JP2020141682A - Ａｘｌに結合する抗体 - Google Patents

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Abstract

【課題】改善された抗腫瘍活性を有する抗ＡＸＬ抗体の提供。【解決手段】ＡＸＬに結合し、ＡＸＬのリガンドである増殖停止特異的６（Ｇａｓ６）とＡＸＬ結合について競合しない抗ＡＸＬ抗体、抗体の第１の結合領域及び該第１の抗原結合領域とは異なる標的又たはエピトープに結合する第２の結合領域を含む二重特異性抗体、細胞傷害性作用物質等のイムノコンジュゲート、及び、抗ＡＸＬ抗体、イムノコンジュゲート、又は組成物による癌の処置方法、診断方法の提供。【選択図】図１

Description

発明の分野
本発明は、AXLに結合する抗体、イムノコンジュゲート、そのような抗体またはイムノコンジュゲートを含む組成物、ならびに、該抗体およびイムノコンジュゲートの使用に関する。
背景
哺乳動物受容体チロシンキナーゼ（RTK）のTAMサブファミリーは、AXL、Tyro3、およびMerからなる。AXLは、形質転換能力を有する104〜140 kDaの膜貫通タンパク質である[1]。AXLは、そのリガンドであるビタミンK依存性増殖停止特異的因子6（Gas6）の結合時に活性化され得る。AXLに対するGas6結合は、AXLの二量体化、自己リン酸化、ならびにその後の、PI3K／AKT、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）、STAT、およびNF-κBカスケードなどの細胞内シグナル伝達経路の活性化につながる[2]。癌細胞において、AXLは、腫瘍細胞の運動性、浸潤、遊走を増強し、上皮間葉転換（EMT）に関与している[3]。さらに、AXL発現は、上皮成長因子受容体（EGFR）標的療法（Wilson 2014、Brand 2013、Zhang 2012）またはB-raf（BRAF）経路の阻害剤（Muller, 2014）などの化学療法および標的療法に対する耐性に関係している。
TAM受容体ファミリーメンバーの細胞外ドメインは、2個のN末端免疫グロブリン（Ig）様ドメインおよび2個のフィブロネクチンIII型（FNIII）リピートの組み合わせから構成されている[1]。リガンドであるGas6は、AXLのIg様ドメインIおよびIIに結合する[14]。
AXLの上方制御が、胃癌、前立腺癌、卵巣癌、および肺癌を含む様々な癌において報告されている[1]。さらに、AXLは、乳癌および膵臓癌において過剰発現しており、より高い転移頻度および不良な全生存と有意に関連している[2]。
RTKの標的阻害は、抗腫瘍および／または転移療法として有効であり得る。そのようなAXLおよび／またはリガンドGas6の標的阻害は、低分子および抗AXL抗体の両方を含む[3]。抗AXL抗体は、受容体発現の下方制御、腫瘍細胞増殖の低減、およびアポトーシスの誘導によって、インビボで非小細胞肺癌異種移植片の成長を減衰させることが記載されている[4]。さらに、種々のモノクローナル抗体が、リガンドGas6のAXLに対する結合を遮断することが記載されている[2]、[5]、および[7]。
抗AXL抗体は、以前に記載されている[8]〜[13]。しかし、改善された抗腫瘍活性を有する抗AXL抗体の必要性が残っている。
抗AXL抗体を提供することが、本発明の目的である。したがって、1つの局面において、本発明は、AXLに結合し、AXL結合についてリガンドである増殖停止特異的6（Gas6）と競合しない抗体に関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体の第1の結合領域、および該第1の抗原結合領域とは異なる標的またはエピトープに結合する第2の結合領域を含む二重特異性抗体に関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体または二重特異性抗体、および、細胞傷害性作用物質、化学療法薬、サイトカイン、免疫抑制剤、抗生物質、または放射性同位元素などの治療部分を含むイムノコンジュゲートに関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲートを含む組成物に関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体をコードする核酸構築物に関する。
別の局面において、本発明は、本発明による1つまたは複数の核酸構築物を含む発現ベクターに関する。
別の局面において、本発明は、本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体を産生するハイブリドーマに関する。
別の局面において、本発明は、薬剤としての使用のための、本発明による抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲートに関する。
別の局面において、本発明は、癌の処置における使用のための、本発明による抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲートに関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体、二重特異性抗体、イムノコンジュゲート、組成物、または薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、癌の処置の方法に関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体、二重特異性抗体、イムノコンジュゲート、組成物、または薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、AXL発現細胞の関与または蓄積を特徴とする疾患を診断する方法であって、任意で、抗体が検出可能な作用物質で標識され、AXL発現細胞の量が疾患と相関するかまたは疾患を示す方法に関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体、二重特異性抗体、イムノコンジュゲート、組成物、または薬学的組成物の、それを必要とする個体への投与を含む、AXLを発現する腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法に関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体を産生するための方法であって、a）本発明による宿主細胞またはハイブリドーマを培養する工程、およびb）培養培地から抗体を精製する工程を含む方法に関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体または二重特異性抗体を含む診断用組成物に関する。
別の局面において、本発明は、試料におけるAXL抗体またはAXLを発現する細胞の存在を検出するための方法であって、a）試料と、本発明による抗体、二重特異性抗体、イムノコンジュゲートとを、抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲートとAXLとの間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程；およびb）複合体が形成されているかどうかを解析する工程を含む方法に関する。
別の局面において、本発明は、試料におけるAXL抗原またはAXLを発現する細胞の存在を検出するためのキットであって、i）本発明による抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲート；およびii）キットの使用説明書を含むキットに関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗AXL抗体に結合する抗イディオタイプ抗体に関する。
[本発明1001]
AXLに結合し、リガンドである増殖停止特異的6（Gas6）とAXL結合について競合しない、抗体。
[本発明1002]
Gas6の存在下でのAXLに対する最大の抗体結合が、実施例2に開示されている方法によって判定される際に、Gas6の非存在下での結合の少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％、例えば100％である、本発明1001の抗体。
[本発明1003]
Gas6の存在下でのAXLに対する最大の抗体結合が、競合アッセイによって判定される際に、Gas6の非存在下での結合の少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％、例えば100％であり、該AXLに結合する前記抗体と該Gas6との間の競合が、Gas6と共におよびGas6なしでプレインキュベートされたA431細胞上で判定される、本発明1001または1002の抗体。
[本発明1004]
前記抗体が、ヒトAXLに対して0.3×10-9〜63×10-9 Mの範囲の結合親和性（KD）を有し、該結合親和性が、可溶性AXL細胞外ドメインを用いたバイオレイヤー干渉法を用いて測定される、本発明1001〜1003のいずれかの抗体。
[本発明1005]
前記抗体が、AXLに対して9.7×10-5〜4.4×10-3 s-1の解離速度を有し、該解離速度が、可溶性組み換えAXL細胞外ドメインを用いたバイオレイヤー干渉法によって測定される、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1006]
AXLが、SEQ ID NO:130において特定されるヒトAXLである、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1007]
AXLが、SEQ ID NO:147において特定されるカニクイザルAXLである、本発明1001〜1005のいずれかの抗体。
[本発明1008]
AXLが、SEQ ID NO:130において特定されるヒトAXL、およびSEQ ID NO:147において特定されるカニクイザルAXLである、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1009]
以下からなる群より選択される可変重鎖（VH）CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む少なくとも1つの結合領域を含む、前記本発明のいずれかの抗体：
a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38 [107]；
b）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95 [613]；
c）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]；
d）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48 [148]；
e）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59 [171]；
f）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80 [187]；
g）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120 [148 / 140]；
h）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53 [154]；
i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75 [183]；
j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75 [183-N52Q]；
k）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116 [733]；
l）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125 [171 / 172 / 181]；
m）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110 [726]；
n）それぞれ、SEQ ID NO:108、121、および122 [726 / 187]；
o）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43 [140]；
p）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64 [172]；
q）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69 [181]；
r）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54 [154-M103L]；
s）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80 [187]；
t）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85 [608-01]；
u）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90 [610-01]；
v）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100 [613-08]；
w）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105 [620-06]；ならびに
x）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111 [726-M101L]。
[本発明1010]
VH CDR1、CDR2、およびCDR3が、a）、d）、g）、またはk）のいずれかから選択される、本発明1009の抗体。
[本発明1011]
少なくとも1つの結合領域が、
以下からなる群より選択される配列と少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％、例えば100％の配列同一性を有する、CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む可変重鎖（VH）領域と、CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む可変軽鎖（VL）領域と
を含む、前記本発明のいずれかの抗体；
a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [107]；
b）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148]；
c）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [733]；
d）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154]；
e）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154-M103L]；
f）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171]；
g）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [172]；
h）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [181]；
i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183]；
j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183-N52Q]；
k）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [187]；
l）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [608-01]；
m）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [610-01]；
n）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613]；
o）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:101、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613-08]；
p）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [620-06]；
q）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726]；
r）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726-M101L]；
s）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [140]；
t）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID NO:129のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 613-08]；
u）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148 / 140]；
v）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171 / 172 / 181]；ならびに
w）それぞれ、SEQ ID NO:121、109、および122のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726 / 187]；ならびに
x）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]。
[本発明1012]
少なくとも1つの結合領域が、以下からなる群より選択されるVH領域および可変軽鎖（VL）領域を含む、前記本発明のいずれかの抗体；
a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [107]；
b）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148]；
c）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [733]；
d）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154]；
e）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154-M103L]；
f）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171]；
g）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [172]；
h）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [181]；
i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183]；
j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183-N52Q]；
k）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [187]；
l）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [608-01]；
m）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [610-01]；
n）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613]；
o）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:101、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613-08]；
p）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [620-06]；
q）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726]；
r）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726-M101L]；
s）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [140]；
t）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID NO:129のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 613-08]；
u）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148 / 140]；
v）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171 / 172 / 181]；ならびに
w）それぞれ、SEQ ID NO:121、109、および122のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726 / 187]；ならびに
x）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]。
[本発明1013]
少なくとも1つの結合領域が、以下からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む、前記本発明のいずれかの抗体；
a）SEQ ID NO:1を含むVH領域、およびSEQ ID NO:2を含むVL領域 [107]；
b）SEQ ID NO:5を含むVH領域、およびSEQ ID NO:6を含むVL領域 [148]；
c）SEQ ID NO:34を含むVH領域、およびSEQ ID NO:35を含むVL領域 [733]；
d）SEQ ID NO:7を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154];
e）SEQ ID NO:10を含むVH領域、およびSEQ ID NO:11を含むVL領域 [171]；
f）SEQ ID NO:16を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183]；
g）SEQ ID NO:25を含むVH領域、およびSEQ ID NO:26を含むVL領域 [613]；
h）SEQ ID NO:31を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726]；
i）SEQ ID NO:3を含むVH領域、およびSEQ ID NO:4を含むVL領域 [140]；
j）SEQ ID NO:8を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154-M103L]；
k）SEQ ID NO:12を含むVH領域、およびSEQ ID NO:13を含むVL領域 [172]；
l）SEQ ID NO:14を含むVH領域、およびSEQ ID NO:15を含むVL領域 [181]；
m）SEQ ID NO:17を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183-N52Q]；
n）SEQ ID NO:19を含むVH領域、およびSEQ ID NO:20を含むVL領域 [187]；
o）SEQ ID NO:21を含むVH領域、およびSEQ ID NO:22を含むVL領域 [608-01]；
p）SEQ ID NO:23を含むVH領域、およびSEQ ID NO:24を含むVL領域 [610-01]；
q）SEQ ID NO:27を含むVH領域、およびSEQ ID NO:28を含むVL領域 [613-08]；
r）SEQ ID NO:29を含むVH領域、およびSEQ ID NO:30を含むVL領域 [620-06]；ならびに
s）SEQ ID NO:32を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726-M101L]。
[本発明1014]
前記抗体がAXL上のエピトープに結合し、該エピトープが、本発明1009〜1013において定義される抗体のいずれかによって認識される、本発明1001〜1008のいずれかの抗体。
[本発明1015]
前記抗体がAXL上のエピトープに結合し、該エピトープが、本発明1013において定義される抗体のいずれかによって認識される、本発明1001〜1008のいずれかの抗体。
[本発明1016]
前記抗体がAXLのIg1様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置L121〜Q129またはT112〜Q124に対応する1つまたは複数のアミノ酸を含むかまたは必要とする、本発明1001〜1008のいずれかの抗体。
[本発明1017]
前記抗体がAXLのIg2様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置D170またはD179の組み合わせに対応するアミノ酸、および位置T182〜R190に対応する1つまたは複数のアミノ酸を含むかまたは必要とする、本発明1001〜1008のいずれかの抗体。
[本発明1018]
前記抗体がヒトAXLのFN1様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置Q272〜A287およびG297〜P301に対応する1つまたは複数のアミノ酸を含むかまたは必要とする、本発明1001〜1008のいずれかの抗体。
[本発明1019]
前記抗体がヒトAXLのFN2様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置A359、R386に対応するアミノ酸、および位置Q436〜K439に対応する1つまたは複数のアミノ酸を含むかまたは必要とする、前記本発明1001〜1008のいずれかの抗体。
[本発明1020]
IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプの重鎖を含む、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1021]
アイソタイプがIgG1、任意でアロタイプIgG1m(f)である、本発明1020の抗体。
[本発明1022]
完全長モノクローナル抗体、例えば完全長モノクローナルIgG1,κ抗体である、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1023]
エフェクター機能欠損抗体、安定化IgG4抗体、または一価抗体である、本発明1001〜1022のいずれかの抗体。
[本発明1024]
全ヒンジ領域が欠失しているように重鎖が改変されている、本発明1023の抗体。
[本発明1025]
抗体の配列が、N結合型グリコシル化のためのいかなるアクセプター部位も含まないように改変されている、本発明1023および1024のいずれかの抗体。
[本発明1026]
一本鎖抗体である、本発明1001〜1025のいずれかの抗体。
[本発明1027]
前記本発明のいずれかの抗体の第1の結合領域と、該第1の結合領域とは異なる標的またはエピトープに結合する第2の結合領域とを含む、二重特異性抗体。
[本発明1028]
前記二重特異性抗体が第1および第2の重鎖を含み、該第1および第2の重鎖の各々が、少なくともヒンジ領域、CH2およびCH3領域を含み、該第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のK409、T366、L368、K370、D399、F405、およびY407からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも1つが置換されており、該第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のF405、T366、L368、K370、D399、Y407、およびK409からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも1つが置換されており、該第1の重鎖および該第2の重鎖の該置換が同じ位置ではない、本発明1027の二重特異性抗体。
[本発明1029]
ヒトIgG1重鎖中のK409に対応する位置のアミノ酸が第1の重鎖においてRであり、ヒトIgG1重鎖中のF405に対応する位置のアミノ酸が第2の重鎖においてLであるか、またはその逆である、本発明1027〜1028のいずれかの二重特異性抗体。
[本発明1030]
本発明1001〜1026のいずれかの抗体または本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体と、細胞傷害性作用物質、化学療法薬、サイトカイン、免疫抑制剤、抗生物質、または放射性同位元素などの治療部分とを含む、イムノコンジュゲート。
[本発明1031]
治療部分が細胞傷害性作用物質である、本発明1030のイムノコンジュゲート。
[本発明1032]
細胞傷害性作用物質が、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)-ペンタノアート（SSP）、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（mc-vc-PAB）、またはAV-1 K-lockバリン-シトルリンなどの切断可能なリンカーで抗体に連結されている、本発明1030〜1031のいずれかのイムノコンジュゲート。
[本発明1033]
細胞傷害性作用物質が、スクシンイミジル-4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート（MCC）またはマレイミドカプロイル（MC）などの切断不可能なリンカーで抗体またはその断片に連結されている、本発明1030〜1031のいずれかのイムノコンジュゲート。
[本発明1034]
細胞傷害性作用物質が、DNA標的作用物質、例えば、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ラシェルマイシン（CC-1065）、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PBD）、およびインドリノベンゾジアゼピン（IGN）などのDNAアルキル化剤および架橋剤；微小管標的作用物質、例えばデュオスタチン（duostatin）、例えばデュオスタチン-3、アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチンE（MMAE）およびモノメチルアウリスタチンF（MMAF）、ドラスタチン、メイタンシン、N(2')-デアセチル-N(2')-(3-マルカプト-1-オキソプロピル)-メイタンシン（DM1）、ならびにツブリシン；ならびにヌクレオシド類似体；またはこれらの類似体、誘導体、もしくはプロドラッグの群から選択される、本発明1030〜1033のいずれかのイムノコンジュゲート。
[本発明1035]
i）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有する切断可能なリンカー；
ii）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有さない切断可能なリンカー；
iii）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有する切断不可能なリンカー；または
iv）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有さない切断不可能なリンカー
の組み合わせを含む、本発明1030〜1034のいずれかのイムノコンジュゲート。
[本発明1036]
リンカーがmc-vc-PABであり、細胞傷害性作用物質がMMAEであるか；または
リンカーがSSPであり、細胞傷害性作用物質がDM1である、
本発明1030〜1032、および1034〜1035のいずれかのイムノコンジュゲート。
[本発明1037]
前記イムノコンジュゲートが、リンカーmc-vc-PAB、細胞傷害性作用物質MMAE、および前記抗体を含み、少なくとも1つの結合領域が、以下からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む、前記本発明のいずれかのイムノコンジュゲート；
a）SEQ ID NO:1を含むVH領域、およびSEQ ID NO:2を含むVL領域 [107]；
b）SEQ ID NO:5を含むVH領域、およびSEQ ID NO:6を含むVL領域 [148]；
c）SEQ ID NO:34を含むVH領域、およびSEQ ID NO:35を含むVL領域 [733]；
d）SEQ ID NO:7を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154];
e）SEQ ID NO:10を含むVH領域、およびSEQ ID NO:11を含むVL領域 [171]；
f）SEQ ID NO:16を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183]；
g）SEQ ID NO:25を含むVH領域、およびSEQ ID NO:26を含むVL領域 [613]；
h）SEQ ID NO:31を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726]；
i）SEQ ID NO:3を含むVH領域、およびSEQ ID NO:4を含むVL領域 [140]；
j）SEQ ID NO:8を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154-M103L]；
k）SEQ ID NO:12を含むVH領域、およびSEQ ID NO:13を含むVL領域 [172]；
l）SEQ ID NO:14を含むVH領域、およびSEQ ID NO:15を含むVL領域 [181]；
m）SEQ ID NO:17を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183-N52Q]；
n）SEQ ID NO:19を含むVH領域、およびSEQ ID NO:20を含むVL領域 [187]；
o）SEQ ID NO:21を含むVH領域、およびSEQ ID NO:22を含むVL領域 [608-01]；
p）SEQ ID NO:23を含むVH領域、およびSEQ ID NO:24を含むVL領域 [610-01]；
q）SEQ ID NO:27を含むVH領域、およびSEQ ID NO:28を含むVL領域 [613-08]；
r）SEQ ID NO:29を含むVH領域、およびSEQ ID NO:30を含むVL領域 [620-06]；ならびに
s）SEQ ID NO:32を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726-M101L]。
[本発明1038]
リンカーがMMCであり、細胞傷害性作用物質がDM1であるか；または
リンカーがMCであり、細胞傷害性作用物質がMMAFである、
本発明1030、および1032〜1033のいずれかのイムノコンジュゲート。
[本発明1039]
抗体あたりの細胞傷害性作用物質の数が、1〜8個、例えば2〜7個、例えば2〜6個、例えば2〜5個、例えば2〜4個、および例えば2〜3個である、本発明1030〜1038のいずれかのイムノコンジュゲート。
[本発明1040]
本発明1001〜1026のいずれかの抗体、本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体、または本発明1030〜1039のいずれかのイムノコンジュゲートを含む、組成物。
[本発明1041]
本発明1001〜1026のいずれかの抗体、本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体、または本発明1030〜1039のいずれかのイムノコンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[本発明1042]
本発明1001〜1013および1037のいずれかの1つまたは複数の対応するアミノ酸配列をコードする、核酸構築物。
[本発明1043]
本発明1001〜1026のいずれかの抗体をコードする、核酸構築物。
[本発明1044]
本発明1042および1043のいずれかの1つまたは複数の核酸構築物を含む、発現ベクター。
[本発明1045]
本発明1044のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1046]
組み換え原核生物、組み換え真核生物、または組み換え微生物の宿主細胞などの組み換え宿主細胞である、本発明1045の宿主細胞。
[本発明1047]
本発明1001〜1026のいずれかの抗体または本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体を産生する、本発明1045〜1046のいずれかの宿主細胞。
[本発明1048]
本発明1001〜1026のいずれかの抗体を産生する、ハイブリドーマ。
[本発明1049]
薬剤としての使用のための、本発明1001〜1026のいずれかの抗体、本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体、または本発明1030〜1039のいずれかのイムノコンジュゲート。
[本発明1050]
癌の処置における使用のための、本発明1001〜1026のいずれかの抗体、本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体、または本発明1030〜1039のいずれかのイムノコンジュゲート。
[本発明1051]
本発明1001〜1026のいずれかの抗体、本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体、本発明1030〜1039のいずれかのイムノコンジュゲート、本発明1040の組成物、または本発明1041の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、癌の処置の方法。
[本発明1052]
本発明1001〜1026のいずれかの抗体、本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体、本発明1030〜1039のいずれかのイムノコンジュゲート、本発明1040の組成物、または本発明1041の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、AXL発現細胞の関与または蓄積を特徴とする疾患を診断する方法であって、任意で、抗体が検出可能な作用物質で標識され、AXL発現細胞の量が疾患と相関するかまたは疾患を示す、方法。
[本発明1053]
癌が、AXLを発現する固形腫瘍またはAXL発現血液癌である、本発明1049〜1050のいずれかの使用、および本発明1051〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
血液癌が、慢性リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（AML）、および慢性骨髄性白血病などの白血病、非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、ならびに多発性骨髄腫からなる群より選択される、本発明1052および1053のいずれかの使用または方法。
[本発明1055]
AXLを発現する固形腫瘍が、肺癌または類表皮癌である、本発明1052および1053のいずれかの使用または方法。
[本発明1056]
癌が、結腸直腸癌腫および結腸直腸腺癌などの結腸直腸癌、膀胱癌、軟骨肉腫などの骨癌、トリプルネガティブ乳癌などの乳癌、神経膠芽腫、星状細胞腫、神経芽腫などの中枢神経系の癌、子宮頸癌、結合組織癌、子宮内膜癌、線維芽細胞癌、胃癌腫などの胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝細胞癌などの肝臓癌、NSCLCおよび肺扁平上皮癌などの肺癌、筋肉癌、神経組織癌、卵巣癌、膵管癌および膵臓腺癌などの膵臓癌、悪性黒色腫などの皮膚癌、ならびに軟部組織肉腫からなる群より選択される、本発明1052および1053のいずれかの使用または方法。
[本発明1057]
本発明1001〜1026のいずれかの抗体、本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体、本発明1030〜1039のいずれかのイムノコンジュゲート、本発明1040の組成物、または本発明1040の薬学的組成物の、それを必要とする個体への投与を含む、AXLを発現する腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法。
[本発明1058]
本発明1001〜1026のいずれかの抗体を産生するための方法であって、
a）本発明1044〜1047のいずれかの宿主細胞または本発明1048のハイブリドーマを培養する工程、および
b）培養培地から抗体を精製する工程
を含む、方法。
[本発明1059]
本発明1001〜1026のいずれかの抗体、または本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体を含む、診断用組成物。
[本発明1060]
試料におけるAXL抗体またはAXLを発現する細胞の存在を検出するための方法であって、
a）試料と、本発明1001〜1026のいずれかの抗体、本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体、または本発明1030〜1039のいずれかのイムノコンジュゲートとを、抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲートとAXLとの間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程；および
b）複合体が形成されているかどうかを解析する工程
を含む、方法。
[本発明1061]
試料におけるAXL抗原またはAXLを発現する細胞の存在を検出するためのキットであって、
i）本発明1001〜1026のいずれかの抗体、本発明1027〜1029のいずれかの二重特異性抗体、または本発明1030〜1039のいずれかのイムノコンジュゲート；および
ii）該キットの使用説明書
を含む、キット。
[本発明1062]
本発明1001〜1026のいずれかの抗AXL抗体に結合する、抗イディオタイプ抗体。
（A）ヒトAXL-ECD、（B）カニクイザルAXL-ECD、または（C）マウスAXL-ECDをトランスフェクトしたHEK293細胞に対する、抗AXL抗体の結合曲線。示したデータは、実施例2に記載されているような1つの代表的な実験の平均蛍光強度（MFI）である。 マウス-ヒトAXLキメラに対する抗AXL抗体の結合を、実施例3に記載されているように行った。以下のホモ・サピエンス（Homo sapiens）AXL（hsAXL）およびハツカネズミ（Mus musculus）AXL（mmAXL）キメラタンパク質を試験した：（A）hsAXLおよびモック、（B）hsAXL-mmECD、（C）hsAXL-mmIg1、（D）hsAXL-mmIg2、（E）hsAXL-mmFN1、（F）hsAXL-mmFN2。 A431細胞における抗AXL抗体依存性細胞媒介性細胞傷害。A431細胞における抗AXL抗体による抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を、実施例4に記載されているように判定した。 AXL抗体-薬物コンジュゲート（AXL-ADC）の結合特性。ヒトAXLを一過性にトランスフェクトしたHEK293T細胞に対するAXL-ADCの結合を、実施例5に記載されているように判定した。示したデータは、1つの代表的な実験の平均蛍光強度（MFI）である。 AXL抗体-薬物コンジュゲートにより誘導されるインビトロ細胞傷害。AXL抗体-薬物コンジュゲートによる細胞傷害の誘導を、実施例6に説明されているように判定した。 AXLに対する結合を可能にする抗体VHおよびVLのバリアント。同一のVLまたはVH領域を有する抗体を整列させ、それぞれ、VH（図A〜D）またはVL（図E）配列における差を特定して、図において四角により示した。CDR領域に下線を引いている。 LCLC-103H細胞におけるADCによる細胞傷害の誘導を、実施例8に記載されているように判定した。 実施例9に記載されているような、治療的LCLC-103H異種移植モデルにおけるMMAEコンジュゲートAXL抗体による抗腫瘍活性。 実施例10に記載されているような、AXLモノクローナル抗体のプールを用いた凍結PAXF1657腫瘍切片（膵臓癌PDXモデル）の免疫組織化学染色。 （A）PAXF1657モデルのAXL-ADCでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。コンジュゲートされていないAXL Humab（C）および非標的ADC（D）は、抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力が、MMAEの細胞傷害活性および標的結合に依存していたことが示される。エラーバーは標準誤差を表す。 （A）PAXF1657モデルのAXL-ADCでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。コンジュゲートされていないAXL Humab（C）および非標的ADC（D）は、抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力が、MMAEの細胞傷害活性および標的結合に依存していたことが示される。エラーバーは標準誤差を表す。 （A）PAXF1657モデルのAXL-ADCでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。コンジュゲートされていないAXL Humab（C）および非標的ADC（D）は、抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力が、MMAEの細胞傷害活性および標的結合に依存していたことが示される。エラーバーは標準誤差を表す。 マウス-ヒトAXLキメラに対する抗AXL抗体の結合を、実施例11に記載されているように行った。以下のホモ・サピエンスAXL（hsAXL）およびハツカネズミAXL（mmAXL）キメラタンパク質を試験した：（A）hsAXLおよびモック、（B）hsAXL-mmECD、（C）hsAXL-mmIg1、（D）hsAXL-mmIg2、（E）hsAXL-mmFN1、（F）hsAXL-mmFN2。 AXLのIg1ドメインに結合する抗体とプレインキュベートしていたA431細胞に対するヒトGas6（hGas6）の結合。示したデータは、1つの代表的な実験の平均蛍光強度（MFI）である。 実施例13に記載されているような、高レベルの内在性Gas6を産生する治療的A431異種移植モデルにおける、MMAEコンジュゲートAXL抗体の抗腫瘍活性。パネルAおよびBは、2つの独立した実験からの結果を示す。 実施例13に記載されているような、低レベルの内在性Gas6を発現する治療的LCLC-103H異種移植モデルにおける、MMAEコンジュゲートAXL抗体の抗腫瘍活性。パネルAおよびBは、2つの独立した実験からの結果を示す。 A431細胞（A）およびMDA-MB231細胞（B）におけるAXL-ADCによる細胞傷害の誘導を、実施例8に記載されているように判定した。 甲状腺癌、食道癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、および子宮内膜癌におけるAXL染色。AXL陽性細胞の平均AXL染色強度（OD）をX軸上にプロットし、AXL陽性腫瘍細胞のパーセンテージをY軸上にプロットしている。各ドットは、個々の患者に由来する腫瘍コアを表す。 様々な腫瘍徴候についてAXL免疫染色した腫瘍コアの代表的な例。 AXL抗体はAXLに特異的に結合するが、他のTAM受容体ファミリーメンバーには結合しない。ヒトAXL（A）、ヒトMER（B）、ヒトTYRO3（C）をトランスフェクトしたHEK293細胞、またはトランスフェクトしていないHEK293細胞（D）に対するHuMab-AXL抗体の結合。示したデータは、実施例15に記載されているような1つの代表的な実験の平均蛍光強度（MFI）である。 AXL抗体はAXLに特異的に結合するが、他のTAM受容体ファミリーメンバーには結合しない。トランスフェクトした細胞の妥当な発現を確認するために、トランスフェクトしていないHEK293F細胞、およびAXL（E）、MER（F）、またはTYRO3（G）をトランスフェクトした細胞を、MER特異的抗体およびTYRO3特異的抗体で染色した。示したデータは、実施例15に記載されているような1つの代表的な実験の平均蛍光強度（MFI）である。 AXL抗体と1時間4℃でインキュベートし、その後、4℃または37℃での一晩インキュベーションを行った腫瘍細胞株の形質膜上のAXL抗体の検出。MDA-MB-231細胞（AおよびB）ならびにCalu-1細胞（CおよびD）の両方において、37℃でインキュベートしていた細胞上よりも、4℃でインキュベートしていた細胞の形質膜上により多くの抗体が検出され、37℃での膜結合抗体の内部移行が示された。 AXL抗体と1時間4℃でインキュベートし、その後、4℃または37℃での一晩インキュベーションを行った腫瘍細胞株の形質膜上のAXL抗体の検出。MDA-MB-231細胞（AおよびB）ならびにCalu-1細胞（CおよびD）の両方において、37℃でインキュベートしていた細胞上よりも、4℃でインキュベートしていた細胞の形質膜上により多くの抗体が検出され、37℃での膜結合抗体の内部移行が示された。 AXL抗体と1時間4℃でインキュベートし、その後、4℃または37℃での一晩インキュベーションを行った腫瘍細胞株の形質膜上のAXL抗体の検出。MDA-MB-231細胞（AおよびB）ならびにCalu-1細胞（CおよびD）の両方において、37℃でインキュベートしていた細胞上よりも、4℃でインキュベートしていた細胞の形質膜上により多くの抗体が検出され、37℃での膜結合抗体の内部移行が示された。 AXL抗体と1時間4℃でインキュベートし、その後、4℃または37℃での一晩インキュベーションを行った腫瘍細胞株の形質膜上のAXL抗体の検出。MDA-MB-231細胞（AおよびB）ならびにCalu-1細胞（CおよびD）の両方において、37℃でインキュベートしていた細胞上よりも、4℃でインキュベートしていた細胞の形質膜上により多くの抗体が検出され、37℃での膜結合抗体の内部移行が示された。 Fab-TAMRA/QSY7と複合体形成させたAXL抗体とのインキュベーション後の、LCLC-103H細胞の幾何平均蛍光強度。IgG1-b12およびFab-TAMRA/QSY7単独を、陰性対照として含めた。 （A）食道癌PDXモデルES0195における、IgG1-AXL-107-vcMMAEでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAEを、それぞれ、アイソタイプ対照抗体およびアイソタイプ対照ADCとして含めた。（B）雌SCIDマウスの乳房脂肪体におけるMDA-MB-231-luc D3H2LN腫瘍細胞の注射後32日目の、個々のマウス中の腫瘍サイズ。* p＜0.05；** p＜0.0001。 患者由来の子宮頸癌異種移植モデルにおけるAXL-ADCの治療効果。（A）子宮頸癌PDXモデルCEXF 773における、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAEを、それぞれ、アイソタイプ対照抗体およびアイソタイプ対照ADCとして含めた。（B）子宮頸癌PDXモデルCEXF 773における処置の開始後28日目の、個々のマウス中の腫瘍サイズ。* p＜0.001。 同所乳癌異種移植モデルにおけるAXL-ADCの治療活性。（A）同所MDA-MB-231-luc D3H2LN異種移植モデルにおける、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEでの治療的処置後の平均腫瘍サイズ。IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAEを、それぞれ、アイソタイプ対照抗体およびアイソタイプ対照ADCとして含めた。（B）雌SCIDマウスの乳房脂肪体におけるMDA-MB-231-luc D3H2LN腫瘍細胞の注射後32日目の、個々のマウス中の腫瘍サイズ。* p＜0.001。 形質膜上に様々なレベルのAXL発現を有するヒト腫瘍細胞株における、IgG1-AXL-107-vcMMAEの細胞傷害。ヒト腫瘍細胞株の形質膜におけるAXL発現を、Qifikit解析を用いて評価し、IgG1-AXL-107-vcMMAEの細胞傷害を、1μg/mLのIgG1-AXL-107-vcMMAEへの曝露後に細胞培養中に残った生腫瘍細胞のパーセンテージとして表した。
