aumento a escala y similares, en las células hospedadoras elegidas para la expresión. Por ejemplo, los residuos de cisteína se pueden eliminar o sustituir con otro residuo aminoácido, a fin de eliminar puentes disulfuro.

Los términos "purificado" o "purificado sustancialmente", según se usan aquí, significan que el ácido nucleico o polipéptido indicado está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas, p.ej., polinucleótidos, proteínas y similares. En una realización de la invención, el polinucleótido o polipéptido se purifica, de forma que constituya al menos 95% en peso, más preferiblemente al menos 99% en peso, de las macromoléculas biológicas indicadas presentes (pero pueden estar presentes agua, tampones y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tengan un peso molecular inferior a 1000 daltons).

El término "aislado", según se usa aquí, se refiere a un ácido nucleico o polipéptido separado de al menos otro componente (p.ej., ácido nucleico o polipéptido), presente con el ácido nucleico o polipéptido en su fuente natural. En una realización, el ácido nucleico o polipéptido se encuentra sólo en presencia, si hay algo, de un disolvente, tampón, ion u otros componentes presentes normalmente en una solución de los mismos. Los términos "aislado" y "purificado" no abarcan ácidos nucleicos o polipéptidos presentes en su fuente natural.

El término "recombinante", según se usa aquí para referirse a un polipéptido o proteína, significa que un polipéptido o proteína se deriva de sistemas de expresión recombinantes (p.ej., microbianos, de insecto o mamífero). "Microbiano" se refiere a polipéptidos o proteínas recombinantes fabricados en sistemas de expresión bacterianos o fúngicos (p.ej., levadura). Como producto, "microbiano recombinante" define un polipéptido o proteína esencialmente exento de sustancias endógenas nativas y no acompañado de glucosilación nativa asociada. Los polipéptidos o proteínas expresados en la mayoría de los cultivos bacterianos, p.ej., E. coli, estarán exentos de modificaciones de glucosilación; los polipéptidos o proteínas expresados en levadura tendrán un patrón de gluosilación diferente, en general, de aquellos expresados en células de mamíferos.

El término "vehículo o vector de expresión recombinante" se refiere a un plásmido, fago, virus o vector, para expresar un polipéptido a partir de una secuencia de ADN(ARN). Un vehículo de expresión puede comprender una unidad transcripcional que comprende un conjunto de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o activadores; (2) una secuencia estructural o codificadora, que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína, y (3) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la transcripción. Las unidades estructurales destinadas al uso en sistemas de expresión de levadura o eucarióticos incluyen preferiblemente una secuencia guía, que permite la secreción extracelular de proteína traducida por una célula hospedadora. Alternativamente, cuando la proteína recombinante se expresa sin una secuencia guía o de transporte, puede incluir un residuo de metionina amino-terminal. Este residuo puede ser o no posteriormente escindido de la proteína recombinante expresada, para proporcionar un producto final.

El término "sistema de expresión recombinante" significa células hospedadoras que tienen una unidad transcripcional recombinante integrada de forma estable en el ADN cromosómico, o llevan la unidad transcripcional recombinante extracromosómicamente. Los sistemas de expresión recombinantes, según se definen aquí, expresarán polipéptidos o proteínas heterólogos, tras inducción de los elementos reguladores ligados al segmento de ADN o gen sintético destinado a expresarse. Este término significa también células hospedadoras que tienen integrado de forma estable un elemento o elementos genéticos recombinantes que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o activadores. Los sistemas de expresión recombinante, según se definen aquí, expresarán polipéptidos o proteínas endógenos a la célula, tras inducción de los elementos reguladores ligados con el segmento de ADN o gen endógeno destinado a expresarse. Las células pueden ser procarióticas o eucarióticas.

El término "secretada" incluye una proteína que se transporta a través o por medio de una membrana, incluyendo el transporte como resultado de secuencias señal en su secuencia aminoácida, cuando se expresa en una célula hospedadora adecuada. Las proteínas "secretadas" incluyen, sin limitación, proteínas secretadas total (p.ej., proteínas solubles), o parcialmente (p.ej., receptores) desde la célula en la que se expresan. Las proteínas "secretadas" también incluyen, sin limitación, proteínas que se transportan a través de la membrana del retículo endoplásmico. Las proteínas "secretadas" también pretenden incluir proteínas que contienen secuencias señal atípicas (p.ej., interleuquina-1 beta, véase Krasney, P.A. y Young, P.R. (1992), Cytokine 4(2): 134-143) y factores liberados de células dañadas (p.ej., antagonista del receptor de interleuquina-1, véase Arend, W.P. et al., (1998) Annu. Rev. Immunol., 16:27-55).

Cuando se desee, se puede diseñar un vector de expresión para que contenga una "secuencia señal o guía", que dirigirá el polipéptido a través de la membrana de una célula. Tal secuencia puede estar presente de forma natural en los polipéptidos aquí descritos, o ser proporcionada de fuentes de proteína heterólogas mediante técnicas de ADN recombinante.

El término "estrictas", se usa para referirse a condiciones que se consideran normalmente en la técnica como estrictas. Las condiciones estrictas pueden incluir condiciones muy estrictas (p.ej., hibridación con ADN unido a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecil sulfato sódico al 7% (SDS), EDTA 1mM a 65ºC y lavado en SSC 0,1X/SDS al 0,1% a 68ºC), y condiciones moderadamente estrictas (es decir, lavado en SSC 0,2X/SDS al 0,1% a 42ºC). En los Ejemplos se describen otras condiciones de hibridación ejemplares.

En casos de hibridación de desoxinucleótidos, condiciones de hibridación estrictas ejemplares adicionales, incluyen lavado en SSC 6X/pirofosfato sódico al 0,5% a 37ºC (para oligonucleótidos de 14 bases), 48ºC (para oligonucleótidos de 17 bases), 55ºC (para oligonucleótidos de 20 bases) y 60ºC (para oligonucleótidos de 23 bases).

Según se usa aquí, "sustancialmente equivalente" se puede referir tanto a secuencias nucleotídicas como aminoácidas, por ejemplo, una secuencia mutante, que varía respecto a una secuencia de referencia en una o más sustituciones, eliminaciones o adiciones, cuyo efecto neto no produce una diferencia funcional adversa entre las secuencias de referencia y de interés. Típicamente, tal secuencia equivalente sustancial varía respecto a una de las enumeradas aquí en no más de aproximadamente 35% (es decir, el número de sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de residuos individuales en una secuencia sustancialmente equivalente, comparada con la secuencia de referencia correspondiente, dividido por el número total de residuos en la secuencia sustancialmente equivalente, es aproximadamente 0,35 o inferior). Tal secuencia se dice que tiene 65% de identidad de secuencia con la secuencia enumerada. En una realización, una secuencia sustancialmente equivalente, p.ej., mutante, varía respecto a una secuencia enumerada en no más de 30% (70% de identidad de secuencia); en una variación de esta realización, en no más de 25% (75% de identidad de secuencia); en una variación adicional de esta realización, en no más de 20% (80% de identidad de secuencia), en una variación adicional de esta realización, en no más de 10% (90% de identidad de secuencia), y en una variación adicional de esta realización, en no más de 5% (95% de identidad de secuencia). Secuencias aminoácidas sustancialmente equivalentes, p.ej., mutantes, tienen preferiblemente al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia aminoácida enumerada, más preferiblemente al menos 90% de identidad de secuencia. Secuencias nucleotídicas sustancialmente equivalentes pueden tener porcentajes de identidad de secuencia inferiores, teniendo en cuenta, por ejemplo, la redundancia o degeneración del código genético. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica tiene al menos 65% de identidad, más preferiblemente al menos 75% de identidad y, con la máxima preferencia, al menos aproximadamente 95% de identidad. Para los fines de la invención, las secuencias que tienen actividad biológica sustancialmente equivalente y características de expresión sustancialmente equivalentes, se consideran sustancialmente equivalentes. Para los fines de determinar la equivalencia, no se debe considerar el truncamiento de la secuencia madura (p.ej., a través de una mutación que cree un codón de parada falso). La identidad de secuencia se puede determinar, p.ej., usando el método de Jotun Hein (Hein J. (1990) Methods Enzymol. 183:626-645). La identidad entre secuencias se puede determinar asimismo mediante otros métodos conocidos en la técnica, p.ej., variando las condiciones de hibridación.

El término "totipotente", se refiere a la capacidad de una célula de diferenciarse en todos los tipos celulares de un organismo adulto.

El término "transformación" significa introducir ADN en una célula hospedadora adecuada, de forma que el ADN sea replicable, bien como un elemento extracromosómico, o mediante integración cromosómica. El término "transfección", se refiere a la absorción de un vector de expresión por una célula hospedadora adecuada, ya sea que se exprese de hecho cualquier secuencia codificadora, o no. El término "infección" se refiere a la introducción de ácidos nucleicos en una célula hospedadora adecuada, mediante el uso de un virus o un vector vírico.

Según se usa aquí, un "fragmento modulador de absorción", UMF, significa una serie de nucleótidos que intervienen en la absorción de un fragmento de ADN ligado, en una célula. Los UMFs pueden identificarse fácilmente usando UMFs conocidos como secuencia destinataria o motivo destinatario, con los sistemas de ordenador descritos más adelante. La presencia y actividad de un UMF se puede confirmar uniendo el UMF potencial a una secuencia marcadora. La molécula de ácido nucleico resultante se incuba a continuación con un hospedador adecuado en condiciones apropiadas, y se determina la absorción de la secuencia marcadora. Según se describió anteriormente, un UMF incrementará la frecuencia de absorción de una secuencia marcadora ligada.

Cada uno de los términos anteriores está destinado a abarcar lo que se describe para cada uno, a menos que el contexto indique lo contrario.

4.2 Ácidos nucleicos

La invención se basa en el descubrimiento de un nuevo polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre, polinucleótidos que codifican el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre, y el uso de estas composiciones para el diagnóstico, tratamiento o prevención de cánceres y otros trastornos inmunológicos.

Los polinucleótidos aislados aquí descritos incluyen, pero no están limitados a, un polinucleótido que comprende cualquiera de las secuencias nucleotídicas de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33; un fragmento de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33; un polinucleótido que comprende la secuencia codificadora de la proteína completa de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33 (por ejemplo, que codifica SEQ ID NO: 23, 25 o 28); y un polinucleótido que comprende la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia codificadora de la proteína madura de los polinucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33. Los polinucleótidos incluyen también, pero no están limitados a, un polinucleótido que hibrida, en condiciones estrictas, con (a) el complemento de cualquiera de las secuencias nucleotídicas de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33; (b) un polinucleótido que codifica cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID Nº: 23, 25, 28, 30-32, 34 o 35; (c) un polinucleótido que es una variante alélica de cualquier polinucleótido citado anteriormente; (d) un polinucleótido que codifica una especie homóloga a cualquiera de las proteínas citadas anteriormente; (e) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un dominio específico o truncamiento de los polipéptidos de SEQ ID NO: 23, 25, 28, 30-32, 34 o 35. Los dominios de interés pueden depender de la naturaleza del polipéptido codificado: p.ej., dominios en polipéptidos análogos a receptores incluyen dominios de unión a ligando, extracelulares, transmembranares o citoplásmicos, o sus combinaciones; dominios en proteínas análogas a inmunoglobulina incluyen los dominios variables análogos a inmunoglobulina; dominios en polipéptidos análogos a enzimas incluyen dominios catalíticos y de unión a sustrato; y dominios en polipéptidos ligando incluyen dominios de unión a receptor.

Los polinucleótidos aquí descritos incluyen ADN presente en la naturaleza o total o parcialmente sintético, p.ej., ADNc y ADN genómico, y ARN, p.ej., ARNm. Los polinucleótidos pueden incluir toda la región codificadora del ADNc, o pueden representar una parte de la región codificadora del ADNc.

La presente invención también se refiere a genes que corresponden a las secuencias de ADNc aquí descritas. Los genes correspondientes se pueden aislar de acuerdo con métodos conocidos, usando la información de secuencia aquí descrita. Tales métodos incluyen la preparación de sondas o cebadores a partir de la información de secuencia descrita para identificación y/o amplificación de genes en genotecas apropiadas u otras fuentes de materiales genómicos. Se pueden obtener secuencias 5' y 3' adicionales usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede obtener ADNc o ADN genómico completo, que corresponda a cualquiera de los polinucleótidos de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, escrutando genotecas de ADNc o ADN genómico apropiadas, bajo condiciones de hibridación adecuadas, usando cualquiera de los polinucleótidos de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26.27, 29 o 33, o una de sus partes como sonda. Alternativamente, los polinucleótidos de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, se pueden usar como base para un cebador o cebadores adecuados que permitan la identificación y/o amplificación de genes en genotecas de ADN genómico o ADNc apropiadas.

Las secuencias de ácido nucleico aquí descritas se pueden ensamblar a partir de ESTs y secuencias (incluyendo ADNc y secuencias genómicas) obtenidas de una o más bases de datos públicas, como dbEST, gbpri, y UniGene. Las secuencias EST pueden proporcionar información identificadora de secuencia, información de fragmentos o segmentos significativos, o información de segmentos nuevos para el gen completo.

Asimismo, se describen polinucleótidos que incluyen secuencias nucleotídicas que son sustancialmente equivalentes a los polinucleótidos descritos anteriormente. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden tener al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% o 89%, más típicamente al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93% o 94%, e incluso más típicamente al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia respecto a un polinucleótido descrito anteriormente.

Asimismo, se describen fragmentos de secuencias de ácidos nucleicos que hibridan, en condiciones estrictas, con cualquiera de las secuencias nucleotídicas de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, o sus complementos, siendo dicho fragmento superior a aproximadamente 5 nucleótidos, preferiblemente 7 nucleótidos, más preferiblemente superior a 9 nucleótidos y, con la máxima preferencia, superior a 17 nucleótidos. Se consideran fragmentos, p.ej., de 15, 17 o 20 nucleótidos o más, que son selectivos para (es decir, hibridan específicamente con uno cualquiera de los polinucleótidos descritos). Las sondas capaces de hibridar específicamente con un polinucleótido, pueden diferenciar las secuencias polinucleotídicas aquí descritas de otras secuencias polinucleotídicas en la misma familia de genes, o pueden diferenciar genes humanos de genes de otras especies, y están basadas preferiblemente en secuencias nucleotídicas únicas.

Las secuencias incluidas en el alcance de la presente memoria no están limitadas a estas secuencias específicas, sino que también incluyen sus variaciones específicas y alélicas. Las variaciones específicas y alélicas se pueden determinar rutinariamente comparando la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, uno de sus fragmentos representativos, o una secuencia nucleotídica idéntica al menos en un 90%, preferiblemente idéntica en un 95%, a las SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, con una secuencia de otro aislado de la misma especie. Asimismo, para resolver la variabilidad de codón, también se incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican las mismas secuencias aminoácidas que los OFRs específicos aquí descritos. En otras palabras, en la región codificadora de un ORF, se considera expresamente la sustitución de un codón por otro codón que codifica el mismo aminoácido.

El resultado más próximo para los ácidos nucleicos de la presente solicitud, incluyendo SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, se puede obtener buscando en una base de datos, usando un algoritmo o un programa. Preferiblemente se usa BLAST, que significa herramienta de búsqueda de alineamientos locales básicos, para buscar alineamientos de secuencia locales (Altschul, S.F., J. Mol. Evol., 36, 290-300 (1993) y Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 21:403-410 (1990)).

También se describen las especies homólogas (u ortólogas) de los polinucleótidos y proteínas descritos. Las especies homólogas se pueden aislar e identificar fabricando sondas o cebadores adecuados a partir de las secuencias aquí descritas, y escrutando una fuente de ácido nucleico adecuada de la especie deseada.

La invención se refiere asimismo a variantes alélicas de los polinucleótidos o proteínas descritos, es decir, formas alternativas del polinucleótido aislado existentes en la naturaleza, que codifican asimismo proteínas que son idénticas, homólogas o relacionadas con las codificadas por los polinucleótidos.

Las secuencias de ácidos nucleicos aquí descritas se refieren además a secuencias que codifican variantes de los ácidos nucleicos descritos. Estas variantes de secuencias aminoácidas se pueden preparar mediante métodos conocidos en la técnica, introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en un polinucleótido nativo o variante. Hay dos variables en la construcción de variantes de secuencia aminoácida: la localización de la mutación y la naturaleza de la mutación. Los ácidos nucleicos que codifican las variantes de secuencia aminoácida se construyen preferiblemente mutando el polinucleótido para que codifique una secuencia aminoácida que no existe en la naturaleza. Estas alteraciones de ácidos nucleicos se pueden realizar en puntos que difieren en los ácidos nucleicos de diferentes especies (posiciones variables), o en regiones muy conservadas (regiones constantes). Los sitios en tales localizaciones se modificarán típicamente en series, p.ej., sustituyendo primeramente con opciones conservativas (p.ej., aminoácido hidrófobo por un aminoácido hidrófobo diferente) y, después, con opciones más distantes (p.ej. aminoácido hidrófobo por un aminoácido cargado) y, a continuación se pueden realizar eliminaciones o inserciones en el sitio elegido como objetivo. Las eliminaciones de secuencia aminoácida varían generalmente de aproximadamente 1 a 30 residuos, preferiblemente aproximadamente de 1 a 10 residuos, y son típicamente contiguas. Las inserciones de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales, que varían en longitud de uno a cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de uno solo o múltiples residuos aminoácidos. Las inserciones intrasecuencia pueden variar generalmente de aproximadamente 1 a 10 residuos aminoácidos, preferiblemente de 1 a 5 residuos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen las secuencias señal heterólogas necesarias para secreción o para direccionamiento a diana intracelular en diferentes células hospedadoras, y secuencias como FLAG o secuencia de polihistidina, útiles para purificar la proteína expresada.

En un método preferido, los polinucleótidos que codifican las nuevas secuencias aminoácidas se cambian a través de mutagénesis dirigida. Este método usa secuencias oligonucleotídicas para alterar un polinucleótido para que codifique la variante aminoácida deseada, así como suficientes nucleótidos adyacentes en ambos lados del aminoácido cambiado para formar un dúplex estable en cada lado del punto que se está cambiando. En general, las técnicas de mutagénesis dirigida se conocen bien por los expertos en la técnica y esta técnica se ejemplifica mediante publicaciones como Edelman et al., ADN 2:183 (1983). Zoller y Smith, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982), publicaron un método versátil y eficiente para producir cambios puntuales específicos en una secuencia polinucleotídica. También se puede usar PCR para crear variantes de secuencia aminoácida de los nuevos ácidos nucleicos. Cuando se usan pequeñas cantidades de ADN molde como materia prima, un cebador o cebadores que difieren ligeramente en secuencia de la región correspondiente en el ADN molde, pueden generar la variante aminoácida deseada. La amplificación por PCR produce una población de fragmentos de ADN producto que difieren del polinucleótido molde que codifica el polipéptido en la posición especificada por el cebador. Los fragmentos de ADN producto reemplazan la región correspondiente en el plásmido, y esto produce un polinucleótido que codifica la variante aminoácida deseada.

Una técnica adicional para producir variantes aminoácidas es la mutagénesis de casete, descrita en Wells et al., Gene 34:315 (1985); y otras técnicas de mutagénesis bien conocidas en la técnica, como, por ejemplo, las técnicas en Sambrook et al., más citado anteriormente, y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. Debido a la degeneración inherente al código genético, se pueden usar otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia aminoácida u otra funcionalmente equivalente, para la clonación y expresión de estos nuevos ácidos nucleicos. Tales secuencias de ADN incluyen aquéllas capaces de hibridar con la nueva secuencia de ácido nucleico apropiada, bajo condiciones estrictas.

Se pueden usar polinucleótidos que codifican truncamientos de polipéptidos preferidos, para producir polinucleótidos que codifican proteínas quiméricas o de fusión, que comprenden uno o más dominios y secuencias de proteínas heterólogas.

Los polinucleótidos de la solicitud incluyen adicionalmente el complemento de cualquiera de los polinucleótidos descritos anteriormente. El polinucleótido puede ser de ADN (genómico, ADNc, amplificado o sintético) o ARN. Los métodos y algoritmos para obtener tales polinucleótidos son bien conocidos para los expertos en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, métodos para determinar las condiciones de hibridación que pueden aislar rutinariamente los polinucleótidos de identidades de secuencia deseadas.

Según la presente memoria descriptiva, se pueden usar secuencias polinucleotídicas que comprenden las secuencias codificadoras de proteína madura, que codifican una cualquiera de SEQ ID NO: 23, 25, 28, 30-32, 34 o 35, o sus equivalentes funcionales, para producir moléculas de ADN recombinante que dirigen la expresión de ese ácido nucleico, o uno de sus equivalentes funcionales, en células hospedadoras apropiadas. También se incluyen los insertos de ADNc de cualquiera de los clones identificados aquí.

Un polinucleótido se puede unir a cualquiera de una variedad de otras secuencias nucleotídicas mediante técnicas de ADN recombinante bien establecidas (véase Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY). Las secuencias nucleotídicas útiles para unir a polinucleótidos incluyen una variedad de vectores, p.ej., plásmidos, cósmidos, derivados del fago lambda, fagémidos y similares, que son bien conocidos en la técnica. Consecuentemente, también se describe un vector que incluye un polinucleótido descrito aquí, y una célula hospedadora que contiene el polinucleótido. En general, el vector contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios de endonucleasa de restricción convenientes, y un marcador seleccionable para la célula hospedadora. Los vectores incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de producción de sondas, y vectores de secuenciación. La célula hospedadora puede ser una célula procariótica o eucariótica, y puede ser un organismo unicelular o parte de un organismo multicelular.

También se describen construcciones recombinantes que comprenden un ácido nucleico que tiene cualquiera de las secuencias nucleotídicas de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, o uno de sus fragmentos, o cualquier otro polinucleótido descrito aquí. En una realización, las construcciones recombinantes comprenden un vector, como un vector plasmídico o vírico, en el cual se inserta un ácido nucleico que tiene cualquiera de las secuencias nucleotídicas de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, o uno de sus fragmentos en orientación directa o inversa. En el caso de un vector que comprende uno de los ORFs descritos aquí, el vector puede comprender además secuencias reguladoras, incluyendo por ejemplo un promotor, ligado operativamente al ORF. Los expertos en la técnica conocen gran cantidad de vectores y promotores adecuados, y están disponibles en el comercio para producir las construcciones recombinantes. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene), pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucarióticos: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXTI, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia).

El polinucleótido aislado descrito aquí, puede estar ligado operativamente a una secuencia de control de expresión como los vectores de expresión pMT2 o pED descritos en Kaufman et al., Nucleic Acid Res. 19, 4485-4490 (1991), a fin de producir la proteína de forma recombinante. En la técnica se conocen muchas secuencias de regulación de expresión adecuadas. También se conocen métodos generales de expresión de proteínas recombinantes, y se ejemplifican en R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990). Según se define aquí, "ligado operativamente" significa que el polinucleótido aislado y la secuencia de control de expresión están situados en un vector o célula, de forma que la proteína se expresa mediante una célula hospedadora que se ha transformado (transfectado) con la secuencia de control de expresión/polinucléotido ligados.

Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloramfenicol-transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Promotores bacterianos particularmente nombrados incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR y trc. Promotores eucarióticos incluyen CMV tempranos inmediatos, HSV timidina-quinasa, SV40 tempranos y tardíos, LTRs de retrovirus y metalotioneína-I de ratón. La selección de vectores y promotores apropiados está completamente al nivel del técnico medio en la materia. Generalmente, vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedadora, p.ej., el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen TRPI de S. Cerevisiae, y un promotor derivado de un gen muy expresado, para dirigir la transcripción de una secuencia estructural aguas abajo. Tales promotores se pueden derivar de operones que codifican enzimas glucolíticas como la 3-fosfoglicerato-quinasa (PGK), factor-a, fosfatasa ácida, o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en fase apropiada con secuencias de iniciación y terminación de la traducción y, preferiblemente, una secuencia guía, capaz de dirigir la secreción de proteína traducida al espacio periplásmico o al medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación amino-terminal que proporciona características deseadas, p.ej., estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Se construyen vectores de expresión útiles para uso bacteriano, insertando una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada, junto con señales adecuadas de iniciación y terminación de la traducción, en fase de lectura utilizable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación, para asegurar el mantenimiento del vector y para proporcionar amplificación en el hospedador, si es deseable. Hospedadores procarióticos adecuados para transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies en los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también se pueden emplear otras como materia de elección.

Como ejemplo representativo pero no limitativo, vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos disponibles comercialmente, que comprenden elementos genéticos del vector de clonación pBR322 (ATCC 37017), bien conocido. Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), y GEM 1 (Promega Biotech. Madison, WI, USA). Estas secciones de "cadena principal" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar. Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y el crecimiento de la cepa hospedadora hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce o se desreprime mediante métodos apropiados (p.ej., cambio de temperatura o inducción química), y las células se cultivan durante un período adicional. Las células se recogen típicamente mediante centrifugación, se disgregan mediante medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se conserva para una purificación adicional.

Los polinucleótidos de la invención se pueden usar también para inducir respuestas inmunológicas. Por ejemplo, según se describe en Fan et al., Nat. Biotech. 17:870-872 (1999), se pueden usar secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido para producir anticuerpos frente al polipéptido codificado, después de la administración tópica de ADN plasmídico puro, o después de la inyección y, preferiblemente, inyección intramuscular del ADN. Las secuencias de ácido nucleico se insertan preferiblemente en un vector de expresión recombinante, y pueden estar en forma de ADN puro.

4.2.1 Ácidos nucleicos antisentido

Otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico antisentido aisladas, que pueden hibridar con, o son complementarias de, la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica análoga al factor de crecimiento de células madre, o sus fragmentos, análogos o derivados. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia nucleotídica que es complementaria de un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína (p.ej., complementaria de la hebra codificadora de una molécula de ADNc bicatenaria, o complementaria de una secuencia de ARNm). En aspectos específicos, se describen moléculas de ácido nucleico antisentido que comprenden una secuencia complementaria de, al menos aproximadamente 10, 25, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos, o una hebra codificadora del factor análogo al factor de crecimiento de células madre completo, o de sólo una parte del mismo. Se describen adicionalmente moléculas de ácido nucleico que codifican fragmentos, homólogos, derivados y análogos de una sustancia análoga al factor de crecimiento de células madre, o ácidos nucleicos antisentido, complementarios de una secuencia de ácido nucleico análoga al factor de crecimiento de células madre.

En una realización, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido respecto a una "región codificadora" de la hebra codificadora de una secuencia nucleotídica que codifica una proteína análoga al factor de crecimiento de células madre. El término "región codificadora" se refiere a la región de la secuencia nucleotídica que comprende codones que se traducen en residuos aminoácidos. En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido respecto a una "región de concesión" de la hebra codificadora de una secuencia nucleotídica que codifica la proteína análoga al factor de crecimiento de células madre. El término "región de concesión" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificadora, que no se traducen en aminoácidos (es decir, denominadas también regiones 5' y 3' no traducidas).

Dadas las secuencias de hebra codificadora que codifican la proteína análoga al factor de crecimiento de células madre descritas aquí, se pueden diseñar ácidos nucleico antisentido, según las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick o Hoogsteen. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificadora completa del ARNm análogo al factor de crecimiento de células madre, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido sólo de una parte de la región codificadora o no codificadora del ARNm análogo al factor de crecimiento de células madre. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede se complementario de la región que rodea al punto de iniciación de la traducción del ARNm análogo al factor de crecimiento de células madre. Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, aproximadamente de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. Se puede construir un ácido nucleico antisentido, usando síntesis química o reacciones de ligamiento enzimático, usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico antisentido (p.ej. un oligonucleótido antisentido), usando nucleótidos existentes en la naturaleza o nucleótidos modificados de diversas formas, diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas, o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido (p.ej., se pueden usar derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina).

Ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para producir el ácido nucleico antisentido incluyen: 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxi-
hidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina. N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5'-metoxi-uracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente, usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado estará en orientación antisentido respecto a un ácido nucleico destinatario de interés, descrito más adelante en la siguiente sección).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido aquí descritas se administran típicamente a un sujeto, o se generan in situ, de forma que hibridan con ARNm celular y/o ADN genómico que codifica una proteína análoga al factor de crecimiento de células madre, o se unen a los mismos, para inhibir así la expresión de la proteína (p.ej., inhibiendo la transcripción y/o traducción). La hibridación puede realizarse mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable, o por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco mayor de la doble hélice. Un ejemplo de una ruta de administración de moléculas de ácido nucleico antisentido incluye la inyección directa en un punto de tejido. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico antisentido se pueden modificar para direccionarse a células seleccionadas y, a continuación, administrarse sistémicamente. Por ejemplo, para la administración sistémica, las moléculas antisentido se pueden modificar de forma que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada (p.ej., uniendo las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de la superficie celular). Las moléculas de ácido nucleico antisentido se pueden suministrar también a células que usan los vectores aquí descritos. Para lograr suficientes moléculas de ácido nucleico, se prefieren construcciones de vectores en las que la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte pol II o pol III.

En otra realización adicional, la molécula de ácido nucleico antisentido es una molécula de ácido nucleico alfa-anomérica. Una molécula de ácido nucleico alfa-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario, en los que, contrariamente a las unidades alfa usuales, las hebras discurren paralelas entre sí. Véase, p.ej., Gaultier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641. La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender también un 2'-o-metilribonucleótido (véase, p.ej., Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (véase, p.ej., Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330.

