JP2016520578A - mAb2抗Met抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年8月23日に出願されたシンガポール特許出願第201306428-2号および2013年4月30日に出願されたシンガポール特許出願第201303329-5号の優先権の恩典を主張するものであり、その内容は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、免疫学の分野にあり、c-Metに特異的に結合する抗体、そのフラグメント、およびその使用に関する。
c-Metは、膜貫通β鎖にジスルフィド結合により連結された細胞外α鎖で構成される190kDのチロシンキナーゼ受容体である。c-Metは170kDの単一のポリペプチドとして合成され、これはタンパク質分解的に切断されてα鎖とβ鎖を形成する。成熟α鎖は45kDであって、semaドメインの一部を構成している。semaドメインは、セマフォリンとプレキシンが共有する保存されたドメインである。このドメインは、ホモ二量体化にとって重要な7枚羽根のβプロペラ構造をとっている。c-Metでは、α鎖とβ鎖の両方がsemaドメインを形成しており、該ドメインは受容体の二量体化およびリガンド結合に必要にしてかつ十分である。
本発明の抗体、フラグメントおよびその使用を説明する前に、本発明は、記載される特定のペプチド、方法、使用および実験条件に限定されるものではなく、そうしたペプチド、方法、使用および条件は変更することができることを理解すべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の態様のみを説明することを目的としており、限定することを意図したものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることを理解すべきである。
である。
である。
A. a. Ab2Lの軽鎖可変ドメイン配列(SEQ ID NO:9)と少なくとも80%同一である軽鎖可変ドメイン配列;
b. Ab2Hの重鎖可変ドメイン配列(SEQ ID NO:8)と少なくとも80%同一である重鎖可変ドメイン配列;または
c. (a)の軽鎖可変ドメインおよび(b)の重鎖可変ドメイン;ならびに
B. 各CDRにおいて多くて合計3つのアミノ酸付加、置換、および/または欠失によって以下の配列と異なる軽鎖CDR1、CDR2、CDR3および重鎖CDR1、CDR2、CDR3:
a. 抗体Ab2の軽鎖CDR1 (SEQ ID NO:5)、CDR2 (SEQ ID NO:6)、CDR3 (SEQ ID NO:7)および重鎖CDR1 (SEQ ID NO:2)、CDR2 (SEQ ID NO:3)、CDR3 (SEQ ID NO:4);ここでは、前記抗体はc-Metのα鎖に含まれるエピトープに特異的に結合する。
抗α鎖c-Met抗体の開発および初期特性評価
ヒトc-Metのα鎖を原核生物において発現させて、精製した。精製したα鎖を使用してBALB/cマウスを免疫した。抗α鎖c-Met抗体を産生するハイブリドーマ細胞を得るために、免疫したマウスの脾臓細胞をSP2/0-Ag14細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞を単一細胞クローニングして、モノクローナルハイブリドーマクローンからの細胞上清を、主にウェスタンブロッティングと細胞染色によって、抗α鎖c-Met反応性についてスクリーニングした。一次および二次抗体スクリーニング(図1D)後、アイソタイプ特徴付けおよびエピトープマッピングのために21種の抗体のパネルを選択した。抗体のアイソタイプ判定は、モノクローナルハイブリドーマ上清中に市販のアイソタイピングストリップを浸すことによって行った。全21種のモノクローナル抗体は、同じIgGアイソタイプ(ただし、同じサブクラスではない)およびカッパ軽鎖を共有する(表2)。
21種のモノクローナル抗体のパネルから、腹水作製および精製のために11種の抗体を選択した。精製した抗体は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、フローサイトメトリー、および細胞散乱によるアゴニスト/アンタゴニスト活性によってさらに特性評価された。