詳細な説明
抗体
1つの局面において、本発明は、AXLに結合し、AXL結合についてリガンドである増殖停止特異的6（Gas6）と競合しない抗体に関する。
本明細書において使用される「抗体」という用語は、典型的な生理学的および／または腫瘍特異的条件下で、少なくとも約30分、少なくとも約45分、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約8時間、少なくとも約12時間、約24時間もしくはそれより長い時間、約48時間もしくはそれより長い時間、約3、4、5、6、7日もしくはそれより長い日数などのような有意な期間の半減期、または任意の他の関連する機能的に定義される期間（抗原に対する抗体結合と関連する生理学的応答を誘導、促進、増強、および／もしくは調節するのに十分な時間、ならびに／または抗体が内部移行するのに十分な時間）を伴い、抗原に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそのいずれかの誘導体を指すように意図される。抗原と相互作用する結合領域（または本明細書において使用され得る結合ドメイン、両方は同じ意味を有する）は、免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の両方の可変領域を含む。抗体（Ab）の定常領域は、免疫系の種々の細胞（エフェクター細胞など）、および、補体活性化の古典経路における第1の構成要素であるC1qなどの補体系の構成要素を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。上記で示されるように、本明細書において使用される抗体という用語は、別の方法で述べられるか、または文脈によって明確に否定されない限り、抗原に対して特異的に相互作用する、例えば結合する能力を保持する抗体の断片を含む。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。「抗体」という用語内に包含される結合断片の例は、（i）VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価断片、または[15]に記載されている一価抗体である、Fab'またはFab断片；（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結されている2つのFab断片を含む二価断片である、F(ab')2断片；（iii）VHおよびCH1ドメインから本質的になるFd断片；（iv）抗体の単一アームのVLおよびVHドメインから本質的になるFv断片；（v）VHドメインから本質的になり、ドメイン抗体 [17]とも呼ばれる、dAb断片 [16]；（vi）ラクダ科動物またはナノボディ [18]、ならびに（vii）単離された相補性決定領域（CDR）を含む。さらに、Fv断片の2つのドメインであるVLおよびVHは、別々の遺伝子によりコードされているが、組み換え法を用いて、VLおよびVH領域が対形成して一価分子を形成している単一のタンパク質鎖（一本鎖抗体または一本鎖Fv（scFv）として公知である、例として[19]および[20]を参照されたい）として作製されることを可能にする合成リンカーにより接続されていてもよい。そのような一本鎖抗体は、別の方法で言及されるか、または文脈によって明確に示されない限り、抗体という用語内に包含される。そのような断片は、概して、抗体の意味の内に含まれるが、それらは、集合的におよび各々独立的に、本発明の独特の特徴であり、異なる生物学的特性および有用性を呈する。本発明の文脈におけるこれらのおよび他の有用な抗体断片は、本明細書においてさらに議論される。抗体という用語は、別の方法で特定されない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）、抗体様ポリペプチド、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体、ならびに、酵素的切断、ペプチド合成、および組み換え技術などの任意の公知の技術によって提供され、かつ毒素にコンジュゲートされる能力を保持する、抗原に特異的に結合する能力を保持する「抗体断片」または「その断片」（抗原結合断片）も含むこともまた、理解されるべきである。生成される抗体は、任意のアイソタイプを所有することができる。
本明細書において使用される「免疫グロブリン重鎖」または「免疫グロブリンの重鎖」という用語は、免疫グロブリンの重鎖のうちの1つを指すように意図される。重鎖は、典型的に、重鎖可変領域（本明細書においてVHと省略される）、および免疫グロブリンのアイソタイプを定義する重鎖定常領域（本明細書においてCHと省略される）から構成される。重鎖定常領域は、典型的に、CH1、CH2、およびCH3の3つのドメインから構成される。本明細書において使用される「免疫グロブリン」という用語は、1対の低分子量の軽（L）鎖および1対の重（H）鎖の、2対のポリペプチド鎖からなり、すべての4つがジスルフィド結合によって潜在的に相互接続されている、構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指すように意図される。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴決定されている（例として、[21]を参照されたい）。免疫グロブリンの構造内で、2つの重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」においてジスルフィド結合を介して相互接続されている。重鎖と同等に、各軽鎖は、典型的に、いくつかの領域；軽鎖可変領域（本明細書においてVLと省略される）、および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、典型的に、1つのドメインCLから構成される。さらに、VHおよびVL領域は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる、より保存されている領域で分散される、相補性決定領域（CDR）とも呼ばれる、超可変性の領域（または、構造的に定義されたループの配列および／もしくは形態において超可変的であり得る超可変領域）にさらに細分され得る。各VHおよびVLは、典型的に、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される、3つのCDRおよび4つのFRから構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR配列は、IMGTにしたがって定義される（[22]および[23]を参照されたい）。
本明細書において使用される「抗原結合領域」または「結合領域」という用語は、抗原に結合することができる抗体の領域を指す。抗原は、例えば、細胞、細菌、またはビリオン上に存在する、ポリペプチドなどの任意の分子であることができる。「抗原」および「標的」という用語は、文脈によって明確に否定されない限り、本発明の文脈において互換的に使用され得る。
本明細書において使用される「結合」という用語は、例として、BIAcore 3000機器において抗原をリガンドとして、およびタンパク質を分析物として用いた表面プラズモン共鳴（SPR）により決定した場合に、典型的に、約10-6 M未満、例えば10-7 M未満、例えば約10-8 M未満、例えば約10-9 M未満、約10-10 M未満、または約10-11 Mもしくはさらにそれより低いKDに対応する結合親和性での、あらかじめ決定された抗原または標的に対する抗体の結合を指し、あらかじめ決定された抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）に対する結合のその親和性よりも少なくとも10倍低い、例えば少なくとも100倍低い、例として少なくとも1,000倍低い、例えば少なくとも10,000倍低い、例として少なくとも100,000倍低いKDに対応する親和性で、あらかじめ決定された抗原に結合する。親和性がより低い量は、タンパク質のKDに依存するため、タンパク質のKDが非常に低い（すなわち、タンパク質が高度に特異的である）場合、抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性より低い量は、少なくとも10,000倍であり得る。本明細書において使用される「KD」（M）という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指し、kdをkaで割ることによって得られる。
本明細書において使用される「kd」（秒-1）という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、kオフ値またはオフ速度とも呼ばれる。
本明細書において使用される「ka」（M-1×秒-1）という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度定数を指す。前記値は、kオン値またはオン速度とも呼ばれる。
本明細書において使用される「KA」（M-1）という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合平衡定数を指し、kaをkdで割ることによって得られる。
本明細書において使用される「AXL」という用語は、哺乳動物TAM受容体チロシンキナーゼ（RTK）のサブファミリーの一部である104〜140 kDaの分子量を有する894アミノ酸タンパク質であり、UFOまたはJTK11とも呼ばれる、AXLという名称のタンパク質を指す。分子量は、タンパク質のグリコシル化における可能性のある差のために可変である。AXLタンパク質は、タンパク質のN末端上の2つの細胞外免疫グロブリン様（Ig様）ドメイン、2つの膜近位の細胞外フィブロネクチンIII型（FNIII）ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内キナーゼドメインからなる。AXLは、そのリガンドGas6の結合時に、AXL細胞外ドメイン間のリガンド非依存性同種親和性相互作用により、活性酸素種の存在下での自己リン酸化により[24]、またはEGFRを通したトランス活性化により（Meyer, 2013）活性化され、いくつかの腫瘍タイプにおいて異常に発現している。ヒトにおいて、AXLタンパク質は、SEQ ID N0:130に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされている（ヒトAXLタンパク質：Swissprot P30530；カニクイザルAXLタンパク質：GenbankアクセッションHB387229.1）。
本明細書において使用される「リガンド非依存性同種親和性相互作用」という用語は、リガンドの非存在下で起こる（近隣細胞上に発現した）2つのAXL分子間の会合を指す。
本明細書において使用される「AXLに結合する抗体」という用語は、AXLの細胞外部分上のエピトープに結合する任意の抗体を指す。
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸、糖側鎖、またはそれらの組み合わせなどの分子の表面グルーピングからなり、通常、特異的な3次元構造特性、および特異的な電荷特性を有する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合が失われるが、後者に対する結合は失われないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与しているアミノ酸残基、および、特異的な抗原結合ペプチドによって有効に遮断されるかまたは覆われるアミノ酸残基（換言すると、アミノ酸残基が特異的な抗原結合ペプチドの占有面積内である）などの、結合に直接関与していない他のアミノ酸残基を含み得る。
本明細書において使用される「リガンド」という用語は、受容体などの別のタンパク質に特異的にかつ可逆的に結合して、より大きな複合体を形成する、ホルモン、ペプチド、イオン、薬物、またはタンパク質などの物質を指す。受容体に対するリガンド結合は、その化学的コンフォメーションを変更し得、その機能状態を決定する。例として、リガンドは、アゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得る。
本明細書において使用される「増殖停止特異的6」または「Gas6」という用語は、AXLを含むTAMファミリーの受容体に対するリガンドとして機能する、75〜80 kDaの分子量を有する721アミノ酸タンパク質を指す。Gas6は、負に荷電したリン脂質膜との特異的相互作用を担う、複数のγ-カルボキシグルタミン酸残基（Gla）を含有するN末端領域から構成される。Glaドメインは、Gas6のAXLに対する結合には必要ではないが、AXLの活性化に必要とされる。Gas6はまた、「AXLに対するリガンド」とも呼ばれ得る。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」、「モノクローナルAb」、「モノクローナル抗体組成物」、「mAb」などの用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を提示する。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を提示する抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させた、トランスジェニック非ヒト動物または染色体導入（transchromosomal）非ヒト動物、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスから取得されたB細胞を含むハイブリドーマによって、産生され得る。
1つの態様において、Gas6の存在下での最大の抗体結合は、実施例2に開示されている方法によって判定される際に、Gas6の非存在下での結合の少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％、例えば100％である。
AXLに対する抗AXLとリガンドGas6との間の競合は、「Gas6結合での抗AXL結合の干渉」という見出しの下、実施例2に記載されているように判定され得る。したがって、1つの態様において、抗体は、AXL結合についてリガンドGas6と競合せず、結合についての競合は、以下の工程を含むアッセイにおいて判定される：
i）AXL発現細胞をGas6とインキュベートする工程、
ii）試験されるべき抗AXL抗体を添加する工程、
iii）抗AXL抗体を検出する蛍光標識された二次試薬を添加する工程、および
iv）FACSにより細胞を解析する工程。
別の態様において、抗体は、結合についてリガンドGas6と競合せず、結合についての競合は、以下の工程を含むアッセイにおいて判定される：
i）AXL発現細胞を抗AXL抗体とインキュベートする工程、
ii）Gas6を添加する工程、
iii）Gas6を検出する蛍光標識された二次試薬を添加する工程、および
iv）FACSにより細胞を解析する工程。
1つの態様において、抗体は、AXLに対して0.3×10-9〜63×10-9 Mの範囲の結合親和性（KD）を有し、該結合親和性は、可溶性AXL細胞外ドメインを用いたバイオレイヤー干渉法を用いて測定される。
結合親和性は、実施例2に記載されているように判定され得る。したがって、1つの態様において、抗体は、抗原に対して0.3×10-9〜63×10-9 Mの結合親和性を有し、結合親和性は、以下の工程を含む方法によって判定される：
i）抗ヒトFc Captureバイオセンサーに抗AXL抗体を負荷する工程、および
ii）様々な濃度でバイオレイヤー干渉法により可溶性組み換えAXL細胞外ドメインの会合および解離を判定する工程。
本明細書において使用される「可溶性組み換えAXL細胞外ドメイン」という用語は、組み換えで発現されているAXL細胞外ドメインを指す。組み換えAXL細胞外ドメインは、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが存在しないために、例えば細胞表面に付着せず、溶液中にとどまる。タンパク質を組み換えで発現する方法は周知であり、例えば[25]を参照されたく、したがって、そのような組み換えAXL細胞外ドメインを提供することは、当業者の知識内である。
1つの態様において、抗体は、AXLに対して6.9×10-5 s-1〜9.7×10-3 s-1の解離速度を有し、解離速度は、可溶性組み換えAXL細胞外ドメインを用いたバイオレイヤー干渉法によって測定される。
結合親和性は、上記（および実施例2）に記載されているように判定され得る。したがって、1つの態様において、抗体は、AXLに対して6.9×10-5 s-1〜9.7×10-3 s-1の解離速度を有し、解離速度は、以下の工程を含む方法によって測定される：
i）抗ヒトFc Captureバイオセンサーに抗AXL抗体を負荷する工程、および
ii）様々な濃度でバイオレイヤー干渉法により組み換えAXL細胞外ドメインの会合および解離を判定する工程。
本明細書において使用される「解離速度」という用語は、その抗原に結合した抗原特異的抗体が、その抗原から解離する速度を指し、s-1として表現される。したがって、AXLに結合する抗体の文脈において、「解離速度」という用語は、AXLに結合する抗体がAXLの組み換え細胞外ドメインから解離する速度を指し、s-1として表現される。
1つの態様において、AXLはヒトAXLである。AXLのアミノ酸配列は、Swissprot P30530にしたがう。
1つの態様において、AXLはカニクイザルAXL（GenbankアクセッションHB387229.1）である。
1つの態様において、抗体は、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも95％、例えば少なくとも96％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％の配列同一性を有する、可変重鎖（VH）CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む、少なくとも1つの結合領域を含む：
a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38 [107]；
b）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95 [613]；
c）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]；
d）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48 [148]；
e）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59 [171]；
f）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80 [187]；
g）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120 [148 / 140]；
h）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53 [154]；
i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75 [183]；
j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75 [183-N52Q]；
k）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116 [733]；
l）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125 [171 / 172 / 181]；
m）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110 [726]；
n）それぞれ、SEQ ID NO:108、121、および122 [726 / 187]；
o）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43 [140]；
p）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64 [172]；
q）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69 [181]；
r）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54 [154-M103L]；
s）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80 [187]；
t）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85 [608-01]；
u）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90 [610-01]；
v）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100 [613-08]；
w）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105 [620-06]；ならびに
x）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111 [726-M101L]。
1つの態様において、抗体は、以下からなる群より選択される可変重鎖におけるCDR配列にわたって、合計で、最大でも5個の変異または置換、例えば最大でも4個の変異または置換、例えば最大でも3個の変異または置換、例えば最大でも2個の変異または置換、例えば最大でも1個の変異または置換を有する可変重鎖（VH）CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む、少なくとも1つの結合領域を含む：
a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38 [107]；
b）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95 [613]；
c）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]；
d）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48 [148]；
e）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59 [171]；
f）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80 [187]；
g）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120 [148 / 140]；
h）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53 [154]；
i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75 [183]；
j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75 [183-N52Q]；
k）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116 [733]；
l）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125 [171 / 172 / 181]；
m）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110 [726]；
n）それぞれ、SEQ ID NO:108、121、および122 [726 / 187]；
o）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43 [140]；
p）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64 [172]；
q）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69 [181]；
r）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54 [154-M103L]；
s）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80 [187]；
t）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85 [608-01]；
u）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90 [610-01]；
v）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100 [613-08]；
w）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105 [620-06]；ならびに
x）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111 [726-M101L]。
これにより、5個までの変異または置換の変異または置換が、可変重鎖における3つのCDR配列にわたって許容される態様が提供される。変異または置換が、30％より多く、例えば20％より多く、または例えば10％より多く、エピトープを変化させないか、または好ましくはエピトープに対する結合親和性を改変しないように、変異または置換は、保存的な物理的または機能的アミノ酸のものであり得る。保存的な物理的または機能的アミノ酸は、20種の天然アミノ酸、すなわち、Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、およびValから選択される。
1つの態様において、抗体は、以下からなる群より選択される可変重鎖（VH）CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む、少なくとも1つの結合領域を含む；
a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38 [107]；
b）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95 [613]；
c）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]；
d）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48 [148]；
e）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59 [171]；
f）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80 [187]；
g）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120 [148 / 140]；
h）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53 [154]；
i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75 [183]；
j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75 [183-N52Q]；
k）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116 [733]；
l）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125 [171 / 172 / 181]；
m）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110 [726]；
n）それぞれ、SEQ ID NO:108、121、および122 [726 / 187]；
o）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43 [140]；
p）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64 [172]；
q）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69 [181]；
r）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54 [154-M103L]；
s）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80 [187]；
t）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85 [608-01]；
u）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90 [610-01]；
v）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100 [613-08]；
w）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105 [620-06]；ならびに
x）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111 [726-M101L]。
1つの特定の態様において、VH CDR1、CDR2、およびCDR3は、a）、d）、g）、またはk）のいずれかから選択される。
1つの態様において、少なくとも1つの結合領域は、以下からなる群より独立して選択される配列と少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％、例えば少なくとも100％の配列同一性を有するVH領域および可変軽鎖（VL）領域を含む；
a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [107]；
b）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148]；
c）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [733]；
d）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154]；
e）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154-M103L]；
f）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171]；
g）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [172]；
h）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [181]；
i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183]；
j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183-N52Q]；
k）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [187]；
l）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [608-01]；
m）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [610-01]；
n）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613]；
o）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:10、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613-08]；
p）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [620-06]；
q）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726]；
r）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726-M101L]；
s）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [140]；
t）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID NO:129のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 613-08]；
u）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148 / 140]；
v）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171 / 172 / 181]；ならびに
w）それぞれ、SEQ ID NO:121、109、および122のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726 / 187]；ならびに
x）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]。
1つの態様において、少なくとも1つの結合領域は、以下からなる群より選択される可変重鎖および可変軽鎖におけるCDR配列にわたって、合計で、保存的な物理的または機能的アミノ酸から選択される最大でも5個の変異または置換、例えば保存的な物理的または機能的アミノ酸から選択される最大でも4個の変異または置換、例えば保存的な物理的または機能的アミノ酸から選択される最大でも3個の変異または置換、例えば保存的な物理的または機能的アミノ酸から選択される最大でも2個の変異または置換、例えば保存的な物理的または機能的アミノ酸から選択される最大でも1個の変異または置換を有する、VH領域および可変軽鎖（VL）領域を含む；
a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [107]；
b）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148]；
c）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [733]；
d）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154]；
e）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154-M103L]；
f）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171]；
g）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [172]；
h）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [181]；
i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183]；
j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183-N52Q]；
k）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [187]；
l）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [608-01]；
m）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [610-01]；
n）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613]；
o）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:10、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613-08]；
p）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [620-06]；
q）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726]；
r）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726-M101L]；
s）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [140]；
t）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID NO:129のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 613-08]；
u）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148 / 140]；
v）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171 / 172 / 181]；ならびに
w）それぞれ、SEQ ID NO:121、109、および122のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726 / 187]；ならびに
x）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]。
これにより、5個までの変異または置換の変異または置換が、可変重鎖および可変軽鎖における3つのCDR配列にわたって許容される態様が提供される。5個までの変異または置換は、可変重鎖の3つのCDR配列および可変軽鎖の3つのCDR配列にわたって分布され得る。5個までの変異または置換は、結合領域の6つのCDR配列にわたって分布され得る。変異または置換が、30％より多く、例えば20％より多く、または例えば10％より多く、エピトープを変化させないか、または好ましくはエピトープに対する結合親和性を改変しないように、変異または置換は、保存的な物理的または機能的アミノ酸のものであり得る。保存的な物理的または機能的アミノ酸は、見出される20種の天然アミノ酸、すなわち、Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、およびValから選択される。
特定の態様において、少なくとも1つの結合領域は、以下からなる群より選択されるVH領域および可変軽鎖（VL）領域を含む；
a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [107]；
b）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148]；
c）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [733]；
d）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154]；
e）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154-M103L]；
f）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171]；
g）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [172]；
h）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [181]；
i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183]；
j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183-N52Q]；
k）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [187]；
l）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [608-01]；
m）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [610-01]；
n）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613]；
o）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:10、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613-08]；
p）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [620-06]；
q）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726]；
r）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726-M101L]；
s）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [140]；
t）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID NO:129のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 613-08]；
u）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148 / 140]；
v）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171 / 172 / 181]；ならびに
w）それぞれ、SEQ ID NO:121、109、および122のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726 / 187]；ならびに
x）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]。
1つの態様において、少なくとも1つの結合領域は、以下からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む；
a）SEQ ID NO:1を含むVH領域、およびSEQ ID NO:2を含むVL領域 [107]；
b）SEQ ID NO:5を含むVH領域、およびSEQ ID NO:6を含むVL領域 [148]；
c）SEQ ID NO:34を含むVH領域、およびSEQ ID NO:35を含むVL領域 [733]；
d）SEQ ID NO:7を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154];
e）SEQ ID NO:10を含むVH領域、およびSEQ ID NO:11を含むVL領域 [171]；
f）SEQ ID NO:16を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183]；
g）SEQ ID NO:25を含むVH領域、およびSEQ ID NO:26を含むVL領域 [613]；
h）SEQ ID NO:31を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726]；
i）SEQ ID NO:3を含むVH領域、およびSEQ ID NO:4を含むVL領域 [140]；
j）SEQ ID NO:8を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154-M103L]；
k）SEQ ID NO:12を含むVH領域、およびSEQ ID NO:13を含むVL領域 [172]；
l）SEQ ID NO:14を含むVH領域、およびSEQ ID NO:15を含むVL領域 [181]；
m）SEQ ID NO:17を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183-N52Q]；
n）SEQ ID NO:19を含むVH領域、およびSEQ ID NO:20を含むVL領域 [187]；
o）SEQ ID NO:21を含むVH領域、およびSEQ ID NO:22を含むVL領域 [608-01]；
p）SEQ ID NO:23を含むVH領域、およびSEQ ID NO:24を含むVL領域 [610-01]；
q）SEQ ID NO:27を含むVH領域、およびSEQ ID NO:28を含むVL領域 [613-08]；
r）SEQ ID NO:29を含むVH領域、およびSEQ ID NO:30を含むVL領域 [620-06]；ならびに
s）SEQ ID NO:32を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726-M101L]。
1つの態様において、少なくとも1つの結合領域は、以下からなる群より選択される可変重鎖および可変軽鎖配列にわたって、最大でも10個の変異または置換、最大でも5個の変異または置換、例えば最大でも4個の変異または置換、例えば最大でも3個の変異または置換、例えば最大でも2個の変異または置換、例えば最大でも1個の変異または置換を有する、可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域を含む。
1つの態様において、少なくとも1つの結合領域は、以下からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む；
a）SEQ ID NO:1を含むVH領域、およびSEQ ID NO:2を含むVL領域 [107]；
b）SEQ ID NO:5を含むVH領域、およびSEQ ID NO:6を含むVL領域 [148]；
c）SEQ ID NO:34を含むVH領域、およびSEQ ID NO:35を含むVL領域 [733]；
d）SEQ ID NO:7を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154];
e）SEQ ID NO:10を含むVH領域、およびSEQ ID NO:11を含むVL領域 [171]；
f）SEQ ID NO:16を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183]；
g）SEQ ID NO:25を含むVH領域、およびSEQ ID NO:26を含むVL領域 [613]；
h）SEQ ID NO:31を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726]；
i）SEQ ID NO:3を含むVH領域、およびSEQ ID NO:4を含むVL領域 [140]；
j）SEQ ID NO:8を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154-M103L]；
k）SEQ ID NO:12を含むVH領域、およびSEQ ID NO:13を含むVL領域 [172]；
l）SEQ ID NO:14を含むVH領域、およびSEQ ID NO:15を含むVL領域 [181]；
m）SEQ ID NO:17を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183-N52Q]；
n）SEQ ID NO:19を含むVH領域、およびSEQ ID NO:20を含むVL領域 [187]；
o）SEQ ID NO:21を含むVH領域、およびSEQ ID NO:22を含むVL領域 [608-01]；
p）SEQ ID NO:23を含むVH領域、およびSEQ ID NO:24を含むVL領域 [610-01]；
q）SEQ ID NO:27を含むVH領域、およびSEQ ID NO:28を含むVL領域 [613-08]；
r）SEQ ID NO:29を含むVH領域、およびSEQ ID NO:30を含むVL領域 [620-06]；ならびに
s）SEQ ID NO:32を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726-M101L]。
これにより、10個までの変異または置換の変異または置換が、可変重鎖および可変軽鎖にわたって許容される態様が提供される。10個までの変異または置換は、各結合領域の可変重鎖および可変軽鎖の完全長にわたって分布され得る。変異または置換が、30％より多く、例えば20％より多く、または例えば10％より多く、エピトープを変化させず、および好ましくはエピトープに対する結合親和性を改変しないように、変異または置換は、保存的な物理的または機能的アミノ酸のものであり得る。保存的な物理的または機能的アミノ酸は、見出される20種の天然アミノ酸、すなわち、Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、およびValから選択される。
