CN103698530A - 结核分支杆菌蛋白在制备诊断活动性肺结核的产品中的用途 - Google Patents

结核分支杆菌蛋白在制备诊断活动性肺结核的产品中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和/或Rv3835蛋白在开发和/或设计具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核用途的产品中的应用。本发明还提供了使用了Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835制备的蛋白质芯片。通过本发明制备的蛋白质芯片，检测活动性肺结核患者及正常人血清中6个蛋白抗原各自相应的IgM抗体的水平，联合分析这6个蛋白质的相应抗体的检测结果，判断被检人是否为活动性肺结核，检测结果表明，本发明提供的蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核的最佳工作点的特异性为89.1%，敏感性为74.3%，均高于现有技术中活动性肺结核诊断的指标。

Description

结核分支杆菌蛋白在制备诊断活动性肺结核的产品中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及结核分枝杆菌蛋白在制备诊断和/或辅助诊断疾病的产品中的用途。
背景技术
多个世纪以来，结核病持续在全球成为一个不容忽视的公共卫生问题。目前全球已有三分之一的人口携带结核分枝杆菌，仅2010年一年就新增结核病病例880万，死亡145万，平均不到22秒即有一人死于肺结核病，结核病高居传染病死亡人数之首。而我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患者人数高居全球第二位，受感染人数超过5亿，仅2010年一年就有新发病例90～120万，占据了全球总新增病例的约12%，如不及时采取有效措施，在未来十年内可能有3000万人发病，将会导致严重的公共卫生问题和社会问题，所以从国家战略层面必需尽快实现对肺结核的有效控制。
科学证明表明由于活动性肺结核的极易传播性，对活动性肺结核的诊断及尽快消除传染源，控制结核病流行有非常重大的意义。所以确定肺结核有无活动性对治疗和管理均极其重要。目前活动性判断应综合临床、X线表现和痰菌决定，而主要依据是痰菌和X线。痰涂片检查简便易行，准确性较高，是活动性肺结核确诊的金标准，但某些研究中其检出率较甚至低于10%。基于核酸扩增的诊断方法，如实时定量PCR以及DNA芯片的优点是灵敏度高且耗时短，其问题在于特异性较难保证，容易导致假阳性结果。并且，由于现有的治疗活动性肺结核的DOTS战略，治疗周期长且有较大的副作用，无论从患者还是治疗费用角度，区分结核潜伏性感染与活动性肺结核病人也显得尤为重要。而基于抗原抗体反应的血清学诊断，由于其简便性、快速性，日益成为重要的活动性肺结核临床辅助性诊断手段，并且能满足区分潜伏性感染与活动性肺结核的要求。因此，从长远角度综合来看，应致力于发现敏感性和特异性均较好的结核标志物。
理想的结核诊断标志物应符合以下条件：（1）敏感性高；（2）特异性高；（3）存在于体液，特别是血液中，易于检测。但是目前肺结核分支杆菌血清学诊断所针对的抗原如抗原5、38KD抗原、30/31KD抗原以及抗原60等，均存在阳性检出率低，与其它分支杆菌的交叉免疫性等问题，虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值，但目前仍不能用于活动性肺结核的确诊。为了实现对活动性肺结核的高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的活动性肺结核生物标志物。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测血清中抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和/或抗Rv3835抗体的水平的产品在制备具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核用途的产品中的应用。
所述应用中，所述Rv2693c是如下a）或b）的蛋白：
a）序列表中的SEQ ID №.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.1所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质；
所述Rv1833c是如下c）或d）的蛋白：
c）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
d）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.2所示蛋白具有相同功能的由c)衍生的蛋白质；
所述Rv1899c是如下e）或f）的蛋白：
e）序列表中的SEQ ID №.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
f）将序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.3所示蛋白具有相同功能的由e)衍生的蛋白质；
所述Rv0526是如下g）或h）的蛋白：
g）序列表中的SEQ ID №.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
h）将序列表中的SEQ ID №.4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.4所示蛋白具有相同功能的由g)衍生的蛋白质；
所述Rv0287是如下i）或j）的蛋白：
i）序列表中的SEQ ID №.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
j）将序列表中的SEQ ID №.5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.5所示蛋白具有相同功能的由i)衍生的蛋白质；
所述Rv3835是如下k）或l）的蛋白：
k）序列表中的SEQ ID №.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
l）将序列表中的SEQ ID №.6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.6所示蛋白具有相同功能的由k)衍生的蛋白质；
