WO1999033977A1 - Proteine d'antigene tumoral, son gene et son utilisation - Google Patents

Proteine d'antigene tumoral, son gene et son utilisation Download PDF

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WO1999033977A1
WO1999033977A1 PCT/JP1998/005809 JP9805809W WO9933977A1 WO 1999033977 A1 WO1999033977 A1 WO 1999033977A1 JP 9805809 W JP9805809 W JP 9805809W WO 9933977 A1 WO9933977 A1 WO 9933977A1
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protein
dna
tumor
antibody
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Kyogo Itoh
Shigeki Shichijo
Yasuhisa Imai
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Kyogo Itoh
Shigeki Shichijo
Yasuhisa Imai
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Definitions

  • the present invention relates to a novel tumor antigen protein and a gene thereof, an antibody against the tumor antigen protein, and a method for treating, preventing or diagnosing a tumor using these substances.
  • TCR T cell receptor
  • This tumor antigen peptide is produced by synthesizing a tumor-specific protein, that is, a tumor antigen protein in a cell, and then decomposing the peptide in the cytoplasm by a proteosome.
  • the MHC class I antigen (HLA antigen) formed in the endoplasmic reticulum binds to the above-mentioned tumor antigen peptide, moves to the transgolgi on the mature side via the cis Golgi, and is carried to the cell surface for antigen presentation.
  • This antigen Tumor-specific CTLs recognize the displayed complex and exhibit antitumor effects through cytotoxicity and lymphokine production (clinical immunity, 1 (9): 1034-1042, 1995).
  • the use of flll tumor antigen protein or tumor antigen peptide will enhance tumor-specific CTLs in tumor patients and treat tumors It became possible.
  • T. Boon et al. First identified a protein named MAGE in human melanoma cells in 1991 (Science, 254: 1643-1647, 1991). Of B-severe antigen protein has been further identified from melanoma cells.
  • Tumor antigen proteins in the first category are expressed only in testis in normal »and a group of tumor tissues that are expressed in melanoma, head and neck cancer, non-small cell lung cancer, bladder cancer, etc. It is a protein.
  • the tumor antigen proteins in this category include the above-mentioned MAGE, a group of proteins forming one or more similar families thereof (J. Exp. Med., 178: 489-495, 1993), BAGE (Immunity , 2: 167-175, 1995) and GAGE (J. Exp. Med., 182: 689-698, 1995), both of which have been identified from melanoma cells.
  • this category of fl swelling antigen protein is highly expressed in some melanomas but is only expressed in 10% to 30% of patients with other types of tumors. It cannot be widely applied to the treatment and diagnosis of various tumors.
  • the tumor antigen proteins included in the second category are a group of proteins that are expressed only in melanosite and retina in normal thread! ⁇ And are expressed only in melanomas in tumor tissue. Since these tissue-specific proteins are strongly expressed in the melanoma of tumor cells, they function as melanoma-specific tumor antigen proteins.
  • the fl sever antigen proteins of this category include tyrosinase (J. Exp. Med., 178: 489-495, 1993), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3515, 1994), gp100 (J. Exp.Med., 179: 1005-1009, 1994), gp75 (J.
  • tumor antigen proteins in this category are not expressed in tumors other than melanoma, they cannot be widely applied to tumor treatment and diagnosis.
  • the third category of tumor antigen proteins is a group of proteins that have been expressed as tumor antigen peptides recognized by CTL as a result of tumor-specific mutations.
  • Tumor antigen proteins in this category include suddenly altered CDK4 (Science, 269 1281-1284, 1995), ⁇ -eaten in (J. Exp. Med.,
  • MUM-1 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7976-7980, 1995.
  • CDK4 j3-catenin
  • a single amino acid mutation increases the MHC class I antigen-binding affinity of the peptide and allows it to be recognized by T cells.
  • MUM-1 mutations cause T cells to recognize a peptide that results from the translation of an otherwise untranslated intron site.
  • the frequency of these mutations is low, so they cannot be widely applied to the treatment and diagnosis of tumors.
  • Tumor antigen proteins in the fourth category which are widely expressed in normal tissues, are proteins recognized by CTL, and P15 (J. Immunol, 154: 5944-5955, 1995) It has been identified from melanoma cells.
  • tumor antigen proteins are expressed only in a limited number of tumors, such as melanoma, or expressed in many types of tumors, but only in a small percentage of patients with that tumor. Since it is not expressed, it cannot be widely applied to the treatment and diagnosis of various tumors. In other words, in order to apply tumor antigen proteins and tumor antigen peptides generated by their cytolysis to the treatment and diagnosis of various tumors, squamous cell carcinomas (esophageal cancer , Lung cancer, etc.).
  • the present inventors attempted to clone a gene encoding a tumor antigen protein from squamous cell carcinoma cells derived from esophageal cancer, and began to encode a tumor antigen protein (SART-11) from tumor cells other than melanoma. Gene that has been successfully cloned (International Publication No. 97/46676 pamphlet).
  • the main tumor marker currently used is not so low in showing false positives in benign diseases, and therefore, it is necessary to identify tumor antigen proteins with high tumor specificity and to identify diagnostic antibodies against the tumor antigen proteins. Isolation is desired.
  • a specific tumor antigen protein or a tumor antigen peptide is used in the form of, for example, pectin as described above, the tumor antigen protein is expressed, and treatment with the tumor antigen protein or its tumor antigen peptide is performed. It is desirable to preliminarily diagnose and select a patient who can respond to the disease, and then apply the tumor antigen protein or tumor antigen peptide to the patient. In selecting such a patient, a tumor antigen protein with high tumor specificity or an antibody thereto is considered to be a very useful diagnostic agent. From such a viewpoint, it is desired to identify a tumor antigen protein which has higher tumor specificity and is applicable to a wide range of tumor patients, and an antibody against the tumor antigen protein. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel tumor antigen protein, a gene, an antibody against the tumor antigen protein, or a method for treating, preventing, or diagnosing a tumor using these substances. More specifically, the present invention provides a tumor antigen protein or a corresponding tumor antigen peptide having high tumor specificity, which can be widely used for treatment and diagnosis of various tumors, particularly squamous cell carcinoma, etc., and DNAs encoding them. And an antibody that recognizes and binds them.
  • esophageal cancer-derived squamous cell carcinoma cell line KE-4 (hereinafter, referred to as esophageal cancer cell line KE-4, or simply KE-4), Tumor restricted to HLA-A2601 and HLA-A2402, which are MHC class I antigens expressed in the KE-4 A CTL that recognizes the antigen peptide (hereinafter referred to as E-4CTL) was established (Cancer. Res., 55: 4248-4253, 1995).
  • the recombinant plasmid of the cDNA library prepared from ⁇ -4 and the recombinant plasmid of HLA-A2601 cDNA were simultaneously transfected into the fibroblast cell line VA-13 cells, and KE was added to the transfectant.
  • -4CTL was acted on, and the amount of IFN- ⁇ production was measured to screen for activation of KE-4CTL.
  • a gene encoding a novel antigen protein was successfully cloned.
  • the nucleotide sequence of the cloned gene is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the novel tumor antigen protein is introduced into a plasmid vector that expresses a fusion protein with GST, and E. coli is transformed.
  • a plasmid vector that expresses a fusion protein with GST E. coli is transformed.
  • E. coli E. coli is transformed.
  • Western blot analysis was performed on various cell lines and tissues, and all normal tissues except testis and fetal liver, and in melanoma and leukemia, No expression was observed, but the molecular weight was observed in all cases of squamous cell carcinoma of the head and neck examined, 60% of esophageal squamous cell carcinoma, 50% of lung squamous cell carcinoma, and 50% of lung adenocarcinoma.
  • cancer cells that showed a positive result in the Western blot analysis (cancer cells expressing the tumor antigen protein of the present invention) were actually recognized and damaged by tumor-specific CTL. .
  • the tumor antigen protein of the present invention is specifically and frequently expressed in various squamous cell carcinomas or adenocarcinomas, it activates antitumor immunity in these cancer patients It is considered to be useful as a drug for Further, it is considered that the antibody against the tumor antigen protein of the present invention can be effectively used in diagnosis of cancer patients and selection of target patients.
  • the nucleotide sequence of the DNA (SEQ ID NO: 1) encoding the approximately 43-kilodalton tumor antigen protein of the present invention corresponds to the tumor antigen protein SART-1 described in WO 97/46676 pamphlet.
  • DNA encoding (WO 97/46676) (Described in the pamphlet SEQ ID NO: 2).
  • the tumor antigen protein of the present invention was detected as a protein with a molecular weight of about 43 kilodaltons in various tumor tissues and tumor cells in the above-mentioned western plot analysis, and its expression pattern was about 125 molecular weight. Since it does not match SART-1 which is estimated to be a kilodalton, it is considered that it is expressed in vivo (tumor tissue, tumor cells) separately from the SART-1.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the gist of the present invention is a DNA of the following (a) or (b):
  • the present invention also relates to an expression plasmid having the DNA, a tumor antigen protein obtained by expressing the DNA, an antibody recognizing the tumor antigen protein, and use thereof.
  • FIG. 1 shows a tumor antigen restricted to HLA-A2601 and HLA-A2402 after double transfecting a gene encoding the novel tumor antigen protein of the present invention and cDNA of HLA-A2601 into VA-13 cells.
  • Mixed culture with peptide-recognizing CTL (KE-4CTL) KE-4CTL
  • FIG. 1 It is a graph showing the result of measuring the amount of IFN-y in the culture solution produced by the reaction of KE-4CTL (picture in the figure).
  • (b) shows the results of double transfection using DNAs encoding different types of HLA (HLA-A0201cDNA) for comparison, and similarly measured.
  • the vertical axis indicates the amount of IFN-T, and the horizontal axis indicates the amount of the transfected novel fl sever antigen protein gene.
  • FIG. 2 shows the results of electrophoresis in a ⁇ stan blot performed using an antiserum against a fusion protein (about 70 kD) of the novel tumor antigen protein (about 43 kD) of the present invention and GST (about 27 kD).
  • Factor Xa (-) shows that the fusion protein of the tumor antigen protein of the present invention and GST was not treated with Factor Xa.
  • Factor Xa (+) in the figure shows the results when the fusion protein was cleaved by treatment with Factor X.
  • PBMC represents healthy human peripheral blood mononuclear cells
  • KE4 and TE9 represent esophageal cancer cell lines, E95-24, E96-18, E96-34, E96-26 and E96-30. Indicates esophageal cancer tissue
  • KL79, KL80, KL81, KL82, KL83 and KL84 indicate lung cancer fiber.
  • the DNA of the present invention encodes a novel tumor antigen protein, and comprises a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA that encodes a protein having activity as a tumor antigen.
  • the term “gene” when expressing a DNA encoding a desired protein having the tumor antigen activity of the present invention, is used interchangeably.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can be cloned according to the method described in Examples described later.
  • all or a part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used as a hybridization probe or a PCR primer, for example, derived from an esophageal cancer cell line KE-4 (FERM BP-5955).
  • Closing is also possible by screening the cDMA library. Such cloning can be easily performed by those skilled in the art, for example, by referring to a basic book such as ⁇ Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 tumor antigen protein S Art- 1 co one sul DNA (International described in WO 97/466 ⁇ No. 6 Panfuretsu Bok of P CT application filed by the present applicant No. 1517 of the publication No. 97/46676 pamphlet).
  • E. coli JM109 (3) having a DNA coding for SART-1 was obtained from the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, 1-3-1 Tsukuba East, Ibaraki Prefecture, under the accession number: FERM. Deposited under BP-5951 (Deposit date: May 22, 1997). Therefore, it is not possible to use the plasmid in this deposited microorganism. Also, it is possible to obtain a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions refers to, for example, a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 A DNA having a nucleotide sequence similar to the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, such as DNA having substitution, deletion and Z or addition of one or more nucleotides, : A DNA that hybridizes with the DNA described in 1 under stringent conditions.