1つの態様において、少なくとも1つの結合領域は、以下からなる群より選択される可変重鎖および可変軽鎖配列にわたって、保存的な物理的または機能的アミノ酸から選択される最大でも10個の変異または置換、保存的な物理的または機能的アミノ酸から選択される最大でも5個の変異または置換、例えば保存的な物理的または機能的アミノ酸から選択される最大でも4個の変異または置換、例えば保存的な物理的または機能的アミノ酸から選択される最大でも3個の変異または置換、例えば保存的な物理的または機能的アミノ酸から選択される最大でも2個の変異または置換、例えば保存的な物理的または機能的アミノ酸から選択される最大でも1個の変異または置換を有する、可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域を含む。
1つの態様において、少なくとも1つの結合領域は、以下からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む；
a）SEQ ID NO:1を含むVH領域、およびSEQ ID NO:2を含むVL領域 [107]；
b）SEQ ID NO:5を含むVH領域、およびSEQ ID NO:6を含むVL領域 [148]；
c）SEQ ID NO:34を含むVH領域、およびSEQ ID NO:35を含むVL領域 [733]；
d）SEQ ID NO:7を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154];
e）SEQ ID NO:10を含むVH領域、およびSEQ ID NO:11を含むVL領域 [171]；
f）SEQ ID NO:16を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183]；
g）SEQ ID NO:25を含むVH領域、およびSEQ ID NO:26を含むVL領域 [613]；
h）SEQ ID NO:31を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726]；
i）SEQ ID NO:3を含むVH領域、およびSEQ ID NO:4を含むVL領域 [140]；
j）SEQ ID NO:8を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154-M103L]；
k）SEQ ID NO:12を含むVH領域、およびSEQ ID NO:13を含むVL領域 [172]；
l）SEQ ID NO:14を含むVH領域、およびSEQ ID NO:15を含むVL領域 [181]；
m）SEQ ID NO:17を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183-N52Q]；
n）SEQ ID NO:19を含むVH領域、およびSEQ ID NO:20を含むVL領域 [187]；
o）SEQ ID NO:21を含むVH領域、およびSEQ ID NO:22を含むVL領域 [608-01]；
p）SEQ ID NO:23を含むVH領域、およびSEQ ID NO:24を含むVL領域 [610-01]；
q）SEQ ID NO:27を含むVH領域、およびSEQ ID NO:28を含むVL領域 [613-08]；
r）SEQ ID NO:29を含むVH領域、およびSEQ ID NO:30を含むVL領域 [620-06]；ならびに
s）SEQ ID NO:32を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726-M101L]。
これにより、10個までの変異または置換の変異または置換が、可変重鎖および可変軽鎖にわたって許容される態様が提供される。10個までの変異または置換は、可変重鎖および可変軽鎖にわたって分布され得る。10個までの変異または置換は、結合領域にわたって分布され得る。変異または置換が、エピトープを変化させないか、またはエピトープに対する結合を改変しないように、変異または置換は、保存的な物理的または機能的アミノ酸のものであり得る。
1つの局面において、本発明は、AXLに対するGas6結合と競合または干渉することなく、AXLの細胞外ドメインに結合する抗体に関する。特定の態様において、抗体は、AXLに対するGas6結合と競合または干渉することなく、細胞外ドメインのIg1様ドメインに結合する。1つの態様において、抗体は、細胞外ドメインIg1様に結合し、AXLに対する最大のGas6結合においてわずか20％の低減を示す。1つの態様において、抗体は、AXLに対する最大のGas6結合においてわずか15％の低減を示す。1つの態様において、抗体は、AXLに対する最大のGas6結合においてわずか10％の低減を示す。1つの態様において、抗体は、AXLに対する最大のGas6結合においてわずか5％の低減を示す。1つの態様において、抗体は、AXLに対する最大のGas6結合においてわずか4％の低減を示す。1つの態様において、抗体は、AXLに対する最大のGas6結合においてわずか2％の低減を示す。1つの態様において、抗体は、最大のGas6結合においてわずか1％の低減を示す。1つの態様において、抗体は、AXLに対するGas6結合と競合または干渉することなく、細胞外ドメインのIg2様ドメインに結合する。1つの態様において、抗体は、細胞外ドメインIg2様に結合し、AXLに対する最大のGas6結合において、わずか20％、例えばわずか15％、例えばわずか10％、例えばわずか5％、例えばわずか4％、例えばわずか2％、例えばわずか1％の低減を示す。Gas6結合と競合または低減する態様の能力は、実施例2または実施例12に開示されているように判定され得る。1つの態様において、抗体は、AXLに対する最大のGas6結合と競合または干渉することなく、細胞外ドメインのIg2様ドメインに結合する。
1つの態様において、抗体は、AXL上のエピトープに結合し、該エピトープは、本明細書に記載される抗体によって認識される。
抗体が結合するエピトープを決定する方法は、当技術分野において周知であり、したがって、当業者は、そのようなエピトープを決定する方法を承知しているであろう。しかし、抗体が本明細書において定義されるいずれかのエピトープ内に結合するかどうかを判定する実施例は、AXL細胞外ドメインの点変異によると考えられる。AXL細胞外ドメインに点変異を導入すること、および点変異したAXL細胞外ドメインに対する抗体結合を試験することは、当業者の知識内である。エピトープの文脈においてAXLタンパク質内のアミノ酸の位置に言及する場合、ナンバリングは、実施例7に記載されるように決定されている。したがって、エピトープを定義するアミノ酸位置のナンバリングは、図6に提示される配列に基づいて行われ、すなわち、示される配列における1番目のアミノ酸を位置「1」とナンバリングし、2番目を位置「2」とする、などであった。
1つの態様において、抗体は、AXLのIg1様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープは、ヒトAXLの位置L121〜Q129またはT112〜Q124に対応するアミノ酸を含むかまたは必要とする。1つの態様において、抗体は、AXLのIg1様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープは、ヒトAXLの位置L121〜Q129またはT112〜Q124に対応する1つまたは複数のアミノ酸を含むかまたは必要とする。1つの態様において、エピトープは、位置L121、G122、H123、Q124、T125、F126、V127、S128、Q129の1つまたは複数のアミノ酸、または位置T112、G113、Q114、Y115、Q116、C117、L118、V119、F120、L121、G122、H123、Q124の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
別の態様において、抗体は、AXLのIg2様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープは、ヒトAXLの位置D170またはD179の組み合わせ、およびT182〜R190に対応するアミノ酸を含むかまたは必要とする。
1つの態様において、抗体は、AXLのIg2様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープは、ヒトAXLの位置D170またはD179の組み合わせに対応するアミノ酸、および位置T182〜R190に対応する1つまたは複数のアミノ酸を含むかまたは必要とする。1つの態様において、エピトープは、位置T182、A183、P183、G184、H185、G186、P187、Q189、R190の1つまたは複数のアミノ酸を含む。
別の態様において、抗体は、ヒトAXLのFN1様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープは、ヒトAXLの位置Q272〜A287およびG297〜P301に対応するアミノ酸を含むかまたは必要とする。
別の態様において、抗体は、ヒトAXLのFN2様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープは、ヒトAXLの位置A359、R386、およびQ436〜K439に対応するアミノ酸を含むかまたは必要とする。
1つの態様において、抗体は、ヒトAXLのFN1様ドメイン内のエピトープに結合する。
1つの態様において、抗体は、AXL上のエピトープに結合し、該エピトープは、以下により定義される抗体のいずれか1つによって認識される：
a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [107]；
b）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148]；
c）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [733]；
d）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154]；
e）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154-M103L]；
f）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171]；
g）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [172]；
h）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [181]；
i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183]；
j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183-N52Q]；
k）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [187]；
l）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [608-01]；
m）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [610-01]；
n）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613]；
o）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:10、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613-08]；
p）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [620-06]；
q）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726]；
r）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726-M101L]；
s）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [140]；
t）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID NO:129のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 613-08]；
u）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148 / 140]；
v）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171 / 172 / 181]；ならびに
w）それぞれ、SEQ ID NO:121、109、および122のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726 / 187]；ならびに
x）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]。
1つの態様において、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプの重鎖を含む。
本明細書において使用される「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる、免疫グロブリンクラス（例として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、もしくはIgM、または任意のそのアロタイプ、例えば、IgG1m(za)およびIgG1m(f)）を指す。さらに、各重鎖アイソタイプは、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかと組み合わせることができる。
1つの態様において、アイソタイプはIgG1、任意でアロタイプIgG1m(f)である。
1つの態様において、抗体は、完全長モノクローナル抗体、任意で完全長モノクローナルIgG1,κ抗体である。
本明細書において使用される場合の「完全長抗体」という用語は、そのアイソタイプの野生型抗体において普通に見出されるものに対応するすべての重鎖および軽鎖の定量ドメインおよび可変ドメインを含有する抗体（例えば、親抗体またはバリアント抗体）を指す。本発明による完全長抗体は、（i）CDR配列を、完全な重鎖配列および完全な軽鎖配列を含む適しているベクター中にクローニングする工程、および（ii）適している発現系において完全な重鎖および軽鎖配列を発現する工程を含む方法によって産生され得る。CDR配列または完全な可変領域配列のいずれかから出発する場合に、完全長抗体を産生することは、当業者の知識内である。したがって、当業者は、本発明による完全長抗体を生成する方法を承知しているであろう。
1つの態様において、抗体はヒト抗体である。
本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域およびフレームワーク領域、ならびにヒト免疫グロブリン定常ドメインを有する抗体を含むように意図される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダムもしくは部位特異的な変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異、挿入、または欠失）を含み得る。しかし、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の非ヒト種の生殖細胞系列に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むようには意図されない。
本明細書において使用される際、抗体が、例として、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫化することによって、またはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって、ヒト免疫グロブリン配列を用いた系から取得され、選択されたヒト抗体が、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例として少なくとも96％、例えば少なくとも97％、例として少なくとも98％、または例えば少なくとも99％、アミノ酸配列が同一である場合に、ヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列「に由来する」。典型的に、特定のヒト生殖細胞系列配列に由来するヒト抗体は、重鎖CDR3の外側で、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、わずか20個のアミノ酸の差、例えば、わずか10個のアミノ酸の差、例えばわずか9，8、7、6、または5個、例としてわずか4、3、2、または1個のアミノ酸の差を提示することになる。
本発明による抗体は、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖においてアミノ酸改変を含み得る。特定の態様において、抗体のFc領域中のアミノ酸が改変され得る。
本明細書において使用される「Fc領域」という用語は、抗体のN末端からC末端への方向で、少なくともヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域を含む領域を指す。抗体のFc領域は、免疫系の種々の細胞（エフェクター細胞など）および補体系の構成要素を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
本明細書において使用される「ヒンジ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域を指す。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のヒンジ領域は、Kabat [26]に示されているようなEuナンバリングによるアミノ酸216〜230に対応する。しかし、ヒンジ領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであってもよい。
本明細書において使用される「CH1領域」または「CH1ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のCH1領域を指す。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH1領域は、Kabat [26]に示されているようなEuナンバリングによるアミノ酸118〜215に対応する。しかし、CH1領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであってもよい。
本明細書において使用される「CH2領域」または「CH2ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のCH2領域を指す。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH2領域は、Kabat [26]に示されているようなEuナンバリングによるアミノ酸231〜340に対応する。しかし、CH2領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであってもよい。
本明細書において使用される「CH3領域」または「CH3ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のCH3領域を指す。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH3領域は、Kabat [26]に示されているようなEuナンバリングによるアミノ酸341〜447に対応する。しかし、CH3領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであってもよい。
別の態様において、抗体は、エフェクター機能欠損抗体、安定化IgG4抗体、または一価抗体である。
1つの特定の態様において、重鎖は、全ヒンジ領域が欠失しているように改変されている。
1つの態様において、抗体の配列は、N結合型グリコシル化のためのいかなるアクセプター部位も含まないように改変されている。
1つの態様において、抗体は一本鎖抗体である。
さらなる局面において、本発明は、少なくとも、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体の第1の結合領域、および第1の結合領域とは異なる標的またはエピトープに結合する第2の結合領域を含む、多重特異性抗体に関する。本明細書において使用される「多重特異性抗体」という用語は、結合領域が、少なくとも2つ、例えば少なくとも3つの異なる抗原、または、同じ抗原上の少なくとも2つ、例えば少なくとも3つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。
1つの態様において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体の第1の結合領域、および第1の結合領域とは異なる標的またはエピトープに結合する第2の結合領域を含む、二重特異性抗体に関する。
本明細書において使用される「二重特異性」という用語は、結合分子の結合領域が、2つの異なる抗原、または同じ抗原上の2つの異なるエピトープに結合する、抗体などの結合分子を指す。
「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも2つの異なる、典型的にはオーバーラップしないエピトープに対して特異性を有する抗体を指す。そのようなエピトープは、同じ標的または異なる標的上にあってもよい。エピトープが異なる標的上にある場合、そのような標的は、同じ細胞または異なる細胞、細胞タイプもしくは構造、例えば細胞外組織上にあってもよい。
本明細書において使用される「異なる標的」という用語は、AXLまたはAXL断片以外の別のタンパク質、分子などを指す。
本発明において使用され得る二重特異性抗体分子の例は、（i）異なる抗原結合領域を含む2つのアームを有する単一抗体；（ii）例えば、余分のペプチドリンカーにより直列に連結された2つのscFvを介して、2つの異なるエピトープに対して特異性を有する一本鎖抗体；（iii）各軽鎖および重鎖が、短いペプチド連結を通して直列に2つの可変ドメインを含有する、デュアル可変ドメイン抗体（DVD−Ig（商標））[29]；（iv）化学的に連結された二重特異性(Fab')2断片；（v）2つの一本鎖ダイアボディの融合物であり、標的抗原の各々に対して2つの結合部位を有する四価の二重特異性抗体を結果として生じるTandab（登録商標）；（vi）scFvとダイアボディとの組み合わせであり、多価の分子を結果として生じるフレキシボディ（flexibody）；（vii）タンパク質キナーゼAにおける「二量体化およびドッキングドメイン」に基づき、Fabに適用した場合には、異なるFab断片に連結された2つの同一のFab断片からなる三価の二重特異性結合タンパク質を生じることができる、いわゆる「ドックおよびロック」分子（Dock-and-Lock（登録商標））；（viii）例えば、ヒトFabアームの両方の末端に融合された2つのscFvを含む、いわゆるScorpion分子；ならびに（ix）ダイアボディを含む。
1つの態様において、本発明の二重特異性抗体は、ダイアボディ、CrossMabなどのクロスボディ、または、制御されたFabアーム交換を介して取得される二重特異性抗体（例えば[30]に記載されている）である。
二重特異性抗体の様々なクラスの例は、（i）ヘテロ二量体化を強いる相補的CH3ドメインを有するIgG様分子；（ii）分子の2つの側面が各々、少なくとも2つの異なる抗体のFab断片またはFab断片の一部を含有する、組み換えIgG様デュアル標的化分子；（iii）完全長IgG抗体が、余分のFab断片またはFab断片の一部に融合されている、IgG融合分子；（iv）一本鎖Fv分子または安定化ダイアボディが、重鎖定常ドメイン、Fc領域、またはその一部に融合されている、Fc融合分子；（v）様々なFab断片が、互いに融合され、重鎖定常ドメイン、Fc領域、またはその一部に融合されている、Fab融合分子；ならびに、（vi）様々な一本鎖Fv分子または様々なダイアボディまたは様々な重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、Nanobodies（登録商標））が、互いに融合されているか、または、重鎖定常ドメイン、Fc領域、またはその一部に融合されている別のタンパク質または担体分子に融合されている、ScFvベースおよびダイアボディベース、および重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、Nanobodies（登録商標））を含むが、これらに限定されない。
相補的CH3ドメインを有するIgG様分子の例は、Triomab（登録商標）（Trion Pharma/Fresenius Biotech, [31]）、Knobs-into-Holes（Genentech, [32]）、CrossMAb（Roche, [33]）、および静電気的にマッチしたもの（Amgen, [34]および[35]；Chugai, [36]；Oncomed, [37]）、LUZ-Y（Genentech）、DIG-bodyおよびPIG-body（Pharmabcine）、Strand Exchange Engineered Domain body（SEEDbody）（EMD Serono, [38] ）、Biclonics（Merus）、FcΔAdp（Regeneron, [39] ）、二重特異性IgG1およびIgG2（Pfizer/Rinat, [40] ）、Azymetric足場（Zymeworks/Merck, [41]）、mAb-Fv（Xencor, [42] ）、二価二重特異性抗体（Roche [43] ）、ならびにDuoBody（登録商標）分子（Genmab A/S, [30] ）を含むが、これらに限定されない。
組み換えIgG様デュアル標的化分子の例は、Dual Targeting（DT）-Ig（GSK/Domantis）、Two-in-one抗体（Genentech）、Cross-Linked Mab（Karmanos Cancer Center）、mAb2（F-Star, [44]）、Zybodies（商標）（Zyngenia）、共通軽鎖でのアプローチ（Crucell/Merus, [45]）、κλBodies（NovImmune）、およびCovX-body（CovX/Pfizer）を含むが、これらに限定されない。
IgG融合分子の例は、Dual Variable Domain（DVD）-Ig（商標）（Abbott, [46]）、デュアルドメインダブルヘッド抗体（Unilever; Sanofi Aventis, [47]）、IgG様二重特異性（ImClone/Eli Lilly）、Ts2Ab（MedImmune/AZ）およびBsAb（Zymogenetics）、HERCULES（Biogen Idec, [48]）、scFv融合物（Novartis）、scFv融合物（Changzhou Adam Biotech Inc, [49]）、ならびにTvAb（Roche, [50], [51]）を含むが、これらに限定されない。
Fc融合分子の例は、ScFv/Fc融合物（Academic Institution）、SCORPION（Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS）、Dual Affinity Retargeting Technology（Fc-DART（商標））（MacroGenics, [52], [53]）、およびDual(ScFv)2-Fab（National Research Center for Antibody Medicine - 中国）を含むが、これらに限定されない。
Fab融合二重特異性抗体の例は、F(ab)2（Medarex/AMGEN）、Dual-ActionまたはBis-Fab（Genentech）、Dock-and-Lock（登録商標）（DNL）（ImmunoMedics）、二価二重特異性（Biotecnol）、およびFab-Fv（UCB-Celltech）を含むが、これらに限定されない。
ScFvベース、ダイアボディベース、およびドメイン抗体の例は、Bispecific T cell Engager（BiTE（登録商標））（Micromet）、タンデムダイアボディ（Tandab（商標））（Affimed）、Dual Affinity Retargeting Technology（DART）（MacroGenics）、一本鎖ダイアボディ（Academic）、TCR様抗体（AIT, ReceptorLogics）、ヒト血清アルブミンScFv融合物（Merrimack）、およびCOMBODY（Epigen Biotech）、デュアル標的化nanobodies（登録商標）（Ablynx）、デュアル標的化重鎖のみのドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。
本発明による二重特異性抗体は、抗体の定常領域に改変を導入することによって生成され得る。
別の方法で述べるかまたは文脈によって否定されない限り、定常領域配列のアミノ酸は、本明細書においてEuインデックスのナンバリング（[26]に記載されている）にしたがって、ナンバリングされている。「Euインデックスのナンバリング」および「Kabatに示されているEuナンバリング」という用語は、互換的に使用され、同じ意味および目的を有し得る。したがって、別の配列におけるアミノ酸またはセグメントに「対応する」1つの配列におけるアミノ酸またはセグメントとは、ALIGN、ClustalW、または同様のものなどの標準的な配列アラインメントプログラムを用いて、典型的にはデフォルトの設定で他のアミノ酸またはセグメントと整列し、ヒトIgG1重鎖に対して少なくとも50％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％の同一性を有するものである。配列または配列中のセグメントを整列させ、それにより、本発明によるアミノ酸位置に対応する配列中の位置を決定する方法は、当技術分野において周知である。
本明細書において使用される「位置に対応するアミノ酸」という用語は、ヒトIgG1重鎖におけるアミノ酸位置の数を指す。
本発明はまた、実施例の抗体のVL領域、VH領域、または1つもしくは複数のCDRの機能的バリアントを含む抗体も提供する。AXL抗体の文脈において使用されるVL、VH、またはCDRの機能的バリアントは、抗体が、親抗体の親和性／結合力および／または特異性／選択性の少なくとも実質的な割合（少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、またはそれより多く）を保持することを依然として可能にし、いくつかの場合、そのようなAXL抗体は、親抗体よりも大きい親和性、選択性および／または特異性と関連し得る。
そのような機能的バリアントは、典型的に、親抗体に対して有意な配列同一性を保持する。2つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×100）であり、2つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れる。2つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、当技術分野において周知である数学アルゴリズムを用いて遂行され得る。
バリアントのVH、VL、および／またはCDR配列は、主として保存的置換を通して親抗体配列のものから異なってもよく；例として、バリアントにおける置換の少なくとも約35％、約50％またはそれより多く、約60％またはそれより多く、約70％またはそれより多く、約75％またはそれより多く、約80％またはそれより多く、約85％またはそれより多く、約90％またはそれより多く（例えば、約65〜95％、例えば約92％、93％、または94％）が、保存的なアミノ酸残基の置き換えである。
バリアントのVH、VL、および／またはCDR配列は、主として保存的置換を通して親抗体配列のものから異なってもよく；例として、バリアントにおける置換の10個未満、例えば9個未満、8個未満、7個未満、6個未満、5個未満、4個未満、3個未満、2個未満、または1個が、保存的なアミノ酸残基の置き換えである。
「アミノ酸」および「アミノ酸残基」という用語は、本明細書において互換的に使用され得、限定するように理解されるべきではない。
本発明の文脈において、アミノ酸は、保存的アミノ酸または非保存的アミノ酸によって定義され得、そのため、それに応じて分類され得る。アミノ酸残基はまた、代替の物理的および機能的特性によって定義されるクラスに分けられ得る。したがって、アミノ酸のクラスは、以下の表の1つまたは両方において反映され得る。
保存的クラスのアミノ酸残基
Figure 2020141682
アミノ酸残基の代替の物理的および機能的分類
Figure 2020141682
本発明の文脈において、抗体における置換は、以下のように示される：
元のアミノ酸-位置-置換されたアミノ酸。
アミノ酸の十分に認識されている命名法に言及すると、3文字コードまたは1文字コードが使用され、任意のアミノ酸残基を示すコード「Xaa」または「X」を含む。したがって、XaaまたはXは、典型的に、20種の天然に存在するアミノ酸の任意を表し得る。本明細書において使用される「天然に存在する」という用語は、以下のアミノ酸残基；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびシステインのいずれか1つを指す。それに応じて、「K409R」または「Lys409Arg」という表示法は、抗体が、アミノ酸位置409にリジンのアルギニンでの置換を含むことを意味する。
所定の位置でのアミノ酸の任意の他のアミノ酸への置換は、以下のように言及される：
元のアミノ酸-位置；または例えば「K409」。
元のアミノ酸および／または置換されたアミノ酸が、1つより多いが、すべてではないアミノ酸を含み得る改変について、1つより多いアミノ酸は、「,」または「/」によって分離され得る。例えば、位置409でのリジンのアルギニン、アラニン、またはフェニルアラニンでの置換は、以下である：
「Lys409Arg,Ala,Phe」または「Lys409Arg/Ala/Phe」または「K409R,A,F」または「K409R/A/F」または「K409をR、A、またはFへ」。
そのような呼称は、本発明の文脈において互換的に使用され得るが、同じ意味および目的を有する。
さらに、「置換」という用語は、任意の1種または残りの19種の天然アミノ酸への、または非天然アミノ酸などの他のアミノ酸への置換を包含する。例えば、位置409のアミノ酸Kの置換は、以下の置換：409A、409C、409D、409E、409F、409G、409H、409I、409L、409M、409N、409Q、409R、409S、409T、409V、409W、409P、および409Yの各々を含む。なお、これは、Xが元のアミノ酸以外の任意のアミノ酸を称する呼称409Xと同等である。これらの置換はまた、K409A、K409Cなど、またはK409A,C,など、またはK409A/C/などと称され得る。同じことが、類推により本明細書において述べられる各々のおよびあらゆる位置に、そのような置換の任意の1つを本明細書において具体的に含むようにあてはまる。
本発明による抗体はまた、アミノ酸残基の欠失を含み得る。そのような欠失は、「del」と表示され得、例えば、K409delとの表記を含む。したがって、そのような態様において、位置409のリジンは、アミノ酸配列から欠失している。
1つの特定の態様で、二重特異性抗体は、第1および第2の重鎖を含み、第1および第2の重鎖の各々は、少なくともヒンジ領域、CH2およびCH3領域を含み、第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のK409、T366、L368、K370、D399、F405、およびY407からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも1つが置換されており、第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のF405、T366、L368、K370、D399、Y407、およびK409からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも1つが置換されており、第1および第2の重鎖は、同じ位置で置換されていない。
1つの態様で、第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のK409に対応する位置のアミノ酸はK、L、またはMではなく、任意で、ヒトIgG1重鎖中のF405に対応する位置のアミノ酸はFであり、第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のF405に対応する位置のアミノ酸はFではなく、ヒトIgG1重鎖中のK409に対応する位置のアミノ酸はKである。
1つの態様で、第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のF405に対応する位置のアミノ酸はF、R、およびGではなく、第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のT366、L368、K370、D399、Y407、およびK409からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。
1つの態様で、ヒトIgG1重鎖中のK409に対応する位置のアミノ酸は、第1の重鎖においてK、L、またはM以外の別のものであり、第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のF405に対応する位置のアミノ酸はFではなく、任意で、ヒトIgG1重鎖中のK409に対応する位置のアミノ酸はKである。
1つの態様で、ヒトIgG1重鎖中のF405に対応する位置のアミノ酸は、前記第1の重鎖においてLであり、ヒトIgG1重鎖中のK409に対応する位置のアミノ酸は、前記第2の重鎖においてRであるか、またはその逆である。
したがって、1つの態様で、ヒトIgG1重鎖中のK409に対応する位置のアミノ酸は、第1の重鎖においてRであり、ヒトIgG1重鎖中のF405に対応する位置のアミノ酸は、第2の重鎖においてLである。
別の態様において、二重特異性抗体の第1および第2の結合領域の両方が、AXLに結合する。しかし、第1の結合領域は、第2の結合領域とは異なるCDR配列のセットを含む。したがって、特定の態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の結合領域、ならびに第1および第2の重鎖を含み、第1および第2の結合領域は、以下からなる群より選択されるVHおよびVL領域を各々含む；
a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [148]；
b）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [733]；
c）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [140]；
d）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および55のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154]；
e）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154-M103L]；
f）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [171]；
g）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [172]；
h）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [181]；
i）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183]；
j）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183-N52Q]；
k）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [187]；
l）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [608-01]；
m）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [610-01]；
n）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:94、95、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613]；
o）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:101、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613-08]；
p）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [620-06]；
q）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726]；
r）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [107]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726-M101L]；
s）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [733]；
t）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [107]；
u）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および55のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154]；
v）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154-M103L]；
w）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [171]；
x）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [172]；
y）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [181]；
z）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183]；
aa）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183-N52Q]；
bb）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [187]；
cc）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [608-01]；
dd）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [610-01]；
ee）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:94、95、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613]；
ff）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:101、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613-08]；
gg）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [620-06]；
hh）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726]；
ii）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [148]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726-M101L]；
jj）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [140]；
kk）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 51、52、および55のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154]；
ll）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [154-M103L]；
mm）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [171]；
nn）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [172]；
oo）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [181]；
pp）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183]；
qq）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [183-N52Q]；
rr）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [187]；
ss）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [608-01]；
tt）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [610-01]；
uu）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 94、95、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613]；
vv）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:101、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [613-08]；
ww）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [620-06]；
xx）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726]；ならびに
yy）それぞれ、SEQ ID NO: 114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第1のVL領域 [733]；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む第2のVL領域 [726-M101L]。
抗AXL抗体薬物コンジュゲート‐イムノコンジュゲート
本発明のいずれかの局面または態様による抗体は、細胞傷害性作用物質、化学療法薬、サイトカイン、免疫抑制剤、抗生物質、または放射性同位元素などの治療または診断部分にコンジュゲートされ得る。そのようなコンジュゲートは、「イムノコンジュゲート」と本明細書において呼ばれる。1つまたは複数の細胞毒素を含むイムノコンジュゲートは、「免疫毒素」と呼ばれる。細胞傷害性作用物質、薬物などにコンジュゲートされた抗体はまた、抗体-薬物コンジュゲート（ADC）としても公知である。イムノコンジュゲートは、抗体-薬物コンジュゲートが内部移行され、分解され、放出された毒素により細胞殺傷を誘導するのに十分な期間の半減期を有し得る。
したがって、別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面もしくは態様による抗体、または本明細書に記載されるいずれかの局面もしくは態様による二重特異性抗体、および、細胞傷害性作用物質、化学療法薬、サイトカイン、免疫抑制剤、抗生物質、または放射性同位元素などの治療部分を含むイムノコンジュゲートに関する。細胞傷害性作用物質、化学療法薬、サイトカイン、免疫抑制剤、抗生物質、または放射性同位元素は、リンカーを介して抗体または二重特異性抗体にコンジュゲートされ得る。
ADCはしばしば、細胞傷害性ペイロードが、抗体にコンジュゲートされている際には不活性であるように設計される。細胞傷害性ペイロードは、細胞の形質膜への結合後のADCの内部移行時に細胞内で、あるいは、腫瘍微小環境中のタンパク質分解活性に応答して、放出され得る。本明細書において使用される「内部移行される」または「内部移行」という用語は、本発明による抗体などの分子が、細胞膜により包み込まれて、細胞の内部中に引き込まれる生物学的プロセスを指す。それはまた、「エンドサイトーシス」とも呼ばれ得る。
したがって、本発明のいずれかの局面または態様による抗体は、標的であるAXLへの結合時に細胞中に内部移行され得る。
いくつかの事例において、内部移行を受ける抗体を使用することが望ましい場合がある。良好な内部移行特性を有するそのような抗体は、任意で、細胞内で切断されるように設計されているリンカーを介した、細胞傷害性作用物質、薬物などへのコンジュゲーションに適していてもよい。
ADCは、ひとたび内部移行されると、たいていの場合にリソソームへ送達され得、有効な薬物放出は、これらのオルガネラで見出される異化環境を利用する。抗体を細胞傷害性作用物質と接続するのは、典型的にはリンカーである。したがって、専門のリンカーが、標的腫瘍細胞中もしくは標的腫瘍細胞上、または腫瘍微小環境中に見出される特異的な微小環境においてのみ切断されるように設計されている。例は、酸性条件、還元条件、または特異的なプロテアーゼによって切断されるリンカーを含む。
循環における抗体-リンカー-薬物の安定性は、これにより特異的な標的細胞への薬物の抗体媒介性送達が可能になるため、重要である。加えて、ADCの長い循環半減期により、注射後数日間から数週間の曝露が提供される。切断不可能なリンカーおよびプロテアーゼで切断可能なリンカーを通してコンジュゲートされている薬物は、ジスルフィドリンカーおよびヒドラゾンリンカーよりも、循環において概してより安定であるが、後者の2つのリンカーの安定性は、近隣の化学構造の変更によって調整することができる[6]。
1つの態様において、治療部分は細胞傷害性作用物質である。
