CN115998883B

CN115998883B - Cflar的抑制剂在治疗arid1a缺失型肿瘤中的应用

Info

Publication number: CN115998883B
Application number: CN202310273284.0A
Authority: CN
Inventors: 王晓月; 梁俊波; 王町町; 古雅妮
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2023-03-21
Filing date: 2023-03-21
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2043-03-21
Also published as: CN115998883A

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及CFLAR的抑制剂在治疗ARID1A缺失型肿瘤中的应用。具体地，本发明提供了以下任意一种或多种基因的抑制剂在制备ARID1A缺失型癌症药物中的应用：CFLAR、PHIP、FTO和ADRB3。或者，本发明提供了ARID1A抑制剂与CFLAR、PHIP、FTO和ADRB3的抑制剂中一种或多种组合使用在制备癌症药物中的应用。

Description

CFLAR的抑制剂在治疗ARID1A缺失型肿瘤中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及CFLAR的抑制剂在治疗ARID1A缺失型肿瘤中的应用。

背景技术

合成致死（Synthetic lethality）理论由来已久，通俗来讲，指两个非致死基因同时失活将导致细胞死亡的现象。概念最早可以追溯到1992年，美国科学家卡尔文在果蝇的研究中发现，具有pd和 Pdr双基因突变的果蝇不能存活，而这其中任何一个基因单独突变都不会导致果蝇死亡。1946年，西奥多·多布赞斯基正式提出“合成致死”概念，用来描述这种不同基因之间的互补性致死作用。

合成致死对癌症研究有重要影响。合成致死率的概念为癌症治疗的发展开辟了一条新的途径，即在识别出癌症特异性突变后，靶向合成致死目标。随着越来越强大的工具和应用合成致死概念，药物靶点和遗传背景的确定无疑将是一种有效的治疗选择和患者的变革机会。许多研究人员已经预见到使用合成致命性基因筛查来识别药物组合和发现特定基因型癌症的特定弱点的巨大潜力。

ARID1A是人类癌症中最常见的突变基因之一，在多种肿瘤中发生突变或缺失，在卵巢透明细胞癌的突变率高达60%。前期研究显示，ARID1A可通过多种机制影响肿瘤的发生发展，如调控增强子活性、调节细胞周期和DNA损伤检查点、与p53相互作用调控p53下游靶基因表达、负调节TERT转录活性等。大多数ARID1A突变都是失活突变，也即其细胞是ARID1A缺陷型细胞，ARID1A缺陷与多种肿瘤类型突变负荷增加有关。

目前针对ARID1A缺陷型肿瘤还没有特异疗法。本发明所提供的治疗靶点对于ARID1A缺陷型肿瘤治疗的影响具有重要的临床意义。

发明内容

为筛选ARID1A缺失型肿瘤的治疗靶点，本发明利用CRISPR基因编辑技术针对性筛选ARID1A的合成致死基因，鉴定ARID1A合成致死靶点，为ARID1A缺陷型（ARID1A缺失型）肿瘤患者的治疗提供药物靶点。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了以下任意一种或多种基因的抑制剂在制备ARID1A缺失型癌症药物中的应用：CFLAR、PHIP、FTO和ADRB3。

另一方面，本发明提供了ARID1A抑制剂与以下一种或多种抑制剂组合使用在制备癌症药物中的应用：CFLAR的抑制剂、PHIP的抑制剂、FTO的抑制剂和ADRB3的抑制剂。

优选地，所述抑制剂（基因抑制剂）包括CRISPR技术、RNA干扰技术、反义寡核苷酸（ASO）技术、TALEN技术、ZFN技术、Cre-loxP 基因重组技术等基因编辑技术所使用的试剂。

在另一种具体实施例中，所述抑制剂还可以是对具体基因表达具有特异性抑制效果的化合物，具体包括竞争性抑制剂或非竞争性抑制剂，非限制性举例如：FTO的抑制剂有FB23-2、Rheic Acid、Dac51、FB23等。

优选地，本发明所述抑制剂是CRISPR技术中所使用的试剂。

如本发明所使用术语“CRISPR技术”也可称为CRISPR/Cas技术，该技术中CRISPR是指规律间隔成簇短回文重复序列/规律间隔成簇短回文重复序列相关核酸酶系统（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associatedproteins）；Cas是指CRISPR-associated proteins，也即CRISPR相关蛋白，具有靶向和/或剪切靶核酸的活性。Cas蛋白种类众多，最常见的例如Cas9、Cas12等，不同cas蛋白的引导序列设计原则不同，但都是本领域技术人员所熟知的。Cas蛋白通过引导序列达到特异性靶向位点，达到精准基因编辑（包括基因敲除）的目的。

