DE60033695T2

DE60033695T2 - Verfahren und materialien bezüglich stammzell wachstumsfaktor ähnlichen polypeptiden und polynukleotiden

Info

Publication number: DE60033695T2
Application number: DE60033695T
Authority: DE
Inventors: Ivan San Francisco LABAT; Y. Tom San Jose TANG; Radoje T. Palo Alto DRMANAC; Chenghua San Jose LIU; Juhi Fremont LEE; Nancy K. Mountain View MIZE; John Sunnyvale CHILDS; Cheng-Chi Cupertino CHAO
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Holdings Co Ltd
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-23
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2020-12-24
Also published as: EP1248848B1; CA2395443A1; US7317099B2; EP1248848A1; US20030211987A1; WO2001053500A8; MX245947B; DE60033695D1; EP1248848A4; WO2001053500A1; EP1683809A1; ATE355305T1; MXPA02006193A; ES2283343T3

Description

1. HINTERGRUND
1.1 TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Polynukleotide und Proteine, die von solchen Polynukleotiden kodiert werden, zusammen mit Verwendungszwecken für diese Polynukleotide und Proteine, beispielsweise in therapeutischen, diagnostischen und Forschungsverfahren. Insbesondere betrifft die Erfindung ein neuartiges Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Polypeptid.
1.2 ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Identifizierte Polynukleotid- und Polypeptidsequenzen verfügen über zahlreiche Anwendungen in beispielsweise der Diagnostik, der forensischen Medizin, der Genkartierung, der Identifizierung von Mutationen, die für Genschäden oder andere Merkmale verantwortlich zeichnen, zur Beurteilung der Biodiversität und zur Herstellung vieler anderer Arten von Daten und Produkten, die von DNA und Aminosäuresequenzen abhängen. Von Proteinen ist bekannt, dass sie über eine biologische Aktivität verfügen, beispielsweise aufgrund ihrer sezernierten Beschaffenheit im Fall von Leader-Sequenz-Klonierung, aufgrund ihrer Zell- oder Gewebequelle im Fall von auf PCR basierten Techniken oder aufgrund einer strukturellen Ähnlichkeit zu anderen Genen mit bekannter biologischer Aktivität. Auf diese Polypeptide und die Polynukleotide, die sie kodieren, ist die vorliegende Erfindung gerichtet. Insbesondere ist diese Erfindung auf neuartige Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptide und Polynukleotide gerichtet.
Stammzellen sind als Zellen mit der Fähigkeit zur unbegrenzten oder anhaltenden Selbsterneuerung definiert, die mindestens einen Typ hoch differenzierter Nachkommen produzieren können. Man glaubt, dass zwischen Stammzellen und deren terminal differenzierten Nachkommen eine Zwischenpopulation von festgelegten Vorläuferzellen mit begrenzter Fähigkeit und beschränktem Differenzierungspotential vorliegt (Watt und Hogan, (2000) Science 287, 1427-1430). Die Teilung und Differenzierung von embryonalen Stammzellen hat alle differenzierten Zellen und Organe eines mehrzelligen Organismus zur Folge. Eine Reserve von Stammzellen wird während des adulten Lebens eines Organismus aufrechterhalten, um die terminal differenzierten Zellpopulationen ähnlich wie hämopoetische Zellen wiederaufzufüllen. Es wird allgemein angenommen, dass die adulten Stammzellen von den embryonalen Stammzellen abstammen und nur ein begrenztes Potential zur Differenzierung aufweisen. Stammzellen sind im Allgemeinen äußerst schwierig zu kultivieren und in vitro aufrechtzuerhalten, geschweige denn sie auf einen vorbestimmten Differenzierungsweg zu lenken.
Neuere Forschungen haben jedoch gezeigt, dass die adulten Stammzellen über ein viel breiteres Potential zur Differenzierung verfügen, als bisher geglaubt wurde. Es wurde gezeigt, dass adulte Nervenstammzellen, wenn sie in einen bestrahlten Wirt verpflanzt wurden, das Knochenmark populieren und zu Knochenmark-, Lymphoid- und frühen hämopoetischen Zellen führen können (Bjornson et al., (1999) Science, 283, 534-537). Zudem waren Forscher erstmals in der Lage, menschliche embryonale Stammzellen in vitro zu kultivieren. Die Verfasser zeigten, das menschliche Blastozystenzellen für eine längere Zeit kultiviert werden können und zu einer Vielfalt an unterschiedlichen Zelltypen differenzieren könnten (Thomson et al., (1998) Science, 282, 1145-1147). Dies hat den Weg für die Anwendung autologer Transplantation und Organregeneration zur Behandlung von Organversagen und degenerativen Erkrankungen geebnet. Präzise Interaktionen von zahlreichen Rezeptoren auf den Stammzellen mit löslichen und von Stromazellen exprimierten Faktoren sind erforderlich, damit eine Stammzelle sich teilt und sich auf Differenzierung festlegt. Es ist offensichtlich geworden, dass die Gewebenischen und die Mikroumgebung, die die Faktoren bereitstellt, von äußerster Bedeutung sind. Von allen Zytokinen wie IL-3, IL-6, IL-7 und löslichen Proteinen wie und flt-3, Erythropoetin und Stammzellfaktor ist gezeigt worden, dass sie zusammenarbeiten, um eine Differenzierung entlang eines spezifischen Wegs zu erzielen. Es wird geglaubt, dass präzise Kombinationen von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Gewebelokalisation zu unterschiedlichen differenzierten Populationen von Stammzellen führen könnten.
Somit können die Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung dazu verwendet werden, die Differenzierung von embryonalen und adulten Stammzellen zu induzieren, um zu unterschiedlichen Zelltypen zu führen. Sie können auch bei der Behandlung von Leukämie, Hämophilie und degenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit verwendet werden. Die Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung können weiterhin zum Entwickeln von neuen Geweben und Organen genutzt werden, die Patienten helfen können, die transplantierter Gewebe bedürfen.
2. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung basiert auf der Entdeckung neuartiger Stammzellwachstumsfaktor-ähnlicher Polypeptide, neuartiger isolierter Polynukleotide, die solche Polypeptide kodieren, einschließlich rekombinanter DNA-Molekülen, klonierter Gene oder degenerierter Varianten davon, insbesondere natürlich vorkommende Varianten, wie Allelvarianten, Antisense-Polynukleotidmoleküle und Antikörper, die spezifisch eines oder mehrere Epitope erkennen, die auf solchen Polypeptiden vorliegen, als auch Hybridome, die solche Antikörper produzieren. Spezifisch basieren die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung auf Polynukleotiden, die aus cDNA-Bibliotheken isoliert wurden, die aus menschlicher fötaler Leber/Milz, Ovarium, adultem Gehirn, Lungentumor, Rückenmark, Zervix, Endothelzellen, Nabelschnur, Lymphozyt, Lungenfibroblast, fötalem Gehirn und Testis hergestellt wurden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das für ein Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 25 besteht, oder für ein Polypeptid mit mindestens 90 % Sequenzidentität zu SEQ ID Nr. 25 mit Stammzellwachstumsfaktoraktivität kodiert.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Polynukleotid um eine DNA-Sequenz.
Außerdem wird von diesem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ein isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das das Komplement eines Polynukleotids der Erfindung umfasst.
Außerdem werden von der vorliegenden Erfindung ein Vektor bereitgestellt, der das Komplement eines Polynukleotids der Erfindung umfasst, ein Expressionsvektor, der ein Polynukleotid der Erfindung umfasst, sowie eine Wirtszelle, die gentechnisch verändert wurde, um ein Polynukleotid der Erfindung zu exprimieren. In Bezug auf Wirtszellen steht das Polynukleotid vorzugsweise in operativer Verbindung mit einer regulatorischen Sequenz, die die Expression des Polynukleotids in der Wirtszelle steuert.
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polypeptid mit Stammzellwachstumsfaktoraktivität bereitgestellt, wobei das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 25 besteht, oder ein Polypeptid mit mindestens 90 % Sequenzidentität dazu.
Außerdem wird von diesem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Polypeptid der Erfindung und eine Trägersubstanz umfasst.
Weiterhin wird von der vorliegenden Erfindung ein In-vitro-Verfahren zum Nachweisen eines Polynukleotids der Erfindung in einer Probe bereitgestellt, das Folgendes umfasst:

a) Kontaktieren der Probe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit Nukleinsäure-Primern, die sich unter solchen Bedingungen an das Polynukleotid der Erfindung anlagern;
b) Amplifizieren eines Produkts, das aus dem Polynukleotid der Erfindung besteht; und
c) Nachweisen des Produkts und dadurch des Polynukleotids der Erfindung in der Probe.

Vorzugsweise umfasst das Polynukleotid ein RNA-Molekül und das Verfahren umfasst weiterhin das reverse Transkribieren eines angelagerten RNA-Moleküls in ein cDNA-Polynukleotid.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein In-vitro-Verfahren zum Nachweisen eines Polypeptids der Erfindung in einer Probe bereitgestellt, das Folgendes umfasst:

a) Kontaktieren der Probe mit einer Verbindung, die an das Polypeptid bindet und mit diesem einen Komplex bildet, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die dazu ausreichen, um den Komplex zu bilden, wobei die Verbindung ein Antikörper ist, der für ein Polypeptid der Erfindung spezifisch ist; und
b) Nachweisen der Bildung des Komplex, so dass, wenn eine Komplexbildung nachgewiesen wird, ein Polypeptid der Erfindung nachgewiesen wird.

Weiterhin wird von der vorliegenden Erfindung ein In-vitro-Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die an ein Polypeptid der Erfindung bindet, bereitgestellt, das Folgendes umfasst:

a) Kontaktieren der Verbindung mit dem Polypeptid der Erfindung unter Bedingungen und für eine Zeitspanne, die dazu ausreichen, um einen Komplex aus Polypeptid und Verbindung zu bilden; und
b) Nachweisen des Komplex, so dass, wenn der Komplex aus Polypeptid und Verbindung nachgewiesen wird, eine Verbindung, die an das Polypeptid der Erfindung bindet, identifiziert wird.

Gemäß diesem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird weiterhin ein In-vitro-Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die an ein Polypeptid der Erfindung bindet, bereitgestellt, das Folgendes umfasst:

a) Kontaktieren der Verbindung mit dem Polypeptid der Erfindung in einer Zelle für eine Zeitspanne, die dazu ausreicht, um einen Komplex aus Polypeptid und Verbindung zu bilden, wobei der Komplex die Expression einer Reportergensequenz in der Zelle antreibt; und
b) Nachweisen des Komplex durch Nachweisen der Expression der Reportergensequenz, so dass, wenn der Komplex aus Polypeptid und Verbindung nachgewiesen wird, eine Verbindung, die an das Polypeptid der Erfindung bindet, identifiziert wird.

Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein In-vitro-Verfahren zur Herstellung eines Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptids bereitgestellt, das Folgendes umfasst:

a) Kultivieren einer Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen, die dazu ausreichen, um das Polypeptid in der Zelle zu exprimieren; und
b) Isolieren des Polypeptids aus der Zellkultur oder den Zellen von Schritt (a).

Gemäß weiteren Gesichtspunkten der Erfindung werden ein Kit, das ein Polypeptid der Erfindung umfasst, und ein Nukleinsäure-Array, das ein Polynukleotid der Erfindung an eine Oberfläche angeheftet umfasst, bereitgestellt. Vorzugsweise erkennt das Array vollständige Übereinstimmungen mit dem Polynukleotid der Erfindung oder das Array erkennt Fehlpaarungen mit dem Polynukleotid der Erfindung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird weiterhin eine Zusammensetzung bereitgestellt, die Folgendes umfasst:

a) eine therapeutische Menge eines Polypeptids der Erfindung; oder
b) eine therapeutische Menge eines Polynukleotids, das für ein Polypeptid der Erfindung kodiert, in einer Form und unter Bedingungen, so dass das Polypeptid hergestellt wird, und eine pharmazeutisch unbedenkliche Trägersubstanz, zur Verwendung als ein Arzneimittel. Vorzugsweise wird das Arzneimittel zum Verstärken der Aktivität oder Expression des Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptids der Erfindung verwendet.

Gemäß diesem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird außerdem eine Zusammensetzung bereitgestellt, die Folgendes umfasst:
eine therapeutische Menge eines Polynukleotids, das die Expression einer Nukleotidsequenz inhibiert, die für ein Polypeptid der Erfindung kodiert, zur Verwendung als ein Arzneimittel. Vorzugsweise wird das Arzneimittel zum Inhibieren der Aktivität oder Expression von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichem Polypeptid der Erfindung verwendet.
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung, die aus der Gruppe bestehend aus:

a) einer Zusammensetzung, die eine therapeutische Menge eines Polypeptids mit Stammzellwachstumsfaktoraktivität umfasst, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 25, 28, 31, 34 oder 35 umfasst; und
b) eine Zusammensetzung, die eine therapeutische Menge eines Polynukleotids umfasst, das für das Polypeptid kodiert, in einer Form und unter Bedingungen, so dass das Polypeptid produziert wird,