細胞毒素または細胞傷害性作用物質は、細胞に対して有害である（例えば、殺傷する）任意の作用物質を含む。本発明のイムノコンジュゲートを形成するのに適している細胞傷害性作用物質は、taxol、ツブリシン、デュオスタチン（duostatin）、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（dihydroxy anthracin dione）、メイタンシンまたはその類似体もしくは誘導体、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン；カリケアマイシンまたはその類似体もしくは誘導体；抗代謝剤（メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、ダカルバジン（decarbazine）、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビンなど）、アルキル化剤（メクロレタミン、チオテパ（thioepa）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）、ロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（DTIC）、プロカルバジン、マイトマイシンC、シスプラチン、およびカルボプラチンなどの他の白金誘導体；ならびにデュオカルマイシンA、デュオカルマイシンSA、CC-1065（ラシェルマイシンとしても公知である）、またはCC-1065の類似体もしくは誘導体など）、ドラスタチン、アウリスタチン、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PDB）、インドリノベンゾジアゼピン（IGN）またはその類似体、抗生物質（ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（AMC）など）、抗有糸分裂作用物質（例えば、チューブリン標的作用物質）、例えば、ジフテリア毒素および関連分子（ジフテリアA鎖およびその活性断片およびハイブリッド分子など）；リシン毒素（リシンAまたは脱グリコシル化リシンA鎖毒素）、コレラ毒素、志賀様毒素（SLT-I、SLT-II、SLT-IIV）、LT毒素、C3毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆ボーマン・バークプロテアーゼ阻害剤、緑膿菌（Pseudomonas）外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゲラニン（gelanin）、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、およびエノマイシン毒素を含む。他の適しているコンジュゲート分子は、CLIP、マガイニン2、メリチン、セクロピン、およびP18などの抗微生物／溶菌ペプチド；リボヌクレアーゼ（RNアーゼ）、DNアーゼI、ブドウ球菌腸毒素-A、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ジフテリア毒素、および緑膿菌内毒素を含む。例えば、Pastan et al., Cell 47, 641 (1986)およびGoldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994)を参照されたい。例えば抗癌サイトカインまたはケモカインなどの、本明細書において別の場所に記載されるような、本発明の抗AXL抗体または抗体-薬物コンジュゲートと組み合わせて投与され得る治療用作用物質もまた、本発明において開示される抗体へのコンジュゲーションに有用な治療部分のための候補である。
本明細書において使用される「細胞傷害性作用物質」という用語は、細胞に対して有害である（例えば、殺傷する）任意の作用物質を指す。当技術分野において周知であるこれらのクラスの薬物、およびそれらの作用機構の説明のためには、[54]を参照されたい。抗体免疫毒素の調製に関連する追加の技術は、例として[55]および[56]に提供されている。
1つの態様において、細胞傷害性作用物質は、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)-ペンタノアート（SSP）、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（mc-vc-PAB）、またはAV-1 K-lockバリン-シトルリンなどの切断可能なリンカーで、前記抗体またはその断片に連結されている。
本明細書において使用される「切断可能なリンカー」という用語は、標的とされる細胞中または腫瘍微小環境中で特異的なプロテアーゼによって触媒され、細胞傷害性作用物質の放出を結果としてもたらす、リンカーのサブセットを指す。切断可能なリンカーの例は、ジスルフィド、ヒドラゾン、またはペプチドを含む化学モチーフに基づくリンカーである。切断可能なリンカーの別のサブセットは、細胞傷害性作用物質と主要リンカーとの間、すなわち、リンカー-薬物の組み合わせを抗体に付着させる部位に、余分のリンカーモチーフが加わる。いくつかの態様において、余分のリンカーモチーフは、細胞内環境中（例えば、リソソームまたはエンドソームまたは小胞内）に存在する切断可能な作用物質によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームのプロテアーゼを含むがこれらに限定されない、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであることができる。いくつかの態様において、ペプチジルリンカーは、少なくとも2アミノ酸長または少なくとも3アミノ酸長である。切断作用物質は、カテプシンBおよびD、ならびにプラスミンを含むことができ、これらのすべては、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞の内側で活性薬物の放出を結果としてもたらすことが公知である（例えば、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123を参照されたい）。具体的な態様において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、Val-Cit（バリン-シトルリン）リンカーまたはPhe-Lys（フェニルアラニン-リジン）リンカーである（Val-Citリンカーを有するドキソルビシンの合成を記載している米国特許第6214345号を参照されたい）。治療用作用物質の細胞内タンパク質分解性放出を用いる利点は、作用物質が、コンジュゲートされている際には典型的に減衰されており、コンジュゲートの血清安定性が、典型的に高いことである。
別の態様において、細胞傷害性作用物質は、スクシンイミジル-4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート（MCC）またはマレイミドカプロイル（MC）などの切断不可能なリンカーで、前記抗体またはその断片に連結されている。
本明細書において使用される「切断不可能なリンカー」という用語は、切断可能なリンカーとは対照的に、細胞内または細胞外のプロテアーゼによって特異的にかつ予想通りに認識されるモチーフを含まない、リンカーのサブセットを指す。したがって、切断不可能なリンカーに基づくADCは、完全な抗体-リンカー-薬物複合体がリソソーム区画において分解されるまで、抗体から放出または切断されない。切断不可能なリンカーの例は、チオエーテルである。さらに別の態様において、リンカー単位は切断可能ではなく、薬物は抗体分解によって放出される（[57]を参照されたい）。典型的に、そのようなリンカーは、細胞外環境に対して実質的に感受性がない。本明細書において使用される際、リンカーの文脈における「細胞外環境に対して実質的に感受性がない」とは、抗体薬物コンジュゲート化合物の試料において、リンカーのわずか20％、典型的にはわずか約15％、より典型的にはわずか約10％、およびさらにより典型的にはわずか約5％、わずか約3％、またはわずか約1％が、抗体薬物コンジュゲート化合物が細胞外環境（例えば、血漿）中に存在する際に切断されることを意味する。リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性がないかどうかは、例えば、抗体薬物コンジュゲート化合物をあらかじめ設定された時間（例えば、2、4、8、16、または24時間）、血漿とインキュベートし、次いで、血漿中に存在する遊離の薬物の量を定量することによって判定することができる。
1つの態様において、細胞傷害性作用物質は、DNA標的作用物質、例えば、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ラシェルマイシン（CC-1065）、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PBD）、およびインドリノベンゾジアゼピン（IGN）などのDNAアルキル化剤および架橋剤；微小管標的作用物質、例えばデュオスタチン、例えばデュオスタチン-3、アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチンE（MMAE）およびモノメチルアウリスタチンF（MMAF）、ドラスタチン、メイタンシン、N(2')-デアセチル-N(2')-(3-マルカプト-1-オキソプロピル)-メイタンシン（DM1）、およびツブリシン；ならびにヌクレオシド類似体；またはそれらの類似体、誘導体、もしくはプロドラッグの群から選択される。
1つの態様において、イムノコンジュゲートは、以下の組み合わせを含む；
i）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有する前記切断可能なリンカー；
ii）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有さない前記切断可能なリンカー；
iii）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有する前記切断不可能なリンカー；または
iv）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有さない前記切断不可能なリンカー。
本明細書において使用される「バイスタンダー殺傷効果」、「バイスタンダー殺傷」、「バイスタンダー殺傷能力」、または「バイスタンダー細胞傷害」という用語は、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーのいずれかにより抗体にコンジュゲートされている細胞傷害性作用物質が、抗体からの放出後に細胞膜を横切って拡散する能力を有し、それにより近隣細胞の殺傷を引き起こす効果を指す。細胞傷害性作用物質が切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーによりコンジュゲートされている場合、バイスタンダー殺傷能力を有するのは、細胞傷害性作用物質のみまたはリンカーの一部を有する細胞傷害性作用物質のいずれかであり得る。細胞膜を横切って拡散する能力は、細胞傷害性作用物質または細胞傷害性作用物質とリンカーとの組み合わせの疎水性に関連する。そのような細胞傷害性作用物質は、有利には、プロテアーゼにより抗体から放出されているMMAEなどの膜透過性毒素であり得る。特に、不均質な標的発現を有する腫瘍および抗体浸透が限定され得る固形腫瘍において、バイスタンダー殺傷効果が望ましい場合がある。
本明細書において使用される「非バイスタンダー殺傷能力」、「非バイスタンダー殺傷効果」、「非バイスタンダー殺傷」、または「非バイスタンダー細胞傷害」という用語は、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーのいずれかにより抗体にコンジュゲートされている細胞傷害性作用物質が、抗体からの放出後に細胞膜を横切って拡散する能力を有さない効果を指す。したがって、そのような細胞傷害性作用物質または細胞傷害性作用物質とリンカーとの組み合わせは、抗体からの放出時に近隣細胞を殺傷することができないことになる。理論により縛られることなく、細胞傷害性作用物質と切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーのいずれかとのそのような組み合わせは、抗体が結合する標的を発現する細胞のみを殺傷することになると確信される。
抗体と細胞傷害性作用物質との間の安定な連結は、ADCの重要な要因である。切断可能なタイプおよび切断不可能なタイプの両方のリンカーが、前臨床試験および臨床試験において安全であることが判明している。
1つの態様において、細胞傷害性作用物質は、アウリスタチンおよびメイタンシノイドなどの微小管標的作用物質の群から選択される。
本明細書において使用される「微小管標的作用物質」という用語は、有糸分裂（細胞分裂）を阻害する作用物質または薬物を指す。微小管は、細胞分裂中のDNAの妥当な分離に不可欠な構造であり、微小管機能は、「動的不安定性」、すなわち微小管構造が連続的に伸長および短縮するプロセスに決定的に依存する。微小管標的作用物質は、微小管を破壊または安定化して、有糸分裂紡錘体の形成を阻止し、有糸分裂の停止およびアポトーシスを結果としてもたらす。微小管標的作用物質は、例えば、植物アルカロイドなどの天然物質に由来することができ、微小管の重合を破壊または安定化し、かくして有糸分裂紡錘体の形成およびその後の細胞分裂を阻止することによって細胞が有糸分裂を経験するのを阻止し、癌性増殖の阻害を結果としてもたらす。微小管標的作用物質の例は、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、デュオスタチン、アウリスタチン、メイタンシノイド、ツブリシン、およびドラスタチンである。
1つの態様において、細胞傷害性作用物質は、アウリスタチンまたはアウリスタチンペプチド類似体および誘導体である（[131]；[132]）。アウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解、ならびに核分裂および細胞分裂を干渉し[133]、抗癌活性[134]および抗真菌活性[135]を有することが示されている。アウリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のN（アミノ）末端またはC（末端）を通して、リンカーを介して抗体に付着され得る。
例示的なアウリスタチン態様は、[136]に開示され、[137]に記載されている、N末端連結モノメチルアウリスタチン薬物部分DEおよびDFを含む。
特定の態様において、細胞傷害性作用物質は、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）；
Figure 2020141682
であり、抗体は、適切なリンカーにより上記の化学構造の左側の窒素（N）でMMAEに連結されている。
1つの態様において、細胞傷害性作用物質モノメチルアウリスタチンE（MMAE）は、バリン-シトルリン（VC）リンカーを介して抗体に連結されている。
別の態様において、細胞傷害性作用物質モノメチルアウリスタチンE（MMAE）は、バリン-シトルリン（VC）リンカーおよびマレイミドカプロイル（MC）リンカーを介して抗体に連結されており、細胞傷害性作用物質とリンカーとの組み合わせは、化学構造；
Figure 2020141682
を有し、式中、MAbは抗体である。
1つの態様において、細胞傷害性作用物質は、モノメチルアウリスタチンF（MMAF）；
Figure 2020141682
であり、抗体は、適切なリンカーにより上記の化学構造の左側の窒素（N）でMMAFに連結されている。
1つの態様において、細胞傷害性作用物質モノメチルアウリスタチンF（MMAF）は、マレイミドカプロイル（mc）リンカーを介して抗体に連結されており、細胞傷害性作用物質とリンカーとの組み合わせは、化学構造；
Figure 2020141682
を有し、式中、MAbは抗体である。
1つの態様において、細胞傷害性作用物質はデュオスタチン3である。
別の特定の態様において、細胞傷害性作用物質はDNA標的作用物質である。
本明細書において使用される「DNA作用剤」という用語は、DNAをアルキル化および／または架橋することができる特定のクラスの細胞傷害性作用物質を指す。そのようなDNA作用剤の例は、DNAをアルキル化および架橋するそれらの能力のおかげで非常に強力である、インドリノ-ベンゾジアゼピン二量体およびピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PBD）を含むIGN剤である。別の例は、DNAをアルキル化のみする能力のおかげで非常に強力である、インドリノ-ベンゾジアセピン単量体を含むIGN剤である。デュオカルマイシンは、別のクラスのDNA作用剤である。デュオカルマイシンは、低分子の合成DNA副溝結合アルキル化剤である。これらの化合物は、固形腫瘍および血液腫瘍を標的とするのに適している。
1つの態様において、イムノコンジュゲートは、抗体あたり2〜4個の細胞傷害性分子を含む。毒素およびリンカー-毒素の組み合わせの化学的特性に応じて、抗体あたり2〜4個の細胞傷害性作用物質は、より少量が負荷されているコンジュゲートよりも循環からより急速に浄化される、より多量に負荷されたコンジュゲートよりも優れている場合がある。細胞傷害性作用物質の負荷は、pにより表され、分子における抗体あたりの細胞傷害性作用物質部分の平均数（薬物対抗体の比、DARとも称される）である。細胞傷害性作用物質の負荷は、抗体あたり1〜20個の薬物部分の範囲にわたり得、リジンまたはシステイン中のような、アミノ基またはスルフヒドリル基などであるがこれらに限定されない、有用な官能基を有するアミノ酸上で起こり得る。
1つの態様において、抗体あたりの細胞傷害性作用物質の数は、1〜8個、例えば2〜7個、例えば2〜6個、例えば2〜5個、例えば2〜4個、および例えば2〜3個である。
別の態様において、イムノコンジュゲートは、抗体あたり4〜8個の細胞傷害性分子を含む。別の態様において、イムノコンジュゲートは、抗体あたり6〜10個の細胞傷害性分子を含む。さらに別の態様において、イムノコンジュゲートは、抗体あたり10〜30個、例えば15〜25個、例えば20個の細胞傷害性分子を含む。
コンジュゲーションの方法に応じて、pは、抗体上の付着部位の数によって限定され得、例えば、付着はシステインチオールまたはリジンである。概して、抗体は、薬物部分に連結され得る多くの遊離かつ反応性のシステインチオール基を含有しておらず、なぜなら、抗体中のたいていのシステインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在するからである。そのため、細胞傷害性作用物質がシステインチオールを介してコンジュゲートされているそれらの態様において、抗体は、反応性のシステインチオール基を生成するために、部分的または完全な還元条件下で、ジチオスレイトール（DTT）またはトリカルボニルエチルホスフィン（TCEP）などの還元剤で還元され得る。ある特定の態様において、最大で8個の遊離システインチオール基が、抗体の（部分的）還元後に利用可能になる（鎖間ジスルフィド結合に関与する8個のシステインが存在する）ため、本発明のADCについての薬物負荷は、1〜約8個の範囲にわたる。
1つの態様において、薬物リンカー部分はvcMMAEである。vcMMAE薬物リンカー部分およびコンジュゲーション法は、[27]；[28]；[145]、[146]；および[147]（参照により本明細書に組み入れられる）に開示されており、vcMMAEは、リンカーmc-vc-PABと細胞傷害性部分MMAEとのコンジュゲーションによって形成され、vcMMAE薬物リンカー部分は、その中に開示されているものと同様の方法を用いて、システイン残基で抗AXL抗体に結合されている。
1つの態様において、薬物リンカー部分はmcMMAFである。mcMMAF薬物リンカー部分およびコンジュゲーション法は、[138]；[139]、および[140]（参照により本明細書に組み入れられる）に開示されており、mcMMAF薬物リンカー部分は、その中に開示されているものと同様の方法を用いて、システイン残基で抗AXL抗体に結合されている。
1つの態様において、細胞傷害性作用物質は、[58]、[148] 、および[149]に記載されているように、K-Lock（商標）コンジュゲーションによって抗体アミノ酸配列内の1または2個のリジンに連結されており、デュオスタチン3（Duo3としても公知である）は、その中に記載されているものと同様の方法を用いて、リジン残基で抗AXL抗体に結合されている。
ヒドロキシル基を含むリンカーなどの他のリンカー技術が、本発明の抗AXL抗体薬物コンジュゲートにおいて使用され得る。
1つの態様において、リンカーは、抗AXL抗体の（部分的）還元によって取得される抗AXL抗体の遊離システイン残基に付着される。
特定の態様において、リンカーはmc-vc-PABであり、細胞傷害性作用物質はMMAEであるか；またはリンカーはSSPであり、細胞傷害性作用物質はDM1である。
特定の態様において、リンカーはMMCであり、細胞傷害性作用物質はDM1であるか；またはリンカーはMCであり、細胞傷害性作用物質はMMAFである。
特定の態様において、リンカーは切断可能なリンカーAV1-K lockであり、細胞傷害性作用物質はデュオスタチン3である。
1つの態様において、イムノコンジュゲートは、リンカーmc-vc-PAB、細胞傷害性作用物質MMAE、ならびに、少なくとも1つの結合領域が、以下からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む抗体を含む；
a）SEQ ID NO:1を含むVH領域、およびSEQ ID NO:2を含むVL領域 [107]；
b）SEQ ID NO:5を含むVH領域、およびSEQ ID NO:6を含むVL領域 [148]；
c）SEQ ID NO:34を含むVH領域、およびSEQ ID NO:35を含むVL領域 [733]；
d）SEQ ID NO:7を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154];
e）SEQ ID NO:10を含むVH領域、およびSEQ ID NO:11を含むVL領域 [171]；
f）SEQ ID NO:16を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183]；
g）SEQ ID NO:25を含むVH領域、およびSEQ ID NO:26を含むVL領域 [613]；
h）SEQ ID NO:31を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726]；
i）SEQ ID NO:3を含むVH領域、およびSEQ ID NO:4を含むVL領域 [140]；
j）SEQ ID NO:8を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154-M103L]；
k）SEQ ID NO:12を含むVH領域、およびSEQ ID NO:13を含むVL領域 [172]；
l）SEQ ID NO:14を含むVH領域、およびSEQ ID NO:15を含むVL領域 [181]；
m）SEQ ID NO:17を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183-N52Q]；
n）SEQ ID NO:19を含むVH領域、およびSEQ ID NO:20を含むVL領域 [187]；
o）SEQ ID NO:21を含むVH領域、およびSEQ ID NO:22を含むVL領域 [608-01]；
p）SEQ ID NO:23を含むVH領域、およびSEQ ID NO:24を含むVL領域 [610-01]；
q）SEQ ID NO:27を含むVH領域、およびSEQ ID NO:28を含むVL領域 [613-08]；
r）SEQ ID NO:29を含むVH領域、およびSEQ ID NO:30を含むVL領域 [620-06]；ならびに
s）SEQ ID NO:32を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726-M101L]。
別の代替態様において、本発明に開示される抗AXL抗体薬物コンジュゲートは、コンジュゲートされた核酸または核酸関連分子を含む。1つのそのような態様において、コンジュゲートされた核酸は、細胞傷害性リボヌクレアーゼ、アンチセンス核酸、阻害性RNA分子（例えば、siRNA分子）、または免疫刺激性核酸（例えば、免疫刺激性CpGモチーフ含有DNA分子）である。
別の代替態様において、本発明の抗AXL抗体は、アプタマーまたはリボザイムまたはそれらの機能的ペプチド類似体もしくは誘導体にコンジュゲートされる。
別の代替態様において、1つまたは複数の放射標識アミノ酸を含む抗AXL抗体薬物コンジュゲートが提供される。放射標識抗AXL抗体は、診断目的および治療目的の両方で使用され得る（放射標識分子へのコンジュゲーションは別の可能な特徴である）。ポリペプチド用の標識の非限定的な例は、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、および125I、131I、および186Reを含む。放射標識アミノ酸および関連ペプチド誘導体を調製するための方法は、当技術分野において公知である（例として[59]および[60]、[61]、[62]、[63]、[64]、および[65]の米国特許第5,697,902号を参照されたい）。例えば、放射性同位元素は、クロラミンT法によってコンジュゲートされ得る。
1つの態様において、抗体は、放射性同位元素または放射性同位元素含有キレートにコンジュゲートされる。例えば、抗体は、抗体が放射性同位元素と複合体形成することを可能にするキレーターリンカー、例えばDOTA、DTPA、またはチウキセタンにコンジュゲートされることができる。抗体は、またもしくは代替的に、1つまたは複数の放射標識アミノ酸または他の放射標識分子を含み得るか、またはそれらにコンジュゲートされ得る。放射標識抗AXL抗体は、診断目的および治療目的の両方で使用され得る。放射性同位元素の非限定的な例は、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、125I、111In、131I、186Re、213Bs、225Ac、および227Thを含む。
抗AXL抗体はまた、例としてその循環半減期を増大させるために、共有結合性コンジュゲーションによりポリマーに化学修飾され得る。例示的なポリマー、およびそれらをペプチドに付着させる方法は、例として[66]；[67]；[68]；および[69]に例証されている。追加のポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（PEG）（例えば、約1,000〜約40,000の間、例えば約2,000〜約20,000の間の分子量を有するPEG）を含む。これは、例えば、抗AXL抗体が断片である場合に使用され得る。
[70]、[71]、および[72]により記載されている方法を含む、本発明による抗AXL抗体を上記のものなどのコンジュゲート分子にコンジュゲートするための、当技術分野において公知である任意の方法が、使用され得る。そのような抗体は、抗AXL抗体（例えば、抗AXL抗体H鎖またはL鎖）のN末端側またはC末端側に他の部分を化学的にコンジュゲートすることによって産生され得る（例えば、[73]を参照されたい）。そのようなコンジュゲート抗体誘導体はまた、内部の残基もしくは糖、または、適切な場合、抗体定常ドメイン中に導入されている天然に存在しないアミノ酸もしくは追加のアミノ酸でのコンジュゲーションによって生成され得る。
作用物質は、本発明において開示される抗AXL抗体に、直接または間接のいずれかでカップリングされ得る。第2の作用物質の間接カップリングの1つの例は、抗体中のシステインまたはリジン残基へのスペーサー部分を介したカップリングである。1つの態様において、抗AXL抗体は、インビボで治療用薬物に活性化されることができるプロドラッグ分子へ、スペーサーまたはリンカーを介してコンジュゲートされる。投与後、スペーサーまたはリンカーは、腫瘍細胞関連酵素または他の腫瘍特異的条件によって切断され、それにより活性薬物が形成される。そのようなプロドラッグ技術およびリンカーの例は、[74]、[75]、[76]、[77]、[78]、および[79]（すべてが参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。適している抗体-プロドラッグ技術およびデュオカルマイシン類似体はまた、[80]（参照により本明細書に組み入れられる）においても見出すことができる。
1つの態様において、本発明の抗AXL抗体は、抗体が放射性同位元素にコンジュゲートされることを可能にするキレーターリンカー、例えばチウキセタンに付着される。
組成物
さらなる局面において、本発明は、本発明の抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲートを含む組成物に関する。
別の局面において、本発明は、本発明による抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲート、および薬学的担体を含む薬学的組成物に関する。
薬学的組成物は、[81]に開示されているものなどの従来の技術にしたがって、薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに任意の他の公知のアジュバントおよび賦形剤とともに製剤化され得る。
薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに任意の他の公知のアジュバントおよび希釈剤は、本発明の抗体または抗体コンジュゲート、および選択された投与の様式に適しているべきである。薬学的組成物の担体および他の構成要素の適合性は、選択された本発明の化合物または薬学的組成物の望ましい生物学的特性に対して有意な負の影響がない（例えば、抗原結合時に実質的な影響に満たない（10％以下の相対的阻害、5％以下の相対的阻害など））ことに基づいて決定される。
本発明の薬学的組成物はまた、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、界面活性剤（例えば、Tween-20またはTween-80などの非イオン性界面活性剤）、安定剤（例えば、糖またはタンパク質を含まないアミノ酸）、保存剤、組織固定剤、可溶化剤、および／または薬学的組成物中に含まれるのに適している他の材料も含み得る。
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投薬レベルは、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与の様式にとって望ましい治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るために、変動し得る。選択される投薬レベルは、使用される本発明の特定の組成物またはそのアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排出の速度、処置の持続期間、使用される特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康、および事前の病歴、ならびに医学分野において周知である同様の要因を含む、様々な薬物動態学的要因に依存することになる。
薬学的組成物は、任意の適している経路および様式によって投与され得る。インビボおよびインビトロで本発明の化合物を投与するのに適している経路は、当技術分野において周知であり、当業者によって選択され得る。
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は、非経口的に投与される。
本明細書において使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」という用語は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与の様式を指し、表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入を含む。
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は、静脈内または皮下の注射または注入によって投与される。
薬学的に許容される担体は、本発明の化合物と生理学的に適合性である、任意およびすべての適している溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤、抗酸化剤、ならびに吸収遅延剤などを含む。
本発明の薬学的組成物において使用され得る、適している水性および非水性の担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適している混合物、オリーブ油、コーン油、落花生油、綿実油、およびゴマ油などの植物油、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガカントガム、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、ならびに／または種々の緩衝剤を含む。他の担体が、薬学分野において周知である。
薬学的に許容される担体は、無菌の注射可能な溶液および分散系の即時調製のための、無菌の水性溶液または分散系および無菌の粉末を含む。薬学的活性物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において公知である。いずれかの従来の媒体または作用物質が活性化合物と不適合性である限りを除いて、本発明の薬学的組成物におけるそれらの使用が企図される。
妥当な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散系の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。
本発明の薬学的組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤、例として（1）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性抗酸化剤；（2）アスコルビルパルミタート、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、プロピルガラート、α-トコフェロールなどのような油溶性抗酸化剤；および（3）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート剤も含み得る。
本発明の薬学的組成物はまた、組成物中に、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、グリセロール、または塩化ナトリウムなどの等張剤も含み得る。
本発明の薬学的組成物はまた、薬学的組成物の貯蔵寿命または有効性を増強し得る、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、保存剤または緩衝剤などの、選択される投与の経路に適切な1つまたは複数のアジュバントも含有し得る。本発明の化合物は、インプラント、経皮貼付剤、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの、急速な放出から化合物を保護することになる担体とともに調製され得る。そのような担体は、ゼラチン、グリセリルモノステアラート、グリセリルジステアラート、生分解性生体適合性のポリマー、例えばエチレンビニルアセタート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリ-オルト-エステル、および単独もしくはワックスを伴うポリ乳酸、または当技術分野において周知である他の材料を含み得る。そのような製剤の調製のための方法は、概して、当業者に公知である。例えば、[82]を参照されたい。
1つの態様において、本発明の化合物は、インビボでの妥当な分布を確実にするように製剤化され得る。非経口投与のための薬学的に許容される担体は、無菌の注射可能な溶液または分散系の即時調製のための、無菌の水性溶液または分散系および無菌の粉末を含む。薬学的活性物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において公知である。いずれかの従来の媒体または作用物質が活性化合物と不適合性である限りを除いて、本発明の薬学的組成物におけるそれらの使用が企図される。他の活性化合物または治療用化合物もまた、組成物中に組み入れられ得る。
注射用の薬学的組成物は、典型的に、製造および保存の条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適している他の規則正しい構造として製剤化され得る。担体は、例として、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適している混合物、オリーブ油などの植物油、ならびに、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含有する、水性または非水性の溶媒、または分散媒であってもよい。妥当な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散系の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばグリセロール、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが、好ましいと考えられる。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアラート塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の活性化合物を、例えば上記で列挙されたような成分の1つまたは組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込むこと、必要とされる際には、その後の滅菌マイクロ濾過によって調製され得る。概して、分散系は、活性化合物を、基本の分散媒、および、例えば上記で列挙されたもの由来の必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、調製の方法の例は、事前に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分プラス任意の追加の望ましい成分の粉末を生じる、真空乾燥および冷凍乾燥（凍結乾燥）である。
無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の活性化合物を、上記で列挙された成分の1つまたは組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込むこと、必要とされる際には、その後の滅菌マイクロ濾過によって調製され得る。概して、分散系は、活性化合物を、基本の分散媒、および上記で列挙されたもの由来の必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、調製の方法の例は、事前に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分プラス任意の追加の望ましい成分の粉末を生じる、真空乾燥および冷凍乾燥（凍結乾燥）である。
本発明の薬学的組成物は、本発明の1つの抗体、二重特異性抗体、もしくはADC、本発明による抗体、二重特異性抗体、もしくはADCと別の治療用化合物との組み合わせ、または本発明の化合物の組み合わせを含有し得る。
核酸構築物、発現ベクター、および宿主細胞
1つの局面において、本発明は、表1に示される1つまたは複数の配列をコードする核酸構築物に関する。したがって、本発明は、SEQ ID NO:1〜135に示される配列のいずれか1つをコードする核酸構築物に関する。1つの態様において、核酸構築物は、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、および135からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つをコードする。したがって、1つの態様において、核酸構築物は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体をコードする。
特定の態様において、核酸構築物は、SEQ ID NO:46、47、48、49、50、36、37、38、39、40、114、115、116、117、および118からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つをコードする。
さらなる局面において、本発明は、本発明の抗体をコードする発現ベクターに関する。したがって、発現ベクターは、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による1つまたは複数の核酸構築物を含む。そのような発現ベクターは、本発明の抗AXL抗体を発現するために、1つの態様において使用され得る。発現された抗AXL抗体は、その後、本明細書に記載されるような部分にコンジュゲートされ得る。別の態様において、抗AXL抗体は、その後、本明細書に記載されるような二重特異性抗体を生成するために使用され得る。
1つの態様において、本発明の発現ベクターは、SEQ ID NO:38、43、48、53、54、59、64、69、75、80、85、90、95、100、105、110、111、116、120、122、125、および127からなる群より選択される重鎖（VH）CDR3アミノ酸配列の1つまたは複数をコードする核酸配列を含む。
特定の態様において、本発明の発現ベクターは、SEQ ID NO:36〜38、41〜43、46〜48、51〜54、57〜59、62〜64、67〜69、72〜75、78〜80、83〜85、88〜90、93〜95、98〜100、103〜105、108〜110、および114〜116からなる群より選択されるVH CDR1、CDR2、およびCDR3アミノ酸配列の1つまたは複数をコードする核酸配列を含む。
1つの態様において、本発明の発現ベクターは、SEQ ID NO:40、45、50、56、61、66、71、77、82、87、92、97、102、107、113、および118からなる群より選択される軽鎖（VL）CDR3アミノ酸配列の1つまたは複数をコードする核酸配列を含む。
別の特定の態様において、本発明の発現ベクターは、SEQ ID NO:1、3、5、7、8、10、12、14、16、17、19、21、23、25、27、29、31、32、および34からなる群より選択されるVHアミノ酸配列の1つまたは複数をコードする核酸配列を含む。
別の特定の態様において、本発明の発現ベクターは、SEQ ID NO:2、4、6、9、11、13、15、18、20、22、24、26、28、30、33、および35からなる群より選択されるVLアミノ酸配列の1つまたは複数をコードする核酸配列を含む。
1つの態様において、本発明の発現ベクターは、SEQ ID NO:1〜35からなる群より選択されるアミノ酸配列の1つまたは複数をコードする核酸配列を含む。
特定の態様において、本発明の発現ベクターは、上記のアミノ酸配列の1つまたは複数のバリアントをコードする核酸配列を含み、該バリアントは、最大でも25個のアミノ酸改変、例えば20個、例えば最大でも15、14、13、12、もしくは11個のアミノ酸改変、例えば10、9、8、7、6、5、4、3、2、もしくは1個のアミノ酸改変、例えば欠失もしくは挿入、好ましくは置換、例えば保存的置換もしくは非保存的置換、または、該配列のいずれかに対して少なくとも80％の同一性、上述のアミノ酸配列のいずれかに対して例えば少なくとも85％の同一性もしくは90％の同一性もしくは95％の同一性、例えば96％の同一性もしくは97％の同一性もしくは98％の同一性もしくは99％の同一性を有する。本発明はまた、上述の核酸配列とは異なるが、遺伝コードの変動により本発明の抗体と同じアミノ酸配列をコードする核酸配列にも関する。例えば、核酸配列は、変動し得るが、本明細書に記載されるいずれかのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を結果として生じ得る。遺伝コードに基づいて、そのようなさらなる核酸配列を特定する方法は、当業者に周知である。
さらなる態様において、発現ベクターは、さらに、抗体、例えばヒトIgG1,κモノクローナル抗体の軽鎖、重鎖、または軽鎖および重鎖の両方の定常領域をコードする核酸配列を含む。
上記のような発現ベクターは、本発明の抗体の組み換え産生のために使用され得る。
本発明の文脈における発現ベクターは、染色体、非染色体、および合成核酸ベクター（発現制御エレメントの適しているセットを含む核酸配列）を含む、任意の適しているベクターであり得る。そのようなベクターの例は、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAとの組み合わせに由来するベクター、ならびにウイルス核酸（RNAまたはDNA）ベクターを含む。1つの態様において、抗AXL抗体をコードする核酸は、例えば、直鎖状発現エレメント（例として[83]に記載されている）を含む裸のDNAもしくはRNAベクター、コンパクト核酸ベクター（例として[84]および／もしくは[85]に記載されている）、pBR322、pUC19/18、もしくはpUC118/119などのプラスミドベクター、「midge」最小サイズの核酸ベクター（例として[86]に記載されている）中に、または、Cap04沈殿構築物などの沈殿核酸ベクター構築物（例として[87]、[88]、[89]、および[90]に記載されている）として含まれる。そのような核酸ベクターおよびその使用法は、当技術分野において周知である（例として[91]および[92]を参照されたい）。
1つの態様において、ベクターは、細菌細胞における抗AXL抗体の発現に適している。そのようなベクターの例は、BlueScript（Stragagene）、pINベクター（[93]、pETベクター（Novagen, Madison WI）など）のような発現ベクターを含む。
発現ベクターは、またもしくは代替的に、酵母システムにおける発現に適しているベクターであり得る。酵母システムにおける発現に適している任意のベクターが、使用され得る。適しているベクターは、例えば、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGHなどの構成性または誘導性のプロモーターを含むベクター（[94]および[95]に概説されている）を含む。
核酸構築物および／またはベクターはまた、新生ポリペプチド鎖などのポリペプチドを、ペリプラズム腔へまたは細胞培養培地中に標的化することができる、分泌／局在化配列をコードする核酸配列も含み得る。そのような配列は、当技術分野において公知であり、分泌リーダーまたはシグナルペプチド、オルガネラ標的化配列（例えば、核局在化配列、ER保持シグナル、ミトコンドリア移行配列、葉緑体移行配列）、膜局在化／アンカー配列（例えば、輸送停止配列、GPIアンカー配列）などを含む。
本発明の発現ベクターにおいて、抗AXL抗体をコードする核酸は、任意の適しているプロモーター、エンハンサー、および他の発現促進エレメントを含み得るか、またはそれらと関連し得る。そのようなエレメントの例は、強い発現プロモーター（例えば、ヒトCMV IEプロモーター／エンハンサー、ならびにRSV、SV40、SL3-3、MMTV、およびHIV LTRプロモーター）、有効なポリ(A)終結配列、大腸菌（E.coli）におけるプラスミド産物用の複製開始点、選択可能マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または好都合なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）を含む。核酸はまた、CMV IEなどの構成性プロモーターとは対照的に誘導性プロモーターも含み得る（そのような用語が、ある一定の条件下での遺伝子発現の程度の実質的な記述子であることを、当業者は認識するであろう）。
1つの態様において、抗AXL抗体をコードする発現ベクターは、ウイルスベクターを介して、宿主細胞もしくは宿主動物中に位置づけられ得るか、および／または送達され得る。
またさらなる局面において、本発明は、本明細書において定義される本発明の抗AXL抗体、または本明細書において定義される本発明の二重特異性分子を産生する、トランスフェクトーマなどの組み換え真核生物または原核生物の宿主細胞に関する。宿主細胞の例は、酵母、細菌および哺乳動物細胞、例えば、CHOもしくはHEK細胞、またはその誘導体を含む。例えば、1つの態様において、本発明は、本発明の抗AXL抗体の発現をコードする配列を含む、細胞ゲノム中に安定に組み込まれた核酸を含む細胞を提供する。別の態様において、本発明は、本発明の抗AXL抗体の発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または直鎖状発現エレメントなどの組み込まれていない核酸を含む細胞を提供する。
さらなる局面において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面および態様によるベクターを含む宿主細胞に関する。1つの態様において、本明細書に記載される抗AXL抗体は、抗体を産生する組み換え真核生物、原核生物、または微生物の宿主細胞の使用によって提供される。それに応じて、本発明は、組み換え原核生物、組み換え真核生物、または組み換え微生物の宿主細胞などの、組み換え宿主細胞を提供する。宿主細胞の例は、酵母、細菌および哺乳動物の細胞、例えば、CHOまたはHEK-293細胞を含む。例えば、1つの態様において、宿主細胞は、本明細書に記載される抗AXL抗体の発現をコードする配列を含む、細胞ゲノム中に安定に組み込まれた核酸を含む。1つの態様において、宿主細胞は、本明細書に記載される第1または第2のポリペプチドの発現をコードする配列を含む、細胞ゲノム中に安定に組み込まれた核酸を含む。別の態様において、宿主細胞は、本明細書に記載される抗AXL抗体、第1または第2のポリペプチドの発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または直鎖状発現エレメントなどの組み込まれていない核酸を含む。
本明細書において使用される「組み換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）という用語は、発現ベクターがその中に導入されている細胞を指すように意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫もまた指すように意図されることが、理解されるべきである。変異または環境の影響のいずれかにより、ある一定の改変が次の世代において起こり得るため、そのような子孫は、実際のところ親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。組み換え宿主細胞は、例えば、CHO細胞、HEK-293細胞、PER.C6、NSO細胞、およびリンパ球細胞などのトランスフェクトーマ、ならびに大腸菌などの原核生物細胞、ならびに、植物細胞および真菌などの他の真核生物宿主を含む。
本明細書において使用される「トランスフェクトーマ」という用語は、CHO細胞、PER.C6、NS0細胞、HEK-293細胞、植物細胞、または酵母細胞を含む真菌などの、抗体または標的抗原を発現する、組み換え真核生物宿主細胞を含む。
別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体を産生するハイブリドーマに関する。したがって、抗体は、例として表面上に抗原を発現する細胞の形態の、関心対象の抗原、または関心対象の抗原をコードする核酸で免疫化されたマウスから取得されたマウス脾臓B細胞より調製されたハイブリドーマから取得され得る。モノクローナル抗体はまた、免疫化されたヒト、または、ウサギ、ラット、イヌ、霊長類などのような非ヒト哺乳動物の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから取得され得る。