具体地，所述CRISPR技术中所使用的试剂是本领域所熟知的，具体地至少包括Cas蛋白和引导序列（可称为sgRNA）。如本发明所使用的引导序列是通过两个oligo退火后连接到分子载体上使用的，两个oligo中反向互补的部分即为引导序列。例如，靶向ARID1A的sgRNA是通过序列分别为caccgATGGTCATCGGGTACCGCTG和aaacCAGCGGTACCCGATGACCATG的oligo反向互补构成的，则靶向ARID1A的引导序列即为ATGGTCATCGGGTACCGCTG，也即得知两个oligo的情况下，其反向互补序列即为引导序列（sgRNA），也即为Cas蛋白所靶向的位点。

具体地，本发明针对ARID1A、CFLAR、PHIP、FTO、ADRB3设计并合成了特异性引导序列（sgRNA，其oligo如具体实施例所记载），所述特异性引导序列与Cas9蛋白组合使用即可以达到抑制（敲除）ARID1A、CFLAR、PHIP、FTO、ADRB3表达的目的。也即本发明中将针对具体基因设计的特异性引导序列结合Cas蛋白就可以实现抑制具体基因表达的目的。包括针对具体基因所设计的特异性引导序列和Cas蛋白在内的试剂，就称为该具体基因的抑制剂。

优选地，所述抑制剂可以通过任意常规技术导入靶细胞（癌细胞），本发明具体实施例中具体使用了转染的方法，所述转染试剂可以是商品化的产品或自行配制的试剂；示例性的所述商品化产品包括Lipofectamine™ 2000（Thermo Fisher Scientific）、Lipofectamine™ 3000（Thermo Fisher Scientific）、Lipofectamine™ RNAiMAX（ThermoFisher Scientific）、Neon™转染系统（Thermo Fisher Scientific）、HiPerFect（QIAGEN）、X-tremeGENE（Roche）、siLentFect™（Bio-Rad）等。

如本文所用，“癌症”和“肿瘤”是可互换的术语，是指动物中任何异常细胞或组织的生长或增殖。如本文所用，术语“癌症”和“肿瘤”涵盖实体癌和血液/淋巴癌，并且还涵盖恶性、恶性前和良性生长，诸如发育异常。癌症的非限制性实例包括：肺癌、小细胞肺癌（SCLC）、非小细胞肺癌（NSCLC）、尿道癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食管癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌（liver cancer）、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌（包括子宫体子宫内膜癌）、唾液腺癌、肾癌（kidney cancer）、肾癌（renalcancer）、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌（hepatic carcinoma）、脑癌、睾丸癌、胆管上皮癌、胆囊癌、胃癌、黑素瘤、间皮瘤和各种类型的头颈癌。

优选地，所述癌症包括肝癌、卵巢癌、胃癌。

也即，所述ARID1A缺失型癌症包括ARID1A缺失型的以上任一癌症，具体优选为ARID1A缺失型肝癌、ARID1A缺失型卵巢癌、ARID1A缺失型胃癌。

如本文所用，本发明所述 ARID1A缺失型也可称为ARID1A缺陷型、ARID1A突变型、ARID1A敲除型，具体表现为ARID1A不表达或表达降低。

具体地，如本发明具体实施例3和4中所验证的，在ARID1A野生型肝癌、ARID1A野生型卵巢癌、ARID1A野生型胃癌中抑制CFLAR后都未对癌细胞的增殖产生极显著影响，但在ARID1A缺失型肝癌、ARID1A缺失型卵巢癌、ARID1A缺失型胃癌中抑制CFLAR后都使癌细胞的增殖受到明显抑制，也即，在肝癌、胃癌、卵巢癌中都验证了ARID1A和CFLAR同时缺失时产生合成致死现象，也即，CFLAR抑制剂对ARID1A缺失型癌症具有治疗作用，CFLAR是ARID1A缺失型癌症的治疗靶点。

同时，ARID1A和CFLAR同时被抑制时，癌细胞也同样会表现出合成致死现象，因此ARID1A抑制剂和CFLAR抑制剂组合使用时，也可以作为癌症的治疗药物。

同理，如实施例3所述在ARID1A缺失型肝癌中对PHIP、FTO、ADRB3进行抑制后也表现出合成致死现象，抑制PHIP、FTO、ADRB3可以达到治疗ARID1A缺失型肝癌的目的。PHIP、FTO、ADRB3任意一种的抑制剂与ARID1A抑制剂组合使用时，也可以作为癌症的治疗药物。