Gemäß diesem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung bereitgestellt, die eine therapeutische Menge eines Polynukleotids umfasst, das die Expression einer Nukleotidsequenz inhibiert, die für ein Polypeptid mit Stammzellwachstumsfaktoraktivität, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 25, 28, 31, 34 oder 35 umfasst, kodiert, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibition der Aktivität des Stammzellwachstumsfaktors in einem Patienten, der dieser bedarf,.
Die hierin offenbarten Zusammensetzungen beinhalten zusätzlich Vektoren wie Expressionsvektoren, die die offenbarten Polynukleotide enthalten, Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um solche Polynukleotide zu enthalten, und Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um solche Polynukleotide zu exprimieren.
Hierin werden isolierte Polynukleotide offenbart, die ein Polynukleotid beinhalten, aber nicht darauf beschränkt sind, das die in SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 dargelegte Nukleotidsequenz umfasst; oder ein Fragment der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33; ein Polynukleotid, das die vollständige proteinkodierende Sequenz der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 (beispielsweise SEQ ID Nr. 23, 25 oder 28) umfasst; und ein Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz der reifen proteinkodierenden Sequenz einer beliebigen Sequenz der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 umfasst. Die hierin offenbarten Polynukleotide beinhalten außerdem, sind aber nicht darauf beschränkt, ein Polynukleotid, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an (a) das Komplement einer beliebigen der in SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 dargelegten Nukleotidsequenzen; (b) eine Nukleotidsequenz, die eine beliebige Sequenz von SEQ ID Nr. 23, 25, 28, 30-32, 34 oder 35 kodiert, hybridisiert; ein Polynukleotid, das eine Allelvariante eines beliebigen der oben vorgetragenen Polynukleotide mit mindestens 70 % Polynukleotidsequenzidentität zu den Polynukleotiden ist; ein Polynukleotid, das für ein Spezieshomolog (z. B. Orthologa) eines beliebigen der oben vorgetragenen Peptide kodiert; oder ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine spezifische Domäne oder Verkürzung des Polypeptids, umfassend SEQ ID Nr. 23, 25, 28 oder 31, umfasst.
Eine wie in dieser Anmeldung verwendete Sammlung kann eine Sammlung von nur einem Polynukleotid sein. Die Sammlung von Sequenzinformationen oder eindeutig identifizierender Information jeder Sequenz kann auf einem Nukleinsäure-Array bereitgestellt werden. In einer Ausführungsform werden Segmente der Sequenzinformation auf einem Nukleinsäure-Array bereitgestellt, um das Polynukleotid zu erkennen, dass das Segment enthält. Das Array kann dafür entworfen sein, vollständige Übereinstimmungen oder Fehlpaarungen mit dem Polynukleotid, das das Segment enthält, zu erkennen. Die Sammlung kann auch in einem computerlesbaren Format bereitgestellt werden.
Weiterhin werden Klonierungs- oder Expressionsvektoren, die mindestens ein Fragment der oben dargelegten Polynukleotide umfassen, und Wirtszellen oder -organismen, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert wurden, offenbart. Zu geeigneten Vektoren zählen Plasmide, Cosmide, Lambda-Phagen-Derivate, Phagemide und dergleichen, die im Stand der Technik wohl bekannt sind. Demgemäß werden außerdem ein Vektor, der ein offenbartes Polynukleotid enthält, und eine Wirtszelle, die das Polynukleotid enthält, offenbart. Im Allgemeinen enthält der Vektor einen Replikationsursprung, der in mindestens einem Organismus funktionell ist, geeignete Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen und einen selektierbaren Marker für die Wirtszelle. Hierin offenbarte Vektoren beinhalten Expressionsvektoren, Replikationsvektoren, die Probe generierende Vektoren und Sequenzierungsvektoren. Die Wirtszelle kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein und kann ein einzelliger Organismus oder Teil eines mehrzelligen Organismus sein.
Die hierin offenbarten Zusammensetzungen beinhalten Polypeptide, die ein isoliertes Peptid umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, das aus der Gruppe ausgewählt ist, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 23, 25, 28, 30-32, 34 oder 35 umfasst, oder das entsprechende vollständige oder reife Protein. Hierin offenbarte Polypeptide beinhalten außerdem Polypeptide mit biologischer Aktivität, die von (a) einem beliebigen der Polynukleotide mit einer in SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 dargelegten Nukleotidsequenz oder (b) Polynukleotiden, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an das Komplement der Polynukleotide von (a) hybridisieren, kodiert werden. Biologisch oder immunologisch aktive Varianten von beliebigen der als SEQ ID Nr. 23, 25, 28, 30-32, 34 oder 35 aufgeführten Proteinsequenzen und substantielle Äquivalente davon, die die biologische oder immunologische Aktivität bewahren, werden ebenfalls betrachtet. Die Polypeptide können vollständig oder zum Teil chemisch synthetisiert werden, werden aber vorzugsweise durch rekombinante Mittel unter Verwendung der hierin offenbarten gentechnisch veränderten Zellen (z. B. Wirtszellen) hergestellt.
Außerdem werden Zusammensetzungen offenbart, die ein offenbartes Polypeptid umfassen. Pharmazeutische Zusammensetzungen können das offenbarte Polypeptid und eine unbedenkliche Trägersubstanz, wie eine hydrophile, z. B. pharmazeutisch unbedenkliche Trägersubstanz, umfassen.
Außerdem werden Verfahren zur Herstellung des offenbarten Polypeptids offenbart, die das Kultivieren von Wirtszellen, die einen Expressionsvektor umfassen, der mindestens ein Fragment eines Polynukleotids enthält, das für das betroffene Polypeptid kodiert, in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression des gewünschten Polypeptids zulassen, und das Reinigen des Proteins oder Peptids aus der Kultur oder aus den Wirtszellen umfassen. Zu bevorzugten Ausführungsformen zählen jene, in denen das mittels eines solchen Vorgangs hergestellte Protein eine reife Form des Proteins ist.
Erfindungsgemäße Polynukleotide verfügen über zahlreiche Anwendungen in einer Vielfalt von Techniken, die dem Fachmann der Molekularbiologie bekannt sind. Zu diesen Techniken zählen die Verwendung als Hybridisierungssonden, die Verwendung als Oligomere oder Primer für die PCR, die Verwendung in einem Array, die Verwendung in computerlesbaren Datenträgern, die Verwendung zur Chromosomen- und Genkartierung, die Verwendung bei der rekombinanten Herstellung des Proteins und die Verwendung bei der Erzeugung von Antisense-DNA oder -RNA, deren chemischen Analoga und dergleichen. Wenn beispielsweise die Expression einer mRNA weitgehend auf einen bestimmten Zell- oder Gewebetyp beschränkt ist, können Polynukleotide der Erfindung als Hybridisierungssonden verwendet werden, um das Vorliegen der bestimmten Zell- oder Gewebe-mRNA in einer Probe unter Anwendung von z. B. In-situ-Hybridisierung nachzuweisen.
In anderen beispielhaften Ausführungsformen werden die Polynukleotide bei der Diagnostik als exprimierte Sequenzmarkierungen zum Identifizieren exprimierter Gene oder, wie in der Technik wohl bekannt ist und von Vollrath et al., Science 258:52-59 (1992) beispielhaft gezeigt wird, als exprimierte Sequenzmarkierungen zur physischen Kartierung des menschlichen Genoms verwendet.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in einer Vielfalt an herkömmlichen Vorgehensweisen und Verfahren verwendet werden, die derzeit auf andere Proteine angewendet werden. Zum Beispiel kann ein Polypeptid der Erfindung dazu verwendet werden, einen Antikörper zu erzeugen, der spezifisch das Polypeptid bindet. Solche Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, sind zum Nachweisen oder Quantifizieren des Polypeptids in Gewebe geeignet. Die Polypeptide der Erfindung können auch als Molekulargewichtsmarker und als ein Nahrungszusatz verwendet werden.
Es werden außerdem Verfahren zum Verhindern, Behandeln oder Verbessern eines medizinischen Zustandes offenbart, die den Schritt des Verabreichens einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein hierin offenbartes Peptid und eine pharmazeutisch unbedenkliche Trägersubstanz umfasst, an ein Subjekt der Säugerspezies umfassen.
Insbesondere können die Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung dazu verwendet werden, die Differenzierung von embryonalen und adulten Stammzellen zu induzieren, um zu unterschiedlichen Zelltypen zu führen. Sie können auch bei der Behandlung von Erkrankungen, beispielsweise Leukämie, Hämophilie und degenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit, verwendet werden. Die Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung können weiterhin zum Entwickeln von neuen Geweben und Organen genutzt werden, die Patienten helfen können, die transplantierter Gewebe bedürfen.
Außerdem werden Verfahren zur Behandlung von wie hierin vorgetragenen Störungen offenbart, die die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein Polynukleotid oder Polypeptid der Offenbarung und eine pharmazeutisch unbedenkliche Trägersubstanz umfasst, an ein Subjekt der Säugerspezies, zu den hierin vorgetragenen Störungen verwandte Symptome oder Anlagen aufweist, umfassen. Darüber hinaus werden Verfahren zum Behandeln von hierin vorgetragenen Erkrankungen oder Störungen betrachtet, die den Schritt des Verabreichens einer Zusammensetzung, die Verbindungen und andere Substanzen, die die Gesamtaktivität der Zielgenprodukte modulieren, und eine pharmazeutisch unbedenkliche Trägersubstanz umfasst. Verbindungen und andere Substanzen können eine solche Modulation entweder auf der Ebene der Zielgen-/-proteinexpression oder der Zielproteinaktivität bewirken. Insbesondere werden Verfahren zum Verhindern, Behandeln oder Verbessern eines medizinischen Zustandes, einschließlich Viruserkrankungen, offenbart, die das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein hierin offenbartes Polypeptid umfasst, oder einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die einen Bindungspartner (z. B. ein für die folgenden spezifischer Antikörper) von hierin offenbarten Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptiden umfasst, an ein Subjekt der Säugerspezies, einschließlich jedoch nicht beschränkt auf den Menschen, umfassen. Der Mechanismus des bestimmten Zustands oder der bestimmten Pathologie wird vorschreiben, ob die Polypeptide oder diese Bindungspartner (oder Inhibitoren) für die Einzelperson, die einer Behandlung bedarf, nutzbringend sein würden.
Gemäß diesem Verfahren können die Polypeptide verabreicht werden, um eine In-vitro- oder In-vivo-Inhibition der Zellfunktion hervorzurufen. Das Polypeptid kann in vivo für sich oder als ein Zusatz zu anderen Therapien verabreicht werden. Umgekehrt können Protein oder andere hierin offenbarte Wirkstoffe in Formulierungen eines bestimmten Mittels eingebunden werden, um Nebenwirkungen eines solchen Mittels zu minimieren.
Die Erfindung offenbart weiterhin Verfahren zum Herstellen von in den oben beschriebenen Verfahren nützlichen Arzneimitteln.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens der hierin offenbarten Polynukleotide oder Polypeptide in einer Probe (z. B. Gewebe oder Probe). Solche Verfahren können beispielsweise als Teil einer prognostischen oder diagnostischen Einschätzung von hierin vorgetragenen Störungen und zur Identifizierung von Patienten, die eine Veranlagung für solche Zustände aufweisen, genutzt werden.
Hierin wird ein Verfahren zum Nachweisen eines Polypeptids der Anmeldung in einer Probe offenbart, das das Kontaktieren der Probe mit einer Verbindung umfasst, die an das Polypeptid bindet und mit diesem einen Komplex bildet, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die dazu ausreichen, um den Komplex zu bilden, und das Nachweisen der Bildung des Komplex umfasst, so dass, wenn ein Komplex gebildet ist, das Polypeptid nachgewiesen wird.
Die Erfindung betrifft außerdem Kits, die Polynukleotidsonden und/oder monoklonale Antikörper und gegebenenfalls quantitative Standards umfassen, zum Durchführen der hierin offenbarten Verfahren. Des Weiteren werden Verfahren zum Beurteilen der Wirksamkeit von Medikamenten und Überwachen des Fortschritts von Patienten, die in klinische Studien zur Behandlung der oben vorgetragenen Störungen einbezogen sind, offenbart.
Außerdem werden Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Expression oder Aktivität der hierin offenbarten Polynukleotide und/oder Polypeptide modulieren (d. h, steigern oder mindern), offenbart. Solche Verfahren können beispielsweise zur Identifizierung von Verbindungen, die Symptome von wie hierin vorgetragenen Störungen verbessern, genutzt werden. Solche Verfahren können Assays zum Identifizieren von Verbindungen und anderen Substanzen, die mit Polypeptiden der Anmeldung interagieren (z. B. an diese binden), beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Es wird ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die an ein Polypeptid der Anmeldung bindet, offenbart, das das Kontaktieren der Verbindung mit dem Polypeptid unter Bedingungen und für eine Zeitspanne umfasst, die dazu ausreichen, um einen Komplex aus Polypeptid und Verbindung zu bilden, und das Nachweisen des Komplex umfasst, so dass, wenn der Komplex aus Polypeptid und Verbindung nachgewiesen wird, eine Verbindung, die an das Polypeptid bindet, identifiziert wird.
Außerdem wird ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die an das Polypeptid bindet, offenbart, das das Kontaktieren der Verbindung mit dem Polypeptid in einer Zelle für eine Zeitspanne umfasst, die dazu ausreicht, um einen Komplex aus Polypeptid und Verbindung zu bilden, wobei der Komplex die Expression einer Reportergensequenz in der Zelle antreibt, und das Nachweisen des Komplex durch Nachweisen der Expression der Reportergensequenz umfasst, so dass, wenn der Polypeptid/Verbindungskomplex nachgewiesen wird, eine Verbindung, die an das Polypeptid bindet, identifiziert wird.
3. KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die schematische Anordnung der SEQ ID Nr. 24 mit SEQ ID Nr. 1-21.
2 zeigt die BLASTX-Aminosäuresequenz-Anordnung zwischen dem Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichem Polypeptid der SEQ ID Nr. 28 und dem Tumorendothelmarker-7-Vorläuferprotein der SEQ ID Nr. 36 (St. Croix et al., Science, 289, 1197-1201), das zeigt, dass die zwei Sequenzen 72 % Ähnlichkeit gegenüber 441 Aminosäureresten und 57 % Identität gegenüber denselben 441 Aminosäureresten gemein haben, wobei A = Alanin, C = Cystein, D = Asparaginsäure, E = Glutaminsäure, F = Phenylalanin, G = Glycin, H = Histidin, I = Isoleucin, K = Lysin, L = Leucin, M = Methionin, N = Asparagin, P = Prolin, Q = Glutamin, R = Arginin, S = Serin, T = Threonin, V = Valin, W = Tryptophan, Y = Tyrosin. Gaps sind als Bindestriche dargestellt.
4. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptid der SEQ ID Nr. 28 ist ein Protein von ungefähr 529 Aminosäuren mit einer vorhergesagten unglykosylierten Molekularmasse von ungefähr 59,2 kDa. Proteindatenbankrecherchen mit dem BLASTP-Algorithmus (S.F. Altschul et al., J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993), und S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 21:403-410 (1990), hierin durch Bezugnahme aufgenommen) zeigen, dass SEQ ID Nr. 28 zum Tumorendothelmarker-7-Vorläuferprotein homolog ist.
2 zeigt ies BLASTX-Aminosäuresequenz-Anordnung zwischen dem vom Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptid der SEQ ID Nr. 28 kodierten Protein und dem Tumorendothelmarker-7-Vorläuferprotein der SEQ ID Nr. 36 (St. Croix et al., Science, 289, 1197-1201), das angibt, dass die zwei Sequenzen 72 % Ähnlichkeit gegenüber 441 Aminosäureresten und 57 % Identität gegenüber denselben 441 Aminosäureresten gemein haben.
Ein vorhergesagtes Signalpeptid von ungefähr dreißig Resten wird von ungefähr Rest 1 bis Rest 30 der SEQ ID Nr. 28 (SEQ ID Nr. 30) kodiert. Der extrazelluläre Teil ist für sich allein nützlich. Dies kann mittels Expression in Säugetierzellen und Sequenzieren des gespaltenen Produkts bestätigt werden. Die Signalpeptidregion wurde unter Anwendung des Programms Neural Network SignalP V1.1 (Nielsen et al., (1997) Int. J. Neur. Syst. 8, 581) (vom Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University of Denmark) und Hydrophobieanalyse unter Anwendung des Kyte/Doolittle-Algorithmus (Kyte und Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157, 105) vorhergesagt. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Spaltstelle sich von der vom Computerprogramm vorhergesagten unterscheiden kann. SEQ ID Nr. 31 ist das resultierende Peptid, wenn das Signalpeptid aus SEQ ID Nr. 28 entfernt wird.
Eine vorhergesagte Transmembranregion von ungefähr achtundzwanzig Resten wird von ungefähr Rest 452 bis Rest 479 der SEQ ID Nr. 28 (SEQ ID Nr. 32) kodiert. Dies kann mittels Expression in Säugetierzellen bestätigt werden. Die Transmembranregion wurde unter Anwendung des Programms Neural Network SignalP V1.1 (Nielsen et al., (1997) Int. J. Neur. Syst. 8, 581) (vom Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University of Denmark) und Hydrophobieanalyse unter Anwendung des Kyte/Doolittle-Algorithmus (Kyte und Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157, 105) vorhergesagt. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Transmembranregion sich von der vom Computerprogramm vorhergesagten unterscheiden kann.
Das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptid der SEQ ID Nr. 25 (mit SEQ ID Nr. 23 identisch) ist ein Protein von ungefähr 392 Aminosäuren mit einer vorhergesagten unglykosylierten Molekularmasse von ungefähr 50 kDa. Proteindatenbanksuchen mit dem BLASTP-Algorithmus (S.F. Altschul et al., J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993), und S.F.
Altschul et al., J. Mol. Biol. 21:403-410 (1990), hierin durch Bezugnahme aufgenommen) zeigen, dass SEQ ID Nr. 25 zum Tumorendothelmarker-7-Vorläuferprotein homolog ist.
Eine vorhergesagte Transmembranregion von ungefähr achtundzwanzig Resten wird von ungefähr Rest 315 bis Rest 342 der SEQ ID Nr. 25 (SEQ ID Nr. 32) kodiert. Dies kann mittels Expression in Säugetierzellen bestätigt werden. Die Transmembranregion wurde unter Anwendung des Programms Neural Network SignalP V1.1 (Nielsen et al., (1997) Int. J. Neur. Syst. 8, 581) (vom Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University of Denmark) und Hydrophobieanalyse unter Anwendung des Kyte/Doolittle-Algorithmus (Kyte und Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157, 105) vorhergesagt. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Transmembranregion sich von der vom Computerprogramm vorhergesagten unterscheiden kann.
Insbesondere können die Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung dazu verwendet werden, die Differenzierung von embryonalen und adulten Stammzellen zu induzieren, um unterschiedliche Zelltypen zu verursachen. Sie können auch bei der Behandlung von Leukämie, Hämophilie und degenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit verwendet werden. Die Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung können weiterhin zum Entwickeln von neuen Geweben und Organen genutzt werden, die Patienten helfen können, die transplantierter Gewebe bedürfen.
4.1 DEFINITIONEN
Es muss angemerkt werden, dass die Singularformen „ein", „eine", „die", „der" und „das", wie hierin und in den angefügten Ansprüchen verwendet, Pluralreferenzen einschließen, sofern der Zusammenhang nicht klar etwas anderes vorschreibt.
Der Ausdruck „aktiv" bezieht sich auf jene Formen des Polypeptids, die die biologischen und/oder immunologischen Aktivitäten eines beliebigen natürlich vorkommenden Polypeptids bewahren. Erfindungsgemäß beziehen sich die Ausdrücke „biologisch aktiv" oder „biologische Aktivität" auf ein Protein oder Peptid mit strukturellen, regulatorischen oder biochemischen Funktionen eines natürlich vorkommenden Moleküls. Desgleichen bezieht sich „biologisch aktiv" oder „biologische Aktivität" auf die Fähigkeit des natürlichen, rekombinanten oder synthetischen Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Peptids oder eines beliebigen Peptids davon, eine spezifische biologische Reaktion in geeigneten Tieren oder Zellen zu induzieren und an spezifische Antikörper zu binden. Der Ausdruck „Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche biologische Aktivität" bezieht sich auf biologische Aktivität, die der biologischen Aktivität einer Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Substanz ähnlich ist.
Beim Ausdruck „aktivierte Zellen", wie in dieser Anmeldung verwendet, handelt es sich um jene Zellen, die an extrazellulärem oder intrazellulärem Membrantransport beteiligt sind, einschließlich des Exports von sekretorischen oder Enzymmolekülen als Teil eines normalen oder Erkrankungsprozesses.
Die Ausdrücke „komplementär" oder „Komplementarität" beziehen sich auf die natürliche Bindung von Polynukleotiden mittels Basenpaarung. Zum Beispiel bindet die Sequenz 5'-AGT-3' an die komplementäre Sequenz 3'-TCA-5'. Komplementarität zwischen zwei einzelsträngigen Molekülen kann „partiell" sein, so dass nur einige der Nukleinsäuren binden, oder sie kann „komplett" sein, so dass zwischen den einzelsträngigen Molekülen vollkommene Komplementarität besteht. Der Komplementaritätsgrad zwischen den Nukleinsäuresträngen hat beträchtliche Auswirkungen auf die Effizienz und Stärke der Hybridisierung zwischen den Nukleinsäuresträngen.
Der Ausdruck „embryonale Stammzellen (ES)" bezieht sich auf eine Zelle, die viele differenzierte Zelltypen in einem Embryo oder einem Erwachsenen zur Folge haben kann, einschließlich der Keimzellen. Der Ausdruck „Keimbahnstammzellen (GSCs)" bezieht sich auf Stammzellen, die von primordialen Stammzellen abgeleitet sind, die eine beständige und kontinuierliche Quelle von Keimzellen für die Produktion von Gameten bereitstellen. Der Ausdruck „primordiale Keimzellen (PGCs)" bezieht sich auf eine kleine Population von Zellen, die während der Embryogenese aus anderen Zellstammbäumen, insbesondere aus dem Dottersack, den Mesenterien oder den Genitalleisten ausgesondert wurden und das Potential aufweisen, zu Keimzellen und anderen Zellen zu differenzieren. PGCs sind die Quelle, aus der GSCs und ES-Zellen abgeleitet werden. Die PGCs, die GSCs und die ES-Zellen sind zur Selbsterneuerung fähig. Somit populieren diese Zellen nicht nur die Keimbahn und haben mehrere terminal differenzierte Zellen zur Folge, die die adulten spezialisierten Organe umfassen können, sondern können sich selbst regenerieren. Der Ausdruck „totipotent" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Zelle, zu allen Zelltypen eines adulten Organismus zu differenzieren. Der Ausdruck „pluripotent" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Zelle, zu einer Reihe differenzierter Zelltypen zu differenzieren, die in einem adulten Organismus vorliegen. Eine pluripotente Zelle ist im Vergleich zu einer totipotenten Zelle in ihrer Differenzierungsfähigkeit beschränkt.
Der Ausdruck „Expression modulierendes Fragment", EMF, steht für eine Reihe von Nukleotiden, die die Expression eines operativ gekoppelten ORF oder eines anderen EMF modulieren.
Wie hierin verwendet, wird von einer Sequenz gesagt, dass sie „die Expression einer operativ gekoppelten Sequenz moduliert", wenn die Expression der Sequenz durch das Vorliegen des EMF abgeändert wird. EMFs beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Promotoren und Promotoren modulierende Sequenzen (induzierbare Elemente). Eine Klasse von EMFs sind Nukleinsäurefragmente, die die Expression eines operativ gekoppelten ORF als Antwort auf einen spezifischen regulatorischen Faktor oder ein spezifisches physiologisches Ereignis induzieren.
Die Ausdrücke „Nukleotidsequenz" oder „Nukleinsäure" oder „Polynukleotid" oder „Oligonukleotid" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Heteropolymer von Nukleotiden oder die Sequenz dieser Nukleotide. Diese Begriffe beziehen sich auch auf DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die einzelsträngig oder doppelsträngig sein können und den Sense- oder den Antisense-Strang zu Peptidnukleinsäure (PNA) oder zu einem beliebigen DNA-artigen oder RNA-artigen Material darstellen können. In den Sequenzen ist A Adenin, C Cytosin, G Guanin und T Thymin, während N A, T, G oder C ist. Es ist vorgesehen, dass, wenn das Polynukleotid RNA ist, das T (Thymin) in der Sequenz hierin durch U (Uracil) ersetzt werden kann. Im Allgemeinen können hierin offenbarte Nukleinsäuresegmente aus Fragmenten des Genoms und kurzen Oligonukleotid-Linkern oder aus einer Reihe von Oligonukleotiden oder aus einzelnen Nukleotiden zusammengebaut werden, um eine synthetische Nukleinsäure bereitzustellen, die in einer rekombinanten Transkriptionseinheit, die regulatorische Elemente umfasst, die von einem Mikroben-Operon oder einem Virus-Operon oder einem eukaryontischen Gen abgeleitet wurden, exprimiert werden kann.
Die Ausdrücke „Oligonukleotidfragment" oder ein „Polynukleotidfragment", „-teil" oder „-segment" oder „-sonde" oder „-primer" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine Sequenz von Nukleotidresten, bei denen es sich um mindestens etwa 5 Nukleotide, mehr bevorzugt mindestens etwa 7 Nukleotide, mehr bevorzugt mindestens etwa 9 Nukleotide, mehr bevorzugt mindestens etwa 11 Nukleotide und am meisten bevorzugt mindestens etwa 17 Nukleotide handelt. Das Fragment ist vorzugsweise weniger als etwa 500 Nukleotide, vorzugsweise weniger als etwa 200 Nukleotide, mehr bevorzugt weniger als etwa 100 Nukleotide, mehr bevorzugt weniger als etwa 50 Nukleotide und am meisten bevorzugt weniger als 30 Nukleotide. Vorzugsweise ist die Sonde von etwa 6 Nukleotide bis etwa 200 Nukleotide, vorzugsweise von etwa 15 bis etwa 50 Nukleotide, mehr bevorzugt von etwa 17 bis 30 Nukleotide und am meisten bevorzugt von etwa 20 bis 25 Nukleotide. Vorzugsweise können die Fragmente in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), verschiedenen Hybridisierungsvorgängen oder Mikroarrayvorgängen verwendet werden, um identische oder ähnliche Teile von mRNA- oder DNA-Molekülen zu identifizieren oder zu amplifizieren. Ein Fragment oder Segment kann jede Polynukleotidsequenz der vorliegenden Anmeldung eindeutig identifizieren. Vorzugsweise umfasst das Fragment eine Sequenz, die einem Teil der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 im Wesentlichen ähnlich ist.
Sonden können beispielsweise verwendet werden, um zu bestimmen, ob spezifische mRNA-Moleküle in einer Zelle oder einem Gewebe vorliegen, oder um ähnliche Nukleinsäuresequenzen aus chromosomaler DNA zu isolieren, wie von Walsh et al. beschrieben (P.S. Walsh et al., 1992, PCR Methods Appl. 1:241-250). Sie können mittels Nick-Translation, Klenow-Auffüllreaktion, PCR oder andere in der Technik wohl bekannte Verfahren markiert werden. Sonden, deren Herstellung und/oder Markierung sind in J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; oder F.M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, sorgfältig ausgeführt.
Die hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen beinhalten auch die Sequenzinformation von einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33. Die Sequenzinformation kann ein Segment der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 sein, das die Sequenzinformation der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 eindeutig identifiziert oder darstellt. Ein solches Segment kann eine Zwanzig-Mer-Nukleinsäuresequenz sein, da die Wahrscheinlichkeit, dass bei einer Zwanzig-Mer-Sequenz im menschlichen Genom vollständige Übereinstimmung vorliegt, 1 zu 300 ist. Im menschlichen Genom gibt es 300 Milliarden Basenpaare in einem Satz Chromosomen. Da 4²⁰ mögliche Zwanzig-Mer-Sequenzen existieren, gibt es 300 Mal mehr Zwanzig-Mer- Sequenzen als Basenpaare in einem Satz menschlicher Chromosomen vorliegen. Unter Anwendung derselben Analyse ist die Wahrscheinlichkeit, dass bei einer Siebzehn-Mer-Sequenz im menschlichen Genom eine vollständige Übereinstimmung vorliegt, ungefähr 1 zu 5. Wenn diese Segmente in Arrays für Expressionsstudien eingesetzt werden, können Fünfzehn-Mer-Sequenzen verwendet werden. Die Wahrscheinlichkeit, dass bei der Fünfzehn-Mer-Sequenz in den exprimierten Sequenzen eine vollständige Übereinstimmung vorliegt, ist ebenfalls ungefähr eins zu fünf, da exprimierte Sequenzen weniger als ungefähr 5 % der gesamten Genomsequenz umfassen.
In ähnlicher Weise kann ein Segment eine Fünfundzwanzig-Mer-Sequenz sein, wenn die Sequenzinformation zum Nachweisen einer einzigen Fehlpaarung verwendet wird. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Fünfundzwanzig-Mer-Sequenz in einem menschlichen Genom mit einer einzigen Fehlpaarung erscheinen würde, wird durch Multiplizieren der Wahrscheinlichkeit einer vollständigen Übereinstimmung (1 : 4²⁵) mal der erhöhten Wahrscheinlichkeit einer Fehlpaarung an jeder Nukleotidposition (3 × 25) berechnet. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Achtzehn-Mer-Sequenz mit einer einzigen Fehlpaarung in einem Array für Expressionsstudien nachgewiesen werden kann, ist ungefähr eins zu fünf. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Zwanzig-Mer-Sequenz mit einer einzigen Fehlpaarung in einem menschlichen Genom nachgewiesen werden kann, ist ungefähr eins zu fünf.
Der Ausdruck „offenes Leseraster", ORF, steht für eine Reihe von Nukleotidtripletts, die für Aminosäuren ohne etwaige Terminationskodons kodieren, und ist eine Sequenz, die in Protein translatiert werden kann.
Die Ausdrücke „operativ gekoppelt" oder „operativ verbunden" beziehen sich auf funktionell ähnliche Nukleinsäuresequenzen. Zum Beispiel ist ein Promotor mit einer kodierenden Sequenz operativ verbunden oder operativ gekoppelt, wenn der Promotor die Transkription der kodierenden Sequenz steuert. Obgleich operativ gekoppelte Nukleinsäuresequenzen zusammenhängend sein und sich im selben Leseraster befinden können, sind bestimmte genetische Elemente, z. B. Repressorgene, nicht auf zusammenhängende Weise mit der kodierenden Sequenz gekoppelt, aber steuern dennoch die Transkription/Translation der kodierenden Sequenz.
Der Ausdruck „pluripotent" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Zelle, zu einer Reihe differenzierter Zelltypen zu differenzieren, die in einem adulten Organismus vorliegen.
Eine pluripotente Zelle ist im Vergleich zu einer totipotenten Zelle in ihrer Differenzierungsfähigkeit beschränkt.
Die Ausdrücke „Polypeptid" oder „Peptid" oder „Aminosäuresequenz" beziehen sich auf eine Oligopeptid-, Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsequenz oder ein Fragment davon und auf natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle. Ein Polypeptid-„Fragment", -„Teil" oder -„Segment" ist eine Spanne von Aminosäureresten von mindestens etwa 5 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens etwa 7 Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens etwa 9 Aminosäuren und am meisten bevorzugt mindestens etwa 17 oder mehr Aminosäuren. Das Peptid ist vorzugsweise nicht größer als etwa 200 Aminosäuren, mehr bevorzugt weniger als 150 Aminosäuren und am meisten bevorzugt weniger als 100 Aminosäuren. Vorzugsweise umfasst das Peptid etwa 5 bis etwa 200 Aminosäuren. Um aktiv zu sein, muss jedes Polypeptid eine ausreichende Länge haben, um biologische und/oder immunologische Aktivität aufzuweisen.
Der Ausdruck „natürlich vorkommendes Polypeptid" bezieht sich auf Polypeptide, die von Zellen hergestellt werden, die nicht gentechnisch verändert wurden, und sieht insbesondere verschiedene Polypeptide vor, die aus posttranslationalen Modifikationen des Polypeptids hervorgehen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Acetylierung, Carboxylierung, Glykosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung.
Der Ausdruck „translatierter proteinkodierender Teil" steht für eine Sequenz, die für das vollständige Protein kodiert, das eine beliebige Leader-Sequenz oder eine Processing-Sequenz enthalten kann.
Der Ausdruck „reife proteinkodierende Sequenz" bezieht sich auf eine Sequenz, die für ein Peptid oder Protein ohne jegliche etwaige Leader-/Signalsequenz kodiert. Der „reife Proteinteil" bezieht sich auf jenen Teil des Proteins ohne die Leader-/Signalsequenz. Dem Peptid kann die Leader-Sequenz während der Prozessierung in der Zelle entfernt worden sein oder das Protein kann synthetisch oder unter Verwendung eines Polynukleotids, das nur für die reife proteinkodierende Sequenz kodiert, produziert worden sein. Es ist vorgesehen, dass der reife Proteinteil einen anfänglichen Methioninrest enthalten kann oder auch nicht. Das anfängliche Methionin wird oftmals während der Verarbeitung des Peptids entfernt.
Der Ausdruck „Derivat" bezieht sich auf Polypeptide, die mit solchen Techniken wie Ubiquitinierung, Markierung (z. B. mit Radionukliden oder verschiedenen Enzymen), kovalenter Polymeranbindung, wie Pegylierung (Derivatisierung mit Polyethylenglykol), und Insertion oder Substitution mittels chemischer Synthese von Aminosäuren wie Ornithin, das für gewöhnlich nicht in menschlichen Proteinen auftritt, chemisch modifiziert wurden.
Der Ausdruck „Variante" (oder „Analogon") bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, das sich von natürlich vorkommenden Polypeptiden durch Aminosäureinsertionen, -deletionen und -substitutionen unterscheidet, die unter Anwendung von z. B. rekombinanten DNA-Techniken erzeugt wurden. Eine Anleitung zur Bestimmung, welche Aminosäurereste ersetzt, hinzugefügt oder deletiert werden können, ohne Aktivitäten von Interesse zu beseitigen, kann gefunden werden, indem die Sequenz des bestimmten Polypeptids mit der von homologen Peptiden verglichen und die Anzahl von Aminosäuresequenzänderungen, die in Regionen hoher Homologie (konservierte Regionen) vorgenommen wurden, minimiert wird oder in dem Aminosäuren durch eine Consensus-Sequenz ersetzt werden.
Alternativ können rekombinante Varianten, die dieselben oder ähnliche Polypeptide kodieren, synthetisiert oder mittels Nutzung der „Redundanz" im genetischen Kode selektiert werden. Verschiedene Kodonsubstitutionen, wie die stummen Änderungen, die verschiedene Restriktionsstellen hervorbringen, können eingeführt werden, um die Klonierung in einen Plasmid- oder viralen Vektor oder die Expression in einem bestimmten prokaryontischen oder eukaryontischen System zu optimieren. Mutationen in der Polynukleotidsequenz können in dem Polypeptid oder Domänen anderer Peptide widergespiegelt werden, die dem Polypeptid hinzugefügt wurden, um die Eigenschaften eines beliebigen Teils des Polypeptids zu modifizieren, Charakteristika wie Ligandenbindungsaffinitäten, Affinitäten zwischen den Ketten oder die Abbau-/Umsatzrate zu ändern.
Vorzugsweise sind Aminosäure-„Substitutionen" das Resultat des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, d. h. konservative Aminosäureersetzungen. „Konservative" Aminosäuresubstitutionen können auf Basis der Ähnlichkeit in Bezug auf die Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Beschaffenheit der beteiligten Reste vorgenommen werden. Zum Beispiel beinhalten nichtpolare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin; polare neutrale Aminosäuren beinhalten Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin; positiv geladene (basische) Aminosäuren beinhalten Arginin, Lysin und Hystidin und negativ geladene (saure) Aminosäuren beinhalten Asparaginsäure und Glutaminsäure. „Insertionen" oder „Deletionen" liegen vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis 20 Aminosäuren, mehr bevorzugt 1 bis 10 Aminosäuren. Die zulässige Variation kann experimentell bestimmt werden, indem systematisch Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in einem Polypeptidmolekül unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken vorgenommen und die resultierenden rekombinanten Varianten auf Aktivität geprüft werden.
Alternativ, wenn eine Funktionsabänderung erwünscht wird, können Insertionen, Deletionen oder nicht konservative Veränderungen konstruiert werden, um abgeänderte Polypeptide herzustellen. Solche Abänderungen können beispielsweise eine oder mehrere der biologischen Funktionen oder biochemischen Charakteristika der Polypeptide der Erfindung abändern. Zum Beispiel können solche Abänderungen Polypeptidcharakteristika wie Ligandenbindungsaffinitäten, Affinitäten zwischen den Ketten oder die Abbau-/Umsatzrate ändern. Des Weiteren können solche Abänderungen so gewählt werden, dass sie Polypeptide erzeugen, die für die Expression, die Maßstabsvergrößerung (Scale-Up) und dergleichen in den für die Expression ausgewählten Wirtszellen besser geeignet sind. Zum Beispiel können Cysteinreste deletiert oder durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt werden, um Disulfidbrücken zu eliminieren.
Die Ausdrücke „gereinigt" oder „im Wesentlichen gereinigt", wie hierin verwendet, zeigt an, dass die angegebene Nukleinsäure oder das angegebene Polypeptid in der substantiellen Abwesenheit anderer biologischer Makromoleküle, z. B. Polynukleotide, Proteine und dergleichen, vorliegt. In einer Ausführungsform ist das Polynukleotid oder Polypeptid derart gereinigt, dass es mindestens 95 Gew.-%, mehr bevorzugt mindestens 99 Gew.-% der vorliegenden angegebenen biologischen Makromolekülen ausmacht (es können jedoch Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, insbesondere Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 Dalton, vorliegen).
Der Ausdruck „isoliert", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid, das von mindestens einer anderen Komponente (z. B. Nukleinsäure oder Polypeptid) getrennt ist, die mit der Nukleinsäure oder dem Polypeptid in deren bzw. dessen natürlicher Quelle vorliegt. In einer Ausführungsform wird die Nukleinsäure oder das Polypeptid in der Gegenwart von (falls überhaupt) nur einem Lösemittel, Puffer, Ion oder anderen Komponenten, die normalerweise in einer Lösung derselben bzw. desselben vorliegt, vorgefunden. Die Ausdrücke „isoliert" und „gereinigt" umfassen nicht Nukleinsäuren oder Polypeptide, die in ihrer natürlichen Quelle vorliegen.
Der Ausdruck „rekombinant", wenn er hierin verwendet wird, um auf ein Polypeptid oder Protein zu verweisen, bedeutet, dass ein Polypeptid oder Protein aus rekombinanten Expressionssystemen (z. B. von Mikroben, Insekten oder Säugetieren) abgeleitet ist. „Mikrobe" bezieht sich auf rekombinante Polypeptide oder Proteine, die in Bakterien- oder Pilz-Expressionssystemen (z. B. Hefe) hergestellt sind. Als ein Produkt definiert „rekombinante Mikrobe" ein Polypeptid oder Protein, das im Wesentlichen frei von nativen endogenen Substanzen ist und nicht von assoziierter nativer Glykosylierung begleitet wird. Polypeptide oder Proteine, die in den meisten Bakterienkulturen, z. B. E. coli, exprimiert werden, werden frei von Glykosylierungsmodifikationen sein; Polypeptide oder Proteine, die in Hefe exprimiert werden, werden ein Glykosylierungsmuster aufweisen, das sich im Allgemeinen von den in Säugetierzellen exprimierten unterscheidet.
Der Ausdruck „rekombinantes Expressionsvehikel oder rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Plasmid oder einen Phagen oder Virus oder Vektor zum Exprimieren eines Polypeptids aus einer DNA-Sequenz (RNA-Sequenz). Ein Expressionsvehikel kann eine Transkriptionseinheit umfassen, die eine Anordnung (Assembly) aus (1) einem genetischen Element oder genetischen Elementen mit einer regulatorischen Rolle bei der Genexpression, beispielsweise Promotoren oder Enhancer, (2) einer strukturellen oder kodierenden Sequenz, die in mRNA transkribiert und in Protein translatiert wird, und (3) geeigneten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen. Strukturelle Einheiten, die zur Verwendung in Hefe oder eukaryontischen Expressionssystemen gedacht sind, enthalten vorzugsweise eine Leader-Sequenz, die eine extrazelluläre Sekretion von translatiertem Protein durch eine Wirtszelle ermöglicht. Alternativ, wenn rekombinantes Protein ohne eine Leader- oder Transportsequenz exprimiert wird, kann es einen aminoterminalen Methioninrest enthalten. Dieser Rest kann oder kann nicht anschließend von dem exprimierten rekombinanten Protein abgespalten werden, um ein Endprodukt bereitzustellen.
Der Ausdruck „rekombinantes Expressionssystem" steht für Wirtszellen, die eine rekombinante Transkriptionseinheit stabil in chromosomale DNA integriert haben oder die rekombinante Transkriptionseinheit extrachromosomal tragen. Rekombinante Expressionssysteme, wie hierin definiert, werden heterologe Polypeptide oder Proteine bei Induktion der regulatorischen Elemente, die mit dem zu exprimierenden DNA-Segment oder synthetischen Gen gekoppelt sind, exprimieren. Dieser Ausdruck steht auch für Wirtszellen, die ein rekombinantes genetisches Element oder rekombinante genetische Elemente mit einer regulatorischen Rolle bei der Genexpression, beispielsweise Promotoren oder Enhancer, stabil integriert haben. Rekombinante Expressionssysteme, wie hierin definiert, werden in Bezug auf die Zelle endogene Polypeptide oder Proteine bei Induktion der regulatorischen Elemente, die mit dem zu exprimierenden endogenen DNA-Segment oder Gen gekoppelt sind, exprimieren. Die Zellen können prokaryontisch oder eukaryontisch sein.
Der Ausdruck „sezerniert" beinhaltet ein Protein, das über oder durch eine Membran transportiert wird, einschließlich eines Transports infolge von Signalsequenzen in seiner Aminosäuresequenz, wenn es in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird. „Sezernierte" Proteine beinhalten ohne Einschränkung Proteine, die komplett (z. B. lösliche Proteine) oder partiell (z. B. Rezeptoren) aus der Zelle sezerniert wurden, in der sie exprimiert wurden. „Sezernierte" Proteine beinhalten außerdem ohne Einschränkung Proteine, die über die Membran des endoplasmatischen Retikulums transportiert werden. „Sezernierte" Proteine sollen auch Proteine beinhalten, die nicht typische Signalsequenzen (z. B. Interleukin-I beta, siehe P.A. Krasney und P.R. Young, (1992) Cytokine 4(2):134-143) und Faktoren, die aus beschädigten Zellen abgegeben wurden (z. B. Interleukin-I-Rezeptorantagonist, siehe W.P. Arend et al., (1998) Annu. Rev. Immunol. 16:27-55), enthalten.
Auf Wunsch kann ein Expressionsvektor derart entworfen sein, dass er eine „Signal- oder Leader-Sequenz" enthält, die das Polypeptid durch die Membran einer Zelle leiten wird. Eine solche Sequenz kann an den hierin offenbarten Polypeptiden natürlich vorliegen oder mittels rekombinanter DNA-Techniken aus heterologen Proteinquellen bereitgestellt werden.
Der Ausdruck „stringent" wird verwendet, um auf Bedingungen zu verweisen, die in der Technik allgemein als stringent verstanden werden. Stringente Bedingungen können hoch stringente Bedingungen (d. h. Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7%-igem Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1%-igem SDS bei 68°C) und gemäßigten stringenten Bedingungen (d. h. Waschen in 0,2 × SSC/0,1%-igem SDS bei 42°C) beinhalten. Andere beispielhafte Hybridisierungsbedingungen sind hierin in den Beispielen beschrieben.
In Fällen einer Hybridisierung von Desoxyoligonukleotiden beinhalten weitere beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen Waschen in 6 × SSC/0,05%-igem Natriumpyrophosphat bei 37°C (für Oligonukleotide mit 14 Basen), 48°C (für Oligonukleotide mit 17 Basen), 55°C (für Oligonukleotide mit 20 Basen) und 60°C (für Oligonukleotide mit 23 Basen).
Wie hierin verwendet, kann sich „im Wesentlichen äquivalent" sowohl auf Nukleotid- und Aminosäuresequenzen beziehen, beispielsweise eine Mutantensequenz, die sich von einer Referenzsequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen unterscheidet, wobei die Nettoauswirkung davon nicht in einer nachteiligen Funktionsunähnlichkeit zwischen der Referenz- und der Subjektsequenz resultiert. In der Regel unterscheidet sich eine im Wesentlichen äquivalente Sequenz von einer der hierin aufgeführten um nicht mehr als etwa 35 % (d. h. die Anzahl individueller Restsubstitutionen, -additionen und/oder -deletionen in einer im Wesentlichen äquivalenten Sequenz, im Vergleich zu der entsprechenden Referenzsequenz, geteilt durch die Gesamtzahl von Resten in der im Wesentlichen äquivalenten Sequenz ist etwa 0,35 oder weniger). Von einer solchen Sequenz wird gesagt, dass sie 65 % Sequenzidentität zu der aufgeführten Sequenz aufweist. In einer Ausführungsform unterscheidet sich eine im Wesentlichen äquivalente Sequenz, z. B. Mutantensequenz, von einer aufgeführten Sequenz um nicht mehr als 30 % (70 % Sequenzidentität); in einer Variation dieser Ausführungsform um nicht mehr als 25 % (75 % Sequenzidentität) und in einer weiteren Variation dieser Ausführungsform um nicht mehr als 20 % (80 % Sequenzidentität) und in einer weiteren Variation dieser Ausführungsform um nicht mehr als 10 % (90 % Sequenzidentität) und in einer weiteren Variation dieser Ausführungsform um nicht mehr als 5 % (95 % Sequenzidentität). Im Wesentlichen äquivalente Aminosäuresequenzen, z. B. Mutantenaminosäuresequenzen, weisen vorzugsweise mindestens 80 % Sequenzidentität zu einer aufgeführten Aminosäuresequenz auf, mehr bevorzugt mindestens 90 % Sequenzidentität. Im Wesentlichen äquivalente Nukleotidsequenzen können niedrigere prozentuale Sequenzidentitäten aufweisen, wobei beispielsweise die Redundanz oder Degeneration des genetischen Kodes berücksichtigt wird. Vorzugsweise weist die Nukleotidsequenz mindestens etwa 65 % Identität auf, mehr bevorzugt mindestens etwa 75 % Identität und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95 % Identität. Für die Zwecke hierin werden Sequenzen mit im Wesentlichen äquivalenter biologischer Aktivität und im Wesentlichen äquivalenten Expressionscharakteristika als im Wesentlichen äquivalent betrachtet. Für die Zwecke des Bestimmens der Äquivalenz sollte die Verkürzung der reifen Sequenz (z. B. mittels einer Mutation, die ein störendes Stoppkodon erzeugt) missachtet werden. Die Sequenzidentität kann z. B. unter Anwendung des Jotun-Hein-Verfahrens bestimmt werden (J. Hein, (1990) Methods Enzymol. 183:626-645). Die Identität zwischen Sequenzen kann auch mittels anderer in der Technik bekannter Verfahren bestimmt werden, z. B. durch Variieren der Hybridisierungsbedingungen.
Der Ausdruck „totipotent" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Zelle, zu allen Zelltypen eines adulten Organismus zu differenzieren.
Der Ausdruck „Transformation" steht für das Einführen von DNA in eine geeignete Wirtszelle, so dass die DNA replizierbar ist, entweder als ein extrachromosomales Element oder mittels chromosomaler Integration. Der Ausdruck „Transfektion" bezieht sich auf das Aufnehmen eines Expressionsvektors durch eine geeignete Wirtszelle, ob nun etwaige kodierende Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Der Ausdruck „Infektion" bezieht sich auf die Einführung von Nukleinsäuren in eine geeignete Wirtszelle durch Verwendung eines Virus oder viralen Vektors.
Wie hierin verwendet, steht ein „die Aufnahme modulierendes Fragment" (uptake modulating fragment), UMF, für eine Reihe von Nukleotiden, die die Aufnahme eines gekoppelten DNA-Fragments in eine Zelle vermitteln. UMFs können mit den im Folgenden beschriebenen computerbasierten Systemen unter Verwendung von bekannten UMFs als einer Zielsequenz oder ein Zielmotiv leicht identifiziert werden. Das Vorliegen und die Aktivität eines UMF kann durch Anhaften des vermuteten UMF an eine Markersequenz bestätigt werden. Das resultierende Nukleinsäuremolekül wird dann unter adäquaten Bedingungen mit einem adäquaten Wirt inkubiert und die Aufnahme der Markersequenz wird bestimmt. Wie oben beschrieben, wird eine UMF die Häufigkeit der Aufnahme einer gekoppelten Markersequenz erhöhen.
Jeder der obigen Ausdrücke soll alles umfassen, was für jeden beschrieben ist, sofern der Zusammenhang nicht etwas anderes vorschreibt.
4.2 NUKLEINSÄUREN
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung eines neuartigen Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptids, den Polynukleotiden, die das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptid kodieren, und der Verwendung dieser Zusammensetzungen für die Diagnose, Behandlung oder Prävention von Krebserkrankungen und anderen immunologischen Störungen.