4.2.2 Ribozimas y restos de PNA

Las modificaciones de ácidos nucleicos incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, bases modificadas y ácidos nucleicos cuyas cadenas principales de fosfato de azúcar se modifican o derivatizan. Estas modificaciones se realizan al menos en parte para incrementar la estabilidad química de los ácidos nucleicos modificados, de forma que se pueden usar, por ejemplo, como ácidos nucleicos que se unen en antisentido, en aplicaciones terapéuticas en un sujeto.

En una realización, un ácido nucleico antisentido es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad ribonucleasa, que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, como un ARNm, con el cual tienen una región complementaria. Por tanto, las ribozimas (p.ej., ribozimas con cabeza en martillo, según se describen en Haselhoff y Gerlach 1988, Nature 334: 585-591) se pueden usar para escindir catalíticamente transcritos de ARNm análogos al factor de crecimiento de células madre, para inhibir así la traducción del ARNm análogo al factor de crecimiento de células madre. Se puede diseñar una ribozima que tenga especificidad para un ácido nucleico que codifica un polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre, basándose en la secuencia nucleotídica de un ADNc análogo al factor de crecimiento de células madre, aquí descrito. Por ejemplo, se puede construir un derivado del ARN de Tetrahymena L-19 IVS, en el que la secuencia nucleotídica del sitio activo es complementaria a la secuencia nucleotídica a escindir en un ARNm que codifica un polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre. Véase p.ej., Patente de EE.UU. 4.987.071 de Cech, et al., y Patente de EE.UU. 5.116.742 de Cech, et al. El ARNm análogo al factor de crecimiento de células madre se puede usar también para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleasa específica, de un conjunto de moléculas de ARN. Véase p.ej., Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418.

Alternativamente, la expresión génica análoga al factor de crecimiento de células madre se puede inhibir direccionando a diana secuencias nucleotídicas complementarias a la región reguladora del ácido nucleico análogo al factor de crecimiento de células madre (p.ej., promotor y/o activadores análogos al factor de crecimiento de células madre) para formar estructuras de hélice triple que evitan la transcripción del gen análogo al factor de crecimiento de células madre, en células elegidas como objetivo. Véase, p.ej., Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene, et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; Maher, 1992, Bioassays 14:807-15.

En diversas realizaciones, los ácidos nucleicos análogos al factor de crecimiento de células madre se pueden modificar en el resto de la base, azúcar, o cadena principal de fosfato para mejorar, p.ej., la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, la cadena principal de fosfato de desoxirribosa de los ácidos nucleicos se puede modificar para generar ácidos nucleicos peptídicos. Véase, p.ej., Hyrup, et al., 1996, Bioorg. Med. Chem. 4: 5-23. Según se usan aquí, los términos "ácidos nucleicos peptídicos" o "PNAs", se refieren a sustancias parecidas a ácidos nucleicos (p.ej. sustancias parecidas a ADN), en las que la cadena principal de fosfato de desoxirribosa se reemplaza por una cadena principal pseudopeptídica y sólo se mantienen las cuatro nucleobases naturales. Se ha demostrado que la cadena principal neutra de los PNAs permite la hibridación específica con ADN y ARN en condiciones de fuerza iónica baja. La síntesis de oligómeros de PNA se puede realizar usando protocolos de síntesis peptídica en fase sólida estándar, según se describe en Hyrup et al., 1996, citado más arriba; Perry-O'Keefe, et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-14675.

Los PNAs de análogo del factor de crecimiento de células madre se pueden usar en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, se pueden usar PNAs como sustancias antisentido o antigénicas para la modulación específica de secuencia de la expresión génica, p.ej., induciendo la parada de la transcripción o traducción, o inhibiendo la replicación. Los PNAs de análogos del factor de crecimiento de células madre se pueden usar también, por ejemplo, en el análisis de mutaciones de un único par de bases en un gen (p.ej., fijación de PCR dirigida por PNA; como enzimas de restricción artificiales, cuando se usan en combinación con otras enzimas, p.ej., nucleasas S1 (véase Hyrup, et al., 1996, citado anteriormente); o como sondas o cebadores para secuencias de ADN e hibridación (véase, Hyrup et al., 1996, citado anteriormente; Perry-O'Keefe, et al., 1996, citado anteriormente).

En otra realización, los PNAs de análogos del factor de crecimiento de células madre se pueden modificar, p.ej., para incrementar su estabilidad o absorción celular, uniendo grupos lipófilos u otros grupos auxiliares al PNA, mediante la formación de quimeras de PNA-ADN, o mediante el uso de liposomas u otras técnicas de suministro de fármacos conocidas en la técnica. Por ejemplo, se pueden producir quimeras de PNA-ADN de polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre, que combinan las propiedades ventajosas de PNA y ADN. Tales quimeras permiten a las enzimas de reconocimiento de ADN (p.ej., ARNsa H y ADN-polimerasas) interactuar con la porción de ADN, mientras que la porción de PNA proporcionará elevada afinidad de unión y especificidad. Las quimeras de PNA-ADN se pueden ligar usando conectores de longitudes apropiadas, seleccionadas en términos de apilamiento de bases, número de uniones entre las nucleobases, y orientación (véase, Hyrup, et al., 1996, citado anteriormente). La síntesis de quimeras de PNA-ADN se puede realizar según se describe en Hyrup, et al., 1996, citado anteriormente, Nucl. Acids Res. 24:3357-3363. Por ejemplo, se puede sintetizar una cadena de ADN sobre un soporte sólido, usando la química del acoplamiento de fosforamidita estándar, y se pueden usar análogos de nucleósidos modificados, p.ej., fosforamidita de 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-desoxitimidina) entre el PNA y el extremo 5' del ADN. Véase, p.ej., Mag et al., 1989, Nucl. Acid Res. 17:5973-5988. Los monómeros de PNA se acoplan luego de forma escalonada para producir una molécula quimérica con un segmento de PNA 5' y un segmento de ADN 3'. Véase, p.ej., Finn et al., 1996, citado anteriormente. Alternativamente, se pueden sintetizar moléculas quiméricas con un segmento de ADN 5' y un segmento de PNA 3'. Véase, p.ej., Petersen et al., 1975, Bioorg. Med. Chem. Lett. 5:1119-11124.

En otras realizaciones, el oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntos, como péptidos (p.ej., para direccionar a diana receptores de células hospedadoras in vivo), o sustancias que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, p.ej., Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre, et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652; publicación PCT Nº WO88/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, p.ej., publicación PCT Nº WO 89/10134). Además, los oligonucleótidos se pueden modificar con sustancias de escisión activadas por hibridación (véase, p.ej., Krol et al., 1988 BioTechniques 6:958-976) o sustancias intercalantes (véase, p.ej., Zon, 1988 Pharm. Res. 5:539-549). A este fin, el oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula, p.ej., un péptido, una sustancia reticulante activada por hibridación, una sustancia transportadora, una sustancia de escisión activada por hibridación, y similares.

4.3 Hospedadores

La presente invención se refiere además a células hospedadoras obtenidas mediante ingeniería genética para contener los polinucleótidos aquí descritos. Por ejemplo, tales células hospedadoras pueden contener ácidos nucleicos de la invención, introducidos en la célula hospedadora usando métodos conocidos de transformación, transfección o infección. Asimismo, se describen células hospedadoras obtenidas mediante ingeniería genética para expresar los polinucleótidos descritos, en las que tales polinucleótidos están en asociación operativa con una secuencia reguladora heteróloga a la célula hospedadora, que dirige la expresión de los polinucleótidos en la célula.

La célula hospedadora puede ser una célula hospedadora eucariótica superior, como una célula de mamífero, una célula hospedadora eucariótica inferior, como una célula de levadura, o la célula hospedadora puede ser una célula procariótica, como una célula bacteriana. La introducción de la construcción recombinante en la célula hospedadora se puede efectuar mediante transfección de fosfato cálcico, DEAE, transfección en la que interviene dextrano o electroporación (Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)). Las células hospedadoras que contienen uno de los polinucleótidos de la solicitud, se pueden usar de formas convencionales para producir el producto génico codificado por el fragmento aislado (en el caso de un ORF), o se pueden usar para producir proteína heteróloga, bajo el control del EMF.

Se puede usar cualquier sistema hospedador/vector para expresar uno o más de los ORFs aquí descritos. Estos incluyen, pero no están limitados a, hospedadores eucarióticos, como células HeLa, células Cv-1, células COS, y células Sf9, así como hospedadores procarióticos, como E. coli y B. subtilis. Las células con la máxima preferencia son aquellas que no expresan normalmente el polipéptido o proteína particular, o que expresan el polipéptido o proteína a una concentración natural baja. Las proteínas maduras se pueden expresar en células de mamífero, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de promotores apropiados. También se pueden emplear sistemas de traducción exentos de células para producir tales proteínas usando ARNs derivados de las construcciones de ADN aquí descritas. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para uso con hospedadores procarióticos y eucarióticos, por Sambrook et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

También se pueden emplear diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar proteína recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell 23:175(1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado y también cualquier punto necesario de unión al ribosoma, punto de poliadenilación, puntos de escisión donantes y aceptores, secuencias de terminación de la transcripción, y secuencias no transcritas flanqueantes 5'. Se pueden usar secuencias de ADN derivadas del genoma vírico de SV40, por ejemplo, origen de SV40, promotor temprano, activador, puntos de escisión y poliadenilación, para proporcionar los elementos genéticos requeridos no transcritos. Los polipéptidos y proteínas recombinantes producidos en cultivo bacteriano, se aislan normalmente mediante extracción inicial de glóbulos celulares, seguida de una o más etapas de precipitación por adición de sales, intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión por tamaños. Se pueden usar etapas de replegamiento de proteínas, si es necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, se puede emplear cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), para las etapas finales de purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas se pueden disgregar mediante cualquier método conveniente, incluyendo congelación-descongelación cíclica, sonicación, disgregación mecánica o uso de agentes lisantes.

Diversos tipos de células pueden actuar como células hospedadoras adecuadas para expresión de la proteína. Las células hospedadoras de mamífero incluyen, por ejemplo, células COS de mono, células ováricas de hámster chino (CHO), células de riñón humano 293, células humanas epidérmicas A431, células humanas Colo205, células 3T3, células CV-1, otras líneas celulares de primates transformadas, células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HeLa, células L de ratón, células BHK, HL-60, U937, HaK o Jurkat.

Alternativamente, puede ser posible producir la proteína en eucariotas inferiores como levadura, o en procariotas como bacterias. Cepas de levadura potencialmente adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida o cualquier cepa de levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. Cepas bacterianas potencialmente adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar proteínas heterólogas. Si la proteína se obtiene en levadura o bacterias, puede ser necesario modificar la proteína allí producida, por ejemplo mediante fosforilación o glucosilación de los puntos apropiados, a fin de obtener la proteína funcional. Tales uniones covalentes se pueden lograr usando métodos químicos o enzimáticos conocidos.

En otra realización, se pueden obtener células y tejidos mediante ingeniería genética para expresar un gen endógeno que comprenda los polinucleótidos descritos bajo la regulación de elementos reguladores inducibles, en cuyo caso las secuencias reguladoras del gen endógeno pueden reemplazarse mediante recombinación homóloga. Según se describe aquí, el direccionamiento a diana de genes se puede usar para reemplazar una región reguladora existente de un gen, por una secuencia reguladora aislada de un gen diferente o una secuencia reguladora nueva, sintetizada mediante métodos de ingeniería genética. Tales secuencias reguladoras pueden estar formadas por promotores, activadores, regiones de unión a estructuras de soporte, elementos reguladores negativos, puntos de iniciación de la transcripción, puntos reguladores de unión de proteína o combinaciones de dichas secuencias. Alternativamente, secuencias que afectan a la estructura o estabilidad del ARN o proteína producido pueden ser reemplazadas, eliminadas, añadidas o modificadas de otra forma, direccionando a diana, incluyendo señales de poliadenilación, elementos de estabilidad de ARNm, puntos de escisión, secuencias guía para incrementar o modificar las propiedades de transporte o secreción de la proteína, u otras secuencias que alteran o mejoran la función o estabilidad de las moléculas de proteína o ARN.

El suceso de direccionamiento a diana puede ser una simple inserción de la secuencia reguladora, situando el gen bajo la regulación de la nueva secuencia reguladora, p.ej., insertando un nuevo promotor o activador, o ambos, aguas arriba de un gen. Alternativamente, el suceso de direccionamiento puede ser una simple eliminación de un elemento regulador, como la eliminación de un elemento regulador negativo específico de tejido. Alternativamente, el suceso de direccionamiento puede reemplazar un elemento existente: por ejemplo, un activador específico de tejido puede reemplazarse por un activador que tenga una especificidad más amplia o de diferente tipo celular que los elementos existentes en la naturaleza. Aquí, las secuencias existentes en la naturaleza se eliminan y se añaden nuevas secuencias. En todos los casos, la identificación del suceso de direccionamiento se puede facilitar mediante el uso de uno o más genes marcadores seleccionables, que son contiguos con el ADN elegido como diana, permitiendo la selección de células en las que el ADN exógeno se ha integrado en el genoma de la célula hospedadora. La identificación del suceso de direccionamiento se puede facilitar también mediante el uso de uno o más genes marcadores que presentan la propiedad de selección negativa, de forma que el marcador seleccionable negativamente está ligado al ADN exógeno, pero configurado de forma que el marcador seleccionable negativamente flanquea la secuencia elegida como diana, y de forma que un suceso de recombinación homóloga correcta con secuencias en el genoma de la célula hospedadora, no produce la integración estable del marcador seleccionable negativamente. Los marcadores útiles para este propósito incluyen el gen de la timidina-quinasa del virus del Herpes simplex (TK) o el gen de la xantina-guanina-fosforribosil-transferasa (gpt).

Las técnicas de destrucción dirigida de genes o activación de genes, que se pueden usar de acuerdo con este aspecto de la descripción, se describen más en particular en la Patente de EE.UU. Nº 5.272.071 de Chappel; Patente de EE.UU. Nº 5.578.461 de Sherwin et al.; Solicitud Internacional Nº PCT/US92/09627 (WO93/09222) de Selden et al.; y en la Solicitud Internaional Nº PCT/US90/06436 (WO91/06667) de Skoultchi et al.

4.3.1 Proteínas quiméricas y de fusión

En esta memoria se describen proteínas quiméricas o de fusión análogas al factor de crecimiento de células madre. Según se usa aquí "proteína quimérica" o "proteína de fusión" análoga al factor de crecimiento de células madre comprende un polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre, ligado operativamente a un polipéptido análogo al factor de crecimiento de células distintas de las células madre. Un "polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia aminoácida correspondiente a una proteína análoga al factor de crecimiento de células madre, mientras que un "polipéptido análogo al factor de crecimiento de células distintas de las células madre", se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia aminoácida correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la proteína análoga al factor de crecimiento de células madre, p.ej., una proteína que es diferente de la proteína análoga al factor de crecimiento de células madre y que se deriva de un organismo igual o distinto. En una proteína de fusión análoga al factor de crecimiento de células madre, el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre puede corresponder a toda una proteína análoga al factor de crecimiento de células madre, o a una parte de la misma. En una realización, una proteína de fusión análoga al factor de crecimiento de células madre comprende al menos una porción biológicamente activa de una proteína análoga al factor de crecimiento de células madre. En otra realización, una proteína de fusión análoga al factor de crecimiento de células madre comprende al menos dos porciones biológicamente activas de una proteína análoga al factor de crecimiento de células madre. En otra realización adicional, una proteína de fusión análoga al factor de crecimiento de células madre comprende al menos tres porciones biológicamente activas de una proteína análoga al factor de crecimiento de células madre. En la proteína de fusión, el término "ligado operativamente" pretende indicar que el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre y el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células distintas de las células madre, están fusionados entre sí dentro del marco de lectura. El polipéptido análogo al factor de crecimiento de células distintas de las células madre se puede fusionar al extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre.

En una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST, análoga al factor de crecimiento de células madre, en la que las secuencias análogas al factor de crecimiento de células madre están fusionadas con el extremo C-terminal de las secuencias GST (glutatión S-transferasa). Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de polipéptidos análogos al factor de crecimiento de células madre.

En otra realización, la proteína de fusión es una proteína análoga al factor de crecimiento de células madre, que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N-terminal. En ciertas células hospedadoras (p.ej. células hospedadoras de mamíferos), se puede incrementar la expresión y/o secreción de análogo al factor de crecimiento de células madre, mediante el uso de una secuencia señal heteróloga.

En otra realización adicional, la proteína de fusión es una proteína de fusión de inmunoglobulina análoga al factor de crecimiento de células madre, en la que las secuencias análogas al factor de crecimiento de células madre se fusionan con secuencias derivadas de un miembro de la familia de proteínas de la inmunoglobulina. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina análogas al factor de crecimiento de células madre aquí descritas se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas y administrarse a un sujeto, para inhibir una interacción entre un ligando de análogo al factor de crecimiento de células madre y una proteína análoga al factor de crecimiento de células madre sobre la superficie de una célula, para suprimir así la transducción de señal in vivo, en la que interviene un análogo al factor de crecimiento de células madre. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina análogas al factor de crecimiento de células madre se pueden usar para incidir en la biodisponibilidad de un ligando afín al análogo del factor de crecimiento de células madre. La inhibición de la interacción entre el ligando del análogo al factor de crecimiento de células madre y el análogo al factor de crecimiento de células madre puede ser útil terapéuticamente para el tratamiento de trastornos proliferativos y diferenciativos, así como para modular (p.ej. promoviendo o inhibiendo) la supervivencia celular. Además, las proteínas de fusión de inmunoglobulina análogas al factor de crecimiento de células madre aquí descritas, se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos anti-análogo al factor de crecimiento de células madre en un sujeto, para purificar ligandos de análogo al factor de crecimiento de células madre, y en ensayos de detección sistemática para identificar moléculas que inhiban la interacción de análogo al factor de crecimiento de células madre con un ligando de análogo al factor de crecimiento de células madre.

Una proteína de fusión o quimérica análoga al factor de crecimiento de células madre, aquí descrita, se puede producir mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias polipeptídicas se ligan conjuntamente dentro del marco de lectura, según técnicas convencionales, p.ej. empleando extremos romos o escalonados para ligamiento, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones no deseadas y ligamiento enzimático. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, se puede realizar amplificación PCR de fragmentos génicos, usando cebadores de anclaje que originan salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos, que se pueden hibridar y volver a amplificar posteriormente para producir una secuencia génica quimérica (véase, p.ej. Ausubel et al., (compiladores) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons. 1992). Además, están disponibles en el comercio muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (p.ej. un polipéptido GST). Se puede clonar un ácido nucleico que codifique un análogo del factor de crecimiento de células madre en tal vector de expresión, de forma que el resto de fusión está ligado en el mismo marco de lectura, con la proteína análoga al factor de crecimiento de células madre.

4.4 Polipéptidos

Los polipéptidos aislados aquí descritos incluyen, pero no están limitados a, un polipéptido que comprende: la secuencia aminoácida indicada como una cualquiera de SEQ ID NO: 23, 25, 28, 30-32, 34 o 35, o una secuencia aminoácida codificada por una cualquiera de las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, o la correspondiente proteína completa o madura. Los polipéptidos aquí descritos incluyen también polipéptidos preferiblemente con actividad biológica o inmunológica, que son codificados por: (a) un polinucleótido que tiene una cualquiera de las secuencias nucleotídicas expuestas en SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, o (b) polinucleótidos que codifican una cualquiera de las secuencias indicadas como SEQ ID NO: 23, 25, 28, 30-32, 34 o 35, o (c) polinucleótidos que hibridan con el complemento de los polinucleótidos de (a) o (b), bajo condiciones de hibridación estrictas. Asimismo, se describen variantes biológicamente activas o inmunológicamente activas de cualquiera de las secuencias aminoácidas indicadas como SEQ ID NO: 23, 25, 28, 30-32, 34 o 35, o la correspondiente proteína completa o madura; y sus "equivalentes sustanciales" (p.ej. con al menos 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% o 89%, más típicamente al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93% o 94%, e incluso más típicamente al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, lo más típicamente al menos 99% de identidad de aminoácidos) que mantengan la actividad biológica. Los polipéptidos codificados por variantes alélicas pueden tener una actividad similar,
incrementada o reducida, comparados con los polipéptidos que comprenden SEQ ID NO: 23, 25, 28, 30-32, 34 o 35.

También se contemplan fragmentos de las proteínas aquí descritas, que son capaces de presentar actividad biológica. Los fragmentos de la proteína pueden estar en forma lineal o se pueden ciclar usando métodos conocidos, por ejemplo, según se describe en H. U. Saragovi et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992) y en R. S. McDowell et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9245-9253 (1992). Tales fragmentos se pueden fusionar con moléculas transportadoras, como inmunoglobulinas, para diversos propósitos, incluyendo el incremento de la valencia de puntos de unión de proteínas.

Se describen formas completas y maduras (por ejemplo, sin una secuencia señal o secuencia precursora), de las proteínas descritas. La secuencia codificadora de proteína se identifica en el listado de secuencias mediante traducción de las secuencias nucleotídicas descritas. La forma madura de tal proteína se puede obtener mediante expresión de un polinucleótido completo en una célula de mamífero adecuada u otra célula hospedadora. La secuencia de la forma madura de la proteína se puede determinar también a partir de la secuencia aminoácida de la forma completa. Cuando las proteínas están unidas a la membrana, también se describen las formas solubles de las proteínas. En tales formas, parte o la totalidad de las regiones que hacen que las proteínas estén unidas a la membrana, se eliminan, de forma que las proteínas se secretan totalmente de la célula en la que se expresan.

Las composiciones de proteínas aquí descritas pueden comprender además un vehículo aceptable, como un vehículo hidrófilo, p.ej. farmacéuticamente aceptable.

Asimismo, se describen polipéptidos aislados codificados por los fragmentos de ácidos nucleicos aquí descritos, o por variantes degeneradas de los fragmentos de ácidos nucleicos aquí descritos. Se entiende por "variante degenerada" fragmentos nucleotídicos que difieren de un fragmento de ácido nucleico aquí descrito (p.ej. un ORF) en la secuencia nucleotídica pero, debido a la degeneración del código genético, codifican una secuencia polipeptídica idéntica. Los fragmentos de ácido nucleico preferidos son los ORFs que codifican proteínas.

Se pueden utilizar diversas metodologías conocidas en la técnica para obtener uno cualquiera de los polipéptidos o proteínas aislados aquí descritos. En el nivel más sencillo, la secuencia aminoácida se puede sintetizar usando sintetizadores de péptidos disponibles en el comercio. Las secuencias de proteína construidas sintéticamente, en virtud de compartir características estructurales primarias, secundarias o terciarias y/o características conformacionales con proteínas, pueden poseer propiedades biológicas en común con las mismas, incluyendo la actividad de la proteína. Esta técnica es particularmente útil en la producción de pequeños péptidos y fragmentos de polipéptidos mayores. Los fragmentos son útiles, por ejemplo, para producir anticuerpos frente al polipéptido nativo. Por tanto, se pueden emplear como sustitutos biológicamente activos o inmunológicos para proteínas naturales purificadas, en la detección sistemática de compuestos terapéuticos y en procesos inmunológicos para el desarrollo de anticuerpos.

Los polipéptidos y proteínas aquí descritos se pueden purificar alternativamente a partir de células que se han alterado para expresar el polipéptido o proteína deseado. Según se usa aquí, se dice que una célula se altera para expresar un polipéptido o proteína deseado cuando se hace que la célula, a través de manipulación genética, produzca un polipéptido o proteína que normalmente no produce o que la célula produce normalmente a una concentración inferior. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente procedimientos para introducir y expresar secuencias recombinantes o sintéticas en células eucarióticas o procarióticas, a fin de generar una célula que produce uno de los polipéptidos o proteínas aquí descritos.

La invención se refiere también a métodos para producir un polipéptido, que comprenden producir un cultivo de células hospedadoras en un medio de cultivo adecuado, y purificar la proteína de las células o del cultivo en el que las células se producen. Por ejemplo, los métodos descritos incluyen un procedimiento para producir un polipéptido, en el que una célula hospedadora que contiene un vector de expresión que incluye un polinucleótido descrito, se cultiva en condiciones que permiten la expresión del polipéptido codificado. El polipéptido se puede recuperar del cultivo, convenientemente del medio de cultivo, o de un lisado preparado de las células hospedadoras y purificado posteriormente. Las realizaciones preferidas incluyen aquéllas en las que la forma de la proteína producida por tal proceso es una forma completa o madura.

En un método alternativo, el polipéptido o proteína se purifica de células bacterianas que producen naturalmente el polipéptido o proteína. Un experto en la técnica puede seguir fácilmente métodos conocidos para aislar polipéptidos y proteínas, a fin de obtener uno de los polipéptidos o proteínas aquí descritos. Estos incluyen, pero no están limitados a, inmunocromatografía, HPLC, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de inmunoafinidad. Véase, p.ej., Scopes, Protein Purification: Principles and Practice. Springer-Verlag (1994): Sambrook et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Los fragmentos polipeptídicos que conservan actividad biológica/inmunológica incluyen fragmentos que comprenden más de aproximadamente 100 aminoácidos, o más de aproximadamente 200 aminoácidos, y fragmentos que codifican dominios de proteína específicos.

Los polipéptidos purificados se pueden usar en ensayos de unión in vitro que son bien conocidos en la técnica, para identificar moléculas que se unen a los polipéptidos. Estas moléculas incluyen, pero no están limitadas a, p.ej., moléculas pequeñas, moléculas de bibliotecas combinatorias, anticuerpos u otras proteínas. Las moléculas identificadas en el ensayo de unión se ensayan luego para actividad antagonista o agonista en modelos animales de cultivo de tejidos in vivo, que son bien conocidos en la técnica. En resumen, las moléculas se valoran en una pluralidad de cultivos celulares o animales, y luego se ensayan, bien para muerte celular/animal o para supervivencia prolongada del animal/células.

Además, los péptidos o moléculas descritos, capaces de unirse a los péptidos pueden estar formando complejos con toxinas, p.ej., ricino o cólera, o con otros compuestos que son tóxicos para las células. El complejo toxina-molécula de unión se dirige a continuación a un tumor y otra célula objetivos, mediante la especificidad de la molécula de unión para SEQ ID NO. 23, 25, 28, 30-32, 34 o 35.

La proteína descrita se puede expresar también como un producto de animales transgénicos, p.ej., como componente de la leche de vacas, cabras, cerdos u ovejas transgénicos, que están caracterizados por células somáticas o germinales que contienen una secuencia nucleotídica que codifica la proteína.

Las proteínas aquí descritas incluyen también proteínas caracterizadas por secuencias aminoácidas similares a las de proteínas purificadas, pero en las que se las modificaciones se proporcionan de forma natural o se obtienen deliberadamente mediante ingeniería genética. Por ejemplo, se pueden realizar modificaciones en la secuencia peptídica o de ADN por expertos en la técnica, utilizando técnicas conocidas. Las modificaciones de interés en las secuencias de proteína pueden incluir alteración, sustitución, reemplazamiento, inserción o eliminación de un residuo aminoácido seleccionado en la secuencia codificadora. Por ejemplo, se puede eliminar o reemplazar uno o más de los residuos de cisteína con otro aminoácido, para alterar la conformación de la molécula. Las técnicas para tal alteración, sustitución, reemplazamiento, inserción o eliminación son bien conocidas por los expertos en la técnica (véase, p.ej., Patente de EE.UU. Nº 4.518.584). Preferiblemente, tal alteración, sustitución, reemplazamiento, inserción o eliminación conserva la actividad deseada de la proteína. Se pueden determinar las regiones de la proteína que son importantes para la función de la proteína, mediante varios métodos conocidos en la técnica, incluyendo el método de barrido de alanina, que implica la sustitución sistemática de aminoácidos individuales o cadenas con alanina, seguida de ensayo de la variante resultante que contiene alanina para actividad biológica. Este tipo de análisis determina la importancia del aminoácido o aminoácidos sustituidos en la actividad biológica. Las regiones de la proteína que son importantes para la función de la misma se pueden determinar mediante el programa eMATRIX.

Otros fragmentos y derivados de las secuencias de proteínas que se esperaría que conservasen la actividad de la proteína en su totalidad o en parte y que son útiles para la detección sistemática u otras metodologías inmunológicas, se pueden producir también fácilmente por los expertos en la técnica, dadas las descripciones aquí proporcionadas. Tales modificaciones forman parte de esta descripción.

La proteína se puede producir asimismo ligando operativamente el polinucleótido aislado aquí descrito a secuencias de control adecuadas, en uno o más vectores de expresión de insectos, y empleando un sistema de expresión de insectos. Están disponibles comercialmente materiales y métodos para expresión de células de baculovirus/insecto, en forma de kit, p.ej., de Invitrogen, San Diego, Calif. EE.UU., (el kit MaxBat®), y tales métodos son bien conocidos en la técnica, según se describe en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº 1555 (1987). Según se usa aquí, un insecto capaz de expresar un polinucleótido descrito es "transformado".

La proteína descrita se puede preparar cultivando células hospedadoras transformadas en condiciones de cultivo adecuadas para expresar la proteína recombinante. La proteína expresada resultante se puede purificar a continuación de tal cultivo (es decir, de medios de cultivo o extractos celulares), usando procedimientos de purificación conocidos, como filtración en gel y cromatografía de intercambio iónico. La purificación de la proteína puede incluir también una columna de afinidad que contiene sustancias que se unirán a la proteína; una o más etapas de columna sobre resinas de afinidad tales como concanavalina A-agarosa, heparina-toyopearl® o Cibacrom blue 3GA Sepharosa®; una o más etapas que implican cromatografía de interacción hidrófoba, usando resinas tales como éter fenílico, éter butílico o éter propílico; o cromatografía de inmunoafinidad.

