KR20060090714A - Ｎｅｍｏ 올리고머화를 차단하기 위한 펩티드에 의한ｎｆ―ｋａｐｐａｂ 활성의 선택적 억제 - Google Patents

Ｎｅｍｏ 올리고머화를 차단하기 위한 펩티드에 의한ｎｆ―ｋａｐｐａｂ 활성의 선택적 억제 Download PDF

Info

Publication number
KR20060090714A
KR20060090714A KR1020067007920A KR20067007920A KR20060090714A KR 20060090714 A KR20060090714 A KR 20060090714A KR 1020067007920 A KR1020067007920 A KR 1020067007920A KR 20067007920 A KR20067007920 A KR 20067007920A KR 20060090714 A KR20060090714 A KR 20060090714A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
polypeptide
glu
nemo
gln
Prior art date
Application number
KR1020067007920A
Other languages
English (en)
Inventor
파브리스 아구
질 꾸르뚜와
알렝 이스라엘
미쉘 베롱
프랑수와 트렝꺄르
쇼지 야마오카
프랑수와즈 발뢰
이브-마리 꼬익
Original Assignee
앵스띠뛰 파스퇴르
상뜨로 나쇼날 드 라 러쉐르쉐 샹띠피크
인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 앵스띠뛰 파스퇴르, 상뜨로 나쇼날 드 라 러쉐르쉐 샹띠피크, 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) filed Critical 앵스띠뛰 파스퇴르
Publication of KR20060090714A publication Critical patent/KR20060090714A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 NF-kB 신호 전달 경로를 억제하는 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 필요로 하는 대상에 그 폴리펩티드를 투여함으로써 감염성 반응, 종양 형성, 바이러스 감염의 조절 및/또는 치료; 세포 증식 및 아포토시스(apoptosis)의 조절; 및 항원성 자극에서 B 또는 T 림프구의 조절 방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 NEMO의 올리고머화(oligomerization)를 조절하는 폴리펩티드의 확인 방법을 제공한다.

Description

ＮＥＭＯ 올리고머화를 차단하기 위한 펩티드에 의한 ＮＦ―ＫＡＰＰＡＢ 활성의 선택적 억제{SELECTIVE INHIBITION OF NF-KAPPAB ACTIVATION BY PEPTIDES DESIGNED TO DISRUPT NEMO OLIGOMERIZATION}
본 발명은 NF-kB 신호 전달 경로를 억제하는 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 필요로 하는 대상에 그 폴리펩티드를 투여함으로써 감염성 반응, 종양 형성, 바이러스 감염의 조절 및/또는 치료; 세포 증식 Ａ및 아포토시스(apoptosis)의 조절; 및 항원성 자극에서 B 또는 T 림프구의 조절 방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 NEMO의 올리고머화(oligomerization)를 조절하는 폴리펩티드의 확인 방법을 제공한다.
핵인자(Nuclear factor)-kB(NF-kB) 신호 전달은 감염성 반응, 종양 형성, 바이러스 감염, 세포 증식 및 아포토시스의 조절, 및 항원성 자극에서의 B 또는 T 림프구의 조절에 관계된 필수적인 신호 전달 경로이다(Ghosh, 1998, Annu, Rev. Immunol.; Karin, 1999, J.Biol. Chem.; Israel, 2000, Trends Cell Biol.; Santoro, 2003, EMBO J.). 포유류 세포에는 이량체화 하는 RelA, RelB, c-Rel, NF-kB2/p100/p52 및 NF-kB1/p105/p50의 다섯 개의 NF-kB 패밀리 구성원들이 있다. 우세한 형태가 p50 및 RelA 서브 유닛으로 구성된 이종 이량체 전사 인자인 NF-kB는 IkB로 알려진 억제 단백질과 연관되어 세포질에 억류된 상태로 존재한다. 시토카인 TNF-α 및 인터루킨-1에 의해 자극되자 마자, 내독소(LPS), 미생물 및 바이러스 감염, 염증 전구 신호(pro-inflammatory signal)는 두 개의 키나아제 서브 유닛, 즉 IKKα/IKK-1 및 IKKβ/IKK-2와 구조/조절 서브 유닛 NEMO/IKK-γ로 구성된 단백질 복합체인 정준(canonical) IkB 키나아제 복합체(IKK)에 수렴한다. 일단 활성화된 IKK 복합체는 IkB 단백질을 인산화시키고, 프로테오솜에 의한 유비퀴틴화 및 연속적인 분해를 유발한다. 그러면 자유로워진 NF-kB는 유전자 발현을 시작시키거나 상향 조절하기 위하여 핵으로 이동할 수 있다. 비록 IKKα 및 IKKβ가 현저한 구조적인 유사성(52%)을 나타내지만, 상세한 유전적 연구로부터 IKKα 및 IKKβ가 NF-kB의 활성을 위한 두 가지 경로에 관여한다는 것이 밝혀졌다(Pomerantz, 2002, Mol Cell). IKKβ는 고전적인 NF-kB 복합체의 활성에 책임이 있는 염증 전구 키나아제인 반면, NF-kB 유도 키나아제(NIK)와 연관된 IKKα는 비정준 NF-kB 신호 전달 경로에서 필수적인 역할을 한다(Senftleben, 2001, Science). 또한, IKKα는 각질형성세포 분화에서 역할을 하지만 이 과정은 그 키나아제 활성과는 관계없다(Hu, 2001, Nature).
NEMO 단백질(NF-kB 필수 조절체(NF-kB essential modulator))은 NF-kB 경로 활성에 중요한 역할을 한다. NEMO 단백질은 IKKα 및 IKKβ 단백질 키나아제와 연 관되어 IKK 복합체로 불리는 고분자량 복합체가 된다. IKK 키나아제는 알려지지 않은 메카니즘에 의한 인산화 반응으로 활성화되는데, 이는 NEMO 올리고머화(oligomerization)의 결과로 믿어진다(Agou 외, 2004, J. Biol. Chem.). NEMO 단백질의 존재는 NEMO-결핍 세포들이 많은 자극에 반응하여 NF-kB를 활성화 시킬 수 없기 때문에 IKK 활성의 기초가 된다. NEMO는 큰 꼬인 코일(coiled-coil:CC1)을 포함하는 N-말단에 IKK-결합 도메인으로 구성된다. C-말단 도메인은 단백질의 조절부로서 역할을 하고, 많은 상위 신호 분자 또는 바이러스 단백질을 연결하는 결합 주형으로서 종종 보고된다(Ghosh, 1998, Annu, Rev. Immunol.; Santoro, 2003, EMBO J.). 흥미롭게도, IP 및 EDA-ID 병리에 책임이 있는 돌연변이는 주로 분자의 이러한 부분에서 발견되었다(Doffinger, 2001, Nature Gen.; Zonana, 2000, Am.J.Hum.Genet.). C-말단 도메인은 두 개의 연속적인 꼬인 코일 모티프, 즉 CC2(246-286 잔기) 및 LZ(390-412 잔기)(Tegethoff, 2003, Mol. Cell Biol.; Agou 외., 2004, J.Biol.Chem.)와 C-말단 끝의 아연 손가락 모티프(zinc finger motif)를 포함하는 최소 올리고머화 도메인로 구성된다.
염증 전구 자극에 반응하여 IKK의 활성을 유도하는 생화학적 메카니즘은 불명확하다. 활성 T-루프에서 두 세린 잔기의 인산화 반응이 IKKβ의 활성을 유발하는 것으로 기술되었다. 그러나, 이러한 인산화 반응을 유발하는 메카니즘은 여전히 알려지지 않았다. 가능성 있는 하나의 메카니즘은 NEMO 올리고머화에 의해 유발된 키나아제의 형태 변화이다(Agou 외., 2004, J.Biol.Chem.). 올리고머 상태의 이러한 변화는 트랜스-자가인산화(trans-auto-phosphorylation) 메카니즘에 의한 T-루 프 활성을 유도할 수 있다(Zandi, 1997, Cell; Tang, 2003, J.Biol.Chem.). IKK 활성에서 NEMO 올리고머화의 역할과 일관되게, 최소 올리고머화 도메인에서 돌연변이는 많은 자극에 반응하여 NEMO-결핍 세포 활성에서 유전적 상보성에 의한 NF-kB 구조에 실패하였다. 또한, NEMO의 강제적인 올리고머화는 IKK 복합체의 완전한 활성을 유발하였다(Inohara, 2000, J. Biol. Chem.; Poyet, 2000, J.Biol.Chem.; Poyet, 2001, J.Biol.Chem.) 최근에, TNF-α에 반응하여 NEMO 인산화 및 유비퀴틴화(ubiquitination)가 보고되었다(Carter, 2001, J.Biol. Chem.;Trompouky, 2003, Nature; Kovalenko, 2003, Nature). 그러나, 이러한 NEMO 변형은 여러 염증 전구 자극에 반응하여 IKK 복합체를 활성화시키는 결정적인 단계로서 아직 증명되지 않았다.
NF-kB 활성의 억제는 새로운 항염증 및 항암제의 개발을 위한 특별한 목표를 구성한다(May, 2000, Science; Poulaki, 2002, Am J Pathol.). NF-kB 신호 전달 경로의 많은 단백질 중에서, IKK 복합체는 새로운 특정 NF-kB 억제제의 발견을 위한 가장 가능성 있는 분자 목표 중 하나이다. 생체 내에서 가능성 있는 독성 효과를 최소화하기 위하여, 치료 성공 여부는 NF-kB 활성의 기본적 수준을 조절함이 없이 활성 신호를 차단하는 NF-kB 억제제의 능력에 상당히 좌우될 것이다. May 등은 구조 NEMO와 IKK 키나아제의 상호 작용을 단절시킴으로써 특정적으로 염증 전구 NF-kB 활성을 차단하는 세포를 투과할 수 있는 펩티드 억제제를 기술하였다(May, 2000, Science; May, 2002, J.Biol.Chem.). 단백질의 기능을 변경하는 펩티드의 합리적인 구조에 의해 단백질-단백질 상호 작용을 조절하는 것은 특히 유연하고 역동 적인 결합 특성을 나타내는 신호 전달 단백질로(Pawson, 2003, Science), 새로운 부류의 치료제의 개발 및 기본적인 연구 모두를 위한 중요한 수단을 제공한다(Souroujon, 1998, Nat Biotechnol.). 펩티드들이 위치 선정(전위)(Lin, 1995, J.Biol.Chem.), 수용체에 점증(Chang, 2000, J.Biol.Chem.), 분자내 상호작용(Souroujon, 1998, Nat Biotechnol.) 및 올리고머화(Judice, 1997, P.N.A.S.)를 방해함으로써 단백질의 기능을 조절하는 펩티드 조절자에 대한 많은 연구가 문헌에 기록되어 있다. 최근에, 여러 펩티드로 HIV-1 gp41 혼합 단백질을 억제하는 것은 이러한 개념에 대한 명백한 증거를 제공한다(Chan, 1998, Cell and Eckert, 2001, Ann. Rev. Biochem. 참조).
NF-kB의 활성 억제가 새로운 항염증 및 항암제의 개발을 위한 바람직한 목표를 제공한다는 이론하에, 본 발명자는 항염증 및 항암제 후보들을 발견하고 그러한 것들을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 NF-kB 신호 전달 경로의 조절 및/또는 억제를 위해 유용한 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
이를 위하여, 본 발명은 NF-kB 신호 전달 경로를 억제하는 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서, NEMO로부터 유도된 폴리펩티드는 CC2 도메인(쥐:서열 ID NO: 3 또는 인간:서열 ID NO: 14)이다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, NEMO로부터 유도된 폴리펩티드는 LZ 도메인(쥐:서열 ID NO: 7 또는 인간:서열 ID NO: 16)이다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서, NEMO로부터 유도된 폴리펩티드는 스페이서(spacer) 서열을 통해서 높은 형질 도입 가능성을 지닌 폴리펩티드에 융합된다.
또한, 본 발명의 다른 실시 형태에서, 스페이서(spacer) 서열 및 높은 형질 도입 가능성을 가진 폴리펩티드를 가지거나 그렇지 않은 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 있다.
본 발명의 또 다른 실시 형태에서, NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 그것을 필요로 하는 대상에 투여함으로써 NF-kB 신호 전달 경로에 의해 조절되는 질병을 조정하거나 치료하는 방법이 있다. NF-kB 신호 전달 경로에 의해 조절되는 질병은 감염성 반응, 종양 형성 및 바이러스 감염을 포함한다.
본 발명은 또한 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 그것을 필요로 하는 대상에 투여함으로써 세포 증식 또는 아포토시스(apoptosis)를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 그것을 필요로 하는 대상에 투여함으로써 항원성 자극에서 B 또는 T 림프구를 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 다른 실시 형태에서, 본 발명은:
a) 후보 폴리펩티드 서열을 확인하는 단계;
b) 상기 후보 폴리펩티드 서열을 스페이서(spacer) 서열을 통하여 높은 형질 도입 가능성을 가진 폴리펩티드에 연결함으로써 폴리펩티드 혼합 구조체를 형성하는 단계;
c) 세포 배지를 상기 폴리펩티드 혼합 구조체와 접촉시키는 단계;
d) NF-kB 신호 전달 경로의 활성을 모니터하는 단계;
e) 상기 폴리펩티드 혼합 구조체에 의한 상대적인 억제를 측정하기 위하여 상기 폴리펩티드 혼합 구조체 존재시의 NF-kB 신호 전달 경로의 활성을 상기 폴리펩티드 혼합 구조체 부재시의 NF-kB 신호 전달 경로의 활성과 비교하는 단계; 및
f) 상기 폴리펩티드 혼합 구조체에 의한 상대적 억제를 NEMO 올리고머화와 연관시키는 단계;에 의해 NEMO의 올리고머화를 조절하는 폴리펩티드를 확인하는 방법을 제공한다.
상기의 목적은 본 발명의 어느 측면을 더욱 강조한다. 본 발명의 부가적인 목적, 관점 및 실시 형태들은 이하의 상세한 설명에서 기술된다.
본 발명의 더욱 더 완전한 이해 및 부수하는 장점들은 이하의 상세한 설명에 더하여 첨부된 도면을 참조함으로써 보다 잘 이해될 것이다.
도 1: NEMO 단백질의 기능 도메인.
(A) 쥐 NEMO 단백질은 N-말단에 IKK 결합 도메인 및 C-말단에 올리고머화 도메인, 프롤린이 풍분한 모티프(PPP) 및 아연 손가락 구조(ZF)를 포함하는 412개의 아미노산 및 복합 도메인을 포함한다. Wolf 등(1997, Protein Sci.)에 의해 개발된 알고리즘을 사용하여 꼬인-코일 예측(coiled-coil prediction)(비어있는 상자) 및 NLM 보존 모티프(검은 막대)가 도시된다. NEMO 올리고머화를 위해 필요한 모든 결정자(Agou 등, 2004, J.Biol.Chem.)를 포함하는 제2 꼬인 코일(CC2) 및 루이신 지퍼(LZ) 모티프에 대응하는 NEMO253 -337 서열(서열 ID NO: 12의 253-337 잔기)은 밑줄이 그어진 NLM 보존 모티프(서열 ID NO: 12의 293-322 잔기) 및 그 서열 아래에 실린더로 도시된 꼬인 코일 서열로 지시된다. 그 서열 바로 위의 문자들은 꼬인 코일 서열의 주요한 특징인 헵타드 반복(heptad repeat) 'a' 및 'd' 위치를 나타낸다(Vinson, 2002, Mol. Cell. Biol.). (B) 다른 종의 NRP/optineurin, ABIN-1/Naf 1, ABIN-2 및 ABIN-3/LIND(각각 서열 ID NO: 19-29)와 공유되는 NEMO와 같은 모티프(NEMO Like Motif:NLM)을 도시하는 쥐(Mm), 인간(Hs), 소(Bt) 및 노랑초파리(Dm)로부터의 NEMO 단백질의 여러 서열 배열. 여러 서열 배열은 서열 단편의 PSI-BLAST-발생된 가장 높은 스코어링 쌍을 분석하고 CLUSTAL W를 사용하여 같은 것을 재배열함으로써 구성되었다(Thompson, 1994, N.A.R.). 동일하고 유사한 아미노산 잔기(어두운 부분)는 각각 (!) 또는 (*)로 표시된다.
도 2: NEMO 펩티드 흡수의 흐름 세포 측정.
(A) 안테나페디아(Antennapedia) 펩티드와 접합에 의해 매개된 NEMO 펩티드의 세포 전달. 70Z/3 세포를 2μM BODIPY-표지를 단 Ant-CC2 야생형(wild type:WT), 또는 Ant-CC2 변이체(Mu), 또는 Ant-LZ 야생형(WT) 또는 Ant-LZ 변이체(Mu) 펩티드 존재시 또는 부재시(W/O), 또는 대조구로 2μM BODIPY-접합된 BSA(BODIPY-BSA) 또는 BODIPY-FL만으로 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. (B) 70Z/3 세포에서 37℃에서 5시간 동안 0, 0.2, 2 및 20μM의 Ant-CC2의 안테나페디아-매개된 흡수의 농도 의존성(왼쪽 패널) 및 37℃에서 Ant-CC2 20μM 첨가 후 0, 0.5, 1, 2 또는 5 시간 후에 BODIPY-접합된 Ant-CC2의 FACS 운동역학 분석.
도 3: 세포를 투과할 수 있는 Ant- CC2 및 Ant- LZ 펩티드에 의한 LPS -유도된 NF-kB 활성의 억제
(A) 70Z3 B 림프구를 NF-kB의 제어 하에 β-갈락토시다아제를 포함하는, pIL1-β-갈락토시다아제로 안정적으로 감염시켰다("물질 및 방법" 참조). 결과로 얻은 세포주, 70Z3-C3를 안테나페디아 펩티드(Ant), 또는 BODIPY-표지된 안테나페디아 펩티드(BODIPY-Ant), 또는 CC2 펩티드 또는 LZ 펩티드에 연결된 BODIPY-표지된 안테나페디아 펩티드(BODIPY-Ant-CC2 또는 BODIPY-Ant-LZ) 20㎛의 존재 또는 부재시에 2시간 동안 배양하였고, 펩티드 내재화 후에 세포들은 5시간 동안 LPS(3㎍/㎖, 왼쪽 패널의 (+))로 처리하거나 또는 처리하지 않았으며(오른쪽패널 및 왼쪽 패널에서 (-)) NF-kB 활성을 β-갈락토시다아제 분석으로 측정하였다. 에러 막대는 세 개의 개별 실험의 표준 편차를 나타낸다. (B) BODIPY-Ant-CC2 펩티드(왼쪽 패널) 또는 BODIPY-Ant-LZ 펩티드(오른쪽 패널)에 의한 LPS-유도된 NF-kB 활성 억제의 농도 의존도. 세포들은 지시된 것처럼 다른 농도의 펩티드로 (A)처럼 처리하였다. LPS-유도된 NF-kB 활성을 억제하는 각 펩티드의 가능성은 대조구(펩티드가 없음)와 비교하여 LPS-유도된 NF-kB 활성 50% 억제에 대응하는 IC50 값을 결정함으로써 측정하였다(C). (D) NF-kB 활성 억제에 대한 안테나페디아의 N-혼합 서열의 효과. 대조구(펩티드 없음), N-말단(CC2, LZ)에 안테나페디아 서열을 가지거나(BODIPY-Ant-CC2, BODIPY-Ant-LZ) 또는 가지지 않은 CC2 또는 LZ 펩티드를 70Z3-C3 세포와 2시간 동안 배양하였고 이어서 3시간 동안 LPS-처리를 하거나(+) 또는 하지 않았다(-). 그런 다음, NF-kB 활성을 β-갈락토시다아제 분석으로 측정하였다.
도 4: LPS 에 반응한 NF - kB 활성의 특정 억제는 CC2 및 LZ 꼬인 코일의 소수성 중심에서의 몇몇 돌연변이에 의해 좌우된다.