Die hierin offenbarten isolierten Polynukleotide beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, ein Polynukleotid, das eine beliebige der Nukleotidsequenzen der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 24 oder 33 umfasst; ein Fragment der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33; ein Polynukleotid, das die vollständige proteinkodierende Sequenz der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 (beispielsweise für SEQ ID Nr. 23, 25 oder 28 kodiert) umfasst; und ein Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz umfasst, die die reife proteinkodierende Sequenz der Polynukleotide einer beliebigen Sequenz der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 kodiert. Die Polynukleotide beinhalten außerdem ein Polynukleotid, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an (a) das Komplement einer beliebigen der Nukleotidsequenzen in SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33; (b) ein Polynukleotid, das ein beliebiges der Polypeptide der SEQ ID Nr. 23, 25, 28, 30-32, 34 oder 35 kodiert, (c) ein Polynukleotid, das eine Allelvariante eines beliebigen der oben vorgetragenen Polynukleotide ist; (d) ein Polynukleotid, das ein Spezieshomologon eines beliebigen der oben vorgetragenen Proteine kodiert; oder (e) ein Polynukleotid, das ein Polypeptid kodiert, das eine spezifische Domäne oder Verkürzung der Polypeptide der SEQ ID Nr. 23, 25, 28, 30-32, 34 oder 35 umfasst, hybridisiert, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Domänen von Interesse können von der Beschaffenheit des kodierten Polypeptids abhängen: z. B. beinhalten Domänen in rezeptorartigen Polypeptiden Ligandenbindungs-, extrazelluläre, Transmembran- oder zytoplasmatische Domänen oder Kombinationen davon; Domänen in immunglobulinartigen Proteinen beinhalten die variablen immunglobulinartigen Domänen; Domänen in enzymartigen Polypeptiden beinhalten katalytische und Substratbindungsdomänen und Domänen in Liganden-Polypeptiden beinhalten Rezeptorbindungsdomänen.
Die hierin offenbarten Polynukleotide beinhalten natürlich vorkommende oder vollständig oder teilsynthetische DNA, z. B. cDNA und genomische DNA, und RNA, z. B. mRNA. Die Polynukleotide können alles der kodierenden Region der cDNA beinhalten oder können einen Teil der kodierenden Region der cDNA darstellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Gene, die den hierin offenbarten cDNA-Sequenzen entsprechen. Die entsprechenden Gene können gemäß bekannten Verfahren unter Verwendung der hierin offenbarten Sequenzinformation isoliert werden. Solche Verfahren beinhalten die Herstellung von Sonden oder Primern aus der offenbarten Sequenzinformation zur Identifizierung und/oder Amplifikation von Genen in adäquaten genomischen Bibliotheken oder anderen Quellen von genomischen Materialien. Weitere 5'- und 3'-Sequenzen können unter Anwendung von in der Technik bekannten Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel kann vollständige cDNA oder genomische DNA, die einem beliebigen der Polynukleotide der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 entspricht, durch Screenen adäquater cDNA-Bibliotheken oder Bibliotheken genomischer DNA unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen unter Verwendung eines beliebigen der Polynukleotide der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 oder eines Teils davon als einer Sonde erhalten werden. Alternativ können die Polynukleotide der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 als Grundlage für einen geeigneten Primer bzw. geeignete Primer verwendet werden, die eine Identifizierung und/oder Amplifikation von Genen in adäquaten Bibliotheken genomischer DNA oder cDNA-Bibliotheken ermöglichen.
Die hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen können aus ESTs und Sequenzen (einschließlich cDNA- und genomischer Sequenzen), die aus einer oder mehreren öffentlichen Datenbanken, wie dbEST, gbpri und UniGene, bezogen wurden, assembliert werden. Die EST-Sequenzen können identifizierende Sequenzinformationen, repräsentative Fragment- oder Segmentinformationen oder Informationen zu neuartigen Segmenten für das vollständige Gen bereitstellen.
Ebenfalls werden Polynukleotide offenbart, die Nukleotidsequenzen beinhalten, die zu den oben vorgetragenen Polynukleotiden im Wesentlichen äquivalent sind. Zum Beispiel können Polynukleotide z. B. mindestens etwa 65 %, mindestens etwa 70 %, mindestens etwa 75 %, mindestens etwa 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % oder 89 %, typischer mindestens etwa 90 %, 91 %, 92 %, 93 % oder 94 % oder noch typischer mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % Sequenzidentität zu einem oben vorgetragenen Polynukleotid aufweisen.
Weiterhin werden Nukleinsäurefragmente offenbart, die unter stringenten Bedingungen an eine beliebige der Nukleotidsequenzen der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 oder Komplemente davon hybridisieren, wobei das Fragment größer als etwa 5 Nukleotide, vorzugsweise 7 Nukleotide, mehr bevorzugt größer als 9 Nukleotide und am meisten bevorzugt größer als 17 Nukleotide ist. Fragmente von z. B. 15, 17 oder 20 Nukleotiden oder mehr, die für ein beliebiges der vorgetragenen Polynukleotide selektiv sind (d. h. spezifisch an ein solches hybridisieren), sind vorgesehen. Sonden, die spezifisch an ein Polynukleotid hybridisieren können, können hierin offenbarte Polynukleotidsequenzen von anderen Polynukleotidsequenzen in derselben Familie von Genen unterscheiden oder können menschliche Gene von Genen anderer Spezies unterscheiden und basieren vorzugsweise auf einzigartigen Nukleotidsequenzen.
Die Sequenzen, die in den Schutzumfang der vorliegenden Offenbarung fallen, sind nicht auf diese spezifischen Sequenzen beschränkt, sondern beinhalten auch Allel- und Speziesvariationen davon. Allel- und Speziesvariationen können routinemäßig bestimmt werden, indem die in SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 bereitgestellte Sequenz, ein repräsentatives Fragment davon oder eine Nukleotidsequenz, die zu mindestens 90 %, vorzugsweise zu 95 % zu SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 identisch ist, mit einer Sequenz von einem anderen Isolat derselben Spezies verglichen wird. Darüber hinaus sind, um einer Kodonvariabilität Rechnung zu tragen, Nukleinsäuremoleküle eingeschlossen, die für dieselben Aminosäuresequenzen wie die hierin offenbarten spezifischen ORFs kodieren. Mit anderen Worten, in der kodierenden Region eines ORF ist eine Substitution eines Kodons durch ein anderes Kodon, das die gleiche Aminosäure kodiert, ausdrücklich vorgesehen.
Das Nächster-Nachbar-Ergebnis für die Nukleinsäuren der vorliegenden Anmeldung, einschließlich SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33, kann erhalten werden, indem eine Datenbank unter Anwendung eines Algorithmus oder eines Programms durchsucht wird. Vorzugsweise wird ein BLAST, was für „Basic Local Alignment Search Tool" steht, verwendet, um nach lokalen Sequenz-Alignments zu suchen (S.F. Altschul, J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993), und S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 21:403-410 (1990)).
Spezieshomologa oder (Orthologa) der offenbarten Polynukleotide und Proteine werden ebenfalls offenbart. Spezieshomologa können isoliert und identifiziert werden, indem geeignete Sonden oder Primer aus den hierin offenbarten Sequenzen hergestellt werden und auf eine geeignete Nukleinsäurequelle aus den gewünschten Spezies gescreent wird.
Die Erfindung betrifft auch Allelvarianten der offenbarten Polynukleotide oder Proteine; das heißt, natürlich vorkommende alternative Formen des isolierten Polynukleotids, die ebenfalls Proteine kodieren, die mit den von den Polynukleotiden kodierten identisch sind, zu diesen homolog sind oder diesen ähnlich sind.
Die hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen richten sich weiterhin auf Sequenzen, die Varianten der beschriebenen Nukleinsäuren kodieren. Diese Aminosäuresequenzvarianten können mittels in der Technik bekannter Verfahren hergestellt werden, indem adäquate Nukleotidänderungen in ein natives Polynukleotid oder eine Polynukleotidvariante eingeführt werden. Bei der Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten liegen zwei Variablen vor: die Stelle der Mutation und die Beschaffenheit der Mutation. Nukleinsäuren, die die Aminosäuresequenzvarianten kodieren, werden vorzugsweise konstruiert, indem das Polynukleotid mutiert wird, um eine Aminosäuresequenz zu kodieren, die in der Natur nicht vorkommt. Diese Nukleinsäureänderungen können an Stellen vorgenommen werden, die sich in Bezug auf die Nukleinsäuren von anderen Spezies (variable Positionen) oder hoch konservierte Regionen (konstante Regionen) unterscheiden. Stellen an solchen Positionen werden in der Regel in Reihe modifiziert, z. B. indem zunächst mit konservativen Auswahlmöglichkeiten (z. B. hydrophobe Aminosäure zu einer anderen hydrophoben Aminosäure) und dann mit entfernteren Auswahlmöglichkeiten (z. B. hydrophobe Aminosäure zu einer geladenen Aminosäure) substituiert wird, und danach können am Zielort Deletionen oder Insertionen vorgenommen werden. Aminosäuresequenzdeletionen reichen im Allgemeinen von etwa 1 bis 30 Reste, vorzugsweise etwa 1 bis 10 Reste und sind in der Regel zusammenhängend. Aminosäureinsertionen beinhalten amino- und/oder carboxylterminale Fusionen, die in Bezug auf die Länge von einem bis einhundert oder mehr Resten reichen, als auch Insertionen in die Sequenzen von einzelnen oder mehreren Aminosäureresten. Intrasequenzinsertionen können im Allgemeinen von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten, vorzugsweise von 1 bis 5 Resten reichen. Beispiele von Insertionen an den Termini beinhalten die heterologen Signalsequenzen, die für die Sekretion oder die intrazelluläre Targetierung in verschiedenen Wirtszellen und Sequenzen wie FLAG oder Polyhistidin- Sequenzen, die zum Reinigen des exprimierten Proteins geeignet sind, erforderlich sind.
In einem bevorzugten Verfahren werden Polynukleotide, die die neuartigen Aminosäuresequenzen kodieren, mittels ortsgerichteter Mutagenese geändert. Dieses Verfahren verwendet Oligonukleotidsequenzen zum Verändern eines Polynukleotids, um die gewünschte Aminosäurenvariante zu kodieren, als auch ausreichend angrenzende Nukleotide auf beiden Seiten der geänderten Aminosäure, um einen stabilen Doppelstrang auf einer von beiden Seiten der Stelle, die geändert wird, zu bilden. Im Allgemeinen sind die Techniken der ortsgerichteten Mutagenese dem Fachmann wohl bekannt und diese Technik wird von Publikationen wie Edelman et al., DNA 2:183 (1983), beispielhaft gezeigt. Ein vielseitiges und effizientes Verfahren zum Bewirken von ortsspezifischen Änderungen in einer Polynukleotidsequenz wurde von Zoller und Smith, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982), veröffentlicht. PCR kann ebenfalls angewendet werden, um Aminosäuresequenzvarianten der neuartigen Nukleinsäuren zu erzeugen. Wenn geringe Mengen von Matrix-DNA als Ausgangsmaterial verwendet werden, kann bzw. können ein Primer bzw. Primer, der bzw. die sich in Bezug auf die Sequenz von der entsprechenden Region in der Matrix-DNA geringfügig unterscheidet bzw. unterscheiden, die gewünschte Aminosäurenvariante erzeugen. PCR-Amplifikation resultiert in einer Population von Produkt-DNA-Fragmenten, die sich von der Polynukleotid-Matrize unterscheiden, die das Polypeptid an der von dem Primer spezifizierten Position kodieren. Die Produkt-DNA-Fragmente ersetzen die entsprechende Region in dem Plasmid und dies ergibt ein Polynukleotid, das die gewünschte Aminosäurenvariante kodiert.
Eine weitere Technik zum Erzeugen von Aminosäurenvarianten ist die in Wells et al., Gene 34:315 (1985), beschriebene Kassettenmutagenesetechnik und andere in der Technik wohl bekannte Mutagenesetechniken, wie beispielsweise die Techniken in Sambrook et al., oben, und Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. Aufgrund der inhärenten Degeneration des genetischen Kodes können andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen dieselbe oder eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz kodieren, für die Klonierung und Expression dieser neuartigen Nukleinsäuren verwendet werden. Solche DNA-Sequenzen beinhalten jene, die unter stringenten Bedingungen an die adäquate neuartige Nukleinsäuresequenz hybridisieren können.
Polynukleotide, die bevorzugte Polypeptidverkürzungen kodieren, können dazu verwendet werden, Polynukleotide zu erzeugen, die chimäre Proteine oder Fusionsproteine kodieren, die eine oder mehrere Domänen und heterologe Proteinsequenzen umfassen.
Die Polynukleotide der Anmeldung beinhalten zusätzlich das Komplement eines beliebigen der oben vorgetragenen Polynukleotide. Das Polynukleotid kann DNA (genomische, cDNA, amplifizierte oder synthetische DNA) oder RNA sein. Verfahren und Algorithmen zum Erhalten solcher Polynukleotide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise Verfahren zum Bestimmen von Hybridisierungsbedingungen, die Polynukleotide mit den gewünschten Sequenzidentitäten routinemäßig isolieren können, beinhalten.
Gemäß der vorliegenden Offenbarung können Polynukleotidsequenzen, die die reifen proteinkodierenden Sequenzen umfassen, die für eine beliebige Sequenz von SEQ ID Nr. 23, 25, 28, 30-32, 34 oder 35 oder funktionelle Äquivalente davon kodieren, dazu verwendet werden, rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen, die die Expression dieser Nukleinsäure oder eines funktionellen Äquivalents davon in adäquaten Wirtszellen steuern. Ebenfalls eingeschlossen sind die cDNA-Inserts eines beliebigen der hierin identifizierten Klone.
Ein Polynukleotid kann mittels gängigen rekombinanten DNA-Techniken (siehe J. Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY) mit einer beliebigen einer Vielfalt von anderen Nukleotidsequenzen verbunden werden. Geeignete Nukleotidsequenzen zum Verbinden mit Polynukleotiden beinhalten eine Auswahl von Vektoren, z. B. Plasmide, Cosmide, Lambda-Phagen-Derivate, Phagemide und dergleichen, die in der Technik wohl bekannt sind. Demgemäß werden außerdem ein Vektor, der ein hierin offenbartes Polynukleotid enthält, und eine Wirtszelle, die das Polynukleotid enthält, offenbart. Im Allgemeinen enthält der Vektor einen Replikationsursprung, der in mindestens einem Organismus funktionell ist, zweckmäßige Restriktionsendonukleaseorte und einen selektierbaren Marker für die Wirtszelle. Die Vektoren beinhalten Expressionsvektoren, Replikationsvektoren, Sondengenerierungsvektoren und Sequenzierungsvektoren. Die Wirtszelle kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein und kann ein einzelliger Organismus oder Teil eines mehrzelligen Organismus sein.
Außerdem werden rekombinante Konstrukte offenbart, die eine Nukleinsäure mit einer beliebigen der Nukleotidsequenzen der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 oder ein Fragment davon oder ein beliebiges anderes hierin offenbartes Polynukleotid umfassen. In einer Ausführungsform umfassen die rekombinanten Konstrukte einen Vektor, wie einen Plasmid- oder viralen Vektor, in den eine Nukleinsäure mit einer beliebigen der Nukleotidsequenzen der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 oder einem Fragment davon in einer Vorwärts- oder Rückwärtsorientierung inseriert wird. Im Fall eines Vektors, der eines der hierin offenbarten ORFs umfasst, kann der Vektor weiterhin Regulationssequenzen umfassen, darunter beispielsweise einen Promotor, der operativ an das ORF gekoppelt ist. Große Zahlen von geeigneten Vektoren und Promotoren sind dem Fachmann bekannt und sind zum Erzeugen der rekombinanten Konstrukte im Handel erhältlich. Die folgenden Vektoren werden beispielhaft bereitgestellt. Bakteriell: pBs, Phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryontisch: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXTI, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL (Pharmacia).
Das hierin offenbarte isolierte Polynukleotid kann operativ an eine Expressionskontrollsequenz, wie die in Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991), offenbarten pMT2- oder pED-Expressionsvektoren, gekoppelt werden, um das Protein rekombinant zu produzieren. Viele geeignete Expressionskontrollsequenzen sind in der Technik bekannt. Allgemeine Verfahren zum Exprimieren von rekombinanten Proteinen sind ebenfalls bekannt und sind in R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990), beispielhaft gezeigt. Wie hierin definiert, bedeutet „operativ gekoppelt", dass das isolierte Polynukleotid und eine Expressionskontrollsequenz derart in einem Vektor oder einer Zelle angeordnet sind, dass das Protein von einer Wirtszelle exprimiert wird, die mit dem Polynukleotid/der Expressionskontrollsequenz, die ligiert sind, transformiert (transfiziert) wurde.
Promotorregionen können aus einem beliebigen Gen unter Verwendung von CAT-Vektoren (CAT = Chloramphenicol-Transferase) oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markern ausgewählt werden. Zwei adäquate Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Speziell genannte bakterielle Promotoren beinhalten lacI, lacZ, T3, T7, gpt, Lambda-PR und trc. Eukaryontische Promotoren beinhalten CMV-Immediate-Early, HSV-Thymidinkinase, Early- und Late-SV40, LTRs von Retrovirus und Maus-Metallothionein-I. Die Auswahl des adäquaten Vektors und Promotors liegt innerhalb des Könnens des Durchschnittsfachmanns. Im Allgemeinen werden rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Marker, die die Transformation der Wirtszelle ermöglichen, z. B. das Ampicillinresistenzgen vom E. coli- und S. cerivisiae-TRP1-Gen, und einen Promotor, der von einem stark exprimierten Gen abgeleitet ist, um die Transkription einer stromabwärts gelegenen strukturellen Sequenz zu steuern, beinhalten. Solche Promotoren können von Operonen abgeleitet sein, die u. a. glykolytische Enzyme wie 3-Phosphoglyceratkinase (PGK), a-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine kodiert. Die heterologe strukturelle Sequenz wird in adäquater Phase mit Translationsinitiations- und -terminationssequenzen und vorzugsweise einer Leader-Sequenz, die die Sekretion von translatiertem Protein in den periplasmatischen Raum oder extrazelluläres Medium steuern kann, assembliert. Gegebenenfalls kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein kodieren, das ein aminoterminales Identifizierungspeptid einschließt, das gewünschte Eigenschaften verleiht, z. B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung von exprimiertem rekombinantem Produkt. Geeignete Expressionsvektoren zur bakteriellen Verwendung werden konstruiert, indem eine strukturelle DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein kodiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und -terminationssignalen in funktionsfähiger Lesephase mit einem funktionellen Promotor inseriert wird. Der Vektor wird einen oder mehrere phänotypische selektierbare Marker und einen Replikationsursprung umfassen, um die Erhaltung des Vektors sicherzustellen und, falls erwünscht, für die Amplifikation in dem Wirt sorgen. Geeignete prokaryontische Wirte zur Transformation beinhalten E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obgleich andere ebenfalls als Auswahlmöglichkeit eingesetzt werden können.
Als ein repräsentatives, jedoch nicht einschränkendes Beispiel können geeignete Expressionsvektoren zur bakteriellen Verwendung einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, der von im Handel erhältlichen Plasmiden abgeleitet ist, die genetische Elemente des wohl bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Solche kommerziellen Vektoren beinhalten beispielsweise pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM 1 (Promega Biotech, Madison, WI, USA). Diese pBR322-„Rückgrat"-Sektionen werden mit einem adäquaten Promotor und der zu exprimierenden strukturellen Sequenz kombiniert. Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstamms und dem Wachstum des Wirtsstamms zu einer adäquaten Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch adäquate Mittel (z. B. Temperaturwechsel oder chemische Induktion) induziert oder dereprimiert und die Zellen werden für einen weiteren Zeitraum kultiviert. Die Zellen werden in der Regel mittels Zentrifugierung geerntet, mit physikalischen oder chemischen Mitteln gesprengt und der resultierende Rohextrakt zur weiteren Reinigung aufbewahrt.
Polynukleotide der Erfindung können auch dazu verwendet werden, Immunreaktionen zu induzieren. Zum Beispiel, wie in Fan et al., Nat. Biotech. 17:870-872 (1999), beschrieben, können Nukleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid kodieren, verwendet werden, um Antikörper gegen das kodierte Polypeptid nach topischer Verabreichung von nackter Plasmid-DNA oder nach Injektion und vorzugsweise intramuskulärer Injektion der DNA zu erzeugen. Die Nukleinsäuresequenzen werden vorzugsweise in einen rekombinanten Expressionsvektor inseriert und können in der Form von nackter DNA sein.
4.2.1 ANTISENSE-NUKLEINSÄUREN
Ein anderer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft isolierte Antisense-Nukleinsäuremoleküle, die an das Nukleinsäuremolekül, das die Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Nukleotidsequenz oder Fragmente, Analoga oder Derivate davon umfasst, hybridisieren können oder zu diesem komplementär sind. Eine „Antisense"-Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, die zu einer „Sense"-Nukleinsäure, die ein Protein kodiert, komplementär ist (z. B. zu dem kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder zu einer mRNA-Sequenz komplementär ist). In spezifischen Gesichtspunkten werden Antisense-Nukleinsäuremoleküle offenbart, die eine Sequenz umfassen, die zu mindestens etwa 10, 25, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotiden oder einem ganzen Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen kodierenden Strang oder zu nur einem Teil davon komplementär ist. Nukleinsäuremoleküle, die Fragmente, Homologa, Derivate und Analoga einer Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Substanz oder Antisense-Nukleinsäuren, die zu einer Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Nukleinsäuresequenz komplementär sind, kodieren, werden zusätzlich offenbart.
In einer Ausführungsform ist ein Antisense-Nukleinsäuremolekül zu einer „kodierenden Region" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, die ein Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Protein kodiert, „antisense". Der Ausdruck „kodierende Region" bezieht sich auf die Region der Nukleotidsequenz, die Kodons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. In einer anderen Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül zu einer „nachgebenden Region" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, die ein Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Protein kodiert, antisense. Der Ausdruck „nachgebende Region" bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren, die nicht in Aminosäuren translatiert werden (d. h. auch als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet).
Angesichts der kodierenden Strangsequenzen, die das hierin offenbarte Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Protein kodieren, können Antisense-Nukleinsäuren gemäß den Richtlinien der Basenpaarung nach Watson und Crick oder Hoogsteen entworfen werden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zu der ganzen kodierenden Region von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlicher mRNA komplementär sein, mehr bevorzugt ist jedoch ein Oligonukleotid, das zu nur einem Teil der kodierenden oder nichtkodierenden Region von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlicher mRNA antisense ist. Das Antisense-Oligonukleotid kann beispielsweise zu der Region komplementär sein, die den Translationsstartort von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlicher mRNA umgibt. Ein Antisense-Oligonukleotid kann beispielsweise etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. Eine Antisense-Nukleinsäure kann unter Anwendung chemischer Synthese oder enzymatischer Ligationsreaktionen mittels in der Technik bekannter Vorgehensweisen konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäure (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid) kann beispielsweise unter Verwendung natürlich vorkommender Nukleotide oder verschiedenartig modifizierter Nukleotide, die entworfen wurden, um die biologische Stabilität der Moleküle zu verbessern oder die physikalische Stabilität des Doppelstrangs, der zwischen der Antisense- und der Sense-Nukleinsäure gebildet wird, zu steigern, chemisch synthetisiert werden (z. B. können Phosphorothioatderivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden).
Beispiele von modifizierten Nukleotiden, die zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, beinhalten: 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-Galactosylqueuosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D- Mannosylqueuosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queuosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Alternativ kann die Antisense-Nukleinsäure biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors produziert werden, in den eine Nukleinsäure in einer Antisense-Orientierung (d. h. aus der inserierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird in einer Antisense-Orientierung zu einer Zielnukleinsäure von Interesse sein, im folgenden Abschnitt weiter beschrieben) subkloniert wird.
Die hierin offenbarten Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden in der Regel an einen Patienten verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie an zelluläre mRNA und/oder genomische DNA hybridisieren oder binden und ein Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Protein kodieren, um dadurch die Expression des Proteins zu inhibieren (z. B. durch Inhibieren der Transkription und/oder Translation). Die Hybridisierung kann mittels herkömmlicher Nukleotidkomplementarität, um einen stabilen Doppelstrang zu bilden, oder beispielsweise im Fall einer Antisense-Nukleinsäuremolekül, das an DNA-Doppelstränge bindet, durch spezifische Interaktionen in der Hauptfurche der Doppelhelix erfolgen. Ein Beispiel eines Wegs der Verabreichung von Nukleinsäuremolekülen beinhaltet die direkte Injektion an einer Gewebestelle. Alternativ können Antisense-Nukleinsäuremoleküle modifiziert werden, um ausgewählte Zellen zu targetieren, und dann systemisch verabreicht werden. Zum Beispiel können Antisense-Moleküle zur systemischen Verabreichung derart modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden (z. B. indem die Antisense-Nukleinsäuremoleküle an Peptide oder Antikörper gekoppelt werden, die an Zelloberflächenrezeptoren oder -antigene binden). Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle können auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen geliefert werden. Um ausreichend Nukleinsäuremoleküle zu erzielen, sind Vektorkonstrukte, in denen das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter die Kontrolle eines starken pol-II- oder pol-III-Promotors gestellt wird, bevorzugt.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül ein alpha-anomerisches Nukleinsäuremolekül. Ein alpha-anomerisches Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in der die Stränge im Gegensatz zu den gewöhnlichen Alpha-Einheiten parallel zueinander verlaufen. Siehe z. B. Gaultier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (siehe z. B. Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (siehe z. B. Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330) umfassen.
4.2.2 RIBOZYME UND PNA-ANTEILE
Nukleinsäuremodifikationen beinhalten, als nicht einschränkendes Beispiel, modifizierte Basen und Nukleinsäuren, deren Zuckerphosphat-Rückgrate modifiziert oder derivatisiert sind. Diese Modifikationen werden zumindest zum Teil ausgeführt, um die chemische Stabilität der modifizierten Nukleinsäure zu verstärken, so dass sie beispielsweise als Antisense-Bindungsnukleinsäuren in therapeutischen Anwendungen in einem Patienten verwendet werden können.
In einer Ausführungsform ist eine Antisense-Nukleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, spalten können. Folglich können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme, wie in Haselhoff und Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591, beschrieben) dazu verwendet werden, Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, um dadurch die Translation von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlicher mRNA zu inhibieren. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäure, die eine Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Substanz kodiert, kann auf Basis der Nukleotidsequenz einer hierin offenbarten Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen cDNA entworfen werden. Zum Beispiel kann ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA konstruiert werden, in dem die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle zu der zu spaltenden Nukleotidsequenz in einer mRNA, die eine Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Substanz kodiert, komplementär ist. Siehe z. B. US-Patentschrift 4,987,071 an Cech et al. und US-Patentschrift 5,116,742 an Cech et al. Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche mRNA kann auch dazu verwendet werden, eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen. Siehe z. B. Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418.
Alternativ kann die Expression von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlicher Genen inhibiert werden, indem Nukleotidsequenzen, die zu der regulatorischen Region der Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Nukleinsäure komplementär sind (z. B. der Promotor und/oder die Enhancer der Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Substanz), targetiert werden, um Tripelhelixstrukturen zu bilden, die die Transkription des Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Gens in Zielzellen verhindern. Siehe z. B. Helene, 1991, Anticancer Drug Des. 6:569-584; Helene et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; Maher, 1992, Bioassays 14:807-815.
In verschiedenen Ausführungsformen können die Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Nukleinsäuren an dem Basenanteil, Zuckeranteil oder Phosphat-Rückgrat modifiziert werden, um z. B. die Stabilität, Hybridisierung oder Löslichkeit des Moleküls zu verbessern. Zum Beispiel kann das Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat der Nukleinsäuren modifiziert werden, um Peptidnukleinsäuren zu erzeugen. Siehe z. B. Hyrup et al., 1996, Bioorg. Med. Chem. 4:5-23. Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke „Peptidnukleinsäuren" oder „PNAs" auf Nukleinsäuremimesen (z. B. DNA-Mimesen), in denen das Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat durch ein Pseudopeptid-Rückgrat ersetzt wird und nur die vier natürlichen Nukleobasen bewahrt werden. Vom neutralen Rückgrat von PNAs wurde gezeigt, dass es eine spezifische Hybridisierung an DNA oder RNA unter Bedingungen mit niedriger Ionenstärke ermöglicht. Die Synthese von PNA-Oligomeren kann unter Anwendung von Standard-Festphasensyntheseprotokollen, wie in Hyrup et al., 1996, oben; Perry-O'Keefe et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-14675, beschrieben, durchgeführt werden.
PNAs von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Substanzen können in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel können PNAs als Antisense- oder Antigen-Agentien zur sequenzspezifischen Modulation der Genexpression durch z. B. Induzieren eines Transkriptions- oder Translationsarrests oder Inhibieren der Replikation verwendet werden. PNAs von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Substanzen können auch beispielsweise bei der Analyse von Einzelbasenpaarmutationen in einem Gen verwendet werden (z. B. PNA-gesteuertes PCR-Clamping; als künstliche Restriktionsenzyme bei Verwendung in Kombination mit anderen Enzymen, z. B. S1-Nukleasen (siehe Hyrup et al., 1996, oben) oder als Sonden oder Primer für die DNA-Sequenz und Hybridisierung (siehe Hyrup et al., 1996, oben; Perry-O'Keefe et al., 1996, oben).
In einer anderen Ausführungsform können PNAs von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Substanzen durch Anheften von lipophilen oder anderen Helfergruppen an PNA, durch Bildung von PNA-DNA-Chimären oder durch Verwendung von Liposomen oder anderen in der Technik bekannten Techniken der Arzneimittelabgabe modifiziert werden, z. B. um ihre Stabilität oder zelluläre Aufnahme zu verstärken. Zum Beispiel können PNA-DNA-Chimären von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Substanzen erzeugt werden, die die vorteilhaften Eigenschaften von PNA und DNA vereinen können. Solche Chimären ermöglichen DNA-Erkennungsenzymen (z. B. RNase H und DNA-Polymerasen), mit dem DNA-Teil zu interagieren, während der PNA-Teil eine stärkere Bindungsaffinität und Spezifität bereitstellen würde. PNA-DNA-Chimären können unter Verwendung von Linkern mit adäquaten Längen gekoppelt werden, die hinsichtlich der Basenstapelung, Anzahl von Bindungen zwischen den Nukleobasen und Orientierung ausgewählt werden (siehe Hyrup et al., 1996, oben). Die Synthese von PNA-DNA-Chimären kann wie in Hyrup et al., 1996, oben, et al., 1996, Nucl. Acids Res. 24:3357-3363, beschrieben durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Kette unter Anwendung von Standard-Phosphoramidit-Kopplungschemie auf einen festen Träger synthetisiert werden und modifizierte Nukleosidanaloga, z. B. 5'-(4-Methoxytrityl)amino-5'-desoxythymidinphosphoramidit, zwischen der PNA und dem 5'-Ende der DNA verwendet werden. Siehe z. B. Mag et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17:5973-5988. PNA-Monomere werden dann schrittweise gekoppelt, um ein chimäres Molekül mit einem 5'-PNA-Segment und einem 3'-DNA-Segment zu produzieren. Siehe z. B. Finn et al., 1996, oben. Alternativ können chimäre Moleküle mit einem 5'-DNA-Segment und einem 3'-PNA-Segment synthetisiert werden. Siehe z. B. Petersen et al., 1975, Bioorg. Med. Chem. Lett. 5:1119-11124.
In anderen Ausführungsformen kann das Oligonukleotid andere angehängte Gruppen wie Peptide (z. B. zum Targetieren von Wirtszellrezeptoren in vivo) oder Agentien, die den Transport über die Zellmembran (siehe z. B. Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT-Veröffentlichung Nr. WO88/09810) oder die Blut-Hirn-Schranke (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO89/10134) erleichtern, beinhalten. Darüber hinaus können Oligonukleotide mit durch Hybridisierung ausgelösten Spaltungsagentien (siehe z. B. Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958-976) oder interkalierenden Agentien (siehe z. B. Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549) modifiziert werden. Zu diesem Zweck kann das Oligonukleotid an ein anderes Molekül, z. B. ein Peptid, ein durch Hybridisierung ausgelöstes Vernetzungsmittel, ein TransportMittel, ein durch Hybridisierung ausgelöstes SpaltungsMittel und dergleichen, konjugiert werden.
4.3 WIRTE
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Wirtszellen, die gentechnisch verändert wurden, um die hierin offenbarten Polynukleotide zu enthalten. Zum Beispiel können solche Wirtszellen Nukleinsäuren der Erfindung enthalten, die in die Wirtszelle unter Anwendung bekannter Transformations-, Transfektions- oder Infektionsverfahren eingeführt wurden. Weiterhin werden Wirtszellen offenbart, die gentechnisch verändert wurden, um die offenbarten Polynukleotide zu exprimieren, wobei solche Polynukleotide in operativer Verbindung mit einer Regulationssequenz stehen, die zu der Wirtszelle heterolog ist und die Expression der Polynukleotide in der Zelle antreibt.
Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Wirtszelle, wie eine Säugetierzelle, eine niedere eukaryontische Wirtszelle, wie eine Hefezelle, sein oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle, wie eine Bakterienzelle, sein. Die Einführung des rekombinanten Konstrukts in die Wirtszelle kann mittels Kalziumphosphat-Transfektion, DEAE, dextranvermittelte Transfektion oder Elektroporation bewirkt werden (L. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)). Die Wirtszellen, die eines der Polynukleotide der Anmeldung enthalten, können auf herkömmliche Weisen verwendet werden, um das Genprodukt zu produzieren, das von dem isolierten Fragment kodiert wird (im Fall eines ORF), oder können dazu verwendet werden, ein heterologes Protein unter der Kontrolle des EMF zu produzieren.
Ein beliebiges Wirts-Nektor-System kann verwendet werden, um eines oder mehrere der hierin offenbarten ORFs zu exprimieren. Diese beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, eukaryontische Wirte, wie HeLa-Zellen, Cv-1-Zellen, COS-Zellen und Sf9-Zellen, sowie prokaryontische Wirte, wie E. coli und B. subtilis. Die am meisten bevorzugten Zellen sind diejenigen, die das bestimmte Polypeptid oder Protein normalerweise nicht exprimieren oder die das Polypeptid oder Protein in einem niedrigen natürlichen Niveau exprimieren. Reife Proteine können in Säugetierzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle von adäquaten Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls eingesetzt werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs, die von den hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet sind, zu produzieren. Adäquate Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden von Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor, New York (1989), beschrieben.
Verschiedene Säugetierzellkultursysteme können ebenfalls eingesetzt werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren. Beispiele von Säugetier-Expressionssystemen beinhalten die COS-7-Linien von Affennieren-Fibroblasten, von Gluzman, Cell 23:175 (1981), beschrieben, und andere Zelllinien, die einen kompatiblen Vektor exprimieren können, beispielsweise die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Säugetier-Expressionsvektoren werden einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und auch etwaige erforderliche Ribosombindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Donor- und Akzeptorspleißstellen, Transkriptionsterminationssequenzen und 5'-flankierende nichttranskribierte Sequenzen umfassen. DNA-Sequenzen, die von dem viralen SV40-Genom abgeleitet sind, beispielsweise SV40-Ursprungs-, -Early-Promotor-, -Enhancer-, -Spleiß- und -Polyadenylierungsstellen, können verwendet werden, um die erforderten nichttranskribierten genetischen Elemente bereitzustellen. Rekombinante Polypeptide und Proteine, die in Bakterienkultur produziert wurden, werden für gewöhnlich durch anfängliche Extraktion aus Zellpellets, gefolgt von einem oder mehreren Schritten der Aussalzung, des wässrigen Ionenaustauschs oder der Größenausschlusschromatographie isoliert. Proteinumfaltungsschritte können, falls erforderlich, beim Abschließen der Konstruktion des reifen Proteins verwendet werden. Schließlich kann Hochdruckflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC) für abschließende Reinigungsschritte eingesetzt werden. Mikrobielle Zellen, die bei der Expression von Proteinen eingesetzt werden, können mittels eines beliebigen zweckmäßigen Verfahrens gesprengt werden, einschließlich periodischem Einfrieren und Auftauen, Beschallung, mechanische Sprengung oder Verwendung von Zelllyseagentien.
Eine Reihe von Typen von Zellen kann als geeignete Wirtszellen zur Expression des Proteins fungieren. Säugetierwirtszellen beinhalten beispielsweise COS-Zellen vom Affen, CHO-Zellen (CHO = Chinese Hamster Ovary, Ovarien des chinesischen Hamsters), 293-Zellen aus der menschlichen Niere, A431-Zellen aus der menschlichen Epidermis, Colo205-Zellen vom Menschen, 3T3-Zellen, CV-1-Zellen, andere transformierte Zelllinien von Primaten, normale diploide Zellen, von einer In-vitro-Kultur von primärem Gewebe abgeleitete Zellstämme, primäre Explantate, HeLa-Zellen, L-Zellen von der Maus, BHK-, HL-60-, U937-, HaK- oder Jurkat-Zellen.
Alternativ kann es möglich sein, das Protein in niederen Eukaryonten wie Hefe oder in Prokaryonten wie Bakterien zu produzieren. Möglicherweise geeignete Hefestämme beinhalten Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces-Stämme, Candida oder ein beliebiger Hefestamm, der heterologe Proteine exprimieren kann. Möglicherweise geeignete Bakterienstämme beinhalten Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium oder ein beliebiger Bakterienstamm, der heterologe Proteine exprimieren kann. Wenn das Protein in Hefe oder Bakterien hergestellt wird, kann es erforderlich sein, das darin produzierte Protein zu modifizieren, beispielsweise mittels Phosphorylierung oder Glykosylierung der entsprechenden Stellen, um das funktionelle Protein zu erhalten. Solche kovalenten Anheftungen können unter Anwendung bekannter chemischer oder enzymatischer Verfahren bewirkt werden.
In einer anderen Ausführungsform können Zellen und Gewebe so konstruiert werden, dass sie ein endogenes Gen, das die offenbarten Polynukleotide umfasst, unter der Kontrolle induzierbarer regulatorischer Elemente exprimieren, wobei die Regulationssequenzen des endogenen Gens in diesem Fall mittels homologer Rekombination ersetzt werden können. Wie hierin beschrieben, kann Gen-Targetierung verwendet werden, um die existierende regulatorische Region eines Gens durch eine Regulationssequenz, die aus einem anderen Gen isoliert wurde, oder eine neuartige Regulationssequenz, die mittels Gentechnikverfahren synthetisiert wurde, zu ersetzen. Solche Regulationssequenzen können sich aus Promotoren, Enhancern, Scaffold-Anheftungsregionen, negativen regulatorischen Elementen, Transkriptionsinitiationsorten, regulatorischen Proteinbindungsstellen oder Kombinationen der Sequenzen zusammensetzen. Alternativ können Sequenzen, die die Struktur oder Stabilität der RNA oder des produzierten Proteins beeinträchtigen, ersetzt, entfernt, hinzugefügt oder anderweitig mittels Targetierung modifiziert werden, einschließlich Polyadenylierungssignalen, mRNA-Stabilitätselementen, Spleißstellen, Leader-Sequenzen zum Verstärken oder Modifizieren der Transport- oder Sekretionseigenschaften des Proteins oder anderer Sequenzen, die die Funktion oder Stabilität von Protein oder RNA-Molekülen verändern oder verbessern.
Das Targetierungsereignis kann eine einfache Insertion der Regulationssequenz sein, wobei das Gen unter die Kontrolle der neuen Regulationssequenz gestellt wird, wobei z. B. ein neuer Promotor oder Enhancer oder beide stromaufwärts von einem Gen inseriert wird. Alternativ kann das Targetierungsereignis eine einfache Deletion eines regulatorischen Elements sein, wie die Deletion eines gewebespezifischen negativen regulatorischen Elements. Alternativ kann das Targetierungsereignis ein existierendes Element ersetzen; zum Beispiel kann ein gewebespezifischer Enhancer durch einen Enhancer ersetzt werden, der eine breitere oder andere Zelltypenspezifität als die natürlich vorkommenden Elemente aufweist. Hierbei werden die natürlich vorkommenden Sequenzen deletiert und neue Sequenzen hinzugefügt. In allen Fällen kann die Identifizierung des Targetierungsereignisses durch die Verwendung eines oder mehrerer selektierbarer Markergene, die mit der targetierenden DNA zusammenhängend sind, vereinfacht werden, was die Selektion von Zellen ermöglicht, in denen sich die exogene DNA in das Wirtszellgenom integriert hat. Die Identifizierung des Targetierungsereignisses kann auch durch die Verwendung eines oder mehrerer Markergene, die die Eigenschaft der negativen Selektion aufweisen, vereinfacht werden, so dass der negativ selektierbare Marker an die exogene DNA gekoppelt, jedoch derart konfiguriert ist, dass der negativ selektierbare Marker die targetierende Sequenz flankiert und dass ein Ereignis einer korrekten homologen Rekombination mit Sequenzen in dem Wirtszellgenom nicht in der stabilen Integration des negativ selektierbaren Markers resultiert. Marker, die für diesen Zweck geeignet sind, beinhalten das Thymidinkinasegen (TK-Gen) vom Herpes-simplex-Virus oder das bakterielle Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase-Gen (gpt-Gen).
Die Gen-Targetierungs- oder Genaktivierungstechniken, die gemäß diesem Gesichtspunkt der Offenbarung verwendet werden können, sind genauer in der US-Patentschrift Nr. 5,272,071 an Chappel; der US-Patentschrift Nr. 5,578,461 an Sherwin et al.; der internationalen Anmeldung Nr. PCT/US92/09627 (WO93/09222) von Selden et al. und der internationalen Anmeldung Nr. PCT/LTS90/06436 (WO91/06667) von Skoultchi et al. beschrieben.
4.3.1 CHIMÄRE PROTEINE UND FUSIONSPROTEINE
Hierin werden Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche chimäre Proteine oder Fusionsproteine offenbart. Wie hierin verwendet, umfasst ein Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches „chimäres Protein" oder „Fusionsprotein" ein Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Polypeptid, das operativ an ein Nicht-Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Polypeptid gekoppelt ist. Ein „Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Polypeptid" bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die einem Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Protein entspricht, wohingegen ein „Nicht-Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Polypeptid" sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bezieht, die einem Protein entspricht, das nicht im Wesentlichen homolog zu dem Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Protein ist, z. B. ein Protein, das sich von dem Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Protein unterscheidet und das von demselben oder einem anderen Organismus abgeleitet ist. In einem Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Protein kann das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptid dem gesamten oder einem Teil eines Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Proteins entsprechen. In einer Ausführungsform umfasst ein Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Fusionsprotein mindestens einen biologisch aktiven Teil eines Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Proteins. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Fusionsprotein mindestens zwei biologisch aktive Teile eines Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Proteins. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst ein Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Fusionsprotein mindestens drei biologisch aktive Teile eines Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Proteins. In dem Fusionsprotein soll der Ausdruck „operativ gekoppelt" anzeigen, dass das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptid und das Nicht-Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptid „in-frame" (im Raster) miteinander fusioniert sind. Das Nicht-Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptid kann an den N-Terminus oder den C-Terminus des Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptids fusioniert sein.
In einer Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein GST-Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Fusionsprotein, in dem die Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Sequenzen an den C-Terminus der GST-Sequenzen (GST = Glutathion-S-Transferase) fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Reinigung von rekombinanten Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptiden erleichtern.
In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Protein, das eine heterologe Signalsequenz an seinem N-Terminus enthält. In bestimmten Wirtszellen (z. B. Säugetierwirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Substanzen durch Verwendung einer heterologen Signalsequenz erhöht werden.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Immunglobulin-Fusionsprotein, in dem die Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Sequenzen an Sequenzen fusioniert sind, die von einem Mitglied der Immunglobulin-Proteinfamilie abgeleitet wurden. Die hierin offenbarten Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Immunglobulin-Fusionsproteine können in pharmazeutische Zusammensetzungen eingebunden und an einen Patienten verabreicht werden, um eine Interaktion zwischen einem Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Liganden und einem Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Protein auf der Oberfläche einer Zelle zu inhibieren, um dadurch von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Substanzen vermittelte Signaltransduktion in vivo zu unterdrücken. Die Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Immunglobulin-Fusionsproteine können dazu verwendet werden, die Bioverfügbarkeit eines Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen zugehörigen Liganden zu beeinflussen. Die Inhibition des Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Liganden/der Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Interaktion kann therapeutisch sowohl für die Behandlung von proliferativen und differentiativen Störungen als auch zum Modulieren (z. B. Fördern oder Inhibieren) des Zellüberlebens von Nutzen sein. Darüber hinaus können die hierin offenbarten Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Immunglobulin-Fusionsproteine als Immunogene verwendet werden, um Anti-Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Antikörper in einem Patienten zu produzieren, um Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Liganden zu reinigen und in Screening-Assays, um Moleküle zu identifizieren, die die Interaktion von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Substanzen mit einem Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Liganden inhibieren.
