RU2156467C2 - Иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса - Google Patents
Иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса Download PDFInfo
- Publication number
- RU2156467C2 RU2156467C2 RU98114286A RU98114286A RU2156467C2 RU 2156467 C2 RU2156467 C2 RU 2156467C2 RU 98114286 A RU98114286 A RU 98114286A RU 98114286 A RU98114286 A RU 98114286A RU 2156467 C2 RU2156467 C2 RU 2156467C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- test system
- syphilis
- pathogenic
- peroxidase conjugate
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в производстве диагностических препаратов для выявления сифилиса. Тест-система включает в себя фиксированный на твердофазном носителе антиген - выделенную из ультраозвученной непатогенной трепонемы клеточную структуру и пероксидазный конъюгат. Тест-система используется при инкубации антигена с тестируемой сывороткой с последующим добавлением субстрата и учетом результатов реакции. Пероксидазный конъюгат конструируется на основе моноклональных анти-JgM и анти-JgG. Тест-система обладает повышенной чувствительностью и специфичностью и может производиться в промышленном масштабе.
Description
Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в производстве диагностических препаратов для выявления сифилиса на различных стадиях заболевания.
Иммуноферментный анализ (ИФА) широко используется в диагностике инфекционных заболеваний благодаря широкому спектру определяемых антител, антигенов или гаптенов, а также возможности автоматизации при чтении результатов и постановке реакции.
Специфичность и чувствительность ИФА обусловлены принципом его осуществления, при котором зафиксированный на твердом носителе антиген инкубируется с тестируемой сывороткой, затем с антивидовым глобулином, меченным ферментом. Взаимодействие фермента с субстратом дает цветную реакцию, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител.
Повышение чувствительности и специфичности ИФА достигается выбором твердого носителя с достаточно стойкими иммунологическими свойствами, чистотой и активностью антигенов и антител, выбором каталитически активных ферментов и хромогенных субстратов, оптимизацией условий реакции (Иммуноферментный анализ и его применение в инфекционной патологии. Обзорная информация под ред. В.И. Покровского, Е.П. Голубинского.- М.: ВНИИМИ, 1986).
Использование ИФА в диагностике сифилиса известно с 1975 г., однако достаточной специфичности и чувствительности в выявлении антител к возбудителю сифилиса, особенно на начальных стадиях и при латентных формах заболевания, пока не достигнуто.
Во многом это обусловлено свойствами трепонемных культур, используемых в качестве антигена. Высокий уровень числа отрицательных реакций при наличии заболевания и неспецифически-положительных реакций при наличии аутоиммунных заболеваний у пациентов связан с наличием липидов в бледных трепонемах.
Установлено, что специфическая антигенная активность трепонемы связана с протеином клетки и содержанием глютамина.
Известно использование ряда тестов на основе очищенных непатогенных трепонем и аффинно-очищенных антител, конъюгированных пероксидазой хрена. Однако результаты реакций при различных исследованиях трудно сопоставимы и неоднозначны на различных стадиях заболевания.
Более чувствительным является метод иммуноблотинга, при котором трепонемы подвергаются электрофорезу в градиенте концентрации додецилсульфата натрия. Затем проводится обработка разделенных белковых иммунодетерминант на нитроцеллюлозе исследуемой сывороткой и антителами к JgG либо JgM, меченными ферментами либо радиоактивными веществами. При этом иммунодетерминанты 15.5, 17, 44.5 и 47 кД являются диагностическими при сифилисе.
Однако эта тест-система практически трудно осуществима при массовых обследованиях и для организации ее промышленного производства (Г.А. Дмитриев, Е.Е. Брагина. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса//Венерология и дерматология, 1996, N 3, с. 33-34).
Наиболее близкой к заявляемой является промышленно выпускаемая тест-система иммуноферментная для серодиагностики сифилиса, разработанная Центральным кожно-венерологическим институтом (ЦКВИ) (Г.А. Дмитриев, Е.Е. Брагина. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса//Венерология и дерматология, 1996, N 3, с. 34).
В этой тест-системе в качестве антигена применяет взвесь обработанных ультразвуком непатогенных трепонем штамма Рейтер, для выявления комплекса антиген-антитело используют антивидовую сыворотку, меченную пероксидазой хрена.
Чувствительность и специфичность этой тест-системы значительно выше традиционной РСК, однако все же высок уровень ложноотрицательных и ложноположительных реакций, особенно на стадиях первичного обследования и латентном периоде заболевания, что обусловлено наличием во взвеси антигена не только протеинов клетки, а также мембранной цитоплазмической структуры, снижающей активность антигена.
Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности тест-системы и обеспечение возможности ее промышленного производства.
Поставленная цель достигается тем, что иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса включает фиксирование на твердофазном носителе антигена выделенной из ультраозвученной непатогенной трепонемы ее клеточной структуры, очищенной методом аффинной хроматографии, инкубирование антигена с тестируемой сывороткой и пероксидазным конъюгатом, который конструируется на основе моноклональных анти-JgM и анти-JgG, добавление субстрата и учет результатов реакции.