可以知晓的是，本发明所述ARID1A、CFLAR、PHIP、FTO或ADRB3抑制剂的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时最佳的疗程，即ARID1A、CFLAR、PHIP、FTO或ADRB3抑制剂在额定的时间内每日的剂量，可以用本领域内公知的方法确定。

如本发明所提供的应用中，所述抑制剂还可以与其他癌症治疗方法、癌症治疗药物联合使用。其他癌症治疗方法非限制性的例如：放射疗法、免疫疗法、基因疗法、手术，其他癌症治疗药物非限制性的例如：紫杉醇（paclitaxel）和多西紫杉醇吉西他滨（docetaxelgemcitabine）、丝裂霉素（mitomycin）、霉酚酸（mycophenolic acid）、甲基丝裂霉素（potfiromycin）、嘌呤霉素（puromycin）、三铁阿霉素（quelamycin）、罗多比星（rodorubicin）、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、他尼珠单抗、阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿夫土珠单抗、阿仑单抗、培化阿珠单抗、阿麦妥昔单抗、阿泊珠单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、贝伐单抗等。

如果治疗产生临床效益，例如，受试者中肿瘤的尺寸、转移潜力减小，那么治疗是有效的。当预防性地施用治疗时，“有效”意指治疗延迟或防止肿瘤形成，或预防或减轻肿瘤的临床症状的症状。有效性是与诊断或治疗特定肿瘤类型的任何已知方法相结合来测定。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物种包含前述ARID1A抑制剂和以下一种或多种前述抑制剂：CFLAR、PHIP、FTO和ADRB3的抑制剂。

如本发明所述，所述药物组合物中还包括合适的药学可接受载体。

具体地，合适的药学可接受载体是本领域公知的，并且随药学配制剂的想要的形式和施用模式而变化。例如，它们可以包括稀释剂或赋形剂诸如填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、滑润剂等。通常，载体是固体、液体或可蒸发的载体，或其组合。每种载体应当是“可接受的”，其意义为与配制剂中的其它成分是相容的而且对患者无害。载体应当是生物学可接受的，在对宿主施用时不会引发不利反应（例如免疫应答）。

本发明所述“药物”、“药物组合物”“癌症药物”、“癌症治疗的药物”、“肿瘤药物”具有相同含义，其代表可以治疗肿瘤的物质或物质组合。本发明所提供抑制剂（药物）的具有治疗肿瘤的作用，所述“治疗”包括阻止或延缓疾病（如肿瘤）的症状和并发症的出现，也包括延长肿瘤患者的生存期，改善生活质量，减轻症状，使肿瘤缩小甚至消除，使肿瘤转移受到遏制，预防肿瘤复发。在本发明中“癌症治疗”、“抑制细胞增殖”具有相同的含义。

另一方面，本发明提供了ARID1A缺失型癌症的治疗方法，所述方法包括向已经受试者施用CFLAR、PHIP、FTO和ADRB3中一种或多种的抑制剂。或者，所述方法包括将CFLAR、PHIP、FTO和ADRB3中一种或多种的抑制剂与靶细胞接触。

优选地，所述靶细胞包括癌细胞（ARID1A缺失的癌细胞），具体可以是取自受试者的癌细胞（体外）或受试者体内的癌细胞。

本文中使用的术语“受试者”是指任何动物（例如，哺乳动物），包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等，其将成为特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在涉及人受试者时在本文中可互换地使用。

最优选地，所述受试者是人。

另一方面，本发明提供给了一种治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：

1）取受试者的癌细胞，检测癌细胞中ARID1A的表达量，

2）通过步骤1）鉴定出细胞不表达或低表达ARID1A的受试者，向所述不表达或低表达ARID1A的受试者施用CFLAR、PHIP、FTO和ADRB3中一种或多种的抑制剂，达到抑制癌症进展的目的。

具体地，所述不表达或低表达ARID1A的受试者也可以称为ARID1A缺失型癌症患者。

优选地，以上靶细胞包括肝癌、卵巢癌、胃癌细胞，更具体地是ARID1A缺失型肝癌细胞、ARID1A缺失型卵巢癌细胞、ARID1A缺失型胃癌细胞。

另一方面，本发明提供了治疗ARID1A缺失型癌症的CFLAR、PHIP、FTO和ADRB3的抑制剂。

另一方面，本发明提供了治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物中含有ARID1A抑制剂，还含有以下一种或多种基因的抑制剂：CFLAR、PHIP、FTO和ADRB3。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