왼쪽 패널은 CC2(A) 및 LZ(B) 펩티드의 나선 휠 다이어그램을 나타낸다. 도면은 분자의 평면도이다. 꼬인 코일 서열의 본질적인 특징(Vinson, 2002, Mol. Cell. Biol.)인 (a)에서 (g) 위치는 각 펩티드 서열에서 연속 위치를 나타낸다. 일반적으로 소수성 아미노산이 차지하는 첫 번째 (a) 및 네 번째 (d) 위치는 평행 꼬인 코일 뿐만 아니라 역평행-꼬인 코일을 위한 소수성 중심을 구성한다. CC2 (a) 위치에 주입된 돌연변이(BODIPY-Ant-CC2(Mu); 서열 ID NO: 5의 6-40 잔기에 대응하는 글리신 돌연변이를 가진 서열 ID NO: 3의 6-40 잔기로서 도시됨) 또는 LZ (d) 위치에 주입된 돌연변이(BODIPY-Ant-Mu)가 도시된다. 오른쪽 패널에서는, 세포를 투과할 수 있는 야생형(BODIPY-Ant-CC2(WT)) 또는 돌연변이체(BODIPY-Ant-CC2(Mu)) CC2 펩티드(A) 또는 야생형(BODIPY-Ant-LZ(WT)) 또는 돌연변이체(BODIPY-Ant-(Mu)) LZ 펩티드(B) 10 ㎛의 존재 또는 부재시(대조구)에 70Z3-C3 세포를 2시간 동안 배양하였다. 내재화되지 않은 여분의 펩티드를 제거하기 위하여 세포를 여러 번 세척한 다음 세 번 희석하였고 LPS가 있거나(+) 없이(-) 5시간 동안 처리하기 전에 24시간 동안 배양하였다. NF-kB 활성은 β-갈락토시다아제 분석으로 측정하였다. 에러 막대는 두 독립적인 실험의 표준 편차를 나타낸다.
도 5: LZ 펩티드에 의한 NF - kB 활성의 억제는 특정의 꼬인 코일 가닥의 형성으로 발생한다.
(A) NEMO로부터 유도된 LZ(서열 ID NO: 12의 301-336 잔기) 및 GCN4 펩티드(서열 ID NO: 8의 23-55 잔기)의 서열 배열. 두 꼬인 코일 모티프는 clustalX를 사용하여 배열되었다. 동일하고 유사한 아미노산 잔기(어두운 부분)는 각각 (!) 및 (*)로 표시되었다. (B) GCN4 꼬인 코일의 전체 및 나선형 휠 다이어그램(평면도). GCN4 아미노산 서열을 그 대응하는 [a-g] 위치로 도시하였고 상응하는 NEMO로부터 유도된 LZ 서열과 다른 잔기는 보존의 정도에 따라 박스화되었다. 동일하고(개방된 사각형) 유사한 잔기(개방된 삼각형)가 표시되었다. (C) LPS-유도된 NF-kB 활성의 억제에 대한 세포를 투과할 수 있는 NEMO로부터 유도된 LZ 및 GCN4 펩티드의 비교. 70Z3-C3 세포를 안테나페디아 융합 LZ(BODIPY-Ant-LZ) 또는 GCN4(BODIPY-Ant-GCN4) 펩티드 10 μM의 존재 또는 부재시(펩티드 없음)에 2시간 동안 배양하였다. 내재화되지 않은 여분의 펩티드를 제거하기 위하여 세포를 여러 번 세척한 하였고, LPS가 있거나(+) 없이(-) 5시간 동안 처리하기 전에 24시간 동안 배양을 용이하게 하기 위하여 세 번 희석하였다. NF-kB 활성은 β-갈락토시다아제 분석으로 측정하였다. 에러 막대는 두 독립적인 실험의 표준 편차를 나타낸다.
도 6: 안테나페디아 서열을 가지거나 그렇지 않은 NEMO 로부터 유도된 폴리펩티드의 올리고머화 특성.
모든 펩티드들을 회수를 개선하기 위하여 0.1 mM DDM을 포함하는 버퍼로 평형이 맞춰진 superdex 75 HR10/30 컬럼에 10μM의 농도로 로딩하였다("물질 및 방법" 참조). 안테나페디아 서열에 혼합된 CC2 돌연변이체(점선)(BODIPY-Ant-CC2(Mu)) 및 CC2 야생형(BODIPY-Ant-CC2(WT))의 크로마토그래프 특성 또는 안테나페디아 서열에 혼합되지 않은 야생형(CC2(WT), CC2(Mu))의 크로마토그래피 특성은 왼쪽 패널에 도시되고, 안테나페디아 서열에 혼합된 LZ 돌연변이체(점선)(BODIPY-Ant-LZ(Mu)) 및 LZ 야생형(BODIPY-Ant-LZ(WT))의 크로마토그래프 특성 또는 안테나페디아 서열에 혼합되지 않은 야생형(LZ(WT), LZ(Mu))의 용리 특성은 오른쪽 패널에 도시된다. 구형 단백질 표지의 용리 부피는 화살표로 지시된다: Oval, 난백알부민(43kDa); Chym, 키모트립시노겐 A(25kDa); Ribo, 리보누클라아제(13.4kDa) 및 Apro, 아프로티닌(6.5kDa).
도 7: CC2 펩티드에 대한 Ant- CC2 및 Ant- LZ 펩티드의 연관
(A) 형광 비등방성(anisotropy)에 의한 CC2로 BODIPY-Ant-CC2(1 μM)의 직접 적정. CC2의 농도는 아미노산 분석으로 측정하였다. 밀리유닛(mA)인 BODIPY-Ant-CC2의 비등방성 값은 CC2 펩티드의 증가하는 농도에 대하여 기록되었다. 데이타 점은 15.2 μM의 KD를 가진 결합 등온선 식으로 나타낸다(실선)(물질 및 방법). 두 점선은 화학량적 적정을 나타내고 16 μM 의 CC2 농도에서 교차한다. BODIPY-Ant-CC2의 농도가 1μM이라면, 이는 0.8의 복합체 화학량을 준다. (B) 형광 비등방성에 의한 CC2로 BODIPY-Ant-LZ(0.1 μM)의 직접 적정. BODIPY-Ant-LZ(흰색 바)만 또는 CC2 펩티드(30 μM, 회색 바; 100 μM, 흑색 바)가 존재할 때의 비등방성 값을 밀리유닛(mA)으로 나타낸다.
도 8: Ant- CC2 및 Ant- LZ 펩티드에 의해 망막모세포종 세포주 Y79 에서 유도된 세포사 (cell death)
Rb 세포주 Y79를 여러 농도의 Ant-CC2(WT)(검은 사각형) 또는 Ant-CC2(Mu)(흰 사각형)(A), 또는 Ant-LZ(WT)(검은 원), 또는 Ant-LZ(Mu)(흰 원)(B), 또는 Ant 펩티드(흰 삼각형)(C)로 3시간(A,B) 또는 16시간(C) 동안 처리하였다. 그런 다음 세포 생존은 "물질 및 방법"에 기술된 MTS 평가를 사용하여 측정하였다.
특별한 언급이 없다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 효소학, 생화학, 세포 생물학, 분자 생물학, 및 의학 분야의 숙련된 자가 통상적으로 이해하는 것과 같은 의미를 가진다.
본 명세서에 기술된 방법 및 물질과 유사하거나 등가인 모든 방법 및 물질은 여기에 기술된 적절한 방법 및 물질을 사용하여 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참조 문헌은 그 전부가 참조를 위해 통합된다. 의미가 충돌하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 통제할 것이다. 또한, 특별한 언급이 없다면 본 발명의 물질, 방법 및 예들은 단지 예시적인 것이며 본 발명을 한정하기 위한 것은 아니다.
본 출원에서, 본 발명자는 NEMO 올리고머화를 차단하도록 의도된 펩티드에 의한 NF-kB 활성의 억제를 연구하였다. 본 발명자는 이미 최소 삼량체화 도메인은 CC2-LZ 꼬인 코일 서브도메인을 포함하고 격리된(isolated) 및/또는 정제된 CC2 및 LZ 도메인이 서로 결합하여 이종 이량체의 안정한 삼량체를 형성한다는 것을 밝혔다. 이러한 구조 모델은 HIV-1에서 gp41 엑토도메인(ectodomain)의 접힘을 암시한다(Agou 등, 2004, J.Biol.Chem.). 그 구조적 모델은 NEMO의 C-말단으로부터 유도된 LZ 나선형 모티프에 의해 에워싸지고, CC2 꼬인 코일의 외부 둘레에 역평행식으로 에워 싸는 (NEMO의 CC2 꼬인 코일 모티프로 형성된)중심의 세 가닥 꼬인 코일로 구성된다. 이러한 모델에 기초하여, 본 발명자는 NEMO 서브유닛 사이의 접촉부를 모방하는 CC2 또는 LZ 서브도메인의 최적 부분에 대응하는 세포를 투과할 수 있는 두 개의 펩티드를 구상하였다. 펩티드 도입은 FACS에 의해 모니터되었고 LPS-유도된 NF-kB 활성에 대한 그 효과는 안정하게 이식된 pre-B 70Z/3 림프구에서 β-갈락토시다아제에 의존한 NF-kB를 사용하여 정량되었다. 또한, 본 발명자는 CC2 펩티드 보다 더 적은 양의 LZ 펩티드가 μM 영역의 IC50 값으로 특정적으로 NF-kB 활성을 억제한다는 것을 기술하였다. 그 효과는 돌연변이된 CC2 및 LZ 펩티드 뿐만 아니라 이종 기원의 꼬인 코일 펩티드(GCN4)를 포함하여 대조구 펩티드가 NF-kB 활성에 대한 억제 효과를 가지지 않기 때문에 특정적이었다. 또한, 본 발명자는 이러한 NF-kB 펩티드성 억제제가 구조성 NF-kB 활성을 나타내는 인간 망막모세포종 세포주 Y79에서 세포사(cell death)를 유도한다는 것을 밝혔다. 결론적으로, 본 발명자는 NEMO의 올리고머화를 목표로 함으로써 NF-kB 경로를 억제하는 새로운 가능성 있는 전략을 제공한다.
본 발명자는 NEMO가 NF-kB 활성 경로에서 상위 역할을 하기 때문에, NF-kB 신호 전달을 억제하는 약제를 찾기 위한 가장 우선의 목표를 구성함을 증명하였다. NEMO 및 여러 도메인의 역할은 부분적으로 연구되었고 이하의 논문: "NEMO는 꼬인 코일 C-말단 도메인을 통해 삼량체화한다(NEMO trimerizes through its coiled-coil C-terminal domain)", J Biol Chem, 2002 5월 17일; 277(20):17464-75. Agou 외에 발표되었으며, 그 복사본이 참조를 위해 통합된다.
본 발명에서, 발명자는 올리고머화 도메인(CC2 도메인=약 40 잔기) 또는 LZ 모티프(LZ 도메인=약 40 잔기)를 모방한 펩티드를 합성하였다. 이러한 펩티드의 조합은 NF-kB 경로를 억제하는 두 경우에서, NEMO의 올리고머화 또는 단백질성 작동체와의 조합을 변경한다.
본 발명에서, 펩티드 약제는 길이면에서 16개의 아미노산 펩티드(페너트라틴(Penetratin)/안테나페디아)와 화학적으로 결합되고, 이로 인하여 세포간 수송이 가능하게 한다. 결과로 생긴 펩티드는 또한 FACS를 통해 B 림프구 세포주로의 내재화를 모니터하기 위하여 형광 추적자와 화학적으로 연결될 수 있다.
이러한 펩티드의 작용은 베타-갈락토시다아제 운반체 유전자를 안정적으로 통합하고 또한 그 촉진자에서 여러 가지 NF-kB 전사 인자(클론 C3) 활성 자리로부터 상위를 차지하는 B 림프구에 직접적으로 시험되었다(이하의 예 참조).
본 발명자는 LPS에 의한 B 림프구의 같은 자극을 측정함으로써 이러한 펩티드의 억제 효과를 성공적으로 모니터할 수 있었다.
결과는 전체적으로 "CC2" 모티프를 모방한 펩티드의 존재가 20 μM의 상대적으로 낮은 투여량에서 대조구 펩티드와 비교하여 70%까지 NF-kB 활성을 감소시킨다는 것이다. 이러한 농도에서, "루이신 지퍼(leucine zipper)" 펩티드의 효과는 여전히 중요한데, 이는 매질에 존재할 때 세포 반응을 완전히 제거하기 때문이다.
NF-kB 세포 신호 전달 경로의 이러한 새로운 억제제는 함-염증 화합물 및 항-종양 화합물로서 주요한 장점을 제공하고, 암 및 다른 질병의 치료 및/또는 방지를 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 NEMO의 올리고머화를 조절하기 위해 사용되는 화합물, 펩티드 또는 조성물에 관한 것이다. 특히, 이하에서 기술되는 펩티드 화합물은 격리된 및/또는 정제된 상태일 수 있고 또는 벡터화제(vectorizing agent)를 가지거나 그렇지 않을 수 있다. 본 발명은 또한 동족체가 상기 억제 활성을 가지는 한, NEMO로부터 유도된 폴리펩티드와 적어도 70% 상동성을 가진 펩티드도 포함한다. NEMO로부터 유도된 폴리펩티드 및 그 동족체의 억제 활성을 평가하는 방법은 본 출원의 실시예에서 제공되고 예시된다. 본 발명의 펩티드 및 그 투여량은 NF-kB 활성이 대조구 펩티드와 비교하여 적어도 50% 감소될 때 억제 활성을 가지는 것으로 간주된다.
본 발명은 또한 감염성 반응, 종양 형성, 바이러스 감염의 치료, 세포 증식 및 아포토시스의 조절 및 항원성 자극을 위해 사용되는 약제 제조를 위한 상기 펩티드를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 펩티드를 포함하는 약제 조성물은 암 치료를 위해 유용하다.
또한, 본 발명은 특히 2003년 4월 1일, CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganisms)(프랑스 공화국, 75724 빠리 세덱스 15, 뤼 드 독뙤르 루 28(28 rue de Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15))에 번호 I-3004으로 제출된 70Z/3-C3 세포주를 수단으로 NF-kB 신호 전달 경로를 억제하는 펩티드 및 화합물을 획득하고, 제조하고 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서, "감소된" 또는 "억제된"이라는 용어는 직접적 또는 간접적으로 NF-kB 경로에서 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 감소시키는 것을 의미한다. "NF-kB 경로를 억제한다"라는 문구는 바람직하게는 NF-kB 경로가 NEMO 올리고머화의 차단에 의해 억제됨을 의미한다.
본 명세서에서 "향상된"이라는 용어는 대응하는 DNA에 의해 암호화되는 NEMO로부터 유도된 펩티드의 세포내 활성 또는 농도가 증가함을 의미한다. 향상은 박테리아 세포의 여러 조작의 도움으로 달성될 수 있다. 향상, 특히 과-발현을 달성하기 위하여, 대응하는 유전자의 다수의 복제가 증가할 수 있고, 강한 프로모터(promoter)가 사용될 수 있으며 또는 구조 유전자의 상위에 위치한 프로모터- 및 조절 구역 또는 리보솜 결합 자리가 돌연변이 될 수 있다. 구조 유전자의 상위에 통합된 발현 카세트(expression cassettes)는 같은 방식으로 작동한다. 또한, 유도성 프로모터를 사용함으로써 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 높은 활동성을 가진 대응하는 효소를 암호화하는 유전자가 또한 사용될 수 있다. 발현은 또한 mRNA의 생존 기간을 신장하는 조치에 의해 개선될 수 있다. 또한, 효소의 분해를 방지하는 것은 전체적으로 효소의 활동성을 증가시킨다. 또한, 이러한 조치들은 원하는 방식으로 임의적으로 결합될 수 있다. 식물에서 유전자 활동성을 변경하는 이러한 방법 및 다른 방법들은 예를 들어 Methods in Plant Molecular Biology, Maliga 외, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1995)에 기술된 것처럼 알려져 있다.
NF-kB 경로를 억제하는 높은 활동성을 지닌 대응하거나 변형된 NEMO로부터 유도된 펩티드를 암호화하는 유전자가 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는 대응하는 효소는 NF-kB 경로를 억제하는 NEMO 단백질의 원래 형태보다 더 큰 능력, 더 바람직하게는 적어도 5, 10, 25 또는 50% 더 억제하는 능력을 가진다. 가장 바람직하게는 본 발명의 NEMO로부터 유도된 펩티드는 원래의 NEMO 단백질 존재시에 비하여 NF-kB 경로를 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 감소시킨다.
본 출원의 내용에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 그 염기 조성 및 염기 서열의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%가 본 발명에 따른 서열에 대응한다면 본 발명에 따른 서열과 "상동"이다. 본 발명에 따르면, "상동 단백질" 또는 "상동 펩티드"는 쥐로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 3) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 7) 또는 인간으로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 14) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 16)의 아미노산 서열에 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질(펩티드)을 포함하는 것으로 이해되고, "대응하다"라는 것은 대응하는 아미노산이 동일하거나 또는 상호간에 상동 아미노산인 것을 의미한다. 본 발명의 실시예에서 명확해지는 것처럼, CC2의 상동 펩티드는 바람직하게는 꼬인 코일 모티프 구조를 보유하고 LZ의 상동 펩티드는 바람직하게는 나선형 모티프 구조를 보유한다. 서열 ID NO: 3, 서열 ID NO: 7, 서열 ID NO: 14 및 서열 ID NO: 16의 확인에 의해 제공된 지시 사항 및 이하의 실시예의 상세한 설명으로, 본 발명의 범위 내에서 이론적인 돌연변이의 선별은 관련 분야의 숙련된 자의 수준이면 충분하다. 더 구체적으로, 관련 분야에서 관례적인 것처럼, 후보 서열(즉, 서열 ID NO: 3, 서열 ID NO: 7, 서열 ID NO: 14 및 서열 ID NO: 16에 대응하는 영역)을 확인함으로 전문가는 동일하거나 더 나은 치료 효율을 가진 돌연변이체를 선별하기 위하여 상기 서열의 하나 이상의 모든 가능한 치환을 평가하고 선별할 수 있다.
"상동 아미노산"이라는 표현은 특히 그 전하, 소수성 특징, 입체적 특성 등에 대하여 상응하는 특성을 가진 아미노산을 의미한다.
뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 상동성, 서열 유사성 또는 서열 동일성은 Bestfit 또는 Gap 쌍비교 프로그램과 같은 알려진 소프트웨어 또는 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 결정될 수 있다(GCG Wisconsin Package, Genetic Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711). Bestfit은 두 서열 사이의 최적의 동일 또는 유사 단편을 찾기 위하여 Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981), Smith and Waterman의 국부적인 상동 알고리즘을 사용한다. Gap은 전체적인 배열을 실행한다: 다른 유사한 서열을 가진 전체 서열은 J. Mol. Biol.48:443-453(1970)의 Needleman 및 Wunsch 방법을 사용한다. 서열 상동성. 유사성 또는 동일성 정도를 결정하기 위하여 Bestfit과 같은 서열 배열 프로그램을 사용할 때, 디폴트 세팅(default setting)은 사용될 수 있고, 또는 적절한 스코링 매트릭스는 동일성, 유사성 또는 상동성 스코어를 최적화하기 위해서 사용될 수 있다. 유사하게, 두 개의 서로 다른 아미노산 서열 사이의 서열 동일성, 유사성 또는 상동성을 결정하기 위하여 Bestfit과 같은 프로그램을 사용할 때, 디폴트 세팅(default setting)이 사용될 수 있고, 또는 blosum45 또는 blosum80과 같은 스코링 매트릭스는 동일성, 유사성 또는 상동성 스코어를 최적화하기 위해서 선택될 수 있다.
본 발명은 쥐로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 3) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 7) 또는 인간으로부터 유도된 NEMO 또는 그 단편의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 14) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 16)의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리펩티드에 관한 것으로, 이는 쥐로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 3) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 7) 또는 인간으로부터 유도된 NEMO, 또는 그 단편의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 14) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 16)을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 서열을 포함하는 프로브(probe)로 대응하는 유전자 은행의 교잡 및 상기 DNA의 분리를 수단으로 선별함으로써 획득될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 쥐로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 3) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 7) 또는 인간으로부터 유도된 NEMO, 또는 그 단편의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 14) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 16)을 암호화하는 서열에 높은 유사성을 나타내는 cDNAs 또는 유전자를 분리하기 위하여 RNA, cDNA 및 DNA를 위한 교잡 프로브(probe)로서 적절할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 NF-kB 경로를 억제하는 능력을 가진 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 생산을 위한 중합연쇄반응(PCR)을 위한 프라이머(primer)로서 적절할 수 있다.