  • the DNA has, for example, a part of the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a probe.
  • Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd edition, Vol. 1-3 And can be obtained by screening various cDNA libraries by the method described in Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and the like.
  • substitution, deletion and substitution of one or more bases with respect to the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 as described above. / Or a DNA with an addition can be produced.
  • “stringent conditions” refers to, for example, a solution containing 6 XSSC (20 XSSC indicates 333 mM sodium citrate, 333 mM NaCl), 0.5% SDS and 50% formamide. After pre-hybridization at 42 ° C, conditions such as washing at 68 ° C in a solution of 0.1 XSSC and 0.5% SDS, or Nakayama et al., Bio-experimental illustrated gene analysis Basics, p. 148-151, Shujunsha, 1995.
  • “having activity as a tumor antigen” with respect to a protein means that the protein is recognized by CTL by binding to MHC class I antigen (HLA antigen) by intracellular degradation. Has the property of producing Therefore, “DNA encoding a protein having activity as a tumor antigen” means that when expressed, MHC class I antigen
  • HLA antigen refers to DNA that can give a tumor antigen peptide recognized by CTL. That is, a protein produced by expressing the DNA When a partial peptide produced by intracellular degradation of MHC is capable of binding to MHC class I antigen and bound to MHC class I antigen and presented on the cell surface, a complex of the peptide fragment and MHC class I antigen Specific CTLs bind to the cells and induce cytotoxic effects and cytokine production.
  • the DNA encoding a protein that produces such a peptide fragment is the "DNA encoding a protein having activity as a tumor antigen" in the present invention.
  • the candidate DNA can be “DNA encoding a protein having activity as a B13 ⁇ 4 antigen”, for example, the following method can be used.
  • COS-7 (ATCC CRL1651) derived from African green monkey kidney and fibroblast VA-
  • the transfecting can be performed, for example, by a lipofectin method using a ribofectamine reagent (manufactured by GIBCO BRL).
  • a restricted tumor-reactive CTL is added to the used MHC class I antigen and allowed to act, and the amount of various cytokines (eg, IFN- ⁇ ) produced by the reaction of the CTL is measured, for example, by ELISA
  • cytokines eg, IFN- ⁇
  • An expression plasmid having DNA encoding a specific MHC class I antigen can be prepared, for example, by a known method (Nakao et al., Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995)).
  • a tumor antigen protein by expressing the DNA of the present invention can be carried out, for example, based on many books and documents such as the aforementioned Molecular Cloning.
  • a regulatory gene such as a promoter sequence (eg, trp, lac, T7, SV40 early promoter) that regulates transcription is added upstream of the DNA to be expressed, and an appropriate vector (eg, pSV— SPORT 1) can produce an expression plasmid that replicates and expresses in host cells.
  • an appropriate vector eg, pSV— SPORT 1
  • the expression plasmid is transferred to an appropriate host cell. To obtain a transformant.
  • host cells include prokaryotic organisms such as Escherichia coli, unicellular eukaryotic organisms such as yeast, and multicellular eukaryotic cells such as insects and animals.
  • a known method such as a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, or an electric pulse method may be used.
  • the obtained transformant is cultured in a medium suitable for the transformant by a conventional method to produce the desired protein.
  • the tumor antigen protein obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method.
  • a plasmid vector for expressing a DNA encoding the tumor antigen protein of the present invention with, for example, a fusion protein with GST (glutathione S-transferase)
  • a transformant obtained by introducing the expression vector into a host such as Escherichia coli DH5 may be used as the transformant of the present invention.
  • a fusion protein of a protein and GST can be produced.
  • Such a fusion protein can be easily purified using daltathione sepharose or the like.
  • the fusion protein thus purified can also have the above-mentioned activity as a tumor antigen, but it is desirable to separate GST using the enzyme Factor X or the like to obtain a non-fused tumor antigen protein .
  • the expression product obtained in this way is encoded by the DNA of the present invention, and is a protein produced by its expression. It has properties as a tumor antigen protein, producing a recognizable tumor antigen peptide.
  • the present invention hybridizes with DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and has an activity as a tumor antigen It also provides an expression plasmid having DNA encoding the protein.
  • the present invention also provides a transformant transformed by the expression plasmid.
  • the present invention provides a protein having an activity as a tumor antigen produced by expressing the DNA of the present invention.
  • a specific example of such a protein is a protein obtained by expressing a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. The protein shows a band with a molecular weight of about 43 kDa by SDS-PAGE under reducing conditions.
  • the tumor antigen protein of the present invention comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is coded at positions 590 to 922 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and has at least HLA-A26 and HLA-A24 restricted Includes a tumor antigen peptide moiety.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a DNA encoding the tumor antigen protein SART-1 described in WO 97/46676 pamphlet disclosed by the present inventors (International SEQ ID NO: 2 of the publication No. 97/46676 pamphlet).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 corresponds to the amino acid sequence of SART-1 (SEQ ID NO: 1 of the pamphlet of WO 97/46676) and the sequence after position 690. It has been clarified by the present inventors that various sequences of the fll0 antigen peptide are present in the sequence after position 690 (see WO 97/46676 pamphlet).
  • the tumor antigen protein and gene (DNA) of the present invention as described above are useful for various purposes such as treatment, prevention and diagnosis of tumors in vivo and in vitro, as described in detail below.
  • the DNA of the present invention and the tumor antigen protein that is an expression product thereof can be widely used as an antitumor agent or a diagnostic agent for squamous cell carcinoma or the like, which frequently occurs.
  • squamous cell carcinoma is one of the most common human cancers, and squamous cell carcinoma in esophageal and lung cancers is known to be relatively resistant to current chemotherapy and radiation therapy. ing.
  • the present invention provides a medicine comprising the DNA or tumor antigen protein of the present invention as an active ingredient.
  • the medicament containing the tumor antigen protein of the present invention as an active ingredient can be administered with an adjuvant so as to effectively establish cellular immunity, or can be administered in the form of particles.
  • tumor antigen protein is administered to a living body, tumor antigen peptide is presented at high density to MHC class I antigen of antigen presenting cells, and tumor-specific CT L proliferates efficiently, thereby achieving treatment or prevention of the tumor.
  • adjuvant those described in the literature (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) can be applied.
  • agents capable of efficiently presenting exogenous antigen peptides to MHC Class I antigens such as ribosome preparations, granular preparations bound to beads having a diameter / ira, and preparations bound to lipids Shapes are also conceivable.
  • Administration methods include intradermal administration, subcutaneous administration, and intravenous injection.
  • a method of administering antigen-presenting cells such as dendritic cells or macrophages that have presented a tumor antigen peptide, or cells into which DNA encoding a tumor antigen protein has been introduced can be considered.
  • the dosage of the tumor antigen protein of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age and weight of the patient, etc., and is usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.0001 mg to 100 mg. Yes, it is preferably administered once every few days or months.
  • the tumor can be treated or prevented by administering to a patient a drug containing, as an active ingredient, DNA encoding the tumor antigen protein of the present invention.
  • DNA of the present invention When the DNA of the present invention is administered, the tumor antigen protein is highly expressed in the cell, and the generated tumor antigen peptide binds to the MHC class I antigen and is presented at a high density on the cell surface.
  • the tumor-specific CTL is efficiently propagated in the body, and the treatment or prevention of the tumor is achieved.
  • Methods for administering DNA and introducing it into cells for such a purpose are known, for example, a method using a viral vector and other methods (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, ⁇ (1), 23-48 (1994), Special Issue on Experimental Medicine, J (15), (1994), and references cited in these publications), and any of these methods can be applied to the present invention. .
  • a DNA virus or an RNA virus such as a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a box virus, a polio virus, or a simbis virus, may be used.
  • the method of incorporating and introducing is mentioned.
  • a method using a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a vaccinia virus and the like is particularly preferable.
  • DNA vaccine method administering the expression plasmid directly into the muscle
  • ribosome method lipofectin method
  • microinjection method examples thereof include a calcium phosphate method and an electoporation method, and a DNA vaccine method and a ribosome method are particularly preferable.
  • DNA of the present invention can be applied by any method, the in vivo method is more preferable.
  • the drug When administered by the in vivo method, the drug is administered by an appropriate route depending on the disease, symptom, and the like to be treated. For example, it can be administered intravenously, intraarterially, subcutaneously, intradermally, intramuscularly, and the like.
  • it When administered by the in vivo method, for example, it may be in the form of a liquid preparation or the like, but it is generally regarded as a pharmaceutical preparation containing the DNA of the present invention, which is an active ingredient, and if necessary.
  • a conventional carrier may be added.
  • the form of the ribosome preparation such as a suspending agent, a freezing agent, and a centrifuging concentrated freezing agent may be used. can do.
  • the content of the DNA of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age and weight of the patient, etc., and usually 0.000001 to 100 mg, preferably 0.001 to 10 mg of the present invention.
  • the DNA of the invention is administered once every few days to several months.
  • the DNA and protein of the present invention as described above are also useful as a reagent for research in the research field in addition to the above-mentioned medicine.
  • the protein of the present invention can be used as an active ingredient of a diagnostic agent for tumor. That is, the tumor antigen protein of the present invention is labeled as necessary to detect the presence of an antibody (antibody against a tumor antigen protein) in a sample (blood, tumor tissue, etc.) obtained from a patient suspected of having a tumor. By doing so, it is possible to diagnose the presence or absence of a tumor. Further, the protein of the present invention is also useful as an immunogen for producing the antibody of the present invention described below.
  • the term “antibody” refers to an antibody against the tumor antigen protein of the present invention or a partial protein consisting of a part thereof.
  • the antibody is, for example, Antibodies; A Laboratory Manual, edited by Lane, H, D. et al., Cold Spring Harber Laboratory Press It is easily prepared by the method described in New York 1989 and the like. That is, the antibody of the present invention can be easily prepared by appropriately immunizing an animal by using the tumor antigen protein of the present invention or a partial protein consisting of a part thereof as an immunogen and appropriately immunizing an animal by a conventional method.
  • a tumor antigen protein of the present invention a partial protein (including peptide fragment) composed of a part of the tumor antigen protein of the present invention, a lupus ulcer antigen protein of the present invention or a part composed thereof
  • examples include a fusion protein of a protein and GST (glutathion S-transferase), or a fusion protein of a tumor antigen protein of the present invention or a partial protein consisting of a part thereof and a Myc tag.
  • the length of the partial protein includes a length of at least 8 amino acids or more from the viewpoint of the minimum length that can form an epitope.
  • a monoclonal antibody specific to the tumor antigen protein of the present invention can be prepared by a known method.
  • the technology of dilipidoma described above is a monoclonal antibody against many specific antigens.
  • the method can be carried out by a person skilled in the art according to a method described in a document such as, for example, Protein Experiment Method for Molecular Biology, Chapter 4, Yodosha (1994).
  • the method of immunizing a host animal or the method and schedule for culturing antibody-producing cells obtained therefrom follow conventional established antigen stimulation and production techniques.
  • the obtained antibody can be obtained by a known technique, for example, immunofluorescence chromatography,
  • the antibody fragment can be purified by HPLC (high performance liquid chromatography) or the like.
  • Various antibody fragments can also be prepared based on the antibodies obtained as described above.
  • the antibody fragment is, for example, an F (al) ′) 2 fragment that can be generated by pepsin digestion of an antibody, or a Fab ′ fragment that can be generated by reducing the disulfide bond of an F (ab ′) 2 fragment.
  • 2Fab or Fab fragments that can be produced by treating an antibody with papain and a reducing agent. These fragments are also included in the scope of the present invention.
  • various derivatives can be produced based on these antibodies or antibody fragments.
