ES2447032T3 - Vacuna de la tuberculosis de BCG recombinante para inducir respuestas inmunológicas contra Mycobacterium tuberculosis - Google Patents

Abstract

Un bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante, en el que al menos un gen del regulón DosR estásobrerregulado y dicho BCG comprende al menos dos secuencias de ácidos nucleicos que son diferentes entre sí yque cada una codifica uno o más genes que están sobreexpresados, incluyendo dichas al menos dos secuencias deácidos nucleicos: i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de Mycobacterium tuberculosis (Mtb); y ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de resucitación de Mtb o dereactivación de Mtb que no es un antígeno de DosR.

Description

Vacuna de la tuberculosis de BCG recombinante para inducir respuestas inmunológicas contra Mycobacterium tuberculosis

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a vacunas de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) mejoradas que pueden evitar el desarrollo de síntomas de la tuberculosis, antes y después de la exposición al Mtb. En particular, la invención proporciona una vacuna basada en la subunidad del bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante mejorada en la que uno o más de los antígenos de Mtb y uno o más de los antígenos de resucitación o de reactivación de Mtb están sobreexpresados, y en la que al menos una porción del regulón DosR está sobrerregulada.

Antecedentes de la invención

La actual vacuna de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) profiláctica (antes de la exposición) de BCG de Mycobacterium bovis (M. bovis), introducida hace más de sesenta años, protege de forma eficaz contra la manifestación grave de la enfermedad en niños pero no evita el establecimiento de TB latente o de la enfermedad por reactivación de la infección en adolescentes y adultos. Además, casi todas las nuevas vacunas de Mtb que están en ensayos clínicos en la actualidad están diseñadas como vacunas profilácticas y no como vacunas profilácticas y terapéuticas (después de la exposición).

Se cree que el Mtb avanza a través de una serie de etapas durante su ciclo infeccioso en el ser humano como una reacción a las respuestas inmunológicas humanas, y que cada etapa está orquestada por un programa genético diferenciado que dirige la expresión de antígenos específicos de la etapa. Si este concepto es válido, entonces una vacuna de la tuberculosis verdaderamente exhaustiva debería incluir antígenos que representen cada etapa, así como antígenos que sean independientes de la etapa. La tuberculosis latente (LTBI/latencia) parece ser una de estas etapas, y las pruebas actuales sugieren que el Mtb adopta un fenotipo fisiológico exclusivo durante la latencia que se caracteriza por una bacteriostasis (persistencia no replicativa), un cambio de la respiración aerobia a la anaerobia, la expresión de la proteína chaperona pequeña !-cristalina (Acr/HspX) y una mayor resistencia a varios antibióticos micobacterianos.

El mantenimiento del estado de persistencia no replicativo, que se cree que es típico de Mtb en lesiones latentes, parece depender de la producción continua de las citoquinas Th1 (IFN∀, IL-12 y TNF!) y de óxido nítrico, y de la localización de MTB dentro de granulomas estables. Sin embargo, la reactivación de la infección de Mtb latente, que se caracteriza por la reanudación de la replicación bacteriana, una inflamación y cavitación, puede ser precipitada con prontitud por regímenes inmunosupresores (por ejemplo, corticosteroides o antagonistas de TNF!), y aparece en 5-10% de individuos con infección latente, quizás debido a la tolerancia adquirida a micobacterias ambientales, la edad y, de modo más significativo, la enfermedad del VIH. Este escenario clínico habitual y el papel probado del sistema inmunológico celular para el mantenimiento de la latencia conduce a la conclusión de que la persistencia no replicativa es un fenotipo metaestable determinado por tres procesos que interaccionan entre sí: la replicación bacteriana dentro de las lesiones latentes está constreñida por efectores del sistema inmunológico celular; las bacterias dentro de las lesiones latentes controlan la producción de efectores inmunológicos; y una menor producción de efectores inmunológicos da como resultado la reanudación de la replicación.

Hasta la fecha no se han desarrollado vacunas satisfactorias que confieran inmunidad frente a la infección por Mtb y, al mismo tiempo, puedan tratar o prevenir el desarrollo de los síntomas de TB después de una exposición a Mtb, o como resultado de la reactivación de una infección latente. Una vacuna de BCG recombinante, modificada para inducir una respuesta inmunológica de este tipo, puede reducir las tasas de reactivación en personas con grados sutiles de inmunosupresión producida, por ejemplo, por el envejecimiento, la diabetes, la enfermedad del VIH, una tolerancia adquirida a micobacterias ambientales, o la desnutrición. Así, sigue siendo necesario el desarrollo de nuevas vacunas de TB, y sería particularmente útil desarrollar una vacuna que pueda utilizarse tanto de modo profiláctico como también para un tratamiento después de la exposición.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el desarrollo de un nuevo bacillo de Calmette-Guerin recombinante (rBCG) para su uso como una vacuna. La vacuna puede utilizarse de modo profiláctico para evitar una infección por Mtb en individuos no expuestos. Sin embargo, la vacuna también es eficaz para tratar individuos que ya han sido expuesto y/o están infectados por Mtb. La vacuna evita el establecimiento de la infección y, de modo similar, evita la reactivación del Mtb latente en individuos que ya han sido previamente infectados. El rBCG que se emplea en la preparación de la vacuna está genéticamente modificado para que exprese antígenos "clásicos" de Mtb y antígenos relacionados con varias etapas del ciclo vital del Mtb, por ejemplo, latencia, reactivación y resucitación. Así, la respuesta inmunológica que se genera como resultado de una inmunización con la vacuna protege al individuo vacunado contra el desarrollo de una infección por Mtb activa en cualquiera y todas las etapas de la exposición a Mtb. En particular, el rBCG sobreexpresa 1) uno o más genes que codifican antígenos de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) que se sabe que inducen potentes respuestas inmunológicas protectoras frente a Mtb; y 2) uno o más genes que codifican al menos un antígeno de resucitación o reactivación de Mtb. Las secuencias que codifican los antígenos están localizadas sobre un elemento extracromosómico o están integradas en el cromosoma del BCG recombinante. Además, la expresión de todo o parte del regulón Dos R está sobrerregulada en el nuevo rBCG.

Las realizaciones de la invención en las que las secuencias que codifican los antígenos están integradas en el cromosona se muestran de forma esquemática en la figura 1.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Representación esquemática del rBCG de la invención.

Figura 2. Diagrama del plásmido de integración y el módulo de expresión.

Figura 3A-D. Inmunotransferencias que demuestran la expresión de los módulos de antígenos integrados en el cromosoma. A, expresión de Rv0867c a partir del precursor de AERAS-407, AFV-102pRC108, carril 1 = AFV102pRC108, carril 2 = AFV-102; B, sobreexpresión de Ag85A y Ag85B a partir del precursor de AERAS-407, AFV102RC108, carril 1 = AFV-102, carril 2 = AFV-102pRC108; C, expresión de Rv3407 a partir del precursor de AERAS407, AFV-102pRC108, carril 1 = AFV-102, carril 2 = AFV-102pRC108; D, expresión de DosR (Rv3133c) a partir del precursor de AERAS-407, AFV-102pRC108, carril 1 = AFV-102, carril 2 = AFV-102pRC108.

Figura 4. Diagrama de un segundo plásmido de integración y módulo de expresión.

Figura 5A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv3804c (A, SEQ ID NO:1) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:2).

Figura 6A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv1886c (A, SEQ ID NO:3) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:4).

Figura 7A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv0867c (A, SEQ ID NO:5) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:6).

Figura 8A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv1009c (A, SEQ ID NO:7) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:8).

Figura 9A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv1884c (A, SEQ ID NO:9) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:10).

Figura 10A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2389c (A, SEQ ID NO:11) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:12).

Figura 11A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2450c (A, SEQ ID NO:13) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:14).

Figura 12A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2623c (A, SEQ ID NO:15) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:16).

Figura 13A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv0288c (A, SEQ ID NO:17) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:18).

Figura 14A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2626c (A, SEQ ID NO:19) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:20).

Figura 15A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2005c (A, SEQ ID NO:21) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:22).

Figura 16A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv1996c (A, SEQ ID NO:23) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:24).

Figura 17A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv0685c (A, SEQ ID NO:25) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:26).

Figura 18A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv0824c (A, SEQ ID NO:27) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:28).

Figura 19A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2029c (A, SEQ ID NO:29) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:30).

Figura 20A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2627c (A, SEQ ID NO:31) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:32).

Figura 21A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv2744c (A, SEQ ID NO:33) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:34).

Figura 22A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv3347c (A, SEQ ID NO:35) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:36).

Figura 23A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv1130c (A, SEQ ID NO:37) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:38).

Figura 24A y B. Secuencia de aminoácidos de Rv1169c (A, SEQ ID NO:39) y secuencia de nucleótidos (B, SEQ ID NO:40).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención

La presente invención proporciona un nuevo rBCG para su uso en preparaciones de vacunas de Mtb. El rBCG está genéticamente modificado para que sobreexprese 1) uno o más antígenos de Mtb, que pueden incluir los denominados antígenos de Mtb clásicos, tales como Rv1886c-Ag85B ("85B") y Rv3804c-Ag85A ("85A"), entre otros, y 2) al menos un antígeno de resucitación/reactivación de Mtb. Además, en el rBCG de la invención, el regulón DosR, o una porción de este, está sobrerregulado. El regulón DosR, formado por 48 genes, generalmente se activa en Mtb como resultado de una caída en la tensión de O2 (hipoxia) después de la infección.

Los antígenos de Mtb que se seleccionan para su inclusión en el rBCG de la invención generalmente son aquellos de los cuales se sabe o se predice que inducen una respuesta inmunológica protectora en individuos expuestos a los antígenos. Pueden utilizarse diversos criterios para seleccionar los antígenos adecuados que incluyen, pero no se limitan a: la observación de que los individuos con respuestas inmunológicas contra el antígeno son capaces de controlar la infección de Mtb; la determinación de que el antígeno contiene uno o más epitopos de células T mediante un análisis inmunoinformático (por ejemplo, utilizando un programa como el que se encuentra en el sitio web de the Technical University of Denmark: cbs.dtu.dk/services/NetCTL, en el que el análisis se basa en la identificación de sitios de ruptura de proteosomas, la eficacia de transporte del retículo endoplásmico (ER), la afinidad de unión del complejo de histocompatibilidad mayor de clase I (MHC), etc.); un análisis de pruebas experimentales basado en una búsqueda bibliográfica en profundidad; la selección o clasificación de los resultados según diversos parámetros, tales como persistencia/supervivencia de macrófagos; la sobrerregulación de la expresión del sistema de dos componentes MprAB; la respuesta a la hipoxia; la implicación en la latencia; la expresión en tejido pulmonar; los genes con promotores que son corregulados con Rv2031 (Acr); las proteínas que se segregan (que son más accesibles al sistema inmunológico); la presencia de repeticiones (muchas proteínas asociadas con la virulencia tienen dominios de aminoácidos repetidos); la capacidad para actuar como inmunógeno de células B; una biogénesis asociada a la pared celular o de paredes celulares (se considera que las proteínas expuestas/asociadas a membranas son más accesibles al sistema inmunológico); los datos existentes de la eficacia de la vacuna; la exclusividad para Mtb; etc. Así, los antígenos pueden seleccionarse basándose en los datos experimentales que demuestran su eficacia o, como alternativa (o además), estos antígenos pueden seleccionarse basándose en sus capacidades predichas. Los expertos en la técnica están familiarizados con la aplicación de estos análisis, y con el desarrollo de sistemas de puntuación o clasificación para asignar una puntuación comparativa ponderada a los antígenos candidatos. Por ejemplo, pueden asignarse puntuaciones numéricas a cada atributo que se está considerando, y los antígenos con los totales acumulados más altos pueden seleccionarse para su uso. Además, otras consideraciones pueden desempeñar un papel en el proceso de toma de decisiones, algunas de las cuales tienen una naturaleza práctica (por ejemplo, la disponibilidad del antígeno, la facilidad de expresar el antígeno, la facilidad de medir las respuestas inmunológicas frente al antígeno, etc.).