프로브(probe) 또는 프라이머(primer)로서 역할을 하는 이러한 올리고뉴클레오티드는 30보다 많은, 바람직하게는 30 이상, 더 바람직하게는 20 이상, 가장 바람직하게는 적어도 15 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 적어도 40 또는 50 뉴클레오티드 길이를 가진 올리고뉴클레오티드 역시 적당할 수 있다.
"격리된(isolated) 및/또는 정제된"이라는 용어는 그 본래 환경과는 분리된 것을 의미한다.
"폴리뉴클레오티드"라는 용어는 일반적으로 폴리리보뉴클레오티드(polyribonucleotides) 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotides)를 언급하고 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA를 나타낼 수 있다.
"폴리펩티드"라는 용어는 펩티드 결합을 통해서 연결된 둘 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 단백질을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 쥐로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 3) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 7) 또는 인간으로부터 유도된 NEMO, 또는 단편의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 14) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 16), 특히 NF-kB 경로를 억제하는 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드에 대응하는 폴리펩티드를 포함하고, 쥐로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 3) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 7) 또는 인간으로부터 유도된 NEMO, 또는 단편의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 14) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 16)에 대응하는 폴리펩티드와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%의 상동성 및 가장 바람직하게는 쥐로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 3) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 7) 또는 인간으로부터 유도된 NEMO, 또는 단편의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 14) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 16)에 대응하는 폴리펩티드와 적어도 90% 내지 95%의 상동성을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 유전 코드의 변성에 의해 쥐로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 3) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 7), 또는 인간으로부터 유도된 NEMO, 또는 단편의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 14) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 16)을 암호화하는 DNA 서열을 암호화하는 것에 관한 것이다. 관련 분야의 숙련된 자는 상기한 DNA 서열이 쥐로부터 유도된 NEMO(서열 ID NO: 11) 또는 인간으로부터 유도된 NEMO(서열 ID NO: 17)을 위한 전체 길이 DNA 서열에 기초할 수 있고 이에 의하여 이러한 서열은 본 발명에 따른 이러한 서열의 범위를 확인하는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
같은 방식으로, 본 발명은 또한 쥐로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 3) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 7) 또는 인간으로부터 유도된 NEMO, 또는 단편의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 14) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 16)을 암호화하는 DNA 서열과 혼성화하는 DNA 서열에 관한 것이다.
또한, 관련 분야의 숙련된 자는 단백질 활성에 어떤 근본적인 변화를 야기하지 않는, 즉 기능적으로 중성인 "센스 돌연변이(sense mutation)"로서 알라닌에 의한 글리신의 치환 또는 글루탐산에 의한 아스파르트산의 치환과 같은 고전적인 아미노산 치환을 알고 있다. 또한, 단백질의 N- 및/또는 C-말단에서의 변화는 실질적으로 그 기능을 손상하지 않고, 심지어 상기 기능을 안정화할 수 있다는 것을 알고 있다.
같은 방식으로, 본 발명은 쥐로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 3) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 7) 또는 인간으로부터 유도된 NEMO, 또는 단편의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 14) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 16)을 암호화하는 DNA 서열과 혼성화하는 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 쥐로부터 유도된 NEMO의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 3) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 7) 또는 인간으로부터 유도된 NEMO, 또는 단편의 경우 NEMO의 CC2 영역(서열 ID NO: 14) 또는 NEMO의 LZ 영역(서열 ID NO: 16)을 암호화하는 DNA 서열과 혼성화하는 DNA 서열에서 유래한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 연쇄중합반응(PCR)에 의해 생산된 DNA 서열에 관한 것이다. 이러한 형태의 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 적어도 15 뉴클레오티드 길이를 가진다.
"엄격한 조건(stringent conditions)" 또는 "엄격한 교잡 조건"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드가 다른 서열보다 더 큰 정도(예를 들어, 배경에 비해 12배)로 검출될 수 있도록 목표 서열에 교잡하는 조건을 포함한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고 서로 다른 상황에서는 서로 다를 것이다. 교잡의 엄격함 및/또는 세척 조건을 조절함으로써, 프로브(동종 프로빙)에 100% 상보적인 표적 서열은 확인될 수 있다. 선택적으로, 엄격한 조건은 더 낮은 정도의 유사성이 검출되도록(이종 프로빙) 서열에서의 일부 잘못된 매칭을 허용하도록 조절될 수 있다.
일반적으로, 엄격한 조건은 pH가 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.5 M Na 이온, 구체적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도(또는 다른 염들) 보다 작고 온도는 짧은 프로브(예를 들어, 10 내지 50 뉴클레오티드)의 경우 적어도 약 30℃이고 긴 프로브(예를 들어, 50 뉴클레오티드보다 큰 경우)의 경우 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 불안정제의 첨가로 달성될 수 있다. 대표적인 낮은 엄격한 조건은 37℃에서 30 내지 35% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS(소디움 도데실 설페이트) 및 50 내지 55℃에서 1X 내지 2X SSC(20X SSC=3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산3나트륨) 세척의 완충 용액과 교잡을 포함한다. 대표적인 중간 엄격한 조건은 37℃에서 40 내지 45% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS(소디움 도데실 설페이트) 및 55 내지 60℃에서 0.5X 에서 1X SSC 세척의 완충 용액과 교잡을 포함한다. 대표적인 높은 엄격한 조건은 37℃에서 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS 및 60 내지 65℃에서 0.1X SSC 세척의 완충 용액과 교잡을 포함한다.
특이성은 일반적으로 후-교잡 세척의 기능이고, 결정적인 인자는 최종 세척 용액의 이온 세기 및 온도이다. DNA-DNA 하이브리드에서, Tm은 Meinkoth 및 Wahl 방정식, Anal. Biochem., 138:267-284 (1984): Tm =81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(% 포름)-500/L;으로부터 어림잡을 수 있으며, M은 1가 양이온의 몰농도이고, %GC는 DNA에서 구아노신 및 시토신의 백분율이며, % 포름은 혼성화 용액에서 포름아미드의 백분율이고, L은 염기 쌍으로 하이브리드의 길이다. Tm은 상보적인 목표 서열의 50%가 완벽하게 매치된 프로브에 혼성화하는 (정해진 이온 세기 및 pH 하에서)온도이다. Tm은 각각 1% 미스 매칭(mismatching)에 대하여 약 1℃ 씩 감소한다; 따라서, Tm, 교잡 및/또는 세척 조건은 원하는 동질성의 서열에 혼성화되도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 만약 약 90% 동질성을 가진 서열을 찾는다면, Tm은 10℃ 감소할 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 세기 및 pH에서 특정 서열 및 그 보체에 대한 녹는점(Tm)보다 약 5℃ 낮도록 선택될 수 있다. 그러나, 심하게 엄격한 조건은 녹는점(Tm)보다 1,2,3 또는 4℃ 낮게 교잡 및/또는 세척을 활용할 수 있다; 중간 정도의 엄격 조건은 녹는점(Tm)보다 6,7,8,9 또는 10℃ 낮게 교잡 및/또는 세척을 활용할 수 있다; 낮은 엄격 조건은 녹는점(Tm)보다 11,12,13,14,15 또는 20℃ 낮게 교잡 및/또는 세척을 활용할 수 있다. 방정식, 교잡 및 세척 조성물, 및 원하는 Tm을 이용하여, 숙련된 자들은 교잡 및/또는 세척 용액의 엄격함의 변화가 내재적으로 기술되는 것을 이해할 것이다. 만약 미스 매칭(mismatching)의 원하는 정도가 45℃(수용액) 또는 32℃(포름아미드 용액) 보다 낮은 Tm이 된다면, 높은 온도가 사용될 수 있도록 SSC 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 핵산의 교잡에 대한 폭넓은 지침은 Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel 등, Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(2000)에서 참조할 수 있다.
따라서, 상기 정보를 가지고 숙련된 전문가는 본 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 유사한 격리된 및/또는 정제된 폴리뉴클레오티드를 확인할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 분리에서, 그 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 NF-kB 경로를 억제하는데 본 폴리뉴클레오티드처럼 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 NF-kB 경로를 억제하는 능력을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상당한 동종성을 가진 폴리뉴클레오티드를 선별하는 방법이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 관련 분야에서 식물 또는 그와 동류에 알려진 것처럼 하나 이상의 적절한 플라스미드 벡터로 운반될 수 있다.
일 실시 형태에서, 세포 타입에 적절한 벡터로 폴리뉴클레오티드를 박테리아 또는 곰팡이 균주에 이동시켜 폴리뉴클레오티드를 전파하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 전파하고 이러한 세포 형태에서 단백질을 생산하는 일반적인 방법은 관련 분야에 알려져 있으며 예를 들어 Maniatis 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1982) 및 Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989)에 기술되어 있다.
상기한 실시 형태는 서열 ID NO: 3(NEMO 단백질의 CC2 영역; 즉, 서열 ID NO: 12의 246-286 아미노산) 및 서열 ID NO: 7(NEMO 단백질의 LZ 영역; 즉, 서열 ID NO: 12의 390-412 아미노산)의 내용으로 기술되고, 서열 ID NO: 12는 쥐로부터 유도된 NEMO이다. 상기한 실시 형태는 서열 ID NO: 18(인간으로부터 유도된 NEMO)에서 유도된 서열 ID NO: 14 및 서열 ID NO: 16에 기초하여 또한 기술된다. 그러나, 본 발명은 바람직하게는 진핵세포에 내재화될 수 있는 NEMO 단백질의 펩티드 유도체를 제공한다. NEMO 펩티드 유도체의 내재화는 NEMO 펩티드 유도체, 또는 그 동종체를 높은 형질 도입 가능성을 가진 폴리펩티드에 융합함으로써 달성될 수 있다. 숙련된 전문가는 여기서 사용된 "높은 형질 도입 가능성"이라는 용어는 폴리펩티드 및 그 융합 단백질이 쉽게 세포막을 통과하여 세포 내로 융합 단백질의 내재화를 초래하는 것을 의미한다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 높은 형질 도입 가능성을 가진 펩티드의 예는 다음과 같다: 안테나페디아/페너트라틴(Penetratin) 단백질의 세번째 나선(Ant)(Prochiantz, 2000, Curr. Opin. Cell Biol.), TAT 유도 단백질(Fawel, 1994, P.N.A.S.), HSV-1으로부터의 VP22(Stroh C. 2003, Oncogene), Pep. 1(Morris, 2001, Nature Biotech.).
본 발명 및 그 용도를 실증하기 위하여, 본 발명자는 서열 ID NO: 3 및 서열 ID NO: 7을 짧은 SKGMQ 링커(서열 ID NO: 9) 또는 LKAQADI 링커(서열 ID NO: 10)에 의해 분리되게 내재화 펩티드 Ant(서열 ID NO: 1)에 혼합하였다. 결과적인 Ant-CC2 구조체는:CRQIKIWFQNRRMKWKKSKGMQLEDLRQQLQQAEEALVAKQELIDKLKEEAEQHKIV (서열 ID NO: 2)를 가지고, N-말단 시스테인은 내재화 및/또는 억제의 검출을 용이하게 하기 위하여 형광단에 연결을 위해서 부가된다. 결과적인 Ant-LZ 구조체는: CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADIYKADFQAERHAREKLVEKKEYLQEQLEQLQREFNKL (서열 ID NO: 6), 여기서 N-말단 시스테인은 내재화 및/또는 억제의 검출을 용이하게 하기 위하여 형광단에 연결을 위해서 부가된다.
본 발명에서 N-말단 시스테인은 부가적인 첨가물이므로 그 잔기는 최종 억제 펩티드에서는 생략될 수 있다. 또한, 본 발명에서 높은 형질 도입 가능성을 가진 펩티드(예를 들어, Ant)와 CC2 또는 LZ 펩티드 사이의 링커(linker)는 CC2 또는 LZ 펩티드의 억제 특성을 상당히 감소시키지 않는 한, 서열 및/또는 길이가 변화할 수 있다. 이를 위하여, 링커는 1-35 아미노산, 바람직하게는 2-25 아미노산, 더 바람직하게는 3-15 아미노산, 가장 바람직하게는 4-10 아미노산 정도의 길이일 수 있다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 링커 서열은 서열 ID NO: 9 또는 서열 ID NO: 10의 링커 서열이다.
상기한 것처럼, CC2의 동종 펩티드는 심지어 상기한 융합 구조체일 때라도 바람직하게는 꼬인-코일 모티프 구조를 보유하고 LZ의 동종 펩티드는 바람직하게는 나선형 모티프 구조를 보유한다. 이러한 것처럼, 본 발명은 각각 CC2 및 LZ 구조를 보유하고 NF-kB 경로를 억제하는 능력을 가진 서열 ID NO: 2(쥐로부터 유도) 및 서열 ID NO: 6(쥐로부터 유도) 및 서열 ID NO: 13(인간으로부터 유도) 및 서열 ID NO: 15(인간으로부터 유도)의 동종 펩티드를 상기한 동종성 한계를 내에서 포함한다.
본 발명의 실시 형태에서, 본 발명자는 야생형 NEMO의 N-말단 구역, 특히 도 1A에 도시된 NLM 보존 모티프(서열 ID NO: 12의 293-322 잔기)를 조사하였다. 이를 위하여, 이하의 서열들을 제조하였다(대응하는 서열에 대해서 표 1을 참조):
NLM-DR(서열 ID NO: 30)
Ant.NLM-DR(서열 ID NO: 31)
TatNLM-DR(서열 ID NO: 32)
R7-NLM-DR(서열 ID NO: 33)
R9-NLM-DR(서열 ID NO: 34)
NLM-DR은 도 1A에서 도시한 더 큰 30개 아미노산 보존 NLM 모티프로부터 유도된 21개 아미노산 "모티프"(및 대응하는 야생형 NLM은 같은 아미노산 영역을 포함한다)이다. NLM-DR은 야생형 서열에서 11 잔기의 아스파르트산이 아르기닌(표 1 및 서열 ID NO: 30 참조)으로 치환된다는 점에서 야생형 NLM 서열로부터 돌연변이되었다. 이러한 돌연변이는 구조 연구에서 확인한 것처럼 결과적인 폴리펩티드가 그 나선형인 펩티드의 안정화를 위한 분자내 염 다리를 용이하게 할 것이기 때문에 선택되었다.
원편광 이색성 분광분석(CD)으로부터, CC2 및 LZ 펩티드는 그 농도에 따라 나선형 구조를 채택한다는 것이 밝혀졌다. CC2는 LZ보다 더 안정한 나선을 만든다. RMN 및 Rayon X 회절 분석으로 CC2 구조가 확인되었다. CD 연구로부터, NLM-DR 펩티드는 항상 야생형 펩티드보다 더 안정한 나선으로 구성된다는 것을 알 수 있다.
비록 본 실시예에서 사용된 폴리펩티드가 21 아미노산 길이이긴 하지만, NLM 단편의 기능할 수 있는 크기는 15 아미노산 만큼 짧을 수 있다는 것이 본 발명에서 고려된다. 또한, 헬리시티(helicity) 및 펩티드와 그 분자 표적 사이의 분자내 상호 작용을 강화할 수 있는 NLM 폴리펩티드 서열에서의 돌연변이는 특히 관심사항이고 본 발명의 범위 내이다.
본 발명에서 펩티드의 단량체화(monomerization)를 매개하는 안테나페디아가 중요할 것이라는 것이 추측된다. 특히, 단량체화는 펩티드들이 NEMO 올리고머화를방해하는 것으로 추측된다.
핵 인자(Nuclear factor)-kB(NF-kB) 신호 전달은 감염성 반응, 종양 형성, 바이러스 감염, 세포 증식 및 아포토시스의 조절; 및 항원성 자극에서 B 및 T 림프구와 관계된 필수적인 신호 도입 경로이다(Ghosh, 1998, Annu. Rex.Immunol.; Karin, 1999, J.Biol.Chem.; Israel, 2000, Trends Cell Biol.; Santoro, 2003, EMBO J..). 본 발명의 펩티드는 감염성 반응, 종양 형성, 바이러스 감염의 조절 및/또는 치료, 세포 증식 및 아포토시스의 조절; 및 항원성 자극에서 B 또는 T 림프구의 조절에 유용하다. 따라서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상에 본 발명에 따른 펩티드를 투여함으로써 상기한 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, "치료를 필요로 하는 대상"이라는 용어는 인간, 가축, 농장 동물, 또는 일반적으로 야생 동물을 언급한다. 예를 들어, 그 대상은 사람, 개, 고양이, 말, 소, 쥐, 기니피그, 양, 돼지 등에서 선택될 수 있다.
명백하게도, 투여되는 펩티드의 양은 그것이 투여될 대상에 따라 다를 것이다. 대상이 사람인 경우에, 투여될 펩티드의 양은 환자의 나이, 증상의 심각성 및 환자의 과거 치료 경력을 포함하여 여러 가지 요소에 의해 좌우될 것이고 항상 투여하는 의사의 현명한 판단에 따라야 한다. 일반적으로, 인간 또는 다른 포유류에 단일 또는 나누어서 투여되는 본 발명의 화합물의 전체 일일 투여량은 예를 들어 펩티드 0.1 ㎎/㎏/일 내지 30 ㎎/㎏/일, 바람직하게는 0.1 ㎎/㎏/일 내지 20 ㎎/㎏/일, 더 바람직하게는 2 ㎎/㎏/일 내지 10 ㎎/㎏/일의 단일 또는 복합 투여량이다. 단일 투여 조성물은 일일 투여량을 구성하기 위해서 이러한 양 또는 그것의 약수를 포함할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 바람직한 투여량은 하루에 두 번 10 ㎎/환자이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 투여 경로는 정맥 내 투여이다.
본 발명의 펩티드는 또한 약제학적으로 투여될 수 있는 조성물의 성분으로서 투여될 수 있다. 달리 표현하면, 펩티드는 치료를 필요로 하는 대상에 투여를 위한 제형으로 존재할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 NF-kB 경로 억제 또는 감염성 반응, 종양 형성, 바이러스 감염, 세포 증식 및 아포토시스의 조절 및 항원성 자극의 치료를 위한 단독 활성 성분일 수 있다. 선택적으로, 본 조성물은 같은 질병을 치료하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드는 NF-kB 경로에 의해 유발되는 것이 아닌 질병의 치료를 위해 유용한 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물로 존재할 수 있다.
본 발명에서 투여를 위해 적절한 약제학적으로 효과적인 양의 펩티드는 단독으로 또는 약제학적으로 수용할 수 있는 하나 이상의 운반체와 조합하여 투여될 수 있다. 본 명세서에서 "약제학적으로 수용할 수 있는 운반체"라는 용어는 비독성, 비활성 고체, 반-고체 또는 액체 충전재, 희석제, 캡슐화된 물질 또는 어떤 형태의 형성 첨가제를 의미한다. 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체로서 작용할 수 있는 물질의 예로는 락토스, 글루코스 및 수크로오스와 같은 당류; 옥수수 녹말 및 감자 녹말과 같은 녹말; 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 그 유도체; 분말화된 트래거캔스 고무; 맥아(malt); 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 첨가제; 땅콩유, 목화씨유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수 기름 및 콩기름과 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천(agar); 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 발열성 물질 무함유 물(pyrogen-free water); 등장 염수; 링거액; 에틸 알콜 및 인산염 완충 용액이 있고, 소디움 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 다른 비독성의 양립할 수 있는 윤활제 뿐만 아니라 착색제, 방출제, 코팅제, 감미료, 조미 및 방향제, 방부제 및 항산화제 또한 제조자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
본 발명에서 투여를 위해 적절한 약제 조성물은 구강 분무형 또는 코분무형(nasal spray)으로서 인간 또는 다른 동물에게 경구, 직장(rectally), 비측(nasally), 비경구(parenterally)(예를 들어, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 또는 피하 주입 또는 임플란트(implant)), 조내(intracisternally), 질내(intravaginally), 복강내(intraperitoneal), 설하(sublingually), 국소(예를 들어, 분말, 연고, 또는 적제(滴劑)), 협측적(bucally)으로 투여될 수 있다. 약제 조성물은 각각의 투여 경로에 적절한 투약 형태로 제제될 수 있다.