ヒト抗体は、トランスジェニックマウスまたは染色体導入マウス、例えば、マウスシステムではなくヒト免疫システムの一部を保有するHuMAbマウスを用いて生成され得る。HuMAbマウスは、再配列されていないヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ座を、内在性のμおよびκ鎖座を不活性化する標的変異とともに含有する[96]。それに応じて、マウスは、マウスIgMまたはκの発現の低減を呈し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖の導入遺伝子が、クラススイッチおよび体細胞変異を受けて、高親和性ヒトIgG,κモノクローナル抗体を生成する[96]、[97]、[98]、および[99]。HuMAbマウスの調製は、[100]、[101]、[102]、[103]、および[104]に詳細に記載されている。[105]〜[121]もまた、参照されたい。これらのトランスジェニックマウス由来の脾細胞が、周知の技術にしたがってヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成するために使用され得る。
さらに、本発明のヒト抗体または他の種由来の本発明の抗体は、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、哺乳動物ディスプレイ、酵母ディスプレイ、および当技術分野において公知である他の技術を非限定的に含む、ディスプレイタイプの技術を通して特定され得、結果として生じた分子は、親和性成熟などの追加の成熟に、そのような技術が当技術分野において周知であるために供され得る。
したがって、1つの局面において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体を産生するための方法であって、
a）本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による宿主細胞またはハイブリドーマを培養する工程；および
b）培養培地から抗体を精製する工程
を含む方法に関する。
治療適用
別の局面において、本発明は、薬剤としての使用のための、本明細書中のいずれかの局面または態様において定義されるような、本発明の抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲート、またはADCに関する。
本発明の抗AXL抗体は、AXLを発現する細胞が関わる障害の処置または予防において使用することができる。例えば、抗体は、例えばインビトロもしくはエクスビボで培養中の細胞へ、または、例えばインビボでヒト対象へ、AXL発現細胞が関わる障害を処置または予防するために投与され得る。本明細書において使用される際、「対象」という用語は、典型的に、抗AXL抗体またはADCが投与されるヒトである。対象は、例として、AXL機能を調節することによって、または直接的にもしくは間接的にAXL発現細胞を殺傷することによって、矯正または改善され得る障害を有するヒト患者を含み得る。
1つの局面において、本発明は、癌の処置における使用のための、本明細書中のいずれかの局面または態様において定義されるような、本発明の抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲートに関する。
1つの局面において、本発明は、細胞と本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗AXL抗体またはADCとを接触させる工程により、AXL発現細胞においてAXL関連シグナル伝達を調節するための方法を提供する。
1つの態様において、本発明は、細胞と本発明の抗AXL抗体またはADCとを接触させる工程により、AXL発現細胞を殺傷するための方法を提供する。理論に縛られることなく、細胞の表面上のAXL分子の抗体媒介性またはADC媒介性の架橋またはクラスター形成（例えば、FcR発現細胞に結合する、AXLに結合した抗体のFc領域のため）が、細胞のアポトーシスにつながる可能性がある。
1つの態様において、本発明は、細胞と本発明のAXL特異的抗体またはADCとを、ADCCまたはADCPなどのFc依存性細胞応答を誘導することができるエフェクター細胞の存在下で接触させる工程により、AXL発現細胞を殺傷するための方法を提供する。この態様において、抗体は、典型的に完全長であり、例えば、IgG1,κアイソタイプなどの、ADCCまたはADCP応答につながるアイソタイプである。
1つの態様において、本発明は、細胞と本発明のAXL特異的抗体またはADCとを、AXL特異的抗体またはADCのAXL発現細胞の形質膜への結合後に活性化され得、それによりCDCを誘導する、正常ヒト血清中に存在する補体タンパク質などの補体タンパク質の存在下で接触させる工程により、AXL発現細胞を殺傷するための方法を提供する。この態様において、抗体は、典型的に完全長であり、例えば、IgG1,κアイソタイプなどの、補体系の活性化を誘導することができるアイソタイプである。
本発明の抗AXL抗体は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様において記載されるようなADCを用いるADCアプローチにそれらが適するようにする、AXLへの結合時の内部移行を特徴とし得る。
それに応じて、1つの態様において、本発明は、細胞と、抗AXL抗体-リンカー-薬物複合体の特異的（すなわち、切断可能なリンカー）または非特異的（切断不可能なリンカー）なタンパク質分解性切断のために内部移行およびリソソームへの輸送を必要とする本発明のADCとを接触させる工程により、AXL発現細胞を殺傷するための方法を提供する。
1つの態様において、本発明は、例えば、本発明によるAXL特異的抗体またはADCのAXL発現マクロファージ、樹状細胞、またはNK細胞への結合によって、自然免疫応答または適応免疫応答のAXL媒介性制御を干渉するための方法に関する。
別の態様において、本発明は、細胞と本発明のADCとを接触させる工程により、AXL発現細胞を殺傷する方法であって、抗AXL抗体が、例えば、pHの変化または還元条件によって、ひとたびADCが内部移行すると薬物の放出を可能にするリンカーを介して、治療部分に連結されている方法を提供する。適しているリンカー技術は、上記のように、当技術分野において公知である。
別の局面において、本発明は、対象においてAXLを発現する細胞が関わる障害を処置または予防するための方法であって、本発明の抗AXL抗体、二重特異性抗体、またはADCの治療的有効量の、それを必要とする対象への投与を含む方法を提供する。方法は、典型的に、本発明による抗AXL抗体、二重特異性抗体、またはADCを、障害を処置または予防するのに有効な量で対象に投与する工程を含む。
特定の局面において、抗AXL抗体またはADCは、癌を発症するリスクを低減させるため、癌の進行における事象の発生を遅延させるため、または、癌が寛解している際および／もしくは原発腫瘍が外科的に除去されている際に再発のリスクを低減させるために、予防的に投与される。後者の場合、抗AXL抗体を、例えば、手術と関連して（すなわち、前、間、または後に）投与することができる。予防的投与はまた、他の生物学的要因のために存在すると確信される腫瘍の位置を特定することが難しい患者においても、有用であり得る。
いくつかの癌細胞において見出されるような、AXLの過剰発現または異常な発現などの高いAXL発現を有する細胞は、本発明の抗AXL抗体、二重特異性抗体、またはADCにとって特に良好な標的であり、なぜなら、より多くの抗体またはADCが、腫瘍細胞あたりに結合し得るからである。腫瘍組織などの不均質にAXLを発現する組織もまた、本発明の抗AXL抗体、二重特異性抗体、ADC、または抗AXL-ADCにとって適している標的であり得る。したがって、1つの局面において、AXLを発現する細胞が関わる障害は、癌、すなわち、例えば、細胞が固形腫瘍または血液腫瘍由来である障害を含む、AXLを発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする障害などの、腫瘍形成性障害である。AXL発現は、例えば、非小細胞肺癌（NSCLC；[122]）、膵臓癌[123]、食道癌[124]、子宮内膜癌[125]において記載されている。
AXLを発現する例示的な細胞は、したがって、例えば、非小細胞肺癌、膵臓癌、および食道癌由来の細胞などの癌細胞を含む。
1つの局面において、本発明は、本発明による抗体、二重特異性抗体、イムノコンジュゲート、組成物、または薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、癌を処置または予防するための方法を提供する。
1つの態様において、癌は、AXLを発現する固形腫瘍またはAXL発現血液癌である。1つの態様において、血液癌は急性骨髄性白血病（AML）である。1つの態様において、AXLを発現する固形腫瘍は、肺癌または類表皮癌である。
したがって、本発明は、本発明の抗AXL抗体またはADCの治療的有効量の、それを必要とする対象への投与を含む方法に関する。
1つの局面において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体、二重特異性抗体、イムノコンジュゲート、組成物、または薬学的組成物の、それを必要とする個体への投与を含む、AXLを発現する腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法に関する。
1つの局面において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体、二重特異性抗体、イムノコンジュゲート、組成物、または薬学的組成物の、それを必要とする個体への投与を含む、AXLを発現する腫瘍細胞の遊走および／または浸潤を阻害するための方法に関する。
1つの局面において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体、二重特異性抗体、イムノコンジュゲート、組成物、または薬学的組成物の、それを必要とする個体への投与を含む、EGFRもしくはBRAF標的療法などの標的療法に対する、または化学療法剤に対する耐性を阻害するための方法に関する。
1つの局面において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体、二重特異性抗体、イムノコンジュゲート、組成物、または薬学的組成物の、それを必要とする個体への投与を含む、腫瘍関連マクロファージを標的とするかまたは阻害するための方法に関する。
1つの局面において、本発明は、固形腫瘍を処置または予防するための方法であって、本発明の抗AXL抗体またはADCの治療的有効量の、それを必要とする対象への投与を含み、固形腫瘍が、黒色腫、癌腫、肉腫、腺腫、および／または神経膠腫である方法を提供する。1つの態様において、癌は、子宮内膜／子宮頸癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌など）、甲状腺癌、大腸癌、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、食道癌、皮膚癌、悪性黒色腫、および膵臓癌からなる群より選択される。
1つの態様において、癌は、切除不可能である進行性または転移性の膵臓癌などの、膵臓癌である。他の別々のかつ具体的な態様において、癌は、子宮内膜／子宮頸癌、または肺癌である。1つの態様において、癌は甲状腺癌である。1つの態様において、癌は大腸癌である。1つの態様において、癌は腎臓癌である。1つの態様において、卵巣癌である。1つの態様において、癌は、エストロゲン受容体α陰性癌またはエストロゲン受容体α陽性癌などの、乳癌である。1つの態様において、癌は、トリプルネガティブ乳癌（すなわち、エストロゲン受容体について陰性（ER-）、プロゲステロン受容体について陰性（PR-）、およびヒト上皮成長因子受容体2について陰性（HER-）と試験で示された乳癌）である。1つの態様において、癌は食道癌である。1つの態様において、癌は皮膚癌である。1つの態様において、癌は、悪性黒色腫などの黒色腫である。1つの態様において、癌は急性骨髄性白血病（AML）である。1つの態様において、癌は、チロシンキナーゼ阻害剤およびまたはBRAF阻害剤の化学療法に対して耐性である。1つの態様において、癌は、EGFR標的療法に対して耐性である。
1つの局面において、本発明は、AXLの細胞外ドメイン、例えばAXLのIg1様ドメイン、例えばAXLのIg2様ドメイン、例えばAXLのFN1ドメイン、または例えばAXLのFN2ドメインに結合する抗体に関し、該抗体は、薬剤としての使用のためである。
特定の態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、薬剤としての使用のためである。
特定の態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、甲状腺癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、大腸癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、腎臓癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、卵巣癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、乳癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、トリプルネガティブ乳癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、食道癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、皮膚癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、悪性黒色腫などの黒色腫の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、肺癌（例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌（NSCLC）など）の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、急性骨髄性白血病（AML）の処置または予防における使用のためである。
これにより、癌の処置または予防のための態様が提供される。前記態様は、処置の効力または効果を増大させるために、細胞傷害性作用物質にカップリングまたは連結され得る。
本発明の特定の局面において、本明細書に開示される抗体は、例えば、癌の処置または予防のためなどの、薬剤としての使用のためのイムノコンジュゲートを形成するように、アウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）など）などの細胞傷害性作用物質に連結され得る。
1つの局面において、本発明は、AXLに結合し、AXL結合についてリガンドであるGas6と競合しない抗体を含む、イムノコンジュゲートに関する。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、薬剤としての使用のためである。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、甲状腺癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、大腸癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、腎臓癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、卵巣癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、乳癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、トリプルネガティブ乳癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、肺癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、食道癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、悪性黒色腫などの黒色腫の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、肺癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、急性骨髄性白血病の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
これにより、抗体が、イムノコンジュゲートを形成するようにアウリスタチンなどの細胞傷害性作用物質に連結されている態様が提供される。抗体と細胞傷害性作用物質とは、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（mc-vc-PAB）リンカーにより連結され得る。
本発明の追加の局面において、本発明は、AXLの細胞外ドメイン、例えばAXLのIg2様ドメインに結合する抗体に関し、該抗体は、薬剤としての使用のためである。
特定の態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、薬剤としての使用のためである。
特定の態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、甲状腺癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、大腸癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、腎臓癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、卵巣癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、乳癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、トリプルネガティブ乳癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、食道癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、皮膚癌の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、悪性黒色腫などの黒色腫の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、肺癌（例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌など）の処置または予防における使用のためである。
態様において、抗体は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含み、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、急性骨髄性白血病（AML）の処置または予防における使用のためである。
これにより、癌の処置または予防のための態様が提供される。前記態様は、処置の効力または効果を増大させるために、細胞傷害性作用物質とカップリングまたは連結され得る。
本発明の特定の局面において、本明細書に開示される抗体は、例えば、癌の処置または予防のためなどの、薬剤としての使用のためのイムノコンジュゲートを形成するように、アウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）など）などの細胞傷害性作用物質と連結され得る。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、薬剤としての使用のためである。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、癌の処置または予防のためである。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、甲状腺癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、大腸癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、腎臓癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、卵巣癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、乳癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、トリプルネガティブ乳癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、肺癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、食道癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、悪性黒色腫などの黒色腫の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、肺癌の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
1つの態様において、本発明は、VH領域およびVL領域を含む少なくとも1つの結合領域を含む抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、VH領域は、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50の配列を含み、該抗体は、イムノコンジュゲートを形成するようにモノメチルアウリスタチンEに連結されており、該イムノコンジュゲートは、急性骨髄性白血病の処置または予防における使用のためである。その1つの態様において、前記抗体は、リンカーmc-vc-PABによりモノメチルアウリスタチンEに連結されている。
これにより、抗体が、イムノコンジュゲートを形成するようにアウリスタチンなどの細胞傷害性作用物質に連結されている態様が提供される。抗体と細胞傷害性作用物質とは、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（mc-vc-PAB）リンカーにより連結され得る。
ある態様において、抗AXL抗体で処置されるべき患者の選択は、腫瘍細胞を含有する試料などの、試料におけるAXL発現のレベルに基づくか、または、標識された抗AXL抗体または抗体断片、例えば、本発明のものを用いてAXL発現腫瘍を検出することによる。本発明のAXL抗体を用いてAXL発現を判定するための例示的な診断アッセイは、本明細書に記載される。抗AXL抗体またはADCのための効率的な投薬量および投薬レジメンは、処置されるべき疾患または状態に依存し、当業者によって決定され得る。
当技術分野において通常の技能を有する医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定して、処方し得る。これに関連して、薬学的組成物に言及する場合、組成物それ自体を含むように、またはその逆であるようにも理解されるべきである。例えば、医師は、薬学的組成物において使用される抗AXL抗体の用量を、望ましい治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで開始し、望ましい効果が達成されるまで徐々に投薬量を増加させることができる。概して、本発明の薬学的組成物の適している用量は、特定の投薬レジメンにしたがって治療効果を生じるのに有効な最低の用量である、化合物の量となる。そのような有効用量は、概して、上記の要因に依存することになる。
例えば、治療的使用のための「有効量」は、疾患の進行を安定化するその能力によって測定され得る。癌を阻害する化合物の能力は、例えば、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデルシステムにおいて評定され得る。あるいは、組成物のこの特性は、熟練した実践者に知られているインビトロアッセイによって、細胞成長を阻害するか、または細胞傷害性を誘導する化合物の能力を検討することによって評定され得る。治療用化合物の治療的有効量は、対象において、腫瘍サイズを減少させ得るか、またはさもなければ症状を改善し得る。当業者は、そのような量を、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与の経路のような要因に基づいて、決定することができるであろう。
本発明の抗AXL抗体の治療的有効量についての例示的、非限定的な範囲は、約0.1〜100 mg/kg、例えば約0.1〜50 mg/kg、例えば約0.1〜20 mg/kg、例えば約0.1〜10 mg/kg、例として約0.5、例えば約0.3、約1、約3 mg/kg、約5 mg/kg、または約8 mg/kgである。
本発明の抗AXL ADCの治療的有効量についての例示的、非限定的な範囲は、0.02〜100 mg/kg、例えば約0.02〜30 mg/kg、例えば約0.05〜10 mg/kgまたは0.1〜3 mg/kg、例えば約0.5〜2 mg/kgである。
投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であり得、例として、標的の部位の近位に投与され得る。
上記の処置の方法および使用における投薬レジメンは、最適な望ましい応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単一ボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割された用量が経時的に投与されてもよく、または、用量が、治療状況の緊急性によって示されるように、比例して低減または増大されてもよい。
1つの態様において、有効性-安全性ウインドウは、例えば、薬物-抗体比（DAR）を低下させること、および／または抗AXL ADCの非標識抗AXL抗体との混合などにより特異的な毒性を低下させることによって最適化される。
1つの態様において、処置の効力は、治療中に、例えば、あらかじめ定義された時点でモニターされる。1つの態様において、効力は、腫瘍細胞を含有する試料におけるAXLのレベルを測定することによって、疾患区域の可視化によって、または、本明細書にさらに記載される他の診断方法によって、例えば、本発明のAXL特異的抗体に由来する標識抗AXL抗体、断片、またはミニ抗体を例えば用いて、1回または複数のPET-CTスキャンを行うことによって、モニターされ得る。
望ましい場合、薬学的組成物の有効日用量は、任意で、単位剤形において、1日を通して適切な間隔で別々に投与される2、3、4、5、6、またはそれより多い部分用量（sub-dose）として、投与され得る。別の態様において、抗AXL抗体は、いずれかの望ましくない副作用を最小化するために、24時間より長いなどの長期にわたって、ゆっくりとした連続注入により投与される。
本発明の化合物を単独で投与することが可能であるが、上記のような薬学的組成物として化合物を投与することが好ましい。
本発明の抗AXL抗体、二重特異性抗体、またはADCの有効用量はまた、週1回、週2回、または週3回の投与期間を用いて投与され得る。投与期間は、例えば、8週間、12週間、または臨床的進行が確立されるまでに制限され得る。
例えば、1つの態様において、抗AXL抗体、二重特異性抗体、またはADCは、10〜500 mg/m2の間、例えば200〜400 mg/m2の間の週投薬量で、注入により投与される。そのような投与は、例えば、1〜8回、例えば3〜5回、反復され得る。投与は、1〜24時間、例えば1〜12時間の期間にわたって、連続注入により行われ得る。
別の態様において、抗AXL抗体、二重特異性抗体、またはADCは、10〜500 mg/m2の間、例えば50〜200 mg/m2の間の投薬量で、3週間ごとに、注入により投与される。そのような投与は、例えば、1〜8回、例えば3〜5回、反復され得る。投与は、1〜24時間、例えば1〜12時間の期間にわたって、連続注入により行われ得る。
1つの態様において、抗AXL ADCは、約0.1〜10 mg/kg、例えば約1〜3 mg/kgの単一用量として、毎週、または3週間ごとに、12回まで、8回まで、または臨床的進行まで投与される。投与は、1〜24時間、例えば1〜12時間の期間にわたって、連続注入により行われ得る。そのようなレジメンは、必要に応じて1回または複数回、例えば、6か月または12か月後に反復され得る。投薬量は、例として生物学的試料を採取すること、および本発明の抗AXL抗体の抗原結合領域を標的とする抗イディオタイプ抗体を用いることにより、投与時の血中の本発明の化合物の量を測定することによって、決定または調整され得る。
1つの態様において、抗AXL抗体は、維持療法として、例えば、6か月またはそれより長い期間にわたって1週間に1回など、投与される。
非限定的な例として、本発明による処置は、本発明の化合物の日投薬量として、日あたり約0.1〜100 mg/kg、例えば、0.2、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90、または100 mg/kgの量で、処置の開始後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40日目の少なくとも1つ、あるいは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20週目の少なくとも1つ、またはそれらの任意の組み合わせに、24、12、8、6、4、もしくは2時間ごとの単一用量もしくは分割用量、またはそれらの任意の組み合わせを用いて提供され得る。
非経口組成物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、単位剤形において製剤化され得る。本明細書において使用される単位剤形とは、処置されるべき対象のための単位投薬量として適している物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的担体と関連して望ましい治療効果を生じるように算出された、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形についての規格は、（a）活性化合物の独自の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（b）個体における感受性の処置のためにそのような活性化合物を調合する技術分野での固有の限界によって規定され、かつそれらに直接依存する。
診断適用
本発明の抗AXL抗体はまた、本明細書に記載される抗AXL抗体を含む組成物を用いて、診断目的でも使用され得る。それに応じて、本発明は、本明細書に記載される抗AXL抗体を用いた診断方法および組成物を提供する。そのような方法および組成物は、AXL発現細胞が関わる疾患を検出または特定するなどの純粋に診断目的で、ならびに、治療的処置の進捗のモニタリング、疾患進行のモニタリング、処置後の状態の評価、疾患の再発のモニタリング、疾患を発症するリスクの評定などのために使用することができる。
1つの局面において、本発明の抗AXL抗体は、例えば、AXLを発現する細胞が疾患を示すか、または病因に関与している疾患の、患者から取った試料においてAXLのレベルまたはその細胞表面上にAXLを発現する細胞のレベルを検出することによる診断において、エクスビボで使用される。これは、例えば、試験されるべき試料を、任意で対照試料とともに、抗AXL抗体と、AXLに対する抗体の結合を可能にする条件下で接触させることによって達成され得る。複合体形成を、次いで、（例えば、ELISAを用いて）検出することができる。試験試料とともに対照試料を用いる場合は、抗AXL抗体または抗AXL抗体-AXL複合体のレベルを両方の試料において解析し、試験試料における抗AXL抗体または抗AXL抗体-AXL複合体の統計学的に有意なより高いレベルが、対照試料と比較して試験試料においてより高いAXLのレベルを示す。
本発明の抗AXL抗体を使用することができる従来のイムノアッセイの例は、非限定的に、ELISA、RIA、FACSアッセイ、プラズモン共鳴アッセイ、クロマトグラフィーアッセイ、組織の免疫組織化学、ウエスタンブロット、および／または免疫沈降を含む。
それに応じて、1つの態様において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体、二重特異性抗体、イムノコンジュゲート、組成物、または薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、AXL発現細胞の関与または蓄積を特徴とする疾患を診断する方法であって、任意で、抗体が検出可能な標識で標識され、AXL発現細胞の量が疾患と相関するかまたは疾患を示す方法に関する。
1つの態様において、本発明は、試料におけるAXL抗原またはAXLを発現する細胞の存在を検出するための方法であって、
‐試料と本発明の抗AXL抗体とを、試料におけるAXLに対する抗AXL抗体の結合を可能にする条件下で接触させる工程；および
‐複合体が形成されているかどうかを解析する工程
を含む方法に関する。典型的に、試料は生物学的試料である。本文脈において使用される「AXL抗原」という用語は、可溶性および細胞結合性の両方のAXL抗原を指す。
1つの態様において、試料は、AXL抗原および／またはAXLを発現する細胞を含有することが公知であるか、またはその疑いがある組織試料である。例えば、AXL発現のインサイチュ検出は、患者から組織学的標本を取り出すこと、および本発明の抗体をそのような標本に提供することによって遂行され得る。抗体は、標本に抗体を塗布することによって、または重層することによって提供され得、次いで、適している手段を用いて検出される。次いで、検討される組織におけるAXLまたはAXL発現細胞の存在だけではなく、AXLまたはAXL発現細胞の分布もまた決定することが可能である（例えば、癌細胞の広がりを評価する文脈において）。本発明を用いて、当業者は、多種多様の組織学的方法（染色手順など）のいずれかが、そのようなインサイチュ検出を達成するために改変され得ることに、容易に気づくであろう。
上記のアッセイにおいて、抗AXL抗体を、AXLに結合した抗体を検出させるための検出可能な物質で標識することができる。あるいは、結合した（一次）抗AXL抗体は、検出可能な物質で標識され、一次抗体に結合する二次抗体によって検出され得る。さらに、上記のアッセイにおいて、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体または二重特異性抗体を含む診断用組成物が、使用され得る。したがって、1つの局面において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの局面または態様による抗体または二重特異性抗体を含む診断用組成物に関する。
試料におけるAXLのレベルはまた、検出可能な物質で標識されたAXL標準品および非標識抗AXL抗体を利用する競合イムノアッセイによって、概算することもできる。このタイプのアッセイにおいては、生物学的試料、標識AXL標準品、および抗AXL抗体を組み合わせて、非標識抗AXL抗体に結合した標識AXL標準品の量を決定する。生物学的試料におけるAXLの量は、抗AXL抗体に結合した標識AXL標準品の量に反比例する。
インビトロ診断技術において使用される抗AXL抗体、二次抗体、および／またはAXL標準品に適している標識は、非限定的に、種々の酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、および放射活性材料を含む。適している酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを含み；適している補欠分子団複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンを含み；適している蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、およびフィコエリスリンを含み；発光材料の例は、ルミノールを含み；ならびに、適している放射活性材料の例は、125I、131I、35S、および3Hを含む。
1つの局面において、本発明の抗AXL抗体は、腫瘍などのAXL発現組織のインビボ画像化において使用される。インビボの方法について、例えば、(Fab')2、Fab、およびFab'断片などの抗体断片は、その急速な分布動態のために特に有利である。
インビボ画像化は、任意の適している技術によって行うことができる。例えば、99Tc、131I、111In、または他のγ線放出同位体で標識された抗AXL抗体（例えば、断片など）は、典型的に、低エネルギー、高解像度のコリメーターまたは低エネルギーの汎用コリメーターを用いて、γシンチレーションカメラ（例えば、Elscint Apex 409ECT装置）で、腫瘍などのAXL発現組織における抗AXL抗体の蓄積または分布を画像化するために使用され得る。あるいは、89Zr、76Br、18F、または他の陽電子放出放射性核種での標識が、陽電子放出断層撮影法（PET）を用いて腫瘍における抗AXL抗体または抗体断片の分布を画像化するために使用され得る。そのような技術の使用によって取得された画像は、例えば、癌細胞の存在についてのバイオマーカーとしてAXLを用いる文脈において、患者、哺乳動物、または組織におけるAXLの生体内分布を評価するために使用され得る。この技術についての変動は、γカメラ技術を上回って画像化を改善するための磁気共鳴画像化（MRI）の使用を含み得る。従来の免疫シンチグラフィーの方法および原理は、例えば、[126]、[127]、および[128]に記載されている。その上、そのような画像は、またもしくは代替的に、腫瘍を除去するための外科技術についての基礎として働く。さらに、そのようなインビボ画像化技術により、患者が腫瘍を有すると特定されている（他のバイオマーカー、転移などの存在により）が、伝統的な解析技術によっては腫瘍を特定できない状況における、腫瘍の特定および位置確認が可能になり得る。これらの方法のすべてが、本発明の特徴である。
本発明により提供されるインビボ画像化および他の診断方法は、ヒト患者（例えば、事前に癌と診断されていない患者、または癌からの回復／寛解の時期の患者）における微小転移の検出に特に有用である。
1つの態様において、本発明は、本発明の抗AXL抗体が、検出を促進する放射線不透過性作用物質にコンジュゲートされ、コンジュゲート抗体が、例えば血流中への注射によって宿主に投与され、宿主における標識抗体の存在および位置がアッセイされる、インビボ画像化法を提供する。この技術および本明細書において提供される任意の他の診断方法を通して、本発明は、ヒト患者もしくはヒト患者から取った生物学的試料における疾患関連細胞の存在をスクリーニングするため、および／または抗AXL ADC療法の前に抗AXL抗体の分布を評価するための方法を提供する。
画像診断のために、放射性同位元素は、中間官能基を用いることによって直接または間接のいずれかで、抗AXL抗体に結合され得る。有用な中間官能基は、エチレンジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸などのキレーターを含む（例として[129]を参照されたい）。
診断方法は、放射性同位元素および放射線不透過性作用物質に加えて、色素（ビオチン-ストレプトアビジン複合体を有するなど）、コントラスト剤、蛍光化合物または分子、および磁気共鳴画像法（MRI）のための増強剤（例えば、常磁性イオン）（例えば、MRI技術およびMRI増強剤にコンジュゲートされた抗体の調製を記載している[130]を参照されたい）にコンジュゲートされている抗AXL抗体を用いて行われ得る。そのような診断／検出剤は、MRIにおける使用のための作用物質、および蛍光化合物から選択され得る。抗AXL抗体に放射性金属または常磁性イオンを負荷するため、それを、イオンを結合するために非常に多数のキレート基が付着されている長い尾部を有する試薬と反応させることが必要であり得る。そのような尾部は、例えば、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム（polyoxime）、およびこの目的に有用であることが公知である同様の基などのキレート基に結合され得るペンダント基を有する、ポリリジン、多糖類、または別の誘導体化されたもしくは誘導体化可能な鎖などのポリマーであり得る。キレートは、標準的な化学を用いて抗AXL抗体にカップリングされ得る。
したがって、本発明は、抗AXL抗体が、コントラスト剤（磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影法、または超音波コントラスト増強剤用など）、または、例えば、γ、β、α、オージェ電子、または陽電子を放出する同位体であり得る放射性核種にコンジュゲートされている、診断用抗AXL抗体を提供する。
さらなる局面において、本発明は、試料におけるAXL抗原またはAXLを発現する細胞の存在を検出するためのキットであって、
‐本発明の抗AXL抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲートもしくはADC；および
‐キットの使用説明書
を含むキットに関する。
1つの態様において、本発明は、抗AXL抗体、および、抗AXL抗体のAXLに対する結合を検出するための1つまたは複数の試薬を含む容器を含む、癌の診断用キットを提供する。試薬は、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、または他の検出可能なタグを含み得る。試薬はまた、二次抗体もしくは三次抗体、または、可視化され得る産物を産生する酵素反応のための試薬も含み得る。1つの態様において、本発明は、適している容器中の標識または非標識形態における本発明の1つまたは複数の抗AXL抗体、間接アッセイのためのインキュベーション用の試薬、および、標識の性質に応じた、そのようなアッセイにおける検出用の基質または誘導体化剤を含む、診断キットを提供する。対照試薬および使用説明書もまた、含まれ得る。
診断キットはまた、組織試料または宿主におけるAXLの存在の検出用の、コンジュゲート／標識された抗AXL抗体などの抗AXL抗体での使用のために供給され得る。したがって、本発明による抗AXL抗体はまた、例えば、固形腫瘍、リンパ節、または他の組織生検においてAXL発現を検出するために設計された免疫組織化学アッセイにおける一次抗体として、例えば、コンパニオン診断の一部として使用され得る。あるいは、本発明による抗AXL抗体は、AXL発現腫瘍細胞を特定するために、血液、骨髄、細針吸引物、例えばリンパ節吸引物、または腹水においてAXL発現細胞を特定するフローサイトメトリーベースのアッセイまたは免疫組織化学アッセイにおける一次抗体として使用され得る。本発明による抗AXL抗体は、例えば、ELISAベースのアッセイにおいて、可溶性AXLを特定するために使用され得る。本発明による抗AXL抗体は、患者における画像化研究のために使用することができる、コンパニオン診断、例として放射性コンジュゲートとして使用され得る。そのような診断キットにおいて、および本明細書において別の場所に記載される治療的使用のためのキットにおいて、抗AXL抗体は、典型的に、容器中の凍結乾燥形態において、単独で、または標的細胞もしくはペプチドに特異的な追加の抗体とともにのいずれかで、提供され得る。典型的に、トリス、リン酸塩または炭酸塩緩衝剤、安定剤、保存剤、殺生物剤、不活性タンパク質、例えば血清アルブミンなどのような、薬学的に許容される担体（例えば、不活性希釈剤）および／またはその構成要素もまた、含まれ（典型的に、混合のために別々の容器中）、追加の試薬も含まれる（また典型的に、別々の容器中）。ある特定のキットにおいて、典型的に別々の容器中に存在する、AXL特異的Abに結合することができる二次抗体もまた、含まれる。二次抗体は、典型的に、本発明の抗AXL抗体に類似した様式で、標識にコンジュゲートされ、製剤化される。上記および本明細書において別の場所に記載される方法を用いて、抗AXL抗体は、癌／腫瘍細胞のサブセットを定義し、そのような細胞および関連腫瘍組織を特徴決定するために使用され得る。
抗イディオタイプ抗体
さらなる局面において、本発明は、本明細書に記載されるような本発明の抗AXL抗体に結合する抗イディオタイプ抗体に関する。
抗イディオタイプ（Id）抗体とは、抗体の抗原結合部位と概して会合する固有の決定基を認識する抗体である。抗Id抗体は、抗AXLモノクローナル抗体の供給源と同じ種および遺伝子タイプの動物を、それに対して抗Idが調製されるモノクローナル抗体で免疫化することによって調製され得る。免疫化された動物は、典型的に、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Id抗体）を産生することによって、免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識し、応答することができる。そのような抗体は、例として、米国特許第4,699,880号に記載されている。そのような抗体は、本発明のさらなる特徴である。
抗Id抗体はまた、さらに別の動物において免疫応答を誘導し、いわゆる抗抗Id抗体を産生する「免疫原」としても使用され得る。抗抗Id抗体は、抗Id抗体を誘導した元のモノクローナル抗体とエピトープが同一であり得る。したがって、モノクローナル抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることによって、同一特異性の抗体を発現する他のクローンを特定することが可能である。抗Id抗体は、変動し得（それにより抗Id抗体バリアントを産生する）、および／または、本発明のAXL特異的抗体に関して本明細書において別の場所に記載されるものなどの、任意の適している技術によって誘導体化され得る。例えば、モノクローナル抗Id抗体は、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などの担体にカップリングされて、BALB/cマウスを免疫化するために使用され得る。これらのマウス由来の血清は、典型的に、元／親の抗AXL抗体と、同一でない場合は類似した結合特性を有する、抗抗Id抗体を含有することになる。
配列
（表１）
Figure 2020141682
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本発明は、さらに限定すると解釈されるべきではない以下の実施例によって、さらに例証される。
実施例1‐免疫化およびAXL抗体の生成
AXL用の発現構築物
種々の完全長AXLバリアントの発現用の以下のコドン最適化構築物を生成した：ヒト（ホモ・サピエンス）AXL（Genbankアクセッション番号NP_068713.2）、ヒト細胞外ドメイン（ECD）がカニクイザル（マカカ・ファスシクラリス（Macaca fascicularis））AXLのECD（GenbankアクセッションHB387229.1の翻訳；アミノ酸1〜447）で置き換えられたヒト-カニクイザルキメラAXL、ヒトECDがマウス（ハツカネズミ）AXLのECD（GenbankアクセッションNP_033491.2；アミノ酸1〜441）で置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトIg様ドメインI（アミノ酸1〜134、本明細書において「Ig1ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのIg様ドメインIで置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトIg様ドメインII（アミノ酸148〜194、本明細書において「Ig2ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのIg様ドメインIIにより置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトFNIII様ドメインI（アミノ酸227〜329、本明細書において「FN1ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのFNIII様ドメインIで置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトFNIII様ドメインII（アミノ酸340〜444、本明細書において「FN2ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのFNIII様ドメインIIにより置き換えられたヒト-マウスキメラAXL。加えて、種々のAXL ECDバリアント用の以下のコドン最適化構築物を生成した：C末端Hisタグを有するヒトAXLの細胞外ドメイン（ECD）（アミノ酸1〜447）（AXLECDHis）、N末端シグナルペプチドおよびC末端Hisタグを有するヒトAXLのFNIII様ドメインII（アミノ酸327〜447）（AXL-FN2ECDHis）、ならびに、C末端Hisタグを有するヒトAXLのIg1様ドメインおよびIg2様ドメイン（アミノ酸1〜227）（AXL-Ig12ECDHis）。
構築物は、クローニングに適している制限酵素部位および最適コザック（GCCGCCACC）配列を含有した[141]。構築物を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.3（Invitrogen）にクローニングした。
EL4細胞におけるAXL発現
EL4細胞に、完全ヒトAXLコード配列を含有するpcDNA3.3ベクターを安定にトランスフェクトして、抗生剤G418（Geneticin）での選択後に、安定なクローンを選択した。
Hisタグ付加AXLの精製
AXLECDHis、AXL-FN2ECDHis、およびAXL-Ig12ECDHisを、HEK-293F細胞において発現させた。Hisタグにより、固定化金属親和性クロマトグラフィーでの精製が可能になる。このプロセスにおいて、クロマトグラフィー樹脂上に固定されたキレーターは、Co2+カチオンを充填している。Hisタグ付加タンパク質を含有する上清を、バッチモード（すなわち、溶液）において樹脂とインキュベートした。Hisタグ付加タンパク質は、樹脂ビーズに強く結合し、他方、培養上清中に存在する他のタンパク質は結合しないか、またはHisタグ付加タンパク質と比較して弱く結合する。インキュベーション後に、ビーズを上清から回収して、カラム中に詰める。弱く結合したタンパク質を除去するために、カラムを洗浄する。次いで、強く結合したHisタグ付加タンパク質を、Co2+に対するHisの結合と競合するイミダゾールを含有する緩衝液で溶出する。脱塩カラム上の緩衝液交換により、溶出剤をタンパク質から除去する。
免疫化
抗体IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-183、IgG1-AXL-613、およびIgG1-AXL-726は、以下の免疫化に由来した：20μgのAXLECDHisタンパク質（IgG1-AXL-511、IgG1-AXL-613、IgG1-AXL-183）、20μg AXL-FN2ECDHISプラス20μg AXL-Ig12ECDHis（IgG1-AXL-726）、または20μg AXL-Ig12ECDHis（IgG1-AXL-107）で腹腔内に（IP）、および同じタンパク質で皮下に（SC；尾の基部）、14日の間隔で交互に免疫化したHCo12-BalbC（IgG1-AXL-107）、HCo17-BalbC（IgG1-AXL-183、IgG1-AXL-726）、およびHCo20（IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-613）トランスジェニックマウス（Medarex, San Jose, CA, USA）。合計で8回の免疫化：4回のIP免疫化および4回のSC免疫化を行った。大部分の免疫化について、最初の免疫化は、完全フロイントアジュバント（CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）において行い、すべてのその後の免疫化は、不完全フロイントアジュバント（IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）において行った。抗体IgG1-AXL-183は、Sigmaアジュバントシステム（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）においてすべて行った免疫化に由来した。