El conjunto de antígenos de partida puede ser cualquiera o todos los productos de los marcos de lectura abiertos (ORF) de Mtb conocidos. Los expertos en la técnica están familiarizados con las fuentes para identificar productos de ORF de Mtb, por ejemplo, el sitio web "Tuberculist" patrocinado por el Instituto Pasteur. En una realización de la invención, los antígenos a partir de los cuales se puede realizar una selección incluyen, pero no se limitan a todos los productos de ORF de M. tuberculosis H37Rv, identificados con el n.º de registro de GenBank AL123456 (NC 000962).

En una realización preferida de la invención, los antígenos que son expresados por rBCG se seleccionan, pero no se limitan a un grupo inicial de 189 antígenos presentados en la tabla 1.

Tabla 1: Lista de los 189 antígenos seleccionados

n.º

Gen (nombre) Tamaño Anotación de NCBI [anotación actualizada](a)

Rv0079

273 proteína hipotética

Rv0101

nrp 2512 probable péptido sintasa (nrp)

Rv0125

pepA 355 probable serina proteasa pepA (MTB32A) [DegQ]

Rv0170

mce1B 346 proteína de la familia MCE mce1B [Ttg2C, transportador ABC de componentes periplásmicos]

Rv0198c

663 posible metaloproteasa de cinc [PepO, metaloendopeptidasa predicha]

Rv0211

pck4 606 fosfoenolpiruvato carboxiquinasa pckA (GTP)

Rv0227c

421 probable proteína de membrana conservada

Rv0243

fadA2 440 acetil-coA acetiltransferasa [beta ceto-tiolasa]

Rv0251c

hsp [acr2] 159 proteína de choque térmico hsp (proteína A de unión a ribosomas inducida por estrés térmico)

Rv0282

631 proteína hipotética [AAA ATPasa]

Rv0283

538 posible proteína de membrana conservada [proteína de unión a ATP/GTP]

Rv0284

[ftsk] 1330 posible proteína de membrana conservada [ATPasa de reparto de cromosomas]

Rv0285

PE5 102 proteína de la familia PE (PE5)

Rv0286

PPE4 513 proteína de la familia PPE (PPE4)

Rv0287

exsG 97 proteína similar a ESAT-6 esxG (proteína hipotética conservada TB9.8)

Rv0288

esxH (TB10.4) 96 antígeno 7 esxH de proteína de bajo PM (antígeno de 10 kDa) CFP-7, TB10.4)

Rv0289

295 proteína hipotética [transportador]

Rv0290

472 probable proteína transmembrana conservada (mgcP3) [transportador]

Rv0292

331 probable proteína transmembrana conservada

Rv0350

dnaK 625 chaperona molecular DnaK

Rv0351

grpE 235 probable proteína grpE (cofactor HSP-70)

Rv0383c

284 posible proteína segregada conservada

Rv0384c

clpB 848 probable endopeptidasa de proteína de choque térmico F84.1 de proteína ClpB (cadena B) de unión a ATP

n.º

Gen (nombre) Tamaño Anotación de NCBI [anotación actualizada](a)

Rv0450c

mmpl4 967 probable mmpL4 transmembrana conservada [exportación de fármaco]

Rv0467

icl [aceA] 428 isocitrato liasa (icl)

Rv0468

fadB2 268 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa

Rv0503c

cmaA2 302 ciclopropan-graso-acil-fosfolípido-sintasa 2 (acido ciclopropanmicólico sintasa 2, CMAA2)

Rv0569

88 proteína hipotética

Rv0572c

113 proteína hipotética

Rv0574c

[pgsA] 380 proteína hipotética [biosíntesis de pgsA poli-gamma-glutamilo]

Rv0588

yrbE2B 295 proteína de membrana integral hipotética conservada YrbE2B [Ttg2B putativo, sistema de transporte de tipo ABC implicado en la resistencia a disolventes orgánicos, componente de permeasa)

Rv0628c

383 proteína hipotética

Rv0685

Tuf 396 factor de alargamiento Tu, tuf [regulado por hierro]

Rv0754

PE_PGRS11 584 proteína de la familia PE-PGRS (PE-PGRS 11) [fosfoglicerato mutasa]

Rv0798c

cap29 265 antígeno de 29 kDa CFP-29 [linocina M-18 bacteriocina]

Rv0824c

desA1 389 probable acil-[-portador de acilo-desaturasa desA1]

Rv0847

lpqS 130 probable lipoproteína LPQS

Rv0867c

rpfA 407 posible proteína transmembrana conservada [transglicosilasa, rpfA]

Rv0885

340 proteína hipotética

Rv1006

567 proteína hipotética

Rv1009

rpfB 362 posible factor estimulante de la resucitación rpfB [transglicosilasa, dominio de adhesion C5]

Rv1057

393 proteína hipotética

Rv1094

desA2 271 posible acil-[-proteína portadora de acilo] desaturasa (DESA2)

Rv1124

ephC 316 probable epóxido hidrolasa EPHC (epóxido hidratasa)

Rv1130

[prpD] 526 proteína hipotética [2 metil-citrato deshidratasa]

Rv1131

gltA1 393 citrato sintasa (glaA1)

Rv1169c

PE11 100 proteína de la familia PE (PE11) [triacil glicerol lipasa]

n.º

Gen (nombre) Tamaño Anotación de NCBI [anotación actualizada](a)

Rv1174c

[sak5] 110 antígeno TB8.4 de células T de bajo PM [antígeno de secreción SA5K]

Rv1182

papA3 472 probable proteína asociada a poliquetida sintasa conservada PAPA3

Rv1186c

538 proteína hipotética [regulador de la expresión de poliquetida sintasa]

Rv1187

rocA 543 probable prolina-5-carboxilato deshidrogenasa rocA

Rv1188

329 probable prolina deshidrogenasa

Rv1196

PPE18 (mtb39a) 391 probable proteína de la familia PPE de prolina deshidrogenasa [MTB39a]

Rv1221

sigE 257 factor sigma-70 de ARN polimerasa (SigE)

Rv1347c

210 proteína hipotética [plegamiento de N-acetiltransferasa relacionado con GCN5]

Rv1348

[IrtA] 859 probable transportador ABC de proteína de union a ATP transmembrana de transporte de fármacos [transportador ABC esencial MdlA/MsbA, proteína de interacción con sideróforos]

Rv1349

[irtB] 579 posible transportador ABC de proteína de union a ATP transmembrana de transporte de fármacos [transportador de hierro-sideróforos ABC ATM1]

Rv1411c

lprG 236 posible lipoproteína lprG conservada

Rv1436

gap 339 gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa

Rv1461

[sufB] 846 proteína hipotética [sufB, activador de citosina desulfurasa]

Rv1462

[sufD] 397 proteína hipotética [sufD, activador de citosina desulfurasa]

yRv1464

csd [sufS] 417 posible cisteína desulfurasa csd [SufS]

Rv1465

[nifU] 162 posible proteína relacionada con la fijación de nitrógeno [IscU]

Rv1466

115 proteína hipotética [PaaD, enzima biosintética del agrupamiento de metal-azufre predicha]

Rv1477

ripA 427 proteína de invasión hipotética [hidrolasa de la pared celular Nlp_p60]

Rv1478

241 proteína de invasión hipotética [hidrolasa de la pared celular NLp_p60]

Rv1594

nadA 349 quinolina sintetasa (nadA)

Rv1636

TB15.3 146 proteína hipotética conservada regulada por hierro TB15.3 [USP]

Rv1733c

210 probable proteína transmembrana conservada

Rv1734c

80 proteína hipotética [dihidrolisina acetil-transferasa]

Rv1735c

165 proteína de membrana hipotética

n.º

Gen (nombre) Tamaño Anotación de NCBI [anotación actualizada](a)

Rv1736c

narX 652 posible nitrato reductasa narX

Rv1737c

narK2 395 posible transportador de nitrato/nitrito narK2

Rv1738

94 proteína hipotética

Rv1793

esxN 94 proteína ESXN similar a ESAT-6 putativa (proteína 5 similar a ESAT-6)

Rv1812c

[ndH] 400 posible deshidrogenasa [Ndh, NADH deshidrogenasa, subunidad que contiene FAD subunit]

Rv1813c

143 proteína hipotética

Rv1876

bfrA 159 probable bacterioferritina bfrA

Rv1884c

rpfC 176 probable factor estimulante de la resucitación rpfC [transglicosilasa]

Rv1886c

ftpB (Ag85B) 325 antígeno segregado 85-B FBPB (85-B) (micolil-transferasa 85B)

Rv1908c

katG 740 catalasa-peroxidasa-peroxinitritasa-T katG

Rv1926c

mpt63 159 proteína inmunogénica MPT63 (antígeno extracelular inmunoprotector de 16 kDa)

Rv1980c

mpb64 228 proteína inmunogénica MPT64

Rv1986

199 probable proteína de membrana integral conservada [eflujo de lisina permeasa]

Rv1996

317 proteína hipotética [USP]

Rv1997

ctpF 905 probable APTasa cptF de tipo transportador de cationes metálicos P

Rv1998c

258 proteína hipotética

Rv2004c

498 proteína hipotética [quinasa predicha]

Rv2005c

295 proteína hipotética [similar a USP]

Rv2006

otsB1 1327 probable trehalose-6-fosfato fosfatasa OSTB1

Rv2007c

fdxA 114 probable ferrodoxina fdxA

Rv2008c

441 proteína hipotética [ATPasa predicha]

Rv2011c

143 proteína hipotética [regulador de la transcripción]

Rv2028c

279 proteína hipotética [USP]

Rv2029c

pfkB 339 posible fosfofructoquinasa (pfkB)

Rv2030c

681 proteína hipotética [esterasa/transferasa putativa]

n.º

Gen (nombre) Tamaño Anotación de NCBI [anotación actualizada](a)

Rv2031c

acr (!cristalina) 144 antígeno Hsp16.3 de la proteína de choque térmico HspX (homólogo de alfacristalina) de 14 kDa

Rv2032

acg 331 proteína hipotética conservada Acg

Rv2110c

[prcB] 291 PrcB de proteosoma (subunidad beta) [proteasa de HslV]

Rv2123

PPE37 473 proteína de la familia PPE (PPE37)

Rv2140c

TB18.6 [pepB] 176 proteína hipotética (TB 18.6) [PEBP, proteína de unión a fosfatidiletanolamina bacteriana/arqueobacteriana]

Rv2182c

[pslC] 247 1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferasa

Rv2224c

[caeA] 520 probable proteasa exportada [cae, carboxilasa, proteína similar a TAP]

Rv2244

acpM 115 proteína portadora de acilo (acpM)

Rv2245

kasA 416 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa (kasA)

Rv2246

kasB 438 3-oxoacil-(proteína portadora de acilo) sintasa (kasB)

Rv2251

[glcD] 475 posible flavoproteína [GlcD, deshidrogenasas que contienen FAD/FMN]