附图说明

图1是在ARID1A野生型（WT）肝癌细胞和ARID1A敲除型（KO）肝癌细胞中检测ARID1A表达量的结果图。

图2是针对ARID1A筛选合成致死基因的结果图。

图3是在ARID1A野生型（WT）肝癌细胞和ARID1A敲除型（KO）肝癌细胞中分别敲除CFLAR、PHIP、FTO和ADRB3后细胞增殖效率的检测结果图。其中，A图和B图是在ARID1A野生型和ARID1A敲除型中敲除CFLAR后细胞增殖速率对比，C图和D图是在ARID1A野生型和ARID1A敲除型中敲除PHIP后细胞增殖速率对比，E图和F图是在ARID1A野生型和ARID1A敲除型中敲除FTO后细胞增殖速率对比，G图和H图是在ARID1A野生型和ARID1A敲除型中敲除ADRB3后细胞增殖速率对比。

图4是人卵巢癌细胞系ES2和SKOV3、人胃癌细胞系AGS和MKN45中ARID1A表达量检测的结果图。

图5是在ARID1A野生型（WT）细胞和ARID1A敲除型（KO）细胞中敲除CFLAR后对细胞抑制作用的检测结果图，A是人卵巢癌细胞系ES2和SKOV3中敲除CFLAR后对细胞抑制作用对比， B是人胃癌细胞系AGS、MKN45中敲除CFLAR后对细胞抑制作用对比。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、构建PLC/PRF/5 ARID1A敲除细胞系

一、实验材料

人肝癌细胞系PLC/PRF/5（中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）；lentiCRISPR v2载体（Addgene公司）；sgRNA序列（苏州泓迅生物科技有限公司合成）

二、实验方法

1、敲除ARID1A sgRNA质粒的构建：

针对ARID1A蛋白编码区设计sgRNA，将sgRNA的两条oligo（序列分别为caccgATGGTCATCGGGTACCGCTG和aaacCAGCGGTACCCGATGACCATc）退火和磷酸化后连接到BsmBI酶切的lentiCRISPR v2载体上，转化至大肠杆菌，挑单克隆进行Sanger测序，提取成功连接sgRNA的质粒。

2、PLC/PRF/5 ARID1A敲除细胞系的构建：

使用Lipofectamine 3000将sgRNA质粒转染PLC/PRF/5细胞，加入最低致死剂量的puromycin筛选出成功转染的细胞，然后使用流式细胞仪进行单克隆分选并扩大培养。

3、Western blot检测扩大培养单克隆细胞中ARID1A蛋白表达

用 RIPA 裂解液裂解扩大培养的单克隆细胞（ARID1A敲除组）和PLC/PRF/5ARID1A野生型细胞、BCA法蛋白定量。将制备好的蛋白样品进行上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育和ECL显影。

三、实验结果

Western Blot结果显示，与ARID1A野生型（WT）细胞相比，敲除组（即图示KO组）没有检测到ARID1A蛋白表达，表示成功构建ARID1A敲除细胞系（图1）。

实施例2、CRISPR全基因组合成致死筛选药物靶点

将CRISPR Brunello文库（Cat.#73179, Addgene）包装慢病毒后以MOI~0.3感染ARID1A野生型与敲除型细胞，负性筛选后提取筛选前后细胞基因组DNA，高通量测序sgRNA丰度，通过比较筛选前后sgRNA丰度变化计算ARID1A野生型与敲除型细胞中每个基因betascore，挑选不影响（基本不影响）ARID1A野生型细胞生长（beta score ≈ 0）但对于ARID1A缺失型细胞生长必需（beta score <-0.5）的基因，该部分基因即为ARID1A合成致死靶点，即为ARID1A缺失型肿瘤患者的候选治疗药物靶点。

共鉴定到133个ARID1A合成致死候选靶点，如图2所示，横坐标和纵坐标分别表示ARID1A野生型和敲除型细胞beta score，红色点（最深色点）表示和ARID1A有合成致死关系的基因。

实施例3、在PLC/PRF/5细胞中验证候选靶点

对以下4个基因CFLAR、PHIP、FTO、ADRB3进行验证：在ARID1A野生型和ARID1A敲除型分别敲除以上基因，敲除所使用sgRNA 的oligo分别如表1所示。在ARID1A野生型中，敲除以上任意一种基因，都不对细胞增殖速率产生极明显抑制；而在ARID1A敲除型细胞中敲除以上任意一种基因则明显抑制细胞增殖速率；以上实验结果说明CFLAR、PHIP、FTO、ADRB3分别都与ARID1A具有合成致死作用，可以作为ARID1A缺失型癌症的治疗靶点。