구강 투여를 위한 액체 투약 형태는 약제학적으로 수용할 수 있는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 서스펜션, 시럽 및 엘릭시르(elixirs)를 포함한다. 활성 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드에 더하여, 액체 투약 형태는 관련 분야에서 통상적으로 사용되는 비활성 희석제를 포함할 수 있다. 상기 비활성 희석제는 물 또는 다른 용매, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 면화유, 땅콩유, 옥수수 기름, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로퍼퓨릴 알콜(tetrahydrofurfuryl alcohol), 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르와 같은 용화제 및 유화제, 및 그 혼합물을 포함한다. 경구 투여를 위한 액체 투약 형태는 습윤제, 유화 및 현수제, 감미료, 향료 및 방향제를 포함하는 보조제를 또한 포함할 수 있다. 경구 투여를 위한 다른 투약 형태는 예를 들어 소디움 카르복시-메틸셀룰로오스와 같은 비독성 현수제 존재시에 수상 매질에서 활성 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 포함하는 수성 서스펜션 및 적절한 식물유, 예를 들어 낙화생유(arachis oil) 존재시에 본 발명의 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 포함하는 유성 서스펜션을 포함할 수 있다.
주사 가능한 제조물, 예를 들어 멸균의 주사 가능한 수성 또는 유성 서스펜션은 적절한 분산 또는 습윤제 및 현가제를 사용하여 관련 분야에 알려진 것처럼 제제될 수 있다. 멸균의 주사 가능한 제조물은 또한 비독성의 비경구적으로 수용할 수 있는 희석제 또는 용매, 예를 들어 1,3-부탄디올(butanediol)에서 멸균의 주사 가능한 용액, 서스펜션 또는 에멀젼일 수 있다. 사용될 수 있는 수용가능한 운반체 및 용매 중에서는 물, 링거 용액, U.S.P. 및 염화나트륨 등장 용액일 수 있다. 또한, 멸균의 불휘발성 오일은 종래에 용매 또는 현가 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위하여 어떤 부드러운 불휘발성 오일은 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 포함하여 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사 가능한 물질의 제조에 사용된다.
주사 가능한 제형은 예를 들어 박테리아를 구속할 수 있는 필터를 통한 여과, 또는 멸균수 또는 사용하기 전에 다른 멸균 주사 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태인 멸균제를 첨가함으로써 멸균될 수 있다.
본 발명의 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드의 효과를 연장하기 위하여, 피하 또는 근육내 주입으로 펩티드의 흡수를 느리게 하는 것이 바람직하다. 이는 낮은 수용성을 가진 결정질 또는 무정형 물질의 액체 서스펜션을 사용함으로써 실행될 수 있다. NEMO로부터 유도된 폴리펩티드의 흡수율은 용해 비율, 즉 결정 크기 및 결정질 형태에 따라 좌우된다. 선택적으로, 약제를 오일 운반체에 용해시키거나 분산시키는 것은 비경구적으로 투여된 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드 형태의 흡수를 지연시킨다. 주사할 수 있는 저장 형태는 폴리락티드(polylactide)-폴리글리콜리드(polyglycolide)와 같은 생분해성 폴리머로 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 마이크로캡슐에 넣은 매트릭스를 형성함으로써 만들어진다. 폴리머에 대한 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드의 비율 및 사용된 특정 폴리머의 성질에 따라, NEMO로부터 유도된 폴리펩티드의 방출 비율을은 조절될 수 있다. 다른 생분해성 폴리머의 예는 폴리(오르소에스테르)(polyothoesters) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 주사 가능한 저장 제형은 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 신체 조직과 양립할 수 있는 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 포획함으로써 제조된다.
직장 또는 질 투여를 위한 조성물은 바람직하게는 본 발명의 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 외부 온도에서는 고체이지만 신체 온도에서 액체이어서 직장 또는 자궁에서 녹아 펩티드를 방출하는 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌제(座劑) 왁스와 같은 비염증성 수용체 또는 운반체와 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌약이다.
경구 투여를 위한 고체 투약 형태는 캡슐, 정제, 알약, 프릴(prill), 분말 및 알갱이를 포함한다. 이러한 고체 투약 형태에서, 펩티드는 적어도 하나의 비활성의 약제학적으로 수용할 수 있는 수용체 또는 운반체와 혼합된다. 또한, 고체 투약 형태는 하나 이상의 충전재, 희석제, 결합제, 습윤제, 분해제, 지연제, 흡수 촉진제, 침윤제, 흡수체 또는 윤활제를 포함할 수 있다. 적절한 충전재 또는 희석제의 예는 녹말, 락토스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 및 규산, 시트르산 나트륨 및 디칼슘 포스페이트를 포함한다. 적절한 결합제의 예는 마이크로결정질 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산(alginate), 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로오스, 및 아카시아(acacia)를 포함한다. 글리세롤은 적절한 습윤제의 예이다. 적절한 분해제의 예는 한천(agar-agar), 탄산 칼슘, 감자 또는 타포이카(tapoica) 녹말, 옥수수 녹말, 알긴산, 어떤 실리케이트 및 탄산 나트륨을 포함한다. 파라핀은 적절한 용해-지연제이다. 흡수 촉진제로서, 어떤 제4 암모늄 화합물이 사용될 수 있다. 적절한 침윤제의 예는 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트(glycerol monostearate)를 포함한다. 적절한 흡수제의 예는 카올린 및 벤토나이트 점토를 포함한다. 적절한 윤활제의 예는 활석, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 황산로릴나트륨(sodium lauryl sulfate)을 포함한다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우에, 투약 형태는 완충제(buffering agent)를 또한 포함할 수 있다.
원한다면 정제는 예를 들어 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트를 사용하는 장용제(enteric coating)를 포함할 수 있는 알려진 방법 및 첨가제를 사용하여 코팅될 수 있다. 정제는 본 발명의 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드의 지속적인 방출을 위하여 관련 분야에 잘 알려진 방식으로 제제될 수 있다. 이러한 정제는 원한다면 알려진 방법, 예를 들어 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트를 사용함으로써 장용제와 함께 제공될 수 있다. 정제는 임의적으로 불투명화제(opacifying agents)를 포함할 수 있고 활성 성분만을 또는 우선적으로 장(腸)의 어떤 부분에서 임의적으로 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 삽입(embedding) 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함할 수 있다.
유사하게, 캡슐, 예를 들어 부가된 첨가제를 가지거나 그렇지 않은 활성 펩티드를 포함하는 단단하거나 부드러운 젤라틴 캡슐은 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 원한다면 알려진 방식으로 장용제(enteric coating)를 제공받을 수 있다. 캡슐의 내용물은 활성 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드의 지속적인 방출을 위하여 알려진 방법으로 제제될 수 있다. 이러한 고체 투약 형태에서 활성 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드는 수크로오스, 락토오스 또는 녹말과 같은 적어도 하나의 비활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이러한 투약 형태는 보통 실행되는 것처럼 비활성 희석제를 제외한 부가 물질, 예를 들어 스테아르산 마그네슘 및 마이크로결정질 셀룰로오스와 같은 정제 윤활제 및 다른 정제 보조제를 또한 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 투약 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다. 그것들은 임의적으로 불투명화제를 포함할 수 있고 활성 성분만을 또는 우선적으로 장(腸)의 어느 부위에 임의적으로 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 삽입(embedding) 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함할 수 있다.
유사한 형태의 고체 조성물은 락토오스 또는 유당 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 및 이와 유사한 것과 같은 첨가제를 사용하는 부드럽거나 단단히 채워진 젤라틴 캡슐에서 충전재로서 사용될 수 있다.
원한다면, 본 발명의 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드는 느린 방출 또는 폴리머 매트릭스, 리포좀 및 마아크로스피어와 같은 표적화된 전달 시스템에 통합될 수 있다. 그것들은 예를 들어 박테리아를 억류할 수 있는 필터를 통한 여과, 또는 멸균수 또는 사용하기 전에 다른 멸균 주사 매질에서 용해되거나 분산될 수 있는 멸균의 고체 조성물 형태인 멸균제를 첨가함으로써 멸균될 수 있다.
NEMO로부터 유도된 폴리펩티드는 부가 첨가제를 가지거나 그렇지 않은 알갱이로 제제될 수 있다. 상기 알갱이는 환자에 의해 즉시 섭취될 수 있고 또는 섭취 전에 적절한 액체 운반체(예를 들어, 물)에 첨가될 수 있다. 상기 알갱이들은 액체 매질에서 분산을 용이하게 하기 위하여 분해제, 예를 들어 산(acid) 및 탄산염 또는 중탄산염에서 형성된 발포성 커플(effervescent couple)을 포함할 수 있다.
본 발명의 국소 또는 경피 투여를 위한 투약 형태는 연고, 페이스트(pastes), 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이액, 흡입제 또는 패치를 포함한다. 경피성 패치는 신체에 펩티드의 조절된 전달을 제공하는 부가적인 장점을 가진다. 전달 속도는 속도 조절막을 제공하거나 또는 펩티드를 폴리머 매트릭스 또는 겔에 분산함으로써 조절될 수 있다. 활성 성분은 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체 및 필요할 수 있는 어떤 방부제 또는 완충제와 멸균 상태에서 혼합된다. 적절한 매질에 펩티드를 용해하거나 분산하여 이러한 투약 형태를 만들 수 있다. 흡수 촉진제는 또한 피부를 통한 펩티드의 유동을 증가시킬 수 있다. 안제형(ophthalmic formulation), 귀약, 눈 연고, 분말 및 용액은 또한 본 발명의 범위 내인 것으로 고려된다.
국소 투여를 위한 투약 형태는 약학적으로 본 발명의 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드가 그 펩티드를 경피적으로 투여하기 위하여 피부와 접촉하도록 분산되는 매트릭스를 포함할 수 있다. 적절한 경피성 조성물은 디메틸 술폭시드 또는 프로필렌 글리콜과 같은 가능한 경피성 촉진제에 더하여, 약제학적으로 활성 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 국소 운반체, 즉 동물 및 식물 기름, 오일, 바셀린, 왁스, 파라핀, 녹말, 트래거캔스 고무, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 산화아연, 또는 그 혼합물과 혼합함으로써 제조될 수 있다. 선택적으로, 활성 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드는 약제학적으로 수용할 수 있는 페이스트(paste), 크림, 겔 또는 연고에 분산될 수 있다. 국소성 제형에 포함된 활성 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드의 양은 국소성 제형이 피부에 존재하도록 의도된 시간 동안 치료적으로 효과적인 양의 펩티드가 전달되도록 존재하여야 한다.
분말 및 스프레이액은 본 발명의 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드에 더하여, 락토스, 활석, 규산, 수산화알루미늄, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 분말, 또는 이러한 물질의 혼합물과 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 스프레이액은 클로로플루오르하이드로 카본과 같은 통상적인 추진제를 부가적으로 포함할 수 있다. 치료적인 활성 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드는 환자의 구강 또는 비강에 에어로졸로서 분산되는 조성물로 제제될 수 있다. 이러한 에어로졸은 휘발성 추진제를 포함하는 펌프 팩 또는 가압 팩에서 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 치료적인 활성 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드는 외부 공급원, 예를 들어 정맥 내 주입에 의하거나 신체내에 위치된 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드의 공급원으로부터 연속 주입에 의해 투여될 수도 있다. 내부 공급원은 예를 들어 삼투압에 의해 연속적으로 방출되어 주입되는 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 포함하는 이식된 저장소 및 (a) 예를 들어 도데카노에이트염(dodecanoate salt) 또는 친지방성 에스테르와 같은 매우 드문 수용성 유도체의 형태로 흡입되는 펩티드의 유성 서스펜션과 같은 액체 또는 (b) 주입되는 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 위해 예를 들어 합성 수지 또는 왁스 물질의 이식된 지지체 형태의 고체일 수 있는 임플란트(implants)를 포함한다. 그 지지체는 펩티드 전체 양을 포함하는 단일 본체 또는 전달될 펩티드의 각각의 양을 포함하는 일련의 여러 본체일 수 있다. 내부 공급원에 존재하는 활성 펩티드의 양은 치료적으로 효과적인 양의 펩티드가 오랫동안 전달되도록 존재하여야 한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드 혼합 구조체 및 하나 이상의 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체 또는 첨가제를 포함하는 조성물의 효과적인 양을 대상에서 NF-kB 신호 전달 경로에 의해 조절되는 질병을 조절하거나 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하는 방법에 관한 것이다.
상기 용도의 바람직한 형태에 따르면, NF-kB 신호 전달 경로에 의해 조절되는 질병은 감염성 반응, 종양 형성 및 바이러스 감염으로 구성된 그룹에서 선택된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드 혼합 구조체 및 하나 이상의 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체 또는 첨가제를 포함하는 조성물의 효과적인 양을 대상에서 세포 증식 또는 아포토시스를 조절하기 위한 약제의 제조에 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드 혼합 구조체 및 하나 이상의 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체 또는 첨가제를 포함하는 조성물의 효과적인 양을 대상에서 항원성 자극의 B 또는 T 림프구를 조절하기 위한 약제의 제조에 사용하는 방법에 관한 것이다.
상기 용도의 바람직한 형태에 따르면, 상기 치료를 요하는 대상은 인간이다.
상기 용도의 다른 바람직한 형태에 따르면, 상기 효과적인 양의 범위는 0.1 ㎎/㎏/일 내지 30 ㎎/㎏/일이다.
상기 용도의 다른 바람직한 형태에 따르면, 상기 조성물은 경구, 직장, 비강, 비경구, 조내(intracisternal), 질내, 복강내, 설하(sublingual), 국소 및 협측(bucal) 투여로 구성된 그룹으로부터 선택되는 형태로 투여된다.
상기 용도의 다른 바람직한 형태에 따르면, 상기 조성물은 바람직하게는 정맥내로 투여된다.
또한, 본 발명은:
a) 후보 폴리펩티드 서열을 확인하는 단계;
b) 상기 후보 폴리펩티드 서열을 스페이서(spacer) 서열을 통하여 높은 형질 도입 가능성을 가진 폴리펩티드에 연결함으로써 폴리펩티드 혼합 구조체를 형성하는 단계;
c) 세포 배지를 상기 폴리펩티드 혼합 구조체와 접촉시키는 단계;
d) NF-kB 신호 전달 경로의 활성을 모니터하는 단계;
e) 상기 폴리펩티드 혼합 구조체에 의한 상대적인 억제를 측정하기 위하여 상기 폴리펩티드 혼합 구조체 존재시의 NF-kB 신호 전달 경로의 활성을 상기 폴리펩티드 혼합 구조체 부재시의 NF-kB 신호 전달 경로의 활성과 비교하는 단계; 및
f) 상기 폴리펩티드 혼합 구조체에 의한 상대적 억제를 NEMO 올리고머화와 연관시키는 단계;에 의해 NEMO의 올리고머화를 조절하는 폴리펩티드를 확인하는 방법을 제공한다.
본 방법에서, 후보 펩티드 서열은 바람직하게는 꼬인-코일 또는 나선형 구조를 가진다. 더 바람직하게는, 후보 폴리펩티드 서열은 20-60 아미노산을 가진다. 또한, 후보 폴리펩티드 서열은 NEMO로부터 유도되는 것이 바람직하다.
상기한 것처럼, 스페이서 서열(spacer sequence)은 1-35 아미노산 길이를 가질 수 있고, 그러나 더 짧은 길이가 사용될 수 있다(supra). 스페이서 서열의 예는 서열 ID NO: 9 및 서열 ID NO: 10을 포함한다. 또한, 높은 형질 도입 가능성을 가진 폴리펩티드의 예는 서열 ID NO: 1의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드이다.
바람직한 실시 형태에서, 세포 배지는 NF-kB 의존성 β-갈락토시다아제 리포터 유전자로 감염된 pre-B 70Z/3 림프구를 포함한다.
폴리펩티드 혼합 구조체가 세포 배양에 포함된 세포에 실질적으로 통합되는 것을 보장하기 위하여, 폴리펩티드 혼합 구조체는 N-말단 시스테인 잔기를 가지는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드 혼합 구조체는 시스테인 잔기를 형광단(예를 들어, BODIPY)으로 화학적으로 반응시킴으로써 표지될 수 있고, 따라서 FACS와 같은 기술을 사용하여 세포 흡수를 관찰하는 것이 가능하다.
따라서, NEMO 올리고머화를 조절하는 폴리펩티드를 선별하는 방법은:
b-1) 상기 폴리펩티드 혼합 구조체를 표지하는 단계(labeling); 및
c-1) 표지된 폴리펩티드 혼합 구조체의 세포 흡수를 모니터하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 관련 분야의 숙련된 자는 생체 내에서 펩티드와 NEMO 연관을 밝히기 위하여 표지된 펩티드를 가지고 풀 다운(pull down) 실험에 의해 NF-kB 경로 억제와 NEMO 올리고머화 조절을 연관시킬 수 있을 것이다. NEMO 단백질과 연관된 이러한 펩티드의 올리고머 상태는 특징화될 수 있다(교차 결합, 겔 여과). 시험관 안에서, 형광 안테나페디아 표지된 CC2 또는 LZ 펩티드와 NEMO 올리고머화를 모방한 CC2 또는 LZ 펩티드의 연관으로 인한 비등방성 증가의 억제는 생체 내에서 NF-kB 경로를 억제하는 화합물을 테스트하는데 사용될 수 있다.
도 1은 NEMO 단백질의 기능 도메인을 도시한 도면,
도 2는 NEMO 펩티드 흡수의 흐름 세포 측정을 도시한 도면,
도 3은 세포를 투과할 수 있는 Ant-CC2 및 Ant-LZ 펩티드에 의한 LPS-유발된 NF-kB 활성의 억제를 도시한 도면,
도 4는 LPS에 반응한 NF-kB 활성의 특정 억제가 CC2 및 LZ 꼬인 코일의 소수성 중심에서의 몇몇 돌연변이에 의해 좌우됨을 도시한 도면,
도 5는 LZ 펩티드에 의한 NF-kB 활성의 억제가 특정의 꼬인 코일 가닥의 형 성으로 발생함을 도시한 도면,
도 6은 안테나페디아 서열을 가지거나 그렇지 않은 NEMO에서 유래된 폴리펩티드의 올리고머화 특성을 도시한 도면,
도 7은 CC2 펩티드에 대한 Ant-CC2 및 Ant-LZ 펩티드의 연관을 도시한 도면, 및
도 8은 Ant-CC2 및 Ant-LZ 펩티드에 의해 망막모세포종 세포주 Y79에서 유도된 세포사(cell death)를 도시한 도면이다.
본 발명을 일반적으로 기술한 것에 더하여, 본 발명은 본 발명을 예시할 뿐 제한하고자 제공된 것이 아닌 이하의 특정 예를 참조할 때 더 잘 이해될 것이다.
물질 및 방법
세포 배양, 안정한 트랜스펙션 및 세포주
쥐 pre-B 70Z/3의 성장 조건은 Courtois et al., 1997 Mol. cell. Biol.에 기술되었다. 70Z3-C3 안정한 세포주는 IL-2 프로모터(Fiering et al., 1990)에 NF-kB 자리의 세 탄뎀(tandem) 복사본을 포함하는 플라스미드 cx12lacZ-kB (a kind gift from G.R. Crabtree)를 가지고, Courtois et al. 에 기술된 전기천공법( electroporation)으로 제조되었다. 인간 망막모세포종 세포주 Y79은 American Type Culture Collection (Manassas, VA)으로부터 구입하였고 페니실린 100 U/㎖, 스트 렙토마이신 100 ㎍/㎖ 및 10% 우태 아 혈청(fetal calf serum)(FCS)이 공급된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
FACS 분석
0.5 x 106 70Z/3-C3 세포 0.5 ㎖를 37℃에서 도면 제목에 지시된 여러 농도의 펩티드와 여러 번 배양하였다. 세포 서스펜션을 실온에서 1,000 x g로 원심분리 하였고 세포 펠렛은 PBS 버퍼(1㎖)로 세 번 세척하였으며 , 마지막으로 0.1% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS 완충용액 500 ㎕로 재분배시켰다. 형광 분석은 FACSCalibur(BD Biosciences)로 실행하였고 샘플당 15,000 이벤트(events)의 최소량이 선택되었다. 모든 실험을 두 번씩 반복하였다.
펩티드 합성 및 정제
펩티드는 Mousson et al. 2002 (Biochemistry, 41 p13611- p13616)에 기술된 것처럼, 연속 흐름 Fmoc/tBu chemistry (Chan, WC, and White, P.D. (2000); Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis.. A pratical approach) on an Applied Biosystems (Foster City, CA) Pioneer peptide synthesiser을 사용하여 합성되었다. 모든 화학 시약은 Applied Biosystems에서 구입하였다. 모든 펩티드는 N-말단이 아세틸기로 차단되었고 C-말단은 아미드로 차단되었다. 단일-여분의 시스테인 잔기는 연속적인 특정 라벨링을 위하여 펩티드의 N-말단에 통합되었다(표 1 참조).