Rv2377c

mbtH 71 proteína conservada putativa MBTH

Rv2378c

mbtG 431 lisina-N-oxigenasa MBTG [lucD]

Rv2380c

mbtE 1682 peptido sintasa MBTE [EntF]

Rv2381c

mbtD 1004 poliquetida sintasa MBTD [acil-transferasa, dominio KR]

Rv2382c

mbtC 444 poliquetida sintasa MBTC

Rv2383c

mbtB 1414 feniloxazolina sintasa (MBTB) [EntF, GrsT]

Rv2386c

mbtI 450 componente I de antranilato sintasa (MBTA) [salicilato sintasa]

Rv2389c

rpfD 154 probable factor estimulante de la resucitación rpfE [transglicosilasa]

Rv2428

ahpC 195 alquil hidroxiperóxido reductasa C proteína ahpC

Rv2429

ahpD 177 alquil hidroxiperóxido reductasa D proteína ahpD

Rv2430c

PPE41 194 proteína de la familia PPE (PPE41)

Rv2450c

rpfE 172 probable factor estimulante de la resucitación rpfE [transglicosilasa]

Rv2457c

clpX 426 subunidad de unión a ATP de la proteasa dependiente de ATP (CplX)

Rv2466c

207 proteína hipotética [DsbA_FmE putativa] [tiol oxidorreductasa, biosíntesis de poliquetida]

n.º

Gen (nombre) Tamaño Anotación de NCBI [anotación actualizada](a)

Rv2510c

533 proteína hipotética [dominio de unión a ATP]

Rv2515c

415 proteína hipotética [cinc peptidasa putativa]

Rv2516c

250 proteína hipotética

Rv2557

224 proteína hipotética

Rv2590

fadD9 1168 probable ácido graso coA ligasa fadD9

Rv2620c

141 probable proteína transmembrana conservada

Rv2621c

224 posible proteína reguladora transcripcional

Rv2622

273 posible metiltransferasa (metilasa)

Rv2623

TB31.7 297 proteína hipotética TB31.7 [USP]

Rv2625c

393 probable proteína rica en alanina y rica en leucina transmembrana conservada [dominio CBS de cinc-proteasa M-50]

Rv2626c

143 proteína hipotética [regul./unión de apareamiento CBS, euk]

Rv2627c

413 proteína hipotética

Rv2628

120 proteína hipotética

Rv2629

374 proteína hipotética [factor de liberación de cadena peptídica erF1]

Rv2657c

86 probable proteína profago phiRv2 [proteína reguladora MerR]

Rv2659c

375 probable phiRv2 profago integrasa

Rv2660

75 proteína hipotética

Rv2710

sigB 323 factor sigma de ARN polimerasa (SigB)

Rv2744c

35kd-Ag [pspA] 270 proteína rica en alanina de 35 kDa conservada [proteína de choque de fago IM30]

Rv2780

ald 371 L-alanina deshidrogenasa segregada ald (antígeno de 40 kDa, TB43)

Rv2833c

ugpB 436 probable lipoproteína UGPB de unión a Sn-glicerol-3-fosfato

Rv2856

nicT 372 posible proteína de membrana integral de transporte de níquel nicT

Rv2869c

404 probable proteína transmembrana conservada [metaloproteasa de cinc asociada a membrana pdz putativa]

Rv2875

mpt70 193 proteína inmunogénica segregada mayor MPT70

Rv2930

fadD26 626 ácido graso-coA ligasa FadD26

n.º

Gen (nombre) Tamaño Anotación de NCBI [anotación actualizada](a)

Rv2986c

hupB 214 probable homólogo de proteína HU de unión al ADN HupB (proteína similar a histonas, proteína de unión a laminina-2 de 21 kDa)

Rv2999

lppY 321 probable lipoproteína conservada LPPY

Rv3126c

104 proteína hipotética

Rv3127

344 proteína hipotética [posible nitrorreductasa]

Rv3129

110 proteína hipotética

Rv3130c

tgsI 463 proteína hipotética [diacilglicerol aciltransferasa]

Rv3131

nfnB 332 proteína hipotética [posible nitrorreductasa NfnB]

Rv3132c

devS 578 detector de histidina quinasa de dos componentes DevS

Rv3133c

devR 217 proteína reguladora de la transcripción de dos componentes DevR

Rv3134c

268 proteína hipotética [USP]

Rv3139

fadE24 468 probable acil-coA deshidrogenasa FadE24

Rv3140

fadE23 401 probable acil-coA deshidrogenasa FadE23

Rv3173c

200 probable proteína reguladora transcripcional (familia TetR/acRR)

Rv3229c

desA3 427 posible linoleoil-coa desaturasa (delta-(6)-desaturasa)

Rv3250c

rubB 495 probable rubredoxina rubB

Rv3251c

rubA 55 probable rubredoxina rubA

Rv3283

sseA 297 probable tiosulfato azufretranserasa SSEA (rodanasa)

Rv3290c

lat 449 L-lisina épsilon aminotransferasa

Rv3347c

PPE55 3157 proteína de la familia PPE (PE55) [8 copias de repeticiones de pentapéptido]

Rv3372

ostB2 391 posible trehalose-6-fosfato fosfatasa (OSTB2)

Rv3515c

fadD19 548 ácido graso-coA ligasa dependiente de AMP FadD19

Rv3516

echA19 263 enoil-coA hidratasa/isomerasa (echA19)

Rv3546

fadA5 391 acetil-coA acetiltransferasa (FadA5)

Rv3570c

[ncnH] 394 posible oxidorreductasa [NcnH, naftociclinona hidroxilasa]

Rv3593

lpqF [penP] 452 probable lipoproteína conservada LPQF [PenP, beta-lactamasa de clase A]

n.º

Gen (nombre) Tamaño Anotación de NCBI [anotación actualizada](a)

Rv3597c

lsr2 112 probable precursor de la proteína LSR2 regulada por hierro

Rv3616c

[espB] 392 proteína rica en alanina y rica en glicina hipotética conservada [componente del sistema de secreción ESAT]

Rv3619c

esxV 94 proteína similar a ESAT-6 putativa ESXV (proteína 1 similar a ESAT-6)

Rv3660c

350 proteína hipotética

Rv3763

lpqH 159 precursor de antígeno de lipoproteína de 19 kDa LPQH

Rv3804c

fbpA (Ag85A) 338 antígeno segregado 85-A FBPA (85-A) (micolil-transferasa 85A)

Rv3812

PE_PGRS62 504 proteína de la familia PE-PGRS (PE_PGRS62)

Rv3833

263 proteína reguladora transcripcional [probable familia araC]

Rv3839

258 proteína hipotética

Rv3840

137 probable proteína reguladora transcripcional [atenuador de la transcripción relacionado con el envuelta celular]

Rv3841

bfrB 181 posible bacterioferritina bfrB

Rv3871

[Ftsk] 591 proteína hipotética [FtsK_SPOIIIE]

Rv3873

PPE68 368 proteína de la familia PPE [PPE68, inmunógeno RD1 T/B]

Rv3874

esxB 100 antígeno de filtrado de cultivo de 10 kDa ESXB (LHP, CFP-10)

Rv3875

esxA 95 diana antigénica secretora temprana de 6 kDa ESXA (ESAT-6)

Rv3876

[Ftsk] 666 proteína rica en alanina y prolina hipotética conservada [ATPasa de reparto de cromosomas]

Rv3878

280 proteína rica en alanina hipotética conservada

Rv3879c

729 proteína rica en alanina y prolina hipotética

(a). La anotación NCBI se basa en el n.º de registro AL123456 (NC_000962); la anotación actualizada se basa en análisis bioinformáticos, los datos de servidores relacionados con MTB y pruebas experimentales.

En una realización más preferida de la invención, los antígenos que son expresados por el rBCG son los 45 antígenos presentados en las tablas 2 y 3.

Tabla 2. Antígenos de primer rango (según la clase/fase)

n.º

Gen (nombre) Tamaño Anotación de NCBI [anotación actualizada](a) Puntuación Cual. Puntuación Cuant.

Clase: LATENCIA/DosR

Rv1738

94 proteína hipotética 9 14

Rv2623

TB31.7 297 proteína de choque térmico TB31.7 [proteína de estrés universal] 9 14

Rv2031c

acr (!crIstallina) 144 antígeno de 14kDa de proteína de choque térmico HspX (homólogo de alfa-cristalina) Hsp16.3 8 14

Rv2032

acg 331 proteína hipotética conservada Acg [nitrorreductasa] 8 13

Rv2626c

143 proteína hipotética [regulación/unión de apareamiento CBS, euk] 8 13

Rv2005c

295 proteína hipotética [similar a USP] 8 12

Rv3127

344 proteína hipotética [posible nitrorreductasa] 8 12

Rv1733c

210 probable proteína transmembrana conservada 8 11

Rv1996

317 proteína hipotética [USP] 8 10

Rv2628

120 proteína hipotética 8 9

Rv0079

273 proteína hipotética 7 11

Rv3130c

[tgsI] 463 proteína hipotética [diacilglicerol aciltransferasa] 7 11

Rv3131

[nfnB] 332 proteína hipotética [posible nitrorreductasa NfnB] 7 11

Rv1813c

143 proteína hipotética 7 9

Rv2006

otsB1 1327 probable trehalosa-6-fosfato fosfatasa OTSB1 7 9

Rv2029c

pfkB 339 posible fosfofructoquinasa (pfkB) 7 9

Rv2627c

413 proteína hipotética [serina endopeptidasa] 7 9

Rv2030c

681 proteína hipotética [esterasa/transferasa putativa] 6 10

Rv3132c

devs 578 detector de histidina quinasa de dos componentes DEVS 6 10

Rv2629

374 proteína hipotética [factor de liberación peptídico erf-1] 6 9

Clase: RESUCITACIÓN

Rv2450c

rpfE 172 probable factor estimulante de la resucitación rpfE [transglicosilasa] 9 14

Rv1009

rpfB 362 posible factor estimulante de la resucitación rpfB [transglicosilasa, dominio de adhesión C5] 9 13

Rv0867c

rpfA 407 posible proteína transmembrana conservada [transglicosilasa, rpfA] 9 12

Rv2389c

rpfD 154 probable factor estimulante de la resucitación rpfD [transglicosilasa] 8 10

Rv1884c

rpfC 176 probable factor estimulante de la resucitación rpfC [transglicosilasa] 7 8

Clase: REACTIVACIÓN

Rv1009

rpfB 362 posible factor estimulante de la resucitación rpfB [transglicosilasa, dominio de adhesión C5] 9 13

Rv0867c

rpfA 407 posible proteína transmembrana conservada [transglicosilasa, rpfA] 9 12

Rv0288

esxH (TB10.4) 96 antígeno 7 de proteína de bajo PM esxH (antígeno de 10kDa) CFP-7, TB10.4) 8 13

Rv0685

Tuf 396 factor de alargamiento Tu [regulado por hierro] 8 9

Rv0824c

desAI 389 probable acil[-vehículo de acilo-desaturasa desa1] 7 10

Rv2744c

35kd-Ag [pspA] 270 proteína rica en alanina de 35 kDa conservada [proteína de choque de fago IM30] 7 8

Rv3347c

PPE55 3157 proteína de la familia PPE 55 [8 copias de repeticiones de pentapéptido] 6 10

