CN115963257A - 碳青霉烯酶免疫层析检测试纸及其制备方法、试剂盒和应用 - Google Patents

碳青霉烯酶免疫层析检测试纸及其制备方法、试剂盒和应用 Download PDF

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CN115963257A CN202211185654.7A CN202211185654A CN115963257A CN 115963257 A CN115963257 A CN 115963257A CN 202211185654 A CN202211185654 A CN 202211185654A CN 115963257 A CN115963257 A CN 115963257A
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Abstract

本发明提供了一种碳青霉烯酶免疫层析检测试纸及其制备方法、试剂盒和应用,涉及生物技术领域。该碳青霉烯酶免疫层析检测试纸包括标记抗体和检测抗体,标记抗体被标记物标记;标记抗体包括KPC、OXA‑48、VIM、IMP和NDM中至少一种碳青霉烯酶的抗体;检测抗体由标记抗体中碳青霉烯酶抗体的配对抗体组成;免疫层析检测试纸沿待测样本流动方向依次设置结合物释放区、检测区和质控区;结合物释放区包被标记抗体;检测区包被检测抗体。该碳青霉烯酶免疫层析检测试纸缓解了现有技术中存在的缺乏一种简便快捷的检测碳青霉烯酶的产品问题。

Description

碳青霉烯酶免疫层析检测试纸及其制备方法、试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其是涉及一种碳青霉烯酶免疫层析检测试纸及其制备方法、试剂盒和应用。
背景技术
当前,细菌耐药已成为全球公共健康领域的重大挑战,其中尤以碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌 (carbapenem-resistant Enterobacterales,CRE)引起的感染形势最为严峻。碳青霉烯类抗菌药物包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等,是治疗多重耐药革兰阴性杆菌所致感染最有效的抗菌药物之一。而随着该类药物在临床的广泛应用,肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率呈逐年快速上升趋势。
碳青霉烯类耐药肠杆科细菌(CRE)引起医院感染,是一种条件性病原体。CHINET中国细菌耐药监测网历年监测结果显示,我国临床分离肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率从2005 年的3%快速攀升至2019年的25%以上,上升幅度高达8倍。2018年全国细菌耐药监测网(CARSS) 数据显示,全国1429所医院临床分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的平均耐药率为10.1%,部分省市甚至超过20%。由于CRE菌株通常还携带有对其他抗菌药物耐药的基因,对抗菌药物呈广泛耐药甚至全耐药的特征,使临床的抗感染治疗面临无药可用的困境。当身体的免疫功能下降时,细菌会在肺部、泌尿道等许多部位引起感染。碳青霉烯类抗菌药物作为临床治疗肠杆菌科细菌引起感染的重要药物,近年来,随着这些药物的广泛使用,碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CPKP)已经出现在世界各地,检出量逐年上升,引起医疗界的广泛关注。在我国CRE引起的院内感染中,最常见的为碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的引发的院内感染。
产生碳青霉烯酶是肠杆菌目细菌对碳青霉烯类药物耐药最主要的机制。不同地区、不同医院、不同人群以及不同细菌所产的碳青霉烯酶种类均有差异。我国临床分离的CRE菌株产生的碳青霉烯酶以KPC和NDM型为主,少数菌株产生OXA-48、IMP和VIM型碳青霉烯酶。由于不同种类的抗菌药物对产生不同碳青霉烯酶菌株的体外抗菌活性不同,准确、快速地对CRE产生的碳青霉烯酶进行检测,对于临床抗感染治疗的精准用药和医院感染预防控制具有重要的价值。
目前实验室检测碳青霉烯酶的方法分为表型检测和基因型检测。表型检测方法包括Carba NP试验、改良碳青霉烯灭活试验(包括mCIM和eCIM)、碳青霉烯酶抑制剂增强试验和时间飞行质谱技术等;基因型检测方法包括免疫层析技术和基因检测技术。除Carba NP试验外,其他几种方法基本都是基于培养的,耗时长达3-7天,且不同的酶类检测方法不同,操作复杂,需要有专业背景的技术人员,对于难培养或生长缓慢的细菌无能为力,难以满足临床需要。Carba NP试验需要特殊试剂,其中一些需自制,有效期短,灵敏度低。基因检测技术相较其他诊断方法灵敏度高,但成本较高,实验需要4~6个小时,对操作要求较高,应用受到限制。因此,一种能够简便快速的检测碳青霉烯酶的产品是目前市场需要的。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,缓解了现有技术中存在的缺乏一种简便快捷的检测碳青霉烯酶的产品的问题。
本发明的第二目的在于提供一种上述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种含有上述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸的试剂盒及它们的应用。
为解决上述技术问题,本发明特采用如下技术方案:
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,包括标记抗体和检测抗体;所述标记抗体包括KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM中至少一种碳青霉烯酶的抗体;所述检测抗体由标记抗体中碳青霉烯酶抗体的配对抗体组成;
所述免疫层析检测试纸沿待测样本流动方向依次设置结合物释放区、检测区和质控区;所述结合物释放区包被标记抗体;所述检测区包被检测抗体;