mAb 2および13は、フローサイトメトリーで天然c-Metへの最強の結合を示した。これらの抗体が腫瘍細胞に対して何らかの生理学的効果を有するかどうかを調べるために、10μg/mLのmAbをSNU-5細胞に添加した。SNU-5細胞の生存率およびカスパーゼ活性化に対するmAb 2および13の効果は、抗体処理の72時間後に記録した(図7A)。mAb 11および18は、フローサイトメトリーでそれぞれ中間のおよび弱い親和性を実証したものであり、これらを対照として使用した。SU11274は、細胞生存率の有意な減少および高いカスパーゼ活性化を示した。これは、SU11274の作用機序がカスパーゼの活性化によるものであり、ひいてはSNU-5腫瘍細胞のアポトーシスをもたらすことを示している。対照的に、mAb 2および13で処理した細胞は、細胞生存率を減少させ、さらにはカスパーゼ活性化をも低減させた。細胞増殖に対する抗α鎖モノクローナル抗体の効果を確かめるために、抗体処理の72時間後に細胞カウントを行った。mAb 2は最も強い細胞増殖減少を示し、その後にmAb 13が続いた。mAb 18はわずかに細胞増殖を減少させ、mAb 11は効果がなかった(図7A)。
mAb 2および13が抗体結合の際に細胞内に内在化されたかどうかを調べるために、SNU-5細胞を10μg/mLの抗α鎖モノクローナル抗体とインキュベートした。モノクローナル抗体で処理した細胞を固定し、透過処理した。結合され、内在化された抗体は、抗マウスAlexa Fluor(登録商標)488結合二次抗体で検出した。抗体の局在化を共焦点顕微鏡で観察した。4℃では、mAb 2および13の染色はいずれも、拡散細胞質染色を用いて細胞膜上に局在することが観察された(図8)。細胞表面上の抗体局在化は37℃では目立たなくなった一方で、細胞質において染色の増加が観察された。細胞質染色は細胞内に蓄積することが観察され、このことは、mAb 2および13がc-Metに結合したとき内在化されて細胞内に蓄積することを示唆している。
温度が天然c-Metへの抗α鎖モノクローナル抗体の結合親和性に影響を与えるかどうかを確認するために、mAb 2、13、11および18を生存SNU-5細胞と共に4℃または37℃でインキュベートした。生存SNU-5細胞の細胞表面上に発現された天然c-Metへのモノクローナル抗体の結合は、Alexa Fluor(登録商標)488色素と結合した抗マウス二次抗体を用いて検出し、フローサイトメトリーで分析した。蛍光強度と相関する抗体結合を異なる温度で比較した。興味深いことに、各抗体は異なる温度間でのピークシフトを示し(図9)、4℃での抗体結合の減少を示した。試験した4種の抗体のうち、mAb 2は最も劇的なピークシフトを示した。抗体結合の減少は、生存SNU-5細胞上に発現された天然c-Met上のエピトープを抗体が利用できないことによると考えられる。c-Metは、通常の生理学的温度では動的なタンパク質であるが、低温では柔軟性がなくなって、特定のエピトープを隠蔽させる。
以前のpepscan分析は、最大15アミノ酸残基(全ての残基が抗体-Met相互作用に関与するわけではない)内となるように抗体のエピトープを絞り込むために設計された。低温での抗体結合の減少をさらに理解するために、mAb 2のエピトープをより詳細にマッピングした。mAb 2のPepscan分析は、mAb 2がペプチドO28およびO29に同等の親和性で結合することを実証した。これは、mAb 2のエピトープが両方のペプチドによって共有されることを示している。mAb 2相互作用にとって重要な残基を同定するために、各アミノ酸残基がアラニン残基で置換された、ペプチドO28およびO29の変形を合成した。以前に使用したのと同じELISAベースのアッセイを利用して、精製したmAb 2を各アラニン置換ペプチドに添加した。ペプチドに対する抗体の相互作用の減少は、mAb 2-Met相互作用における置換されたアミノ酸残基の重要性を示すであろう。
細胞株および試薬
全ての細胞は、5%CO2加湿インキュベーター内に37℃で維持した。ピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコ改変必須培地(DMEM)高グルコース中で培養された、HaCaT細胞、U-87MG細胞およびマウスNIH3T3細胞は、それぞれ、Birgit Lane (Institute of Medical Biology(IMB), シンガポール)、Nick Leslie (Division of Cell Signalling and Immunology, University of Dundee)およびAxel Ullrich (Institute of Medical Biology(IMB), シンガポール)の研究所からの寛大な贈り物であった。SNU-5細胞は韓国細胞株バンク(Korean Cell Line Bank)から購入した。T47D細胞とSNU-5細胞はRPMI 1640培地で培養した。DMEMおよびRPMIはInvitrogen社(米国)から入手した。全ての組織培養培地には、HyClone Laboratories/Thermo Scientific社(米国)から入手した10%の熱不活性化ウシ胎児血清を補充した。