和/或，所述有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核用途的产品中，包括记载如下内容的说明书：与正常未患有任何疾病的人相比，活动性肺结核感染人中，抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和抗Rv3835抗体水平中至少有3种显著升高。
所述抗体为IgM。
本发明的还一个目的是提供一种用于鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核的标志物组合物，由抗Rv2693c的抗体、抗Rv1833c的抗体、抗Rv1899c的抗体、抗Rv0526的抗体、抗Rv0287的抗体和抗Rv3835的抗体组成；
所述标志物组合物中，各个所述抗体为人离体血清中的抗体；
所述抗体为IgM。
所述Rv2693c是如下a）或b）的蛋白：
a）序列表中的SEQ ID №.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.1所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质；
所述Rv1833c是如下c）或d）的蛋白：
c）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
d）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.2所示蛋白具有相同功能的由c)衍生的蛋白质；
所述Rv1899c是如下e）或f）的蛋白：
e）序列表中的SEQ ID №.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
f）将序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.3所示蛋白具有相同功能的由e)衍生的蛋白质；
所述Rv0526是如下g）或h）的蛋白：
g）序列表中的SEQ ID №.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
h）将序列表中的SEQ ID №.4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.4所示蛋白具有相同功能的由g)衍生的蛋白质；
所述Rv0287是如下i）或j）的蛋白：
i）序列表中的SEQ ID №.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
j）将序列表中的SEQ ID №.5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.5所示蛋白具有相同功能的由i)衍生的蛋白质；
所述Rv3835是如下k）或l）的蛋白：
k）序列表中的SEQ ID №.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
l）将序列表中的SEQ ID №.6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.6所示蛋白具有相同功能的由k)衍生的蛋白质。
本发明的再一个目的是提供血清中的抗Rv2693c的抗体、抗Rv1833c的抗体、抗Rv1899c的抗体、抗Rv0526的抗体、抗Rv0287的抗体和/或抗Rv3835的抗体作为标志物在开发、设计和/或制备具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核用途的产品中的应用；所述Rv2693c是如下a）或b）的蛋白：
a）序列表中的SEQ ID №.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.1所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质；
所述Rv1833c是如下c）或d）的蛋白：
c）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
d）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.2所示蛋白具有相同功能的由c)衍生的蛋白质；
所述Rv1899c是如下e）或f）的蛋白：
e）序列表中的SEQ ID №.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
f）将序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.3所示蛋白具有相同功能的由e)衍生的蛋白质；
所述Rv0526是如下g）或h）的蛋白：
g）序列表中的SEQ ID №.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
h）将序列表中的SEQ ID №.4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.4所示蛋白具有相同功能的由g)衍生的蛋白质；
所述Rv0287是如下i）或j）的蛋白：
i）序列表中的SEQ ID №.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
j）将序列表中的SEQ ID №.5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.5所示蛋白具有相同功能的由i)衍生的蛋白质；
所述Rv3835是如下k）或l）的蛋白：
k）序列表中的SEQ ID №.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
l）将序列表中的SEQ ID №.6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.6所示蛋白具有相同功能的由k)衍生的蛋白质；
所述有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核用途的产品中，包括记载如下内容的说明书：与正常未患有任何疾病的人相比，活动性肺结核感染人中，抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和抗Rv3835抗体水平中至少有3种显著升高。
所述抗体为IgM。