  • Derivatives here include, for example, chimeric antibodies and humanized antibodies
  • the antibody can be prepared, for example, according to the method described in JP-A-61-47500, Nature, 321, 522 (1986).
  • those in which the antibody or antibody fragment is labeled with an enzyme or the like are also included in the category of the derivative.
  • Specific examples of the enzyme labeling method include the dartalaldehyde method, the Persio method, the maleimide method, and the pyridyl disulfide method.
  • Examples of the enzyme used for labeling include small intestine alkaline phosphatase, horseradish peroxidase and the like.
  • These labeled antibodies can be easily prepared by those skilled in the art according to, for example, enzyme immunoassays and basic books such as Medical Shoin (1978). Furthermore, it can be labeled with a radioisotope (radio isotope).
  • antibodies, etc. The above-described antibodies, antibody fragments, or derivatives thereof (hereinafter, referred to as antibodies, etc.) of the present invention can be used as diagnostic agents for tumors as described below. .
  • Example 4 Western blot analysis of various cell lines and tissues using the antibody of the present invention revealed that all the normal tissues except testis and fetal liver, or melanoma and leukemia, this the expression was not observed, all cases of squamous cell carcinoma of the head and neck, which were examined, 6 0% of esophageal squamous cell carcinoma, 50% of lung squamous cell carcinoma, in ⁇ beauty of lung adenocarcinoma 5 0% of cases Expression of the novel tumor antigen protein of the invention was observed. Furthermore, cancer cells (positive cells of the ffi ⁇ antigen protein of the present invention) that showed a positive result in the Western blot analysis were actually recognized by ulcer-specific CTL and could be injured and damaged. It became clear.
  • the expression of the tumor antigen protein of the present invention was not detected in normal tissues other than testis and fetal liver, or in melanoma or leukemia, and was specifically and frequently expressed in various squamous cell carcinomas or adenocarcinomas. . Therefore, it is considered that the antibody against the tumor antigen protein of the present invention can be widely used for diagnosis of these cancer patients. Further, by detecting the tumor antigen protein of the present invention using such an antibody or the like, early detection, recurrence, and metastasis of a tumor can be achieved, and the tumor antigen protein, tumor antigen peptide or It is possible to efficiently select tumor patients to whom a drug using the DNA encoding them can be applied. As a result, it is expected to greatly contribute to the treatment and prevention of tumors. Therefore, the present invention provides an antibody, an antibody fragment, or a derivative thereof against the tumor antigen protein of the present invention or a partial protein consisting of a part thereof.
  • the present invention also provides a composition for treating or diagnosing a tumor, comprising any of these antibodies, antibody fragments, or derivatives thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for diagnosing a tumor using the antibody, antibody fragment or derivative thereof of the present invention.
  • the antibody or the like of the present invention can be used as an active ingredient of a diagnostic agent for fl severe ulcer by allowing the antibody or the like of the present invention to be present in an appropriate buffer such as, for example, a phosphate buffer (pH 7.0) containing calcium serum albumin.
  • an appropriate buffer such as, for example, a phosphate buffer (pH 7.0) containing calcium serum albumin.
  • a method for performing an immunological diagnosis using the diagnostic agent of the present invention include a method for detecting a tumor antigen protein from a tumor specimen, a method for detecting the presence of a tumor antigen protein in blood or tissue, and the like.
  • Can be Specific detection methods include, in addition to Western blot analysis described in Example 4 below, immunohistochemistry, Immunobout, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), Fluorescence or luminescence measurement methods are exemplified.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • Fluorescence or luminescence measurement methods are exemplified.
  • the diagnostic agent of the present invention can be used in the form of a kit containing, for example, an enzyme-labeled antibody, a color former, a color auxiliary, a stop solution, a standard product, and the like, depending on the measurement method.
  • the antibody or the like of the present invention is used for treatment, for example, the ability to administer a monoclonal antibody specific to the tumor antigen protein of the present invention, or the use of a monoclonal antibody to which a carcinostatic agent or a toxin is bound
  • a method of administering the compound to a cancer patient to kill the tumor cells expressing the tumor antigen protein for example, the ability to administer a monoclonal antibody specific to the tumor antigen protein of the present invention, or the use of a monoclonal antibody to which a carcinostatic agent or a toxin is bound
  • antibody of the present invention uses such as the antibody of the present invention include abundance chromatography, screening of a cDNA library, and the like.
  • CTL cytotoxic T cell
  • a recombinant plasmid was prepared in which the cDNA of HLA-A2601 was incorporated into expression vector pCR3 (manufactured by INVITR0GEN).
  • the recombinant bra corner de Gene Pulser (Bio- Rad, Inc.) using 25 / zF, under conditions of 2.5k V, were introduced into the electret E. coli by the electric pulse Toro MAX DH10B / p3 TM cells (GIBCO BRLth) And transformants into which recombinant plasmid had been introduced were selected in LB medium (1% bactotryptone, 0.5% first extract, 0.5% NaCl, pH 7.3) containing ampicillin (50 // g / ml) .
  • IFN-y interferon- ⁇
  • ELISA Adsorb an anti-human IFN- ⁇ mouse monoclonal antibody as a solid antibody to a 96- well microphone plate, and bind nonspecifically with serum albumin. After blocking the binding, IFN- ⁇ in the sample was allowed to bind to the antibody. Next, an anti-human IFN-v ⁇ sagi polyclonal antibody is bound as a detection antibody, and an alkaline phosphatase-labeled anti-sagiminoglobulin antibody is further bound, and paranitrophenyl phosphate is used as a chromogenic substrate. After the reaction was stopped with IN NaOH or the like, the absorbance (405 nm) was measured. This was quantified by comparing with the value obtained with the standard IFN- ⁇ .
  • Recombinant plasmid DNA collected by isopropanol precipitation was suspended in 50 ⁇ l of a 10 mM Tris, ImM EDTA, pH 7.4 solution containing 20 ng / ml RNase.
  • KE-4 c DN to fibroblast cell line VA-13 cells (RIKEN Cell Development Bank, Ann. Med. Exp. Biol. Fenn., 44: 242-254, 1966) by the lipofectin method as follows:
  • the recombinant plasmid of A and the recombinant plasmid of HLA-A2601 cDNA were double transfected. That is, VA-13 cells were added to a 96-well flat-bottomed microplate at 7,000 cells / well, and cultured in RPMI164 medium containing 100/1/10% FCS for 2 days. Using a lipofectin reagent (manufactured by GIBCO BRL), recombinant plasmid KE-4 cDNA of about 100 transformants and HLA-A2601c DN shown in Reference Example 2 were used.
  • HLA-A0201 For comparison, the same experiment was performed using cDNAs encoding different types of HLA (HLA-A0201).
  • the black squares and the mouth indicate the results using HLA-A2601 cDNA and HLA-A0201 cDNA, respectively.
  • the horizontal axis shows the amount of the plasmid clone (ng / well), and the vertical axis shows the amount of IFN- ⁇ produced by KE4-CTL (pg / ml). From FIG. 1, it can be seen that transfection of this plasmid clone into VA-13 cells induces the production of IFN-y from KE-4CTL, that is, the plasmid clone is a gene encoding a tumor antigen protein. It became clear.
  • the transformant having the recombinant plasmid into which the cDNA of the tumor antigen protein gene selected in Example 1 was integrated was cultured at 37 ° C in LB medium containing 500 ml of ampicillin (50 / g / ml) at 14 ° C. The cells were cultured for 16 hours, and the cells were collected by centrifugation. Recombinant plasmid was recovered from the cells according to PLASMID MAXI kit (QIAGEN).
  • the cDNA contains the SP6 RNA polymerase promoter sequence and the T7 RNA polymerase promoter. —Integrated at the site between the protein sequences.
  • the SP6 promoter primer and the T7 promoter primer described in the literature were synthesized.
  • the SP6 promoter primer or T7 promoter primer was combined with Fluore-dATP Labeling ix (Pharmacia Biotech) and AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) to perform dideoxy sequencing reaction, and the fluorescence was measured.
  • the nucleotide sequence of cDNA was determined from both ends using a DNA sequencer (Pharmacia Biotech Byone ⁇
  • the determined nucleotide sequence (1011 bP) is shown in SEQ ID NO: 1.
  • This amplified fragment is digested with restriction enzymes EcoRI and NotI, and a plasmid vector pGEX-5X-3 (Pharmacia Biotech) expressing a fusion protein with glutathione S-transferase (GST) Ligation at the EcoRI and NotI sites of to obtain a recombinant plasmid.
  • the recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli DH5, and a transformant was selected.
  • the transformant is cultured in a large amount, and the cells are disrupted by ultrasonication in the presence of the proteinase inhibitors PMS F and aprotune to extract the fusion protein of the tumor antigen protein of the present invention and GST. did.
  • the fusion protein was isolated by abundity purification using Glutathione Sepharose 4B (Pharmacia Biotech) and gel filtration purification using Superrosel2 (Pharmacia Biotech). Using the isolated fusion protein as an antigen, the rabbit was immunized by a conventional method to obtain an antiserum.
  • Example 4 Western plot analysis
  • the antiserum obtained in Example 3 recognized the 70 kD fusion protein used for immunization, and when the fusion protein was cleaved into GST and a tumor antigen protein by the enzyme FactorX, it was added together with 27 KD GST. It recognized the 3 KD tumor antigen protein (Fig. 2A).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • leukemia cell lines in 16 cases
  • melanomas in 2 cases.
  • Fig. 2 (B) An example of these results is shown in Fig. 2 (B).
  • the novel tumor antigen protein of the present invention was specifically and frequently expressed in various squamous cell carcinomas or adenocarcinomas. It can be applied to the diagnosis of cancer cells and cancer patients.
  • Example 5 Expression of tumor antigen protein in various cancer cells and measurement of cell injury activity by CTL DNA obtained by treating a recombinant plasmid (K 3) (FERM BP-5951) having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 of WO 97/46676 pamphlet with EcoRI and NotI The fragment was ligated to the EcoR I and Not I sites of the plasmid vector pGEX-4T-2 (Pharmacia Biotech), which expresses a fusion protein with glutathione S-transferase (GST). I got a plus. From this plasmid, a fusion protein with GST and an antiserum thereto were prepared in the same manner as in Example 3.
  • K 3 recombinant plasmid
  • pGEX-4T-2 Pharmacia Biotech
  • This antiserum recognizes a tumor antigen protein (molecular weight: about 125 kDa) described in WO 97/46676.
  • the method described in Example 4 was performed using the antiserum against the protein having a molecular weight of about 125 kDa and the antiserum obtained from Example 3 against the tumor antigen protein of the present invention having a molecular weight of about 43 kDa.
  • Western blot was performed according to the procedure described above, and expression in various HLA-A24 positive cancer cell lines was examined. On the other hand, the cytotoxicity of KE-4CTL to various cancer cells was determined by DD Kharkevitch et al., Int. J. Cancer,
  • KE-4CTL shows a damaging activity on cancer cell lines expressing the 43 kD protein, but on cancer cell lines not expressing the 43 kD protein, Except for TE-10, KE-4CTL did not show any damaging activity. From these results, it is considered that the antigen peptide derived from the 43 kD protein tends to present antigen more efficiently and be recognized by CTLs than the antigen peptide derived from the 125 kD protein. Antibodies against the D protein were considered to be more useful for diagnosing cancer patients who can expect a therapeutic effect with the tumor antigen protein of the present invention, its tumor antigen peptide, or DNA encoding the tumor antigen protein.