Alternativamente, la proteína se puede expresar también en una forma que facilitará la purificación. Por ejemplo, se puede expresar como una proteína de fusión, como proteína que se une a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST) o tiorredoxina (TRX), o como un marcador de His. Están disponibles comercialmente kits para expresión y purificación de tales proteínas de fusión de New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, N.J.) e Invitrogen, respectivamente. La proteína se puede marcar también con un epítope y purificarse posteriormente usando un anticuerpo específico dirigido a tal epítope. Uno de tales epítopes ("FLAG®") está disponible comercialmente de Kodak (New Haven Conn.).

Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC), que emplean medios RP-HPLC hidrófobos, p.ej., gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes, para purificar más la proteína. Algunas o todas de las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, se pueden emplear para proporcionar una proteína recombinante aislada, sustancialmente homogénea. La proteína así purificada está exenta sustancialmente de otras proteínas de mamífero y se define de acuerdo con la presente descripción como una "proteína aislada".

Los polipéptidos aquí descritos incluyen análogos (variantes). Los polipéptidos descritos incluyen análogos del factor de crecimiento de células madre. Esto abarca fragmentos de polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre, así como polipéptidos análogos al factor de crecimiento de células madre que comprenden uno o más aminoácidos eliminados, insertados o sustituidos. Asimismo, los análogos del polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre abarcan fusiones de los polipéptidos análogos al factor de crecimiento de células madre o modificaciones de los polipéptidos análogos al factor de crecimiento de células madre, en las que el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre o análogo está fusionado con otro resto o restos, p.ej., resto de direccionamiento u otra sustancia terapéutica. Tales análogos pueden presentar propiedades mejoradas como actividad y/o estabilidad. Ejemplos de restos que se pueden fusionar con el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre o un análogo, incluyen, por ejemplo, restos de direccionamiento que permiten el suministro del polipéptido a neuronas, p.ej., anticuerpos frente al sistema nervioso central o anticuerpos frente a receptores y ligandos expresados en células neuronales. Otros restos que se pueden fusionarse al polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre incluyen sustancias terapéuticas que se usan para el tratamiento, por ejemplo fármacos antidepresivos u otras medicaciones para trastornos neurológicos. Asimismo, se pueden fusionar polipéptidos análogos al factor de crecimiento de células madre con moduladores del crecimiento neuronal, y otras quimioquinas para suministro dirigido.

4.4.1 Determinación de identidad y similitud de polipéptidos y polinucleótidos

La identidad y/o similitud preferidas se diseñan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Se codifican en programas de ordenador métodos para determinar la identidad y similitud, incluyendo pero no limitados al conjunto de programas GCG, incluyendo GAP (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984): Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX, FASTA (Altschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990), PSI-BLAST (Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., vol. 25, págs 3389-3402, el conjunto de programas eMatrix (Wu et al., J. Comp. Biol., vol. 6, págs. 219-235 (1999), conjunto de programas eMotif (Nevill-Manning, et al., ISMB-97, vol. 4, págs. 202-209, el conjunto de programas GeneAtlas (Molecular Simulations Inc. (MSI), San Diego, CA) (Sanchez y Sali (1998), Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 13597-13602: Kitson DH et al. (2000) "Remote homology detection using structural modeling - an evaluation", presentado: Fischer y Eisenberg (1996) Protein Sci. 5, 947-955) y el algoritmo de predicción de hidrofobicidad de Kyte-Doolittle (J. Molec. Biol. 157, págs. 105-31 (1982). Los programas BLAST están disponibles al público en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul S. et al., NCB NLM NIH Bethesda, MD 20894: Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990).

4.5 Terapia génica

Las mutaciones en los polinucleótidos descritos pueden producir pérdida de la función normal de la proteína codificada. Se puede usar terapia génica para restaurar la actividad normal de los polipéptidos, o para tratar enfermedades en las que intervienen los polipéptidos aquí descritos. El suministro de un gen funcional que codifica los polipéptidos descritos a las células apropiadas se efectúa ex vivo, in situ, o in vivo, mediante el uso de vectores, y más particularmente de vectores víricos. (p.ej, adenovirus, virus adenoasociados o un retrovirus), o ex vivo mediante el uso de métodos de transferencia física de ADN (p.ej., liposomas o tratamientos químicos). Véase, por ejemplo, Anderson, Nature, suplemento del vol. 392, nº 6679, págs. 20-25 (1998). Para informes adicionales de tecnología de terapia génica, véanse Friedmann, Science, 244:1275-1281 (1989); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); y Miller, Nature, 357:455-460 (1992). La introducción de uno cualquiera de los nucleótidos descritos o de un gen que codifique los polipéptidos descritos se puede lograr también con sustratos extracromosómicos (expresión transitoria) o cromosomas artificiales (expresión estable). Las células se pueden cultivar también ex vivo, en presencia de proteínas de la presente solicitud, a fin de proliferar o de producir un efecto deseado sobre tales células o actividad en las mismas. Las células tratadas se pueden introducir luego in vivo para fines terapéuticos. Alternativamente, se considera que en otras enfermedades humanas, evitar la expresión de los polipéptidos aquí descritos o inhibir su actividad será útil en el tratamiento de las enfermedades. Se considera que se podrían aplicar terapia antisentido o terapia génica para regular negativamente la expresión de los polipéptidos descritos.

Otros métodos que inhiben la expresión de una proteína incluyen la introducción de moléculas antisentido respecto a los ácidos nucleicos descritos, sus complementos o sus secuencias traducidas de ARN, mediante métodos conocidos en la técnica. Además, los polipéptidos descritos se pueden inhibir usando métodos de eliminación dirigidos, o la inserción de un elemento regulador negativo, como un lentificador, que es específico de tejido.

Además, se describen células obtenidas in vivo mediante ingeniería genética para expresar los polinucleótidos descritos, en las que tales polinucleótidos están en asociación operativa con una secuencia reguladora heteróloga respecto a la célula hospedadora, que dirige la expresión de los polinucleótidos en la célula. Estos métodos se pueden usar para incrementar o reducir la expresión de los polinucleótidos descritos.

El conocimiento de las secuencias de ADN aquí descritas permite la modificación de las células para permitir, incrementar o reducir la expresión del polipéptido endógeno. Las células se pueden modificar (p.ej., mediante recombinación homóloga), para proporcionar una expresión del polipéptido incrementada, reemplazando, total o parcialmente el promotor existente en la naturaleza con la totalidad o parte de un promotor heterólogo, de forma que las células expresen la proteína a concentraciones mayores. El promotor heterólogo se inserta de tal manera que está ligado operativamente a las secuencias que codifican la proteína deseada. Véanse, por ejemplo, Publicación Internacional PCT Nº WO 94/12650, Publicación internacional PCT Nº WO 92/20808, y Publicación internacional PCT
Nº WO 91/09955. También se considera que, además del ADN del promotor heterólogo, se pueden insertar junto con el promotor heterólogo, un marcador amplificable de ADN (p.ej., ada, dhfr y el gen CAD multifuncional, que codifica carbamil-fosfato-sintetasa, aspartato-transcarbamilasa y dihidro-rotasa) y/o intrones de ADN. Si está ligado a la secuencia codificadora de proteína deseada, la amplificación del marcador de ADN mediante métodos de selección estándar produce la amplificación conjunta de las secuencias codificadoras de proteína deseadas en las células.

En otra realización, se pueden obtener mediante ingeniería genética células y tejidos que expresen un gen endógeno que comprende los polinucleótidos descritos, bajo el control de elementos reguladores inducibles, en cuyo caso las secuencias reguladoras del gen endógeno se pueden reemplazar mediante recombinación homóloga. Según se describe aquí, se puede usar reconocimiento génico para reemplazar una región reguladora existente de un gen con una secuencia reguladora aislada de un gen diferente o una secuencia reguladora nueva sintetizada mediante métodos de ingeniería genética. Tales secuencias reguladoras pueden estar formadas por promotores, activadores, regiones de unión a la estructura de soporte, elementos reguladores negativos, puntos de iniciación de la transcripción, puntos de unión de proteínas reguladoras, o combinaciones de dichas secuencias. Alternativamente, secuencias que afectan a la estructura o estabilidad del ARN o proteína producidos, se pueden reemplazar, eliminar, añadir o modificar de otra forma mediante reconocimiento. Estas secuencias incluyen señales de poliadenilación, elementos de estabilidad de mARN, puntos de escisión, secuencias guía para incrementar o modificar las propiedades de transporte o secreción de la proteína, u otras secuencias que alteran o mejoran la función o estabilidad de moléculas de proteína o ARN.

El suceso de reconocimiento puede ser una simple inserción de la secuencia reguladora, colocando el gen bajo el control de la nueva secuencia reguladora, p.ej., insertando un nuevo promotor o activador o ambos, aguas arriba de un gen. Alternativamente, el suceso de reconocimiento puede ser una simple eliminación de un elemento regulador, como la eliminación de un elemento regulador negativo específico de tejido. Alternativamente, el suceso de reconocimiento puede reemplazar un elemento existente; por ejemplo, un activador específico de tejido puede ser reemplazado por un activador que tiene una especificidad más amplia o de diferente tipo celular que los elementos existentes en la naturaleza. Aquí, las secuencias presentes en la naturaleza se eliminan y se añaden las secuencias nuevas. En todos los casos, la identificación del suceso de reconocimiento se puede facilitar mediante el uso de uno o más genes marcadores seleccionables que son contiguos con el ADN reconocido, permitiendo la selección de células en las que el ADN exógeno se ha integrado en el genoma celular. La identificación del suceso de reconocimiento se puede facilitar también mediante el uso de uno o más genes marcadores que presentan la propiedad de selección negativa, de forma que el marcador seleccionable negativamente está ligado al ADN exógeno, pero configurado de forma que el marcador seleccionable negativamente flanquea la secuencia de reconocimiento, y de forma que un suceso de recombinación homóloga correcto con secuencias en el genoma de la célula hospedadora, no produce la integración estable del marcador seleccionable negativamente. Marcadores útiles para este fin incluyen el gen de timidina-quinasa del virus del Herpes Simplex o el gen de xantina-guanina-fosforribosil-transferasa bacteriano (gpt).

Las técnicas de reconocimiento génico o activación génica que se pueden usar según este aspecto de la descripción, se describen más particularmente en la Patente de EE.UU. Nº 5.272.071 de Chappel; Patente de EE.UU. Nº 5.578.461 de Sherwin et al.; Solicitud Internacional Nº PCT/US92/09627 (WO 93/09222) de Selden et al.; y Solicitud Internacional Nº PCT/US90/06436 (WO91/06667) de Skoultchi et al.

4.6 Animales transgénicos

En métodos preferidos para determinar las funciones biológicas de los polipéptidos descritos in vivo, uno o más genes aquí descritos se sobreexpresan o inactivan en la línea germinal de animales, usando recombinación homóloga [Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)]. Los animales en los que el gen se sobreexpresa, bajo el control regulador de elementos promotores exógenos o endógenos, se conocen como animales transgénicos. Los animales en los que un gen endógeno se ha inactivado mediante recombinación homóloga se denominan animales "inactivados". Se pueden preparar animales inactivados, preferiblemente mamíferos no humanos, según se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.557.032. Los animales transgénicos son útiles para determinar los papeles que juegan los polipéptidos en procesos biológicos y, preferiblemente, en enfermedades. Los animales transgénicos son útiles como sistemas modelo para identificar compuestos que modulan el metabolismo lipídico. Los animales transgénicos, preferiblemente mamíferos no humanos, se producen usando métodos descritos en la Patente de EE.UU. Nº 5.489.743 y la publicación PCT Nº WO 94/28122.

Se pueden preparar animales transgénicos en los que todo o parte de un promotor de los polinucleótidos se activa o inactiva para alterar el grado de expresión de los polipéptidos. La inactivación se puede realizar usando métodos de recombinación homólogos descritos anteriormente. La activación se puede lograr complementando, o incluso reemplazando el promotor homólogo, para proporcionar una expresión de proteína incrementada. el promotor homólogo se puede complementar mediante inserción de uno o más elementos activadores heterólogos conocidos, para conferir activación de promotor en un tejido particular.

Los polinucleótidos aquí descritos también permiten el desarrollo, p.ej., a través de estrategias de recombinación homóloga o inactivacion, de animales incapaces de expresar polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre funcional, o que expresan una variante del polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre. Tales animales son útiles como modelos para estudiar las actividades in vivo del polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre, así como para estudiar moduladores del polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre.

En métodos preferidos para determinar las funciones biológicas de los polipéptidos descritos in vivo, uno o más genes aquí descritos se sobreexpresan o inactivan en la línea germinal de animales, usando recombinación homóloga [Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)]. Los animales en los que el gen se sobreexpresa, bajo el control regulador de elementos promotores exógenos o endógenos, se conocen como animales transgénicos. Los animales en los que un gen endógeno se ha inactivado mediante recombinación homóloga se denominan animales "inactivados". Se pueden preparar animales inactivados, preferiblemente mamíferos no humanos, según se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.557.032. Los animales transgénicos son útiles para determinar los papeles que juegan los polipéptidos en procesos biológicos, y preferiblemente en enfermedades. Los animales transgénicos son útiles como sistemas modelo para identificar compuestos que modulan el metabolismo lipídico. Los animales transgénicos, preferiblemente mamíferos no humanos, se producen usando métodos descritos en la Patente de EE.UU. Nº 5.489.743 y la publicación PCT Nº WO 94/28122.

4.7 Usos y actividad biológica de polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre

Se espera que los polinucleótidos y proteínas de la presente invención presenten uno o más de los usos o actividades biológicas (incluyendo las asociadas con ensayos aquí citados) identificadas aquí. Los usos o actividades descritos para las proteínas de la presente invención se pueden proporcionar mediante administración o uso de tales proteínas o de polinucleótidos que codifiquen tales proteína (como, por ejemplo, en terapias génicas o vectores adecuados para introducción de ADN). El mecanismo subyacente a la enfermedad o patología particular determinará si los polipéptidos, sus polinucleótidos o moduladores (activadores o inhibidores), serán beneficiosos para el sujeto que precise tratamiento. Por tanto, "composiciones terapéuticas" incluye composiciones que comprenden polinucleótidos aislados (incluyendo moléculas de ADN recombinante, genes clonados y sus variantes degeneradas) o polipéptidos (incluyendo proteína completa, proteína madura y sus truncamientos o dominios), o compuestos y otras sustancias que modulan la actividad total de los productos génicos elegidos como objetivo, bien en el aspecto de expresión del gen/proteína elegido como objetivo, o bien de la actividad de la proteína elegida como objetivo. Tales moduladores incluyen polipéptidos, análogos (variantes), incluyendo fragmentos y proteínas de fusión, anticuerpos y otras proteínas de unión; compuestos químicos que activan o inhiben directa o indirectamente los polipéptidos de la invención (identificados, p.ej., a través de ensayos de identificación sistemática según se describen aquí); polinucleótidos antisentido y polinucleótidos adecuados para formación de triple hélice; y, en particular, anticuerpos u otras parejas de unión que reconocen específicamente uno o más epítopes de los polipéptidos descritos aquí.

Los polipéptidos de la presente invención pueden estar implicados del mismo modo en activación celular o en una de las otras vías fisiológicas descritas aquí.

4.7.1 Usos de investigación y utilidades

Los polinucleótidos proporcionados por la presente invención se pueden usar por la comunidad científica para diversos fines. Los polinucleótidos se pueden usar para expresar proteína recombinante para análisis, caracterización o uso terapéutico; como marcadores para tejidos en los que la proteína correspondiente se expresa preferencialmente (bien constitutivamente o en una etapa particular de la diferenciación o desarrollo del tejido o en enfermedades); como marcadores de peso molecular sobre geles; como marcadores o identificadores (cuando están marcados con isótopos) para identificar cromosomas o para mapear posiciones génicas relacionadas; para comparar con secuencias de ADN endógenas en pacientes, para identificar trastornos genéticos potenciales; como sondas para hibridar y, por tanto, descubrir secuencias nuevas de ADN relacionadas; como fuente de información para derivar cebadores de PCR para obtención de las huellas dactilares genéticas; como sonda para "extraer" secuencias conocidas en el procedimiento de descubrimiento de otros polinucleótidos nuevos; para seleccionar y obtener oligómeros para unión a un "chip de ADN" u otro soporte, incluyendo el examen de patrones de expresión; para incrementar los anticuerpos anti-proteína usando técnicas de inmunización de ADN; y como antígeno para producir anticuerpos anti-ADN o provocar otra respuesta inmunológica. Cuando el polinucleótido codifica una proteína que se une o se une potencialmente a otra proteína (como, por ejemplo, en una interacción proteína-ligando), el polinucleótido se puede usar también en ensayos de interacción de trampa (como, por ejemplo, los descritos en Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993)), para identificar polinucleótidos que codifican la otra proteína con la cual se produce la unión, o para identificar inhibidores de la interacción de unión.

Los polipéptidos proporcionados por la presente invención se pueden usar de forma similar en ensayos para determinar la actividad biológica, incluyéndose en un conjunto de múltiples proteínas para detección sistemática de alto rendimiento; para producir anticuerpos o provocar otra respuesta inmunológica; como reactivo (incluyendo el reactivo marcado) en ensayos diseñados para determinar cuantitativamente concentraciones de la proteína (o su receptor) en fluidos biológicos; como marcadores para tejidos en los que se expresa con preferencia el polipéptido correspondiente (bien constitutivamente o en una etapa particular de diferenciación o desarrollo del tejido o en una enfermedad); y, por supuesto, para aislar receptores o ligandos correlativos. Las proteínas implicadas en estas interacciones de unión se pueden usar también para detectar sistemáticamente péptidos o inhibidores de pequeñas moléculas o agonistas de la interacción de unión.

Los polipéptidos de la invención son útiles también para obtener sustancias de anticuerpos que son específicamente inmunorreactivas con proteínas análogas al factor de crecimiento de células madre. Se pueden usar anticuerpos y sus partes (p.ej., fragmentos Fab), que se unen a los polipéptidos de la invención, para identificar la presencia de tales polipéptidos en una muestra. Tales determinaciones se realizan usando cualquier formato de inmunoensayo adecuado, y cualquier polipéptido de la invención que se una específicamente al anticuerpo se puede usar como testigo
positivo.

Cualquiera o todas estas utilidades de investigación se pueden desarrollar en calidad de reactivo o formato de kit para comercialización como productos de investigación.

Métodos para llevar a cabo los usos enumerados anteriormente se conocen bien por los expertos en la técnica. Referencias que describen dichos métodos incluyen, sin limitación, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press., compiladores Sambrook, J. E. F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, y "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", compiladores Academic Press, Berger, S. L. y A. R. Kimmel, 1987.

4.7.2 Usos nutricionales

Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención se pueden usar también como fuentes o complementos nutricionales. Tales usos incluyen, sin limitación, el uso como complemento proteínico o aminoácido, uso como fuente de carbono, uso como fuente de nitrógeno y uso como fuente de carbohidrato. En tales casos, el polipéptido o polinucleótido de la invención se puede añadir al alimento de un organismo particular o se puede administrar como preparación sólida o líquida separada, como en forma de polvo, píldoras, soluciones, suspensiones o cápsulas. En el caso de microorganismos, el polipéptido o polinucleótido de la invención se puede añadir al medio en o sobre el que se cultiva el microorganismo.

Adicionalmente, los polipéptidos de la invención se pueden usar como marcadores, y como complemento alimenticio. Un polipéptido formado por la SEQ ID NO: 34, por ejemplo, tiene una masa molecular de aproximadamente 50,2 kDa en su estado no tratado y no glucosilado. Los complementos alimenticios proteínicos se conocen bien, y la formulación de complementos alimenticios adecuados que incluyen los polipéptidos de la invención, está dentro del nivel de especialidad en la técnica de preparación de alimentos.

4.7.3 Citoquina y actividad de proliferación/diferenciación celulares

Un polipéptido de la presente invención puede presentar actividad relacionada con citoquinas, actividad de proliferación celular (bien induciendo o inhibiendo) o diferenciación celular (bien induciendo o inhibiendo), o puede inducir la producción de otras citoquinas en ciertas poblaciones celulares. Un polinucleótido de la invención puede codificar un polipéptido que presente tales atributos. Muchos factores proteínicos descubiertos hasta la fecha, incluyendo todas las citoquinas conocidas, han mostrado actividad en uno o más ensayos de proliferación celular dependientes de uno o más factores y, por tanto, los ensayos sirven como confirmación conveniente de la actividad de citoquinas. La actividad de composiciones terapéuticas aquí descritas se pone de manifiesto mediante uno cualquiera de diversos ensayos rutinarios de proliferación celular dependientes de factores, para líneas celulares que incluyen, sin limitación, 32D, DA2, DA1G, 510, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+(preB M+), 2E8, TB5, DA1, 123, 51165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e, CMK, HUVEC y Caco. Las composiciones terapéuticas aquí descritas se pueden usar en lo siguiente:

Ensayos para proliferación de células T o timocitos, que incluyen sin limitación los descritos en: Current Protocols in Immunology, editado por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, ElM. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience (capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocite Function 3.1-3.19; Capítulo 7, Immunologic Studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Bertagnolli, et al., I. Immunol. 149:3778-3783, 1992; Bowman et al., I. Immunol, 152:1756-1761, 1994.

Ensayos para la producción de citoquinas y/o proliferación de células del bazo, células de los nódulos linfáticos o timocitos, que incluyen, sin limitación, los descritos en: Polyclonal T cell stimulation Kruisbeek, A.M y Shevach, E.M. en Currrent Protocols in Immunology, compiladores J. E. e.a. Coligan, vol1, págs. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons. Toronto, 1994; y Measurement of mouse and human interleukin-\gamma, Scheriber, R.D. en Current Protocols in Immunology, compiladores J. E. e.a. Coligan, vol 1, págs. 6.8.1-6.8.8 John Wiley and sons, Toronto, 1994.

Ensayos para proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas y linfopoyéticas que incluyen, sin limitación, los descritos en: Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K, Davis, L.S. y Lipsky, P.E. en Current Protocols in Immunology, compiladores J. E. e.a. Coligan, vol 1, págs. 6.3.1.-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; deVries et al. J. Exp. Med. 173:1205-1211, 1991; Moreau et al., Nature 336:690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin6-Nordan, R. en Current Protocols in Immunology, compiladores J. E. Coligan, vol 1, págs. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Smith et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:1857-1861, 1986; Measurements of human Interleukin 11—Bennett, F. Giannotti, J. Clark, S.C. y Turner, K. J. en Current Protocols in Immunology, compiladores J. E. Coligan, vol 1, págs 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9-Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S.C. y Turner, K: J. en Current Protocols in Immunology, compiladores J. E. Coligan, vol.1, pág. 6.3.1., John Wiley and Sons, Toronto, 1991.

Ensayos para respuestas del clon de células T a antígenos (que identificarán, entre otros, proteínas que afectan a las interacciones entre células T y APC, así como efectos directos sobre las células T, midiendo la proliferación y la producción de citoquinas) incluyen, sin limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology, editado por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, publicado por Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience (Capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocite Function: Capítulo 6, Cytokines and their cellulr receptors; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:6091-6095, 1980:; Weinberger et al., Eur. J. Immun., 11:405-411, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137-3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988.

4.7.4 Actividad del factor de crecimiento de células madre

Un polipéptido de la presente invención puede presentar actividad de factor de crecimiento de células madre y estar implicado en la proliferación, diferenciación y supervivencia de células madre pluripotentes y totipotentes, incluyendo células germinales primordiales, células madre embrionarias, células madre hematopoyéticas y/o células madre de la línea germinal. La administración del polipéptido de la invención a células madre in vivo o ex vivo puede mantener y expandir las poblaciones celulares en un estado totipotencial o pluripotencial, lo cual sería útil para volver a producir tejidos dañados o enfermos, trasplante, fabricación de sustancias biofarmacéuticas y desarrollo de biosensores. La capacidad de producir grandes cantidades de células humanas tiene aplicaciones de trabajo importantes para la producción de proteínas humanas, que actualmente se tienen que obtener de fuentes o donantes no humanos, implante de células para tratar enfermedades tales como Parkinson, Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas; tejidos para injertos, como médula ósea, piel, cartílago, tendones, hueso, músculo (incluyendo músculo cardíaco), vasos sanguíneos, córnea, células neuronales, células gastrointestinales y otras; y órganos para trasplante como riñón, hígado, páncreas (incluyendo células de islotes), corazón y pulmón.

Se considera que se pueden administrar múltiples factores de crecimiento y/o citoquinas exógenos diferentes en combinación con el polipéptido de la invención, para lograr el efecto deseado, incluyendo cualquiera de los factores de crecimiento enumerados aquí, otros factores de mantenimiento de células madre, e incluyendo específicamente el factor de células madre (SCF), el factor inhibidor de leucemia (LIF), el ligando Flt-3 (Flt-3L), cualquiera de las interleuquinas, receptor IL-6 soluble, recombinante, fusionado con IL-6, la proteína inflamatoria de macrófagos 1-alfa (MIP-1-alfa), G-CSF, GM-CSF, trombopoyetina (TPO), factor 4 de plaquetas (PF-4), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento neuronales y factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF).

Debido a que las células madre totipotentes pueden originar virtualmente cualquier tipo celular maduro, la expansión de estas células en cultivo facilitará la producción de grandes cantidades de células maduras. Las técnicas para cultivar células madre son conocidas en la técnica y la administración de polipéptidos de la invención, opcionalmente con otros factores de crecimiento y/o citoquinas, se espera que incremente la supervivencia y proliferación de las poblaciones de células madre. Esto se puede lograr mediante administración directa del polipéptido de la invención al medio de cultivo. Alternativamente, se pueden usar células estromales transfectadas con un polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención, como capa nutritiva para las poblaciones de células madre en cultivo o in vivo. Las células de soporte estromales para capas nutritivas pueden incluir fibroblastos de médula ósea embrionaria, células estromales de médula ósea, células de hígado fetal o fibroblastos embrionarios cultivados (véase Patente de EE.UU. Nº 5.690.926).

Las propias células madre se pueden transfectar con un polinucleótido de la invención para inducir la expresión autocrina del polipéptido de la invención. Esto permitirá la producción de líneas de células madre totipotenciales/pluripotenciales indiferenciadas, que son útiles como tales, o pueden diferenciarse a continuación en los tipos celulares maduros deseados. Estas líneas celulares estables pueden servir también como fuente de ARNm totipotencial/pluripotencial indiferenciado para crear genotecas de ADNc y moldes para experimentos de reacción en cadena de la polimerasa. Estos estudios permitirán el aislamiento e identificación de genes expresados diferencialmente en poblaciones de células madre, que regulan la proliferación y/o mantenimiento de células madre.

La expansión y mantenimiento de poblaciones de células madre totipotentes serán útiles en el tratamiento de muchos estados patológicos. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar para manipular células madre en cultivo para producir células neuroepiteliales que se pueden usar para aumentar o reemplazar células dañadas por enfermedad, enfermedad autoinmunitaria, lesión accidental o trastornos genéticos. El polipéptido de la invención puede ser útil para inducir la proliferación de células neuronales y para la regeneración de tejido nervioso y cerebral, es decir, para el tratamiento de enfermedades y neuropatías del sistema nervioso central y periférico, así como trastornos mecánicos y traumáticos que implican degeneración, muerte o traumatismo de las células neuronales o el tejido nervioso. Además, estas células se pueden cultivar in vitro para formar otras células diferenciadas, como tejido cutáneo, que se puede usar para trasplante. Además, las poblaciones de células madre expandidas se pueden alterar también genéticamente para fines de terapia génica y para reducir el rechazo del hospedador de tejidos reemplazados, después del injerto o implante.

La expresión del polipéptido de la invención y su efecto sobre las células madre también se puede manipular, para lograr una diferenciación controlada de las células madre en tipos celulares más diferenciados. Un método ampliamente aplicable de obtener poblaciones puras de un tipo celular diferenciado específico a partir de poblaciones de células madre indiferenciadas, implica el uso de un promotor específico del tipo celular, que dirige un marcador seleccionable. El marcador seleccionable permite sobrevivir sólo a células del tipo deseado. Por ejemplo, se puede inducir a las células madre a diferenciarse en cardiomiocitos (Wobus et al., Differntiation, 48:173-182, (1991); Klug et al., J. Clin. Invest., 98(1):216-224, (1998)) o células de músculo esquelético (Browder, L. W. en: Principles of tissue Engineering, editores Lanza et al., Academic Press (1997). Alternativamene, se puede lograr una diferenciación dirigida de las células madre cultivando las células madre en presencia de un factor de diferenciación, como ácido retinoico, y un antagonista del polipéptido de la invención, que inhibiría los efectos de la actividad del factor de células madre endógeno, y permitiría continuar la diferenciación.

Los cultivos in vitro de células madre se pueden usar para determinar si los polipéptidos de la invención presentan actividad de factor de crecimiento de células madre. Las células madre se aislan de una cualquiera de varias fuentes celulares (incluyendo células madre hematopoyéticas y células madre embrionarias) y se cultivan sobre una capa nutritiva, según se describió por Thompson et al., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:7844-7848 (1995), en presencia del polipéptido de la invención, solo o en combinación con otros factores de crecimiento o citoquinas. La capacidad del polipéptido de la invención de inducir la proliferación de células madre se determina mediante formación de colonias sobre soporte semisólido, p.ej. según se describió por Bernstein et al., Blood, 77:2316-2321 (1991).