NEMO로부터 유도된 펩티드 서열
명칭 서열1 이론적 질량(Da) 실험적 질량(Da) NEMO 인간 서열 구성
BODIPY-Ant B-CRQIKIWFQNRRMKWKK (서열 ID NO: 1) 2805.19 2805.06±0.52
BODIPY-Ant-CC2 (WT) B-CRQIKIWFQNRRMKWKKSKGMQL EDLRQQLQQAEEALVAKQELIDKLKEEAEQHKIV (서열 ID NO: 2) 7433.01 7433.33±0.46 B-CRQIKIWFQNRRMKWKKSKGMQL EDL K QQLQQAEEALVAKQE V IDKLKEEAEQHKIV (서열 ID NO: 13)
CC2 (WT) SKGMQLEDLRQQLQQAEEALVAK QELIDKLKEEAEQHKIV (서열 ID NO: 3) 4155.75 4155.86±0.53 SKGMQLEDL K QQLQQAEEALVAK QE V IDKLKEEAEQHKIV (서열 ID NO: 14)
BODIPY-Ant-CC2 (Mu) B-CRQIKIWFQNRRMKWKKSKGMQLEDLRQQ G QQAEEA G VAKQEL G DKLKEEAEQHKIV (서열 ID NO: 4) 7265.18 7265.04±0.35
CC2 (Mu) SKGMQLEDLRQQ G QQAEEA G VAKQEL G DKLKEEAEQHKIV (서열 ID NO: 5) 3987.43 3987.43±0.55
BODIPY-Ant-LZ (WT) B-CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADIYKADFQAERHAREKLVEKKEYLQEQLEQLQREFNKL (서열 ID NO: 6) 8064.2 8063.9± 0.48 B-CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADIYKADFQAE Q AREKL A EKKE L LQEQLEQLQRE YS KL (서열 ID NO: 15)
LZ (WT) LKAQADIYKADFQAERHAREKLVEKKEYLQEQLEQLQREFNKL (서열 ID NO: 7) 5318.08 5318.21±0.5 LKAQADIYKADFQAER Q AREKL A EKKE L LQEQLEQLQRE YS KL (서열 ID NO: 16)
BODIPY-Ant-LZ (Mu) B-CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADIYKADFQAERHAREKLVEKKEY S QEQLEQ S QREFNKL (서열 ID NO: 8) 8012.04 8011.98±0.26
LZ (Mu) LKAQADIYKADFQAERHAREKLVEKKEY S QEQLEQ S QREFNKL (서열 ID NO: 9) 5265.92 5268.82±0.18
BODIPY-Ant-GCN4 (WT) B-CRQIKIWFQNRRMKWKKSKGMQR MKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER (서열 ID NO: 10) 7315.48 7314.76±0.40
NLM-DR LKAQADIYKA R FQAERHAREK (서열 ID NO: 30) 2570.94 2570.78+/-0.21 LKAQADIYKA R FQAERQAREK (서열 ID NO: 35)
BODIPY-Ant-NLM-DR B-CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADIYKA R FQAERHAREK (서열 ID NO: 31) 5317.08 5316.38+/-0.26 B-CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADIYKA R FQAERQAREK (서열 ID NO: 36)
BODIPY-TAT-NLM-DR B-CYGRKKRRQRRRLKAQADIYKA R FQAERHAREK (서열 ID NO: 32) 4630.17 4630.11+/-0.22 B-CYGRKKRRQRRRLKAQADIYKA R FQAERQAREK (서열 ID NO: 37)
BODIPY-R7-NLM-DR B-CRRRRRRRLKAQADIYKA R FQAERHAREK (서열 ID NO: 33) 4181.65 4181.60+/-0.69 B-CRRRRRRRLKAQADIYKA R FQAERQAREK (서열 ID NO: 38)
BODIPY-R9-NLM-DR B-CRRRRRRRRRLKAQADIYKA R FQAERHAREK (서열 ID NO: 34) 4494.02 4493.81+/-0.23 B-CRRRRRRRRRLKAQADIYKA R FQAERQAREK (서열 ID NO: 39)
(1) 모든 펩티드에서 N-말단은 "물질 및 방법"에 기술된 것처럼 말레이미드(maleimide)와 특정 펩티드 커플링의 편의를 위해 시스테인 잔기를 포함한다. NEMO 서열(평문)에 혼합된 안테나페디아 서열, TAT 및 폴리-아르기닌(R7 또는 R9)은 굵은 글씨체로 표시되었다. 꼬인 코일 서열에 관련된 잔기는 밑줄이 그어졌고 CC2 및 LZ 변이체 및 NLM-DR에서 치환된 잔기는 굵은 글씨체로 밑줄이 그어졌다. B=Bodipy(C-말단 Bodipy 변형은 서열 리스팅의 서열 배열에서 생략되었다). 본 발명의 범위 내에서 Bodipy 및/또는 N-말단 시스테인은 제거될 수 있고 기술된 것처럼 사용될 수 있다는 것이 고려된다.
정제하지 않은(crude) 펩티드들은 Nucleoprep 20 μM C18 100 Å 예비 컬럼 상에서 0.08% 수성 트리플루오르아세트산(TFA)(pH 2)의 아세토니트릴(1%/분)의 선형 기울기를 18 ㎖/분의 흐름 속도로 60분 동안 사용하여 역상 중압액체크로마토그래피(MPLC)에 의해 직접적으로 정제되었다. 펩티드의 순도는 0.08% 수성 TFA(pH 2)의 아세토니트릴(0.5%/분) 선형 기울기를 1 ㎖/분의 흐름 속도로 20분 동안 사용하여, nucleosil 5 μM C18 300 Å 분석 컬럼상에서 증명되었다. 형광단 bodipy®FL N-(2 아미노-에틸)말레이미드(분자 프로브)를 설프하이드릴기에 대한 접합은 어두운 곳에서 30분 동안 50 mM 아세테이트 버퍼에서 pH 6의 동몰량(equimolar) 조건 하에 이루어졌다. 그런 다음, 그 혼합물을 BODIPY 접합된 펩티드의 정제를 위하여 Nucleoprep 20 μM C18 100 Å 예비 컬럼 상에 로딩하였다. 세포사(cell death) 실험에서, BODIPY-라벨링이 결핍된 모든 펩티드들은 시스테인 잔기의 어떤 산화를 방지하기 위하여 요오드아세트아미드(iodoacetamide)로 처리하였다. 모든 정제된 펩티드들은 아미노산 분석에 의해 정량되었고 마지막으로 양이온 전자분무 이온화 질량 분석기(electrospray ionization/mass spectrometry)(ES+)를 사용하여 특성이 부여되었다. 일단 펩티드의 완전성 및 커플링 효율이 질량 분석법으로 증명되면, 펩티드의 흡광 계수는 펩티드가 방향족 잔기(표 1 참조)를 포함할 때 280 ㎚ 및 505 ㎚에서 측정하였다. 라벨링의 안정성은 280 ㎚ 및 505 ㎚에서 펩티드의 흡광도를 주기적으로 측정하여 흡수율을 계산함으로써 모니터되었다. 모든 펩티드들을 물에 용해시켜 2 mM로 저장하였다.
NF-kB 억제 분석
첫 번째 과정으로, 10% 우태 아 혈청(FCS) 및 50 μM β-메르캅토에탄올이 보충된 220 ㎕ RPMI 1640에서 2.2 x 105 70Z/3-C3 세포들을 96-웰 플레이트에 위치시켰고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 여러 농도의 펩티드(0에서 20μM)와 함께 배양하였다. 2시간 후 각 세포 샘플의 동일 분량(100 ㎕)을 각각 105 세포를 포함하는 두 웰에 옮겼다. 그런 다음, 세포 시료 중 하나를 0.5 ㎍/㎖ 최종 농도로 Salmonella abortus(Sigma)의 리포폴리사카라이드로 5시간 동안 처리하였고, 나머지 하나는 남겨 두었다. 5시간 후, 세포들을 실온에서 400 x g로 5분 동안 원심분리 하였고 세포 펠렛을 원심 분리로 차가운 PBS 버퍼(250 1㎕)를 사용하여 세 번 세척하였다. 그런 다음, 세포들은 용해 버퍼(8 mM 염화마그네슘, 1 mM 디티오에리트리톨(dithioerythritol), 1% Triton X-100, 15% 글리세롤 및 프로테아제 억제 혼합물(Roche)를 포함하는 25 mM tris-인산염 버퍼, pH 7.8)에서 용해하였고, 용해물을 깨끗하게 하기 위하여 샘플들을 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 상등액은 얼음에 보관하였으며, 30㎕는 화학적 발광기질(Chemiluminescent substrate)(BD Biosciences Clontech, Bronstein 외, 1989)로서 galacton-star를 사용하여 판 루미노미터(plate luminometer)(Berthold)로 β-갈락토시다아제 활성을 측정하여 분석하였다. 반응의 배경은 1시간 동안 용해 버퍼 30㎕를 반응 버퍼(196㎕)와 혼합함으로써 측정되었고 galacton-star 기질(4㎕)은 BD Biosciences에서 제공되었다. 두 번째 과정 및 더 엄격한 분석으로, 70Z/3-C3 세포(매질 220㎕에서 2.2 x 105)를 2시간 동안의 펩티드 내재화 후에 실온에서 400 x g로 원심 분리하였고 세포 펠렛을 원심분리로 PBS 200㎕를 사용하여 세 번 세척하였다. 그런 다음 세포들은 완전한 매질로 세 번 희석하였고, 적어도 24 시간 동안 배양하였다. 그 다음의 단계들은 첫 번째 과정과 동일하다.
세포사(Cell death) 분석
세포사의 검출은 Promega에 의해 제공된 MTS 분석을 사용하여 실행되었다(CellTiter 96® AQueous one solution cell proliferation assay). 간략하게, 0.3 x 106 Y79 세포주 450㎕를 야생형 Ant-CC2 및 Ant-LZ 펩티드(0.1에서 20μM) 또는 그 돌연변이체 Ant-CC2(Mu), Ant-LZ(Mu) 또는 Ant 50㎕로 처리하거나 또는 37℃에서 세럼이 없는 RPMI 매질에 처리하지 않은채로 두었다. 1 또는 14시간의 배양 후에, 세포 서스펜션 중 하나(200㎕. 0.12 x 106 세포)를 96-웰 플레이트에 옮겼고 MTS 화합물 및 페나진 에토설페이트(phenazine ethosulfate)를 포함하는 MTS 용액(40 ㎕)과 혼합하였다. 2시간 후, 살아 있는 세포에 의해 생산된 포마즌(Formazan)의 양은 490 nm 흡광도에서 자동화된 마이크로플레이트 리더(Bio-TeK Instruments, INC)를 사용하여 측정하였다. 세포 생존은 현미경으로 관찰되었고 비처리된 대조구의 백분율 값으로 평가되었다. 반응의 배경은 MTS 용액을 세포가 없는 RPMI 매질과 혼합함으로써 측정되었다. 세포사 분석의 민감도를 증가시키기 위하여, 본 발명자는 형광단의 흡수 스펙트럼이 포마즌의 흡수 스펙트럼과 겹치기 때문에 BODIFY-라벨링이 없는 펩티드를 사용하였다. 모든 실험은 두 번씩 반복하였고 각 실험 조건은 각 실험에서 중복 웰에서 반복되었다.
분석적인 겔 여과 실험
펩티드의 올리고머 상태는 Traincard et al., 2003에 기술된 것처럼 여과에 의해 측정되었다. 간략히 말해서, 샘플 500 ㎕를 200 mM NaCl 및 0.1 mM DDM을 포함하는 pH 8.0 Tris-HCl 50 mM로 평형화된 Superdex 75 HR 10/30 컬럼에서, 0.4 ㎖/분의 일정 흐름 속도로 로딩하였다. DDM 세제의 존재는 컬럼에서 흡수를 최소화하고 펩티드 회수를 증가시키기 위하여 평형 버퍼에 부가되었다. 컬럼은 블루 덱스트란(dextran) 2000(void volume), 디티오에리트리톨(dithioerythritol)(total volume), 소혈청알부민(bovine serum albumin)(67 kDa, Rs = 35.2 Å), 난(卵)알부민(ovalbumine)(43 kDa, Rs = 27.5 Å), 키모트립시노겐(chymotrypsinogen) A (25 kDa, Rs = 21.1 Å), 리보뉴클레아제(ribonuclease) A (13.7 kDa, Rs = 16.4 Å), 시토크롬(cytochrome) C (12.4 kDa, Rs = 17.7 Å) 및 아프로티닌(aprotinin)(6.5 KDa, Rs = 13.5 Å)을 가진 같은 평형 버퍼에서 교정되었다.
형광 비등방성 측정
비등방성 측정(Anisotropy measurements)은 여기 및 방출 빔을 위한 편광자를 구비한 PTI Quantamaster 형광계로 실행되었다. 이러한 기구는 L-형상의 PMT를 사용한다. 모든 실험은 각각 495 ㎚ 및 520 ㎚인 여기 및 방출 파장으로 22℃에서 1 센티미터 통로-길이 큐빗에서 실행되었다. 여기 및 방출 단색화 장치의 대역은 각각 2 및 4 ㎚로 설정되었다. 정상 상태 형광 비등방성은 밀리비등방성(millianisotropy)(mA)로 표현되었고 다음의 식에 따라 계산되었다: (1) A= (IVV-GIVH)/(IVV+2GIVH) ; (2) G=IHV/IHH.; 여기서 A는 비등방성이고, G는 파장에 의존하는 왜곡에 대한 교정 인자이며 I는 형광 강도이다(각각 여기 및 방출 편광자에서 수직 및 수평 포지셔닝에 대한 기입). 실험은 적어도 2번 실행되었고 각각의 데이타는 2분간의 20 기록의 결과이다. 모든 측정은 150 mM KCl을 포함하는 pH 8의 50 mM Tris-HCl 버퍼에서 실행되었다. 본 발명자는 사용된 BODIPY-Ant-CC2 및 BODIPY-Ant LZ 농도(각각 1 μM 및 0.1 μM)에서, 필터 효과는 무시할 수 있다는 것을 증명하였다. BODIPY-Ant-CC2 펩티드는 비등방성 측정 전에 22 ℃에서 단독으로 또는 증가하는 농도(1-125 μM)의 CC2와 함께 밤새도록 미리 배양되었다. BODIPY-Ant LZ 펩티드(100 nM)는 비등방성 측정 전에 22 ℃에서 단독으로 또는 CC2 10 μM 및 100 μM(도 7 참조)과 함께 밤새도록 미리 배양되었다. 해리 일정 변수는 Kaleidagraph nonlinear regression software(Synergy Software, reading PA)를 사용하여 Agou et al. (2004, J Biol Chem.)에 기술된 것처럼 결합 등온 방정식에 비등방성 데이타를 전체적으로 맞춤으로써 추정되었다. 결합 화학양론, n은 비등방성 데이타의 감소 및 평평한 구역을 통해서 그어진 절단선(도 7의 점선)으로부터 추정되었다.
결과
NF-kB 활성을 차단하는 NEMO로부터 유도된 펩티드의 합리적인 계획
본 발명자는 NEMO의 최소 삼량체화 도메인이 서열 251에서 337을 포함한다는 것을 이미 기술하였다(도 1A). 이 영역은 각각 N-말단 및 C-말단에서 CC2(253-285잔기) 및 LZ(301-337 잔기)로 명명된 약 35 잔기의 두 개의 꼬인-코일 서열을 포함한다. 비록 최소 올리고머화 도메인의 구조가 이미 결정되지는 않았지만, 형광 편광법(fluorescence polarization method)과 관련된 여러 생화학 연구로부터 CC2/LZ 삼량체가 아마도 역평행 기원(Traincard, 2003, submitted)으로 가까이 쌓인 CC2 및 LZ 꼬인-코일로 구성된 여섯 가닥의 나선형 다발을 형성할 것이라는 것을 제안하게 되었다. 또한, PSI-BLAST 연구로부터 네 개의 다른 단백질, 즉 ABIN-1(Heyninck, 1999, J. Cell. Biol.), ABIN-2/NAF(Van Huffel, 2001, J. Biol. Chem), ABIN-3/LIND(Staege, 2001, Immunogenetics) 및 NRP/optineurin (Schwamborn, 2000, J. Biol. Chem)(도 1B)와 공유되는 "NEMO 같은 모티프"(NLM)로 불리는 20 잔기의 보존된 모티프를 포함한다는 것이 밝혀졌다. 흥미롭게도, ABIN-1(Heyninck, 2003, FEBS Letters), NEMO의 C-말단 도메인(Le Page, 2001, Virology) 및 ABIN-2(Liu WK, 2003, Biochemical Journal) 또는 ABIN-3/LIND (Heyninck, 2003, FEBS letters) 단백질의 보존된 모티프를 포함하는 이러한 단백질 모두는 세포에서 과다 발현되었을 때 지배적인 부정적 방식으로 NF-kB 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. NF-kB와 상호작용하는 ABIN 펩티드를 공개하는 두 개의 부가 참고 문헌은 국제 특허 WO 99/57133 및 WO 03/00280이다.
NEMO 올리고머화를 차단하는 것이 NF-kB 활성을 억제하는 가능성 있는 치료 전략이기 때문에, 본 발명자는 CC2 또는 LZ 서열을 모방하는 NEMO로부터 유도된 파트너 펩티드를 고안하였다(표 1). CC2 펩티드와 달리, LZ 펩티드는 N-말단에서 NLM 모티프를 또한 포함한다는 점에서 흥미롭다. 세포로의 모든 펩티드 흡수를 조절하기 위하여, 본 발명자는 안테나페디아/페너트라틴(Penetratin)(Ant)의 세 번째 나선으로부터 유도된 16-아미노산 서열로 구성된 펩티드 N-말단에 기능적인 유사체를 접합시켰다. 이러한 양친성(amphipatic) 나선은 내재화 벡터(Prochiantz, 2000, Curr. Opin. Cell Biol.)로서 작동한다. 대부분의 안테나페디아 혼합 펩티드는 각 펩티드의 세포로의 도입 가능성을 분석하기 위하여 BODIPY 형광단으로 표지되었다. 특정 라벨링은 단일 시스테인 잔기를 N-말단의 극단에 부가함으로써 실행되었고 서열 완전성은 질량 분석법(표 1 및 "물질 및 방법" 참조)에 의해 증명되었다.
안테나페디아 혼합 펩티드에 의해 조정된 NEMO로부터 유도된 펩티드의 세포 흡수
BODIPY 표지된 NEMO 펩티드의 살아있는 세포로의 흡수는 세포 내재화를 정량하기 위해 사용되는 종래 수단인 형광 활성화 세포 분리법(fluorescence-activated cell sorting: FACS)에 의해 모니터되었다. 도 2A는 Ant-CC2(WT), Ant-CC2(Mu), Ant-LZ(WT) or Ant-LZ(Mu) BODIPY-펩티드로 2시간 동안 37℃에서 처리된 세포의 FACS 분석을 도시하고, 비처리된 세포 및 같은 농도의 자유 BODIPY 또는 BODIPY-접합된 BSA로 처리된 세포의 자가 형광의 FACS 분석과 비교되었다. 펩티드 및 단백질을 포유류 세포에 도입하는 안테나페디아 펩티드의 역할에 일치하게, 70Z3-C3-세포주 100%는 네 개의 서로 다른 NEMO 펩티드에 의해 유사하게 도입되었고, 이는 처리된 개체의 모든 세포들이 거의 동일한 NEMO로부터 유도된 BODIPY-펩티드의 세포내 농도를 가진다는 것을 제안한다. 비교 분석은 비처리된 세포 및 BODIPY-BSA 또는 자유 BODIPY로 처리된 세포가 유사한 세포 형광을 나타낸다는 것을 지시하고, 이는 FACS 분석전의 우리의 과도한 세정 프로토콜이 NEMO 펩티드 내재화에서 표면 결합된 펩티드의 어떠한 기여도 최소화하는데 최적이었다는 것을 증명한다("물질 및 방법" 참조). 따라서, 이러한 데이타는 관측된 세포 형광 신호가 도입된 NEMO 펩티드의 세포내 농도를 대부분 반영하지만 막 표면으로의 비특이적인 흡수를 반영하지 않는다는 것을 제안한다.