  • novel tumor antigen protein and its gene which are frequently expressed in various squamous cell carcinomas or adenocarcinomas of the present invention, and antibodies against the novel tumor antigen protein are useful for preventing, treating or diagnosing a wide range of JH ulcers. Useful for

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Description

明 細 書 腫瘍抗原タンパク質及ぴその遺伝子並びにその利用 技術分野
本発明は、 新規な腫瘍抗原タンパク質及びその遺伝子、 該腫瘍抗原タンパク質 に対する抗体、 並びにこれらの物質を用いて腫瘍を治療、 予防又は診断する方法 に関する。 背景技術
生体による腫瘍の排除には免疫系、 特に T細胞が重要な役割を果たしているこ とが知られている。 実際、 ヒ トの腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示す リンパ球の浸潤が認められ (Arch. Surg. , 126:200-205, 1990)、 メラノーマから は自己の腫瘍細胞を認識する細胞傷害性 T細胞 （CTL) が比較的容易に分離さ れている（Immunol. Today, 8:385, 1987、 J. Immunol. , 138:989, 1987、
Int. J. Cancer, 52:52-59, 1992等） Q また、 T細胞移入によるメラノーマ治療の 臨床結果も腫瘍排除における T細胞の重要性を示唆している（J.Natl. Cancer. Inst. , 86:1159, 1994)。
CTLが自己の腫瘍細胞を攻撃する際の標的分子については長い間不明であつ たが、 最近の免疫学及び分子生物学の進歩により次第に明らかになつてきた。 す なわち CTLは、 T細胞受容体 （TCR) を用いて、 腫瘍抗原ペプチドと呼ばれ るべプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラス I抗原 （MHCクラス I抗原、 ヒ トの場合は HL A抗原と呼ばれる） との複合体を認識することにより、 自己の腫 瘍細胞を攻撃していることが明らかとなった。
この腫瘍抗原ペプチドは、 腫瘍に特有のタンパク質、 すなわち腫瘍抗原タンパ ク質が細胞内で合成された後、 プロテオソームによって細胞質内でぺプチドに分 解されることによって生成される。 一方、 小胞体で形成された MHCクラス I抗 原 （HLA抗原） は、 上記の腫瘍抗原ペプチドと結合し、 シスゴルジを経て成熟 側のトランスゴルジへと移動し、 細胞表面に運ばれて抗原提示される。 この抗原 提示された複合体を腫瘍特異的な C T Lが認識し、 細胞傷害作用やリンフォカイ ンの産生を介して抗腫瘍効果を示す （臨床免疫， 1(9) : 1034-1042, 1995)。 この ような一連の作用の解明に伴い、 flll瘍抗原タンパク質又は腫瘍抗原ぺプチドをい わゆる癌ワクチンとして利用することにより、 腫瘍患者の体内の腫瘍特異的な C T Lを増強させ、 腫瘍を治療することが可能となった。
この腫瘍抗原タンパク質としては、 1991年に T. Boon らが初めて MA G Eと名 付けたタンパク質をヒ トメラノーマ細胞から同定し（Science, 254: 1643-1647, 1991)、 またその後、 レ、くつかの B重瘍抗原タンパク質がさらにメラノーマ細胞か ら同定されている。
今までに同定された腫瘍抗原タンパク質は、 T. Boonらの総説 (J. Exp. Med.， 183,
725〜729， 1996)に記述されているように、 以下の 4つのカテゴリ一に分けるこ とができる。
1つ目のカテゴリーに含まれる腫瘍抗原タンパク質は、 正常 »では精巣での み発現しており、 腫瘍組織ではメラノーマ、 頭頸部癌、 非小細胞性肺癌、 膀胱癌 などに発現が認められる一群のタンパク質である。 このカテゴリーの腫瘍抗原タ ンパク質としては、 上記の MAG E、 その 1 2種類以上の類似するファミリーを 形成するタンパク質群（J. Exp. Med.， 178:489-495, 1993)、 B A G E (Immunity, 2 : 167-175, 1995)及び G A G E (J. Exp. Med.， 182 :689-698, 1995)があり、 いず れもメラノーマ細胞から同定されている。
しかし、 このカテゴリーの fl重瘍抗原タンパク質は、 メラノーマでは高発現して いるものもあるが、 その他の種類の腫瘍ではその腫瘍の患者のうち 1 0 %から 3 0 にしか発現しておらず、 種々の腫瘍の治療や診断に広く応用することは できない。
2つ目のカテゴリーに含まれる腫瘍抗原タンパク質は、 正常糸!^ではメラノサ イト、 網膜でのみ発現しており、 腫瘍組織ではメラノ一マのみで発現が認められ る一群のタンパク質である。 これらの組織特異的なタンパク質は腫瘍細胞のメラ ノ一マに強度に発現していることから、 メラノーマに特異的な腫瘍抗原タンパク 質として機能している。 このカテゴリ一の fl重瘍抗原タンパク質としては、 チロシ ナーゼ（J. Exp. Med.， 178: 489-495, 1993)、 MA R T— 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 : 3515， 1994)、 g p 1 0 0 (J. Exp. Med. , 179 : 1005-1009, 1994)、 g p 7 5 (J. Exp. Med. , 181 : 799-804, 1995)があり、 これらの遺伝子はいずれもメラ ノーマ細胞からクローニングされている。 また、 別途 Melan— A (J. Exp. Med.， 180: 35, 1994)が同定されたが、 MA R T— 1と同一の分子であった。
しかし、 このカテゴリーの腫瘍抗原タンパク質は、 メラノーマ以外の腫瘍では 発現していないため、 広く腫瘍の治療や診断に応用することはできない。
3つ目のカテゴリ一に含まれる腫瘍抗原タンパク質は、 腫瘍特異的な突然変異 の結果、 C T Lに認識される腫瘍抗原ぺプチドとして発現されるようになった一 群のタンパク質である。 このカテゴリーの腫瘍抗原タンパク質としては、 突然変 異した C D K4 (Science, 269 1281—1284, 1995)、 β -eaten in (J. Exp. Med. ,
183: 1185-1192, 1996)、 MUM— 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 : 7976 - 7980， 1995)がある。 C D K 4、 j3 - cateninでは、 1つのアミノ酸変異により、 ぺプチ ドの MH Cクラス I抗原結合親和性が増加し、 T細胞に認識されるようになる。 MUM— 1では、 突然変異により、 通常は翻訳されないイントロン部位が翻訳さ れることにより生じるペプチドが T細胞に認識される。 し力 し、 これらの突然変 異の頻度は低いため、 広く腫瘍の治療や診断に応用することはできない。
4番目のカテゴリーに含まれる腫瘍抗原タンパク質は、 正常組織にも広範に発 現しているが、 C T Lに認識されるタンパク質であり、 P 1 5 (J. Immunol, 154: 5944-5955, 1995)がメラノーマ細胞から同定されている。
以上のような既知の腫瘍抗原タンパク質は、 メラノーマのような限られた腫瘍 でしか発現していないか、 又は多くの種類の腫瘍で発現していてもその腫瘍の患 者のうちの少数にしか発現していないため、 種々の腫瘍の治療や診断に幅広く応 用できるものではない。 すなわち、 腫瘍抗原タンパク質やその細胞內分解により 生じる腫瘍抗原ぺプチドを種々の腫瘍の治療や診断に応用するためには、 メラノ 一マに比べて発生頻度が圧倒的に高い扁平上皮癌 （食道癌、 肺癌等） 等に幅広く 適用可能な腫瘍抗原の同定が必要である。 これに関して、 本発明者らは食道癌由 来の扁平上皮癌細胞から腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子のクロ一ニング を試み、 メラノーマ以外の腫瘍細胞からはじめて、 腫瘍抗原タンパク質 （S A R T一 1 ) をコードする遺伝子のクローニングに成功している （国際公開第 97/46676号パンフレット） 。
ところで、 腫瘍の診断に関しては、 現在、 腫瘍関連抗原に対する抗体を用いる ことにより、 ラジオィムノアツセィゃ E L I S Aなどによる血中抗原物質の検出、 酵素抗体法や蛍光抗体法などの免疫組織化学法による組織細胞診、 さらには腫瘍 のイメージングなどが試みられている （Oncodevelopmental Markers,
Fishman，W. H.ら著、 Academic Press出版、 1983年） 。 しかし現在使用されている 主な腫瘍マーカ一は良性疾患において偽陽性を示す頻度が決して低くなく、 その ため腫瘍特異性の高い腫瘍抗原タンパク質の同定、 及び該腫瘍抗原タンパク質に 対する診断用の抗体の単離が望まれている。
さらに、 前記のように特定の腫瘍抗原タンパク質、 又は腫瘍抗原ペプチドを例 えばヮクチンのような形で用いる場合、 当該腫瘍抗原タンパク質を発現しており、 該腫瘍抗原タンパク質又はその腫瘍抗原ぺプチドによる治療に反応しうる患者を あらかじめ診断 ·選定した上で、 その患者に対して当該腫瘍抗原タンパク質又は 腫瘍抗原べプチドを適用することが望ましい。 そのような対象患者の選定におい て、 腫瘍特異性の高い腫瘍抗原タンパク質又はそれに対する抗体は非常に有用な 診断薬となると考えられる。 このような観点からも、 より腫瘍特異性が高く、 ま た幅広レヽ腫瘍患者に適用可能な腫瘍抗原タンパク質、 及び該腫瘍抗原タンパク質 に対する抗体の同定が望まれている。 発明の開示
本発明の目的は、 新規な腫瘍抗原タンパク質、 遺伝子、 又は該腫瘍抗原タンパ ク質に対する抗体、 あるいはこれらの物質を用いて腫瘍を治療、 予防又は診断す るための方法を »することにある。 さらに詳しくは、 本発明は、 各種の腫瘍、 特に扁平上皮癌等の治療や診断に幅広く利用できる、 腫瘍特異性の高い腫瘍抗原 タンパク質又はその対応する腫瘍抗原ペプチド、 それらをコードする D NA、 及 びそれらを認識し結合する抗体を提供することを目的とする。
上記の目的を達成するために、 本発明者らは食道癌由来の扁平上皮癌細胞株 KE - 4(以下、 食道癌細胞株 KE- 4、 あるいは単に KE- 4と称す）を樹立し、 また該 KE - 4 において発現する MHCクラス I抗原である HLA- A2601、 HLA- A2402に拘束性の腫瘍 抗原ぺプチドを認識する C T L (以下、 E - 4CTLと称す）を樹立した (Cancer. Res. , 55:4248-4253, 1995)。
つづいて、 線維芽細胞株 VA-13細胞に、 ΚΕ- 4から作製した c D N Aライブラリ 一の組換えプラスミドと HLA- A2601 c D N Aの組換えプラスミドを同時にトラン スフヱク トし、 そのトランスフエクタントに KE- 4CTLを作用させ、 IFN- γの産生 量を測定することにより、 KE- 4CTLの活性化に関してスクリ一二ングした。 該ス クリ一二ングを繰り返した結果、 新規な 抗原タンパク質をコ一ドする遺伝子 をクロ一ユングすることに成功した。 クローニングされた遺伝子のヌクレオチド 配列を配列番号： 1に示す。
次に、 この新規な腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子を G S Tとの融合タ ンパク質を発現させるプラスミ ドベクターに導入し、 大腸菌を形質転換すること により、 本発明の新規な腫瘍抗原タンパク質と G S Tとの融合タンパク質を調製 した。 該融合タンパク質をゥサギに免疫することにより得られた抗体を用レヽ、 種々の細胞株及び組織に対するウェスタンブロット解析を行ったところ、 精巣及 ぴ胎児肝を除く全ての正常組織、 及びメラノーマ、 白血病では発現が認められな かったが、 検討した頭頸部扁平上皮癌の全例、 食道扁平上皮癌の 6 0 %、 肺扁平 上皮癌の 5 0 %、 及ぴ肺腺癌の 5 0 %において、 分子量約 4 3キロダルトンを有 する本発明の新規な腫瘍抗原タンパク質の発現が認められた。 さらに、 前記ゥェ スタンブロット解析で陽性を示した癌細胞 （本発明の腫瘍抗原タンパク質の発現 している癌細胞） は、 実際に腫瘍特異的 C T Lにより認識され傷害を受けること も明らかとなった。