4.7.5 Actividad reguladora de hematopoyesis

Un polipéptido de la presente invención puede estar implicado en la regulación de la hematopoyesis y, consecuentemente, en el tratamiento de trastornos de células mieloides o linfoides. Incluso la actividad biológica marginal en el soporte de células formadoras de colonias o líneas celulares dependientes de factores indica la implicación en la regulación de la hematopoyesis, p.ej., soportando el crecimiento y proliferación de células progenitoras eritroides, solas o en combinación con otras citoquinas, indicando por ello la utilidad, por ejemplo, en el tratamiento de diversas anemias, o para uso conjunto con radiación/quimioterapia, para estimular la producción de precursores eritorides y/o células eritroides; soportando el crecimiento y proliferación de células mieloides como granulocitos y monocitos/macrófagos (es decir, actividad tradicional de factor estimulante de colonias) útiles, por ejemplo, junto con la quimioterapia para prevenir o tratar la mielosupresión consiguiente; soportando el crecimiento y proliferación de megacariocitos y consecuentemente de plaquetas, permitiendo así la prevención o tratamiento de diversos trastornos de las plaquetas como trombocitopenia y, en general, para uso en lugar de las transfusiones de plaquetas o de forma complementaria; y/o soportando el crecimiento y proliferación de células madre hematopoyéticas que son capaces de madurar hasta cualquiera y todas las células hematopoyéticas mencionadas anteriormente y, por tanto, tienen utilidad terapéutica en diversos trastornos de células madre (como los tratados normalmente con trasplante, incluyendo, sin limitación, anemia aplásica y hemoglobinuria noctuARN paroxística), así como en repoblar el compartimiento de células madre después de irradiación/quimioterapia, bien in vivo o ex vivo (es decir, conjuntamente con el trasplante de médula ósea o con trasplante de células progenitoras periféricas (homólogo o heterólogo)), como células normales o manipuladas genéticamente para terapia génica.

Las composiciones terapéuticas descritas aquí, se pueden usar en lo siguiente:

Anteriormente se citan ensayos adecuados para proliferación y diferenciación de diversas líneas hematopoyéticas.

Ensayos para diferenciación de células madre embrionarias (que identificarán, entre otras, proteínas que influencian la hematopoyesis de diferenciación embrionaria) incluyen, sin limitación, los descritos en: Hohansson et al., Cellular Biology 15:141-151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13:473-486, 193; McClanahan et al., Blood 81:2903-2915, 1993.

Los ensayos para la supervivencia y diferenciación de células madre (que identificarán, entre otras, proteínas que regulan la linfo-hematopoyesis) incluyen, sin limitación, los descritos en: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M.G. en Culture of Hematopoietic Cells, compiladores R.I. Freshney et al., vol 1, págs. 265-268, Wiley-Liss, Inc. New York, N.Y. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I. K. y Briddel, R.A. en Culture of Hematopoietic Cells, compiladores R. I. Freshney et al., vol 1 págs. 23-39, Wiley-Liss, Inc. New York, N.Y. 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R. E. en Culture of Hematopoietic Cells, compiladores R. I. Freshney et al., vol 1 págs. 1-21, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. y Allen, T. en Culture of Hematopoietic Cells, compiladores R. I. Freshney et al., vol 1 págs. 163-179, Wiley-Liss, Inc., New York,
N.Y. 1994.

4.7.6 Actividad de crecimiento de tejidos

Un polipéptido de la presente invención puede estar implicado también en el crecimiento o regeneración del hueso, cartílago, tendón, ligamento y/o tejido nervioso, así como en la cicatrización de heridas y reparación y reemplazamiento de tejido, y en la cicatrización de quemaduras, incisiones y úlceras.

Un polipéptido de la presente invención, que induce el crecimiento de cartílago y/o hueso, en circunstancias en las que no se forma normalmente hueso, se aplica en la cicatrización de fracturas de hueso y deterioro de cartílagos o defectos en seres humanos y otros animales. Las composiciones de un polipéptido, anticuerpo, pareja de unión u otro modulador de la invención pueden tener un uso profiláctico en la reducción de fracturas cerradas, así como abiertas, y también en la fijación mejorada de uniones artificiales. La formación de hueso de novo inducida por una sustancia osteogénica contribuye a la reparación de defectos craneofaciales congénitos, inducidos por traumatismo o resección oncológica, y también es útil en cirugía plástica cosmética.

Un polipéptido de esta invención puede estar implicado también en la atracción de células formadoras de hueso, estimulación del crecimiento de células formadoras de hueso o inducción de la diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso. También es posible el tratamiento de la osteoporosis, osteoartritis, trastornos degenerativos óseos o enfermedad periodontal, usando la composición de la invención, por ejemplo mediante la estimulación de la reparación del hueso y/o cartílago, o bloqueando la inflamación o procesos de destrucción tisular (actividad colagenasa, actividad de osteoclastos, etc.) en los que intervienen procesos inflamatorios.

Otra categoría de actividad de regeneración tisular que puede implicar al polipéptido de la presente invención es la formación de tendones/ligamentos. La inducción de formación de tejidos de tipo tendón/ligamento u otra formación de tejidos, en circunstancias en las que tal tejido no se forma normalmente, se aplica en la cicatrización de desgarros de tendones o ligamentos, deformidades y otros defectos de tendones o ligamentos en seres humanos y otros animales. Tal preparación que emplea una proteína inductora de tejido análogo a tendón/ligamento, puede presentar un uso profiláctico en la prevención del deterioro de tejido de tendones o ligamentos, así como un uso en la fijación mejorada del tendón o ligamento al hueso u otros tejidos, y en la reparación de defectos en el tejido de tendones o ligamentos. La formación de novo de tejido análogo a tendones o ligamentos, inducida por una composición de la presente invención, contribuye a la reparación de defectos de tendones o ligamentos congénitos, inducidos por traumatismo o de otro origen, y también es útil en cirugía plástica cosmética, para la unión o reparación de tendones o ligamentos. Las composiciones de la presente invención pueden proporcionar un medio para atraer células formadoras de tendones o ligamentos, estimular el crecimiento de células formadoras de tendones o ligamentos, inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de tendones o ligamentos, o inducir el crecimiento de células de tendones/ligamentos o progenitores ex vivo, para volver a efectuar la reparación tisular in vivo. Las composiciones de la invención pueden ser útiles también en el tratamiento de la tendinitis, el síndrome del túnel carpiano y otros defectos de tendones o ligamentos. Las composiciones pueden incluir también una matriz y/o sustancia secuestrante apropiada como vehículo, como es bien conocido en la técnica.

Las composiciones de la invención pueden ser útiles también para la proliferación de células neuronales y para la regeneración de tejido nervioso y cerebral, es decir, para el tratamiento de enfermedades y neuropatías del sistema nervioso central y periférico, así como trastornos mecánicos y traumáticos, que implican la degeneración, muerte o traumatismo de células neuronales o tejido nervioso. Más específicamente, se puede usar una composición en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso periférico, como lesiones en los nervios periféricos, neuropatía periférica y neuropatías localizadas y enfermedades del sistema nervioso central, como enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y síndrome de Shy-Drager. Otras enfermedades que se pueden tratar según la presente memoria incluyen trastornos mecánicos y traumáticos, como trastornos de la médula espinal, traumatismo encefálico y otras enfermedades cerebrovasculares, como el ictus. Las neuropatías periféricas resultantes de la quimioterapia u otras terapias médicas se pueden tratar también usando una composición de la invención.

Las composiciones de la invención pueden ser útiles también para favorecer un cierre mejor o más rápido de heridas que no cicatrizan, incluyendo sin limitación úlceras de presión, úlceras asociadas con insuficiencia vascular, heridas quirúrgicas y traumáticas, y similares.

Las composiciones de la presente invención pueden estar implicadas también en la producción o regeneración de otros tejidos, como órganos (incluyendo, por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñón, piel, endotelio), músculo (liso, esquelético o cardíaco) y tejido vascular (incluyendo el endotelio vascular), o para favorecer el crecimiento de células comprendidas en tales tejidos. Parte de los efectos deseados pueden producirse mediante inhibición o modulación de la cicatrización fibrótica, y pueden permitir que el tejido normal se regenere. Un polipéptido de la presente invención puede presentar también actividad angiogénica.

Una composición de la presente invención puede ser útil también para la protección del intestino o regeneración y tratamiento de fibrosis pulmonar o hepática, lesión por reperfusión en diversos tejidos, y enfermedades resultantes de lesiones de citoquinas sistémicas.

Una composición de la presente invención puede ser útil también para favorecer o inhibir la diferenciación de tejidos descritos anteriormente, a partir de células o tejidos precursores, o para inhibir el crecimiento de tejidos descritos anteriormente.

Las composiciones terapéuticas aquí descritas se pueden usar en lo siguiente:

Ensayos para actividad de regeneración tisular que incluyen, sin limitación, los descritos en: publicación de Patente Internacional Nº WO 95/16035 (hueso, cartílago, tendón); publicación de Patente Internacional Nº WO 95/05846 (nervio, neuronal); publicación de Patente Internacional Nº WO 91/07491 (piel, endotelio).

Los ensayos para actividad de cicatrización de heridas incluyen, sin limitación, los descritos en: Winter. Epidermal Wound Healing, págs. 71-112 (compiladores Maibach, H. I. y Rovee, D. T.), Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, modificado por Eaglstein y Mertz, J. Invest. Dermatol. 71:382-84 (1978).

4.7.7 Actividad estimuladora o supresora de la función inmunológica

Un polipéptido de la presente invención puede presentar también actividad estimulante o supresora inmunológica incluyendo, sin limitación, las actividades para las cuales se describen aquí ensayos. Un polinucleótido de la invención puede codificar un polipéptido que presente tales actividades. Una proteína puede ser útil en el tratamiento de diversas deficiencias y trastornos inmunológicos (incluyendo inmunodeficiencia combinada grave (SCID)), p.ej., regulando (incrementando o disminuyendo) el crecimiento y proliferación de linfocitos T y/o B, así como afectando a la actividad citolítica de células NK y otras poblaciones celulares. Estas deficiencias inmunológicas pueden ser genéticas o producidas por infecciones víricas (p.ej. VIH), así como bacterianas o fúngicas, o pueden originarse por trastornos autoinmunitarios. Más específicamente, enfermedades infecciosas producidas por infección vírica, bacteriana, fúngica y otras, se pueden tratar usando una proteína de la presente invención, incluyendo infecciones por VIH, virus de la hepatitis, virus del herpes, micobacterias, género Leishmania, género Malaria y diversas infecciones fúngicas, como candidiasis. Por supuesto, en este aspecto, las proteínas de la presente invención pueden ser útiles también cuando puede ser deseable un refuerzo del sistema inmunitario en general, por ejemplo en el tratamiento del cáncer.

Los trastornos autoinmunitarios que se pueden tratar usando una proteína de la presente invención incluyen, por ejemplo, enfermedad del tejido conectivo, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, inflamación pulmonar autoinmunitaria, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis autoinmunitaria, diabetes mellitus dependiente de insulina, miastenia grave, enfermedad injerto-contra-huésped y enfermedad ocular inflamatoria autoinmunitaria. Tal proteína (o sus antagonista, incluyendo anticuerpos) de la presente invención, puede ser útil también en el tratamiento de reacciones y enfermedades alérgicas (p.ej., anafiláxis, enfermedad del suero, reacciones a fármacos, alergias alimentarias, alergias al veneno de insectos, mastocitosis, rinitis alérgica, neumonitis de hipersensibilidad, urticaria, angioedema, eccema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, eritema multiforme, síndroma de Stevens-Johnson, conjuntivitis alérgica, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis venérea, conjuntivitis papilar gigante y alergias de contacto), como asma (particularmente asma alérgico) u otros problemas respiratorios. Otras enfermedades, en las que se desee la supresión inmunitaria (incluyendo, por ejemplo, el trasplante de órganos), pueden ser tratables también usando una proteína (o sus antagonistas) de la presente invención. Los efectos terapéuticos de los polipéptidos o sus antagonistas sobre las reacciones alérgicas, se pueden evaluar mediante modelos animales in vivo, como el ensayo de incremento de contacto acumulativo (Lastborn et al, Toxicology 125:59-66, 1998), prueba de punción cutánea (Hoffmann et al., Allergy 54:446-54, 1999), prueba de sensibilización cutánea de cobayas (Vohr et al., Arch. Toxicol. 73:501-9) y prueba de nódulos linfáticos locales murinos (Kimber et al., J. Toxicol. Environ. Health 53:563-79).

Usando las proteínas de la invención puede ser posible también modular respuestas inmunológicas, de diversas formas. La regulación por disminución puede producirse como inhibición o bloqueo de una respuesta inmunitaria ya en curso, o puede implicar la prevención de la inducción de una respuesta inmunitaria. Las funciones de las células T activadas pueden inhibirse suprimiendo las respuestas de células T o induciendo tolerancia específica en las células T, o ambas. La inmunosupresión de las respuestas de células T es, generalmente, un proceso activo, no específico para antígeno, que requiere la exposición continua de las células T a la sustancia supresora. La tolerancia, que implica la inducción de arreactividad o anergia en células T es distinguible de la inmunosupresión, en que es generalmente específica para antígeno y persiste una vez que ha cesado la exposición a la sustancia inductora de tolerancia. Operacionalmente, la tolerancia se puede demostrar mediante la carencia de una respuesta de células T, tras la exposición repetida a un antígeno específico, en ausencia de la sustancia inductora de tolerancia.

La regulación por disminución o prevención de una o más funciones antigénicas (incluyendo, sin limitación, las funciones de antígeno de linfocitos B (como, por ejemplo, B7)), p.ej., evitando la síntesis de concentraciones elevadas de linfoquina, mediante células T activadas), será útil en situaciones de trasplantes de tejidos, piel y órganos y en la enfermedad injerto-contra-huésped (EICH). Por ejemplo, el bloqueo de la función de las células T debería producir una destrucción de tejido reducida en el trasplante de tejidos. Típicamente, en trasplantes de tejidos, el rechazo del trasplante se inicia a través de su reconocimiento como extraño por las células T, seguido de una reacción inmunológica que destruye el trasplante. La administración de una composición terapéutica aquí descrita, puede evitar la síntesis de citoquinas por células inmunitarias, como las células T y, por tanto, actuar como un inmunosupresor. Asimismo, una carencia de estimulación conjunta puede ser suficiente también para anergizar las células T, induciendo así la tolerancia en un sujeto. La inducción de tolerancia a largo plazo mediante reactivos bloqueantes de antígenos de linfocitos B puede evitar la necesidad de una administración repetida de estos reactivos bloqueantes. Para lograr una inmunosupresión o tolerancia suficiente en un sujeto, puede ser necesario también bloquear la función de una combinación de antígenos de linfocitos B.

La eficacia de composiciones terapéuticas particulares en la prevención del rechazo de trasplantes de órganos o EICH, se puede valorar usando modelos animales que son predictivos de la eficacia en seres humanos. Ejemplos de sistemas apropiados que se pueden usar incluyen injertos cardíacos alogénicos en ratas e injertos de células de islotes pancreáticos en ratones, que se han usado ambos para examinar los efectos inmunosupresores de proteínas de fusión CTLA4Ig in vivo, según se describió en Lenschow et al., Science 257:789-792 (1992) y Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11102-11105 (1992). Además, se pueden usar modelos murinos de EICH (véase Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, 1989, págs. 846-847) para determinar el efecto de las composiciones terapéuticas descritas aquí, sobre el desarrollo de tal enfermedad.

El bloqueo de la función antigénica puede ser también útil terapéuticamente para tratar enfermedades autoinmunitarias. Muchos trastornos autoinmunitarios son el resultado de la activación inapropiada de células T que son reactivas frente a tejido propio, y que favorecen la producción de citoquinas y autoanticuerpos implicados en la patología de las enfermedades. Evitar la activación de las células T autorreactivas puede reducir o eliminar los síntomas de enfermedad. La administración de reactivos que bloquean la estimulación de células T puede usarse para inhibir la activación de las células T y evitar la producción de autoanticuerpos o citoquinas derivadas de células T, que pueden estar implicados en el proceso de la enfermedad. Adicionalmente, el bloqueo de los reactivos puede inducir tolerancia específica de antígeno de las células T autorreactivas, que podría conducir a un alivio de la enfermedad a largo plazo. La eficacia de las sustancias bloqueantes en la prevención o alivio de los trastornos autoinmunitarios se puede determinar usando diversos modelos animales de enfermedades autoinmunitarias humanas bien caracterizados. Los ejemplos incluyen encefalitis autoinmunitaria experimental murina, el lupus eritematoso sistémico en ratones MRL/LPR/LPR o ratones híbridos NZB, artritis de colágeno autoinmunitaria murina, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB y miastenia grave
experimental murina (véase Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, 1989, págs. 840-856).

La regulación por incremento de una función antigénica (p.ej., función antigénica de linfocitos B), como medio para regular por incremento las respuestas inmunitarias, puede ser útil también en terapia. La regulación por incremento de las respuestas inmunitarias puede consistir en incrementar una respuesta inmunitaria existente o provocar una respuesta inmunitaria inicial. Por ejemplo, incrementar una respuesta inmunitaria puede ser útil en casos de infección vírica, incluyendo enfermedades víricas sistémicas como la gripe, el catarro común y la encefalitis.

Alternativamente, las respuestas inmunitarias antivíricas se pueden incrementar en un paciente infectado extrayendo las células T del paciente, estimulando conjuntamente las células T in vitro con APCs pulsadas con antígeno vírico, bien expresando un péptido descrito o junto con una forma estimuladora de un péptido soluble descrito aquí, y volviendo a introducir las células T activadas in vitro, en el paciente. Otro método para incrementar las respuestas inmunitarias antivíricas sería aislar células infectadas de un paciente, trasnfectarlas con un ácido nucleico que codifique una proteína de la presente invención, según se describe aquí, de forma que las células expresen la totalidad o una parte de la proteína sobre su superficie, y volver a introducir las células transfectadas en el paciente. Las células infectadas serían ahora capaces de suministrar una señal coestimuladora y, por tanto, activar las células T in vivo.

Un polipéptido de la presente invención puede proporcionar la señal de estimulación necesaria a las células T para inducir una respuesta inmunitaria en la que intervienen las células T, frente a las células tumorales transfectadas. Además, las células tumorales que carecen de moléculas de clase I o de clase II del MHC, o que son incapaces de volver a expresar cantidades suficientes de moléculas de clase I o de clase II del MHC, se pueden transfectar con ácido nucleico que codifica la totalidad o una parte (p.ej. una parte truncada del dominio citoplásmico) de una cadena proteínica alfa de clase I del MHC y una proteína de microblobulina \beta_{2}, o una cadena alfa de clase II del MHC y una proteína de cadena beta de clase II del MHC, para expresar así las proteínas de clase I o de clase II del MHC sobre la superficie celular. La expresión del MHC de clase I o II apropiado, junto con un péptido que tiene la actividad de un antígeno de linfocitos B (p.ej., B7-1, B7-2, B7-3) induce una respuesta inmunitaria en la que intervienen células T, frente a la célula tumoral transfectada. Opcionalmente, un gen que codifica una construcción antisentido que bloquea la expresión de una proteína asociada a la clase II del MHC, como la cadena invariable, se puede transfectar también conjuntamente con un ADN que codifica un péptido que tiene la actividad de un antígeno de linfocito B, para favorecer la presentación de antígenos asociados a tumores, e inducir inmunidad específica de tumores. Por tanto, la inducción de una respuesta inmunitaria en la que intervienen células T, en un sujeto humano, puede ser suficiente para remediar la tolerancia específica de tumor en el sujeto.

La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, medirse mediante los siguientes métodos:

Ensayos adecuados para citotoxicidad de timocitos o esplenocitos incluyen, sin limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology, editado por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D, H. Margulies, E:M, Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience (Capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Hermann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al, J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., I. Immunol. 137-3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bowman et al., J. Virology 61:1992-1998; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153:3079-3092, 1994.

Ensayos para respuestas de inmunoglobulina dependientes de células T y que cambian el isotipo (que identificarán, entre otras, proteínas que modulan respuestas de anticuerpos dependientes de células T y que afectan a los perfiles Th1/Th2) incluyen, sin limitación, los descritos en: Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990; y ensayos para la función de células B: In vitro antibody production, Mond, J. J. y Brunswick, M, en Current Protocols in Immunology, compiladores J. E. e.a. Coligan, vol 1, págs. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.

Ensayos de reacción de linfocitos mixta (MLR) (que identificarán, entre otras, proteínas que generan predominantemente respuestas Th1 y CTL) incluyen, sin limitación, los descritos en Current Protocols in Immunology, editado por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience (capítulo 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al. J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992.

Ensayos dependientes de células dendríticas (que identificarán, entre otras, proteínas expresadas por células dendríticas que activan células T nativas) incluyen, sin limitación, los descritos en: Guery et al., J. Immunol. 134:536-544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154:5071-5079, 1995; Porgador et al, Journal of Experimental Medicine 182:255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169:1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94:797-807, 1994; e Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640, 1990.

Ensayos para supervivencia/apoptosis de linfocitos (que identificarán, entre otras, proteínas que evitan la apoptosis tras la inducción de superantígenos y proteínas que regulan la homeostasis de linfocitos) incluyen, sin limitación, los descritos en: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53:1954-1951, 1993; Itoh et al., Cell 66:233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145:4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1:639-648, 1992.

Ensayos para proteínas que influencian las etapas tempranas del compromiso y desarrollo de células T incluyen, sin limitación, los descritos en: Antica et al., Blood 84:111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:111-122, 1994; Galy et al., Blood 85:2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7548-7551, 1991.

4.7.8 Actividad quimiotáctica/quimiocinética

Un polipéptido de la presente invención puede estar implicado en actividad quimiotáctica o quimiocinética para células de mamífero, incluyendo, por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, células cebadas, eosinófilos, células epiteliales y/o endoteliales. Un polinucleótido de la invención puede codificar un polipéptido que presente tales atributos. La activación de receptores quimiotácticos y quimiocinéticos se puede usar para movilizar o atraer una población celular deseada hacia un sitio deseado de acción. Las composiciones quimiotácticas o quimiocinéticas (p.ej., proteínas, anticuerpos, parejas de unión o moduladores de la invención) proporcionan ventajas particulares en el tratamiento de heridas y otros traumatismos de los tejidos, así como en el tratamiento de infecciones localizadas. Por ejemplo, la atracción de linfocitos, monocitos o neutrófilos hacia tumores o sitios de infección, puede producir respuestas inmunitarias mejoradas frente al tumor o a la sustancia infectiva.

Una proteína o péptido tiene actividad quimiotáctica para una población celular particular si puede estimular, directa o indirectamente, la orientación o movimiento dirigido de tal población celular. Preferiblemente, la proteína o péptido tiene la capacidad de estimular directamente el movimiento dirigido de células. Se puede determinar fácilmente si una proteína particular tiene actividad quimiotáctica para una población de células empleando tal proteína o péptido en cualquier ensayo conocido para quimiotaxis celular.

Las composiciones terapéuticas aquí descritas se pueden usar en lo siguiente:

Ensayos para actividad quimiotáctica (que identificarán proteínas que inducen o evitan la quimiotaxis) consisten en ensayos que miden la capacidad de una proteína para inducir la migración de células a través de una membrana, así como la capacidad de una proteína para inducir la adhesión de una población celular a otra población celular. Ensayos adecuados para movimiento y adhesión incluyen, sin limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology, compilado por J. E. coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience (Capítulo 6.12. Measurement of alpha and beta Chemokines 6.12.1-6.12.28); Taub et al., J. Clin. Invest. 95:1370-1376, 1995; Lind et al., APMIS 103:140-146, 1995; Muller et al., Eur. J. Immunol. 25:1744-1748; Gruber et al., J. of Immunol. 152:5860-5867, 1994; Johnston et al., J. of Immunol. 153:1762-1768, 1994.

4.7.9 Actividad hemostática y trombolítica

Un polipéptido de la invención puede estar implicado asimismo en la hemostasis o trombolisis o trombosis. Un polinucleótido de la invención puede codificar un polipéptido que presenta tales atributos. Las composiciones pueden ser útiles en el tratamiento de diversos trastornos de coagulación (incluyendo trastornos hereditarios, como hemofilias), o para favorecer la coagulación y otros sucesos hemostáticos en el tratamiento de heridas procedentes de traumatismos, cirugía u otras causas. Una composición de la invención puede ser útil también para disolver o inhibir la formación de trombos y para el tratamiento y prevención de enfermedades producidas por los mismos (como, por ejemplo, infarto de vasos cardíacos y del sistema nervioso central (p.ej. ictus)).

Las composiciones terapéuticas aquí descritas se pueden usar en lo siguiente:

Ensayos para la actividad hemostática y trombolítica incluyen, sin limitación, los descritos en: Linet et al., J. Clin. Pharmacol. 26:131-140, 1986; Burdick et al., Thrombosis Res. 45:413-419; Humphrey et al., Fibrinolysis 5:71-79 (1991); Schaub, Prostaglandins 35:467-474, 1988.

4.7.10 Diagnóstico y terapia del cáncer

Los polipéptidos de la invención pueden estar implicados en la producción, proliferación o metástasis de células cancerosas. La detección de la presencia o cantidad de polinucleótidos o polipéptidos de la invención puede ser útil para el diagnóstico y/o pronóstico de uno o más tipos de cáncer. Por ejemplo, la presencia o expresión incrementada de un polinucleótido/polipéptido de la invención, puede indicar un riesgo hereditario de cáncer, una enfermedad precancerosa, o una malignidad que avanza. A la inversa, un defecto en el gen o ausencia del polipéptido puede estar asociada con una enfermedad cancerosa. La identificación de polimorfismos de un solo nucleótido asociados con cáncer o con una predisposición al cáncer, puede ser útil también para el diagnóstico o pronóstico.

Los tratamientos del cáncer favorecen la regresión tumoral inhibiendo la proliferación de las células tumorales, inhibiendo la angiogénesis (crecimiento de nuevos vasos sanguíneos que es necesaria para mantener el crecimiento tumoral) y/o evitando la metástasis mediante la reducción de la movilidad o invasividad de las células tumorales. Las composiciones terapéuticas de la invención pueden ser efectivas en oncología pediátrica y de adultos, incluyéndolas en tumores/malignidades en fase sólida; tumores localmente avanzados; sarcomas de tejidos blandos humanos; cáncer metastásico, incluyendo metástasis linfáticas, malignidades de células sanguíneas, incluyendo mieloma múltiple, leucemias agudas y crónicas, y linfomas; cánceres de cabeza y cuello, incluyendo el cáncer de boca, cáncer de laringe y cáncer de tiroides; cánceres pulmonares, incluyendo carcinoma microcíticos y cánceres amicrocíticos; cánceres de mama, incluyendo carcinoma microcítico y carcinoma ductal; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer colorrectal y pólipos asociados con neoplasia colorrectal, cánceres pancreáticos, cáncer hepático; cánceres urológicos, incluyendo cáncer de vejiga y cáncer de próstata; malignidades del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma ovárico, cánceres uterinos (incluyendo el endometrial) y tumores sólidos en los folículos ováricos; cánceres de riñón, incluyendo el carcinoma de células renales; cánceres cerebrales, incluyendo tumores cerebrales intrínsecos, neuroblastoma, tumores cerebrales astrocíticos, gliomas, invasión de células tumorales metastásicas en el sistema nervioso central; cánceres óseos, incluyendo osteomas; cánceres cutáneos, incluyendo melanoma maligno, progresión tumoral de queratinocitos cutáneos humanos, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, hemangiopericitoma y sarcoma de Kaposi.

Los polipéptidos, polinucleótidos o moduladores de polipéptidos de la invención (incluyendo los inhibidores y estimuladores de la actividad biológica del polipéptido de la invención), se pueden administrar para tratar el cáncer. Las composiciones terapéuticas se pueden administrar en dosis terapéuticamente efectivas, solas o en combinación con terapia auxiliar del cáncer, como cirugía, quimioterapia, radioterapia, termoterapia y tratamiento con láser, y pueden proporcionar un efecto beneficioso, p.ej. reduciendo el tamaño del tumor, reduciendo la velocidad de crecimiento tumoral, inhibiendo la metástasis, o mejorando de otra forma el estado clínico general, sin erradicar necesariamente el cáncer.

La composición se puede administrar asimismo en cantidades terapéuticamente efectivas como una parte de un cóctel antitumoral. Un cóctel antitumoral es una mezcla del polipéptido o modulador de la invención con uno o más fármacos antitumorales, además de un vehículo farmacéuticamente aceptable para el suministro. El uso de cócteles antitumorales como tratamiento del cáncer es rutinario. Los fármacos antitumorales que se conocen bien en la técnica y se pueden usar como tratamiento en combinación con el polipéptido o modulador de la invención incluyen: Actinomicina D, aminoglutetimida, asparaginasa, bleomicina, busulfán, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino (cis-DDP), ciclofosfamida, HCI de citarabina (arabinósido de citosina), dacarbazina, dactinomicina, HCI de daunorubicina, HCI de doxorubicina, fosfato sódico de estramustina, etopósido (V16-213), floxuridina, 5-fluorouracilo (5-Fu), flutamida, hidroxiurea (hidroxicarbamida), ifosfamida, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, acetato de leuprolida (análogo del factor liberador de LHRH), lomustina, HCI de mecloretamina (mostaza nitrogenada), melfalán, mercaptopurina, mesna, metotrexato (MTX), mitomicina, mitoxantrona HCI, octreotida, plicamicina, HCI de procarbazina, estreptozocina, citrato de tamoxifén, tioguanina, tiotepa, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, amsacrina, azacitidina, hexametilmelamina, interleuquina-2, mitoguazona, pentostatina, semustina, tenipósido y sulfato de vindesina.