본 발명자는 다음으로 다른 NEMO 펩티드의 도입도 유사한 방식으로 발생할 것이라는 생각을 품고서 Ant-CC2 BODIPY 펩티드에 대한 세포 흡수의 속도 및 농도 의존성을 조사하였다(도 2B 및 도 2C). 37℃에서 0.2, 2 또는 20 μM BODIPY-Ant-CC2 펩티드로 처리된 70Z3-C3의 첨가 후 5시간 FACS 분석은 문헌(Lindsay, 2002, Current Opinion in Pharmacology)에 기록된 것처럼 안테나페디아 혼합 펩티드의 배양된 농도의 함수로서 세포내 농도의 선형 의존성을 기술한다. 명백하게도, 37℃에서 Ant-CC2 20 μM로 처리된 세포들은 30분 만에 이미 최대 세포내 농도에 도달하였고 5시간에 도달할 때까지 변하지 않았다. LPS에 반응하여 강한 NF-kB 활성을 유도하는 시간은 3-5 시간의 세포 처리 시간을 필요로 하기 때문에, 이러한 결과는 각 펩티드의 세포내 농도가 LPS 자극 동안에 일정하게 유지됨을 나타낸다.
세포를 투과할 수 있는 CC2 및 LZ에 의한 LPS-유도된 NF-kB 활성의 특정적 억제
세포를 투과할 수 있는 BODIPY-Ant-CC2 및 BODIPY-Ant-LZ 펩티드에 의한 LPS-유도된 NF-kB 활성의 억제 가능성을 분석하기 위하여, 본 발명자는 쥐 pre-B 70Z3 세포주를 NF-kB 전사 인자의 조절하에 β-갈락토시다아제 리포터 유전자를 품고 있는 p12XlacZ-kB로 안정적으로 감염시켰다. 결과적인 세포주 70Z3-C3를 5시간 동안 LPS(3㎍/㎖)로 처리하였을 때, LacZ 유전자의 100배-활성이 관찰되었고, 이는 우리의 세포 분석이 상당한 감도로 LPS에 반응하는 NF-kB 활성을 측정함을 나타낸다(도 3A, 대조구 "펩티드 없음"). 흥미롭게도 두 개의 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드 20 μM로 세포 배양했을 때 NF-kB 활성을 상당히 감소시켰다. 이러한 감소는 BODIPY-Ant-CC2와 비교하여 BODIPY-Ant-LZ 존재시에 더 강했다. 억제 효과는 본질적으로 N-말단 BODIPY 표지(BODIPY-Ant 또는 Ant)를 포함하거나 그렇지 않은 격리된 및/또는 정제된 안테나페디아 펩티드의 존재가 대조구(도 3A)처럼 같은 정도로 NK-kB 활성을 유도하기 때문에 NEMO 서열이 원인이다. LPS 부재시에 측정된 기초 NK-kB 활성은 모든 샘플에서 매우 유사하였고, 이는 CC2 및 LZ 펩티드 둘 다가 내재적인 기초 NF-kB 활성에 영향을 미치지 않고 LPS에 대응성(responsiveness)을 파괴한다는 것을 주의하라. 이는 주로 NF-kB의 억제에 의해 유도된 아포토시스에 기인하는 생체 내 세포 독성을 최소화하는데 필수적이다(Chen, 2003, Nature Med.).
BODIPY-Ant-LZ 또는 BODIPY-Ant-CC2 펩티드 중 어느 것이 가장 효과적인 억제제인지를 결정하기 위하여, 본 발명자는 다음으로 각 펩티드의 농도 의존적인 억제를 측정하였다. 도 3B에 도시된 것처럼, 양 NEMO 펩티드는 LPS에 반응하여 NF-kB 투여 의존적인 억제를 나타낸다. BODIPY-Ant-LZ는 BODIPY-Ant-CC2보다 훨씬 더 큰 정도로 NF-kB를 억제하였고 IC50 값은 각각 3 μM 및 22 μM이었다(도 3C). 이러한 상당한 차이는 LZ 서열에 포함된 NLM 모티프에 의해 설명될 수 있다. NEMO 표적의 세포내 성질에 일치하게, 안테나페디아 단백질 전위 도메인(PTD)에 혼합되지 않은 LZ 및 CC2 펩티드 둘 다는 대조구로서 같은 정도의 활성을 나타내었고(도 3D), 이는 NEMO로부터 유도된 펩티드가 NF-kB의 억제를 위해 세포막을 통과해야 함을 확인한다. 이러한 결과들을 종합해 보면, NEMO 올리고머화 도메인의 두 꼬인-코일 서열을 모방한 펩티드들은 LPS에 반응하여 NF-kB 활성의 능력있는 펩티드 억제제라는 것을 나타낸다.
LZ 및 CC2 꼬인-코일의 소수성 중심의 돌연변이는 NF-kB 신호 전달 경로의 특이적 억제를 차단한다.
이론적으로, 만약 BODIPY-Ant-LZ 또는 BODIPY-Ant-CC2 펩티드가 NEMO 올리고머화 도메인에 특정적인 결합을 통해서 NF-kB 활성을 억제한다면, 꼬인 코일 연결을 차단하는 돌연변이는 NF-kB 활성을 억제하는 능력이 손상될 것이다. α-나선 꼬인-코일 상호 작용은 상당히 연구되었고 그 특이적인 조립을 지배하는 대부분의 규칙은 잘 기록되었다(Vinson, 2002, Mol. Cell. Biol.). 7개 반복의 첫 번째 (a) 및 네 번째 위치 (d)에 의해 표현되는 꼬인-코일 경계면은 일반적으로 소수성 아미노산에 의해 점유된다. 프롤린 또는 글리신은 나선 구조를 보존하기 위하여 상당히 배제된다. 중심 극성 잔기는 특히 d 위치에 변화가 발생할 때 루신 교체에 비례하여 불안정하다. 이러한 규칙을 고려하여, 본 발명자는 d 위치에서 두 돌연변이 L->S를 포함하는 BODIPY-Ant-LZ 변이체(BODIPY-Ant-LZ (Mu)) 및 a 위치에서 두 돌연변이 L->G 및 하나의 돌연변이 I->G를 포함하는 BODIPY-Ant-CC2 변이체(BODIPY-Ant-CC2 (Mu))(도 4A 및 4B, 및 표 1)를 합성하였다. 이러한 돌연변이들의 NF-kB 활성에 대한 억제 가능성을 시험하기 위해서, 본 발명자는 2시간 동안의 펩티드 내재화 후에 세포외 매질에 존재하는 어떤 잔류 펩티드를 제거하기 위하여 70Z3-C3의 과도한 세척으로 구성된 더 엄격한 세포 분석을 개발하였다. 세포들을 LPS-유도된 NF-kB 활성 전에 적어도 24시간 동안 배양하였다. 이러한 방식으로, 수용체 결합 LPS와 펩티드 간섭은 배제되었다. 상기한 세포 분석에서처럼, BODIPY-Ant-CC2(WT) 및 BODIDY-Ant-LZ(WT) 역시 10 μM 농도로 사용될 때 NF-kB 활성을 각각 1.7 배 및 5.8배 억제하였다(도 4A 및 4B). 이는 펩티드들이 LPS의 수용체 결합에 경쟁적으로 작용하지 않음을 의미한다. 예상했던 것처럼, CC2 변이체(BODIPY-Ant-CC2(Mu))의 존재는 β-갈락토시다아제 활성이 대조구(도 4A, 펩티드가 없음)의 활성과 등가이기 때문에 NF-kB 활성에 영향을 미치지 않았다. LPS에 반응하여, NF-kB는 BODIPY-Ant-LZ 변이체 존재시에 야생형이 존재하는 경우보다 더 강하게 활성화되었다. 그러나, BODIPY-Ant-CC2(Mu)와 달리, LZ 변이체 대조구와 비교했을 때 약간의 억제가 관찰되었다(15%). 종합해볼 때, 이러한 데이타는 CC2 및 LZ 변이체가 야생형처럼 LPS-유도된 NF-kB 활성을 억제할 수 없음을 보여준다.
NF-kB 활성의 억제는 LZ 펩티드의 특정적인 꼬인-코일 상호 작용에 의해 조절된다.
프로그램 MULTICOIL(Wolf, 1997, Protein Science)을 사용한 계산적인 분석으로부터 서열화된 게놈에서 발견된 모든 추정 ORFs의 5% 이상이 꼬인-코일 모티프를 가지는 것으로 예견되었고(Newman, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 단백질에서 약 2-4% 아미노산이 꼬인-코일 폴드를 채용하는 것(Berger, 1995, Proc.Natl.Acad.Sci. USA)으로 예상되었다. 이러한 풍부함은 NEMO로부터 유도된 LZ 펩티드가 생체 안에서 특이성을 짝짖는 꼬인-코일 상호작용을 유지하는지에 대한 의문을 불러 일으킨다. 이런 의문을 해결하기 위하여, 본 발명자는 GCN4 루이신 지퍼 서열을 모방한 다른 꼬인-코일 펩티드를 합성하였고 NF-kB 활성을 억제하는 능력을 시험하였다. BODIPY-Ant-GCN4는 펩티드 전달을 용이하게 하기 위하여 그 N-말단에 안테나페디아 서열 및 CC2 서열과 동일한 짧은 SKGMQ 링커(서열 ID NO: 9)를 포함하였다(표 1). FACS로 세포내 흡수를 모니터하기 위하여 BODIPY로 그 N-말단을 표지하였다(데이타는 도시하지 않음). GCN4 펩티드는 NEMO의 LZ 서열과 서열 유사성이 낮지만(22%) 동일한 잔기는 대부분 d 위치에서 루이신으로 표현되었다(도 5). 이러한 잔기들은 꼬인-코일 올리고머화 안정화를 위한 대부분의 에너지에 기여한다(Vinson, 2002, Mol. Cell. Biol.). 꼬인-코일 특이성을 위해 중요한 위치는 한 쌍의 서로 다른 아미노산으로 구성된다(Vinson, 2002, Mol. Cell. Biol). GCN4는 소수성 잔기 및 전형적인 아스파라긴 잔기로 구성되는 반면, NEMO의 LZ는 두 대전된 아미노산 R 및 K를 포함한다(도 4B 및 도 5A). 따라서, 꼬인 코일 경계면에 위치된 이러한 잔기들은 꼬인 코일 상호 작용의 선택성에 기여한다.
도 5B는 LPS에 반응하는 NF-kB 활성 억제에 대한 10 μM 농도의 BODIPY-Ant-GCN4의 효과를 도시한다. 꼬인 코일 서열의 효과를 비교하기 위하여, 본 발명자는 상기한 엄격한 세포 분석을 사용하였다. BODIPY-Ant-LZ와 달리 BODIPY-Ant-GCN4는 NF-kB 활성 수준이 펩티드가 없는 대조구의 NF-kB 활성 수준에 거의 같기 때문에 NF-kB 활성을 억제하는 능력이 없다. 모든 것을 종합해 볼 때, 이러한 결과는 NEMO의 LZ 펩티드가 선택적인 꼬인-코일 상호 작용을 통해서 NF-kB 활성을 억제한다는 가설을 강하게 지지한다.
안테나페디아 서열은 NF-kB 펩티드 억제제의 단량체화(monomerization)를 유도한다.
안테나페디아 서열은 알파-나선 양친성(amphiphatic) 구조를 채택한 단백질 전달 도메인(PTD)이다(Prochiantz, 2000, Curr. Opin. Cell Biol.). CC2 또는 LZ와 같은 꼬인-코일 서열의 N-말단에 혼합될 때, 안테나페디아는 분자내 상호 작용을 통하여 꼬인-코일의 소수성 경계면을 덮음으로써 꼬인-코일 연관을 변경할 수 있다. CC2 및 LZ 펩티드의 올리고머화 특성에 대한 안테나페디아 펩티드의 N-융합 효과를 시험하기 위하여, 본 발명자는 겔 여과로 N-말단에 안테나페디아 서열을 포함하거나 그렇지 않은 펩티드를 분석하였다. 도 6에 도시된 것처럼, 안테나페디아의 N-말단 융합을 포함하는 모든 펩티드는 구형의 단백질 표지에 비교되었을 때 그 단량체 형태에 대응하여 용출 부피로 함께 용출된다. 본 발명자는 펩티드 회수를 향상시키기 위하여 cmc 아래로 세제를 버퍼에 첨가하였음을 주의하라. 같은 10 μM 농도로 주입되었을 때, 안테나페디아 N-융합이 없는 CC2 야생형 및 LZ 야생형은 올리고머화한다. 최근에 보고된 것처럼 CC2(WT)는 삼량체를 형성하는데 비해 LZ(WT)는 이량체를 형성한다(Traincard et al). 예상했던 것처럼, 세 개의 지방성 잔기가 글리신 잔기로 치환된 CC2 변이체가 화학적으로 획득되었을 때, 그 변이체는 올리고머화하는 능력을 상실하였다(아래 패널, 점선). d 위치에서 두 L->S 변이체의 효과는 LZ(변이체) 보다는 덜 강했다. 그러나, 본 발명자는 비록 그 연관이 야생형 LZ(실선)에 비교하여 돌연변이에 의해 상당히 감소하였지만, 여전히 10μM 농도(점선)에서 LZ 변이체의 2합체화물(dimerization)를 검출하였다. 모든 것을 종합해 볼 때, 이러한 데이타는 CC2 및 LZ 펩티드 둘 다에 대한 안테나페디아 서열의 N-융합이 동형의 꼬인-코일 상호 작용을 변경하고, 이는 NEMO로부터 유도된 펩티드의 단량체화를 수월하게 한다는 것을 나타낸다. 또한, 이러한 결과는 a 및 d 위치에서의 잔기 변화가 LZ 및 CC2 펩티드의 올리고머화를 변경함을 나타낸다. 따라서, 합성 펩티드들은 α-나선형 꼬인-코일 구조를 형성하는 것 같다.
안테나페디아 서열의 N-융합을 가지거나 그렇지 않은 CC2 및 LZ 펩티드의 동형 및 이형 상호 작용.
안테나페디아의 N-융합이 CC2 및 LZ 펩티드의 올리고머화 특성을 변형하기 때문에, 본 발명자는 다음으로 BODIPY로 표지된 Ant-CC2 및 Ant-LZ 단량체가 안테나페디아 서열이 결핍된 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드에 결합할 수 있는지를 형광 편광(fluorescence polarzation)에 의해 연구하였다. 이러한 CC2 및 LZ 펩티드는 세포를 투과할 수 있는 BODIPY-Ant-CC2 및 BODIPY-Ant-LZ NF-kB 억제제 둘 다의 생체 내 결합 표적으로 취급될 수 있다. 도 7은 고정된 농도의 BODIPY-Ant-CC2와 여러 농도의 CC2 펩티드의 상호 작용에 대한 전형적인 결합 등온선을 도시한다. 결합 그래프의 형태는 S자 모양이 아니며, 이는 CC2가 협동성(cooperativity)없이 BODIPY-Ant-CC2에 결합함을 나타낸다. 비등방성의 초기 부분의 접선과 점근선 사이의 절편으로부터 계산된 화학양론은 0.8이다. 이러한 화학양론을 고려할 때, 해리 상수 KD는 15.2 μM이다. 유사한 결과는 본 발명자가 이미 보고하였듯이(Inset 도 7, Traincard et al.), 고정 농도의 BODIPY-Ant-LZ가 여러 농도의 CC2로 적정될 때 획득되었다. 종합적으로, 이러한 데이타는 Ant-CC2 및 Ant-LZ 단량체 모두가 시험관에서 NEMO의 최소 올리고머화 도메인을 구성하는 CC2 펩티드에 결합한다는 것을 의미한다.
인간 망막모세포종 세포에서 세포사(cell death)는 NF-kB 억제제 Ant-CC2 및 Ant-LZ에 의해 유도되지만, 그것들의 변이체 Ant-CC2(Mu) 및 Ant-LZ(Mu)에 의해서는 그렇지 않다.
구성적으로 활성화된 NF-kB 전위 인자는 종양 형성의 여러 측면과 관련이 있다는 것이 명백해졌으며(Karin review), 이는 전형적인 인간 세포의 암 세포로의 변화를 기술하는 세포 생리학에서 대부분의 여섯 가지 필수적인 변경을 포함한다(Hanahan, 2000, Cell for review). 이로부터 NF-kB 억제제를 새로운 항암 치료제로 사용하고 싶다는 생각이 강하게 유발된다. 최근에 프로테아좀(proteasome) 억제제 또는 핵 전위를 차단하는 SN50 펩티드를 사용하여 희망적인 결과들이 보고되었다(Orlowski, 2002, Trends in Molecular Medicine; Mitsiades, 2002, Blood). 그러나, NF-kB 억제에 대한 이러한 제제의 특이성은 의문이었다. Poulaki et al. (2002, Am J Pathol..)는 SN50 펩티드로 인간 망막모세종(Rb) 세포주 Y79의 처리가 암 세포의 아포토시스를 유도한다고 밝혔다. 쥐 및 사람 NEMO 펩티드의 서열 배열은 NEMO의 최소 올리고머화 도메인이 엄격히 보존됨을 나타내고, 이는 NF-kB 억제의 유사한 효과가 설치류 뿐만 아니라 인간 세포에서도 관찰될 수 있음을 제안한다.
특정 NF-kB 억제가 암 세포의 아포토시스를 유발할 수 있다면, 본 발명자는 인간 망막모세포종 세포 생육성에 대한 세포를 투과할 수 있는 Ant-LZ 및 Ant-CC2 펩티드 둘 다의 효과를 시험하였다. 이러한 실험에서, 본 발명자는 MTS 분석에서 어떠한 간섭도 방지하기 위하여 N-말단 BODIPY 라벨링 없이 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드를 사용하였다("물질 및 방법" 참조). 도 7에 도시한 것처럼, 본 발명자는 세포들이 3시간 동안 Ant-CC2(도 8A) 또는 Ant-LZ(도 8B)로 처리되었을 때 Y79 세포 생육성의 투여량 의존성을 발견하였다. 세포사에 대한 Ant-LZ 펩티드의 효과는 Ant-CC2의 효과보다 강했다. 세포사의 이러한 유도는 암세포가 3시간 동안 20 μM 농도로 처리되었을 때 Rb 세포 생존율이 Ant-LZ 및 Ant-CC2 펩티드 각각의 경우 65% 및 20% 이었기 때문에 중요하다. 놀랍게도, Ant-CC2(Mu)(도 8A) 또는 Ant-CC2(Mu)(도 8B)로 세포를 처리한 경우 WT 펩티드와 달리 세포사 농도를 유발하지 않았다. 세포사에 대한 이러한 효과는 안테나페디아 펩티드로 Y79 세포주의 처리가 세포 생존율(도 8C)에 영향을 미치지 않기 때문에 본질적으로 NEMO 서열이 원인이었다. 대조적으로, Y79 세포의 80% 및 55%는 각각 Ant-LZ 및 Ant-CC2가 5 μM 존재시에 죽었다(도 8C). 결론적으로, 이러한 결과는 Ant-LZ 및 Ant-CC2 펩티드에 의한 특정 NF-kB 억제는 Rb 세포주에서 세포사를 유발한다는 것을 나타내며, 이는 특정 NF-kB 억제제의 항암 화학요법제로서의 정당성을 입증한다.
염증 전구 신호 부재시에, 분석된 모든 펩티드들은 MTS 분석, 현미경으로 직접 관찰, 및 FACS 분석에서 추론된 전진 산란-FSC 및 측면 산란-SSC 변수에 따라, 30 μM 이상의 농도에서 시험된 B 림프구에 대한 검출할 수 있는 세포 독성을 가지지 않았다. 그러나, 본 발명자는 NEMO로부터 유도된 폴리펩티드 존재시에 LPS가 pre-B 림프구를 자극할 때 농도 의존적인 방식으로 FACS에 의해 약간의 세포사를 검출할 수 있었다. 세포사의 세포 비율은 Ant-CC2 농도 20 μM에서 자극제가 없을 때 9% 이었고 반면, LPS 자극 후에 13%로 증가하였다(데이타를 도시하지 않음). 이는 세포를 아포토시스로부터 보호하는 NF-kB 경로의 역할과 일치한다. 세포사는 구성적인 NF-kB 활성이 보고된(Poulaki, 2002, Am J Pathol.) Rb 세포주 Y79에서 더 명백하고 빨랐다. 본 발명자는 NEMO 펩티드-유도된 세포사가 사실상 아포토시스라는 것을 Annexin V 라벨링 및 TUNEL 방법에 의해 기술하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 아포토시스의 조절에서 NF-kB 경로의 역할을 고려할 때, NEMO로부터 유도된 폴리펩티드에 의해 유도된 세포사는 본질적으로 아포토시스인 것 같다.
