RU2152036C1 - Способ определения и дифференциации ботулинических токсинов типов а и в - Google Patents
Способ определения и дифференциации ботулинических токсинов типов а и в Download PDFInfo
- Publication number
- RU2152036C1 RU2152036C1 RU98109136A RU98109136A RU2152036C1 RU 2152036 C1 RU2152036 C1 RU 2152036C1 RU 98109136 A RU98109136 A RU 98109136A RU 98109136 A RU98109136 A RU 98109136A RU 2152036 C1 RU2152036 C1 RU 2152036C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- type
- toxins
- fragments
- antibodies
- botulinum
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к микробиологии, биохимии и иммунологии и может быть использовано для серологической диагностики ботулизма. Способ включает адсорбцию специфических F/ab/2 - фрагментов антител типов A и B на тв рдой фазе - планшете, промывание планшета, внесение антигена и инкубацию. После удаления несвязавшегося антигена и промывания планшета вносят противоботулинические конъюгаты, дифференцирующие типы ботулинических токсинов А и В на основе аффинноочищенных F/ab/2 - фрагментов антител соответствующего типа, подвергнутых перекрестной истощающей иммуносорбции, и инкубируют. Несвязавшиеся конъюгаты удаляют, планшеты промывают и в лунки добавляют индикаторный раствор. Результаты реакции оценивают по наличию окраски в рабочих лунках. Способ обеспечивает ускорение до 4 ч проведения анализа дифференциации токсинов типов A и B. 1 табл.
Description
Изобретение относится к области микробиологии, биохимии и иммунологии и может быть использовано для экстренной серологической диагностики ботулизма, определения источников инфекции, а также для санитарно-гигиенического контроля за производством и хранением пищевых продуктов.
Известен способ биологического тестирования для выявления ботулинических токсинов, включающий метод биологической пробы для определения токсинов и реакцию нейтрализации токсинов для дифференциации типов токсинов на мышах ("Инструкция о порядке расследования, учета и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых отравлениях" N 1135-73 от 20.12.73 г.; "Временные методические рекомендации по лабораторной диагностике ботулизма" N 1129-83 от 07.09.83 г.).
Недостатком данного способа являются трудоемкость, большие сроки учета результатов (72 часа - биопроба и 72 часа - реакция нейтрализации токсинов) и использование большого количества абсолютно здоровых белых мышей определенной массы и возраста, которые являются дефицитными и дорогими.
Наиболее близким аналогом к предлагаемому изобретению является способ иммуноферментного определения антигенов, включающий адсорбцию специфических F/ab/2-фрагментов антител на твердой фазе и выявление антигена с помощью конъюгата специфических F/ab/2-фрагментов антител с ферментом. (Авторское свидетельство N 1337775, кл. G 01 N 33/53, 1987 г.).
Недостатком данного способа является невозможность дифференциации при определении ботулинических токсинов типов A и B.
Технический результат заключается в создании экономичного экспрессного высокочувствительного метода для индикации и дифференциации ботулинических токсинов типов A и B.
Сущность заключается в создании 2-х иммуноферментных тестов с использованием специфических конъюгатов на основе перекрестно- и аффинноочищенных F/ab/2-фрагментов, дифференцирующих ботулинические токсины типов A и B.
Способ осуществляется следующим образом.
Иммуноферментное определение ботулинического токсина:
в качестве специфических антител для фиксации на твердой фазе ("подложка") и для конъюгации с ферментом использования перекрестно- и аффинноочищенные дифференцирующие типы токсинов A и B F/ab/2-фрагменты противоботулинических антител.
в качестве специфических антител для фиксации на твердой фазе ("подложка") и для конъюгации с ферментом использования перекрестно- и аффинноочищенные дифференцирующие типы токсинов A и B F/ab/2-фрагменты противоботулинических антител.
Для постановки реакции использовали планшеты одноразового применения. Для фиксации на планшете использовался аффинноочищенные F/ab/2-фрагменты противоботулинических антител типа A или типа B.
В качестве референс-препарата использовали ботулинический анатоксин типа A или типа B, являющийся антигенным аналогом ботулинического токсина, или ботулинический токсин типа A или типа B, который в разведениях вносили в лунки планшета.