細胞培養プレート/皿を冷PBSですすいでから、細胞を掻き取った。細胞を遠心分離によって集めた。PBSを除去し、細胞ペレットをドライアイス上で急速凍結した。凍結した細胞ペレットを、完全プロテアーゼ阻害剤(Roche社,英国,#11 697 498 001)を含有するNP40溶解緩衝液(1%NP40, 150mM NaCl, 50mM Tris-HCL pH8.0)を用いて氷上で溶解させた。細胞溶解物を10,000×gで遠心分離し、上清を分析のために回収した。タンパク質の定量は、BCAキット(Pierce/Thermo Scientific社)を用いて、メーカーのプロトコルに従って行った。
c-Metα鎖は、最初に、完全長ヒトc-Met cDNAを含むエントリーベクター(Invitrogen社 #IOH36570)からpCR2.1ベクター(Invitrogen社)に、TOPO TAクローニングキット(Invitrogen社)を用いてクローニングした。c-Metα鎖の増幅は、c-Metα鎖プライマー
を用いて行った。プラスミド抽出、ゲル抽出、およびPCR産物精製の全ての手順は、Qiagen社(英国)のキットを用いて、メーカーのプロトコルに従って行った。
抗体産生は、Moravian Biotechnology(チェコ共和国)のBorek Vojtesek博士により実施された。簡単に述べると、細菌から発現された精製ヒトc-Metα鎖でマウスを免疫化した。各注射は、精製したc-Metα鎖を40μg含んでいた。マウスの尾の血液を採取して、c-Metα鎖に対する免疫応答を試験した。c-Metα鎖に対する最高の免疫応答を与えた2匹のマウスを、ハイブリドーマ細胞融合のために犠牲にした。マウス由来の脾臓細胞を、不死のマウス骨髄腫細胞であるSP2/0-Ag14細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する選択培地中で増殖させた。脾臓細胞と不死細胞との間でうまく融合されたハイブリドーマ細胞のみが選択培地中で生き残って、増殖するだろう。
抗体スクリーニングは、Moravian Biotechnologyと共同で行った。モノクローナル抗体のスクリーニングの概要を図1bisに示す。細胞融合の10日後に、抗α鎖抗体の産生についてハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。
マウスモノクローナル抗体のアイソタイプは、市販のIsoQuick(商標)ストリップ(Sigma-Aldrich社)を用いて判定した。アイソタイピングストリップをハイブリドーマ細胞の上清中で5分間インキュベートした。ストリップ上に赤のテストラインが現れる。赤のテストラインの位置は抗体のアイソタイプに依存しており、したがって、メーカーのアイソタイピングチャートを参照することにより、抗体のアイソタイプを決定する。
ビオチンにSGSGリンカー配列によってN末端で連結されたペプチドは、Mimotopes社(オーストラリア)により合成された。Pepscan用のペプチド:c-Metのα鎖全体にまたがるペプチドを合成した。連続重複配列を有する全部で55のペプチドを合成した。各ペプチドは、10アミノ酸残基だけその前のペプチドに重複していた。
Pepscanの結果は、mAb 2がペプチドO28およびO29に結合することを示した。各アミノ酸残基を順次アラニン残基に置換したペプチドO28およびO29の変形を合成した。ストレプトアビジン被覆プレート(Pierce/Thermo Scientific社, #15520)を室温で3%BSA/PBSによりブロックした。メーカーの推奨に従ってペプチドをDMSO中に溶解して貯蔵した。ストレプトアビジン被覆プレートに各ペプチド(5μg/mL)を室温で一晩コーティングした。ウェルを洗浄した後、ハイブリドーマ上清または精製したモノクローナル抗体を各ウェルに添加した。結合したモノクローナル抗体を検出するためにHRP結合抗マウス抗体を添加した。ELISA基質(Bio-Rad社, #172-1067)溶液をメーカーの説明書に従って新たに調製し、ウェルに添加した。色の変化を肉眼でモニタリングし、100mM硫酸を添加して反応を停止させた。吸光度をマイクロプレートリーダー(SPECTRAmax PLUS384, Molecular Device社, 米国)で450nMにて読み取った。c-Metの細胞外ドメインの結晶構造(アクセッション番号1SHY)をタンパク質構造データベース(PDB)から入手した。エピトープのコンピュータイメージングは、PyMol (DeLano Scientific LLC, 米国)ソフトウェアで解析した。