장래의 NF-kB 억제제(유기 또는 펩티도미메틱(peptidomimetic) 화합물)의 본성에도 불구하고, 상기로부터의 결과는 NEMO의 올리고머화를 목표로 하는 것이 IKK 키나아제 활성 및 NEMO-키나아제 연관과 비교하여 더 매력적이고 가능성 있는 전략일 것이고, 이는 이러한 분자들이 염증 전구 신호에 상당히 좌우되기 때문임을 설명한다. 따라서, 이러한 약제는 세포 생존력이 필요한 보통의 세포에서 기초적인 NF-kB 활성을 덜 방해할 것이다.
야생형 NEMO의 N-말단로부터 유도된 펩티드
본 발명자는 야생형 NEMO의 N-말단 구역, 특히 도 1A에 도시된 NLM 보존 모티프(서열 ID NO: 12의 293-322 잔기)를 조사하였다. 이를 위하여, 다음의 서열들을 제조하였다(대응하는 서열은 표 1 참조하라):
NLM-DR (서열 ID NO　: 30)
Ant.NLM-DR (서열 ID NO　: 31)
Tat NLM-DR (서열 ID NO　: 32)
R7-NLM-DR (서열 ID NO　: 33)
R9-NLM-DR (서열 ID NO　: 34)
NLM-DR은 도 1A에 상술한 NLM 모티프가 보존된 더 큰 30 아미노산으로부터 유도된 21 아미노산 "모티프"(및 대응하는 야생형 NLM은 같은 아미노산 영역을 포함한다)이다. NLM-DR은 야생형 서열의 11 잔기의 아스파라트산이 아르기닌으로 치환되었다는 점에서 야생형 NLM 서열로부터 돌연변이된 것이다(표 1 및 서열 ID NO: 30).
본 발명자는 야생형에 비해 NLM-DR 변이된 펩티드의 이점을 증명하는 각각의 협동 지수(cooperativity indices)를 측정함으로써 NLM-DR을 대응하는 NLM 펩티드에 비교하였다.
Hill 계수를 수단으로 "협동 지수"의 계산은 다음의 식에 기초한다:
Boundmax x Ln /(KDn + Ln)
여기서, Boundmax는 결합된 리간드의 최대 농도,
L은 자유 리간드의 농도,
n은 협동 지수, 및
KD는 단백질에 의한 리간드의 친화상수이다.
Hill 계수를 수단으로 계산된 협동 지수는:
Figure 112006028633282-PCT00001
변이체 NLM 펩티드(NLM-DR) 경우-해리 상수 Kd 170 μM 및 협동 지수 1.4(1326μM); 및
Figure 112006028633282-PCT00002
대응하는 야생형 NLM 펩티드(NLM) 경우- 해리 상수 Kd 240 μM 및 협동 지수 2.1(99642μM);이다.
만약 이러한 값들이 협동성을 고려하지 않은 그래프로부터 획득된 값들과 비교된다면, NLM-DR 펩티드의 친화력은 야생형 NLM 펩티드의 친화력보다 75 배 더 높을 것이다.
본 발명자는 또한 상기한 NLM-DR 형태들에 대한 생물학적으로 연관된 결과들이 NF-kB 활성 경로 억제, IC50 및 독성 결과(FACS)에 적합하기 때문에 이를 평가하였다. 그 결과는 표 2에 기록되어 있다.
NLM-DR로부터 유도된 펩티드의 특성
세포독성* 세포 흡수 상대 효율 (FACS) IC50
MTS 분석 세포 형태
펩티드 FACS 현미경
BODIPY-Ant-NLM-DR no + + + 1.1 μM
BODIPY-TAT-NLM-DR no no no + 1 μM
BODIPY-R9-NLM-DR no no no ++ 0.9 μM
BODIPY-R7-NLM-DR n.d. no no ++++ 0.9 μM
지시된 기술로 평가된 *세포독성은 독성이 없음(no)에서 높은 독성(++++)으로 분류되었다; MTS 세포 증식 분석은 Promega로부터이다; n.d.= 측정되지 않음.
본 발명에 대한 많은 조절 및 변경이 상기로부터 가능하다. 따라서, 첨부된 청구항의 범위 내에서, 본 발명은 본 명세서에 특정적으로 기술된 것처럼 실행될 수 있다.
Figure 112006028633282-PCT00003
Figure 112006028633282-PCT00004
Figure 112006028633282-PCT00005
Figure 112006028633282-PCT00006
Figure 112006028633282-PCT00007
Figure 112006028633282-PCT00008
Figure 112006028633282-PCT00009
Figure 112006028633282-PCT00010
Figure 112006028633282-PCT00011
Figure 112006028633282-PCT00012
Figure 112006028633282-PCT00013
SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT PASTEUR INSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE AGOU, FABRICE COURTOIS, GILLES ISRAEL, ALAIN VERON, MICHEL TRAINCARD, FRANCOIS YAMAOKA, SHOJI <120> SELECTIVE INHIBITION OF NF-KappaB ACTIVATION BY PEPTIDES DESIGNED TO DISRUPT NEMO OLIGOMERIZATION <150> US 60/530,418 <151> 2003-12-18 <150> US 60/505,161 <151> 2003-09-24 <160> 39 <170> KopatentIn version 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys <210> 2 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Gln 20 25 30 Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys 35 40 45 Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val 50 55 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala 1 5 10 15 Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu 20 25 30 Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val 35 40 <210> 4 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Gly Gln Gln 20 25 30 Ala Glu Glu Ala Gly Val Ala Lys Gln Glu Leu Gly Asp Lys Leu Lys 35 40 45 Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val 50 55 <210> 5 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Gly Gln Gln Ala 1 5 10 15 Glu Glu Ala Gly Val Ala Lys Gln Glu Leu Gly Asp Lys Leu Lys Glu 20 25 30 Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val 35 40 <210> 6 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 6 Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu 20 25 30 Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Leu Gln Glu 35 40 45 Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu 50 55 60 <210> 7 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 7 Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg 1 5 10 15 His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Leu Gln Glu Gln 20 25 30 Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu 35 40 <210> 8 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 8 Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu 20 25 30 Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Ser Gln Glu 35 40 45 Gln Leu Glu Gln Ser Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu 50 55 60 <210> 9 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 9 Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg 1 5 10 15 His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Ser Gln Glu Gln 20 25 30 Leu Glu Gln Ser Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu 35 40 <210> 10 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 10 Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys Ser Lys Gly Met Gln Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu 20 25 30 Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu 35 40 45 Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg 50 55 <210> 11 <211> 1239 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 atgaacaagc acccctggaa gaaccagctg agtgagacgg tgcagcccag tggtggccca 60 gcagaggacc aggacatgct gggtgaagaa tcttctctgg ggaagcctgc aatgctacat 120 ctgccttcag agcagggtac tcctgagacc ctccagcgct gcctggaaga gaatcaagag 180 ctccgagacg ctatccggca gagcaatcag atgctgaggg aacgctgtga ggagctgctg 240 catttccagg tcagccagcg ggaggagaag gagttcctta tgtgcaaatt ccaggaagcc 300 cggaagctgg tggagagact gagcttggag aagcttgatc ttcggagtca gagggaacag 360 gccttaaagg agttggagca actgaagaaa tgccaacagc agatggctga ggacaaggcc 420 tctgtgaaag ctcaggtgac atcattgctc ggagaactcc aggagagcca gagccgtttg 480 gaggctgcca ccaaggatcg gcaagcttta gagggaagga ttcgagcagt tagtgagcag 540 gtcagacagc tggagagtga gcgggaggtg ctacagcagc agcacagcgt ccaggtggac 600 cagctgcgta tgcagaacca gagcgtggag gctgccttgc gaatggagcg gcaggctgct 660 tcagaggaga agcggaagct ggctcagttg caggcagcct atcaccaact cttccaagac 720 tacgacagcc acattaagag cagcaagggc atgcagctgg aagatctgag gcaacagctc 780 cagcaagctg aggaggccct ggtagccaaa caggaattga ttgataagct gaaagaggag 840 gctgagcagc acaagattgt gatggagact gtgccagtct tgaaggccca ggcggatatc 900 tacaaggctg acttccaagc tgagaggcat gcccgggaga agctggtgga gaagaaggag 960 tatttgcagg agcagctgga gcagctgcag cgcgagttca acaagctgaa agttggctgc 1020 catgagtcag ccaggattga ggatatgagg aagcggcatg tagagactcc ccagcctcct 1080 ttactccctg ctccagctca ccactccttt catttggcct tgtccaacca gcggaggagc 1140 cctcctgaag aacctcctga cttctgttgt ccgaagtgcc agtatcaggc tcctgatatg 1200 gacactctac agatacatgt catggagtgc atagagtag 1239 <210> 12 <211> 412 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Asn Lys His Pro Trp Lys Asn Gln Leu Ser Glu Thr Val Gln Pro 1 5 10 15 Ser Gly Gly Pro Ala Glu Asp Gln Asp Met Leu Gly Glu Glu Ser Ser 20 25 30 Leu Gly Lys Pro Ala Met Leu His Leu Pro Ser Glu Gln Gly Thr Pro 35 40 45 Glu Thr Leu Gln Arg Cys Leu Glu Glu Asn Gln Glu Leu Arg Asp Ala 50 55 60 Ile Arg Gln Ser Asn Gln Met Leu Arg Glu Arg Cys Glu Glu Leu Leu 65 70 75 80 His Phe Gln Val Ser Gln Arg Glu Glu Lys Glu Phe Leu Met Cys Lys 85 90 95 Phe Gln Glu Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Ser Leu Glu Lys Leu 100 105 110 Asp Leu Arg Ser Gln Arg Glu Gln Ala Leu Lys Glu Leu Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Lys Cys Gln Gln Gln Met Ala Glu Asp Lys Ala Ser Val Lys Ala 130 135 140 Gln Val Thr Ser Leu Leu Gly Glu Leu Gln Glu Ser Gln Ser Arg Leu 145 150 155 160 Glu Ala Ala Thr Lys Asp Arg Gln Ala Leu Glu Gly Arg Ile Arg Ala 165 170 175 Val Ser Glu Gln Val Arg Gln Leu Glu Ser Glu Arg Glu Val Leu Gln 180 185 190 Gln Gln His Ser Val Gln Val Asp Gln Leu Arg Met Gln Asn Gln Ser 195 200 205 Val Glu Ala Ala Leu Arg Met Glu Arg Gln Ala Ala Ser Glu Glu Lys 210 215 220 Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Ala Ala Tyr His Gln Leu Phe Gln Asp 225 230 235 240 Tyr Asp Ser His Ile Lys Ser Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu 260 265 270 Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val Met 275 280 285 Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp 290 295 300 Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu 325 330 335 Lys Val Gly Cys His Glu Ser Ala Arg Ile Glu Asp Met Arg Lys Arg 340 345 350 His Val Glu Thr Pro Gln Pro Pro Leu Leu Pro Ala Pro Ala His His 355 360 365 Ser Phe His Leu Ala Leu Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Pro Glu Glu 370 375 380 Pro Pro Asp Phe Cys Cys Pro Lys Cys Gln Tyr Gln Ala Pro Asp Met 385 390 395 400 Asp Thr Leu Gln Ile His Val Met Glu Cys Ile Glu 405 410 <210> 13 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 13 Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gln Gln Leu Gln Gln 20 25 30 Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys 35 40 45 Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val 50 55 <210> 14 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 14 Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gln Gln Leu Gln Gln Ala 1 5 10 15 Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu 20 25 30 Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val 35 40 <210> 15 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 15 Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu 20 25 30 Arg Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu 35 40 45 Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Tyr Ser Lys Leu 50 55 60 <210> 16 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 16 Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg 1 5 10 15 Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu Gln 20 25 30 Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Tyr Ser Lys Leu 35 40 <210> 17 <211> 2035 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 cgagctggac tgtttctact cctccctcct cctccactgc ggggtctgac cctactcctt 60 gtgtgaggac tcctctagtt cagagacata ttctgttcac caaacttgac tgcgctctat 120 cgaggtcgtt aaattcttcg gaaatgcctc acatatagtt tggcagctag cccttgccct 180 gttggatgaa taggcacctc tggaagagcc aactgtgtga gatggtgcag cccagtggtg 240 gcccggcagc agatcaggac gtactgggcg aagagtctcc tctggggaag ccagccatgc 300 tgcacctgcc ttcagaacag ggcgctcctg agaccctcca gcgctgcctg gaggagaatc 360 aagagctccg agatgccatc cggcagagca accagattct gcgggagcgc tgcgaggagc 420 ttctgcattt ccaagccagc cagagggagg agaaggagtt cctcatgtgc aagttccagg 480 aggccaggaa actggtggag agactcggcc tggagaagct cgatctgaag aggcagaagg 540 agcaggctct gcgggaggtg gagcacctga agagatgcca gcagcagatg gctgaggaca 600 aggcctctgt gaaagcccag gtgacgtcct tgctcgggga gctgcaggag agccagagtc 660 gcttggaggc tgccactaag gaatgccagg ctctggaggg tcgggcccgg gcggccagcg 720 agcaggcgcg gcagctggag agtgagcgcg aggcgctgca gcagcagcac agcgtgcagg 780 tggaccagct gcgcatgcag ggccagagcg tggaggccgc gctccgcatg gagcgccagg 840 ccgcctcgga ggagaagagg aagctggccc agttgcaggt ggcctatcac cagctcttcc 900 aagaatacga caaccacatc aagagcagcg tggtgggcag tgagcggaag cgaggaatgc 960 agctggaaga tctcaaacag cagctccagc aggccgagga ggccctggtg gccaaacagg 1020 aggtgatcga taagctgaag gaggaggccg agcagcacaa gattgtgatg gagaccgttc 1080 cggtgctgaa ggcccaggcg gatatctaca aggcggactt ccaggctgag aggcaggccc 1140 gggagaagct ggccgagaag aaggagctcc tgcaggagca gctggagcag ctgcagaggg 1200 agtacagcaa actgaaggcc agctgtcagg agtcggccag gatcgaggac atgaggaagc 1260 ggcatgtcga ggtctcccag gcccccttgc cccccgcccc tgcctacctc tcctctcccc 1320 tggccctgcc cagccagagg aggagccccc ccgaggagcc acctgacttc tgctgtccca 1380 agtgccagta tcaggcccct gatatggaca ccctgcagat acatgtcatg gagtgcattg 1440 agtagggccg gccagtgcaa ggccactgcc tgccgaggac gtgcccggga ccgtgcagtc 1500 tgcgctttcc tctcccgcct gcctagccca ggatgaaggg ctgggtggcc acaactggga 1560 tgccacctgg agccccaccc aggagctggc cgcggcacct tacgcttcag ctgttgatcc 1620 gctggtcccc tcttttgggg tagatgcggc cccgatcagg cctgactcgc tgctcttttt 1680 gttcccttct gtctgctcga accacttgcc tcgggctaat ccctccctct tcctccaccc 1740 ggcactgggg aagtcaagaa tggggcctgg ggctctcagg gagaactgct tcccctggca 1800 gagctgggtg gcagctcttc ctcccaccgg acaccgaccc gcccgctgct gtgccctggg 1860 agtgctgccc tcttaccatg cacacgggtg ctctcctttt gggctgcatg ctattccatt 1920 ttgcagccag accgatgtgt atttaaccag tcactattga tggacatttg ggttgtttcc 1980 catctttttg ttaccataaa taatggcata gtaaaaatcc ttgtgcatta aaaaa 2035 <210> 18 <211> 419 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Asn Arg His Leu Trp Lys Ser Gln Leu Cys Glu Met Val Gln Pro 1 5 10 15 Ser Gly Gly Pro Ala Ala Asp Gln Asp Val Leu Gly Glu Glu Ser Pro 20 25 30 Leu Gly Lys Pro Ala Met Leu His Leu Pro Ser Glu Gln Gly Ala Pro 35 40 45 Glu Thr Leu Gln Arg Cys Leu Glu Glu Asn Gln Glu Leu Arg Asp Ala 50 55 60 Ile Arg Gln Ser Asn Gln Ile Leu Arg Glu Arg Cys Glu Glu Leu Leu 65 70 75 80 His Phe Gln Ala Ser Gln Arg Glu Glu Lys Glu Phe Leu Met Cys Lys 85 90 95 Phe Gln Glu Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Leu Glu Lys Leu 100 105 110 Asp Leu Lys Arg Gln Lys Glu Gln Ala Leu Arg Glu Val Glu His Leu 115 120 125 Lys Arg Cys Gln Gln Gln Met Ala Glu Asp Lys Ala Ser Val Lys Ala 130 135 140 Gln Val Thr Ser Leu Leu Gly Glu Leu Gln Glu Ser Gln Ser Arg Leu 145 150 155 160 Glu Ala Ala Thr Lys Glu Cys Gln Ala Leu Glu Gly Arg Ala Arg Ala 165 170 175 Ala Ser Glu Gln Ala Arg Gln Leu Glu Ser Glu Arg Glu Ala Leu Gln 180 185 190 Gln Gln His Ser Val Gln Val Asp Gln Leu Arg Met Gln Gly Gln Ser 195 200 205 Val Glu Ala Ala Leu Arg Met Glu Arg Gln Ala Ala Ser Glu Glu Lys 210 215 220 Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Val Ala Tyr His Gln Leu Phe Gln Glu 225 230 235 240 Tyr Asp Asn His Ile Lys Ser Ser Val Val Gly Ser Glu Arg Lys Arg 245 250 255 Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu 260 265 270 Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala 275 280 285 Glu Gln His Lys Ile Val Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln 290 295 300 Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu 305 310 315 320 Lys Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu 325 330 335 Gln Arg Glu Tyr Ser Lys Leu Lys Ala Ser Cys Gln Glu Ser Ala Arg 340 345 350 Ile Glu Asp Met Arg Lys Arg His Val Glu Val Ser Gln Ala Pro Leu 355 360 365 Pro Pro Ala Pro Ala Tyr Leu Ser Ser Pro Leu Ala Leu Pro Ser Gln 370 375 380 Arg Arg Ser Pro Pro Glu Glu Pro Pro Asp Phe Cys Cys Pro Lys Cys 385 390 395 400 Gln Tyr Gln Ala Pro Asp Met Asp Thr Leu Gln Ile His Val Met Glu 405 410 415 Cys Ile Glu <210> 19 <211> 51 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val 1 5 10 15 Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala 20 25 30 Asp Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys 35 40 45 Glu Tyr Leu 50 <210> 20 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val 1 5 10 15 Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala 20 25 30 Asp Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys 35 40 45 Glu Leu Leu 50 <210> 21 <211> 51 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 21 Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val 1 5 10 15 Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala 20 25 30 Asp Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys 35 40 45 Glu Phe Leu 50 <210> 22 <211> 55 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 22 Glu Leu Ile Lys Lys Met Gln Leu Asp Ile Asn Glu Leu Lys Ala Arg 1 5 10 15 Asp Ile Gln Lys Gln Glu Val Ile Lys Gly Leu Gln Ile Gln Asn Asp 20 25 30 Ile Tyr Arg Arg Asp Phe Glu Met Glu Arg Ala Asp Arg Glu Lys Asn 35 40 45 Ala Gly Glu Lys Asp Gln Tyr 50 55 <210> 23 <211> 51 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Leu Gln Met Asp Glu Met Lys Gln Thr Leu Ala Lys Gln Glu Glu Asp 1 5 10 15 Leu Glu Thr Met Ala Val Leu Arg Ala Gln Met Glu Val Tyr Cys Ser 20 25 30 Asp Phe His Ala Glu Arg Ala Ala Arg Glu Lys Ile His Glu Glu Lys 35 40 45 Glu Gln Leu 50 <210> 24 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Leu Gln Met Asp Glu Met Lys Gln Thr Ile Ala Lys Gln Glu Glu Asp 1 5 10 15 Leu Glu Thr Met Thr Ile Leu Arg Ala Gln Met Glu Val Tyr Cys Ser 20 25 30 Asp Phe His Ala Glu Arg Ala Ala Arg Glu Lys Ile His Glu Glu Lys 35 40 45 Glu Gln Leu 50 <210> 25 <211> 59 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Ser Pro Ser Ser Pro Pro Ala Ala Phe Gly Ser Pro Glu Gly Val Gly 1 5 10 15 Gly His Leu Arg Lys Gln Glu Leu Val Thr Gln Asn Glu Leu Leu Lys 20 25 30 Gln Gln Val Lys Ile Phe Glu Glu Asp Phe Gln Arg Glu Arg Ser Asp 35 40 45 Arg Glu Arg Met Asn Glu Glu Lys Glu Glu Leu 50 55 <210> 26 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Pro Pro Ser Ser Pro Pro Thr Ala Phe Gly Ser Pro Glu Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ala Leu Leu Arg Lys Gln Glu Leu Val Thr Gln Asn Glu Leu Leu Lys 20 25 30 Gln Gln Val Lys Ile Phe Glu Glu Asp Phe Gln Arg Glu Arg Ser Asp 35 40 45 Arg Glu Arg Met Asn Glu Glu Lys Glu Glu Leu 50 55 <210> 27 <211> 51 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Glu Ala Asn Gln Glu Leu Thr Ala Met Arg Met Ser Arg Asp Thr Ala 1 5 10 15 Leu Glu Arg Val Gln Met Leu Glu Gln Gln Ile Leu Ala Tyr Lys Asp 20 25 30 Asp Phe Lys Ser Glu Arg Ala Asp Arg Glu Arg Ala His Ser Arg Ile 35 40 45 Gln Glu Leu 50 <210> 28 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Glu Val Lys Gln Glu Leu Ala Ala Ser Arg Thr Ala Arg Asp Ala Ala 1 5 10 15 Leu Glu Arg Val Gln Met Leu Glu Gln Gln Ile Leu Ala Tyr Lys Asp 20 25 30 Asp Phe Met Ser Glu Arg Ala Asp Arg Glu Arg Ala Gln Ser Arg Ile 35 40 45 Gln Glu Leu 50 <210> 29 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ser Phe Ser Glu Asp Cys Leu Arg Lys Ser Arg Val Glu Phe Cys His 1 5 10 15 Glu Glu Met Arg Thr Glu Met Glu Val Leu Lys Gln Gln Val Gln Ile 20 25 30 Tyr Glu Glu Asp Phe Lys Lys Glu Arg Ser Asp Arg Glu Arg Leu Asn 35 40 45 Gln Glu Lys Glu Glu Leu 50 <210> 30 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 30 Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg 1 5 10 15 His Ala Arg Glu Lys 20 <210> 31 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 31 Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu 20 25 30 Arg His Ala Arg Glu Lys 35 <210> 32 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 32 Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln 1 5 10 15 Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu 20 25 30 Lys <210> 33 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 33 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr 1 5 10 15 Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys 20 25 <210> 34 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 34 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp 1 5 10 15 Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys 20 25 30 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg 1 5 10 15 Gln Ala Arg Glu Lys 20 <210> 36 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu 20 25 30 Arg Gln Ala Arg Glu Lys 35 <210> 37 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln 1 5 10 15 Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu 20 25 30 Lys <210> 38 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr 1 5 10 15 Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys 20 25 <210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp 1 5 10 15 Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys 20 25 30

Claims (45)

  1. (a) 서열 ID NO: 2, 서열 ID NO: 3, 서열 ID NO: 6, 서열 ID NO: 7, 서열 ID NO: 13, 서열 ID NO: 14, 서열 ID NO: 15, 서열 ID NO: 16, 서열 ID NO: 30, 서열 ID NO: 31, 서열 ID NO: 32, 서열 ID NO: 33, 서열 ID NO: 34, 서열 ID NO: 35, 서열 ID NO: 36, 서열 ID NO: 37, 서열 ID NO: 38, 및 서열 ID NO: 39로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    (b) 상기 (a)에 정의된 폴리뉴클레오티드와 상보적인 정제된 폴리뉴클레오티드;
    (c) 상기 (a)에 정의된 폴리뉴클레오티드와 적어도 70% 동일한 정제된 폴리뉴클레오티드;
    (d) 상기 (a)에 정의된 폴리뉴클레오티드와 적어도 80% 동일한 정제된 폴리뉴클레오티드;
    (e) 상기 (a)에 정의된 폴리뉴클레오티드와 적어도 90% 동일한 정제된 폴리뉴클레오티드; 및
    (f) 50 내지 68℃ 온도에서 5X SSC 세척을 포함하는 엄격한 조건하에서, 상기 (a)에 정의된 폴리뉴클레오티드에 교잡하는 정제된 폴리뉴클레오티드;로 구성된 그룹에서 선택되는, NF-kB 신호 전달 경로를 억제하는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 NF-kB 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 정제된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 NEMO 올리고머화를 차단하는 것을 특징으로 하는 정제된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항의 정제된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  5. 제1항의 정제된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포.
