CN1284996A - 肿瘤抗原蛋白及其基因和用途 - Google Patents

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Abstract

包含SEQ ID NO:1所示的碱基序列的DNA或在严格条件下与包含SEQ ID NO:1所示的碱基序列的DNA杂交并编码具有肿瘤抗原活性的蛋白的DNA;携带上述DNA的表达质粒;用所述表达质粒转化的转化体;上述DNA表达产生的肿瘤抗原蛋白;抗上述蛋白的抗体;及它们在治疗、防止或诊断肿瘤中的用途。

Description

肿瘤抗原蛋白及其基因和用途
技术领域
本发明涉及新的肿瘤抗原蛋白和编码相同蛋白的基因、抗所述肿瘤抗原蛋白的抗体以及采用这些物质治疗、防止或诊断肿瘤的方法。
背景技术
已知免疫系统尤其是T细胞在体内肿瘤排斥中起着重要作用。实际上在人肿瘤病灶中已经观察到对肿瘤细胞具有细胞毒性效应的淋巴细胞的浸润(Arch.Surg.,126：200-205，1990)，而且已经比较容易地从黑素瘤分离到识别自身肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(例如，Immunol.Today,8：385，1987；J.Immunol.,138∶989，1987；和Int.J．Cancer，52：52-59，1992)。此外，通过引入T细胞对黑素瘤的临床治疗结果也表明T细胞在肿瘤排斥中的重要性(J.Natl.Cancer.Inst.,86：1159，1994)。
虽然长期以来不了解CTL攻击自身肿瘤细胞的靶分子，但是免疫学和分子生物学的最近进展已经逐渐揭示了这类靶分子。准确地说，已经发现CTL利用T细胞受体(TCR)识别称为肿瘤抗原肽的肽和主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原(MHCⅠ类抗原，在人类称为HLA抗原)之间的复合物，由此攻击自身肿瘤细胞。
肿瘤抗原肽产生自肿瘤特异性蛋白即肿瘤抗原蛋白。因此，该蛋白在细胞内合成，然后在细胞质被蛋白酶体降解为肽。另一方面，在内质网形成的MHCⅠ类抗原(HLA抗原)当结合至上述肿瘤抗原肽时，经高尔基体内侧转运到高尔基体外侧即成熟侧，然后携带到它们作为抗原提呈的细胞表面。肿瘤特异性CTL识别作为抗原提呈的该复合物，并通过细胞毒性效应或产生淋巴因子呈现其抗肿瘤效应(Rinsho-Menneki，27(9)：1034-1042，1995)。因为这一系列作用的阐明，已经成为可能的是，通过使用在患者中增强肿瘤特异性CTL的肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽作为所谓的癌症疫苗来治疗肿瘤。
作为这样的肿瘤抗原蛋白，T.Boon等于1991年首次鉴定了来自人黑素瘤细胞并命名为MAGE的蛋白(Science，254：1643-1647，1991)，此后从黑素瘤细胞已经鉴定了数个另外的肿瘤抗原蛋白。
如T.Boon等的综述(J.Exp.Med.,183：725-729，1996)，迄今鉴定的肿瘤抗原蛋白可以分为以下四类。
属于第一类的肿瘤抗原蛋白对于正常组织仅在睾丸组织中表达，而对于肿瘤组织它们表达于黑素瘤、头颈部癌症、非小细胞肺癌、膀胱癌以及其它肿瘤。上述的MAGE和组成12个以上成员的家族的类似蛋白(J.Exp.Med.,178：489-495，1993)以及BAGE(Immunity，2：167-175，1995)和GAGE(J.Exp.Med.,182：689-698，1995)属于此类肿瘤抗原蛋白，所有这些肿瘤抗原蛋白均已经在黑素瘤细胞中鉴定。
虽然部分该类肿瘤抗原蛋白高表达于黑素瘤，但是其表达仅在10-30％的非黑素瘤的特定肿瘤患者中观察到，因此它们不能广泛用于各种肿瘤的治疗或诊断。
属于第二类的肿瘤抗原蛋白仅表达于正常组织中的黑素细胞和视网膜以及肿瘤组织中的黑素瘤。由于这些组织特异性蛋白高表达于黑素瘤，所以它们可以用作黑素瘤特异性肿瘤抗原蛋白。酪氨酸酶(J.Exp.Med.,178：489-495，1993)、MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：3515，1994)、gp100(J.Exp.Med.,179：1005-1009，1994)和gp75(J.Exp.Med.,181：799-804，1995)属于该类肿瘤抗原蛋白。编码这些蛋白的基因均已经从黑素瘤细胞克隆。已经证实单独分离的Melan-A(J.Exp.Med.,180：35，1994)与MART-1相同。
然而，这类肿瘤抗原蛋白不能广泛用于各种肿瘤的治疗或诊断，因为它们不在非黑素瘤的肿瘤中表达。
属于第三类的肿瘤抗原蛋白因为肿瘤特异性突变使其表达为CTL识别的肿瘤抗原肽。突变的CDK4(Science，269：1281-1284，1995)、β-连环蛋白(J.Exp.Med.,183：1185-1192，1996)和MUM-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92：7976-7980，1995)属于该类肿瘤抗原蛋白。在CDK4和β-连环蛋白中，单个氨基酸突变增加了该肽与MHCⅠ类抗原的结合亲和力，这使其可以被T细胞识别。在MUM-1中，正常不被翻译的内含子因为突变而被翻译，所产生的肽被T细胞识别。然而因为这类突变发生的频率低，所以它们不能广泛用于各种肿瘤的治疗或诊断。
属于第四类的肿瘤抗原蛋白广泛表达于正常组织而且也被CTL识别，其实例包括从黑素瘤细胞鉴定的P15(J.Immunol.154：5944-5955，1995)。
如上所述，一些已知的肿瘤抗原蛋白仅在有限的诸如黑素瘤的肿瘤中表达，而其它肿瘤抗原蛋白即使在各种肿瘤中有表达，但也仅在特定肿瘤患者中的少部分人中表达，因此它们不能广泛用于各种肿瘤的治疗或诊断。所以，在把由细胞内降解产生的肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽用于治疗或诊断各种肿瘤前，有必要鉴定可广泛用于各种肿瘤的肿瘤抗原，例如发病率显著高于黑素瘤的扁平细胞癌(例如食管癌、肺癌)。在这方面，本发明人已经对编码得自食管癌的扁平细胞癌细胞的肿瘤抗原蛋白的基因进行了克隆，并首次成功克隆了编码来自非黑素瘤的肿瘤细胞的肿瘤抗原蛋白(SART-1)的基因(国际公开WO 97/46676)。
关于肿瘤的诊断，目前利用抗肿瘤相关抗原的抗体正在制备各种方法，该类方法包括例如用放射免疫测定、ELISA等检测血中的抗原物质；用免疫组织化学方法如酶联免疫吸附测定或荧光抗体技术进行组织细胞诊断；或者进行肿瘤成像(Fishman,W.H.等，“Oncodevelopmental Markers”,Academic Press,1983)。然而，目前使用的主要肿瘤标记在良性疾病产生较高频率的假阳性。所以，极其需要鉴定高度肿瘤特异性的肿瘤抗原蛋白以及分离抗所述肿瘤抗原蛋白的抗体以用于诊断。