以上のように、 本発明の腫瘍抗原タンパク質は、 種々の扁平上皮癌あるいは腺 癌にぉレ、て特異的かつ高頻度で発現していることから、 これらの癌患者の抗腫瘍 免疫を活性化するための医薬として有用であると考えられる。 また本発明の腫瘍 抗原タンパク質に対する抗体は、 癌患者の診断、 対象患者の選定において、 有効 に利用できるものと考えられる。
なお本発明の約 43キ口ダルトンの腫瘍抗原タンパク質をコ一ドする D N A (配 列番号： 1 ) のヌクレオチド配列は、 国際公開第 97/46676号パンフレッ トに記載 の腫瘍抗原タンパク質 S A R T— 1をコードする D N A (国際公開第 97/46676号 パンフレッ トの配列番号： 2に記載） の、 第 1517位以降のヌクレオチド配列と一 致する。 しかしながら、 本発明の腫瘍抗原タンパク質は、 上記ウェスタンプロッ ト解析において、 種々の腫瘍組織及ぴ腫瘍細胞中で分子量約 43キロダルトンのタ ンパク質として検出されており、 しかもその発現パターンは分子量約 125キロダ ルトンと推定される S ART— 1と一致していないことから、 該 SART- 1と は別個に生体内 （腫瘍組織、 腫瘍細胞内） で発現しているものと考えられる。 本発明は、 以上のような知見に基づき完成したものである。
即ち本発明の要旨は、 以下の （a) 又は （b) の DNA：
(a) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DN A；又は
( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件 下でハイブリダィズし、 かつ腫瘍抗原としての活性を有するタンパク質をコード する DNAに関する。
本発明はまた、 該 DNAを有する発現プラスミド、 該 DN Aが発現して得られ る腫瘍抗原タンパク質、 該腫瘍抗原タンパク質を認識する抗体及びそれらの利用 に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の新規な腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子と HLA- A2601 の c DN Aとを VA- 13細胞へダブルトランスフエクトしたのち、 HLA- A2601、 HLA- A2402に拘束性の腫瘍抗原ペプチドを認識する CTL (KE-4CTL) と混合培養し、
KE- 4CTLが反応して産生した培養液中の IFN- y量の測定を行つた結果を示すグラ フである （図中画） 。 図中ロは、 比較のために異なったタイプの HLAをコードす る DNA (HLA-A0201cDNA) を用いてダブルトランスフエタトし、 同様に測定し た結枭を示すものである。 縦軸は IFN-T量を、 横軸はトランスフエクトした新規 な fl重瘍抗原タンパク質遺伝子の量を示す。
図 2は、 本発明の新規な腫瘍抗原タンパク質 （約 43 kD) と GST (約 27 kD) との融合タンパク質 （約 70 kD)に対する抗血清を用いて行ったゥエスタ ンブロットにおける電気泳動の結果である。 図 2 Aにおいて、 Factor Xa(- )は本 発明の腫瘍抗原タンパク質と G S Tとの融合タンパク質を Factor Xaで処理しな かつた場合、 また図中 Factor Xa (+)は Factor Xで処理することにより融合タンパ ク質を切断した場合の結果を示す。 図 2 Bにおいて、 PBMCは健常人末梢血単 核球を、 KE 4及び TE 9は食道癌細胞株を、 E95— 24、 E96— 18、 E 96— 34、 E 96-26及び E 96— 30は食道癌組織を、 また K L 79、 K L80、 KL81、 KL82、 KL83及び K L 84は肺癌糸纖を示す。 発明を実施するための最良の形態
本明細書中、 本発明の DNAとは、 新規な腫瘍抗原タンパク質をコードするも のであり、 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNA、 又は配列番号： 1に 記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズす る DN Aであって、 かつ腫瘍抗原としての活性を有するタンパク質をコードする DNAである。 なお、 本明細書中では、 本発明の腫瘍抗原活性を有する所望のタ ンパク質をコードする DNAを表現する際に、 遺伝子なる語句も相互変換可能に 用いる。
ここで 「配列番号： 1に記載の塩基配列からなる D N A」 は、 後述の実施例に 記載の方法に従ってクローニングすることができる。 また、 配列番号： 1に記载 の塩基配列の全部又は一部をハイブリダイゼーシヨンのプローブ又は P CRのプ ライマ一として用い、 例えば食道癌細胞株 KE - 4 (FERM BP-5955) 由来の cDMAライ プラリ一をスクリ一ユングすることによつてもクローユングすることが可能であ る。 該クローニングは、 例え ^Molecular Cloning ： A Laboratory Manual第 2 版、 第卜 3卷、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989等の基本書を参考に して、 当業者ならば容易に行うことができる。
さらに、 配列番号： 1に記載の塩基配列は、 本出願人による P CT出願の国際 公開第97/466ァ6号パンフレツ卜に記載の腫瘍抗原タンパク質 S ART— 1をコ一 ドする DNA (国際公開第 97/46676号パンフレットの配列番号： 2に記載） の第 1517位以降の配列と一致する。 該 S ART— 1をコ一ドする DNAを有する E. coli JM109 ( 3)は、 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号、 工業技術院生命工学ェ 業技術研究所に、 受託番号： FERM BP— 5951で寄託されている （受託 日 ：平成 9年 5月 22日） 。 従ってこの寄託微生物中のプラスミ ドを利用するこ とによっても、 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる D N Aを得ることが可能 である。
本明細書において、 「配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DN Aとストリ ンジェントな条件下でハイプリダイズする D N A」 とは、 例えば配列番号： 1に 記載の塩基配列からなる DNAに対して 1又は複数個の塩基の置換、 欠失及び Z 又は付加を有する DNAのような、 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DN Aに類似の塩基配列を有する DN Aであって、 配列番号： 1に記載の DNAとス トリンジェントな条件下でハイブリダイズする DN Aを指す。
該 DNAは、 例えば配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAの一部をプ ローブある ヽ fまプフづマー {こ用レヽ、 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 第 2版、 第 1-3卷、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989等に記載の方法 によって種々の c DNAライブラリーをスクリーエングすることにより得ること ができる。 また、 前記 Molecular Cloningに記載の部位特異的変異誘発や PC R 法によっても、 前記の如き配列番号： 1に記載の塩基配列からなる D N Aに対し て 1又は複数個の塩基の置換、 欠失及び/又は付加を有する DN Aを製造するこ とができる。
ここで、 「ストリンジェントな条件」 とは、 例えば、 6 XSSC (20 XS SCは、 333 mM S o d i um c i t r a t e、 333 mM NaC lを 示す） 、 0.5%SDS及び 50%ホルムアミ ドを含む溶液中で 42 °Cにてハイ プリダイズさせた後、 0. 1 XSSC、 0.5 % S D Sの溶液中で 68 °Cにて洗 浄するような条件、 あるいは、 中山ら著、 バイオ実験イラストレイテッド②遺伝 子解析の基礎、 p. 148— 151、 秀潤社、 1 995年、 に記載の条件等を指す。 本明細書中、 タンパク質に関して 「腫瘍抗原としての活性を有する」 とは、 そ のタンパク質が、 細胞内分解により、 MHCクラス I抗原 （HLA抗原） と結合 して C T Lにより認識される腫瘍抗原ぺプチドを生じるという特性を有すること を意味する。 従って、 「腫瘍抗原としての活性を有するタンパク質をコードする DNA」 とは、 それが発現したとき、 細胞内分解により、 MHCクラス I抗原
(HLA抗原） と結合して CTLにより認識される腫瘍抗原ぺプチドを与えるこ とができる DN Aを指す。 すなわち、 該 DN Aが発現して生産されるタンパク質 の細胞内分解により生じる部分ペプチドが、 MHCクラス I抗原と結合可能であ り、 MHCクラス I抗原と結合して細胞表面に提示された場合、 そのペプチド断 片と MHCクラス I抗原との複合体に対して特異的な C T Lが結合して細胞傷害 作用やサイトカインの産生が誘導されることになる。 そのようなペプチド断片を 生じるタンパク質をコードする DNAは、 本発明における 「腫瘍抗原としての活 性を有するタンパク質をコードする DNA」 である。
候補となる DN Aが、 「B1¾抗原としての活性を有するタンパク質をコードす る DNA」 であり得る力否かを調べるには、 例えば以下のような方法を用いるこ とができる。
まず、 アフリカミドリザル腎臓由来の COS- 7 (ATCC CRL1651) や繊維芽細胞 VA-
13 (理化学研究所細胞開発銀行） といった腫瘍抗原タンパク質を発現していない 細胞に対し、 候補となる DNAを有する発現プラスミ ドと、 MHCクラス I抗原 をコードする DNAを有する発現プラスミドとをダブルトランスフエクトする。 該トランスフエクトは、 例えばリボフェクトァミン試薬 (GIBCO BRL社製） を用 いたリポフエクチン法などにより行うことができる。 その後、 用いた MHCクラ ス I抗原に拘束性の腫瘍反応性の CTLを加えて作用させ、 該 CTLが反応して産生す る種々のサイトカイン （例えば IFN- γ) の量を、 例えば EL I S Α法などで測定 することによって、 候補 DN Aが腫瘍抗原としての活性を有するタンパク質をコ ードする DN Aであるか否かを調べることができる。 特定の MHCクラス I抗原 をコードする DNAを有する発現プラスミ ドは、 例えば、 既知の方法 （中尾ら著， Cancer Res. , 55:4248-4252(1995)) で調製することができる。
本発明の DN Αを用いる組換え DN Α技術により、 腫瘍抗原タンパク質を大量 に製造することが可能である。 本発明の DN Aを発現して腫瘍抗原タンパク質を 生産するには、 例えば、 前述の Molecular Cloning等の多くの成書や文献に基づ いて実施することができる。 通常、 発現させたい DNAの上流に、 場合によって は転写を制御するプロモーター配列 （例えば、 t r p、 l a c、 T7、 S V40 初期プロモーター） 等の制御遺伝子を付加し、 適当なベクタ一 （例えば p SV— S PORT 1など） に組み込むことにより、 宿主細胞内で複製し、 発現する発現 プラスミ ドを作製することができる。 次に発現プラスミ ドを適当な宿主細胞に導 入して形質転換体を得る。 宿主細胞としては、 大腸菌などの原核生物、 酵母のよ うな単細胞真核生物、 昆虫、 動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。 また、 宿主細胞への発現プラスミドの導入法としては、 リン酸カルシウム法、 D E A E—デキストラン法、 電気パルス法などの公知の方法を用いれば良い。 得ら れた形質転換体は、 常法により該形質転換体に適した培地で培養することによつ て目的とするタンパク質を生産する。 以上のようにして得られた腫瘍抗原タンパ ク質は、 一般的な生化学的方法によつて単離精製することができる。
また、 本発明の腫瘍抗原タンパク質をコードする D N Aを、 例えば G S T (グ ルタチオン S—トランスフェラーゼ） との融合タンパク質を発現させるプラスミ ドベクター （例えば p G E X— 5 X— 3、 フアルマシアバイオテク社製） に揷入 して得られる発現ベクターも使用することができ、 該発現べクタ一を、 例えば大 腸菌 D H 5 ひ等の宿主に導入して得られた形質転換体は、 本発明の腫瘍抗原タン パク質と G S Tとの融合タンパク質を産生することができる。 このような融合タ ンパク質は、 ダルタチオンセファロース等を用いて容易に精製することができる。 このようにして精製された融合タンパク質も、 上記の腫瘍抗原としての活性を有 し得るが、 酵素 Factor X等を用いて G S Tを分離し、 非融合型の腫瘍抗原タンパ ク質を得ることが望ましい。