Ein hierin offenbartes Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches chimäres Protein oder Fusionsprotein kann mittels standardmäßiger rekombinanter DNA-Techniken produziert werden. Zum Beispiel werden DNA-Fragmente, die für die verschiedenen Polypeptidsequenzen kodieren, zusammen gemäß herkömmlichen Techniken in-frame ligiert, z. B. durch Einsetzen von Termini mit abgestumpften Enden oder gestaffelten Enden zur Ligierung, Restriktionsenzymverdau, um adäquate Termini bereitzustellen, Auffüllen von kohäsiven Enden, soweit erforderlich, Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um unerwünschte Bindungen zu vermeiden, und enzymatische Ligierung. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen mittels herkömmlicher Techniken, einschließlich DNA-Syntheseautomaten, synthetisiert werden. Alternativ kann eine PCR-Amplifikation von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern durchgeführt werden, die komplementäre Überhänge zwischen zwei aufeinander folgenden Genfragmenten zur Folge haben, die anschließend angelagert und reamplifiziert werden können, um eine chimäre Gensequenz zu produzieren (siehe z. B. Ausubel et al. (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Darüber hinaus sind viele Expressionsvektoren im Handel erhältlich, die bereits einen Fusionsanteil (z. B. ein GST-Polypeptid) kodieren. Eine Nukleinsäure, die Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Substanz kodiert, kann in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, so dass der Fusionsanteil in-frame an das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Protein gekoppelt wird.
4.4 POLYPEPTIDE
Die hierin offenbarten isolierten Polypeptide beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, ein Polypeptid, umfassend: die Aminosäuresequenz, die als eine beliebige Sequenz der SEQ ID Nr. 23, 25, 28, 30-32, 34 oder 35 dargelegt ist, oder eine Aminosäuresequenz, die von einer beliebigen der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 oder dem entsprechende vollständigen oder reifen Protein kodiert wird. Hierin offenbarte Polypeptide beinhalten außerdem Polypeptide, vorzugsweise mit biologischer oder immunologischer Aktivität, die von: (a) einem Polynukleotid mit einer beliebigen der in SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 dargelegten Nukleotidsequenzen oder (b) Polynukleotiden, die eine beliebige der als SEQ ID Nr. 23, 25, 28, 30-32, 34 oder 35 dargelegten Aminosäuresequenzen kodieren, oder (c) Polynukleotiden, die an das Komplement der Polynukleotide von entweder (a) oder (b) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, kodiert werden. Außerdem werden biologisch aktive oder immunologisch aktive Varianten einer beliebigen der als SEQ ID Nr. 23, 25, 28, 30-32, 34 oder 35 dargelegten Aminosäuresequenzen oder des entsprechenden vollständigen oder reifen Proteins und „substantielle Äquivalente" davon (z. B. mit mindestens etwa 65 %, mindestens etwa 70 %, mindestens etwa 75 %, mindestens etwa 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % oder 89 %, typischer mindestens etwa 90 %, 91 %, 92 %, 93 % oder 94 % oder noch typischer mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 %, am typischsten mindestens etwa 99 % Aminosäurenidentität), die die biologische Aktivität bewahren, offenbart.
Polypeptide, die von Allelvarianten kodiert werden, können im Vergleich zu Polypeptiden, die SEQ ID Nr. 23, 25, 28, 30-32, 34 oder 35 umfassen, eine ähnliche, erhöhte oder verminderte Aktivität aufweisen.
Fragmente der hierin offenbarten Proteine, die biologische Aktivität aufweisen können, sind ebenfalls vorgesehen. Fragmente des Proteins können in linearer Form sein oder sie können unter Anwendung bekannter Verfahren zyklisiert werden, beispielsweise wie in H.U. Saragovi et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992), und in R.S. McDowell et al., J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992), beschrieben. Solche Fragmente können für viele Zwecke an Trägermoleküle wie Immunglobuline fusioniert sein, darunter das Erhöhen der Valenz von Proteinbindungsstellen.
Sowohl vollständige als auch reife Formen (beispielsweise ohne eine Signalsequenz oder Vorläufersequenz) der offenbarten Proteine werden beschrieben. Die proteinkodierende Sequenz wird in der Sequenzauflistung durch Translation der offenbarten Nukleotidsequenzen identifiziert. Die reife Form eines solchen Proteins kann mittels Expression eines vollständigen Polynukleotids in einer geeigneten Säugetierzelle oder anderen Wirtszelle erhalten werden. Die Sequenz der reifen Form des Proteins kann auch aus der Aminosäuresequenz der vollständigen Form bestimmt werden. Wo die Proteine membrangebunden sind, werden auch lösliche Formen der Proteine offenbart. In solchen Formen werden ein Teil der oder alle Regionen, die bewirken, dass die Proteine membrangebunden sind, deletiert, so dass die Proteine vollständig aus der Zelle, in der sie exprimiert werden, sezerniert werden.
Hierin offenbarte Proteinzusammensetzungen können weiterhin eine unbedenkliche Trägersubstanz, wie eine hydrophile, z. B. pharmazeutisch unbedenkliche Trägersubstanz umfassen.
Weiterhin werden Polypeptide offenbart, die von den hierin offenbarten Nukleinsäurefragmenten oder von degenerierten Varianten der hierin offenbarten Nukleinsäurefragmente kodiert werden. Mit „degenerierte Variante" sind Nukleotidfragmente beabsichtigt, die sich von einem hierin offenbarten Nukleinsäurefragment (z. B. einem ORF) durch eine Nukleotidsequenz unterscheiden, aufgrund der Degeneration des genetischen Codes jedoch eine identische Polypeptidsequenz kodieren. Bevorzugte Nukleinsäurefragmente sind die ORFs, die Proteine kodieren.
Eine Vielfalt von in der Technik bekannten Methoden können genutzt werden, um ein beliebiges der hierin offenbarten isolierten Polypeptide oder Proteine zu erhalten. Auf dem einfachsten Niveau kann die Aminosäuresequenz unter Verwendung im Handel erhältlicher Peptidsynthesizer synthetisiert werden. Die synthetisch konstruierten Proteinsequenzen können, da sie primäre, sekundäre oder tertiäre Struktur- und/oder Konformationscharakteristika mit Proteinen gemein haben, biologische Eigenschaften mit diesen gemein haben, einschließlich Proteinaktivität. Diese Technik ist insbesondere beim Produzieren kleiner Peptide und Fragmente größerer Polypeptide nützlich. Fragmente sind beispielsweise beim Erzeugen von Antikörpern gegen das native Polypeptid von Nutzen. Daher können sie beim Screenen von therapeutischen Verbindungen und bei immunologischen Prozessen zur Entwicklung von Antikörpern als biologisch aktive oder immunologische Austauschstoffe für natürliche, gereinigte Proteine eingesetzt werden.
Die hierin offenbarten Polypeptide und Proteine können alternativ aus Zellen gereinigt werden, die geändert wurden, um das gewünschte Polypeptid oder Protein zu exprimieren. Wie hierin verwendet, wird von einer Zelle gesagt, dass sie geändert wurde, um ein gewünschtes Polypeptid oder Protein zu exprimieren, wenn die Zelle durch Genmanipulation dazu gebracht wird, ein Polypeptid oder Protein zu produzieren, das sie normalerweise nicht produziert oder das die Zellen normalerweise in einer geringeren Konzentration produziert. Ein Fachmann kann Vorgehensweisen zum Einführen und Exprimieren von entweder rekombinanten oder synthetischen Sequenzen in eukaryontische oder prokaryontische Zellen leicht adaptieren, um eine Zelle zu erzeugen, die eines der hierin offenbarten Polypeptide oder Proteine produziert.
Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zum Produzieren eines Polypeptids, das das Wachsen einer Kultur von Wirtszellen in einem geeigneten Kulturmedium und das Reinigen des Proteins aus den Zellen oder der Kultur, in der die Zellen gewachsen werden, umfasst. Zum Beispiel beinhalten die offenbarten Verfahren einen Vorgang zum Produzieren eines Polypeptids, wobei eine Wirtszelle, die einen geeigneten Expressionsvektor enthält, der ein offenbartes Polynukleotid beinhaltet, unter Bedingungen kultiviert wird, die die Expression des kodierten Polypeptids ermöglichen. Das Polypeptid kann aus der Kultur, in geeigneter Weise aus dem Kulturmedium, oder aus einem Lysat, das aus den Wirtszellen hergestellt wurde, gewonnen und weiter gereinigt werden.
Bevorzugte Ausführungsform beinhalten jene, in denen das mittels eines solchen Vorgangs produzierte Protein eine vollständige oder reife Form des Proteins ist.
In einem alternativen Verfahren wird das Polypeptid oder Protein aus Bakterienzellen gereinigt, die das Polypeptid oder Protein auf natürliche Weise produzieren. Ein Fachmann kann leicht bekannte Verfahren zum Isolieren von Polypeptiden oder Proteinen befolgen, um eines der hierin offenbarten Polypeptide oder Proteine zu erhalten. Diese beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Immunchromatographie, HPLC, Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Immunaffinitätschromatographie. Siehe z. B. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag (1994); Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Polypeptidfragmente, die die biologische/immunologische Aktivität bewahren, beinhalten Fragmente, die mehr als etwa 100 Aminosäuren oder mehr als etwa 200 Aminosäuren umfassen, und Fragmente, die spezifische Proteindomänen kodieren.
Die gereinigten Polypeptide können in In-vitro-Bindungsassays verwendet werden, die in der Technik wohl bekannt sind, um Moleküle zu identifizieren, die an die Polypeptide binden. Diese Moleküle beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, z. B. Kleinmoleküle, Moleküle aus kombinatorischen Bibliotheken, Antikörper oder andere Proteine. Die in dem Bindungsassay identifizierten Moleküle werden dann auf Antagonisten- oder Agonistenaktivität in In-vivo-Gewebekultur oder Tiermodellen, die in der Technik wohl bekannt sind, geprüft. Kurz dargestellt, die Moleküle werden in mehrere Zellkulturen oder Tiere titriert und dann auf entweder Zelltod/Tod des Tiers oder längeres Überleben des Tiers/der Zellen geprüft.
Darüber hinaus können die offenbarten Peptide oder Moleküle, die an die Peptide binden können, mit Toxinen, z. B. Ricin oder Cholera, oder mit anderen Verbindungen, die für die Zellen toxisch sind, komplexiert werden. Der Komplex aus Toxin und bindendem Molekül wird dann mittels der Spezifität des bindenden Moleküls für SEQ ID Nr. 23, 25, 28, 30-32, 34 oder 35 auf einen Tumor oder eine andere Zelle gerichtet.
Das offenbarte Protein kann auch als ein Produkt transgener Tiere exprimiert werden, z. B. als ein Bestandteil der Milch von transgenen Kühen, Ziegen, Schweinen oder Schafen, die durch somatische oder Keimzellen gekennzeichnet sind, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die das Protein kodiert.
Die hierin offenbarten Proteine beinhalten außerdem Proteine, die durch Aminosäuresequenzen gekennzeichnet sind, die denen von gereinigten Proteinen ähnlich sind, in denen jedoch Modifikationen auf natürliche Weise bereitgestellt sind oder vorsätzlich konstruiert wurden. Zum Beispiel können Modifikationen in der Peptid- oder DNA-Sequenz vom Fachmann unter Anwendung bekannter Techniken durchgeführt werden. Modifikationen von Interesse in den Proteinsequenzen können die Veränderung, Substitution, Ersetzung, Insertion oder Deletion eines ausgewählten Aminosäurerests in der kodierenden Sequenz beinhalten. Zum Beispiel können ein oder mehrere der Cysteinreste deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, um die Konformation des Moleküls zu ändern. Techniken für eine solche Veränderung, Substitution, Ersetzung, Insertion oder Deletion sind dem Fachmann wohl bekannt (siehe z. B. US-Patentschrift Nr. 4,518,584). Vorzugsweise bewahrt eine solche Veränderung, Substitution, Ersetzung, Insertion oder Deletion die gewünschte Aktivität des Proteins. Regionen des Proteins, die für die Proteinfunktion wichtig sind, können mit verschiedenen in der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden, einschließlich des Alanin-Scanning-Verfahrens, das die systematische Substitution von einzelnen oder Reihen von Aminosäuren mit Alanin, gefolgt vom Prüfen der resultierenden Alanin enthaltenden Variante auf biologische Aktivität involvierte. Diese Analyseart bestimmt die Bedeutung der substituierten Aminosäure bzw. Aminosäuren bei der biologischen Aktivität. Regionen des Proteins, die für die Proteinfunktion wichtig sind, können mit dem Ematrix-Programm bestimmt werden.
Andere Fragmente und Derivate der Sequenzen von Proteinen, von denen erwartet werden würde, dass sie die Proteinaktivität vollständig oder zum Teil bewahren, und die für ein Screening oder andere immunologische Methoden geeignet sind, können angesichts der Offenbarungen hierin ebenfalls leicht vom Fachmann hergestellt werden. Solche Modifikationen bilden einen Teil dieser Offenbarung.
Das Protein kann auch produziert werden, indem das hierin beschriebene isolierte Polynukleotid operativ an geeignete Kontrollsequenzen in einem oder mehreren Insekten-Expressionsvektoren gekoppelt und ein Insekten-Expressionssystem eingesetzt wird. Materialien und Verfahren für Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssysteme sind in Kitform von z. B. Invitrogen, San Diego, Kalif., USA (das MaxBat^TM-Kit) im Handel erhältlich und solche Verfahren sind in der Technik wohl bekannt, wie in Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987), beschrieben. Wie hierin verwendet, wird eine Insektenzelle, die ein offenbartes Polynukleotid exprimieren kann, „transformiert".
Das offenbarte Protein kann hergestellt werden, indem transformierte Wirtszellen unter Kulturbedingungen kultiviert werden, die dazu geeignet sind, das rekombinante Protein zu exprimieren. Das resultierende exprimierte Protein kann dann aus einer solchen Kultur (d. h. aus Kulturmedium oder Zellextrakten) unter Anwendung bekannter Reinigungsprozesse, wie Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie, gereinigt werden. Die Reinigung des Proteins kann auch eine Affinitätssäule, die Agentien enthält, die an das Protein binden werden; ein oder mehrere Säulenschritte über solche Affinitätsharze wie Concanavalin A/Agarose, Heparin/Toyopearl^TM oder Cibacrom blue/3GA-Sepharose^TM; ein oder mehrere Schritte, die hydrophobe Interaktionschromatographie unter Verwendung von solchen Harzen wie Phenylether, Butylether oder Propylether einbinden; oder Immunaffinitätschromatographie beinhalten.
Alternativ kann das Protein auch in einer Form exprimiert werden, die die Reinigung erleichtern wird. Zum Beispiel kann es als ein Fusionsprotein, wie die von Maltose-Bindungsprotein (MBP), Glutathion-S-Transferase (GST) oder Thioredoxin (TRX), oder als ein His-Tag exprimiert werden. Kits zur Expression und Reinigung solcher Fusionsproteine sind von New England BioLab (Beverly, Mass., USA), Pharmacia (Piscataway, N.J., USA) bzw. Invitrogen im Handel erhältlich. Das Protein kann auch mit einem Epitop markiert und anschließend unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers, der auf ein solches Epitop gerichtet ist, gereinigt werden. Ein derartiges Epitop („FLAG^®") ist von Kodak (New Haven, Conn., USA) im Handel erhältlich.
Schließlich können ein oder mehrere RP-HPLC-Schritte (RP-HPLC = reverse-phase high performance liquid chromatography, Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie), die hydrophobe RP-HPLC-Medien, z. B. Kieselgel mit Methyl- oder anderen aliphatischen Seitengruppen, einsetzen, angewendet werden, um das Protein weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorstehenden Reinigungsschritte, in verschiedenen Kombinationen, können auch dazu eingesetzt werden, ein im Wesentlichen homogenes isoliertes rekombinantes Protein bereitzustellen. Das somit gereinigte Protein ist im Wesentlichen frei von anderen Säugetierproteinen und ist gemäß der vorliegenden Offenbarung als ein „isoliertes Protein" definiert.
Die hierin offenbarten Polypeptide beinhalten Analoga (Varianten). Die offenbarten Polypeptide beinhalten Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Analoga. Dies umspannt Fragmente von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichem Polypeptid als auch Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptide, die eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, inseriert oder substituiert umfassen. Außerdem umspannen Analoga des Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptids Fusionen der Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptide oder Modifikationen der Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptide, wobei das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptid oder Analogon an einen anderen Anteil oder andere Anteile, z. B. Targetierungsanteil, oder ein anderes Therapeutikum fusioniert ist. Solche Analoga können verbesserte Eigenschaften, wie Aktivität und/oder Stabilität, aufweisen. Beispiele von Anteilen, die an das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptid oder ein Analogon fusioniert sind, beinhalten beispielsweise Targetierungsanteile, die für die Abgabe von Polypeptid an Neuronen sorgen, z. B. Antikörper an das Zentralnervensystem oder Antikörper an den Rezeptor und Liganden, die auf Nervenzellen exprimiert werden. Andere Anteile, die an Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Polypeptid fusioniert sein können, beinhalten Therapeutika, die für die Behandlung verwendet werden, beispielsweise Antidepressiva oder andere Medikationen für neurologische Störungen. Außerdem können Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptide an Nervenzellwachstumsmodulatoren und andere Chemokine zur targetierten Abgabe fusioniert sein.
4.4.1 BESTIMMEN VON POLYPEPTID- UND POLYNUKLEOTIDIDENTITÄT UND -ÄHNLICHKEIT
Eine bevorzugte Identität und/oder Ähnlichkeit sind so entworfen, dass sie die größte Übereinstimmung zwischen den geprüften Sequenzen ergeben. Verfahren zum Bestimmen der Identität und Ähnlichkeit sind in Computerprogrammen kodifiziert, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, des GCG-Programmpakets, einschließlich GAP (J. Devereux et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, USA), BLASTP, BLASTN, BLASTX, FASTA (S.F. Altschul et al., J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990), PSI-BLAST (S.F. Altschul et al., Nucleic Acids Res. Bd. 25, S. 3389-3402), der eMatrix-Software (Wu et al., J. Comp. Biol., Bd. 6, S. 219-235 (1999)), eMotif-Software (Nevill-Manning et al., ISMB-97, Bd. 4, S. 202-209), der GeneAtlas-Software (Molecular Simulations Inc. (MSI), San Diego, CA, USA) (Sanchez und Sali, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 13597-13602; DH Kitson et al., (2000) „Remote homology detection using structural modeling – an evaluation", übermittelt: Fischer und Eisenberg, (1996) Protein Sci. 5, 947-955) und des Kyte-Doolittle-Hydrophobievorausssagealgorithmus (J. Mol. Biol. 157, S. 105-131 (1982). Die BLAST-Programme sind vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) und anderen Quellen (BLAST Manual, S. Altschul et al., NCB NLM NIH Bethesda, MD 20894, USA; S. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) öffentlich zugänglich.
4.5 GENTHERAPIE
Mutationen im Gen der offenbarten Polynukleotide können in einem Verlust der normalen Funktion des kodierten Proteins resultieren. Gentherapie kann angewendet werden, um die normale Aktivität der Polypeptide wiederherzustellen oder um Erkrankungszustände zu behandeln, wobei die hierin offenbarten Polypeptide beteiligt sind. Die Abgabe eines funktionellen Gens, das die offenbarten Polypeptide kodiert, an adäquate Zellen wird ex vivo, in situ oder in vivo durch Verwendung von Vektoren und insbesondere viralen Vektoren (z. B. Adenovirus, adenoassoziierter Virus oder ein Retrovirus) oder ex vivo durch Anwendung von physikalischen DNA-Transferverfahren (z. B. Liposomen oder chemischen Behandlungen) bewirkt. Siehe beispielsweise Anderson, Nature, Ergänzung zu Bd. 392, Nr. 6679, S. 25-20 (1998). Zwecks weiterer Überblicke über die Gentherapietechnologie siehe Friedman, Science, 244:1275-1281 (1989); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); und Miller, Nature, 357:455-460 (1992). Die Einführung eines beliebigen der offenbarten Nukleotide oder eines Gens, das die offenbarten Polypeptide kodiert, kann mit extrachromosomalen Substraten (vorübergehende Expression) oder künstlichen Chromosomen (stabile Expression) durchgeführt werden. Zellen können auch ex vivo in Gegenwart von Proteinen der vorliegenden Anmeldung kultiviert werden, um solche Zellen zu proliferieren oder einen gewünschten Effekt auf diese oder eine gewünschte Aktivität in diesen herbeizuführen. Behandelte Zellen können dann in vivo zu therapeutischen Zwecken eingeführt werden. Alternativ ist vorgesehen, dass in anderen Zuständen einer Erkrankung eines Menschen das Verhindern der Expression oder das Inhibieren der Aktivität von hierin offenbarten Polypeptiden beim Behandeln der Krankheitszustände von Nutzen sein wird. Es ist vorgesehen, dass Antisense-Therapie oder Gentherapie angewendet werden könnte, um die Expression der offenbarten Polypeptide negativ zu regulieren.
Andere Verfahren, die die Expression eines Proteins inhibieren, beinhalten die Einführung von Antisense-Molekülen zu den offenbarten Nukleinsäuren, deren Komplementen oder deren translatierten RNA-Sequenzen mittels in der Technik bekannten Verfahren. Des Weiteren können die offenbarten Polypeptide inhibiert werden, indem Verfahren mit targetierter Deletion oder die Insertion eines negativen regulatorischen Elements wie eines Silencers, das gewebespezifisch ist, angewendet werden bzw. wird.
Des Weiteren werden Wirtszellen offenbart, die in vivo gentechnisch verändert wurden, um die offenbarten Polynukleotide zu exprimieren, wobei solche Polynukleotide in operativer Verbindung mit einer Regulationssequenz stehen, die zu der Wirtszelle heterolog ist und die Expression der Polynukleotide in der Zelle antreibt. Diese Verfahren können verwendet werden, um die Expression der offenbarten Polynukleotide zu erhöhen oder zu vermindern.
Eine Kenntnis der hierin offenbarten DNA-Sequenzen ermöglicht eine Modifikation von Zellen, um eine Expression des endogenen Polypeptids zu ermöglichen, zu erhöhen oder zu vermindern. Zellen können modifiziert werden (z. B. mittels homologer Rekombination), um für eine erhöhte Polypeptidexpression zu sorgen, indem der natürlich vorkommende Promotor vollständig oder zum Teil durch den gesamten oder einen Teil eines heterologen Promotors ersetzt wird, so dass die Zellen das Protein in höheren Niveaus exprimieren. Der heterologe Promotor wird derart inseriert, dass er operativ an die gewünschten proteinkodierenden Sequenzen gekoppelt wird. Siehe beispielsweise die internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 94/12650, die internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 92/20808 und die internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 91/09955. Es ist außerdem vorgesehen, dass neben der heterologen Promotor-DNA amplifizierbare Marker-DNA (z. B. ada, dhfr und das multifunktionelle CAD-Gen, das Carbamylphosphatsynthase, Aspartattranscarbamylase und Dihydroorotase kodiert) und/oder Intron-DNA zusammen mit der heterologen Promotor-DNA inseriert werden kann. Wenn sie an die gewünschte proteinkodierende Sequenz gekoppelt ist, resultiert die Amplifikation der Marker-DNA mittels Standardselektionsverfahren in der Koamplifikation der gewünschten proteinkodierenden Sequenzen in den Zellen.
In einer anderen Ausführungsform können Zellen und Gewebe so konstuiert werden, dass sie ein endogenes Gen, das die offenbarten Polynukleotide umfasst, unter der Kontrolle induzierbarer regulatorischer Elemente exprimieren, wobei die Regulationssequenzen des endogenen Gens in diesem Fall mittels homologer Rekombination ersetzt werden können. Wie hierin beschrieben, kann Gen-Targetierung verwendet werden, um die existierende regulatorische Region eines Gens durch eine Regulationssequenz, die aus einem anderen Gen isoliert wurde, oder eine neuartige Regulationssequenz, die mittels Gentechnikverfahren synthetisiert wurde, zu ersetzen. Solche Regulationssequenzen können sich aus Promotoren, Enhancern, Scaffold-Anheftungsregionen, negativen regulatorischen Elementen, Transkriptionsinitiationsorten, regulatorischen Proteinbindungsstellen oder Kombinationen der Sequenzen zusammensetzen. Alternativ können Sequenzen, die die Struktur oder Stabilität der RNA oder des produzierten Proteins beeinträchtigen, ersetzt, entfernt, hinzugefügt oder anderweitig mittels Targetierung modifiziert werden. Diese Sequenzen beinhalten Polyadenylierungssignale, mRNA-Stabilitätselemente, Spleißstellen, Leader-Sequenzen zum Verstärken oder Modifizieren der Transport- oder Sekretionseigenschaften des Proteins oder andere Sequenzen, die die Funktion oder Stabilität von Protein oder RNA-Molekülen verändern oder verbessern.
Das Targetierungsereignis kann eine einfache Insertion der Regulationssequenz sein, wobei das Gen unter die Kontrolle der neuen Regulationssequenz gestellt wird, wobei z. B. ein neuer Promotor oder Enhancer oder beide stromaufwärts von einem Gen inseriert wird. Alternativ kann das Targetierungsereignis eine einfache Deletion eines regulatorischen Elements sein, wie die Deletion eines gewebespezifischen negativen regulatorischen Elements. Alternativ kann das Targetierungsereignis ein existierendes Element ersetzen; zum Beispiel kann ein gewebespezifischer Enhancer durch einen Enhancer ersetzt werden, der eine breitere oder andere Zelltypenspezifität als die natürlich vorkommenden Elemente aufweist. Hierbei werden die natürlich vorkommenden Sequenzen deletiert und neue Sequenzen hinzugefügt. In allen Fällen kann die Identifizierung des Targetierungsereignisses durch die Verwendung eines oder mehrerer selektierbarer Markergene, die mit der targetierenden DNA zusammenhängend sind, vereinfacht werden, was die Selektion von Zellen ermöglicht, in denen sich die exogene DNA in das Zellgenom integriert hat. Die Identifizierung des Targetierungsereignisses kann auch durch die Verwendung eines oder mehrerer Markergene, die die Eigenschaft der negativen Selektion aufweisen, vereinfacht werden, so dass der negativ selektierbare Marker an die exogene DNA gekoppelt, jedoch derart konfiguriert ist, dass der negativ selektierbare Marker die targetierende Sequenz flankiert und dass ein Ereignis einer korrekten homologen Rekombination mit Sequenzen in dem Wirtszellgenom nicht in der stabilen Integration des negativ selektierbaren Markers resultiert. Marker, die für diesen Zweck geeignet sind, beinhalten das Thymidinkinasegen (TK-Gen) vom Herpes-simplex-Virus oder das bakterielle Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase-Gen (gpt-Gen).
Die Gen-Targetierungs- oder Genaktivierungstechniken, die gemäß diesem Gesichtspunkt der Offenbarung verwendet werden können, sind genauer in der US-Patentschrift Nr. 5,272,071 an Chappel; der US-Patentschrift Nr. 5,578,461 an Sherwin et al.; der internationalen Anmeldung Nr. PCT/LTS92/09627 (WO93/09222) von Selden et al. und der internationalen Anmeldung Nr. PCT/L1S90/06436 (WO91/06667) von Skoultchi et al. beschrieben.
4.6 TRANSGENE TIERE
In bevorzugten Verfahren zum Bestimmen biologischer Funktionen der offenbarten Polypeptide in vivo werden ein oder mehrere hierin offenbarte Gene entweder überexprimiert oder in der Keimbahn von Tieren unter Anwendung homologer Rekombination inaktiviert [Capecchi, Science, 244:1288-1292 (1989)]. Tiere, in denen das Gen unter der regulatorischen Kontrolle von exogenen oder endogenen Promotorelementen überexprimiert wird, sind als transgene Tiere bekannt. Tiere, in denen ein endogenes Gen mittels homologer Rekombination inaktiviert wurde, werden als „Knockout"-Tiere bezeichnet. Knockout-Tiere, vorzugsweise nicht menschliche Säugetiere, können wie in der US-Patentschrift Nr. 5,557,032 beschrieben hergestellt werden. Transgene Tiere sind zum Bestimmen der Rollen, die Polypeptide in biologischen Prozessen und vorzugsweise in Krankheitszuständen spielen, von Nutzen. Transgene Tiere sind als Modellsysteme zum Identifizieren von Verbindungen, die den Lipidstoffwechsel modulieren, geeignet. Transgene Tiere, vorzugsweise nicht menschliche Säugetiere, werden unter Anwendung von in der US-Patentschrift Nr. 5,489,743 und der PCT-Veröffentlichung Nr. WO94/28122 beschriebenen Verfahren produziert.
Es können transgene Tiere hergestellt werden, wobei der gesamte oder ein Teil eines Promotors der Polynukleotide entweder aktiviert oder inaktiviert wird, um das Niveau der Expression der Polypeptide zu ändern. Die Inaktivierung kann unter Anwendung von oben beschriebenen homologen Rekombinationsverfahren ausgeführt werden. Die Aktivierung kann erzielt werden, indem der homologe Promotor ergänzt oder sogar ersetzt wird, um für eine erhöhte Proteinexpression zu sorgen. Der homologe Promotor kann mittels Insertion eines oder mehrerer heterologer Enhancer-Elemente ergänzt werden, von denen bekannt ist, dass sie Promotoraktivierung in einem bestimmten Gewebe verleihen.
Die hierin offenbarten Polynukleotide machen außerdem die Entwicklung von Tieren durch z. B. homologe Rekombination oder Knockout-Strategien möglich, die dabei scheitern, funktionelles Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Polypeptid zu exprimieren, oder die eine Variante von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichem Polypeptid exprimieren. Solche Tiere sind als Modelle zum Untersuchen der In-vivo-Aktivitäten von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichem Polypeptid sowie zum Untersuchen von Modulatoren des Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptids geeignet.
In bevorzugten Verfahren zum Bestimmen biologischer Funktionen der offenbarten Polypeptide in vivo werden ein oder mehrere hierin offenbarte Gene entweder überexprimiert oder in der Keimbahn von Tieren unter Anwendung homologer Rekombination inaktiviert [Capecchi, Science, 244:1288-1292 (1989)]. Tiere, in denen das Gen unter der regulatorischen Kontrolle von exogenen oder endogenen Promotorelementen überexprimiert wird, sind als transgene Tiere bekannt. Tiere, in denen ein endogenes Gen mittels homologer Rekombination inaktiviert wurde, werden als „Knockout"-Tiere bezeichnet. Knockout-Tiere, vorzugsweise nicht menschliche Säugetiere, können wie in der US-Patentschrift Nr. 5,557,032 beschrieben hergestellt werden. Transgene Tiere sind zum Bestimmen der Rollen, die Polypeptide in biologischen Prozessen und vorzugsweise in Krankheitszuständen spielen, von Nutzen. Transgene Tiere sind als Modellsysteme zum Identifizieren von Verbindungen, die den Lipidstoffwechsel modulieren, geeignet. Transgene Tiere, vorzugsweise nicht menschliche Säugetiere, werden unter Anwendung von in der US-Patentschrift Nr. 5,489,743 und der PCT-Veröffentlichung Nr. WO94/28122 beschriebenen Verfahren produziert.
Es können transgene Tiere hergestellt werden, wobei der gesamte oder ein Teil des Promotors der Polynukleotide entweder aktiviert oder inaktiviert wird, um das Niveau der Expression der Polypeptide zu ändern. Die Inaktivierung kann unter Anwendung von oben beschriebenen homologen Rekombinationsverfahren ausgeführt werden. Die Aktivierung kann erzielt werden, indem der homologe Promotor ergänzt oder sogar ersetzt wird, um für eine erhöhte Proteinexpression zu sorgen. Der homologe Promotor kann mittels Insertion eines oder mehrerer heterologer Enhancer-Elemente ergänzt werden, von denen bekannt ist, dass sie Promotoraktivierung in einem bestimmten Gewebe verleihen.
4.7 VERWENDUNGSZWECKE UND BIOLOGISCHE AKTIVITÄT VON MENSCHLICHEM STAMMZELLWACHSTUMSFAKTOR-ÄHNLICHEM POLYPEPTID
Von den Polynukleotiden und Proteinen der vorliegenden Erfindung wird erwartet, dass sie einen oder mehrere der hierin identifizierten Verwendungszwecke oder eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten (einschließlich der mit hierin zitierten Assays verbundenen) aufweisen. Verwendungszwecke oder Aktivitäten, die für Proteine der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, können durch Verabreichung oder Verwendung solcher Proteine oder von Polynukleotiden, die solche Proteine kodieren, bereitgestellt werden (wie beispielsweise in Gentherapien oder Vektoren, die zur Einführung von DNA geeignet sind). Der dem bestimmten Zustand oder der bestimmten Pathologie zugrunde liegende Mechanismus wird vorschreiben, ob die Polypeptide, die Polynukleotide oder Modulatoren (Aktivatoren oder Inhibitoren) davon für den Patienten, der einer Behandlung bedarf, nutzbringend wären. Folglich beinhalten „therapeutische Zusammensetzungen" Zusammensetzungen, die isolierte Polynukleotide (einschließlich rekombinanter DNA-Moleküle, klonierter Gene und degenerierter Varianten davon) oder Polypeptide (einschließlich vollständigem Protein, reifem Protein und Verkürzungen oder Domänen davon) oder Verbindungen und andere Substanzen, die die Gesamtaktivität der Zielgenprodukte entweder auf dem Niveau der Zielgen-/Proteinexpression oder der Zielproteinaktivität modulieren, umfassen. Solche Modulatoren beinhalten Polypeptide, Analoga (Varianten), einschließlich Fragmenten und Fusionsproteinen, Antikörper und anderer Bindungsproteine; chemische Verbindungen, die die Polypeptide der Erfindung direkt oder indirekt aktivieren oder inhibieren (z. B. mittels Arzneimittel-Screening-Assays, wie hierin beschrieben, identifiziert); Antisense-Polynukleotide und Polynukleotide, die zur Tripelhelixbildung geeignet sind; und insbesondere Antikörper oder andere Bindungspartner, die ein oder mehrere Epitope der hierin offenbarten Polypeptide spezifisch erkennen.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können gleichfalls in die zelluläre Aktivierung oder in einen der anderen hierin beschriebenen physiologischen Stoffwechselwege eingebunden werden.
4.7.1 FORSCHUNGSVERWENDUNGSZWECKE UND -PROGRAMME
Die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Polynukleotide können von der Forschungsgemeinschaft zu verschiedenen Zwecken verwendet werden. Die Polynukleotide können dazu verwendet werden, rekombinantes Protein zur Analyse, Charakterisierung oder therapeutischen Verwendung zu exprimieren; als Marker für Gewebe, in denen das entsprechende Protein vorzugsweise exprimiert wird (entweder konstitutiv oder in einem bestimmten Stadium der Gewebedifferenzierung oder -entwicklung oder in Krankheitszuständen); als Molekulargewichtsmarker auf Gelen; als Chromosommarker oder -tags (falls markiert), um Chromosome zu identifizieren oder ähnliche Genpositionen zu kartieren; um sie mit endogenen DNA-Sequenzen in Patienten zu vergleichen, um potentielle genetische Störungen zu identifizieren; als Sonden, um neuartige, ähnliche DNA-Sequenzen zu hybridisieren und somit zu entdecken; als eine Informationsquelle, um PCR-Primer für genetisches Fingerprinting abzuleiten; als eine Sonde, um bekannte Sequenzen im Vorgang des Entdeckens anderer neuartiger Polynukleotide „abzuziehen"; um Oligomere zur Anheftung an einen „Genchip" oder anderen Träger, darunter zur Untersuchung von Expressionsmustern, auszuwählen und herzustellen; um Anti-Protein-Antikörper unter Anwendung von DNA-Immunisierungstechniken zu züchten und als ein Antigen, um Anti-DNA-Antikörper zu züchten oder eine andere Immunreaktion auszulösen. Wenn das Polynukleotid ein Protein kodiert, das an ein anderes Protein bindet oder potentiell an ein anderes Protein bindet (wie beispielsweise bei einer Interaktion von Rezeptor und Ligand), kann das Polynukleotid auch in Interaktions-Trap-Assays (wie beispielsweise in Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993), beschrieben) verwendet werden, um Polynukleotide zu identifizieren, die das andere Protein kodieren, mit dem eine Bindung erfolgt, oder um Inhibitoren der Bindungsinteraktion zu identifizieren.
Die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Polypeptide können in ähnlicher Weise in Assays zum Bestimmen der biologischen Aktivität verwendet werden, darunter in einem Panel mehrerer Proteine für ein Screening mit hohem Durchsatz; um Antikörper zu züchten oder eine andere Immunreaktion auszulösen; als ein ReMittel (einschließlich des markierten ReMittel) in Assays, die dazu entworfen sind, Konzentrationen des Proteins (oder von dessen Rezeptor) in biologischen Flüssigkeiten quantitativ zu bestimmen; als Marker für Gewebe, in denen das entsprechende Polypeptid vorzugsweise exprimiert wird (entweder konstitutiv oder in einem bestimmten Stadium der Gewebedifferenzierung oder -entwicklung oder in Krankheitszuständen); und natürlich um korrelierende Rezeptoren oder Liganden zu isolieren. Proteine, die in diesen Bindungsinteraktionen beteiligt sind, können auch dazu verwendet werden, auf Peptid- oder Kleinmolekülinhibitoren oder -agonisten der Bindungsinteraktion zu screenen.
Die Polypeptide der Erfindung sind auch zum Herstellen von Antikörpersubstanzen geeignet, die spezifisch mit Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Proteinen immunoreaktiv sind. Antikörper und Teile davon (z. B. Fab-Fragmente), die an die Polypeptide der Erfindung binden, können zum Identifizieren des Vorliegens solcher Polypeptide in einer Probe verwendet werden. Solche Bestimmungen werden unter Anwendung eines beliebigen geeigneten Immunoassayformats ausgeführt und ein beliebiges Polypeptid der Erfindung, das spezifisch von dem Antikörper gebunden wird, kann als eine Positivkontrolle eingesetzt werden.
Ein beliebiges oder alle dieser Forschungsprogramme können in analysenreinem oder Kitformat zur Vermarktung als Forschungsprodukte entwickelt werden.
Verfahren zum Durchführen der oben aufgeführten Verwendungszwecke sind dem Fachmann wohl bekannt. Referenzen, die solche Verfahren offenbaren, beinhalten ohne Einschränkung „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Hrsg. J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, 1989, und „Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Hrsg. S.L. Berger und A.R. Kimmel, 1987.
4.7.2 ERNÄHRUNGSVERWENDUNGSZWECKE
Polynukleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch als Nahrungsquellen oder Nahrungszusätze verwendet werden. Solche Verwendungszwecke beinhalten ohne Einschränkung die Verwendung als ein Protein- oder Aminosäurezusatz, die Verwendung als eine Kohlenstoffquelle, die Verwendung als eine Stickstoffquelle und die Verwendung als eine Kohlenhydratquelle. In derartigen Fällen kann das Polypeptid oder Polynukleotid der Erfindung der Nahrung eines bestimmten Organismus zugegeben werden oder kann als eine separate feste oder flüssiges Zubereitung verabreicht werden, wie in der Form von Pulver, Pillen, Lösungen, Suspensionen oder Kapseln. Im Fall von Mikroorganismen kann das Polypeptid oder Polynukleotid der Erfindung dem Medium zugesetzt werden, in oder auf dem der Mikroorganismus kultiviert wird.
Darüber hinaus können die Polypeptide der Erfindung als Marker und als ein Nahrungszusatz verwendet werden. Ein Polypeptid, das aus beispielsweise SEQ ID Nr. 34 besteht, hat in seinem unverarbeiteten und unglykosylierten Zustand eine Molekularmasse von ungefähr 50,2 kDa. Proteinnahrungszusätze sind wohl bekannt und die Formulierung geeigneter Nahrungszusätze, die Polypeptide der Erfindung enthalten, liegt innerhalb des Niveaus des fachmännischen Könnens in der Nahrungszubereitungstechnik.
4.7.3 ZYTOKIN- UND ZELLPROLIFERATIONS-/-DIFFERENZIERUNGS-AKTIVITÄT
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann eine Aktivität hinsichtlich Zytokin, Zellproliferation (entweder induzierend oder inhibierend) oder Zelldifferenzierung (entweder induzierend oder inhibierend) aufweisen oder kann die Produktion von anderen Zytokinen in bestimmten Zellpopulationen induzieren. Ein Polynukleotid der Erfindung kann ein Polypeptid kodieren, das solche Merkmale aufweist. Viele bis zum heutigen Tag entdeckte Proteinfaktoren, einschließlich aller bekannten Zytokine, haben in einem oder mehreren faktorabhängigen Zellproliferationsassays eine Aktivität aufgezeigt und daher dienen die Assays als eine praktische Bestätigung von Zytokinaktivität. Die Aktivität von hierin offenbarten therapeutischen Zusammensetzungen wird mit einem beliebigen einer Reihe von routinemäßigen faktorabhängigen Zellproliferationsassays für Zelllinien bewiesen, einschließlich, ohne Einschränkung, 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+(preB M+), 2E8, RBS, DA1, 123, T1165, HAT2, CTLL2, TF-1, Mo7e, CMK, HUVEC und Caco. Hierin offenbarte therapeutische Zusammensetzungen können in den folgenden Assays verwendet werden:
Assays auf T-Zell- oder Thymozytproliferation beinhalten ohne Einschränkung die in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verl. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Bertagnolli et al., I. Immunol. 149:3778-3783, 1992; Bowman et al., I. Immunol. 152:1756-1761, 1994, beschriebenen.
Assays auf Zytokinproduktion und/oder -proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten beinhalten ohne Einschränkung die in: Polyclonal T cell stimulation, A.M. Kruisbeek und E.M. Shevach in Current Protocols in Immunology, Hrsg. J.E. e.a. Coligan, Bd. 1, S. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto, 1994; und Measurement of mouse and human interleukin-γ, R.D. Schreiber in Current Protocols in Immunology, Hrsg. J.E. e.a. Coligan, Bd. 1, S. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto, 1994, beschriebenen.
Assays auf Proliferation und Differenzierung in hämopoetischen und lymphopoetischen Zellen beinhalten ohne Einschränkung die in: Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, K. Bottomly, L.S. Davis und P.E. Lipsky in Current Protocols in Immunology, Hrsg. J.E. e.a. Coligan, Bd. 1, S. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173:1205-1211, 1991; Moreau et al., Nature 336:690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6 – R. Nordan in Current Protocols in Immunology, Hrsg. J.E. Coligan, Bd. 1, S. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11 – F. Bennett, J. Giannotti, S.C. Clark und K.J. Turner in Current Protocols in Immunology, Hrsg. J.E. Coligan, Bd. 1, S. 6.15.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9 – A. Ciarletta, J. Giannotti, S.C. Clark und K.J. Turner in Current Protocols in Immunology, Hrsg. J.E. Coligan, Bd. 1, S. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991, beschriebenen.
Assays auf T-Zellklon-Reaktionen auf Antigene (die unter anderem Proteine, die Interaktionen von APC und T-Zellen als auch direkte T-Zellen-Effekte beeinflussen, durch Messen der Proliferation und Zytokinproduktion identifizieren werden) beinhalten ohne Einschränkung die in: Current Protocols in Immunology, von J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober herausgegeben, Verl. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Kapitel 6, Cytokines and their cellular receptors; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11:405-411, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988, beschriebenen.
4.7.4 STAMMZELLWACHSTUMSFAKTORAKTIVITÄT
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann Stammzellwachstumsfaktoraktivität aufweisen und an der Proliferation, der Differenzierung und dem Überleben von pluripotenten und totipotenten Stammzellen, einschließlich primordialer Keimzellen, embryonaler Stammzellen, hämopoetischer Stammzellen und/oder Keimbahnstammzellen, beteiligt sein. Eine Verabreichung des Polypeptids der Erfindung an Stammzellen in vivo oder ex vivo kann Zellpopulationen in einem totipotentiellen oder pluripotentiellen Zustand erhalten und erweitern, was zur Umkonstruktion von beschädigten oder kranken Geweben, Transplantation, Herstellung von Biopharmazeutika und Entwicklung von Biosensoren von Nutzen wäre. Die Möglichkeit, große Mengen menschlicher Zellen zu produzieren, hat bedeutende Arbeitsanwendungen für die Produktion von menschlichen Proteinen, die gegenwärtig von nicht menschlichen Quellen oder Spendern bezogen werden müssen, Implantation von Zellen, um Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und andere neurodegenerative Erkrankungen zu behandeln; Gewebe zur Transplantation, wie Knochenmark, Haut, Knorpel, Sehnen, Knochen, Muskel (einschließlich Herzmuskel), Blutgefäßen, Hornhaut, Nervenzellen, Zellen des Magen-Darm-Trakts und andere; und Organe zur Transplantation, wie Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse (einschließlich Inselzellen), Herz und Lunge.
Es ist vorgesehen, dass mehrere unterschiedliche exogene Wachstumsfaktoren und/oder Zytokine in Kombination mit dem Polypeptid der Erfindung verabreicht werden können, um die gewünschte Wirkung zu erzielen, einschließlich beliebiger der hierin aufgeführten Wachstumsfaktoren, anderer Stammzellerhaltungsfaktoren und insbesondere einschließlich Stammzellfaktor (stem cell factor, SCF), Leukämie inhibierender Faktor (LIF), Flt-3-Ligand (Flt-3L), eines beliebigen der Interleukine, rekombinantem löslichen IL-6-Rezeptor, der an IL-6 fusioniert ist, Makrophagen inflammatorischem Protein 1-alpha (MIP-1-alpha), G-CSF, GM-CSF, Thrombopoetin (TPO), Plättchenfaktor 4 (PF-4), aus Blutplättchen gewonnenem Wachstumsfaktor (platelet-derived growth factor, PDGF), Nervenwachstumsfaktoren und basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (basic fibroblast growth factor, BFGF).
Da totipotente Stammzellen praktisch jeglichen reifen Zelltyp zur Folge haben können, werden diese Zellen in Kultur die Produktion von großen Mengen reifer Zellen erleichtern. Techniken zum Kultivieren von Stammzellen sind in der Technik bekannt und von der Verabreichung von Polypeptiden der Erfindung, gegebenenfalls mit anderen Wachstumsfaktoren und/oder Zytokinen, wird erwartet, dass sie das Überleben und die Proliferation der Stammzellpopulationen verstärkt. Dies kann mittels direkter Verabreichung des Polypeptids der Erfindung an das Kulturmedium erreicht werden. Alternativ können Stromazellen, die mit einem Polynukleotid transfiziert sind, das für das Polypeptid der Erfindung kodiert, als eine Feeder-Schicht für die Stammzellpopulationen in Kultur oder in vivo verwendet werden. Stützzellen des Stromas für Feeder-Schichten können embryonale Knochenmarksfibroblasten, Knochenmarkstromazellen, fötale Leberzellen oder kultivierte embryonale Fibroblasten beinhalten (siehe US-Patentschrift Nr. 5,690,926).
Stammzellen selbst können mit einem Polynukleotid der Erfindung transfiziert werden, um eine autokrine Expression des Polypeptids der Erfindung zu induzieren. Dies wird die Erzeugung von undifferenzierten totipotentiellen/pluripotentiellen Stammzelllinien ermöglichen, die im Ist-Zustand nützlich sind oder die dann zu den gewünschten reifen Zelltypen differenziert werden können. Diese stabilen Zelllinien können auch als eine Quelle undifferenzierter totipotentieller/pluripotentieller mRNA dienen, um cDNA-Bibliotheken und Matrizen für Polymerase-Kettenreaktionsversuche zu erschaffen. Diese Studien würden die Isolierung und Identifizierung unterschiedlich exprimierter Gene in Stammzellpopulationen ermöglichen, die die Stammzellproliferation und/oder -erhaltung regulieren.
Die Erweiterung und die Erhaltung von totipotenten Stammzellpopulationen werden bei der Behandlung von vielen pathologischen Zuständen von Nutzen sein. Zum Beispiel können Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Stammzellen in Kultur zu manipulieren, was Sinnesepithelzellen zur Folge hat, die dazu verwendet werden können, durch Krankheit, Autoimmunerkrankung, Unfallschaden oder genetische Störungen beschädigte Zellen anzureichern oder zu ersetzen. Das Polypeptid der Erfindung kann zur Induktion der Proliferation von Nervenzellen und zur Regeneration von Nerven- und Hirngewebe, d. h. zur Behandlung von Erkrankungen und Neuropathien des Zentralnervensystems und des peripheren Nervensystems sowie mechanischen und traumatischen Erkrankungen, die Degeneration, Tod oder Trauma von Nervenzellen oder Nervengewebe involvieren, geeignet sein. Darüber hinaus können diese Zellen in vitro kultiviert werden, um andere differenzierte Zellen zu bilden, wie Hautgewebe, das zur Transplantation verwendet werden kann. Des Weiteren können die erweiterten Stammzellpopulationen auch gentechnisch verändert werden, zu Gentherapiezwecken und um die Abstoßung von Ersatzgeweben durch den Wirt nach Transplantation oder Implantation zu vermindern.
Die Expression des Polypeptids der Erfindung und deren Auswirkung auf Stammzellen kann ebenfalls manipuliert werden, um eine kontrollierte Differenzierung der Stammzellen zu mehr differenzierten Zelltypen zu erzielen. Ein allgemein anwendbares Verfahren zum Erlangen reiner Populationen eines spezifischen differenzierten Zelltyps aus undifferenzierten Stammzellpopulationen schließt die Verwendung eines zelltypspezifischen Promotors ein, der einen selektierbaren Marker antreibt. Der selektierbare Marker ermöglicht nur Zellen des gewünschten Typs das Überleben. Zum Beispiel können Stammzellen induziert werden, um zu Kardiomyozyten (Wobus et al., Differentiation, 48:173-182 (1991); Klug et al., J. Clin. Invest., 98(1):216-224 (1998)) oder Skelettmuskelzellen (L.W. Browder in: Principles of Tissue Engineering, Hrsg. Lanza et al., Academic Press (1997)) zu differenzieren. Alternativ kann eine gesteuerte Differenzierung von Stammzellen erzielt werden, indem die Stammzellen in Gegenwart eines Differenzierungsfaktors wie Retinsäure und eines Antagonisten des Polypeptids der Erfindung, der die Auswirkungen von endogener Stammzellfaktoraktivität inhibieren und das Fortschreiten der Differenzierung ermöglichen würde, kultiviert werden.