抗体IgG1-AXL-137、IgG1-AXL-148、IgG1-AXL-154、IgG1-AXL-171、およびIgG1-AXL-733は、以下の免疫化に由来した： HCo12-BalbC（IgG1-AXL-137、IgG1-AXL-148）、HCo17-BalbC（IgG1-AXL-154、IgG1-AXL-733）、およびHCo20-BalbC（IgG1-AXL-171）トランスジェニックマウス（Medarex, San Jose, CA, USA）を、CFA中の20μgのAXLECDHisタンパク質で免疫化した。その後、マウスを、PBS中の完全長ヒトAXLをトランスフェクトしたEL4細胞で腹腔内に（IP）、およびIFA中のAXLECDHisタンパク質で皮下に（SC；尾の基部）、14日の間隔で交互に免疫化した。
下記のような抗原特異的スクリーニングFMATアッセイにおいて検出された、200（1/200の血清希釈）またはそれより高い、少なくとも2回の連続したAXL特異的抗体タイターを有するマウスを、融合の3〜4日前に追加免疫した（PBS中の10μgのAXL由来タンパク質を静脈内に注射した）。
均質抗原特異的スクリーニングアッセイ
免疫化マウスの血清中、またはHuMab（ヒトモノクローナル抗体）ハイブリドーマもしくはトランスフェクトーマの培養上清中の抗AXL抗体の存在を、Fluorometric Micro volume Assay Technology（FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いた均質抗原特異的スクリーニングアッセイによって判定した。このために、4細胞ベースアッセイまたは8細胞ベースアッセイのいずれかの組み合わせを有する、2つの異なる試験設計を使用した。
4細胞ベースアッセイ試験設計を、免疫化マウス由来の血清の試験のために、および、ハイブリドーマまたはトランスフェクトーマの培養上清用の一次スクリーニング試験として使用した。4アッセイ試験設計においては、試料を、それぞれ、A431（DSMZ）およびMDA-MB-231細胞（両方とも細胞表面にAXLを発現する）に対するヒト抗体の結合、ならびに、TH1021-AXL（完全長ヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞；上記のように産生される）およびHEK293野生型細胞（AXLを発現しない陰性対照）に対する結合について解析した。
ハイブリドーマまたはトランスフェクトーマの培養上清試料を、追加的に、8細胞ベースアッセイ試験設計に供した。8アッセイ試験設計においては、試料を、それぞれ、TH1021-hAXL（ヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-cAXL（ヒトECDがカニクイザルAXLのECDで置き換えられているヒト-カニクイザルAXLキメラを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-mAXL（ヒトECDがマウスAXLのECDで置き換えられているヒト-マウスAXLキメラを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-mIg1（マウスAXLのIg様ドメインIにより置き換えられているIg様ドメインIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-mIg2（マウスAXLのIg様ドメインIIにより置き換えられているIg様ドメインIIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-mFN1（マウスAXLのFNIII様ドメインIにより置き換えられているFNIII様ドメインIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞）、TH1021-mFN2（マウスAXLのFNIII様ドメインIIにより置き換えられているFNIII様ドメインIIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK-293F細胞）、およびHEK293野生型細胞（AXLを発現しない陰性対照）に対するヒト抗体の結合について解析した。
試料を、細胞に添加して、AXLに結合させた。その後、HuMabの結合を、蛍光コンジュゲート（ヤギ抗ヒトIgG Fcγ-DyLight649；Jackson ImmunoResearch）を用いて検出した。AXL特異的なヒト化マウス抗体A0704P（HEK-293F細胞において産生）を陽性対照として使用し、HuMabマウスのプールした血清およびChromPureヒトIgG、全分子（Jackson ImmunoResearch）を、それぞれ、陰性対照として使用した。試料を、Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System（8200 CDS）を用いてスキャンし、平均蛍光を読み取り値として使用した。カウントが50よりも高く、カウント×蛍光が陰性対照より少なくとも3倍高かった場合に、試料を陽性と述べた。
HuMabハイブリドーマの生成
十分な抗原特異的タイターが生じたHuMabマウス（上記）を屠殺して、脾臓、ならびに腹部大動脈および大静脈に隣接したリンパ節を収集した。脾細胞およびリンパ節細胞のマウス骨髄腫細胞株（SP2.0細胞）への融合を、CytoPulse CEEF 50 Electrofusion System（Cellectis, Paris, フランス）を用いた電気融合により、本質的に製造業者の説明書にしたがって行った。次に、初代ウェルを、ClonePix システム（Genetix, Hampshire, UK）を用いてサブクローニングした。この目的で、特異的な初代ウェルハイブリドーマを、40％ CloneMedia（Genetix, Hampshire, UK）および60％ HyQ 2×完全培地（Hyclone, Waltham, USA）から作製した半固体培地に播種した。サブクローンを、上記のような抗原特異的結合アッセイにしたがって再試験し、IsoCyteシステム（Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA）を用いてスキャンした。さらなる拡大用に、初代ウェルあたり最良の産生クローンを選択するために、Octet（Fortebio, Menlo Park, USA）を用いてIgGレベルを測定した。結果として生じたHuMabハイブリドーマのさらなる拡大および培養を、標準的なプロトコル（例えば、Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006に記載されている）に基づいて行った。このプロセスに由来するクローンを、PC1021と称した。
精製抗体の質量分析
6ウェルまたはHyperflask段階由来の、抗体を含有するハイブリドーマ上清の小さな0.8 mlアリコートを、Sciclone ALH 3000ワークステーション（Caliper Lifesciences, Hopkinton, USA）上で、プロテインG樹脂を含有するPhyTipカラム（PhyNexus Inc., San Jose, USA）を用いて精製した。PhyTipカラムは、製造業者の説明書にしたがって使用したが、緩衝液を、結合緩衝液PBS（B. Braun, Medical B.V., Oss, オランダ）および溶出緩衝液0.1Mグリシン-HCl pH 2.7（Fluka Riedel-de Haen, Buchs, ドイツ）により置き換えた。精製後に、試料を、2Mトリス-HCl pH 9.0（Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, オランダ）で中和した。あるいは、いくつかの場合、より大きい体積の培養上清を、プロテインA親和性カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
精製後に、試料を、384ウェルプレート（Waters, 100μl正方形ウェルプレート, パート番号186002631）中に置いた。試料を、37℃で一晩、N-グリコシダーゼFで脱グリコシル化した。DTT（15 mg/ml）を添加（1μl/ウェル）し、37℃で1時間インキュベートした。試料（5または6μl）を、BEH300 C18, 1.7μm, 2.1×50 mmカラムを有するAcquity UPLC（商標）（Waters, Milford, USA）上で、60℃で脱塩した。両方とも0.1％ギ酸（Fluka, カタログ番号56302, Buchs, ドイツ）を含むMQ水およびLC-MSグレードのアセトニトリル（Biosolve, カタログ番号01204101, Valkenswaard, オランダ）を、それぞれ溶出液AおよびBとして使用した。飛行時間型エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを、陽イオンモードで作動するmicrOTOF（商標）質量分析計（Bruker, Bremen, ドイツ）上で、オンラインで記録した。解析の前に、900-3000 m/zスケールを、ESチューニングミックス（Agilent Technologies, Santa Clara, USA）で較正した。質量スペクトルを、5〜80 kDaの間の分子量について探索する最大エントロピーアルゴリズムを用いたDataAnalysis（商標）ソフトウェアv. 3.4（Bruker）でデコンボリューションした。
デコンボリューション後に、すべての試料について結果として生じた重鎖および軽鎖の質量（還元条件下）を、重複する抗体を見出すために比較した。重鎖の比較においては、C末端リジンバリアントの可能性のある存在を考慮に入れた。これにより、固有の抗体の一覧表が結果としてもたらされ、ここで固有とは重鎖および軽鎖の固有の組み合わせとして定義される。重複する抗体が見出された場合には、他の試験由来の結果を使用して、どの抗体が実験を継続するのに最良の材料であるかを決定した。
AXL抗体可変ドメインの配列解析および発現ベクターにおけるクローニング
全RNAを0.2〜5×106個のハイブリドーマ細胞から調製して、5'-RACE-相補DNA（cDNA）を、SMART RACE cDNA Amplificationキット（Clontech）を用い、製造業者の説明書にしたがって100 ng全RNAから調製した。VHおよびVLをコードする領域を、PCRにより増幅し、ライゲーション非依存性クローニング（Aslanidis, C. and P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990;18(20): 6069-74）によってpG1fおよびpKappa発現ベクターにインフレームで直接クローニングした。各抗体について、12種のVLクローンおよび12種のVHクローンを配列決定した。結果として生じた配列を、表1に示す。CDR配列を、IMGT[22]および[23]にしたがって定義した。正確なオープンリーディングフレーム（ORF）を有するクローンを、さらなる研究および発現のために選択した。見出された重鎖および軽鎖のすべての組み合わせのベクターを、293fectinを用いてFreestyle 商標 293-F細胞に、一過性に共発現させた。
抗体IgG1-AXL-154、IgG1-AXL-183、およびIgG1-AXL-726について、可変ドメイン中に点変異を有する以下のバリアントを生成した：IgG1-AXL-154-M103L、IgG1-AXL-183-N52Q、およびIgG1-AXL-726-M101L。変異体は、Quickchange II変異導入キット（Stratagene）を用いた部位特異的変異導入によって生成した。
AXL対照抗体
実施例のいくつかにおいて、 [142]および[143]に以前に記載されている、AXLに対する比較抗体（IgG1-YW327.6S2）を使用した。これらのAXL特異的抗体のVHおよびVLの配列を、pG1fおよびpKappa発現ベクター中にクローニングした。
b12抗体
実施例のいくつかにおいて、gp120特異的抗体である抗体b12[144]を、陰性対照として使用した。
発現
抗体を、IgG1,κとして発現させた。抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするプラスミドDNA混合物を、293fectin（Invitrogen, US）を用いてFreestyle HEK293F細胞（Invitrogen, US）に、本質的に製造業者により記載されているように、一過性にトランスフェクトした。
抗体の精製
培養上清を、0.2μmデッドエンドフィルターを通して濾過し、5 mL MabSelect SuReカラム（GE Health Care）上にロードして、0.1 M酢酸ナトリウム-NaOH、pH 3で溶出した。溶出液を、直ちに2Mトリス-HCl、pH 9で中和し、12.6 mM NaH2PO4、140 mM NaCl、pH 7.4（B.Braun）に対して一晩透析した。あるいは、精製に続いて、溶出液をHiPrep脱塩カラム上にロードして、抗体を12.6 mM NaH2PO4、140 mM NaCl、pH 7.4（B.Braun）緩衝液中に交換した。透析または緩衝液の交換の後、試料を、0.2μmデッドエンドフィルターを通して滅菌濾過した。純度をSDS-PAGEにより判定し、IgG濃度をOctet（Fortebio, Menlo Park, USA）を用いて測定した。精製抗体は、4℃で保存した。
抗体IgG1-AXL-511を、以下の方法により生成した。
AXL用の発現構築物
種々の完全長AXLバリアントの発現用の以下のコドン最適化構築物を生成した：ヒト（ホモ・サピエンス）AXL（Genbankアクセッション番号NP_068713.2）、ヒト細胞外ドメイン（ECD）がカニクイザル（マカカ・ファスシクラリス）AXLのECD（GenbankアクセッションHB387229.1の翻訳；アミノ酸1〜447）で置き換えられたヒト-カニクイザルキメラAXL、ヒトECDがマウス（ハツカネズミ）AXLのECD（GenbankアクセッションNP_033491.2；アミノ酸1〜441）で置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトIg様ドメインI（アミノ酸1〜147、本明細書において「Ig1ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのIg様ドメインIで置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトIg様ドメインII（アミノ酸148〜227、本明細書において「Ig2ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのIg様ドメインIIにより置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトFNIII様ドメインI（アミノ酸228〜326、本明細書において「FN1ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのFNIII様ドメインIで置き換えられたヒト-マウスキメラAXL、ヒトFNIII様ドメインII（アミノ酸327〜447、本明細書において「FN2ドメイン」とも呼ばれる）がマウスAXLのFNIII様ドメインIIにより置き換えられたヒト-マウスキメラAXL。加えて、種々のAXL ECDバリアント用の以下のコドン最適化構築物を生成した：C末端Hisタグを有するヒトAXLの細胞外ドメイン（ECD）（アミノ酸1〜447）（AXLECDHis）、N末端シグナルペプチドおよびC末端Hisタグを有するヒトAXLのFNIII様ドメインII（アミノ酸327〜447）（AXL-FN2ECDHis）、ならびに、C末端Hisタグを有するヒトAXLのIg1様ドメインおよびIg2様ドメイン（アミノ酸1〜227）（AXL-Ig12ECDHis）。
構築物は、クローニングに適している制限酵素部位および最適コザック（GCCGCCACC）配列を含有した（Kozak et al. (1999) Gene 234: 187-208）。構築物を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.3（Invitrogen）にクローニングした。
EL4細胞におけるAXL発現
EL4細胞に、完全長ヒトAXLコード配列を含有するpcDNA3.3ベクターを安定にトランスフェクトして、抗生剤G418（Geneticin）での選択後に、安定なクローンを選択した。
Hisタグ付加AXLの精製
AXLECDHis、AXL-FN2ECDHis、およびAXL-Ig12ECDHisを、HEK293F細胞において発現させ、固定化金属親和性クロマトグラフィーで精製した。
免疫化
ヒト抗体遺伝子配列を発現する4種のトランスジェニックマウス由来の材料を、抗体を選択するために使用した。種々の免疫化プロトコルで免疫化して、種々の抗体応答を有し、伝統的なハイブリドーマプロセスから種々の数の抗体を生じるマウスを選択した。マウスA（ハイブリドーマプロセスにおいて3.5％のヒット）は、HCo17-BALB/cトランスジェニックマウス（Bristol-Myers Squibb, Redwood City, CA, USA）であり、20μg AXL-FN2ECDHISプラス20μg AXL-Ig12ECDHisで腹腔内に（IP）、および同じタンパク質で皮下に（SC；尾の基部）、14日の間隔で交互に免疫化した。合計で8回の免疫化：4回のIP免疫化および4回のSC免疫化を行った。大部分の免疫化について、最初の免疫化は、完全フロイントアジュバント（CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）において行い、すべてのその後の免疫化は、不完全フロイントアジュバント（IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）において行った。マウスB（ハイブリドーマプロセスにおいて0％のヒット）は、マウスAと同様の免疫化プロトコルを用いて、20μgのAXLECDHisタンパク質で免疫化したHCo12トランスジェニックマウス（Medarex）であった。マウスC（ハイブリドーマプロセスにおいて38％のヒット）は、PBS中の完全長ヒトAXLをトランスフェクトしたEL4細胞で腹腔内に（IP）、およびIFA中のAXLECDHisタンパク質で皮下に（SC；尾の基部）、14日の間隔で交互に免疫化したHCo12-BALB/cマウスであった。マウスD（ハイブリドーマプロセスにおいて0％のヒット）は、マウスAと同様の免疫化プロトコルを用いて、20μgのAXL-Ig12ECDHisタンパク質で免疫化したHCo12トランスジェニックマウス（Medarex）であった。
200（1/200の血清希釈）またはそれより高い、少なくとも2回の連続したAXL特異的抗体タイターを有するマウスを、融合の3〜4日前に追加免疫した（PBS中の10μgのAXL由来タンパク質を静脈内に注射した）。
脾臓細胞からのRNAの単離
全RNAを、Mini RNA easyキット（Qiagen）を用いて脾臓細胞から単離した。5'-RACE用のファーストストランドcDNAを、150 ngのRNAを用い、SMART RACE cDNA Amplificationキット（Clontech, Mountain View, CA, USA）、PrimeScript Reverse Transcriptase（Clontech）、ならびにプライマーとしてSMART IIAオリゴおよびオリゴdTを用いて合成した。VLをコードする領域を、Advantage 2ポリメラーゼ（Clontech）、プライマーRACEkLIC4短FW2（320 nM）、RACEkLIC4長FW2（80 nM）、およびRACEkLICRV_PmlA3（400 nM）を用い、95℃で30秒、および68℃で1分の35サイクルを行うPCRによって増幅した。VHをコードする領域を、Pfu Ultra II Fusion HS DNAポリメラーゼ（Stratagene）、プライマーRACEG1LIC3短FW（320 nM）、RACEG1LIC3長FW（80 nM）、およびRACEG1LIC3RV2（400 nM）を用い、95℃で20秒、66℃で20秒、および72℃で30秒の40サイクルを行って、72℃で3分の最終的な伸長工程で終わるPCRによって増幅した。VHまたはVLをコードするPCR産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、期待されるサイズのDNA産物をゲルから切って、Qiagen MiniEluteキットを用いて精製した。PCRによって増幅されたVHおよびVLのコード領域を、哺乳動物発現ベクターである、VH領域用のpG1f（ヒトIgG1定常領域をコードするDNA配列を含有する）およびVL領域用のpKappa（κ軽鎖定常領域をコードするDNA配列を含有する）にインフレームで、大腸菌株DH5αT1R（Life technologies）におけるライゲーション依存性クローニング（Aslanidis, C. and P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990;18(20): 6069-74）によってクローニングし、単一のHCまたはLC発現ベクターを各々含有する単一の細菌コロニーを生じた。
プライマー配列
Figure 2020141682
LEE PCR
直鎖状発現エレメント（LEE）を、CMVプロモーター、HCまたはLCをコードする領域、およびポリAシグナル含有エレメントを含有する断片を発現プラスミドから増幅することによって産生した。このために、Accuprime Taq DNAポリメラーゼ（Life Technologies）、ならびにプライマーCMVPf(Bsal)2およびTkpA(Bsal)rを用いて、94℃で45秒、55℃で30秒、および68℃で2分（LC）または3分（HC）の35サイクルを行い、DNA鋳型としてプラスミドを含有する大腸菌（DH5α株）コロニーの材料を用いて、領域を増幅した。
HEK-293細胞における一過性発現
抗体を、IgG1,κとして発現させた。抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするプラスミドDNA混合物を、本質的にVink, T., et al. (2014) ('A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies', Methods, 65 (1), 5-10)により記載されているように、293fectin（Life technologies）を用いてFreestyle 293-F（HEK293F）細胞（Life technologies, USA）に、一過性にトランスフェクトした。
AbのLEE発現のために、1μlのHC LEE PCR反応混合物、1μlのLC PCR反応混合物、および、1μlの、Vink, T., et al. (2014)に記載されている3種の発現増強プラスミドのミックスを含有する30 ng/μl増強ミックスを混合して、本質的に上に記載されているように、容器として96ウェルプレートを用いて、トランスフェクション試薬として293fectinを用い、製造業者（Life technologies）の説明書にしたがって、100μlの総体積においてHEK293F細胞にトランスフェクトした。
AXLECDHis ELISA
ELISAプレート（Greiner, オランダ）を、100μl／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.5μg/ml AXLECDHisでコーティングし、室温（RT）で16時間インキュベートした。コーティング溶液を除去して、150μl PBSTC（0.1％ tween-20および2％ニワトリ血清を含有するPBS）をウェルに添加し、RTで1時間インキュベートすることによって、ウェルをブロッキングした。プレートを、300μl PBST（0.1％ tween-20を含有するPBS）／ウェルで3回洗浄して、100μlの試験溶液を添加し、その後RTで1時間のインキュベーションを行った。300μlのPBST／ウェルで3回洗浄した後、100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼとカップリングした抗体ヤギ抗ヒトIgG（1/3000に希釈）を添加して、RTで1時間インキュベートした。300μlのPBST／ウェルで3回洗浄した後、100μlのABTS（1mg/ml）溶液を添加し、十分なシグナルが観察されるまでRTでインキュベートして、100μlの2％シュウ酸溶液を添加することによって反応を停止した。96ウェルプレートを、ELISAリーダー上で405 nmで測定した。
多様性スクリーニング
試料を、それぞれ、TH1021-hAXL（ヒトAXLを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-cAXL（ヒトECDがカニクイザルAXLのECDで置き換えられているヒト-カニクイザルAXLキメラを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-mAXL（ヒトECDがマウスAXLのECDで置き換えられているヒト-マウスAXLキメラを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-mIg1（マウスAXLのIg様ドメインIにより置き換えられているIg様ドメインIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-mIg2（マウスAXLのIg様ドメインIIにより置き換えられているIg様ドメインIIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-mFN1（マウスAXLのFNIII様ドメインIにより置き換えられているFNIII様ドメインIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK293F細胞）、TH1021-mFN2（マウスAXLのFNIII様ドメインIIにより置き換えられているFNIII様ドメインIIを有するヒトAXLを一過性に発現するHEK293F細胞）、およびHEK293F細胞（AXLを発現しない陰性対照）に対する抗体の結合について解析した。
LEE発現由来の試料を、細胞に添加して、種々のAXL構築物に結合させた。その後、抗体の結合を、蛍光コンジュゲート（ヤギ抗ヒトIgG Fcγ-DyLight649；Jackson ImmunoResearch）を用いて検出した。試料を、Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System（8200 CDS）を用いてスキャンし、平均蛍光を読み取り値として使用した。カウントが50よりも高く、カウント×蛍光が陰性対照より少なくとも3倍高かった場合に、試料を陽性と述べた。
HCおよびLCプールの提供：
各マウスについて、352種のHC発現ベクターを含有する細菌コロニーおよび384種のLC発現ベクターを含有する細菌コロニーを選んで、LEE PCRにより増幅した。LEE反応物の一部を配列解析した（AGOWA）。妥当なVHインサートを含有する構築物のパーセンテージは、4種のマウスの間で、マウスA（50％）、マウスB（23％）、マウスC（90％）、およびマウスD（14％）と大きく異なっており、上記を参照されたいハイブリドーマプロセスにおいて得られたヒットの変動に似ていた。限定された量の妥当なインサートのみを有するマウスにおけるHCの多様性は、同一のHCの大きな群によって支配されており、マウスBにおいて65/83、およびマウスDにおいて46/49であった。マウスBおよびDについて、固有のHC（マウスBについて9種、マウスDについて4種）を選択した。マウスAおよびCについては選択を行わなかった。
HCとLCプールとの共トランスフェクション
単一のHCをコードするLEEを、96種のLCをコードするLEEのプールと、LEEトランスフェクションプロトコルを用いて共トランスフェクトした。
AXL結合抗体のHC選択
マウスBおよびDについて、単一HCとプールしたLCとのLEE共トランスフェクション由来の上清を、産生された抗体混合物のAXL結合についてAXL ELISAにより解析した。マウスB由来の9種のHCのうち7種が、AXL結合を結果としてもたらし、マウスD由来の4種のHCのうちの4種が、AXL結合を結果としてもたらした。
マウスAおよびCについて、単一HCとプールしたLCとのLEE共トランスフェクション由来の上清を、産生された抗体混合物のAXL結合について多様性スクリーニングにより解析した。このスクリーニングによって、AXLバリアントに対する抗体の結合の喪失を特定することによる、AXL結合HCの特定および大まかなエピトープマッピングの両方が可能になった。マウスAからは、HCのおよそ40％がヒトAXLに結合し、そのうちの大部分は、Ig1またはFNIII-2ドメインのいずれかに対する結合を、これらのドメインがマウス同等物により置き換えられた際に失った。マウスCからは、HCのおよそ70％がヒトAXLに結合し、そのうちの大部分は、Ig1またはIg2ドメインのいずれかに対する結合を、これらのドメインがマウス同等物により置き換えられた際に失った。AXL ELISAまたは多様性スクリーニングにより判定されるような結合、HC配列情報、および多様性スクリーニングにおける特異的なAXLドメインに対する結合の喪失に基づいて、合計で12種の固有のHCを、最良のLCの決定のために選択した。
HCの単一LCとの共トランスフェクション
12種の固有の選択されたHCの各々の単一HC LEEを、対応するマウスのLCプール由来の96種の単一LC LEEと共トランスフェクトした。
AXL結合抗体のLC選択
単一HC/LCの組み合わせのLEE発現の上清を、産生された抗体のAXL結合についてAXL ELISAにより解析した。ELISAの結果およびLC配列情報の両方に基づいて、各HCについて、少なくとも6種のLCが見出され、単一のLCが最良として選択された。マウスがハイブリドーマプロセスにおいて成功していなかった場合でさえ、AXL結合抗体は、4匹全部のマウスから同定された。
抗体511の結合親和性
1つの抗AXL抗体（クローン511）の親和性を判定した。
親和性を、ForteBio OctetRED384上でバイオレイヤー干渉法を用いて判定した。抗ヒトFc Capture（AHC）バイオセンサー（ForteBio, Portsmouth, UK; カタログ番号18-5064）に、1 nmの負荷応答を目標にして、hIgG（1μg/mL）を150秒間負荷した。ベースライン（150秒）後に、AXLECDHis（実施例1に記載されている）の会合（1000秒）および解離（2000秒）を、2倍希釈工程で10μg/mL〜0.16μg/mL（218 nM〜3 nM）の濃度範囲を用いて判定した。算出のために、アミノ酸配列に基づくAXLECDHisの理論的な分子量、すなわち46 kDaを使用した。実験を、1000 rpmで振盪しながら、30℃で、OctetRED384上で実施した。各抗体を、3回の独立した実験において試験した。
データを、別の方法で述べない限り、1000秒の会合時間および1000秒の解離時間での1:1モデルおよびグローバルフルフィットを用いて、ForteBio Data Analysis Software v7.0.3.1で解析した。（獲得された2000秒の解離時間の代わりに）1000秒の解離時間を、これがより良好なフィットを結果としてもたらしたために使用した。データ追跡を、参照曲線（AXLECDHisを含まない抗体）を引くことによって補正し、Y軸をベースラインの最後の5秒に整列させ、工程間（interstep）補正およびサビツキー・ゴーレイ（Savitzky-Golay）フィルタリングを適用した。
クローン511のAXLに対する親和性（KD）は、23*10-9M（kオン 1.7*105 1/Msおよび3.9*10-3 1/sのk解離）であった。
デュオスタチン-3合成
化合物3の調製：
Figure 2020141682
30 mLの塩化メチレン（DCM）中のBoc-L-フェニルアラニン1（5.36 g、20.2 mmol）の溶液に、カルボニルジイミダゾール（CDI、4.26 g、26.3 mmol）を添加して、1時間撹拌した。次いで、15 mLのDCM中の2（3.67 g、30.3 mmol）および2,4-ジアミノ酪酸（DBU、4.5 mL、30 mmol）の溶液を添加した。混合物を、40℃で16時間加熱した、混合物を、60 mLのDCMおよび40 mLの水で希釈し、次いで、濃HClでpH 7に中和した。DCM抽出物を収集して、0.2M HCl（60 mL）で、次いで塩水（60 mL）で洗浄し、Na2SO4の上で乾燥し、蒸発させて、7.47 gのBoc保護されたスルホンアミドを生み出した。この材料を、40 mLのメタノールに懸濁し、次いで、200 mLの6N HCl／イソプロパノールを添加して、混合物を2時間撹拌した。溶媒を、真空下で蒸発させ、次いで、100 mLのエーテルを添加した。沈殿を、濾過により収集し、乾燥して、化合物3をHCl塩（5.93 g、96％）；MS m/z 269.1（M+H）として生み出した。
化合物5の調製：
Figure 2020141682
10 mLのN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中の化合物4（1.09 g、1.6 mmol）の溶液に、2-(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウラニウムヘキサフルオロホスファート（HATU、0.61 g、1.6 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA、0.56 mL）、および化合物3（0.49 g、1.6 mmol）をその順序で添加した。混合物を1時間撹拌して、100 mLの水および4 mLの酢酸で希釈した。沈殿を、濾過により収集し、真空下で乾燥して、10 mLの4M HCl／ジオキサンに添加した。30分後、200 mLのエーテルを添加して、不溶性沈殿を収集し、HPLCにより精製して、化合物5をテトラヒドロフラン塩（TFA、1.3 g、88％）；MS m/z 835.5 (M+H)として生み出した。化合物5を、本原稿を通してデュオスタチン-3と呼ぶ。
化合物7の調製：
Figure 2020141682
5 mLのDMF中の化合物5（500 mg、0.527 mmol）の溶液に、化合物6（483 mg、0.631 mmol）、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt、40 mg、0.296 mmol）、およびDIEA（0.27 mL）を添加した。混合物を16時間撹拌し、その後、0.4 mLのピペリジンを添加した。1時間後、混合物を100 mLのエーテルで希釈して、沈殿を収集し、乾燥して、化合物7をHCl塩（640 mg、95％）；MS m/z 1240.7 (M+H)として生み出した。
化合物9の調製：
Figure 2020141682
5 mLのDMF中の化合物8（219 mg、0.62 mmol）の溶液に、HATU（236 mg、0.62 mmol）、DIEA（0.15 mL）、および化合物7（316 mg、1.6 mmol）をそれぞれ添加した。1時間後、0.2 mLのピペリジンを添加して、混合物を30分間撹拌し、次いで、HPLCにより精製して、化合物9をTFA塩（235 mg、64％）；MS m/z 1353.8 (M+H)として生み出した。
化合物11の調製：
Figure 2020141682
2 mLのメタノールおよび1 mLの水中の化合物9（235 mg、0.16 mmol）の溶液に、ジアルデヒド10（1.6 mLのiPrOH中0.3M）およびNaCNBH3（180 mg、2.85 mmol）の溶液を添加した。混合物をRTで2時間撹拌し、次いで、HPLCにより精製して、化合物11をTFA塩（126 mg、50％）；MS m/z 1465.8 (M+H)として生じさせた。
AXL特異的抗体-薬物コンジュゲート（ADC）の生成
精製AXL抗体IgG1-AXL-148、IgG1-AXL-183、およびIgG1-AXL-726、ならびに陰性対照抗体IgG1-b12を、K-lock AV1-バリン-シトルリン（vc）リンカーを用いた共有結合性コンジュゲーションを通して、Concortis Biosystems, Inc.（San Diego, CA）によりデュオスタチン-3とコンジュゲートした[58]、[148]、および[149]。
抗AXL抗体薬物コンジュゲートを、その後、濃度（280 nmでの吸光度により）、逆相クロマトグラフィー（RP-HPLC）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）により薬物対抗体の比（「DAR」）、コンジュゲートされていない薬物の量（逆相クロマトグラフィーにより）、凝集のパーセンテージ（サイズ排除クロマトグラフィー、SEC-HPLCにより）、ならびにエンドドキシンレベル（LALにより）について解析した。結果は、以下のようであった（表2）。
（表２）
Figure 2020141682
実施例2‐AXL抗体の結合特性
AXL抗体の結合親和性
9種の抗AXL抗体、ならびに可変ドメイン中に単一のアミノ酸変異を有するこれらの抗体の3種のバリアント（IgG1-AXL-154-M103L、IgG1-AXL-183-N52Q、IgG1-AXL-726-M101L）のパネルの親和性を判定した。
親和性を、ForteBio OctetRED384上でバイオレイヤー干渉法を用いて判定した。抗ヒトFc Capture（AHC）バイオセンサー（ForteBio, Portsmouth, UK；カタログ番号18-5064）に、1 nmの負荷応答を目標にして、hIgG（1μg/mL）を150秒間負荷した。ベースライン（150秒）後に、AXLECDHis（実施例1に記載されている）の会合（1000秒）および解離（2000秒）を、2倍希釈工程で10μg/mL〜0.16μg/mL（218 nM〜3 nM）の濃度範囲を用いて判定した。算出のために、アミノ酸配列に基づくAXLECDHisの理論的な分子量、すなわち46 kDaを使用した。実験を、1000 rpmで振盪しながら30℃で、OctetRED384上で実施した。各抗体を、3回の独立した実験において試験した。
データを、別の方法で述べない限り、1000秒の会合時間および1000秒の解離時間での1:1モデルおよびグローバルフルフィットを用いて、ForteBio Data Analysis Software v7.0.3.1で解析した。（獲得された2000秒の解離時間の代わりに）1000秒の解離時間を、これがより良好なフィットを結果としてもたらしたために使用した。抗体IgG1-AXL-154およびIgG1-AXL-154-M103Lについては、500秒の解離時間を使用した。IgG1-AXL-012およびIgG1-AXL-094については、200秒の解離時間を使用した。データ追跡を、参照曲線（AXLECDHisを含まない抗体）を引くことによって補正し、Y軸をベースラインの最後の5秒に整列させ、工程間補正およびサビツキー-ゴーレイフィルタリングを適用した。
抗AXL抗体の親和性（KD）は、0.3*10-9M〜63*10-9Mの範囲であった（表3）。変異体IgG1-AXL-183-N52Qについて、KDは、およそ2.5倍高い解離速度のために、野生型IgG1-AXL-183よりも低かった。他の2種の変異体の観察された速度論は、野生型IgGの速度論に類似していた。
（表３）
Figure 2020141682
ヒト、マウス、およびカニクイザルAXLに対するAXL抗体の結合
HEK293T細胞に、完全長ヒトAXL、カニクイザル細胞外ドメイン（ECD）を有するヒトAXL、またはマウスECDを有するヒトAXL用の発現構築物を一過性にトランスフェクトした（実施例1を参照されたい）。これらの細胞に対するHuMab-AXL抗体の結合を、フローサイトメトリーにより評定した。トランスフェクトしたHEK293細胞を、AXL抗体の連続希釈液（最終濃度範囲0.0024〜10μg/mL）と4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で1/100に希釈したR-フィコエリスリン(PE)コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA；カタログ番号109-116-098）とインキュベートした（最終体積100μL）。次に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。
結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用し、非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
図1Aは、HuMab-AXL抗体が、ヒトAXL-ECDを発現するHEK293細胞に対して用量依存性結合を示したことを示す。さらに、HuMab-AXL抗体は、完全ヒトAXLについてと同じ範囲のEC50値で、カニクイザルECDを有するAXLを認識した（図1B）。対照的に、マウスECDを有するAXLに対するHuMabの結合は低かった（IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-154、IgG1-AXL-154-M103L、IgG1-AXL-733、IgG1-AXL-183、IgG1-AXL-183-N52Q）か、または検出可能でなかった（IgG1-AXL-171、IgG1-AXL-613、IgG1-AXL-726、IgG1-AXL-726-M101L、IgG1-AXL-148；図1C）。期待されたように、陰性対照抗体IgG1-b12は、AXLバリアントのいずれを発現する細胞に対しても結合を示さなかった（図1）。表4は、ヒトAXLまたはカニクイザルAXL ECDを有するヒトAXLに対する抗AXL抗体の結合についてのEC50値および標準偏差（少なくとも3回の実験において決定された）を示す。マウスAXL ECDを有するヒトAXLに対する結合についてのEC50値は、非常に低いか、または欠如している結合のために決定できなかった。
（表４）
Figure 2020141682
AXL結合についてのAXL抗体とGas6との間の競合
AXLリガンドであるGas6が、AXLに対するAXL抗体の結合を干渉するかどうかを試験した。そのために、AXL陽性A431細胞を、10μg/mLの組み換えヒトGas6（R&D Systems, Abingdon, UK；カタログ番号885-GS）と4℃で15分間インキュベートした。その後、AXL抗体の連続希釈液を調製し（最終濃度範囲0.014〜10μg/mL）、細胞に添加して、4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、100μLにおいて二次抗体と4℃で30分間、暗所でインキュベートした。Fc領域に結合する二次抗体として、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で1/100に希釈したR-フィコエリスリン(PE)コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA；カタログ番号109-116-098）を使用した。次に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。
あるいは、AXLリガンドであるGas6が、AXL抗体の存在下で依然として結合できるかどうかを評価するために、A431細胞を、10μg/mLのAXL抗体とプレインキュベート（15分、4℃）した。抗体のプレインキュベーション後に、組み換えヒトGas6（R&D Systems, Abingdon, UK；カタログ番号885-GS）の連続希釈液を、0.001〜20μg/mLの最終濃度で細胞に添加して、4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、マウス抗Gas6 IgG2a（R&D Systems；カタログ番号MAB885）と4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、FITC標識ヤギ抗マウスIgG（Dako, Heverlee, ベルギー；カタログ番号F049702）と4℃で30分間、暗所でインキュベートした。次に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。
結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用し、非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
A431細胞をGas6とプレインキュベートした実験（n＝3）において、抗AXL抗体の最大結合値は、Gas6の非存在下での抗体結合に匹敵していた（Gas6プレインキュベーション後の最大結合は、Gas6プレインキュベーションを伴わない結合の90〜108％であった）（表4）。Gas6プレインキュベーションを伴うかまたは伴わないAXL抗体結合についてのEC50値は、同じ範囲であったか、または、Gas6プレインキュベーション後にいくらか増強されていた（表5）。
A431細胞に対する対照AXL抗体YW327.6S2の結合は、Gasを伴わない結合と比較して、Gas6の存在下で大きく低減した。Gas6の存在下でのYW327.6S2の最大結合は、Gas6を伴わない結合の19％であり、A431細胞に対する結合についてのEC50値は、細胞をGas6とプレインキュベートしていた際に21倍高かった。
A431細胞を抗AXL抗体とプレインキュベートした実験において、Gas6結合を評定した（n＝3）。A431細胞に対するGas6の結合は、HuMab-AXL抗体とのプレインキュベーションを伴うかまたは伴わない場合で類似していた。細胞をHuMab（0.34〜0.83μg/mL）とプレインキュベートした際のGas6結合の平均EC50濃度、および最大Gas6結合は、陰性対照抗体b12の存在下でのGas6結合に類似していた（EC50濃度：0.40μg/mL；b12対照抗体の存在下でのGas6結合の95〜115％）。A431細胞に対するGas6の結合は、b12とのプレインキュベーションと比較して、対照AXL抗体YW327.6S2の存在下で大きく低減した（EC50濃度は14倍高かった）。対照抗体YW327.6S2の存在下でのGas6の最大結合は、陰性対照抗体b12の存在下での結合の17％であった。
（表５）
Figure 2020141682
an.a.、適用不可能
*低い結合のためにEC50は精度が低い値である。
実施例3‐抗AXL抗体パネルのエピトープマッピング研究
ヒト-マウスAXLキメラ分子を用いたAXLドメイン特異性の判定
AXL抗体のAXLドメイン特異性を、ヒト-マウスキメラAXL変異体のパネルを用いて判定した。ヒトIg様ドメインI（Ig1）、Ig様ドメインII（Ig2）、ヒトFNIII様ドメインI（FN1）、またはヒトFNIII様ドメインIIドメイン（FN2）のいずれかがそれらのマウスホモログで置き換えられた、5種の異なるキメラAXL分子を生成した。
実施例1に記載されているように、AXLヒト-マウスキメラの発現用の以下のコドン最適化構築物を生成して、HEK293F細胞において発現させた。
Figure 2020141682
Figure 2020141682
実施例2に記載されているように、ヒト-マウスAXLキメラに対する1μg/mL抗AXL抗体の結合を、フローサイトメトリーにより判定した。IgG1-b12を、アイソタイプ対照IgG1として含めた。
すべての抗AXL抗体が、ヒトAXLに対する結合を示した（図2A）のに対して、ヒトAXL ECDがそのマウスホモログで置き換えられた際には、結合は撤廃されたか、または強く低減した（図2B）。ヒト-マウス交差反応性モノクローナルAXL抗体であるYW327.6S2を、hsAXL-mmECDの発現を確認するために含めた。
抗AXL抗体107および613は、hsAXL-mmIg1に対して強く低減した結合を示し（図2C）、AXL Ig1ドメイン中のエピトープの認識が示された。IgG1-AXL-148およびIgG1-AXL-171は、hsAXL-mmIg2に対して強く低減した結合を示し（図2D）、AXL Ig2ドメイン中のエピトープの認識が示された。IgG1-AXL-154、IgG1-AXL-183、およびIgG1-AXL-733は、hsAXL-mmFN1に対して低減した結合を示し（図2E）、AXL FN1ドメイン中の結合エピトープを示した。最後に、IgG1-AXL-726の結合は、hsAXL-mmFN2において失われ（図2F）、FN2ドメイン内のエピトープの認識が示された。
すべての抗AXL抗体についてのAXLドメイン特異性を、表6に要約する。
（表６）
Figure 2020141682
an.d.、未決定
AXL抗体の結合に関与するAXL細胞外ドメイン中のアミノ酸を特定するための高解像度エピトープマッピング
抗AXL抗体の結合に関与するAXL細胞外ドメイン中のアミノ酸を特定するために、細胞外ドメイン中にヒトAXL配列と変動するレベルの相同性を有する種に由来するAXL配列の組み換えによって、AXL配列バリアントのライブラリーを生成した。簡潔に言うと、ヒトAXL（Hs）をコードする発現プラスミドを、ハツカネズミ（Mm）、ハイイロジネズミオポッサム（Monodelphis domestica）（Md；フクロネズミ）、グリーンアノール（Anolis carolinensis）（Ac；トカゲ）、およびミドリフグ（Tetraodon nigroviridis）（Tn；フグ）のAXLホモログをコードするクローニングプラスミドと混合するか、またはその逆を行った。クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかに特異的な2種のプライマーの組み合わせを使用して、PCRサイクリング中に新生DNA複製鎖の融解およびリアニーリングを強要する、伸長時間が省略された、AXL細胞外ドメイン（ECD）を増幅するPCRを行った。両方のベクターから生じた終端を含有する組み換え産物に再び特異的な、ネスティッドPCRを用いて、完全長ECDを増幅した。
結果として生じたAXL ECD PCR産物を、完全長AXLを創り出す発現ベクター中にクローニングし、結果として生じたプラスミドを、配列決定し、鋳型ベクターに対する最大の差によってランク付けし、最大の差別化力を有する最小の集合を創り出すように選択した。Hs、Mm、Md、Ac、およびTn由来のAXLホモログをコードするプラスミド、マウスIg1、Ig2、Fn1、またはFn2ドメインを有するHs AXLをコードする4種のヒト／マウスキメラプラスミド、ならびに組み換えライブラリー由来の16種の最も差別化するプラスミドを、製造業者（Life technologies）により供給された仕様書にしたがって、HEK293-F細胞中にトランスフェクトした。1μg/mLの抗AXL抗体を用いたFACS結合データを、変異が結合の喪失と相関した（+1）か、または相関しなかった（-1）かをアミノ酸あたりでスコア化することによってデコンボリューションし、その後、ベースライン補正および-5〜+5のスケールへの正規化を適用して、完全ECDにわたるアミノ酸あたりのインパクトスコアを結果として生じた。