このようにして得られる発現産物は、 本発明の D N Aによりコードされており、 それが発現することにより生産されるタンパク質であって、 細胞内分解により、 MH Cクラス I抗原と結合して C T Lにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生 じるという、 腫瘍抗原タンパク質としての特性を有する。
本発明は、 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる D NA又は配列番号： 1に 記載の塩基配列からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつ腫瘍抗原としての活性を有するタンパク質をコードする D N Aを有する発現 プラスミ ドをも提供するものである。
本発明はまた、 該発現プラスミ ドによって形質転換された形質転換体を提供す るものである。
さらに、 本発明は、 上記の本発明の D N Aが発現することにより生産さ X る 腫瘍抗原としての活性を有するタンパク質を提供するものである。 そのようなタンパク質の具体例として、 配列番号： 1に記載の塩基配列からな る D N Aを発現することによって得られるタンパク質が例示される。 該タンパク 質は、 還元条件下での S D S— P A G Eにより、 分子量約 4 3キロダルトンのバ ンドを示す。
1つの態様では、 本発明の腫瘍抗原タンパク質は、 配列番号： 2に記載のアミ ノ酸配列を含んでいる。 この配列番号： 2に記載のアミノ酸配列は、 配列番号： 1に記載の塩基配列の第 590位〜第 922位の部分にコ一ドされており、 少なくとも HLA- A26及び HLA-A24拘束性の腫瘍抗原べプチド部分を含んでレヽる。
既述のごとく、 配列番号： 1に記載の塩基配列は、 本発明者らが開示した国際 公開第 97/46676号パンフレツ卜に記載の腫瘍抗原タンパク質 S A R T— 1をコ一 ドする D NA (国際公開第 97/46676号パンフレッ トの配列番号： 2に記載） の、 第 1517位以降の配列に一致する。 また、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列は、 該 S A RT—1のァミノ酸配列 （国際公開第 97/46676号パンフレッ トの配列番 号： 1に記載） の第 690位以降の配列に相当しており、 本発明者らによって、 こ の第 690位以降の配列中には種々の fll0抗原べプチド部分の存することが明らか にされている （国際公開第 97/46676号パンフレッ ト参照） 。
以上のような本発明の腫瘍抗原タンパク質及び遺伝子 （D NA) は、 以下に詳 しく述べるように、 インビボ及びインビトロで腫瘍の治療、 予防、 診断など様々 な目的に有用である。 特に本発明の D N A及びその発現産物である腫瘍抗原タン パク質は、 発生頻度の高い扁平上皮癌等の抗腫瘍剤、 又は診断薬として広範に利 用可能である。 ちなみに扁平上皮癌はヒ トの癌で最も多く認められる癌の一つで あり、 特に食道癌や肺癌での扁平上皮癌は現在の化学療法や放射線療法に比較的 抵抗性を示すことが知られている。
従って本発明は、 本発明の D N A又は腫瘍抗原タンパク質を有効成分とする医 薬を提供するものである。
本発明の腫瘍抗原タンパク質を有効成分として含有する医薬は、 細胞性免疫が 効果的に成立するようにアジュバントとともに投与したり、 粒子状の剤型にして 投与することができる。 腫瘍抗原タンパク質を生体に投与すると、 抗原提示細胞 の MH Cクラス I抗原に腫瘍抗原ペプチドが高密度に提示され、 腫瘍特異的 C T Lが効率よく増殖し、 これにより腫瘍の治療又は予防が達成される。 アジュバン トとしては、 文献 (Clin. Microbiol. Rev. , 7:277-289, 1994)に記載のものなど が応用可能である。 また、 リボソーム製剤、 直径数/ i raのビーズに結合させた粒 子状の製剤、 リピッドを結合させた製剤など外因性の抗原ぺプチドを MH Cクラ ス I抗原へ効率良く抗原提示させうる剤形も考えられる。 投与方法としては、 皮 内投与、 皮下投与、 静脈注射などが考えられる。 また、 腫瘍抗原ペプチドを提示 した樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞や、 腫瘍抗原タンパク質をコ ードする D N Aを導入した細胞を投与する方法も考えられる。 製剤中の本発明の 腫瘍抗原タンパク質の投与量は、 治療すべき疾患、 患者の年齢、 体重等により適 宜調整することができるが、 通常 0. 0001mg〜1000mg、 好ましくは 0. 001mg〜 lOOOmgであり、 これを数日ないし数月に 1回投与するのが好ましい。
本発明の腫瘍抗原タンパク質をコ一ドする D N Aを有効成分として含有する医 薬を 患者に投与することで腫瘍を治療又は予防することができる。 本発明の D N Aを投与すると細胞内で腫瘍抗原タンパク質が高発現し、 生じた腫瘍抗原ぺ プチドが MH Cクラス I抗原と結合して、 細胞表面に高密度に提示される。 その 結果、 腫瘍特異的 C T Lが体内で効率的に増殖され腫瘍の治療又は予防が達成さ れる。 そのような目的で D NAを投与し細胞内に導入する方法は既知であり、 例 えばウィルスベクターによる方法及びその他の方法 （日経サイエンス， 1994年 4 月号， 20- 45頁、 月刊薬事， ^ (1)， 23-48 (1994)、 実験医学増刊， J (15)， (1994)、 及ぴこれらの引用文献等） があり、 それらのいずれの方法も本発明に適 用することができる。
ウィルスベクターによる方法としては、 例えばレトロウイルス、 アデノウィル ス、 アデノ関連ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシニアウィルス、 ボックスゥ ィルス、 ポリオウイルス、 シンビスウィルス等の D N Aウィルス又は R N Aウイ ルスに本発明の D NAを組み込んで導入する方法が挙げられる。 この中で、 レト ロウィルス、 アデノウイルス、 アデノ関連ウィルス、 ワクシニアウィルス等を用 いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、 発現プラスミ ドを直接筋肉内に投与する方法 （D NA ワクチン法） 、 リボソーム法、 リポフエクチン法、 マイクロインジェクション法、 リン酸カルシウム法、 エレクト口ポレーシヨン法等が挙げられ、 特に D N Aワク チン法、 リボソーム法が好ましい。
本発明の D N Aを実際に医薬として作用させるには、 D N Aを直接体内に導入 する in vivo法、 及びヒ トからある種の細胞を採集し体外で D N Aを該細胞に導 入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある （日経サイエンス， 1994年 4月号，
20 - 45頁、 月刊薬事， ^ (1) , 23-48 (1994)、 実験医学増刊， 1^ (15) , (1994)、 及 びこれらの引用文献等） 。 いずれの方法でも本発明の D N Aを適用できるが、 in vivo法がより好ましい。
in vivo法により投与する場合、 治療目的の疾患、 症状等に応じた適当な投与 経路で投与する。 例えば、 静脈、 動脈、 皮下、 皮内、 筋肉内等に投与することが できる。 in vivo法により投与する場合は、 例えば、 液剤等の製剤形態をとりう るが、 一般的には有効成分である本発明の D NAを含有する ¾†剤等とされ、 必 要に応じて、 慣用の担体を加えてもよい。 また、 本発明の D N Aを含有するリポ ソーム又は膜融合リボソーム （センダイウィルス （HV J ) —リボソーム等） に おいては、 懸濁剤、 凍結剤、 遠心分離濃縮凍結剤等のリボソーム製剤の形態とす ることができる。
製剤中の本発明の D N Aの含量は、 治療目的の疾患、 患者の年齢、 体重等によ り適宜調整することができるが、 通常、 0. 0001mg〜100mg、 好ましくは 0. 001mg〜 10mgの本発明の D N Aを、 数日ないし数月に 1回投与するのが好ましい。
以上のような本発明の D N A及びタンパク質は、 前述の医薬の他、 当該研究分 野における研究用試薬としても有用である。 さらに、 前記本発明のタンパク質は 腫瘍の診断薬の有効成分とすることもできる。 すなわち、 本発明の腫瘍抗原タン ノ ク質を必要に応じて標識し、 腫瘍が疑われる患者から得た試料 （血液、 腫瘍組 織など） 中の抗体 （腫瘍抗原タンパク質に対する抗体） の存在を検出することに より、 腫瘍の有無を診断することも可能である。 また、 本発明のタンパク質は、 後述の本発明の抗体を産生するための免疫原としても、 有用である。
本明細書において 「抗体」 とは、 本発明の腫瘍抗原タンパク質、 又はその一部 よりなる部分タンパク質に対する抗体を指す。 該抗体は、 例えば Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編， Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989年などに記載の方法により容易に作製される。 即ち、 本発明 の腫瘍抗原タンパク質又はその一部よりなる部分タンパク質を免疫原に用い、 常 法により適宜動物を免疫することにより、 本発明の抗体を容易に作製することが できる。 ここで免疫原としては、 本発明の腫瘍抗原タンパク質、 本発明の腫瘍抗 原タンパク質の一部よりなる部分タンパク質 （ペプチド断片も含む） 、 本発明の 月重瘍抗原タンパク質又はその一部よりなる部分タンパク質と G S T (グルタチォ ン S—トランスフェラーゼ） との融合タンパク質、 あるいは本発明の腫瘍抗原 タンパク質又はその一部よりなる部分タンパク質と Mycタグとの融合タンパク質 などが挙げられる。 ここで部分タンパク質の長さとしては、 ェピトープを構成し 得る最小の長さという観点から、 少なくとも 8アミノ酸以上の長さのものが挙げ られる。
また、 本発明の腫瘍抗原タンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、 既知の 方法によって作製することができる。 最初コーラ一及びマイルシュタイン [K ohler and Mi lstein, Eur. J . I mmunol. 6， 5 1 1 ( 1 9 7 6 ) ] カ示したノヽ ィプリ ド一マの技術は多くの特異抗原に対するモノクローナル抗体の製造に応用 されており、 例えば、 分子生物^究のためのタンパク実験法 第 4章 羊土社 (1994)等の文献記載の手法に従って、 当業者が実施可能である。
宿主動物の免疫方法又はそれから得た抗体産生細胞培養の方法及びスケジュ一 ルは、 従来の確立された抗原刺激及び生産技術に従う。
得られた抗体は、 既知技術、 例えばィムノアフイエティクロマトグラフィー、
H P L C (高速液体クロマトグラフィー） 等によって精製することができる。 以上のようにして得られた抗体をもとに、 種々の抗体フラグメントを作製する ことも可能である。 該抗体フラグメントとは、 例えば抗体のペプシン消化によつ て生成され得る F (al)' )2フラグメント、 F(ab' ) 2フラグメントのジスルフィ ド結 合を還元することによって生成され得る Fab'フラグメント、 及び抗体をパパイン 及び還元剤で処理することによつて生成され得る 2Fab又は Fabフラグメント等が 挙げられ、 これらのフラグメントも本発明の範疇に含まれる。
さらに、 これらの抗体又は抗体フラグメントをもとに、 種々の誘導体を作製す ることも可能である。 ここで誘導体とは、 例えばキメラ抗体、 擬人化抗体が挙げ られ、 該抗体は、 例えば特開昭 61- 47500、 Nature, 321, 522 (1986)等に記載の方法 に準じて作製することができる。 また、 前記抗体又は抗体フラグメントを酵素等 で標識したものも、 当該誘導体の範疇に含まれる。 具体的な酵素標識法としては、 例えばダルタルアルデヒド法、 過ョーソ法、 マレイミド法、 及びピリジル.ジス ルフィド法が挙げられる。 標識に用いられる酵素としては、 例えばゥシ小腸 ·ァ ルカリフォスファターゼ、 西洋ヮサビ'ペルォキシダーゼなどが挙げられる。 こ れらの標識抗体は、 例えば、 酵素免疫測定法、 医学書院 (1978) 等の基本書に従 レ、、 当業者ならば容易に作製することができる。 さらに、 放射性同位元素（ラジ オアイソトープ)により標識することもできる。
以上のような本発明の抗体、 抗体フラグメント、 又はこれらの誘導体 (以下、 抗体等という） は、 以下に述べるような腫瘍の診断薬として利用することができ る。 .