По отношению к прототипу заявляемая тест-система имеет следующие отличительные признаки.
Использование в качестве антигена клеточной структуры, выделенной из ультраозвученных непатогенных трепонем и очищенной методом аффинной хроматографии. Как известно, именно клеточная структура трепонем обладает необходимым составом гликопротеинов, которые являются наиболее специфическими иммунодетерминантами. Аффинная очистка способствует удалению липидных соединений, причем эти приемы технологически доступны и создают наиболее щадящие условия разрушения микроорганизмов. Использование этого признака обеспечивает повышение специфичности тест-системы. Способ получения указанной клеточной структуры, выделенной из ультраозвученной непатогенной трепанемы, описан в заявке на изобретение РФ, опубликованной 10.06.98 и зарегистрированной под N 96006615. Для очистки макромолекул от белковых соединений была использована классическая методика аффинной хроматографии. В принципе для этой цели можно использовать и другие известные методы, например гель-фильтрацию, адсорбционную хроматографию.
Конструирование пероксидазного конъюгата на основе моноклональных анти-JgM и анти-JgG. Моноклональные антитела имеют большие преимущества перед поликлональными антисыворотками, проявляющиеся в постоянстве воспроизводимости состава, в отсутствии перекрестной реактивности и способности прецитипировать антигены, в высокой концентрации специфических антител. Совместное использование гибридных молекул JgM и JgG на участке соединения антиген-антитело создает оптимальные условия реакции, так как JgM способствует проколу бактериальной стенки быстрее и эффективнее, чем JgG, который имеет способность вызывать фиксацию комплемента. Предлагаемый состав конъюгата обеспечивает чувствительность и специфичность реакции.
Возможность практического использования заявляемой тест-системы иллюстрируется примером конкретного выполнения с использованием полной совокупности признаков изобретения.
Пример. Суспензию 3-недельной бактериальной культуры непатогенного штамма Treponema Pallidum, выращенную на плотной питательной среде, подвергают баллистической дезинтеграции, дезинтеграт центрифугируют и их надосадочной жидкости центрифугированием выделяет в осадок клеточные стенки культуры, которые промывают физраствором и очищают методом аффинной хроматографии. Полученный антиген разводят в 0,1 M карбонат-бикарбонатном буфере с pH 9.5 до концентрации 10 мкг/мл, заливают в полистироловые 96-луночные планшеты на 2 ч при 37oC. Затем антиген трехкратно промывают водопроводной водой и 0.05%-ным раствором твина-20.
В сенсибилизированные антигеном лунки планшета вносят в дублях по 200 мкл тестируемой сыворотки, при этом в 8 лунок вносят в дублях по 200 мкл промывающего раствора (раствор твина-20 в 0.85%-ном растворе NaCl), контрольной сыворотки человека, положительной (++++), содержащей антитела к антигенам трепонем, контрольной сыворотки человека слабоположительной (++) и контрольной сыворотки человека отрицательной (-), не содержащей антител к антигенам трепонем. Все сыворотки разводят водным раствором пептона - 0.04 г/мл.
Планшет выдерживают в термостате при 37oC в течение 30 мин. Затем вытряхивают жидкость из лунок, промывают их промывающим раствором и во все лунки добавляет по 200 мкл раствора конъюгата, за исключением лунок с промывающим раствором в том же количестве.
Раствор конъюгата готовят растворением в промывающем растворе 1:100 моноклональных антител JgM, JgG, меченных пероксидазой из хрена, 1%-ного бычьего сывороточного альбумина и мертиолят в концентрации 10-4.
Планшет выдерживают в термостате при 37oC в течение 30 мин. Удаляют жидкость из лунок и промывают их промывающим раствором. В каждую лунку планшета вносят по 200 мл субстратной смеси.
Субстратную смесь готовят смешиванием 0.8%-ного водного раствора 5-аминосалициловой кислоты с раствором гидроокиси натрия до pH 6 и добавлением 0.05%-ного раствора перекиси водорода 1:0.01.
Планшет выдерживает 1 ч при комнатной температуре в темном месте.
Учет результатов реакции проводят визуально:
- в лунках без сывороток cубстратная смесь не должна изменять окраску, быть бесцветной или светло-бежевой (-);
- в лунках с контрольной сывороткой человека отрицательной окраска субстратной смеси светло-бежевая или темно-бежевая (-);
- в лунках со слабоположительной контрольной сывороткой субстратная смесь окрашивается в светло-коричневый цвет (++);
- в лунках с положительной контрольной сывороткой субстратная смесь окрашивается в коричневый, темно-коричневый цвет (++++).