所述任一应用中，所述鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核具体指鉴别、诊断和/或辅助诊断待测人是否患有活动性肺结核；或筛查和/或辅助筛查待测人群中患有活动性肺结核的情况。
本发明的又一个目的是提供一种用于鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核的试剂盒，包括检测芯片，所述检测芯片上连有Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835蛋白中的至少3种蛋白，每种蛋白单独成立一个检测点；优选的，所述检测芯片上连有Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835蛋白；
所述Rv2693c是如下a）或b）的蛋白：
a）序列表中的SEQ ID №.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.1所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质；
所述Rv1833c是如下c）或d）的蛋白：
c）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
d）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.2所示蛋白具有相同功能的由c)衍生的蛋白质；
所述Rv1899c是如下e）或f）的蛋白：
e）序列表中的SEQ ID №.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
f）将序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.3所示蛋白具有相同功能的由e)衍生的蛋白质；
所述Rv0526是如下g）或h）的蛋白：
g）序列表中的SEQ ID №.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
h）将序列表中的SEQ ID №.4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.4所示蛋白具有相同功能的由g)衍生的蛋白质；
所述Rv0287是如下i）或j）的蛋白：
i）序列表中的SEQ ID №.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
j）将序列表中的SEQ ID №.5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.5所示蛋白具有相同功能的由i)衍生的蛋白质；
所述Rv3835是如下k）或l）的蛋白：
k）序列表中的SEQ ID №.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
l）将序列表中的SEQ ID №.6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.6所示蛋白具有相同功能的由k)衍生的蛋白质。
所述试剂盒中，所述检测芯片是将分别含有Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和/或Rv3835蛋白的溶液点样于载体玻片上制成的。
所述分别含有Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和/或Rv3835蛋白的溶液，由溶质和溶剂组成，所述溶质及其在所述溶液中的浓度为：
Figure BDA0000421818710000061
溶剂为水。）
所述溶液中，还包括：体积百分比为25%的甘油、体积百分比为0.02%的Tween20、0.05mg/ml的BSA和0.1g/L的NaN3。
所述点样具体是采用生物芯片点样仪点样的；所述点样的点样体积为0.3-1nl；优选0.5-1nl；最优选1nl。
所述载体玻片具体采用的是三维H载体玻片。
所述点样结束后，还需贴上12个孔的塑料围栏，并保持在30%RH-40%RH湿度4℃环境中过夜后，将玻片放置于塑料盒中封口-80℃低温保存；优选的，湿度为35%RH。
所述试剂盒还包括IgM阳性对照和/或Cy5标记抗人第二抗体；
所述试剂盒还包括说明书，所述说明书记载如下内容：
与正常未患有任何疾病的人相比，活动性肺结核感染人中，抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和抗Rv3835抗体水平中至少有3种显著升高。
所述抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和抗Rv3835抗体水平中至少有3种抗体显著升高按照如下方法进行判断：待测样品的检测结果中，抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和/或抗Rv3835抗体中，至少有3种抗体呈阳性，则判定该待测样品是活动性肺结核阳性，否则为活动性肺结核阴性。
所述试剂盒中，所述抗体呈阳性的具体判断标准为若各个抗体的信噪比值处于如下值之间，则认为是该抗体呈阳性：Rv2693c的抗体的信噪比值处于2.06和2.17之间，包括2.06和2.17；Rv1833c的抗体的信噪比值处于2.05和2.17之间，包括2.05和2.17；Rv1899c的抗体的信噪比值处于2.06和2.19之间，包括2.06和2.19；Rv0526的抗体的信噪比值处于2.07和2.20之间，包括2.07和2.20；Rv3835的抗体的信噪比值处于2.09和2.20之间，包括2.09和2.20；Rv0287的抗体的信噪比值处于2.24和2.36之间，包括2.24和2.36。
所述抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和/或抗Rv3835抗体具体为IgM。
所述信噪比值的计算公式为：
SNR = S - B σ
式中，S和B分别代表所述检测芯片中扫描仪直接显示的信号值和非样品点制区域的背景值，而σ则是代表该点原始信号的标准差；所述σ对应的实验次数为3次；所述S和B值是用扫描仪在635nm通道扫描得到的；所述扫描仪为GenePix。
所述试剂盒还包括配合检测芯片一起使用的试剂，所述试剂包括下述1）-4）：
1）pH7.4PBS溶液,其组成为：
Figure BDA0000421818710000072