デコンボリューションした結合データを、結合に関与するアミノ酸として表6に要約する。結合部位の近傍での組み換え事象が欠如していたために、結合部位を高解像度にマップできなかった抗体を、解像されていないとして示す。
実施例4‐Fc媒介性エフェクター機能
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）
A431類表皮癌細胞のADCCを誘導する抗AXL抗体の能力を、下記に説明するように判定した。エフェクター細胞として、健常ボランティア由来の末梢血単核細胞（UMC Utrecht, オランダ）を使用した。
標的細胞の標識
A431細胞を、培養培地（10％ウシ胎児血清（FSC）を補給したRPMI 1640培養培地）中に収集（5×106細胞）して、それに100μCi 51Cr（クロム-51；Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, オランダ）を添加し、混合物を、37℃の水浴において1時間（hr）、振盪しながらインキュベートした。細胞の洗浄（PBS中で2回、1200 rpm、5分）後に、細胞を、RPMI1640/10％ FSC中に再懸濁して、トリパンブルー排除により計数した。細胞を、1×105細胞／mLの密度に希釈した。
エフェクター細胞の調製
末梢血単核細胞（健常ボランティア、UMC Utrecht, Utrecht, オランダ）を、Ficoll（Bio Whittaker；リンパ球分離媒体、カタログ17-829E）により製造業者の説明書にしたがって、45 mLの新しく採取したヘパリン血から単離した。細胞のRPMI1640/10％ FSC中への再懸濁後に、細胞を、トリパンブルー排除により計数し、1×107細胞／mLの密度に希釈した。
ADCCの設定
50μlの51Cr標識標的細胞を、96ウェルプレート中にピペットで移し、RPMI1640/10％ FSC中に希釈した（最終濃度範囲0.01〜10μg/mLの3倍希釈液）50μLの抗体を添加した。細胞をインキュベート（室温（RT）、15分）して、50μlのエフェクター細胞を添加し、100:1のエフェクター対標的比を結果として生じた（最大溶解の決定のために、エフェクター細胞の代わりに100μlの5％ Triton-X100を添加し；自然溶解の決定のために、50μLの標的細胞および100μLのRPMI1640/10％ FSCを使用した）。細胞を、37℃および5％ CO2で一晩インキュベートした。細胞をスピンダウン（1200 rpm、10分）した後、70μLの上清をmicronicチューブ中に採集して、γカウンターにおいてカウントした。特異的溶解のパーセンテージを、以下のように算出した：
特異的溶解％＝（試料のcpm−標的細胞のみのcpm）／（最大溶解のcpm−標的細胞のみのcpm）
式中、cpmは分あたりのカウントである。
IgG1-AXL-183-N52QおよびIgG1-AXL-733は、10μg/mLの濃度でA431細胞において15〜21％のADCCを誘導した（図3）。IgG1-AXL-148、IgG1-AXL-726-M101L、IgG1-AXL-171、IgG1-AXL-613、IgG1-AXL-107、およびIgG1-AXL-154-M103Lは、10μg／mLまでの濃度でA431細胞において有意なADCCを誘導しなかった（図3）。
実施例5‐AXL抗体-薬物コンジュゲート（AXL-ADC）の結合特性
HEK293T細胞に、完全長ヒトAXL用の発現構築物を一過性にトランスフェクトした（実施例1を参照されたい）。これらの細胞に対する抗AXL抗体およびAXL-ADCの結合を、フローサイトメトリーにより評定した。一過性にトランスフェクトしたHEK293細胞を、抗AXL抗体またはAXL-ADCの連続希釈液（4倍希釈液；最終濃度範囲0.003〜10μg/mL）と4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、100μLにおいて二次抗体と4℃で30分間、暗所でインキュベートした。二次抗体としては、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で1/100に希釈したR-フィコエリスリン(PE)コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA；カタログ番号109-116-098）を使用した。次に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。
結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用し、非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
図4は、ヒトAXL-ECDを発現するHEK293細胞に対する抗AXL抗体の結合が、AXL-ADCの結合に類似していたことを示す。
実施例6‐AXL特異的抗体薬物コンジュゲートにより誘導されるインビトロ細胞傷害
LCLC-103H細胞（ヒト大細胞肺癌）細胞を、10％（体積／体積）熱不活化Cosmic Calf Serum（Perbio；カタログ番号SH30087.03）、2 mM L-グルタミン（Cambrex；カタログ番号US17-905C）、50 IU/mLペニシリン、および50μg/mLストレプトマイシン（Cambrex；カタログ番号DE17-603E）を補給した、L-グルタミンを含むRPMI1640（Cambrex；カタログ番号BE12-115F）中で培養した。MDA-MB-231細胞（ヒト乳癌）を、10％（体積／体積）熱不活化Cosmic Calf Serum（Perbio；カタログ番号SH30087.03）、1 mMピルビン酸ナトリウム（Cambrex；カタログ番号BE13-115E）、2 mM L-グルタミン（Cambrex；カタログ番号US17-905C）、100μM MEM NEAA（Invitrogen；カタログ番号11140）、50 IU/mLペニシリン、および50μg/mLストレプトマイシン（Cambrex；カタログ番号DE17-603E）を補給した、DMEM（Cambrex；カタログ番号BE12-709F）中で培養した。細胞株は、37℃で、5％（体積／体積）CO2加湿インキュベーターにおいて維持した。LCLC-103HおよびMDA-MB-231細胞を、コンフルエント近くまで培養し、その後、細胞をトリプシン処理して、培養培地中に再懸濁し、セルストレーナー（BD Falcon、カタログ番号352340）を通過させて、単一細胞懸濁液を取得した。1×103細胞を、96ウェル培養プレートの各ウェルに播種し、細胞を、室温で30分間、その後37℃、5％ CO2で5時間インキュベートして、プレートに接着させた。
AXL抗体薬物コンジュゲート（AXL-ADC；実施例1を参照されたい）の連続希釈液（4倍；0.00015〜10μg/mLの範囲にわたる最終濃度）を培養培地中で調製し、プレートに添加した。細胞と1μMスタウロスポリン（#S6942-200, Sigma）とのインキュベーションを、100％腫瘍細胞殺傷用の参照として使用した。無処置の細胞を、0％腫瘍細胞殺傷用の参照として使用した。プレートを、37℃、5％ CO2で5日間インキュベートした。次に、CellTiter-Glo Reagent（Promega；カタログ番号G7571）をウェルに添加して（ウェルあたり20μL）、プレートを37℃、5％ CO2で1.5時間インキュベートした。その後、ウェルあたり180μLを、白色96ウェルOptiplate（商標）プレート（PerkinElmer, Waltham, MA；カタログ番号6005299）に移して、室温で30分間インキュベートした。最後に、発光を、EnVisionマルチプレートリーダー（Envision, Perkin Elmer）上で測定した。
AXL-ADCであるIgG1-AXL-148-vcDuo3、IgG1-AXL-183-vcDuo3、およびIgG1-AXL-726-vcDuo3は、図5Aに示されるように、0.01〜0.06μg/mLの間のIC50値で、LCLC-103H細胞において細胞傷害を誘導した。同様に、図5Bは、これらのAXL-ADCが、0.005〜0.015μg/mLの間のIC50値でMDA-MB-231細胞の細胞傷害を誘導したことを示す。
実施例7‐AXLに対する結合を可能にする抗体VHおよびVLのバリアント
VHまたはVL領域におけるアミノ酸残基の決定的または許容的な変化を特定するために、（実施例1に記載されている）抗AXL抗体パネルのVHおよびVL領域のタンパク質配列を、整列させて、AXL結合について比較した。そのために、同一のVHまたはVL領域を有する抗体を、グループ化して、それぞれ、ヒトAXLに対する結合およびVLまたはVH配列における差について比較した。HEK-293F細胞により一過性に発現されるヒトAXLに対する結合を、実施例1に記載されているような均質抗原特異的スクリーニングアッセイにおいて評価した。本実施例において行われたアラインメントについてのアミノ酸位置のナンバリングは、図6に提示される配列に基づいて行われ、すなわち、示される配列における1番目のアミノ酸を位置「1」とナンバリングし、2番目を位置「2」とする、などであった。
最初に、同一のVL配列を有する抗体をグループ化した。
IgG1-AXL-148およびIgG1-AXL-140は、同一のVL配列を有することが見出され、HC CDR3領域中に1個のアミノ酸の差を示した（アミノ酸位置109でIに対してF；図6A）。抗体は両方ともヒトAXLに結合して（表7）、位置109のアミノ酸は抗体結合にとって不可欠ではないことが示され、CDR2領域において特定された変異（アミノ酸位置56でAに対してG）は結合の喪失を補償しないことが仮定された（図6A）。
IgG1-AXL-726およびIgG1-AXL-187は、同一のVL配列を有することが見出され、抗体は両方ともヒトAXLに結合した（表7）。HC CDR3領域中の2個のアミノ酸残基の変化（位置97でSに対してR、および位置105でTに対してA；図6B）が、結合を失うことなく可能とされ、CDR1において特定された変異（位置32でHに対してY）および／またはフレームワーク領域において特定された変異（P3Q、V24I、Y25D、T86A、およびT117A）は、結合の喪失を補償しないことが仮定された（図6B）。
IgG1-AXL-171、IgG1-AXL-172、およびIgG1-AXL-181は、同一のVL配列を有することが見出され、すべての抗体はヒトAXLに結合した（表7）。これらの3種の抗体のCDR3領域は同一であったが、HC CDR1中のアミノ酸残基の変化（位置31でNに対してS）またはフレームワーク領域中のアミノ酸残基の変化（位置82でQに対してH）が、結合を失うことなく可能とされた（図6C）。
IgG1-AXL-613、IgG1-AXL-608-01、IgG1-AXL-610-01、およびIgG1-AXL-620-06は、同一のVL配列を有することが見出され、HC CDR3領域中に1個のアミノ酸の差を示した（アミノ酸位置101でDに対してN；図6D）。すべての抗体はヒトAXLに結合して（表7）、位置101のアミノ酸は不可欠ではないことが示され、HC CDR2において特定された変異（位置58でAに対してV）および／またはフレームワーク領域において特定された変異（N35S、M37V、A61V、L70I、S88A）は、結合の喪失を補償しないことが仮定された（図6D）。
次に、同一のVH配列を有する抗体をグループ化した。
IgG1-AXL-613およびIgG1-AXL-613-08は、同一のVH配列を有することが見出され、LCのCDR3領域中に5個のアミノ酸の差を示した（位置92〜96でYGSSYに対してRSNWL；図6E）。抗体は両方ともヒトAXLに結合して（表7）、位置92〜96でのアミノ酸の変動が可能とされ、抗体結合に影響を及ぼさないことが示され、CDR1において特定された変異（位置30でSの欠失）、CDR2において特定された変異（G51D）、および／またはフレームワーク領域において特定された変異（G9A、S54N、R78S、Q100G、L104V）は、結合の喪失を補償しないことが仮定された（図6E）。
（表７）
Figure 2020141682
実施例8‐MMAEコンジュゲートAXL抗体により誘導されるインビトロ細胞傷害
抗AXL抗体へのMMAEのコンジュゲーション
抗AXL抗体を、標準的な手順にしたがってプロテインAクロマトグラフィーにより精製し、vcMMAEにコンジュゲートした。文献に記載されている手順にしたがって（[150]、[151]、および[152]を参照されたい）、薬物-リンカーvcMMAEを、還元された抗体のシステインにアルキル化した。過剰量のN-アセチルシステインの添加によって、反応を終息させた。いずれの残りのコンジュゲートされていない薬物も、精製によって除去し、最終的な抗AXL抗体薬物コンジュゲートを、PBSにおいて製剤化した。抗AXL抗体薬物コンジュゲートを、その後、濃度（280 nmでの吸光度により）、逆相クロマトグラフィー（RP-HPLC）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）により薬物対抗体の比（DAR）、コンジュゲートされていない薬物の量（逆相クロマトグラフィーにより）、凝集のパーセンテージ（サイズ排除クロマトグラフィー、SEC-HPLCにより）、ならびにエンドトキシンレベル（LALにより）について解析した。結果を、下記の表8に示す。
（表８）抗体-薬物コンジュゲートの様々な特性の概要
Figure 2020141682
細胞培養
LCLC-103H細胞（ヒト大細胞肺癌）およびA431細胞（DMSZ, Braunschweig, ドイツ）を、10％（体積／体積）熱不活化Cosmic Calf Serum（Perbio；カタログ番号SH30087.03）、2 mM L-グルタミン（Cambrex；カタログ番号US17-905C）、50 IU/mLペニシリン、および50μg/mLストレプトマイシン（Cambrex；カタログ番号DE17-603E）を補給した、L-グルタミンを含むRPMI1640（Cambrex；カタログ番号BE12-115F）中で培養した。MDA-MB231細胞を、高グルコースおよびHEPESを含むDMEM（Lonza #BE12-709F）、Donor Bovine Serum with Iron（Life Technologies #10371-029）、2 mM L-グルタミン（Lonza #BE17-605E）、1 mMピルビン酸ナトリウム（Lonza #BE13-115E）、およびMEM Non-Essential Amino Acids Solution（Life Technologies #11140）中で培養した。細胞株は、37℃で、5％（体積／体積）CO2加湿インキュベーターにおいて維持した。LCLC-103H、A431、およびMDA-MB231細胞を、コンフルエント近くまで培養し、その後、細胞をトリプシン処理して、培養培地中に再懸濁し、セルストレーナー（BD Falcon、カタログ番号352340）を通過させて、単一細胞懸濁液を取得した。1×103細胞を、96ウェル培養プレートの各ウェルに播種し、細胞を、室温で30分間、その後37℃、5％ CO2で5時間インキュベートして、プレートに接着させた。
細胞傷害アッセイ
MMAEコンジュゲートAXL抗体の連続希釈液（0.00015〜10μg/mLの範囲にわたる最終濃度）を培養培地中で調製し、プレートに添加した。細胞と1μMスタウロスポリン（#S6942-200, Sigma）とのインキュベーションを、100％腫瘍細胞殺傷用の参照として使用した。無処置の細胞を、100％細胞成長用の参照として使用した。プレートを、37℃、5％ CO2で5日間インキュベートした。次に、CellTiter-Glo Reagent（Promega；カタログ番号G7571）をウェルに添加して（ウェルあたり20μL）、プレートを37℃、5％ CO2で1.5時間インキュベートした。その後、ウェルあたり180μLを、白色96ウェルOptiplate（商標）プレート（PerkinElmer, Waltham, MA；カタログ番号6005299）に移して、室温で30分間インキュベートした。最後に、発光を、EnVisionマルチプレートリーダー（Envision, Perkin Elmer）上で測定した。
MMAEコンジュゲートAXL抗体は、表9aおよび図7に示されるように、0.004〜0.219μg/mLの間の濃度で、LCLC-103H細胞において50％細胞殺傷を誘導した。
同様に、AXL-ADCは、A431細胞（表9bおよび図15A）ならびにMDA-MB231細胞（表9bおよび図15B）において細胞傷害を効率的に誘導した。
（表９ａ）LCLC-103H細胞におけるMMAEコンジュゲートAXL抗体の細胞傷害（EC50値）
Figure 2020141682
（表９ｂ）A431およびMDA-MB-231細胞におけるMMAEコンジュゲートAXL抗体の細胞傷害（EC50値）
Figure 2020141682
実施例9‐SCIDマウスにおけるLCLC-103H腫瘍異種移植片のMMAEコンジュゲート抗AXL抗体での治療的処置
MMAEコンジュゲート抗AXL抗体のインビボ効力を、確立されたSCIDマウスにおける皮下（SC）LCLC-103H異種移植腫瘍において判定した。200μL PBS中の5×106個のLCLC-103H（大細胞肺癌）腫瘍細胞（Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)から取得）を、雌SCIDマウスの右側腹部の皮下に注射した。平均腫瘍サイズが100〜200 mm3よりも大きく、明瞭な腫瘍成長が観察された、腫瘍細胞接種の14〜21日後に開始して、1 mg/kg（20μg／マウス）のIgG1-AXL-vcMMAE抗体（補足的な実施例1に記載されている）または対照（コンジュゲートされていないIgG1-b12）での単回注射を、腹腔内に与えた（100μL／マウス）。腫瘍体積を、少なくとも週あたり2回判定した。腫瘍体積（mm3）を、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
抗AXL-vcMMAE抗体のパネルは、確立されたSC LCLC-103H腫瘍において広範囲の抗腫瘍活性を示した（図8）。クローンIgG1-AXL-733-vcMMAE、IgG1-AXL-107-vcMMAE、およびIgG1-AXL-148-vcMMAEは、腫瘍退縮を誘導し、クローンAXL-171-vcMMAE、IgG1-AXL-511-vcMMAE、およびIgG1-AXL-613-vcMMAEは、腫瘍成長阻害を誘導し、クローンIgG1-AXL-154-M103L-vcMMAE、IgG1-AXL-183-N52Q-vcMMAE、およびIgG1-AXL-726-M101L-vcMMAEは、腫瘍成長阻害を示さなかったか、または軽微の腫瘍成長阻害のみを示した。
一元配置分散分析（対照IgG1-b12に対するダネットの多重比較検定）を用いた、すべての群が無傷であった最後の日（30日目）の統計解析により、IgG1-b12対IgG1-AXL-733-vcMMAE、IgG1-AXL-107-vcMMAE、およびIgG1-AXL-148-vcMMAEの間で腫瘍体積における非常に有意な差（p＜0.0001）が示された。これらのクローンでの処置は、これらの群内のいくつかのマウスにおいて、完全な腫瘍低減につながった。クローンIgG1-AXL-171-vcMMAE、IgG1-AXL-511-vcMMAE、およびIgG1-AXL-613-vcMMAEでの処置もまた、IgG1-b12と比較して有意な腫瘍成長阻害を示したが、差はさほど明白ではなかった（p＜0.05〜p＜0.001）。クローンIgG1-AXL-154-M103L-vcMMAE、IgG1-AXL-183-N52Q-vcMMAE、およびIgG1-AXL-726-M101L-vcMMAEで処置したマウスの腫瘍成長は、IgG1-b12対照と比較して有意に影響を受けなかった。
抗AXL-vcMMAE抗体の抗腫瘍活性は、種々の他のインビボ腫瘍モデルにおいて観察された。2種の細胞株由来の異種移植モデル（A431；類表皮腺癌、およびMDA-MB-231；乳癌）において、抗AXL-vcMMAE抗体は腫瘍成長阻害を誘導し、腫瘍退縮が、膵臓癌および子宮頸癌を有する患者からの2種の患者由来の異種移植モデルにおいて、抗AXL-vcMMAE抗体により誘導された。
実施例10‐不均質な標的発現を有する膵臓癌患者由来の異種移植（PDX）モデルにおけるAXL-ADCの抗腫瘍効力
IgG1-AXL-107-vcMMAE、IgG1-AXL-148-vcMMAE、およびIgG1-AXL-733-vcMMAEの抗腫瘍活性を、PAXF1657膵臓癌PDXモデルにおいて判定した（Oncotest, Freiburg, ドイツにより行われた実験）。ヒト膵臓腫瘍組織を、5〜7週齢の雌NMRI nu/nuマウスの左側腹部の皮下に移植した。動物の無作為化を、以下のように行った：50〜250 mm3、好ましくは80〜200 mm3の間の体積の腫瘍を有する動物を、群腫瘍体積の比較可能な中央値および平均値を考慮して、7種の実験群（群あたり8匹の動物）に分配した。無作為化の日（0日目）に、3種のADCを、4 mg/kgまたは2 mg/kgのいずれかで静脈内に（i.v.）投与し、対照群は、単一用量のIgG1-b12（4 mg/kg）を受けた。腫瘍体積（mm3）を、週に2回モニターして、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
PAXF1657腫瘍の染色を、標準的な免疫組織化学技術で行った。簡潔に言うと、凍結組織を、アセトンで10分間固定化し、内在性ペルオキシダーゼを、過酸化水素を用いて消耗させた。その後、組織切片を正常マウス血清でブロッキングし、5μg/mLの、5種のIgG1-AXL抗体（IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-137、IgG1-AXL-148、IgG1-AXL-183、IgG1-AXL-726）のプールとのインキュベーションによって染色を行った。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲートの二次抗体とのインキュベーション後に、HRPを、アミノエチルカルバゾール（AEC；赤色を結果として生じる）で可視化した。各スライドを、核を特定するためにヘマトキシリン（青色）で対比染色し、glycergel中にカバーガラスをかけた。免疫染色した組織切片を、手動Zeiss顕微鏡（AxioSkop）上で10倍および40倍の倍率でデジタル化した。
図9は、PAXF1657腫瘍における不均質なAXL発現を示す。強いAXL染色が、いくつかの腫瘍細胞において観察されるが、他の細胞はAXL染色を示していない。白黒写真において、AXL染色は濃い灰色として見える。ヘマトキシリン染色（核）は、薄い灰色として見える。
図10Aは、2 mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAE、IgG1-AXL-148-vcMMAE、およびIgG1-AXL-733-vcMMAEでのマウスの処置が、対照群と比較して、PAXF1657腫瘍の成長を有意に低減させたことを示す。4 mg/kgの用量で、IgG1-AXL-107-vcMMAE、IgG1-AXL-148-vcMMAE、およびIgG1-AXL-733-vcMMAEは、PAXF1657腫瘍の腫瘍退縮を誘導した。処置後の14日目に、2 mg/kgまたは4 mg/kgのIgG1-AXL-107-MMAE、IgG1-AXL-148-MMAE、またはIgG1-AXL-733-MMAEで処置していたマウスにおける平均腫瘍サイズは、アイソタイプ対照IgG（IgG1-b12）で処置していたマウスにおけるよりも有意に小さかった（p＜0.001；チューキーの多重比較検定）。
コンジュゲートされていないIgG1-AXL-148でのマウスの処置は、PAXF1657モデルにおいて抗腫瘍活性を結果としてもたらさなかった（図10B）。しかし、コンジュゲートされたIgG1-AXL-148-vcMMAEは、このモデルにおいて用量依存性抗腫瘍活性を誘導し（図10B）、AXL-ADCの治療能力はMMAEの細胞傷害活性に依存していることが示された。
さらに、標的化されていないADCであるIgG1-b12-vcMMAEでのマウスの処置は、PAXF1657モデルにおいて抗腫瘍活性を示さず（図10C）、AXL-ADCの治療能力は特異的な標的結合にも依存することが示された。
実施例11‐Ig1ドメインに結合するAXL抗体
AXL抗体IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-137、およびIgG1-AXL-613のAXLドメイン特異性を、ヒト-マウスキメラAXL変異体のパネルを用いて判定した。ヒト-マウス交差反応性モノクローナルAXL抗体であるYW327.6S2を、hsAXL-mmECDの発現を確認するために含めた。IgG1-b12を、アイソタイプ対照抗体として含めた。実施例3に記載されているように、5種の異なるキメラAXL分子を生成して、HEK293Fにおいて発現させた。簡潔に言うと、ヒトIg様ドメインI（Ig1）、Ig様ドメインII（Ig2）、ヒトFNIII様ドメインI（FN1）、またはヒトFNIII様ドメインIIドメイン（FN2）を、それらのマウスホモログで置き換えた。実施例2に記載されているように、ヒト-マウスAXLキメラに対する1μg/mL抗AXL抗体の結合を、フローサイトメトリーにより判定した。
すべての抗AXL抗体が、ヒトAXLに対する結合を示した（図11A）のに対して、ヒトAXL ECDがそのマウスホモログで置き換えられた際には、結合は撤廃された（図11B）。期待されたように、ヒト-マウス交差反応性モノクローナルAXL抗体YW327.6S2は、hsAXL-mmECDに対する結合を示し、hsAXL-mmECDの妥当な発現が確認された。
AXL抗体IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-137、およびIgG1-AXL-613は、hsAXL-mmIg1に対して強く低減した結合を示し（図11C）、AXL Ig1ドメイン中のエピトープの認識が示された。これと合致して、IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-137、およびIgG1-AXL-613のhsAXL-mmIg2（図11D）、hsAXL-mmFN1（図11E）、またはhsAXL-mmFN2（図11F）に対する結合は、影響を受けなかった。ヒト-マウス交差反応性モノクローナルAXL抗体YW327.6S2は、すべてのキメラAXLバリアントに対する結合を示し、これらのタンパク質の妥当な発現が確認された。
実施例12‐AXL抗体IgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613はIg1ドメインに結合するが、Gas6結合と競合しない
AXL抗体IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-137、またはIgG1-AXL-613の結合が、AXLリガンドであるGas6のAXLに対する結合を干渉するかどうかを試験した。そのために、実施例2に記載されているように、10μg/mL AXL抗体とプレインキュベートしていたA431細胞に対するGas6の結合を試験した。AXL結合についてGas6と競合することが記載されたAXL抗体YW327.6S2、IgG1-b12（アイソタイプ対照）、または培地（陰性対照）とのプレインキュベーションを、対照として含めた。
結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用した非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
図12および表11は、IgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613抗体とプレインキュベートしていたA431細胞に対するGas6の結合が、IgG1-b12および培地対照に類似していたことを示す。これは、実施例2に示されるように、AXLに対するIgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613の結合が、Gas6結合を干渉しないことを示す。A431細胞に対するGas6の結合は、IgG1-b12および培地対照と比較して、IgG1-AXL-061、IgG1-AXL-137、および対照AXL抗体YW327.6S2の存在下で大きく低減した。
A431細胞をGas6とプレインキュベートした実験において、IgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613の最大結合値は、Gas6の非存在下での抗体結合に匹敵していた（Gas6プレインキュベーション後の最大結合は、Gas6プレインキュベーションを伴わない結合の91〜108％であった）（表11）。Gas6プレインキュベーションを伴うかまたは伴わない、IgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613結合についてのEC50値は、同じ範囲であったか、またはGas6プレインキュベーション後にいくらか高く（表11）、IgG1-AXL-107およびIgG1-AXL-613がGas6結合と競合しないことが示された。
対照抗体YW327.6S2と同様に、A431細胞に対するIgG1-AXL-061およびIgG1-AXL-137の結合は、Gas6を伴わない結合と比較して、Gas6の存在下で大きく低減した（Gas6プレインキュベーション後の最大結合は、Gas6プレインキュベーションを伴わない結合の40〜43％であった；表11）。IgG1-AXL-061およびIgG1-AXL-137についてのEC50値は、Gas6プレインキュベーション後には妥当に決定できなかった（表11）。これは、IgG1-AXL-061およびIgG1-AXL-137がAXLへの結合についてGas6と競合することを示す。
これらのデータは、AXL Ig1ドメインに結合する抗体が、Gas6結合に対して差別的な効果を有することを実証する。
（表１１）
Figure 2020141682
an.a.、適用不可能
*低い結合のためにEC50は精度が低い値である。
実施例13‐自己分泌（内在性）Gas6産生を伴うおよび伴わない異種移植モデルにおけるAXL-ADCのインビボ抗腫瘍効力
A431およびLCLC-103H腫瘍細胞のGas6産生
A431細胞およびLCLC-103H細胞がGas6を産生するかどうかを試験した。そのために、細胞を、完全培養培地中で3日間成長させた。上清中のGas6レベルを、Quantikine Human Gas6 ELISA（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用い、製造業者の説明書にしたがって決定した。このアッセイは、定量的サンドイッチELISA技術を使用する。ヒトGas6に特異的なモノクローナルAbが、マイクロプレート上にプレコーティングされている。標準品および試料をウェル中にピペットで移すと、存在する任意のヒトGas6が、固定されたAbによって結合される。任意の結合していない物質を洗浄して除去した後、ヒトGas6に特異的な酵素連結ポリクローナルAbをウェルに添加する。任意の結合していないAb-酵素試薬を除去するための洗浄後に、基質をウェルに添加すると、最初の工程において結合したヒトGas6の量に比例して色が顕出する。顕色を停止して、色の強度を測定する。
A431細胞によって調整された細胞培養培地は、2576 ng/mLのGas6を含有することが見出され、他方、LCLC-103H細胞によって調整された培地中のGas6の濃度は、20倍より大きく、低かった（表12）。
（表１２）腫瘍細胞調整培地中のGas6産生
Figure 2020141682
インビボでのAXL-ADCの抗腫瘍活性
IgG1-AXL-061-vcMMAE（Ig1結合剤）、IgG1-AXL-107-vcMMAE（Ig1結合剤）、IgG1-AXL-137-vcMMAE（Ig1結合剤）、IgG1-AXL-148-vcMMAE（Ig2結合剤）、IgG1-AXL-183-vcMMAE（FN1結合剤）、およびIgG1-AXL-726-vcMMAE（FN2結合剤）のインビボ抗腫瘍活性を、高レベルのGas6を産生するA431（類表皮癌）腫瘍モデル、および、低レベルのGas6を産生するLCLC-103H（大細胞肺癌）腫瘍モデルにおいて判定した。
腫瘍誘導を、200μL PBS中の5×106個のA431またはLCLC-103H腫瘍細胞（両方ともLeibniz-Institut - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)から取得）の、雌SCIDマウスの右側腹部における皮下注射によって行った。処置は、平均腫瘍サイズが100〜200 mm3よりも大きく、明瞭な腫瘍成長が観察された、腫瘍細胞接種の14〜21日後に開始した。マウスは、示されているように、IgG1-AXL-vcMMAE ADCまたは対照抗体（コンジュゲートされていないIgG1-b12）での単回注射、または合計で4回の週2回の腹腔内注射を受けた。腫瘍体積を、少なくとも週あたり2回判定した。腫瘍体積（mm3）を、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
図13Aは、3 mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAE、IgG1-AXL-148-vcMMAE、およびIgG1-AXL-733-vcMMAEでのマウスの処置が、A431腫瘍の成長阻害を誘導したことを示す。
図13Bは、3 mg/kgのIgG1-AXL-148-vcMMAE、IgG1-AXL-183-vcMMAE（FN1結合剤）、およびIgG1-AXL-726-vcMMAE（FN2結合剤）でのマウスの処置が、A431腫瘍の成長阻害を誘導したことを示す。対照的に、クローンIgG1-AXL-061-vcMMAEおよびIgG1-AXL-137-vcMMAEは、A431異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を示さなかった。
図14Aは、3 mg/kgのIgG1-AXL-061-vcMMAE、IgG1-AXL-137-vcMMAE、IgG1-AXL-148-vcMMAE、IgG1-AXL-183-vcMMAE、およびIgG1-AXL-726-vcMMAEでのマウスの処置が、LCLC-103H異種移植モデルにおいて腫瘍退縮を誘導したことを示す。同様に、1 mg/kgのIgG1-AXL-107-vcMMAEまたは1 mg/kgのIgG1-AXL-613-vcMMAEでのマウスの処置は、LCLC-103H腫瘍の退縮を誘導した（図14B）。
要約すると、すべてのAXL-ADCは、低レベルのGas6を産生するLCLC-103H異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を示した。高レベルのGas6を産生するA431異種移植モデルにおいて、抗腫瘍活性は、AXLリガンドであるGas6と競合しなかったAXL-ADCについてのみ観察された。
実施例14‐様々な腫瘍徴候におけるAXL発現
AXLの発現を、甲状腺癌、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌もしくは子宮内膜癌、または悪性黒色腫を有する患者由来の組織コアを含む、新しく切ったパラフィン包埋、ホルマリン固定（FFPE）の腫瘍組織マイクロアレイ（TMA）において評定した。TMAは、US BioMaxから取得した。
FFPE腫瘍アレイスライドを、脱パラフィン化して抗原復旧（pH 6）に供し、内在性ペルオキシダーゼを、クエン酸／リン酸緩衝液中の0.1％ H2O2とのインキュベーションによって消耗させた。AXL発現を検出するために、TMAを、1μg/mLの濃度のウサギ抗AXL（Santa Cruz、カタログ番号：sc-20741）と60分間インキュベート（室温（RT））した。上皮起源の（腫瘍）細胞を特定するために、TMAを、1:50の希釈のウサギ抗サイトケラチン（Abcam、カタログ番号ab9377）と60分間インキュベート（RT）した。洗浄工程後に、TMAを、ペルオキシダーゼコンジュゲートの抗ウサギIgGデキストランポリマー（ImmunoLogic、カタログ番号：DPVR55HRP）とインキュベートして、ウサギ抗AXL抗体およびウサギ抗サイトケラチン抗体の結合を検出した。最後に、抗ウサギIgGデキストランポリマーの結合を、ジアミノベンジジン（DAB；茶色；DAKO、カタログ番号：K346811）で可視化した。悪性黒色腫組織コアを有するTMAにおいては、抗ウサギIgGデキストランポリマーの結合を、アミノエチルカルバゾール（AEC；赤色；Vector、SK4200）で可視化した。TMAにおける核を、ヘマトキシリン（青色）で可視化した。
AXLおよびサイトケラチンを免疫染色したTMAを、Aperioスライドスキャナーで20倍の倍率でデジタル化し、免疫染色を、細胞ベースのアルゴリズムを用いて、組織画像解析ソフトウェア（Definiens Tissue Studioソフトウェア、バージョン3.6.1）で定量した。アルゴリズムは、生検材料におけるAXLまたはサイトケラチンの陽性細胞のパーセンテージ（範囲0〜100％）を特定および定量するように、ならびに、各腫瘍コアにおけるAXL陽性腫瘍細胞のAXL染色強度（光学密度（OD）；範囲0〜3）を定量するように、設計された。AXL ODが少なくとも0.1であった場合に、腫瘍細胞をAXL陽性とスコア化した。腫瘍コアあたりのAXL陽性腫瘍細胞のパーセンテージ（範囲0〜100％）は、連続した腫瘍コアにおいて、AXL陽性細胞の総数をサイトケラチン陽性細胞の総数で割ることによって算出した。各腫瘍コアにおける平均AXL染色強度（OD）は、すべてのAXL陽性腫瘍細胞のAXL ODの和を、AXL陽性腫瘍細胞の数で割ることによって算出した。
悪性黒色腫を有する患者由来の腫瘍アレイは、手動でスコア化した。AXL染色強度を、弱（1+）、中（2+）、または強（3+）のいずれかとしてスコア化し、AXL陽性黒色腫細胞のパーセンテージを、10％間隔でスコア化した（範囲0〜100％）。
図16は、甲状腺癌、食道癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、および子宮内膜癌の腫瘍コアにおけるAXL発現のグラフによる表示を提供する。表13は、各徴候について、腫瘍細胞の10％より多くにおいてAXL発現を示した腫瘍コアのパーセンテージを示す。図17は、各徴候について、AXLを免疫染色した組織コアの代表的な例を示す。図は、腫瘍組織におけるAXLの不均質な発現を示す。
（表１３）
Figure 2020141682
使用した略語：NSCLC、非小細胞肺癌；SLCL、小細胞肺癌；TNBC、トリプルネガティブ乳癌
実施例15‐AXL抗体はAXLに特異的に結合するが、他のTAM受容体ファミリーメンバーには結合しない
HEK-293F細胞におけるヒトAXL、MER、およびTYRO3の発現
種々の完全長タンパク質の発現用の以下のコドン最適化構築物を生成した：ヒト（ホモ・サピエンス）AXL（Genbankアクセッション番号NP_068713.2）、ヒトMER（Genbankアクセッション番号EAW52096.1）、およびヒトTYRO3（Genbankアクセッション番号Q06418.1）。 構築物は、クローニングに適している制限酵素部位および最適コザック（GCCGCCACC）配列［Kozak et al. (1999) Gene 234: 187-208］を含有した。構築物を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.3（Invitrogen）にクローニングした。
Freestyle商標293-F（浮遊増殖および化学的に定義されたFreestyle培地に適応したHEK-293サブクローン、（HEK-293F））細胞を、Invitrogenから取得して、293fectin（Invitrogen）を用い、製造業者の説明書にしたがって発現プラスミドをトランスフェクトして、24〜48時間増殖させた。
ヒトAXL、ヒトMER、またはヒトTYRO3に対するAXL抗体の結合研究
完全長ヒトAXL、MER、またはTYRO3用の発現構築物を一過性にトランスフェクトしたHEK-293F細胞を、HuMab-AXL抗体の結合についてフローサイトメトリーにより評定した。トランスフェクトしたHEK-293F細胞を、AXL抗体の連続希釈液（4倍希釈液；最終濃度範囲0.002〜10μg/mL）と4℃で30分間インキュベートした。PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で3回洗浄した後、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で1/100に希釈したR-フィコエリスリン(PE)コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA；カタログ番号109-116-098）とインキュベートした（最終体積100μL）。次に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。マウス抗ヒトMer（R&D Systems、カタログMab8912）およびマウス抗ヒトTyro3（Dtk）（R&D Systems、カタログMAB859）での染色を、発現についての対照として含め、IgG1-b12を、非結合アイソタイプ対照抗体として含めた。結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用し、非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
図18Aは、Humab-AXL抗体が、ヒトAXLを発現するHEK293細胞に対して用量依存性結合を示したことを示す。対照的に、MERを発現する細胞（図18B）もしくはTYRO3を発現する細胞（図18C）、またはトランスフェクトしていないHEK293細胞（図18D）に対するHuMab-AXL抗体の非結合が観察された。MERおよびTyro3に特異的な抗体での染色により、トランスフェクトした細胞は、それぞれ、MER（図18F）またはTYRO3（図18G）の妥当な発現を示したことが確認された。
実施例16‐細胞表面に結合したAXL抗体の内部移行
フローサイトメトリーにより評定した、細胞表面に結合したHuMab-AXLの内部移行
MDA-MB-231およびCalu-1細胞（ヒト肺癌細胞株；ATCC、カタログ番号HTB-54）に対する、細胞表面に結合したHuMab-AXL抗体の内部移行を、フローサイトメトリーにより評定した。50,000細胞を、96ウェル組織培養プレートに播種して、37℃で6時間付着させた。プレートを、AXL抗体の連続希釈液（最終濃度範囲0.0032〜10μg/mL）との4℃で1時間のインキュベーション前に、4℃で30分間インキュベートした。その後、培地を、抗体を含まない組織培養培地により置き換え、細胞を、37℃または4℃で一晩（16〜18時間）インキュベートした。その後、細胞表面上のAXL抗体を検出するために、細胞を、40μLの温かいトリプシン溶液で剥離し、氷冷PBS/0.1％ BSA/0.02％アジドで洗浄し、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で1/100に希釈したR-フィコエリスリン(PE)コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA；カタログ番号109-116-098）と4℃で30分間インキュベートした（最終体積100μL）。最後に、細胞を、PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中で2回洗浄し、120μL PBS/0.1％ BSA/0.02％アジド中に再懸濁して、FACS Cantoll（BD Biosciences）上で解析した。
結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用し、非線形回帰（可変の勾配を有するシグモイド用量応答）を用いて解析した。
図19は、試験したすべてのAXL HuMab抗体についておよびすべての濃度で、抗体結合後に4℃でインキュベートしていた細胞の形質膜上に、37℃でインキュベートしていた細胞と比較してより多くの抗体が検出されたことを示す。これは、37℃で、AXL抗体が、形質膜への結合時に内部移行されることを示す。
Fab-TAMRA/QSY7内部移行および細胞内分解アッセイ
AXL抗体の内部移行を、Fab-TAMRA/QSY7内部移行アッセイにおいて評価した。このアッセイは、蛍光体（TAMRA）と消光剤（QSY7）のペアを使用する。きわめて接近すると、例えば、同じタンパク質へのコンジュゲーション時に、TAMRA蛍光はQSY7によって消光される。この実施例においては、ヤギ抗ヒトIgG Fab断片（Jackson Immunoresearch）を、記載されているように（Ogawa et al. Mol Pharm 2009;6(2):386-395）TAMRA/QSY7とコンジュゲートして（Fab-TAMRA/QSY7）、AXL HuMab（1.5μg/mL）を、Fab-TAMRA/QSY7とプレインキュベートした（12μg/mL；30分、4℃）。複合体をその後、LCLC-103H細胞に添加して、振盪条件（200 rpm、37℃）下で、24時間のインキュベートの間、暗所でインキュベートした。HuMab-Fab-TAMRA/QSY7複合体の内部移行、ならびにエンドソームおよびリソソームにおける細胞内分解は、TAMRA/QSY7の解離を引き起こし、TAMRAの脱消光（dequenching）を結果としてもたらす。Fab-TAMRA/QSY7と複合体形成したAXL抗体とインキュベートしていたLCLC-103H細胞のTAMRA蛍光を、FACS CantoII（BD Biosciences）上で測定した。
図20に示されるように、LCLC-103H細胞の蛍光強度は、AXL抗体-Fab-TAMRA/QSY7複合体とのインキュベーション時に、IgG1-b12-Fab-TAMRA/QSY7またはFab-TAMRA/QSY7単独と比較して増強された。これは、AXL抗体が、LCLC-103H細胞への結合時に内部移行されることを示す。
実施例17‐食道癌患者由来の異種移植（PDX）モデルにおけるAXL-ADCの抗腫瘍効力
IgG1-AXL-107-vcMMAEの抗腫瘍活性を、BALB/cヌードマウスにおける皮下食道PDXモデルES0195において評定した（Crown Bioscience. Taicang Jiangsu Province, 中国により行われた実験）。患者由来の食道異種移植片を有するドナーマウスからの腫瘍断片（ES0195）を、BALB/cヌードマウス中への接種のために使用した。各マウスに、1つの腫瘍断片（直径2〜3 mm）を右側腹部の皮下に接種して、腫瘍体積が約150 mm3になるまで腫瘍を成長させた。動物の無作為化を、以下のように行った：約150 mm3の体積の腫瘍を有する動物を、群腫瘍体積の比較可能な中央値および平均値を考慮して、5種の実験群（群あたり8匹の動物）に分配した。処置群は、IgG1-b12、IgG1-b12-vcMMAE、IgG1-AXL-107、IgG1-AXL-107-vcMMAE、およびパクリタキセルであった。抗体およびADCを、無作為化の日（0日目）および7日目に、4 mg/kgで静脈内に（i.v.）投与した。パクリタキセルは、0、7、および14日目に、20 mg/kgで腹腔内に（i.p.）投与した。腫瘍体積（mm3）を、週に2回モニターして、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
図21は、IgG1-AXL-107-vcMMAEでのマウスの処置が、IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAE対照群と比較して、ES0195腫瘍の腫瘍退縮を誘導したことを示す（23日目にp＜0.001、一元配置分散分析検定）。標的化されていないADCであるIgG1-b12-vcMMAEでのマウスの処置は、このモデルにおいて抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力は特異的な標的結合に依存することが示された。パクリタキセルで処置したマウスは、腫瘍成長阻害を示したが、これはIgG1-AXL-107-vcMMAEでの処置と比較して有効性が低かった（23日目にp＜0.05、一元配置分散分析検定）。
実施例18‐子宮頸癌患者由来の異種移植（PDX）モデルにおけるAXL-ADCの抗腫瘍効力
IgG1-AXL-183-vcMMAEおよびIgG1-AXL-726-vcMMAEの抗腫瘍活性を、NMRI nu/nuマウス（Harlan, オランダ）における患者由来の子宮頚癌異種移植CEXF 773モデルにおいて評定した。実験は、Oncotest（Freiburg, ドイツ）により行われた。
腫瘍断片を、連続継代のヌードマウスにおける異種移植片から取得した。ドナーマウスからの切除後、腫瘍を、断片（直径4〜5 mm）に切って、皮下移植までPBS（10％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）中に置いた。イソフルラン麻酔下のマウスが、側腹部に片側皮下腫瘍移植を受けた。腫瘍体積が50〜250 mm3になるまで、腫瘍を成長させた。
動物の無作為化を、以下のように行った：50〜250 mm3の体積の腫瘍を有する動物を、群腫瘍体積の比較可能な中央値および平均値を考慮して、4種の実験群（群あたり8匹の動物）に分配した。処置群は、IgG1-b12、IgG1-b12-vcMMAE、IgG1-AXL-183-vcMMAE、およびIgG1-AXL-726-vcMMAEであった。抗体およびADCを、無作為化の日（0日目）および7日目に、4 mg/kgで静脈内に（i.v.）投与した。腫瘍体積（mm3）を、週に2回モニターして、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
図22は、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEでのマウスの処置が、IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAE対照群と比較して、CEXF 773腫瘍の腫瘍退縮を誘導したことを示す。標的化されていないADCであるIgG1-b12-vcMMAEでのマウスの処置は、このモデルにおいて抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力は特異的な標的結合に依存することが示された。28日目の腫瘍サイズの統計解析（腫瘍サイズカットオフ500 mm3を用いたクラスカル・ワリスおよびマンテル・コックス）により、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEで処置したマウスにおける平均腫瘍サイズは、IgG1-b12およびIgG1-b12-vcMMAEで処置していたマウスにおけるよりも有意に小さかったことが示された（p＜0.001）。IgG1-AXL-183-vcMMAEとIgG1-AXL-726-vcMMAEとは、同等に有効であった。
実施例19‐同所乳癌異種移植モデルにおけるAXL-ADCの抗腫瘍効力
IgG1-AXL-183-vcMMAEおよびIgG1-AXL-726-vcMMAEの抗腫瘍活性を、同所MDA-MB-231 D3H2LN異種移植モデルにおいて評定した。