Rv1130

prpD 526 proteína hipotética [2 metil-citrato deshidratasa] 6 9

Rv1169c

PE11 100 proteína de la familia PE (PE11) [triacil glicerol lipasa] 6 9

Clase: CLASICA

Rv1886c

fbpB (Ag85B) 325 micolil transferasa/unión a fibronectina 8 14

Rv1980c

mpb64 228 antígeno MPT64/MPB64 7 13

Rv3804c

fbpA (Ag85A) 338 micolil transferasa/unión a fibronectin 7 13

Rv3875

esxA 95 antígeno secretor temprano de 6 kDa esxA 6 11

Rv1926c

mpt63 159 proteína inmunogénica MPT63 (proteína extracelular inmunoprotectora de 16 kDa) 6 10

Clase: CLASICA

Rv0467

icl 428 isocitrato liasa (icl) [AceA] 6 9

Clase: OTROS

Rv3873

PPE68 368 proteína hipotética 8 13

Rv1908c

katG 740 catalasa-peroxidasa-peroxinitritasa-T (dependiente de hemo KATG) 7 10

Rv1174c

sak5 110 antígeno de células T de bajo PM TB8.4 (segregado) 7 9

Rv1349

irtB 579 probable transportador ABC de proteína de unión a ATP de trasnporte de fármacos [transportador de hierro-sideróforos ABC ATM1 ABC] 7 9

Rv2780

ald 371 L-alanina deshidrogenasa ALD segregada (antígeno de 40 kDa) (TB4.3, piridina nucleótico transhidrogenasa asociada a células) 7 9

Rv2620c

141 probable proteína transmembrana conservada 7 8

Rv1793

esxN 94 proteína similar a ESAT-6 putativa (ESXN, proteína 5 similar a ESAT-6) 6 9

(a). La anotación NCBI se basa en el n.º de registro AL123456 (NC_000962); la anotación actualizada se basa en análisis bioinformáticos, los datos de servidores relacionados con MTB y pruebas experimentales.

La lista de los 45 antígenos de primer rango se clasifica según las siguientes clases:

5 * genes del regulón DosR (Voskuil et al., 2003, J. Exp. Med., 198(5):705-713; Voskuil et al., 2004, Tuberculosis, 84, 218-227)

*

genes de resucitación

*

genes de reactivación (fundamentalmente según Talaat et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci., 189(21):7877-7886)

*

genes clásicos

10 * otros (principalmente implicados en la persistencia y la respuesta al estrés) Algunos de los antígenos aparecen en más de una clase en la tabla 3. Tabla 3. Antígenos de primer rango clasificados por puntuaciones cualitativas y cuantitativas

n.º

Gen (nombre) Tamaño Anotación de NCBI [anotación actualizada](a) Puntuación Cual. Puntuación Cuant. Clase/Fase

GRUPO1

Rv1738

94 proteína hipotética 9 14 DosR

Rv2450c

rpfE 172 probable factor estimulante de la resucitación rpfE [transglicosilasa] 9 14 Resucitación

Rv2623

TB31.7 297 proteína hipotética TB31.7 [USP] 9 14 DosR

n.º

Gen (nombre) Tamaño Anotación de NCBI [anotación actualizada](a) Puntuación Cual. Puntuación Cuant. Clase/Fase

GRUPO1

Rv1009

rpfB 362 posible factor estimulante de la resucitación rpfB [transglicosilasa, dominio de adhesión C5] 9 13 Reactivación Resucitación

Rv0867c

rpfA 407 posible proteína transmembrana conservada [transglicosilasa, rpfA] 9 12 Reactivación Resucitación

Rv2031c

acr (!cristalina) 144 proteína de choque térmico HspX (homólogo de !-cristalina) 8 14 DosR

antígeno de 14 kDa Hsp 16.3

Rv1886c

fbpB (Ag85B) 325 antígeno segregado 85-B FBPB (85-B) (micolil-transferasa 85B) 8 14 Clásico

Rv0288

esxH (TB10.4) 96 antígeno 7 de proteína de bajo PM 7 esxH (antígeno de 10 kDa) CFP-7, TB10.4) 8 13 Reactivación

Rv2032

acg 331 proteína hipotética conservada Acg [nitrorreductasa] 8 13 DosR

Rv2626c

143 proteína hipotética [regulación/unión de apareamiento CBS, euk] 8 13 DosR

Rv3873

PPE68 368 proteína de la familia PPE [PPE68, RD1 T/B inmunógeno] 8 13 Others

Rv2005c

295 proteína hipotética [similar a USP] 8 12 DosR

Rv3127

344 proteína hipotética [posible nitrorreductasa] 8 12 DosR

GRUPO II

Rv1733c

210 probable proteína transmembrana conservada 8 11 DosR

Rv1996

317 proteína hipotética [USP] 8 10 DosR

Rv2389c

rpfD 154 probable factor estimulante de la resucitación rpfD [transglicosilasa] 8 10 Resucitación

Rv0685

Tuf 396 factor de alargamiento Tu [regulado por hierro] 8 9 Reactivación

Rv2628

120 proteína hipotética 8 9 DosR

Rv1980c

mpb64 228 proteína inmunogénica MPT64 7 13 Clásico

Rv3804c

fbpA (Ag85A) 338 antígeno segregado 85-A FBPA (85-A) (micolil-transferasa 85A) 7 13 Clásico

Rv0079

273 proteína hipotética 7 11 DosR

Rv3130c

[tgsI] 463 proteína hipotética [diacilglicerol aciltransferasa] 7 11 DosR

Rv3131

[nfnB] 332 proteína hipotética [posible nitrorreductasa NfnB] 7 11 DosR

Rv0824c

desA1 389 probable acil[-vehículo de acilo-desaturasa desA1] 7 10 Reactivación

Rv1908c

katG 740 catatasa-peroxidasa-peroxinitritasa-T katG 7 10 Otros

Rv1174c

[sak5] 110 antígeno de células T de bajo PM TB8.4 [antígeno de secreción SA5K] 7 9 Otros

Rv1349

[irtB] 579 probable transportador de ABC de proteína de union a ATP de transporte de fármacos [transportador de hierro-sideróforos ABC ATM1] 7 9 Otros

Rv1813c

143 proteína hipotética 7 9 DosR

Rv2006

otsB1 1327 probable trehalosa-6-fosfato fosfatasa OSTB1 7 9 DosR

Rv2029c

pfkB 339 posible fosfofructoquinasa (pfkB) 7 9 DosR

Rv2627c

413 proteína hipotética [serina endopeptidasa] 7 9 DosR

Rv2780

ald 371 L-alanina deshidrogenasa segregada ald (antígeno de 40 kDa, TB43) 7 9 Otros

GRUPO III

Rv1884c

rpfC 176 probable factor estimulante de la resucitación rpfC [transglicosilasa] 7 8 Resucitación

GRUPO III

Rv2620c

141 probable proteína transmembrana conservada 7 8 Otros

Rv2744c

35kd-Ag [pspA] 270 proteína rica en alanina de 35 kDa conservada [proteína de choque de fago IM30] 7 8 Reactivación

Rv3875

esxA 95 diana antigénica secretora temprana de 6 kDA ESXA (ESAT-6) 6 11 Clásico

Rv1926c

mpt63 159 proteína inmunogénica MPT63 (proteína extracelular inmunoprotectora de 16 kDa) 6 10 Clásico

Rv2030c

681 proteína hipotética [esterasa/transferasa putativa] 6 10 DosR

Rv3132c

devs 578 detector de histidina quinasa de dos componentes DEVS 6 10 DosR

Rv3347c

PPE55 3157 proteína de la familia PPE (PE55) [8 copias de repeticiones de pentapéptido] 6 10 Reactivación

Rv0467

icl 428 isocitrato liasa(icl) [AceA] 6 9 Clásico

Rv1130

[prpD] 526 proteína hipotética [2 metil-citrato deshidratasa] 6 9 Reactivación

Rv1169c

PE11 100 proteína de la familia PE (PE11) [triacil glicerol lipasa] 6 9 Reactivación

Rv1793

esxN 94 proteína similar a ESAT-6 putativa ESXN (proteína 5 similar a ESAT-6) 6 9 Otros

Rv2629

374 proteína hipotética [factor de liberación peptídico erF1] 6 9 DosR

(a). La anotación NCBI se basa en el n.º de registro AL123456 (NC_000962); la anotación actualizada se basa en análisis bioinformáticos, los datos de servidores relacionados con MTB y pruebas experimentales.

La lista de los 45 antígenos de primer rango se clasifica mediante la puntuación cualitativa y después mediante la puntuación cuantitativa según esta invención y según se analiza en el ejemplo 1. Este método conduce a los 5 siguientes 3 grupos:

-

Grupo I: antígenos con puntuaciones cualitativas 9-8, y dentro de los antígenos con una puntuación cualitativa de 8, el límite de exclusión de la puntuación cuantitativa es 12.

-

Grupo II: antígenos con puntuaciones cualitativas 8-7, el límite de exclusión de la puntuación cuantitativa de 7 es 9.

-

Grupo III: antígenos con puntuaciones cualitativas 7-6, el límite de exclusión de la puntuación cuantitativa de 6 es 9.

10 Los antígenos con más de 5 segmentos transmembrana se retiraron de la lista.

En general, al menos uno de estos antígenos será sobreexpresado y varias antígenos diferentes pueden ser sobreexpresados. Por ejemplo, aproximadamente 1-20 o más de estos antígenos o, como alternativa, aproximadamente 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o solo 1 de dichos antígenos será sobreexpresado por el rBCG. Además, múltiples copias de uno o más de los antígenos pueden ser codificadas y

15 sobreexpresadas en el rBCG. Las secuencias de aminoácidos de los antígenos seleccionados y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican se muestran en las figuras 5A-B a 25A-B.

Además, el rBCG contiene secuencias de ácidos nucleicos que comprenden uno o más genes que codifican y sobreexpresan al menos un antígeno de resucitación/reactivación de Mtb. Los expertos en la técnica sabrán que la definición precisa de antígenos de "resucitación" y "reactivación" puede variar algo en la técnica y, en algunos casos, 20 las definiciones pueden solaparse. Para los objetivos de la invención no es necesario separar los antígenos de

resucitación y de reactivación, puesto que todos se identifican como importantes para el rebrote de Mtb desde el estado latente. En el sentido más preciso, los antígenos de resucitación (es decir, los factores estimulantes de la resucitación) son un subconjunto de antígenos de reactivación que se definen como que poseen una homología de secuencia o funcional significativa con el factor estimulante de la resucitación de Micrococcus luteus (G. Mukamolova et al., Archives of Microbiology, volumen 172, 1999). Para los objetivos de la presente solicitud, un antígeno de "reactivación" es una proteína expresada por M. tuberculosis que induce una respuesta inmunológica en seres humanos con tuberculosis activa pero sin infección por Mtb latente. También pueden identificarse como inmunógenos expresados por Mtb durante el rebrote a partir de una fase estacionaria no replicativa en el modelo de Wayne de tuberculosis latente. Esto puede incluir moléculas que se expresan durante la emergencia de Mtb desde el estado latente hasta el bacilo tuberculoso activo. Los ejemplos de antígenos de reactivación/resucitación adecuados incluyen Rv0867c, Rv0288, Rv1009, Rv0685, Rv0824c, Rv2744c, Rv3347c, Rv1130, Rv1169c, Rv1009, Rv1884c, Rv2389c, y Rv2450c. En una realización preferida, los antígenos de reactivación/resucitación expresados son Rv0867c, Rv1884c, y Rv2389c.

