RS60012B1 - Antitela koja vezuju axl - Google Patents

Antitela koja vezuju axl

Info

Publication number
RS60012B1
RS60012B1 RS20200253A RSP20200253A RS60012B1 RS 60012 B1 RS60012 B1 RS 60012B1 RS 20200253 A RS20200253 A RS 20200253A RS P20200253 A RSP20200253 A RS P20200253A RS 60012 B1 RS60012 B1 RS 60012B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
axl
region
antibody
seq
binding
Prior art date
Application number
RS20200253A
Other languages
English (en)
Inventor
Esther Breij
David Satijn
Den Brink Edward Norbert Van
Dennis Verzijl
Jong Rob N De
Paul Parren
Dijkhuizen Radersma Riemke Van
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of RS60012B1 publication Critical patent/RS60012B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Description

Opis pronalaska
Oblast tehnike na koju se pronalazak odnosi
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela koja vezuju AXL, imunokonjugate, kompozicije koje sadrže takva antitela ili imunokonjugate i upotrebe navedenih antitela i imunokonjugata.
Poznato stanje tehnike
[0002] TAM potfamilija sisarskih Receptorskih tirozin kinaza (RTK) se sastoji od AXL, Tyro3 i Mer. AXL je transmembranski protein od 104-140 kDa koga karakterišu transformišuće sposobnosti [1]. AXL može biti aktiviran po vezivanju njegovog liganda, faktora specifičnog za zaustavljanje rasta tipa 6 zavisog od vitamina K (Gas6). Vezanje Gas6 za AXL dovodi do AXL dimerizacije, autofosforilacije i naknadne aktivacije unutarćelijskih signalnih puteva, poput PI3K/AKT, mitogenom aktivirane protein kinazne (MAPK), STAT i NF-κB kaskade [2]. U kancerskim ćelijama, AXL pojačava motilitet, invaziju, migraciju tumorskih ćelija i uključen je u prelazak epitela u mezenhim (EMT) [3]. Dodatno, pokazano je da ekspresija AXL ima ulogu u rezistenciji na hemoterapiju i cilјanu terapiju, kao što su cilјana terapija epidermalnog faktora rasta (EGFR) (Wilson 2014, Brand 2013, Zhang 2012) ili primena inhibitora B-raf (BRAF) puta (Muller, 2014).
[0003] Vanćelijski domen članova TAM familije receptora se sastoji od kombinacije dva N-terminalna domena slična imunoglobulinskim (Ig) i dva fibronektinska ponovka tipa III (FNIII) [1]. Ligand Gas6 se vezuje za domene slične Ig domenima I i II AXL-a [14].
[0004] Prijavljena je pozitivna regulacija AXL-a u raznim vrstama kancera, uklјučujući kancer želuca, prostate, jajnika i pluća [1]. Dodatno, AXL je prekomerno eksprimiran u kanceru dojke i pankreasa i značajno asocira sa većom učestalošću metastaza i sa lošim sveukupnim preživlјavanjem [2].
[0005] Cilјana inhibicija RTK može biti efektivna kao anti-tumorska i/ili metastatska terapija. Takva cilјana inhibicija AXL i/ili Gas6 liganda obuhvata i male molekule i anti-AXL antitela [3]. Opisana su tako anti-AXL antitela koja smanjuju rast ksenografta nesitnoćelijskog karcinoma pluća in vivo, negativnom regulacijom ekspresije receptora, smanjenjem proliferacije tumorskih ćelija i indukovanjem apoptoze [4]. Nadalje, opisana su razna monoklonska antitela koja blokiraju vezivanje Gas6 liganda za AXL [2], [5] i [7].
[0006] Anti-AXL antitela su prethodno opisana [8]-[13].
[0007] Dodatno, US 2012/121587 opisuje anti-AXL antitela Ax225, Ax284, Ax7 i Ax51. Ax225 se vezuje za FND1 iz AXL-a, Ax284 se vezuje za FND1, dok se IgD2, Ax7 i Ax51 vezuju za IgD2. Ax225 indukuje negativnu modulaciju AXL-a i ima anti-tumorska svojstva.
[0008] WO 2012/175691 opisuje mišje anti-AXL antitelo 20G7-D9, koje ne blokira vezivanje GAS6 i koje inhibira fosforilaciju AXL-a indukovanu ligandom i proliferaciju kancera. Epitop 20G7-d9 je konformacioni epitop i sastoji se od 3 peptida lokalizovana u IgD2, u FND1 i u FND2.
[0009] WO 2012/175692 opisuje nišje anti-AXL antitelo sa Kd od 1,6 nM, koje ne blokira vezivanje GAS6. Antitelo inhibira AXL ligandom indukovanu proliferaciju, ćelijsku migraciju i proliferaciju kancerskih ćelija. In vivo, ono smanjuje rast trostruko negativnog kancera dojke i kancera pankreasa, i vezuje konformacioni epitop koji sadrži 2 peptida lokalizovana u FND1 i FND2, tj. ostatke 229-235 i 378-390.
[0010] WO 2011/159980 opisuje anti-AXL antitela YW327.42 i YW327.6S2 koja blokiraju AXL funkciju sa Kd manjom od 2,5 nM. YW327.42 ne blokira vezivanje GAS6, dok YW327.6S2 blokira vezivanje liganda. YW327.42 se vezuje unutar aminokiselina 1-324, dok se YW327.6S2 vezuje unutar ostataka 1-134. YW327.42 je u kompeticiji sa antitelom 12A11, ali ne i sa antitelom 3G9, dok YW327.6S2 nije u kompeticiji sa bilo kojim od njih pri vezivanju za AXL. YW327.42 i YW327.6S2 smanjuju rast tumora.
[0011] Leconnet i saradnici, Oncogene 2013, str.55405-5414 opisuju upotrebu inhibitornih anti-AXL antitela D9 i E8, koja se takođe internalizuju da bi se smanjio rast tumora pankreasa. Oba antitela efikasno indukuju ADCC i nisu u kompeticiji sa GAS6 pri vezivanju za AXL.
[0012] WO 2011/014457 opisuje anti-AXL antitelo 12A11, koje ne utiče na vezivanje liganda i vezuje se za FND1 AXL-a.12A11 smanjuje rast tumorskih ćelija.
[0013] Liu i saradnici, Journal of the American Chemical Society, vol.116, 2, str.297-305 opisuju anti-AXL antitelo Mab173, koje smanjuje rast tumora, povećava apoptozu tumorskih ćelija i smanjuje nivo AXL proteina u tumorima. Mab173 smanjuje AXL endocitozom i vezuje se za prvi FND.
[0014] Ipak, ostaje potreba za anti-AXL antitelima koje karakteriše pobolјšana anti-tumorska aktivnost.
Kratko izlaganje suštine pronalaska
[0015] Predmet ovog pronalaska je da se obezbede anti-AXL antitela. Stoga, prema jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo koje se vezuje za AXL, pri čemu antitelo nije u kompeticiji za vezivanje za AXL sa ligandom specifičnim za zaustavljanja rasta tipa 6 (Gas6) i antitelo sadrži najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži varijabilni region teškog (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) izabran iz grupe koju čine:
a) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107];
b) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 93, 94 i 95, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 96, GAS i 97, redom, [613];
c) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 98, 99 i 100, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 101, DAS i 102, redom, [613-08];
d) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 93, 94 i 95, redom, i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 128, XAS, pri čemu je X D ili G, i 129, redom [613 / 613-08]; i
e) e) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID No.:93, 126 i 127, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 96, GAS i 97, redom [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06].
[0016] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvi vezujući region antitela prema pronalasku i drugi vezujući region koji vezuje drugačiji cilјni molekul ili epitop od navedenog prvog regiona za vezivanje antigena.
[0017] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku i terapijsku strukturu kao što je citotoksični agens, hemoterapijski lek, citokin, imunosupresiv, antibiotik ili radioizotop.
[0018] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži antitelo, bispecifično antitelo ili imunokonjugat prema pronalasku.
[0019] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo, bispecifično antitelo ili imunokonjugat prema pronalasku i farmaceutski prihvatlјiv nosač.
[0020] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na konstrukt nukleinske kiseline koji kodira antitelo prema pronalasku.
[0021] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ekspresioni vektor koji sadrži jedan ili više konstrukata nukleinske kiselinske prema pronalasku.
[0022] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži vektor prema pronalasku.
[0023] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na hibridom koji proizvodi antitelo prema pronalasku.
[0024] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo, bispecifično antitelo ili imunokonjugat prema pronalasku za upotrebu u vidu medikamenta.
[0025] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo, bispecifično antitelo ili imunokonjugat prema pronalasku za upotrebu u lečenju kancera.
[0026] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju antitela prema pronalasku, postupak koji obuhvata korake a) kultivacije ćelije domaćina ili hibridoma prema pronalasku i b) prečišćavanje antitela iz medijuma za kulturu.
[0027] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na dijagnostičku kompoziciju koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku.
[0028] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za detekciju prisustva AXL antitela ili ćelije koja eksprimira AXL u uzorku, koji obuhvata korake a) dovođenje uzorka u kontakt sa antitelom, bispecifičnim antitelom, imunokonjugatom prema pronalasku, pod uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa između antitela, bispecifičnog antitela ili imunokonjugata i AXL-a; i b) analizu da li se kompleks obrazovao.
[0029] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na komplet za detekciju prisustva AXL antigena ili ćelije koja eksprimira AXL u uzorku, koji sadrži i) antitelo, bispecifično antitelo ili imunokonjugat prema pronalasku; i ii) uputstva za upotrebu kompleta.
[0030] Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na anti-idiotipsko antitelo koje se vezuje za anti-AXL antitelo prema pronalasku.
Kratak opis slika nacrta
[0031]
Slika 1: Krive vezivanja anti-AXL antitela za HEK293 ćelije transektovane sa (A) humanim AXL-ECD, (B) AXL-ECD makaki majmuna ili (C) mišjim AXL-ECD. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) iz jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 2.
Slika 2: Vezivanje anti-AXL antitela za AXL himere miša i čoveka je urađeno kao što je opisano u Primeru 3. Ispitivani su sledeći himerni proteini Homo sapiens AXL-a (hsAXL) i Mus musculus AXL-a (mmAXL): (A) hsAXL i mock, (B) hsAXL-mmECD, (C) hsAXL-mmIg1, (D) hsAXL-mmIg2, (E) hsAXL-mmFN1, (F) hsAXL-mmFN2.
Slika 3: Citotoksičnost posredovana ćelijama i zavisna od anti-AXL antitela u A431 ćelijama. Citotoksičnost posredovana ćelijama i zavisna od anti-AXL antitela u A431 ćelijama je određivana kao što je opisano u Primeru 4.
Slika 4: Karakteristike vezivanja konjugata AXL antitela i leka (AXL-ADC). Vezivanje AXL-ADC za HEK293T ćelije tranzientno transfektovane sa humanim AXL je određivano kao što je opisano u Primeru 5. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) iz jednog reprezentativnog eksperimenta.
Slika 5: In vitro citotoksičnost indukovana konjugatima AXL antitela i leka. Indukcija citotoksičnosti konjugatima AXL antitela i leka je određivana kao što je objašnjeno u Primeru 6.
Slika 6: Varijante VH i VL antitela koje omogućavaju vezivanje za AXL. Antitela sa identičnim VL ili VH regionima su poravnata i identifikovane su i na slikama uokvirene razlike u VH (Slike A-D) ili VL (Slika E) sekvencama, tim redom. CDR regioni su podvučeni.
Slika 7: Indukcija citotoksičnosti sa ADC u LCLC-103H ćelijama je određivana kao što je opisano u Primeru 8.
Figura 8: Anti-tumorska aktivnost AXL antitela konjugovanih sa MMAE u terapijskom LCLC-103H ksenograftnom modelu, utvrđena kao što je opisano u Primeru 9.
Slika 9: Imunohistohemijsko bojenje preseka zamrznutih PAXF1657 tumora (PDX model kancera pankreasa) upotrebom više objedinjenih AXL monoklonskih antitela, kao što je opisano u Primeru 10.
Slika 10: (A) Prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana PAXF1657 modela sa AXL-ADC. Nekonjugovani AXL Humab (C) i ADC koji nije sa ciljanim dejstvom (D) ne pokazuju anti-tumorsku aktivnost, što ukazuje da je terapijski kapacitet AXL-ADC zavisio od citotoksične aktivnosti MMAE i od cilјanog vezivanja, pri čemu grafičke vrednosti greške predstavlјaju S.E.M..
Slika 11: Vezivanje anti-AXL antitela za AXL himere miša i čoveka rađeno je kao što je opisano u Primeru 11. Ispitivani su sledeći himerni proteini Homo sapiens AXL-a (hsAXL) i Mus musculus AXL-a (mmAXL): (A) hsAXL i mock, (B) hsAXL-mmECD, (C) hsAXL-mmIg1, (D) hsAXL-mmIg2, (E) hsAXL-mmFN1, (F) hsAXL-mmFN2.
Slika 12: Vezivanje humanog Gas6 (hGas6) na A431 ćelije koje su prethodno inkubirane sa antitelom koje se vezuje za Ig1 domen AXL-a. Prikazani podaci su srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) iz jednog reprezentativnog eksperimenta.
Slika 13: Anti-tumorska aktivnost AXL antitela konjugovanih sa MMAE u terapijskom A431 ksenograftnom modelu koji proizvodi visok nivo endogenog Gas6, kao što je opisano u Primeru 13. Paneli A i B pokazuju rezultate iz dva nezavisna eksperimenta.
Slika 14: Anti-tumorska aktivnost AXL antitela konjugovanih sa MMAE u terapijskom LCLC-103H ksenograftnom modelu koji eksprimira niske nivoe endogenog Gas6, kao što je opisano u Primeru 13. Paneli A i B pokazuju rezultate iz 2 nezavisna eksperimenta.
Slika 15: Indukcija citotoksičnosti sa AXL-ADC u A431 ćelijama (A) i MDA-MB231 ćelijama (B) je određivana kao što je opisano u Primeru 8.
Slika 16. Bojenje AXL u kanceru štitne žlezde, jednjaka, jajnika, dojke, pluća, pankreasa, grlića materice i endometrijuma. Prosečan intenzitet AXL bojenja (OD) AXL-pozitivnih ćelija je unet shodno X-osi grafika, dok je procenat AXL-pozitivnih tumorskih ćelija unošen u odnosu na Y-osu. Svaka tačka predstavlјa vrednost za centralni region tumora, izdvojen iz pojedinačnog patenta.
Slika 17. Reprezentativni primeri centralnih regiona tumora imunobojenih na AXL sa različitim tumorskim indikacijama.
Slika 18. AXL antitela se specifično vezuju za AXL, ali ne i za ostale članove familije TAM receptora. Vezanje HuMab-AXL antitela za HEK293 ćelije transfektovane sa humanim AXL (A), humanim MER (B), humanim TYRO3 (C) ili HEK293 ćelije koje nisu transfektovane (D). Da bi se potvrdila pravilna ekspresija transfektovanih ćelija, netransfektovane HEK293F ćelije i ćelije koje su transfektovane sa AXL (E), MER (F) ili TYRO3 (G) su obojene antitelima specifičnim za MER i TYRO3. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) iz jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 15.
Slika 19. Detekcija AXL antitela na plazma membrani tumorskih ćelijskih linija koje su bile inkubirane sa AXL antitelom tokom 1 sata na 4°C, nakon čega je sledila inkubacija preko noći na 4°C ili 37°C. I u MDA-MB-231 (A i B) i u Calu-1 ćelijama (C i D), više antitela je detektovano na plazma membrani ćelija koje su bile inkubirane na 4°C nego na ćelijama koje su inkubirane na 37°C, što ilustruje internalizaciju antitela vezanog za membranu na 37°C.
Slika 20. Geometrijska sredina intenziteta fluorescencije LCLC-103H ćelija nakon inkubacije sa AXL antitelima koja su bila u kompleksu sa Fab-TAMRA/QSY7. Samostalni tretman sa IgG1-b12 i Fab-TAMRA/QSY7 je bio uključen u vidu negativnih kontrola.
Slika 21. (A) Prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-AXL-107-vcMMAE u PDX modelu ES0195 kancera jednjaka. IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE su bili uklјučeni kao izotipska kontrolna antitela i izotipski kontrolni ADC, tim redom. (B) Veličina tumora kod pojedinačnih miševa 32. dana nakon injeciranja MDA-MB-231-luc D3H2LN tumorskih ćelija u jastučiće masnih naslaga dojki kod ženki SCID miševa. *p<0,05; **p<0,0001
Slika 22. Terapijski efekat AXL-ADC u ksenograftnom modelu kancera grlića materice dobijenom iz pacijenata. (A) Prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE u PDX modelu CEXF 773 kancera grlića materice. IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE su bili uklјučeni kao izotipska kontrolna antitela i izotipski kontrolni ADC, tim redom. (B) Veličina tumora u pojedinačnim miševima 28. dana nakon započinjanja lečenja u PDX modelu CEXF 773 kancera grlića materice. *p<0,001.
Slika 23. Terapijska aktivnost AXL-ADC u ortotopskom ksenograftnom modelu kancera dojke. (A) Prosečna veličina tumora nakon terapijskog tretmana sa IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE u ortotopskom ksenograftnom modelu MDA-MB-231-luc D3H2LN. IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE su bili uklјučeni kao izotipska kontrolna antitela i izotipski kontrolni ADC, tim redom. (B) Veličina tumora kod pojedinačnih miševa 32. dana nakon injeciranja MDA-MB-231-luc D3H2LN tumorskih ćelija u jastučiće masnih naslaga dojki kod ženki SCID miševa. *<0,001.
Slika 24. Citotoksičnost IgG1-AXL-107-vcMMAE u humanim tumorskim ćelijskim linijama sa različitim nivoima AXL ekspresije na plazma membrani. Ekspresija AXL u plazma membrani humanih tumorskih ćelijskih linija je ispitivana upotrebom Qifikit analize, dok je citotoksičnost IgG1-AXL-107-vcMMAE izražena kao procenat vijabilnih tumorskih ćelija koje su ostale u ćelijskim kulturama nakon izlaganja 1 µg/mL IgG1-AXL-107-vcMMAE.
Detalјan opis pronalaska
Antitela
[0032] Prema jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo koje se vezuje za AXL, pri čemu antitelo nije u kompeticiji za vezanje za AXL sa ligandom specifičnim za zaustavljanje rasta tipa 6 (Gas6) i antitelo sadrži najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži varijabilni region teškog (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) izabran iz grupe koju čine:
a) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107];
b) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 93, 94 i 95, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 96, GAS i 97, redom, [613];
c) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 98, 99 i 100, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 101, DAS i 102, redom, [613-08];
d) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 93, 94 i 95, redom, i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 128, XAS, pri čemu je X D ili G, i 129, redom [613 / 613-08]; i
e) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID No.:93, 126 i 127, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 96, GAS i 97, redom [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06].
[0033] Predviđeno je da se termin "antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi na imunoglobulinski molekul, fragment imunoglobulinskog molekula, ili na derivat bilo koga od njih, koji je sa sposobnoću da se specifično veže za antigen pod uobičajenim fiziološkim i/ili uslovima specifičnim za tumore, sa polu-životom u vidu značajnih vremenskih perioda, kao što je najmanje oko 30 minuta, najmanje oko 45 minuta, najmanje oko jednog sata, najmanje oko dva sata, najmanje oko četiri sata, najmanje oko 8 sati, najmanje oko 12 sati, oko 24 sata ili više, oko 48 sati ili više, oko 3, 4, 5, 6, 7 ili više dana itd., ili u vidu bilo kog drugog relevantnog funkcionalno definisanog perioda (kao što je vreme dovolјno da se indukuje, pospeši, pojača i/ili moduliše fiziološki odgovor udružen sa vezivanjem antitela za antigen i/ili vreme dovolјno da se antitelo internalizuje). Region za vezivanje (ili vezujući domen, kako se ovde takođe upotrebljava, oba su istog značenja) koji intreaguje sa antigenom, sadrži varijabilne regione i teških i lakih lanaca imunoglobulinskog molekula. Konstantni regioni antitela (Abs) mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uklјučujući razne ćelije imunog sistema (poput efektorskih ćelija) i komponente sistema komplemenata kao što je C1q, prva komponenta u klasičnom putu aktivacije sistema komplementata. Kao što je prethodno naznačeno, termin antitelo, kako se ovde upotrebljava, osim ukoliko je drugačije navedeno ili jasno suprotstavlјeno kontekstu, uključuje fragmente antitela koja zadržavaju sposobnost da specifično interaguju, kao što je da se vezuju, sa antigenom. Pokazano je da funkcija antitela da vezuje antigen može biti ostvarena fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata koji su obuhvaćeni pojmom "antitelo" uklјučuju (i) Fab' ili Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena, ili monovalentno antitelo kao što je opisano u [15]; (ii) F(ab')2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se suštinski sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se suštinski sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment [16], koji se suštinski sastoji od VH domena i naziva se i domenskim antitelom [17]; (vi) kamelidna ili nano antitela [18] i (vii) izolovan region koji određuje komplementarnost (CDR). Štaviše, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana razdvojenim genima, oni mogu biti spojeni upotrebom postupaka rekombinantne tehnologije, sintetskim linkerom koji im omogućava da budu napravlјeni kao jedinstven proteinski lanac u kome se VL i VH regioni uparuju tako da se obrazuju monovalentni molekuli (poznati kao jednolančana antitela ili jednolančani Fv (scFv), pogledati na primer [19] i [20]). Takva jednolančana antitela su obuhvaćena terminom antitela, osim ukoliko nije drugačije navedeno ili jasno naznačeno kontekstom. Iako su takvi fragmenti uglavnom obuhvaćeni značenjem pojma antitelo, oni zajedno i svaki nezavisno predstavljaju jedinstvene karakteristike predmetnog pronalaska, ispoljavajući različite biološke osobine i korisnost. Ovakvi i drugi korisni fragmenti antitela se ovde dalje razmatraju u kontekstu predmetnog pronalaska. Takođe se podrazumeva da termin antitelo, ukoliko nije drugačije specifično navedeno, obuhvata i poliklonska antitela, monoklonska antitela (mAbs), polipeptide slične antitelima, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela, kao i „fragmente antitela“ ili „njihove fragmente“ koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen (fragmenti koji vezuju antigen), a koji se obezbeđuju bilo kojom poznatom tehnikom poput enzimskog cepanja, sinteze peptida i rekombinantnih tehnika, uz zadržavanje sposobnosti da budu konjugovani sa toksinom. Ovako generisana antitela mogu biti bilo kog izotipa.
[0034] Predviđeno je da se termini "imunoglobulinski teški lanac" ili "teški lanac imunoglobulina", kako se ovde upotrebljavaju, odnose na jedan od teških lanaca imunoglobulina. Teški lanac se obično sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćenog kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca (ovde skraćenog kao CH) koji definiše izotip imunoglobulina. Konstantni region teškog lanca se obično sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Predviđeno je i da se termin "imunoglobulin", kako se ovde upotrebljava, odnosi na klasu strukturno srodnih glikoproteina koji se sastoje od dva para polipeptidnih lanaca, jednog para lakih (L) lanaca niske molekulske težine i jednog para teških (H) lanaca, pri čemu su sva četiri potencijalno međusobno povezana disulfidnim vezama. Struktura imunoglobulina je dobro okarakterisana (pogledati, na primer, [21]). Unutar strukture imunoglobulina, dva teška lanca su međusobno povezana disulfidnim vezama u takozvanom "zglobnom regionu". Isto kao i teški lanci, svaki laki lanac se obično sastoji od nekoliko regiona; varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćenog kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se obično sastoji od jednog domena, CL. Dalјe, VH i VL regioni mogu dodatno biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti (ili hipervarijabilne regione koji mogu biti hipervarijabilni u sekvenci i/ili obliku strukturno definisanih petlјi), koji se označavaju i kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR-ovi), a koji se smenjuju sa regionima koji su više evolutivno očuvani i označeni kao uokvirujući regioni (FR). Svaki VH i VL se obično sastoji od tri CDR sekvence i četiri FR sekvence, raspoređene od aminokraja ka karboksilnom-kraju po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR sekvence su definisane u skladu sa IMGT (pogledati [22] i [23]).
[0035] Termini "region koji vezuje antigen" ili "vezujući region", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na regione antitela koji su sposovni da se vezuju za antigen. Antigen može biti bilo koji molekul, poput polipeptida, npr. prisutnog na ćeliji, bakteriji ili virusnoj partikuli. Termini "antigen" i "mesto ciljanog dejstva" se mogu, u kontekstu predmetnog pronalaska, koristiti naizmenično, osim ukoliko to nije suprotno kontekstu.
[0036] Termin "vezivanje", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na vezivanje antitela na unapred određeni antigen ili ciljni molekul, obično sa afinitetom vezivanja koji odgovara KDod oko 10<-6>M ili manje, npr.10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje, oko 10<-10>M ili manje ili oko 10<-11>M ili čak manje, što se određuje, na primer, tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR), upotrebom BIAcore 3000 instrumenta koji koristi antigen kao ligand i protein kao analit, kao i vezivanje antitela za unapred određeni antigen sa afinitetom koji odgovara KDkoja je najmanje deset puta niža, kao što je najmanje 100 puta niža, na primer najmanje 1000 puta niža, kao što je najmanje 10.000 puta niža, na primer najmanje 100.000 puta niža od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifičan antigen (npr. BSA, kazein), a koji je drugačiji u odnosu unapred određen antigen ili blisko srodan antigen. Količina sa kojom je afinitet niži zavisi od KDproteina, tako da kada je KDproteina veoma niska (to jest, protein je visoko specifičan), količina sa kojom je afinitet za antigen niži od afiniteta za nespecifičan antigen može biti najmanje 10000 puta. Termin "KD" (M), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitela i antigena i dobija se delјenjem kdsa ka.
[0037] Termin "kd" (sek<-1>), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na konstantu stope disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Navedena vrednost se takođe označava kao koffvrednost ili stopa disocijacije.
[0038] Termin "ka" (M<-1>x sec<-1>), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na konstantu stope asocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Navedena vrednost se takođe označava kao konvrednost ili stopa asocijacije.
[0039] Termin "KA" (M<-1>), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na ravnotežnu konstantu asocijacije određene interakcije antitelo-antigen i dobija se delјenjem kasa kd.