而且，当特定肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽用作例如疫苗时，在将所述蛋白/肽用于病人前，需要诊断和选择出表达肿瘤抗原蛋白和对用所述肿瘤抗原蛋白/肽治疗可能有反应的病人。相信具有高度肿瘤特异性的肿瘤抗原蛋白或抗所述抗原的抗体在选择这类易患病人中是非常有用的诊断剂。鉴于此，需要鉴定具有较高肿瘤特异性并可用于各种肿瘤病人的肿瘤抗原蛋白，以及鉴定产生的抗所述抗原蛋白的抗体。
发明说明
本发明目的之一是提供一种新的肿瘤抗原蛋白或基因或抗所述肿瘤抗原蛋白的抗体。本发明另一目的是提供采用这些物质治疗、防止或诊断肿瘤的方法。更明确地说，本发明目的在于提供一种高度肿瘤特异性的肿瘤抗原蛋白或相应的肿瘤抗原肽、编码它们的DNA以及识别和结合它们的抗体，所有这些都可广泛用于治疗或诊断各种肿瘤，尤其是扁平细胞癌。
为此，本发明人已经建立了一种衍生自食管癌的扁平细胞癌细胞系KE-4(此后称为食管癌细胞系KE-4或简称为KE-4)，而且还建立了识别对在所述KE-4中表达的MHCI类抗原(HLA-A2601和HLA-A2402)限制性的肿瘤抗原肽的CTL(此后称为KE-4CTL)(CancerRes.,55：4248-4253，1995)。
用由KE-4制备的cDNA文库的重组质粒和含有HLA-A2601cDNA的重组质粒共转染成纤维细胞系VA-13。然后用KE-4CTL处理转化体并检测所产生的IFN-γ量以筛选活化的KE-4-CTL。在重复进行所述筛选后，本发明人已经成功克隆了编码新的肿瘤抗原蛋白的基因。克隆基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1。
然后，本发明人将编码一种新的肿瘤抗原蛋白的基因插入表达一种具有GST的融合蛋白的质粒载体，用所得的载体转化大肠杆菌细胞，制备GST和本发明新的肿瘤抗原蛋白之间的融合蛋白。利用通过用上述融合蛋白免疫家兔获得的抗体，通过蛋白质印迹分析对各种细胞系和组织进行分析。结果，尽管在除了睾丸和胎儿肝脏以外的任何的所有正常组织、黑素瘤和白血病中未观察到表达，但是在所检查的100％头颈部扁平细胞癌、60％食管扁平细胞癌、50％肺扁平细胞癌和50％肺腺癌中观察到分子量约43千道尔顿(Kd)的新的本发明肿瘤抗原蛋白的表达。还证实肿瘤特异性CTL的确识别并破坏蛋白印迹分析阳性的癌细胞(表达本发明肿瘤抗原蛋白的癌细胞)。
如上所述，因为本发明肿瘤抗原蛋白在各种扁平细胞癌和腺癌中特异性而且高频率地表达，所以，它可以用作活化患有这类癌症的患者的抗肿瘤免疫的药物。此外，抗本发明肿瘤抗原蛋白的抗体应该有效地用于诊断癌症病人和选择易患病人。
编码约43kDa的本发明肿瘤抗原蛋白的DNA核苷酸序列相当于始于编码肿瘤抗原蛋白SART-1的DNA的第1517位的核苷酸序列，所述DNA序列描述于国际公开WO 97/46676(在WO 97/46676中标示为SEQ ID NO：2)。但是，相信本发明肿瘤抗原蛋白的体内(在肿瘤组织或肿瘤细胞中)表达独立于SART-1，因为在上述蛋白印迹分析中，于各种肿瘤组织和肿瘤细胞中检测到一种分子量约43kDa的蛋白，而且它显示与推定分子量约125kDa的SART-1不一致的表达型。
根据这些发现确立了本发明。
因此，本发明涉及以下(a)或(b)的DNA：
(a)一种示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA；或
(b)一种在严格条件下与示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA杂交并编码具有肿瘤抗原活性的蛋白的DNA。
本发明还涉及含有所述DNA的表达质粒、通过表达所述DNA可获得的肿瘤抗原蛋白、识别所述肿瘤抗原蛋白的抗体、以及它们的用途。
附图简述
图1图示检测结果，其中VA-13细胞用编码本发明新的肿瘤抗原蛋白的基因和HLA-A2601的cDNA双重转染，并与识别HLA-A2601-、HLA-A2402-限制性肿瘤抗原肽的CTL(KE-4CTL)一起培养，以及检测由KE4-CTL对其应答产生的在培养基中的IFN-γ量(■)。符号“□”表示为了比较，在双重转染中采用编码不同类型的HLA(HLA-A0201 cDNA)的cDNA进行相似的检测获得的结果。垂直轴表示IFN-γ量，而水平轴表示编码新的肿瘤抗原蛋白的转染基因量。
图2显示在采用抗本发明的新的肿瘤抗原蛋白(约43kD))和GST(约27kD)之间的融合蛋白(约70kD)的抗血清进行的蛋白质印迹中的电泳结果。在图2A中，“因子Xa(-)”表示没有用因子Xa处理本发明的肿瘤抗原蛋白和GST之间的融合蛋白，而“因子Xa(+)”表示通过用因子Xa处理对所述融合蛋白进行了切割。在图2B中，PBMC表示健康人外周血单核细胞；KE-4和TE-9表示食管癌细胞系；E95-24、E96-18、E96-34、E96-26和E96-30表示食管癌组织；以及KL79、KL80、KL81、KL82、KL83和KL84表示肺癌组织。
实施本发明的最佳模式
在本说明书中，术语“本发明DNA”是指编码一种新的肿瘤抗原蛋白以及由示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA，或者是指一种在严格条件下与示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的、编码具有肿瘤抗原活性的蛋白的DNA杂交的DNA。此外，在本说明书中，术语“基因”和“DNA”当描述编码具有本发明肿瘤抗原活性的需要蛋白的DNA时是相互通用的。
一种“示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA”按照描述于此后的实施例中的方法可以克隆。另一方面，用示于SEQ ID NO：1的全部或部分碱基序列作杂交探针或PCR引物，对得自例如食管癌细胞系KE-4(FERM BP-5955)的cDNA文库进行筛选，可以进行克隆。参考标准教科书如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第二版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989，本领域技术人员可以容易地实施所述克隆。