Проявление связавшегося антигена проводили с помощью специфического конъюгата перекрестно- и аффинноочищеных F/ab/2-фрагментов противоботулинических антител типа A или типа B с пероксидазой хрена в присутствии субстратно-индикаторной смеси. Результаты реакции оценивали по наличию окраски в рабочих лунках.
Пример. Аффинноочищенные F/ab/2-фрагменты противоботулинических антител типа A или типа B, разведенные в 0,01 М фосфатно-буферном растворе pH 7,3 до концентрации белка 0,01 мг/мл, вносят в лунки планшета и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37oC. Сенсибилизированные планшеты хранят при температуре 4-6oC. Для постановки анализа планшеты трехкратно промывают 0,01 М фосфатно-буферным раствором pH 7,3, содержащим 0,05% Твина-20 (далее этот раствор используют на всех этапах постановки реакции). Затем в сенсибилизированные лунки вносят серийные разведения ботулинического анатоксина или токсина соответствующего типа и инкубируют 1,5 ч при 37oC. После удаления антигена и трехкратного промывания планшета в лунки вносят конъюгат перекрестно- и аффинноочищенных F/ab/2-фрагментов противоботулинических антител типа A или типа B с пероксидазой хрена в рабочем разведении и инкубируют 1,5 ч при 37oC. Несвязавшийся конъюгат удаляют, планшеты трехкратного промывают буферным раствором и в лунки добавляют субстратно-индикаторный раствор (5-аминосалициловая кислота или ортофенилендиамин). Результаты реакции оценивают визуально или инструментально при отрицательной реакции в контрольных лунках (подложка + конъюгат; антиген (анатоксин или токсин + конъюгат). На постановку анализа при наличии сенсибилизированных планшетов необходимо 4 ч.
Одномоментно на одном планшете может быть исследовано на наличие ботулинического токсина и определение его типа 80 образцов. При исследовании такого же количества образцов методом биологического тестирования (аналог) для определения токсина необходимо минимум 160 голов белых мышей, а затем для определения типа токсина в реакции нейтрализации также необходимы мыши. Каждый из этих трудоемких тестов дает окончательные результаты в течение 4 суток.
Приведенные данные свидетельствуют об экспрессности и экономичности предлагаемого метода.
При использовании для постановки иммуноферментного анализа для определения ботулинических токсинов тест-систем, включающих F/ab/2-фрагменты без перекрестной очистки (прототип) не удавалось добиться дифференциации между типами токсинов A и B.
Результаты сравнительной оценки специфичности предлагаемого метода и прототипа приведены в таблице.
Как видно из данных таблицы, разработанные тест-системы высокоспецифичны, то есть не дают перекрестных реакций с гетерологичными токсинами (в тест-системе типа A определяется только токсин типа A, а в тест-системе типа B определяется токсин только типа B), в то время как тест-системы прототипа дают положительные результаты при определении гетерологичных типов токсинов (в тест-системе типа A определяется токсин типа B, а в тест-системе типа B определяется токсин типа A).
Таким образом, при значительном сокращении времени, необходимого на проведение анализа (до 4 часов), удалось добиться дифференциации ботулинических токсинов типа A и типа B.