所述标记抗体被标记物标记。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了一种碳青霉烯酶检测试剂盒,该试剂盒包含上述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了一种上述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸的制备方法,包括将标记抗体包被于结合物释放区,将检测抗体包被于检测区。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了上述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,或上述碳青霉烯酶检测试剂盒在非诊断和治疗目的的检测碳青霉烯酶,或检测碳青霉烯类耐药菌中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸包括标记抗体和检测抗体;标记抗体包括KPC、 OXA-48、VIM、IMP和NDM中至少一种碳青霉烯酶的抗体;检测抗体由标记抗体中碳青霉烯酶抗体的配对抗体组成。其检测原理为双抗体夹心法,若待测样本含有碳青霉烯酶抗原且抗原浓度高于最低检测限时,其中的碳青霉烯酶与标记抗体结合形成复合物,在层析作用下复合物沿检测试纸向前移动,经过检测区时与预包被的检测抗体结合,若形成标记物-标记抗体-抗原-检测抗体免疫复合物,检测区出现可检测的信号;相反,若待测样本不含碳青霉烯酶抗原或者抗原浓度低于最低检测限时,则不能形成免疫复合物,检测区无可检测的信号,此时结果为阴性。
本发明提供的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸具有快速、简便的特点,全部检测过程仅需15分钟,不需其它任何仪器设备,无需专业人员,携带方便,可随时随检。而且对标本既能成批检测,又可单份检测。单次检测最多能够同时待测样本中是否存在五种碳青霉烯酶(KPC、NDM、OXA-48、IMP、 VIM)中的一种或几种。缓解了现有技术中存在的缺乏一种简便快捷的检测碳青霉烯酶的产品的问题。
基于上述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸的发明构思,本发明提供的含有上述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸的试剂盒及它们的应用能够准确、快速地对碳青霉烯酶或碳青霉烯酶类耐药菌进行检测,对于临床抗感染治疗的精准用药和医院感染预防控制具有重要的价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为抗体KPC-1和KPC-2的SDS-PAGE电泳图;
图2为抗体OXA-48-1和OXA-48-2的SDS-PAGE电泳图;
图3为抗体VIM-1和VIM-2的SDS-PAGE电泳图;
图4为抗体IMP-1和IMP-2的SDS-PAGE电泳图;
图5为抗体NDM-1和NDM-2的SDS-PAGE电泳图;
图6为实施例2胶体金免疫层析检测试纸的结构示意图;
图7为实施例2胶体金免疫层析检测试纸的结构俯视示意图;
图8为实施例2胶体金免疫层析检测试纸检测五种碳青霉烯酶抗原的检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一般地,连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明,本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知,且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行,所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
需要说明的是:
本发明中,如果没有特别的说明,本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案;本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案;所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中,除非有其他说明,数值范围“a~b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示,其中a和b都是实数。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式,可以分别为一个或多个下限,和一个或多个上限。
除非另有说明,本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,用于检测如下类型中的至少一种碳青霉烯酶:KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM。
该碳青霉烯酶免疫层析检测试纸包括标记抗体和检测抗体;标记抗体包括KPC、OXA-48、VIM、 IMP和NDM中至少一种碳青霉烯酶的抗体;检测抗体由标记抗体中碳青霉烯酶抗体的配对抗体组成,标记抗体被标记物标记。配对抗体指的是可以同时结合在一个抗原分子上的两个抗体,用于以双抗体夹心法检测样本中的抗原。
在一些可选地实施方式中,当标记抗体选自KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM中的其中一种碳青霉烯酶的抗体,检测抗体选自其对应的配对抗体;具体的实施例包括:标记抗体为KPC抗体,检测抗体为KPC抗体的另一配对抗体;标记抗体为OXA-48抗体,检测抗体为OXA-48抗体的另一配对抗体;标记抗体为VIM抗体,检测抗体为VIM抗体的另一配对抗体;标记抗体为VIM抗体,检测抗体为VIM抗体的另一配对抗体;或,标记抗体为NDM抗体,检测抗体为NDM抗体的另一配对抗体。
在另一些可选地实施方式中,当标记抗体选自KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM中至少两种碳青霉烯酶的抗体时,检测抗体中含有标记抗体中的各类型的碳青霉烯酶的抗体的对应的配对抗体;具体的实施例包括但不限于:标记抗体包括KPC抗体和OXA-48抗体,检测抗体包括KPC抗体的另一配对抗体,和OXA-48抗体的另一配对抗体;标记抗体包括VIM抗体、IMP抗体和NDM抗体,检测抗体包括VIM抗体的另一配对抗体,IMP抗体的另一配对抗体和NDM抗体的另一配对抗体;标记抗体包括KPC抗体、OXA-48抗体、VIM抗体、IMP抗体和NDM抗体;检测抗体包括KPC 抗体的另一配对抗体,OXA-48抗体的另一配对抗体,VIM抗体的另一配对抗体,IMP抗体的另一配对抗体和NDM抗体的另一配对抗体。