Además, en el rBCG de la invención, los genes del regulón DosR (regulador de la supervivencia durante la latencia), o una de sus porciones, están sobrerregulados y se expresan. El regulón completo puede estar sobrerregulado, o una porción adecuada de este. Por e, los genes que codifican antígenos que son reconocidos por individuos con TB latente pueden ser los más adecuados para la sobrerregulación. Los ejemplos de antígenos sobrerregulados de DosR incluyen Rv1738, Rv2623, Rv2031c, Rv2032, Rv2626c, Rv2005c, Rv3127, Rv1733c, Rv1996, Rv2628, Rv0079, Rv3130c, Rv3131, Rv1813c, Rv2006, Rv2029c, Rv2627c, Rv2030c, Rv3132c, y Rv2629. Merece la pena advertir que existe algo de solapamiento entre los antígenos de latencia y de reactivacion, que probablemente refleje la presencia extendida de antígenos relacionados con la latencia en organismos previamente latentes que vuelven a entrar en una fase de crecimiento activo, o su función en el estado latente y de replicación activa después de la reactivación en el hospedante mamífero. En la tabla 4 se listan los antígenos que puede considerarse que se solapan entra la latencia y la reactivación.

Tabla 4. Antígenos que se solapan en la latencia y la reactivación.

Antígenos de reactivación/dosR

Rv1996

Rv2005 Rv2029 Rv2623 Rv2626 Rv2727

"Sobrerregular" significa que la expresión de cada uno de los genes individuales del regulón o sus proteínas traducidas aumenta por encima del nivel al cual se expresan cuando el regulón está en un estado "reprimido". Las proteínas del regulón DosR normalmente se expresan a un nivel relativamente bajo. Tras la privación de oxígeno y/o la presencia de compuestos de nitrógeno oxidantes, las proteínas DosS y DosT de organismos complejos de TB se autofosforilan y transfieren su fosfato a DosR. Después, DosR se une a secuencias discretas cadena arriba de los genes regulados por DosR, activando con ello su transcripción y sobrerregulando este grupo de genes y productos génicos que constituye el regulón DosR. La sobrerregulación, dentro del práctica de esta invención, imita el efecto de privación de oxígeno, en el que los genes DosR tienen una mayor transcripción.

Los expertos en la técnica están familiarizados con las estrategias para modificar genéticamente un organismo para sobrerregular genes de interés seleccionados, o regulones de interés seleccionados. Estas estrategias incluyen, pero no se limitan a la sobreexpresión del regulador, la introducción de mutaciones en el regulador o detector que hacen que sean constitutivamente activos, la introducción de reguladores que imitan la función del regulador en cuestión, la introducción de quinasas o productos de bucle de retroalimentación que activan el detector o regulador, o la introducción de genes/productos génicos que imitan el estado ambiental que provoca la activación del detector o regulador. En una realización preferida, el regulón DosR está sobrerregulado por la sobreexpresión del regulador de la respuesta de DosR (Rv3133c) del sistema regulador de "dos componentes" DosRST.

En otra realización preferida, la vacuna incluye uno o más de Rv1908, Rv3873, Rv2780 y Rv1349. Estos son antígenos inmunopotentes que fueron identificados mediante simulación por ordenador y/o mediante experimentación.

Además, el rBCG de la invención puede codificar antígenos seleccionados basándose en otros criterios, tales como una eficacia protectora demostrada en un modelo animal, o la expresión del antígeno por Mtb pero no BCG (J Mattow et al., Electrophoresis, 22:2936-2946, 2001; P.R. Jungblut, Molecular Microbiology, 33:1103-1117, 1999; H.J. Mollenkopf et al., Infection and Immunity, 72:6471-6479, 2004). En una realización preferida, el rBCG de la invención expresa Rv3407, que normalmente es expresado por Mtb pero no por BCG, y se ha demostrado que protege contra la tuberculosis en un modelo de ratón.

El BCG que está genéticamente modificado según se describe en la presente puede ser de cualquier cepa de BCG que se considere adecuada, que incluye, pero no se limita a las cepas de BCG BCG1331, BCG Pasteur, BCG Tokio, BCG Copenhague, BCG Moreau, o BCG Moscú.

En una realización preferida, la cepa es BCG1331. Además, el rBCG puede modificarse genéticamente aún más para que tenga otros rasgos, por ejemplo, un gen de perfringolisina O (pfo) (para faciliar el escape del endosoma); para que exprese diversos marcadores de selección, tales como la resistencia a antibióticos o un marcador de selección auxotrófico, en el que un gen fundamental para el rBCG (por ejemplo, para la síntesis de leucina o lisina) se deleciona y debe complementarse (por ejemplo, por un elemento extracromosómico que codifique el gen crucial que falta) para que la bacteria sobreviva; por la deleción de genes o la inhibición de la función de productos génicos que reprimen la apoptosis, etc.

En general, el rBCG de la invención está genéticamente modificado para que sobreexprese antígenos seleccionados mediante la introducción de genes que codifican los antígenos de interés en el cromosoma del rBCG bajo el control transcripcional de secuencias de control de la expresión muy activas, que pueden incluir las secuencias que son más activas durante la infección de mamíferos. Sin embargo, los genes que codifican los antígenos de interés también pueden expresarse a partir de un plásmido extracromosómico bajo el control transcripcional de secuencias de control de la expresión muy activas. Las secuencias de control de la expresión incluyen, pero no se limitan a promotores, sitios de entrada a ribosomas, etc.

La presente invención también proporciona composiciones para su uso para inducir una respuesta inmunológica y/o la vacunación de un mamífero. Las composiciones pueden utilizarse como vacuna contra Mtb. Las composiciones de la invención incluyen rBCG genéticamente modificado según se describe en la presente, y un vehículo farmacológicamente adecuado. La preparación de dichas composiciones para su uso como vacunas es muy conocida por los expertos en la técnica. Generalmente, dichas composiciones se preparan como disoluciones o suspensiones líquidas, aunque también se contemplan formas sólidas, tales como comprimidos, píldoras, polvos y similares. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la disolución o la suspensión en líquidos antes de la administración. La preparación también puede emulsionarse. Los ingredientes activos pueden mezclarse con excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con los ingredientes activos. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, disolución salina, dextrosa, glicerol, etanol y similares, o sus combinaciones. Además, la composición puede contener cantidades pequeñas de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulgentes, agente tamponantes del pH y similares. Además, la composición puede contener otros adyuvantes. Si se desea administrar una forma oral de la composición pueden añadirse diversos espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulgentes, adyuvantes de la dispersión o ligantes y similares. La composición de la presente invención puede contener cualquiera de dichos ingredientes adicionales para proporcionar la composición en una forma adecuada para la administración. La cantidad final de rBCG en las formulaciones puede variar. Sin embargo, en general, la cantidad en las formulaciones será de aproximadamente 1-99%. Las composiciones también pueden comprender otros adyuvantes, cuyos ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a Seppic, Quil A, Alhydrogel, etc.

La formulación de vacuna también implica estudios para determinar la máxima viabilidad bacteriana y la estabilidad a través del proceso de fabricación. Esto incluye la determinación de la máxima viabilidad del organismo (vivo a muerto) durante el cultivo, utilizando una diversidad de medios empleados habitualmente para el cultivo de micobacterias e incluyen la adición de glicerol, azúcares, aminoácidos y detergentes o sales. Después las células cultivadas se recolectan mediante centrifugación o filtración de flujo tangencial y se resuspenden en un medio estabilizante que permita la protección de las células durante el proceso de congelación o liofilización. Los agentes estabilizantes que se emplean habitualmente incluyen glutamato de sodio, aminoácidos o derivados de aminoácidos, glicerol, azúcares o sales que se emplean habitualmente. La formulación final proporcionará suficientes organismos viables para ser administrados por inyección percutánea, intradérmica, por perfusión o por vía oral, con la suficiente estabilidad como para mantenerse y una caducidad adecuada para la distribución y el uso.

Los métodos de la presente invención implican la administración de una composición que comprende el rBCG de la invención en un vehículo farmacológicamente adecuado a un sujeto, normalmente un mamífero humano. Las preparaciones de vacunas de la presente invención pueden administrarse mediante cualquiera de los muchos medios adecuados que son muy conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a la inyección, por vía oral, intranasal, por ingestión de un producto alimentario que contenga el antígeno, etc. Sin embargo, en una realización preferida, la vía de administración es la inyección intradérmica. Además, las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con otros medicamentos o composiciones inmunogénicas, por ejemplo, como parte de una vacuna de múltiples componantes. Además, la administración puede ser un único acontecimiento, o pueden administrarse múltiples dosis de refuerzo en diversos intervalos programados para aumentar la respuesta inmunológica. En una realización, la preparación de la vacuna de la invención se emplea para una inmunización inicial, y el individuo que recibe la vacuna inicial después se "refuerza" con una o más composiciones de vacunas diferentes, por ejemplo, una vacuna de BCG atenuada conocida. Como alternativa, un individuo puede vacunarse con otra preparación de vacuna y reforzarse una o más veces con la preparación de vacuna de la presente invención. En algunas realizaciones de la invención, las composiciones de refuerzo incluyen ácidos nucleicos que codifican uno o más antígenos de Mtb, por ejemplo: i) uno o más antígenos, tales como Rv1738, Rv2623, Rv2031c, Rv2032, Rv2626c, Rv2005c, Rv3127, Rv1733c, Rv1996, Rv2628, Rv0079, Rv3130c, Rv3131, Rv1813c, Rv2006, Rv2029c, Rv2627c, Rv2030c, Rv2629, Rv2450c, Rv1009, Rv0867c, Rv2389c, Rv1884c, Rv0288, Rv0685, Rv0824c, Rv2744, Rv3347c, Rv1130, Rv1169c, Rv1886, Rv1980c, Rv3804c, Rv3875, Rv1926c, Rv0467, Rv3873, Rv1908c, Rv1174c, Rv2780, Rv2620c, Rv1793, Rv1349 y Rv3132; ii) uno o más

antígenos, tales como Rv1996, Rv2005, Rv2029, Rv2623, Rv2626 y Rv2727; iii) uno o más antígenos, tales como Rv2626, Rv1738, Rv2623, Rv1733, Rv2032, Rv3131, Rv3127, Rv3130c, Rv3804c y Rv1886c; y iv) uno o más antígenos que incluyen al menos uno de un antígeno de dosR, un antígeno de reactivación y/o un antígeno de resucitación, por ejemplo, un antígeno de cada etapa (latencia, reactivación y resucitación) del ciclo vital de M. tuberculosis.

Una ventaja concreta de la preparación de vacuna de la presente invención es que la administración puede ser profiláctica, es decir, antes de que se haya producido la exposición a la bacteria, o se sospeche que se haya producido, o después del hecho, es decir, después de una exposición conocida o sospechada, o de modo terapéutico, por ejemplo, después de la aparición de síntomas de enfermedad asociados con una infección bacteriana. Esto es porque los antígenos que están implicados en el ciclo vital de Mtb o los procesos de infección y enfermedad, tales como la resucitación y la reactivación, se incluyen en la vacuna. Así, la vacuna es útil no solo para prevenir el establecimiento inicial de una infección de Mtb, sino también para prevenir la reactivación de una infección de Mtb latente.