[0040] Termin "AXL", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na protein naslovljen kao AXL, koji se označava i kao UFO ili JTK11, a koji predstavlja protein od 894 aminokiselina sa molekulskom težinom od 104-140 kDa, koji je deo potfamilije sisarskih TAM Receptorskih tirozin kinaza (RTK). Molekulska težina je varijabilna usled potencijalnih razlika u glikozilaciji proteina. AXL protein se sastoji od dva vanćelijska domena slična imunoglobulinskim (Ig-slična) na N-terminalnom kraju proteina, dva vanćelijska fibronektinska domena tipa III (FNIII) koji se postavljaju proksimalno u odnosu na membranu, transmembranskog domena i unutarćelijskog kinaznog domena. AXL se aktivira nakon vezivanja njegovog liganda Gas6, homofilnim interakcijama nezavisnim od liganda između vanćelijskih domena AXL, autofosforilacijom u prisustvu reaktivnih vrsta kiseonika [24] ili transaktivacijom preko EGFR-a (Meyer, 2013) i aberantno se eksprimira u nekoliko tipova tumora. Kod lјudi, AXL protein je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:130 (humani AXL protein: Swissprot P30530; AXL protein makaki majmuna: pristupni broj u Genbank bazi podataka - HB387229.1)).
[0041] Termin "homofilne interakcije nezavisne od liganda", kako se ovde upotrebljava, odnose se na asocijaciju između dva AXL molekula (koji su eksprimirani na susednim ćelijama) koja se odvija u odsustvu liganda.
[0042] Termin "antitelo koje vezuje AXL", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koje antitelo koje vezuje epitop na vanćelijskom delu AXL-a.
[0043] Termin "epitop" označava proteinsku determinant sposobnu da se specifično vezuje za antitelo. Epitopi se obično sastoje od površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera ili njihove kombinacije, i obično ih karakterišu specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prvonavedene, ali ne i za drugonavedene epitope, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop može sadržavati aminokiselinske ostatke koji su direktno uklјučeni u vezivanje i druge aminokiselinske ostatke koji nisu direktno uklјučeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koji su efektivno blokirani ili prekriveni specifičnim peptidom koji vezuje antigen (drugim rečima, aminokiselinski ostatak je unutar regiona “otiska” specifičnog peptida koji vezuje antigen).
[0044] Termin "ligand", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na supstancu, kao što je hormon, peptid, jon, lek ili protein, koja se specifično i reverzibilno vezuje za drugi protein, kao što je receptor, da bi se obrazovao veći kompleks. Vezanje liganda za receptor može izmeniti njegovu hemijsku konformaciju i odrediti njegovo funkcionalno stanje. Na primer, ligand može funkcionisati kao agonista ili antagonista.
[0045] Termini "ligand specifičan za zaustavljanje rasta tipa 6" ili "Gas6", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na protein od 721 aminokiseline, molekulske težine od 75-80 kDa, koji funkcioniše kao ligand za TAM familiju receptora, uklјučujući AXL. Gas6 se sastoji od N-terminalnog regiona koji sadrži više ostataka gama-karboksiglutaminske kiseline (Gla) koji su odgovorni za specifičnu interakciju sa negativno naelektrisanom fosfolipidnom membranom. Iako Gla domen nije neophodan za vezivanje Gas6 za AXL, potreban je za aktivaciju AXL. Gas6 se takođe može označiti kao "ligand za AXL".
[0046] Termini "monoklonsko antitelo", "monoklonsko At", "kompozicija monoklonskog antitela", "mAb" ili slično, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na pripremu molekula antitela za jednomolekulske kompozicije. Kompoziciju monoklonskog antitela karakterišu jedinstvena specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Prema tome, termin "humano monoklonsko antitelo" se odnosi na antitela koja karakteriše jedinstvena sposobnost vezivanja i koja sadrže varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana monoklonska antitela mogu biti proizvedena od strane hibridoma koji uklјučuje B ćeliju dobijenu iz transgene ili transhromozomske životinje različite od čoveka, kao što je transgeni miš, a koja je sa genomom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen lakog lanca, i koja je fuzionisana sa imortalizovanom ćelijom.
[0047] U jednom primeru izvođenja, maksimalno vezivanje antitela u prisustvu Gas6 je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 97%, kao što je najmanje 99%, kao što je vezivanja od 100% u odsustvu Gas6, a koje je određivano postupkom opisanim u Primeru 2.
[0048] Kompeticija između anti-AXL i Gas6 liganda za AXL može biti određena kao što je opisano u Primeru 2 pod naslovom „Interferencija anti-AXL vezivanja sa vezivanjem Gas6“. Stoga, predmetni opis obezbeđuje antitelo koje nije u kompeticiji za AXL vezivanje sa Gas6 ligandom, pri čemu se kompeticija u vezivanju određuje testom koji obuhvata korake
i) inkubiranje ćelija koje eksprimiraju AXL sa Gas6,
ii) dodavanje anti-AXL antitela koja se ispituju,
iii) dodavanje fluorescentno obeleženog sekundarnog reagensa koji detektuje anti-AXL antitela i
iv) analiza ćelija FACS postupkom.
[0049] Antitelo može biti ono koje nije u kompeticiji za vezivanje sa ligandom Gas6, pri čemu se kompeticija u vezivanju određuje analizom koja obuhvata korake
i) inkubiranje ćelija koje eksprimiraju AXL sa anti-AXL antitelom,
ii) dodavanje Gas6,
iii) dodavanje fluorescentno označenog sekundarnog reagensa koji detektuje Gas6 i
iv) analiza ćelija FACS postupkom.
[0050] U jednom primeru izvođenja, antitelo je sa afinitetom vezivanja (KD) za AXL opsega od 0,3x10<-9>do 63x10<-9>M, pri čemu se navedeni afinitet vezivanja meri upotrebom Interferometrije Bio-sloja sa solubilnim vanćelijskim domenom AXL-a.
[0051] Afinitet vezivanja može biti određen kao što je opisano u Primeru 2. Tako, antitelo može biti sa afinitetom vezivanja za antigen od 0,3x10<-9>do 63x10<-9>M, pri čemu se afinitet vezivanja određuje postupkom koji obuhvata korake;
i) nanošenje anti-AXL antitela na Capture biosensore sa anti-humanim Fc, i
ii) određivanje asocijacije i disocijacije solubilnog rekombinantnog AXL vanćelijskog domena Interferometrijom Bio-sloja u različitim koncentracijama.
[0052] Termin "solubilni rekombinantni AXL vanćelijski domen", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na vanćelijski domen AXL-a koji je rekombinantno eksprimiran. Usled odsustva transmembranskog i unutarćelijskog domena, rekombinantni AXL vanćelijski domen nije vezan za, npr. površinu ćelije, i ostaje u rastvoru. Poznato je kako rekombinantno eksprimirati protein, pogledati npr. [25], i stoga je unutar opsega znanja stručnjaka da obezbediti takav rekombinantni AXL vanćelijski domen.
[0053] U jednom primeru izvođenja, antitelo je sa stopom disocijacije od AXL-a od 6,9x10<-5>s<-1>do 9,7x10<-3>s<-1>, pri čemu se stopa disocijacije meri Interferometrijom Bio-sloja upotrebom solubilnog rekombinantnog AXL vanćelijskog domena.
[0054] Afinitet vezivanja može biti određen kao što je prethodno opisano (i u Primeru 2). Tako, antitelo može biti sa stopom disocijacije za AXL od 6,9x10<-5>s<-1>do 9,7x10<-3>s<-1>, i pri čemu se stopa disocijacije meri postupkom koji obuhvata korake
i) nanošenje anti-AXL antitela na Capture biosensore sa anti-humanim Fc, i
ii) određivanje asocijacije i disocijacije rekombinantnog AXL vanćelijskog domena
[0055] Interferometrijom Bio-sloja u različitim koncentracijama.
[0056] Termin "stopa disocijacije", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na brzinu kojom se antitelo specifično za antigen vezuje za svoj antigen, disocira od tog antigena i izražava se u s<-1>. Prema tome, u kontekstu antitela koje vezuje AXL, termin "stopa disocijacije" se odnosi na disosovanje antitela koje vezuje AXL od rekombinantnog AXL vanćelijskog domena i izražava se s<-1>.
[0057] AXL može biti humani AXL. Aminokiselinska sekvenca AXL je u skladu sa Swissprot P30530.
[0058] AXL može biti AXL makaki majmuna (pristupni broj u Genbank - HB387229.1).
[0059] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence varijabilnog teškog lanca (VH) koje su najmanje 95%, kao što je najmanje 96%, kao što je najmanje 97%, kao što je najmanje 98%, kao što je najmanje 99%, identične sekvencama koje su izabrane iz grupe koja se sastoji od:
a) SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom [107];
b) SEQ ID Nos.: 93, 94 i 95, redom [613];
c) SEQ ID Nos.: 93, 126 i 127, redom [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06];
d) SEQ ID Nos.: 83, 84 i 85, redom [608-01];
e) SEQ ID Nos.: 88, 89 i 90, redom [610-01];
f) SEQ ID Nos.: 98, 99 i 100, redom, [613-08]; i
g) SEQ ID Nos.: 103, 104 i 105, redom [620-06].
[0060] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence varijabilnog teškog lanca (VH) sa ukupno najviše 5 mutacija ili supstitucija, kao što je najviše 4 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 3 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 2 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 1 mutacija ili supstitucija duž CDR sekvenci u navedenom varijabilnom teškom lancu, izabran iz grupe koja se sastoji od:
a) SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom [107];
b) SEQ ID Nos.: 93, 94 i 95, redom [613];
c) SEQ ID Nos.: 93, 126 i 127, redom [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06];
d) SEQ ID Nos.: 83, 84 i 85, redom [608-01];
e) SEQ ID Nos.: 88, 89 i 90, redom [610-01];
f) SEQ ID Nos.: 98, 99 i 100, redom, [613-08]; i
g) SEQ ID Nos.: 103, 104 i 105, redom [620-06].
[0061] Mutacije ili supstitucije poput do pet mutacija ili supstitucija mogu biti dozvoljene duž tri CDR sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca. Mutacije ili supstitucije mogu biti sa konzervativnim, fizičkim ili funkcionalnim aminokiselinama tako da mutacije ili supstitucije ne menjaju epitop ili, poželjno, ne modifikuju afinitet vezivanja za epitop za više od 30%, kao što je više od 20% ili kao što je više od 10%. Konzervativne, fizičke ili funkcionalne aminokiseline su izabrane od 20 prirodnih aminokiselina, tj. od Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr i Val.
[0062] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH), izabran iz grupe koja se sastoji od;
a) SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom [107];
b) SEQ ID Nos.: 93, 94 i 95, redom [613];
c) SEQ ID Nos.: 93, 126 i 127, redom [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06];
d) SEQ ID Nos.: 83, 84 i 85, redom [608-01];
e) SEQ ID Nos.: 88, 89 i 90, redom [610-01];
f) SEQ ID Nos.: 98, 99 i 100, redom, [613-08]; i
g) SEQ ID Nos.: 103, 104 i 105, redom [620-06].
[0063] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan region za vezivanje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) sa najviše 10 mutacija ili supstitucija, najviše 5 mutacija ili supstitucija, kao što je najviše 4 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 3 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 2 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 1 mutacija ili supstitucija duž navedenih sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca i varijabilnih regiona lakih lanaca, i izabran je iz grupe koju čine;
a) VH region koji obuhvata SEQ ID No.: 1 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.: 2 [107];
b) VH region koji obuhvata SEQ ID No.: 25 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.: 26 [613];
c) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:21 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:22 [608-01];
d) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:23 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:24 [610-01];
e) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:27 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:28 [613-08]; i
f) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:29 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:30 [620-06].
[0064] U varijabilnom regionu teškog i varijabilnom regionu lakog lanca može biti dozvolјeno do 10 mutacija ili supstitucija. Do 10 mutacija ili supstitucija može biti raspoređeno duž pune dužine varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca svakog vezujućeg regiona. Mutacije ili supstitucije mogu biti sa konzervativnim, fizičkim ili funkcionalnim aminokiselinama, tako da mutacije ili supstitucije ne menjaju epitop i poželјno ne menjaju afinitet vezivanja za epitop za više od 30%, kao što je više od 20% ili kao što je više od 10%. Konzervativne, fizičke ili funkcionalne aminokiseline mogu biti izabrane od 20 prirodno pronađenih aminokiselina, tj. od Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr i Val.
[0065] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region je izabran iz grupe koju čine;
a) VH region koji obuhvata SEQ ID No.: 1 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.: 2 [107];
b) VH region koji obuhvata SEQ ID No.: 25 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.: 26 [613];
c) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:21 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:22 [608-01];
d) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:23 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:24 [610-01];
e) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:27 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:28 [613-08]; i
f) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:29 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:30 [620-06].
[0066] Mutacije ili supstitucije poput do 10 mutacija ili supstitucija mogu biti dopuštene duž varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca. Do 10 mutacija ili supstitucija može biti raspoređeno duž varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca. Do 10 mutacija ili supstitucija može biti raspoređeno duž regiona za vezivanje. Mutacije ili supstitucije mogu biti sa konzervativnim, fizičkim ili funkcionalnim aminokiselinama, tako da mutacije ili supstitucije ne menjaju epitop ili modifikuju vezivanje za epitop.
[0067] Predmetni opis obezbeđuje antitela koja se vežu za AXL vanćelijski domen bez kompeticije sa ili ometanja vezivanja Gas6 za AXL. Preciznije, antitelo se može vezati za vanćelijski domen sličan Ig1 domenu bez kompeticije sa ili ometanja vezivanja Gas6 za AXL. Antitelo se može vezivati za vanćelijski domen sličan Ig1 domenu i ispoljiti smanjenje vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 20%. Preciznije, antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 15%. Antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 10%. Antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 5%. Antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 4%. Antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 2%. Antitelo može ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 1%. Antitelo se može vezivati za vanćelijski domen sličan Ig2 domenu bez kompeticije sa ili ometanja vezivanja Gas6 za AXL. Antitelo se može vezati za vanćelijski domen sličan Ig2 i ispoljiti smanjenje maksimalnog vezivanja Gas6 za AXL koje nije veće od 20%, kao što je ono koje nije veće od 15%, kao što je ono koje nije veće od 10%, kao što je ono koje nije veće od 5%, kao što je ono koje nije veće od 4%, kao što je ono koje nije veće od 2%, kao što je ono koje nije veće 1%. U kontekstu predmetnog opisa, sposobnost da bude u kompeticiji sa ili da redukuje vezivanje Gas6 može biti određeno kao što je opisano u Primeru 2 ili Primeru 12. U jednom primeru izvođenja, antitelo se vezuje za vanćelijski domen sličan Ig2 domenu bez kompeticije sa ili interferiranja sa maksimalnim vezivanjem Gas6 za AXL.
[0068] Postupci određivanja epitopa za koje se antitelo vezuje su dobro poznati u oblasti tehnike, tako da će stručnjaku biti poznato kako da odredi takav epitop. Međutim, primer utvrđivanja da li se antitelo vezuje unutar bilo kog epitopa koji je ovde definisan bi bio putem tačkastih mutacija u AXL vanćelijskom domenu. Stručnjak će takođe znati da uvede tačkastu(e) mutaciju(e) u AXL vanćelijski domen i da ispita vezivanje antitela za AXL vanćelijski domen sa tačkastim mutacijama. Kada se odnosi na pozicije aminokiselina unutar AXL proteina u kontekstu epitopa, sistem numeracije se određuje kao što je opisano u Primeru 7. Tako se numeracija aminokiselinskih pozicija koje defefinišu epitop vrši na osnovu sekvenci koje su navedene na Slici 6, tj. prva aminokiselina u prikazanoj sekvenci je numerisana kao pozicija '1', druga kao pozicija '2' itd.
[0069] Antitelo se može vezivati za epitop unutar domena sličnog Ig1 domenu u AXL, pri čemu epitop sadrži ili zahteva aminokiseline koje odgovaraju pozicijama od L121 do Q129 ili od T112 do Q124 u humanom AXL-u. U jednom primeru izvođenja, antitelo se vezuje za epitop unutar domena sličnog Ig1 domenu AXL-a, pri čemu epitop sadrži ili zahteva jednu ili više aminokiselina koje odgovaraju pozicijama od L121 do Q129 ili od T112 do Q124 humanog AXL-a. Epitop može sadržavati jednu ili više aminokiselina na poziciji L121, G122, H123, Q124, T125, F126, V127, S128, Q129 ili više aminokiselina na poziciji T112, G113, Q114, Y115, Q116, C117, L118, V119, F120, L121, G122, H123, Q124.
[0070] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži teški lanac izotipa izabranog iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.
[0071] Termin "izotip", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na imunoglobulinsku klasu (na primer IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM) ili bilo koji alotip iste, kao što je IgG1m(za) i IgG1m(f)), kodiran genima konstantnog regiona teškog lanca. Dodatno, svaki se izotip teškog lanca može kombinovati sa kapa (κ) ili lambda (λ) lakim lancem.
[0072] U jednom primeru izvođenja, izotip je IgG1, opciono alotipa IgG1m(f).
[0073] U jednom primeru izvođenja, antitelo je monoklonsko antitelo pune dužine, opciono monoklonsko IgG1, κ antitelo pune dužine.
[0074] Termin "antitelo pune dužine", kada se ovde koristi, odnosi se na antitelo (npr. matično ili varijantu antitela) koje sadrži sve konstantne i varijabilne domene teških i lakih lanaca koji odgovaraju onima koja se normalno nalaze u antitelu tog izotipa divlјeg tipa. Antitelo pune dužine u skladu sa predmetnim pronalaskom može biti proizvedeno postupkom koji obuhvata korake (i) kloniranja CDR sekvenci u pogodan vektor koji sadrži kompletne sekvence teškog lanca i kompletnu sekvencu lakog lanca, i (ii) ekspresiju kompletnih sekvenci teških i lakih lanaca u odgovarajućim ekspresionim sistemima. Stručnjaku je poznat način proizvodnje antitela pune dužine kada se polazi bilo od CDR sekvenci ili potpunih sekvenci varijabilnih regiona. Stoga, stručnjaku će biti poznato kako da proizvede antitelo pune dužine prema predmetnom pronalasku.
[0075] Antitelo može biti humano antitelo.
[0076] Predviđeno je da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata antitela koja sadrže varijabilne i uokvirujuće regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci i humanog imunoglobilinskog konstatnog domena. Humana antitela predmetnog opisa mogu sadržavati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr. uvedeni su mutacijama, insercijama ili delecijama, nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Ipak, nije predviđeno da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativnih sekvenci druge vrste, različite od čoveka, poput miša, i ugrađene u humane uokvirujuće sekvence.
[0077] Kao što se ovde upotrebljava, humano antitelo je „izvedeno iz“ određene germinativne sekvence ukoliko je antitelo dobijeno iz sistema koji koristi humane imunoglobulinske sekvence, na primer imunizacijom transgenog miša koji nosi humane imunoglobulinske gene ili skriningom biblioteke humanih imunoglobulinskih gena, a pri čemu je odabrano humano antitelo najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, na primer najmanje 96%, kao što je najmanje 97%, na primer najmanje 98%, ili kao što je najmanje 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom koja je kodirana germinativnim imunoglobulinskim genom. Uobičajeno je da osim CDR3 teškog lanca, humano antitelo izvedeno iz određene humane germinativne sekvence ne karakteriše više od 20 aminokiselinskih razlika, npr. ne više od 10 aminokiselinskih razlika, kao što je ne više od 9, 8, 7, 6 ili 5, na primer ne više od 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinske razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu kodiranu germinativnim imunoglobulinskim genom.
[0078] Antitelo prema predmetnom pronalasku može sadržavati modifikacije aminokiselina u imunoglobulinskom teškom i/ili lakom lancu. U posebnom primeru izvođenja, aminokiseline u Fc regionu antitela mogu biti modifikovane.
[0079] Termin "Fc region", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na region koji sadrži, u smeru od N-ka C-kraju antitela, najmanje zglobni region, CH2 region i CH3 region. Fc region antitela može posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uklјučujući razne ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije) i komponente sistema komplemenata.
[0080] Termin "zglobni region”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na zglobni region imunoglobulinskog teškog lanca. Tako, na primer, zglobni region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 216-230 prema Eu numeraciji koja je navedena u publikaciji Kabata [26]. Ipak, zglobni region može biti i bilo kog drugog podtipa, kao što je ovde opisano.
[0081] Termin "CH1 region" ili "CH1 domen”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na CH1 region imunoglobulinskog teškog lanca. Tako, na primer, CH1 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 118-215 prema Eu numeraciji koja je navedena u publikaciji Kabata [26]. Ipak, CH1 region može biti i bilo kog drugog podtipa, kao što je ovde opisano.
[0082] Termin "CH2 region" ili "CH2 domen”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na CH2 region imunoglobulinskog teškog lanca. Tako, na primer, CH2 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 231-340 prema Eu numeraciji koja je navedena u publikaciji Kabata [26]. Ipak, CH2 region može biti i bilo kog drugog podtipa, kao što je ovde opisano.
[0083] Termin "CH3 region" ili "CH3 domen”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na CH3 region imunoglobulinskog teškog lanca. Tako, na primer, CH3 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 341-447 prema Eu numeraciji koja je navedena u publikaciji Kabata [26]. Ipak, CH3 region može biti i bilo kog drugog podtipa, kao što je ovde opisano.
[0084] Antitelo može biti antitelo sa deficijencijom u efektorskoj funkciji, stabilizovano IgG4 antitelo ili monovalentno antitelo.
[0085] Preciznije, teški lanac može biti modifikovan tako da je delecijom uklonjen ceo zglobni region.
[0086] Sekvenca antitela može biti modifikovana tako da ne sadrži bilo kakvo akceptorsko mesto za N-vezanu glikozilaciju.
[0087] Antitelo može biti jednolančano antitelo.
[0088] Predmetni opisa se dalјe odnosi na multispecifično antitelo koje sadrži najmanje prvi region za vezivanje antitela prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan, kao i drugi region za vezivanje koji vezuje različit ciljni molekul ili epitop u odnosu na prvi region za vezivanje. Termin "multispecifično antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antitela u kojima postoje vezujući regioni za od dva do najmanje dva, kao što je za najmanje tri, različita antigena ili najmanje dva, kao što su najmanje tri, različita epitopa na istom antigenu.
[0089] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvi region za vezivanje antitela prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan, kao i drugi region za vezivanje koji vezuje različit ciljni molekul ili epitop u odnosu na prvi vezujući region.
[0090] Termin "bispecifičan", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na molekule koji se vezuju, kao što su antitela, gde se region za vezivanje vezujućeg molekula vezuje za dva različita antigena ili dva različita epitopa na istom antigenu.
[0091] Termin "bispecifično antitelo" se odnosi na antitelo koje je sa specifičnošću za najmanje dva različita, obično nepreklapajuća epitopa. Takvi epitopi mogu biti na istim ili različitim ciljnim molekulima. Ukoliko su epitopi na različitim ciljnim molekulima, takvi ciljni molekuli mogu biti na istoj ćeliji ili na različitim ćelijama, ćelijskim tipovima ili strukturama, poput vanćelijskog tkiva.
[0092] Termin "različit ciljni molekul”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na protein, molekul ili slično koji je drugačiji od AXL-a ili AXL fragmenta.
[0093] Primeri molekula bispecifičnih antitela koji mogu biti upotrebljeni u predmetnom pronalasku obuhvataju (i) jedno antitelo sa dva kraka koji sadrži različite regione koji vezuju antigen, (ii) jednolančano antitelo koje je sa specifičnošću za dva različita epitopa, npr. čine ga dva scFv koji su povezani u tandem posredstvom dodatnog peptidnog linkera; (iii) antitelo sa dvostruko varijabilnim domenom (DVD-Ig™), gde svaki laki lanac i teški lanac sadrži dva varijabilna domena koji su povezani u tandem posredstvom kratke peptidne spone [29]; (iv) hemijski povezan bispecifičan (Fab’)2 fragment; (v) Tandab®, koji je fuzija dva jednolančana dimerna antitela što rezultuje u tetravalentnom bispecifičnom antitelu koje ima dva mesta vezivanja za svaki cilјni antigen; (vi) fleksibilno antitelo, koje je kombinacija scFv i dimernog antitela što rezultuje multivalentnim molekulom; (vii) takozvani molekul "usidri i zaključaj" (Dock-and-Lock®), zasnovan na "dimerizacionom i usidravajućem domenu" u Protein kinazi A, koji, kada se primenjuje Fab segmentima, može proizvesti trovalentni bispecifičan vezujući protein koji se sastoji od dva identična Fab fragmenta povezana sa različitim Fab fragmentom; (viii) molekul označen kao “Škorpija” (engl. Scorpion), koji sadrži, npr. dva scFv koji su fuzionisani na oba kraja kraka humanog Fab; i (ix) dimerno antitelo.
[0094] Bispecifično antitelo može biti dimerno antitelo, umreženo antitelo, kao što je tzv. CrossMab, ili bispecifično antitelo dobijeno kontrolisanom izmenom Fab kraka (kao što je opisano u [30]).
[0095] Primeri različitih klasa bispecifičnih antitela uklјučuju, ali nisu ograničeni na, (i) molekule slične IgG sa komplementarnim CH3 domenima da bi se isforsirala heterodimerizacija; (ii) rekombinantne dvostruko ciljajuće molekule slične IgG, gde svaka od dve strane molekula sadrži Fab fragment ili deo Fab fragmenta iz najmanje dva različita antitela; (iii) IgG fuzione molekule, gde su IgG antitela pune dužine fuzionisana sa dodatnim Fab fragmentom ili delovima Fab fragmenta; (iv) Fc fuzione molekule, gde su jednolančani Fv molekuli ili stabilizovana dimerna antitela fuzionisani sa konstantnim domenima teških lanaca, Fc-regionima ili njihovim delovima; (v) Fab fuzione molekule, gde su različiti Fab-fragmenti fuzionisani zajedno i fuzionisani sa konstantnim domenima teških lanaca, Fc-regionima ili njihovim delovima; i (vi) antitela zasnovana na SCFv- i dimernim antitelima i antitelima teškog lanca (npr. domenskim antitelima, nano antitelima - Nanobodies®), gde su različiti jednolančani Fv molekuli ili različita dimerna antitela ili različita antitela teškog lanca (npr. domenska antitela, Nanobodies®) fusionisana jedna sa drugima ili sa drugim proteinom ili molekulom nosača koji je fuzionisan sa konstantnim domenima teških lanaca, Fc-regionima ili njihovim delovima.