在一些优选的实施方式中,标记抗体包括KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM共五种碳青霉烯酶的抗体,相应地,检测抗体包括能够与检测抗体中KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM共五种碳青霉烯酶的抗体配对的抗体,以实现对五种碳青霉烯酶同时检测的技术效果。
本发明提供的免疫层析检测试纸沿待测样本流动方向依次设置结合物释放区、检测区和质控区;结合物释放区包被标记抗体;检测区包被检测抗体。免疫层析检测试纸的检测原理为双抗体夹心法,若待测样本含有碳青霉烯酶抗原且抗原浓度高于最低检测限时,其中的碳青霉烯酶与标记物标记的标记抗体结合形成复合物,在层析作用下复合物沿检测试纸向前移动,经过检测区时与预包被的检测抗体结合,若形成标记物-标记抗体-抗原-检测抗体免疫复合物,检测区出现可检测的信号;相反,若待测样本不含碳青霉烯酶抗原或者抗原浓度低于最低检测限时,则不能形成免疫复合物,检测区无可检测的信号,此时结果为阴性。
在一些可选的实施方式中,所述质控区包被和结合物释放区中包被的抗原或标记抗体特异性结合的抗体;可选地,结合物释放区还包被质控抗原,质控区包被和质控抗原特异性结合的抗体;可选地,质控区直接包被和标记抗体特异性结合的抗体。质控区在检测样本时均应出现可检测的信号,质控区是否出现可检测的信号是判定层析过程是否正常的标准,同时也作为试剂的内控标准。检测区和质控区可检测的信号可由仪器检测,例如采用荧光微球形成的荧光信号;或者直接形成肉眼可观测的信号,例如彩色微球、胶体金、胶体银、胶体碳的富集导致的检测区或质控区显色。
本发明提供的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸中使用的抗体可选自市售抗体,在一些优选的实施方式中,碳青霉烯酶免疫层析检测试纸中使用的抗体全部或部分的选自如下配对抗体:
下述配对抗体中的抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;轻链可变区包括三个互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
KPC配对抗体,包括KPC-1和KPC-2,KPC-1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_1、Seq_2和Seq_3所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_4、Seq_5 和Seq_6所示;
KPC-2的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_11、Seq_12和Seq_13所示; CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_14、Seq_15和Seq_16所示。
OXA-48配对抗体,包括OXA-48-1和OXA-48-2;
OXA-48-1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_21、Seq_22和Seq_23所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_24、Seq_25和Seq_26所示;
OXA-48-2的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_31、Seq_32和Seq_33所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_34、Seq_35和Seq_36所示。
VIM配对抗体,包括VIM-1和VIM-2;
VIM-1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_41、Seq_42和Seq_43所示; CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_44、Seq_45和Seq_46所示;
VIM-2的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_51、Seq_52和Seq_53所示; CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_54、Seq_55和Seq_56所示。
IMP配对抗体,包括IMP-1和IMP-2;
IMP-1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_61、Seq_62和Seq_63所示; CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_64、Seq_65和Seq_66所示;
IMP-2的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_71、Seq_72和Seq_73所示; CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_74、Seq_75和Seq_76所示。
NDM配对抗体,包括NDM-1和NDM-2;
NDM-1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_81、Seq_82和Seq_83所示; CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_84、Seq_85和Seq_86所示;
NDM-2的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_91、Seq_92和Seq_93所示; CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_94、Seq_95和Seq_96所示。