而且，示于SEQ ID NO：1的碱基序列相当于编码肿瘤抗原蛋白SART-1的DNA的第1517位及其以后的核苷酸序列，所述DNA序列描述于本发明人的PCT申请的国际公开WO97/46676(在WO97/46676中标示为SEQ ID NO：2)。含有编码所述SART-1的DNA的大肠杆菌JM 109(K3)已经保藏于国立生物科学和人体技术研究所(The National Institute of Bioscience and Human Technology,1-1-3Higashi,Tsukuba,Ibaraki，日本)(保藏号：FERM BP-5951，保藏日期：1997年5月22日)。因此，人们利用包含于所述保藏微生物中的质粒可以获得示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA。
本文所用的“在严格条件下与示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA杂交的DNA”是指其碱基序列类似于示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA序列并在严格条件下与其杂交的DNA。实例包括在示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA中含有一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加的DNA。
用示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA的一部分作探针或引物，按照描述于例如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第二版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中的方法，对各种cDNA文库进行筛选可以获得所述DNA。另一方面，通过定点诱变或描述于上述“Molecular Cloning”的PCR方法，也可以制备上述在示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA中含有一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加的DNA。
在这方面，术语“严格条件“是指例如在含有6×SSC(20×SSC意指333mM构缘酸钠和333mM NaCl)、0.5％SDS和50％甲酰胺的溶液中于42℃进行杂交，然后在0.1×SSC和0.5％SDS的溶液中于68℃洗涤的该类条件，或者是指描述于Nakayama等，“Bio-Jikken-Illustrated”，第2卷，“Idenshi-Kaiseki-no-Kiso (Basis for GeneAnalysis)”，第148-151页，Shujunsha,1995的那些条件。
本文所用的短语“具有肿瘤抗原活性”是指所述蛋白具有在细胞内被降解产生肿瘤抗原肽的特异性特征，所述肿瘤抗原肽与MHCⅠ类抗原(HLA抗原)结合并被CTL识别。因此，“编码具有肿瘤抗原活性的蛋白的DNA”是指当表达时可以提供细胞内降解产生的肿瘤抗原肽的DNA，所述肽与MHCⅠ类抗原(HLA抗原)结合并被CTL识别。因此，当这种DNA表达时，所产生的蛋白在细胞内降解得到能够结合MHCⅠ类抗原的部分肽。所产生的部分肽片段与MHCⅠ类抗原形成复合物并提呈于细胞表面，所述复合物然后被特异性CTL结合，产生细胞毒性效应并诱导细胞因子。编码产生这种肽片段的蛋白的DNA是本发明的“编码具有肿瘤抗原活性的蛋白的DNA”。
例如通过以下方法可以确定候选DNA是否可能是“编码具有肿瘤抗原活性的蛋白的DNA”。
首先，将一种含有候选DNA的表达质粒和另一种含有编码MHCⅠ类抗原的DNA的表达质粒双重转染入不表达肿瘤抗原蛋白的细胞内，例如得自非洲绿猴肾脏的COS-7(ATCC CRL 1651)或成纤维细胞VA-13(RIKEN CELL BANK,The Institute of Physical and ChemicalResearch)。例如通过采用脂质转染胺试剂(GIBCO BRL)的脂质转染法可以实现所述转染。接着将限于所用的特定MHCⅠ类抗原的肿瘤效应性CTL加入到用于反应的转染试剂中，用例如ELISA检测所述CTL在应答中产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)量，以确定所述候选DNA是否是编码具有肿瘤抗原活性的蛋白的DNA。例如按照已知的方法(Nakao等，Cancer Res.,55：4248-4252(1995))，可以制备含有编码特定MHCⅠ类抗原的DNA的表达质粒。
通过采用本发明的DNA，按照重组DNA技术能够大量产生肿瘤抗原蛋白。按照许多出版物和文献例如上述的“Molecular Cloning”的描述可以实现通过表达本发明DNA产生肿瘤抗原蛋白。在任选将调节基因如控制转录的启动子(例如trp、lac、T7或SV40早期启动子)与所述DNA上游连接后，将需要表达的DNA插入合适的载体(例如pSV-SPORT1)中，从而能够构建在宿主细胞中复制和表达的表达质粒。然后将所述表达质粒引入合适的宿主细胞中以获得转化体。宿主细胞的实例包括原核细胞如大肠杆菌，单细胞真核生物如酵母和得自多细胞真核生物如昆虫或动物的细胞。用已知的方法如磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法或电脉冲法能够实现用表达质粒转化宿主细胞。当用常规方法在适合所述转化体的培养基中培养时，所获得的转化体产生所需要的蛋白。按照标准生化方法可以分离和纯化由此获得的肿瘤抗原蛋白。
此外，可以将编码本发明肿瘤抗原蛋白的DNA插入一种表达融合蛋白的质粒载体中，所述融合蛋白具有例如GST(谷胱甘肽S-转移酶)(例如，pGEX-5X-3，Pharmacia Biotech)，从而也可以使用所产生的表达载体。例如，当用这样一种表达载体转化一种宿主如大肠杆菌菌株DH5α时，所产生的转化体能够产生本发明肿瘤抗原蛋白和GST之间的融合蛋白。利用例如谷胱甘肽琼脂糖凝胶(GlutathioneSepharose)能够容易地纯化所述融合蛋白。尽管所述纯化的融合蛋白可能具有上述肿瘤抗原活性，但是仍然需要用酶因子X等分离出GST部分，以获得非融合的肿瘤抗原蛋白。
所述表达产物是一种本发明DNA编码的蛋白，并因其表达而产生。因此，该蛋白作为肿瘤抗原蛋白具有在细胞内降解产生与MHCⅠ类抗原结合并被CTL识别的肿瘤抗原肽的特征。
此外，本发明提供含有由示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA，或者在严格条件下与示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA杂交的DNA的表达质粒，而且所述表达质粒编码一种具有肿瘤抗原活性的蛋白。
另外，本发明提供已经用所述表达质粒转化的转化体。
此外，本发明提供具有肿瘤抗原活性、可以通过表达本发明上述DNA产生的蛋白。