商業的に得られるSC-10抗体(Santa Cruz社, 米国)は、ヒトc-MetのC末端細胞質領域内のペプチドに対して産生されたものであり、ウェスタンブロット上のc-Met前駆体(170kD)および成熟c-Metβ鎖(145kD)を認識すると予想される。AF276抗体(R&D systems社)は、c-Metの細胞外ドメインに対するヤギ抗体である。AF276抗体は、ウェスタンブロット上のc-Met前駆体、成熟c-Metβ鎖および成熟c-Metα鎖を認識すると予想される。SC-10抗体とAF276抗体は両方とも、ウェスタンブロッティングにおいて1:10000の希釈率で使用した。1μg/mLの抗α鎖c-Metモノクローナル抗体をウェスタンブロッティングのために使用した。
上記のように細胞をNP40溶解緩衝液中で溶解することによって細胞溶解物を得た。1μgの精製抗体を細胞溶解物と一晩インキュベートした(約500μL中に200μg〜500μgの総タンパク質)。洗浄したプロテインGビーズ(Sigma-Aldrich社, 米国)を細胞溶解物に添加した。ビーズを18,000×gで遠心分離して収集し、NP40溶解緩衝液で数回洗浄した。結合したタンパク質を2X LDSサンプル緩衝液の添加により溶出し、そのサンプルを100℃に加熱した。10,000×gで遠心分離することにより溶出液からビーズを分離した。溶出液をSDS-PAGEゲルで分析した。
フローサイトメトリーは、Flow Cytometry Core Facility (College of Medicine, Dentistry and Nursing, University of Dundee, 英国)の支援を受けて実施された。
10μg/mLの抗α鎖モノクローナル抗体を生存SNU-5細胞と4℃または37℃で1時間インキュベートした。細胞を回収し、冷PBSで1回洗浄した。生細胞への抗体結合は、Alexa Fluor(登録商標)488結合抗マウス二次抗体(Invitrogen社 #A11029)により測定した。細胞を1%BSA/PBS中に再懸濁して、フローサイトメトリーで分析した。
100〜200個のHaCaT細胞を24ウェルプレートに播種し、小さなコロニーを形成するまで(約7日間)増殖させた。細胞を24時間血清飢餓状態にした。細胞を精製モノクローナル抗体(1μg/mL)と24時間インキュベートした後、冷PBSで2回すすぎ、氷冷メタノール中で固定した。次に、細胞を1%クリスタル-バイオレット(Sigma-Aldrich社)溶液中で染色した。細胞染色はZeiss Axiovert 25倒立顕微鏡を用いて観察し、Canon EOS 1000 Dカメラを用いて写真撮影した。
CellTiter-Glo(登録商標)発光細胞生存率アッセイおよびCaspase-Glo(登録商標)3/7アッセイ(Promega社, 米国)を用いて、それぞれ細胞生存率およびカスパーゼ活性化を測定した。SNU-5細胞(1×105個)を各96ウェルに播種し、72時間処理した後に分析した。細胞生存率およびカスパーゼ活性化はメーカーのプロトコルに従って行った。En Visionプレートリーダー(PerkinElmer社, 米国)を用いて発光を読み取った。
細胞カウント
細胞を播種し、抗α鎖c-Metモノクローナル抗体で72時間処理した。細胞を回収し、自動ADAM細胞カウンター(Digital Bio社, 韓国)を用いて計数した。
SNU-5細胞を5μMのCellTracker BODIPY色素で30分間染色した。染色した細胞を播種し、抗α鎖c-Metモノクローナル抗体で6日間処理した。細胞を回収し、生細胞中の色素保持をフローサイトメトリーにより分析した。