本领域公知,抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定,根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本发明涉及的具有与上述CDR序列完全相同的CDR序列的抗体的变体,因其具有与上述抗体完全相同的CDR 序列,因此具有相类似的生物活性,可以用于本发明提供的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,因此具有上述CDR序列的抗体的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸属于本发明的保护范围。
在一些优选的实施方式中,KPC-1的重链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_7所示,轻链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_8所示;KPC-2的重链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_17所示,轻链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_18所示;OXA-48-1的重链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_27所示,轻链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_28所示;OXA-48-2的重链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_37所示,轻链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_38所示;VIM-1的重链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_47所示,轻链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_48所示;VIM-2的重链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_57所示,轻链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_58所示;IMP-1的重链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_67所示,轻链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_68所示;IMP-2的重链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_77所示,轻链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_78所示;NDM-1的重链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_87所示,轻链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_88所示;NDM-1的重链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_97所示,轻链可变区的氨基酸序列优选如所示Seq_98所示。
在一些优选的实施方式中,KPC-1、KPC-2、OXA-48-1、OXA-48-2、VIM-1、VIM-2、IMP-1、 IMP-2、NDM-1和NDM-2的重链可变区N端还连接有氨基酸序列如Seq_121所示的信号肽。
在一些优选的实施方式中,KPC-1、KPC-2、OXA-48-1、OXA-48-2、VIM-1、VIM-2、IMP-1、 IMP-2、NDM-1和NDM-2的轻链可变区N端还连接有氨基酸序列如Seq_122所示的信号肽。
在一些优选的实施方式中,KPC-1、KPC-2、OXA-48-1、OXA-48-2、VIM-1、VIM-2、IMP-1、 IMP-2、NDM-1和NDM-2的抗体类型例如可以为但不限于为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、 IgE或IgD,更优选地,上述抗体包含兔抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。重链恒定区的氨基酸序列优选如所示Seq_123所示,轻链恒定区的氨基酸序列优选如所示Seq_124所示。
在一些可选的实施方式中,标记抗体选自KPC-1、OXA-48-1、VIM-1、IMP-1和NDM-1中的至少一种。相应的,检测抗体从KPC-2、OXA-48-2、VIM-2、IMP-2和NDM-2中选择与标记抗体配对的配对抗体。
在另一些可选的实施方式中,标记抗体选自KPC-2、OXA-48-2、VIM-2、IMP-2和NDM-2中的至少一种。相应的,检测抗体从KPC-1、OXA-48-1、VIM-1、IMP-1和NDM-1中选择与标记抗体配对的配对抗体。
在一些优选的实施方式中,优选以KPC-1、OXA-48-1、VIM-1、IMP-1和NDM-1中的至少一种作为标记抗体。
在一些优选的实施方式中,当免疫层析检测试纸的检测区包被至少两种碳青霉烯酶的抗体时,各种类碳青霉烯酶抗体分别包被于检测区中间隔设置的检测线,根据检测线的结果判定待测样本中是否含有对应的碳青霉烯酶类型。
在一些可选的实施方式中,免疫层析检测试纸的结合物释放区包被KPC-1、OXA-48-1、VIM-1、 IMP-1和NDM-1;检测区包被KPC-2、OXA-48-2、VIM-2、IMP-2和NDM-2;或,结合物释放区包被KPC-2、OXA-48-2、VIM-2、IMP-2和NDM-2;检测区包被KPC-1、OXA-48-1、VIM-1、IMP-1 和NDM-1。
在一些可选的实施方式中,免疫层析检测试纸的结合物释放区包被KPC-1、OXA-48-1、VIM-1、 IMP-1和NDM-1;检测区由五条检测线组成,分别包被KPC-2、OXA-48-2、VIM-2、IMP-2和NDM-2。
在一些可选的实施方式中,所述标记物包括乳胶颗粒、荧光分子标记、量子点、荧光微球、彩色微球、胶体金、胶体银和胶体碳中的一种或多种。