[0096] Primeri molekula sličnih IgG koji su sa molekulima komplementarnim CH3 domenima obuhvataju, ali nisu ograničeni na, Triomab® (Trion Pharma/Fresenius Biotech, [31]), Knobs-into-Holes (Genentech, [32]), CrossMabs (Roche, [33]) i elektrostatičke podudarne (Amgen, [34] i [35]; Chugai, [36]; Oncomed, [37]), LUZ-Y (Genentech), DIG-antitelo i PIG-antitelo (Pharmabcine), antitelo konstruisanih domena dobijeno izmenom lanaca (SEEDbody od engl. Strand Exchange Engineered Domain body) (EMD Serono, [38]), Biclonics (Merus), FcΔAdp (Regeneron, [39]), bispecifičan IgG1 i IgG2 (Pfizer/Rinat, [40]), Azymetric mrežu (Zymeworks/Merck, [41]), mAb-Fv (Xencor, [42]), bivalentna bispecifična antitela (Roche [43]) i DuoBody® molekule (Genmab A/S, [30]).
[0097] Primeri rekombinantnih dualno ciljajućih molekula sličnih IgG obuhvataju, ali nisu ograničeni na, dvostruko cilјajući (DT)-Ig (GSK/Domantis), antitelo “dva-u-jedan” (Genentech), umrežene Mabs (Karmanos Cancer Centar), mAb2 (F-Star, [44]), Zybodies™ (Zyngenia), pristupe sa uobičajenim lakim lancima (Crucell/Merus, [45]), κλ antitela (NovImmune) i CovX-antitelo (CovX/Pfizer).
[0098] Primeri IgG fuzionih molekula obuhvataju, ali nisu ograničeni na, dvostruko varijabilni domen (DVD)-Ig™ (Abbott, [46]), antitela sa dvostrukom domenom i dvostrukim vrhom (Unilever; Sanofi Aventis, [47]), bispecifične molekule slične IgG (ImClone)/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) i BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec, [48]), scFv fuziju (Novartis), scFv fuziju (Changzhou Adam Biotech Inc, [49]) i TvAb (Roche, [50], [51]).
[0099] Primeri Fc fuzionih molekula uklјučuju, ali nisu ograničeni na, ScFv/Fc fuzione molekule (Academic Insitution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), molekule dobijene tehnologijom dualnog afiniteta i preusmeravanja specifičnosti (Fc-DART™) (MacroGenics, [52], [53]) i dualni (ScFv)2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine - Kina).
[0100] Primeri Fab fuzionih bispecifičnih antitela uklјučuju, ali nisu ograničeni na, F(ab)2 (Medarex/AMGEN), dualno delujuća antitela ili Bis-Fab (Genentech), Dock-and-Lock® (DNL) (ImmunoMedics), bivalentna bispecifična antitela (Biotecnol) i Fab-Fv (UCB-Celltech).
[0101] Primeri antitela zasnovanih na ScFv-, dimernim antitelima i domenskim antitelima obuhvataju, ali nisu ograničeni na, bispecifičan angažer T ćelija (BiTE®) (Micromet, Tandem Diabody (Tandab™) (Affimed), antitela dobijena tehnologijom za dualni afinitet i preusmeravanje specifičnosti (DART) (MacroGenics), jednolančano dimerno antitelo (Academic), antitela nalik TCR (AIT, ReceptorLogics), fuzioni molekul ScFv i humanog serumskog albumina (Merrimack) i COMBODY (Epigen Biotech), dvostruko ciljajuća nanoantitela® (Ablynx), antitela sa samo dualno ciljajućim domenima teških lanaca.
[0102] Bispecifično antitelo prema predmetnom pronalasku može biti generisano uvođenjem modifikacija u konstantni region antitela.
[0103] Ukoliko nije drugačije navedeno ili protivrečno kontekstu, aminokiseline sekvenci konstatnih regiona su numerisane ovde u skladu sa Eu-indeksom numeracije (opisanom u [26]). Termini "Euindeks numeracije" i "Eu numeracija naveda u publikaciji Kabata" mogu biti upotrebljavani naizmenično i imaju isto značenje i svrhu. Prema tome, aminokiselina ili segment u jednoj sekvenci koji "odgovara" aminokiselini ili segmentu u drugoj sekvenci predstavlja one koji, kada su poravnati sa drugom aminokiselinom ili segmentom upotrebom standardnog programa za poravnanje sekvenci poput ALIGN, ClustalW ili sličnog, obično pri zadatim podešavanjima, karakteriše identičnost od najmanje 50%, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% sa humanim IgG1 teškim lancem. U oblasti tehnike je dobro poznato kako poravnavati sekvence ili segmente sekvence i time odrediti odgovarajuće pozicije u sekvenci u odnosu na aminokiselinske pozicije prema predmetnom pronalasku.
[0104] Termin "aminokiselina koja odgovara pozicijama", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na broj pozicije aminokiseline u teškom lancu humanog IgG1.
[0105] Predmetni opis takođe obezbeđuje antitela koja sadrže funkcionalne varijante VL regiona, VH regiona ili jedne ili više CDR sekvenci antitela iz primera. Funkcionalna varijanta VL, VH ili CDR upotrebljena u kontekstu AXL antitela i dalјe omogućava da antitelo zadrži barem značajan udeo (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ili više) afiniteta/aviditeta i/ili specifičnosti/selektivnosti matičnog antitela, dok u pojedinim slučajevima takvo AXL antitelo može biti udruženo sa većim afinitetom, selektivnošću i/ili specifičnošću u odnosu na matično antitelo.
[0106] Ovakve funkcionalne varijante obično zadržavaju značajan identitet sekvence sa matičnim antitelom. Procenat identiteta između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje su zajedničke za obe sekvence (tj.% homologije = br. identičnih pozicija/ukupan br. pozicija x 100), uzimajući u obzir broj praznina, kao i dužinu svake od praznina, koji moraju biti uvedeni radi optimalnog poravnanja dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence se može postići upotrebom matematičkog algoritma koji je dobro poznat u oblasti tehnike.
[0107] VH, VL i/ili CDR sekvence varijanti se mogu razlikovati od onih u sekvenci matičnog antitela, pri čemu su u njima uglavnom prisutne konzervativne supstitucije; na primer, najmanje oko 35%, oko 50% ili više, oko 60% ili više, oko 70% ili više, oko 75% ili više, oko 80% ili više, oko 85% ili više, oko 90% ili više (npr. oko 65-95%, kao što je oko 92%, 93% ili 94%) supstitucija u varijanti su konzervativne zamene aminokiselinskih ostataka.
[0108] VH, VL i/ili CDR sekvence varijanti se mogu razlikovati od onih u sekvenci matičnog antitela, pri čemu su u njima uglavnom prisutne konzervativne supstitucije; na primer, 10 ili manje, poput 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, 2 ili manje ili 1 od supstitucija u varijanti su konzervativne zamene aminokiselinskih ostataka.
[0109] Termini "aminokiselina" i "aminokiselinski ostatak" se ovde mogu koristiti naizmenično i ne treba ih smatrati kao ograničavajućima.
[0110] U kontekstu predmetnog pronalaska, aminokiselina može biti definisana kao konzervativna ili nekonzervativna aminokiselina, a shodno tome može biti i klasifikovana. Aminokiselinski ostaci mogu takođe biti podeljeni u klase definisane alternativnim fizičkim i funkcionalnim osobinama. Stoga se klase aminokiselina mogu definisati kao što je navedeno u okviru jedne ili obe od tabela koje slede:
Aminokiselinski ostaci konzervativne klase
Alternativne fizičke i funkcionalne klasifikacie aminokiselinskih ostataka
[0111] U kontekstu predmetnog pronalaska, supstitucija u antitelu se označava kao:
Originalna aminokiselina – pozicija – supstituisana aminokiselina;
Prema dobro poznatoj nomenklaturi aminokiselina, upotrebljava se kod od tri slova ili kod u vidu jednog slova, uključujući kodove "Xaa" ili "X", a da bi se označio bilo koji aminokiselinski ostatak. Prema tome, Xaa ili X obično mogu predstavlјati bilo koju od 20 aminokiselina koje se javlјaju u prirodi. Termin "koji se javlja u prirodi”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koji od sledećih aminokiselinskih ostataka; glicina, alanina, valina, leucina, izoleucina, serina, treonina, lizina, arginina, histidina, asparaginske kiseline, asparagina, glutaminske kiseline, glutamina, prolina, triptofana, fenilalanina, tirozina, metionina i cisteina. Tako, obeležje "K409R" ili "Lys409Arg" označava da antitelo sadrži supstituciju lizina sa argininom na aminokiselinskoj poziciji 409.
[0112] Supstitucija aminokiseline na datoj poziciji sa bilo kojom drugom aminokiselinom se označava kao:
Originalna aminokiselina – pozicija; ili npr. "K409"
[0113] Za modifikacije u kojima originalna(e) aminokiselina(e) i/ili supstituisana(e) aminokiselina(e) mogu sadržavati više od jedne, ali ne i sve aminokiseline, više od jedne aminokiseline može biti razdvojeno sa "," ili "/". Npr. supstitucija lizina argininom, alaninom ili fenilalaninom na poziciji 409 može biti predstavljena kao:
"Lys409Arg, Ala, Phe" ili "Lys409Arg/Ala/Phe" ili "K409R,A,F" ili "K409R/A/F" ili "K409 u R, A ili F".
[0114] Ovakvo označavanje se, u kontekstu predmetnog pronalaska, može koristiti naizmenično, ali ima isto značenje i svrhu.
[0115] Štaviše, termin "supstitucija" obuhvata supstituciju u bilo koju ili u druge od devetnaest prirodnih aminokiselina, ili u druge aminokiseline, kao što su aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi. Na primer, supstitucija aminokiseline K na poziciji 409 obuhvata svaku od sledećih supstitucija: 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409G, 409H, 4091, 409L, 409M, 409N, 409Q, 409R, 409S, 409T, 409V, 409W, 409P i 409Y. Navedeno je, imeđu ostalog, ekvivalentno oznaci 409X, gde X označava bilo koju aminokiselinu drugačiju od originalne aminokiseline. Ovakve supstitucije se takođe mogu označiti sa K409A, K409C itd. ili K409A,C, itd. ili sa K409A/C/ itd. Isto se analogno može primeniti na sve i svaku poziciju koja je ovde pomenuta, da bi se specifično uključile bilo koje od ovakvih supstitucija.
[0116] Antitelo prema pronalasku može takođe sadržavati deleciju aminokiselinskog ostatka. Takva delecija može biti označena sa "del" i obuhvata, npr. ono što se može napisati kao K409del. Prema tome, u takvim primerima izvođenja, lizin na poziciji 409 je deletiran iz aminokiselinske sekvence.
[0117] U jednom posebnom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac, svaki prvi i drugi teški lanac sadrži najmanje zglobni region, CH2 i CH3 region, pri čemu je u prvom teškom lancu supstituisana najmanje jedna od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama izabranim iz grupe koja se sastoji od K409, T366, L368, K370, D399, F405 i Y407 u teškom lancu humanog IgG1, dok je u drugom teškom lancu supstituisana najmanje jedna od aminokiselina na pozicijama koje odgovarajna poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od F405, T366, L368, K370, D399, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1, i pri čemu prvi i drugi teški lanci nisu supstituisani na istim pozicijama.
[0118] Predmetni opis obezbeđuje antitela u kojima, u prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 nije K, L ili M i, opciono, aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je F, dok u drugom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 nije F i aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je K.
[0119] Predmetni opis obezbeđuje antitela u kojima, u prvom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 nije F, R i G, dok su u drugom teškom lancu supstituisane aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama izabranim iz grupe koja se sastoji od; T366, L368, K370, D399, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1.
[0120] Predmetni opis obezbeđuje antitela u kojima je aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 drugačija od K, L ili M u prvom teškom lancu, dok u drugom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 nije F i, opciono, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je K.
[0121] Aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 može biti L u navedenom prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 može biti R u navedenom drugom teškom lancu, ili obrnuto.
[0122] Shodno navedenom, u jednom primeru izvođenja, aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u prvom teškom lancu, dok aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 predstavlja L u drugom teškom lancu.
[0123] Predmetni opis obezbeđuje antitela, pri čemu i prvi i drugi region za vezivanje bispecifičnog antitela vezuju AXL. Ipak, prvi region za vezivanje sadrži drugačiji set CDR sekvenci od drugog vezujućeg regiona. Stoga, bispecifično antitelo može sadržavati prvi i drugi vezujući region, i prvi i drugi teški lanac, pri čemu svaki od prvog i drugog vezujućeg regiona sadrži VH i VL region izabran iz grupe koju čine;
a) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 46, 47 i 48, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 49, AAS i 50, redom, [148];
b) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 114, 115 i 116, redom, i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 117, DAS i 118, redom [733];
c) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 41, 42 i 43, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 44, AAS i 45, redom, [140];
d) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 51, 52 i 55, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 55, GAS i 56, redom. [154];
e) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 51, 52 i 54, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 55, GAS i 56, redom. [154-M103L];
f) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 57, 58 i 59, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 60, GAS i 61, redom, [171];
g) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 62, 63 i 64, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 65, GAS i 66, redom, [172];
h) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 67, 68 i 69, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 70, GAS i 71, redom, [181];
i) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 72, 73 i 75, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 76, ATS i 77, redom, [183];
j) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 72, 74, i 75, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 76, ATS i 77, redom, [183-N52Q];
k) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 78, 79 i 80, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 81, AAS i 82, redom, [187];
I) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 83, 84 i 85, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 86, GAS i 87, redom, [608-01];
m) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 88, 89 i 90, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 91, GAS i 92, redom, [610-01];
n) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 94, 95 i 95, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 96, GAS i 97, redom, [613];
o) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 98, 99 i 100, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 101, DAS i 102, redom, [613-08];
p) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 103, 104, i 105, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 106, GAS i 107, redom,
[620-06];
q) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 108, 109 i 110, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 112, AAS i 113, redom, [726];
r) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, redom, [107]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 108, 109 i 111, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 112, AAS i 113, redom, [726-M101L];
s) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 46, 47 i 48, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 49, AAS i 50, redom, [148]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 41, 42 i 43, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 44, AAS i 45, redom, [107];
t) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 46, 47 i 48, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 49, AAS i 50, redom, [148]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 83, 84 i 85, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 86, GAS i 87, redom, [608-01];
u) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 46, 47 i 48, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 49, AAS i 50, redom, [148]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 88, 89 i 90, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 91, GAS i 92, redom, [610-01];
v) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 46, 47 i 48, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 49, AAS i 50, redom, [148]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 94, 95 i 95, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 96, GAS i 97, redom, [613];
w) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 46, 47 i 48, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 49, AAS i 50, redom, [148]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 98, 99 i 100, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 101, DAS i 102, redom, [613-08];
x) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 46, 47 i 48, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 49, AAS i 50, redom, [148]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 103, 104, i 105, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 106, GAS i 107, redom, [620-06];
y) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 114, 115 i 116, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 117, DAS i 118, redom, [733]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 83, 84 i 85, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 86, GAS i 87, redom, [608-01];
z) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 114, 115 i 116, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 117, DAS i 118, redom, [733]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 88, 89 i 90, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 91, GAS i 92, redom, [610-01];
aa) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 114, 115 i 116, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 117, DAS i 118, redom, [733]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 94, 95 i 95, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 96, GAS i 97, redom, [613];
bb) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 114, 115 i 116, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 117, DAS i 118, redom, [733]i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 98, 99 i 100, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 101, DAS i 102, redom, [613-08]; i
cc) prvi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 114, 115 i 116, redom; i prvi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 117, DAS i 118, redom, [733]; i drugi VH region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 103, 104, i 105, redom; i drugi VL region koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 106, GAS i 107, redom, [620-06].
Konjugat anti-AXL antitela sa lekom - imunokonjugati
[0124] Antitela prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja predmetnog pronalaska mogu biti konjugovana sa terapijskom ili dijagnostičkom strukturom, poput citotoksičnog agensa, hemoterapijskog leka, citokina, imunosupresiva, antibiotika ili radioizotopa. Takvi konjugati se ovde nazivaju "imunokonjugati". Imunokonjugati koji uklјučuju jedan ili više citotoksina se označavaju kao "imunotoksini". Antitela konjugovana sa citotoksičnim agensom, lekom ili sličnim su takođe poznati kao konjugati antitela i leka (ADC). Imunokonjugat može biti sa poluživotom dovolјnog perioda vremena da se konjugat antitela i leka internalizuje, razgradi i da indukuje ubijanje ćelija oslobođenim toksinom.
[0125] Shodno navedenom, prema drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan ili bispecifično antitelo prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan, i terapijski ostatak, kao što je citotoksičan agens, hemoterapijski lek, citokin, imunosupresiv, antibiotik ili radioizotop. Citotoksični agens, hemoterapijski lek, citokin, imunosupresiv, antibiotik ili radioizotop mogu biti konjugovani sa antitelom ili bispecifičnim antitelom putem linkera.
[0126] ADC su često dizajnirani tako da je koristan citotoksični teret neaktivan kada se konjuguje sa antitelom. Koristan citotoksični teret može biti oslobođen intracelularno po internalizaciji ADC-a, nakon vezivanja za plazma membranu ćelija, ili, alternativno, kao odgovor na proteolitičku aktivnost u mikrosredini tumora. Termini "internalizovan" ili "internalizacija", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na biološki proces u kome se molekuli, kao što je antitelo prema predmetnom pronalasku, okružuju ćelijskom membranom i uvlače u unutrašnjost ćelije. Navedeno se može označiti i kao "endocitoza".
[0127] Stoga, antitela prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja predmetnog pronalaska mogu biti internalizovana u ćeliju po vezivanju za ciljni molekul, AXL.
[0128] U pojedinim slučajevima, može biti poželјno da se upotrebljavaju antitela koja su podvrgnuta internalizaciji. Takva antitela, koja karakterišu dobra svojstva internalizacije, mogu biti pogodna za konjugaciju sa citotoksičnim agensom, lekom ili sličnim, opciono preko linkera koji je dizajniran tako da podleže cepanju unutar ćelije.
[0129] Jednom internalizovani, ADC se u većini slučajeva mogu isporučiti lizozomima, gde efektivno oslobađanje leka koristi prednost kataboličkog okruženja koje se nalazi u ovim organelama. Uobičajeno je da je linker onaj koji povezuje antitelo sa citotoksičnim agensom. Tako, dizajnirani su specijalizovani linkeri koji su podložni cepanju samo u specifičnoj mikrosredini koja se nalazi u ili na cilјnoj tumorskoj ćeliji ili u mikrosredini tumora. Primeri obuhvataju linkere koje se cepaju u kiselim uslovima, redukujućim uslovima ili sa specifičnim proteazama.
[0130] Stabilnost kompleksa antitelo-linker-lek u cirkulaciji je važna, pošto omogućava isporuku leka posredovanu antitelom do specifičnih cilјnih ćelija. Dodatno, dug poluživot ADC-a u cirkulaciji obezbeđuje izlaganje istom nakon injeciranja tokom od nekoliko dana do nekoliko nedelјa. Lekovi koji su konjugovani preko linkera koji nisu podložni cepanju i linkera koji su podložni cepanju sa proteazama, uglavnom su stabilniji u cirkulaciji od disulfidnih i hidrazonskih linkera, mada se stabilnost drugonavedenih linkera može podesiti izmenom susedne hemijske strukture [6].
[0131] Terapijska struktura može biti citotoksični agens.
[0132] Citotoksin ili citotoksični agens obuhvata bilo koji agens koji je štetan za ćelije (npr. ubija ih). Pogodni citotoksični agensi za obrazovanje imunokonjugata predmetnog pronalaska obuhvataju taksol, tubulizine, duostatine, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihiroksi antracin dion, majtanzin ili njegov analog ili derivat, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin; kaliheamicin ili njegove analoge i derivate; antimetabolite (poput metotreksata, 6-merkaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracila, dekarbazina, hidroksiuree, asparaginaze, gemcitabina, kladribina), alkilujuće agense (kao što su mehloretamin, tioepa, hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, dakarbazin (DTIC), prokarbazin, mitomicin C, cisplatin i drugi derivati platine, kao što je karboplatina; kao i duokarmicin A, duokarmicin SA, CC-1065 (poznat kao rahelmicin) ili analoge ili derivate CC-1065), dolastatin, auristatin, pirolo[2,1-c][1,4] benzodiazepine (PDB), indolinobenzodiazepin (IGN) ili njegove analoge, antibiotike (kao što su daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, daunorubicin (ranije daunomicin), doksorubicin, idarubicin, mitramicin, mitomicin, mitoksantron, plikamicin, antramicin (AMC)), antimitotske agense (npr. agense koji ciljano deluju na tubulin), kao što su difterijski toksin i srodni molekuli (poput difterija A lanca i njegovih aktivnih fragmenata i hibridnih molekula); ricinski toksin (kao što je ricin A ili deglikozilovan A lanac ricinskog toksina), toksin kolere, toksin sličan Šiga toksinu (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT toksin, C3 toksin, Šiga toksin, toksin pertusisa, toksin tetanusa, Bovman-Birkov proteazni inhibitor soje, egzotoksin Pseudomonasa, alorin, saporin, modecin, gelanin, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, diantinski proteini, proteini Phytolacca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin i enomicinski toksini. Ostali pogodni konjugovani molekuli uklјučuju antimikrobne/litičke peptide kao što su CLIP, Magainin 2, melitin, Cekropin i P18; ribonukleaze (RNaze), DNazu I, stafilokokni enterotoksin-A, antivirusni protein vinobojke, toksin difterije i endotoksin Pseudomonasa. Pogledati, na primer, Pastan i saradnici, Cell 47, 641 (1986) i Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Terapijski agensi koji mogu biti primenjeni u kombinaciji sa anti-AXL antitelima ili konjugatima antitela i lekova predmetnog pronalaska, a koji su kao što je opisano ovde u drugom delu teksta, kao što su, npr, anti-kancer citokini ili hemokini, takođe su kandidati za terapijske strukture korisne za konjugovanje sa antitelom opisanim u predmetnom pronalasku.
[0133] Termin "citotoksični agens”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koji agens koji je štetan za ćelije (npr. ubija ih). Radi opisa ovih klasa lekova koje su dobro poznate u oblasti tehnike i njihovih mehanizama dejstva, pogledati [54]. Dodatne tehnike koje su relevantne za dobijanje imunotoksina antitela su obezbeđene u, na primer, [55] i [56].
[0134] Citotoksični agens može biti povezan sa navedenim antitelom, ili sa njegovim fragmentom, preko linkera koji je podložan cepanju, kao što je N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)-pentanoat (SSP), maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (mc-vc-PAB) ili AV-1 K-lock valin-citrulin.
[0135] Termin "linker podložan cepanju", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na podskup linkera koje katalizuju specifične proteaze u cilјnoj ćeliji ili u mikrosredini tumora, što rezultuje oslobađanjem citotoksičnog agensa. Primeri linkera podložnih cepanju su linkeri zasnovani na hemijskim motivima koji uključuju disulfide, hidrazone ili peptide. Druga podgrupa linkera podložnih cepanju predstavlja one u koje je dodat dodatni linkerski motiv između citotoksičnog agensa i primarnog linkera, tj. mesta koje vezuje kombinaciju antitelo-linker za antitelo. Motiv dodatnog linkera može biti podložan isecanju od strane agensa za cepanje koji je prisutan u unutarćelijskom okruženju (npr. unutar lizozoma ili endozoma ili kaveola). Linker može biti, npr. peptidil linker koji se cepa unutarćelijskom peptidazom ili proteaznim enzimom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lizozomsku ili endozomalnu proteazu. U pojedinim primerima izvođenja, peptidil linker je dužine od najmanje dve aminokiseline ili je dužine od najmanje tri aminokiseline. Agensi za cepanje mogu obuhvatati katepsine B i D i plazmin, za koje je poznato da hidrolizuju derivate dipeptidnih lekova, što rezultuje oslobađanjem aktivnog leka unutar cilјnih ćelija (pogledati npr. Dubowchik i Walker, 1999, Pharm. Terapeutics 83:67-123). Peptidil liker koji može biti podložan cepanju unutarćelijskom proteazom je i Val-Cit (valin-citrulinski) linker ili Phe-Lys (fenilalanin-lizinski) linker (pogledati npr. US6214345, koja opisuje sintezu doksorubicina sa Val-Cit linkerom). Prednost upotrebe unutarćelijskog proteolitičkog oslobađanja terapijskog agensa je što se agens obično utišava kada se konjuguje i što je serumska stabilnost konjugata obično visoka.
[0136] U sledećem primeru izvođenja, citotoksični agens je povezan sa navedenim antitelom, ili njegovim fragmentom, sa linkerom koji nije podložan cepanju, kao što je sukcinimidil-4(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (MCC) ili maleimidokaproil (MC).
[0137] Termin "linker koji nije podložan cepanju", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na podskup linkera koji, za razliku od linkera koji su podložni cepanju, ne sadrži motive koji su specifični i prepoznatljivi na predvidiv način od strane unutarćelijskih ili vanćelijskih proteaza. Tako, ADC zasnovani na linkerima koji nisu podložni cepanju, ne oslobađaju se ili se ne cepaju iz antitela sve dok ne dođe do potpune razgradnje kompleksa antitelo-linker-lek u lizozomskom odeljku ćelije. Primeri linkera koji nisu podložni cepanju su tioetri. U još jednom primeru izvođenja, linkerska jedinica nije podložna cepanju i lek se oslobađa degradacijom antitela (pogledati [57]). Ovakav linker obično nije suštinski osetljiv na vanćelijsko okruženje. Kako se ovde upotrebljava, "nije suštinski osetlјiv na vanćelijsko okruženje", u kontekstu linkera, označava da se ne više od 20%, obično ne više od oko 15%, obično ne više od oko 10%, a još češće ne više od oko 5%, ne više od oko 3% ili ne više od oko 1% linkera u uzorku jedinjenja koje je konjugat antitela i leka, cepa kada je jedinjenje koje je konjugat antitela i leka prisutno u vanćelijskom okruženju (npr. plazmi). Da li je linker suštinski neosetljiv na vanćelijsko okruženje, može se utvrditi, na primer, inkubiranjem jedinjenja koje je konjugat antitela i leka sa plazmom tokom unapred određenog vremenskog perioda (npr.2, 4, 8, 16 ili 24 sata) i potom kvantifikacijom količine slobodnog leka koji je prisutan u plazmi.