10μg/mLの抗α鎖モノクローナル抗体を生存SNU-5細胞と4℃または37℃で1時間インキュベートした。抗体処理細胞をPBSで1回洗浄し、Thermo Shandon Cytospin 3 Cytofuge (Thermo Scientific社)を800rpmで5分間使用してポリリシン被覆スライド(Thermo Scientific社, #5991056)上に沈着させ、直ちに4%パラホルムアルデヒド中で固定した。次に、細胞をブロックし、0.4%Triton X-100および5%BSAを含有するPBSで透過処理した。結合した抗α鎖c-Met抗体を、抗マウスAlexa Fluor(登録商標)488結合二次抗体を用いて検出した。ファロイジンを二次抗体と一緒に添加した。細胞を洗浄した後、4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で染色し、アンチブリーチング剤として2.5%DABCO (1,4-ジアザビシクロ-[2.2.2]オクタン)(Sigma-Aldrich社)を含有するHydromount (National Diagnostics社, 米国)でマウントした。Nikon Eclipse E600顕微鏡を用いて免疫蛍光を観察した。
Pepscan分析を使用して、mAb 2によって結合されたc-Metα鎖の領域を決定した。α鎖全体にまたがる連続重複ペプチドをインビトロで合成した(Mimotopes社)。15アミノ酸残基から構成された各ペプチドは、10アミノ酸だけ各隣接ペプチドと重複する。これらのペプチドは、SGSGリンカー配列を介してN末端でビオチンによりタグ付けした。ペプチドを96ウェルプレートの個々のストレプトアビジン被覆ウェルに添加し、未結合のペプチドを徹底的な洗浄により除去した。α鎖上のmAb 2結合の領域を決定するために、mAb 2を各ペプチド含有ウェルに添加した。抗体の結合を比色アッセイにより検出し、450nMで吸光度を読み取ることによって分析した。
に同様の親和性で結合した(図11A)。これは、mAb 2のエピトープが両ペプチドによって共有されることを示している。mAb 2-Met相互作用にとって重要なペプチドO28およびO29内の残基を同定するために、アラニンスキャンを実施した。各アミノ酸残基を順次アラニン残基に置換したペプチドO28およびO29の変形を合成した(表3)。ペプチドP1〜P16 (SEQ ID NO:26〜39を有する)およびP17〜P31 (SEQ ID NO:40〜56を有する)を、それぞれ元のペプチドO28およびO29から誘導した。上記と同じELISAベースのアッセイを用いて、合成ペプチドをストレプトアビジン被覆ウェルに添加し、各ペプチド含有ウェルに精製mAb 2を添加した。mAb 2の結合は、450nMで吸光度を読み取ることによって測定した。ペプチドへの抗体結合の低下は、置換されたアミノ酸残基のmAb 2-Met相互作用における重要性を実証する。ペプチドO27、ペプチドO1およびペプチドなしを陰性対照として使用した。興味深いことに、ペプチドO28の最初の10アミノ酸はペプチドO27と重複するにもかかわらず、mAb 2はペプチドO27に結合しない。
mAb 2の重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を、抗体単鎖可変フラグメント(scFv)発現用のファージ発現ベクターpIT2にクローニングした。2つのmAb 2 scFv構築物を作製した:VH-VL scFvおよびVL-VH scFv。mAb 2の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列とタンパク質配列を、それぞれ図13および図14に示す。
Claims (31)
- c-Metのα鎖に含まれるエピトープに特異的に結合する抗体。
- 前記エピトープが、配列IEEもしくはCPD;またはIEEもしくはCPDC;またはIEEおよびCPD;またはIEEおよびCPDCを含む、請求項1記載の抗体。
- 前記エピトープが、******IEE***CPD(SEQ ID NO:12)または*IEE***CPDC****(SEQ ID NO:13)を含み、ここで、*は任意のアミノ酸であり得る、請求項2記載の抗体。
- ******IEE***CPDが、C***P*IEEP**CPD(SEQ ID NO:14)である、請求項3記載の抗体。
- *IEE***CPDC****が、*IEEP**CPDC****(SEQ ID NO:15)である、請求項3記載の抗体。
- c-Metがヒトc-Metである、請求項1記載の抗体。
- モノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項1または2記載の抗体。
- マウス抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
- マウスモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
- マウス抗体がヒト化されている、請求項10または11記載の抗体。