MDA-MB-231-luc D3H2LN Bioware細胞（乳腺腺癌；Perkin Elmer, Waltham, MA）を、6〜11週齢の雌SCID（C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL）マウス（Charles-River）の乳房脂肪体に、イソフルラン麻酔下で移植した。腫瘍を成長させて、腫瘍が約325 mm3に達した際に、マウスを無作為化した。そのために、マウスを、群腫瘍体積の比較可能な中央値および平均値を考慮して、4種の実験群（群あたり6〜7匹の動物）に分配した。処置群は、IgG1-b12、IgG1-b12-vcMMAE、IgG1-AXL-183-vcMMAE、およびIgG1-AXL-726-vcMMAEであった。動物は、無作為化の日に開始して、3 mg/kgの抗体またはADCの、合計で4回の週2回投与を受けた。腫瘍体積（mm3）を、週に2回モニターして、キャリパー（PLEXX）測定値から0.52×（長さ）×（幅）2として算出した。
図23は、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEでのマウスの処置が、IgG1-b12およびIgG1-b12-MMAE対照群と比較して、MDA-MB-231腫瘍の腫瘍退縮を誘導したことを示す。標的化されていないADCであるIgG1-b12-vcMMAEでのマウスの処置は、このモデルにおいて抗腫瘍活性を示さず、AXL-ADCの治療能力は特異的な標的結合に依存することが示された。32日目の腫瘍サイズの統計解析（一元配置分散分析検定）により、IgG1-AXL-183-vcMMAEまたはIgG1-AXL-726-vcMMAEで処置していたマウスにおける平均腫瘍サイズは、IgG1-b12およびIgG1-b12-vcMMAEで処置していたマウスにおけるよりも有意に小さかったことが示された（p＜0.001）。IgG1-AXL-183-vcMMAE処置群とIgG1-AXL-726-vcMMAE処置群との間に、差は観察されず、これらが同等に有効な抗腫瘍活性を誘導したことが示された。
実施例20‐AXL特異的抗体薬物コンジュゲートにより誘導されるインビトロ細胞傷害は標的発現に依存する
IgG1-AXL-107-vcMMAEのインビトロ細胞傷害を、様々なレベルのAXL発現を有するヒト腫瘍細胞株において試験した。
細胞培養
LS174T細胞（ヒト結腸直腸腺癌細胞株；ATCC、カタログ番号CL-188）を、Glutamax、Hepes、およびフェノールレッドを含む最小必須培地（MEM）（Life Technologies、カタログ番号42360-024）中で培養した。構成要素は、10％ Donor Bovine Serium with Iron（DBSI）（Life Technologies、カタログ番号10371-029）および1％ピルビン酸ナトリウム（100 mM；Lonza、カタログ番号BE13-115E）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza、カタログ番号DE17-603E）である。
NCI-H226細胞（ヒト肺扁平上皮癌；ATCC、カタログ番号CRL-5826）、NCI-H661細胞（ヒト大細胞肺癌；ATCC、カタログ番号HTB-183）、およびNCI-H1299細胞（ヒト非小細胞肺癌；ATCC、カタログ番号CRL-5803）を、RPMI 1640培地（ATCC改変；Life Technologies、カタログ番号A10491-01）中で培養した。構成要素は、10％ Donor Bovine Serium with Iron（DBSI；Life Technologies、カタログ番号10371-029）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza、カタログ番号DE17-603E）である。
SKOV-3細胞（ヒト卵巣腺癌；ATCC、カタログ番号HTB-77）を、L-グルタミンおよびHEPESを含むマッコイ5A培地（Lonza、カタログ番号BE12-168F）中で培養した。構成要素は、10％ Donor Bovine Serium with Iron（DBSI；Life Technologies、カタログ番号10371-029）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza、カタログ番号DE17-603E）である。
Calu-1細胞（ヒト肺類表皮癌；ATCC、カタログ番号HTB-54）を、カトペプトン（Catopeptone）を含み、HEPESを含まないマッコイ5A培地（Life Technologies、カタログ番号26600-023）中で培養した。構成要素は、10％ Donor Bovine Serium with Iron（DBSI；Life Technologies、カタログ番号10371-029）および0.85％ NaCl溶液中の1％ L-グルタミン（200 nM）（Lonza、カタログ番号BE17-605F）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Lonza、カタログ番号DE17-603E）である。Calu-1細胞は、EGFR標的療法に対して耐性である。
LCLC-103H細胞（ヒト大細胞肺癌）、A431細胞（ヒト類表皮腺癌）、およびMDA-MB-231細胞（ヒト乳癌）は、実施例8に記載されているように培養した。
ヒト腫瘍細胞株の形質膜上のAXL発現の定量
ヒト腫瘍細胞株の形質膜上のAXL発現を、QIFIKIT（DAKO、カタログ番号K0078）をマウスモノクローナル抗体Z49M（Santa Cruz biotechnology、カタログ番号sc-73719）とともに用いた間接免疫蛍光により評価した。接着細胞をトリプシン処理し、セルストレーナーを通過させて、単一細胞懸濁液を取得した。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によってペレットにし、PBSで洗浄して、1×106細胞／mLの濃度で再懸濁した。次の工程は、氷上で行った。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり100,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号650101）に播種した。細胞を、300×gで3分間の遠心分離によってペレットにし、10μg/mLの濃度の50μL抗体試料またはマウスIgG1アイソタイプ対照試料（BD/Pharmingen、カタログ番号555746）中に再懸濁した。4℃で30分のインキュベーション後に、細胞をペレットにし、150μL FACS緩衝液中に再懸濁した。セットアップおよび較正ビーズを、製造業者の説明書にしたがってプレートに添加した。細胞およびビーズを、並行して、150μL FACS緩衝液でさらに2回洗浄し、50μLのFITCコンジュゲートヤギ抗マウスIgG（1/50；DAKO、カタログ番号K0078）中に再懸濁した。二次抗体を、4℃で30分間、暗所でインキュベートした。細胞およびビーズを、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、100μL FACS緩衝液中に再懸濁した。免疫蛍光を、FACS Canto II（BD Biosciences）上で、生細胞のゲート内の10,000イベントを記録することによって測定した。較正ビーズの平均蛍光強度を、GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いて較正曲線を算出するために使用した。各細胞株について、抗体結合能力（ABC）、形質膜上に発現しているAXL分子の数の推定値を、較正曲線の方程式に基づき、AXL抗体染色細胞の平均蛍光強度を用いて算出した（GraphPadソフトウェアを用いた、標準曲線からの未知のものの内挿）。
細胞傷害アッセイ
LCLC-103H、A431、MDA-MB-231、NCI-H226、NCI-H661、NCI-H1299、LS174T、およびSKOV-3細胞について、インビトロ細胞傷害アッセイを、実施例8に記載されているように行った。Calu-1については、細胞培養を5日の代わりに11日インキュベートしたという調節を伴い、実施例8に記載されているように行った。用量応答曲線を、Graphpad Prismソフトウェアを使用し、非線形回帰解析を用いて生成した。1μg/mLのIgG1-AXL-107-vcMMAE濃度での生細胞のパーセンテージを、用量応答曲線から内挿した。
図24に示されるように、IgG1-AXL-107-vcMMAEは、高いAXL発現を有する細胞株において最も強力な細胞傷害を誘導したのに対して、低いAXL発現を有する細胞株においては、細胞傷害は低かったか、または欠如していた。図はまた、IgG1-AXL-107-vcMMAEが、Calu-1などのEGFR標的療法に対して耐性である細胞における細胞傷害の誘導に有効であることも示す。
参照文献
Figure 2020141682
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Claims (62)

  1. AXLに結合し、リガンドである増殖停止特異的6（Gas6）とAXL結合について競合しない、抗体。
  2. Gas6の存在下でのAXLに対する最大の抗体結合が、実施例2に開示されている方法によって判定される際に、Gas6の非存在下での結合の少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％、例えば100％である、請求項1記載の抗体。
  3. Gas6の存在下でのAXLに対する最大の抗体結合が、競合アッセイによって判定される際に、Gas6の非存在下での結合の少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％、例えば100％であり、該AXLに結合する前記抗体と該Gas6との間の競合が、Gas6と共におよびGas6なしでプレインキュベートされたA431細胞上で判定される、請求項1または2記載の抗体。
  4. 前記抗体が、ヒトAXLに対して0.3×10-9〜63×10-9 Mの範囲の結合親和性（KD）を有し、該結合親和性が、可溶性AXL細胞外ドメインを用いたバイオレイヤー干渉法を用いて測定される、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。
  5. 前記抗体が、AXLに対して9.7×10-5〜4.4×10-3 s-1の解離速度を有し、該解離速度が、可溶性組み換えAXL細胞外ドメインを用いたバイオレイヤー干渉法によって測定される、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
  6. AXLが、SEQ ID NO:130において特定されるヒトAXLである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
  7. AXLが、SEQ ID NO:147において特定されるカニクイザルAXLである、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体。
  8. AXLが、SEQ ID NO:130において特定されるヒトAXL、およびSEQ ID NO:147において特定されるカニクイザルAXLである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
  9. 以下からなる群より選択される可変重鎖（VH）CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む少なくとも1つの結合領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体：
    a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38 [107]；
    b）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95 [613]；
    c）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]；
    d）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48 [148]；
    e）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59 [171]；
    f）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80 [187]；
    g）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120 [148 / 140]；
    h）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53 [154]；
    i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75 [183]；
    j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75 [183-N52Q]；
    k）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116 [733]；
    l）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125 [171 / 172 / 181]；
    m）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110 [726]；
    n）それぞれ、SEQ ID NO:108、121、および122 [726 / 187]；
    o）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43 [140]；
    p）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64 [172]；
    q）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69 [181]；
    r）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54 [154-M103L]；
    s）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80 [187]；
    t）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85 [608-01]；
    u）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90 [610-01]；
    v）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100 [613-08]；
    w）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105 [620-06]；ならびに
    x）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111 [726-M101L]。
  10. VH CDR1、CDR2、およびCDR3が、a）、d）、g）、またはk）のいずれかから選択される、請求項9記載の抗体。
  11. 少なくとも1つの結合領域が、
    以下からなる群より選択される配列と少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも99％、例えば100％の配列同一性を有する、CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む可変重鎖（VH）領域と、CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む可変軽鎖（VL）領域と
    を含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体；
    a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [107]；
    b）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148]；
    c）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [733]；
    d）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154]；
    e）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154-M103L]；
    f）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171]；
    g）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [172]；
    h）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [181]；
    i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183]；
    j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183-N52Q]；
    k）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [187]；
    l）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [608-01]；
    m）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [610-01]；
    n）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613]；
    o）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:101、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613-08]；
    p）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [620-06]；
    q）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726]；
    r）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726-M101L]；
    s）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [140]；
    t）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID NO:129のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 613-08]；
    u）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148 / 140]；
    v）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171 / 172 / 181]；ならびに
    w）それぞれ、SEQ ID NO:121、109、および122のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726 / 187]；ならびに
    x）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]。
  12. 少なくとも1つの結合領域が、以下からなる群より選択されるVH領域および可変軽鎖（VL）領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体；
    a）それぞれ、SEQ ID NO:36、37、および38のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:39、GAS、およびSEQ ID NO:40のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [107]；
    b）それぞれ、SEQ ID NO:46、47、および48のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148]；
    c）それぞれ、SEQ ID NO:114、115、および116のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:117、DAS、およびSEQ ID NO:118のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [733]；
    d）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および53のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154]；
    e）それぞれ、SEQ ID NO:51、52、および54のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:55、GAS、およびSEQ ID NO:56のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [154-M103L]；
    f）それぞれ、SEQ ID NO:57、58、および59のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171]；
    g）それぞれ、SEQ ID NO:62、63、および64のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:65、GAS、およびSEQ ID NO:66のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [172]；
    h）それぞれ、SEQ ID NO:67、68、および69のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:70、GAS、およびSEQ ID NO:71のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [181]；
    i）それぞれ、SEQ ID NO:72、73、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183]；
    j）それぞれ、SEQ ID NO:72、74、および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:76、ATS、およびSEQ ID NO:77のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [183-N52Q]；
    k）それぞれ、SEQ ID NO:78、79、および80のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:81、AAS、およびSEQ ID NO:82のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [187]；
    l）それぞれ、SEQ ID NO:83、84、および85のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:86、GAS、およびSEQ ID NO:87のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [608-01]；
    m）それぞれ、SEQ ID NO:88、89、および90のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:91、GAS、およびSEQ ID NO:92のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [610-01]；
    n）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613]；
    o）それぞれ、SEQ ID NO:98、99、および100のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:101、DAS、およびSEQ ID NO:102のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613-08]；
    p）それぞれ、SEQ ID NO:103、104、および105のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:106、GAS、およびSEQ ID NO:107のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [620-06]；
    q）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および110のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726]；
    r）それぞれ、SEQ ID NO:108、109、および111のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726-M101L]；
    s）それぞれ、SEQ ID NO:41、42、および43のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:44、AAS、およびSEQ ID NO:45のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [140]；
    t）それぞれ、SEQ ID NO:93、94、および95のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:128、XAS（配列中、XはDまたはGである）、およびSEQ ID NO:129のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 613-08]；
    u）それぞれ、SEQ ID NO:46、119、および120のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:49、AAS、およびSEQ ID NO:50のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [148 / 140]；
    v）それぞれ、SEQ ID NO:123、124、および125のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:60、GAS、およびSEQ ID NO:61のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [171 / 172 / 181]；ならびに
    w）それぞれ、SEQ ID NO:121、109、および122のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:112、AAS、およびSEQ ID NO:113のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [726 / 187]；ならびに
    x）それぞれ、SEQ ID NO:93、126、および127のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVH領域；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:96、GAS、およびSEQ ID NO:97のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含むVL領域 [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06]。
  13. 少なくとも1つの結合領域が、以下からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体；
    a）SEQ ID NO:1を含むVH領域、およびSEQ ID NO:2を含むVL領域 [107]；
    b）SEQ ID NO:5を含むVH領域、およびSEQ ID NO:6を含むVL領域 [148]；
    c）SEQ ID NO:34を含むVH領域、およびSEQ ID NO:35を含むVL領域 [733]；
    d）SEQ ID NO:7を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154];
    e）SEQ ID NO:10を含むVH領域、およびSEQ ID NO:11を含むVL領域 [171]；
    f）SEQ ID NO:16を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183]；
    g）SEQ ID NO:25を含むVH領域、およびSEQ ID NO:26を含むVL領域 [613]；
    h）SEQ ID NO:31を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726]；
    i）SEQ ID NO:3を含むVH領域、およびSEQ ID NO:4を含むVL領域 [140]；
    j）SEQ ID NO:8を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154-M103L]；
    k）SEQ ID NO:12を含むVH領域、およびSEQ ID NO:13を含むVL領域 [172]；
    l）SEQ ID NO:14を含むVH領域、およびSEQ ID NO:15を含むVL領域 [181]；
    m）SEQ ID NO:17を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183-N52Q]；
    n）SEQ ID NO:19を含むVH領域、およびSEQ ID NO:20を含むVL領域 [187]；
    o）SEQ ID NO:21を含むVH領域、およびSEQ ID NO:22を含むVL領域 [608-01]；
    p）SEQ ID NO:23を含むVH領域、およびSEQ ID NO:24を含むVL領域 [610-01]；
    q）SEQ ID NO:27を含むVH領域、およびSEQ ID NO:28を含むVL領域 [613-08]；
    r）SEQ ID NO:29を含むVH領域、およびSEQ ID NO:30を含むVL領域 [620-06]；ならびに
    s）SEQ ID NO:32を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726-M101L]。
  14. 前記抗体がAXL上のエピトープに結合し、該エピトープが、請求項9〜13において定義される抗体のいずれかによって認識される、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。
  15. 前記抗体がAXL上のエピトープに結合し、該エピトープが、請求項13において定義される抗体のいずれかによって認識される、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。
  16. 前記抗体がAXLのIg1様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置L121〜Q129またはT112〜Q124に対応する1つまたは複数のアミノ酸を含むかまたは必要とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。
  17. 前記抗体がAXLのIg2様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置D170またはD179の組み合わせに対応するアミノ酸、および位置T182〜R190に対応する1つまたは複数のアミノ酸を含むかまたは必要とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。
  18. 前記抗体がヒトAXLのFN1様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置Q272〜A287およびG297〜P301に対応する1つまたは複数のアミノ酸を含むかまたは必要とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。
  19. 前記抗体がヒトAXLのFN2様ドメイン内のエピトープに結合し、該エピトープが、ヒトAXLの位置A359、R386に対応するアミノ酸、および位置Q436〜K439に対応する1つまたは複数のアミノ酸を含むかまたは必要とする、前記請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。
  20. IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプの重鎖を含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
  21. アイソタイプがIgG1、任意でアロタイプIgG1m(f)である、請求項20記載の抗体。
  22. 完全長モノクローナル抗体、例えば完全長モノクローナルIgG1,κ抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
  23. エフェクター機能欠損抗体、安定化IgG4抗体、または一価抗体である、請求項1〜22のいずれか一項記載の抗体。
  24. 全ヒンジ領域が欠失しているように重鎖が改変されている、請求項23記載の抗体。
  25. 抗体の配列が、N結合型グリコシル化のためのいかなるアクセプター部位も含まないように改変されている、請求項23および24のいずれか一項記載の抗体。
  26. 一本鎖抗体である、請求項1〜25のいずれか一項記載の抗体。
  27. 前記請求項のいずれか一項記載の抗体の第1の結合領域と、該第1の結合領域とは異なる標的またはエピトープに結合する第2の結合領域とを含む、二重特異性抗体。
  28. 前記二重特異性抗体が第1および第2の重鎖を含み、該第1および第2の重鎖の各々が、少なくともヒンジ領域、CH2およびCH3領域を含み、該第1の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のK409、T366、L368、K370、D399、F405、およびY407からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも1つが置換されており、該第2の重鎖において、ヒトIgG1重鎖中のF405、T366、L368、K370、D399、Y407、およびK409からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも1つが置換されており、該第1の重鎖および該第2の重鎖の該置換が同じ位置ではない、請求項27記載の二重特異性抗体。
  29. ヒトIgG1重鎖中のK409に対応する位置のアミノ酸が第1の重鎖においてRであり、ヒトIgG1重鎖中のF405に対応する位置のアミノ酸が第2の重鎖においてLであるか、またはその逆である、請求項27〜28のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
  30. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体または請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体と、細胞傷害性作用物質、化学療法薬、サイトカイン、免疫抑制剤、抗生物質、または放射性同位元素などの治療部分とを含む、イムノコンジュゲート。
  31. 治療部分が細胞傷害性作用物質である、請求項30記載のイムノコンジュゲート。
  32. 細胞傷害性作用物質が、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)-ペンタノアート（SSP）、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（mc-vc-PAB）、またはAV-1 K-lockバリン-シトルリンなどの切断可能なリンカーで抗体に連結されている、請求項30〜31のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート。
  33. 細胞傷害性作用物質が、スクシンイミジル-4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート（MCC）またはマレイミドカプロイル（MC）などの切断不可能なリンカーで抗体またはその断片に連結されている、請求項30〜31のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート。
  34. 細胞傷害性作用物質が、DNA標的作用物質、例えば、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ラシェルマイシン（CC-1065）、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PBD）、およびインドリノベンゾジアゼピン（IGN）などのDNAアルキル化剤および架橋剤；微小管標的作用物質、例えばデュオスタチン（duostatin）、例えばデュオスタチン-3、アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチンE（MMAE）およびモノメチルアウリスタチンF（MMAF）、ドラスタチン、メイタンシン、N(2')-デアセチル-N(2')-(3-マルカプト-1-オキソプロピル)-メイタンシン（DM1）、ならびにツブリシン；ならびにヌクレオシド類似体；またはこれらの類似体、誘導体、もしくはプロドラッグの群から選択される、請求項30〜33のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート。
  35. i）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有する切断可能なリンカー；
    ii）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有さない切断可能なリンカー；
    iii）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有する切断不可能なリンカー；または
    iv）細胞傷害性作用物質、およびバイスタンダー殺傷能力を有さない切断不可能なリンカー
    の組み合わせを含む、請求項30〜34のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート。
  36. リンカーがmc-vc-PABであり、細胞傷害性作用物質がMMAEであるか；または
    リンカーがSSPであり、細胞傷害性作用物質がDM1である、
    請求項30〜32、および34〜35のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート。
  37. 前記イムノコンジュゲートが、リンカーmc-vc-PAB、細胞傷害性作用物質MMAE、および前記抗体を含み、少なくとも1つの結合領域が、以下からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート；
    a）SEQ ID NO:1を含むVH領域、およびSEQ ID NO:2を含むVL領域 [107]；
    b）SEQ ID NO:5を含むVH領域、およびSEQ ID NO:6を含むVL領域 [148]；
    c）SEQ ID NO:34を含むVH領域、およびSEQ ID NO:35を含むVL領域 [733]；
    d）SEQ ID NO:7を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154];
    e）SEQ ID NO:10を含むVH領域、およびSEQ ID NO:11を含むVL領域 [171]；
    f）SEQ ID NO:16を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183]；
    g）SEQ ID NO:25を含むVH領域、およびSEQ ID NO:26を含むVL領域 [613]；
    h）SEQ ID NO:31を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726]；
    i）SEQ ID NO:3を含むVH領域、およびSEQ ID NO:4を含むVL領域 [140]；
    j）SEQ ID NO:8を含むVH領域、およびSEQ ID NO:9を含むVL領域 [154-M103L]；
    k）SEQ ID NO:12を含むVH領域、およびSEQ ID NO:13を含むVL領域 [172]；
    l）SEQ ID NO:14を含むVH領域、およびSEQ ID NO:15を含むVL領域 [181]；
    m）SEQ ID NO:17を含むVH領域、およびSEQ ID NO:18を含むVL領域 [183-N52Q]；
    n）SEQ ID NO:19を含むVH領域、およびSEQ ID NO:20を含むVL領域 [187]；
    o）SEQ ID NO:21を含むVH領域、およびSEQ ID NO:22を含むVL領域 [608-01]；
    p）SEQ ID NO:23を含むVH領域、およびSEQ ID NO:24を含むVL領域 [610-01]；
    q）SEQ ID NO:27を含むVH領域、およびSEQ ID NO:28を含むVL領域 [613-08]；
    r）SEQ ID NO:29を含むVH領域、およびSEQ ID NO:30を含むVL領域 [620-06]；ならびに
    s）SEQ ID NO:32を含むVH領域、およびSEQ ID NO:33を含むVL領域 [726-M101L]。
  38. リンカーがMMCであり、細胞傷害性作用物質がDM1であるか；または
    リンカーがMCであり、細胞傷害性作用物質がMMAFである、
    請求項30、および32〜33のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート。
  39. 抗体あたりの細胞傷害性作用物質の数が、1〜8個、例えば2〜7個、例えば2〜6個、例えば2〜5個、例えば2〜4個、および例えば2〜3個である、請求項30〜38のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート。
  40. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体、請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体、または請求項30〜39のいずれか一項記載のイムノコンジュゲートを含む、組成物。
  41. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体、請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体、または請求項30〜39のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  42. 請求項1〜13および37のいずれか一項記載の1つまたは複数の対応するアミノ酸配列をコードする、核酸構築物。
  43. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体をコードする、核酸構築物。
  44. 請求項42および43のいずれか一項記載の1つまたは複数の核酸構築物を含む、発現ベクター。
  45. 請求項44記載のベクターを含む、宿主細胞。
  46. 組み換え原核生物、組み換え真核生物、または組み換え微生物の宿主細胞などの組み換え宿主細胞である、請求項45記載の宿主細胞。
  47. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体または請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体を産生する、請求項45〜46のいずれか一項記載の宿主細胞。
  48. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
  49. 薬剤としての使用のための、請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体、請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体、または請求項30〜39のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート。
  50. 癌の処置における使用のための、請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体、請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体、または請求項30〜39のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート。
  51. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体、請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体、請求項30〜39のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート、請求項40記載の組成物、または請求項41記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、癌の処置の方法。
  52. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体、請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体、請求項30〜39のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート、請求項40記載の組成物、または請求項41記載の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、AXL発現細胞の関与または蓄積を特徴とする疾患を診断する方法であって、任意で、抗体が検出可能な作用物質で標識され、AXL発現細胞の量が疾患と相関するかまたは疾患を示す、方法。
  53. 癌が、AXLを発現する固形腫瘍またはAXL発現血液癌である、請求項49〜50のいずれか一項記載の使用、および請求項51〜52のいずれか一項記載の方法。
  54. 血液癌が、慢性リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（AML）、および慢性骨髄性白血病などの白血病、非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、ならびに多発性骨髄腫からなる群より選択される、請求項52および53のいずれか一項記載の使用または方法。
  55. AXLを発現する固形腫瘍が、肺癌または類表皮癌である、請求項52および53のいずれか一項記載の使用または方法。
  56. 癌が、結腸直腸癌腫および結腸直腸腺癌などの結腸直腸癌、膀胱癌、軟骨肉腫などの骨癌、トリプルネガティブ乳癌などの乳癌、神経膠芽腫、星状細胞腫、神経芽腫などの中枢神経系の癌、子宮頸癌、結合組織癌、子宮内膜癌、線維芽細胞癌、胃癌腫などの胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝細胞癌などの肝臓癌、NSCLCおよび肺扁平上皮癌などの肺癌、筋肉癌、神経組織癌、卵巣癌、膵管癌および膵臓腺癌などの膵臓癌、悪性黒色腫などの皮膚癌、ならびに軟部組織肉腫からなる群より選択される、請求項52および53のいずれか一項記載の使用または方法。
  57. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体、請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体、請求項30〜39のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート、請求項40記載の組成物、または請求項40記載の薬学的組成物の、それを必要とする個体への投与を含む、AXLを発現する腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法。
  58. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体を産生するための方法であって、
    a）請求項44〜47のいずれか一項記載の宿主細胞または請求項48記載のハイブリドーマを培養する工程、および
    b）培養培地から抗体を精製する工程
    を含む、方法。
  59. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体、または請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体を含む、診断用組成物。
  60. 試料におけるAXL抗体またはAXLを発現する細胞の存在を検出するための方法であって、
    a）試料と、請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体、請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体、または請求項30〜39のいずれか一項記載のイムノコンジュゲートとを、抗体、二重特異性抗体、またはイムノコンジュゲートとAXLとの間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程；および
    b）複合体が形成されているかどうかを解析する工程
    を含む、方法。
  61. 試料におけるAXL抗原またはAXLを発現する細胞の存在を検出するためのキットであって、
    i）請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体、請求項27〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗体、または請求項30〜39のいずれか一項記載のイムノコンジュゲート；および
    ii）該キットの使用説明書
    を含む、キット。
  62. 請求項1〜26のいずれか一項記載の抗AXL抗体に結合する、抗イディオタイプ抗体。
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