[0138] U jednom primeru izvođenja, citotoksični agens je izabran iz grupe: agenasa koji cilјano deluju na DNK, npr. DNK alkilujućih agensa i umreživača, kao što su kaliheamicin, duokarmicin, rahelmicin (CC-1065), pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepini (PBD) i indolinobenzodiazepin (IGN); agenasa koji cilјano deluju na mikrotubule, kao što su duostatin poput duostatina-3, auristatin, kao što je monometilauristatin E (MMAE) i monometilauristatin F (MMAF), dolastatin, majtanzin, N(2')-deacetil-N(2')-(3-markapto-1-oksopropil)-majtanzin (DM1) i tubulizin; i nukleozidni analozi; ili njihovi analozi, derivati ili prolekovi.
[0139] U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži kombinaciju;
i) citotoksični agens i navedeni linker podložan cepanju, koju karakteriše kapacitet ubijanja susednih ćelija;
ii) citotoksični agens i navedeni linker podložan cepanju, koju ne karakteriše kapacitet ubijanja susednih ćelija;
iii) citotoksični agens i navedeni linker koji nije podložan cepanju, koju karakteriše kapacitet ubijanja susednih ćelija; ili
iv) citotoksični agens i navedeni linker koji nije podložan cepanju, koju karakteriše kapacitet ubijanja susednih ćelija.
[0140] Termini "efekat ubijanja susednih ćelija", "ubijanje susednih ćelija", "kapacitet ubijanja susednih ćelija" ili "citotoksičnost susednih ćelija”, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na efekat u kome je citotoksični agens koji je konjugovan sa antitelom, bilo preko linkera koji je podložan cepanju ili nije podložan cepanju, sa kapacitetom da difunduje kroz ćelijske membrane nakon oslobađanja iz antitela i da time prouzrokuje ubijanje susednih ćelija. Kada je citotoksični agens konjugovan preko linkera koji je podložan cepanju ili nije podložan cepanju, on može biti bilo citotoksični agens koji samostalno deluje ili citotoksični agens sa delom linkera koji ima sposobnost ubijanja susednih ćelija. Kapacitet difuzije kroz ćelijske membrane je povezan sa hidrofobnošću citotoksičnog agensa ili kombinacije citotoksičnog agensa i linkera. Ovakvi citotoksični agensi mogu prevashodno biti toksini koji prolaze kroz membrane, kao što je MMAE koji se proteazama oslobađa iz antitela. Posebno kod tumora sa heterogenom cilјanom ekspresijom i kod solidnih tumora gde prodiranje antitela može biti ograničeno, efekat ubijanja susednih ćelija može biti poželјan.
[0141] Termini "bez kapaciteta ubijanja susednih ćelija", "bez efekta ubijanja susednih ćelija", "bez ubijanja susednih ćelija" ili "bez citotoksičnosti susednih ćelija”, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na efekat u kome citotoksični agens koji je konjugovan sa antitelom, bilo linkerom koji je podložan cepanju ili nije podložan cepanju, nema sposobnost difuzije kroz ćelijske membrane nakon oslobađanja iz antitela. Stoga, takvi citotoksični agensi ili kombinacije citotoksičnog agensa i linkera, bilo da je on podložan cepanju ili ne, neće biti u stanju da ubiju susedne ćelije po oslobađanju iz antitela. Veruje se, bez vezivanja za teoriju, da će ovakve kombinacije citotoksičnog agensa ili linkera, bilo da je on podložan cepanju ili ne, ubiti samo ćelije koje eksprimiraju ciljni molekul za koji se antitelo vezuje.
[0142] Stabilna veza između antitela i citotoksičnog agensa je važan faktor ADC-a. U pretkliničkim i kliničkim ispitivanjima je dokazano da su bezbedni i tipovi linkera koji su podložni cepanju i oni koji nisu podložni cepanju.
[0143] U jednom primeru izvođenja, citotoksični agens je izabran iz grupe agenasa koji ciljano deluju na mikrotubule, kao što su auristatini i majtanzinoidi.
[0144] Termin "agensi koji ciljano deluju na mikrotubule”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na agens ili lek koji inhibira mitozu (ćelijsku deobu). Mikrotubule su strukture koje su neophodne za pravilno razdvajanje DNK tokom ćelijske deobe, a funkcija mikrotubula kritično zavisi od „dinamičke nestabilnosti“, tj. procesa u kome se strukture mikrotubula neprekidno izdužuju i skraćuju. Agensi koji ciljano deluju na mikrotubule remete ili stabilizuju mikrotubule, što sprečava stvaranje mitotskog vretena i rezultuje zaustavljanjem mitoze i apoptozom. Agensi koji ciljano deluju na mikrotubule mogu biti izvedeni iz npr. prirodnih supstanci poput biljnih alkaloida, i sprečavati da ćelije prolaze kroz mitozu narušavanjem ili stabilizujom polimerizaciju mikrotubula, čime sprečavaju obrazovanje mitotskog vretena i naknadnu deobu ćelija, što rezultuje u inhibiciji rasta kancera. Primeri agenasa koji ciljano deluju na mikrotubule su paklitaksel, docetaksel, vinblastin, vinkristin, vinorelbin, duostatini, auristatini, majtanzanoidi, tubulizini i dolastatin.
[0145] Citotoksični agens može biti tipa auristatina ili auristatinskih peptidnih analoga ili derivata ([131]; [132]). Pokazano je da auristatini ometaju dinamiku mikrotubula, hidrolizu GTP-a i jedarnu i ćelijsku deobu [133], kao i da ih karakteriše antikancerska [134] i antifungalna aktivnost [135]. Auristatinska struktura leka može biti vezana za antitelo posredstvom linkera, preko N (amino) kraja ili C (kraja) peptidne strukture leka.
[0146] Auristatinski primeri izvođenja za primer uključuju auristatinske strukture leka DE i DF sa monoetil grupom vezanom na N-kraju, opisane u [136] i opisane u [137].
[0147] Citotoksični agens može biti monometil auristatin E (MMAE);
pri čemu je antitelo povezano sa MMAE preko azota (N) na levoj strani prethodno navedene hemijske strukture preko odgovarajućeg linkera.
[0148] Citotoksični agens monometil auristatin E (MMAE) može biti povezan sa antitelom preko valincitrulinskog (VC) linkera.
[0149] Citotoksični agens monometil auristatin E (MMAE) može biti povezan sa antitelom preko valincitrulinskog (VC) linkera i maleimidokaproilskog (MC) linkera, pri čemu je kombinacija citotoksičnog agensa i linkera hemijske strukture;
gde je Mab antitelo.
[0150] Citotoksični agens može biti monometil auristatin F (MMAF);
pri čemu je antitelo povezano sa MMAF preko azota (N) na levoj strani prethodno navedene hemijske strukture putem odgovarajućeg linkera.
[0151] Citotoksični agens monometil auristatin F (MMAF) može biti povezan sa antitelom preko maleimidokaproilskog (mc)-likera, pri čemu je kombinacija citotoksičnog agensa i linkera hemijske strukture;
gde je Mab antitelo.
citotoksični agens može biti duostatin3.
[0152] Citotoksični agens može biti agens koji ciljano deluje na DNK.
[0153] Termin "agens koji deluje na DNK", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na specifičnu klasu citotoksičnih agenasa koji mogu biti sposobni da alkiluju i/ili umreže DNK. Primer takvog agensa koji deluje na DNK su IGN agensi koji sadrže indolino-benzodiazepinske dimere i pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepini (PBD) koji su veoma potentni zahvalјujući njihovoj sposobnosti da alkiluju i umrežavaju DNK. Drugi primer su IGN agensi koji sadrže indolino-benzodiazepinske monomere koji su veoma potentni zahvalјujući sposobnosti da alkiluju samo DNK. Duokarmicini su druga klasa agenasa koji deluju na DNK. Duokarmicini su mali molekuli, sitetski alkilirajući agensi koji se vezuju za mali žljeb DNK. Ova jedinjenja su pogodna za cilјano dejstvo na solidne tumore, kao i na hematološke tumore.
[0154] Imunokonjugat može sadržavati od dva do četiri citotoksična molekula po antitelu. U zavisnosti od hemijskih osobina toksina i kombinacije linkera i toksina, konjugati sa od dva do četiri citotoksična molekula po antitelu mogu biti superiorniji od konjugata sa većim opterećenjem koji se brže uklanjaju iz cirkulacije u odnosu na konjugate sa manjim opterećenjem. Opterećenje citotoksičnim agensom se predstavlja sa p i predstavlja prosečan broj struktura citotoksičnog agensa po antitelu u molekulu (označen i kao odnos leka i antitela, DAR od engl. drug to antibody ratio). Opterećenje citotoksičnim agensom može biti opsega od 1 do 20 ostataka leka po antitelu i može se nalaziti na aminokiselinama sa korisnim funkcionalnim grupama kao što su, ali bez ograničavanja samo na, amino ili sulfhidrilne grupe, kao u lizinu ili cisteinu.
[0155] Broj citotoksičnih agensa po antitelu može biti od 1 do 8, kao što je 2 do 7, kao što je 2 do 6, kao što je 2 do 5, kao što je 2 do 4 i kao što je 2 do 3.
[0156] Imunokonjugat može sadržavati od četiri do osam citotoksičnih molekula po antitelu. Imunokonjugat može sadržavati od šest do deset citotoksičnih molekula po antitelu. Alternativno, imunokonjugat može sadržavati od 10 do 30, kao što je 15 do 25, kao što je 20, citotoksičnih molekula po antitelu.
[0157] U zavisnosti od načina konjugacije, p može biti ograničen brojem mesta vezivanja na antitelu, na primer, time što je mesto vezivanja tiol cisteina ili lizin. U principu, antitela ne sadrže mnogo slobodnih i reaktivnih tiolskih grupa cisteina koje mogu biti povezane sa strukturom leka, pošto je većina tiola cisteinskog ostatka u antitelu prisutna u vidu disulfidnih mostova. Stoga, u onim primerima izvođenja gde je citotoksični agens konjugovan preko cisteinskog tiola, antitelo može biti redukovano redukujućim agensom kao što je ditiotreitol (DTT) ili trikarboniletilfosfin (TCEP), pod delimično ili potpuno redukujućim uslovima, da bi se stvorile reaktivne cisteinske tiolne grupe. U određenim primerima izvođenja, opterećenje ADC pronalaska lekom je opsega od 1 do oko 8, pošto maksimalno 8 slobodnih cisteinskih tiolnih grupa postaje dostupno nakon (delimične) redukcije antitela (postoji 8 cisteina koji su uklјučeni u međulančano povezivanje disulfidnim mostovima).
[0158] Struktura leka sa linkerom može biti vcMMAE. Struktura leka sa linkerom tipa vcMMAE i postupci konjugacije su opisani u [27]; [28]; [145], [146]; i [147] vcMMAE se obrazuje konjugacijom mc-vc-PAB linkera i citotoksične grupe MMAE, a struktura leka sa linkerom tipa vcMMAE je povezana sa anti-AXL antitelima preko ostataka cisteina upotrebom postupka koji je sličan onima koji su ovde opisani.
[0159] Struktura leka sa linkerom može biti mcMMAF. Struktura leka sa linkerom tipa mcMMAF i postupci konjugacije su opisani u [138]; [139] i [140], a struktura leka sa linkerom tipa mcMMAF je povezana sa anti-AXL antitelima preko ostataka cisteina upotrebom postupka koji je sličan onima koji su ovde opisani.
[0160] Citotoksični agens može biti povezan sa 1 ili sa 2 lizina unutar aminokiselinske sekvence antitela konjugacijom tipa K-Lock™, kao što je opisano u [58], [148] i [149], a duostatin3 (takođe poznat kao Duo3) može biti vezan za anti-AXL antitela preko ostatka lizina upotrebom postupka koji je sličan onima koji su ovde opisani.
[0161] Druge tehnologije ugradnje linkera mogu biti upotrebljene u konjugatima anti-AXL antitela i leka pronalaska, kao što je ugradnja linkera koji sadrže hidroksilnu grupu.
[0162] Linker može biti vezan za slobodne cisteinske ostatke anti-AXL antitela dobijene (delimičnom) redukcijom anti-AXL antitela.
[0163] Linker može biti mc-vc-PAB i citotoksični agens može biti MMAE; ili je linker SSP, a citotoksični agens može biti DM1.
[0164] Linker može biti MMC, a citotoksični agens može biti DM1; ili linker može biti MC, a citotoksični agens može biti MMAF.
[0165] Linker može biti linker podložan cepanju tipa AV1-K lock, a citotoksični agens je duostatin3. Imunokonjugat može sadržavati linker mc-vc-PAB, citotoksični agens MMAE i antitelo, pri čemu najmanje jedan region za vezivanje sadrži VH region i VL region izabran iz grupe koju čine;
a) VH region koji obuhvata SEQ ID No.: 1 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.: 2 [107];
b) VH region koji obuhvata SEQ ID No.: 25 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.: 26 [613];
c) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:21 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:22 [608-01];
d) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:23 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:24 [610-01];
e) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:27 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:28 [613-08]; i
f) VH region koji obuhvata SEQ ID No.:29 i VL region koji obuhvata SEQ ID No.:30 [620-06].
[0166] Konjugat anti-AXL antitela i leka predmetnog opisa može sadržavati konjugovanu nukleinsku kiselinu ili molekul udružen sa nukleinskom kiselinom. Konjugovana nukleinska kiselina može biti citotoksična ribonukleaza, antisensna nukleinska kiselina, inhibitorni molekul RNK (npr. molekul siRNK) ili imunostimuliratorna nukleinska kiselina (npr. imunostimulatorni DNK molekul koji sadrži CpG motiv).
[0167] Anti-AXL antitelo predmetnog opisa može biti konjugovano sa aptamerom ili ribozimom ili funkcionalnim peptidnim analogom ili njegovim derivatom.
[0168] Alternativno, obezbeđeni su konjugati anti-AXL antitela i leka koji sadrže jednu ili više radioaktivno obeleženih aminokiselina. Radioaktivno obeleženo anti-AXL antitelo može biti upotrebljeno i u dijagnostičke i u terapijske svrhe (konjugacija sa radioaktivno obeleženim molekulama je još jedna moguća karakteristika). Neograničavajući primeri obeleživača za polipeptide uklјučuju<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc i<125>J,<131>J i<186>Re Postupci za pripremu radioaktivno obeleženih aminokiselina i srodnih peptidnih derivata su poznati u oblasti tehnike (pogledati na primer [59] i [60], [61], [62], [63], [64] i [65]US 5,697,902. Na primer, radioizotop može biti konjugovan hloraminskim T postupkom.
[0169] Antitelo može biti konjugovano sa radioizotopom ili sa helatom koji sadrži radioizotop. Na primer, antitelo može biti konjugovano sa helatornim linkerom, npr. DOTA, DTPA ili tiuksetanom, što omogućava da antitelo bude u kompleksu sa radioizotopom. Antitelo takođe može ili alternativno sadrži ili je konjugovano sa jednom ili sa više radioaktivno obeleženih aminokiselina ili drugih radioaktivno obeleženih molekula. Radioaktivno obeleženo anti-AXL antitelo može biti upotrebljeno i u dijagnostičke i u terapijske svrhe. Neograničavajući primeri radioizotopa uključuju<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<125>J,<111>In,<131>J,<186>Re,<213>Bs,<225>Ac i<227>Th.
[0170] Anti-AXL antitela mogu takođe biti hemijski modifikovana kovalentnom konjugacijom sa polimerom da bi se, na primer, povećao njihov poluživot u cirkulaciji. Primeri polimera i postupci njihovog vezivanja za peptide su ilustrovani, na primer, u [66]; [67]; [68]; i [69]. Dodatni polimeri obuhvataju polioksietilisane poliole i polietilen glikol (PEG) (npr. PEG sa molekulskom težinom između oko 1.000 i oko 40.000, kao što je između oko 2.000 i oko 20.000). Navedeno može, na primer, biti upotrebljeno ukoliko anti-AXL antitelo predstavlja fragment.
[0171] Može biti upotrebljen bilo koji postupak koji je poznat u oblasti tehnike za konjugovanje anti-AXL antitela predmetnog pronalaska do konjugovanog(ih) molekula, kao što su oni opisani prethodno, uklјučujući postupke opisane u [70], [71] i [ 72]. Ovakva antitela mogu biti proizvedena hemijskim konjugovanjem drugih struktura sa N-terminalnim ili C-terminalnim krajem anti-AXL antitela (npr. H ili L lancem anti-AXL antitela) (pogledati, npr. [73]). Takvi konjugovani derivati antitela mogu takođe biti generisani konjugacijom na internim ostacima ili šećerima ili aminokiselinama koje se ne javlјaju u prirodi ili sa dodatnim aminokiselinama koje su bile uvedene u konstantni domen antitela, gde je to prikladno.
[0172] Agensi mogu biti kuplovani bilo direktno ili indirektno sa anti-AXL antitelom opisanim u ovom pronalasku. Jedan primer indirektnog kuplovanja drugog agensa je kuplovanje preko spejserske strukture za cisteinske ili lizinske ostatke u antitelu. U jednom primeru izvođenja, anti-AXL antitelo se konjuguje, upotrebom spejsera ili linkera, sa molekulom proleka koji se može aktivirati in vivo u terapijski lek. Nakon primene, spejseri ili linkeri se odvajaju cepanjem, destvom enzima koji se javljaju u tumorskim ćelijama ili dejstvom drugih uslova koji su specifični za tumor, pri čemu se obrazuje aktivan lek. Primeri takvih tehnologija sa prolekovima i linkerima su opisani u [74], [75], [76], [77], [78] i [79]. Pogodna tehnologija tipa antitelo-prolek i analozi duokarmicina se takođe mogu pronaći u [80].
[0173] Anti-AXL antitelo predmetnog pronalaska može biti vezano za helatorski linker, npr. tiuksetan, koji omogućava da se antitelo konjuguje sa radioizotopom.
Kompozicije
[0174] Prema daljem aspektu, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži antitelo, bispecifično antitelo ili imunokonjugat pronalaska.
[0175] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo, bispecifično ili imunokonjugat prema pronalasku i farmaceutski nosač.
[0176] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane sa farmaceutski prihvatlјivim nosačima ili razblaživačima, kao i sa bilo kojim drugim poznatim adjuvansima i ekscipijensima, praćenjem konvencionalnih tehnika kao što su one opisane u [81].
[0177] Farmaceutski prihvatlјivi nosači ili razblaživači, kao i bilo koji drugi poznati adjuvansi i eksipijensi, trebali bi da budu pogodni za antitelo ili konjugat antitela predmetnog pronalaska i izabrani način primene. Pogodnost za nosače i druge komponente farmaceutskih kompozicija se određuje na osnovu nedostatka značajnog negativnog uticaja na želјena biološke osobine izabranog jedinjenja ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska (npr. manje je od značajnog uticaja (10% ili manje relativne inhibicije, 5% ili manje relativne inhibicije itd.) nakon vezivanja antigena).
[0178] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može takođe uključivati razblaživače, ispunjivače, soli, pufere, deterdžente (npr. nejonski deterdžent, kao što je Tween-20 ili Tween-80), stabilizatore (npr. šećere ili aminokiseline oslobođene proteina), konzervanse, tkivne fiksative, solubilizatori i/ili druge materijale koji su pogodni za uklјučivanje u farmaceutsku kompoziciju.
[0179] Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska mogu varirati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efektivna u postizanju želјenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, bez prisustva toksičnosti za pacijenta. Odabrani nivo doze će zavisiti od različitih farmakokinetičkih faktora, uklјučujući aktivnost određenih kompozicija predmetnog pronalaska koje se koriste, ili njihovih amida, načina primene, vremena primene, stope izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim upotrebljenim kompozicijama, kao i od starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravstvenog stanja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji će se lečiti i sličnih faktora koji su dobro poznati u medicinskoj praksi.
[0180] Farmaceutska kompozicija može biti primenjena bilo kojim pogodnim putem i načinom primene. Pogodni putevi primene jedinjenja predmetnog pronalaska in vivo i in vitro su dobro poznati u oblasti tehnike i mogu biti izbrani od strane prosečno iskusnih stručnjaka.
[0181] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska se primenjuje parenteralno.
[0182] Termini "parenteralna primena" i "primenjeno parenteralno", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na načine primene drugačini od enteralnog i topikalnog, obično putem injekcije, a obuhvata epidermalno, intravensko, intramuskularno, intra-arterijsko, intratekalno, intrakapsularno, intraorbitalno, intrakardijalno, intradermalno, intraperitonealno, intratendinozno, transtrahealno, subkutano, subkutikularno, intra-artikularno, subkapsularno, subarahnoidno, intraspinalno, intrakranijalno, intratorakalno, epiduralno i intrasternalno injeciranje i infuziju.
[0183] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti primenjena intravenskim ili subkutanim injeciranjem ili infuzijom.
[0184] Farmaceutski prihvatlјivi nosači obuhvataju bilo koji i sve pogodne rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense, antioksidanse, kao i agense za odlaganje apsorpcije i slične, koji su fiziološki kompatibilni sa jedinjenjem predmetnog pronalaska.
[0185] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska obuhvataju vodu, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferisan fosfatom, etanol, dekstrozu, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slični), kao i njihove odgovarajuće smeše, bilјna ulјa, kao što su maslinovo ulјe, kukuruzno ulјe, ulјe kikirikija, ulje pamuka i susama, koloidni rastvori karboksimetil celuloze, tragakant guma i organski estri koji se mogu injecirati, poput etil oleata, i/ili razlni puferi. Ostali nosači su dobro poznati u farmaceutskoj praksi.
[0186] Farmaceutski prihvatlјivi nosači obuhvataju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za trenutnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti tehnike. Osim u slučaju kada je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska.
[0187] Pravilna fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje poput lecitina, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom površinski aktivnih materija.
[0188] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe sadržavati farmaceutski prihvatlјive antioksidanse, na primer (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slični; (2) antioksidanse rastvorljive u ulјu, kao što su askorbil palmitat, butilisan hidroksianizol (BHA), butilisani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slični; i (3) agense za helaciju metala, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetra sirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slični.
[0189] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe sadržavati izotonične agense, kao što su šećeri, polialkoholi poput manitola, sorbitola, glicerola ili natrijum hlorid u kompozicijama.
[0190] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe sadržavati jedan ili više adjuvanasa pogodnih za izabrani put primene, kao što su konzervansi, ovlaživači, emulgatori, sredstava za dispergovanje, konzervansi ili puferi, koji mogu poboljšati rok trajanja ili efektivnost farmaceutske kompozicije. Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti pripremljena sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog otpuštanja, kao što su formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem, uklјučujući implantate, transdermalne flastere i mikro-inkapsulirane sisteme za isporuku. Takvi nosači mogu uklјučivati želatin, gliceril monostearat, gliceril distearat, biorazgradive, biokompatibilne polimere, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poli-orto-esteri i polilaktična kiselina samostalno ili sa voskom, ili druge materijale koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Postupci za pripremu ovakvih formulacija su opšte poznati stručnjacima. Pogledati npr. [82].
[0191] Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti formulisana da se obezbedi pravilna distribucija in vivo. Farmaceutski prihvatlјivi nosači za parenteralnu primenu obuhvata sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za trenutnu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti tehnike. Osim u slučaju kada je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. Ostala aktivna ili terapijska jedinjenja mogu takođe biti ugrađena u kompozicije.
[0192] Farmaceutske kompozicije za injeciranje obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura koja je pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti vodeni ili nevodeni rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliole (poput glicerola, propilen glikola, polietilen glikola i sličnih), i odgovarajuće smeše istih, bilјna ulјa poput maslinovog ulja, kao i organske estre za injeciranje poput etil oleata. Pravilna fluidnost se može održati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželјno je da se u kompoziciju uklјuče izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi poput glicerola, manitola, sorbitola ili natrijum hlorida. Produžena apsorpcija kompozicije za injeciranje se može postići uklјučivanjem u kompoziciju agensa koja odlaže apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatina. Sterilni rastvori za injeciranje mogu biti pripremljeni ugradnjim aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču, sa jednim ili sa kombinacijom sastojaka, npr. kao što su oni nabrojani prethodno, ukoliko je potrebno, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. U principu, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potom dodavanjem drugih potrebnih sastojaka, npr. onih koji su ptrethodno nabojani. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, primeri postupaka za pripremu su sušenje vakuumom i sušenjem zamrzavanjem (liofilizacija) kojima se dobija prah aktivnog sastojka i bilo koji dodatni želјeni sastojak iz njihovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.
[0193] Sterilni rastvori za injeciranje mogu biti pripremljeni ugradnjom aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač, sa jednim ili sa kombinacijom prethodno nabrojanih sastojaka, nakon čega po potrebi sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potom dodavanjem potrebnih drugih sastojaka od onih koji su prethnodno nabrojani. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, primeri postupaka za pripremu su sušenje vakuumom i sušenjem zamrzavanjem (liofilizacija) kojima se dobija prašak aktivnog sastojka zajedno sa bilo kojim dodatnim želјeni sastojkom iz njihovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.
[0194] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može sadržavati jedno antitelo, bispecifično antitelo ili ADC predmetnog pronalaska, kombinaciju antitela, bispecifičnog antitela ili ADC prema pronalasku sa drugim terapijskim jedinjenjem ili kombinaciju jedinjenja predmetnog pronalaska.
Konstrukti nukleinskih kiselina, ekspresioni vektori i ćelije domaćini
[0195] Prema jednom aspektu, predmetni opis se odnosi na kontrukt nukleinske kiseline koja kodira antitelo prema pronalasku. Stoga, predmetni opis se odnosi na konstrukte nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od sekvenci navedenih u SEQ ID Nos.: 1, 2, 21 do 30, 36 do 40, 83 do 107, 119 do 129. Konstrukt nukleinske kiseline može kodirati najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos.: 1, 2, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 36, 37, 38, 39, 40, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 i 129. Konstrukt nukleinske kiseline može kodirati antitelo prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan.