一种该蛋白的具体实例是通过表达示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA可获得的一种蛋白。在还原条件下的SDS-PAGE中，该蛋白在分子量约43kD处显示一条带。
在一个实施方案中，本发明肿瘤抗原蛋白包括示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列。示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列由示于SEQ ID NO：1的碱基序列从第590位至第922位的区段编码，并至少含有其HLA-A26-和HLA-A24-限制性肿瘤抗原肽部分。
如上所述，示于SEQ ID NO：1的碱基序列相当于编码肿瘤抗原蛋白SART-1的DNA的第1517位及该位以后的序列，所述DNA序列由本发明人公开并描述于国际公开WO 97/46676(在国际公开WO97/46676中标示为SEQ ID NO：2)。同样，示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列相当于所述SART-1(在国际公开WO 97/46676中标示为SEQID NO：1)氨基酸序列的第690位以及该位以后的序列，本发明人已经证明各种肿瘤抗原肽部分存在于第690位及其该位以后的该部分序列中(参见国际公开WO 97/46676)。
本发明的上述肿瘤抗原蛋白及其基因(DNA)可体内及体外用于各种目的，包括治疗、预防和诊断肿瘤，如下所详述。具体来说，本发明DNA及其表达产物即肿瘤抗原蛋白可以广泛用作常见癌症如扁平细胞癌的抗肿瘤药物或诊断试剂。就此而论，扁平细胞癌是一种最常见的人类癌症，尤其是已知食管癌或肺癌中的扁平细胞癌对现有的化学治疗或放射治疗抗性较高。
因此，本发明提供包含作为活性成分的本发明的DNA或肿瘤抗原蛋白的药物。
包括作为活性成分的本发明肿瘤抗原蛋白的药物可以与佐剂一起给予或者以颗粒剂型给予，以有效建立细胞免疫。当所述肿瘤抗原蛋白给予到活体时，肿瘤抗原肽以高密度提呈于抗原提呈细胞的MHCⅠ类抗原上，这使得肿瘤特异性CTL有效增殖而实现治疗或防止肿瘤。为了此目的，可应用描述于文献(Clin.Microbiol.Rev.,7：277-289，1994)中的佐剂。另外，还设计了使外源性抗原肽有效地在MHCⅠ类抗原提呈的剂型，如脂质体制剂、其中所述肿瘤抗原蛋白或肽结合到直径数μm的珠粒上的颗粒剂或其中所述蛋白或肽结合到脂质上的制剂。例如通过皮内、皮下或静脉注射可以实现给予。此外，设计了其中给予抗原提呈细胞如提呈所述肿瘤抗原肽的树突细胞或巨噬细胞、或者给予已经引入编码所述肿瘤抗原蛋白的DNA的细胞的方法。尽管本发明肿瘤抗原蛋白在用于给予的制剂中的量可以根据例如需要治疗的疾病、特定患者的年龄和体重调适，但是，通常剂量为0.0001mg-1000mg、优选0.001mg-1000mg，并优选以每隔数天至数月给予。
通过将含有作为活性成分的编码本发明肿瘤抗原蛋白的DNA的药物给予到患有肿瘤的患者，可以治疗或防止肿瘤。当给予本发明的DNA时，所述肿瘤抗原蛋白在所述细胞中表达程度相当高，而且所产生的肿瘤抗原肽结合到MHCⅠ类抗原并以高密度提呈于细胞表面上。这将引起体内的肿瘤特异性CTL有效增殖，由此实现治疗或防止肿瘤。给予以及为这些目的将DNA引入细胞的方法是本领域已知的。方法实例包括一种应用病毒载体的方法和描述于文献(Nikkei-Science，1994年4月，第20-45页；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan，12(15)，1994，以及其中引用的参考文献)的方法，这些方法的任何方法均可以用于本发明中。
使用病毒载体的方法的实例包括这些方法，其中将本发明的DNA引入DNA病毒或RNA病毒如反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒或新培斯病毒中，然后引入细胞中。其中特别优选采用反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或痘苗病毒的方法。
还有其中将表达质粒直接肌内注射的另一种方法(DNA接种)、脂质体方法、脂质转染法、显微注射法、磷酸钙法和电穿孔法。其中特别优选DNA接种和脂质体法。
为了使本发明的DNA用作实际应用的药物，人们可以采用以下两种方法中的一种方法：体内法，其中DNA直接引入人体；或体外法，其中从人体取出某些种类的细胞，在体外将DNA引入所述细胞后再引入体内(Nikkei-Science，1994年4月，第20-45页；Gekkan-Yakuji,36(1)，23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan，12(15)，1994，以及其中引用的参考文献)。尽管本发明的DNA可以通过任一方法给予，但是更优选体内法。
在体内法的情况下，DNA可以根据要治疗的疾病和症状以及其它因素通过任何合适的途径给予。例如它可以通过静脉、动脉、皮下、皮内或肌内途径给予。在体内法的情况下，这类药物可以以各种剂型如溶液给予，它们通常配制为含有作为活性成分的本发明DNA的注射剂，该注射剂需要时还可以包含常规载体。当将本发明DNA包含于脂质体或膜融合的脂质体(如仙台病毒(HVJ)-脂质体)时，这类药物可以为悬浮液、冻干药物、离心浓缩的冻干药物等形式。
尽管在这类制剂中的本发明的DNA量随例如要治疗的疾病、具体病人的年龄和体重而不同，但是通常每隔数天至数月给予本发明的DNA量优选为0.0001-100mg、更优选0.001-10mg。
除了上述药物外，如上所述的本发明的DNA和蛋白也可以用作本领域研究试剂。而且，上述的本发明蛋白可以用作肿瘤诊断剂的活性成分。准确地说，需要时可以对本发明肿瘤抗原蛋白进行标记，并用于检测在从怀疑患有肿瘤的病人获得的样品(如血液、肿瘤组织)中存在的抗体(抗所述肿瘤抗原蛋白的抗体)，以便诊断是否存在肿瘤。另外，本发明的蛋白还可以用作产生下述本发明抗体的免疫原。
本文所用的术语“抗体”是指抗本发明肿瘤抗原蛋白或包含其部分的部分蛋白的抗体。例如按照描述于“抗体：实验室手册”(Lane,H.D.等编辑，冷泉港实验室出版社，纽约，1989)中的方法，容易制备这类抗体。准确地说，采用本发明肿瘤抗原蛋白或含其部分的部分蛋白作免疫原以常规方式免疫动物，可以容易地制备本发明的抗体。这种免疫原的实例有本发明肿瘤抗原蛋白、含有本发明肿瘤抗原蛋白的部分的部分蛋白(包括一个肽片段)、本发明肿瘤抗原蛋白或包括其部分的部分蛋白和GST(谷胱苷肽S-转移酶)之间的融合蛋白和本发明肿瘤抗原蛋白或含其部分的部分蛋白和Myc tag之间的融合蛋白。在这方面，根据能够组成一个表位的最小长度，部分蛋白的长度通常是至少8个氨基酸。