Además, las composiciones terapéuticas aquí descritas se pueden usar para el tratamiento profiláctico del cáncer. Hay estados hereditarios y/o situaciones ambientales (p.ej. la exposición a carcinógenos) conocidos en la técnica, que predisponen a un individuo a desarrollar cánceres. Bajo estas circunstancias, puede ser beneficioso tratar a estos individuos con dosis terapéuticamente efectivas del polipéptido de la invención, para reducir el riesgo de desarrollar cánceres.

Se pueden usar modelos in vitro para determinar las dosis efectivas del polipéptido de la invención como tratamiento potencial del cáncer. Estos modelos in vitro incluyen ensayos de proliferación de células tumorales cultivadas, crecimiento de células tumorales cultivadas en agar blando (véase Freshney, (1987) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wiley-Liss, Nueva York, NY, capítulo 18 y capítulo 21), sistemas tumorales en ratones inmunosuprimidos, según se describen en Giovanella et al., J. Natl. Can. Inst., 52:921-30 (1974), movilidad y potencial invasivo de células tumorales en ensayos en cámara de Boyden, según se describen en Pilkington et al., Anticancer Res., 17:4107-9 (1997), y ensayos de angiogénesis, como inducción de vascularización de la membrana corioalantoica de pollo o inducción de migración celular endotelial vascular, según se describe en Ribatta et al., Intl. J. Dev. Biol., 40:1189-97 (1999) y Li et al., Clin. Exp. Metastasis, 17:423-9 (1999), respectivamente. Están disponibles líneas de células tumorales adecuadas, p.ej. de los catálogos de la American Type Tissue Culture Collection.

4.7.11 Actividad de receptor/ligando

Un polipéptido de la presente invención puede demostrar también actividad como receptor, ligando de receptor o inhibidor o agonista de interacciones receptor/ligando. Un polinucleótido de la invención puede codificar un polipéptido que presente tales características. Ejemplos de tales receptores y ligandos incluyen, sin limitación, receptores de citoquina y sus ligandos, receptores de quinasas y sus ligandos, receptores de fosfatasas y sus ligandos, receptores implicados en interacciones entre células y sus ligandos (incluyendo, sin limitación, moléculas de adhesión celular (como selectinas, integrinas y sus ligandos) y parejas de receptor/ligando implicadas en la presentación de antígenos, reconocimiento de antígenos y desarrollo de respuestas inmunitarias celulares y humorales. Los receptores y ligandos son útiles asimismo para la detección selectiva de inhibidores potenciales peptídicos o de molécula pequeña, de la interacción receptor/ligando relevante. Una proteína de la presente invención (incluyendo, sin limitación, fragmentos de receptores y ligandos), puede ser útil por sí misma como inhibidor de las interacciones receptor/ligando.

La actividad de un polipéptido de la invención se puede medir, entre otros medios, mediante los siguientes métodos:

Ensayos adecuados para la actividad receptor-ligando, incluyen, sin limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology, compilado por E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience (capítulo 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.28.1-7.28.22), Takai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6864-6868, 1987; Bierer et al. J. Exp. Med. 168:1145-1156, 1988; Rosenstein et al., J. Exp. Med. 169:149-160, 1989; Stoltenborg et al., J. Immunol. Methods 175:59-68, 1994; Stitt et al., Cell 80:661-670, 1995.

A modo de ejemplo, los polipéptidos de la invención se pueden usar como receptor para un ligando o ligandos, transmitiendo la actividad biológica de ese ligando o ligandos. Los ligandos se pueden identificar mediante ensayos de unión, cromatografía de afinidad, ensayos de detección sistemática de dihíbridos, ensayos BIAcore, ensayos de solapamiento en gel, u otros métodos conocidos en la técnica.

Los estudios de caracterización de fármacos o proteínas como agonistas o antagonistas, o agonistas o antagonistas parciales, requieren el uso de otras proteínas como ligandos competitivos. Los polipéptidos de la presente invención o su ligando o ligandos se pueden marcar acoplándolos a radioisótopos, moléculas colorimétricas o moléculas de toxina, mediante métodos convencionales ("Guide to Protein Purification" Murray P. Deutscher (ed) Methods in Enzymology, vol. 182 (1990), Academic Press Inc. San Diego). Ejemplos de radioisótopos incluyen, pero no están limitados a, tritio y carbono-14. Ejemplos de moléculas colorimétricas incluyen, pero no están limitados a, moléculas fluorescentes como fluorescamina, o rodamina u otras moléculas colorimétricas. Ejemplos de toxinas incluyen, pero no están limitados a, ricino.

4.7.12 Detección sistemática de fármacos

Esta invención es particularmente útil para la detección sistemática de compuestos químicos, usando los nuevos polipéptidos o sus fragmentos de unión, en cualquiera de una pluralidad de técnicas de detección sistemática de fármacos. Los polipéptidos o fragmentos empleados en tal ensayo pueden, bien estar libres en solución, fijados a un soporte sólido, situados sobre una superficie celular o localizados intracelularmente. Un método de detección sistemática de fármacos utiliza células hospedadoras eucarióticas o procarióticas que se transforman de forma estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido o su fragmento. Los fármacos se detectan sistemáticamente frente a tales células transformadas en ensayos de unión competitiva. Tales células, bien en forma viable o fijada, se pueden usar para ensayos de unión estándar. Uno puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre los polipéptidos de la invención o sus fragmentos, y la sustancia que se está ensayando; o examinar la disminución en la formación del complejo entre los nuevos polipéptidos y una línea celular apropiada, que se conocen bien en la técnica.

Las fuentes para compuestos de ensayo que se pueden analizar sistemáticamente para la capacidad de unir o modular (es decir, incrementar o reducir) la actividad de los polipéptidos de la invención, incluyen (1) bibliotecas químicas inorgánicas y orgánicas, (2) bibliotecas de productos naturales, y (3) bibliotecas combinatorias, formadas por péptidos, oligonucleótidos o moléculas orgánicas aleatorios o miméticos.

Las bibliotecas químicas se pueden sintetizar o comprar fácilmente de diversas fuentes comerciales, y pueden incluir análogos estructurales de compuestos conocidos o compuestos que se identifican como "blancos" o "guía", a través de detección sistemática de productos naturales.

Las fuentes de bibliotecas de productos naturales son microorganismos (incluyendo bacterias y hongos), plantas u otra vegetación, u organismos marinos, y se pueden crear bibliotecas de mezclas para detección sistemática, mediante: (1) fermentación y extracción de caldos del suelo, plantas o microorganismos marinos; o (2) extracción de los propios organismos. Las bibliotecas de productos naturales incluyen policétidos, péptidos no ribosómicos y sus variantes (no existentes en la naturaleza). Para un análisis, véase Science 282:63-68 (1998).

Las bibliotecas combinatorias están compuestas de gran número de péptidos, oligonucleótidos o compuestos orgánicos y se pueden preparar fácilmente mediante métodos de síntesis automatizados tradicionales, PCR, clonación o métodos sintéticos de uso privado. De interés particular son las bibliotecas combinatorias de péptidos y oligonucleótidos. Otras bibliotecas adicionales de interés incluyen bibliotecas de péptidos, proteínas, peptidomiméticos, recogida sintética multiparalela, recombinatorias y polipeptídicas. Para un análisis de química combinatoria y bibliotecas creadas a partir de la misma, véase Myers, Curr. Opin. Biotechnol. 8:701-707 (1997). Para análisis y ejemplos de bibliotecas de peptidomiméticos, véanse Al-Obeidi et al., Mol. Biotechnol. 9(3):205-23 (1998); Hruby et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1(1):114-19 (1997): Dorner et al., Bioorg. Med. Chem. 4(5):709-15 (1996) (dipéptidos alquilados).

La identificación de moduladores a través del uso de diversas bibliotecas descrito aquí, permite la modificación del "blanco" (o "guía") candidato, para optimizar la capacidad del "blanco" de unirse a un polipéptido de la invención. Las moléculas identificadas en el ensayo de unión, se ensayan a continuación para actividad antagonista o agonista en cultivo de tejidos in vivo o modelos animales que son bien conocidos en la técnica. En resumen, las moléculas se valoran en una pluralidad de cultivos celulares o animales, y luego se ensayan, bien para muerte celular/animal, o para supervivencia prolongada del animal/células.

Las moléculas de unión así identificadas pueden formar complejos con toxinas, p.ej., ricino o cólera, o con otros compuestos que son tóxicos para las células, como radioisótopos. El complejo toxina-molécula de unión se direccionan hacia un tumor u otra célula mediante la especificidad de la molécula de unión para un polipéptido de la invención. Alternativamente, las moléculas de unión pueden formar complejos con sustancias formadoras de imagen, para fines de direccionamiento y formación de imágenes.

4.7.13 Ensayo para actividad de receptores

Se describen métodos para detectar la unión específica de un polipéptido, p.ej. un ligando o un receptor. La técnica proporciona numerosos ensayos particularmente útiles para identificar parejas de unión previamente desconocidas para polipeptidos receptores aquí descritos. Por ejemplo, se puede usar clonación de expresión usando células de mamífero o bacterianas, o ensayos de detección sistemática dihíbridos, para identificar polinucleótidos que codifiquen parejas de unión. Como otro ejemplo, se puede usar cromatografía de afinidad con el polipéptido inmovilizado apropiado, para aislar polipéptidos que reconozcan y se unan a los polipéptidos aquí descritos. Existen diversas bibliotecas usadas para la identificación de compuestos y, en particular, de moléculas pequeñas, que modulan (es decir, incrementan o reducen) la actividad biológica de un polipéptido descrito. Los ligandos para polipéptidos receptores aquí descritos, se pueden identificar asimismo añadiendo ligandos exógenos, o cócteles de ligandos, a dos poblaciones de células que sean genéticamente idénticas excepto para la expresión del receptor: una población celular expresa el receptor, mientras que la otra no. A continuación, se compara la respuesta de las dos poblaciones celulares a la adición del ligando o ligandos. Alternativamente, se puede expresar conjuntamente una biblioteca de expresión con el polipéptido descrito en células, y ensayar para una respuesta autocrina para identificar un ligando o ligandos potenciales. Como otro ejemplo adicional, se pueden usar ensayos BIAcore, ensayos de solapamiento en gel u otros métodos conocidos en la técnica, para identificar parejas de unión de polipéptidos, incluyendo, (1) bibliotecas químicas orgánicas o inorgánicas, (2) bibliotecas de productos naturales, y (3) bibliotecas combinatorias formadas por polipéptidos, oligonucleótidos o moléculas orgánicas aleatorios.

Se puede determinar el papel de las moléculas señalizadoras intracelulares aguas abajo en la cascada de señalización del polipéptido de la invención. Por ejemplo, una proteína quimérica en la que el dominio citoplásmico del polipéptido de la invención está fusionado con la porción extracelular de una proteína, cuyo ligando se ha identificado, se produce en una célula hospedadora. La célula se incuba a continuación con el ligando específico para la porción extracelular de la proteína quimérica, activando así el receptor quimérico. Se pueden ensayar a continuación las proteínas aguas abajo conocidas, implicadas en la señalización intracelular, para modificaciones esperadas, p.ej. fosforilación. Se pueden usar también otros métodos conocidos para los expertos en la técnica, para identificar moléculas señalizadoras implicadas en la actividad del receptor.

4.7.14 Leucemias

Las leucemias y trastornos relacionados se pueden tratar o prevenir mediante administración de una sustancia terapéutica que favorezca o inhiba la función de los polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención. Tales leucemias y trastornos relacionados incluyen, pero no están limitados a, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, eritroleucemia, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica (para un análisis de tales trastornos, véase Fishman et al., 1985, Medicine, 2ª edición, Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia).

4.7.15 Trastornos del sistema nervioso

Los trastornos del sistema nervioso, que implican tipos celulares que se pueden ensayar para la eficacia de la invención con compuestos que modulan la actividad de los polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención, y que se pueden tratar tras observar un indicio de utilidad terapéutica, incluyen, pero no están limitados a, lesiones del sistema nervioso, y enfermedades o trastornos que producen, bien una desconexión de axones, una disminución o regeneración de neuronas, o desmielinización. Las lesiones del sistema nervioso que se pueden tratar en un paciente (incluyendo pacientes mamíferos humanos y no humanos) según la invención incluyen, pero no están limitadas a, las siguientes lesiones, bien del sistema nervioso central (incluyendo la médula espinal y el cerebro) o periférico:

(i) lesiones traumáticas, incluyendo lesiones producidas por daños físicos o asociadas con cirugía, por ejemplo, lesiones que cortan una parte del sistema nervioso, o lesiones por compresión;

(ii) lesiones isquémicas, en las que una carencia de oxígeno en una parte del sistema nervioso produce lesión neuronal o muerte, incluyendo infarto o isquemia cerebral, o infarto o isquemia de la médula espinal;

(iii) lesiones infecciosas, en las que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona como resultado de una infección, por ejemplo, mediante un absceso o asociadas con una infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, virus del Herpes zoster o del Herpes simplex o enfermedad de Lyme, tuberculosis o sífilis:

(iv) lesiones degenerativas, en las que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona como resultado de un proceso degenerativo, incluyendo, pero no limitadas a, degeneración asociada con la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, o esclerosis lateral amiotrófica;

(v) lesiones asociadas con enfermedades o trastornos nutricionales, en las que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona por un trastorno nutricional o un trastorno del metabolismo, incluyendo, pero no limitadas a, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de ácido fólico, enfermedad de Wernicke, ambliopia del tabaco-alcohol, enfermedad de Marchiafava-Bignami (degeneración primaria del cuerpo calloso), y degeneración cerebelar alcohólica;

(vi) lesiones neurológicas asociadas con enfermedades sistémicas, incluyendo, pero no limitadas a, diabetes (neuropatía diabética, parálisis de Bell), lupus eritematoso sistémico, carcinoma o sarcoidosis;

(vii) lesiones producidas por sustancias tóxicas, incluyendo alcohol, plomo o neurotoxinas particulares; y

(viii) lesiones desmielinizantes, en las que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona por una enfermedad desmielinizante, incluyendo, pero no limitadas a, esclerosis múltiple, mielopatía asociada al virus de la inmunodeficiencia humana, mielopatía transversal de diversas etiologías, leucoencefalopatía multifocal progresiva y mielinolisis pontina central.

Las sustancias terapéuticas que son útiles para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso central se pueden seleccionar ensayando para actividad biológica en el incremento de la supervivencia o diferenciación de neuronas. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las sustancias terapéuticas que provoquen cualquiera de los siguientes efectos, pueden ser útiles según la memoria descriptiva:

(i) tiempo de supervivencia incrementado de neuronas en cultivo;

(ii) ramificación incrementada de neuronas en cultivo o in vivo;

(iii) producción incrementada de moléculas asociadas a neuronas in cultivo o in vivo, p.ej., colina-acetiltransferasa o acetil-colinesterasa, con respecto a las neuronas motoras; o

(iv) síntomas reducidos de disfunción neuronal in vivo.

Tales efectos se pueden medir mediante cualquier método conocido en la técnica. En realizaciones preferidas, no limitativas, la supervivencia incrementada de nueronas se puede medir mediante el método indicado en Arakawa et al., (1990, J. Neurosci. 10:3507-3515); la ramificación incrementada de neuronas se puede detectar mediante los métodos indicados en Pestronk et al. (1980, Exp. Neurol. 70:65-82) o Brown et al. (1981, Ann. Rev. Neurosci. 4:17-42); la producción incrementada de moléculas asociadas a las neuronas se puede medir mediante bioensayos, pruebas enzimáticas, unión de anticuerpos, prueba de transferencia de Northern, etc., dependiendo de la molécula a medir; y la disfunción de neuronas motoras se puede medir valorando la manifestación física del trastorno de las neuronas motoras, p.ej., debilidad, velocidad de conducción de neuronas motoras o discapacidad funcional.

En realizaciones específicas, los trastornos neuronales motores que se pueden tratar según la descripción incluyen, pero no están limitados a, trastornos como infarto, infección, exposición a toxinas, traumatismo, lesión quirúrgica, enfermedad degenerativa o malignidad que puede afectar a las neuronas motoras, así como a otros componentes del sistema nervioso, así como trastornos que afectan selectivamente a neuronas, como esclerosis lateral amiotrófica, e incluyendo, pero no limitadas a, atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular infantil y juvenil, parálisis bulbar progresiva de la infancia (síndrome de Fazio-Londe), poliomielitis y el síndrome pospolio y neuropatía motosensorial hereditaria (enfermedad de Charcolt-Marie-Tooth).

4.7.16 Otras actividades

Un polipéptido de la invención puede presentar también una o más de las siguientes actividades o efectos adicionales: inhibir el crecimiento, infección o función o matar a, agentes infecciosos, incluyendo, sin limitación, bacterias, virus, hongos y otros parásitos: afectar a (suprimiendo o incrementando) características corporales, incluyendo, sin limitación, talla, peso, color de pelo, color de los ojos, piel, proporción grasa/carne u otra pigmentación de tejidos, o tamaño o forma de órganos o partes del cuerpo (como, por ejemplo, aumento o disminución de mamas, cambio en el estado o forma de huesos), afectar a biorritmos o ciclos o ritmos circadianos; afectar a la fertilidad de sujetos masculinos o femeninos; afectar al metabolismo, catabolismo, anabolismo, tratamiento, utilización, almacenamiento o eliminación de grasa, lípidos, proteínas, carbohidratos, vitaminas, minerales, cofactores u otros factores o componentes nutricionales de la dieta; afectar a las características de comportamiento, incluyendo, pero no limitadas a, apetito, libido, estrés, cognición (incluyendo trastornos cognitivos), depresión (incluyendo trastornos depresivos) y comportamientos violentos; proporcionar efectos analgésicos u otros efectos reductores del dolor; favorecer la diferenciación y crecimiento de células madre embrionarias en linajes diferentes de los linajes hematopoyéticos; actividad hormonal o endocrina; en el caso de enzimas, corregir deficiencias de la enzima y tratar enfermedades relacionadas con la deficiencia; tratamiento de trastornos hiperproliferativos (como, por ejemplo, psoriasis); actividad análoga a la inmunoglobulina (como, por ejemplo, la capacidad de unirse a antígenos o al complemento); y capacidad de actuar como antígenos en una composición de vacuna, para originar una respuesta inmunitaria frente a tal proteína u otro material o entidad que tenga reactividad cruzada con tal proteína.

4.7.17 Identificación de polimorfismos

La demostración de polimorfismos hace posible la identificación de tales polimorfismos en sujetos humanos y el uso farmacogenético de esta información para diagnóstico y tratamiento. Tales polimorfismos pueden estar asociados, p.ej., con predisposición o susceptibilidad diferencial a diversas enfermedades (como trastornos en los que interviene la inflamación o la respuesta inmunitaria) o una respuesta diferencial a la administración de fármacos, y esta información genética se puede usar para diseñar un tratamiento preventivo o terapéutico adecuadamente. Por ejemplo, la existencia de un polimorfismo asociado con una predisposición a la inflamación o la enfermedad autoinmunitaria, hace posible el diagnóstico de esta enfermedad en seres humanos, identificando la presencia del polimorfismo.

Se pueden identificar polimorfismos de diversas formas conocidas en la técnica, que implican todas generalmente la obtención de una muestra del paciente, analizando ADN de la muestra, implicando opcionalmente el aislamiento o amplificación del ADN, e identificando la presencia del polimorfismo en el ADN. Por ejemplo, se puede usar PCR para amplificar un fragmento apropiado de ADN genómico, que se puede secuenciar a continuación. Alternativamente, el ADN se puede someter a hibridación de oligonucleótidos específica para alelo (en la que los oligonucleótidos apropiados se hibridan con el ADN, bajo condiciones que permiten la detección de un único desapareamiento) o a un ensayo de extensión de un único nucleótido (en el que un oligonucleótido que hibrida inmediatamente adyacente a la posición del polimorfismo, se extiende con uno o más nucleótidos marcados). Además, se pueden realizar análisis tradicionales de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (usando enzimas de restricción que proporcionan una digestión diferencial del ADN genómico, dependiendo de la presencia o ausencia del polimorfismo). Se pueden usar micromatrices con las secuencias de nucleótidos de la presente invención, para detectar polimorfismos. La micromatriz puede comprender secuencias nucleotídicas modificadas aquí descritas, a fin de detectar las secuencias nucleotídicas de la presente invención. En una alternativa, cualquiera de las secuencias nucleotídicas de la presnte invención se puede colocar sobre la micromatriz, para detectar cambios en esas secuencias.

Alternativamente, también se podría detectar un polimorfismo que produzca un cambio en la secuencia de aminoácidos, detectando un cambio correspondiente en la secuencia aminoácida de la proteína, p.ej., mediante un anticuerpo específico para la secuencia variante.

4.7.18 Artritis e inflamación

Los efectos inmunosupresores de las composiciones de la invención frente a la artritis reumatoide se determinan en un sistema modelo animal experimental. El sistema modelo experimental es artritis inducida por aditivos en ratas, y el protocolo se describe por J. Holoshitz, et al., 1983, Science, 219:56, o por B. Waksman et al., 1963, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 23:129. La inducción de la enfermedad se puede producir mediante una única inyección, generalmente intradérmica, de una suspensión de Mycobacterium tuberculosis muerto en aditivo de Freund completo (CFA). La vía de infección puede variar, pero las ratas pueden ser inyectadas en la base de la cola con una mezcla de aditivos. El polipéptido se administra en solución tamponada de fosfato (PBS) a una dosis de aproximadamente 1-5 mg/kg. El testigo consiste en administrar sólo PBS.

El procedimiento para ensayar los efectos del compuesto de ensayo consistiría en inyectar por vía intradérmica Mycobacterium tuberculosis muertos en CFA, seguido de administración inmediata del compuesto ensayado y tratamiento posterior en días alternos hasta el día 24. A los 14, 15, 18, 20, 22 y 24 días tras la inyección de Mycobacterium CFA, se puede obtener una puntuación total de artritis, según se describió por J. Holoskitz, arriba. Un análisis de los datos revelaría que el compuesto de ensayo tendría un efecto espectacular sobre la hinchazón de las articulaciones, según se midió por una reducción de la puntuación de artritis.

4.8 Métodos terapéuticos

Las composiciones (incluyendo fragmentos polipeptídicos, análogos, variantes y anticuerpos u otras parejas de unión o moduladores, incluyendo polinucleótidos antisentido) aquí descritos, tienen numerosas aplicaciones en diversos métodos terapéuticos. Ejemplos de aplicaciones terapéuticas incluyen, pero no están limitadas a, las aquí ejemplificadas.

4.8.1 Ejemplo

Un ejemplo es la administración de una cantidad efectiva de los polipéptidos análogos al factor de crecimiento de células madre u otra composición de la invención, a individuos afectados por una enfermedad o trastorno que se pueda modular regulando los péptidos aquí descritos. Aunque el modo de administración no es particularmente importante, se prefiere la administración parenteral. Un modo ejemplar de administración es suministrar una inyección intravenosa rápida. La dosificación de polipéptidos análogos al factor de crecimiento de células madre u otra composición de la invención, se determinará normalmente por el médico adjunto. Se espera que la dosificación varíe según la edad, peso, estado y respuesta del paciente individual. Típicamente, la cantidad de polipéptido administrada por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 0,01 \mug/kg a 100 mg/kg de peso corporal, siendo la dosis preferida aproximadamente de 0,1 \mug/kg a 10 mg/kg de peso corporal del paciente. Para la administración parenteral, los polipéptidos análogos a factores de crecimiento de células madre aquí descritos, se formularán en forma inyectable, combinados con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos son bien conocidos en la técnica y ejemplos de ellos incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y soluciones formadas por pequeñas cantidades de albúmina de suero humano. El vehículo puede contener cantidades secundarias de aditivos que mantienen la isotonicidad y estabilidad del polipéptido u otro ingrediente activo. La preparación de tales soluciones está incluida en el estado de la técnica.

4.9 Formulaciones farmacéuticas y vías de administración

Una proteína u otra composición aquí descrita (de cualquiera que sea la fuente de que se derive, incluyendo sin limitación fuentes recombinantes y no recombinantes, e incluyendo anticuerpos y otras parejas de unión de los polipéptidos aquí descritos) se puede administrar a un paciente que la necesite, por sí sola o en composiciones farmacéuticas en las que se mezcla con vehículos o excipientes adecuados, en dosis para tratar o mejorar diversos trastornos. Tal composición puede contener opcionalmente (además de proteína u otro ingrediente activo y un vehículo), diluyentes, sustancias de relleno, sales, tampones, estabilizadores, disolventes y otros materiales bien conocidos en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material atóxico que no interfiera con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente o ingredientes activos. Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. La composición farmacéutica aquí descrita puede contener también citoquinas, linfoquinas u otros factores hematopoyéticos, como M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, trombopoyetina, factor de células madre y eritropoyetina. En composiciones adicionales, las proteínas de la invención se pueden combinar con otras sustancias beneficiosas para el tratamiento de la enfermedad o trastorno en cuestión. Estas sustancias incluyen diversos factores de crecimiento, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento transformantes (TGF-\alpha y TGF-\beta), factor de crecimiento análogo a insulina (IGF), así como citoquinas aquí descritas.

La composición farmacéutica puede contener además otras sustancias que incrementan la actividad de la proteína u otro ingrediente activo, o complementan su actividad o uso en el tratamiento. Tales factores y/o sustancias adicionales se pueden incluir en la composición farmacéutica para producir un efecto sinergístico con proteínas u otros ingredientes activos de la invención, o para minimizar los efectos secundarios. A la inversa, las proteínas u otros ingredientes activos de la presente invención se pueden incluir en formulaciones del factor coagulante, citoquina, linfoquina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico o sustancia antiinflamatoria particular, para minimizar los efectos secundarios del factor coagulante, citoquina, linfoquina, otro factor hematopoyético, trombolítico o factor antitrombótico o sustancia antiinflamatoria (como IL-IRa, IL-1 Hy1, IL-1 Hy2, anti-TNF, corticoesteroides, sustancias inmunosupresoras). Una proteína de la presente invención puede ser activa en multímeros (p.ej. heterodímeros u homodímeros) o complejos consigo misma o con otras proteínas. Como resultado, las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden comprender una proteína de la invención en tal forma multimérica o en forma de complejo.

Como alternativa a incluir en una composición farmacéutica que incluye una primera proteína, se pueden administrar conjuntamente con la primera proteína, una segunda proteína o una sustancia terapéutica (p.ej., al mismo tiempo o en momentos diferentes, con la condición de que se alcancen las concentraciones terapéuticas de la combinación de sustancias en el punto de tratamiento). Se pueden encontrar técnicas para formulación y administración de los compuestos de la presente solicitud en "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co. Easton, P.A. última edición. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere además a la cantidad del compuesto suficiente para producir una mejora de los síntomas, p.ej., tratamiento, cicatrización, prevención o mejora del estado médico relevante, o un incremento en la velocidad de tratamiento, cicatrización, prevención o mejora de tales estados. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a tal ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a las cantidades combinadas de los ingredientes activos que producen el efecto terapéutico, administrándose en combinación, en serie o simultáneamente.

Al poner en práctica el método de tratamiento o uso aquí descrito, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína u otro ingrediente activo a un mamífero que tiene una enfermedad a tratar. La proteína u otro ingrediente activo se puede administrar de acuerdo con el método descrito, bien sola o en combinación con otras terapias, como tratamientos que emplean citoquinas, linfoquinas u otros factores hematopoyéticos. Cuando se administra conjuntamente con una o más citoquinas, linfoquinas u otros factores hematopoyéticos, la proteína u otro ingrediente activo se puede administrar, bien simultáneamente con la citoquina o citoquinas, linfoquina o linfoquinas, u otro factor o factores hematopoyéticos, factores trombolíticos o antitrombóticos, o secuencialmente. Si se administra secuencialmente, el médico residente decidirá la secuencia apropiada de administración de proteína u otro ingrediente activo, en combinación con citoquina o citoquinas, linfoquina o linfoquinas, otro factor o factores hematopoyéticos, y factores trombolíticos o antitrombóticos.

4.9.1 Rutas de administración

Las rutas de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, administración oral, rectal, transmucosa o intestinal; suministro parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares. La administración de proteína u otro ingrediente activo usado en la composición farmacéutica o para poner en práctica el método descrito, se puede realizar de diversas formas convencionales, como ingestión oral, inhalación, aplicación tópica o inyección cutánea, subcutánea, intraperitoneal, parenteral o intravenosa. Se prefiere la administración intravenosa al paciente.

Alternativamente, uno puede administrar el compuesto de forma local, más que sistémica, por ejemplo, vía inyección del compuesto directamente en articulaciones artríticas o en tejido fibrótico, a menudo en una formulación de inyección de absorción retardada o en una formulación de liberación prolongada. A fin de evitar el proceso de cicatrización que aparece frecuentemente como una complicación de la cirugía del glaucoma, los compuestos se pueden administrar por vía tópica, por ejemplo, como colirio. Asimismo, uno puede administrar el fármaco en un sistema de suministro de fármaco direccionado a diana, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico, que se dirige, por ejemplo, a tejido artrítico o fibrótico. Los liposomas se direccionarán y absorberán selectivamente por el tipo de tejido afectado.

Los polipéptidos aquí descritos se administran mediante cualquier ruta que suministre una dosis efectiva al sitio de acción deseado. La determinación de una ruta adecuada de administración y de una dosis efectiva para una indicación particular, está comprendida en el nivel del estado de la técnica. Preferiblemente para el tratamiento de heridas, uno administra el compuesto terapéutico directamente en el sitio. Los intervalos de dosificación adecuados para los polipéptidos descritos se pueden extrapolar a partir de estas dosis o de estudios similares en modelos animales apropiados. Las dosis se pueden ajustar a continuación, según sea necesario, por el médico, para proporcionar el máximo beneficio terapéutico.