- キメラ抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
- 前記抗体の重鎖が、
SEQ ID NO:2の配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:3の配列を含むCDR2;または
SEQ ID NO:4の配列を含むCDR3;
の少なくとも1つ、少なくとも2つ、または全てを含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。 - 前記抗体の軽鎖が、
SEQ ID NO:5の配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:6の配列を含むCDR2;または
SEQ ID NO:7の配列を含むCDR3;
の少なくとも1つ、少なくとも2つ、または全てを含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。 - 前記抗体が、SEQ ID NO:8の配列、またはSEQ ID NO:8の配列と少なくとも95%、96%、97%、もしくは98%同一である配列を含む重鎖を有する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
- 前記抗体が、SEQ ID NO:9の配列、またはSEQ ID NO:9の配列と少なくとも95%、96%、97%、もしくは98%同一である配列を含む軽鎖を有する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
- 薬剤に連結されている、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
- 前記薬剤が細胞毒性剤である、請求項18記載の抗体。
- 前記薬剤がメルタンシン、エムタンシン、モノメチルアウリスタチンE、リシン、ジフテリア毒素、ドキソルビシン、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素、およびピロロベンゾジアゼピンからなる群より選択される、請求項19記載の抗体。
- 抗体の重鎖がSEQ ID NO:10に示される配列を含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体をコードする核酸。
- 抗体の軽鎖がSEQ ID NO:11に示される配列を含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体をコードする核酸。
- 請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体を含む薬学的組成物。
- 1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、ビヒクル、または担体をさらに含む、請求項23記載の薬学的組成物。
- 治療に有効な量の、請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体を投与することを含む、癌の治療および/または予防方法。
- 癌が乳癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、脳癌、血液癌、結腸癌、膵臓癌、および前立腺癌からなる群より選択される、請求項23記載の方法。
- c-Metを検出するための請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体を投与することによって、c-Metの異常な発現を検出することを含む、癌の診断方法。
- 癌を治療および/または予防するための医薬の製造における、請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体の使用。
- 異常なc-Met発現を有する細胞を検出するための、請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体の使用。
- 癌の予後マーカーとしての、請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体の使用。
- 癌が乳癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、脳癌、血液癌、結腸癌、膵臓癌、および前立腺癌からなる群より選択される、請求項28記載の使用。
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