另外，按照已知的方法可以制备对本发明肿瘤抗原蛋白特异性的单克隆抗体。已经将最初由Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol.6，511(1976))描述的杂交瘤技术用于生产抗许多特异性抗原的单克隆抗体，并且本领域技术人员可以按照描述于文献如“Bunshi-Seibutu-Gaku-Kennkyu-No-Tame-No-Tanpakushitu-Jikkenn-Ho”(第4章，Yodosha,1994)中的方法实施。
免疫宿主动物或培养得自所述宿主动物的抗体产生细胞的方法和程序与常规建立抗原刺激和产生技术一致。
可以用包括免疫新和层析、HPLC(高效液相层析)等已知的技术纯化所获得的抗体。
根据由此获得的抗体，制备各种抗体片段也是可能的。这类抗体片段包括例如通过胃蛋白酶消化抗体可以产生的F(ab’)2片段、通过还原F(ab’)2片段中的二硫键可以产生的Fab’片段和通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体可以产生的2Fab或Fab片段，而且这类片段也在本发明范围内。
而且，根据这类抗体或抗体片段，制备各种衍生物也是可能的。本文所用“衍生物”包括例如嵌合抗体和人源化抗体，而且例如按照描述于日本专利公开(Kokai)61-47500(1986)或Nature 321，522(1986)中的方法可以制备这类抗体。另外，用例如酶标记的上述抗体或抗体片段也包括在所述衍生物范围内。酶标记方法的具体实例包括戊二醛法、过碘酸盐法、马来酰亚胺法和吡啶基-二硫化物法。用作标记物的酶的实例包括牛小肠碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。本领域技术人员根据标准参考文献如“Koso-Menneki-Sokutei-Ho”(Igaku-Shoin,1978)可以容易地制备这些标记抗体。此外，放射性同位素也可以用作标记物。
如上所述的抗体、抗体片段或其衍生物(此后总称为“抗体等”)可以用作如下所述的肿瘤的诊断剂。
如在以下实施例4中所证实，用本发明的抗体对各种细胞系和组织进行蛋白印迹分析表明，尽管在除了睾丸和胎儿肝脏以外的任何的所有正常组织、黑素瘤和白血病中未观察到表达，但是在所检查的100％头颈部扁平细胞癌、60％食管扁平细胞癌、50％肺扁平细胞癌和50％肺腺癌中观察到本发明的新肿瘤抗原蛋白的表达。此外，还证实肿瘤特异性CTL的确识别并破坏在上述蛋白印迹分析阳性的癌细胞(表达本发明肿瘤抗原蛋白的癌细胞)。
因此证实本发明肿瘤抗原蛋白在各种扁平细胞癌和腺癌中特异性而且高频率地表达，而在除了睾丸和胎儿肝脏以外的正常组织、黑素瘤和白血病中未检测到表达。因此，相信抗本发明肿瘤抗原蛋白的抗体等能够广泛用于诊断这类癌症病人。此外，通过用这些抗体等检测本发明肿瘤抗原蛋白，使得诊断早期肿瘤的发生、复发和转移以及有效选择适用含有本发明肿瘤抗原蛋白或肽、或编码它们的DNA的药物的肿瘤患者成为可能。因此，希望它们对治疗和预防肿瘤非常有用。
因此，本发明提供抗本发明肿瘤抗原蛋白或抗包含其部分的部分蛋白、抗体片段、或其衍生物的抗体。
本发明也提供用于治疗或诊断肿瘤、包含作为活性成分的这类抗体、抗体片段或衍生物中的任何一种的组合物。
本发明还提供用本发明的抗体或抗体片段或其衍生物诊断肿瘤的方法。
可以将本发明抗体等用作肿瘤诊断剂在合适缓中液如含有牛血清白蛋白的磷酸缓中液(pH7.0)中的活性成分。采用本发明诊断剂的免疫诊断的实例包括其中检测肿瘤组织样品中的肿瘤抗原蛋白或其中检测血液或组织中存在的肿瘤抗原蛋白的诊断。更具体的实例包括免疫组织化学法、免疫印迹法、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光或发光测定、以及描述于以下实施例4中的蛋白质印迹分析。在标准参考文献如“Koso-Menneki-Sokutei-Ho”(Igaku-Shoin，1978)中给出了这些测定的细节。
根据所述测定，可以采用包括酶标记抗体、染料、助色剂、阻化剂、标准品等的试剂盒形式的本发明诊断剂。
用其中可以将本发明肿瘤抗原蛋白特异性的单克隆抗体本身或作为与一种抗肿瘤药物或毒素的缀合物给予到癌症患者以杀伤表达所述肿瘤抗原蛋白的肿瘤细胞的方法，能够实施采用本发明的抗体等的治疗。
此外，本发明的抗体等也可以用于亲和层析或筛选cDNA文库。
提供以下实施例以进一步说明本发明，而不能解释为限制本发明的范围。参考实施例1  建立针对食管癌细胞系的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系
按照Nakao等(Cancer Res.,55：4248-4252(1995))公开的方法，从一个患者的外周血单核细胞建立针对根据组织类型分类属于扁平细胞癌的食管癌细胞系KE-4的CTL，命名为KE-4CTL，并用于实验。食管癌细胞系KE-4和KE-4CTL都已经分别以国际保藏号FERMBP-5955和FERM BP-5954于1997年5月23日保藏于国立生物科学和人体技术研究所(The National Institute of Biosclence and HumanTechnology,1-1-3 Higashi,Tsukuba,Ibaraki，日本)。此外，按照Nakao等的上述公开的方法对KE-4的HLAⅠ分子进行分类，证实它们是HLA-A2402、-A2601、B54、-B60、-Cwl和-Cw3。参考实施例2  HLA-A2601 cDNA的制备
采用上述KE-4按照Nakao等(Cancer Res.,55：4248-4252(1995))公开的方法，将HLA-A2601 cDNA导入表达载体pCR3(INVITROGEN)从而制备重组质粒。参者实施例3  衍生自KE-4的cDNA文库的制备
通过分离总RNA部分并按照生产商的方案用mRNA纯化系统(Pharmacia Biotech生产)在寡聚(dT)柱上进行纯化，由KE-4制备Poly(A)+mRNA。采用SuperScriptTM质粒系统(Gibco BRL)按照生产商的方案，由mRNA制备具有连接到每个末端的NotⅠ接头和ScaⅠ接头的cDNA，然后将其连接至用限制酶NotⅠ和SalⅠ消化的表达载体即质粒pSV-SPORTl(Gibco BRL)，以产生重组质粒。在25μF和2.5kV的条件下，采用基因脉冲仪(Bio-Rad)电脉冲将所述重组质粒导入大肠杆菌ElectroMAX DH10B/p3TM细胞(Gibco BRL)中。在含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基(1％细菌用胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，pH7.3)上选择所述重组质粒已经导入的转化体。参考实施例4  干扰素-γ的定量测定