[0196] Predmetni opis obezbeđuje ekspresioni vektor koji kodira antitelo pronalaska. Tako, prema jednom aspektu pronalaska, ekspresioni vektor sadrži jedan ili više konstrukata nukleinske kiseline prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan. Takvi ekspresioni vektori mogu biti upotrebljeni za ekspresiju anti-AXL antitela predmetnog pronalaska. Eksprimirano anti-AXL antitelo može naknadno biti konjugovano sa određenom strukturom, kao što je ovde opisano. U drugom primeru izvođenja, anti-AXL antitelo može naknadno biti upotrebljeno za generisanje bispecifičnog antitela, kao što je ovde opisano.
[0197] Ekspresioni vektor može sadržavati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira jednu ili više od VH CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID Nos.: 36-38, 83-85, 88-90, 93-95, 98-100 i 103-105.
[0198] Ekspresioni vektor može sadržavati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira jednu ili više VH aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID Nos.: 1, 21, 23, 25, 27 i 29.
[0199] Ekspresioni vektor može sadržavati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira jednu ili više VL aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID Nos.: 2, 22, 24, 26, 28 i 30.
[0200] Ekspresioni vektor može sadržavati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijante jedne ili više od prethodno navedenih aminokiselinskih sekvenci, pri čemu navedene varijante sadrže najviše 25 aminokiselinskih modifikacija, kao što je 20, kao što je najviše 15, 14, 13, 12 ili 11 aminokiselinskih modifikacija, kao što je 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinskih modifikacija, poput delecija ili insercija, poželјno supstitucija, kao što su konzervativne ili nekonzervativne supstitucije, ili su varijatne najmanje 80% identične bilo kojoj od navedenih sekvenci, kao što je identičnost od najmanje 85% ili identičnost od 90% ili identičnost od 95%, kao što je identičnost od 96% ili identičnost od 97% ili identičnost od 98% ili identičnost od 99% sa bilo kojom od prethodno navedenih aminokiselinskih sekvenci. Predmetni opis se takođe odnosi na sekvence nukleinske kiseline koje su različite od prethodno navedenih sekvenci nukleinske kiseline, ali koje usled varijanse genetičkog koda kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu kao antitelo predmetnog pronalaska. Na primer, sekvenca nukleinske kiseline može varirati, ali i rezultovati u identičnoj aminokiselinskoj sekvenci kao što je bilo koja aminokiselinska sekvenca koja je ovde opisana. Stručnjaku je dobro poznato kako da na osnovu genetičkog koda identifikuje takve dodatne sekvence nukleinskih kiselina.
[0201] Ekspresioni vektor može dalјe sadržavati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region lakog lanca, teškog lanca ili i lakog i teškog lanca antitela, npr. humanog IgG1, κ monoklonskog antitela.
[0202] Takvi ekspresioni vektori, kao što je prethodno opisano, mogu biti upotrebljeni za rekombinantnu proizvodnju antitela pronalaska.
[0203] Ekspresioni vektor u kontekstu predmetnog pronalaska može biti bilo koji pogodan vektor, uklјučujući hromozomske, nehromozomske i sintetske vektore nukleinskih kiselina (sekvence nukleinskih kiselina koje sadrže odgovarajući set elemenata za kontrolu ekspresije). Primeri takvih vektora obuhvataju derivate SV40, bakterijske plazmide, fagnu DNK, bakulovirusne, plazmide kvasca, vektore izvedene iz kombinacije plazmida i fagne DNK, i vektore na bazi virusnih nukleinskih kiselina (RNK ili DNK). U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira anti-AXL antitela se nalazi u okviru “golog” DNK ili RNK vektora, uklјučujući, na primer, linearni ekspresioni element (kao što je opisano na primer [83]), kompaktnog vektora nukleinske kiseline (kao što je opisano na primer u [84] i/ili [85]), plazmidnog vektora kao što je pBR322, pUC 19/18 ili pUC 118/119, vektora nukleinske kiseline minimalne veličine (engl. midge - kao što je opisano na primer u [86]), ili vektorskog konstrukta precipitirane nukleinske kiseline, poput CaP04 precipitiranog konstrukta (kao što je opisano na primer u [87], [88], [89] i [90]). Takvi vektori nukleinskih kiselina i njihova upotreba su dobro poznati u oblasti tehnike (pogledati na primer [91] i [92]).
[0204] Vektor može biti onaj koji je pogodan za ekspresiju anti-AXL antitela u bakterijskoj ćeliji. Primeri takvih vektora obuhvataju ekspresione vektore kao što su BlueScript (Stratagene), pIN vektori ([93], pET vektori (Novagen, Madison WI) i slični).
[0205] Ekspresioni vektor takođe može biti ili je alternativno vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca. Bilo koji vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca može biti upotrebljen. Pogodni vektori uklјučuju, na primer, vektore koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotore kao što su alfa faktor, alkoholna oksidaza i PGH (revijski pregled u: [94] i [95]).
[0206] Konstrukt i/ili vektor nukleinske kiseline može takođe sadržavati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu sekrecije/lokalizacije, koja može omogućiti ciljano dopremanje polipeptida, kao što je nascentni polipeptidni lanac, do periplazmatskog prostora ili u medijum ćelijske kulture. Takve sekvence su poznate u oblasti tehnike i obuhvataju liderske ili signalne peptide sekrecije, sekvence za ciljanu isporuku u organele (npr. sekvence lokalizacije u jedro, signale zadržavanja u ER, sekvence mitohondrijalnog tranzita, hloroplastne tranzitne sekvence), sekvence lokalizacije/usidravanja u membrani (npr. sekvence zaustavljanja transfera, GPi sekvence za usidravanje) i slične.
[0207] U ekspresionom vektoru predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju anti-AXL antitelo mogu sadržavati ili biti udružene sa bilo kojim pogodnim promotorom, pojačivačem i drugim elementima koji olakšavaju ekspresiju. Primeri takvih elemenata obuhvataju snažne promotore ekspresije (npr. humani CMV IE promotor/pojačivač kao i RSV, SV40, SL3-3, MMTV i HIV LTR promotore), sekvence efektivne poli (A) terminacije, sekvencu početka replikacije za proizvod plazmida u E. coli, gen rezistencije na antibiotike kao selektivni marker i/ili pogodno mesto za kloniranje (npr. polilinker). Nukleinske kiseline takođe mogu sadržavati inducibilni promotor nasuprot konstitutivnom promotoru, kao što je CMV IE (iskusan stručnjak će prepoznati da su navedni termini zapravo predstavljaju opise stepena genske ekspresije pod određenim uslovima).
[0208] Ekspresioni vektor koji kodira anti-AXL-antitelo može biti pozicioniran u i/ili isporučen u ćeliju domaćina ili životinju domaćina putem virusnog vektora.
[0209] Predmetni opis se odnosi na rekombinantnu eukariotsku ili prokariotsku ćeliju domaćina, kao što je transfektom, koji proizvodi anti-AXL antitelo predmetnog pronalaska kao što je ovde definisano, ili bispecifični molekul pronalaska, kao što je ovde definisano. Primeri ćelija domaćina obuhvataju ćelije kvasca, bakterijske ili sisarske ćelije, kao što su CHO ili HEK ćelije ili njihovi derivati. Na primer, u jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju koja u ćelijskom genomu sadrži stabilno integrisanu kodirajuću nukleinsku kiselinu u cilju ekspresije anti-AXL antitela predmetnog pronalaska. U drugom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži neintegrisanu nukleinsku kiselinu, poput plazmida, kozmida, fagemida ili elementa linearne ekspresije, koja sadrži kodirajuću sekvencu u cilju ekspresije anti-AXL antitela pronalaska.
[0210] Prema dalјem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži vektor prema bilo kom aspektu i primeru izvođenja koji je ovde opisan. Anti-AXL antitela koja su ovde opisana su obezbeđena upotrebom rekombinantnih eukariotskih, prokariotskih ili mikrobnih ćelija domaćina koja proizvode antitelo. Prema tome, pronalazak obezbeđuje rekombinantnu ćeliju domaćina, kao što je rekombinantna prokariotska, rekombinantna eukariotska ili rekombinantna mikrobna ćelija domaćin. Primeri ćelija domaćina obuhvataju ćelije kvasca, bakterijske i sisarske ćelije, kao što su CHO ili HEK-293 ćelije. Na primer, u jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin sadrži nukleinsku kiselinu koja je stabilno integrisana u ćelijski genom i sadrži sekvencu koja kodira za ekspresiju ovde opisanog anti-AXL antitela. Ćelija domaćin može sadržavati nukleinsku kiselinu koja je stabilno integrisana u ćelijski genom i sadrži sekvencu koja kodira za ekspresiju prvog ili drugog polipeptida koji je ovde opisan. Ćelija domaćin može sadržavati neintegrisanu nukleinsku kiselinu, poput plazmida, kozmida, fagemida ili linearnog ekspresionog elementa, koja sadrži sekvencu koja kodira za ekspresiju anti-AXL antitela, prvi ili drugi polipeptid koji je ovde opisan.
[0211] Predviđeno je da se termin "rekombinantna ćelija domaćina" (ili jednostavno "ćelija domaćin"), kako se ovde upotrebljava, odnosi na ćeliju u koju je uveden ekspresioni vektor. Podrazumeva se da je predviđeno da se ovakvi termini ne odnose samo na određenu predmetnu ćeliju, već i na potomstvo takve ćelije. Pošto se u sledećim generacijama mogu dogoditi određene modifikacije usled bilo mutacija ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne može, u stvari, biti identično matičnoj ćeliji, ali je još uvek uklјučeno u opseg termina "ćelija domaćin" kako se on ovde upotrebljava. Rekombinantne ćelije domaćina uklјučuju, na primer, transfektome, kao što su CHO ćelije, HEK-293 ćelije, PER.C6, NS0 ćelije i limfocitne ćelije, kao i prokariotske ćelije kao što su E. coli, ali i druge eukariotske domaćinepoput bilјnih ćelija i ćelija gljiva.
[0212] Termin "transfektom", kako se ovde upotrebljava, obuhvata rekombinantne eukariotske ćelije domaćine koje eksprimiraju antitelo ili cilјni antigen, kao što su CHO ćelije, PER.C6, NS0 ćelije, HEK-293 ćelije, bilјne ćelije ili ćelije gljiva, uklјučujući ćelije kvasca.
[0213] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na hibridom koji proizvodi antitelo prema bilo kom ovde opisanom aspektu ili primeru izvođenja. Tako, antitelo može biti dobijeno iz hibridoma pripremlјenih od mišijih B ćelija slezine izolovanih iz miševa imunizovanih sa antigenom od interesa, na primer, u vidu ćelija koje eksprimiraju antigen na površini ili sa nukleinskom kiselinom koja kodira antigen od interesa. Monoklonska antitela mogu takođe biti dobijena iz hibridoma izvedenih iz ćelija koje eksprimiraju antitelo kod imunizovanih lјudi ili sisara različitih od čoveka poput zečeva, pacova, pasa, primata itd.
[0214] Humana antitela mogu biti generisana upotrebom transgenih ili transhromozomalnih miševa, npr. HuMab miševa, koji nose delove humanog imunog sistema, a ne mišji sistem. HuMab miš sadrži minilokus humanog imunoglobulinskog gena koji kodira nerearanžirane humane imnoglobulinske sekvence teškog (µ i γ) i κ lakog lanca, zajedno sa cilјanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse µ i κ lanaca [96]. Shodno navedenom, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ, a kao odgovor na imunizaciju, uvedeni transgeni humanih i lakih lanaca, se podvrgavaju izmeni klase i somatskim mutacijama da bi se generisala humana IgG,κ monoklonska antitela visokog afiniteta [96], [97], [98] i [99]. Priprema HuMab miševa je detalјno opisana u [100], [101], [102], [103] i [104]. Pogledati takođe [105] do [121]. Splenociti iz ovih transgenih miševa mogu biti upotrebljeni za generisanje hibridoma koji luče humana monoklonska antitela, upotrebom dobro poznatih tehnika.
[0215] Dodatno, humana antitela predmetnog opisa, ili antitela predmetnog pronalaska iz drugih vrsta, mogu biti identifikovati upotrebom tehnologija prikazivanja, uklјučujući, bez ograničavanja samo na, prikazivanje na fagima, retrovirusno prikazivanje, ribozomalno prikazivanje, prikazivanje u sisarskim ćelijama, kvascima, kao i druge tehnike koje su poznate u oblasti, a dobijeni molekuli mogu biti potom podvrgnuti dodatnom sazrevanju, kao što je afinitetno sazrevanje, pošto su i takve tehnike dobro poznate u oblasti tehnike.
[0216] Tako, prema jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju antitela prema bilo kom ovde opisanom aspektu ili primeru izvođenja, koji obuhvata korake
a) kultivisanje ćelije domaćina ili hibridoma prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan; i
b) prečišćavanje antitela iz medijuma kulture ćeliija.
Terapijske primene
[0217] Prema drugom aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo, bispecifično antitelo ili imunokonjugat ili ADC predmetnog pronalaska, kao što je ovde definisano u bilo kom aspektu ili primeru izvođenja, za upotrebu u vidu medikamenta.
[0218] Anti-AXL antitela predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljena u lečenju ili prevenciji poremećaja koji uklјučuju ćelije koje eksprimiraju AXL. Na primer, antitela se mogu primenjivati ćelijama u kulturi, npr. in vitro ili ex vivo, ili humanim subjektima, npr. in vivo, radi lečenja ili prevencije poremećaja koji uklјučuju ćelije koje eksprimiraju AXL. Kao što se ovde upotrebljava, termin "subjekat" je obično čovek kome se primenjuje anti-AXL antitelo ili ADC. Subjekti mogu, na primer, uključivati humane pacijente koji boluju od poremećaja koji se mogu korigovati ili pobolјšati modulacijom AXL funkcije ili ubijanjem ćelije koja eksprimira AXL, direktno ili indirektno.
[0219] Prema jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo, bispecifično antitelo ili imunokonjugat predmetnog pronalaska, definisan ovde u bilo kom aspektu ili primeru izvođenja, za upotrebu u lečenju kancera.
[0220] Predmetni opis obezbeđuje postupak za modulisanje signalizacije udružene sa AXL molekulom, u ćeliji koja eksprimira AXL, dovođenjem ćelije u kontakt sa anti-AXL antitelom ili ADC prema bilo kom ovde opisanom aspektu ili primeru izvođenja.
[0221] Predmetni opis obezbeđuje postupak za ubijanje ćelije koja eksprimira AXL, kontaktom ćelije sa anti-AXL antitelom ili ADC pronalaska. Bez ograničavanja na teoriju, umrežavanje ili grupisanje AXL molekula na površini ćelije posredovano antitelom ili sa ADC (npr. usled vezivanja Fc regiona antitela vezanog za AXL sa ćelijama koje eksprimiraju FcR) može dovesti do apoptoze ćelije.
[0222] Predmetni opis obezbeđuje postupak za ubijanje ćelije koja eksprimira AXL, kontaktom ćelije sa antitelom ili ADC pronalaska koji su specifični za AXL, u prisustvu efektorskih ćelija sposobnih da indukuju ćelijski odgovor zavisan od Fc, kao što su ADCC ili ADCP. U ovom primeru izvođenja, antitelo je obično pune dužine i izotipa koji dovodi do ADCC ili ADCP odgovora, kao što je, na primer, to slučaj za IgG1, κ izotip.
[0223] Predmetni opis obezbeđuje postupak za ubijanje ćelije koja eksprimira AXL, kontaktom ćelije sa antitelom ili ADC pronalaska koji su specifični za AXL, u prisustvu proteina komplementa, poput proteina komplementa koji su prisutni u normalnom humanom serumu, a koji se mogu aktivirati i time indukovati CDC nakon vezivanja antitela ili ADC specifičnog za AXL za plazma membranu ćelija koje eksprimiraju AXL. Antitelo je obično pune dužine i izotipa koji može da indukuje aktivaciju sistema komplemenata, kao što je, na primer, IgG1, κ izotip.
[0224] Anti-AXL antitela pronalaska može karakterisati internalizacija nakon vezivanja za AXL, što ih čini pogodnim za ADC pristup upotrebom ADC, kao što je opisano u bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan.
[0225] Shodno navedenom, opis obezbeđuje postupak za ubijanje ćelije koja eksprimira AXL, kontaktom ćelije sa ADC-om prema predmetnom opisu, što zahteva internalizaciju i prenos do lizozoma radi specifičnog (tj. sa linkerom podložnim cepanju) ili nespecifičnog (sa linker koji nije podložan cepanju) proteolitičkog cepanja kompleksa anti-AXL antitelo-linker-lek.
[0226] Predmetni opis se odnosi na postupak za ometanje regulacije urođenog ili adaptivnog imunog odgovora posredovanog sa AXL, kao što je vezivanje antitela ili ADC specifičnog za AXL prema pronalasku za makrofage, dendritične ćelije ili NK ćelije koji eksprimiraju AXL.
[0227] Predmetni opis obezbeđuje postupak ubijanja ćelije koja eksprimira AXL, kontaktom ćelije sa ADC-om pronalaska, pri čemu je anti-AXL antitelo povezano sa terapijskom strukturom preko linkera koji omogućava oslobađanje leka jednom kada se ADC internalizuje, npr. promenom pH ili u redukujućim uslovima. Pogodna tehnologija linkera je poznata u praksi, kao što je prethodno opisano.
[0228] Predmetni opis obezbeđuje postupke za lečenje ili prevenciju poremećaja koji uklјučuje ćelije koje eksprimiraju AXL kod subjekta, postupak koji obuhvata primenu terapijski efektivne količine anti-AXL antitela, bispecifičnog antitela ili ADC predmetnog pronalaska subjektu kome je to potrebno. Postupak obično obuhvata primenu anti-AXL antitela, bispecifičnog antitela ili ADC prema ovom pronalasku subjektu, u količini koja je efektivna za lečenje ili prevenciju poremećaja.
[0229] Anti-AXL antitelo ili ADC prema predmetnom pronalasku mogu biti primenjeni profilaktički u cilјu smanjenja rizika za razvoj kancera, odlaganja početka događaja u progresiji kancera ili smanjenja rizika od ponovne pojave kada je kancer u remisiji i/ili je primarni tumor hirurški uklonjen. U poslednje navedenom slučaju, anti-AXL antitelo može, na primer, biti primenjeno zajedno sa (tj. pre, tokom ili nakon) operacije. Profilaktička primena takođe može biti korisna kod pacijenata kod kojih je teško locirati tumor za koji se veruje, na osnovu drugih bioloških faktora, da je prisutan.
[0230] Ćelije sa visokom AXL ekspresijom, kao što je prekomerna ekspresija ili aberantna AXL ekspresija, što je pronađeno u pojedinim kancerskim ćelijama, posebno su dobre za ciljano dejsvo anti-AXL antitela, bispecifičnih antitela ili ADC pronalaska, pošto više antitela ili ADC-a može biti vezano po ćeliji tumora. Tkiva koja heterogeno eksprimiraju AXL, kao što je tumorsko tkivo, mogu takođe biti pogodna za ciljano dejstvo anti-AXL antitela, bispecifičnih antitela, ADC ili anti-AXL-ADC pronalaska. Stoga, poremećaj koji uklјučuje ćelije koje eksprimiraju AXL može biti kancer, tj. tumorogeni poremećaj, kao što je poremećaj koga karakteriše prisustvo tumorskih ćelija koje eksprimiraju AXL uklјučujući, na primer, poremećaje gde su ćelije iz solidnog tumora ili hematološkog tumora. Ekspresija AXL je opisana, na primer, u nestinoćelijskom kanceru pluća (NSCLC; [122]), kanceru pankreasa [123], kanceru jednjaka [124], kanceru endometrijuma [125].
[0231] Ćeliije koje eksprimiraju AXL za primer stoga uklјučuju kancerske ćelije poput, na primer, ćelija nesitnoćelijskog kancera pluća, kancera pankreasa i kancera jednjaka.
[0232] Predmetni opis obezbeđuje postupke za lečenje ili prevenciju kancera koji obuhvataju primenu antitela, bispecifičnog antitela, imunokonjugata, kompozicije ili farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku, subjektu kome je to potrebno.
[0233] Kancer može biti solidan tumor koji eksprimira AXL ili hematološki kancer koji eksprimira AXL. Hematološki kancer može biti akutna mijeloidna leukemija (AML). Solidni tumor koji eksprimira AXL može biti kancer pluća ili epidermoidni karcinom.
[0234] Stoga, predmetni opis se odnosi na postupke koji obuhvataju primenu terapijski efektivne količine anti-AXL antitelaili ADC predmetnog pronalaska subjektu kome je to potrebno.
[0235] Predmetni opis se odnosi na postupak za inhibiranje rasta i/ili proliferacije tumorskih ćelija koje eksprimiraju AXL, postupak koji obuhvata primenu, pojedincu kome je to potrebno, antitela, bispecifičnog antitela, imunokonjugata, kompozicije ili farmaceutske kompozicije prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan.
[0236] Predmetni opis se odnosi na postupak za inhibiranje migracije i/ili invazije tumorske ćelije koja eksprimira AXL, postupak koji obuhvata primenu, pojedincu kome je to potrebno, antitela, bispecifičnog antitela, imunokonjugata, kompozicije ili farmaceutske kompozicije prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan.
[0237] Predmetni opis se odnosi na postupak za inhibiciju rezistencije na cilјanu terapiju, kao što je EGFR- ili BRAF-cilјana terapija, ili rezistencije na hemoterapijske agense, postupak koji obuhvata primenu, pojedincu kome je to potrebno, antitela, bispecifičnog antitela, imunokonjugata, kompozicije ili farmaceutske kompozicije prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan.
[0238] Predmetni opis se odnosi na postupak za cilјano delovanje ili inhibiciju makrofaga asociranih sa tumorom, postupak koji obuhvata primenu, pojedincu kome je to potrebno, antitela, bispecifičnog antitela, imunokonjugata, kompozicije ili farmaceutske kompozicije prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan.
[0239] Predmetni opis obezbeđuje postupke za lečenje ili prevenciju solidnog tumora, postupak koji obuhvataju primenu terapijski efektivne količine anti-AXL antitela ili ADC predmetnog pronalaska subjektu kome je to potrebno, a pri čemu je solidan tumor melanom, karcinom, sarkom, adenom i/ili gliom. U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera endometrijuma/grlića materice, kancera pluća (kao što je npr. sitnoćelijski ili nesitnoćelijski kancer pluća), tiroidnog kancera, kancera debelog creva, kancera bubrega, kancera jajnika, kancera dojke, kancera jednjaka, kancera kože, malignog melanoma i kancera pankreasa.
[0240] Kancer može biti kancer pankreasa, kao što je napredni ili metastatski kancer pankreasa koji se ne može operisati. Kancer može biti kancer endometrijuma/grlića materice ili kancera pluća. Kancer može biti kancer štitne žlezde. Kancer može biti kancer debelog creva. Kancer može biti kancer bubrega. Kancer može biti kancer jajnika. Kancer može biti kancer dojke kao što je kancer negativan na estrogenski receptor alfa ili pozitivan na estrogenski receptor alfa. Kancer može biti trostruko negativan kancer dojke (tj. kancer dojke koji je u testovima negativan na estrogenske receptore (ER-), progesteronske receptore (PR-) i receptor humanog epidermalnog faktora rasta tipa 2 (HER2-). Kancer može biti kancer jednjaka. Kancer može biti kancer kože. Kancer može biti melanom kao što je maligni melanom. Kancer može biti akutna mijeloidna leukemija (AML). Kancer može biti rezistentan na hemoterapiju, inhibitore tirozin kinaze i ili BRAF inhibitore. Kancer može biti rezistentan na ciljanu EGFR terapiju.
[0241] Predmetni opis se odnosi na antitelo koje se vezuje za vanćelijski domen AXL, kao što je domen AXL-a sličan Ig1, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u vidu medikamenta.
Stoga, pronalazak obezbeđuje antitelo ili imunokonjugat prema bilo kom od aspekata ili primera izvođenja koji su prethodno opisani, za upotrebu u vidu medikamenta.
[0242] Preciznije, antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u vidu medikamenta.
[0243] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera.
[0244] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera štitne žlezde.
[0245] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera debelog creva.
[0246] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera bubrega.
[0247] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera jajnika.
[0248] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera dojke.
[0249] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u lečenju ili prevenciji trostruko negativnog kancera dojke.
[0250] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera jednjaka.
[0251] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera kože.
[0252] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u lečenju ili prevenciji melanoma kao što je maligni melanom.
[0253] Antitelo može sadržavati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera pluća (kao što je, npr. sitnoćelijski kancer pluća ili nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC)).
[0254] Antitelo može imati najmanje jedan region za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, a VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu se navedeno antitelo koristi za lečenje ili prevenciju akutne mijeloidne leukemije (AML).
[0255] Predmetni opis obezbeđuje lečenje ili prevenciju kancera. Antitela koja se koriste prema opisu, mogu biti kuplovana ili povezana sa citotoksičnim agensom da bi se povećala efikasnost ili efekat lečenja.
[0256] Ovde opisana antitela mogu biti povezana sa citotoksičnim agensom kao što je auristatin (kao što je, npr. monometil auristatin E (MMAE)) da bi se obrazovao imunokonjugat za upotrebu u vidu medikamenta, kao što je npr. za lečenje ili prevenciju kancera.
[0257] Predmetni opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo koje se vezuje za AXL, ukoliko antitelo nije u kompeticiji za vezivanje za AXL sa Gas6 ligandom.
[0258] Opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID No..: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u vidu medikamenta.
[0259] Opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID No..: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0260] Predmetni opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera štitne žlezde. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0261] Opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID No..: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera debelog creva. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0262] Predmetni opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera bubrega. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0263] Predmetni opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera jajnika. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0264] Predmetni opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera dojke. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0265] Predmetni opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji trostruko negativnog kancera dojke. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0266] Predmetni opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera pluća. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0267] Predmetni opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera jednjaka. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0268] Predmetni opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji melanoma kao što je maligni melanom. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0269] Predmetni opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera pluća. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0270] Predodređen opis se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo sa najmanje jednim regionom za vezivanje koji sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence iz SEQ ID Nos.: 36, 37 i 38, i VL region sadrži sekvence iz SEQ ID Nos.: 39, GAS i 40, pri čemu je navedeno antitelo povezano sa monometil auristatinom E da bi se obrazovao imunokonjugat, a navedeni imunokonjugat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji akutne mijeloidne leukemije. Antitelo može biti povezano sa monometil auristatinom E preko mc-vc-PAB linkera.