Antes de la administración a seres humanos como una vacuna, las cepas genéticamente modificadas de rBCG de la presente se ensayan según métodos que son muy conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se realizan ensayos para la toxicidad, la virulencia, la seguridad, etc., en modelos animales adecuados, por ejemplo, en ratones, cobayas, etc., algunos de los cuales están inmunocomprometidos. De forma similar, generalmente se ensaya la capacidad de las preparaciones de vacunas para inducir una respuesta inmunológica en modelos animales adecuados, por ejemplo, en ratones, cobayas, etc. Además, pueden realizarse estudios de protección que implican una vacunación, un refuerzo y la posterior exposición al Mtb vivo, utilizando modelos animales adecuados, tales como ratones, cobayas, y primates no humanos. Por último, los expertos en la técnica están familiarizados con las disposiciones para realizar ensayos clínicos en seres humanos que lo consienten, para ensayar la eficacia de las preparaciones de vacunas. Para más detalles véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EEUU 20060121054 (Sun et al.), publicada el 8 de junio, 2006, y las referencias citadas en ella.

"Inducir una respuesta inmunológica" significa que la administración de la preparación de vacuna de la presente provoca la síntesis de anticuerpos específicos (con una titulación en el intervalo de 1 a 1 x 106, preferiblemente 1 x 103, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 106, y lo más preferiblemente mayor que 1 x 106) y/o la proliferación celular, según se mide, por ejemplo, mediante ensayos celulares en los que se evalúa la producción de IFN-∀, por ejemplo, por la incorporación de timidina-3H, u otros medios adecuados. En una realización preferida, la respuesta inmunológica es una respuesta inmunológica protectora, es decir, la respuesta inmunológica protege al individuo vacunado frente a una exposición futura con Mtb. Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que no es necesario que una vacuna o una preparación inmunoestimulante proporcione una protección total para que transmita un beneficio a un paciente. Por ejemplo, las preparaciones pueden inducir respuestas inmunológicas que frenen o disminuyan el avance de los síntomas de la enfermedad, sin errardicarlos por completo.

Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar la práctica de la inención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Selección de antígenos adecuados y diseño de rBCG basado en esta selección

Se seleccionó un grupo inicial de proteínas de Mtb (189 antígenos, véase la tabla 1) de todos los posibles 3989 ORF de Mtb, según el siguiente procedimiento de selección:

(1)

Compilación de los datos disponibles de todos los productos de los 3989 ORF de TB: Se realiza una búsqueda en la bibliografía para análisis globales (por ejemplo, sobre-/infrarregulación de la expresión bajo diversas condiciones, tales como hipoxia, latencia, interacción con macrófagos, localización y persistencia en el tejido pulmonar; regulación por hierro; perfiles transcriptómicos y proteómicos; mutación que conduzca a la atenuación de la virulencia; alta respuesta inmunológica potencial, etc.).

(2)

Establecimiento de un subconjunto de genes mediante el cruzamiento de los datos acumulados: Se realiza la selección de los antígenos que muestran evidencias positivas en cualquiera de dos estudios independientes que se originan a partir de los diferentes criterios mencionados anteriormente.

(3)

Recorte iterativo de los anteriores subconjuntos, que se dirige a la selección de un grupo inicial de candidatos (tabla 1, 189 antígenos), basándose en el grado del efecto documentado en los estudios individuales.

(4)

Realización de estudios bioinformáticos para:

a) una mayor caracterización del grupo inicial de 189 candidatos mediante análisis de los dominios, predicción de la localización celular, inspección del contexto genómico, identificación de las proteínas de repetición, y asignación de una función putativa para el Ag desconocido/hipotético (las búsquedas de similitud de secuencia mediante BLAST contra la base de datos nr, NCBI, bases de datos de dominios/motivos, y servidores relacionados con Mtb y las bases de datos: TB-sgc - The TB Structural Genomics Consortium (sitio web localizado en www.doembi.ucla.edu/TB/), Tuberculist - la base de datos de la genética de Mycobacterium tuberculosis (sitio web localizado en genolist.pasteur.fr/TubercuList/), TBDB - una plataforma integrada para el descubrimiento de fármacos de TB (sitio web localizado en www.tbdb.org), MTBreg -la base de datos de proteínas condicionalmente reguladas en Mycobacterium tuberculosis (sitio web localizado en www.doe-mbi.ucla.edu/Services/MTBreg/), y el servidor BioHealthBase (sitio web localizado en www.biohealthbase.org/GSearch);

b) un análisis inmunoinformático para la predicción de dianas de unión del antígeno de leucocitos humanos (HLA) (mediante NetCTL) y los epitopos de células T experimentalmente documentados por bases de datos (IEDB) y búsquedas en la bibliografía. Se ponen en práctica diversas medidas para determinar los epitopos, tales como ligantes fuertes putativos, y para la selección de candidatos más potentes según las predicciones (es decir, umbrales, y número de supertipos/cobertura de la población).

(5)

Una búsqueda más a fondo en la bibliografía para encontrar datos relativos a aspectos de la virulencia y el desarrollo de vacunas, para cada uno de los 189 antígenos (tabla 1) y/o sus ortólogos.

(6)

Establecimiento de un conjunto de datos de conocimiento de los 189 candidatos (tabla 1), mediante la integración de todos los análisis de datos y la bibliografía (anteriores etapas 4 y 5).

Los antígenos seleccionados en el grupo inicial presentado en la tabla 1 incluyen diversos candidatos a vacuna conocidos y proteínas conocidas por: estar implicadas en diversas etapas del ciclo vital de Mtb (latencia, reactivación, resucitación); antígenos específicos de tejidos; antígenos afectados por el ayuno; y antígenos que se originan en secuencias genómicas presentes en una cepa virulenta de Mtb.

Los 189 antígenos candidatos se clasifican en orden de probable importancia mediante los siguientes 14 análisis:

1) persistencia/supervivencia de macrófagos;

2) sobrerregulación de la expresión por el sistema de dos componentes MprAB;

3) respuesta a hipoxia;

4) implicación en la reactivación;

5) implicación en la latencia;

6) expresión en tejido pulmonar;

7) corregulación con Rv2031 (Acr);

8) si la proteína es segregada o no;

9) la capacidad para actuar como inmunógeno de células B;

10) genes regulados por hierro;

11) asociación con la pared celular o biogénesis de la pared celular;

12) existencia de datos de eficacia de vacuna;

13) presencia de dominios repetidos;

14) respuesta de células T, determinada mediante a) pruebas experimentales conocidas (por ejemplo, de la bibliografía), y b) la determinación de que el antígeno probablemente contenga uno o más epitopos de células T, según se evalúa mediante el programa inmunoinformático de the Technical University of Denmark (cbs.dtu.dk/services/NetCTL).

La presencia o la ausencia de cada uno de estos rasgos se puntúa para cada uno de los 189 genes, y se determina una puntuación cualitativa y se emplea como una medición para clasificar la lista de 189 antígenos y elegir los 45 mejores aciertos.

Los 45 candidatos después se clasificaron utilizando los mismos 13 criterios, asignando puntuaciones numéricas internas a cada uno de los criterios, según la intensidad de los resultados y/o la importancia con respecto al desarrollo de vacunas. En la tabla 2 aparece una lista de los 45 antígenos de primer rango, junto con su subgrupo según la clase/fase de la infección (latencia, resucitación/reactivación, clásicos y otros); dentro de las clases, los antígenos se clasifican según su puntuación. La tabla 3 presenta la priorización de los 45 antígenos en 3 grupos de subconjuntos según sus puntuaciones cuantitativas y, posteriormente, cualitativas.

Basándose en este análisis, se realizaron las selecciones finales de los grupos de antígenos para su uso en los

rBCG, habitualmente basadas en los antígenos con las puntuaciones globales más altas. Además, para la selección final, los antígenos se agruparon según el "tipo", en el que el rBCG incluye al menos:

1) uno o más antígenos de Mtb, incluyendo los denominados antígenos "clásicos" de Mtb, tales como 85A, 85B y TB 10.4; y

2) al menos un antígeno de resucitación/reactivación de Mtb seleccionado de Rv0867c, Rv1009, Rv1884c, Rv2389c, Rv2450c, Rv0867c, Rv0288, Rv1009, Rv0685, Rv0824c, Rv1349, Rv2744c, Rv3347c, Rv1130, y Rv1169c.

Además, los antígenos se seleccionan basándose en otros criterios, tales como una eficacia protectora demostrada en un modelo animal, la expresión del antígeno por Mtb pero no por BCG, o una menor expresión del antígeno en BCG (J. Mattow et al., Electrophoresis, 22:2936-2946, 2001; P.R. Jungblut, Molecular Microbiology, 33:1103-1117, 1999; H.J. Mollenkopf et al, Infection and Immunity, 72:6471-6479). Estos antígenos específicos de Mtb incluyen Rv1511, Rv2520c, Rv3407, Rv2802c y Rv3710.

Las combinaciones preferidas de antígenos para ser expresados en un rBCG incluyen los siguientes:

1) Antígenos clásicos Rv1886c, Rv3804c;

2) Antígenos de resucitación y reactivación Rv0867c, Rv1884c, Rv2389c; y

3) Antígeno específico de Mtb Rv3407.

Ejemplo 2. Construccón de un BCG recombinante genéticamente modificado para que exprese al menos un antígeno clásico de Mtb, al menos un antígeno de resucitación/reactivación de Mtb, y en el que el regulón DosR está sobrerregulado

Materiales y métodos: General

Para la construcción de un rBCG descrito en las siguientes secciones, se emplearon endonucleasas de restricción (en la presente "RE"; New England Biolabs Beverly, MA), ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) y Taq polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA) según los protocolos del fabricante; se preparó ADN plasmídico utilizando kits de purificación de ADN plasmídico a pequeña escala (kit Qiagen MiniprepR, Santa Clara, CA) o a gran escala (kit Qiagen MaxiprepR, Santa Clara, CA) según los protocolos del fabricante (Qiagen, Santa Clara, CA); el agua Milli-Q de calidad de biología molecular sin nucleasas, Tris-HCl (pH 7,5), EDTA pH 8,0, MgCl-2 1 M, etanol al 100% (en v/v), la agarosa ultrapura, y el tampón de electroforesis en gel de agarosa se obtuvieron en Invitrogen, Carlsbad, CA. Las digestiones de RE, PCR, reacciones de acoplamiento de ADN y la electroforesis en gel de agarosa se realizaron según procedimientos muy conocidos(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1, 2, 3, 1989; (Straus, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., marzo, 87(5):1889-1893; 1990). La secuenciación de nucleótidos para verificar la secuencia de ADN de cada plásmido recombinante descrito en las siguientes secciones se realizó mediante técnicas de secuenciación de ADN automáticas convencionales utilizando un secuenciador automático de Applied Biosystems, modelo 373A.

Los cebadores de la PCR se adquirieron de vendedores comerciales, tales como Sigma (St. Louis, MO) o se sintetizaron utilizando un sintetizador de ADN de Applied Biosystems (modelo 373A). Los cebadores de la PCR se emplearon a una concentración de 150-250 #M, y se determinaron las temperaturas de asociación para las reacciones de PCR utilizando el programa informático Clone Manager versión 4.1 (Scientific and Educational Software Inc., Durham, NC). Las PCR se realizaron en un termociclador BioRad (BioRad, Hércules, CA). Los cebadores de la PCR para las amplificaciones se diseñaron utilizando el programa informático Clone Manager® versión 4.1 (Scientific and Educational Software Inc., Durham NC). Las digestiones de RE y las PCR después se analizaron mediante una electroforesis en gel de agarosa utilizando procedimientos convencionales (Straus et al., supra, 1990; y Sambrook et al., supra, 1989). Un clon positivo se define como un clon que muestra el patrón de RE y/o el patrón de PCR apropiado. Los plásmidos identificados mediante este procedimiento después se evaluaron utilizando procedimientos de secuenciación de ADN convencionales, tal como se describió anteriormente.