溶剂为ddH2O；
2）pH7.4的PBST溶液,其组成为：
溶剂为ddH2O；
3）含BSA的pH7.4PBS溶液：
Figure BDA0000421818710000074
溶剂为ddH2O；
4）荧光标记的抗人第二抗体。
所述抗人第二抗体具体为抗人的IgM第二抗体。
本发明的最后一个目的是提供上述任一所述试剂盒在制备具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核用途的产品中的应用。
附图说明
图1为所制备的6个抗原蛋白Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835的银染定量结果图。
图2为所制备的6个抗原蛋白Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835的Western-Blotting鉴定结果图。
图3为应用蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核的方法的特异性和敏感性统计结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、蛋白质芯片的制备
（一）结核分支杆菌抗原蛋白Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835的制备
1、表达
由基因工程改造过的酿酒酵母利用半乳糖诱导过量表达，具体过程为：
首先从分支杆菌属结核分枝杆菌（Mycobacterium M.tuberculosis）H37Rv菌株（北京株）中，通过PCR从头克隆获得蛋白Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835的基因编码片段，通过Invitrogen公司的BP酶将片段连接到pDONR221载体（购自Invitrogen）上，转化到大肠杆菌DH5-Alpha中扩增，提取载体再通过LR酶（Invitrogen）换至经过改造的能够表达GST标签的pEGH-A载体（该载体在“Jian Zhu，Heng Zhu，et al：J.Virol.May2009vol.83no.105219-5231”中公开过，公众可从广东体必康生物科技有限公司获得）上，再次转化到大肠杆菌DH5-Alpha中扩增，提取质粒转化到Pep4酿酒酵母菌株（该菌株在文献“Heng Zhu，Michael Snyder，et al：Nature Genetics26,283–289(2000)doi:10.1038/81576”中公开过，公众可从广东体必康生物科技有限公司获得）中。诱导培养基中培养，待其OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为2g/L的半乳糖，诱导6h，4000rpm离心收集菌，-80℃保存。
PCR从头克隆中所使用的PCR引物序列如下所示：
扩增Rv2693c蛋白的基因编码片段的引物对：
上游引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAAACGCTAACCGCACTAGCGCCCA
下游引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACTACTCGCGGCCGGCGTCG
扩增Rv1833c蛋白的基因编码片段的引物对：
上游引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAAGCATCGATTTCACGCCGGA
下游引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCAGCCGAAGCGCTCAATGA
扩增Rv1899c蛋白的基因编码片段的引物对：
上游引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTATCCCGGGCTGCCGGGTTG
下游引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACTACCGTCGAGCGGTATCTTCTCC
扩增Rv0526蛋白的基因编码片段的引物对：
上游引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTACAGAGCAGAGCGACCAGAAGGAGC
下游引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCATTGCGCCCCCACCGGA
扩增Rv0287蛋白的基因编码片段的引物对：
上游引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAAGCCTTTTGGATGCTCATATCC
下游引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCAGAACCCGGTATAGGTCG
扩增Rv3835蛋白的基因编码片段的引物对：
上游引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTATTGGACGCGCCCGAGCAGGAC
下游引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACTAGCCTGCCGGTGCGGGCTC
每1L诱导培养基（溶剂为水）中含有的组分如表1所示：
表1
2、纯化
1)、准备裂解液：
50ml裂解液中加50μl巯基乙醇，125μlPMSF及两片Roche蛋白抑制剂；
2)、于-80℃冰箱里取出上述步骤1收集的菌（从120ml诱导培养基培养收集到的菌体），加400μl氧化锆珠和400μl裂解液，4℃环境中震荡30s，后置冰上2min，重复四次；
3)、取出后11,000rpm离心2min，取上清于一新的15ml离心管中；
4)、重复2和3步四次，将上清收集于同一离心管中；
5)、添加裂解液至12ml即原始诱导培养基体积的1/10，同时用没加抑制剂的裂解液将谷胱甘肽beads清洗3次。12ml裂解液中加入300μl的beads；
6)、加入beads后的裂解液于4℃孵育2h；
7)、11,000rpm离心2min后取上清保存于4℃。Beads用清洗液Ι和清洗液II各洗3次；
8)、加300μl洗脱液孵育15min后，离心取上清收集于一新的离心管中，重复一次。
得到的洗脱液即溶有该蛋白。
上述纯化过程中所用到的缓冲液（溶剂均为水）的组成见表2-表5.