[0271] Antitelo može biti povezano sa citotoksičnim agensom kao što je auristatin da bi se obrazovao imunokonjugat. Antitelo i citotoksični agens mogu biti povezani maleimidokaproil-valin-citrulin-paminobenziloksikarbonilnim (mc-vc-PAB) linkerom.
[0272] Izbor pacijenata koji će biti lečeni sa anti-AXL antitelama se može zasnivati na nivou AXL ekspresije u uzorku, kao što je uzorak koji sadrži tumorske ćelije, ili na detekciji tumora koji eksprimiraju AXL upotrebom obeleženih anti-AXL antitela ili fragmenata antitela, npr. onih iz pronalaska. Ovde su opisani dijagnostički testovi za određivanje AXL ekspresije upotrebom AXL antitela pronalaska. Efektivne doze i režimi doziranja za anti-AXL antitelo ili ADC zavise od oboljenja ili stanja koje će biti lečeno i može biti određeno od strane stručne osobe.
[0273] Lekar sa prosečnim iskustvom može lako odrediti i propisati efektivnu količinu potrebne farmaceutske kompozicije. U vezi sa navedenim, kada se odnosi na farmaceutsku kompoziciji, podrazumeva se i da ona sadrži kompoziciju kao takvu, ili obrnuto. Na primer, lekar može započeti primenu doza anti-AXL antitela iskorišćenog u farmaceutskoj kompoziciji u nivoima nižim od potrebnih, da bi se postigao želјeni terapijski efekat, i zatim postepeno povećavati dozu do postizanja želјenog efekta. U principu, pogodna doza farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska će biti ona količina jedinjenja koja je najniža efektivna doza za postizanje terapijskog efekta prema određenom režimu doziranja. Takva efektivna doza će generalno zavisiti od prethodno opisanih faktora.
[0274] Na primer, „efektivna količina“ za terapijsku upotrebu može biti izmerena njenom sposobnošću da stabilizuje napredovanje bolesti. Sposobnost jedinjenja da inhibira kancer može se, na primer, proceniti u sistemu animalnog modela za predviđanje efikasnost u humanim tumorima. Alternativno, ovo svojstvo kompozicije može biti procenjeno ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira ćelijski rast ili da indukuje citotoksičnost, upotrebom in vitro analiza koje su poznate iskusnom praktičaru. Terapijski efektivna količina terapijskog jedinjenja može smanjiti veličinu tumora ili na drugi način ublažiti simptome kod subjekta. Prosečno iskusan stručnjak će biti u stanju da odredi takve količine na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, težina simptoma kod subjekta i određena kompozicija ili izabrani način primene koji se upotrebljavaju.
[0275] Neograničavajući opseg terapijski efektivne količine anti-AXL antitela predmetnog pronalaska za primer je oko 0,1-100 mg/kg, kao što je oko 0,1-50 mg/kg, na primer oko 0,1-20 mg/kg, kao što je oko 0,1-10 mg/kg, na primer, oko 0,5, oko 0,3, oko 1, oko 3 mg/kg, oko 5 mg/kg ili oko 8 mg/kg.
[0276] Neograničavajući opseg terapijski efektivne količine anti-AXL ADC-a pronalaska za primer je 0,02-100 mg/kg, kao što je oko 0,02-30 mg/kg, kao što je oko 0,05-10 mg/kg ili 0,1 -3 mg/kg, na primer, oko 0,5-2 mg/kg.
[0277] Primena može npr. biti intravenska, intramuskularna, intraperitonealna ili subkutana i, na primer, primenjena proksimalno u odnosu na mesto ciljanog dejstva.
[0278] Režimi doziranja u prethodno navedenim postupcima lečenja i upotrebe se prilagođavaju tako da se obezbedi željeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može biti primenjen jedan bolus, može biti primenjeno više podelјenih doza tokom vremena ili se doza može proporcionalno smanjivati ili povećavati na osnovu potreba terapijske situacije.
[0279] Odnos efikasnosti i bezbednosti može biti optimizovan smanjivanjem specifične toksičnosti, kao što je, na primer, smanjivanjem odnosa leka i antitela (DAR) i/ili mešanjem anti-AXL ADC sa neobeleženim anti-AXL antitelom.
[0280] Efikasnost tretmana se može pratiti tokom terapije, npr. u unapred definisanim vremenskim tačkama. Efikasnost može biti praćena merenjem nivoa AXL u uzorku koji sadrži tumorske ćelije, vizualizacijom obolele površine ili drugim dijagnostičkim postupcima koji su ovde opisani, npr. jednim ili sa više PET-CT skeniranja, na primer, upotrebom obeleženog anti-AXL antitela, fragmenta ili mini antitela izvedenog iz antitela specifičnog za AXL predmetnog pronalaska.
[0281] Ukoliko je poželjno, efektivna dnevna doza farmaceutske kompozicije može biti primenjena u vidu dve, tri, četiri, pet, šest ili više poddoza, primenjenih odvojeno u odgovarajućim intervalima tokom dana, opciono, u jediničnim doznim oblicima. U drugom primeru izvođenja, anti-AXL antitela se primenjuju sporom kontinuiranom infuzijom tokom dužeg perioda, kao što je više od 24 sata, da bi se smanjili neželјeni sporedni efekti.
[0282] Iako je moguće da se jedinjenje pronalaska primenjuje samostalno, poželjno je da se jedinjenje primenjuje u vidu farmaceutske kompozicije, kao što je prethodno opisano.
[0283] Efektivna doza anti-AXL antitela, bispecifičnog antitela ili ADC pronalaska takođe može biti primenjena upotrebom nedelјnog, dvonedelјnog ili tronedelјnog perioda primene doza. Period doziranja može biti ograničen na, npr.8 nedelјa, 12 nedelјa ili dok se ne utvrdi klinička progresija.
[0284] Na primer, anti-AXL antitelo, bispecifično antitelo ili ADC mogu biti primenjeni infuzijom u nedelјnoj dozi od između 10 i 500 mg/m<2>, kao što je između 200 i 400 mg/m<2>. Takva primena se može ponoviti, npr.1 do 8 puta, kao što je 3 do 5 puta. Primena može biti izvedena kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 1 do 24 sata, kao što je od 1 do 12 sati.
[0285] Anti-AXL antitelo, bispecifično antitelo ili ADC mogu biti primenjivani infuzijom svake tri nedelјe u dozi od između 10 i 500 mg/m<2>, kao što je između 50-200 mg/m<2>. Takva primena se može ponoviti, npr. 1 do 8 puta, kao što je 3 do 5 puta. Primena može biti izvedena kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 1 do 24 sata, kao što je od 1 do 12 sati.
[0286] Anti-AXL ADC može biti primenjen u vidu pojedinačne doze od oko 0,1-10 mg/kg, kao što je oko 1-3 mg/kg, svake nedelјe ili svake treće nedelјe do dvanaest puta, do osam puta, ili do klinički relevantnog napretka. Primena može biti sprovedena kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 1 do 24 sata, kao što je od 1 do 12 sati. Takvi režimi se po potrebi mogu ponavlјati jedan ili više puta, na primer, nakon 6 meseci ili 12 meseci. Doziranje može biti određeno ili podešeno merenjem količine jedinjenja predmetnog pronalaska u krvi nakon primene, na primer, uzimanjem biološkog uzorka i upotrebom anti-idiotipskih antitela koja cilјano deluju na region za vezivanje antigena u anti-AXL antitelu predmetnog pronalaska.
[0287] Anti-AXL antitela mogu biti primenjena kao terapija za održavanje, na primer, jednom nedelјno u periodu od šest meseci ili više.
[0288] Kao neograničavajući primeri, lečenje prema predmetnom pronalasku može biti obezbeđeno u vidu dnevne doze jedinjenja predmetnog pronalaska u količini od oko 0,1-100 mg/kg, kao što je 0,2; 0,5; 0,9; 1,0; 1,1; 1,5; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 mg/kg dnevno, najmanje jednog od dana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40, ili alternativno, najmanje jednu od nedelјa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 nakon započinjanja lečenja, ili bilo koje njihove kombinacije, upotrebom pojedinačne ili podelјene doze na svakih 24, 12, 8, 6, 4 ili 2 sata, ili bilo koje kombinacije istih.
[0289] Parenteralne kompozicije mogu biti formulisane u jediničnom doznom obliku za laku primenu i ujednačenost doze. Jedinični dozni oblik, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinične doze za subjekta koji se leči; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu tako da proizvede želјeni terapijski efekat kada je udružen sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija jediničnih doznih oblika predmetnog pronalaska je diktirana i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog efekta koji je potrebno postići, i (b) ograničenja svojstvenih primeni jedinjenja u praksi kao što su aktivna jedinjenja za lečenje osetlјivosti kod pojedinaca.
Dijagnostičke primene
[0290] Anti-AXL antitela predmetnog pronalaska se takođe mogu koristiti u dijagnostičke svrhe, upotrebom kompozicije koja sadrži anti-AXL antitelo, kao što je ovde opisano. Shodno tome, pronalazak obezbeđuje dijagnostičke postupke i kompozicije upotrebom anti-AXL antitela koja su ovde opisana. Takvi postupci i kompozicije mogu biti upotrebljen u čisto dijagnostičke svrhe, kao što su detekcija ili identifikacija oboljenja koje uklјučuje ćelije koje eksprimiraju AXL, kao i za praćenje napretka terapijskih tretmana, praćenje napredovanja oboljenja, procenu statusa nakon lečenja, praćenje recidiva oboljenja, procenu rizika od razvoja oboljenja i sličnog.
[0291] Anti-AXL antitela predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljena ex vivo, kao što je postavljanje dijagnoze oboljenja u kome ćelije koje eksprimiraju AXL ukazuju na bolest ili su uklјučene u patogenezu, detektovanjem nivoa AXL ili nivoa ćelija koji eksprimiraju AXL na svojoj ćelijskoj površini, u uzorku koji je uzet od pacijenta. Ovo može biti postignuto, na primer, kontaktom uzorka koji se ispituje, opciono zajedno sa kontrolnim uzorkom, sa anti-AXL antitelom pod uslovima koji omogućavaju vezivanje antitela za AXL. Tada može biti detektovano obrazovanje kompleksa (npr. upotrebom ELISA). Kada se zajedno sa ispitivanim uzorkom upotrebljava kontrolni uzorak, nivo anti-AXL antitela ili AXL kompleksa sa anti-AXL antitelom se analizira u oba uzorka i statistički značajno viši nivo anti-AXL antitela ili AXL kompleksa sa anti-AXL antitelom u ispitivanom uzorku ukazuje na viši nivo AXL u ispitivanom uzorku u poređenju s kontrolnim uzorkom.
[0292] Primeri konvencionalnih imunoanaliza u kojima mogu biti upotrebljena anti-AXL antitela pronalaska uklјučuju, bez ograničavanja na, ELISA, RIA, FACS testove, testove plazmonske rezonance, hromatografske testove, imunohistohemiju tkiva, imunoblot analizu i/ili imunoprecipitaciju.
[0293] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na postupak za detekciju prisustva AXL antigena ili ćelije koja eksprimira AXL u uzorku, koji obuhvata:
● dovođenje u kontakt uzorka sa anti-AXL antitelom predmetnog pronalaska, pod uslovima koji omogućavaju vezivanje anti-AXL antitela sa AXL-om u uzorku; i
● analiziranje da li se obrazovao kompleks. Uzorak je obično biološki uzorak. Termin "AXL antigen", kako se upotrebljava u ovom kontektu, odnosi se i na solubilni i AXL antigen koji je vezan za ćeliju.
[0294] Uzorak može biti uzorak tkiva za koga je poznato ili se sumnja da sadrži AXL antigen i/ili ćelije koje eksprimiraju AXL. Na primer, in situ detekcija AXL ekspresije se može postići uzimanjem histološkog uzorka iz pacijenta i obezbeđujenjem antitela pronalaska takvom uzorku. Antitelo može biti obezbeđeno primenom ili prekrivanjem uzorka antitelom, koje se potom detektuje na odgovarajući način. Moguće je zatim utvrditi ne samo prisustvo ćelija koje eksprimiraju AXL ili AXL, već i distribuciju ćelija koje eksprimiraju AXL ili AXL u ispitivanom tkivu (npr. u kontekstu procene širenja kancerskih ćelija). Prilikom upotrebe predmetnog pronalaka, prosečno iskusan stručnjak će lako uočiti da bilo koji od širokog spektra histoloških postupaka (kao što su postupci bojenja) može biti modifikovan da bi se postigla takva in situ detekcija.
[0295] U prethodnim testovima, anti-AXL antitelo može biti obeleženo supstancom koja omogućava detekciju antitela vezanog za AXL. Alternativno, vezano (primarno) anti-AXL antitelo može biti detektovano sekundarnim antitelom koje je obeleženo supstancom koja se može detektovati i koja se vezuje za primarno antitelo. Štaviše, u prethodnim testovima može biti upotrebljena dijagnostička kompozicija koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema bilo kom aspektu ili primeru izvođenja koji je ovde opisan. Stoga, prema jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na dijagnostičku kompoziciju koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema bilo kom ovde opisanom aspektu ili primeru izvođenja.
[0296] Nivo AXL-a u uzorku takođe može biti procenjen kompetitivnim imunoesejem upotrebom AXL standarda koji su obeleženisupstancom koja se može detektovati, kao i neobeleženog anti-AXL antitela. U ovom tipu ispitivanja, biološki uzorak, obeleženi AXL standard(i) i anti-AXL antitelo se spajaju i određuje se količina obeleženog AXL standarda koji je vezan za neobeleženo anti-AXL antitelo. Količina AXL u biološkom uzorku je obrnuto proporcionalna količini obeleženog AXL standarda koji je vezan za anti-AXL antitelo.
[0297] Pogodni obeleživači anti-AXL antitela, sekundarnog antitela i/ili AXL standarda koji se upotrebljavaju u in vitro dijagnostičkim tehnikama obuhvataju, bez ograničavanja samo na, razne enzime, prostetične grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima obuhvataju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu i acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetičnih grupa uklјučuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uklјučuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid i fikoeritrin; primer luminiscentnog materijala uklјučuje luminol; a primeri pogodnog radioaktivnog materijala uklјučuju<125>J,<131>J,<35>S i<3>H.
[0298] Prema dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na komplet za detekciju AXL antigena ili ćelije koja eksprimira AXL u uzorku, koji sadrži:
● anti-AXL antitelo, bispecifično antitelo ili imunokonjugat ili ADC pronalaska; i
● uputstva za upotrebu kompleta.
[0299] Predmetni opis obezbeđuje komplet za dijagnozu kancera koji sadrži spremnik sa anti-AXL antitelom i sa jednim ili sa više od reagenasa za detekciju vezivanja anti-AXL antitela za AXL. Reagensi može uključivati, na primer, fluorescentne obeleživače, enzimske obeleživače ili druge obeleživače koje se mogu detektovati. Reagensi takođe mogu uklјučivati sekundarna ili tercijarna antitela ili reagense za enzimske reakcije, pri čemu enzimske reakcije proizvode proizvod koji se može vizuelizovati. Predmetni opis obezbeđuje dijagnostički komplet koji sadrži jedno ili više anti-AXL antitela pronalaska u obeleženom ili neobeleženom obliku, u odgovarajućim spremnicima, reagense za inkubacije u okviru indirektnog testa i supstrate ili derivatizovane agense za detekciju u takvim testovima, u zavisnosti od prirode obeleživača. Takođe može/mogu biti uklјučen(i) kontrolni reagens(i) i uputstva za upotrebu.
[0300] Dijagnostički kompleti mogu takođe biti obezbeđeni za upotrebu sa anti-AXL antitelom, kao što je konjugovano/obeleženo anti-AXL antitelo, za detekciju prisustva AXL-a u uzorku tkiva ili domaćinu. Tako, anti-AXL antitelo prema predmetnom pronalasku takođe može biti upotrebljeno kao, npr deo, prateće dijagnostike, na primer, kao primarno antitelo u imunohistohemijskom testu dizajniranom za detekciju AXL ekspresije u solidnom tumoru, limfnom čvoru ili biopsiji drugog tkiva. Alternativno, anti-AXL antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti upotrebljena kao primarno antitelo u testu zasnovanom na protočnoj citometriji ili u imunocitohemijskom testu da bi se identifikovale ćelije koje eksprimiraju AXL u krvi, kosnoj srži, aspiratima dobijenim upotrebom tankih igala, npr. aspiratima limfnih čvorova ili peritonealne tečnosti, a radi identifikacije tumorskih ćelija koje eksprimiraju AXL. Anti-AXL antitela prema ovom pronalasku mogu biti upotrebljena za identifikaciju solubilnog AXL, npr. u testu zasnovanom na ELISA postupku. Anti-AXL antitela predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljena kao prateća dijagnostika, na primer, u vidu radiokonjugata koji mogu biti upotrebljeni za studije snimanja kod pacijenata. U takvim dijagnostičkim kompletima, kao i u kompletima za terapijske upotrebe koji su ovde opisani na drugom mestu, antitelo anti-AXL obično može biti obezbeđeno u spremniku u liofilizovanom obliku, bilo samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim antitelima specifičnim za cilјnu ćeliju ili peptid. Uobičajeno je da farmaceutski prihvatlјiv nosač (npr. inertni razblaživač) i/ili njegove komponente, kao što su Tris, fosfatni ili karbonatni pufer, stabilizatori, konzervansi, biocidi, inertni proteini, npr. serumski albumin ili slično, takođe budu uklјučeni (obično u zasebnom spremniku za mešanje), kao i dodatni reagensi (takođe su obično u zasebnom(im) spremniku/spremnicima). U određene complete se takođe uključuje sekundarno antitelo sposobno da se vezuje za At specifično za AXL, koje je obično prisutno u posebnom kontejneru. Drugo antitelo je obično konjugovano sa obeleživačem i formulisano na način sličan anti-AXL antitelu predmetnog pronalaska. Upotrebom postupaka koji su opisani prethodno, kao i ovde na drugom mestu, anti-AXL antitela mogu biti upotrebljena za definisanje podskupova kancerskih/tumorskih ćelija i za karakterizaciju takvih ćelija i srodnih tumorskih tkiva.
Anti-idiotipska antitela
[0301] Prema dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na anti-idiotipsko antitelo koje se vezuje za anti-AXL antitelo pronalaska, kao što je ovde opisano.
[0302] Anti-idiotipsko (Id) antitelo je antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante koje su uglavnom povezane sa mestom vezivanja antigena u antitelu. Anti-Id antitelo može biti pripremljeno imunizacijom životinje iste vrste i genetičkog tipa, kao izvora anti-AXL monoklonskog antitela, sa monoklonskim antitelom na koje se priprema anti-Id. Imunizovana životinja obično može prepoznati i odgovoriti na idiotipske odrednice imunizujućeg antitela, proizvodnjom antitela na ove idiotipske determinante (anti-Id antitela. Takva antitela su opisana, na primer, u US 4,699,880. Ova antitela su dodatni predmet ovog pronalaska.
[0303] Anti-Id antitelo može takođe biti upotrebljeno kao "imunogen" za indukciju imunog odgovora u još drugoj životinji, proizvodeći takozvano anti-anti-Id antitelo. Anti-anti-Id antitelo može biti epitopski identično originalnom monoklonskom antitelu koje je indukovalo anti-Id antitelo. Tako je, upotrebom antitela na idiotipske determinante monoklonskog antitela, moguće identifikovati druge klonove koji eksprimiraju antitela identične specifičnosti. Anti-Id antitela mogu varirati (tako nastaju varijante anti-Id antitela) i/ili biti derivatizovana bilo kojim pogodnim tehnikama, poput onih koje su opisane ovde na drugom mestu u kontekstu AXL-specifičnih antitela predmetnog pronalaska. Na primer, monoklonsko anti-Id antitelo može biti kuplovano sa nosačem kao što je hemocijanin iz školjke Diodora cayenensis (KLH) i upotrebljeno za imunizaciju BALB/c miševa. Serumi ovih miševa obično sadrže anti-anti-Id antitela koja imaju osobine vezivanja slične, ukoliko ne identične, originalnom/matičnom anti- AXL antitelu.
Sekvence
[0304]
Tabela 1
[0305] Predmetni pronalazak je dalјe ilustrovan primerima koji slede i koje ne treba razmatrati kao dodatno ograničavajućim.
Primeri
Primer 1 - Imunizacija i stvaranje AXL antitela
Ekspresioni konstrukti za AXL
[0306] Generisani su sledeći konstrukti optimizovanih kodona za ekspresiju različitih AXL varijanti pune dužine: humani (Homo sapiens) AXL (Genbank pristupni br. NP_068713.2), himerni AXL između humanog i AXL-a makaki majmuna u kome je humani vanćelijski domen (ECD) zamenjen sa ECD makaki majmuna (Macaca fascicularis) (translacijom sekvence sa Genbank pristupnim br. HB387229.1; ak 1-447), himerni AXL između humanog i mišjeg AXL-a u kome je humani ECD zamenjen sa ECD miša (Mus musculus) (Genbank pristupni NP_033491.2; ak 1-441), himerni AXL između humanog i mišjeg AXL-a u kome je humani domen I sličan Ig (ak 1-134, takođe nazvan "domen Ig1") zamenjen domenom I sličnim Ig mišjeg AXL-a, himerni AXL između humanog i mišjeg AXL-a u kome je humani domen II sličan Ig domenu (ak 148-194, ovde takođe nazvan „domen Ig2“) zamenjen domenom II sličnim Ig domenu mišjeg AXL-a, himerni AXL između humanog i mišjeg AXL-a u kome je humani domen I sličan FNIII (ak 227-329, ovde takođe nazvan "domen FN1") zamenjen mišjim AXL domenom I sličnim FNIII, himerni AXL između humanog i mišjeg AXL-a u kome je humani domen II sličan FNIII (ak 340-444, ovde nazvan i „domen FN2“) zamenjen domenom II sličnim FNIII mišjeg AXL-a. Dodatno, generisani su sledeći konstrukti optimizovanih kodona za razne AXL ECD varijante: vanćelijski domen (ECD) humanog AXL-a (ak 1-447) sa C-terminalom His oznakom (AXLECDHis), domen II sličan FNIII humanog AXL-a (ak 327-447) sa N-terminalnim signalnim peptidom i C-terminalom His oznakom (AXL-FN2ECDHis), ako i domeni sličnim Ig1 I Ig2 humanog AXL-a (ak 1-227) sa C- terminalom His oznakom (AXL-Ig12ECDHis).
[0307] Konstrukti su sadržavali pogodna restrikciona mesta za kloniranje i optimalnu Kozak sekvencu (GCCGCCACC) [141]. Konstrukti su klonirani u sisarski ekspresioni vektor pcDNA3.3 (Invitrogen).
Ekspresija AXL u EL4 ćelijama
[0308] EL4 ćelije su bile stabilno transfektovane pcDNA3.3 vektorom koji je sadržavao kodirajuću sekvencu humanog AXL-a pune dužine, a nakon selekcije sa antibiotskim agensom, G418, su izabrani stabilni klonovi (Geneticin).
Prečišćavanje His-obeleženog AXL-a
[0309] AXLECDHis, AXL-FN2ECDHis i AXL-Ig12ECDHis su eksprimirani u HEK-293F ćelijama. Hisobeležavanje omogućava prečišćavanje afinitetnom hromatografijom sa imobilizovanim metalnim jonima. U ovom procesu, helator koji je pričvršćen na hromatografsku smolu je zasićen sa Co<2+>katjonima. Supernatanti koji su sadržali His-obeležene proteine su serijski inkubirani sa smolom (tj. u vidu rastvora). His-obeleženi protein se snažno vezuje za zrna smole, dok se drugi proteini prisutni u supernatantu iz kulture ne vezuju ili vezuju slabo u poređenju sa His-obeleženim proteinima. Nakon inkubacije, zrna su preuzete iz supernatanta i napakovana na kolonu. Kolona je isprana kako bi se uklonili slabo vezani proteini. Čvrsto vezani His-obeleženi proteini su zatim eluirani puferom koji je sadržavao imidazol, koji kompetira sa His u vezivanju za Co<2+>. Eluent se uklanja iz proteina izmenom pufera na koloni za desalinaciju.
Imunizacija
[0310] Antitela IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-183, IgG1-AXL-613 i IgG1-AXL-726 su dobijena iz sledećih imunizacija: HCo12-BalbC (IgG1-AXL-107), HCo17 -BalbC (IgG1-AXL-183, IgG1-AXL-726) i HCo20 (IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-613) transgeni miševi (Medarex, San Jose, CA, USA) su imunizovani naizmenično, najpre intraperitonealnim (IP) injeciranjem 20 µg AXLECDHis proteina (IgG1-AXL-511, IgG1-AXL-613, IgG1-AXL-183), 20 µg AXL-FN2ECDHIS plus 20 µg AXL-Ig12ECDHis (IgG1-AXL-726) ili 20 µg AXL-Ig12ECDHis (IgG1-AXL-107), a potom i subkutano (SC; u bazu repa) sa istim proteinima, u intervalu od 14 dana. Urađeno je ukupno 8 imunizacija: 4 IP i 4 SC imunizacije. Prilikom većine imunizacija, prva imunizacija je izvedena u kompletnom Frojndovom adjuvansu (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), dok su sve naredne imunizacije bile u nekompletnom Frojndovom adjuvansu (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Antitelo IgG1-AXL-183 je dobijeno iz imunizacije koja je rađena u adjuvantnom sistemu firme Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD).
[0311] Antitela IgG1-AXL-137, IgG1-AXL-148, IgG1-AXL-154, IgG1-AXL-171 i IgG1-AXL-733 su dobijena iz sledećih imunizacija: HCo12-BalbC (IgG1-AXL-137, IgG1- AXL-148), HCo17-BalbC (IgG1-AXL-154, IgG1-AXL-733) i HCo20-BalbC (IgG1-AXL-171) transgeni miševi (Medarex, San Jose, CA, USA) su imunizovani sa 20 µg AXLECDHis proteina u CFA. Nakon toga, miševi su imunizovani naizmenično intraperitonealnim (IP) injeciranjem EL4 ćelija koje su bile transfektovane sa humanim AXL-om pune dužine u PBS-u, kao i supkutano (SC; u bazu repa) sa AXLECDHis proteinom u IFA, u intervalu od 14 dana.