Las cepas de Escherichia coli, tales como DH5! y Stable2R, se adquirieron en Invitrogen (Carlsbad, CA) y sirvieron como hospedante inicial de los plásmidos recombinantes. Los plásmidos recombinantes se introdujeron en cepas de

E. coli mediante electroporación utilizando un dispositivo de electropulsos de alto voltaje, tal como Gene Pulser (BioRad Laboratories, Hércules, CA), ajustado a 100-200 ∃, 15-25 #F y 1,0-2,5 kV, según se ha descrito (Straus et al., supra, 1990). Se identificaron las condiciones de electroporación óptimas determinando los ajustes que producen las máximas tasas de transformación por mcg de ADN por bacteria.

Las cepas de E. coli generalmente se cultivan en agar de soja tríptico (Difco, Detroit, MI) o en caldo de cultivo de soja tríptico (Difco, Detroit, MI), que se prepara según las instrucciones del fabricante. A menos que se indique lo contrario, todas las bacterias se cultivaron a 37 ºC en CO2 al 5% (en v/v) con agitación suave. Cuando fue apropiado, el medio suplementó con antibióticos (Sigma, St. Louis, MO). Las cepas bacterianas generalmente se conservan a -80 ºC suspendidas en (Difco) que contiene glicerol al 30% (en v/v) (Sigma, St. Louis, MO) a

aproximadamente 109 unidades formadoras de colonias (indicadas en la presente como "cfu") per ml.

Las cepas micobacterianas se cultivaron en un medio líquido, tal como Middlebrook 7H9 o Saulton Synthetic Medium, preferiblemente a 37 ºC. Las cepas pueden mantenerse como cultivos estáticos o agitados. Además, la velocidad de crecimiento de BCG puede potenciarse mediante la adición de ácido oleico (al 0,06% en v/v; Research Diagnostics, n.º de catálogo 01257) y detergentes, tales como Tyloxapol (al 0,05% en v/v; Research Diagnostics, n.º de catálogo 70400). La pureza de los cultivos de BCG puede evaluarse extendiendo de modo homogéneo partes alícuotas de 100 mcl del cultivo de BCG diluido en serie (por ejemplo, etapas en 10 veces desde puro-10-8) en disolución salina tamponada con fosfato (en la presente denominada PBS) sobre placas de 8,89 cm que contienen 25-30 ml de un medio sólido, tal como Middlebrook 7H10. Además, la pureza del cultivo puede evaluarse aún más utilizando un medio disponible en el mercado, tal como medio tioglicolato (Science Lab, n.º de catálogo 1891) y medio de soja-caseína (BD, n.º de catálogo 211768).

Para insertar los módulos de expresión de antígenos deseados en el cromosoma del derivado BCG1331 que expresa perfringolisina descrito en otra sección, se diseña un plásmido mediante simulación por ordenador y se sintetiza mediante DNA2.0 (Menlo Park, CA). Las características sobresalientes de este vector (pJFINT) incluyen un origen de la replicación de E.coli colE1, 3 sitios de clonación múltiple separados por terminadores de la transcripción rmBT1, T2 of pEX18gm, y mhA, la región de integración de fago attP del bacteriófago L5 y el gen de integrasa del bacteriófago L5 (GenBank nº1 Z18946). Inmediatamente cadena arriba de la secuencia L5, se incluye un módulo de marcador seleccionable que consiste en el alelo de resistencia a kanamicina aphA de Tn10 (GenBank n.º AAM97345) y un gen sacB (Genbank n.º NP_391325). Este módulo de marcador está flanqueado por repeticiones directas del sitio de unión a ∀% resolvasa del transposón Tn1000. Este plásmido no puede replicarse en especies micobacterianas y la secuencia L5 attP premite una recombinación de alta frecuencia con la región attB de los cromosomas micobacterianos para facilitar la integración de la secuencia plasmídica en el cromosoma. El módulo de marcador después puede eliminarse del cromosoma del integrante mediante la introducción de ∀% resolvasa y la selección de cepas sin marcadores sobre medios sólidos que contengan sacarosa al 10%.

Se diseñó un módulo de expresión de antígenos mediante simulación por ordenador para que codificase Rv0867c, Rv1884c, y Rv2389c separados por sitios ribossómicos optimizados bajo el control transcripcional del promotor hsp60 de Mycobacterium bovis y se sintetizó con DNA2.0 (Carlsbad, CA). Un segundo módulo de expresión se diseñó y construyó de modo similar para que codificase Rv1886c, Rv3804c y Rv3407c bajo el control transcripcional del promotor hsp60. Por último, se diseñó y construyó un tercer módulo que codifica Rv3133c (DosR) bajo el control transcripcional del promotor hsp60. Estos tres módulos de expresión de antígenos se acoplaron en pJFINT de modo que cada uno estaba separado por un terminador de la transcripción (figura 2). El plásmido resultante, pRC108, se electroporó en E. coli Stable2 y se verificó la secuencia plasmídica del clon resistente a kanamicina.

El plásmido pRC108 se aisló a partir de 100 ml de un cultivo de E. coli y se electroporó en un derivado que expresa pfo de BCG danés 1331. Después de la electroporación, las células se cultivaron durante la noche en medio 7H9 con un suplemento de OADC al 10% (en v/v) y 0,05% (en v/v) de Tyloxapol y se cultivaron en placa sobre agar 7H 10 que contenía 50 ug/ml de kanamicina. Puesto que el plásmido no codifica un origen de la replicación micobacteriano, la resistencia a la kanamicina en todas las colonias ensayadas fue conferida por la integración del plásmido en el sitio attB del genoma de BCG. Se seleccionaron colonias individuales para el análisis de PCR y se inocularon en medio 7H9 con OADC al 10% (en v/v) y Tyloxapol al 0,05% (en v/v) para el análisis de la expresión de antígenos. La caracterización mediante PCR de las colonias resistentes a kanamicina demuestra la presencia de la secuencia plasmídica completa en el cromosoma del BCG recombinante, denominado AFV-102pRC108. Los cultivos de AFV-102pRC108 se lavaron con 7H9 y se utilizaron para inocular cultivos de 7H9-Tyloxapol exentos de proteínas. Los sobrenadantes de los cultivos de AFV-102pRC108 se recolectaron mediante centrifugación y se inmunotransfirieron con antisueros policlonales de conejos contra el dominio de transglicosilasa de la proteína Rpf, Rv1009, que presenta reactividad cruzada con los dominios de transglicosilasa de todos los Rpf o antisueros policlonales de conejo generados contra los péptidos de Rv0867c. Esto demuestra la producción potenciada de Rv0867c, Rv1884c, y Rv2389c por encima del fondo de los homólogos de BCG de estas proteínas (figura 3A). Este sobrenadante se inmunotransfirió de forma similar con antisueros policlonales de conejo contra el complejo Ag85 y se observó sobreexpresión de Rv1886c y Rv3804c (figura 3B). El sedimiento celular se inmunotransfirió con antisueros policlonales de conejo contra Rv3407 y se confirmó la expresión de Rv3407, cuyo homólogo normalmente es silencioso en BCG (figura 3C). Los sedimentos celulares también se inmunotransfirieron con antisueros policlonales de conejo específicos de DosR para demostrar la sobreexpresión del propio DosR y con antisuero de conejo contra Rv1733c para demostrar la sobrerregulación de una proteína regulada por DosR (figura 3D).

Para completar la construcción de esta vacuna para que sea adecuada para un uso en seres humanos, después se eliminó el módulo de marcador del plásmido integrado. Células AFV-102pRC108 electrocompetentes se electroporaron con el plásmido pYUB870hyg, que codifica la ∀% resolvasa de Tn1000, un alelo sacB, y un gen de resistencia a higromicina (GenBank n.º ABD64366). Los transformantes resistentes a kanamicina e higromicina se seleccionaron sobre medio 7H10 y se inocularon en medio líquido 7H9 con OADC al 10% (en v/v) y Tyloxapol al 0,05% (en v/v) y sin antibióticos. Después de siete días de crecimiento, se cultivaron en placa diluciones de estos cultivos líquidos sobre 7H10 que contenía sacarosa al 10% para seleccionar los recombinantes en los que se ha

extirpado el marcador aphA-sacB y se ha perdido el plásmido pYUB870hyg por dilución y selección contra el alelo sacB.

Se seleccionaron los transformantes resistentes a sacarosa para el análisis de PCR de los módulos de antígenos integrados y se inocularon en medio líquido 7H9 para un análisis de inmunotransferencia como anteriormente. Los análisis de PCR revelaron que los módulos de expresión de antígenos aún estaban presentes en el cromosoma y que el marcador de resistencia a higromicina y el gen sacb habían sido extirpados. La inmunotransferencia de los sobrenadantes y los sedimentos celulares con antisueros contra Rpf, complejo Ag85, Rv3407, y DosR confirman que la extripación del módulo de marcador del cromosoma no afecta a la expresión de los módulos de antígenos insertados.

Se construyó la cepa AERAS-407 mediante la eliminación del marcador de resistencia a antibióticos de AFV102pRC108.

Ejemplo 3. Demostración de la inmunogenicidad y de la protección inducida por la vacunación con AERAS-407 en ratones

Para ilustrar las respuestas inmunológicas inducidas por AERAS-407 y para demostrar su eficacia protectora contra la tuberculosis, cuatro grupos de 10 ratones C57/BL6 se vacunaron por vía subcutánea con 1) disolución salina, 2) BCG, 3) BCG-PfoA, o 4) AERAS-407. Los ratones en los grupos 2, 3 y 4 recibieron 5 x 105 cfu de BCG o BCG recombinante. Después de 10 semanas, cinco ratones de cada grupo se sacrificaron para los inmunoensayos y el resto de los animales se expusieron a 100 cfu de M. tuberculosis Erdman en aerosol.

Para medir las respuestas inmunológicas humorales, se diseñó un chip de micromatrices de péptidos. El chip se rocía con péptidos de 50 aminoácidos solapantes generados a partir de las secuencias de Rv1886c, Rv3804c, Rv3407c, Rv0867c, Rv1884c, Rv2389c, Rv3133c, y todos los BCG codifican proteínas reguladas por DosR que están inducidas en al menos 2 veces por la sobreexpresión de DosR (es decir, genes regulados por DosR cuya transcripción es al menos 2 veces mayor en BCG que expresa constitutivamente el regulón DosR, que en las cepas de origen de tipo salvaje bajo condiciones aerobias). Los sueros reunidos de cada grupo se incuban con 3 chips de péptidos durante 1 hr a 37 ºC. Los chips después se lavan con disolución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, y se incuban con suero IgG antirratón de cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC (Abcam, Cambridge, MA) durante 1 hora a 37 ºC. Después los chips se lavan de nuevo con PBS y se lee la inmunofluorescencia con un escáner de matrices Genepix 4000B Array Scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se promedian los valores para cada gota de péptidos para los 3 chips en cada grupo. Los ratones que recibieron AERAS-407 muestran mayores respuestas de anticuerpos contra los péptidos derivados de Rv1886c, Rv3804c, Rv3407c, Rv0867c, Rv1884c, Rv2389c y proteínas reguladas por DosR que los ratones no vacunados o los ratones vacunados con BCG o BCG-PfoA.