用酶免疫测定(ELISA)进行干扰素-γ(IFN-γ)的定量测定。将抗人IFN-γ的小鼠单克隆抗体吸附在96-孔微量培养板的孔中作为固相抗体，在用牛血清白蛋白封闭非特异性结合后，使其与样品中的IFN-γ结合。然后使其与作为检测抗体的抗人IFN-γ的兔多克隆抗体结合，在与用碱性磷酸酶标记的抗兔免疫球蛋白的羊抗体结合后，与作为显色底物的对-硝基苯基磷酸盐反应。在加入等体积的1N NaOH猝灭反应后，于405nm检测吸光度。所测得的吸光度与用标准IFN-γ获得的吸光度进行比较，以确定所述上清液中的IFN-γ量。实施例1  新的肿瘤抗原蛋白基因的筛选
从述于参考实施例3中的约100个转化体的库中如下回收重组质粒DNA。将100个转化体加入并在含有LB培养基加氨苄青霉素(50μg/ml)的96孔U型底微量培养板的每个孔中培养。然后将部分培养物转移到另一个每孔含有0.25ml TYGPN培养基的96孔U型底微量培养板中(F.M.Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.)，于37℃培养48小时。将所述微量培养板LB培养基中的余下培养物冷冻保藏。在所述微量培养板中用碱裂解法实现从培养于TYGPN培养基中的转化体制备重组质粒DNA(F.M.Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.)。将经异丙醇沉淀回收的重组质粒DNA悬浮于含有20ng/ml RNA酶的50μl的10mM Tris,1mM EDTA,pH7.4中。
采用如下的脂质转染法，用KE-4 cDNA的重组质粒和HLA-A2601 cDNA的重组质粒双重转染成纤维细胞系VA-13细胞(RIKENCELL BANK,The Institute of Physical and Chemical Research;Ann.Med.Exp.Biol.Fenn.,44：242-254，1966)。将7000个VA-13细胞置入96孔平底微量培养板的每个孔中，并在含有10％FCS的100μl RPMI1640培养基中培养2天。采用脂质转染试剂(Gibco BRL)，从70μl混合物中取30μl加入到待双重转染的VA-13细胞中，所述70μl混合物组成为：25μl对应于约100个转化体的KE-4 cDNA重组质粒、10μl(200ng)参考实施例2中所述HLA-A2601 cDNA重组质粒和35μl约35倍稀释的脂质转染试剂。复份制备转染体。5小时后，将200μl含有10％FCS的培养基加入到所述转染体中，再于37℃培养72小时。去除所述培养基后，每孔加入10，000个KE-4CTL细胞，在100μl含有10％FCS和25U/ml IL-2的培养基中于37℃培养24小时。回收所述培养基，用ELISA检测其IFN-γ量。
关于其中观察到高产量IFN-γ的四个组，将相应的约100个含有KE-4 cDNA重组质粒的转化体的冷冻保藏库用于以下筛选。将所述转化体库平板接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基上以获得菌落。如上所述，培养每组的200个菌落(总共800个菌落)使得每个孔中包含单一种类的转化体，由此制备KE-4 cDNA的重组质粒DNA。然后，用KE-4 cDNA的重组质粒和HLA-A2601 cDNA的重组质粒双重转染VA-13细胞，然后与KE-4CTL共培养，如上所述定量检测因KE-4CTL反应产生的IFN-γ，以便选择阳性质粒。这样，选择了KE-4 cDNA重组质粒克隆。此外，用所述质粒克隆重复相似的方法以按照参考实施例4的方法确定KE-4CTL产生的IFN-γ量。结果示于图1。为了进行比较，采用不同类型的HLA(HLA-A0201)进行相似的实验。在该图中，■和□表示分另用HLA-A2601 cDNA和HLA-A0201 cDNA获得的结果。水平轴表示上述质粒克隆的量(ng/孔)，而垂直轴表示KE4-CTL产生的IFN-γ量(pg/ml)。图1说明用该质粒克隆转染VA-13细胞诱导KE-4CTL产生IFN-γ，即所述质粒克隆代表编码肿瘤抗原蛋白的基因。实施例2  新的肿瘤抗原蛋白基因的碱基序列的测定
将含有实施例1中选择的重组质粒、所述肿瘤抗原蛋白基因的cDNA已经导入的转化体在500ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中于37℃培养14-16小时，离心收集细菌细胞。用PLASMIDMAXⅪ试剂盒(QIAGEN)从所述细胞回收重组质粒。该cDNA已经导入定位于SP6 RNA聚合酶启动子序列和T7 RNA聚合酶启动子序列之间的部位。然后合成描述于文献(DNA 4：165，1985)的SP6启动子引物和T7启动子引物。用SP6启动予引物或T7启动子引物联合Fluore-dATP标记混合物(Pharmacia Biotech)和AutoRead测序试剂盒(Pharmacia Biotech)进行双脱氧测序反应，采用荧光DNA测序仪(Pharmacia Biotech)从两端测定cDNA的碱基序列。由此测定的碱基序列(1011bp)示于SEQ ID NO：1。示于SEQ ID NO：1的碱基序列相当于编码肿瘤抗原蛋白SART-1的DNA的第1517位及其以后的序列，所述DNA序列描述于国际公开WO 97/46676(在WO 97/46676中标示为SEQ ID NO：2)。实施例3  抗新的肿瘤抗原蛋白的抗体的产生
采用两种引物：sf-1：5’-TGGGAATTCGATGAGGATCCCGAGC-3’sr-1：5’-TACGGGCGGCCGCTGTCACTTGGT-3’利用PCR扩增重组质粒，该重组质粒中已经导入在实施例2中获得的新的肿瘤抗原蛋白基因的cDNA。
所扩增的片段具有相应于示于SEQ ID NO：1的碱基序列的第146-930位的部分序列。
用限制酶EcoRⅠ和NotⅠ切割所扩增的片段，并将其连接入表达具有谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白的质粒载体pGEX-5X-3(PharmaciaBiotech)，获得重组质粒。将该重组质粒导入大肠杆菌菌株DH5α，并选择转化体。大量培养转化体，并在蛋白酶抑制剂PMSF和抑酶肽存在下声处理破坏细菌细胞，以便提取本发明肿瘤抗原蛋白和GST之间的融合蛋白。然后采用谷胱甘肽Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)的亲和纯化和采用Superrose 12(Pharmacia Biotech)的凝胶过滤分离融合蛋白。所分离的融合蛋白用作抗原以常规方式免疫家兔以产生抗血清。实施例4  蛋白质印迹分析
采用在实施例3中获得的抗血清，通过蛋白印迹研究本发明肿瘤抗原蛋白在各种细胞系和组织中的表达。