表2裂解液（1L）
Figure BDA0000421818710000101
表3清洗液I(1L)
Figure BDA0000421818710000102
表4清洗液II(1L)
表5洗脱液(1L)
3、鉴定
下述实验过程中，所述的溶剂或液体的百分数为体积百分数。
1）、材料制备
配置两块12%的SDS-PAGE胶，1.0mm，15孔。一块银染，一块Western Blotting。取上述纯化好的蛋白各20μl，加入4μl6X Loading buffer，同时制备规格浓度梯度的BSA样品作为银染定量对照，煮样5min。
2)、跑胶
依次每孔加入12μl上述制备好的样品，BSA梯度样品，2.5μMarker（Takara）记录次序。80V30min，140V1h。
3）银染操作步骤：
固定：30min或者更长时间40%乙醇10%冰醋酸加水到250ml
致敏：30min75ml乙醇30%乙醇17g乙酸钠28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠（大苏打）加水到终体积250ml
水洗：3x10min
银染：20min0.625g AgNO3100μl37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml
水洗：2x1min
显色：时间视情况而定6.25g Na2CO350μl37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml
终止：10min1g甘氨酸加水到终体积250ml
保存：1%冰醋酸，4℃
4）Western-Blotting步骤：
转膜：15V40min（半干转，Bio-Rad）。转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml
封闭：5%脱脂牛奶（Bio-Rad）1h。
第一抗体孵育：Anti-GST鼠抗（NovaGen）终浓度1μg/ml1h
第二抗体孵育：羊鼠抗荧光800通道（Odyssey）终浓度1μg/ml1hOdyssey扫描仪扫描，保存图片。
进行银染定量和Western-Blotting鉴定的结果分别如图1和图2所示。图1结果表明所制备的Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835蛋白的量均为50μg/ml；图2结果证明，所制备的Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835蛋白正确。
经测序，所制备的Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835蛋白分别依次具有序列表中SEQ ID №.1-6所示的氨基酸序列。
（二）预点抗原的蛋白质芯片的制备
在含上述制备的50μg/ml的Rv2693c抗原蛋白的洗脱液溶液中，加入终浓度为25%（体积百分比）的甘油、0.02%（体积百分比）的Tween20、0.05mg/ml的BSA和0.1g/L的NaN3。采用生物芯片点样仪将上述混合液点于载体玻片（载体玻片为商品化的三维H载体玻片，购自北京博奥生物芯片有限责任公司）上，每点点样约1nL、2个平行点。采用生物芯片点样仪（购自北京博奥生物芯片有限责任公司）点制。
将上述Rv2693c抗原蛋白替换为Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287或Rv3835抗原蛋白（均为50μg/ml）、作为阳性对照的IgM(1mg/ml)标准品或Cy5标记抗人第二抗体（20μg/ml），混合液中其它组分和终浓度不变，制备出分别含Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287或Rv3835抗原蛋白、IgM标准品或Cy5标记抗人第二抗体的混合液。
以上述相同的点样方法，将分别含Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287或Rv3835抗原蛋白、IgM标准品或Cy5标记抗人第二抗体的混合液点于上述同一载体玻片上，形成微阵列，每玻片可点12个重复平行封闭区间。点样结束后贴上12个孔的塑料围栏，并保持在35%RH湿度4℃环境中16h后，将玻片放置于塑料盒中封口-80℃低温保存。
实施例2、应用蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核
（一）待测血清样品的准备
全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。4℃解冻后的样品应再次离心，然后检测。
（二）诊断过程中所涉及的各种缓冲液及试剂的配制
（1）样品稀释液（见表6）：pH7.4PBS溶液
表6
Figure BDA0000421818710000131
（2）洗涤液（见表7）：pH7.4的PBST溶液
表7
Figure BDA0000421818710000132
（3）芯片封闭液（见表8）：含BSA的pH7.4PBS溶液
表8
Figure BDA0000421818710000133
（4）Cy5标记抗人第二抗体的浓缩液：使用市售的抗人IgM-Cy5荧光标记二抗，稀释至浓度为1mg/ml，分装于避光小管。
（三）应用蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核的方法
使用实施例1制备的蛋白质芯片可以检测被检人血液样品中6个蛋白抗原Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835各自相应的IgM抗体的水平，联合分析这6个蛋白质的相应抗体的检测结果，可以判断被检人是否为活动性肺结核。
1、具体操作步骤
1)将实施例1点制好密封的芯片从-80℃取出，室温复温10分钟。
2)封闭：将芯片放入洗涤盒，加入约50ml芯片封闭液（表8），摇床50rpm，室温1h。
3)快速甩掉芯片上多余的液体，置于湿盒内。
4)待测样品的稀释与加样：将待测血清样品按体积比1:100用上述配制的样品稀释液（表6）稀释，取30μL稀释后的含待测血清的溶液加入到封闭的围栏封闭空间中。反应1h，室温。待检测样品临用前15分钟内配制。