具体结果如附图3所示，其中，A图和B图是在ARID1A野生型和ARID1A敲除型中敲除CFLAR后细胞增殖速率对比，C图和D图是在ARID1A野生型和ARID1A敲除型中敲除PHIP后细胞增殖速率对比，E图和F图是在ARID1A野生型和ARID1A敲除型中敲除FTO后细胞增殖速率对比，G图和H图是在ARID1A野生型和ARID1A敲除型中敲除ADRB3后细胞增殖速率对比。

实施例4：在卵巢癌细胞系、胃癌细胞系中验证候选靶点

一、实验材料

gRNA序列按照表1合成（苏州泓迅生物科技有限公司合成），人卵巢癌细胞系SKOV3、ES-2、人胃癌细胞系AGS、MKN45（中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）。其中：

根据现有技术ARID1A mutation sensitizes most ovarian clear cellcarcinomas to BET inhibitors中报道，ES2细胞系是ARID1A野生型卵巢癌细胞。

SKOV3 cells containing a truncated ARID1a protein have a restrictedgenome-wide response to glucocorticoids中报道，SKOV3是ARID1A缺失型卵巢癌细胞。

AKT inhibition is an effective treatment strategy in ARID1A-deficientgastric cancer cells中报道，AGS是ARID1A 野生型胃癌细胞，MKN45是ARID1A缺失型胃癌细胞。

对人卵巢癌细胞系ES2和SKOV3、人胃癌细胞系AGS和MKN45中ARID1A表达量检测的结果如图4所述。

二、实验方法

利用CRISPR 敲除ARID1A野生型和缺失型细胞中候选靶点的表达，通过CCK8检测细胞增殖，进而确定候选靶点是否与ARID1A具有合成致死作用。

三、实验结果

具体结果如图5所示，A图是敲除CFLAR后对ARID1A野生型（ES2）和天然缺失型（SKOV3）卵巢癌细胞增殖速率抑制率，B图是敲除CFLAR后对ARID1A野生型（AGS）和天然缺失型（MKN45）胃癌细胞增殖速率抑制率。

以上结果显示，与ARID1A野生型细胞相比，利用CRISPR sgRNA敲除候选基因CFLAR表达后，ARID1A敲除型或天然缺失型细胞增殖速率明显降低，表明干扰CFLAR表达后，能更明显抑制ARID1A缺失型癌细胞的生长，可作为ARID1A缺陷型（缺失型）肿瘤患者的治疗靶点。

Claims

1.CFLAR的抑制剂在制备ARID1A缺失型癌症药物中的应用，所述抑制剂是CRISPR技术中所使用的试剂，所述CRISPR技术中所使用的试剂包括Cas蛋白和特异性引导序列。

2.如权利要求1所述的应用，所述药物中还包括合适的药学可接受载体。

3.如权利要求1所述的应用，所述癌症包括肺癌、尿道癌、鳞状细胞癌、垂体癌、食管癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、腹膜癌、肝癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、脑癌、睾丸癌、胆管上皮癌、胆囊癌、黑素瘤和间皮瘤。

4.如权利要求1所述的应用，所述癌症包括肝癌、卵巢癌和胃癌。

5.ARID1A抑制剂与CFLAR的抑制剂组合在制备癌症药物中的应用，所述抑制剂是CRISPR技术中所使用的试剂，所述CRISPR技术中所使用的试剂包括Cas蛋白和特异性引导序列。

6.如权利要求5所述的应用，所述药物中还包括合适的药学可接受载体。

7.如权利要求5所述的应用，所述癌症包括肺癌、尿道癌、鳞状细胞癌、垂体癌、食管癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、腹膜癌、肝癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、脑癌、睾丸癌、胆管上皮癌、胆囊癌、黑素瘤和间皮瘤。

8.如权利要求5所述的应用，所述癌症包括肝癌、卵巢癌和胃癌。

9.一种非治疗目的的抑制ARID1A缺失型细胞增殖的方法，所述方法包括将CFLAR的抑制剂与靶细胞接触，所述抑制剂是CRISPR技术中所使用的试剂，所述CRISPR技术中所使用的试剂包括Cas蛋白和特异性引导序列。

10.一种非治疗目的的抑制细胞增殖的方法，所述方法包括将ARID1A抑制剂与CFLAR的抑制剂组合后与靶细胞接触，所述抑制剂是CRISPR技术中所使用的试剂，所述CRISPR技术中所使用的试剂包括Cas蛋白和特异性引导序列。