在含有0.03TIU/ml抑酶肽的10mM Tris-HCl、pH7.4、150mMNaCl和0.5％Triton X-100中声处理裂解各种细胞系和组织的每一种。将裂解物于14，000rpm离心20分钟，上清液进行SDS-PAGE。将由此分离的蛋白转移到Hybond-PVDF膜(Amersham)上，并与适量实施例3中获得的抗血清于室温下温育4小时。蛋白质印迹法的其它细节与描述于Shichijo等，Journal of Immunological Methods，186∶137(1995)中的方法一致。
结果示于图2。在实施例3中获得的抗血清识别用于免疫的70kDa的融合蛋白。抗血清还识别用酶因子X切割融合蛋白产生的43kDa肿瘤抗原蛋白和27kDa GST(图2A)。关于肿瘤抗原蛋白在各种细胞和组织中表达的研究表明，在所研究的5个健康人外周血单核细胞(PBMC)、16个白血病细胞系和2个黑素瘤细胞系中的任何一个的细胞中均未检测到表达，但是在所检查的5个头颈部扁平细胞癌细胞系中的3个、6个食管扁平细胞癌细胞系中的4个、所有3个肺扁平细胞癌细胞系和6个肺腺癌细胞系中的3个的细胞中观测到表达。在正常组织中，在全部所研究的1个胎儿肝脏、3个睾丸组织中观察到表达，但是在全部所检查的1个新生儿肝脏、1个成人肝脏、2个子宫、4个食管和1个胰腺组织中均未检测到表达。在癌组织中，在10个白血病和10个黑素瘤中的任何一个癌组织中均未检测到表达，但是在7个头颈部扁平细胞癌的7个、30个食管扁平细胞癌中的18个、17个肺扁平细胞癌中的8个和35个肺腺癌中的16个的癌组织中观察到表达。部分实例的结果示于图2(B)。正如以上所述，证实本发明的新的肿瘤抗原蛋白在各种扁平细胞癌和腺癌中特异性而且高频率地表达，所以，相信抗本发明的新的肿瘤抗原蛋白的抗体可用于诊断这类癌症细胞和癌症患者。实施例5肿瘤抗原蛋白在各种癌细胞中的表达和CTL的细胞毒性活性的检测
用EcoRⅠ和NotⅠ处理含有描述于WO 97/46676的SEQ ID NO：2的碱基序列的重组质粒(K3)(FERM BP-5951)以获得DNA片段，将该片段插入表达具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的质粒载体pGEX-4T-2(Pharmacia Biotech)的EcoRⅠ和NotⅠ位点，获得重组质粒。用所述质粒以与描述于实施例3的相似的方式制备具有GST的融合蛋白和抗所述蛋白的抗血清。所得到的抗血清识别描述于WO97/46676的分子量约125kDa的肿瘤抗原蛋白。采用抗约125kDa蛋白的所述抗血清和抗在实施例3中获得的约43kDa蛋白以及针对本发明肿瘤抗原蛋白的抗血清进行蛋白质印迹分析，以便按照实施例4所述的方法检测在各种HLA-A24-阳性的癌细胞系中的表达。另一方面，按照述于D.D.Kharkevitch等，Int.J.Cancer，58：317(1994)的方法，其中将2×105KE-4CTL与用51Cr标记的104靶癌细胞反应，从而检测KE-4CTL对各种癌细胞的细胞毒性活性(特异性裂解)。结果示于下表1。表1
                                           表达的蛋白    特异性裂解
 细胞系         来源           43kD           125kD         (％)KE-4              食管癌             +              +            27KE-3              食管癌             +              +            32TE-8              食管癌             +              +            23TE-11             食管癌             +              +            31PC9               肺癌               +              +            3911-18             肺癌               +              +            27SKG-1             子宫癌             +              +            25TE-10             食管癌             -              +            38LU65A             肺癌               -              +            6PERF-LC-AI        肺癌               -              +            3LK79              肺癌               -              +            3* +表示在蛋白印迹上可以观察到相应的带，而-表示观察不到相应的带。
如表1所示，在所检查的所有癌细胞中都观察到125kDa蛋白的表达。在这些细胞系中，KE-4CTL表现出对表达43kDa蛋白的细胞系的细胞毒性效应。然而，除了TE-10外KE-4CTL对不表达43kDa蛋白的癌细胞系未表现出毒性效应。这些结果表明衍生自43kDa蛋白的抗原肽趋向于作为抗原提呈，并较衍生自125kDa蛋白的抗原肽更有效地被CTL识别。总之，抗43kDa蛋白的抗体在诊断可以用本发明肿瘤抗原蛋白、及其肿瘤抗原肽或编码所述肿瘤抗原蛋白的DNA有效治疗的癌症患者中更有用得多。工业适用性
在各种扁平细胞癌或腺癌中高频率表达的本发明的新的肿瘤抗原蛋白、编码它们的基因以及抗所述新的肿瘤抗原蛋白的抗体可用于预防、治疗或诊断各种肿瘤。