5)将芯片从湿盒中取出，置于洗涤盒，加入约50ml上述配制的洗涤液，摇床50rpm，室温5min，重复3次。
6)快速甩掉芯片上多余的液体，置于湿盒内。
7)每个封闭空间加入30μL已经稀释至终浓度1μg/ml的Cy5荧光抗人二抗于芯片上，避光反应1h。
8)将芯片从湿盒中取出，置于洗涤盒，加入约50ml上述配制的洗涤液，摇床50rpm，室温5min，重复3次。再用约50ml超纯水洗一次，5min。
9)离心干燥，用Genepix扫描仪在635nm通道下读取数据。
2、待测样品分别对6种抗原蛋白抗性的判定
用Genepix扫描仪在635nm通道扫描得到的结果是通过点样点的信噪比（SNR）来进行衡量,点样点的信噪比（SNR）计算公式为：
SNR = S - B σ
式中，S和B分别代表芯片中原始的信号值（是扫描仪直接显示的数值）和背景值（非样品点制区域的信号值)，而σ则是代表该点原始信号的标准差（σ对应的实验次数为3次）。
将蛋白质芯片上点样点的信噪比值与下述表9-表14的信噪比区间（所述信噪比区间包括所给出的信噪比区间的两端值）进行对比，以进行待测样品对相应抗原抗性的阳性、阴性结果的判定：
抗Rv2693c（见表9）：
表9
Figure BDA0000421818710000142
抗Rv1833c（见表10）：
表10
Figure BDA0000421818710000143
抗Rv1899c（见表11）：
表11
Figure BDA0000421818710000151
抗Rv0526（见表12）：
表12
Figure BDA0000421818710000152
抗Rv3835（见表13）：
表13
Figure BDA0000421818710000153
抗Rv0287（见表14）：
表14
Figure BDA0000421818710000154
3、待测样品检验结果的判定
判定标准：
与正常未患有任何疾病的人相比，活动性肺结核感染人中，抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和抗Rv3835抗体水平中至少有3种抗体显著升高，具体表现为：
如果待测样品的检测结果中，抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和/或抗Rv3835抗体中，至少有3种抗体呈阳性（判断抗体是否为阳性的标准：实施例1制备的蛋白质芯片上同一抗原的2个平行点样点都判定为阳性时，该抗体为阳性。），则判定该待测样品是活动性肺结核阳性，否则为活动性肺结核阴性。
（四）、应用蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核的方法的特异性和敏感性
采用200份活动性肺结核相关患者的血清（临床诊断为活动性肺结核的患者100份，潜伏性肺结核感染的患者100份，血清样本由广东省结核病控制中心提供，血清样本的取得均经过患者及体检者的知情同意。）对实施例1的蛋白质芯片进行了特异性和敏感性检测，以上述判定标准判定待测者是否为活动性肺结核阳性。
检测结果如图3所示。图3中横坐标假阳性率代表（1-特异性），纵坐标真阳性率代表敏感性。根据阳性似然比即敏感性/（1-特异性）计算得出实施例1的蛋白质芯片辅助诊断活动性肺结核的最佳工作点的特异性为89.1%，敏感性为74.3%，均大大高于现有技术中活动性肺结核诊断的指标。
100份活动性肺结核患者中，有89份被检测出阳性；100份潜伏性肺结核感染的患者中，24份被检测出阳性。
Figure IDA0000421818800000011
Figure IDA0000421818800000021
Figure IDA0000421818800000031
Figure IDA0000421818800000051
Figure IDA0000421818800000061
Figure IDA0000421818800000071
Figure IDA0000421818800000081
Figure IDA0000421818800000091

Claims (10)

1.检测血清中抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和/或抗Rv3835抗体的水平的产品在制备具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核用途的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述Rv2693c是如下a）或b）的蛋白：
a）序列表中的SEQ ID №.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.1所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质；
所述Rv1833c是如下c）或d）的蛋白：
c）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
d）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.2所示蛋白具有相同功能的由c)衍生的蛋白质；
所述Rv1899c是如下e）或f）的蛋白：
e）序列表中的SEQ ID №.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
f）将序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.3所示蛋白具有相同功能的由e)衍生的蛋白质；
所述Rv0526是如下g）或h）的蛋白：
g）序列表中的SEQ ID №.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
h）将序列表中的SEQ ID №.4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.4所示蛋白具有相同功能的由g)衍生的蛋白质；
所述Rv0287是如下i）或j）的蛋白：
i）序列表中的SEQ ID №.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