在一些优选的实施方式中,所述免疫层析检测试纸为胶体金免疫层析检测试纸,即标记抗体标记胶体金。标记抗体标记的胶体金的粒径优选为5~50nm,例如可以为但不限于为5、10、15、20、 25、30、35、40、45或50nm,或上述任意两个点值之前粒径范围的混合物,胶体金的粒径优选为 20~40nm。胶体金优选采用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备得到。
在一些优选的实施方式中,所述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸还包含壳体。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了一种碳青霉烯酶检测试剂盒,该试剂盒包含上述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸。
在一些优选的实施方式中,试剂盒中还包括样本裂解试剂,所述样本裂解试剂包括缓冲试剂和表面活性剂,所述缓冲体系优选以PBS为缓冲体系,更优选以0.01mol/L PBS缓冲液作为缓冲体系。表面活性剂包括但不限于Tween-20、Tween-80、CHAPS、Brij35、Brij23、Triton-X100、SDS或月桂酰肌氨酸钠中的一种或者几种。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了上述实施例中免疫层析检测试纸的制备方法,所述制备方法包括将标记抗体包被于结合物释放区,将检测抗体包被于检测区。
在一些可选的实施方式中,标记物为胶体金,采用物理吸附法或化学偶联法将胶体金标记于标记抗体,优选采用物理吸附法。更优选按照如下方式制备标记抗体:取胶体金溶液调节pH,再加入标记抗体搅拌,然后加入封闭液继续搅拌,离心后去上清液,然后使用复溶液复溶;封闭液含有酪蛋白或BSA,复溶液含有蔗糖和BSA,并以Tris-HCl作为缓冲体系。其中胶体金优选采用氯金酸- 柠檬酸三钠还原法制得。
在一些可选的实施方式中,将质控区包被的抗体和检测抗体分别使用包被稀释液稀释至终浓度 0.5~2mg/mL,例如可以为但不限于为0.5、1、1.5或2mg/mL,然后划线。
在一些优选的实施方式中,将检测抗体中各类型的碳青霉烯酶抗体分别使用包被稀释液稀释至终浓度为0.5~2mg/mL,例如可以为但不限于为0.5、1、1.5或2mg/mL,在检测区分别划线,形成能够检测不同类型碳青霉烯酶的检测线,以对样本中的抗原类型进行区分。
在一些优选的实施方式中,按照包被稀释液的体积与检测线或质控线的长度比为0.5~2μL/cm划线,例如可以为但不限于为0.5、1、1.5或2μL/cm,优选为1μL/cm。
在一些可选的实施方式中,免疫层析检测试纸按如下方式安装:在固定底板上依次粘贴检测垫、吸水垫、标记垫和样品垫,吸水垫和标记垫各压检测垫1~2mm,样品垫压标记垫1~2mm,组装后试纸条切割成宽度4±0.4mm的试纸条并装壳体。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了上述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸或试剂盒在非诊断和治疗目的的检测碳青霉烯酶,或检测碳青霉烯类耐药菌中的应用。检测碳青霉烯类耐药菌的实例包括但不限于检测碳青霉烯类耐药肠杆科细菌,例如检测肺炎克雷伯菌。上述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸利用形成抗体-抗原-抗体复合物的原理检测测碳青霉烯酶,或碳青霉烯类耐药菌,操作简单,反应时间短,适用于快速鉴定样本中是否存在五种碳青霉烯酶中的一种或几种。
在一些优选的实施方式中,优选使用上述实施例中提供的样本裂解试剂预处理待测样本,再对样本进行检测。目前市面使用细菌裂解常见有:反复冻融法、超声波处理法、有机溶剂处理法等。这些处理方法一般需要借助仪器装置,试剂需要低温保存或者有效期短。采用上述样本裂解试剂预处理待测样本,无需借助仪器,操作简单。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和技术效果:
实施例1
抗体制备:
(1)通过NCBI序列比对,获得KPC酶的保守序列。采用分子生物学领域中的常规酶切及连接技术,构建表达质粒pET 28a(+)PM,转入感受态细胞获得阳性克隆,将阳性克隆转化至到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后培养并诱导表达,纯化后获得KPC抗原。采用同样的方法制备OXA-48、VIM、IMP和NDM抗原。
(2)抗原免疫新西兰大耳白兔,对新西兰大耳兔进行背部皮下多点注射免疫;两周后进行加强免疫,此后每隔一周加强免疫一次,共免疫六次,并且从第三次免疫开始,免疫一周后取大耳白兔耳缘静脉血200~500μL,测定效价和亲和性;在最后一次免疫后,取脾脏进行细胞融合,用于制备杂交瘤细胞。
(3)取对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞与从兔脾脏分离的脾细胞融合,制备杂交瘤细胞,对获得的杂交瘤细胞采用ELISA法进行筛选,融合后第5天观察细胞的生长情况,第10~14天采用间接ELISA法检测细胞培养上清的效价,将效价最强的阳性杂交瘤细胞扩大培养至细胞阳性率达 100%,定株得到杂交瘤细胞株,冻存于液氮中备用。
(4)将步骤(3)筛选出的杂交瘤细胞匀浆化后,提取并反转录RNA进行PCR获得的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收目的片段,送样测序,测序结果与IMGT数据库(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)进行比对,得到抗体的可变区基因片段。
(5)利用同源重组引物分别在抗体重链可变区基因的两端和轻可变区基因的两端加入同源重组臂和信号肽序列,重链可变区信号肽的氨基酸序列如Seq_121所示,轻链可变区信号肽的氨基酸序列如Seq_121所示。将分别含有兔抗体重链IgG1恒定区的表达质粒和含有兔抗体轻链IgG1恒定区的表达质粒线性化,产生同源重组臂;将加入同源重组臂的可变区基因片段和线性化的质粒通过同源重组的方式连接起来,构成完整的轻链表达载体和重链表达载体,将重组产物转化进TOP10大肠杆菌感受态中,扩增质粒。将得到的单克隆抗体重、轻链表达质粒按照1:1比例转染至293T细胞,表达纯化后使用浓缩离心柱浓缩纯化后的单克隆抗体,用PBS作为抗体保存的缓冲液,最后用BSA 蛋白浓度检测方法测定浓缩后的抗体浓度。用SDS-PAGE电泳鉴定单克隆抗体的分子量,SDS-PAGE 电泳图如图1~5所示。KPC-1和KPC-2如图1所示,OXA-48-1和OXA-48-2如图2所示,VIM-1 和VIM-2如图使所示,IMP-1和IMP-2如图4所示,NDM-1和NDM-2如图5所示。