                        序列表&#60110&#62ITOH,Kyogo&#60120&#62肿瘤抗原蛋白、其编码基因及其用途&#60130&#62661093&#60160&#624&#60210&#621&#60211&#621011&#60212&#62DNA&#60213&#62Homo sapiens&#60400&#621cgaggcggag ctggagctgc agaagcagct ggagaaggga cgccggctgc gacagttaca    60gcagctacag cagctgcgag acagtggcga gaaggtggtg gagattgtga agaagctgga    120gtctcgccag cggggctggg aggaggatga ggatcccgag cggaaggggg ccatcgtgtt    180caacgccacg tccgagttct gccgcacctt gggggagatc cccacctacg ggctggctgg    240caatcgcgag gagcaggagg agctcatgga ctttgaacgg gatgaggagc gctcagccaa    300cggtggctcc gaatctgacg gggaggagaa catcggctgg agcacggtga acctggacga    360ggagaagcag cagcaggatt tctctgcttc ctccaccacc atcctggacg aggaaccgat    420cgtgaatagg gggctggcag ctgccctgct cctgtgtcag aacaaagggc tgctggagac    480cacagtgcag aaggtggccc gggtgaaggc ccccaacaag tcgctgccct cagccgtgta    540ctgcatcgag gataagatgg ccatcgatga caagtacagc cggagggagg aataccgagg    600cttcacacag gacttcaagg agaaggacgg ctacaaaccc gacgttaaga tcgaatacgt    660ggatgagacg ggccggaaac tcacacccaa ggaggctttc cggcagctgt cgcaccgctt    720ccatggcaag ggctcaggca agatgaagac agagcggcgg atgaagaagc tggacgagga   780ggcgctcctg aagaagatga gctccagcga cacgcccctg ggcaccgtgg ccctgctcca   840ggagaagcag aaggctcaga agacccccta catcgtgctc agcggcagcg gcaagagcat   900gaacgcgaac accatcacca agtgacagcg ccctcccgta gtcggccctg cctcaacctt   960catattaaat aaagctccct ccttattttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a            1011&#60210&#622&#60211&#62111&#60212&#62PRT&#60213&#62Homo sapiens&#60400&#622Glu Tyr Arg Gly Phe Thr Gln Asp Phe Lys Glu Lys Asp Gly Tyr Lys
              5                  10                  15Pro Asp Val Lys Ile Glu Tyr Val Asp Glu Thr Gly Arg Lys Leu Thr
         20                  25                  30Pro Lys Glu Ala Phe Arg Gln Leu Ser His Arg Phe His Gly Lys Gly
     35                  40                  45Ser Gly Lys Met Lys Thr Glu Arg Arg Met Lys Lys Leu Asp Glu Glu
 50                  55                  60Ala Leu Leu Lys Lys Met Ser Ser Ser Asp Thr Pro Leu Gly Thr Val65                  70                  75                  80Ala Leu Leu Gln Glu Lys Gln Lys Ala Gln Lys Thr Pro Tyr Ile Val
             85                  90                  95Leu Ser Gly Ser Gly Lys Ser Met Asn Ala Asn Thr Ile Thr Lys
        100                 105                 110&#60210&#623&#60211&#6225&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60400&#623tgggaattcg atgaggatcc cgagc                                         25&#60210&#624&#60211&#6224&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60400&#624tacgggcggc cgctgtcact tggt                                          24

Claims (12)

1．以下(a)或(b)的一种DNA：
(a)一种示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA；或
(b)一种在严格条件下与示于SEQ ID NO：1的碱基序列组成的DNA杂交并编码具有肿瘤抗原活性的蛋白的DNA。
2．含有权利要求1的DNA的表达质粒。
3．用权利要求2的表达质粒转化的转化体。
4．通过表达权利要求1的DNA产生的肿瘤抗原蛋白。
5．权利要求4的肿瘤抗原蛋白，它在还原条件下的SDS-PAGE分子量测定中显示约43kDa的一条带。
6．包括示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的权利要求4或5的肿瘤抗原蛋白。
7．含有作为活性成分的权利要求1的DNA或权利要求4-6中任一项的蛋白的药物。
8．含有作为活性成分的权利要求1的DNA或权利要求4-6中任一项的蛋白的肿瘤诊断剂。
9．抗权利要求4-6中任一项的肿瘤抗原蛋白或其部分组成的部分蛋白的抗体、抗体片段或其衍生物。
10．含有作为活性成分的权利要求9的抗体、抗体片段或其衍生物的肿瘤诊断剂。
11．诊断肿瘤的方法，其特征在于它使用抗权利要求4-6中任一项的肿瘤抗原蛋白或其部分组成的部分蛋白的抗体、抗体片段、或其衍生物。
12．将具有肿瘤抗原活性的表达产物、或能够识别具有肿瘤抗原活性的蛋白的片段或其衍生物用作抗原可以产生的抗体，其中通过用含有权利要求1的DNA的表达质粒转化宿主细胞，并在适合所述DNA表达的条件下培养所获得的转化体，从而获得所述表达产物。
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