4.9.2 Composiciones/formulaciones

Por tanto, se pueden formular composiciones farmacéuticas para uso según la presente descripción, de forma convencional, usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y aditivos, que facilitan el tratamiento de los compuestos activos para obtener preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Estas composiciones farmacéuticas se pueden fabricar de una forma que es conocida en sí misma, p.ej., mediante procesos de mezcladura convencional, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsionado, encapsulado, inclusión o liofilización. Una formulación adecuada depende de la ruta de administración elegida. Cuando se administra oralmente una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína u otro ingrediente activo, la proteína u otro ingrediente activo estará en forma de comprimido, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de comprimido, la composición farmacéutica puede contener adicionalmente un vehículo sólido, como una gelatina o un aditivo. El comprimido, cápsula y polvo contiene de aproximadamente 5 a 95% de proteína u otro ingrediente activo y, preferiblemente, de aproximadamente 25 a 90% de proteína u otro ingrediente activo. Cuando se administra en forma líquida, se puede añadir un vehículo líquido, como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal, como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja o aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido, o glicoles, como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene de aproximadamente 0,5 a 90% en peso de proteína u otro ingrediente activo, y preferiblemente de aproximadamente 1 a 50% de proteína u otro ingrediente activo.

Cuando se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína u otro ingrediente activo mediante inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, la proteína u otro ingrediente activo estará en forma de solución acuosa exenta de pirógeno, parenteralmente aceptable. La preparación de tal proteína parenteralmente aceptable u otras soluciones de ingredientes activos, prestando especial atención al pH, isotonicidad, estabilidad y similares, está comprendida en el estado de la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, debería contener, además de la proteína u otro ingrediente activo, un vehículo isotónico, como inyección de cloruro sódico, inyección de solución de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro sódico, inyección de solución de lactato de Ringer u otro vehículo, según se conoce en la técnica. La composición farmacéutica puede contener también estabilizadores, conservantes, tampones, antioxidantes y otros aditivos conocidos para los expertos en la materia. Para inyección, las sustancias descritas se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, como solución de Hank, solución de Ringer, o tampón salino fisiológico. Para administración transmucosa, se usan fluidos penetrantes, apropiados para la barrera a permear. Tales fluidos se conocen generalmente en la técnica.

Para administración oral, los compuestos se pueden formular fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten formular los compuestos aquí descritos como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente a tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener mezclando un excipiente sólido, opcionalmente triturando la mezcla resultante y tratando la mezcla de gránulos, tras añadir aditivos adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Excipientes adecuados son, en particular, rellenos como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o poli(vinil-pirrolidona) (PVP). Si se desea, se pueden añadir sustancias desintegradoras, como la poli(vinilpirrolidona) reticulada, agar o ácido algínico, o una de sus sales, como alginato sódico. Los núcleos de las grageas están provistos de recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden usar soluciones de azúcar concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, poli(vinilpirrolidona), gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de barniz, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los recubrimientos de comprimidos o grageas, para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar oralmente incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas, hechas de gelatina y un plastificante, como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos mezclados con una sustancia de relleno, como lactosa, aglutinantes como almidones y/o lubricantes, como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o en suspensión en líquidos adecuados, como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deberían estar en dosis adecuadas para tal administración. Para administración bucal, las composiciones pueden estar en forma de comprimidos o pastillas para chupar, formuladas de manera convencional.

Para administración mediante inhalación, los compuestos para uso según la presente descripción se suministran convenientemente en forma de una presentación de pulverizador en aerosol en envases presurizados o en un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, p.ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos, p.ej., de gelatina, para uso en un inhalador o insuflador, que contienen una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, como lactosa o almidón. Los compuestos se pueden formular para administración parenteral mediante inyección, p.ej., mediante inyección intravenosa rápida o infusión continua. Se pueden presentar formulaciones para inyección en forma de dosis unitaria, p.ej., en ampollas o recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener sustancias de formulación, como sustancias de suspensión, estabilizadoras y/o dispersantes.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, como carboximetil-celulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores adecuados, o sustancias que incrementan la solubilidad de los compuestos, para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, p.ej., agua estéril, exenta de pirógenos, antes del uso.

Los compuestos se pueden formular también en composiciones rectales, como supositorios o enemas de retención, p.ej., que contienen bases de supositorio convencionales, como manteca de cacao u otros glicéridos. Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos se pueden formular también como una preparación para inyección intravenosa rápida. Tales formulaciones que actúan durante largo tiempo, se pueden administrar mediante implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscularmente), o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales polímeros o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable), o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

Un vehículo farmacéutico para los compuestos hidrófobos aquí descritos, es un sistema cosolvente que comprende alcohol bencílico, un tensioactivo apolar, un polímero orgánico miscible en agua, y una fase acuosa. El sistema cosolvente puede ser el sistema cosolvente VPD. VPD es una solución de alcohol bencílico al 3% p/v, tensioactivo apolar polisorbato 80 al 8% p/v, y polietilenglicol 300 al 65% p/v, completado hasta el volumen requerido con etanol absoluto. El sistema cosolvente VPD (VPD:5W) está formado por VPD diluido 1:1 con una solución de dextrosa en agua al 5%. Este sistema cosolvente disuelve bien los compuestos hidrófobos, y produce en sí mismo baja toxicidad tras la administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de un sistema cosolvente pueden variarse considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Asimismo, la identidad de los componentes del cosolvente se puede variar: por ejemplo, se pueden usar otros tensioactivos apolares de baja toxicidad, en vez de polisorbato 80; el tamaño de la fracción de polietilenglicol puede variarse; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, p.ej., poli(vinilpirrolidona); y la dextrosa puede ser sustituida por otros azúcares o polisacáridos. Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas de suministro para compuestos farmacéuticos hidrófobos. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro o portadores para fármacos hidrófobos. Se pueden emplear también ciertos disolventes orgánicos, como dimetilsulfóxido, aunque normalmente con el inconveniente de una mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos se pueden suministrar usando un sistema de liberación controlada, como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la sustancia terapéutica. Se han establecido varios tipos de materiales de liberación controlada, y se conocen bien por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación controlada pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los compuestos durante, de pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden emplear estrategias adicionales para estabilización de la proteína o de otro ingrediente activo.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender también vehículos o excipientes adecuados, sólidos o en fase de gel. Ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero no están limitados a, carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros, como polietilenglicoles. Muchos de los ingredientes activos de la invención se pueden proporcionar como sales con contraiones compatibles farmacéuticamente. Tales sales de adición de base, farmacéuticamente aceptables, son aquellas sales que mantienen la efectividad biológica y propiedades de los ácidos libres, y que se obtienen mediante reacción con bases orgánicas o inorgánicas, como hidróxido sódico, hidróxido magnésico, amoníaco, trialquil-amina, dialquilamina, monoalquilamina, aminoácidos dibásicos, acetato sódico, benzoato potásico, trietanolamina y análogos.

La composición farmacéutica aquí descrita, puede estar en forma de un complejo de la proteína o proteínas u otro ingrediente activo, junto con antígenos proteínicos o peptídicos. El antígeno proteínico y/o peptídico proporcionará una señal estimuladora a los linfocitos B y T. Los linfocitos B responderán al antígeno a través de su receptor de inmunoglobulina superficial. Los linfocitos T responderán al antígeno a través del receptor de la célula T (TCR), tras la presentación del antígeno mediante las proteínas del MHC. Las proteínas del MHC y proteínas relacionadas estructuralmente, incluyendo las codificadas por los genes de MHC de clase I y de clase II sobre las células hospedadoras, servirán para presentar el antígeno o antígenos peptídicos a los linfocitos T. Los componentes antigénicos se podrían suministrar también como complejos MHC-péptido purificados, solos o con moléculas coestimuladoras que pueden señalizar directamente las células T. Alternativamente, se pueden combinar con la composición farmacéutica aquí descrita anticuerpos capaces de unirse a inmunoglobulina superficial y otras moléculas sobre las células B, así como anticuerpos capaces de unirse al TCR y otras moléculas sobre las células T.

La composición farmacéutica aquí descrita puede estar en forma de un liposoma, en el que una proteína de la presente solicitud se combina, junto con otros vehículos farmacéuticamente aceptables, con sustancias anfipáticas como lípidos que se encuentran en forma agregada como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas lamelares en solución acuosa. Lípidos adecuados para formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitinas, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares y análogos. La preparación de tales formulaciones liposomales está comprendida en el estado de la técnica, según se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.235.871; 4.501.728; 4.837.028; y 4.737.323.

La cantidad de proteína u otro ingrediente activo en la composición farmacéutica dependerá de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se esté tratando, y de la naturaleza de los tratamientos previos que haya sufrido el paciente. En última instancia, el médico residente decidirá la cantidad de proteína u otro ingrediente activo con la que tratar a cada paciente individual. Inicialmente, el médico residente administrará dosis bajas de proteína u otro ingrediente activo y observará la respuesta del paciente. Se pueden administrar dosis mayores de proteína u otro ingrediente activo hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo para el paciente y, en este punto, la dosis no se incrementará más. Se considera que las diversas composiciones farmacéuticas usadas para poner en práctica el método descrito, deberían contener de aproximadamente 0,01 \mug a aproximadamente 100 mg (preferiblemente de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 100 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 1 mg) de proteína u otro ingrediente activo, por kg de peso corporal. Para composiciones que son útiles para regeneración de hueso, cartílago, tendones o ligamentos, el método terapéutico incluye administrar la composición tópicamente, sistémicamente o localmente, como un implante o dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica está, por supuesto, en una forma exenta de pirógenos, farmacéuticamente aceptable. Además, la composición se puede encapsular o inyectar deseablemente en forma viscosa para su suministro al punto de la lesión de hueso, cartílago o tejido. La administración tópica puede ser adecuada para cicatrización de heridas y reparación de tejidos. Se pueden administrar simultánea o secuencialmente con la composición descrita en los métodos, sustancias terapéuticamente útiles distintas de una proteína u otro ingrediente activo, que se pueden incluir también opcionalmente en la composición según se describió anteriormente. Preferiblemente, para formación de hueso y/o cartílago, la composición incluiría una matriz capaz de suministrar la composición que contenga proteína u otro ingrediente activo al punto de la lesión de hueso y/o cartílago, proporcionando una estructura para el hueso y cartílago en desarrollo, y capaz, en el caso óptimo, de ser reabsorbida en el cuerpo. Tales matrices pueden estar formadas de materiales usados actualmente para otras aplicaciones médicas implantadas.

La elección de material de matriz se basa en propiedades de biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, apariencia cosmética y propiedades de superficie de contacto. La aplicación particular de las composiciones definirá la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser biodegradables y definidas químicamente, sulfato cálcico, fosfato tricálcico, hidroxiapatita, ácido poliláctico, ácido poliglicólico y polianhídridos. Otros materiales potenciales son biodegradables y biológicamente bien definidos, como hueso o colágeno dérmico. Otras matrices están formadas por proteínas puras o componentes de matriz extracelular. otras matrices potenciales no son biodegradables y están químicamente definidas, como hidroxiapatita sinterizada, biovidrio, aluminatos u otros materiales cerámicos. Las matrices pueden estar formadas por combinaciones de cualquiera de los tipos de material mencionados anteriormente, como ácido poliláctico e hidroxiapatita o colágeno y fosfato tricálcico. Los productos biocerámicos pueden tener su composición alterada, como en aluminato-fosfato de calcio y tratarse para alterar el tamaño de poro, tamaño de partícula, forma de partícula y biodegradabilidad. Actualmente se prefiere un copolímero 50:50 (peso molar) de ácido láctico y ácido glicólico en forma de partículas porosas que tienen diámetros que varían de 150 a 800 micrones. En algunas aplicaciones, será útil utilizar una sustancia secuestrante, como carboximetilcelulosa o coágulos de sangre autóloga, para evitar que las composiciones de proteína se disocien de la matriz.

Una familia preferida de sustancias secuestrantes es la de los materiales celulósicos, como alquilcelulosas (incluyendo hidroxialquilcelulosas), incluyendo metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa, siendo las de mayor preferencia las sales catiónicas de carboximetilcelulosa (CMC). Otras sustancias secuestrantes preferidas incluyen ácido hialurónico, alginato sódico, poli(etilenglicol), óxido de poli(oxietileno), polímero de carboxivinilo y poli(alcohol vinílico). La cantidad de sustancia secuestrante útil aquí es 0,5-20% en peso, preferiblemente 1-10% en peso, basado en el peso de la formulación total, que representa la cantidad necesaria para evitar la desorción de la proteína de la matriz polímera y para proporcionar una manipulación apropiada de la composición, aunque no tanto como para que se impida a las células progenitoras infiltrarse en la matriz, proporcionando así a la proteína la oportunidad de contribuir a la actividad osteogénica de las células progenitoras. En otras composiciones, las proteínas u otros ingredientes activos se pueden combinar con otras sustancias beneficiosas para el tratamiento del defecto del hueso y/o cartílago, herida o tejido en cuestión. Estas sustancias incluyen diversos factores de crecimiento, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento transformante (TGF-\alpha y TGF-\beta) y factor de crecimiento análogo a insulina (IGF).

Las composiciones terapéuticas son también actualmente valiosas para aplicaciones veterinarias. Particularmente, animales domésticos y caballos de pura sangre, además de los seres humanos, son pacientes deseados para tal tratamiento con proteínas u otro ingrediente activo. El régimen de dosificación de una composición farmacéutica que contiene proteína, destinada a usarse en regeneración de tejidos, se determinará por el médico residente considerando diversos factores que modifican la acción de las proteínas, p.ej., la cantidad de peso de tejido que se desea formar, el punto de la lesión, el estado del tejido lesionado, el tamaño de la herida, el tipo de tejido lesionado (p.ej. hueso), la edad del paciente, sexo y dieta, la gravedad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. La dosificación puede variar dependiendo del tipo de matriz usada en la reconstitución y de la inclusión de otras proteínas en la composición farmacéutica. Por ejemplo, la adición de otros factores de crecimiento conocidos, como IGF I (factor de crecimiento análogo a insulina I), a la composición final, puede afectar también a la dosificación. El progreso se puede controlar mediante valoración periódica del crecimiento y/o reparación del tejido/hueso, por ejemplo mediante rayos X, determinaciones histomorfométricas y marcaje con tetraciclina.

Los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar también para terapia génica. Tales polinucleótidos se pueden introducir, in vivo o ex vivo, en células para su expresión en un sujeto mamífero. Los polinucleótidos de la invención se pueden administrar también mediante otros métodos conocidos para introducción de ácido nucleico en una célula u organismo (incluyendo, sin limitación, en forma de vectores víricos o ADN desnudo). Las células se pueden cultivar también ex vivo, en presencia de proteínas de la presente invención, a fin de proliferar o de producir un efecto deseado sobre tales células, o actividad en las mismas. Las células tratadas se pueden introducir luego in vivo para fines terapéuticos.

4.9.3 Dosis efectiva

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en la presente solicitud, incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito a que se destinan. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad efectiva para evitar el desarrollo o aliviar los síntomas existentes del sujeto al que se está tratando. La determinación de la cantidad efectiva está comprendida en la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada aquí proporcionada. Para cualquier compuesto usado en el método descrito, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro apropiados. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales, para lograr un intervalo de concentración circulante que se puede usar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales, para lograr un intervalo de concentración circuclante que incluya el IC_{50}, según se determinó en cultivo celular (es decir, la concentración del compuesto ensayado que logra una inhibición que es la mitad de la máxima de la actividad biológica de la proteína). Tal información se puede usar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.

Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad del compuesto que produce una mejora de los síntomas o una prolongación de la supervivencia en un paciente. La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, p.ej., para determinar la LD_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED_{50} (dosis terapéuticamente efectiva para el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación entre LD_{50} y ED_{50}. Se prefieren compuestos que presenten índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivos celulares y estudios animales se pueden usar para formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen ED_{50} con escasa o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se puede elegir por el médico individual, a la vista del estado del paciente. Véase, p.ej., Fingl et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", capítulo 1, pág. 1. La cantidad e intervalo de dosificación se puede ajustar individualmente para proporcionar concentraciones plasmáticas del resto activo, que son suficientes para mantener los efectos deseados, o la concentración efectiva mínima (MEC). La MEC variará para cada compuesto, pero se puede estimar de los datos in vitro. Las dosis necesarias para alcanzar la MEC dependerán de las características individuales y la vía de administración. Sin embargo, se pueden usar ensayos HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones plasmáticas.

También se pueden determinar los intervalos de dosificación, usando el valor MEC. Los compuestos se deberían administrar usando un régimen que mantiene las concentraciones plasmáticas por encima del MEC durante 10-90% del tiempo, preferiblemente entre 30-90% y con la máxima preferencia entre 50-90%. En casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local efectiva del fármaco puede no estar relacionada con la concentración plasmática.

Un régimen de dosificación ejemplar para polipéptidos u otras composiciones de la invención estará en el intervalo de aproximadamente 0,01 \mug/kg a 100 mg/kg de peso corporal diariamente, siendo la dosis preferida aproximadamente de 0,1 \mug/kg a 25 mg/kg de peso corporal del paciente diariamente, variando en adultos y niños. La dosificación puede ser una vez al día, o se pueden suministrar dosis equivalentes a intervalos más cortos o más largos.

La cantidad de la composición administrada dependerá, por supuesto, del sujeto que se esté tratando, de la edad y peso del sujeto, de la gravedad de la enfermedad, de la forma de administración y del criterio del médico que
receta.

4.9.4 Envasado

Las composiciones se pueden presentar, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador, que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo, lámina de metal o plástico, como un envase blíster. El envase o dispositivo dipensador puede estar acompañado de instrucciones para administración. Se pueden preparar también composiciones que comprenden un compuesto de la invención, formulado en un vehículo farmacéutico compatible, colocado en un envase apropiado, y marcado para tratamiento de una enfermedad indicada.

4.10 Anticuerpos 4.10.1 Anticuerpos humanos

Los anticuerpos totalmente humanos se refieren a moléculas de anticuerpo en las que esencialmente las secuencias completas, tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, incluyendo los CDRs, proceden de genes humanos. Tales anticuerpos se denominan aquí "anticuerpos humanos" o "anticuerpos totalmente humanos". Se pueden preparar anticuerpos monoclonales humanos mediante la técnica del trioma; la técnica del hibridoma de células B humanas (véase Kozbor, et al., 1983 Immunol. Toay 4:72) y la técnica del hibridoma EBV, para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase Cole, et al., 1985 en: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc., págs 77-96). Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden utilizar para poner en práctica la presente invención y se pueden producir usando hibridomas humanos (véase Cote, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030) o transformando células B humanas con el virus de Epstein Barr in vitro (véase Cole et al., 1985 en: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Además, también se pueden producir anticuerpos humanos usando técnicas adicionales, incluyendo bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). De forma similar, se pueden fabricar anticuerpos humanos introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, p.ej., ratones, en los que los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcial o completamente. Tras la provocación, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se parece mucho a la observada en seres humanos, en todos los aspectos, incluyendo reorganización, ensamblaje de genes y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU N^{os} 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 y en Marks et al., (Bio/Technology 10, 779-783 (1992)); Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994)); Morrison (Nature 368, 812-13 (1994)); Fishwild et al. (Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)); Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996)); y Lonberg y Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995)).

Se pueden producir anticuerpos humanos adicionalmente, usando animales transgénicos no humanos, que se modifican para producir anticuerpos totalmente humanos, más que los anticuerpos endógenos del animal, en respuesta a la provocación por un antígeno. (Véase publicación PCT WO94/02602). Los genes endógenos que codifican las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina en el hospedador no humano, se han incapacitado, y se insertan en el genoma del hospedador loci activos que codifican las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, usando cromosomas artificiales de levadura, que contienen los segmentos de ADN humano requeridos. A continuación, se obtiene como progenie un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas, cruzando animales transgénicos intermedios que contienen menos que el complemento total de las modificaciones. La realización preferida de tal animal no humano es un ratón, y se denomina el Xenomouse®, según se describe en las publicaciones PCT WO96/33735 y WO96/34096. Este animal produce células B que secretan inmunoglobulinas totalmente humanas. Los anticuerpos se pueden obtener directamente del animal tras la inmunización con un inmunógeno de interés como, por ejemplo, una preparación de un anticuerpo policlonal o, alternativamente, de células B inmortalizadas derivadas del animal, como hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Adicionalmente, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones humanas variables, se pueden recuperar y expresar para obtener los anticuerpos directamente, o se pueden modificar más para obtener análogos de anticuerpos como, por ejemplo, moléculas de una sola cadena Fv.

En la patente de EE.UU Nº 5.939.598 se describe un ejemplo de un método para producir un hospedador no humano, ejemplificado como un ratón, que carece de expresión de una cadena pesada de inmunoglobulina endógena. Se puede obtener mediante un método que incluye eliminar los genes del segmento J de al menos un locus de la cadena pesada endógena, en una célula madre embrionaria, para evitar la reorganización del locus y para evitar la formación de un transcrito de un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina reorganizada, efectuándose la eliminación mediante un vector de direccionamiento que contiene un gen que codifica un marcador seleccionable; produciendo, a partir de la célula madre embrionaria, un ratón transgénico cuyas células somáticas y germinales contienen el gen que codifica el marcador seleccionable, y produciendo a partir de la célula madre embrionaria un ratón transgénico cuyas células somáticas y germinales contienen el gen que codifica el marcador seleccionable.

En la Patente de EE.UU. Nº 5.916.771, se describe un método para producir un anticuerpo de interés, como un anticuerpo humano, el cual incluye introducir un vector de expresión que contiene una secuencia nucleotídica que codifica una cadena pesada, en una célula hospedadora de mamífero en cultivo, introducir un vector de expresión que contiene una secuencia nucleotídica que codifica una cadena ligera en otra célula hospedadora de mamífero, y fusionar las dos células para formar una célula híbrida. La célula híbrida expresa un anticuerpo que contiene la cadena pesada y la cadena ligera.

En una mejora adicional de este procedimiento se describen en la publicación PCT WO 99/53049, un método para identificar un epítope clínicamente relevante sobre un inmunógeno, y un método correlativo para seleccionar un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica al epítope relevante con afinidad elevada.

4.10.2 Fragmentos FAB y anticuerpos monocatenarios

Según se describe aquí, se pueden adaptar las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios específicos frente a una proteína antigénica de la invención (véase, p.ej., Patente de EE.UU. Nº 4.946.778). Además, se pueden adaptar los métodos para la construcción de bibliotecas de expresión de F_{ab} (véase, p.ej., Huse, et al., 1989, Science 246: 1275-1281) para permitir una identificación rápida y efectiva de fragmentos de F_{ab} monoclonales con la especificidad deseada para una proteína, o sus derivados, fragmentos, análogos u homólogos. Se pueden producir fragmentos de anticuerpos que contienen los idiotipos frente a un antígeno proteínico, mediante técnicas conocidas en la técnica incluyendo, pero no limitados a: (i) un fragmento F_{(ab')2} producido mediante digestión por pepsina de una molécula de anticuerpo; (ii) un fragmento F_{ab} generado reduciendo los puentes disulfuro de un fragmento F_{(ab')2}; (iii) un fragmento F_{ab} generado mediante el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína, y una sustancia reductora y, (iv) fragmentos F_{v}.

4.10.3 Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de unión es para una proteína antigénica de la invención. La segunda diana de unión es cualquier otro antígeno y, ventajosamente, es una proteína de la superficie celular o receptor o subunidad de receptor.

Se conocen en la técnica métodos para obtener anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la distribución aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se logra normalmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993 y en Traunecker et al., 1991 Embo J. 10:3655-3659.

Los dominios variables de los anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar con secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión se produce preferiblemente con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, regiones CH2 y CH3. Se prefiere que tenga la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el punto necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se transfectan conjuntamente en un organismo hospedador adecuado. Para más detalles de producción de anticuerpos específicos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Según otro enfoque descrito en WO 96/27011, la superficie de contacto entre un par de moléculas de anticuerpo se puede obtener mediante ingeniería genética para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La superficie de contacto preferida comprende al menos una parte de la región CH3 del dominio constante de un anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la superficie de contacto de la primera molécula de anticuerpo, se reemplazan con cadenas laterales más grandes (p.ej., tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes, sobre la superficie de contacto de la segunda molécula de anticuerpo, reemplazando las cadenas laterales grandes de aminoácidos por otras más pequeñas (p.ej. alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar la producción del heterodímero frente a otros subproductos no deseados, como homodímeros.

Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpos (p.ej., anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Se han descrito en la literatura técnicas para producir anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando unión química. Brennan et al., Science 229:81 (1985), describe un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente, para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenita sódica, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' producidos se convierten a continuación en derivados de tio-nitro-benzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte luego al Fab'-tiol, mediante reducción con mercapto-etil-amina, y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB, para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como sustancias para la inmovilización selectiva de enzimas.

Adicionalmente, se pueden recuperar directamente fragmentos Fab' de E. coli, y unirse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992), describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico totalmente humanizado F(ab')_{2}. Cada fragmento Fab' se secretó separadamente de E. coli y se sometió a unión química dirigida in vitro, para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado, era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y a células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos frente a dianas de tumor mamario humano.

También se han descrito diversas técnicas para obtener y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1443 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun, se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región de la bisagra, para formar monómeros, y luego se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método se puede utilizar también para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}), conectado con un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Consecuentemente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios V_{L} y V_{H} de otro fragmento, formando así dos puntos de unión de antígeno. También se ha descrito otra estrategia para obtener fragmentos de anticuerpo biespecíficos, mediante el uso de dímeros F_{V} monocatenarios (sF_{v}). Véase Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Se consideran anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unir dos epítopes diferentes, al menos uno de los cuales se origina en el antígeno proteínico de la invención. Alternativamente, un brazo antiantigénico de una molécula de inmunoglobulina se puede combinar con un brazo que se une a una molécula desencadenante sobre un leucocito, como una molécula receptora de célula T (p.ej., CD2, CD3, CD28 o B7) o a receptores Fc para IgG (Fc R), como Fc RI (CD64), Fc RII (CD32) y Fc RIII (CD16) de forma que se dirijan los mecanismos de defensa celulares a la célula que expresa el antígeno particular. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para dirigir sustancias citotóxicas hacia células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a antígeno y un brazo que se une a una sustancia citotóxica o un quelante de radionucleidos, como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al antígeno proteínico aquí descrito y se une además al factor tisular (TF).

4.10.4 Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados están también dentro del alcance de la presente solicitud. Los anticuerpos heteroconjugados están formados por dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para direccionar a diana células del sistema inmunitario hacia células no deseadas (Patente de EE.UU. Nº 4.676.980), y para tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Se considera que los anticuerpos se pueden preparar in vitro, usando métodos conocidos en química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican a sustancias reticulantes. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas, usando una reacción de intercambio de puentes disulfuro, o formando una unión tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquéllos descritos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU Nº 4.676.980.

4.10.5 Obtención mediante ingeniería genética de función efectora

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, de forma que se incremente, p.ej., la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, se puede introducir un residuo o residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de puentes disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodímero así generado puede tener una capacidad de interiorización mejorada y/o destrucción celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementadas. Véanse Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992). También se pueden preparar anticuerpos homodímeros con actividad antitumoral incrementada, usando reticulantes heterobifuncionales, según se describe en Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede obtener mediante ingeniería genética un anticuerpo que tiene regiones Fc dobles y puede, por tanto, tener capacidades incrementadas de lisis del complemento y ADCC. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).

4.10.6 Inmunoconjugados

Se describen inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con una sustancia citotóxica, como una sustancia quimioterapéutica, toxina (p.ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radioactivo (p.ej. un radioconjugado).

Se han descrito anteriormente sustancias quimioterapéuticas útiles para la producción de tales inmunoconjugados. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que se pueden usar, incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos de la toxina de la difteria que no se unen, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A del ricino, la cadena A de abrina, la cadena A de la modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica chaarntia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Están disponibles diversos radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.

Se obtienen conjugados del anticuerpo y la sustancia citotóxica, usando diversas sustancias que se acoplan a la proteína bifuncional, como N-succinimidil-3-(2-piridiltiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésterers (como dimetiladipimidato HCL), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como glutaraldehído), compuestos bis-azido (com bis(p-azidobenzoíl)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-benozoíldiazonio)etilendiamina), diisocianatos (como tolien-2,6-diisocianato), y compuestos de bis-flúor activo (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino, según se describe en Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianato-bencil-3-metildietilentriaminopentaacético marcado con carbono-14 (MX-DTPA), es una sustancia quelante ejemplar para la conjugación de radionucleidos al anticuerpo, véase WO94/11026.

En otra realización, el anticuerpo se puede conjugar con un "receptor" (como estreptavidina), para utilización en el predireccionamiento a diana, en el que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por eliminación del conjugado no unido de la circulación, usando una sustancia aclaradora y luego administración de un "ligando" (p.ej., avidina), que se conjuga a su vez con una sustancia citotóxica.

4.11 Secuencias legibles por ordenador

En una aplicación de esta realización, una secuencia nucleotídica de la presente invención se puede registrar en medios legibles por ordenador. Según se usa aquí, "medios legibles por ordenador" se refiere a cualquier medio que se puede leer y al que se puede acceder directamente mediante un ordenador. Tales medios incluyen, pero no están limitados a: medios de almacenamiento magnético, como disquetes, medios de almacenamiento de disco duro, y cinta magnética; medios de almacenamiento óptico, como CD-ROM; medios de almacenamiento eléctrico, como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías, como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente como se puede usar cualquiera de los medios legibles por ordenador conocidos actualmente, para crear un producto manufacturado que comprende un medio legible por ordenador que tenga registrada una secuencia nucleotídica de la presente invención. Según se usa aquí "registrada" se refiere a un procedimiento para almacenar información en un medio legible por ordenador. Un experto en la técnica puede adoptar fácilmente cualquiera de los métodos conocidos actualmente para registrar información en un medio legible por ordenador, para producir productos manufacturados que comprenden la información de secuencias de nucleótidos de la presente invención.