後述の実施例 4に示すように、 本発明の抗体を用い、 種々の細胞株及び組織に 対するウェスタンブロット解析を行ったところ、 精巣及び胎児肝を除く全ての正 常組織、 あるいはメラノーマ、 白血病では発現が認められなかったが、 検討した 頭頸部扁平上皮癌の全例、 食道扁平上皮癌の 6 0 %、 肺扁平上皮癌の 5 0 %、 及 び肺腺癌の 5 0 %もの症例において本発明の新規な腫瘍抗原タンパク質の発現が 認められた。 さらに、 前記ウェスタンプロット解析で陽性を示した癌細胞 （本発 明の ffi^抗原タンパク質の発現している細胞） は、 実際に重瘍特異的な C T Lに より認、識され傷害を受けることも明らかとなった。
このように本発明の腫瘍抗原タンパク質は、 精巣及び胎児肝を除く正常組織、 あるいはメラノーマ、 白血病では発現が検出されず、 種々の扁平上皮癌あるいは 腺癌において特異的かつ高頻度に発現していた。 従って本発明の腫瘍抗原タンパ ク質に対する抗体等は、 これらの癌患者の診断に幅広く利用できるものと考えら れる。 また、 このような抗体等を用いて本発明の腫瘍抗原タンパク質を検出する ことにより、 腫瘍の早期発見、 再発、 転移の発見が可能となり、 また本発明の腫 瘍抗原タンパク質、 腫瘍抗原ぺプチド又はそれらをコードする D N Aを用いた医 薬の適応可能な腫瘍患者を効率的に選択することができる。 その結果、 腫瘍の治 療及び予防に大いに役立つことが期待される。 従って、 本発明は、 本発明の腫瘍抗原タンパク質、 又はその一部よりなる部分 タンパク質に対する抗体、 抗体フラグメント、 又はこれらの誘導体を提供するも のである。
本発明はまたこれらの抗体、 抗体フラグメント、 又はこれらの誘導体のいずれ かを有効成分として含有する腫瘍の治療又は診断のための組成物を提供するもの である。
さらに本発明は本発明の抗体、 抗体フラグメント又はそれらの誘導体を用いて 腫瘍を診断する方法をも提供する。
本発明の抗体等を、 例えばゥシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液 (pH7. 0) 等 の適当な緩衝液中に存在させることにより、 fl重瘍の診断薬の有効成分とすること ができる。 本発明の診断薬を用いて免疫学的診断を行う方法としては、 例えば、 腫瘍 標本から腫瘍抗原タンパク質を検出する方法、 血中又は組織中の腫瘍抗 原タンパク質の存在を検出する方法などが挙げられる。 具体的な検出方法として は、 後述の実施例 4に記載のウェスタンプロット解析の他、 免疫組織化学法、 ィ ムノブ口ット法、 放射免疫測定法 （R I A) 、 酵素免疫測定法 （E L I S A) 、 蛍光あるいは発光測定法などが挙げられる。 これらの測定法の詳細については、 例えば、 酵素免疫測定法、 医学書院 (1978) 等の基本書を参考にされたい。 本発明の診断薬は、 測定方法に応じて、 例えば酵素標識抗体、 発色剤、 発色補 助剤、 停止液、 標準品等をも含有するキットの形態において使用することが可能 である。
本発明の抗体等を治療に用いる場合には、 例えば、 本発明の腫瘍抗原タンパク 質に対して特異的なモノクローナル抗体を投与する力、 又は該モノクロ一ナル抗 体に制癌剤や毒素を結合させたものを癌患者に投与して、 該腫瘍抗原タンパク質 を発現している腫瘍細胞を死滅させる方法がある。
さらに、 本発明の抗体等の他の用途としては、 アブイ二ティ一クロマトグラフ ィー、 c D NAライブラリーのスクリーニング等が挙げられる。
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に よりなんら限定されるものではない。
参考例 1 食道癌細胞株に対する細胞傷害性 T細胞 （C T L ) 株の榭立 中尾ら著， Cancer Res., K:4248- 4252 (1995)の記載に従い、 組織型が扁平上 皮癌に分類される食道癌細胞株 ΚΕ-4に対する C T Lを患者の末梢血単核球細胞か ら樹立し、 ΚΕ - 4CTLと命名して実験に使用した。 食道癌細胞株 ΚΕ-4及ひ KE- 4CTLは、 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号、 工業技術院生命工学工業技術研究所に、 それ ぞれ受託番号 FERM BP— 5955及び FERM BP— 5954で寄託され ている （寄託日 ：いずれも平成 9年 5月 23日） 。 また、 前述の中尾らの報告に 従い、 E - 4の HLAクラス I分子のタイピングを行い、 HLA - A2402、 _A2601、 - B54、 -B60、 - Cwl、 ~Cw3であることを確認した。
参考例 2 HLA-A2601 cDNAの調製
前記 KE - 4から、 中尾ら著， Cancer Res. , : 4248-4252 (1995)の記載に従い、
HLA-A2601 の c D N Aを発現べクタ一 pCR3 (INVITR0GEN社製）に組み込んだ組換え プラスミ ドを作製した。
参考例 3 KE- 4由来 c DNAライブラリーの作製
KE - 4から mRNA精製システム （フアルマシアバイオテク ） を用い添付の プロトコ一ルに従い、 全 RNA画分の分離及び oligo(dT)カラムによる poly(A) + mRNAの調製を行った。 mRNAよりスーパ一スクリプトプラスミ ド システム（GIBCO BRL社製）を用い添付のプロトコールに従い、 両端に Notlァダプ ターと Sailアダプタ一を連結した c DNAを作製した後、 この c DNAを発現べ クタ一のプラスミ ド pSV- SPORT GIBCO BRL社製）の制限酵素 Notl及び Sal Iの切断 部位にライゲーシヨンにより連結して組換えプラスミドを得た。 この組換えブラ スミ ドをジーンパルサー (Bio- Rad社製）を用いて 25/zF, 2.5k Vの条件で、 電気 パルスにより大腸菌のエレク トロマックス DH10B/p3TMセル (GIBCO BRLth )に 導入し、 アンピシリン （50//g/ml)を含む LB培地（1%バク トトリプトン、 0.5%ィ 一ストエキス、 0.5%NaCl、 pH7.3)で組換プラスミ ドが導入されている形質転換 体を選択した。
参考例 4 インタ一フエロン一 の定量
インターフェロン一 γ (IFN- y)の定量は、 ェンザィムィムノアッセィ
(ELISA) により行った。 96ウェルマイク口プレートに固層化抗体として抗ヒト IFN- γマウスモノクローナル抗体を吸着させ、 ゥシ血清アルブミンで非特異的結 合をプロックした後、 検体中の IFN - γを抗体に結合させた。 次に検出抗体として 抗ヒ ト IFN-vゥサギポリクロ一ナル抗体を結合させ、 さらにアルカリフォスファ ターゼ標識した抗ゥサギィムノグロブリンャギ抗体を結合した後、 発色基質とし てパラニトロフエニルフォスフェートを反応させ、 IN NaOHを等 えて反応を 停止させた後、 吸光度 (405nm)を測定した。 これをスタンダードの IFN- γで得ら れた値と比較することにより定量した。
実施例 1 新規な腫瘍抗原タンパク質遺伝子のスクリーニング
参考例 3に示した形質転換体の約 100個のプールからの組換えプラスミド D N Aの回収は以下のように行った。 すなわち、 アンピシリン （50 μ g/ml)を含む LB 培地の入った 96ゥエル U底マイクロプレートにゥエルあたり 100個の形質転換体 を加え培養後、 その一部をゥヱル当たり 0. 25mlの TYGPN培地（F. M. Ausubelら編、 CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. )の入った 別の 96ゥエル U底マイクロプレートに移して 37°Cで 48時間培養し、 残りの LB培地 のマイクロプレートは凍結保存した。 TYGPN培地で培養した形質転換体の組換え プラスミ ド D N Aは、 マイクロプレートでアルカリ溶解法 (F. M. Ausubelら編、
CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. )により調 製した。 イソプロパノ一ル沈澱で回収した組換えプラスミ ド D NAは、 50 μ 1の 20ng/ml RNaseを含む 10m Tris, ImM EDTA, pH7. 4溶液で懸濁した。
線維芽細胞株の VA- 13細胞 (理化学研究所細胞開発銀行、 Ann. Med. Exp. Biol. Fenn. , 44： 242-254, 1966)へ、 リポフエクチン法により以下のように KE- 4 c D N
Aの組換えプラスミドと HLA- A2601 c D NAの組換えプラスミ ドをダブルトラン スフェクトした。 すなわち、 VA- 13細胞を 96ゥエル平底マイクロプレートにゥェ ル当たり 7000個を加えて、 100 // 1の 10% FCSを含む RPMI 1 6 4 0培養液で 2日間 培養した。 リポフエクチン試薬 (GIBCO BRL社製）を用い、 形質転換体約 100個分 の KE- 4 c D NAの組換えプラスミ ド 25 / 1と参考例 2に示した HLA- A2601 c D N
Aの組換えプラスミド 10 / 1 (200ng)と約 35倍に希釈したリポフエクチン試薬 35 μ 1の混合液 70 /z lの 30 μ 1 を VA-13細胞に加えてダブルトランスフエタトした。 ト ランスフエクタントは 2点ずつ用意した。 5時間後、 このトランスフエクタントに 200 μ 1の 10% FCSを含む培養液を加え、 更に 72時間、 37°Cで培養した後、 培養液 を除去し、 ゥエル当たり 10000個の KE- 4CTLを加えて ΙΟΟ μ 1の 10%FCSと 25U/mlの IL - 2を含む培養液で 37°Cで 24時間培養した。 培養液を回収し、 IFN- γ量を ELISA で測定した。
高レ、 IFN-γ産生が認められた 4群にっレ、ては、 該当する凍結保存してあつた KE- 4 c D N Aの組み換えプラスミ ドによる形質転換体約 100個のプ一ルを用いて さらに以下のようにスクリーニングを行った。 すなわち、 形質転換体のプールを アンピシリン（50 / g/ml)を含む LB寒天培地のプレートにまいてコロニーを得て、 各群 200コ口ニー、 合計 800コ口ニーにっレ、てゥエル当たりの形質転換体が 1種類 となる条件で上記と同様の方法で培養し、 KE - 4 c D NAの組換えプラスミド D N Aを調製した。 さらに上記と同様な方法で VA- 13細胞への KE-4 c D NAの組換え プラスミ ドと HLA- A2601 c D NAの組換えプラスミ ドのダブルトランスフエクト を行い、 弓 Iき続いて KE- 4CTLとの混合培養を行い、 KE- 4CTLが反応して産生した培 養液中の IFN- γの定量を行って陽性のプラスミ ドを選択した。 この操作により ΚΕ - 4 c D NA組換えプラスミ ドクローンが選択された。 該プラスミ ドクローンに ついてはさらにもう一度、 同様な操作を繰り返して、 KE-4C T L細胞による IFN - Ύの産生量を参考例 4の方法により定量した。 その結果を図 1に示す。 比較のた めに異なったタイプの HLA (HLA-A0201) をコードする cDNAを用いて同様に実験し た。 図中、 顬及び口はそれぞれ HLA- A2601 c D N A及ぴ HLA- A0201 c D N Aを用 いた結果を示す。 横軸は、 前記プラスミ ドクローンの量 （ng/well) を、 また縦 軸は、 KE4— CTLが産生した IFN-γ量 （pg/ml) を示す。 図 1より、 このプラスミ ドクローンの VA- 13細胞へのトランスフエクシヨンにより KE- 4CTLからの IFN- yの 産生が誘導されること、 すなわち該プラスミドクローンは腫瘍抗原タンパク質を コードする遺伝子であることが明らかとなった。