KPC-1和KPC-2,OXA-48-1和OXA-48-2,VIM-1和VIM-2,IMP-1和IMP-2,以及NDM-1和NDM-2的序列信息如表1~表10所示,下述抗体的重链恒定区的氨基酸序列如所示Seq_123所示,核苷酸序列如Seq_125;轻链恒定区的氨基酸序列如所示Seq_124所示,核苷酸序列如Seq_126。
表1KPC-1
表2KPC-2
表3OXA-48-1
表4OXA-48-2
表5VIM-1
表6VIM-2
表7IMP-1
表8IMP-2
表9NDM-1
表10NDM-2
KPC-1、KPC-2、OXA-48-1、OXA-48-2、VIM-1、VIM-2、IMP-1、IMP-2、NDM-1和NDM-2 的重链可变区的核苷酸序列分别如Seq_101、Seq_103、Seq_105、Seq_107、Seq_109、Seq_111、Seq_113、 Seq_115、Seq_117和Seq_119所示;轻链可变区的核苷酸序列分别如Seq_102、Seq_104、Seq_106、 Seq_108、Seq_110、Seq_112、Seq_114、Seq_116、Seq_118和Seq_120所示。
实施例2
本实施例提供了一种胶体金免疫层析检测试纸:
本实施例提供了一种胶体金免疫层析检测试纸,如图6和图7所示(其中图标表示为:10:固定底板;20:样本垫;30:标记垫;40:检测垫;41:检测区;42:质控区;50:吸水垫。),沿待测样本流动方向,包括依次设置于PVC固定底板上的样本垫、标记垫、检测垫和吸水垫;标记垫和检测垫采用硝酸纤维素膜;结合物释放区设置于标记垫;检测区和质控区间隔设置于检测垫;检测区由KPC检测线、OXA-48检测线、VIM检测线、IMP检测线和NDM检测线组成。
结合物释放区包被实施例1制备得到的抗体KPC-1、OXA-48-1、VIM-1、IMP-1和NDM-1;检测区分别包被KPC-2、OXA-48-2、VIM-2、IMP-2和NDM-2;质控区包被羊抗兔抗体。具体的制备方法如下:
(1)胶体金制备方法及其粒径:采用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金,粒径为20~40nm。
(2)胶体金标记抗体工艺:取胶体金溶液,加入K2CO3溶液调节pH,分别加入KPC-1、OXA-48-1、 VIM-1、IMP-1和NDM-1,搅拌2h,然后加入封闭液(5%酪蛋白或BSA)搅拌30min。10000g 离心30min,弃去上清液,最后复溶液(10%蔗糖、1%BSA的0.05M Tris-HCl)溶液复溶。
(3)胶体金垫制备:将步骤(2)五种抗体标记的胶体金溶液混合均匀后,进行喷金处理,干燥方式为37℃烘干。
(4)检测线和质控线包被:将羊抗兔IgG、KPC-2、OXA-48-2、VIM-2、IMP-2和NDM-2分别使用包被稀释液(含1%蔗糖的0.01M PBS溶液),终浓度为0.5~2mg/mL。按照1μL/cm分别划检测线,羊抗兔IgG划质控线,干燥方式为37℃烘干。
(5)试纸条组装,PVC板上依次粘贴检测垫、吸水垫、标记垫和样品垫,吸水垫和标记垫各压检测垫1~2mm,样品垫压标记垫1~2mm。组装后试纸条切割成宽度4±0.4mm,装卡壳。卡壳和干燥剂一同放入铝箔袋塑。贴签装盒即可得到成品试纸条。
实施例3
本实施例提供了一种碳青霉烯酶检测试剂盒,包括实施例2的胶体金免疫层析检测试纸,和样本裂解试剂;样本裂解试剂为0.01mol/L PBS为缓冲体系,还含有0.2%v/vTween-20和1%w/v SDS。以配制1L为例,称取KCl 0.20g、KH2PO4 0.24g、Na2HPO4·12H2O3.58g、NaCl 8.00g、Tween-20 2mL、SDS 10g,加超纯水溶解后定容至1L。
实施例4
本实施例提供了一种碳青霉烯类耐药菌的检测方法,使用实施例4提供的试剂盒检测,检测步骤如下:
使用1μL接种环取一环细菌样本置于含100μL裂解液的EP管中,漩涡振荡混匀,室温下放置 10分钟。向测试卡的加样孔中加入60~80μL样本;放置15~30分钟后观察结果。
效果例1
采用ELISA方法检测实施例1制备得到的抗体效价,结果如表11所示,
表11实施例1制备的抗体效价
效果例2
(1)最低检出限:使用五种碳青霉烯酶抗原和实施例3中的样品裂解试剂制备碳青霉烯酶抗原溶液,即0.5ng/mL KPC抗原溶液,1ng/mL NDM抗原溶液,0.5ng/mL OXA-48抗原溶液,0.25ng/mL IMP抗原溶液,2ng/mL VIM抗原溶液。实施例2制备的胶体金免疫层析检测试纸均可检出上述抗原。检测结果见图8。
(2)分析特异性:用实施例4的检测方法检测以下菌株,不产碳青霉烯酶&产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的细菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、产超广谱β-内酰胺酶肺炎费克雷伯菌、多重耐药铜绿假单胞菌)、不产碳青霉烯酶的肠道感染细菌(包括大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、克氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌)、不产碳青霉烯酶的呼吸道感染细菌(包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、流感嗜血杆菌、表皮葡萄球菌、白喉杆菌、棒状杆菌、百日咳鲍特菌)、不产碳青霉烯酶的消化道感染细菌(包括大肠埃希菌、志贺氏菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌、溶血性弧菌)、空气中常见细菌(包括金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、梭状杆菌、双歧杆菌)、其它微生物(包括酿酒酵母、白色念珠菌、烟曲霉菌、隐球菌),检测结果均为阴性,可见上述菌株与实施例2胶体金免疫层析检测试纸不存在交叉反应。