Para un experto en la técnica están disponibles diversas estructuras de almacenamiento de datos para crear un medio legible por ordenador que tenga registrada la secuencia nucleotídica de la presente invención. La elección de la estructura de almacenamiento de datos estará basada generalmente en los medios elegidos para acceder a la información almacenada. Además, se pueden usar diversos programas de tratamiento de datos y formatos para almacenar la información de secuencia de nucleótidos de la presente invención en medios legibles por ordenador. La información de secuencia se puede representar en un archivo de tratamiento de texto, formateado en software disponible comercialmente, como WordPerfect y Microsoft Word, o representado en forma de un archivo ASCII, almacenado en una aplicación de base de datos, como DB2, Sybase, Oracle, o similares. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente cualquier número de formatos de estructuración de procesadores de datos (p.ej., archivo de texto o base de datos), a fin de obtener un medio legible por ordenador que tenga registrada la información de secuencia de nucleótidos de la presente invención.

Proporcionando cualquiera de las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, o uno de sus fragmentos representativos; o una secuencia nucleotídica idéntica al menos en un 95% a cualquiera de las secuencias nucleotídicas de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33 en una forma legible por ordenador, un experto en la técnica puede acceder rutinariamente a la información de secuencia para diversos propósitos. Está disponible públicamente software que permite a un experto en la técnica acceder a la información de secuencia proporcionada en un medio legible por ordenador. Los ejemplos que siguen demuestran cómo se usa el software que ejecuta los algoritmos de búsqueda BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) y BLAZE (Brutlag et al., Comp. Chem. 17:203-207 (1993)) en un sistema Sybase, para identificar marcos de lectura abiertos (ORFs) en una secuencia de ácido nucleico. Tales ORFs pueden ser fragmentos codificadores de proteína, y pueden ser útiles para producir proteínas importantes comercialmente, como enzimas usadas en reacciones de fermentación y en la producción de metabolitos útiles comercialmente.

Según se usa aquí, un "sistema dirigido por ordenador" se refiere a los medios de hardware, software y medios de almacenamiento de datos usados para analizar la información de secuencia nucleotídica de la presente invención. Los medios de hardware mínimos de los sistemas basados en ordenador aquí descritos, comprenden una unidad de procesamiento central (CPU), medios de entrada, medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que uno cualquiera de los sistemas dirigidos por ordenador disponibles actualmente, es adecuado para usarlo en la presente solicitud. Según se indicó anteriormente, los sistemas dirigidos por ordenador aquí descritos comprenden un medio de almacenamiento de datos que tiene almacenada una secuencia nucleotídica de la presente invención, los medios de hardware necesarios y los medios de software para soportar y ejecutar las herramientas de búsqueda. Según se usa aquí "medios de almacenamiento de datos" se refiere a la memoria que puede almacenar información de la secuencia nucleotídica de la presente invención, o medios de acceso a memoria que pueden acceder a productos manufacturados que tienen registrada la información de secuencia nucleotídica de la presente invención.

Según se usa aquí "herramientas de búsqueda" se refiere a uno o más programas que se ejecutan en el sistema dirigido por ordenador para comparar una secuencia elegida como objetivo o un motivo estructural elegido como objetivo, con la información de secuencia almacenada en los medios de almacenamiento de datos. Las herramientas de búsqueda se usan para identificar fragmentos o regiones de una secuencia conocida que coinciden con una secuencia particular elegida como objetivo, o motivo elegido como objetivo. Se describen públicamente diversos algoritmos y diverso software disponible comercialmente para guiar a las herramientas de búsqueda, y se puede usar en los sistemas dirigidos por ordenador aquí descritos. Ejemplos de tal software incluyen, pero no están limitados a, Smith-Waterman, MacPattern (EMBL), BLASTN y BLASTA (NPOLYPEPTIDEIA). Un experto en la técnica puede reconocer fácilmente que uno cualquiera de los algoritmos o conjuntos de software de implementación disponibles para llevar a cabo búsquedas de homología, se puede adaptar para usarlo en los sistemas dirigidos por ordenador actuales. Según se usa aquí una "secuencia elegida como objetivo" puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico o aminoácido de seis o más nucleótidos o dos o más aminoácidos. Un experto en la técnica puede reconocer fácilmente que, cuanto más larga sea una secuencia elegida como objetivo, menos probable es que una secuencia elegida como objetivo esté presente como suceso aleatorio en la base de datos. La longitud de secuencia de máxima preferencia de una secuencia elegida como objetivo es de aproximadamente 10 a 100 aminoácidos, o de aproximadamente 30 a 300 residuos nucleotídicos. Sin embargo, se reconoce que las búsquedas de fragmentos comercialmente importantes, como fragmentos de secuencia implicados en la expresión génica y el tratamiento de proteínas, pueden ser más cortas.

Según se usa aquí un "motivo estructural elegido como objetivo" o "motivo elegido como objetivo", se refiere a cualquier secuencia o combinación de secuencias seleccionada racionalmente, en el que la secuencia o secuencias se eligen basándose en una configuración tridimensional que se forma tras el plegamiento del motivo elegido como objetivo. Existen diversos motivos elegidos como objetivo conocidos en la técnica. Los motivos de proteínas elegidos como objetivo incluyen, pero no están limitados a, sitios activos de enzimas y secuencias señal. Los motivos de ácidos nucleicos elegidos como objetivo incluyen, pero no están limitados a, secuencias promotoras, estructuras en horquilla y elementos de expresión inducible (secuencias que se unen a proteínas).

4.12 Formación de triple hélice

Además, los fragmentos aquí descritos, según se han descrito ampliamente, se pueden usar para controlar la expresión génica a través de la formación de triple hélice o ADN o ARN antisentido, estando basados ambos métodos en la unión de una secuencia polinucleotídica a ADN o ARN. Los polinucleótidos adecuados para uso en estos métodos tienen normalmente de 20 a 40 bases de longitud, y se diseñan para que sean complementarios a la región del gen implicada en la transcripción (triple hélice - véanse Lee et al., Nucl. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 15241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251:1360 (1991)), o al propio ARNm (antisentido - Olmno, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). La formación de triple hélice produce óptimamente una parada de la transcripción de ARN a partir del ADN, mientras que la hibridación del ARN antisentido bloquea la traducción de una molécula de ARNm en polipéptido. Ambas técnicas han demostrado ser efectivas en sistemas modelo. La información contenida en las secuencias de la presente invención es necesaria para el diseño de un oligonucleótido antisentido o de triple hélice.

4.13 Pruebas y kits de diagnóstico

La presente invención se refiere además a métodos para identificar la presencia o expresión de uno de los ORFs descritos o su homólogo, en una muestra de ensayo, usando una sonda de ácido nucleico o anticuerpos aquí descritos, conjugados opcionalmente o asociados de otra forma, con un marcador adecuado.

En general, los métodos para detectar un polinucleótido de la invención pueden comprender poner en contacto una muestra con un compuesto que se une con el polinucleótido y forma un complejo, durante un período suficiente para formar el complejo, y detectar el complejo, de forma que, si se detecta un complejo, se detecta un polinucleótido de la invención en la muestra. Tales métodos pueden comprender también poner en contacto una muestra, bajo condiciones de hibridación estrictas, con cebadores de ácidos nucleicos que hibridan con un polinucleótido de la invención bajo tales condiciones, y amplificar los polinucleótidos hibridados de forma que, si un polinucleótido está amplificado, un polinucleótido de la invención se detecta en la muestra.

En general, los métodos para detectar un polipéptido de la invención pueden comprender poner en contacto una muestra con un compuesto que se une a y forma un complejo con el polipéptido durante un período suficiente para formar el complejo, y detectar el complejo, de forma que, si se detecta, se detecta un polipéptido de la invención en la muestra.

En detalle, tales métodos comprenden incubar una muestra de ensayo con uno o más de los anticuerpos, o una o más de las sondas de ácido nucleico aquí descritas, y ensayar para la unión de las sondas de ácido nucleico o anticuerpos con componentes contenidos en la muestra de ensayo.

Las condiciones para incubar una sonda de ácido nucleico o anticuerpo con una muestra de ensayo varían. Las condiciones de incubación dependen del formato empleado en el ensayo, los métodos de detección empleados, y el tipo y naturaleza de la sonda de ácido nucleico o anticuerpo usado en el ensayo. Un experto en la técnica reconocerá que uno cualquiera de los formatos de ensayo de hibridación, amplificación o inmunológicos disponibles normalmente, se puede adaptar fácilmente para emplear las sondas de ácido nucleico o anticuerpos aquí descritos. Ejemplos de tales ensayos se pueden encontrar en Chard, T., An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques. Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock, G.R. et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL vol. 1 (1982), vol. 2 (1983), vol. 3 (1985); Tijssen, P., Practice and Theory of immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985). Las muestras de ensayo de la presente invención incluyen células, extractos de proteína o membrana de células, o fluidos biológicos como esputos, sangre, suero, plasma u orina. La muestra de ensayo usada en el método descrito anteriormente, variará basándose en el formato de ensayo, naturaleza del método de detección y los tejidos, células o extractos usados como muestra a ensayar. Los métodos para preparar extractos de proteína o extractos de membrana son bien conocidos en la técnica, y se pueden adaptar fácilmente para obtener una muestra que sea compatible con el sistema utilizado.

En otra realización de la invención, se describen kits que contienen los reactivos necesarios para realizar los ensayos descritos. Específicamente, se describe un kit compartimentado para albergar, en un espacio cerrado, uno o más recipientes que comprenden: (a) un primer recipiente que comprende una de las sondas o anticuerpos aquí descritos; y (b) uno o más recipientes que comprenden uno o más de los siguientes elementos: reactivos de lavado, y reactivos capaces de detectar la presencia de una sonda o anticuerpo unido.

En detalle, un kit compartimentado incluye cualquier kit en el que los reactivos están contenidos en recipientes separados. Tales recipientes incluyen pequeños recipientes de vidrio, recipientes de plástico o tiras de plástico o papel. Tales recipientes permiten transferir eficientemente reactivos desde un compartimento a otro compartimento, de forma que las muestras y reactivos no sufren contaminación cruzada, y las sustancias o soluciones de cada recipiente se pueden añadir en forma cuantitativa desde un compartimento a otro. Tales recipientes incluirán un recipiente que albergará la muestra de ensayo, un recipiente que contiene los anticuerpos usados en el ensayo, recipientes que contienen reactivos de lavado (como solución salina tamponada con fosfato, tampones Tris, etc.), y recipientes que contienen los reactivos usados para detectar el anticuerpo o sonda unido. Los tipos de reactivos de detección incluyen sondas de ácido nucleico marcadas, anticuerpos secundarios marcados o, en la alternativa, si el anticuerpo principal está marcado, los reactivos enzimáticos o de unión al anticuerpo, que son capaces de reaccionar con el anticuerpo marcado. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que las sondas y anticuerpos descritos se pueden incorporar fácilmente en uno de los formatos de kit establecidos, que se conocen bien en la técnica.

4.14 Formación de imágenes médicas

Los nuevos polipéptidos y parejas de unión aquí descritos, son útiles en la foración de imágenes médicas de sitios que expresan las moléculas de la invención (p.ej., en las que el polipéptido de la invención está implicado en la respuesta inmunitaria, para sitios de formación de imágenes de inflamación o infección). Véase, p.ej., Kunkel et al, Patente de EE.UU. Nº 5.413.778. Tales métodos implican la unión química de una sustancia marcadora o formadora de imagen, la administración del polipéptido marcado a un sujeto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, y la formación de imagen del polipéptido marcado in vivo en el sitio diana.

4.15 Ensayos de detección sistemática

Usando las proteínas y polinucleótidos aislados aquí descritos, se describen además métodos de obtención e identificación de sustancias que se unen a un polipéptido codificado por un ORF correspondiente a cualquiera de las secuencias nucleotídicas mostradas en SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 O 33, o se unen a un dominio específico del polipéptido codificado por el ácido nucleico. En detalle, dicho método comprende las etapas de:

(a): poner en contacto una sustancia, con una proteína aislada codificada por un ORF o ácido nucleico aquí descrito; y

(b): determinar si la sustancia se une a dicha proteína o dicho ácido nucleico.

En general, por tanto, tales métodos para identificar compuestos que se unen a un polinucleótido de la invención, pueden comprender poner en contacto un compuesto con un polinucleótido de la invención, durante un tiempo suficiente para formar un complejo de polinucleótido/compuesto, y detectar el complejo, de forma que si se detecta un complejo de polinucleótido/compuesto, se identifica un compuesto que se une a un polinucleótido de la invención.

Del mismo modo, en general, por tanto, tales métodos para identificar compuestos que se unen a un polipéptido de la invención pueden comprender poner en contacto un compuesto con un polipéptido de la invención, durante un tiempo suficiente para formar un complejo de polipéptido/compuesto, y detectar el complejo, de forma que si se detecta un complejo de polinucleótido/compuesto, se identifica un compuesto que se une a un polinucleótido de la invención.

Los métodos para identificar compuestos que se unen a un polipéptido de la invención pueden comprender también poner en contacto un compuesto con un polipéptido de la invención en una célula, durante un tiempo suficiente para formar un complejo de polipéptido/compuesto, en el que el complejo dirige la expresión de una secuencia de un gen receptor en la célula, y detectar el complejo mediante la detección de la expresión de la secuencia del gen informador, de forma que si se detecta un complejo de polinucleótido/compuesto, se identifica un compuesto que se une a un polinucleótido de la invención.

Los compuestos identificados a través de tales métodos pueden incluir compuestos que modulan la actividad de un polipéptido de la invención (es decir, incrementan o reducen su actividad, en relación con la actividad observada en ausencia del compuesto). Alternativamente, los compuestos identificados a través de tales métodos pueden incluir compuestos que modulan la expresión de un polinucleótido de la invención (es decir, incrementan o reducen la expresión en relación con el grado de expresión observado en ausencia del compuesto). Los compuestos, tales como compuestos identificados a través de los métodos de la invención, se pueden ensayar usando ensayos estándar bien conocidos para los expertos en la materia, para su capacidad de modular la actividad/expresión.

Las sustancias detectadas en el ensayo anterior pueden ser, pero no están limitadas a, péptidos, carbohidratos, derivados de vitaminas u otras sustancias farmacéuticas. Las sustancias se pueden seleccionar y detectar sistemáticamente de forma aleatoria, o seleccionarlas o diseñarlas racionalmente usando técnicas de modelado de proteínas.

Para la detección sistemática aleatoria, se seleccionan aleatoriamente sustancias como péptidos, carbohidratos, sustancias farmacéuticas y similares, y se ensayan para su capacidad de unirse a la proteína codificada por el ORF, según se describe aquí. Alternativamente, las sustancias se pueden seleccionar o diseñar racionalmente. Según se usa aquí, se dice que una sustancia se "selecciona o diseña racionalmente", cuando la sustancia se elige basándose en la configuración de la proteína particular. Por ejemplo, un experto en la materia puede adaptar fácilmente los procedimientos disponibles actualmente para producir péptidos, sustancias farmacéuticas y similares, capaces de unirse a una secuencia peptídica específica, a fin de producir péptidos antipéptido diseñados racionalmente, por ejemplo, véase Hurby et al., Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides en Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman, NY (1992), págs. 289-307, y Kaspczak et al., Biochemistry 28:9230-8 (1989), o sustancias farmacéuticas o similares.

Además de lo anterior, se puede usar una clase de sustancias, según se describe ampliamente, para controlar la expresión génica a través de la unión a uno de los ORFs o EMFs de la presente solicitud. Según se describió anteriormente, tales sustancias se pueden detectar sistemáticamente de forma aleatoria o diseñarse/seleccionarse racionalmente. El direccionamiento a diana de ORF o EMF permite a un experto en la técnica diseñar sustancias específicas de secuencia o específicas de elemento, modulando la expresión, bien de un único ORF, o de múltiples ORFs que se basan en el mismo EMF para el control de la expresión. Una clase de sustancias que se unen a ADN son sustancias que contienen residuos de base que hibridan o forman una estructura de triple hélice, uniéndose a ADN o ARN. Tales sustancias pueden estar basadas en la clásica cadena principal fosfodiéster de ácido ribonucleico, o pueden ser una variedad de derivados sulfhidrilo o polímeros, que tienen capacidad de unión a una base.

Las sustancias adecuadas para uso en estos métodos contienen normalmente de 20 a 40 bases, y se diseñan para que sean complementarias a una región del gen implicada en la transcripción (triple hélice - véanse Lee et al., Nucl. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251:1360 (1991)) o al propio ARNm (antisentido - Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). La formación de triple hélice produce, óptimamente, una parada de la transcripción de ARN a partir del ADN, mientras que la hibridación de ARN antisentido bloquea la traducción de una molécula de ARNm en polipéptido. Ambas técnicas han demostrado ser efectivas en sistemas modelo. La información contenida en las secuencias de la presente invención es necesaria para el diseño de un oligonucleótido antisentido o de triple hélice, y otras sustancias que se unen a ADN.

Las sustancias que se unen a una proteína codificada por uno de los ORFs aquí descritos se pueden usar como sustancia de diagnóstico. Las sustancias que se unen a una proteína codificada por uno de los ORFs aquí descritos, se pueden formular usando técnicas conocidas para generar una composición farmacéutica.

4.16 Uso de ácidos nucleicos como sondas

Otro aspecto aquí descrito se refiere a sondas de hibridación de ácidos nucleicos específicas para polipéptido, capaces de hibridar con secuencias nucleotídicas presentes en la naturaleza. Las sondas de hibridación se pueden derivar de cualquiera de las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33. Debido a que el gen correspondiente sólo se expresa en un número limitado de tejidos, se puede usar una sonda de hibridación derivada de cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33, como indicador de la presencia de ARN del tipo de célula de tal tejido, en una muestra.

Se puede emplear cualquier técnica de hibridación adecuada, como, por ejemplo, hibridación in situ. La PCR, según se describe en las Patentes de EE.UU. N^{os} 683.195 y 4.965.188, proporciona usos adicionales para oligonucleótidos basados en las secuencias de nucleótidos. Tales sondas usadas en PCR pueden ser de origen recombinante, pueden sintetizarse químicamente, o una mezcla de ambos. La sonda comprenderá una secuencia nucleotídica discreta para la detección de secuencias idénticas, o un conjunto degenerado de posibles secuencias para identificación de secuencias genómicas estrechamente relacionadas.

Otros métodos para producir sondas de hibridación específicas para ácidos nucleicos, incluyen la clonación de secuencias de ácidos nucleicos en vectores para la producción de sondas de ARNm. Tales vectores son conocidos en la técnica, están disponibles comercialmente, y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro, mediante la adición de la polimerasa de ARN apropiada, como polimerasa de ARN T6 o SP6, y los nucleótidos marcados radioactivamente apropiados. Las secuencias nucleotídicas pueden usarse para construir sondas de hibridación para mapear sus secuencias genómicas respectivas. La secuencia nucleotídica proporcionada aquí se puede mapear a un cromosoma o regiones específicas de un cromosoma, usando técnicas de mapeo génico y/o cromosómico bien conocidas. Estas técnicas incluyen hibridación in situ, análisis de ligamiento frente a marcadores cromosómicos conocidos, detección sistemática de hibridación con bibliotecas o preparaciones cromosómicas clasificadas por flujo, específicas para cromosomas conocidos, y similares. La técnica de hibridación in situ fluorescente de extensiones cromosómicas, se ha descrito, entre otros sitios, en Vema et al (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York NY.

La hibridación fluorescente in situ de preparaciones cromosómicas y otras técnicas de mapeo cromosómico físico se pueden correlacionar con datos de mapeo genético adicionales. Ejemplos de datos de mapeo genético se pueden encontrar en el número Genome de 1994, de Science (265:1981f). La correlación entre la localización de un ácido nucleico sobre un mapa cromosómico físico y una enfermedad específica (o predisposición a una enfermedad específica), puede ayudar a delimitar la región de ADN asociada con esa enfermedad genética. Las secuencias nucleotídicas de la invención de interés se pueden usar para detectar diferencias en secuencias génicas, entre individuos normales, portadores o afectados.

4.17 Preparación de oligonucleótidos unidos a soporte

Se pueden preparar fácilmente oligonucleótidos, es decir, pequeños segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, sintetizando directamente el oligonucleótido mediante medios químicos, según se lleva a cabo normalmente usando un sintetizador de oligonucleótidos automático.

Se pueden preparar oligonucleótidos unidos a un soporte mediante cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la técnica, usando cualquier soporte adecuado, como vidrio, poliestireno o teflón. Una estrategia es marcar de forma precisa oligonucleótidos sintetizados mediante sintetizadores estándar. La inmovilización se puede lograr usando adsorción pasiva (Inouye & Hondo, 1990, J. Clin. Microbiol. 28(6) 1462-72); usando luz UV (Nagata et al., 1985; Dahlen et al., 1987; Morrissey & Collins, Mol. Cell Probes 1989 3(2) 189-207) o mediante unión covalente de ADN con bases modificadas (Keller et al., 1988:1989).

Otra estrategia que se puede emplear es el uso de la interacción fuerte biotina-estreptavidina, como conector. Por ejemplo, Broude et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(8) 3072-6, describe el uso de sondas biotiniladas, aunque estas son sondas dúplex, que se inmovilizan sobre glóbulos magnéticos recubiertos con estreptavidina. Los glóbulos recubiertos con estreptavidina se pueden adquirir de Dynal, Oslo. Por supuesto, esta misma química de ligamiento es aplicable al recubrimiento de cualquier superficie con estreptavidina. Las sondas biotiniladas se pueden adquirir de diversas fuentes, como, p.ej., Operon Technologies (Alameda, CA).

Nunc Laboratories (Naperville, IL), también está vendiendo material adecuado que se puede usar. Nunc Laboratories han desarrollado un método denominado CovaLink NH, mediante el que se puede unir ADN covalentemente a la superficie del micropocillo. CovaLink NH es una superficie de poliestireno injertada con grupos amino secundarios (>NH), que sirven como cabezas de puente para un acoplamiento covalente posterior. Los módulos de CovaLink se pueden adquirir de Nunc Laboratories. Las moléculas de ADN se pueden unir a CovaLink exclusivamente en el extremo 5' mediante una unión fosforamidato, permitiendo la inmovilización de más de 1 pmol de ADN (Rasmussen et al., (1991) Anal. Biochem. 198(1) 138-42.

Se ha descrito (Rasmussen et al., 1991) el uso de tiras de CovaLink NH para la unión covalente de moléculas de ADN en el extremo 5'. En esta tecnología, se emplea una unión fosforamidato (Chu et al., 1983 Nucleic Acids 11 (18) 6513-29). Esto es beneficioso, ya que se prefiere la inmovilización usando una única unión covalente. El enlace de fosforamidato une el ADN a los grupos amino secundarios de CovaLink NH que están situados en el extremo de los brazos espaciadores injertados covalentemente sobre la superficie de poliestireno, a través de un brazo espaciador de 2 nm de largo. Para ligar un oligonucleótido a CovaLink NH a través de una unión fosforamidato, el oligonucleótido terminal tiene que tener un grupo fosfato en el extremo 5'. Es posible quizás, incluso, que la biotina esté unida covalentemente a CovaLink y luego se use la estreptavidina para unir las sondas.

Más específicamente, el método de unión incluye disolver ADN en agua (7,5 ng/\mul) y desnaturalizar durante 10 min. a 95ºC y enfriar sobre hielo durante 10 min. Después se añade 1-metil-imidazol 0,1 M a pH 7,0 (1-MeIm_{7}) enfriado con hielo, hasta una concentración final de 10 mM de 1-MeIm_{7}. Luego se suministra una solución de ADN ss a tiras de CovaLink NH (75 \mul/pocillo) depositadas sobre hielo.

Se obtiene carbodiimida, 0,2 M 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), recién preparada, disuelta en 1-MeIm_{7} 10 mM, y se añaden 25 \mul por pocillo. Las tiras se incuban durante 5 horas a 50ºC. Tras la incubación, las tiras se lavan usando, p.ej., Nunc-Immuno Wash: primero se lavan los pocillos 3 veces, luego se empapan con solución de lavado durante 5 min., y finalmente se lavan 3 veces (donde la solución de lavado contiene NaOH 0,4 N y SDS al 0.25%, calentado hasta 50ºC).

Se considera que un método adicional adecuado es el descrito en la Solicitud de Patente PCT WO 90/03382 (Southern & Maskos). Este método de preparación de un oligonucleótido unido a un soporte, implica unir un reactivo que lleva un nucleósido unido en 3', a través del grupo fosfato mediante una unión fosfodiéster covalente, a grupos hidroxilo alifáticos que lleva el soporte. El oligonucleótido se sintetiza luego sobre el nucleósido soportado y los grupos protectores se eliminan de la cadena oligonucleotídica sintética en condiciones estándar, que no escinden el oligonucleótido del soporte. Reactivos adecuados incluyen la fosforamidita de nucleósido y el hidrógeno fosforato de nucleósido.

Se puede emplear una estrategia sobre chip para la preparación de una sonda de ADN, para la preparación de matrices de sondas de ADN. Por ejemplo, se puede emplear fotodesprotección activada por láser direccionable en la síntesis química de oligonucleótidos directamente sobre una superficie de vidrio, según se describió por Fodor et al. (1991) Science 251 (4995) 767-73. También se pueden inmovilizar sondas sobre soportes de nylon, según se describió por Van Ness et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19(12) 3345-50; o unirlas a teflón, usando el método de Duncan & Cavalier (1988) Anal. Biochem. 169(1) 104-8.

Ligar un oligonucleótido a un soporte de nylon, según se describió por Van Ness et al. (1991), requiere la activación de la superficie de nylon a través de alquilación y activación selectiva del extremo 5'-amino de oligonucleótidos, con cloruro cianúrico.

Una vía particular para preparar oligonucleótidos unidos a soporte es utilizar la síntesis generada por luz, descrita por Pease et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11) 5022-6. Estos autores usaron técnicas fotolitográficas actuales para producir matrices de sondas oligonucleotídicas inmovilizadas (chips de ADN). Estos métodos, en los que se usa la luz para dirigir la síntesis de sondas oligonucleotídicas en micromatrices miniaturizadas de elevada densidad, utilizan N-acil-desoxinucleosido-fosforamiditas protegidas en posición 5' fotolábiles, química de enlace superficial y estrategias de síntesis combinatoria versátiles. De esta forma se puede producir una matriz de 256 sondas oligonucleotídicas definidas espacialmente.

4.18 Preparación de fragmentos de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos se pueden obtener de cualquier fuente apropiada, como ADNc, ADN genómico, ADN cromosómico, bandas cromosómicas microdiseccionadas, insertos de cósmidos o YAC, y ARN, incluyendo ARNm sin ninguna etapa de amplificación. Por ejemplo, Sambrook et al, (1989), describe tres protocolos para el aislamiento de ADN de elevado peso molecular de células de mamífero (párrafos 9.14-9.23).

Se pueden preparar fragmentos de ADN como clones en M13, plásmidos o vectores lambda y/o prepararse directamente de ADN o ADNc genómico, mediante PCR u otros métodos de amplificación. Se pueden preparar muestras o proporcionarse en placas multipocillo. Se pueden preparar aproximadamente 100-1000 ng de muestras de ADN, en 2-500 ml de volumen final.

Los ácidos nucleicos se fragmentarán a continuación mediante cualquiera de los métodos conocidos para los expertos en la materia incluyendo, por ejemplo, el uso de enzimas de restricción, según se describe en 9.24-9.28 de Sambrook et al. (1989), cizallamiento mediante ultrasonidos y tratamiento con NaOH.

El cizallamiento a baja presión también es apropiado, según se describe por Schriefer et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18(24) 7455-6. En este método, se hacen pasar muestras de ADN a través de una pequeña celda de presión francesa, a diversas presiones, desde bajas a intermedias. Un dispositivo de palanca permite una aplicación controlada de presiones a la célula, de bajas a intermedias. Los resultados de estos estudios indican que el cizallamiento a baja presión es una alternativa útil a métodos de fragmentación de ADN sónicos y enzimáticos.

Se considera que un modo particularmente adecuado para fragmentar el ADN es usar la endonucleasa CviJI que reconoce dos bases, descrita por Fitzgerald et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20(14) 3753-62. Estos autores describieron un enfoque para la fragmentación y fraccionamiento rápido de ADN en tamaños particulares, que consideraban adecuados para clonación en perdigonada y secuenciación.

La endonucleasa de restricción CviJI normalmente escinde la secuencia de reconocimiento PuGCPy entre la G y la C, dejando extremos romos. Condiciones de reacción atípicas, que alteran la especificidad de esta enzima (CviJI**), producen una distribución cuasi-aleatoria de fragmentos de ADN a partir de la pequeña molécula pUC19 (2688) pares de bases. Fitzgerald et al. (1992) evaluaron cuantitativamente la aleatoriedad de esta estrategia de fragmentación, usando un digerido CviJI** de pUC19, que se fraccionó por tamaños mediante un método de filtración en gel rápido y se ligó directamente, sin reparación de extremos, a un vector de clonación M13 lac Z negativo. El análisis de secuencia de 76 clones mostró que CviJI** escinde por restricción pyGCPy y PuGCPu, además de sitios PuGCPy, y que los nuevos datos de secuencia se acumulan a una velocidad consecuente con la fragmentación aleatoria.