j）将序列表中的SEQ ID №.5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.5所示蛋白具有相同功能的由i)衍生的蛋白质；
所述Rv3835是如下k）或l）的蛋白：
k）序列表中的SEQ ID №.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
l）将序列表中的SEQ ID №.6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.6所示蛋白具有相同功能的由k)衍生的蛋白质；
和/或，所述有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核用途的产品中，包括记载如下内容的说明书：与正常未患有任何疾病的人相比，活动性肺结核感染人中，抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和抗Rv3835抗体水平中至少有3种显著升高。
3.一种用于鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核的标志物组合物，由抗Rv2693c的抗体、抗Rv1833c的抗体、抗Rv1899c的抗体、抗Rv0526的抗体、抗Rv0287的抗体和抗Rv3835的抗体组成；
所述Rv2693c是如下a）或b）的蛋白：
a）序列表中的SEQ ID №.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.1所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质；
所述Rv1833c是如下c）或d）的蛋白：
c）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
d）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.2所示蛋白具有相同功能的由c)衍生的蛋白质；
所述Rv1899c是如下e）或f）的蛋白：
e）序列表中的SEQ ID №.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
f）将序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.3所示蛋白具有相同功能的由e)衍生的蛋白质；
所述Rv0526是如下g）或h）的蛋白：
g）序列表中的SEQ ID №.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
h）将序列表中的SEQ ID №.4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.4所示蛋白具有相同功能的由g)衍生的蛋白质；
所述Rv0287是如下i）或j）的蛋白：
i）序列表中的SEQ ID №.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
j）将序列表中的SEQ ID №.5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.5所示蛋白具有相同功能的由i)衍生的蛋白质；
所述Rv3835是如下k）或l）的蛋白：
k）序列表中的SEQ ID №.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
l）将序列表中的SEQ ID №.6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.6所示蛋白具有相同功能的由k)衍生的蛋白质。
4.血清中的抗Rv2693c的抗体、抗Rv1833c的抗体、抗Rv1899c的抗体、抗Rv0526的抗体、抗Rv0287的抗体和/或抗Rv3835的抗体作为标志物在开发、设计和/或制备具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核用途的产品中的应用；所述Rv2693c是如下a）或b）的蛋白：
a）序列表中的SEQ ID №.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.1所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质；
所述Rv1833c是如下c）或d）的蛋白：
c）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
d）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.2所示蛋白具有相同功能的由c)衍生的蛋白质；
所述Rv1899c是如下e）或f）的蛋白：
e）序列表中的SEQ ID №.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
f）将序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.3所示蛋白具有相同功能的由e)衍生的蛋白质；
所述Rv0526是如下g）或h）的蛋白：
g）序列表中的SEQ ID №.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
h）将序列表中的SEQ ID №.4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.4所示蛋白具有相同功能的由g)衍生的蛋白质；
所述Rv0287是如下i）或j）的蛋白：
i）序列表中的SEQ ID №.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
j）将序列表中的SEQ ID №.5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.5所示蛋白具有相同功能的由i)衍生的蛋白质；
所述Rv3835是如下k）或l）的蛋白：
k）序列表中的SEQ ID №.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