添加1%全血样本、1%唾液样本、1%痰液样本、1%肺泡灌洗液样本、1%尿液样本时,检测结果与不添加的结果一致,说明上述样本对检测结果无干扰。添加咽拭子样本、鼻拭子样本时,检测结果与不添加的结果一致,说明上述样本对检测结果无干扰。添加10mg/mL牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、酵母提取物、牛肝浸粉、牛心浸粉、牛脑浸粉、脑心浸粉时,检测结果与不添加的结果一致,说明上述培养基组分对检测结果无干扰。添加10mg/mL LB肉汤、牛肉膏蛋白胨肉汤、伊红美蓝琼脂、营养琼脂、蛋白胨水培养基、哥伦比亚肉汤、巧克力琼脂基础培养基、肠道菌增菌肉汤、麦康凯琼脂培养基、血琼脂基础时,检测结果与不添加的结果一致,说明上述培养基成品对检测结果无干扰。
(3)三批试剂性能检测:分别取三个批次的胶体金免疫层析检测试纸检测质控菌株,严格按照上述检测方法操作检测表达不同型的碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌,结果如表12所示。
表12三批试剂检测结果
从上表可知,三批试剂盒对五种碳青霉烯酶质控菌株对应碳青霉烯酶检测结果均为阳性,其它类型的碳青霉烯酶检测结果均为阴性,对照阴性质控菌株的检测结果均为阴性。因此,阴阳性样本的符合率均为100%。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,其特征在于,包括标记抗体和检测抗体;所述标记抗体包括KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM中至少一种碳青霉烯酶的抗体;所述检测抗体由标记抗体中碳青霉烯酶抗体的配对抗体组成;
所述免疫层析检测试纸沿待测样本流动方向依次设置结合物释放区、检测区和质控区;所述结合物释放区包被标记抗体;所述检测区包被检测抗体;
所述标记抗体被标记物标记。
2.根据权利要求1所述的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,其特征在于,标记抗体和检测抗体选自KPC配对抗体、NDM配对抗体、OXA-48配对抗体、IMP配对抗体和VIM配对抗体中的至少一种;
所述KPC的配对抗体包括KPC-1和KPC-2;
KPC-1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_1、Seq_2和Seq_3所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_4、Seq_5和Seq_6所示;
KPC-2的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_11、Seq_12和Seq_13所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_14、Seq_15和Seq_16所示;
所述OXA-48的配对抗体包括OXA-48-1和OXA-48-2;
OXA-48-1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_21、Seq_22和Seq_23所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_24、Seq_25和Seq_26所示;
OXA-48-2的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_31、Seq_32和Seq_33所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_34、Seq_35和Seq_36所示;
所述VIM的配对抗体包括VIM-1和VIM-2;
VIM-1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_41、Seq_42和Seq_43所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_44、Seq_45和Seq_46所示;
VIM-2的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_51、Seq_52和Seq_53所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_54、Seq_55和Seq_56所示;
所述IMP的配对抗体包括IMP-1和IMP-2;
IMP-1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_61、Seq_62和Seq_63所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_64、Seq_65和Seq_66所示;
IMP-2的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_71、Seq_72和Seq_73所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_74、Seq_75和Seq_76所示;
所述NDM的配对抗体包括NDM-1和NDM-2;
NDM-1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_81、Seq_82和Seq_83所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_84、Seq_85和Seq_86所示;
NDM-2的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_91、Seq_92和Seq_93所示;CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_94、Seq_95和Seq_96所示;
优选地,KPC-1的重链可变区的氨基酸序列如所示Seq_7所示,轻链可变区的氨基酸序列如所示Seq_8所示;
优选地,KPC-2的重链可变区的氨基酸序列如所示Seq_17所示,轻链可变区的氨基酸序列如所示Seq_18所示;
优选地,OXA-48-1的重链可变区的氨基酸序列如所示Seq_27所示,轻链可变区的氨基酸序列如所示Seq_28所示;