Según se describe en la literatura, las ventajas de este enfoque comparadas con la sonicación y el fraccionamiento en gel de agarosa incluyen: se requieren cantidades de ADN más pequeñas (0,2-0,5 \mug, en lugar de 2-5 \mug); y están implicadas menos etapas (no se necesita ligamiento previo, reparación de extremos, extracción química o electroforesis en gel de agarosa y elución).

Independientemente de la manera en la que se obtienen o preparan los fragmentos de ácidos nucleicos, es importante desnaturalizar el ADN para proporcionar trozos monocatenarios disponibles para hibridación. Esto se logra incubando la solución de ADN durante 2-5 minutos a 80-90ºC. La solución se enfría rápidamente a continuación hasta 2ºC, para evitar la renaturalización de los fragmentos de ADN, antes de ponerlos en contacto con el chip. Los grupos fosfato se tienen que eliminar también del ADN genómico mediante métodos conocidos en la técnica.

4.19 Preparación de matrices de ADN

Se pueden preparar matrices moteando muestras de ADN sobre un soporte, como una membrana de nylon. El moteado se puede realizar usando matrices de púas metálicas (cuyas posiciones corresponden a una matriz de pocillos en una placa de microvaloración) para transferir repetidamente aproximadamente 20 nl de una solución de ADN a una membrana de nylon. Mediante impresión por transferencia, se logra una densidad de puntos mayor que la densidad de pocillos. Se pueden acomodar de uno a 25 puntos en 1 mm^{2}, dependiendo del tipo de marcador usado. Evitando el moteado en un número preseleccionado de filas y columnas, se pueden formar subgrupos (submatrices) separados. Las muestras de una submatriz pueden ser el mismo segmento genómico de ADN (o el mismo gen) de diferentes individuos, o pueden ser clones genómicos diferentes, solapados. Cada una de las submatrices puede representar el moteado de réplica de las mismas muestras. En un ejemplo, un segmento de gen seleccionado puede amplificarse de 64 pacientes. Para cada paciente, el segmento génico amplificado puede estar en una placa de 96 pocillos (conteniendo los 96 pocillos la misma muestra). Se prepara una placa para cada uno de los 64 pacientes. Usando un dispositivo de 96 púas, todas las muestras se pueden motear sobre una membrana de 8 x 12 cm. Las submatrices pueden contener 64 muestras, una de cada paciente. Cuando las 96 submatrices son idénticas, la separación de puntos puede ser de 1 mm^{2} y puede existir 1 mm de espacio entre submatrices.

Otro enfoque es usar membranas o placas (disponibles de NUNC, Naperville, Illinois), que pueden estar divididas por espaciadores físicos, p.ej. una rejilla de plástico moldeada sobre la membrana, siendo similar la rejilla al tipo de membrana aplicada sobre el fondo de placas multipocillo, o tiras hidrófobas. Un espaciador físico fijado no es preferido para formación de imágenes mediante exposición a pantallas planas de almacenamiento de fósforo o películas de rayos X.

La presente invención se ilustra en los siguientes Ejemplos. Teniendo en consideración la presente descripción, un experto en la técnica apreciará que se pueden realizar muchas otras realizaciones y variaciones dentro del alcance de la presente invención. Consecuentemente, se pretende que los aspectos más amplios de la presente invención no estén limitados a la descripción de los siguientes Ejemplos. La presente invención no está destinada a estar limitada en alcance por las realizaciones ejemplificadas, que están destinadas a ser ilustraciones de aspectos aislados de la invención, y las composiciones y métodos que son equivalentes funcionalmente, están dentro del alcance de la invención. En efecto, se espera que a los expertos en la técnica se les ocurran numerosas modificaciones y variaciones en la puesta en práctica de la invención, tras la consideración de las presentes realizaciones preferidas. Consecuentemente, las únicas limitaciones que se deberían poner al alcance de la invención son las que aparecen en las reivindicaciones adjuntas.

5. Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de SEQ ID NO: 1-21 de una biblioteca de ADNc de células humanas

Se obtuvo una pluralidad de ácidos nucleicos de una biblioteca de ADNc preparada de hígado fetal, bazo, ovario, cerebro adulto, tumor de pulmón, médula espinal, cérvix, ovario, células endoteliales, cordón umbilical, fibroblastos de pulmón, cerebro fetal y testículos humanos, usando PCR estándar, secuenciación mediante análisis de identificación de secuencia de hibridación, y técnicas de secuenciación de Sanger. Los insertos de la biblioteca se amplificaron con PCR, usando cebadores específicos para secuencias de vectores que flanqueaban los insertos. Estas muestras se motearon sobre membranas de nylon y se interrogaron con sondas oligonucleotídicas, para proporcionar identificaciones de secuencias. Los clones se agruparon en grupos de secuencias análogas o idénticas, y se seleccionaron clones representativos únicos de cada grupo para secuenciación sobre gel. La secuencia 5' de los insertos amplificados se dedujo a continuación, usando el cebador de secuenciación M13 inverso, en un protocolo de secuenciación de Sanger típico. Los productos de PCR se purificaron y sometieron a secuenciación cíclica de terminador de colorante fluorescente. Se realizó una secuenciación sobre gel de un solo pase, usando un secuenciador 377 de Applied Biosystems (ABI). Estos insertos se identificaron como una secuencia nuevo, no obtenida previamente de esta biblioteca, y no descritos previamente en bases de datos públicas. Estas secuencias se designan como SEQ ID NO: 1-21, en el listado de secuencias adjunto.

Ejemplo 2 Empalme de SEQ ID NO: 22 Y 24

Los nuevos ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 22 y 24) de la invención se ensamblaron de secuencias que se obtuvieron de una biblioteca de ADNc mediante métodos descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las secuencias finales se empalmaron usando las secuencias EST como simiente. A continuación, se usó un algoritmo recursivo para extender la simiente en un empalme extendido, extrayendo secuencias adicionales de la base de datos Hyseq's, que contiene secuencias EST que pertenecen a este empalme. El algoritmo terminó cuando se empalmó una secuencia contigua completa. La inclusión de secuencias componentes en el empalme, se basó en un resultado de BLASTN respecto al empalme que se extendía, siendo la puntuación de BLAST superior a 300 y el porcentaje de identidad superior al 95%.

El resultado próximo más cercano para la secuencia empalmada (SEQ ID NO: 22 o 24) se obtuvo mediante una búsqueda en FASTA versión 3, frente a Genpept versión 114, usando el algoritmo Fastxy. Fastxy es una versión mejorada del alineamiento FASTA, que permite cambios de marco internos al codón. El resultado próximo más cercano mostraba el homólogo más cercano para cada empalme de Genpept (y contiene las secuencias aminoácidas traducidas para las que codifica el empalme). El resultado próximo más cercano se muestra debajo:

1

Se predijo que los polipéptidos estaban codificados por SEQ ID NO: 22 (o 24), según se indica a continuación. Los polipéptidos se predijeron usando un programa de software llamado FASTY (disponible de http://fasta.bioch.virginia.
edu), que selecciona un polipéptido basándose en una comparación del nuevo polinucleótido traducido con polipéptidos conocidos (W.R. Pearson, Methods in Enzymology, 183:63-98 (1990), incorporada aquí mediante referencia).

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Empalme de SEQ ID NO: 27

El nuevo ácido nucleico de la invención (SEQ ID NO: 27) se empalmó inicialmente de secuencias que se obtuvieron de una biblioteca de ADNc mediante métodos descritos en el Ejemplo 1 anterior. La secuencia final se empalmó usando las secuencias EST como simiente. A continuación, se usó un algoritmo recursivo para extender la simiente en un empalme extendido, extrayendo secuencias adicionales de la base de datos Hyseq's, que contiene secuencias EST que pertenecen a este empalme. El algoritmo terminó cuando se empalmaba una secuencia contigua completa. La inclusión de secuencias componentes en el empalme se basaba en un resultado de BLASTN para el empalme que se extendía, con una puntuación de BLAST superior a 300 y un porcentaje de identidad superior a 95%.

Usando esta secuencia inicial, se diseñaron cebadores adecuados para amplificación de ESTs, que comprenden la secuencia inicial. Los productos se clonaron. El ADN se aisló, se cortó con enzimas de restricción apropiadas, se ligó y se volvió a clonar para generar la secuencia contigua completa. El producto completo se clonó y secuenció a continuación, usando el secuenciador 377 de Applied Biosystems (ABI). Esta secuencia nucleotídica es idéntica a SEQ ID NO: 27.

Alternativamente, el ADN homólogo al factor de células madre completo, se amplificó por PCR, usando cebadores apropiados de la biblioteca Marathon de ADNc de bazo ya preparada (Clontech). El producto de PCR primario se amplificó adicionalmente usando cebadores de PCR anidados. El producto de la segunda PCR se secuenció usando un secuenciador 377 de Applied Biosystems (ABI). Este producto es idéntico a SEQ ID NO: 27.

Ejemplo 4 Empalme de SEQ ID NO: 23, 25 Y 28

Usando PHRAP (Univ. de Washington), se produjeron secuencias de genes completos de ADNc y las correspondientes secuencias de proteína, a partir del empalme. Cualquier cambio de marco y codón de parada incorrecto se corrigió mediante edición manual. Durante la edición, la secuencia se revisó usando FASTY y/o BLAST contra Genbank (es decir Genepept versión 115). Otros programas de ordenador que se usaron en el proceso de edición fueron phredPhrap y Consed (Universidad de Washington) y ed-ready, ed-ext y cg-zip-2 (Hyseq Inc.).

Se predijo que SEQ ID NO: 27 codificaba un polipéptido (SEQ ID NO: 28), según se muestra más adelante. El polipéptido se predijo usando un programa de software denominado BLASTX, que selecciona un polipéptido, basándose en una comparación del nuevo polinucleótido traducido con polinucleótidos conocidos. La metionina inicial empieza en la posición 123 de SEQ ID NO: 3, y el codón putativo de parada, TAA, empieza en la posición 1710 de la secuencia nucleotídica.

El polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre de SEQ ID NO: 28 es una proteína de aproximadamente 529 aminoácidos, con una masa molecular predicha de aproximadamente 59.2 kDa, sin glucosilar. Las búsquedas en bases de datos de proteínas con el algoritmo BLASTP (Altschul S.F. et al., J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993) y Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol. 21:403-10 (1990), incorporados aquí mediante referencia, indican que la SEQ ID NO: 28 es homóloga a la proteína precursora del marcador endotelial tumoral 7.

La Figura 2 muestra el alineamiento de secuencia aminoácida de BLASTX entre la proteína codificada por el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre, SEQ ID NO: 28, y la proteína precursora del marcador endotelial tumoral 7, SEQ ID NO: 36, (St. Croix et al., Science, 289, 1197-1201), indicando que las dos secuencias comparten un 72% de similitud en 441 residuos aminoácidos y 57% de identidad en los mismos 441 residuos aminoácidos.

Desde aproximadamente el residuo 1 hasta el residuo 30 de SEQ ID NO: 28 (SEQ ID NO: 30) se codifica un péptido señal predicho de aproximadamente treinta residuos. La porción extracelular es útil en sí misma. Esto se puede confirmar mediante expresión en células de mamíferos y secuenciación del producto escindido. La región del péptido señal se predijo usando el programa Neural Network SignalP V1.1 (Nielsen et al, (1997) Int. J. Neur. Syst. 8, 581)(del Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University of Denmark), y análisis de hidrofobicidad usando el algoritmo de Kyte/Doolittle (Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157, 105). Un experto en la materia reconocerá que el sitio de escisión puede ser diferente del predicho mediante el programa de ordenador. La SEQ ID NO: 31 es el péptido resultante cuando el péptido señal se elimina de SEQ ID NO: 28.

Desde aproximadamente el residuo 452 hasta el residuo 479 de SEQ ID NO: 28 (SEQ ID NO: 32) se codifica una región transmembranar predicha de aproximadamente veintiocho residuos. Esto se puede confirmar mediante expresión en células de mamífero. La región transmembranar se predijo usando el programa Neural Network SignalP V1.1 (Nielsen et al, (1997) Int. J. Neur. Syst. 8, 581)(del Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University of Denmark), y análisis de hidrofobicidad usando el algoritmo de Kyte/Doolittle (Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157, 105). Un experto en la materia reconocerá que el sitio de escisión puede ser diferente del predicho por el programa de ordenador.

Se predijo que SEQ ID NO: 24 codificaba un polipéptido (SEQ ID NO: 25), según se indica más adelante. El polipéptido se predijo usando un programa de software denominado BLASTX, que selecciona un polipéptido, basándose en una comparación del nuevo polinucleótido traducido con polinucleótidos conocidos. La metionina inicial empieza en la posición 107 de SEQ ID NO: 24, y el codón putativo de parada, TAA, empieza en la posición 1280 de la secuencia nucleotídica.

El polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre, de SEQ ID NO: 25 (idéntica a SEQ ID NO: 23) es una proteína de aproximadamente 392 aminoácidos, con una masa molecular predicha de aproximadamente 50 kDa, sin glucosilar. Búsquedas en bases de datos de proteínas con el algoritmo BLASTP (Altschul S.F. et al. J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993) y Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol. 21:403-10 (1990), incorporados aquí mediante referencia), indican que la SEQ ID NO: 25 es homóloga a la proteína precursora del marcador 7 de tumor endo-
telial.

Desde aproximadamente el residuo 315 hasta el residuo 342 de SEQ ID NO: 25 (SEQ ID NO: 32) se codifica una región transmembranar predicha de aproximadamente veintiocho residuos. Esto se puede confirmar mediante expresión en células de mamífero. La región transmembranar se predijo usando el programa Neural Network SignalP V1.1 (Nielsen et al, (1997) Int. J. Neurl Syst. 8, 581) (del Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University de Dinamarca), y análisis de hidrofobicidad usando el algoritmo de Kyte/Doolittle (Kyte y Doolittle (1982), J. Mol. Biol. 157, 105). Un experto en la técnica reconocerá que la región transmembranar puede ser diferente de la predicha por el programa de ordenador.

Ejemplo 5 A. Clonación y expresión de polinucleótido (SEQ ID NO:33) y polipéptido (SEQ ID NO:34) análogos al factor de células madre soluble

A fin de expresar el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre soluble, el ADN análogo al factor de crecimiento de células madre completo se amplificó por PCR de la biblioteca Marathon de ADNc de bazo ya preparada (Clontech). El producto de PCR primario se amplificó de nuevo usando cebadores de PCR anidados, que generarían el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre soluble, cuando se expresen en líneas celulares adecuadas. El producto de la PCR secundaria (SEQ ID NO: 33), se clonó en pCADN3.1/Myc-His (+) A, entre los puntos EcoRI y XhoI. El plásmido que codificaba el polipéptido análogo al factor de células madre soluble y los vectores testigo se transfectaron en células CHO, usando el reactivo de transfección FuGENE-6 (Roche). El medio de cultivo, el lisado celular y las fracciones de desecho celulares insolubles se analizaron mediante SDS-PAGE, seguido de transferencia Western con anticuerpos anti myc. Según se esperaba, se encontró que más del 95% del polipéptido análogo al factor de células madre soluble (SEQ ID NO: 34) se secretaba y estaba presente en el medio de cultivo.

Usando un enfoque similar, se generan también líneas estables de 293 células que expresan SEQ ID NO: 34. Éstas se clonaron posteriormente para seleccionar moduladores de expresión elevada, moderada y baja.

B. Expresión y purificación de SEQ ID NO: 34 de células de insecto y bacterianas

La proteína análoga al factor de células madre se expresó en células de insecto como sigue:

La versión del gen análogo al factor de células madre con el dominio transmembranar C-terminal truncado (SEQ ID NO: 33) se clonó mediante PCR en un vector de clonación pIB/V5-His TOPO TA (Invitrogen Corporation). El ADN análogo al factor de células madre en el vector se generó, bien con un marcador Myc/His o sin ningún marcador. Se transfectaron células de insecto (High Five TM, Invitrogen) con el ADN plasmídico análogo al factor de crecimiento de células madre, que contenía el marcador, usando el InsectSelectTM System (Invitrogen). La expresión de la proteína análoga al factor de crecimiento de células madre se determinó mediante expresión transitoria. El medio que contenía proteína análoga al factor de crecimiento de células madre expresada se separó sobre SDS-PAGE y se identificó la proteína análoga al factor de crecimiento de células madre mediante análisis de transferencia Western. Para producción a gran escala de proteína análoga al factor de crecimiento de células madre, las células resistentes se expandieron en matraces que contenían medio Ultimate InsectTM exento de suero (Invitrogen). Las células se agitaron a \sim100 mph a 27ºC, durante 4 días. Los medios condicionados que contenían la proteína para purificación se recogieron mediante centrifugación.

La proteína análoga al factor de células madre se expresó en células bacterianas como sigue:

El gen análogo al factor de crecimiento de células madre maduro sin el dominio transmembranar (SEQ ID NO: 33) se clonó en un vector de expresión (PCR T7/NT-TOPO) de Invitrogen. El plásmido resultante se expresó en la cepa BL-21 (DE 3) pLys de E. coli. Las células se cultivaron en caldo LB que contenía ampicilina (100 \mug/ml) a 37ºC. La expresión de la proteína análoga al factor de crecimiento de células madre se indujo a continuación con IPTG (concentración final 1 mM), las células se dejaron crecer durante 4 horas adicionales y se recogieron. El análisis de la producción de análogo de factor de crecimiento de células madre mediante SDS-PAGE y transferencia Western se realizó según se detalla más adelante.

La purificación de proteína análoga al factor de crecimiento de células madre se realizó como sigue. El medio Insect Ultimate que contenía el análogo al factor de crecimiento de células madre marcado con His se llevó hasta pH 7,5, añadiendo una cantidad apropiada de NaOH 1M. La solución se complementó después con PMSF 1 mM (concentración final) para evitar la escisión proteolítica durante el proceso de purificación. El medio se hizo pasar a través de un filtro de 0,2 micrones (unidad de filtro estéril de 1000 ml de Nalgene Surfactant Free Cellulose Acetate) para eliminar el material particulado. La solución resultante se concentró 10 veces y se equilibró simultáneamente con fosfato sódico 20 mM, a pH 7,5, usando un cartucho de diafiltración con un tamaño de umbral de membrana de 10 kDa. El medio concentrado diez veces y diafiltrado se cargó en una columna Ni-NTA equilibrada con fosfato sódico 20 mM a pH 7,5, que contenía NaCl 300 mM e imidazol 20 mM. La proteína análoga al factor de crecimiento de células madre, marcada con His se eluyó con el mismo tampón y un gradiente lineal de imidazol (20-300 mM). La proteína eluida se identificó según se describe más adelante. Las fracciones agrupadas que contenían análogo del factor de crecimiento de células madre se equilibraron con tampón PBS, usando una célula de agitación Amicon con un tamaño de umbral de membrana de 10 kDa. Este proceso produjo también la eliminación de imidazol. La proteína se concentró luego hasta aproximadamente 10 mg/ml en tampón PBS para estudios funcionales.

La purificación de proteína análoga al factor de crecimiento de células madre de cultivos bacterianos se realizó como sigue. Se extrajeron células de E. coli que expresaban análogo del factor de crecimiento de células madre como cuerpos de inclusión, con 10 volúmenes (p/volumen) de tampón de extracción (NaPO_{4} 50 mM, pH 7,0) y después con tampón que contenía hidrocloruro de guanidina 6M en el tampón de extracción. La proteína análoga al factor de crecimiento de células madre disuelta, se fraccionó sobre una columna Ni-NTA, según se describió anteriormente. La versión desplegada de proteína análoga al factor de crecimiento de células madre obtenida de esta purificación de afinidad, se dejó que alcanzase una conformación nativa mediante incubación con un tampón de replegamiento que consistía en DTT y glutatión. La muestra replegada se equilibró con Tween Tris 20 mM al 0,1% y se concentró hasta 100 ml (concentración 10 veces), previamente a la cromatografía líquida de flujo rápido sobre intercambiadores iónicos de Q-sefarosa y SP-sefarosa. También se desarrollaron protocolos adicionales para condiciones de replegamiento apropiadas, usando urea 8M, en vez de hidrocloruro de guanidina 6M.

Ejemplo 6 Expresión de SEQ ID NO: 33 en células humanas primarias

El producto de PCR anidada secundaria a partir de la biblioteca de bazo Marathon o cualquier otro polinucleótido que codifique el polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre se clonan en el vector retrovírico MSCV (Clontech), en puntos de clonación apropiados, usando cebadores de PCR directos e inversos apropiados. Este vector retrovírico se transfecta después usando el reactivo de transfección FUGENE-6, al interior de líneas celulares de empaquetamiento, para producir cantidades adecuadamente grandes de retrovirus que tendrán el ADN análogo al factor de crecimiento de células madre clonado en su interior. Se preparan retrovirus que contienen los sobrenadantes, a partir de líneas celulares empaquetadas y mezcladas con células estromales o madre. Tras la transducción del retrovirus, estas células transducidas pueden expresar la proteína análoga al factor de crecimiento de células madre, que se puede analizar como sigue:

A. Ensayo de cultivo líquido: Se compran en el comercio células madre de origen hematopoyético o diferente. 1x10^{4} células se sembrarán en una placa de 96 pocillos. Se añadirán a las células madre 50-200 ng/ml de proteína análoga al factor de crecimiento de células madre purificada u otros factores de crecimiento adecuados, a concentraciones apropiadas. Se añadirán IL-3 e IL-6 después de 5 días de incubación. Los cultivos se observan microscópicamente y se cuentan todos los días. Se realiza tinción por citometría de flujo para determinar la diferenciación del linaje celular.

B. Ensayo de cultivo asociado a estroma: Se obtienen células estromales de tejidos adecuados procedentes de vendedores comerciales. Se cultivarán 1x10^{4} células madre junto con 1x10^{4} células estromales transducidas con polinucleótido análogo al factor de crecimiento de células madre. Los cultivos se observan al microscopio y se cuentan todos los días. Se puede realizar tinción por citometría de flujo para determinar la diferenciación del linaje celular.

Ejemplo 7 Estudio de expresión usando SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33

Se analiza la expresión de SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33 en varios tejidos, usando una técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa semicuantitativa. Se usan bibliotecas de ADNc humanas como fuentes de genes expresados de tejidos de interés (vejiga adulta, cerebro adulto, corazón adulto, riñón adulto, nódulo linfático adulto, hígado adulto, pulmón adulto, ovario adulto, placenta adulta, recto adulto, bazo adulto, testículos adultos, médula ósea, timo, glándula tiroides, riñón fetal, hígado fetal, hígado-bazo fetal, piel fetal, cerebro fetal, leucocitos y macrófagos fetales). Se usan cebadores específicos de genes para amplificar porciones de las secuencias SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33 de las muestras. Los productos amplificados se separan sobre gel de agarosa, se transfieren y se unen químicamente a un filtro de nylon. El filtro se hibrida a continuación con una sonda bicatenaria marcada radioactivamente (^{33}P-dCTP), generada a partir de SEQ ID NO:1-22, 24, 26-27, 29 o 33, usando un método de cebado aleatorio con polimerasa de Klenow. Los filtros se lavan (elevada austeridad) y se usan para exponer una pantalla de formación de imágenes con fósforo durante varias horas. Las bandas indican la presencia de ADNc que incluye las secuencias SEQ ID NO: 1-22, 24, 26-27, 29 o 33 en una biblioteca específica y, por tanto, la expresión de ARNm en el tipo celular o tejido correspondiente.

<110> Labat, Ivan

\hskip1cm Tang, Y. Tom

\hskip1cm Liu, Chenghua

\hskip1cm Childs, John

\hskip1cm Chao, Cheng-Chi

\hskip1cm Drmanac, Radoje T

\hskip1cm Mize, Nancy

\hskip1cm Lee, Juhi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> MÉTODOS Y MATERIALES QUE SE REFIEREN A POLIPÉPTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS ANÁLOGOS AL FACTOR DE CRECIMIENTO DE CÉLULAS MADRE

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<130> HYS-6CIP2

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\vskip0.400000\baselineskip

<140> SIN ASIGNAR TODAVÍA

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<141> 2000-11-12

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 36

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.0

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<210> 1

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<211> 366

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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300

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 114

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 422

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 460

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características misceláneas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(460)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, G o C

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 447

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 484

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características misceláneas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(484)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, G o C

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 498

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características misceláneas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(498)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, G o C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 405

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 407

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

11

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 392

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

13

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 417

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 415

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 494

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 430

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características misceláneas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(430)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, G o C

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 405

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características misceláneas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(405)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, G o C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 412

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características misceláneas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(412)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, G o C

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 440

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características misceláneas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(440)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, G o C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 416

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 382

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 406

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2668

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 392

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

29

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2668

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (107)...(1282)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

31

32

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 392

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

34

35

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1179

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3095

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (123)...(1712)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

39

40

41

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 529

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

43

44

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1590

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 499

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

49

50

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1351

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)...(1351)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

53

54

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

56

57

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 425

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

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<211> 431

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 36

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61

62

Claims

1. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, consistiendo dicho polipéptido en la secuencia aminoácida de SEQ ID NO: 25, o en un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 25, que tiene actividad de factor de crecimiento de células madre.

2. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 1, que codifica un polipéptido que tiene actividad de factor de crecimiento de células madre, consistiendo dicho polipéptido en la secuencia aminoácida SEQ ID NO: 25.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, que es una secuencia de ADN.

4. Un polinucleótido aislado, que comprende el complemento del polinucleótido de la reivindicación 1 o 2.

5. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4.

6. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2.

7. Una célula hospedadora obtenida mediante ingeniería genética para expresar el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2.

8. La célula hospedadora de la reivindicación 7, en la que el polinucleótido está en asociación operativa con una secuencia reguladora que controla la expresión del polinucleótido en la célula hospedadora.

9. Un polipéptido aislado que tiene actividad de factor de crecimiento de células madre, consistiendo dicho polipéptido en la secuencia aminoácida de SEQ ID NO: 25, o un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el mismo.

10. Un polipéptido aislado según la reivindicación 9, que tiene actividad de factor de crecimiento de células madre, consistiendo dicho polipéptido en la secuencia aminoácida de SEQ ID NO: 25.

11. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 9 o 10 y un vehículo.

12. Un método in vitro para detectar el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2 en una muestra, que comprende:

a): poner en contacto la muestra bajo condiciones estrictas de hibridación, con cebadores de ácidos nucleicos que hibridan con el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2 bajo tales condiciones;

b): amplificar un producto formado por el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2; y

c): detectar dicho producto y, por tanto, el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, en la muestra.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el polinucleótido comprende una molécula de ARN y el método comprende además la transcripción inversa de la molécula de ARN hibridada en un polinucleótido de ADNc.

14. Un método in vitro para detectar el polipéptido de la reivindicación 9 o 10 en una muestra, que comprende:

a): poner en contacto la muestra con un compuesto que se une con el polipéptido y forma un complejo con el mismo, bajo condiciones y durante un período de tiempo suficiente para formar el complejo, en el que el compuesto es un anticuerpo específico para el polipéptido de la reivindicación 9 o 10, y

b): detectar la formación del complejo, de forma que, si se detecta la formación de un complejo, se detecta el polipéptido de la reivindicación 9 o 10.

15. Un método in vitro para identificar un compuesto que se une al polipéptido de la reivindicación 9 o 10, que comprende:

a): poner en contacto el compuesto con el polipéptido de la reivindicación 9 o 10, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para formar un complejo polipéptido/compuesto; y

b): detectar el complejo, de forma que, si se detecta el complejo polipéptido/compuesto, se identifica un compuesto que se une al polipéptido de la reivindicación 9 o 10.

16. Un método in vitro para producir un polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre, que comprende:

a): cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 7, bajo condiciones suficientes para expresar el polipéptido en dicha célula; y

b): aislar el polipéptido del cultivo celular o las células de la etapa (a).

17. Un kit que comprende el polipéptido de la reivindicación 9 o 10.

18. Una matriz de ácidos nucleicos, en la que el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2 está unido a una superficie.

19. La matriz de la reivindicación 18, en la que la matriz detecta apareamientos completos con el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2.

20. La matriz de la reivindicación 18, en la que la matriz detecta desapareamientos con el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2.

21. Una composición que comprende:

a): una cantidad terapéutica de un polipéptido según la reivindicación 9 o 10; o

b): una cantidad terapéutica de un polinucleótido que codifica un polipéptido según la reivindicación 9 o 10, en una forma y bajo condiciones tales que se produce el polipéptido, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para uso como medicamento.

22. Una composición según la reivindicación 21, en la que el medicamento es para incrementar la actividad o expresión del polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre de la reivindicación 9 o 10.

23. Una composición que comprende una cantidad terapéutica de polinucleótido que inhibe la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido según la reivindicación 9 o 10, para uso como medicamento.

24. Una composición según la reivindicación 23, en la que el medicamento es para inhibir la actividad o expresión del polipéptido análogo al factor de crecimiento de células madre de la reivindicación 9 o 10.

25. Uso de una composición seleccionada del grupo formado por:

b): una composición que comprende una cantidad terapéutica de un polinucleótido que codifica dicho polipéptido, en una forma y bajo condiciones tales que se produzca el polipéptido,

26. Uso de una composición que comprende una cantidad terapéutica de un polinucleótido que inhibe la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene actividad de factor de crecimiento de células madre, y que comprende la secuencia aminoácida de SEQ ID NO: 25, 28, 31, 34 o 35, en la fabricación de un medicamento para inhibir la actividad del factor de crecimiento de células madre, en un sujeto que lo precise.