In-vitro-Kulturen von Stammzellen können verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Polypeptid der Erfindung Stammzellwachstumsfaktoraktivität aufweist. Stammzellen werden aus einer beliebigen von verschiedenen Zellquellen (einschließlich hämopoetischer Stammzellen und embryonaler Stammzellen) isoliert und auf einer Feeder-Schicht kultiviert, wie von Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:7844-7848 (1995), beschrieben, in Gegenwart des Polypeptids der Erfindung für sich oder in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren oder Zytokinen. Die Fähigkeit des Polypeptids der Erfindung, eine Proliferation von Stammzellen zu induzieren, wird mittels Koloniebildung auf halbfestem Träger bestimmt, z. B. wie von Bernstein et al., Blood, 77:2316-2321 (1991).
4.7.5 HÄMOPOESE REGULIERENDE AKTIVITÄT
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann an der Regulierung von Hämopoese und folglich an der Behandlung von Knochenmark- oder Lymphoidzellenstörungen beteiligt sein. Selbst geringfügige biologische Aktivität bei der Unterstützung von koloniebildenden Zellen oder faktorabhängigen Zelllinien weist auf eine Beteiligung am Regulieren von Hämopoese, z. B. am Unterstützen des Wachstums und der Proliferation von Vorläuferzellen der erythrozytären Reihe für sich oder in Kombination mit anderen Zytokinen hin, wodurch Nutzen beispielsweise beim Behandeln von verschiedenen Anämien oder für die Verwendung in Verbindung mit Bestrahlung/Chemotherapie, um die Produktion von Vorläufern der erythrozytären Reihe und/oder Zellen der erythrozytären Reihe zu stimulieren, angezeigt wird; beim Unterstützen des Wachstums und der Proliferation von Knochenmarkzellen wie Granulozyten und Monozyten/Makrophagen (d. h, herkömmliche Koloniestimulationsfaktoraktivitiät), was beispielsweise in Verbindung mit Chemotherapie von Nutzen ist, um folgende Knochenmarkdepression zu verhindern oder zu behandeln; beim Unterstützen des Wachstums und der Proliferation von Megakaryozyten und folglich Thrombozyten, wodurch die Verhinderung oder Behandlung von verschiedenen Thrombozytenstörungen wie Thrombozytopenie ermöglicht wird, und im Allgemeinen zur Verwendung anstelle von oder ergänzend zu Thrombozytentransfusionen; und/oder beim Unterstützen des Wachstums und der Proliferation von hämopoetischen Stammzellen, die zu einer beliebigen oder allen der oben erwähnten hämopoetischen Zellen reifen können und folglich therapeutischen Nutzen bei verschiedenen Stammzellstörungen (wie jene, die für gewöhnlich mit Transplantation behandelt werden, einschließlich, ohne Einschränkung, aplastischer Anämie und Marchiafava-Micheli-Anämie) findet sowie beim Repopulieren des Stammzellkompartments nach Bestrahlung/Chemotherapie, entweder in vivo oder ex vivo (d. h. in Verbindung mit Knochenmarktransplantation oder mit Transplantation von peripheren Vorläuferzellen (homolog oder heterolog)) als normale Zellen oder für Gentherapie gentechnisch verändert.
Hierin offenbarte therapeutische Zusammensetzungen können in den folgenden Assays verwendet werden:
Geeignete Assays auf Proliferation und Differenzierung verschiedener hämopoetischer Linien sind oben zitiert.
Assays auf Differenzierung embryonaler Stammzellen (die unter anderem Proteine identifizieren werden, die die Hämopoese bei Differenzierung in Embryonen beeinflussen) beinhalten ohne Einschränkung die in: Johansson et al., Cellular Biology 15:141-151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13:473-486, 1993; McClanahan et al., Blood 81:2903-2915, 1993, beschriebenen.
Assays auf Stammzellüberleben und -differenzierung (die unter anderem Proteine identifizieren werden, die die Lymphohämopoese regulieren) beinhalten ohne Einschränkung die in: Methylcellulose colony forming assays, M.G. Freshney in Culture of Hematopoietic Cells, Hrsg. R.I. Freshney et al., Bd., S. 265-268, Wiley-Liss. Inc., New York, N.Y., 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, I.K. McNiece und R.A. Briddell in Culture of Hematopoietic Cells, Hrsg. R.I. Freshney et al., Bd., S. 23-39, Wiley-Liss. Inc., New York, N.Y., 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, R.E. Ploemacher in Culture of Hematopoietic Cells, Hrsg. R.I. Freshney et al., Bd., S. 1-21, Wiley-Liss. Inc., New York, N.Y., 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, E. Spooncer, M. Dexter und T. Allen in Culture of Hematopoietic Cells, Hrsg. R.I. Freshney et al., Bd., S. 163-179, Wiley-Liss. Inc., New York, N.Y., 1994; Long term culture initiating cell assay, H.J. Sutherland in Culture of Hematopoietic Cells, Hrsg. R.I. Freshney et al., Bd., S. 139-162, Wiley-Liss. Inc., New York, N.Y., 1994, beschriebenen.
4.7.6 GEWEBEWACHSTUMSAKTIVITÄT
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch an dem Wachstum oder der Regeneration von Knochen-, Knorpel-, Sehnen-, Band- und/oder Nervengewebe sowie an der Wundheilung und der Gewebereparatur und -ersetzung und an der Heilung von Verbrennungen, Schnitten und Geschwüren beteiligt sein.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das Knorpel- und/oder Knochenwachstum in Umständen induziert, in denen Knochen normalerweise nicht gebildet wird, findet bei der Heilung von Knochenbrüchen und Knorpelschäden oder -verletzungen in Menschen und Tieren Anwendung. Zusammensetzungen eines Polypeptids, Antikörpers, Bindungspartners oder anderen Modulators der Erfindung können einen Prophylaxeverwendungszweck bei der Minderung geschlossener als auch offener Frakturen und auch bei der verbesserten Fixierung von künstlichen Gelenken aufweisen. De-novo-Knochenbildung, die von einem knochenbildenden Mittel induziert wird, trägt zu der Reparatur von angeborenen, durch ein Trauma induzierten oder durch eine onkologische Resektion induzierten kraniofazialen Verletzungen bei und ist gleichfalls bei der Schönheitschirurgie von Nutzen.
Ein Polypeptid dieser Erfindung kann auch am Anziehen von knochenbildenden Zellen, Stimulieren des Wachstums knochenbildender Zellen oder Induzieren der Differenzierung von Vorläufern von knochenbildenden Zellen beteiligt sein. Die Behandlung von Osteoporose, Osteoarthrose, knochendegenerierenden Störungen oder periodontalen Erkrankungen, wie durch Stimulierung von Knochen- und/oder Knorpelreparatur oder durch Blockierung der Entzündung oder Prozessen der Gewebezerstörung (Kollagenaseaktivität, Osteoklastenaktivität usw.), die von Entzündungsprozessen vermittelt wurden, ist ebenfalls mit der Zusammensetzung der Erfindung möglich.
Eine andere Kategorie der Geweberegenerationsaktivität, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung involvieren kann, ist Sehnen-/Bänderbildung. Die Induktion der Bildung von sehnen-/bandartigem Gewebe oder einer anderen Gewebebildung in Umständen, in denen ein solches Gewebe normalerweise nicht gebildet wird, findet bei der Heilung von Sehnen- oder Bänderrissen, Verformungen und anderen Sehnen- oder Bänderverletzungen in Menschen und anderen Tieren Anwendung. Ein solches Präparat, das ein sehnen-/bandartiges Gewebe induzierendes Protein einsetzt, kann einen Prophylaxeverwendungszweck beim Verhindern von Beschädigungen von Sehnen- oder Bandgewebe sowie einen Verwendungszweck bei der verbesserten Fixierung von Sehne oder Band an Knochen oder anderen Geweben und beim Reparieren von Verletzungen an Sehnen- oder Bandgewebe aufweisen. De-novo-Bildung von sehnen-/bandartigem Gewebe, die von einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung induziert wird, trägt zu der Reparatur von angeborenen, durch ein Trauma induzierten oder anderen Sehnen- oder Bänderverletzungen mit einer anderen Ursache bei und ist gleichfalls bei der Schönheitschirurgie zum Ansatz oder zur Reparatur von Sehnen oder Bändern von Nutzen. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können für eine Umgebung sorgen, um sehnen- oder ligamentbildende Zellen anzuziehen, das Wachstum von sehnen- oder ligamentbildenden Zellen zu stimulieren, die Differenzierung von Vorläufern von sehnen- oder ligamentbildenden Zellen zu induzieren oder das Wachstum von Sehnen-/Ligamentzellen oder Vorläufern ex vivo zur Rückgabe in den lebenden Organismus (in vivo), um eine Gewebereparatur zu bewirken, zu induzieren. Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch bei der Behandlung von Sehnenentzündung, Karpaltunnelsyndrom und anderen Sehnen- oder Bänderverletzungen nützlich sein. Die Zusammensetzungen können außerdem eine adäquate Matrize und/oder ein adäquates Maskierungsmittel als eine Trägersubstanz enthalten, wie in der Technik wohl bekannt ist.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können gleichfalls zur Proliferation von Nervenzellen und zur Regeneration von Nerven- und Hirngewebe, d. h. zur Behandlung von Erkrankungen und Neuropathien des Zentralnervensystems und des peripheren Nervensystems sowie mechanischen und traumatischen Erkrankungen, die Degeneration, Tod oder Trauma von Nervenzellen oder Nervengewebe involvieren, geeignet sein. Genauer gesagt kann eine Zusammensetzung bei der Behandlung von Erkrankungen des peripheren Nervensystems, wie Verletzungen der peripheren Nerven, periphere Neuropathie und lokalisierte Neuropathien, und Erkrankungen des Zentralnervensystems, wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington, amyotrophischer Lateralsklerose und Shy-Drager-Syndrom, verwendet werden. Weitere Zustände, die gemäß der vorliegenden Offenbarung behandelt werden können, beinhalten mechanische und traumatische Erkrankungen, wie Rückenmarkserkrankungen, Kopftrauma und zerebrovaskuläre Erkrankungen wie Schlaganfall. Periphere Neuropathien, die aus Chemotherapie oder anderen medizinischen Therapien resultieren, können ebenfalls mit einer Zusammensetzung der Erfindung behandelt werden.
Zusammensetzungen der Erfindung können auch nützlich sein, um eine bessere oder schnellere Schließung von nicht heilenden Wunden zu begünstigen, einschließlich, ohne Einschränkung, Druckgeschwüre, mit vaskulärer Insuffizienz verbundene Geschwüre, chirurgische und traumatische Wunden und dergleichen.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch an der Entwicklung oder Regeneration anderer Gewebe, wie Gewebe von Organen (einschließlich beispielsweise Bauchspeicheldrüse, Leber, Darm, Niere, Haut, Endothel), Muskelgewebe (glatter, Skelett- oder Herzmuskel) und Gefäßgewebe (einschließlich Gefäßendothel), oder dem Fördern des Wachstums von Zellen, die solche Gewebe umfassen, beteiligt sein. Ein Teil der gewünschten Auswirkungen kann mittels Inhibition oder Modulation von fibrotischer Vernarbung erfolgen, was normalem Gewebe ermöglichen kann, sich zu regenerieren. Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch angiogenetische Aktivität aufweisen.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch zum Schutz oder zur Regeneration der Eingeweide und zur Behandlung von Lungen- oder Leberfibrose, Reperfusionsverletzung in verschiedenen Geweben und Zuständen, die aus systemischen Zytokinschäden resultieren, geeignet sein.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch zum Fördern oder Inhibieren der Differenzierung von oben beschriebenen Geweben aus Vorläufergeweben oder -zellen oder zum Inhibieren des Wachstums oben beschriebener Gewebe von Nutzen sein.
Hierin offenbarte therapeutische Zusammensetzungen können in den folgenden Assays verwendet werden:
Assays auf Gewebeentwicklungsaktivität beinhalten ohne Einschränkung die in: der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO95/16035 (Knochen, Knorpel, Sehne); der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO95/05846 (Nerven, Neuronen); der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO91/07491 (Haut, Endothel) beschriebenen.
Assays auf Wundheilungsaktivität beinhalten ohne Einschränkung die in: Winter, Epidermal Wound Healing, S. 71-112 (Hrsg. H.I. Maibach und D.T. Rovee), Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, wie von Eaglstein und Mertz, J. Invest. Dermatol. 71:382-384 (1978) modifiziert, beschriebenen.
4.7.7 IMMUNFUNKTION STIMULIERENDE ODER -HEMMENDE AKTIVITÄT
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch immunstimulierende oder immunhemmende Aktivität aufweisen, einschließlich, ohne Einschränkung, der Aktivitäten, für die hierin Assays beschrieben werden. Ein Polynukleotid der Erfindung kann ein Polypeptid kodieren, das solche Aktivitäten aufweist. Ein Protein kann bei der Behandlung verschiedener Immundefekte oder -störungen (einschließlich schweren kombinierten Immundefekts (severe combined immunodeficiency, SCID)) nützlich sein, z. B. beim Regulieren (Hoch- oder Herunterregulieren) des Wachstums und der Proliferation von T- und/oder B-Lymphozyten, sowie zum Herbeiführen der zytolytischen Aktivität von NK-Zellen und anderen Zellpopulationen. Diese Immundefekte können genetisch sein oder von Virusinfektionen (z. B. HIV) als auch Bakterien- oder Pilzinfektionen verursacht worden sein oder können aus Autoimmunerkrankungen resultieren. Genauer gesagt können Ursachen von Infektionserkrankungen durch eine Virus-, Bakterien-, Pilz- oder eine andere Infektion mit einem Protein der vorliegenden Erfindung behandelt werden, einschließlich Infektionen durch HIV, Hepatitisviren, Herpesviren, Mycobakterien, Leishmania spp., Malaria spp. und verschiedenen Pilzinfektionen wie Candiadiasis. Natürlich können Proteine der vorliegenden Erfindung in dieser Hinsicht auch von Nutzen sein, wenn eine Belebung des Immunsystems im Allgemeinen wünschenswert sein kann, d. h. bei der Behandlung von Krebs.
Autoimmunerkrankungen, die mit einem Protein der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, beinhalten beispielsweise Bindegewebeerkrankung, multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, autoimmune Lungeninfektion, Guillain-Barre-Syndrom, autoimmune Schilddrüsenentzündung, insulinabhängigen Diabetes mellitus, Erb-Goldflam-Syndrom, Graft-versus-Host-Erkrankung und autoimmune entzündliche Augenerkrankung. Ein solches Protein (oder Antagonisten davon, einschließlich Antikörper) der vorliegenden Erfindung kann auch bei der Behandlung von allergischen Reaktionen und Zuständen (z. B. allergischer Schock, Serumkrankheit, Arzneimittelreaktionen, Nahrungsmittelallergien, Insektengiftallergien, Mastozytose, allergische Rhinitis, exogen allergische Alveolitis, Nesselsucht, angioneurotisches Ödem, Ekzem, atopische Dermatitis, allergische Kontaktdermatitis, Erythema multiforme, Stevens-Johnson-Syndrom, allergische Konjunktivitis, atopische Keratokonjunktivitis, venerische Keratokonjunktivitis, große papilläre Konjunktivitis und Kontaktallergien), wie Asthma (insbesondere allergisches Asthma) oder andere Atemprobleme, nützlich sein. Andere Zustände, in denen Immunsuppression erwünscht ist (einschließlich beispielsweise Organtransplantation), können ebenfalls mit einem Protein (oder Antagonisten davon) der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Die therapeutischen Effekte der Polypeptide oder Antagonisten davon auf allergische Reaktionen können mittels In-vivo-Tiermodellen beurteilt werden, wie dem kumulativen Kontaktverstärkungstest (Lastbom et al., Toxicology 125:59-66, 1998), Hautstichtest (Hoffmann et al., Allergy 54:446-454, 1999), Hautsensibilisierungstest an Meerschweinchen (Vohr et al., Arch. Toxocol. 73:501-509) und murinem lokalem Lymphknotenassay (Kimber et al., J. Toxicol. Environ. Health 53:563-579).
Unter Verwendung der Proteine der Erfindung ist es auch möglich, Immunreaktionen auf eine Reihe von Weisen zu modulieren. Die Herunterregulierung kann in der Form eines Inhibierens oder Blockierens einer bereits laufenden Immunreaktion erfolgen oder kann das Verhindern der Induktion einer Immunreaktion einschließen. Die Funktionen aktivierter T-Zellen können inhibiert werden, indem T-Zellantworten unterdrückt oder eine spezifische Toleranz in T-Zellen induziert wird oder beides. Bei der Immunsuppression von T-Zellantworten handelt es sich im Allgemeinen um einen aktiven, nicht antigenspezischen Vorgang, der eine dauerhafte Exposition der T-Zellen gegenüber dem repressiven Mittel erfordert. Die Toleranz, die das Induzieren von Nichtempfänglichkeit oder Anergie einschließt, kann von der Immunsuppression dadurch unterschieden werden, dass sie im Allgemeinen antigenspezifisch ist und bestehen bleibt, nachdem die Exposition gegenüber dem Toleranz vermittelnden Mittel gestoppt wurde. Fakultativ kann die Toleranz durch das Fehlen einer T-Zellantwort bei erneuter Exposition gegenüber spezifischem Antigen bei Abwesenheit des Toleranz vermittelnden Mittel demonstriert werden.
Ein Herunterregulieren oder Verhindern einer oder mehrerer Antigenfunktionen (einschließlich, ohne Einschränkung, B-Lymphozyten-Antigenfunktionen (wie beispielsweise B7)), z. B. Verhindern von starker Lymphokinsynthese durch aktivierte T-Zellen, wird in Gewebe-, Haut- und Organtransplantationssituationen und bei Graft-versus-Host-Erkrankung (graft-versus-host disease, GVHD) von Nutzen sein. Zum Beispiel sollte eine Blockierung der T-Zellfunktion in einer verminderten Gewebezerstörung bei Gewebetransplantation resultieren. In der Regel wird die Abstoßung des Transplantats bei Gewebetransplantationen durch dessen Erkennung als fremd durch T-Zellen initiiert, worauf eine Immunreaktion folgt, die das Transplantat zerstört. Die Verabreichung einer hierin offenbarten therapeutischen Zusammensetzung kann die Zytokinsynthese durch Immunzellen, wie T-Zellen, verhindern und fungiert somit als ein Immunsuppressivum. Darüber hinaus kann ein Mangel an Kostimulierung auch dazu ausreichen, eine Anergie der T-Zellen zu bewirken, wodurch die Toleranz in einem Patienten induziert. Die Induktion von Langzeittoleranz durch B-Lymphozyten-Antigene blockierende Reagenzien kann das Erfordernis einer wiederholten Verabreichung dieser Blockierungsreagenzien vermeiden. Um eine ausreichende Immunsuppression oder Toleranz in einem Patienten zu erzielen, kann es auch notwendig sein, die Funktion einer Kombination von B-Lymphozyten-Antigenen zu blockieren.
Die Wirksamkeit bestimmter therapeutischer Zusammensetzungen beim Verhindern der Abstoßung von Organtransplantaten oder GVHD kann mit Tiermodellen bewertet werden, die für die Wirksamkeit in Menschen prädiktiv sind. Beispiele von adäquaten Systemen, die verwendet werden können, beinhalten Herzallotransplantate in Ratten und Inselzellxenotransplantate der Bauchspeicheldrüse in Mäusen, die beide zum Untersuchen den immunsuppressiven Wirkungen von CTLA4Ig-Fusionsproteinen in vivo verwendet worden sind, wie in Lenschow et al., Science 257:789-792 (1992), und Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11102-11105 (1992), beschrieben. Darüber hinaus können Mausmodelle von GVHD (siehe Paul (Hrsg.), Fundamental Immunology; Raven Press, New York, 1989, S. 846-847) dazu verwendet werden, die Auswirkung von hierin offenbarten therapeutischen Zusammensetzungen auf die Entwicklung dieser Erkrankung zu bestimmen.
Ein Blockieren einer Antigenfunktion kann auch zum Behandeln von Autoimmunerkrankungen therapeutisch von Nutzen sein. Viele Autoimmunerkrankungen resultieren aus einer unangebrachten Aktivierung von T-Zellen, die gegen Eigengewebe reaktiv sind und die Produktion von Zytokinen und Autoantikörpern fördern, die an der Pathologie der Erkrankungen beteiligt sind. Ein Verhindern der Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen kann Krankheitssymptome mindern oder ausmerzen. Eine Verabreichung von Reagenzien, die die Stimulierung von T-Zellen blockieren, kann angewendet werden, um die T-Zellen-Aktivierung zu inhibieren und die Produktion von Autoantikörpern oder von T-Zellen abgeleiteten Zytokinen zu verhindern, die am Krankheitsprozess beteiligt sein können. Darüber hinaus können Blockierungsreagenzien eine antigenspezifische Toleranz von autoreaktiven T-Zellen induzieren, die zu einer Langzeitentlastung von der Erkrankung führen könnte. Die Wirksamkeit von Blockierungsreagenzien beim Verhindern oder Lindern von Autoimmunerkrankungen kann mit einer Reihe wohl charakterisierter Tiermodelle menschlicher Autoimmunerkrankungen bestimmt werden. Beispiele beinhalten experimentelle autoimmune Enzephalitis in der Maus, systemischer Lupus erythematodes in MRL/lpr/lpr-Mäusen oder NZB-Hybridmäusen, autoimmune Kollagenarthritis in der Maus, Diabetes mellitus in NOD-Mäusen und BB-Ratten und experimentelles Erb-Goldflam-Syndrom in der Maus (siehe Paul (Hrsg.), Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, S. 840-856).
Eine Hochregulierung einer Antigenfunktion (z. B. einer B-Lymphozyten-Antigenfunktion) als ein Mittel zum Hochregulieren von Immunreaktionen kann ebenfalls in der Therapie von Nutzen sein. Eine Hochregulierung von Immunreaktionen kann in der Form eines Verstärkens einer bestehenden Immunreaktion oder eines Auslösens einer anfänglichen Immunreaktion erfolgen. Zum Beispiel kann ein Verstärken einer Immunreaktion in Fällen einer Virusinfektion, einschließlich systemischer Viruserkrankungen, wie Influenza, der Erkältungskrankheit und Enzephalitis, nützlich sein.
Alternativ können antivirale Immunreaktionen in einem infizierten Patienten verstärkt werden, indem T-Zellen aus dem Patienten entfernt werden, die T-Zellen in vitro mit Virusantigen-gepulsten APCs kostimuliert werden, entweder ein offenbartes Peptid exprimierend oder zusammen mit einer stimulierenden Form eines hierin offenbarten löslichen Peptids, und die außerhalb des Organismus (in vitro) aktivierten T-Zellen wieder in den Patienten eingeführt werden. Ein anderes Verfahren zum Verstärken antiviraler Immunreaktionen bestünde darin, infizierte Zellen aus einem Patienten zu isolieren, sie mit einer Nukleinsäure zu transfizieren, die ein Protein der vorliegenden Erfindung wie hierin beschrieben kodiert, so dass die Zellen das gesamte oder ein Teil des Proteins auf ihrer Oberfläche exprimieren, und die transfizierten Zellen wieder in den Patienten einzuführen. Die infizierten Zellen wären jetzt dazu in der Lage, ein kostimulierendes Signal an T-Zellen in vivo zu liefern und diese dadurch zu aktivieren.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann das erforderliche Stimulierungssignal an T-Zellen bereitstellen, um eine T-zellvermittelte Immunreaktion gegen die transfizierten Tumorzellen zu induzieren. Des Weiteren können Tumorzellen, denen MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Moleküle fehlen oder die dabei scheitern, ausreichende Mengen von MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Molekülen erneut zu exprimieren, mit Nukleinsäure transfiziert werden, die das gesamte oder einen Teil (z. B. einen um eine zytoplasmatische Domäne verkürzten Teil) eines MHC-Klasse-I-Alphaketten-Proteins und β₂-Mikroglobulinproteins oder eines MHC-Klasse-II-Alphaketten-Proteins und eines MHC-Klasse-II-Betaketten-Proteins kodiert, um dadurch MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Proteine auf der Zelloberfläche zu exprimieren. Die Expression der adäquaten Klasse-I- oder Klasse-II-MHC in Verbindung mit einem Peptid mit der Aktivität eines B-Lymphozyten-Antigens (z. B. B7-1, B7-2, B7-3) induziert eine T-zellvermittelte Immunreaktion gegen die transfizierte Tumorzelle. Gegebenenfalls kann auch ein Gen, das ein Antisense-Konstrukt kodiert, das die Expression eines MHC-Klasse-II-assoziierten Proteins blockiert, wie die Invariante Kette, mit einer DNA, die ein Peptid mit der Aktivität eines B-Lymphozyten-Antigens kodiert, kotransfiziert werden, um die Präsentation von tumorassoziierten Antigenen zu fördern und eine tumorspezifische Immunität zu induzieren. Somit kann die Induktion einer T-zellvermittelten Immunreaktion in einem menschlichen Patienten ausreichen, um die tumorspezifische Toleranz in dem Patienten zu überwinden.
Die Aktivität eines Proteins der Erfindung kann, neben anderen Mitteln, mit den folgenden Verfahren gemessen werden:
Geeignete Assays auf Thymozyt- oder Splenozytzytotoxizität beinhalten ohne Einschränkung die in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verl. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bowman et al., J. Virology 61:1992-1998; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153:3079-3092, 1994, beschriebenen.
Assays auf T-zellabhängige Immunglobulin-Reaktionen und Isotypwechsel (die unter anderem Proteine identifizieren werden, die T-zellabhängige Antikörperreaktionen modulieren und Th1/Th2-Profile beeinflussen) beinhalten ohne Einschränkung die in: Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990; und Assays for B cell function: In vitro antibody production, J.J. Mond und M. Brunswick in Current Protocols in Immunology, Hrsg. J.E. e.a. Coligan, Bd. 1, S. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto, 1994, beschriebenen.
MCR-Assays (MCR = mixed lymphocyte reaction, gemischte Lymphozytenreaktion) (die unter anderem Proteine identifizieren werden, die vorwiegend Thl- und CTL-Antworten hervorrufen) beinhalten ohne Einschränkung die in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verl. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992, beschriebenen.
Von dendritischen Zellen abhängige Assays (die unter anderem Proteine identifizieren werden, die von dendritischen Zellen exprimiert werden, die native T-Zellen aktivieren) beinhalten ohne Einschränkung die in: Guery et al., J. Immunol. 134:536-544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154:5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182:255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169:1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94:797-807, 1994; und Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640, 1990, beschriebenen.
Assays auf Lymphozytenüberleben/-apoptose (die unter anderem Proteine, die Apoptose nach Superantigen-Induktion verhindern, und Proteine, die die Lymphozyten-Homöostase regulieren, identifizieren werden) beinhalten ohne Einschränkung die in: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53:1945-1951, 1993; Itoh et al., Cell 66:233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145:4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1:639-648, 1992, beschriebenen.
Assays auf Proteine, die Frühstadien von T-Zelldeterminierung und -entwicklung beeinflussen, beinhalten ohne Einschränkung die in: Antica et al., Blood 84:111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:111-122, 1994; Galy et al., Blood 85:2770-2778, 1995, Toki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7548-7551, 1991, beschriebenen.
4.7.8 CHEMOTAKTISCHE/CHEMOKINETISCHE AKTIVITÄT
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann an der chemotaktischen oder chemokinetischen Aktivität für Säugetierzellen, einschließlich beispielsweise Monozyten, Fibroblasten, neutrophilen Zellen, T-Zellen, Mastzellen, eosinophilen Zellen, Epithel- und/oder Endothelzellen, beteiligt sein. Ein Polynukleotid der Erfindung kann ein Polypeptid kodieren, das solche Merkmale aufweist. Chemotaktische und chemokinetische Rezeptoraktivierung kann angewendet werden, um eine gewünschte Zellpopulation zu mobilisieren oder zu einer gewünschten Aktionsstelle anzuziehen. Chemotaktische oder chemokinetische Zusammensetzungen (z. B. Proteine, Antikörper, Bindungspartner oder Modulatoren der Erfindung) liefern besondere Vorteile bei der Behandlung von Wunden und anderen Traumata von Geweben sowie bei der Behandlung von lokalisierten Infektionen. Zum Beispiel kann die Anziehung von Lymphozyten, Monozyten oder neutrophilen Zellen zu Tumoren oder Infektionsstellen in verbesserten Immunreaktionen gegen den Tumor oder das InfektionsMittel resultieren.
Ein Protein oder Peptid weist chemotaktische Aktivität für eine bestimmte Zellpopulation auf, wenn es die gerichtete Orientierung oder Bewegung einer solchen Zellpopulation direkt oder indirekt stimulieren kann. Vorzugsweise weist das Protein oder Peptid die Fähigkeit auf, die gerichtete Bewegung von Zellen direkt zu stimulieren. Ob ein bestimmtes Protein chemotaktische Aktivität für eine Population von Zellen aufweist, kann leicht bestimmt werden, indem ein solches Protein oder Peptid in einem beliebigen bekannten Assay auf Zellchemotaxis eingesetzt wird.
Hierin offenbarte therapeutische Zusammensetzungen können in den folgenden Assays verwendet werden:
Assays auf chemotaktische Aktivität (die Proteine identifizieren werden, die die Chemotaxis induzieren oder verhindern) bestehen aus Assays, die die Fähigkeit eines Proteins, die Wanderung von Zellen über eine Membran zu induzieren, sowie die Fähigkeit eines Proteins, die Adhäsion einer Zellpopulation an eine andere Zellpopulation zu induzieren, messen. Geeignete Assays auf Bewegung und Adhäsion beinhalten ohne Einschränkung die in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verl. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 6.12, Measurement of alpha and beta Chemokines 6.12.1-6.12.28); Taub et al., J. Clin. Invest. 95:1370-1376, 1995; Lind et al., APMIS 103:140-146, 1995; Muller et al., Eur. J. Immunol. 25:1744-1748; Gruber et al., J. of Immunol. 152:5860-5867, 1994; Johnston et al., J. of Immunol. 153:1762-1768, 1994, beschriebenen.
4.7.9 HÄMOSTATISCHE UND THROMBOLYTISCHE AKTIVITÄT
Ein Polypeptid der Erfindung kann auch an der Hämostase oder Thrombolyse oder Thrombusbildung beteiligt sein. Ein Polynukleotid der Erfindung kann ein Polypeptid kodieren, das solche Merkmale aufweist. Zusammensetzungen können bei der Behandlung verschiedener Gerinnungsstörungen (einschließlich Erbkrankheiten wie Hämophilie) oder zum Verstärken der Gerinnung und anderer hämostatischer Ereignisse beim Behandeln von Wunden, die aus Trauma, chirurgischem Eingriff oder anderen Ursachen resultieren, von Nutzen sein. Eine Zusammensetzung der Erfindung kann auch zum Lösen oder Inhibieren der Bildung von Thrombosen und zur Behandlung und Verhinderung von Zuständen, die daraus resultieren (wie beispielsweise Infarkt von Gefäßen des Herzen und des Zentralnervensystems (z. B. Schlaganfall)), nützlich sein.
Hierin offenbarte therapeutische Zusammensetzungen können in den folgenden Assays verwendet werden:
Assay auf hämostatische und thrombolytische Aktivität beinhalten ohne Einschränkung die in: Linet et al., J. Clin. Pharmacol. 26:131-140, 1986; Burdick et al., Thrombosis Res. 45:413-419, 1987; Humphrey et al., Fibrinolysis 5:71-79 (1991); Schaub, Prostaglandins 35:467-474, 1988, beschriebenen.
4.7.10 KREBSDIAGNOSE UND -THERAPIE
Polypeptide der Erfindung können an der Krebszellenentwicklung, -proliferation und -metastasierung beteiligt sein. Der Nachweis des Vorliegens oder der Menge von Polynukleotiden oder Polypeptiden der Erfindung kann für die Diagnose und/oder Prognose einer oder mehrerer Arten von Krebs von Nutzen sein. Zum Beispiel kann das Vorliegen oder die erhöhte Expression eines Polynukleotids/Polypeptids der Erfindung auf ein erbliches Krebsrisiko, eine Präkanzerose oder ein aktuelles Malignom hinweisen. Umgekehrt kann ein Defekt im Gen oder ein Fehlen des Polypeptids mit einer Krebserkrankung in Verbindung gebracht werden. Die Identifizierung von Einzelnukleotidpolymorphismen, die mit Krebs oder einer Neigung zu Krebs assoziiert werden, kann ebenfalls für die Diagnose oder Prognose nützlich sein.
Krebsbehandlungen fördern die Tumorregression durch Inhibieren von Tumorzellproliferation, Inhibieren von Angiogenese (Wachstum von neuen Blutgefäßen, die zum Unterstützen des Tumorwachstums erforderlich sind) und/oder Verhindern von Metastasierung durch Reduzieren der Tumorzellmotilität oder -invasivität. Therapeutische Zusammensetzungen der Erfindung können in der Erwachsenen- und Kinderonkologie wirksam sein, darunter in Tumoren/Malignomen im festen Zustand, lokal fortgeschrittenen Tumoren, Weichteilsarkom des Menschen, metastasierendem Karzinom, einschließlich Lymphgefäßmetastasen, Malignome der Blutzellen, einschließlich Kahler-Krankheit, akuter und chronischer Leukämien und Lymphome, Kopf- und Halskarzinome, einschließlich Mundkrebs, Kehlkopfkrebs und Schilddrüsenkrebs, Lungenkarzinome, einschließlich kleinzelligem Karzinom und nicht-kleinzellige Karzinome, Brustkrebs, einschließlich kleinzelligem Karzinom und duktalem Karzinom, gastrointestinaler Karzinome, einschließlich Speiseröhrenkrebs, Magenkrebs, Dickdarmkrebs, kolorektalem Karzinom und Polypen, die mit kolorektaler Neoplasie assoziiert werden, Bauchspeicheldrüsenkarzinome, Leberkrebs, urologischer Karzinome, einschließlich Blasenkrebs und Prostatakrebs, Malignome des weiblichen Genitaltrakts, einschließlich Eierstockkrebs, Gebärmutterkarzinome (einschließlich Endometriumkarzinome) und festem Tumor im Eierstockfollikel, Nierenkarzinome, einschließlich hypernephroidem Karzinom, Hirnkarzinome, einschließlich intrinsischer Hirnkarzinome, Neuroblastom, astrozytischer Hirnkarzinome, Gliome, metastasierender Tumorzellinvasion im Zentralnervensystem, Knochenkarzinome, einschließlich Osteome, Hautkarzinome, einschließlich malignem Melanom, Tumorprogression von Keratinozyten menschlicher Haut, Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom, Hämangioperiytom und Kaposi-Sarkom.
Polypeptide, Polynukleotide oder Modulatoren von Polypeptiden der Erfindung (einschließlich Inhibitoren und Stimulatoren der biologischen Aktivität des Polypeptids der Erfindung) können verabreicht werden, um Krebs zu behandeln. Therapeutische Zusammensetzungen können in therapeutisch wirksamen Dosierungen für sich oder in Kombination mit hilfreicher Krebstherapie, wie chirurgischem Eingriff, Chemotherapie, Strahlentherapie, Thermotherapie und Lasertherapie, verabreicht werden und können eine förderliche Wirkung liefern, z. B. die Tumorgröße reduzieren, die Geschwindigkeit des Tumorwachstums verlangsamen, die Metastasierung inhibieren oder den klinischen Gesamtzustand anderweitig verbessern, ohne notwendigerweise das Karzinom auszulöschen.
Die Zusammensetzung kann auch in therapeutisch wirksamen Mengen als ein Teil eines Anti-Krebs-Cocktails verabreicht werden. Ein Anti-Krebs-Cocktail ist eine Mischung des Polypeptids oder Modulators der Erfindung mit einer oder mehreren antineoplastischen Substanzen zusätzlich zu einer pharmazeutisch unbedenklichen Trägersubstanz zur Lieferung. Die Verwendung von Anti-Krebs-Cocktails als eine Krebsbehandlungsmethode ist Routine. Antineoplastische Substanzen, die in der Technik wohl bekannt sind und als eine Behandlungsmethode in Kombination mit dem Polypeptid oder Modulator der Erfindung verwendet werden können, beinhalten: Actinomycin D, Aminoglutethimid, Asparaginase, Bleomycin, Busulfan, Carboplatin, Carmustin, Chlorambucil, Cisplatin (cis-DDP), Cyclophosphamid, Cytarabin-HCl (Cytosin-Arabinosid), Dacarbazin, Dactinomycin, Daunorubicin-HCl, Doxorubicin-HCl, Estramustinphosphat-Natrium, Etoposid (V16-213), Floxuridin, 5-Fluoruracil (5-Fu), Flutamid, Hydroxyharnstoff (Hydroxycarbamid), Ifosfamid, Interferon-alpha-2a, Interferon-alpha-2b, Leuprolidacetat (LHRH-Releasingfaktor-Analogon), Lomustin, Mechlorethamin-HCl (Stickstoff-Lost), Melphalan, Mercaptopurin, Mesna, Methotrexat (MTX), Mitomycin, Mitoxantron-HCl, Octreotid, Plicamycin, Procarbazin-HCl, Streptozocin, Tamoxifencitrat, Thioguanin, Thiotepa, Vinblastinsulfat, Vincristinsulfat, Amsacrin, Azacitidin, Hexamethylmelamin, Interleukin-2, Mitoguazon, Pentostatin, Semustin, Teniposid und Vindesinsulfat.
Darüber hinaus können hierin offenbarte therapeutische Zusammensetzungen zur prophylaktischen Behandlung von Krebs verwendet werden. Es gibt hereditäre Zustände und/oder Umgebungssituationen (z. B. Exposition gegenüber Karzinogenen), die in der Technik bekannt sind, bei einer Einzelperson die Veranlagung schaffen, Karzinome zu entwickeln. Unter diesen Umständen kann es förderlich sein, diese Einzelpersonen mit therapeutisch wirksamen Dosen des Polypeptids der Erfindung zu behandeln, um das Risiko der Entwicklung von Karzinomen zu reduzieren.
In-vitro-Modelle können dazu verwendet werden, die wirksamen Dosen des Polypeptids der Erfindung als eine potentielle Krebsbehandlung zu bestimmen. Diese In-vitro-Modelle beinhalten Proliferationsassays von kultivierten Tumorzellen, Wachstum von kultivierten Tumorzellen in weichem Agar-Agar (siehe Freshney, (1987) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wily-Liss, New York, NY, Kap. 18 und Kap. 21), Tumorsystemen in Nacktmäusen, wie in Giovanella et al., J. Natl. Can. Inst. 52:921-930 (1974), beschrieben, Mobilität und Invasionspotential von Tumorzellen in Boyden-Kammer-Assays, wie in Pilkington et al., Anticancer Res., 17:4107-4109 (1997), beschrieben, und Angiogeneseassays, wie Induktion von Vaskularisation der Chorioallantoismembran von Küken oder Induktion der Wanderung vaskulärer Endothelzellen, wie in Ribatta et al., Intl. Dev. Biol., 40:1189-1197 (1999), bzw. Li et al., Clin. Exp. Metastasis, 17:423-429 (1999), beschrieben. Geeignete Tumorzelllinien sind z. B. aus American Type Tissue Culture Collection-Katalogen erhältlich.
4.7.11 REZEPTOR-/LIGANDENAKTIVITÄT
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch Aktivität als Rezeptor, Rezeptorligand oder Inhibitor oder Agonist von Rezeptor/Ligand-Interaktionen demonstrieren. Ein Polynukleotid der Erfindung kann ein Polypeptid kodieren, das solche Merkmale aufweist. Beispiele solcher Rezeptoren und Liganden beinhalten ohne Einschränkung Zytokinrezeptoren und deren Liganden, Rezeptorkinasen und deren Liganden, Rezeptorphosphatasen und deren Liganden, Rezeptoren, die an Zell-Zell-Interaktionen beteiligt sind, und deren Liganden (einschließlich, ohne Einschränkung, Zelladhäsionsmoleküle (wie Selektine, Integrine und deren Liganden)) und Rezeptor/Ligand-Paare, die an der Antigenpräsentation, Antigenerkennung und Entwicklung von zellulären und humoralen Immunantworten beteiligt sind. Rezeptoren und Liganden sind ebenfalls zum Screenen auf potentielle Peptid- oder Kleinmolekülinhibitoren der relevanten Rezeptor/Ligand-Interaktion von Nutzen. Ein Protein der vorliegenden Erfindung (einschließlich, ohne Einschränkung, Fragmenten von Rezeptoren und Liganden) können selbst als Inhibitoren von Rezeptor/Ligand-Interaktionen geeignet sein.
Die Aktivität eines Polypeptids der Erfindung kann, neben anderen Mitteln, mit den folgenden Verfahren gemessen werden:
Geeignete Assays auf Rezeptor/Ligand-Aktivität beinhalten ohne Einschränkung die in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verl. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.28.1-7.28.22); Takai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6864-6868, 1987; Bierer et al., J. Exp. Med. 168:1145-1156, 1988; Rosenstein et al., J. Exp. Med. 169:149-160, 1989; Stoltenborg et al., J. Immunol. Methods 175:59-68, 1994; Stitt et al., Cell 80:661-670, 1995, beschriebenen.
Als Beispiel können die Polypeptide der Erfindung als ein Rezeptor für einen Liganden bzw. mehrere Liganden verwendet werden, wodurch die biologische Aktivität dieses Liganden bzw. dieser Liganden übertragen wird. Die Liganden können durch Bindungsassays, Affinitätschromatographie, Dihybrid-Screening-Assays, BIAcore-Assays, Far-Western-Assays oder anderen in der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden.
Studien, die Arzneimittel oder Proteine als Agonisten oder Antagonisten oder partielle Agonisten oder ein partieller Antagonist charakterisieren, bedingen die Verwendung von anderen Proteinen als konkurrierenden Liganden. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder der Ligand bzw. die Liganden davon können markiert werden, indem sie mittels herkömmlicher Verfahren an Radioisotopen, Farbmoleküle oder ein Toxinmolekül gekoppelt werden („Guide to Protein Purification", Murray P. Deutscher (Hrsg.), Methods in Enzymology, Bd. 182 (1990), Academic Press, Inc., San Diego). Beispiele von Radioisotopen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Tritium und Kohlenstoff-14. Beispiele von Farbmolekülen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, fluoreszierende Moleküle, wie Fluorescamin oder Rhodamin, oder andere Farbmoleküle. Beispiele von Toxinen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Ricin.
4.7.12 ARZNEIMITTELSCREENING
Diese Erfindung ist besonders zum Screenen von chemischen Verbindungen unter Verwendung der neuartigen Polypeptide oder bindenden Fragmente davon in einer beliebigen von einer Vielfalt von Arzneimittelscreeningtechniken geeignet. Die in einem solchen Test eingesetzten Polypeptide oder Fragmente können entweder frei in Lösung, an einen festen Träger fixiert, auf einer Zelloberfläche übertragen oder intrazellulär angeordnet sein. Ein Arzneimittelscreeningverfahren setzt eukaryontische oder prokaryontische Wirtszellen ein, die mit rekombinanten Nukleinsäuren stabil transformiert werden, die das Polypeptid oder ein Fragment davon exprimieren. Arzneimittel werden in Assays mit konkurrierender Bindung gegen solche transformierten Zellen gescreent. Solche Zellen, entweder in lebensfähiger oder fixierter Form, können für Standard-Bindungsassays verwendet werden. Man kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen Polypeptiden der Erfindung oder Fragmenten und dem Mittel, das getestet wird, messen oder die Abnahme der Komplexbildung zwischen den neuartigen Polypeptiden und einer adäquaten Zelllinie untersuchen, die in der Technik wohl bekannt sind.
Quellen für Versuchsverbindungen, die auf die Fähigkeit gescreent werden, an die Polypeptide der Erfindung zu binden oder die Aktivität dieser zu modulieren (d. h. zu erhöhen oder zu verringern), beinhalten (1) Bibliotheken für anorganische und organische Chemikalien, (2) Naturproduktbibliotheken und (3) kombinatorische Bibliotheken, die sich aus entweder randomisierten oder mimetischen Peptiden, Oligonukleotiden oder organischen Molekülen zusammensetzen.
Chemikalienbibliotheken können leicht synthetisiert oder von einer Reihe von Handelsquellen bezogen werden oder sie können Strukturanaloga von bekannten Verbindungen oder Verbindungen, die mittels Naturproduktscreening als „Hits" oder „Leads" identifiziert werden, enthalten.
Die Quellen von Naturproduktbibliotheken sind Mikroorganismen (einschließlich Bakterien und Pilze), Tiere, Pflanzen oder andere Vegetation oder Meeresorganismen und Bibliotheken von Mischungen zum Screenen können mittels: (1) Fermentation und Extraktion von Broths (Brühen) aus Boden-, Pflanzen- oder Meeresmikroorganismen oder (2) Extraktion der Organismen selbst hergestellt werden. Naturproduktbibliotheken beinhalten Polyketide, nichtribosomale Peptide und (nicht natürlich vorkommende) Varianten davon. Zwecks eines Überblicks siehe Science 282:63-68 (1998).
Kombinatorische Bibliotheken setzen sich aus großen Anzahlen von Peptiden, Oligonukleotiden oder organischen Verbindungen zusammen und können leicht mittels herkömmlicher automatisierter Syntheseverfahren, PCR, Klonierung oder proprietären Syntheseverfahren hergestellt werden. Von besonderem Interesse sind kombinatorische Peptid- und Oligonukleotidbibliotheken. Noch andere Bibliotheken von Interesse beinhalten Peptid-, Protein-, peptidomimetische, multiparallele synthetische Sammel-, rekombinatorische und Polypeptidbibliotheken. Zwecks eines Überblicks über die kombinatorische Chemie und daraus erstellte Bibliotheken siehe Myers, Curr. Opin. Biotechnol. 8:701-707 (1997). Zwecks Überblicken über und Beispielen von peptidomimetischen Bibliotheken siehe Al-Obeidi et al., Mol. Biotechnol. 9(3):205-223 (1998); Hruby et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1(1):114-119 (1997); Dorner et al., Bioorg. Med. Chem. 4(5):709-715 (1996) (alkylierte Dipeptide).
Die Identifizierung von Modulatoren durch Verwendung der verschiedenen hierin beschriebenen Bibliotheken ermöglicht die Modifikation des Kandidaten-„Hits" (oder -„Leads"), um die Fähigkeit des „Hits", ein Polypeptid der Erfindung zu binden, zu optimieren. Die in dem Bindungsassay identifizierten Moleküle werden dann auf Antagonisten- oder Agonistenaktivität in In-vivo-Gewebekultur oder Tiermodellen, die in der Technik wohl bekannt sind, geprüft. Kurz dargestellt, die Moleküle werden in mehrere Zellkulturen oder Tiere titriert und dann auf entweder Zelltod/Tod des Tiers oder längeres Überleben des Tiers/der Zellen geprüft.
Die somit identifizierten bindenden Moleküle können mit Toxinen, z. B. Ricin oder Cholera, oder mit anderen Verbindungen, die für die Zellen toxisch sind, wie Radioisotope, komplexiert werden. Der Komplex aus Toxin und bindendem Molekül wird dann mittels der Spezifität des bindenden Moleküls für ein Polypeptid der Erfindung auf einen Tumor oder eine andere Zelle gerichtet. Alternativ können die bindenden Moleküle mit Kontrastmitteln zu Targetierungs- und Bildgebungszwecken komplexiert werden.
4.7.13 ASSAY AUF REZEPTORAKTIVITÄT
Es werden Verfahren offenbart, um die spezifische Bindung eines Polypeptids, z. B. eines Liganden oder Rezeptors, nachzuweisen. Die Technik stellt zahlreiche Assays bereit, die besonders zum Identifizieren zuvor unbekannter Bindungspartner für hierin offenbarte Rezeptorpolypeptide geeignet sind. Zum Beispiel können Expressionsklonierung unter Verwendung von Säugetier- oder Bakterienzellen oder Dihybrid-Screening-Assays verwendet werden, um Polynukleotide zu identifizieren, die Bindungspartner kodieren. Als ein anderes Beispiel kann Affinitätschromatographie mit dem entsprechenden immobilisierten Polypeptid verwendet werden, um Polypeptide zu isolieren, die hierin offenbarte Polypeptide erkennen und binden. Es gibt eine Reihe unterschiedlicher Bibliotheken, die zur Identifizierung von Verbindungen und insbesondere Kleinmolekülen verwendet werden, die die biologische Aktivität eines offenbarten Polypeptids modulieren (d. h. erhöhen oder verringern). Die Liganden für hierin offenbarte Rezeptorpolypeptide können ebenfalls identifiziert werden, indem exogene Liganden oder Cocktails von Liganden zu zwei Zellpopulationen gegeben werden, die genetisch identisch sind, mit Ausnahme der Expression des Rezeptors: Eine Zellpopulation exprimiert den Rezeptor, wohingegen die andere ihn nicht exprimiert. Die Reaktionen der zwei Zellpopulationen auf die Zugabe eines Liganden bzw. mehrerer Liganden werden dann verglichen. Alternativ kann eine Expressionsbibliothek mit dem offenbarten Polypeptid in Zellen koexprimiert und auf eine autokrine Reaktion geprüft werden, um einen potentiellen Liganden bzw. potentielle Liganden zu identifizieren. Als noch ein anderes Beispiel können BIAcore-Assays, Far-Western-Assays oder andere in der Technik bekannte Verfahren dazu verwendet werden, Bindungspartner-Polypeptide zu identifizieren, einschließlich (1) Bibliotheken für anorganische und organische Chemikalien, (2) Naturproduktbibliotheken und (3) kombinatorischer Bibliotheken, die sich aus randomisierten Peptiden, Oligonukleotiden oder organischen Molekülen zusammensetzen.
Die Rolle der stromabwärts gelegenen intrazellulären Signalstoffmoleküle in der Signalkaskade des Polypeptids der Erfindung kann bestimmt werden. Zum Beispiel wird ein chimäres Protein, in dem die zytoplasmatische Domäne des Polypeptids der Erfindung an den extrazellulären Teil eines Proteins, dessen Ligand identifiziert wurde, fusioniert ist, in einer Wirtszelle produziert. Die Zelle wird dann mit dem Liganden inkubiert, der für den extrazellulären Teil des chimären Proteins spezifisch ist, wodurch der chimäre Rezeptor aktiviert wird. Bekannte stromabwärts gelegene Proteine, die an der intrazellulären Signalgebung beteiligt sind, können dann auf erwartete Modifikationen, d. h. Phosphorylierung, geprüft werden. Andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können gleichfalls verwendet werden, um Signalstoffmoleküle zu identifizieren, die an der Rezeptoraktivität beteiligt sind.
4.7.14 LEUKÄMIEN
Leukämien und ähnliche Erkrankungen können durch Verabreichung eines Therapeutikums, das die Funktion der Polynukleotide und/oder Polypeptide der Erfindung fördert oder inhibiert, behandelt oder verhindert werden. Solche Leukämien und ähnlichen Erkrankungen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, akute Leukämie, akute lymphatische Leukämie, akute myeloische Leukämie, Myeloblasten-, Promyelozyten-, Myelomonozyten-, Monozyten-, Erythroleukämie, chronische Leukämie, chronische myeloische (granulozytäre) Leukämie und chronische lymphatische Leukämie (zwecks eines Überblicks über solche Erkrankungen siehe Fishman et al., 1985, Medicine, 2. Ausg., J.B. Lippincott Co., Philadelphia).
4.7.15 ERKRANKUNGEN DES NERVENSYSTEMS
Erkrankungen des Nervensystems, die Zelltypen involvieren, die auf Wirksamkeit der Intervention mit Verbindungen, die die Aktivität der Polynukleotide und/oder Polypeptide der Erfindung modulieren, getestet werden können, und die behandelt werden können, woraufhin ein Hinweis auf den therapeutischen Nutzen beobachtet wird, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Verletzungen des Nervensystems und Erkrankungen oder Störungen, die in entweder einer Abtrennung von Axonen, einer Abnahme oder Degeneration von Neuronen oder Demyelinisation resultieren. Läsionen des Nervensystems, die in einem Patienten (einschließlich menschlicher und nicht menschlicher Säugetierpatienten) erfindungsgemäß behandelt werden können, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, die folgenden Läsionen entweder des Zentralnervensystems (einschließlich Rückenmark, Gehirn) oder des peripheren Nervensystems:

(i) traumatische Läsionen, einschließlich Läsionen, die von physikalischer Verletzung verursacht wurden oder mit einem chirurgischen Eingriff in Verbindung stehen, beispielsweise Läsionen, die einen Teil des Nervensystems abtrennen, oder Kompressionsverletzungen;
(ii) ischämische Verletzungen, bei denen ein Stauerstoffmangel in einem Teil des Nervensystems in der Verletzung oder dem Tod von Neuronen resultiert, einschließlich Hirninfarkt oder -ischämie oder Rückenmarksinfarkt oder -ischämie;
(iii) infektiöse Läsionen, bei denen ein Teil des Nervensystems aufgrund einer Infektion, beispielsweise durch einen Abszess, oder in Verbindung mit einer Infektion durch das humane Immundefizienzvirus (HIV), Gürtelrose oder das Herpes-simplex-Virus oder mit Lyme-Borreliose, Tuberkulose, Syphilis zerstört oder verletzt ist;
(iv) degenerative Läsionen, bei denen ein Teil des Nervensystems aufgrund eines degenerativen Prozesses zerstört oder verletzt wurde, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, mit Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington oder amyotrophischer Lateralsklerose verbundener Degeneration;
(v) mit ernährungsbedingten Erkrankungen oder Störungen verbundene Läsionen, bei denen ein Teil des Nervensystems durch eine ernährungsbedingte Stoffwechselerkrankung oder Störung zerstört oder verletzt wurde, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Vitamin-B12-Mangel, Folsäuremangel, Wernicke-Enzephalopathie, Tabak/Alkohol-Amblyopie, Marchiafava-Bignami-Syndrom (primäre Degeneration des Corpus callosum) und alkoholbedingte Kleinhirndegeneration;
(vi) neurologische Läsionen, die mit systemischen Erkrankungen in Verbindung stehen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Diabetes (diabetische Neuropathie, einseitige Fazialislähmung), systemischer Lupus erythematodes, Karzinom oder Sarkoidose;
(vii) Läsionen, die von toxischen Substanzen verursacht wurden, einschließlich Alkohol, Blei oder insbesondere Neurotoxine; und
(viii) demyelinisierte Läsionen, bei denen ein Teil des Nervensystems von einer Entmarkungskrankheit zerstört oder verletzt wurde, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, multipler Sklerose, mit dem humanen Immundefizienzvirus assoziierter Rückenmarkserkrankung, Querschnittsmyelopathie oder verschiedene Ätiologien, progressiver multifokaler Leukoenzephalopathie und zentraler pontiner Myelinolyse.