[0312] Miševima sa najmanje dva uzastopna titra antitela specifičnog za AXL od 200 (razblaženje seruma 1/200) ili više, koji su detektovani antigen specifičnim skriningom upotrebom FMAT testa, kao što je opisano u dalјem tekstu, primenjena je bust doza 3-4 dana pre fuzije (10 µg proteina izvedenog iz AXL-a je injecirano intravenski, u PBS-u).
Test skrininga specifičan za homegene antigene
[0313] Prisustvo anti-AXL antitela u serumima imunizovanih miševa ili HuMab (humano monoklonsko antitelo) u supernatantu kulture hibridoma ili transfektoma, određivano je skrining testom specifičnim az ahomogene antigene upotrebom tehnologije fluorometrijskog testa u mikronskim zapreminama (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Za navedeno su korišćena dva različito dizajnirana testa sa kombinacijama testova koji su se zasnivali bilo na 4 ili 8 ćelija.
[0314] Dizajn testa zasnovanog na 4 ćelije je upotrebljen za analizu seruma imunizovanih miševa i kao primarni skrining test za supernatant kulture hibridoma ili transfektoma. U ovom dizajnu testa zasnovanog na 4 merenja, analizirano je vezivanje humanih antitela u uzorcima za A431 (DSMZ) i MDA-MB-231 ćelije (obe eksprimiraju AXL na ćelijskoj površini), kao i za vezivanje za TH1021-AXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL pune dužine; proizvedene kao što je prethodno opisano) i HEK293 ćelije divlјeg tipa (negativna kontrola koja ne eksprimira AXL), tim redom.
[0315] Uzorci supernatanta kulture hibridoma ili transfektoma su dodatno podvrgnuti dizajniranom testu zasnovanom na 8 ćelija. U dizajniranom testu zasnovanom na 8 merenja, analizirano je vezivanje humanih antitela uzoraka za TH1021-hAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL), TH1021-cAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale himerni humani i AXL makaki majmuna u kome je humani ECD AXL-a zamenjen ECD makaki majmuna), TH1021-mAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale himerni AXL između čoveka i miša u kome je humani ECD zamenjen ECD-om iz AXL-a miša), TH1021-mlg1 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL u kome je domen I sličan Ig domenu zamenjen sa domenom I sličnim Ig iz mišjeg AXL-a), TH1021-mlg2 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL sa domenom II sličnim Ig domenu koji je zamenjen domenom II koji je sličnam Ig mišjeg AXL-a), TH1021-mFN1 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL u kome je domen I sličan FNIII zamenjen sa mišjim AXL domenom I sličnim FNIII), TH1021-mFN2 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL u kome je domen II koji je sličan FNIII zamenjen mišjim AXL domenom II koji je sličan FNIII) i HEK293 ćelije divlјeg tipa (negativna kontrola koja ne eksprimira AXL).
[0316] Uzorci su dodati ćelijama da bi se omogućilo vezivanje za AXL. Potom je vezivanje HuMab detektovano upotrebom fluorescentnog konjugata (kozju anti-Humani IgG Fc gama-DyLight649; Jackson ImmunoResearch). Humanizovano mišje antitelo A0704P specifično za AXL (sintetisano u HEK-293F ćelijama) upotrebljeno je kao pozitivna kontrola, dok su kao negativne kontrole korišćeni objedinjeni HuMab-mišji serum i ChromPure humani IgG kao ceo molekul (Jackson ImmunoResearch), tim redom. Uzorci su skenirani upotrebom sistema za detekciju ćelija Applied Biosistems 8200 (8200 CDS) i očitana je srednja vrednost fluorescencija. Uzorci su smatrani pozitivnim kada su očitavanja bila veća od 50, i kada su “očitavanje x fluorescenca” bili najmanje tri puta veći od negativne kontrole.
Generisanje HuMab hibridoma
[0317] HuMab miš u kome se razvio dovoljan titar specifičnog antigena (opisano prethodno) je žrtvovan, pa su prikupljeni slezina i limfni čvorovi koji okružuju trbušnu aortu i šuplju venu. Fuzija splenocita i ćelija limfnih čvorova u ćelijsku liniju mišjeg mijeloma (SP2.0 ćelije) je urađena elektrofuzijom, upotrebom sistema za elektrofuziju CytoPulse CEEF 50 (Cellectis, Paris, Francuska), u osnovi prema uputstvima proizvođača. Potom su primarni bunarići subklonirani upotrebom ClonePix sistema (Genetix, Hampshire, UK). U tu svrhu, specifični hibridomi iz primarnih bunarića su zasejani u polutvrdi medijum napravlјen od 40% CloneMedia (Genetix, Hampshire, UK) i 60% HyQ 2x kompletnog medijuma (Hyclone, Waltham, USA). Subklonovi su ponovo testirani upotrebom testa za vezivanje specifičnog antigena, kao što je prethodno opisano, pa su skenirani upotrebom sistema IsoCyte (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA). Nivoi IgG-a su izmereni upotrebom Octet-a (Fortebio, Menlo Park, USA) da bi se selektovao klon iz primarnog bunarića koji je sa najboljom produkcijom za dalje umnožavanja. Dalje umnožavanje i kultivacija dobijenih HuMab hibridoma su urađeni upotrebom standardnih protokola (npr. kao što je opisano u Coligan J.E., Bierer B.E., Margulies D.H., Shevach E.M. i Strober, W., izd. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006). Klonovi dobijeni ovim procesom su označeni kao PC1021.
Masena spektrometrija prečišćenih antitela
[0318] Mali alikvoti antitela od 0,8 mL koji su sadržavali supernatante hibridoma iz faze sa 6-bunarića ili Hyperflask-a su prečišćeni upotrebom PhyTip kolona koje su sadržavale smolu proteina G (PhyNexus Inc., San Jose, USA) upotrebom sistema Sciclone ALH 3000 (Caliper Lifesciences, Hopkinton, USA). PhyTip kolone su korišćene u skladu sa uputstvima proizvođača, ali puferi su zamenjeni sa: PBS puferom za vezivanje (B. Braun, Medical BV, Oss, Netherlands) i elucionim puferom sa 0,1M glicin-HCI pH 2,7 (Fluka Riedel-de Haën, Buchs, Germany). Nakon prečišćavanja, uzorci su neutralizovani sa 2M Tris-HCI pH 9,0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Netherlands). Alternativno, u pojedinim slučajevima su na kolonama prečišćavani veći volumeni supernatanta iz kulture, upotrebom Protein A afinitetne hromatografije na koloni.
[0319] Nakon prečišćavanja, uzorci su prebačeni u ploču sa 384 mesta (Waters, ploča sa kvadratnim bunarićima od 100 µl, part# 186002631). Uzorci su deglikozilovani preko noći na 37°C sa N-glikozidazom F. Zatim je dodat DTT (15 mg/ml) (1 µl/bunariću), pa su uzorci inkubirani tokom 1 h na 37°C. Uzorci (5 ili 6 µl) su dalje desalinizirani na Acquity UPLC™ (Waters, Milford, USA) upotrebom BEH300 C18 kolone (1,7 µm, 2,1 x 50 mm), na 60°C. Kao eluenti A i B su upotrebljeni MQ voda i acetonitril, LC-MS stepena čistoće (Biosolve, kat.br. 01204101, Valkenswaard, The Netherlands) sa 0,1% mravlјe kiseline (Fluka, kat.br.56302, Buchs, Germany), tim redom. Maseni spektri elektrosprej jonizacije tipa vreme leta (engl. time-of-flight) su kompjuterski snimani, upotrebom micrOTOF™ masenog spektrometra (Bruker, Bremen, Nemačka) u režimu rada sa pozitivnim jonima. Pre analize, skala od 900-3000 m/z je kalibrisana mešavinom za podešavanje ES (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Maseni spektri su razvrstani upotrebom kompjuterskog programa DataAnalysis™ v.3.4 (Bruker) i algoritma maksimalne entropije za pretraživanje molekulskih težina između 5 i 80 kDa.
[0320] Nakon razvrstavanja, dobijene mase teških i lakih lanaca (pod redukujućim uslovima) za sve uzorke su upoređene da bi se pronašla identična antitela. U poređenju teških lanaca uzeto je u obzir moguće prisustvo C-terminalnih varijanati lizina. Rezultat navedenog je spisak jedinstvenih antitela, gde je jedinstvenost definisana kao jedinstvena kombinacija teških i lakih lanaca. U slučaju da su pronađena identična antitela, korišćeni su rezultati drugih testova da bi se utvrdilo koje je antitelo najbolјi materijal za nastavak eksperimenata.
Analiza sekvence varijabilnih domena AXL antitela i kloniranje u ekspresione vektore
[0321] Ukupna RNK je pripremlјena iz 0,2 do 5x10<6>hibridoma ćelija, dok je 5'-RACE-komplementarna DNK (cDNK) pripremlјena iz 100 ng ukupne RNK, upotrebom SMART RACE kompleta za amplifikaciju cDNK (Clontech), prema uputstvima proizvođača. VH i VL kodirajući regioni su amplifikovani PCR-om i klonirani direktno, u otvoreni okvir čitanja ekspresionog vektora pGlf i pKappa, ligacijom nezavisnom od kloniranja (Aslanidis, C. i P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990; 18(20): 6069-74). Za svako antitelo je sekvencirano 12 VL klonova i 12 VH klonova. Dobijene sekvence su prikazane u Tabeli 1. CDR sekvence su definisane u skladu sa IMGT [22] i [23]. Klonovi sa ispravnim otvorenim okvirom čitanja (ORF) su odabrani za dalјe istraživanje i ekspresiju. Vektori svih kombinacija teških i lakih lanaca koji su nađeni, tranzijentno su koeksprimirani u ćelijama FreestyleTM 293-F upotrebom 293fectin-a.
[0322] Za antitela IgG1-AXL-154, IgG1-AXL-183 i IgG1-AXL-726, generisane su sledeće varijante sa tačkastim mutacijama u varijabilnim domenima: IgG1-AXL-154-M103L, IgG1-AXL-183-N52Q i IgG1 AXL-726-M101L. Mutanti su generisani mutagenezom usmerenom na mesto, upotrebom Quickchange II kompleta za mutagenezu (Stratagene).
AXL kontrolna antitela
[0323] U pojedinim od Primera, upotrebljeno je anti-AXL antitelo za poređenje (IgG1- YW327.6S2) koje je prethodno opisano [142] i [143]. VH i VL sekvence za ova antitela specifična za AXL su klonirane u ekspresione vektore pGlf i pKappa.
Antitelo b12
[0324] U pojedinim od primera, kao negativna kontrola je upotrebljeno antitelo b12, antitelo specifično za gpl20 [144].
Ekspresija
[0325] Antitela su eksprimirana kao IgG1,κ. Smeše plazmidnih DNK koje kodiraju i teške i lake lance antitela tranzijentno su transfektovane u Freestyle HEK293F ćelije (Invitrogen, US), upotrebom 293fectin reagensa (Invitrogen, US), u osnovi prema uputstvima proizvođača.
Prečišćavanje antitela
[0326] Supernatant kulture je profiltriran kroz 0,2 µm “dead-end” filtere, pa je nanet na MabSelect SuRe kolone od 5 mL (GE Health Care) koje su eluirane sa 0,1 M NaOH-natrijum citratom, pH 3. Eluat je odmah neutralizovan sa 2M Tris-HCl, pH 9, pa podvrgnut dijalizi preko noći sa 12,6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun). Alternativno, nakon prečišćavanja, eluat je nanošen na HiPrep kolonu za desalinizaciju i antitelo je prebačeno u pufer sa 12,6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun). Nakon dijalize ili izmene pufera, uzorci su sterilno profiltrirani kroz 0,2 µm “dead-end” filtere. Čistoća je određena SDS-PAGE postupkom, a koncentracija IgG je merena upotrebom Octet-a (Fortebio, Menlo Park, USA). Prečišćena antitela su čuvana na 4°C.
[0327] Antitelo IgG1-AXL-511 je generisano sledećim postupkom:
Ekspresioni konstrukti za AXL
[0328] Generisani su sledeći ekspresioni konstrukti optimizovanih kodona različitih AXL varijanti pune dužine: humani (Homo sapiens) AXL (Genbank pristupni br. NP_068713.2), himerni AXL između čoveka i makaki majmuna u kome je humani vanćelijski domen (ECD) zamenjen ECD domenom makaki majmuna (Macaca fascicularis) (translacija sekvence sa Genbank pristupnim br. HB387229.1; ak 1-447), himerni AXL između čoveka i miša u kome je humani ECD zamenjen ECD-om iz AXL miša (Mus musculus) (Genbank pristupni br. NP_033491.2; ak 1-441), himerni AXL između čoveka i miša u kome je humani domen I sličan Ig (ak 1-147, ovde takođe nazvan "Ig1 domen") zamenjen domenom I sličnim Ig mišjeg AXL-a, himerni AXL između čoveka i miša u kome je humani domen II sličan Ig (ak 148-227, ovde takođe nazvan "Ig2 domen") zamenjen domenom II sličnim Ig mišjeg AXL-a, himerni AXL između čoveka i miša u kome je humani domen I sličan FNIII (ak 228-326, ovde takođe nazvan "domen FN1") zamenjen domenom I sličnim FNIII mišjeg AXL, himerni AXL između čoveka i miša u kome je humani FNIII sličan domen II (ak 327-447, ovde takođe nazvan "domen FN2") zamenjen FNIII sličnim domenom mišjeg AXL. Pored toga, generisani su sledeći konstrukti optimizovanih kodona za različite varijante AXL ECD: vanćelijski domen (ECD) humanog AXL (ak 1-447) sa C-terminalom His-oznakom (AXLECDHis), domen II sličan FNIII humanog AXL (ak 327-447) sa N-terminalnim signalnim peptidom i C-terminalnom His-oznakom (AXL-FN2ECDHis) i domeni slični Ig1- i Ig2-domenima humanog AXL-a (ak 1-227) sa C-terminalnom His-oznakom (AXL-Ig12ECDHis).
[0329] Konstrukti su sadržali pogodna restrikciona mesta za kloniranje i optimalnu Kozak sekvencu (GCCGCCACC) (Kozak et al. (1999) Gene 234: 187-208). Konstrukti su klonirani u sisarski ekspresioni vektor pcDNA3.3 (Invitrogen).
Ekspresija AXL u EL4 ćelijama
[0330] EL4 ćelije su bile stabilno transfektovane pcDNA3.3 vektorom koji je sadržavao kodirajuću sekvencu humanog AXL-a pune dužine, a nakon selekcije sa antibiotskim agensom, G418, izabrani su stabilni klonovi (Geneticin).
Prečišćavanje His-obeleženog AXL-a
[0331] AXLECDHis, AXL-FN2ECDHis i AXL-Ig12ECDH su eksprimirani u HEK293F ćelijama, pa su prečišćeni imobilizovanom metal-afinitetnom hromatografijom.
Imunizacija
[0332] Za odabir antitela korišćen je materijal iz 4 transgena miša koji eksprimiraju genske sekvence humanog antitela. Miševi su imunizovani upotrebom raznih protokola imunizacije, pa su odabrani oni koji su proizvodili razne brojeve antitela u okviru tradicionalnih hibridoma postupaka. Miš A (uspešnost hibridoma postupka od 3,5%) je bio HCo17-BALB/c transgeni miš (Bristol-Myers Squibb, Redwood Cyti, CA, USA) koji je naizmenično imunizovan intraperitonealno (IP) sa 20 µg AXL-FN2ECDHIS i sa 20 µg AXL-Ig12ECDH, pa supkutano (SC) (u osnovu repa) istim proteinima, u intervalu od 14 dana. Ukupno je izvršeno 8 imunizacija: 4 IP i 4 SC. Prilikom većine imunizacija, prva imunizacija je rađena sa kompletnim Frojndovim adjuvansom (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), dok su sve naredne imunizacije rađene u nekompletnom Freundsovom adjuvansu (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Miš B (uspešnost hibridoma postupka od 0%) je bio HCo12 transgeni miš (Medarex) imunizovan sa 20 µg AXLECDHis proteina, upotrebom sličnog protokola imunizacije kao i kod miša A. Miš C (uspešnost hibridoma postupka od 38%) je bio HCo12-BALB/c miš imunizovan naizmenično, najpre intraperitonealno (IP) sa EL4 ćelijama koje su bile transfektovane sa humanim AXL-om pune dužine u PBS-u, a potom i supkutano (SC; u osnovu repa) sa AXLECDHis proteinom u IFA, u intervalu od 14 dana. Miš D (uspešnost hibridoma postupka od 0%) je bio HCo12 transgeni miš (Medarex) imunizovan sa 20 µg AXL-Ig12ECDHis proteina upotrebom sličnog protokola imunizacije kao i kod miša A.
[0333] Miševima sa najmanje dva uzastopna titra antitela specifičnog za AXL od 200 (razblaženje seruma 1/200) ili više, primenjena je bust doza 3-4 dana pre fuzije (10 µg proteina izvedenog iz AXL-a je injecirano intravenski, u PBS-u).
Izolacija RNK iz ćelija slezine
[0334] Ukupna RNK je izolovana iz ćelija slezine upotrebom Mini RNK easy kompleta (Qiagen). Prvi lanac cDNK za 5'-RACE je sintetisan upotrebom 150 ng RNK i SMART RACE kompleta za amplifikaciju cDNK (Clontech, Mountain View, CA, USA), PrimeScript kompleta za reverznu transkripciju (Clontech) i SMART IIA oligo i oligodT kao prajmera. VL kodirujući regioni su amplifikovani PCR postupkom, upotrebom polimeraze Advantage 2 (Clontech), RACEkLIC4ortFW2 (320 nM), RACEkLIC4LongFW2 (80 nM) i RACEkLICRV_PmIA3 prajmera (400 nM), tokom 35 ciklusa od 30 sekundi na 95°C i 1 minut na 68°C. VH kodirujući regioni su amplifikovani PCR postupkom, upotrebom Pfu Ultra II Fusion HS DNK polimeraze (Stratagene), prajmera RACEG1LIC3shortFW (320 nM), RACEG1LIC3longFW (80 nM) i RACEG1LIC3RV2 (400 nM), tokom 40 ciklusa od 20 sekundi na 95°C, 20 sekundi na 66°C i 30 sekundi na 72°C, sa završnim korakom ekstenzije od 3 minuta na 72°C. VH ili VL kodirajući PCR proizvodi su razdvojeni upotrebom agarozne gel elektroforeze, a DNK proizvodi očekivane veličine su izolovani iz gela i prečišćeni upotrebom Qiagen MiniElute kompleta. VH i VL kodirajući regioni koji su amplifikovani PCR-om su klonirani, sa otvorenim okvirom čitanja, u pGlf sisarske ekspresione vektore (koji su sadržavali DNK sekvencu koja kodira konstantni region humanog IgG1 ) za region VH, i pKappa (koji je sadržavao DNK sekvencu koja kodira konstantni region kapa lakog lanca) za region VL, kloniranjem nezavisnim od ligacije (Aslanidis, C. and P. J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990; 18 (20): 6069-74) u soju E.coli DH5αT1R (Life technologies), čime su dobijene pojedinačne bakterijske kolonije od kojih je svaka sadržavala po jedan HC ili LC ekspresioni vektor.
Sekvence prajmera
LEE PCR
[0335] Elementi linearne ekspresije (LEE) dobijeni su amplifikacijom fragmenta koji su sadržavali CMV promotor, HC ili LC kodirajuće regione i poli A signal koji je sadržavao elemente iz ekspresionih plazmida. Regioni su amplifikovani upotrebom Accuprime Taq DNK polimeraze (Life Technologies) i CMVPf(Bsal)2 i TkpA (Bsal)r prajmera, tokom 35 ciklusa od 45 sekundi na 94°C, 30 sekundi na 55°C i 2 (LC) ili 3 (HC) minuta na 68°C, upotrebom materijala iz kolonija E.coli (soj DH5α) koje su sadržavale plazmide, kao DNK matrice.
Tranzijentna ekspresija u HEK-293ćelijama
[0336] Antitela su eksprimirana kao IgG1,κ. Smeše plazmidne DNK koje su kodirale oba, i teške i lake lance antitela, tranzijentno su transfektovane u Freestyle 293-F ćelije (HEK293F) (Life Technologies, USA) upotrebom 293fectin reagensa (Life Technologies), u osnovi kao što je opisano u Vink T. i saradnici (2014) ('A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies', Methods, 65(1), 5-10).
[0337] Za LEE ekspresiju Abs je pomešano: 1 µl HC LEE PCR reakcione smeše, 1 µl LC PCR reakcione smeše i 1 µl smeše za pojačavanje od 30 ng/µl koja je sadržavala mešavinu 3 plazmida za pojačavanje ekspresije, kao što je opisano u Vink, T. i saradnici (2014), nakon čega je smeša transfektovana u HEK293F ćelije u ukupnoj zapremini od 100 µl upotrebom 293 fektina kao reagensa za transfekciju, prema uputstvima proizvođača (Life Technologies), koristeći ploče sa 96 mesta kao posudu, u osnovi kao što je prethodno opisano.
AXLECDHis ELISA
[0338] ELISA ploče (Greiner, Netherlands) su obložene sa 0,5 µg/mL AXLECDHis u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS), u zapremini od 100 µl/bunaru, nakon čega su inkubirane 16 sati na sobnoj temperaturi (RT). Rastvor AXLECDHis/PBS za oblaganje je potom uklonjen i bunari su blokirani dodavanjem po 150 µl PBSTC (PBS koji je sadržao 0,1% tween-20 i 2% serum pileta), pa inkubirani tokom 1 sata na RT. Ploče su dalje isprane tri puta sa po 300 µl PBST (PBS koji je sadržao 0,1% tween-20)/bunaru i dalje je naneto po 100 µl ispitivanog rastvora, koji je inkubiran tokom 1 sata na RT. Ploče su ponovo isprane tri puta sa po 300 µl PBST/bunaru, nakon čega je naneto po 100 µl kozjeg antihumanog IgG antitela kuplovanog sa peroksidazom rena (razblaženje 1/3000), pa su ploče inkubirane tokom 1 sata na RT. Nakon tri ispiranja sa po 300 µl PBST/bunaru, dalje je naneto po 100 µl ABTS rastvora (1 mg/mL) i ploče su inkubirane na RT sve dok nije uočen signal dovoljnog intenziteta, nakon čega je reakcija zaustavlјena dodavanjem 100 µl 2% rastvora oksalne kiseline. Ploče sa 96-mesta su očitane upotrebom ELISA čitača na 405 nm.
Studija raznovrsnosti
[0339] Uzorci su analizirani prema sposobnosti vezivanje antitela za TH1021-hAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL), TH1021-cAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale himerni AXL čoveka i makaki majmuna u kome je humani ECD zamenjen ECD-om makaki majmuna), TH1021-mAXL (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale himerni AXL između čoveka i miša u kome je humani ECD zamenjen mišjim ECD-om), TH1021-mIg1 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL sa domenom I sličnim Ig koji je zamenjen sa domenom I sličnim Ig mišjeg AXL-a), TH1021-mIg2 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL sa domenom II sličnim Ig koji je zamenjen sa domenom II sličnim Ig mišjeg AXL-a), TH1021-mFN1 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL sa domenom I sličnim FNIII koji je zamenjen sa domenom I sličnim FNIII mišjeg AX-a), TH1021-mFN2 (iz HEK293F ćelija koje su tranzijentno eksprimirale humani AXL sa domenom II sličnim FNIII koji je zamenjen sa domenom II sličnim FNIII mišjeg AX-a) i HEK293F ćelije (negativna kontrola koja ne eksprimira AXL), tim redom.
[0340] Uzorci iz LEE ekspresije su dodati ćelijama kako bi se omogućilo vezivanje za različite AXL konstrukte. Nakon toga, identifikovano je vezivanje antitela upotrebom fluorescentnog konjugata (kozji anti-humani IgG Fc gama-DyLight649; Jackson ImmunoResearch). Uzorci su skenirani upotrebom sistema za detekciju ćelija Applied Biosistems 8200 (8200 CDS), a očitana je srednja vrednost intenziteta fluorescencije. Uzorci su smatrani pozitivnim kada su očitavanja bila veća od 50, i kada su “očitavanje x fluorescenca” bili najmanje tri puta veći od negativne kontrole.
Obezbeđivanje HC i LC smeša:
[0341] Kod svakog miša je odabrano po 352 bakterijske kolonije koje su sadržavale HC ekspresioni vektor, kao i po 384 bakterijske kolonije koje su sadržavale LC ekspresioni vektor. Kolonije su izolovane i amlifikovane LEE PCR postupkom. Deo LEE reakcije je sekvenciran (AGOWA). Procenat pravilnih konstrukata koji su sadržavali VH insert se u velikoj meri razlikovao između 4 miša, miša A (50%), miša B (23%), miša C (90%) i miša D (14%), i odgovarao je uspešnosti dobijenoj u postupku hibridoma, pogledati iznad. Raznovrsnost HC kod miševa je bila ograničena na samo malu količinu pravilih inserata, uz dominaciju velike grupe identičnih HC, 65/83 kod miša B i 46/49 kod miša D. Za miša B i D su izabrani jedinstveni HC (9 za miša B, 4 za miša D). Za miša A i C nije napravljen odabir.
Kotransfekcija HC sa smešom LC
[0342] Pojedinačni HC koji kodira LEE je kontransfektovan sa smešom od 96 LC koji kodiraju LEE, upotrebom protokola za LEE transfekciju.
Selekcija HC iz antitela koja vezuju AXL
[0343] Za miševe B i D, u supernatantima iz LEE kotransfekcija za pojedinačni HC sa smešom LC sekvenci, analizirano je vezivanje proizvedenih antitela za AXL upotrebom AXL ELISA postupka. Pokazano je vezivanje za AXL za 7 od 9 HC iz miša B i za 4 od 4 HC iz miša D.