Claims (1)
- Способ иммуноферментного определения и дифференциации ботулинических токсинов типов А и В, включающий адсорбцию специфических F/ав/2-фрагментов антител на твердой фазе и выявление антигена с помощью конъюгата специфических F/ав/2-фрагментов антител с ферментом, отличающийся тем, что для дифференциации ботулинических токсинов типа А и В используют противоботулинические конъюгаты типа А и типа В на основе аффинноочищенных F/ав/2-фрагментов антител соответствующего типа, подвергнутых перекрестной истощающей иммуносорбции.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98109136A RU2152036C1 (ru) | 1998-05-12 | 1998-05-12 | Способ определения и дифференциации ботулинических токсинов типов а и в |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98109136A RU2152036C1 (ru) | 1998-05-12 | 1998-05-12 | Способ определения и дифференциации ботулинических токсинов типов а и в |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU98109136A RU98109136A (ru) | 2000-03-27 |
| RU2152036C1 true RU2152036C1 (ru) | 2000-06-27 |
Family
ID=20205956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU98109136A RU2152036C1 (ru) | 1998-05-12 | 1998-05-12 | Способ определения и дифференциации ботулинических токсинов типов а и в |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2152036C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2517120C1 (ru) * | 2012-09-05 | 2014-05-27 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ детекции ботулинических токсинов |
| RU2566553C1 (ru) * | 2014-11-12 | 2015-10-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 3F11 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К БОТУЛИНИЧЕСКОМУ ТОКСИНУ ТИПА B |
| RU2571208C1 (ru) * | 2014-11-12 | 2015-12-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 1G7 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К БОТУЛИНИЧЕСКОМУ ТОКСИНУ ТИПА В |
-
1998
- 1998-05-12 RU RU98109136A patent/RU2152036C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Воробьев А.А. и др. Использование иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга для сереологической характеристики антигенов микобактерий. - Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1992, N 2, с.65-67. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2517120C1 (ru) * | 2012-09-05 | 2014-05-27 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ детекции ботулинических токсинов |
| RU2566553C1 (ru) * | 2014-11-12 | 2015-10-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 3F11 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К БОТУЛИНИЧЕСКОМУ ТОКСИНУ ТИПА B |
| RU2571208C1 (ru) * | 2014-11-12 | 2015-12-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 1G7 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К БОТУЛИНИЧЕСКОМУ ТОКСИНУ ТИПА В |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4748110A (en) | Immunoassay for HTLV-III antigens | |
| Peruski et al. | Rapid and sensitive detection of biological warfare agents using time-resolved fluorescence assays | |
| Welch et al. | Bacteremia due to Rochalimaea henselae in a child: practical identification of isolates in the clinical laboratory | |
| CA1340109C (en) | Immunoassay for hiv-1 antigens using f(ab')2 fragments as probe | |
| Grate et al. | Advances in assays and analytical approaches for botulinum-toxin detection | |
| JPH05264553A (ja) | ヘリコバクターピロリ検出用の抗原調製物 | |
| JPH03504412A (ja) | カンピロバクター・ピロリの高分子型細胞関連蛋白の調製法とカンピロバクター・ピロリ感染の血清学的検出のための用法 | |
| Fontana et al. | Development and evaluation of two multi-antigen serological assays for the diagnosis of bovine tuberculosis in cattle | |
| Chenthamarakshan et al. | Detection of immunoglobulins M and G using culture filtrate antigen of Burkholderia pseudomallei | |
| Julián et al. | An ELISA for five glycolipids from the cell wall of Mycobacterium tuberculosis:: Tween 20 interference in the assay | |
| Barrouin-Melo et al. | Diagnosis of canine brucellosis by ELISA using an antigen obtained from wild Brucella canis | |
| Minas et al. | Validation of fluorescence polarization assay (FPA) and comparison with other tests used for diagnosis of B. melitensis infection in sheep | |
| US6733983B1 (en) | Method for identifying a mycobacterium species | |
| US20210072235A1 (en) | Method for diagnosing tuberculosis | |
| RU2152036C1 (ru) | Способ определения и дифференциации ботулинических токсинов типов а и в | |
| US4692417A (en) | Immunological identification test for group D streptococci using achromopeptidase | |
| WO1992009895A1 (en) | Composition and its preparation process using antigen conjugated to enzymatic activity for immunological diagnosis and chagas' disease immunological diagnosis kits, for individual and epidemiological application, based on that composition | |
| FI117911B (fi) | Vasta-ainetuotannon toteaminen | |
| Alasel et al. | Promising alternatives for one-tier testing of Lyme borreliosis | |
| US4814269A (en) | Diagnostic testing for antibodies against microorganisms | |
| Foster et al. | Evaluation of B. melitensis whole-cell lysate antigen-based indirect ELISA for the serodiagnosis of caprine brucellosis | |
| Van der Sluis | Laboratory techniques in the diagnosis of syphilis: a review. | |
| Gonzalez et al. | Serological evidence in sheep suggesting phlebovirus circulation in a Rift Valley fever enzootic area in Burkina Faso | |
| Gabridge et al. | Detection and speciation of common cell culture mycoplasmas by an enzyme-linked immunosorbent assay with biotin-avidin amplification and microporous membrane solid phase | |
| AU600697B2 (en) | Method of detecting urinary tract infection or imflammation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180419 |