実施例 2 新規な腫瘍抗原タンパク質遺伝子の塩基配列決定
実施例 1で選択された腫瘍抗原タンパク質遺伝子の c D N Aが組み込まれた組 換えプラスミドを持つ形質転換体は、 500 mlのアンピシリン （50 / g/ml) を含む LB培地で 37°Cで 14〜16時間培養し、 遠心分離にて菌体を回収した。 菌体から PLASMID MAXI キット（QIAGEN社製） に従い、 組換えプラスミ ドを回収した。 c D N Aは、 SP6 RNA ポリメラーゼプロモーター配列と T7 RNAポリメラーゼプロモ —ター配列に挟まれた部位に組み込まれている。 そこで文献 (DNA 4:165， 1985)に 記載の SP6 プロモータープライマ一及び T7プロモータープライマーを合成した。 次に SP6プロモータープライマー又は T7プロモータープライマーを Fluore - dATP Labeling ix( フアルマシアバイオテク社製） 及び AutoRead Sequencing Kit (フアルマシアバイオテク社製） と組み合わせてジデォキシシークェンシン グ反応を行い、 蛍光 DN Aシーケンサー （フアルマシアバイオテク卞±|¾) を使用 して、 両端から cDN Aの塩基配列を決定した。 決定した塩基配列 (1011 b P ) を配列番号： 1に示す。 なお、 該配列番号： 1に記載の塩基配列は、 国際公 開第 97/46676号パンフレツトに記載の腫瘍抗原タンパク質 S ART— 1をコード する DNA (国際公開第 97746676号パンフレットの配列番号： 2に記载） の、 第 1517位以降の配列に一致するものである。
実施例 3 新規な腫瘍抗原タンパク質に対する抗体の作製
実施例 2で得られた新規な腫瘍抗原タンパク質遺伝子の c D N Aが組み込まれ た組換えプラスミドを、 2種類のプライマー、 s f — 1 ： 5， 一 TGGGAAT TCGATGAGGATCCCGAGC— 3 ' 、 s r - 1 ： 5 ' 一 TACGGG
CGGCCGCTGTCACTTGGT— 3， を用いて P C R法で増幅した。 こ の増幅断片は、 配列番号： 1に記載の塩基配列の第 146位〜第 930位の部分 配列を有している。
この増幅断片を制限酵素 E c o R I及び N o t Iで切断し、 グルタチオン S— トランスフェラ一ゼ （GST) との融合タンパク質を発現させるプラスミドべク ター pGEX— 5X— 3 (フアルマシアバイオテク社） の E c oR I及び No t I部位に連結して、 組換えプラスミドを得た。 該組換えプラスミドを大腸菌 DH 5ひに導入し、 形質転換体を選択した。 該形質転換体を大量培養し、 タンパク分 解酵素阻害剤である PMS F及びァプロチュンの存在下で、 超音波により、 菌体 を破壊して本発明の腫瘍抗原タンパク質と G S Tとの融合タンパク質を抽出した。 その後、 グルタチオンセファロ一ス 4 B (フアルマシアバイオテク社） を用いた アブイ二ティー精製及び Superrosel2 (フアルマシアバイオテク社） を用いたゲ ル濾過精製により、 該融合タンパク質を単離した。 単離した融合タンパク質を抗 原に用いて、 常法によりゥサギを免疫し、 抗血清を得た。 実施例 4 ウェスタンプロット解析
実施例 3で得られた抗血清を用いたウェスタンブロットにより、 本発明の腫瘍 抗原タンパク質の細胞株及び組織での発現を調べた。
まず、 種々の細胞株及び組織を 0 . 2 mM PM S F、 0. 03 TIU/mlァプロチニ ンを含む lOmM Tris-HCl, pH7. 4， 150mM NaCl, 0. 5% Triton X- 100に溶解し、 超音 波処理した後、 14, 000 rpmで 20分間遠心した。 上清を SDS-PAGE法にて電気泳動を した後、 Hybond- PVDFメンブレン （アマシャム社） に転写し、 適当量の実施例 3 で得られた抗血清とともに室温で 4時間ィンキュペートした。 その他のゥエスタ ンブロットの方法は、 七條ら著、 Journal of Immunological Methods, 186: 137 (1995)に記載の方法に従った。
結果を図 2に示す。 実施例 3で得られた抗血清は免疫に用いた 7 0 k Dの融合 タンパク質を認識し、 酵素 FactorXにより融合タンパク質を G S Tと腫瘍抗原タ ンパク質に切断した場合、 2 7 K Dの G S Tとともに 4 3 K Dの腫瘍抗原タンパ ク質を認識した （図 2 A) 。 各種細胞、 での腫瘍抗原タンパク質の発現を調 ベた結果、 細胞では、 健常人末梢血単核球 ( P BMC) 5例、 白血病細胞株 1 6 例及びメラノ一マ細胞株 2例の全例で発現が検出されなかつたが、 頭頸部扁平上 皮癌細胞株 5例中 3例、 食道扁平上皮癌細胞株 6例中 4例、 肺扁平上皮癌細胞株 3例中全例、 肺腺癌細胞株 6例中 3例で発現が認められた。 また正常組織では、 胎児肝臓 1例及び精巣 3例の全例で発現が認められたが、 新生児肝臓 1例、 成人 肝臓 1例、 子宮 2例、 食道 4例及び膝臓 1例の全例で発現が検出されなかった。 また癌組織では、 白血病 1 0例及びメラノ一マ 1 0例の全例で発現が検出されな かったが、 頭頸部扁平上皮癌 7例中全例、 食道扁平上皮癌 3 0例中 1 8例、 肺扁 平上皮癌 1 7例中 8例、 肺腺癌 3 5例中 1 6例で発現が認められた。 これらの結 果の一例を図 2 ( B ) に示す。 以上のように、 本発明の新規な腫瘍抗原タンパク 質は、 種々の扁平上皮癌あるいは腺癌において特異的かつ高頻度で発現していた ことから、 本発明の新規腫瘍抗原タンパク質に対する抗体は、 これらの癌細胞及 び癌患者の診断に応用できるものと考えられる。
実施例 5 各種癌細胞における腫瘍抗原タンパク質の発現、 及び C T Lによる細 胞傷害活性の測定 国際公開第 97/46676号パンフレツトの配列番号： 2に記載の塩基配列を有す る組換えプラスミド （K 3 ) (FERM BP-5951) を E c o R I及び N o t I処理し て得られた D N A断片を、 グルタチオン S—トランスフェラーゼ （G S T) との 融合タンパク質を発現させるプラスミ ドベクター p G E X—4 T—2 (フアルマ シァバイオテク社） の E c oR I及び No t I部位に連結して、 組換えプラスミ ド を得た。該プラスミドより、 実施例 3と同様な方法により G S Tとの融合タンパ ク質及びそれに対する抗血清を作製した。 この抗血清は、 国際公開第 97/46676号 パンフレットに記載の腫瘍抗原タンパク質 （分子量約 125キロダルトン） を認識 するものである。 この分子量約 125キロダルトンのタンパク質に対する抗血清と、 実施例 3で得られた分子量約 43キ口ダルトンの本発明の腫瘍抗原タンパク質に対 する抗血清とを用いて、 実施例 4に記載した方法に従いウェスタンブロットを行 い、 各種 H L A— A 2 4陽性癌細胞株での発現を調べた。 他方、 KE- 4CTLの各種 癌細胞に対する細胞傷害性を、 D. D. Kharkevitchら著、 Int. J. Cancer,
: 317 (1994)に記載の方法に従って測定した。 その際、 51Crで標識した癌細胞 104 個の標的細胞に対し、 KE - 4CTL 2 X 105個を作用させた。 これらの結果を以下の表 1に示す。 細胞株 由来 43kDタンパク質発現 125kDタンパク質発現 細胞傷害性（％)
KE-4 食道癌 + + 27
KE-3 食道癌 + + 32
TE-8 食道癌 + + 23
TE-11 食道癌 + + 31
PC9 肺癌 + + 39
11-18 肺癌 + + 27
SKG-1 子宮癌 + + 25
TE-10 食道癌 + 38
LU65A 肺癌 + 6
RERF-LC-AI肺癌 + 3
LK79 一肺癌 + 3 * ウェスタンブロットによりバンドが認められた場合を十、 認められなかった 場合を一と表した。
表 1に示すように、 125kDのタンパク質は、 検討した癌細胞の全てに発現が認 められた。 それらの細胞株のうち、 43kDのタンパク質が発現している癌細胞株に 対しては、 KE-4CTLが傷害活性を示しているが、 該 43kDのタンパク質が発現して いない癌細胞株については、 TE- 10の場合を除いて KE- 4CTLが傷害活性を示さなか つた。 これらの結果より、 43 k Dタンパク質由来の抗原ペプチドは、 125kDタンパ ク質由来の抗原ぺプチドよりも、 より効率的に抗原提示され CTLに認識される傾 向にあることが考えられ、 43 k Dタンパク質に対する抗体は、 本発明の腫瘍抗原 タンパク質、 その腫瘍抗原ペプチド、 又は腫瘍抗原タンパク質をコードする D N Aによる治療効果の期待できる癌患者の診断に、 より有用であると考えられた。 産業上の有用性
本発明の種々の扁平上皮癌あるいは腺癌で高頻度に発現している新規な腫瘍抗 原タンパク質及びその遺伝子、 並びに該新規な腫瘍抗原タンパク質に対する抗体 は、 広範な JH瘍の予防、 治療又は診断に有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下の （a) 又は （b) の DNA：
(a) 配列番号： 1に記載の塩基配列で示される DN A；又は
( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列で示される D N Aとストリンジェントな条 件下でハイブリダィズし、 かつ腫瘍抗原としての活性を有するタンパク質をコー ドする DNA。
2. 請求項 1記載の DNAを有する発現プラスミド。
3. 請求項 2記載の発現ブラスミドによつて形質転換された形質転換体。
4. 請求項 1記載の DNAが発現することにより生産される腫瘍抗原タンパク質。
5. SDS— PAGE (還元条件下） による分子量測定で約 43キロダルトンの バンドを示す、 請求項 4記載の腫瘍抗原タンパク質。
6. 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列を含む、 請求項 4又は 5記載の腫瘍抗原
7. 請求項 1記載の D N A又は請求項 4〜 6レ、ずれか記載のタンパク質を有効成 分として含有する医薬。
8. 請求項 1記載の D N A又は請求項 4〜 6レ、ずれか記載のタンパク質を有効成 分として含有する fi¾の診断薬。
9. 請求項 4〜 6いずれか記載の腫瘍抗原タンパク質、 又はその一部よりなる部 分タンパク質、 に対する抗体、 抗体フラグメント、 又はこれらの誘導体。
10. 請求項 9記載の抗体、 抗体フラグメント、 又はこれらの誘導体のいずれか を有効成分として含有する) Jffilの診断薬。
1 1. 請求項 4〜 6いずれか記載の腫瘍抗原タンパク質、 又はその一部よりなる 部分タンパク質、 に対する抗体、 抗体フラグメント、 又はこれらの誘導体のいず れかを用いることを特徴とする腫瘍の診断方法。
12. 請求項 1記載の DN Aを有する発現プラスミ ドで宿主細胞を形質転換し、 得られた形質転換体を該 DN Aの発現に適した条件下で培養し、 得られた培養物 中の JB«抗原としての活性を有する発現産物を抗原として用いることにより得る ことができる抗体、 又は該腫瘍抗原としての活性を有するタンパク質を認識しう るそのフラグメント又はそれらの誘導体。
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