  6. a) 서열 ID NO: 3, 서열 ID NO: 7, 서열 ID NO: 14, 서열 ID NO: 16, 서열 ID NO: 30, 서열 ID NO: 31, 서열 ID NO: 32, 서열 ID NO: 33, 서열 ID NO: 34, 서열 ID NO: 35, 서열 ID NO: 36, 서열 ID NO: 37, 서열 ID NO: 38, 및 서열 ID NO: 39로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 NEMO형 폴리펩티드;
    b) 상기 a)에 정의된 폴리펩티드와 적어도 70% 동일한 정제된 폴리펩티드;
    c) 상기 a)에 정의된 폴리펩티드와 적어도 80% 동일한 정제된 폴리펩티드;
    d) 상기 a)에 정의된 폴리펩티드와 적어도 90% 동일한 정제된 폴리펩티드; 및
    e) 상기 a)에 정의된 폴리펩티드와 적어도 95% 동일한 정제된 폴리펩티드;로 구성된 그룹에서 선택된 NF-kB 경로를 억제하는 정제된 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 NF-kB 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 정제된 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 NEMO 올리고머화를 차단하는 것을 특징으로 하는 정제된 폴리펩티드.
  9. a) 서열 ID NO: 3, 서열 ID NO: 7, 서열 ID NO: 14, 서열 ID NO: 16, 서열 ID NO: 30, 서열 ID NO: 31, 서열 ID NO: 32, 서열 ID NO: 33, 서열 ID NO: 34, 서열 ID NO: 35, 서열 ID NO: 36, 서열 ID NO: 37, 서열 ID NO: 38, 및 서열 ID NO: 39로 구성된 그룹에서 선택되고, 높은 형질 도입 가능성을 가진 폴리펩티드에 연결되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 혼합 구조체;
    b) 상기 a)에 정의된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 혼합 구조체;
    c) 상기 a)에 정의된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 혼합 구조체;
    d) 상기 a)에 정의된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 혼합 구조체;
    e) 서열 ID NO: 3, 서열 ID NO: 7, 서열 ID NO: 14, 서열 ID NO: 16, 서열 ID NO: 30, 서열 ID NO: 31, 서열 ID NO: 32, 서열 ID NO: 33, 서열 ID NO: 34, 서열 ID NO: 35, 서열 ID NO: 36, 서열 ID NO: 37, 서열 ID NO: 38, 및 서열 ID NO: 39로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일하고, 높은 형질 도입 가능성을 가진 폴리펩티드에 연결되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드 혼합 구조체;로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 NF-kB 경로를 억제하는 폴리펩티드 혼합 구조체.
  10. 제9항에 있어서,
    NEMO 올리고머화를 차단하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 혼합 구조체.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 연결은 1-35 아미노산 길이를 가진 아미노산 스페이서(spacer) 서열에 의한 것임을 특징으로 하는 폴리펩티드 혼합 구조체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 아미노산 스페이서(spacer) 서열은 서열 ID NO: 9 및 서열 ID NO: 10으 로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 혼합 구조체.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 높은 형질 도입 가능성을 가진 폴리펩티드는 서열 ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 혼합 구조체.
  14. 제13항에 있어서,
    서열 ID NO: 2, 서열 ID NO: 6, 서열 ID NO: 13 및 서열 ID NO: 15로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 혼합 구조체.
  15. 생체 밖에서 진핵세포를 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 혼합 구조체와 접촉시키는 단계를 포함하는 NF-kB 신호 전달 경로의 억제 방법.
  16. 생체 밖에서 상기 NEMO를 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 혼합 구조체와 접촉시키는 단계를 포함하는 NEMO 올리고머화의 차단 방법.
  17. 치료를 필요로 하는 대상에서 NF-kB 신호 전달 경로에 의해 조절되는 질병을 조절하거나 치료하기 위한 약제의 제조를 위해, 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 혼합 구조체 및 하나 이상의 약제학적으로 수용 가능한 운반체 또는 첨가제를 포함하는 유효한 양의 조성물을 사용하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 치료를 필요로 하는 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 유효한 양의 범위는 0.1 ㎎/㎏/일 내지 30 ㎎/㎏/일인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NF-kB 신호 전달 경로에 의해 조절되는 질병은 염증 반응, 종양 형성 및 바이러스 감염으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 경구, 직장, 비강, 비경구, 조내(intracisternal), 질내, 복강내, 설하(sublingual), 국소 및 협측(bucal) 투여로 구성된 그룹에서 선택된 형태로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 바람직하게는 정맥 내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 치료를 필요로 하는 대상에서 세포 증식 또는 아포토시스(apoptosis)를 조절하기 위한 약제의 제조를 위해, 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 혼합 구조체 및 하나 이상의 약제학적으로 수용 가능한 운반체 또는 첨가제를 포함하는 유효한 양의 조성물을 사용하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 치료를 필요로 하는 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 유효한 양의 범위는 0.1 ㎎/㎏/일 내지 30 ㎎/㎏/일인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 경구, 직장, 비강, 비경구, 조내(intracisternal), 질내, 복강내, 설하(sublingual), 국소 및 협측(bucal) 투여로 구성된 그룹에서 선택된 형태로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 바람직하게는 정맥 내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 치료를 필요로 하는 대상에서 항원성 자극의 B 또는 T 림프구를 조절하기 위한 약제의 제조를 위해, 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 혼합 구조체 및 하나 이상의 약제학적으로 수용 가능한 운반체 또는 첨가제를 포함하는 유효한 양의 조성물을 사용하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 치료를 필요로 하는 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    상기 유효한 양의 범위는 0.1 ㎎/㎏/일 내지 30 ㎎/㎏/일인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 경구, 직장, 비강, 비경구, 조내(intracisternal), 질내, 복강내, 설하(sublingual), 국소 및 협측(bucal) 투여로 구성된 그룹에서 선택된 형태로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 바람직하게는 정맥 내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. a) 후보 폴리펩티드 서열을 확인하는 단계;
    b) 상기 후보 폴리펩티드 서열을 스페이서(spacer) 서열을 통하여 높은 형질 도입 가능성을 가진 폴리펩티드에 연결함으로써 폴리펩티드 혼합 구조체를 형성하는 단계;
    c) 세포 배지를 상기 폴리펩티드 혼합 구조체와 접촉시키는 단계;
    d) NF-kB 신호 전달 경로의 활성을 모니터하는 단계;
    e) 상기 폴리펩티드 혼합 구조체에 의한 상대적인 억제를 측정하기 위하여 상기 폴리펩티드 혼합 구조체 존재시의 NF-kB 신호 전달 경로의 활성을 상기 폴리펩티드 혼합 구조체 부재시의 NF-kB 신호 전달 경로의 활성과 비교하는 단계; 및
    f) 상기 폴리펩티드 혼합 구조체에 의한 상대적 억제를 NEMO 올리고머화와 연관시키는 단계;로 구성된 NEMO의 올리고머화를 조절하는 폴리펩티드를 확인하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 후보 폴리펩티드 서열은 꼬인-코일(coiled-coil) 또는 나선형 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서,
    상기 후보 폴리펩티드 서열은 20-60 아미노산을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 후보 폴리펩티드 서열은 NEMO로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스페이서(spacer) 서열은 1-35 아미노산 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 스페이서(spacer) 서열은 서열 ID N0:9 및 서열 ID NO: 10으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제33항에 있어서,
    상기 높은 형질 도입 가능성을 가진 폴리펩티드는 서열 ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 방법.
  40. 제33항에 있어서,
    상기 세포 배지는 2003년 4월 1일, CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganisms)(프랑스 공화국, 75724 빠리 세덱스 15, 뤼 드 독뙤르 루 28(28 rue de Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15))에 번호 I-3004으로 제출된, NF-kB 의존성 β-갈락토시다아제 리포터 유전자로 감염된 pre-B 70Z/3 림프구를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제33항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 혼합 구조체는 N-말단 시스테인 잔기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제39항에 있어서,
    b-1) 상기 폴리펩티드 혼합 구조체를 표지하는 단계(labeling); 및
    c-1) 상기 표지된 폴리펩티드 혼합 구조체의 세포 흡수를 모니터하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 표지하는 단계는 시스테인 잔기를 형광단과 화학적으로 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 형광단은 BODIPY인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제42항에 있어서,
    상기 세포 흡수를 모니터하는 단계는 FACS에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020067007920A 2003-09-24 2004-09-24 Ｎｅｍｏ 올리고머화를 차단하기 위한 펩티드에 의한ｎｆ―ｋａｐｐａｂ 활성의 선택적 억제 KR20060090714A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US50516103P 2003-09-24 2003-09-24
US60/505,161 2003-09-24
US53041803P 2003-12-18 2003-12-18
US60/530,418 2003-12-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20060090714A true KR20060090714A (ko) 2006-08-14

Family

ID=34381127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067007920A KR20060090714A (ko) 2003-09-24 2004-09-24 Ｎｅｍｏ 올리고머화를 차단하기 위한 펩티드에 의한ｎｆ―ｋａｐｐａｂ 활성의 선택적 억제

Country Status (9)

Country Link
US (3) US7700553B2 (ko)
EP (1) EP1677815B8 (ko)
JP (1) JP5027508B2 (ko)
KR (1) KR20060090714A (ko)
CN (1) CN1886148B (ko)
AU (1) AU2004273686B2 (ko)
BR (1) BRPI0414714A (ko)
CA (1) CA2540103C (ko)
WO (1) WO2005027959A1 (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030104622A1 (en) * 1999-09-01 2003-06-05 Robbins Paul D. Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
EP1677815B8 (en) * 2003-09-24 2017-08-30 Institut Pasteur Selective inhibition of nf-kappab activation by peptides designed to disrupt nemo oligomerization.
US20060068032A1 (en) * 2004-09-24 2006-03-30 Sunny Biodiscovery, Inc. Compositions and methods for treating angiogenesis-related diseases, wounds and cosmetic use of components of Angelica sinensis, and methods of preparation thereof
US20090075902A1 (en) * 2007-05-25 2009-03-19 Robbins Paul D Inhibiting the signs of aging by inhibiting nf-kappa b activation
EP2006686A1 (en) * 2007-06-22 2008-12-24 Institut Pasteur Method for screening for selective modulator of the NF-kB pathway activation
FR2927080A1 (fr) * 2008-02-05 2009-08-07 Servier Lab Structure cristalline du domaine cc2-lz de nemo
CN103547592A (zh) 2011-03-30 2014-01-29 埃博灵克斯股份有限公司 使用针对TNFα的单结构域抗体治疗免疫病症的方法
US20130210875A1 (en) * 2012-02-10 2013-08-15 Macau University Of Science And Technology Novel binding site of IKK-beta
EP3184541A1 (en) 2015-12-23 2017-06-28 Institut Pasteur Stapled peptide inhibitors of nemo as potential anti-inflammatory and anti-cancer drugs
CA3039364A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 University Of Florida Research Foundation, Inc. Targeted effector proteins and uses thereof
US11407797B2 (en) 2017-10-11 2022-08-09 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Modified gal-1 proteins and uses thereof
CN111606976A (zh) * 2020-05-26 2020-09-01 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种小肽及其在抑制阿片成瘾性和耐受性上的应用
CN114539426B (zh) * 2022-03-02 2023-07-07 山东仙普爱瑞科技股份有限公司 一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL126024A0 (en) * 1998-03-19 1999-05-09 Yeda Res & Dev Modulators of the function of receptors of the tnf/ngf receptor family and other proteins
WO1999057133A2 (en) 1998-05-06 1999-11-11 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Inhibitors of nf-kb activation
US6680366B1 (en) * 1999-02-22 2004-01-20 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding a modulator of NF-κB
EP1157126A4 (en) * 1999-02-24 2005-03-02 Gen Hospital Corp PROCESS FOR CLONING INTERMEDIATE PRODUCTS FOR SIGNAL TRANSDUCTION
US6864355B1 (en) * 2000-05-02 2005-03-08 Yale University Inhibition of NF-κB activation by blockade of IKKβ-NEMO interactions at the NEMO binding domain
US20060040319A1 (en) * 2000-01-14 2006-02-23 Tom Muir Multiple sensor-containing active modified polypeptides, preparation and uses thereof
EP2338899A1 (en) * 2001-01-18 2011-06-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Peptides for activation and inhibition of delta PKC
US20030165985A1 (en) * 2001-05-08 2003-09-04 Derry Jonathan M.J. Methods for identifying compounds that antagonize cd40 signaling
DE60213596T2 (de) 2001-06-22 2007-09-13 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Abin zum schutz gegen hepatitis
EP1677815B8 (en) * 2003-09-24 2017-08-30 Institut Pasteur Selective inhibition of nf-kappab activation by peptides designed to disrupt nemo oligomerization.
US7413863B2 (en) * 2006-06-08 2008-08-19 Institut Pasteur Identification of substances that inhibit NEMO oligomerization

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005027959A1 (en) 2005-03-31
US7700553B2 (en) 2010-04-20
CN1886148B (zh) 2013-01-02
AU2004273686A1 (en) 2005-03-31
BRPI0414714A (pt) 2006-11-21
CA2540103A1 (en) 2005-03-31
US7390872B2 (en) 2008-06-24
EP1677815A1 (en) 2006-07-12
EP1677815B1 (en) 2017-05-31
CA2540103C (en) 2017-11-07
US20080207517A1 (en) 2008-08-28
CN1886148A (zh) 2006-12-27
US8790883B2 (en) 2014-07-29
JP5027508B2 (ja) 2012-09-19
US20050220792A1 (en) 2005-10-06
AU2004273686B2 (en) 2011-03-03
JP2007506422A (ja) 2007-03-22
US20080242601A1 (en) 2008-10-02
EP1677815B8 (en) 2017-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8790883B2 (en) Methods of identifying NF-κB inhibitors
Caceres et al. Functional analysis of pre‐mRNA splicing factor SF2/ASF structural domains.
Weed et al. Cortactin: coupling membrane dynamics to cortical actin assembly
Reddy Molecular motors and their functions in plants
KR100529270B1 (ko) 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제
US20040146986A1 (en) Runx3 gene showing anti-tumor activity and use thereof
KR20220061282A (ko) 항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
JP7312948B2 (ja) Ａｔｆ５ペプチド多様体及びそれらの使用
JP2011172588A (ja) Ｄｐ７５をコードするｄｎａおよびその使用のためのプロセス
ES2287927T3 (es) Peptidos que tienen una actividad de factor de intercambio del gdp, secuencias de acidos nucleicos que codifican estos peptidos, preparacion y utilizacion.
WO1997005249A9 (en) Extension of a protein-protein interaction surface to inactivate the function of a cellular protein
WO1997005249A2 (en) Extension of a protein-protein interaction surface to inactivate the function of a cellular protein
KR20050085448A (ko) 조절성 징크 핑거 단백질
Mirski et al. Identification of functional nuclear export sequences in human topoisomerase IIα and β
WO1996031534A1 (en) ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING p57KIP2 AND USES OF SAME
US11865181B2 (en) Peptidic materials that traffic efficiently to the cell cytosol and nucleus
US8088892B2 (en) Inhibitors of proteins from the Rho-GEF family
AU741586B2 (en) Polypeptides comprising gax protein domains, involved in repressing transcription and/or interacting with other proteins, corresponding nucleic acids and their use
WO2001018036A2 (en) Methods and reagents for regulating gene expression
AU716234C (en) Extension of a protein-protein interaction surface to inactivate the function of a cellular protein
Massari Transcriptional regulatory properties of the Class I helix-loop-helix proteins
Pfeffer The isolation and characterization of a P. Angulosus homeobox
Casteel Identification and characterization of G-kinase Iβ interacting proteins

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application