优选地,OXA-48-2的重链可变区的氨基酸序列如所示Seq_37所示,轻链可变区的氨基酸序列如所示Seq_38所示;
优选地,VIM-1的重链可变区的氨基酸序列如所示Seq_47所示,轻链可变区的氨基酸序列如所示Seq_48所示;
优选地,VIM-2的重链可变区的氨基酸序列如所示Seq_57所示,轻链可变区的氨基酸序列如所示Seq_58所示;
优选地,IMP-1的重链可变区的氨基酸序列如所示Seq_67所示,轻链可变区的氨基酸序列如所示Seq_68所示;
优选地,IMP-2的重链可变区的氨基酸序列如所示Seq_77所示,轻链可变区的氨基酸序列如所示Seq_78所示;
优选地,NDM-1的重链可变区的氨基酸序列如所示Seq_87所示,轻链可变区的氨基酸序列如所示Seq_88所示;
优选地,NDM-1的重链可变区的氨基酸序列如所示Seq_97所示,轻链可变区的氨基酸序列如所示Seq_98所示;
优选地,KPC-1、KPC-2、OXA-48-1、OXA-48-2、VIM-1、VIM-2、IMP-1、IMP-2、NDM-1和NDM-2的重链可变区N端还连接有氨基酸序列如Seq_121所示的信号肽;
优选地,KPC-1、KPC-2、OXA-48-1、OXA-48-2、VIM-1、VIM-2、IMP-1、IMP-2、NDM-1和NDM-2的轻链可变区N端还连接有氨基酸序列如Seq_122所示的信号肽;
优选地,KPC配对抗体、NDM配对抗体、OXA-48配对抗体、IMP配对抗体和VIM配对抗体中的重链恒定区的氨基酸序列如所示Seq_123所示,轻链恒定区的氨基酸序列如所示Seq_124所示。
3.根据权利要求2所述的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,其特征在于,所述标记抗体选自KPC-1、OXA-48-1、VIM-1、IMP-1和NDM-1中的至少一种,所述检测抗体选自KPC-2、OXA-48-2、VIM-2、IMP-2和NDM-2中的至少一种;
或,所述标记抗体选自KPC-2、OXA-48-2、VIM-2、IMP-2和NDM-2中的至少一种,所述检测抗体选自KPC-1、OXA-48-1、VIM-1、IMP-1和NDM-1中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,其特征在于,所述标记物包括乳胶颗粒、荧光分子标记、量子点、荧光微球、彩色微球、胶体金、胶体银和胶体碳中的一种或多种;
优选地,所述标记物为胶体金;
优选地,胶体金颗粒的粒径为5~50nm,优选为20~40nm。
5.根据权利要求1所述的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,其特征在于,所述质控区包被和结合物释放区中包被的抗原或标记抗体特异性结合的抗体。
6.根据权利要求1-5任一项所述的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,其特征在于,所述标记抗体包括KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM共五种碳青霉烯酶的抗体;
优选地,所述结合物释放区包被KPC-1、OXA-48-1、VIM-1、IMP-1和NDM-1;所述检测区包被KPC-2、OXA-48-2、VIM-2、IMP-2和NDM-2;
或,所述结合物释放区包被KPC-2、OXA-48-2、VIM-2、IMP-2和NDM-2;所述检测区包被KPC-1、OXA-48-1、VIM-1、IMP-1和NDM-1。
7.根据权利要求1-5任一项所述的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,其特征在于,沿待测样本流动方向,包括依次设置于固定底板上的样本垫、标记垫、检测垫和吸水垫;所述结合物释放区设置于标记垫;检测区和质控区间隔设置于检测垫;
优选地,所述检测区至少包括两条间隔设置的检测线,所述检测抗体中不同类型的碳青霉烯酶抗体分别包被于不同的检测线;
优选地,所述碳青霉烯酶免疫层析检测试纸还包括壳体。
8.碳青霉烯酶检测试剂盒,其特征在于,包含权利要求1-7任一项所述的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸;
优选地,还包括样本裂解试剂;
优选地,所述样本裂解试剂包括缓冲体系和表面活性剂;
优选地,所述样本裂解试剂以PBS为缓冲体系;
优选地,所述表面活性剂包括Tween-20、Tween-80、CHAPS、Brij35、Brij23、Triton-X100、SDS或月桂酰肌氨酸钠中的一种或者几种。
9.权利要求1-7任一项所述的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸的制备方法,其特征在于,包括将标记抗体包被于结合物释放区,将检测抗体包被于检测区;
优选地,所述标记物为胶体金,采用物理吸附法或化学偶联法将胶体金标记于标记抗体,优选采用物理吸附法;
优选地,取胶体金溶液调节pH,再加入标记抗体搅拌,然后加入封闭液继续搅拌,离心后去上清液,然后使用复溶液复溶;封闭液含有酪蛋白或BSA;复溶液含有蔗糖和BSA,复溶液以Tris-HCl作为缓冲体系;
优选地,将检测抗体使用包被稀释液稀释至终浓度为0.5~2mg/mL,在检测区划线,形成检测线;
优选地,将检测抗体中各类型的碳青霉烯酶抗体分别使用包被稀释液稀释至终浓度为0.5~2mg/mL,在检测区分别划线,形成检测线;
优选地,包被稀释液的体积与检测线的长度比为0.5~2μL/cm,优选为1μL/cm;
优选地,在固定底板上依次粘贴检测垫、吸水垫、标记垫和样品垫,吸水垫和标记垫各压检测垫1~2mm,样品垫压标记垫1~2mm,组装后试纸条切割成宽度4±0.4mm的试纸条并装壳体。
10.权利要求1-7任一项所述的碳青霉烯酶免疫层析检测试纸,或权利要求8所述的碳青霉烯酶检测试剂盒在非诊断和治疗目的的检测碳青霉烯酶,或检测碳青霉烯类耐药菌中的应用;
优选地,所述碳青霉烯类耐药菌包括碳青霉烯类耐药肠杆科细菌;
优选地,所述碳青霉烯类耐药菌包括肺炎克雷伯菌;
优选地,先使用权利要求8中所述的样本裂解试剂预处理待测样本,再对样本进行检测;
优选地,将待测细菌样本置于样本裂解试剂中,混合后静置10~30min,取60~80μL使用免疫层析检测试纸检测;放置15~30分钟后观察结果。
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