l）将序列表中的SEQ ID №.6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.6所示蛋白具有相同功能的由k)衍生的蛋白质；
所述有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核用途的产品中，包括记载如下内容的说明书：与正常未患有任何疾病的人相比，活动性肺结核感染人中，抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和抗Rv3835抗体水平中至少有3种显著升高。
5.一种用于鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核的试剂盒，包括检测芯片，所述检测芯片上连有Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835蛋白中的至少3种蛋白，每种蛋白单独成立一个检测点；优选的，所述检测芯片上连有Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和Rv3835蛋白；
所述Rv2693c是如下a）或b）的蛋白：
a）序列表中的SEQ ID №.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.1所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质；
所述Rv1833c是如下c）或d）的蛋白：
c）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
d）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.2所示蛋白具有相同功能的由c)衍生的蛋白质；
所述Rv1899c是如下e）或f）的蛋白：
e）序列表中的SEQ ID №.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
f）将序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.3所示蛋白具有相同功能的由e)衍生的蛋白质；
所述Rv0526是如下g）或h）的蛋白：
g）序列表中的SEQ ID №.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
h）将序列表中的SEQ ID №.4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.4所示蛋白具有相同功能的由g)衍生的蛋白质；
所述Rv0287是如下i）或j）的蛋白：
i）序列表中的SEQ ID №.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
j）将序列表中的SEQ ID №.5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.5所示蛋白具有相同功能的由i)衍生的蛋白质；
所述Rv3835是如下k）或l）的蛋白：
k）序列表中的SEQ ID №.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
l）将序列表中的SEQ ID №.6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID №.6所示蛋白具有相同功能的由k)衍生的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述检测芯片是将分别含有Rv2693c、Rv1833c、Rv1899c、Rv0526、Rv0287和/或Rv3835蛋白的溶液点样于载体玻片上制成的。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括说明书，所述说明书记载如下内容：
与正常未患有任何疾病的人相比，活动性肺结核感染人中，抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和抗Rv3835抗体水平中至少有3种显著升高。
8.根据权利要求5-7任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和抗Rv3835抗体水平中至少有3种抗体显著升高按照如下方法进行判断：待测样品的检测结果中，抗Rv2693c抗体、抗Rv1833c抗体、抗Rv1899c抗体、抗Rv0526抗体、抗Rv0287抗体和/或抗Rv3835抗体中，至少有3种抗体呈阳性，则判定该待测样品是活动性肺结核阳性，否则为活动性肺结核阴性；
所述抗体呈阳性的具体判断标准为若各个抗体的信噪比值处于如下值之间，则认为是该抗体呈阳性：Rv2693c的抗体的信噪比值处于2.06和2.17之间，包括2.06和2.17；Rv1833c的抗体的信噪比值处于2.05和2.17之间，包括2.05和2.17；Rv1899c的抗体的信噪比值处于2.06和2.19之间，包括2.06和2.19；Rv0526的抗体的信噪比值处于2.07和2.20之间，包括2.07和2.20；Rv3835的抗体的信噪比值处于2.09和2.20之间，包括2.09和2.20；Rv0287的抗体的信噪比值处于2.24和2.36之间，包括2.24和2.36。
9.根据权利要求5-8任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括配合检测芯片一起使用的试剂，所述试剂包括下述1）-4）：
1）pH7.4PBS溶液,其组成为：
Figure FDA0000421818700000051
溶剂为ddH2O；
2）pH7.4的PBST溶液,其组成为：
溶剂为ddH2O；
3）含BSA的pH7.4PBS溶液：
溶剂为ddH2O；
4）荧光标记的抗人第二抗体。
10.权利要求5-9任一所述试剂盒在制备具有鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查活动性肺结核用途的产品中的应用。
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