- в лунках без сывороток cубстратная смесь не должна изменять окраску, быть бесцветной или светло-бежевой (-);
- в лунках с контрольной сывороткой человека отрицательной окраска субстратной смеси светло-бежевая или темно-бежевая (-);
- в лунках со слабоположительной контрольной сывороткой субстратная смесь окрашивается в светло-коричневый цвет (++);
- в лунках с положительной контрольной сывороткой субстратная смесь окрашивается в коричневый, темно-коричневый цвет (++++).
Тест-система считается специфически активной при наличии выраженной реакции с положительными контрольными сыворотками и отсутствием реакции с отрицательной контрольной сывороткой.
Заявляемая тест-система была испытана на 604 сыворотках, в том числе 300 - от больных с подтвержденным диагнозом сифилиса, из них у четырех больных отрицательный результат теста; 150 - от больных различными кожными заболеваниями, из них у трех больных ложноположительный результат теста; 154 - от здоровых лиц, из них у двух ложноположительный результат.
Чувствительность заявляемой тест-системы составляет не менее 97%, специфичность 98%.
Claims (1)
- Иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса, содержащая фиксированный на твердом носителе антиген - обработанные ультразвуком клетки непатогенной трепанемы и пероксидазный конъюгат и используемая при инкубировании с тестируемой сывороткой с последующим добавлением субстрата и учетом результатов реакции, отличающаяся тем, что в качестве антигена она содержит выделенные клеточные структуры ультраозвученной непатогенной трепанемы, а в качестве пероксидазного конъюгата - конъюгат на основе моноклональных анти-JgM и анти-JgG.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU98114286A RU2156467C2 (ru) | 1998-07-20 | 1998-07-20 | Иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU98114286A RU2156467C2 (ru) | 1998-07-20 | 1998-07-20 | Иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU98114286A RU98114286A (ru) | 2000-05-20 |
RU2156467C2 true RU2156467C2 (ru) | 2000-09-20 |
Family
ID=20208886
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU98114286A RU2156467C2 (ru) | 1998-07-20 | 1998-07-20 | Иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2156467C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2800470C1 (ru) * | 2022-08-29 | 2023-07-21 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата для идентификации типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae O1, включая и R-варианты в дот-ИФА |
-
1998
- 1998-07-20 RU RU98114286A patent/RU2156467C2/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Дмитриев Г.А. и др. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. Венерология и дерматология. 1996, N 3, с.34. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2800470C1 (ru) * | 2022-08-29 | 2023-07-21 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата для идентификации типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae O1, включая и R-варианты в дот-ИФА |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4748110A (en) | Immunoassay for HTLV-III antigens | |
US6916626B1 (en) | Detection of Candida | |
JP2905218B2 (ja) | Hivi抗原の検出のためのイムノアッセイ法 | |
AU2002248996A1 (en) | Detection of candida | |
JPH03504412A (ja) | カンピロバクター・ピロリの高分子型細胞関連蛋白の調製法とカンピロバクター・ピロリ感染の血清学的検出のための用法 | |
AU640635B2 (en) | Avidin-biotin assisted immunoassay | |
JPH11513802A (ja) | 抗ポリマー抗体の検出方法およびシリコーン関連疾患(srd)の診断を援助するのに有用な診断試験キット | |
US4740467A (en) | Methods for diagnosing syphilis | |
JPH02156158A (ja) | 免疫試薬組成物およびクラミジア抗原または淋菌抗原の測定におけるその使用 | |
JPH02226069A (ja) | 改良されたクラミジアアッセイ | |
WO1992009895A1 (en) | Composition and its preparation process using antigen conjugated to enzymatic activity for immunological diagnosis and chagas' disease immunological diagnosis kits, for individual and epidemiological application, based on that composition | |
RU2156467C2 (ru) | Иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса | |
WO1987006620A1 (en) | Diagnostic kit for sexually transmitted diseases | |
Verhofstede et al. | Comparison of six commercial enzyme linked immunosorbent assays for detecting IgM antibodies against Toxoplasma gondii. | |
NO317151B1 (no) | Pavisning av antistoffproduksjon | |
US6379906B1 (en) | Compositions and methods for detecting adult Taenia solium | |
JPH02503951A (ja) | アッセイ | |
RU2376604C2 (ru) | Способ выявления антигена или антитела в иммуноферментном анализе | |
RU2203499C1 (ru) | Способ постановки диагностической реакции при бруцеллезе | |
RU2152036C1 (ru) | Способ определения и дифференциации ботулинических токсинов типов а и в | |
Kiraly et al. | Evaluation of the T. pallidum haemagglutination (TPHA) test for syphilis on" problem sera" | |
RU2153172C1 (ru) | Способ диагностики псевдотуберкулеза | |
Sato et al. | Treponema pallidum specific IgM haemagglutination test for serodiagnosis of syphilis. | |
US20050059103A1 (en) | Means and methods for the detection of immunoglobulin capable of binding to mycobacterium antigen | |
RU1780006C (ru) | Способ диагностики туберкулеза |