Therapeutika, die zur Behandlung einer Erkrankung des Nervensystems geeignet sind, können ausgewählt werden, indem auf biologische Aktivität beim Fördern des Überlebens oder der Differenzierung von Neuronen getestet wird. Zum Beispiel und nicht einschränkend, Therapeutika, die eine der folgenden Wirkungen hervorrufen, können gemäß der Offenbarung von Nutzen sein:

(i) verlängerte Überlebenszeit von Neuronen in Kultur;
(ii) erhöhtes Sprießen von Neuronen in Kultur oder in vivo;
(iii) erhöhte Produktion eines neuronassoziierten Moleküls in Kultur oder in vivo, z. B. Cholinacetyltransferase oder Acetylcholinesterase bezüglich Motoneuronen; oder
(iv) verminderte Symptome von Neuronendysfunktion in vivo.

Solche Wirkungen können mit einem beliebigen in der Technik bekannten Verfahren gemessen werden. In bevorzugten, nicht einschränkenden Ausführungsformen kann ein erhöhtes Überleben von Neuronen mit dem in Arakawa et al. (1990, J. Neurosci. 10:3507-3515) dargelegten Verfahren gemessen werden; ein erhöhtes Sprießen von Neuronen kann mit in Pestronk et al. (1980, Exp. Neurol. 70:65-82) oder Brown et al. (1981, Ann. Rev. Neurosci. 4:17-42) dargelegten Verfahren nachgewiesen werden; eine erhöhte Produktion von neuronassoziierten Molekülen kann je nach dem zu messenden Molekül mittels Bioassay, enzymatischem Assay, Antikörperbindung, Northern-Blot-Assay usw. gemessen werden und eine Motoneuronendysfunktion kann gemessen werden, indem die physische Manifestation von Motoneuronenerkrankung, z. B. Schwäche, Motoneuronenleitungsgeschwindigkeit oder funktionelle Behinderung, beurteilt wird.
In spezifischen Ausführungsformen beinhalten Motoneuronenerkrankungen, die gemäß der Offenbarung behandelt werden können, Erkrankungen wie Infarkt, Infektion, Aussetzung gegenüber Toxin, Trauma, von einem chirurgischen Eingriff herrührende Schäden, degenerative Erkrankung oder Malignom, die die Motoneuronen sowie andere Bestandteile des Nervensystems beeinträchtigen können, als auch Erkrankungen, die Neuronen selektiv beeinträchtigen, wie amyotrophische Lateralsklerose, und einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Cruveilhier'-Krankheit, progressiver Bulbärparalyse, primärer Lateralsklerose, infantiler und juveniler Muskelatrophie, familiärer progressiver Bulbärparalyse (Fazio-Londe-Syndrom), Polio und des Post-Polio-Syndroms und hereditärer motorisch-sensorischer Neuropathie (Charcot-Marie-Krankheit), sind jedoch nicht darauf beschränkt.
4.7.16 ANDERE AKTIVITÄTEN
Ein Polypeptid der Erfindung kann auch eine oder mehrere der folgenden zusätzlichen Aktivitäten oder Wirkungen aufweisen: Inhibieren des Wachstums, der Infektion oder der Funktion oder Abtöten von infektiösen Agentien, einschließlich, ohne Einschränkung, Bakterien, Viren, Pilze und anderer Parasiten; Erwirken (Unterdrücken oder Verstärken) von Körpercharakteristika, einschließlich, ohne Einschränkung, Größe, Gewicht, Haarfarbe, Augenfarbe, Haut, Körperfettverhältnis oder andere Gewebepigmentierung oder Organ- oder Körperteilgröße oder -form (wie beispielsweise Brustvergrößerung oder -verkleinerung, Änderung der Knochenform oder -gestalt); Erwirken von Biorhythmen oder zirkadianen Zyklen oder Rhythmen; Erwirken der Fertilität von männlichen oder weiblichen Patienten; Erwirken des Stoffwechsels, des Abbaustoffwechsels, des Aufbaustoffwechsels, der Verarbeitung, der Nutzung, der Speicherung oder der Eliminierung von diätetischem Fett, Lipid, Protein, Kohlenhydrat, diätetischen Vitaminen, Mineralien, Kofaktoren oder anderen Ernährungsfaktoren oder einem anderen Ernährungsbestandteil oder anderen Ernährungsbestandteilen; Erwirken von Verhaltenscharakteristika, einschließlich, ohne Einschränkung, Appetit, Libido, Stress, Wahrnehmung (einschließlich Wahrnehmungsstörungen), Depression (einschließlich Depressionserkrankungen) und gewalttätigen Verhaltensweisen; Bereitstellen von analgetischen Wirkungen oder anderen schmerzreduzierenden Wirkungen; Fördern von Differenzierung und Wachstum von embryonalen Stammzellen, die einen anderen Stammbaum als einen hämopoetischen Stammbaum aufweisen; hormonale oder endokrine Aktivität; im Fall von Enzymen Beheben von Defiziten an dem Enzym und Behandeln von defizitähnlichen Erkrankungen; Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen (wie beispielsweise Psoriasis); immunglobulinartige Aktivität (wie beispielsweise die Fähigkeit, Antigen oder Komplement zu binden) und die Fähigkeit, in einer Impfstoffzusammensetzung als ein Antigen zu fungieren, um einen Immunreaktion gegen ein solches Protein oder ein anderes Material oder eine andere Funktionseinheit, das bzw. die mit einem solchen Protein kreuzreaktiv ist, zu steigern.
4.7.17 IDENTIFIZIERUNG VON POLYMORPHISMEN
Die Demonstration von Polymorphismen macht die Identifizierung solcher Polymorphismen in menschlichen Patienten und die pharmakogenetische Verwendung dieser Information zur Diagnose und Behandlung möglich. Solche Polymorphismen können mit z. B. einer unterschiedlichen Veranlagung oder Suszeptibilität für verschiedene Krankheitszustände (wie Störungen, die Entzündung oder Immunreaktion einschließen) oder einer unterschiedlichen Reaktion auf Arzneimittelverabreichung in Beziehung stehen und diese genetische Information kann dazu verwendet werden, die präventive oder therapeutische Behandlung dementsprechend maßzuschneidern. Zum Beispiel macht die Existenz eins Polymorphismus, der mit einer Veranlagung für Entzündung oder Autoimmunerkrankung assoziiert ist, die Diagnose dieses Zustands in Menschen möglich, indem das Vorliegen des Polymorphismus identifiziert wird.
Polymorphismen können auf eine Vielfalt von in der Technik bekannten Weisen identifiziert werden, die im Allgemeinen das Erlangen einer Probe von einem Patienten, das Analysieren der DNA aus der Probe, gegebenenfalls die Isolierung oder Amplifikation der DNA umfassend, und das Identifizieren des Vorliegens des Polymorphismus in der DNA involviert. Zum Beispiel kann PCR verwendet werden, um ein entsprechendes Fragment genomischer DNA zu amplifizieren, das dann sequenziert werden kann. Alternativ kann die DNA allelspezifischer Oligonukleotidhybridisierung (in der entsprechende Oligonukleotide unter Bedingungen, die den Nachweis einer einzigen Basenfehlpaarung ermöglichen, an die DNA hybridisiert werden) oder einem Einzelnukleotiderweiterungsassay (in dem ein Oligonukleotid, das direkt angrenzend an die Position des Polymorphismus hybridisiert, mit einem oder mehreren markierten Nukleotiden erweitert wird) unterzogen werden. Des Weiteren kann herkömmliche Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-Analyse (unter Verwendung von Restriktionsenzymen, die einen unterschiedlichen Verdau der genomischen DNA in Abhängigkeit von dem Vorliegen oder dem Fehlen des Polymorphismus bereitstellt) durchgeführt werden. Es können Arrays mit Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Polymorphismen nachzuweisen. Das Array kann hierin offenbarte modifizierte Nukleotidsequenzen umfassen, um die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung nachzuweisen. Als Alternative kann eine beliebige der Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung auf dem Array angeordnet werden, um Veränderungen dieser Sequenzen nachzuweisen.
Alternativ könnte ein Polymorphismus, der in einer Veränderung der Aminosäuresequenz resultiert, auch nachgewiesen werden, indem eine entsprechende Veränderung der Aminosäuresequenz des Proteins, z. B. durch einen Antikörper, der für die Variantsequenz spezifisch ist, nachgewiesen wird.
4.7.18 ARTHRITIS UND ENTZÜNDUNG
Die immunsuppressiven Wirkungen der Zusammensetzungen der Erfindung gegen rheumatoide Arthritis werden in einem experimentellen Tiermodellsystem bestimmt. Das experimentelle Modellsystem ist durch Adjuvantien induzierte Arthritis in Ratten und das Protokoll wird von J. Holoshitz et al., 1983, Science, 219:56, oder von B. Waksman et al., 1963, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 23:129, beschrieben. Die Induktion der Erkrankung kann durch eine einzige Injektion, im Allgemeinen intradermal, einer Suspension von abgetötetem Mycobacterium tuberculosis in komplettem Freund-Adjuvans (complete Freund's adjuvant, CFA) bewirkt werden. Der Injektionsweg kann variieren, Ratten können jedoch am Ende des Schwanzes mit einer Adjuvansmischung injiziert werden. Das Polypeptid wird in phosphatgepufferter Lösung (phosphate buffered solution, PBS) in einer Dosis von etwa 1-5 mg/kg verabreicht. Die Kontrolle besteht aus einer Verabreichung von lediglich PBS.
Die Vorgehensweise zum Testen der Wirkungen der Testverbindung würde aus dem intradermalen Injizieren von abgetötetem Mycobacterium tuberculosis in CFA, gefolgt von sofortigem Verabreichen der Testverbindung und anschließender Behandlung alle zwei Tage bis Tag 24 bestehen. 14, 15, 18, 20, 22 und 24 Tage nach Injektion von Mycobacterium/CFA kann ein Gesamt-Arthritis-Score wie von J. Holoshitz, oben, beschrieben erhalten werden. Eine Analyse der Daten würde offen legen, dass die Testverbindung eine drastische Wirkung auf die Schwellung der Gelenke haben würde, wie durch eine Verringerung des Arthritis-Score gemessen.
4.8 THERAPEUTISCHE VERFAHREN
Die hierin offenbarten Zusammensetzungen (einschließlich Polypeptidfragmente, Analoga, Varianten und Antikörper oder anderer Bindungspartner oder Modulatoren, einschließlich Antisense-Polynukleotide) haben zahlreiche Anwendungen in einer Vielfalt von therapeutischen Verfahren. Beispiele von therapeutischen Anwendungen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, die hierin beispielhaft gezeigten.
4.8.1 BEISPIEL
Ein Beispiel ist die Verabreichung einer wirksamen Menge der Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptide oder einer anderen Zusammensetzung der Erfindung an Einzelpersonen, die von einer Erkrankung oder Störung betroffen sind, die mittels Regulieren der hierin offenbarten Peptide moduliert werden kann. Obgleich der Verabreichungsmodus nicht besonders wichtig ist, ist parenterale Verabreichung bevorzugt. Ein beispielhafter Verabreichungsmodus besteht darin, eine intravenöse Schnellinjektion zu setzen. Die Dosierung von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptiden oder einer anderen Zusammensetzung der Erfindung wird normalerweise vom verschreibenden Arzt bestimmt. Es wird erwartet, dass die Dosierung je nach dem Alter, Gewicht, Zustand und Ansprechen des individuellen Patienten variieren wird. In der Regel wird die pro Dosis verabreichte Polypeptidmenge im Bereich von etwa 0,01 μg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht liegen, wobei die bevorzugte Dosis etwa 0,1 μg/kg bis 10 mg/kg Körpergewicht des Patienten beträgt. Zur parenteralen Verabreichung werden hierin offenbarte Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptide in einer injizierbaren Form, kombiniert mit einem pharmazeutisch unbedenklichen parenteral verabreichbaren Vehikel formuliert. Solche Vehikel sind in der Technik wohl bekannt und Beispiele beinhalten Wasser, Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung und Lösungen, die aus geringen Mengen des menschlichen Serumalbumins bestehen. Das Vehikel kann geringfügige Mengen von Additiven enthalten, die die Isotonie und Stabilität des Polypeptids oder eines anderen Wirkstoffs bewahren. Die Zubereitung solcher Lösungen liegt innerhalb des Niveaus des fachmännischen Könnens in der Technik.
4.9 PHARMAZEUTISCHE FORMULIERUNGEN UND VERABREICHUNGSWEGE
Ein Protein oder eine andere hierin offenbarte Zusammensetzung (von welcher Quelle auch immer abgeleitet, einschließlich, ohne Einschränkung, von rekombinanten und nicht rekombinanten Quellen und einschließlich Antikörpern und anderer Bindungspartner der hierin offenbarten Polypeptide) kann an einen bedürftigen Patienten für sich oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen es bzw. sie mit geeigneten Trägersubstanzen oder einem geeigneten Arzneimittelträger bzw. geeigneten Arzneimittelträgern in Dosen zum Behandeln oder Bessern einer Vielfalt von Störungen gemischt wird, verabreicht werden. Eine solche Zusammensetzung kann fakultativ (neben dem Protein oder einem anderen Wirkstoff und einer Trägersubstanz) Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisierungsmittel, Lösungsvermittler und andere in der Technik wohl bekannte Stoffe enthalten. Der Ausdruck „pharmazeutisch unbedenklich" steht für einen nicht toxischen Stoff, der die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des Wirkstoffs bzw. der Wirkstoffe nicht störend beeinflusst. Die Charakteristika der Trägersubstanz werden von dem Verabreichungsweg abhängen. Die hierin offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung kann außerdem Zytokine, Lymphokine oder andere hämopoetische Faktoren wie M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G- CSF, Meg-CSF, Thrombopoetin, Stammzellfaktor und Erythropoetin enthalten. In weiteren Zusammensetzungen können Proteine der Erfindung mit anderen Agentien kombiniert werden, die für die Behandlung der betreffenden Erkrankung oder Störung förderlich sind. Diese Agentien beinhalten verschiedene Wachstumsfaktoren, wie epidermaler Wachstumsfaktor (epidermal growth factor, EGF), aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (platelet-derived growth factor, PDGF), von transformierten Zellen gebildete Wachstumsfaktoren (transforming growth factors) (TGF-α und TGF-β), insulinähnlicher Wachstumsfaktor (insulin-like growth factor, IGF), sowie hierin beschriebene Zytokine.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin andere Agentien enthalten, die entweder die Aktivität des Proteins oder eines anderen Wirkstoffs verstärken oder seine Aktivität oder Verwendung bei einer Behandlung ergänzen. Solche zusätzlichen Faktoren und/oder Agentien können in die pharmazeutische Zusammensetzung eingebunden werden, um eine synergistische Wirkung mit dem Protein oder anderen Wirkstoff der Erfindung hervorzurufen oder um Nebenwirkungen zu minimieren. Umgekehrt kann das Protein oder der andere Wirkstoff der vorliegenden Erfindung in Formulierungen des bestimmten Gerinnungsfaktors, Zytokins, Lymphokins, anderen hämopoetischen Faktors, thrombolytischen oder antithrombotischen Faktors oder entzündungshemmenden Mittels eingebunden werden, um Nebenwirkungen des Gerinnungsfaktors, Zytokins, Lymphokins, anderen hämopoetischen Faktors, thrombolytischen oder antithrombotischen Faktors oder entzündungshemmenden Mittels (wie IL-1 Ra, IL-1 Hy1, IL-1 Hy2, Anti-TNF, Kortikosteroide, Immunsuppressiva) zu minimieren. Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann in Multimeren (z. B. Heterodimeren oder Homodimeren) oder Komplexen mit sich selbst oder anderen Proteinen aktiv sein. Demzufolge können hierin offenbarte pharmazeutische Zusammensetzungen ein Protein der Erfindung in einer solchen multimeren oder komplexierten Form umfassen.
Als Alternative zum Einbinden in eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erstes Protein enthält, kann ein zweites Protein oder ein Therapeutikum gleichzeitig (z. B. zur selben Zeit oder zu verschiedenen Zeitpunkten, vorausgesetzt, dass therapeutische Konzentrationen der Kombination von Agentien an der Behandlungsstelle erzielt werden) mit dem ersten Protein verabreicht werden. Techniken zur Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der augenblicklichen Erfindung lassen sich in „Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, neueste Ausgabe, finden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich weiterhin auf diejenige Menge der Verbindung, die dazu ausreicht, in einer Besserung von Symptomen, z. B. Behandlung, Heilung, Prävention oder Besserung des relevanten medizinischen Zustands, oder einem Anstieg der Geschwindigkeit der Behandlung, Heilung, Prävention oder Besserung solcher Zustände zu resultieren. Bei Anwendung auf einen einzelnen Wirkstoff, der für sich verabreicht wird, bezieht sich eine therapeutisch wirksame Dosis auf diesen Wirkstoff allein. Bei Anwendung auf eine Kombination bezieht sich eine therapeutisch wirksame Dosis auf kombinierte Mengen der Wirkstoffe, die in der therapeutischen Wirkung resultieren, ob nun in Kombination, nacheinander oder gleichzeitig verabreicht.
Beim Ausüben des hierin offenbarten Verfahrens zur Behandlung oder Verwendung wird eine therapeutisch wirksame Menge von Protein oder einem anderen Wirkstoff an ein Säugetier mit einem zu behandelnden Zustand verabreicht. Das Protein oder der andere Wirkstoff kann gemäß dem offenbarten Verfahren entweder für sich oder in Kombination mit anderen Therapien, wie Behandlungen, die Zytokine, Lymphokine oder andere hämopoetische Faktoren einsetzen, verabreicht werden. Bei gemeinsamer Verabreichung mit einem oder mehreren Zytokinen, Lymphokinen oder anderen hämopoetischen Faktoren kann das Protein oder der andere Wirkstoff entweder gleichzeitig mit dem Zytokin bzw. den Zytokinen, dem Lymphokin bzw. den Lymphokinen, dem anderen hämopoetischen Faktor bzw. den anderen hämopoetischen Faktoren, thrombolytischen oder antithrombotischen Faktoren verabreicht werden oder sie können sequentiell verabreicht werden. Wenn sie sequentiell verabreicht werden, wird der behandelnde Arzt die adäquate Abfolge des Verabreichens des Proteins oder anderen Wirkstoffs in Kombination mit einem Zytokin bzw. Zytokinen, einem Lymphokin bzw. Lymphokinen, einem anderen hämopoetischen Faktor bzw. anderen hämopoetischen Faktoren, thrombolytischen oder antithrombotischen Faktoren festsetzen.
4.9.1 VERABREICHUNGSWEGE
Geeignete Verabreichungswege können beispielsweise orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung; parenterale Abgabe, einschließlich intramuskulärer, subkutaner, intramedullärer Injektionen sowie intrathekaler, direkter intraventrikulärer, intravenöser, intraperitonealer, intranasaler oder intraokularer Injektionen, beinhalten. Die Verabreichung von Protein oder anderem Wirkstoff, das bzw. der in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird, oder zum Ausüben des offenbarten Verfahrens kann auf eine Vielfalt von herkömmlichen Wegen ausgeführt werden, wie orale Ingestion, Inhalierung, topische Anwendung oder kutane, subkutane, intraperitoneale, parenterale oder intravenöse Injektion. Intravenöse Verabreichung an den Patienten ist bevorzugt.
Alternativ kann man die Verbindung auf eine lokale Weise anstelle einer systemischen Weise verabreichen, beispielsweise mittels Injektion der Verbindung direkt in ein arthritisches Gelenk oder in fibrotisches Gewebe, oftmals in einer Depot- oder Retardformulierung. Um den Narbenbildungsprozess zu verhindern, der häufig als Komplikation von Glaukomchirurgie auftritt, können die Verbindungen topisch, beispielsweise als Augentropfen, verabreicht werden. Darüber hinaus kann man das Arzneimittel in einem System mit gesteuerter Arzneimittelabgabe verabreichen, beispielsweise in einem Liposom, das mit einem spezifischen Antikörper überzogen ist, der sich beispielsweise auf arthritisches oder fibrotisches Gewebe richtet. Die Liposome werden auf das betroffene Gewebe gerichtet und von diesem selektiv aufgenommen.
Die hierin offenbarten Polypeptide werden mittels eines beliebigen Wegs verabreicht, der eine wirksame Dosierung an die gewünschte Aktionsstelle liefert. Die Bestimmung eines geeigneten Verabreichungswegs und einer wirksamen Dosierung für eine bestimmte Indikation liegt innerhalb des Niveaus des fachmännischen Könnens in der Technik. Vorzugsweise verabreicht man zur Wundenbehandlung die therapeutische Verbindung direkt an die Stelle. Geeignete Dosierungsbereiche für die offenbarten Polypeptide können aus diesen Dosierungen oder aus ähnlichen Studien in adäquaten Tiermodellen extrapoliert werden. Die Dosierungen können dann von dem Arzt nach Bedarf eingestellt werden, um einen maximalen therapeutischen Nutzen bereitzustellen.
4.9.2 ZUSAMMENSETZUNGEN/FORMULIERUNGEN
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Offenbarung können somit auf herkömmliche Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch unbedenklicher Trägersubstanzen formuliert werden, die Arzneimittelträger und Hilfsstoffe umfassen und die die Einarbeitung der Wirkverbindung in Präparate, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf eine Weise hergestellt werden, die an sich bekannt ist, z. B. mit Hilfe herkömmlicher Misch-, Lösungs-, Granulier-, Dragéeherstellungs-, Pulverisier-, Emulgier-, Einkapselungs-, Einfang- oder Lyophilisierprozesse. Die korrekte Formulierung hängt von dem gewählten Verabreichungsweg ab. Wenn eine therapeutisch wirksame Menge von Protein oder anderem Wirkstoff oral verabreicht wird, wird das Protein oder der andere Wirkstoff in Form einer Tablette, einer Kapsel, eines Pulvers, einer Lösung oder eines Elixiers sein. Bei Verabreichung in Tablettenform kann die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich eine feste Trägersubstanz, wie eine Gelatine oder ein Adjuvans, enthalten. Die Tablette, die Kapsel und das Pulver enthalten von etwa 5 bis 95 % Protein oder anderen Wirkstoff und vorzugsweise von etwa 25 bis 90 % Protein oder anderen Wirkstoff. Bei Verabreichung in flüssiger Form kann eine flüssige Trägersubstanz, wie Wasser, Petroleum, Öle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, wie Erdnussöl, Mineralöl, Sojabohnenöl oder Sesamöl, oder synthetische Öle, zugegeben werden. Die flüssige Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann weiterhin physiologische Kochsalzlösung, Dextroselösung oder eine Lösung eines anderen Saccharids oder Glykole wie Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol enthalten. Bei Verabreichung in flüssiger Form enthält die pharmazeutische Zusammensetzung von etwa 0,5 bis 90 Gew.-% Protein oder anderen Wirkstoff und vorzugsweise von etwa 1 bis 50 Gew.-% Protein oder anderen Wirkstoff.
Wenn eine therapeutisch wirksame Menge von Protein oder anderem Wirkstoff mittels intravenöser, kutaner oder subkutaner Injektion verabreicht wird, wird das Protein oder der andere Wirkstoff in Form einer pyrogenfreien, parenteral unbedenklichen wässrigen Lösung sein. Die Herstellung solcher parenteral unbedenklichen Lösungen des Proteins oder anderen Wirkstoffs, mit gebührender Beachtung des pH-Werts, der Isotonie, der Stabilität und dergleichen, liegt innerhalb des fachmännischen Könnens in der Technik. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen, kutanen oder subkutanen Injektion sollte neben dem Protein oder anderen Wirkstoff ein isotonisches Vehikel, wie Natriumchloridinjektionslösung, Ringer-Injektionslösung, Dextroseinjektionslösung, Injektionslösung mit Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktatinjektionslösung oder ein anderes Vehikel, wie es in der Technik bekannt ist, enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch Stabilisierungsmittel, Konservierungsmittel, Puffer, Antioxidantien oder andere Additive, die dem Fachmann bekannt sind, enthalten. Zur Injektion können die offenbarten Agentien in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern, wie Hanks-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischem Kochsalzpuffer, formuliert werden. Zur transmukosalen Verabreichung werden Penetrationsverbesserer, die entsprechend der zu durchdringenden Barriere sind, in der Formulierung verwendet. Solche Penetrationsverbesserer sind in der Technik allgemein bekannt.
Zur oralen Verabreichung können die Verbindungen einfach formuliert werden, indem die Wirkverbindungen mit in der Technik wohl bekannten pharmazeutisch unbedenklichen Trägersubstanzen kombiniert werden. Solche Trägersubstanzen ermöglichen, dass die hierin offenbarten Verbindungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Breie, Suspensionen und dergleichen zur oralen Ingestion durch einen zu behandelnden Patienten formuliert werden können. Pharmazeutische Präparate zur oralen Verwendung können erhalten werden, indem fester Arzneimittelträger, gegebenenfalls eine resultierende Mischung gemahlen und die Mischung von Granalien verarbeitet wird, nachdem geeignete Hilfsstoffe, falls gewünscht, zugegeben wurden, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Arzneimittelträger sind insbesondere Füllstoffe, wie Zucker, einschließlich Laktose, Saccharose, Mannit oder Sorbit; Cellulosepräparate, wie beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragant, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Auf Wunsch können den Zerfall bewirkende Substanzen zugegeben werden, wie das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar-Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat. Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die fakultativ Gummi arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösemittel oder Lösemittelgemische enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können den Tabletten oder Drageeüberzügen zugesetzt werden, zur Identifizierung oder um unterschiedliche Kombinationen von Wirkverbindungsdosen zu kennzeichnen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die oral verwendet werden können, beinhalten Hartkapseln, die aus Gelatine hergestellt sind, sowie weiche, versiegelte Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie Glycerin oder Sorbit, hergestellt sind. Die Hartkapseln können die Wirkstoffe in Mischung mit Füllstoff wie Laktose, Bindemitteln wie Stärken und/oder Gleitmitteln wie Talkum oder Magnesiumstearat und fakultativ Stabilisierungsmitteln enthalten. In Weichkapseln können die Wirkverbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglykolen, gelöst oder suspendiert sein. Alle Formulierungen zur oralen Verabreichung sollten in für eine solche Verabreichung geeigneten Dosierungen vorliegen. Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Lutschpastillen, die auf herkömmliche Weise formuliert wurden, annehmen.
Zur Verabreichung mittels Inhalierung werden die Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Offenbarung zweckmäßig in Form einer Aerosolspraydarreichung aus Druckpackungen oder einem Zerstäuber geliefert, mit der Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas. Im Fall eines unter Druck gesetzten Aerosols kann die Dosiseinheit festgelegt werden, indem ein Ventil bereitgestellt wird, um eine abgemessene Menge abzugeben. Kapseln und Patronen von z. B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalationsapparat oder Insufflationsapparat können formuliert werden, die eine Pulvermischung der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis, wie Laktose oder Stärke, enthalten. Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung mittels Injektion, z. B. mittels Schnellinjektion oder Dauerinfusion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Einheitsdosisform, z. B. in Ampullen oder in Mehrfachdosenbehältnissen, mit einem zugesetzten Konservierungsmittel dargereicht werden. Die Zusammensetzungen können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln annehmen und können Formulierungsagentien wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel enthalten.
Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung beinhalten wässrige Lösungen der Wirkverbindungen in wasserlöslicher Form. Darüber hinaus können Suspensionen der Wirkverbindungen als entsprechende ölige Injektionssuspensionen zubereitet werden. Geeignete lipophile Lösemittel oder Vehikel beinhalten Fettöle, wie Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposome. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Fakultativ kann die Suspension auch geeignete Stabilisierungsmittel oder Agentien enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung von stark konzentrierten Lösungen zu ermöglichen. Alternativ kann der Wirkstoff in Pulverform zur Konstitution in einem geeigneten Vehikel, z. B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor Gebrauch sein.
Die Verbindungen können auch in rektal verabreichbaren Zusammensetzungen, wie Zäpfchen oder Retentionsklistier, formuliert werden, die herkömmliche Zäpfchenbasen enthalten, wie Kakaobutter oder andere Glyceride. Neben den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als ein Depotpräparat formuliert werden. Solche langwirkenden Formulierungen können mittels Implantation (beispielsweise subkutan oder intramuskulär) oder mittels intramuskulärer Injektion verabreicht werden. Folglich können die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Stoffen (beispielsweise als eine Emulsion in einem unbedenklichen Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als schwer lösliche Derivate, beispielsweise als ein schwer lösliches Salz, formuliert werden.
Eine pharmazeutische Trägersubstanz für die hierin offenbarten hydrophoben Verbindungen ist ein Colösemittelsystem, das Benzylalkohol, eine unpolare grenzflächenaktive Substanz, ein wassermischbares organisches Polymer und eine wässrige Phase umfasst. Das Colösemittelsystem kann das VPD-Colösemittelsystem sein. VPD ist eine Lösung von 3 % (w/v) Benzylalkohol, 8 % (w/v) der unpolaren grenzflächenaktiven Substanz Polysorbat 80 und 65 % (w/v) Polyethylenglykol 300, die in absolutem Ethanol auf das Volumen aufgefüllt wird. Das VPD-Colösemittelsystem (VPD:5W) besteht aus VPD, die 1:1 mit 5%-iger Dextroselösung in Wasser verdünnt ist. Dieses Colösemittelsystem löst hydrophobe Bestandteile gut und entwickelt selbst bei systemischer Verabreichung eine geringe Toxizität. Naturgemäß können die Anteile eines Colösemittelsystems beträchtlich variiert werden, ohne dessen Löslichkeits- und Toxizitätscharakteristika zu zerstören. Des Weiteren kann die Identität der Colösemittelbestandteile variiert werden: Zum Beispiel können andere unpolare grenzflächenaktive Substanzen mit geringer Toxizität anstelle von Polysorbat 80 verwendet werden; der Umfang der Fraktion von Polyethylenglykol kann variiert werden; andere biokompatible Polymere können Polyethylenglykol ersetzen, z. B. Polyvinylpyrrolidon; und andere Zucker oder Polysaccharide können Dextrose ersetzen. Alternativ können andere Abgabesysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen eingesetzt werden. Liposome und Emulsionen sind wohl bekannte Beispiele von Abgabevehikeln oder Trägersubstanzen für hydrophobe Arzneimittel. Bestimmte organische Lösemittel wie Dimethylsulfoxid können ebenfalls eingesetzt werden, obgleich für gewöhnlich auf Kosten einer höheren Toxizität. Darüber hinaus können die Verbindungen unter Verwendung eines Retardsystems abgegeben werden, wie halbdurchlässige Matrizen fester hydrophober Polymere, die das Therapeutikum enthalten. Verschiedene Arten von Retardstoffen haben sich bewährt und sind dem Fachmann wohl bekannt. Retardkapseln können in Abhängigkeit von ihrer chemischen Beschaffenheit die Verbindungen ein paar Wochen bis zu mehr als 100 Tage lang abgeben. Je nach der chemischen Beschaffenheit und der biologischen Stabilität des therapeutischen ReMittel können weitere Strategien zur Stabilisierung des Proteins oder anderen Wirkstoffs eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können außerdem geeignete Fest- oder Gelphasenträgersubstanzen oder -arzneimittelträger umfassen. Beispiele solcher Trägersubstanzen oder Arzneimittelträger beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Kalziumcarbonat, Kalziumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere wie Polyethylenglykole. Viele der Wirkstoffe der Erfindung können als Salze mit pharmazeutisch verträglichen Gegenionen bereitgestellt werden. Solche pharmazeutisch unbedenklichen Basenadditionssalze sind jene Salze, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Säuren bewahren und die durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Basen, wie Natriumhydroxid, Magnesiumhydroxid, Ammoniak, Trialkylamin, Dialkylamin, Monoalkylamin, zweiwertige Aminosäuren, Natriumacetat, Kaliumbenzoat, Triethanolamin und dergleichen, erhalten werden.
Die hierin offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form eines Komplex des Proteins bzw. der Proteine oder des anderen Wirkstoffs zusammen mit Protein- oder Peptidantigenen sein. Das Protein- und/oder Peptidantigen wird an sowohl B- als auch T-Lymphozyten ein stimulierendes Signal abgeben. Die B-Lymphozyten werden dem Antigen über ihren Oberflächen-Immunglobulinrezeptor antworten. Die T-Lymphozyten werden dem Antigen über den T-Zellrezeptor (T cell receptor, TCR) nach Präsentation des Antigens durch MHC-Proteine antworten. MHC und strukturell ähnliche Proteine, einschließlich der von Klasse-I- und Klasse-II-MHC-Genen auf Wirtszellen kodierten, werden dazu dienen, das Peptidantigen bzw. die Peptidantigene den T-Lymphozyten zu präsentieren. Die Antigenbestandteile könnten auch als gereinigte MHC-Peptid-Komplex für sich oder mit kostimulierenden Molekülen, die T-Zellen direkt signalisieren können, bereitgestellt werden. Alternativ können Antikörper, die Oberflächen-Immunglobulin und andere Moleküle auf B-Zellen binden können, sowie Antikörper, die den TCR und andere Moleküle auf T-Zellen binden können, mit der hierin offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert werden.
Die hierin offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form eines Liposoms sein, in dem ein Protein der vorliegenden Anmeldung zusätzlich zu anderen pharmazeutisch unbedenklichen Trägersubstanzen mit amphipathischen Agentien, wie Lipiden, die in gehäufter Form als Mizellen, unlösliche Monoschichten, Flüssigkristalle oder lamellare Schichten in wässriger Lösung vorliegen, kombiniert wird. Geeignete Lipide zur liposomalen Formulierung beinhalten ohne Einschränkung Monoglyceride, Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithine, Phospholipide, Saponin, Gallensäuren und dergleichen. Die Herstellung solcher liposomalen Formulierung liegt innerhalb des Niveaus des fachmännischen Könnens in der Technik, wie beispielsweise in den US-Patentschriften Nr. 4,235,871; 4,501,728; 4,837,028 und 4,737,323 offenbart.
Die Menge von Protein oder anderem Wirkstoff in der pharmazeutischen Zusammensetzung wird von der Natur und Schwere des behandelnden Zustands und von der Natur vorheriger Behandlungen, denen der Patient unterzogen wurde, abhängen. Letztendlich wird der behandelnde Arzt die Menge von Protein oder anderem Wirkstoff festlegen, mit der jeder einzelne Patient zu behandeln ist. Anfangs wird der behandelnde Arzt niedrige Dosen des Proteins oder anderen Wirkstoffs verabreichen und die Reaktion des Patienten beobachten. Es können höhere Dosen des Proteins oder anderen Wirkstoffs verabreicht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten erzielt wird, und an diesem Punkt wird die Dosierung nicht weiter erhöht. Es ist vorgesehen, dass die verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zum Ausüben des offenbarten Verfahrens verwendet werden, etwa 0,01 μg bis etwa 100 mg (vorzugsweise etwa 0,1 μg bis etwa 10 mg, mehr bevorzugt etwa 0,1 μg bis etwa 1 mg) Protein oder anderen Wirkstoff pro kg Körpergewicht enthalten. Bei Zusammensetzungen, die zur Knochen-, Knorpel-, Sehnen- oder Bandregeneration geeignet sind, beinhaltet das therapeutische Verfahren das Verabreichen der Zusammensetzung topisch, systemisch oder lokal als ein Implantat oder eine Vorrichtung. Bei Verabreichung ist die therapeutische Zusammensetzung natürlich in einer pyrogenfreien, physiologisch unbedenklichen Form. Des Weiteren kann die Zusammensetzung wünschenswerterweise in einer viskosen Form zur Abgabe an die Stelle der Knochen-, Knorpel- oder Gewebeschäden eingekapselt oder injiziert werden. Die topische Verabreichung kann für die Wundheilung und Gewebereparatur geeignet sein. Therapeutisch geeignete Agentien, bei denen es sich nicht um ein Protein oder einen anderen Wirkstoff handelt und die ebenfalls gegebenenfalls in die wie oben beschriebene Zusammensetzung eingebunden werden können, können in den offenbarten Verfahren alternativ oder zusätzlich gleichzeitig oder sequentiell mit der Zusammensetzung verabreicht werden. Vorzugsweise würde die Zusammensetzung zur Knochen- und/oder Knorpelbildung eine Matrize enthalten, die die das Protein enthaltende oder den anderen Wirkstoff enthaltende Zusammensetzung an die Stelle der Knochen- und/oder Knorpelschäden liefern kann, wodurch sie eine Struktur für den entwickelnden Knochen und Knorpel bereitstellt und optimal vom Körper resorbiert werden kann. Solche Matrizen können aus Materialien gebildet werden, die derzeit für andere implantierte medizinische Anwendungen im Gebrauch sind.
Die Wahl des Matrizenmaterials wird auf Biokompatibilität, biologischen Abbaubarkeit, mechanischen Eigenschaften, kosmetischem Erscheinungsbild und Grenzflächeneigenschaften basiert. Die bestimmte Anwendung der Zusammensetzungen wird die entsprechende Formulierung definieren. Potentielle Matrizen für die Zusammensetzungen können biologisch abbaubar und chemisch definiertes Kalziumsulfat, Trikalziumphosphat, Hydroxyapatit und chemisch definierte Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Polyanhydride sein. Andere potentielle Materialien sind biologisch abbaubar und biologisch gut definiert, wie Knochen- oder Hautkollagen. Weitere Matrizen setzen sich aus reinen Proteinen oder extrazellulären Matrizenbestandteilen zusammen. Andere potentielle Materialien sind nicht biologisch abbaubar und chemisch definiert, wie gesintertes Hydroxyapatit, Bioglas, Aluminate oder andere Keramikmaterialien. Die Matrizen können sich aus Kombinationen beliebiger der oben erwähnten Materialarten zusammensetzen, wie Polymilchsäure und Hydroxyapatit oder Kollagen und Trikalziumphosphat. Die Zusammensetzung der Biokeramiken kann geändert werden, wie zu Kalzium-Aluminium-Phosphat, und die Verarbeitung kann geändert werden, um die Porengröße, Teilchengröße, Teilchenform und biologische Abbaubarkeit zu ändern. Derzeit wird ein Copolymer mit einem Verhältnis von 50:50 (Molekulargewicht) von Milchsäure zu Glykolsäure in Form von porösen Teilchen mit Durchmessern, die von 150 bis 800 Mikrometer reichen, bevorzugt. In manchen Anwendungen wird es nützlich sein, ein Maskierungsmittel, wie Carboxymethylcellulose oder autologes Blutgerinnsel, zu verwenden, um zu verhindern, dass die Proteinzusammensetzungen sich von der Matrize trennen.
Eine bevorzugte Familie von Maskierungsmitteln ist cellulosische Materialien, wie Alkylcellulosen (einschließlich Hydroxyalkylcellulosen), einschließlich Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Carboxymethylcellulose, wobei die am meisten bevorzugten kationische Salze von Carboxymethylcellulose (CMC) sind. Andere bevorzugte Maskierungsmittel beinhalten Hyaluronsäure, Natriumalginat, Poly(ethylenglykol), Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Poly(vinylalkohol). Die Menge von hierin verwendbarem Maskierungsmittel ist 0,5-20 Gew.-%, vorzugsweise 1-10 Gew.-%, auf Basis des Gesamtformulierungsgewichts, was die Menge darstellt, die dazu erforderlich ist, eine Desorption des Proteins von der Polymermatrize zu verhindern und eine adäquate Handhabung der Zusammensetzung bereitzustellen, jedoch nicht so sehr, dass die Vorläuferzellen darin gehindert werden, in die Matrize einzudringen, wodurch dem Protein die Möglichkeit geboten wird, die osteogene Aktivität der Vorläuferzellen zu unterstützen. In weiteren Zusammensetzungen können Proteine oder ein anderer Wirkstoff mit anderen Agentien kombiniert werden, die für die Behandlung des betreffenden Knochen- und/oder Knorpeldefekts, der betreffenden Wunde oder des betreffenden Gewebes förderlich ist. Diese Agentien beinhalten verschiedene Wachstumsfaktoren, wie epidermaler Wachstumsfaktor (epidermal growth factor, EGF), aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (platelet-derived growth factor, PDGF), von transformierten Zellen gebildete Wachstumsfaktoren (transforming growth factors) (TGF-α und TGF-β) und insulinähnlicher Wachstumsfaktor (insulin-like growth factor, IGF).
Die therapeutischen Zusammensetzungen sind derzeit auch für Tiermedizinanwendungen nützlich. Insbesondere Haustiere und Rassepferde sind neben Menschen für eine solche Behandlung mit Proteinen oder einem anderen Wirkstoff erwünschte Patienten. Die Dosierungsvorgabe einer Protein enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei der Geweberegeneration verwendet werden soll, wird vom behandelnden Arzt unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren, die die Aktion der Proteine modifizieren, bestimmt, z. B. die Quantität des Gewebegewichts, das zu bilden gewünscht wird, die Stelle des Schadens, der Zustand des geschädigten Gewebes, die Größe einer Wunde, die Art des geschädigten Gewebes (z. B. Knochen), das Alter, das Geschlecht und die Ernährungsgewohnheiten des Patienten, die Schwere einer etwaigen Infektion, die Verabreichungszeit und andere klinische Faktoren. Die Dosierung kann mit der Art der Matrize, die bei der Wiederherstellung verwendet wird, und mit Einbindung von anderen Proteinen in die pharmazeutische Zusammensetzung variieren. Zum Beispiel kann sich die Zugabe anderer bekannter Wachstumsfaktoren, wie IGF-I (insulinähnlicher Wachstumsfaktor I), zu der endgültigen Zusammensetzung ebenfalls auf die Dosierung auswirken. Der Fortschritt kann mittels periodischer Beurteilung des Gewebe-/Knochenwachstums und/oder der Gewebe-/Knochenreparatur, beispielsweise Röntgenstrahlen, histomorphometrische Bestimmungen und Tetracyclinmarkierung, überwacht werden.
Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können ebenfalls zur Gentherapie verwendet werden. Solche Polynukleotide können entweder in vivo oder ex vivo in Zellen zur Expression in einem Säugetierpatienten eingeführt werden. Die Polynukleotide der Erfindung können auch mittels anderer bekannter Verfahren zur Einführung von Nukleinsäure in eine Zelle oder einen Organismus (einschließlich, ohne Einschränkung, in Form von viralen Vektoren oder nackter DNA) verabreicht werden. Zellen können außerdem ex vivo in Gegenwart von Proteinen der vorliegenden Erfindung kultiviert werden, um zu proliferieren oder eine gewünschte Wirkung auf solche Zellen oder eine gewünschte Aktivität in diesen zu liefern. Behandelte Zellen können dann in den lebenden Organismus (in vivo) zu therapeutischen Zwecken eingeführt werden.
4.9.3 WIRKSAME DOSIERUNG
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Anmeldung geeignet sind, beinhalten Zusammensetzungen, in denen die Wirkstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um ihren beabsichtigen Zweck zu erzielen. Genauer gesagt steht eine therapeutisch wirksame Menge für eine Menge, die wirksam dabei ist, die Entwicklung der existierenden Symptome des behandelten Patienten zu verhindern oder diese zu lindern. Die Bestimmung der wirksamen Menge liegt gut innerhalb der Fertigkeiten des Fachmanns, insbesondere in Anbetracht der hierin bereitgestellten ausführlichen Offenbarung. Für eine beliebige in dem offenbarten Verfahren verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis zunächst aus geeigneten In-vitro-Assays abgeschätzt werden. Zum Beispiel kann eine Dosis in Tiermodellen formuliert werden, um einen Kreislaufkonzentrationsbereich zu erhalten, der dazu verwendet werden kann, geeignete Dosen in Menschen präziser zu bestimmen. Zum Beispiel kann eine Dosis in Tiermodellen formuliert werden, um einen Kreislaufkonzentrationsbereich zu erhalten, der den IC₅₀-Wert einschließt, wie er in Zellkultur bestimmt wurde (d. h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Inhibition der biologischen Aktivität des Proteins erzielt). Eine derartige Information kann dazu verwendet werden, geeignete Dosen in Menschen präziser zu bestimmen.
Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf die Menge der Verbindung, die in einer Besserung von Symptomen oder einer Verlängerung des Überlebens in einem Patienten resultiert. Die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen kann mittels standardmäßiger pharmazeutischer Vorgehensweisen in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z. B. zum Bestimmen des LD₅₀-Werts (die Dosis, die für 50 % der Population tödlich ist) und des ED₅₀-Werts (die Dosis, die in 50 % der Population therapeutisch wirksam ist). Das Verhältnis der Dosis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und dieser kann als das Verhältnis zwischen LD₅₀-Wert und ED₅₀-Wert ausgedrückt werden. Verbindungen, die hohe therapeutische Indices aufweisen, sind bevorzugt. Die aus diesen Zellkulturassays und Tierstudien erhaltenen Daten können beim Formulieren eines Dosierungsbereichs zur Verwendung im Menschen verwendet werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich von Kreislaufkonzentrationen, die den ED₅₀-Wert einschließen, mit wenig oder keiner Toxizität. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der eingesetzten Dosierungsform und des angewendeten Verabreichungswegs variieren. Die genaue Formulierung, der genaue Verabreichungsweg und die genaue Dosierung können von dem jeweiligen Arzt in Anbetracht des Zustands des Patienten gewählt werden. Siehe z. B. Fingl et al., 1975, in „The Pharmacological Basis of Therapeutics", Kap. 1, S. 1. Die Dosierungsmenge und das Dosierungsintervall können individuell eingestellt werden, um Plasmaspiegel des aktiven Anteils zu liefern, die dazu ausreichen, die gewünschten Wirkungen oder die minimale wirksame Konzentration (minimal effective concentration, MEC) aufrechtzuerhalten. Die MEC wird für jede Verbindung variieren, kann jedoch aus In-vitro-Daten abgeschätzt werden. Dosierungen, die zum Erzielen der MEC erforderlich sind, werden von individuellen Charakteristika und dem Verabreichungsweg abhängen. HPLC-Assays oder Bioassays können jedoch zum Bestimmen von Plasmakonzentrationen verwendet werden.
Die Dosierungsintervalle können ebenfalls unter Anwendung des MEC-Werts bestimmt werden. Die Verbindungen sollten unter Anwendung einer Vorgabe verabreicht werden, die die Plasmaspiegel 10-90 % der Zeit, vorzugsweise zwischen 30 und 90 % und am meisten bevorzugt zwischen 50 und 90 % über der MEC hält. In Fällen einer lokalen Verabreichung oder selektiven Aufnahme kann die wirksame lokale Konzentration des Arzneimittels nicht zu der Plasmakonzentration in Beziehung stehen.
Eine beispielhafte Dosierungsvorgabe für Polypeptide oder andere Zusammensetzungen wird im Bereich von täglich etwa 0,01 μg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht liegen, wobei die bevorzugte Dosis täglich etwa 0,1 μg/kg bis 25 mg/kg Körpergewicht des Patienten ist, wobei diese in Erwachsenen und Kindern variiert. Die Dosisgabe kann einmal täglich erfolgen oder es können äquivalente Dosen in längeren oder kürzeren Intervallen gegeben werden.
Die verabreichte Zusammensetzungsmenge wird natürlich von dem behandelten Patienten, dem Alter und Gewicht des Patienten, der Schwere des Gebrechens, der Verabreichungsweise und der Beurteilung durch den verschreibenden Arzt abhängen.
4.9.4 VERPACKUNG
Die Zusammensetzungen können auf Wunsch in einer Packung oder einer Abgabevorrichtung dargereicht werden, das bzw. die eine oder mehrere Einheitsdosisformen enthalten kann, die den Wirkstoff enthalten. Die Packung kann beispielsweise Metall- oder Kunststofffolie umfassen, wie eine Blisterpackung. Die Packung oder Abgabevorrichtung kann von Anweisungen zur Verabreichung begleitet sein. Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung umfassen, die in einer verträglichen pharmazeutischen Trägersubstanz formuliert ist, können ebenfalls hergestellt, in ein adäquates Behältnis gegeben und zur Behandlung eines angezeigten Zustands gekennzeichnet werden.
4.10 ANTIKÖRPER
4.10.1 MENSCHLICHE ANTIKÖRPER
Vollständig menschliche Antikörper beziehen sich auf Antikörpermoleküle, in denen im Wesentlichen die ganzen Sequenzen sowohl der leichten Kette als auch der schweren Kette, einschließlich der CDRs, von menschlichen Genen kommen. Solche Antikörper werden hierin als „menschliche Antikörper" oder „vollständig menschliche Antikörper" bezeichnet. Menschliche monoklonale Antikörper können mittels der Triomtechnik; der menschlichen B-Zellen-Hybridomtechnik (siehe Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72) und der EBV-Hybridomtechnik hergestellt werden, um menschliche monoklonale Antikörper zu produzieren (siehe Cole et al., 1985, in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96). Menschliche monoklonale Antikörper können bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung genutzt werden und können mittels Verwendung menschlicher Hybridome (siehe Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) oder mittels Transformieren menschlicher B-Zellen mit dem Epstein-Barr-Virus in vitro (siehe Cole et al., 1985, in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96) produziert werden. Darüber hinaus können menschliche Antikörper auch unter Anwendung weiterer Techniken produziert werden, einschließlich Phagen-Display-Bibliotheken (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). In ähnlicher Weise können menschliche Antikörper hergestellt werden, indem menschliche Immunglobulinloki in transgene Tiere, z. B. Mäuse, in denen die endogenen Immunglobulingene zum Teil oder vollständig inaktiviert wurden, eingeführt werden. Bei Anregung wird die Produktion menschlicher Antikörper beobachtet, die der, die in Menschen beobachtet wird, in allen Hinsichten stark ähnelt, einschließlich Genneuordnung, Assembly und Antikörperrepertoire. Diese Herangehensweise ist beispielsweise in den US-Patentschriften Nr. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 und in Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992)); Lonberg et al. (Nature 368, 856-859 (1994)); Morrison (Nature 368, 812-813 (1994)); Fishwild et al. (Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)); Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996)) und Lonberg und Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995)) beschrieben.
Menschliche Antikörper können darüber hinaus mit transgenen, nicht menschlichen Tieren produziert werden, die derart modifiziert werden, dass sie als Antwort auf eine Anregung durch ein Antigen anstelle der endogenen Antikörper des Tiers vollständig menschliche Antikörper produzieren. (Siehe PCT-Veröffentlichung WO94/02602.) Die endogenen Gene, die die schwere und die leichte Immunglobulinkette in dem nicht menschlichen Wirt kodieren, sind untauglich gemacht worden und aktive Loki, die Immunglobuline der menschlichen schweren und der menschlichen leichten Kette kodieren, werden in das Genom des Wirts inseriert. Die menschlichen Gene werden beispielsweise unter Verwendung von künstlichen Hefechromosomen, die die erforderlichen menschlichen DNA-Segmente enthalten, eingebunden. Ein Tier, das alle gewünschten Modifikationen liefert, wird dann als Progenitur erhalten, indem transgene Zwischentiere, die weniger als das vollständige Komplement der Modifikationen enthalten, gekreuzt werden. Die bevorzugte Ausführungsform eines solchen nicht menschlichen Tiers ist eine Maus und wird als die Xenomouse^TM bezeichnet, wie in den PCT-Veröffentlichungen WO 96/33735 und WO 96/34096 offenbart ist. Dieses Tier produziert B-Zellen, die menschliche Immunglobuline komplett sezernieren. Die Antikörper können nach Immunisierung mit einem Immunogen von Interesse, wie beispielsweise einem Präparat eines polyklonalen Antikörpers, direkt aus dem Tier oder alternativ aus immortalisierten B-Zellen, die von dem Tier abgeleitet wurden, wie Hybridome, die monoklonale Antikörper produzieren, erhalten werden. Darüber hinaus können die Gene, die die Immunglobuline mit menschlichen variablen Regionen kodieren, zurückgewonnen und exprimiert werden, um die Antikörper direkt zu erhalten, oder können weiter modifiziert werden, um Analoga von Antikörpern zu erhalten, wie beispielsweise Einzelketten-Fv-Moleküle.
Ein Beispiel eines Verfahrens zum Produzieren eines nicht menschlichen Wirts, als eine Maus beispielhaft gezeigt, dem es an Expression eines endogenen Immunglobulins der schweren Kette mangelt, ist in der US-Patentschrift Nr. 5,939,598 offenbart. Es kann mittels eines Verfahrens erhalten werden, das das Deletieren der J-Segment-Gene aus mindestens einem endogenen Lokus der schweren Kette in einer embryonalen Stammzelle, um die Neuordnung des Lokus zu verhindern und ein Transkript eines neu geordneten Immunglobulinlokus der schweren Kette zu verhindern, wobei die Deletion mit einem Targetierungsvektor bewirkt wird, der ein Gen enthält, das einen selektierbaren Marker kodiert; und das Produzieren einer transgenen Maus, deren somatische und Keimzellen das Gen enthalten, das den selektieren Marker enthält, aus der embryonalen Stammzelle beinhaltet.
Ein Verfahren zum Produzieren eines Antikörpers von Interesse, wie ein menschlicher Antikörper, ist in der US-Patentschrift Nr. 5,916,771 offenbart. Es beinhaltet das Einführen eines Expressionsvektors, das eine Nukleotidsequenz enthält, die eine schwere Kette kodiert, in eine Säugetierwirtszelle in Kultur, das Einführen eines Expressionsvektors, das eine Nukleotidsequenz enthält, die eine leichte Kette kodiert, in eine andere Säugetierwirtszelle und das Fusionieren der zwei Zellen, um eine Hybridzelle zu bilden. Die Hybridzelle exprimiert einen Antikörper, der die schwere Kette und die leichte Kette enthält.
In einer weiteren Verbesserung dieser Vorgehensweise sind ein Verfahren zum Identifizieren eines klinisch relevanten Epitops auf einem Immunogen und ein korrelierendes Verfahren zum Selektieren eines Antikörpers, der immunspezifisch mit hoher Affinität an das relevante Epitop bindet, in der PCT-Veröffentlichung WO 99/53049 offenbart.
4.10.2 FAB-FRAGMENTE UND EINZELKETTENANTIKÖRPER
Wie hierin beschrieben, können Techniken für die Produktion von Einzelkettenantikörpern, die für ein antigenes Protein der Erfindung spezifisch sind, angepasst werden (siehe z. B. US-Patentschrift Nr. 4,946,778). Des Weiteren können Verfahren für die Konstruktion von F_ab-Expressionsbibliotheken angepasst werden (siehe z. B. Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281), um eine schnelle und effiziente Identifizierung von monoklonalen F_ab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität für ein Protein oder Derivate, Fragmente, Analoga oder Homologa davon zu ermöglichen. Antikörperfragmente, die die Idiotypen zu einem Proteinantigen enthalten, können mittels in der Technik bekannter Techniken produziert werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt: (i) einem F_(ab')2-Fragment, das mittels Pepsinverdau eines Antikörpermoleküls produziert wird; (ii) einem F_ab-Fragment, das mittels Reduzieren der Disulfidbrücken eines F_(ab')2-Fragments erzeugt wird; (iii) einem F_ab-Fragment, das durch die Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt wird; und (iv) F_v-Fragmente.
4.10.3 BISPEZIFISCHE ANTIKÖRPER
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte Antikörper, die Bindungsspezifitäten für mindestens zwei unterschiedliche Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für ein antigenes Protein der Erfindung. Das zweite Bindungsziel ist ein beliebiges anderes Antigen und vorteilhafterweise ein Zelloberflächenprotein oder ein Zelloberflächenrezeptor oder eine Zelloberflächenrezeptoreinheit.
Verfahren zum Herstellen bispezifischer Antikörper sind in der Technik bekannt. Herkömmlich ist die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Koexpression von zwei Paaren aus schweren Immunglobulinketten/leichten Immunglobulinketten, wobei die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Milstein und Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Aufgrund der wahllosen Sortierung von schweren und leichten Immunglobulinketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) eine potentielle Mischung von zehn unterschiedlichen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls wird gewöhnlich mittels Affinitätschromatographieschritten durchgeführt. Ähnliche Vorgehensweisen sind in WO 93/08829, am 13. Mai 1993 veröffentlicht, und in Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659, offenbart.
Antikörpervariable Domänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) können an Sequenzen von konstanten Immunglobulin-Domänen fusioniert werden. Die Fusion ist vorzugsweise mit einer konstanten Domäne einer schweren Immunglobulinkette, die mindestens einen Teil der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es ist bevorzugt, dass die erste konstante Region der schweren Kette (CH1), die die Stelle enthält, die zur Bindung der leichten Kette erforderlich ist, in mindestens einer der Fusionen vorliegt. DNAs, die die Fusionen der schweren Immunglobulinketten und auf Wunsch die leichte Immunglobulinkette kodieren, werden in separate Expressionsvektoren inseriert und in einen geeigneten Wirtsorganismus kotransfiziert. Zwecks weiterer Details des Erzeugens bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
Gemäß einer anderen Herangehensweise, die in WO 96/27011 beschrieben ist, kann die Grenzfläche zwischen einem Paar von Molekülen so konstruiert werden, dass der Prozentanteil von Heterodimeren, die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden, maximiert wird. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst mindestens einen Teil der CH3-Region einer konstanten Antikörperdomäne. In diesem Verfahren werden eine oder mehrere kleine Aminosäureseitenketten von der Grenzfläche des ersten Antikörpermoleküls durch größere Seitenketten (z. B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt wird. Kompensatorische „Hohlräume" mit zu der großen Seitenkette bzw. den großen Seitenketten identischer oder ähnlicher Größe werden auf der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls erzeugt, indem große Aminosäureseitenketten durch kleinere (z. B. Alanin oder Threonin) ersetzt werden. Dies stellt einen Mechanismus zum Erhöhen der Ausbeute des Heterodimers gegenüber anderen unerwünschten Endprodukten wie Homodimeren bereit.
Bispezifische Antikörper können als vollständige Antikörper oder Antikörperfragmente (z. B. bispezifiche F(ab')₂-Antikörper) hergestellt werden. Techniken zum Erzeugen bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten sind in der Literatur beschrieben worden. Zum Beispiel können bispezifische Antikörper unter Anwendung chemischer Verknüpfung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229:81 (1985), beschreiben eine Vorgehensweise, bei der intakte Antikörper proteolytisch gespalten werden, um F(ab')₂-Fragmente zu erzeugen. Diese Fragmente werden in Gegenwart des dithiolkomplexierenden Mittel Natriumarsenit reduziert, um benachbarte Dithiole zu stabilisieren und eine intermolekulare Disulfidbildung zu verhindern. Die erzeugten Fab'-Fragmente werden dann in TNB-Derivate (TNB = Thionitrobenzoat) umgewandelt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann mittels Reduktion mit Mercaptoethylamin zurück in das Fab'-Thiol umgewandelt und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats gemischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die produzierten bispezifischen Antikörper können als Agentien für die selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
Darüber hinaus können Fab'-Fragmente direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gekoppelt werden, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten bispezifischen Antikörper-F(ab')₂-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde separat aus E. coli sezerniert und direkter chemischer Kopplung in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Der so gebildete bispezifische Antikörper war dazu in der Lage, an Zellen, die den ErbB2-Rezeptor überexprimieren, und normale menschliche T-Zellen zu binden sowie die lytische Aktivität von menschlichen zytotoxischen Lymphozyten gegen menschliche Brusttumorziele auszulösen.
Verschiedene Techniken zum Herstellen und Isolieren bispezifischer Antikörperfragmente direkt aus rekombinanter Zellkultur wurden ebenfalls beschrieben. Zum Beispiel wurden Bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucin-Zippern produziert. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden mittels Genfusion mit den Fab'-Teilen von zwei unterschiedlichen Antikörpern verknüpft. Die Antikörperhomodimere wurden an der Gelenkregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörperheterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Produktion von Antikörperhomodimeren genutzt werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), beschriebene „Diabody"-Technologie hat einen alternativen Mechanismus zum Herstellen bispezifischer Antikörperfragmente geliefert. Die Fragmente umfassen eine variable Domäne der schweren Kette (V_H), die mit einer variablen Domäne der leichten Kette (V_L) durch einen Linker verbunden ist, der zu kurz ist, um die Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen. Demgemäß sind die V_H-Domäne und die V_L-Domäne eines Fragments dazu gezwungen, mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments ein Paar zu bilden, wodurch zwei antigenbindende Stellen gebildet werden. Es wurde ebenfalls von einer anderen Strategie zum Herstellen bispezifischer Antikörperfragmente durch Verwendung von sFv-Dimeren (sFv = single-chain Fv, Einzelketten-Fv) berichtet. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).
Antikörper mit mehr als zwei Valenzen sind vorgesehen. Zum Beispiel können trispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
Beispielhafte bispezifische Antikörper können an zwei unterschiedliche Epitope binden, von denen mindestens eines von dem Proteinantigen der Erfindung herstammt. Alternativ kann ein Anti-Antigen-Arm eines Immunglobulinmoleküls mit einem Arm kombiniert werden, der an ein auslösendes Molekül auf einem Leukozyt, wie ein T-Zellrezeptormolekül (z. B. CD2, CD3, CD28 oder B7), oder Fc-Rezeptoren für IgG (Fc R), wie Fc RI (CD64), Fc RII (CD32) und Fc RIII (CD 16) bindet, um so Zellabwehrmechanismen auf die Zelle zu konzentrieren, die das bestimmte Antigen exprimiert. Bispezifische Antikörper können ebenfalls dazu verwendet werden, zytotoxische Agentien auf Zellen zu richten, die ein bestimmtes Antigen exprimieren. Diese Antikörper verfügen über einen antigenbindenden Arm und einen Arm, der ein zytotoxisches Mittel oder einen Radionuklidchelator, wie EOTUBE, DPTA, DOTA oder TETA, bindet. Ein anderer bispezifischer Antikörper von Interesse bindet das hierin beschriebene Proteinantigen und bindet weiterhin Gewebefaktor (tissue factor, TF).
4.10.4 HETEROKONJUGATANTIKÖRPER
Heterokonjugatantikörper liegen ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Anmeldung. Heterokonjugatantikörper setzen sich aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern zusammen. Solche Antikörper wurden zum Beispiel zum Richten von Zellen des Immunsystems auf unerwünschte Zellen (US-Patentschrift Nr. 4,676,980) und zur Behandlung von HIV-Infektion (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 ) vorgeschlagen. Es ist vorgesehen, dass die Antikörper in vitro unter Anwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel involvieren, hergestellt werden können. Zum Beispiel können Immunotoxine unter Anwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Bilden einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele geeigneter Reagentien zu diesem Zweck beinhalten Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat und die beispielsweise in der US-Patentschrift Nr. 4,676,980 offenbarten.
4.10.5 EFFEKTORFUNKTIONKONSTRUKTION
Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren, um so die Wirksamkeit des Antikörpers beim Behandeln von Krebs zu verstärken. Zum Beispiel können ein Cysteinrest bzw. mehrere Cysteinreste in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch eine Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten in dieser Region ermöglicht wird. Der so erzeugte homodimere Antikörper kann eine verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder eine erhöhte komplementvermittelte Zellabtötung und antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992), und Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992). Homodimere Antikörper mit verstärkter Anti-Tumoraktivität können gleichfalls unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer hergestellt werden, wie in Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993), beschrieben. Alternativ kann ein Antikörper konstruiert werden, der doppelte Fc-Regionen aufweist und dadurch eine verstärkte Komplementlyse und verstärkte ADCC-Fähigkeiten aufweisen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).
4.10.6 IMMUNKONJUGATE
Es werden Immunkonjugate offenbart, die einen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel, wie ein Chemotherapeutikum, ein Toxin (z. B. ein enzymatisch aktives Toxin bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder Fragmente davon) oder ein radioaktives Isotop (d. h. ein Radiokonjugat) konjugiert ist.
Chemotherapeutika, die bei der Erzeugung solcher Immunkonjugate nützlich sind, sind oben beschrieben worden. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, beinhalten Diphtherie-A-Kette, nicht bindende aktive Fragmente von Diphtherietoxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, Alpha-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthinproteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothene. Eine Vielfalt von Radionukliden steht zur Produktion von radiokonjugierten Antikörpern zur Verfügung. Beispiele beinhalten ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re.
Konjugate des Antikörpers und des zytotoxischen Mittel werden unter Verwendung einer Vielfalt von bifunktionellen proteinkoppelnden Agentien, wie N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionelle Derivate von Imidoestern (wie Dimethyladipimidat-HCL), aktive Ester (wie Disuccinimidylsuberat), Aldehyde (wie Glutaraldehyd), Bisazidoverbindungen (wie Bis-(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazoniumderivate (wie Bis-(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanate (wie Toluol-2,6-diisocyanat) und bisaktive Fluorverbindungen (wie 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol), hergestellt werden. Zum Beispiel kann ein Ricin-Immunotoxin wie in Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987) beschrieben hergestellt werden. Mit Kohlenstoff-14 markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhafter Chelatbildner zur Konjugation von Radionukleotid an den Antikörper. Siehe WO94/11026.
In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen „Rezeptor" (wie Streptavidin) zur Verwendung bei der Tumorprätargetierung konjugiert werden, wobei das Antikörper/Rezeptor-Konjugat an den Patienten verabreicht wird, woraufhin die Entfernung von ungebundenem Konjugat aus dem Kreislauf unter Verwendung einer Klärsubstanz und dann die Verabreichung eines „Liganden" (z. B. Avidin), der wiederum an ein zytotoxisches Mittel konjugiert wird, folgt.
4.11 COMPUTERLESBARE SEQUENZEN
In einer Anwendung dieser Ausführungsform kann eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung auf computerlesbaren Medien aufgezeichnet werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich „computerlesbare Medien" auf ein beliebiges Medium, das gelesen und auf das durch einen Computer direkt zugegriffen werden kann. Solche Medien beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt: magnetische Speichermedien wie Disketten, Festplattenspeichermedien und Magnetband; optische Speichermedien wie CD-ROM; elektrische Speichermedien wie RAM und ROM; und Hybride dieser Kategorien wie magnetische/optische Speichermedien. Ein Fachmann kann leicht verstehen, wie ein beliebiges der derzeit bekannten computerlesbaren Medien dazu verwendet werden kann, ein Produkt zu erzeugen, das ein computerlesbares Medium umfasst, auf dem eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung aufgezeichnet ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich „aufgezeichnet" auf einen Vorgang zum Speichern von Informationen auf einem computerlesbaren Medium. Ein Fachmann kann ein beliebiges der derzeit bekannten Verfahren zum Aufzeichnen von Informationen auf einem computerlesbaren Medium einfach anpassen, um Produkte zu erzeugen, das die Nukleotidsequenzinformation der vorliegenden Erfindung umfasst.
Eine Vielfalt von Datenspeicherstrukturen steht einem Fachmann zur Verfügung, um ein computerlesbares Medium zu erstellen, auf dem eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung aufgezeichnet ist. Die Wahl der Datenspeicherstruktur wird im Allgemeinen auf dem gewählten Mittel zum Zugreifen auf die gespeicherten Informationen basieren. Darüber hinaus kann eine Vielfalt von Datenprozessorprogrammen und -formaten verwendet werden, um die Nukleotidsequenzinformation der vorliegenden Erfindung auf einem computerlesbaren Medium zu speichern. Die Sequenzinformation kann in einer Textverarbeitungstextdatei dargestellt werden, in im Handel erhältlicher Software wie WordPerfect und Microsoft Word formatiert, oder in Form einer ASCII-Datei dargestellt werden, in einer Datenbankanwendung wie DB2, Sybase, Oracle oder dergleichen gespeichert. Ein Fachmann kann eine Reihe von Datenprozessorstrukturierungsformaten (z. B. Textdatei oder Datenbank) einfach anpassen, um ein computerlesbares Medium zu erhalten, auf dem die Nukleotidsequenzinformation der vorliegenden Erfindung aufgezeichnet ist.
Durch Bereitstellen einer beliebigen der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27,, 29 oder 33 oder eines repräsentativen Fragments davon oder einer Nukleotidsequenz, die zu mindestens 95 % zu einer beliebigen der Nukleotidsequenzen von SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 identisch ist, in computerlesbarer Form kann ein Fachmann routinemäßig auf die Sequenzinformationen zu einer Vielfalt von Zwecken zugreifen. Computersoftware ist öffentlich zugänglich, die einem Fachmann ermöglicht, auf Sequenzinformationen zuzugreifen, die in einem computerlesbaren Medium bereitgestellt sind. Die folgenden Beispiele zeigen, wie Software, die den BLAST-Suchalgorithmus (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) und den BLAZE-Suchalgorithmus (Brutlag et al., Comp. Chem. 17:203-207 (1993)) auf einem Sybase-System implementiert, dazu verwendet wird, offene Leseraster (open reading frames, ORFs) in einer Nukleinsäuresequenz zu identifizieren. Solche ORFs können proteinkodierende Fragmente sein und können beim Produzieren gewerblich wichtiger Proteine, wie Enzyme, die in Fermentationsreaktionen und bei der Produktion von gewerblich nützlichen Metaboliten verwendet werden, von Nutzen sein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „ein rechnerbasiertes System" auf die Hardwaremittel, Softwaremittel und Datenspeichermittel, die zum Analysieren der Nukleotidsequenzinformationen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Mindesthardwaremittel der hierin offenbarten computerbasierten Systeme umfasst einen Zentralprozessor (central processing unit, CPU), ein Eingabemittel, ein Ausgabemittel und ein Datenspeichermittel. Ein Fachmann kann leicht verstehen, dass ein beliebiges der gegenwärtig verfügbaren computerbasierten Systeme zur Verwendung in der vorliegenden Anmeldung geeignet ist. Wie oben angegeben, umfassen die hierin offenbarten computerbasierten Systeme ein Datenspeichermittel, in dem eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung gespeichert ist, und die notwendigen Hardwaremittel und Softwaremittel zum Unterstützen und Implementieren eines Suchmittels. Wie hierin verwendet, bezieht sich „Datenspeichermittel" auf Speicher, der Nukleotidsequenzinformationen der vorliegenden Erfindung speichern kann, oder ein Speicherzugriffsmittel, das auf Produkte zugreifen kann, auf denen die Nukleotidsequenzinformationen der vorliegenden Erfindung aufgezeichnet sind.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Suchmittel" auf ein oder mehrere Programme, die auf dem computerbasierten System implementiert sind, um eine Zielsequenz oder ein Zielstrukturmotiv mit den in dem Datenspeichermittel gespeicherten Sequenzinformationen zu vergleichen. Suchmittel werden dazu verwendet, Fragmente oder Regionen einer bekannten Sequenz, die mit einer bestimmten Zielsequenz oder einem bestimmten Zielmotiv übereinstimmen, zu identifizieren. Eine Vielfalt bekannter Algorithmen ist öffentlich offen gelegt und eine Vielfalt gewerblich verfügbarer Softwareprogramme zum Ausführen eines Suchmittels werden in den hierin offenbarten computerbasierten Systemen verwendet und können in diesen verwendet werden. Beispiele solcher Softwareprogramme beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Smith-Waterman, MacPattern (EMBL), BLASTN und BLASTA (NPOLYPEPTIDEIA). Ein Fachmann kann leicht erkennen, dass ein beliebiger der verfügbaren Algorithmen oder ein beliebiges der verfügbaren implementierenden Softwarepakete zum Ausführen von Homologiesuchen zur Verwendung in den vorliegenden computerbasierten Systemen angepasst werden kann. Wie hierin verwendet, kann eine „Zielsequenz" eine beliebige Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz mit sechs oder mehr Nukleotiden oder zwei oder mehr Aminosäuren sein. Ein Fachmann kann leicht erkennen, dass je länger eine Zielsequenz ist, desto weniger wahrscheinlich ist es, dass eine Zielsequenz als eine zufällige Erscheinung in der Datenbank vorliegen wird. Die am meisten bevorzugte Sequenzlänge einer Zielsequenz ist von etwa 10 bis 100 Aminosäuren oder von etwa 30 bis 300 Nukleotidreste. Es ist jedoch weit anerkannt, dass Suchen nach gewerblich wichtigen Fragmenten, wie Sequenzfragmenten, die an der Genexpression und Proteinverarbeitung beteiligt sind, eine kürzere Länge aufweisen können.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „ein Zielstrukturmotiv" oder „Zielmotiv" auf eine beliebige rational gewählte Sequenz oder Kombination von Sequenzen, wobei die Sequenz bzw. Sequenzen auf Grundlage einer dreidimensionalen Konfiguration ausgewählt werden, die bei der Faltung des Zielmotivs gebildet wird. Es gibt eine Vielfalt von in der Technik bekannten Zielmotiven. Proteinzielmotive beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, enzymaktive Stellen und Signalsequenzen. Nukleinsäurezielmotive beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Promotorsequenzen, Haarnadelstrukturen und induzierbare Expressionselemente (proteinbindende Sequenzen).
4.12 TRIPELHELIXBILDUNG
Darüber hinaus können die hierin offenbarten Fragmente, wie allgemein beschrieben, dazu verwendet werden, die Genexpresion durch Tripelhelixbildung oder Antisense-DNA oder -RNA zu steuern, wobei beide Verfahren auf der Bindung einer Polynukleotidsequenz an DNA oder RNA basieren.
Polynukleotide, die zur Verwendung in diesen Verfahren geeignet sind, sind für gewöhnlich 20 bis 40 Basen lang und sind derart entworfen, dass sie zu einer Region des Gens, das an der Transkription beteiligt ist (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids. Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 15241:456 (1988); und Dervan et al., Science 251:1360 (1991)), oder zu der mRNA selbst (Antisense – Olmno. J. Neurochem. 56:560 (1991): Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)) komplementär sind. Die Tripelhelixbildung resultiert optimalerweise in einer Abschottung der RNA-Transkription von DNA, wohingegen die Antisense-RNA-Hybridisierung die Translation eines mRNA-Moleküls zu Polypeptid blockiert. Beide Techniken haben sich als in Modellsystemen wirksam gezeigt. Informationen, die in den Sequenzen der vorliegenden Erfindung enthalten sind, sind für den Entwurf eines Antisense- oder Tripelhelix-Oligonukleotids erforderlich.
4.13 DIAGNOSEASSAYS UND -KITS
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zum Identifizieren des Vorliegens oder der Expression eines des der offenbarten ORFs oder eines Homologons davon in einer Testprobe unter Verwendung einer Nukleinsäuresonde oder hierin offenbarter Antikörper, die gegebenenfalls konjugiert oder anderweitig mit einem geeigneten Marker verbunden sind.
Im Allgemeinen können Verfahren zum Nachweisen eines Polynukleotids der Erfindung das Kontaktieren einer Probe mit einer Verbindung, die an das Polynukleotid bindet und mit diesem einen Komplex bildet, für einen Zeitraum, der dazu ausreicht, um den Komplex zu bilden, und das Nachweisen des Komplex, so dass, wenn ein Komplex nachgewiesen wird, ein Polynukleotid der Erfindung in der Probe nachgewiesen wird, umfassen. Solche Verfahren können auch das Kontaktieren einer Probe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit Nukleinsäure-Primern, die sich unter solchen Bedingungen an ein Polynukleotid der Erfindung anlagern, und das Amplifizieren angelagerter Polynukleotide, so dass, wenn ein Polynukleotid amplifiziert wird, ein Polynukleotid der Erfindung in der Probe nachgewiesen wird, umfassen.
Im Allgemeinen können Verfahren zum Nachweisen eines Polypeptids der Erfindung das Kontaktieren einer Probe mit einer Verbindung, die an das Polypeptid bindet und mit diesem einen Komplex bildet, für einen Zeitraum, der dazu ausreicht, um den Komplex zu bilden, und das Nachweisen des Komplex, so dass, wenn ein Komplex nachgewiesen wird, ein Polypeptid der Erfindung in der Probe nachgewiesen wird, umfassen.
Im Einzelnen umfassen solche Verfahren das Inkubieren einer Testprobe mit einem oder mehreren der Antikörper oder einer oder mehreren der hierin offenbarten Nukleinsäuresonden und das Prüfen auf Bindung der Nukleinsäuresonden oder Antikörper an Bestandteile in der Testprobe.
Bedingungen zum Inkubieren einer Nukleinsäuresonde oder eines Antikörpers mit einer Testprobe variieren. Die Inkubationsbedingungen hängen von dem in dem Assay eingesetzten Format, den eingesetzten Nachweisverfahren und der Art und Beschaffenheit der Nukleinsäuresonde oder des Antikörpers, die bzw. der in dem Assay verwendet wird. Ein Fachmann wird erkennen, dass ein beliebiges der gemeinhin verfügbaren Hybridisierungs-, Amplifikations- oder immunologischen Assayformate leicht angepasst werden kann, um die hierin offenbarten Nukleinsäuresonden oder Antikörper einzusetzen. Beispiele solcher Assays lassen sich in T. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande (1986); G.R. Bullock et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL, Bd. 1 (1982), Bd. 2 (1983), Bd. 3 (1985); P. Tijssen, Practice and Theory of Immunoassays; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande (1985), finden. Die Testproben der vorliegenden Erfindung beinhalten Zellen, Protein- oder Membranextrakte von Zellen oder biologische Flüssigkeiten, wie Sputum, Blut, Serum, Plasma oder Urin. Die in dem oben beschriebenen Verfahren verwendete Testprobe wird auf Basis des Assayformats, der Natur des Nachweisverfahrens und der Gewebe, Zellen oder Extrakte, die als die zu prüfende Probe verwendet werden, variieren. Verfahren zum Herstellen von Proteinextrakten oder Membranextrakten von Zellen sind in der Technik wohl bekannt und können einfach angepasst werden, um eine Probe zu erhalten, die mit dem eingesetzten System kompatibel ist.
In einer anderen Ausführungsform werden Kits beschrieben, die die erforderlichen Reagentien enthalten, um die offenbarten Assays auszuführen. Genauer gesagt ist ein Kammerkit offenbart, um ein oder mehrere Behältnisse in enger Einbindung aufzunehmen, die Folgendes umfassen: (a) ein erstes Behältnis, das eine der hierin offenbarten Sonden oder einen der hierin offenbarten Antikörper umfasst; und (b) ein oder mehrere Behältnisse, die eine oder mehrere der folgenden Substanzen umfassen: Waschreagentien, Reagentien, die das Vorliegen einer gebundenen Sonde oder eines gebundenen Antikörpers nachweisen können.
Im Einzelnen beinhaltet ein Kammerkit ein beliebiges Kit, in dem Reagentien in separaten Behältnissen enthalten sind. Solche Behältnisse beinhalten kleine Glasbehältnisse, Kunststoffbehältnisse oder Kunststoff- oder Papierstreifen. Solche Behältnisse ermöglichen, Reagentien effizient von einer Kammer in eine andere Kammer zu überführen, so dass die Proben und Reagentien nicht miteinander kontaminiert werden, und die Agentien oder Lösungen jedes Behältnisses können quantitativ von einer Kammer in eine andere gegeben werden. Solche Behältnisse werden ein Behältnis, das die Testprobe aufnehmen wird, ein Behältnis, das die in dem Assay verwendeten Antikörper enthält, Behältnisse, die Waschreagentien (wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Tris-Puffer usw.) enthalten, und Behältnisse, die die Reagentien enthalten, die zum Nachweisen des gebundenen Antikörpers oder der gebundenen Sonde verwendet werden, beinhalten. Typen von Nachweisreagentien beinhalten markierte Nukleinsäuresonden, markierte sekundäre Antikörper oder als Alternative, wenn der primäre Antikörper markiert ist, die enzymatischen oder antikörperbindenden Reagentien, die mit dem markierten Antikörper reagieren können. Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass die offenbarten Sonden und Antikörper einfach in eines der bewährten Kitformate, die in der Technik wohl bekannt sind, eingebunden werden können.
4.14 MEDIZINISCHE BILDGEBUNG
Die hierin offenbarten neuartigen Polypeptide und Bindungspartner sind bei der medizinischen Bildgebung (Bilddarstellung) von Stellen, die die Moleküle der Erfindung exprimieren, nützlich (z. B. wenn das Polypeptid der Erfindung an der Immunreaktion beteiligt ist, zur Bilddarstellung von Entzündungs- oder Infektionsstellen). Siehe z. B. Kunkel et al., US-Pat. Nr. 5,413,778. Solche Verfahren involvieren die chemische Anheftung eines Markierungs- oder Kontrastmittels, die Verabreichung des markierten Polypeptids in einer pharmazeutisch unbedenklichen Trägersubstanz an einen Patienten und die Bilddarstellung des markierten Polypeptids in vivo an der Zielstelle.
4.15 SCREENING-ASSAYS
Unter Verwendung der hierin offenbarten isolierten Proteine und Polynukleotide gibt es weitere offenbarte Verfahren zum Erhalten und Identifizieren von Agentien, die an ein Polypeptid binden, das von einem ORF kodiert wurde, das einer beliebigen der in SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 dargelegten Nukleotidsequenzen entspricht, oder an eine spezifische Domäne des Polypeptids binden, das von der Nukleinsäure kodiert wurde. Im Einzelnen umfasst das Verfahren die folgenden Schritte:

(a) Kontaktieren eines Mittel mit einem isolierten Protein, das von einem ORF kodiert wurde, oder einer hierin offenbarten Nukleinsäure; und
(b) Bestimmen, ob das Mittel an das Protein oder die Nukleinsäure bindet.

Im Allgemeinen können solche Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die an ein Polynukleotid der Erfindung binden, daher das Kontaktieren einer Verbindung mit einem Polynukleotid der Erfindung für eine Zeitspanne, die dazu ausreicht, um einen Komplex aus Polynukleotid und Verbindung zu bilden, und das Nachweisen des Komplex, so dass, wenn ein Komplex aus Polynukleotid und Verbindung nachgewiesen wird, eine Verbindung, die an ein Polynukleotid der Erfindung bindet, identifiziert wird, umfassen.
Desgleichen können solche Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die an ein Polypeptid der Erfindung binden, im Allgemeinen das Kontaktieren einer Verbindung mit einem Polypeptid der Erfindung für eine Zeitspanne, die dazu ausreicht, um einen Komplex aus Polypeptid und Verbindung zu bilden, und das Nachweisen des Komplex, so dass, wenn ein Komplex aus Polypeptid und Verbindung nachgewiesen wird, eine Verbindung, die an ein Polypeptid der Erfindung bindet, identifiziert wird, umfassen.
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die an ein Polypeptid der Erfindung binden, können außerdem das Kontaktieren einer Verbindung mit einem Polypeptid der Erfindung in einer Zelle für eine Zeitspanne, die dazu ausreicht, um einen Komplex aus Polypeptid und Verbindung zu bilden, wobei der Komplex die Expression einer Reportergensequenz in der Zelle antreibt, und das Nachweisen des Komplex durch Nachweisen der Expression der Reportergensequenz, so dass, wenn ein Komplex aus Polypeptid und Verbindung nachgewiesen wird, eine Verbindung, die ein Polypeptid der Erfindung bindet, identifiziert wird, umfassen.
Mittels solcher Verfahren identifizierte Verbindungen können Verbindungen beinhalten, die die Aktivität eines Polypeptids der Erfindung modulieren (das heißt, dessen Aktivität in Bezug auf die bei Fehlen der Verbindung beobachtete Aktivität erhöhen oder verringern). Alternativ können mittels solcher Verfahren identifizierte Verbindungen beinhalten, die die Expression eines Polypeptids der Erfindung modulieren (das heißt, die Expression in Bezug auf die bei Fehlen der Verbindung beobachtete Expressionsniveaus erhöhen oder verringern). Verbindungen, wie mittels der Verfahren der Erfindung identifizierte Verbindungen, können unter Anwendung von Standardassays, die dem Fachmann wohl bekannt sind, auf ihre Fähigkeit, die Aktivität/Expression zu modulieren, getestet werden.
Die in dem obigen Assay gescreenten Agentien können Peptide, Kohlenhydrate, Vitaminderivate oder andere Pharmazeutika sein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Agentien können wahllos gewählt und gescreent oder rationell gewählt oder unter Anwendung von Proteinmodellierungstechniken entworfen werden.
Für ein wahlloses Screening werden Agentien wie Peptide, Kohlenhydrate, Pharmazeutika und dergleichen wahllos gewählt und auf ihre Fähigkeit, an das Protein zu binden, das von dem wie hierin beschriebenen ORF kodiert wurde, geprüft. Alternativ können Agentien rationell gewählt oder entworfen werden. Wie hierin verwendet, wird von einem Mittel gesagt, dass es „rationell gewählt oder entworfen" wurde, wenn das Mittel auf Basis der Konfiguration des bestimmten Proteins gewählt wird. Zum Beispiel kann ein Fachmann gegenwärtig verfügbare Vorgehensweisen leicht anpassen, um Peptide, Pharmazeutika und dergleichen zu erzeugen, die an eine spezifische Peptidsequenz binden kann, um rationell entworfene Antipeptid-Peptide, zum Beispiel siehe Hurby et al., „Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides.", in Synthetic Peptides. A User's Guide, W.H. Freeman, NY (1992), S. 289-307, und Kaspczak et al., Biochemistry 28:9230-9238 (1989), oder Pharmazeutika oder dergleichen zu erzeugen.
Zusätzlich zu dem Vorstehenden kann eine Klasse von Agentien, wie allgemein beschrieben, dazu verwendet werden, die Genexpression durch Bindung an eines der ORFs oder EMFs der vorliegenden Anmeldung zu steuern. Wie oben beschrieben, können solche Agentien wahllos gescreent oder rationell entworfen/gewählt werden. Die Targetierung des ORF oder EMF ermöglicht einem Fachmann, sequenzspezifische oder elementspezifische Antigene zu entwerfen, die die Expression entweder eines einzigen ORF oder mehrerer ORF, die auf dasselbe EMF zur Expressionssteuerung angewiesen sind, modulieren. Eine Klasse von DNA-bindenden Agentien sind Agentien, die Basenreste enthalten, die hybridisieren oder eine Tripelhelixbildung durch Bindung an DNA oder RNA bilden. Solche Agentien können auf dem klassischen Phosphodiester, dem Ribonukleinsäure-Rückgrat basieren oder können eine Vielfalt von Sulfhydryl- oder polymeren Derivaten sein, die über eine Basenanheftungsfähigkeit verfügen.
Zur Verwendung in diesen Verfahren geeignete Agentien enthalten für gewöhnlich 20 bis 40 Basen und sind derart entworfen, dass sie zu einer Region des Gens, das an der Transkription beteiligt ist (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids. Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); und Dervan et al., Science 251:1360 (1991)), oder zu der mRNA selbst (Antisense – Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991): Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)) komplementär sind. Die Tripelhelixbildung resultiert optimalerweise in einer Abschottung der RNA-Transkription von DNA, wohingegen die Antisense-RNA-Hybridisierung die Translation eines mRNA-Moleküls zu Polypeptid blockiert. Beide Techniken haben sich als in Modellsystemen wirksam gezeigt. Informationen, die in den Sequenzen der vorliegenden Erfindung enthalten sind, sind für den Entwurf eines Antisense- oder Tripelhelix-Oligonukleotids und anderer DNA-bindenden Agentien erforderlich.
Agentien, die an ein Protein binden, das von einem der hierin offenbarten ORFs kodiert wurde, können als ein Diagnostikum verwendet werden. Agentien, die an ein Protein binden, das von einem der hierin offenbarten ORFs kodiert wurde, können unter Anwendung bekannter Techniken formuliert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu erzeugen.
4.16 VERWENDUNG VON NUKLEINSÄUREN ALS SONDEN
Ein anderer hierin offenbarter Gesichtspunkt betrifft polypeptidspezifische Nukleinsäure-Hybridisierungssonden, die mit natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen hybridisieren können. Die Hybridisierungssonden können von einer beliebigen der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 20 oder 33 abgeleitet werden. Da das entsprechende Gen nur in einer begrenzten Anzahl von Geweben exprimiert wird, kann eine Hybridisierungssonde, die von einer beliebigen der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 abgeleitet wurde, als ein Indikator auf das Vorliegen von RNA eines Zelltyps eines solchen Gewebes in einer Probe verwendet werden.
Eine beliebige geeignete Hybridisierungstechnik kann eingesetzt werden, wie beispielsweise In-situ-Hybridisierung. Wie in den US-Patentschriften Nr. 4,683,195 und 4,965,188 beschriebene PCR stellt weitere Verwendungszwecke für auf den Nukleotidsequenzen basierte Oligonukleotide bereit. Solche in der PCR verwendete Sonden können rekombinanten Ursprungs, chemisch synthetisiert oder eine Mischung von beiden sein. Die Sonde wird eine diskrete Nukleotidsequenz zum Nachweis identischer Sequenzen oder einen degenerierten Pool möglicher Sequenzen zur Identifizierung eng verwandter genomischer Sequenzen umfassen.
Andere Mittel zum Produzieren spezifischer Hybridisierungssonden für Nukleinsäuren beinhalten das Klonieren von Nukleinsäuresequenzen in Vektoren für die Produktion von mRNA-Sonden. Solche Vektoren sind in der Technik bekannt und im Handel erhältlich und können zum Synthetisieren von RNA-Sonden in vitro mittels der Zugabe der entsprechenden RNA-Polymerase wie T7- oder SP6-RNA-Polymerase und der entsprechenden radioaktiv markierten Nukleotide verwendet werden. Die Nukleotidsequenzen können dazu verwendet werden, Hybridisierungssonden zur Kartierung ihrer jeweiligen genomischen Sequenzen zu konstruieren. Die hierin bereitgestellte Nukleotidsequenz kann unter Anwendung wohl bekannter Techniken zur Gen- und/oder Chromosomkartierung auf ein Chromosom oder spezifische Regionen eines Chromosoms kartiert werden. Diese Techniken beinhalten In-situ-Hybridisierung, Verknüpfungsanalyse gegen bekannte chromosomale Marker, Hybridisierungsscreening mit Bibliotheken oder durchflusssortierten Chromosompräparaten, die für bekannte Chromosome spezifisch sind, und dergleichen. Die Technik der Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung von Chromosom-Spreads wurde, neben anderen Stellen, in Verma et al., (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York NY, beschrieben.
Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung von Chromosompräparaten und andere physikalische Chromosomkartierungstechniken können mit zusätzlichen Genkartendaten korreliert werden. Beispiele von Genkartendaten lassen sich in der 1994 Genome Issue of Science (265:1981 ff.) finden. Die Korrelation zwischen dem Platz einer Nukleinsäure auf einer physikalischen Chromosomkarte und einer spezifischen Erkrankung (oder Veranlagung für eine spezifische Erkrankung) kann dabei helfen, die DNA-Region abzugrenzen, die mit dieser genetischen Erkrankung assoziiert ist. Die Nukleotidsequenzen der beanspruchten Erfindung können dazu verwendet werden, Unterschiede der Gensequenzen zwischen normalen, Träger- oder betroffenen Einzelpersonen zu erkennen.
4.17 HERSTELLUNG VON TRÄGERGEBUNDENEN OLIGONUKLEOTIDEN
Oligonukleotide, d. h. kleine Nukleinsäuresegmente, können durch beispielsweise direktes Synthetisieren des Oligonukleotids mit chemischen Mitteln leicht hergestellt werden, wie es üblicherweise unter Verwendung eines Oligonukleotid-Syntheseautomats praktiziert wird.
Trägergebundene Oligonukleotide können mittels eines beliebigen der dem Fachmann bekannten Verfahren unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Trägers, wie Glas, Polystyrol oder Teflon, hergestellt werden. Eine Strategie besteht darin, mit Standardsynthesegeräten synthetisierte Oligonukleotide präzise auszumachen. Die Immobilisierung kann unter Anwendung passiver Adsorption (Inouye & Hondo, 1990, J. Clin. Microbiol. 28(6):1462-1472); unter Anwendung von UV-Licht (Nagata et al., 1985; Dahlen et al., 1987; Morrissey & Collins, Mol. Cell Probes, 1989, 3(2):189-207) oder mittels kovalenter Bindung von basenmodifizierter DNA (Keller et al., 1988, 1989) erzielt werden.
Eine andere Strategie, die eingesetzt werden kann, besteht in der Verwendung der starken Biotin/Streptavidin-Interaktion als einem Linker. Zum Beispiel beschreiben Broude et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(8):3072-3076, die Verwendung biotinylierter Sonden, obgleich es sich bei diesen um Doppelstrangsonden handelt, die auf mit Streptavidin überzogenen Magnetperlen immobilisiert sind. Mit Streptavidin überzogene Perlen können von Dynal, Oslo, bezogen werden. Natürlich kann dieselbe Verknüpfungschemie auf das Überziehen einer beliebigen Oberfläche mit Streptavidin angewendet werden. Biotinylierte Sonden können von verschiedenen Quellen bezogen werden, wie z. B. Operon Technologies (Alameda, CA, USA).
Nunc Laboratories (Naperville, IL, USA) verkauft ebenfalls geeignetes Material, das verwendet werden könnte. Nunc Laboratories hat ein Verfahren entwickelt, mit dem DNA kovalent an die CovaLink NH genannte Mikrowelloberfläche gebunden werden kann. CovaLink NH ist eine Polystyroloberfläche, die mit sekundären Aminogruppen (> NH) gepfropft ist, die als Brückenköpfe zur weiteren kovalenten Kopplung dienen. CovaLink Modules können von Nunc Laboratories bezogen werden. DNA-Moleküle können an CovaLink mit einer Phosphoramiditbindung ausschließlich an dem 5'-Ende gebunden werden, was eine Immobilisierung von mehr als 1 pmol DNA ermöglicht (Rasmussen et al., (1991) Anal. Biochem. 198(1):138-142).
Die Verwendung von CovaLink NH-Streifen zur kovalenten Bindung von DNA-Molekülen am 5'-Ende wurde beschrieben (Rasmussen et al., 1991). Bei dieser Technologie wird eine Phosphoramiditbindung eingesetzt (Chu et al., 1983, Nucleic Acids 11(18):6513-6529). Dies ist vorteilhaft, da eine Immobilisierung unter Verwendung nur einer einzigen kovalenten Bindung bevorzugt ist. Die Phosphoramiditbindung verbindet die DNA mit den sekundären Aminogruppen des CovaLink NH, die am Ende von Spacer-Armen angeordnet, die durch einen 2 nm langen Spacer-Arm kovalent auf die Polystyroloberfläche gepfropft sind. Um ein Oligonukleotid mittels einer Phosphoramiditbindung mit CovaLink NH zu verknüpfen, muss der Oligonukleotidterminus eine Phosphatgruppe am 5'-Ende aufweisen. Es ist vielleicht sogar möglich, dass Biotin kovalent an CovaLink gebunden und dann Streptavidin verwendet werden kann, um die Sonden zu binden.
Genauer gesagt beinhaltet as Verknüpfungsverfahren das Lösen von DNA in Wasser (7,5 ng/μl) und das Denaturieren für 10 Min. bei 95°C und das Abkühlen auf Eis für 10 Min. Dann wird eiskaltes 0,1 M 1-Methylimidazol, pH 7,0 (1-MeIm₇) auf eine Endkonzentration von 10 mM 1-MeIm₇ zugegeben. Anschließend wird eine ss-DNA-Lösung in CovaLink NH-Streifen (75 μl/Well), die auf Eis stehen, dispensiert.
Carbodiimid 0,2 M 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), in 10 mM 1-MeIm₇ gelöst, wird frisch hergestellt und es werden 25 μl pro Well zugegeben. Die Streifen werden 5 Stunden bei 50°C inkubiert. Nach der Inkubation werden die Streifen mit z. B. Nuc-Immuno Wash gewaschen: Zunächst werden die Wells 3 Mal gewaschen, dann werden sie mit für 5 Min. mit Waschlösung getränkt und schließlich werden sie 3 Mal gewaschen (wobei es sich bei der Waschlösung um 0,4 N NaOH, 0,25 % SDS, auf 50°C erhitzt, handelt).
Es ist vorgesehen, dass ein weiteres geeignetes Verfahren das in der PCT-Patentveröffentlichung WO 90/03382 (Southern & Maskos) beschriebene ist. Dieses Verfahren zum Herstellen eines Oligonukleotids, das einen Träger gebunden ist, involviert das Anheften eines 3'-NukleosidreMittel durch die Phosphatgruppe mittels einer kovalenten Phosphodiesterverbindung an aliphatische Hydroxylgruppen, die von dem Träger getragen werden. Das Oligonukleotid wird dann auf dem getragenen Nukleosid synthetisiert und Schutzgruppen werden von der synthetischen Oligonukleotidkette unter Standardbedingungen, die das Oligonukleotide nicht von dem Träger spalten, entfernt. Geeignete Reagentien beinhalten Nukleosidphosphoramidit und Nukleosidhydrogenphosphorat.
Es kann eine On-Chip-Strategie zur Herstellung einer DNA-Sonde zur Herstellung von DNA-Sondenarrays angewendet werden. Zum Beispiel kann bei der chemischen Synthese von Oligonukleotiden direkt auf einer Glasoberfläche adressierbare laseraktivierte Photoentschützung eingesetzt werden, wie von Fodor et al., (1991) Science 251(4995):767-773 beschrieben. Die Sonden können auch auf Nylonträger immobilisiert werden, wie von Van Ness et al., (1991) Nucleid Acids Res. 19(12):3345-3350, beschrieben, oder unter Anwendung des Verfahrens von Duncan & Cavalier, (1988) Anal. Biochem. 169(1):104-108, mit Teflon verbinden werden.
Um ein Oligonukleotid mit einem Nylonträger zu verbinden, wie von Van Ness et al. (1991) beschrieben, ist die Aktivierung der Nylonoberfläche mittels Alkylierung und die selektive Aktivierung des 5'-Amins von Oligonukleotiden mit Cyanurchlorid erforderlich.
Eine bestimmte Art und Weise zum Herstellen trägergebundener Oligonukleotid besteht darin, die durch Licht hervorgerufene Synthese, wie von Pease et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11):5022-5026, beschrieben, zu nutzen. Diese Verfasser verwendeten aktuelle Photolithographietechniken, um Arrays von immobilisierten Oligonukleotidsonden (DNA-Chips) zu erzeugen. Diese Verfahren, in denen Licht zum Steuern der Synthese von Oligonukleotidsonden in hochdichten, miniaturisierten Arrays verwendet wird, nutzen photolabile, am 5'-Ende geschützte N-Acyldesoxynukleosidphosphoramidite, Oberflächenlinkerchemie und vielfältige kombinatorische Synthesestrategien. In dieser Art und Weise kann eine Matrize von 256 räumlich definierten Oligonukleotidsonden erzeugt werden.
4.18 HERSTELLUNG VON NUKLEINSÄUREFRAGMENTEN
Die Nukleinsäuren können von einer beliebigen adäquaten Quelle erhalten werden, wie cDNAs, genomische DNA, chromosomale DNA, mikrosezierte Chromosombänder, Cosmid- oder YAC-Inserts und RNA, einschließlich mRNA ohne etwaige Amplifikationsschritte. Zum Beispiel beschreiben Sambrook et al. (1989) drei Protokolle zur Isolierung von hochmolekularer DNA aus Säugetierzellen (S. 9.14-9.23).
DNA-Fragmente können als Klone in M13-, Plasmid- oder Lambdavektoren hergestellt werden und/oder mittels PCR oder anderer Amplifikationsverfahren direkt aus genomischer DNA oder cDNA hergestellt werden. Proben können in Multiwellplatten hergestellt oder in diese dispensiert werden. Etwa 100-1000 ng DNA-Proben können in einem Endvolumen von 2-500 ml hergestellt werden.
Die Nukleinsäuren würden dann mittels eines beliebigen der dem Fachmann bekannten Verfahren fragmentiert, einschließlich beispielsweise unter Verwendung von Restriktionsenzymen, wie in 9.24-9.28 von Sambrook et al. (1989) beschrieben, wobei die Scherung mittels Ultraschall und NaOH-Behandlung erfolgt.
Niederdruckscherung ist ebenfalls geeignet, wie von Schriefer et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18(24):7455-7456, beschrieben. In diesem Verfahren werden DNA-Proben durch eine kleine French-Druckzelle bei einer Vielfalt von niedrigen bis mittleren Drücken geleitet. Eine Hebelvorrichtung ermöglicht eine gesteuerte Anwendung von niedrigen bis mittleren Drücken auf die Zelle. Die Ergebnisse dieser Studie weisen darauf hin, dass Niederdruckscherung eine nützliche Alternative zu Schall- und enzymatischen DNA-Fragmentierungsverfahren ist.
Eine besonders geeignete Art und Weise zum Fragmentieren von DNA ist vorgesehen, darin zu bestehen, dass die Zwei-Basen-Erkennungsendonuklase, CviJI, von Fitzgerald et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20(14):3753-3762, beschrieben. Diese Verfasser beschreiben eine Vorgehensweise zur schnellen Fragmentierung und Fraktionierung von DNA in bestimmte Größen, die als für Shotgun-Klonierung und -Sequenzierung geeignet erachtet werden.
Die Restriktionsendonuklease CviJI spaltet normalerweise die Erkennungssequenz PuGCPy zwischen dem G und dem C, um stumpfe Enden zu hinterlassen. Atypische Reaktionsbedingungen, die die Spezifität dieses Enzyms (CviJI**) verändern, ergeben eine sozusagen wahllose Verteilung von DNA-Fragmenten, die das Kleinmolekül pUC19 (2688 Basenpaare) bilden. Fitzgerald et al. (1992) werteten die Wahllosigkeit dieser Fragmentierungsstrategie quantitativ aus, wobei sie einen CviJI**-Verdau von pUC19 anwendeten, der mit einem schnellen Gelfiltrationsverfahren größenfraktioniert und direkt, ohne Endreparatur, an einen lacZ-minus-M13-Klonierungsvektor ligiert wurde. Die Sequenzanalyse von 76 Klonen zeigte, dass CviJI** zusätzlich zu PuGCPy-Stellen pyGCPy und PuGCPu einschränkt und dass neue Sequenzdaten mit einer Rate angesammelt werden, die mit der wahllosen Fragmentierung konsistent ist.
Wie in der Literatur berichtet wird, beinhalten Vorteile dieser Vorgehensweise im Vergleich zu Beschallung und Agarosegelfraktionierung: kleinere DNA-Mengen werden erfordert (0,2-0,5 μg anstelle von 2-5 μg) und es sind weniger Schritte involviert (keine Präligierung, Endreparatur, chemische Extraktion oder Agarosegelelektrophorese und -elution sind erforderlich).
Ungeachtet der Art und Weise, in der die Nukleinsäurefragmente erhalten oder hergestellt werden, ist es wichtig, die DNA zu denaturieren, um einzelsträngige Stücke zu erzielen, die zur Hybridisierung zur Verfügung stehen. Dies wird durch Inkubieren der DNA-Lösung für 2-5 Minuten bei 80-90°C erreicht. Die Lösung wird dann schnell auf 2°C abgekühlt, um die Renaturierung der DNA-Fragmente zu verhindern, bevor sie mit dem Chip in Kontakt gebracht werden. Phosphatgruppen müssen ebenfalls mittels in der Technik bekannter Verfahren aus genomischer DNA entfernt werden.
4.19 HERSTELLUNG VON DNA-ARRAYS
Arrays können durch Tüpfeln von DNA-Proben auf einem Träger, wie einer Nylonmembran, hergestellt werden. Das Tüpfeln kann unter Verwendung von Arrays aus Metallstiften (deren Positionen einem Array von Wells in einer Mikrotiterplatte entsprechen) wiederholt durch Übertragung von etwa 20 nl einer DNA-Lösung auf eine Nylonmembran durchgeführt werden. Mit Offsetdruck wird eine Dichte von Punkten, die höher als die Dichte der Wells ist, erzielt. Ein bis 25 Punkte können in 1 mm² untergebracht werden, in Abhängigkeit von dem verwendeten Markertyp. Indem ein Tüpfeln in einer vorgewählten Anzahl von Reihen und Spalten vermieden wird, werden separate Teilmengen (Teilarrays) gebildet. Proben in einem Teilarray können das gleiche genomische DNA-Segment (oder das gleiche Gen) von verschiedenen Einzelpersonen aufweisen oder können unterschiedliche, überlappende genomische Klone sein. Jedes der Teilarrays kann Replika-Tüpfeln derselben Proben darstellen. In einem Beispiel kann ein gewähltes Gensegment aus 64 Patienten amplifiziert werden. Für jeden Patienten kann das amplifizierte Gensegment in einer 96-Well-Platte sein (wobei alle 96 Wells dieselbe Probe enthalten). Es wird eine Platte für jeden der 64 Patienten präpariert. Durch Verwendung einer Vorrichtung mit 96 Stiften können alle Proben auf einer Membran von 8 × 12 cm getüpfelt werden. Teilarrays können 64 Proben enthalten, eine von jedem Patienten. Wenn die 96 Teilarrays identisch sind, kann die Punktspanne 1 mm² betragen und zwischen den Teilarrays kann ein Zwischenraum von 1 mm bestehen.
Eine andere Vorgehensweise besteht darin, Membranen oder Platten (von NUNC, Naperville, Illinois, USA, erhältlich), die mit physikalischen Abstandshaltern aufgeteilt werden können, z. B. einem Kunststoffgitter, das über der Membran geformt ist, wobei das Gitter der Sorte von Membran, die auf den Boden von Multiwellplatten angewendet wird, ähnlich ist, oder hydrophobe Streifen zu verwenden. Ein feststehender physikalischer Abstandshalter ist nicht für die Bildgebung durch Exposition gegenüber flachen Phosphorspeicherungsfolien oder Röntgenfilmen bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen veranschaulicht. Bei Betrachtung der vorliegenden Offenbarung wird ein Fachmann zu schätzen wissen, dass viele andere Ausführungsformen und Änderungen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden können. Dementsprechend ist beabsichtigt, dass die weiteren Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung nicht auf die Offenbarung der folgenden Beispiele beschränkt sind. Die vorliegende Erfindung wird in Bezug auf den Schutzumfang nicht durch die beispielhaft gezeigten Ausführungsformen, die als Veranschaulichungen einzelner Gesichtspunkte der Erfindung gedacht sind, und Zusammensetzungen und Verfahren, die innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung funktionell äquivalent sind, eingeschränkt. Tatsächlich wird erwartet, dass dem Fachmann bei Betrachtung der vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen zahlreiche Modifikationen und Änderungen einfallen. Demzufolge sind die einzigen Einschränkungen, die auf den Schutzumfang der Erfindung angewendet werden sollten, jene, die in den angefügten Ansprüchen in Erscheinung treten.
5. BEISPIELE
BEISPIEL 1
Isolierung von SEQ ID Nr. 1-21 aus einer cDNA-Bibliothek von menschlichen Zellen
Eine Vielzahl von neuartigen Nukleinsäuren wurden und Sanger-Sequenzierungstechniken aus einer cDNA-Bibliothek erhalten, die unter Anwendung von Standard-PCR, Sequenzierung durch Hybridisierungssequenzsignaturanalyse aus menschlicher fötaler Leber/Milz, Ovarium, adultem Gehirn, Lungentumor, Rückenmark, Zervix, Endothelzellen, Nabelschnur, Lymphozyt, Lungenfibroblast, fötalem Gehirn und Testis hergestellt wurde. Die Inserts der Bibliothek wurden mit PCR unter Verwendung von Primern, die spezifisch für Vektorsequenzen waren, die die Inserts flankieren, amplifiziert. Diese Proben wurden auf Nylonmembranen getüpfelt und mit Oligonukleotidsonden untersucht, um Sequenzsignaturen zu erzielen. Die Klone wurden in Gruppen mit ähnlichen oder identischen Sequenzen geclustert und einzelner repräsentative Klone wurden aus jeder Gruppe zur Gel-Sequenzierung ausgewählt. Die 5'-Sequenz der amplifizierten Inserts wurde dann unter Anwendung des reversen M13-Sequenzierungsprimers in einem typischen Sanger-Sequenzierungsprotokoll abgeleitet. Die PCR-Produkte wurden gereinigt und einer Fluoreszenzfarbstoff-Terminator-Zyklussequenzierung unterzogen. Die Gel-Sequenzierung mit einem einzigen Durchlauf wurde mit einem Sequenzierer 377 Applied Biosystems (ABI) durchgeführt. Diese Inserts wurden als eine neuartige Sequenz identifiziert, die nicht zuvor aus dieser Bibliothek bezogen wurde und von der nicht zuvor in öffentlichen Datenbanken berichtet wurde. Diese Sequenzen sind im angefügten Sequenzprotokoll mit SEQ ID Nr. 1-21 benannt.
BEISPIEL 2
ASSEMBLIERUNG VON SEQ ID Nr. 22 und 24
Die neuartigen Nukleinsäuren (SEQ ID Nr. 22 und 24) der Erfindung wurden aus Sequenzen assembliert, die mittels in Beispiel 1 oben beschriebener Verfahren aus einer cDNA-Bibliothek erhalten wurden. Die endgültigen Sequenzen wurden unter Verwendung der EST-Sequenzen als Saat assembliert. Dann wurde ein rekursiver Algorithmus verwendet, um die Saat zu einer erweiterten Assemblierung zu erweitern, indem zusätzliche Sequenzen aus der Datenbank von Hyseq gezogen wurden, die EST-Sequenzen enthielten, die zu dieser Assemblierung gehören. Der Algorithmus endete, als ein komplettes Contig assembliert worden war. Die Einbindung von Bestandsteilsequenzen in die Assemblierung basierte auf einem BLASTN-Hit bei der erweiterten Assemblierung, wobei der BLAST-Score höher als 400 und die prozentuale Identität höher als 95 % war.
Das Nächster-Nachbar-Ergebnis für die assemblierte Sequenz (SEQ ID Nr. 22 oder 24) wurde mit einer Suche mit FASTA, Version 3, gegen die Genpept-Version 114 unter Anwendung des Fastxy-Algorithmus erhalten. Fastxy ist eine verbesserte Version des FASTA-Alignments, das „in codon frame"-Verschiebungen ermöglicht. Das Nächster-Nachbar-Ergebnis zeigte das nächste Homologon für jede Assemblierung von Genpept (und enthält die translatierten Aminosäuresequenzen, für die die Assemblierung kodiert). Das Nächster-Nachbar-Ergebnis ist unten dargelegt:
Es wurden Polypeptide vorhergesagt, die von SEQ ID Nr. 22 (oder 24) kodiert werden sollten, wie unten dargelegt. Die Polypeptide wurden mit einem Softwareprogramm namens FASTY (von http://fasta.bioch.virginia.edu erhältlich) vorhergesagt, das ein Polypeptid auf Grundlage eines Vergleichs von translatiertem neuartigen Polypeptid zu bekannten Polypeptiden auswählt (W.R. Pearson, Methods in Enzymology, 183:63-98 (1990), hierin durch Bezugnahme aufgenommen).
BEISPIEL 3
ASSEMBLIERUNG VON SEQ ID Nr. 27
Die neuartige Nukleinsäure (SEQ ID Nr. 27) der Erfindung wurden anfangs aus Sequenzen assembliert, die mittels in Beispiel 1 oben beschriebener Verfahren aus einer cDNA-Bibliothek erhalten wurden. Die endgültige Sequenz wurde unter Verwendung der EST-Sequenzen als Saat assembliert. Dann wurde ein rekursiver Algorithmus verwendet, um die Saat zu einer erweiterten Assemblierung zu erweitern, indem zusätzliche Sequenzen aus der Datenbank von Hyseq gezogen wurden, die EST-Sequenzen enthielten, die zu dieser Assemblierung gehören. Der Algorithmus endete, als ein komplettes Contig assembliert worden war. Die Einbindung von Bestandsteilsequenzen in die Assemblierung basierte auf einem BLASTN-Hit bei der erweiterten Assemblierung, wobei der BLAST-Score höher als 300 und die prozentuale Identität höher als 95 % war.
Unter Verwendung dieser anfänglichen Sequenz wurden geeignete Primer zur Amplifikation von ESTs, die die anfängliche Sequenz umfassen, entworfen. Die Produkte wurden kloniert. Die DNA wurde isoliert, mit adäquaten Restriktionsenzymen geschnitten, ligiert und rekloniert, um das vollständige Contig zu erzeugen. Das vollständige Produkt wurde dann kloniert und mit einem Sequenzierer 377 Applied Biosystems (ABI) sequenziert. Diese Nukleotidsequenz ist mit SEQ ID Nr. 27 identisch.
Alternativ wurde die vollständige Stammzellfaktor-ähnliche DNA unter Verwendung adäquater Primern aus einer „Marathon-Ready"-Milz-cDNA-Bibliothek (Clontech) PCR-amplifiziert. Das primäre PCR-Produkt wurde mit ineinandergeschachtelten PCR-Primern weiter amplifiziert. Das Produkt der zweiten PCR wurde mit einem Sequenzierer 377 Applied Biosystems (ABI) sequenziert. Dieses Produkt ist mit SEQ ID Nr. 27 identisch.
BEISPIEL 4
ASSEMBLIERUNG VON SEQ ID Nr. 23, 25 und 28
Unter Anwendung von PHRAP (Univ. of Washington) wurden vollständige cDNA-Gensequenzen und die entsprechenden Proteinsequenzen aus der Assemblierung erzeugt. Etwaige Rasterverschiebungen und inkorrekte Stoppkodone wurden mittels Bearbeitung von Hand berichtigt. Während der Bearbeitung wurde die Sequenz unter Verwendung von FASTY und/oder BLAST gegen Genbank (d. h. Genpept-Version 115) geprüft. Andere Computerprogramme, die möglicherweise beim Bearbeitungsvorgang verwendet wurden, waren phredPhrap und Consed (University of Washington) und ed_ready, ed_ext und cg_zip-2 (Hyseq, Inc.).
Es wurde ein Polypeptid (SEQ ID Nr. 28) vorhergesagt, das von SEQ ID Nr. 27 kodiert werden sollte, wie unten dargelegt. Das Polypeptid wurde mit einem Softwareprogramm namens BLASTX vorhergesagt, das ein Polypeptid auf Grundlage eines Vergleichs von translatiertem neuartigen Polypeptid zu bekannten Polypeptiden auswählt. Das erste Methionin beginnt bei Position 123 von SEQ ID Nr. 3 und das putative Stoppkodon, TAA, beginnt bei Position 1710 der Nukleotidsequenz.
Das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptid der SEQ ID Nr. 28 ist ein Protein von ungefähr 529 Aminosäuren mit einer vorhergesagten Molekularmasse von ungefähr 59,2 kDa unglykosyliert. Proteindatenbanksuchen mit dem BLASTP-Algorithmus (S.F. Altschul et al., J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993), und S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 21:403-410 (1990), hierin durch Bezugnahme aufgenommen) zeigen, dass SEQ ID Nr. 28 zum Tumorendothelmarker-7-Vorläuferprotein homolog ist.
2 zeigt das BLASTX-Aminosäuresequenz-Alignment zwischen dem vom Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Polypeptid der SEQ ID Nr. 28 kodierten Protein und dem Tumorendothelmarker-7-Vorläuferprotein der SEQ ID Nr. 36 (St. Croix et al., Science, 289, 1197-1201), das zeigt, dass die zwei Sequenzen 72 % Ähnlichkeit gegenüber 441 Aminosäureresten und 57 % Identität gegenüber denselben 441 Aminosäureresten gemein haben.
Ein vorhergesagtes Signalpeptid von ungefähr dreißig Resten wird von ungefähr Rest 1 bis Rest 30 der SEQ ID Nr. 28 (SEQ ID Nr. 30) kodiert. Der extrazelluläre Teil ist für sich allein nützlich. Dies kann mittels Expression in Säugetierzellen und Sequenzieren des gespaltenen Produkts bestätigt werden. Die Signalpeptidregion wurde unter Anwendung des Programms Neural Network SignalP V1.1 (Nielsen et al., (1997) Int. J. Neur. Syst. 8, 581) (vom Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University of Denmark) und Hydrophobieanalyse unter Anwendung des Kyte/Doolittle-Algorithmus (Kyte und Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157, 105) vorhergesagt. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Spaltstelle sich von der vom Computerprogramm vorhergesagten unterscheiden kann. SEQ ID Nr. 31 ist das resultierende Peptid, wenn das Signalpeptid aus SEQ ID Nr. 28 entfernt wird.
Eine vorhergesagte Transmembranregion von ungefähr achtundzwanzig Resten wird von ungefähr Rest 452 bis Rest 479 der SEQ ID Nr. 28 (SEQ ID Nr. 32) kodiert. Dies kann mittels Expression in Säugetierzellen bestätigt werden. Die Transmembranregion wurde unter Anwendung des Programms Neural Network SignalP V1.1 (Nielsen et al., (1997) Int. J. Neur. Syst. 8, 581) (vom Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University of Denmark) und Hydrophobieanalyse unter Anwendung des Kyte/Doolittle-Algorithmus (Kyte und Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157, 105) vorhergesagt. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Transmembranregion sich von der vom Computerprogramm vorhergesagten unterscheiden kann.
Es wurde ein Polypeptid (SEQ ID Nr. 25) vorhergesagt, das von SEQ ID Nr. 24 kodiert werden sollte, wie unten dargelegt. Das Polypeptid wurde mit einem Softwareprogramm namens BLASTX vorhergesagt, das ein Polypeptid auf Grundlage eines Vergleichs von translatiertem neuartigen Polypeptid zu bekannten Polypeptiden auswählt. Das erste Methionin beginnt bei Position 107 der SEQ ID Nr. 24 und das putative Stoppkodon, TAA, beginnt bei Position 1280 der Nukleotidsequenz.
Das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Polypeptid der SEQ ID Nr. 25 (mit SEQ ID Nr. 23 identisch) ist ein Protein von ungefähr 392 Aminosäuren mit einer vorhergesagten Molekularmasse von ungefähr 50 kDa unglykosyliert. Proteindatenbanksuchen mit dem BLASTP-Algorithmus (S.F. Altschul et al., J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993), und S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 21:403-410 (1990), hierin durch Bezugnahme aufgenommen) zeigen, dass SEQ ID Nr. 25 zum Tumorendothelmarker-7-Vorläuferprotein homolog ist.
Eine vorhergesagte Transmembranregion von ungefähr achtundzwanzig Resten wird von ungefähr Rest 315 bis Rest 342 der SEQ ID Nr. 25 (SEQ ID Nr. 32) kodiert. Dies kann mittels Expression in Säugetierzellen bestätigt werden. Die Transmembranregion wurde unter Anwendung des Programms Neural Network SignalP V1.1 (Nielsen et al., (1997) Int. J. Neur. Syst. 8, 581) (vom Center for Biological Sequence Analysis, The Technical University of Denmark) und Hydrophobieanalyse unter Anwendung des Kyte/Doolittle-Algorithmus (Kyte und Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157, 105) vorhergesagt. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Transmembranregion sich von der vom Computerprogramm vorhergesagten unterscheiden kann.
BEISPIEL 5
A. KLONIERUNG UND EXPRESSION VON LÖSLICHEM STAMMZELLFAKTOR-ÄHNLICHEM POLYNUKLEOTID (SEQ ID Nr. 33) UND POLYPEPTID (SEQ ID Nr. 34)
Um lösliches Stammzellfaktor-ähnliches Polypeptid zu exprimieren, wurde die vollständige Stammzellfaktor-ähnliche DNA aus einer „Marathon-Ready"-Milz-cDNA-Bibliothek (Clontech) PCR-amplifiziert. Das primäre PCR-Produkt wurde mit ineinandergeschachtelten PCR-Primern weiter amplifiziert, was bei Expression in geeigneten Zelllinien lösliches Stammzellfaktor-ähnliches Polypeptid erzeugen würde. Das Produkt der sekundären PCR (SEQ ID Nr. 33) wurde in Pcdna3.1/Myc-His(+)A zwischen EcoRI- und XhoI-Stellen kloniert. Das Plasmid, das Stammzellfaktor-ähnliches Polypeptid kodiert, und Kontrollvektoren wurden unter Verwendung von FuGENE-6-TransfektionsreMittel (Roche) in CHO-Zellen transfiziert. Kulturmedium, Zelllysat und die unlöslichen Zelltrümmerfraktionen wurden mittels SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotting mit Anti-myc-Antikörper analysiert. Wie erwartet wurde festgestellt, dass mehr als 95 % des löslichen Stammzellfaktor-ähnlichen Polypeptids (SEQ ID Nr. 34) sezerniert und in dem Kulturmedium vorhanden waren.
Unter Anwendung einer ähnlichen Vorgehensweise werden auch stabile Linien von 293-Zellen, die SEQ ID Nr. 34 exprimieren, erzeugt. Diese wurden weiter kloniert, um starke, mittelmäßige und schwache Expressoren auszuwählen.
B. EXPRESSION UND REINIGUNG VON SEQ ID Nr. 34 VON INSEKTEN- UND BAKTERIENZELLEN
Stammzellfaktor-ähnliches Protein wurde wie folgt in Insektenzellen exprimiert:
Das um die C-terminale Transmembrandomäne verkürzte Stammzellfaktor-ähnliches Gen (SEQ ID Nr. 33) wurde mittels PCR in einen Pib/V5-His TOPO TA-Klonierungsvektor (Invitrogen Corporation) kloniert. Die Stammzellfaktor-ähnliche DNA in dem Vektor wurde entweder mit einem Myc/His-Tag oder ohne jegliche Tags erzeugt. Insektenzellen (High Five TM, Invitrogen) wurden unter Anwendung des InsectSelectTM-Systems (Invitrogen) mit der Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Plasmid-DNA, die das Tag enthielt, transfiziert. Die Expression des Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Proteins wurde mittels vorübergehender Expression bestimmt. Das Medium, das das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Protein enthielt, wurde auf SDS-PAGE getrennt und das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Protein wurde mittels Western-Blot-Analyse identifiziert. Zur Produktion von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichem Protein in großem Maßstab wurden resistente Zellen in Kolben expandiert, die Ultimate InsectTMSerum-Free-Medium (Invitrogen) enthielten. Die Zellen wurden 4 Tage bei ~100 mph bei 27°C geschüttelt. Die konditionierten Medien, die das Protein zur Reinigung enthielten, wurden mittels Zentrifugierung gesammelt.
Stammzellfaktor-ähnliches Protein wurde wie folgt in Bakterienzellen exprimiert:
Das reife Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Gen ohne die Transmembrandomäne (SEQ ID Nr. 33) wurde in einen Expressionsvektor (PCR T7/NT-TOPO) von Invitrogen kloniert. Das resultierende Plasmid wurde in einem E. coli-BL-21 (DE3) pLys-Stamm exprimiert. Zellen wurden in LB-Broth, die Ampicillin (100 μg/ml) enthielt, bei 37°C gewachsen. Dann wurde die Expression des Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Proteins mit IPTG (Endkonzentration von 1 Mm) induziert und die Zellen wurden weitere 4 Stunden gewachsen und geerntet. Die Analyse der Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Produktion mittels SDS-PAGE und Western-Blotting wurde wie oben detailliert ausgeführt vorgenommen.
Die Reinigung von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichem Protein aus Insektenzellkulturen wurde wie folgt ausgeführt. Insect Ultimate-Medium, das die mit His-Tag markierte Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Substanz enthielt, wurde durch Zugeben einer adäquaten Menge von 1 M NaOH auf pH 7,5 eingestellt. Die Lösung wurde dann mit 1 Mm MPMSF (Endkonzentration) supplementiert, um die proteolytische Spaltung während des Reinigungsvorgangs zu verhindern. Das Medium wurde durch einen 0,2-Mikron-Filter (sterile Nalgene Surfactant Free Cellulose Acetate-1000-ml-Filtereinheit) laufen gelassen, um teilchenförmiges Material zu entfernen. Die resultierende Lösung wurde 10-fach konzentriert und gleichzeitig unter Verwendung einer Diafiltrationspatrone mit einer Membran-Cut-off-Größe von 10 kDa mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, äquilibriert. Das 10-fach konzentrierte und diafiltrierte Medium wurde auf eine Ni-NTA-Säule geladen, die mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, äquilibriert worden war. Nicht zurückbehaltene Bestandteile wurden durch Waschen der Säule mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, das 300 mM NaCl und 20 mM Imidazol enthielt, entfernt. Das mit His-Tag markierte Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Protein wurde mit demselben Puffer und einem linearen Gradienten von Imidazol (20-300 mM) eluiert. Das eluierte Protein wurde wie oben beschrieben identifiziert. Die gepoolten Fraktionen, die Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Substanz enthielten, wurden unter Verwendung einer Amicon Stircell mit einer Membran-Cut-off-Größe von 10 kDa mit PBS-Puffer äquilibriert. Dieser Vorgang resultierte ebenfalls in der Entfernung von Imidazol. Das Protein wurde dann für Funktionsstudien auf ungefähr 10 mg/ml in PBS-Puffer konzentriert.
Die Reinigung von Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichem Protein aus Bakterienkulturen wurde wie folgt ausgeführt. E. coli-Zellen, die Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Substanz als Einschlusskörperchen exprimieren, wurden mit 10 Volumina (Gew./Vol.) Extraktionspuffer (50 mM NaPO4, pH 7,0) und weiterhin mit Puffer, der 6 M Guanidinhydrochlorid in dem Extraktionspuffer enthielt, extrahiert. Das solubilisierte Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Protein wurde wie oben beschrieben auf einer Ni-NTA-Säule fraktioniert. Die entfaltete Version des Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Proteins, die aus dieser Affinitätsreinigung erhalten wurde, wurde durch Inkubation mit einem Neufaltungspuffer, der aus DTT und Glutahion bestand, eine native Konformation erlangen gelassen. Die erneut gefaltete Probe wurde mit 20 mM Tris, 0,1 % Tween, äquilibriert und vor Schnellfluss-Flüssigkeitschromatographie auf Ionenaustauschern Q-Sepharose und SP-Sepharose auf 100 ml (10-fache Konz.) konzentriert. Weitere Protokolle werden ebenfalls für geeignete Neufaltungsbedingungen unter Verwendung von 8 M Harnstoff anstelle von 6 M Guanidinhydrochlorid entwickelt.
BEISPIEL 6
EXPRESSION VON SEQ ID Nr. 33 IN PRIMÄREN MENSCHLICHEN ZELLEN
Das Produkt der sekundären ineinandergeschachtelten PCR aus einer Marathon-Milz-Bibliothek oder ein beliebiges anderes Polynukleotid, das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Polypeptid exprimiert, wird in retroviralen MSCV-Vektor (Clontech) in geeignete Klonierungsstellen unter Verwendung von adäquaten Forward- und Reverse-PCR-Primern kloniert. Dieser retrovirale Vektor wird dann unter Verwendung von FUGENE-6-TransfektionsreMittel in Verpackungszelllinien transfiziert, um geeignet große Mengen von Retrovirus zu produzieren, in den die Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche DNA kloniert ist. Retrovirus enthaltende Überstände werden aus verpackten Zelllinien hergestellt und mit Stroma- oder Stammzellen gemischt. Bei der Retrovirustransduktion können diese transduzierten Zellen das Stammzellwachstumsfaktor-ähnliche Protein exprimieren, das dann wie folgt analysiert werden kann:

A. Flüssigkeitskulturassay: Stammzellen hämopoetischen oder anderen Ursprungs werden im Handel erworben. 1 × 10⁴ Stammzellen werden in einer 96-Well-Platte plattiert. 50-200 ng/ml gereinigtes Stammzellwachstumsfaktor-ähnliches Protein oder andere geeignete Wachstumsfaktoren in adäquaten Konzentrationen werden den Stammzellen zugesetzt. IL-3 und IL-6 werden nach 5 Tagen Inkubation zugegeben. Die Kulturen werden mit einem Mikroskop beobachtet und jeden Tag gezählt. Durchflusszytometriefärbung kann durchgeführt werden, um die Zellstammbaumdifferenzierung zu bestimmen.

BEISPIEL 7
Expressionsstudie unter Verwendung von SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 Die Expression von SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 in verschiedenen Geweben wird unter Anwendung einer auf einer semiquantitativen Polymerase-Kettenreaktion basierten Technik analysiert. Menschliche cDNA-Bibliotheken werden als Quellen exprimierter Gene aus Geweben von Interesse (adulte Blase, adultes Gehirn, adultes Herz, adulte Niere, adulter Lymphknoten, adulte Leber, adulte Lunge, adultes Ovarium, adulte Plazenta, adultes Rektum, adulte Milz, adulter Testis, Knochenmark, Thymus, Schilddrüse, fötale Niere, fötale Leber, fötale Leber/Milz, fötale Haut, fötales Gehirn, fötaler Leukozyt und Makrophage) verwendet. Genspezifische Primer werden dazu verwendet, Teile der Sequenzen der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 aus den Proben zu amplifizieren. Die amplifizierten Produkte werden auf einem Agarosegel getrennt, übertragen und chemisch mit einem Nylonfilter verbunden. Der Filter wird dann mit einer radioaktiv markierten (³³P-dCTP) doppelsträngigen Sonde, die unter Verwendung eines Klenow-Polymerase-„Random-Prime"-Verfahrens aus SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 erzeugt wurde, hybridisiert. Die Filter werden gewaschen (hohe Stringenz) und verwendet, um eine Phosphorbildgebungsfolie mehrere Stunden lang zu exponieren. Die Banden zeigen das Vorliegen von cDNA, die die Sequenzen der SEQ ID Nr. 1-22, 24, 26-27, 29 oder 33 enthält, in einer spezifischen Bibliothek und somit die mRNA-Expression in dem entsprechenden Zelltyp oder Gewebe.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 25 besteht, oder für ein Polypeptid mit mindestens 90 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 25 mit Stammzellwachstumsfaktoraktivität.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, das für ein Polypeptid mit Stammzellwachstumsfaktoraktivität kodiert, wobei das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 25 besteht.
Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, bei dem es sich um eine DNA-Sequenz handelt.
Isoliertes Polynukleotid, das das Komplement des Polynukleotids nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Vektor, der das Polynukleotid nach Anspruch 4 umfasst.
Expressionsvektor, der das Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Wirtszelle, die gentechnisch verändert wurde, um das Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2 zu exprimieren.
Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei das Polynukleotid in operativer Verbindung mit einer Regulationssequenz steht, die die Expression des Polynukleotids in der Wirtszelle kontrolliert.
Isoliertes Polypeptid mit Stammzellwachstumsfaktoraktivität, wobei das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 25 besteht, oder ein Polypeptid mit mindestens 90 % Sequenzidentität dazu.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 9 mit Stammzellwachstumsfaktoraktivität, wobei das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 25 besteht.
Zusammensetzung, die das Polypeptid nach Anspruch 9 oder 10 und eine Trägersubstanz umfasst.
In-vitro-Verfahren zum Nachweisen des Polynukleotids nach Anspruch 1 oder 2 in einer Probe, das Folgendes umfasst: a) Kontaktieren der Probe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit Nukleinsäure-Primern, die sich unter solchen Bedingungen an das Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2 anlagern; b) Amplifizieren eines Produkts, das aus dem Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2 besteht; und c) Nachweisen des Produkts und dadurch des Polynukleotids nach Anspruch 1 oder 2 in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Polynukleotid ein RNA-Molekül umfasst und das Verfahren weiterhin das reverse Transkribieren eines angelagerten RNA-Moleküls in ein cDNA-Polynukleotid umfasst.
In-vitro-Verfahren zum Nachweisen des Polypeptids nach Anspruch 9 oder 10 in einer Probe, das Folgendes umfasst: a) Kontaktieren der Probe mit einer Verbindung, die an das Polypeptid bindet und mit diesem einen Komplex bildet, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die dazu ausreichen, um den Komplex zu bilden, wobei die Verbindung ein Antikörper ist, der für das Polypeptid nach Anspruch 9 oder 10 spezifisch ist; und b) Nachweisen der Bildung des Komplexes, so dass, wenn eine Komplexbildung nachgewiesen wird, das Polypeptid nach Anspruch 9 oder 10 nachgewiesen wird.
In-vitro-Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die an das Polypeptid nach Anspruch 9 oder 10 bindet, das Folgendes umfasst: a) Kontaktieren der Verbindung mit dem Polypeptid nach Anspruch 9 oder 10 unter Bedingungen und für eine Zeitspanne, die dazu ausreichen, um einen Komplex aus Polypeptid und Verbindung zu bilden; und b) Nachweisen des Komplex, so dass, wenn der Komplex aus Polypeptid und Verbindung nachgewiesen wird, eine Verbindung, die an das Polypeptid nach Anspruch 9 oder 10 bindet, identifiziert wird.
In-vitro-Verfahren zum Herstellen eines Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichen Poly peptids, das Folgendes umfasst: a) Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 7 unter Bedingungen, die dazu ausreichen, um das Polypeptid in der Zelle zu exprimieren; und b) Isolieren des Polypeptids aus der Zellkultur oder den Zellen von Schritt (a).
Kit, das das Polypeptid nach Anspruch 9 oder 10 umfasst.
Nukleinsäure-Array, in dem das Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2 an eine Oberfläche angeheftet ist.
Array nach Anspruch 18, wobei das Array vollständige Übereinstimmungen mit dem Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2 nachweist.
Array nach Anspruch 18, wobei das Array Fehlanpassungen zu dem Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2 nachweist.
Zusammensetzung, die Folgendes umfasst: a) eine therapeutische Menge eines Polypeptids nach Anspruch 9 oder 10 oder b) eine therapeutische Menge eines Polynukleotids, das ein Polypeptid nach Anspruch 9 oder 10 kodiert, in einer Form und unter Bedingungen, so dass das Polypeptid produziert wird, und eine pharmazeutisch unbedenkliche Trägersubstanz, zur Verwendung als ein Arzneimittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das Arzneimittel zum Verstärken der Aktivität oder Expression des Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichem Polypeptids nach Anspruch 9 oder 10 verwendet wird.
Zusammensetzung, die Folgendes umfasst: eine therapeutische Menge eines Polynukleotids, das die Expression einer Nukleotidsequenz inhibiert, die für ein Polypeptid nach Anspruch 9 oder 10 kodiert, zur Verwendung als ein Arzneimittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei das Arzneimittel zum Inhibieren der Aktivität oder Expression des Stammzellwachstumsfaktor-ähnlichem Polypeptids nach Anspruch 9 oder 10 verwendet wird.
Verwendung einer Zusammensetzung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: a) einer Zusammensetzung, die eine therapeutische Menge eines Polypeptids mit Stammzellwachstumsfaktoraktivität umfasst, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 25, 28, 31, 34 oder 35 umfasst; und b) eine Zusammensetzung, die eine therapeutische Menge eines Polynukleotids umfasst, das für das Polypeptid kodiert, in einer Form und unter Bedingungen, so dass das Polypeptid hergestellt wird, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verstärkung der Stammzellwachstumsfaktoraktivität in einem Patienten, der dieser bedarf.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine therapeutische Menge eines Polynukleotids umfasst, das die Expression einer Nukleotidsequenz inhibiert, die für ein Polypeptid mit Stammzellwachstumsfaktoraktivität kodiert, und das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 25, 28, 31, 34 oder 35 umfasst, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung der Stammzellwachstumsfaktoraktivität in einem Patienten, der dieser bedarf.