Para medir las respuestas inmunológicas celulares inducidas por AERAS-407, se recolectaron los bazos y se homogeneizaron. Se ajustaron las concentraciones de esplenocitos a 5 x 105 células/pocillo en medio R10 en placas de múltiples cámaras y se incubaron durante 3 días a 37 ºC con Rv1886c, Rv3804c, Rv3407c, Rv0867c, Rv1884c, o Rv2389c purificados a una conentración de 1 #g/ml. Además, se incuban esplenocitos de cada ratón con Rv2623 y Rv3130c, puesto que se sabe que estas proteínas están altamente sobrerreguladas en cepas que sobreexpresan DosR y se sabe que son potentes inmunógenos de células T. Después de una incubación de 3 días se recolectan los sobrenadantes de los cultivos de esplenocitos y se ensayan mediante ELISA para el ∀-interferón producido en respuesta a la estimulación con antígenos. Los cultivos control de esplenocitos no estimulados o esplenocitos estimulados con PMA/PHA se incluyen como control negativo y positivo, respectivamente.

Para cuantificar la protección conferida por la vacunación con AERAS-407, los 5 ratones restantes de cada grupo se sacrifican 10 semanas después de la exposición an M. tuberculosis, y se recolectan asépticamente los pulmones y los bazos de cada animal. Los pulmones y los bazos se homogeneizan en PBS y las diluciones se cultivan en placa sobre agar 7H10. Después de 4 semanas de incubación, se cuenta el número de colonias de M. tuberculosis para los pulmones y el bazo de cada animal y se corrige para el factor de dilución. Este valor es el número de bacilos de tuberculosis vivos presentes en los pulmones y el bazo de cada animal. La vacunación de BCG generalmente produce una reducción de aproximadamente 1 log en cfu/pulmón y bazo frente a la vacunación con disolución salina. La vacunación con AERAS-407 produce una reducción mayor de la carga de Mtb en los pulmónes y bazos de los ratones.

Ejemplo 4. Construcción de una segunda vacuna de BCG recombinante genéticamente modificada para que sobreexprese antígenos de M. tb clásicos y el regulón DosR

Una segunda combinación de antígenos (TB10.4, Ag85B, Ag85A y Rv3407) también se sobreexpresa en la cepa rBCG AFV102 por la integración en el cromosoma en el sitio attB. Esto se realizó de una manera similar a la descrita en el ejemplo 2 para la construcción Aeras 407. Para integrar este segundo conjunto de antígenos, se construyó el plásmido de integración pAF707 (mostrado de modo esquemático en la figura 4) según se describe para pJFINT en el ejemplo 2, excepto por las siguientes diferencias: se empleó un gen de resistencia a higromicina en lugar de un gen de resistencia a kanamicina, y se empleó el promotor PBlaf para dirigir a los antígenos TB10.4, Ag85B, Ag85A y Rv3407 para la sobreexpresión en el orden listado. El resto de los métodos y los materiales genéticos son similares a los descritos en el ejemplo 2. La cepa resultante se denominó Aeras 406. La cepa final se analizó después mediante PCR, seguido de un análisis de secuenciación, y se confirmó que tenía el genotipo deseado. Después se demostró que la cepa sobreexpresaba los antígenos seleccionados mediante un análisis de SDS-PAGE y un ensayo

5 de inmunotransferencia según se describe en el ejemplo 2 (los datos no se muestran).

Ejemplo 5. Protección de primates no humanos de la tuberculosis mediante vacunación con AERAS-407

La eficacia protectora de AERAS-407, en particular con relación a la capacidad potenciada para prevenir la infección latente y la reactivación de la enfermedad, se ensaya mejor en macacos rhesus, puesto que los ratones no crean focos latentes granulomatosos, tal como hacen los seres humanos y otros primates. Para evaluar la eficacia 10 protectora de AERAS-407 en NHP, cuatro grupos de seis macacos rhesus agrupados por peso y sexo se vacunaron con 1) disolución salina, 2) BCG 1331, 3) BCG-Pfo, o 4) AERAS-407. Cada animal en los grupos 2-4 recibe 5 x 105 cfu del respectivo BCG o rBCG mediante una inyección intradérmica. Quince semanas después de la vacunación, todos los animales se exponen mediante instilación bronquial a aproximadamente 300 cfu de M. tuberculosis Erdman. Todos los animales se evalúan cada mes durante seis meses para detectar síntomas clínicos de 15 tuberculosis mediante rayos X del pecho, peso, alimentación, tos, letargia y respuestas inmunológicas a proteínas específicas de TB. Todos los animales que murieron durante el periodo de observación de seis meses se sometieron a una necropsia y se mide la patología de los tejidos y la carga de Mtb por órgano como en el ejemplo 3. A los animales moribundos se les eutaniza de manera humanitaria y se examinan de modo similar. Seis meses después de la exposición, todos los animales supervivientes se eutanizan y se realiza una necropsia para determinar la

20 patología de los tejidos y la carga de Mtb en pulmones, hígado y bazo. La vacunación con AERAS-407 produce una menor mortalidad, menor daño en los tejidos y menores recuentos de organismos de Mtb viables en los pulmones de los animales experimentalmente infectados.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Un bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante, en el que al menos un gen del regulón DosR está sobrerregulado y dicho BCG comprende al menos dos secuencias de ácidos nucleicos que son diferentes entre sí y que cada una codifica uno o más genes que están sobreexpresados, incluyendo dichas al menos dos secuencias de ácidos nucleicos:

   i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de Mycobacterium tuberculosis (Mtb); y

   ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno de resucitación de Mtb o de reactivación de Mtb que no es un antígeno de DosR.
2. 2.-El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que una o más de dichas al menos dos secuencias de ácidos nucleicos está integrada en un cromosoma de dicho rBCG.
3. 3.-El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que una o más de dichas al menos dos secuencias de ácidos nucleicos es una secuencia de ácido nucleico extracromosómica.
4. 4.- El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un antígeno de Mtb es 85A o dicho al menos un antígeno de Mtb es 85B.
5. 5.- El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un antígeno de resucitación o de reactivación de Mtb se selecciona del grupo que consiste en Rv0867c, Rv1009, Rv1884c, Rv2389c, Rv2450c, Rv0288, Rv0685, Rv0824c, Rv2744c, Rv3347c, Rv1130 y Rv1169c.
6. 6.- El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un antígeno de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) se selecciona del grupo que consiste en Rv2623, Rv2626c, Rv2005c, Rv1996, Rv2029c, Rv2627c, Rv1908, Rv3837, Rv2780 y Rv1349.
7. 7.- El BCG recombinante de la reivindicación 1, en el que la expresión de dicho al menos un gen del regulón DosR está sobrerregulada por la actividad potenciada de un promotor.
8. 8.- Un bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante según la reivindicación 1, que comprende al menos dos secuencias de ácidos nucleicos que son diferentes entre sí y que cada una codifica uno o más genes que están sobreexpresados,

   en el que al menos una primera secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en Rv2450c, Rv1009, Rv0867c, Rv2389c, Rv1884c, Rv0288, Rv0685, Rv0824c, Rv2744, Rv3347c, Rev1130, Rv1169c; y

   en el que al menos una segunda secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en Rv1738, Rv2623, Rv2031c, Rv2032, Rv2626c, Rv2005c, Rv3127, Rv1733c, Rv1996, Rv2628, Rv0079, Rv3130c, Rev3131, Rv1813c, Rv2006, Rv2029c, Rv2627c, Rv2030c, Rv2629, Rv2450c, Rv1009, Rv0867c, Rv2389c, Rv1884c, Rv0288, Rv0685, Rv0824c, Rv2744, Rv3347c, Rev1130, Rv1169c, Rv1886, Rv1980c, Rv3804c, Rv3875, Rv1926c, Rv0467, Rv3873, Rv1908c, Rv1174c, Rv2780, Rv2620c, Rv1793, Rv1349 y Rv3132; y

   en el que al menos un gen del regulón DosR está sobrerregulado.
9. 9.- Una composición de vacuna que comprende:

   un bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso para inmunizar un sujeto contra una infección por Mtb o para inducir una respuesta inmunológica frente a Mtb en dicho sujeto,

   en la que dicha composición de vacuna se administra en una cantidad suficiente para inmunizar a dicho sujeto contra una infección por Mtb o para inducir una respuesta inmunológica frente a Mtb en dicho sujeto.
10. 10.- La composición de vacuna de la reivindicación 9, para su uso según la reivindicación 9, en la que la composición de vacuna se adapta para ser administrada también como una composición de refuerzo que comprende uno o más antígenos de Mtb.
11. 11.- La composición de vacuna de la reivindicación 10, para su uso según la reivindicación 10, en la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv1738, Rv2623, Rv2031c, Rv2032, Rv2626c, Rv2005c, Rv3127, Rv1733c, Rv1996, Rv2628, Rv0079, Rv3130c, Rv3131, Rv1813c, Rv2006, Rv2029c, Rv2627c, Rv2030c, Rv2629, Rv2450c, Rv1009, Rv0867c, Rv2389c, Rv1884c, Rv0288, Rv0685, Rv0824c, Rv2744, Rv3347c, Rv1130, Rv1169c, Rv1886, Rv1980c, Rv3804c, Rv3875, Rv1926c, Rv0467, Rv3873, Rv1908c, Rv1174c, Rv2780, Rv2620c, Rv1793, Rv1349 y Rv3132.
12. 12.- La composición de vacuna de la reivindicación 10, para su uso según la reivindicación 10, en la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv1996, Rv2005, Rv2029, Rv2623, Rv2626 y Rv2727, o en la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv2626, Rv1738, Rv2623, Rv1733, Rv2032, Rv3131, Rv3127, Rv3130c, Rv3804c y Rv1886c.
13. 13.- Una composición de vacuna que comprende

    5 un bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso para prevenir la recurrencia de los síntomas de la tuberculosis en un paciente con una infección por Mtb latente,

    en la que dicha composición de vacuna se administra en una cantidad suficiente para prevenir la recurrencia de los síntomas de la tuberculosis en dicho paciente.
14. 14.- La composición de vacuna de la reivindicación 13, para su uso según la reivindicación 13, que comprende

    10 además la etapa de administrar una composición de refuerzo que comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican uno o más antígenos de Mtb.
15. 15.- La composición de vacuna de la reivindicación 14, para su uso según la reivindicación 14, en la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv1738, Rv2623, Rv2031c, Rv2032, Rv2626c, Rv2005c, Rv3127, Rv1733c, Rv1996, Rv2628, Rv0079, Rv3130c, Rv3131, Rv1813c, Rv2006, Rv2029c, Rv2627c, Rv2030c,

    15 Rv2629, Rv2450c, Rv1009, Rv0867c, Rv2389c, Rv1884c, Rv0288, Rv0685, Rv0824c, Rv2744, Rv3347c, Rv1130, Rv1169c, Rv1886, Rv1980c, Rv3804c, Rv3875, Rv1926c, Rv0467, Rv3873, Rv1908c, Rv1174c, Rv2780, Rv2620c, Rv1793, Rv1349 y Rv3132.
16. 16.- La composición de vacuna de la reivindicación 14, para su uso según la reivindicación 14, en la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv1996, Rv2005, Rv2029, Rv2623, Rv2626 y Rv2727, o en

    20 la que dicho uno o más antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv2626, Rv1738, Rv2623, Rv1733, Rv2032, Rv3131, Rv3127, Rv3130c, Rv3804c y Rv1886c.
17. 17.- La composición de vacuna de la reivindicación 10, para su uso según la reivindicación 10, en la que dicho uno o más antígenos incluye al menos un antígeno de cada etapa del ciclo vital de un Mtb.