[0344] Za miševe A i C, u supernatantima iz LEE kotransfekcija za pojedinačni HC sa smešom LC sekvenci, analizirano je vezivanje proizvedenih smeša antitela za AXL upotrebom studije skrininga raznovrsnosti. Ovakav skrining je omogućio i identifikaciju HC koji vezuju AXL, kao i grubo mapiranje epitopa, identifikacijom gubitka sposobnosti vezivanja antitela za AXL varijante. Kod miša A, približno 40% HC je bilo vezano za humani AXL, od kojih je većina izgubila sposobnost vezivanja bilo za Ig1 ili FNIII-2 domen kada su ovi domeni zamenjeni mišjim ekvivalentom. Kod miša C, približno 70% HC je bilo vezano za humani AXL, od kojih je većina izgubila sposobnost vezivanja bilo za Ig1 ili Ig2 domen kada su ovi domeni zamenjeni mišjim ekvivalentom. Na osnovu vezivanja utvrđenog sa AXL ELISA postupkom ili skriningom diverziteta, kao i na osnovu informacija o HC sekvenci i gubitku vezivanja za specifičen domene u skriningu diverziteta, izabrano je ukupno 12 jedinstvenih HC za određivanje najbolјeg LC.
Kotransfekcija HC sa pojedinačnim LC
[0345] Svaki pojedinačni HC LEE, od 12 odabranih jedinstvenih HC, je kotransfektovan sa 96 pojedinačnih LC LEE iz LC smeše odgovarajućih miševa.
Selekcija LC iz antitela koja vezuju AXL
[0346] Upotrebom AXL ELISA postupka, analizirano je vezivanje sintetisanih antitela za AXL u supernatantima iz LEE ekspresija pojedinačnih HC/LC kombinacija. Na osnovu rezultata ELISA i informacija o LC sekvenci, za svaki HC je pronađeno najmanje 6 LC i jedan je odabran kao najbolјi. Antitela koja vezuju AXL identifikovana su kod sva 4 miša, čak i kod miševa koji nisu bili uspešni u hibridoma procesu.
Afinitet vezivanja antitela 511
[0347] Određen je afinitet jednog anti-AXL antitela (klon 511).
[0348] Afinitet je određen upotrebom Interferometrije Bio-sloja na ForteBio OctetRED384. Na Capture biosenzore sa anti-humanim Fc (AHC) (ForteBio, Portsmouth, UK; kat. br. 18-5064) je nanet hlgG (1 µg/mL) tokom 150 s, sa cilјem da se obezbedi odgovor od 1 nm. Nakon bazalnog nivoa (150 s), određivane su asocijacija (1000 s) i disocijacija (2000 s) AXLECDHis-a (kao što je opisano u primeru 1), upotrebom raspona koncentracija od 10 µg/mL - 0,16 µg/mL (218 nM - 3 nM) sa dvostrukim razblaženjima. Za proračun je upotrebljena teorijska molekulska masa AXLECDH-a zasnovana na sekvenci aminokiselina, tj.46 kDa. Eksperimenti su izvođeni na OctetRED384 uređaju, uz mućkanje pri brzini od 1000 obrtaja/min i na 30°C. Svako antitelo je testirano u tri nezavisna eksperimenta.
[0349] Podaci su analizirani upotrebom programa ForteBio Data Analysis v7.0.3.1 i modela 1:1, kao i potpuno uklapanje sa vremenima asocijacije i disocijacije od po 1000 s, osim ukoliko nije drugačije navedeno. Korišćeno je vreme disocijacije od 1000 s (umesto dobijenog vremena disocijacije od 2000 s), pošto je ono dovelo do boljeg uklapanja. Podaci su korigovani oduzimanjem referentne krive (antitela bez AXLECDHis), a Y-osa je usklađena sa poslednjih 5 s osnovnog merenja i primenom korekcije međukoraka, kao i Savitzky-Golay filtera.
[0350] Afinitet (KD) klona 511 za AXL je iznosio 23<∗>10<-9>M (kon1.7<∗>10<5>1/Ms i kdisod 3.9<∗>10<-3>1/s).
Sinteza duostatina-3.
Priprema jedinjenja 3:
[0351]
[0352] Rastvoru Boc-L-fenilalanina 1 (5,36 g; 20,2 mmol) u 30 mL metilen hlorida (DCM), dodat je karbonildiimidazol (CDI; 4,26 g; 26,3 mmol) i rastvor je mešan tokom 1 sata. Zatim su dodati rastvor 2 (3,67 g; 30,3 mmol) i 2,4-diaminobuterna kiselina (DBU, 4,5 mL, 30 mmol) u 15 mL DCM-a. Smeša je greijana na 40°C tokom 16 sati. Smeša je razblažena sa 60 mL DCM-a i 40 mL vode, pa je neutralisana do pH 7 sa koncentrovanom HCl. DCM ekstrakt je prikuplјen, ispran sa 0,2M HCl (60 mL), pa zasićenim rastvorom soli (60 mL), nakon čega je osušen upotrebom Na2S04 i uparen da bi se dobilo 7,47 g sulfonamida zaštićenog sa Boc. Ovo jedinjenje je rastvoreno u 40 mL metanola, pa je dodato 200 mL 6N HCl/izopropanola i smeša je mešana tokom 2 sata. Rastvarač je uparen pod vakuumom, a zatim je dodato 100 mL etra. Precipitat je sakuplјen filtracijom i osušen da bi se dobilo jedinjenje 3 kao HCI so (5,93 g; 96%); MS m/z 269,1 (M+H).
Priprema jedinjenja 5:
[0353]
[0354] Rastvoru jedinjenja 4 (1,09 g; 1,6 mmol) u 10 mL N N,N-dimetilformamida (DMF) su dodati 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uranijum heksafluorofosfat (HATU; 0,61 g; 1,6 mmol), diizopropiletilamin (DIEA, 0,56 mL) i jedinjenje 3 (0,49 g; 1,6 mmol), tim redosledom. Smeša je zatim mešana tokom 1 sata i razblažena sa 100 mL vode i 4 mL sirćetne kiseline. Talog je prikuplјen filtracijom, osušen pod vakuumom, pa je dodat u 10 mL 4M HCl/dioksana. Nakon 30 min, dodato je 200 mL etra i nerastvorlјiv precipitat je prikuplјen i prečišćen HPLC postupkom da bi se dobilo jedinjenje 5 u vidu tetrahidrofuranske soli (TFA, 1,3 g; 88%); MS m/z 835,5 (M+H). Jedinjenje 5 se u tekstu odnosi na duostatin-3.
Priprema jedinjenja 7:
[0355]
[0356] Rastvoru jedinjenja 5 (500 mg, 0,527 mmol) u 5 mL DMF-a su dodati jedinjenje 6 (483 mg; 0,631 mmol), N-hidroksibenzotriazol (HOBt; 40 mg; 0,296 mmol) i DIEA (0,27 mL). Smeša je mešana 16 sati, pa je dodato 0,4 mL piperidina. Nakon 1 sata, smeša je razblažena sa 100 mL etra i precipitat je prikuplјen i osušen da bi se dobilo jedinjenje 7 kao HCI so (640 mg, 95%); MS m/z 1240,7 (M+H).
Priprema jedinjenja 9:
[0357]
[0358] Rastvoru jedinjenja 8 (219 mg; 0,62 mmol) u 5 mL DMF-a su dodati HATU (236 mg; 0,62 mmol), DIEA (0,15 mL) i jedinjenje 7 (316 mg; 1,6 mmol), tim redom. Nakon jednog sata, dodato je 0,2 mL piperidina i smeša je mešana tokom 30 min, pa je prečišćena HPLC postupkom da bi se dobilo jedinjenje 9 kao TFA so (235 mg; 64%); MS m/z 1353,8 (M+H).
Priprema jedinjenja 11:
[0359]
[0360] Rastvoru jedinjenja 9 (235 mg, 0,16 mmol) u 2 mL metanola i 1 mL vode, dodati su rastvor dialdehida 10 (1,6 mL 0,3 M u iPrOH) i NaCNBH3 (180 mg; 2,85 mmol). Smeša je mešana tokom 2 sata na RT, a zatim je prečišćena HPLC postupko da bi se dobilo jedinjenja 11 u vidu TFA soli (126 mg, 50%); MS m/z 1465,8 (M+H)
Generisanje konjugata antitela specifičnog za AXL i leka (ADC).
[0361] Prečišćena AXL antitela IgG1-AXL-148, IgG1-AXL-183 i IgG1-AXL-726, kao i negativno kontrolno antitelo IgG1-b12, su konjugovana sa Duostatin-3 kompanije Concortis Biosystems, Inc. (San Diego, CA) preko kovalentnih veza koristeći K-lock AV1-valin-citrulin (vc) linkera [58], [148] i [149].
[0362] Konjugatima anti-AXL antitela i leka su dalje analizirani: koncentracija (apsorbancijom na 280 nm), odnos lek:antitelo (DAR), hromatografijom reverzne faze (RP-HPLC) i hromatografijom hidrofobne interakcije (HIC), količina nekonjugovanog leka (hromatografijom reverzne faze), procenat agregacije (hromatografijom isklјučenja po veličini, SEC-HPLC) i nivoi endotoksina (upotrebom LAL). Rezultati su bili sledeći (Tabela 2):
Tabela 2
Primer 2 - Karakteristike vezivanja AXL antitela
Afinitet vezivanja AXL antitela
[0363] Određeni su afiniteti vezivanja panela od 9 anti-AXL antitela, kao i 3 varijante ovih antitela sa pojedinačnim mutacijama aminokiselina u varijabilnim domenima (IgG1-AXL-154-M103L, IgG1-AXL-183-N52Q, IgG1-AXL-726 -M101L).
[0364] Afinitet je određen upotrebom Interferometrije Bio-sloja na ForteBio OctetRED384. Na Capture biosenzore sa anti-humanim Fc (AHC) (ForteBio, Portsmouth, UK; kat. br. 18-5064) je nanet hlgG (1 µg/mL) tokom 150 s, sa cilјem da se obezbedi odgovor od 1 nm. Nakon bazalnog nivoa (150 s), određivane su asocijacija (1000 s) i disocijacija (2000 s) AXLECDHis-a (kao što je opisano u primeru 1), upotrebom raspona koncentracija od 10 µg/mL - 0,16 µg/mL (218 nM - 3 nM) sa dvostrukim razblaženjima. Za proračun je upotrebljena teorijska molekulska masa AXLECDH-a zasnovana na sekvenci aminokiselina, tj.46 kDa. Eksperimenti su izvođeni na OctetRED384 uređaju, uz mućkanje pri brzini od 1000 obrtaja/min i na 30°C. Svako antitelo je testirano u tri nezavisna eksperimenta.
[0365] Podaci su analizirani upotrebom programa ForteBio Data Analysis v7.0.3.1 i modela 1:1, kao i potpuno uklapanje sa vremenima asocijacije i disocijacije od po 1000 s, osim ukoliko nije drugačije navedeno. Korišćeno je vreme disocijacije od 1000 s (umesto dobijenog vremena disocijacije od 2000 s), pošto je ono dovelo do boljeg uklapanja. Podaci su korigovani oduzimanjem referentne krive (antitela bez AXLECDHis), a Y-osa je usklađena sa poslednjih 5 s osnovnog merenja i primenom korekcije međukoraka, kao i Savitzky-Golay filtera.
[0366] Afiniteti (KD) anti-AXL antitela su bili opsega od 0.3<∗>10<-9>M do 63<∗>10<-9>M (Tabela 3). Za mutiran IgG1-AXL-183-N52Q, KDje bio niži nego za IgG1-AXL-183 divljeg tipa, zbog približno 2,5 puta veće stope disocijacije. Dobijena kinetika druga dva mutanta je bila slična kinetikama IgG-a divlјeg tipa.
Tabela 3
Vezivanje AXL antitela za AXL čoveka, miša i makaki majmuna
[0367] HEK293T ćelije su bile tranzijentno transfektovane sa ekspresionim konstruktima za humani AXL pune dužine, humanim AXL-om sa vanćelijskim domenom makaki majmuna (ECD) ili humanim AXL-om sa mišjim ECD (videti Primer 1). Vezivanje HuMab-AXL antitela za ove ćelije je procenjeno upotrebom protočne citometrije. Transfektovane ćelije HEK293 su inkubirane tokom 30 minuta na 4°C sa serijskim razblaženjima AXL antitela (opsega finalne koncentracije od 0,0024-10 µg/mL). Nakon tri ispiranja sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, ćelije su inkubirane sa kozjim anti-humanim IgG F(ab')2 konjugovanim R-fikoeritrinom (PE) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; kat. br. 109-116-098) koje je razblaženo u odnosu 1/100 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu (finalna zapremina 100 µL). Ćelije su zatim isprane dva puta sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane na FACS CantoII uređaju (BD Biosciences).
[0368] Krive vezivanja su analizirane postupkom nelinearne regresije (sigmoidnom dozno-zavisnom krivom sa promenjivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[0369] Slika 1A prikazuje da su HuMab-AXL antitela pokazala dozno-zavisno vezanje za HEK293 ćelije koje su eksprimirale humani AXL-ECD. Pored toga, HuMab-AXL antitela su prepoznala AXL sa ECD-om makaki majmuna, sa vrednošću EC50u istom rasponu kao i za potpuni humani AXL (Slika 1B). Nasuprot tome, vezivanje HuMabs za AXL sa mišjim ECD-om je bilo nisko (IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-154, IgG1-AXL-154-M103L, IgG1-AXL-733, IgG1-AXL-183, IgG1-AXL -183-N52Q) ili se nije moglo detektovati (IgG1-AXL-171, IgG1-AXL-613, IgG1-AXL-726, IgG1-AXL-726-M101L, IgG1-AXL-148; Slika 1C). Kao što je bilo očekivano, IgG1-b12 antitelo kao negativna kontrola, nije pokazalo vezanje za ćelije koje eksprimiraju bilo koju od varijanti AXL-a (Slika 1). Tabela 4 prikazuje vrednosti EC50 i standardne devijacije za vezivanje anti-AXL antitela za humani AXL ili za humani AXL sa ECD-om iz AXL-a makaki majmuna (određenim u najmanje 3 eksperimenta). EC50 vrednosti vezivanja humanog AXL-a sa ECD-om iz AXL miša nije bilo moguće odrediti zbog veoma niskog ili odsustva vezivanja.
Tabela 4
Kompeticija između AXL antitela i Gas6 u vezivanju za AXL
[0370] Ispitano je da li je AXL ligand Gas6 ometao vezivanje AXL antitela za AXL. Stoga su AXL-pozitivne ćelije A431 inkubirane 15 minuta na 4°C sa 10 µg/mL rekombinantnog humanog Gas6 (R&D Systems, Abingdon, UK; kat. br. 885-GS). Zatim su pripremlјena serijska razblaženja AXL antitela (finalne koncentracije opsega 0,014-10 µg/mL), dodata su ćelijama i inkubirana tokom 30 minuta na 4°C. Nakon tri ispiranja sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, ćelije su inkubirane u mraku sa 100 µL sekundarnih antitela na 4°C, tokom 30 minuta. Kao sekundarno antitelo je korišćen kozji anti-humani IgG F(ab')2 konjugovan sa R-fikoeritrinom (PE) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; kat. br. 109-116-098) koje je razblažen u odnosu 1/100 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu. Ćelije su potom isprane dva puta sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane na FACS CantoII uređaju (BD Biosciences).
[0371] Alternativno, da bi se procenilo da li se AXL ligand Gas6 i dalјe može vezivati u prisustvu AXL antitela, ćelije A431 su prethodno inkubirane sa 10 µg/mL AXL antitela (15 minuta, 4°C). Nakon ove prethodno inkubacije antitela, ćelijama su dodata serijska razblaženja rekombinantnog humanog Gas6 (R&D Systems, Abingdon, UK; kat. br. 885-GS) u finalnim koncentracijama od 0,001-20 µg/mL, i inkubirana su tokom 30 minuta na 4°C . Nakon tri ispiranja sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, ćelije su inkubirane sa mišjim anti-Gas6 IgG2a (R&D Systems; kat. br. MAB885) na 4°C tokom 30 minuta. Nakon tri ispiranja sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, ćelije su inkubirane u mraku sa kozjim anti-mišjim IgG obeleženim FITC-om (Dako, Heverlee, Belgium; kat. br. F049702) na 4°C tokom 30 minuta. Zatim su isprane dva puta sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane na FACS CantoII uređaju (BD Biosciences).
[0372] Krive vezivanja su analizirane postupkom nelinearne regresije (sigmoidnom dozno-zavisnom krivom sa promenjivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[0373] U eksperimentima (n=3) u kojima su ćelije A431 prethodno inkubirane sa Gas6, maksimalne vrednosti vezivanja anti-AXL antitela su bile uporedive sa vezivanjem antitela u odsustvu Gas6 (maksimalno vezivanje nakon preinkubacije sa Gas6 je bilo 90-108% u odnosu na vezivanja bez prethodne inkubacije sa Gas6) (Tabela 4). EC50vrednosti za vezivanje AXL antitela sa ili u odsustvu prethodne inkubacije sa Gas6 su bile istog opsega, ili donekle pojačane nakon prethodne inkubacije sa Gas6 (Tabela 5).
[0374] Vezivanje kontrolnog AXL antitela YW327.6S2 za ćelije A431 je bilo značajno smanjeno u prisustvu Gas6 u poređenju sa vezivanjem bez Gas6. Maksimalno vezivanje YW327.6S2 u prisustvu Gas6 je iznosilo 19% od vezivanja bez prisustva Gas6, a EC50 vrednost vezivanja za A431 ćelije je bila 21-put veća kada su ćelije bile prethodno inkubirane sa Gas6.
[0375] U eksperimentima u kojima su ćelije A431 bile prethodno inkubirane sa anti-AXL antitelama procenjivano je vezivanje sa Gas6 (n = 3). Vezivanje Gas6 za A431 ćelije bilo je slično onom sa ili bez prethodne inkubacije sa HuMab-AXL antitelom. Prosečne EC50 koncentracije vezivanja Gas6 kada su ćelije prethodno inkubirane sa HuMabs-om (0,34-0,83 µg/mL) i maksimalna vezanja su bila slična vezivanju za Gas6 u prisustvu kontrolnog negativnog antitela b12 (EC50 koncentracija: 0,40 µg/mL; 95-115% vezivanja Gas6 u prisustvu kontrolnog antitela b12). Vezivanje Gas6 za A431 ćelije je značajno smanjeno u prisustvu kontrolnog AXL antitela YW327.6S2 u poređenju sa vezivanjem prilikom prethodne inkubacije sa b12 (EC50 koncentracija je bila 14-puta veća). Maksimalno vezivanje Gas6 u prisustvu kontrolnog antitela YW327.6S2 je iznosilo 17% u odnosu na vezivanje u prisustvu kontrolnog negativnog antitela b12.
Tabela 5
Primer 3 – Studije mapiranja epitopa panela anti-AXL antitela
Određivanje specifičnosti AXL domena upotrebom himernih AXL molekula čoveka i miša
[0376] Specifičnost AXL domena AXL antitela je određena upotrebom panela himernih AXL mutanata čoveka i miša. Generisano je pet različitih himernih AXL molekula, u kojima su humani domen I sličan Ig (Ig1), domen II sličan Ig (Ig2), domen I sličan FNIII (FN1) ili domen II sličan FNIII (FN2), zamenjeni njihovim mišjim homolozima.
[0377] Generisani su sledeći konstrukti optimizovanih kodona za ekspresiju AXL himera između čoveka i miša, koji su potom eksprimirani u HEK293F ćelijama kao što je opisano u Primeru 1:
Homo sapiens AXL (p33-HAHs-AXL): (SEQ ID NO: 130)
Homo sapiens AXL - Mus musculus Ig1 domen (p33-AXL-mlg1): (SEQ ID NO: 132)
Homo sapiens AXL - Mus musculus Ig2 domen (p33-AXL-mlg2): (SEQ ID NO: 133)
Homo sapiens AXL - Mus musculus FN2 domen (p33-AXL-mFN2): (SEQ ID NO: 135)
[0378] Protočnom citometrijom je određeno vezivanje 1 µg/mL anti-AXL antitela za himerne AXL proteine čoveka i miša, kao što je opisano u Primeru 2. Uklјučen je IgGl-b12 kao IgG1 kontrolni izotip.
[0379] Sva anti-AXL antitela je karakterisalo vezivanje za humani AXL (Slika 2A), dok je vezivanje poništeno ili značajno redukovano kada je ECD humanog AXL-a bio zamenjen njegovim mišjim homologom (Slika 2B). Uklјučeno je unakrsno-reaktivno humano-mišje monoklonsko AXL antitelo YW327.6S2 kako bi se potvrdila ekspresija hsAXL-mmECD.
[0380] Anti-AXL antitela 107 i 613 su pokazala značajno smanjenje vezivanja za hsAXL-mmlg1 (Slika 2C), što ukazuje na prepoznavanje epitopa u Ig1 domenu AXL-a. Značajno redukovano vezivanje za hsAXL-mmlg2 su pokazali IgG1-AXL-148 i IgG1-AXL-171 (Slika 2D), što ukazuje na prepoznavanje epitopa u Ig2 domenu AXL-a. Smanjeno vezivanje za hsAXL-mmFN1 su pokazali IgG1-AXL-154, IgG1-AXL-183 i IgG1-AXL-733 (Slika 2E), što ukazuje na epitop vezivanja u FN1 domenu AXL-a. Konačno, vezivanje IgGl-AXL-726 je bilo izgublјeno kod hsAXL-mmFN2 (Slika 2F), što ukazuje na prepoznavanje epitopa unutar domena FN2.
[0381] Specifičnost AXL domena za sva anti-AXL antitela je sumarno prikazana u Tabeli 6.
Tabela 6
Mapiranje epitopa visoke rezolucije za identifikaciju aminokiselina u AXL vanćelijskom domenu uključenih u vezivanje za AXL antitela
[0382] Da bi se identifikovale aminokiseline u vanćelijskom domenu AXL-a koje su uklјučene u vezivanje anti-AXL antitela, biblioteka varijanti AXL sekvenci je generisana rekombinacijom AXL sekvenci izvedenih iz vrsta sa promenlјivim nivoom homologije sa sekvencom vanćelijskog domena humanog AXL-a. Ukratko, ekspresioni plazmid koji kodira humani AXL (Hs) je pomešan sa plazmidima za kloniranje koji kodiraju homologe AXL-a iz Mus musculus (Mm), Monodelphis domestica (Md; oposum), Anolis carolinensis (Ac; gušter) i Tetraodon nigroviridis (Tn; “pufferfish”), ili obrnuto. Kombinacija dva prajmera specifična bilo za klonirajući ili za ekspresioni vektor je korišćena u PCR postupku amplifikacije vanćelijskog domena (ECD) AXL-a, sa skraćenim vremenom elongacije, pojačanim topljenjem i ponovnim spajanje nascentnih DNK lanaca replikacije tokom izvođenja PCR ciklusa. ECD pune dužine je amplifikovan upotrebom “nested” PCR-a, specifičnog za proizvode rekombinacije koji sadrže krajeve koji potiču od oba vektora.
[0383] Dobijeni AXL ECD PCR proizvodi su klonirani u ekspresioni vektor dajući AXL pune dužine, a dobijeni plazmidi su sekvencirani, rangirani prema maksimalnoj razlici u odnosu na vektore koji su služili kao matrice, pa su odabrani oni koji su ušli u minimalnu grupu sa maksimalnom sposobnošću diferencijacije. U HEK293-F ćelije, prema specifikacijama proizvođača (Life technologies), transfektovani su plazmidi koji kodiraju AXL homologe iz Hs, Mm, Md, Ac i Tn, četiri himerna plazmida između čoveka i miša koji kodiraju Hs AXL-a sa mišjim domenima Ig1, Ig2, Fn1 ili Fn2, i šesnaest najrazličitijih plazmida iz rekombinantne biblioteke. Podaci vezivanja dobijeni FACS analizama, upotrebom 1 µg/mL anti-AXL antitela, su razvrstani, pri čemu je bodovanje po aminokiselini bilo takvo da kada je mutacija prisutna ono iznosi (+1) ili (-1) kada nije u korelaciji sa gubitkom vezivanja, nakon čega je primenjena korekcija osnovne vrednosti i normalizacija prema skali od -5 do 5, što je rezultovalo u skoru efekta po aminokiselini celog ECD-a.
[0384] Podaci o razvrstanim podacima vezivanja su sumirani u Tabeli 6, u vidu aminokiselina koje su uklјučene u vezivanje. Antitela za koja nije bilo moguće mapirati mesto vezivanja sa visokom rezolucijom, zbog nedostatka rekombinacionih događaja u blizini tog mesta, označena su kao nerazrešena.
Primer 4 – Efektorske funkcije posredovane sa Fc
Citotoksičnost posredovana ćelijama i zavisna od antitela (ADCC)
[0385] Sposobnost anti-AXL antitela da indukuju ADCC u A431 ćelijama epidermoidnog karcinoma određivana je kao što je objašnjeno u dalјem tekstu. Kao efektorske ćelije su korišćene mononuklearne ćelije periferne iz krvi zdravih dobrovolјaca (UMC Utrecht, Netherlands).
Obeležavanje cilјnih ćelija
[0386] A431 ćelije (5x10<6>ćelija) su prikupljene u medijumu za kulturu (medijum za kulturu RPMI 1640 koji je bio dopunjen sa 10% fetalnog seruma teleta (FSC)), kome je potom dodato 100 µCi<51>Cr (Chromium-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Netherlands), nakon čega je smeša inkubirana u vodenom kupatilu na 37°C tokom sat vremena uz treskanje. Nakon pranja ćelija (dva puta u PBS, 1200 rpm, 5 min), ćelije su resuspendovane u RPMI1640/10% FSC-a i prebrojane upotrebom tripan plave boje. Ćelije su razblažene do gustine od 1x10<5>ćelija/mL.
Priprema efektorskih ćelija
[0387] Mononuklearne ćelije periferne krvi (zdravi dobrovolјci, UMC Utrecht, Utrecht, The Netherlands) su izolovane iz 45 mL sveže uzete heparinizovane krvi upotrebom Ficoll reagensa (Bio Whittaker; medijum za odvajanje limfocita, kat. br.17-829E) prema uputstvima proizvođača. Nakon resuspendovanja ćelija u RPMI1640/10% FSC-a, ćelije su prebrojane upotrebom tripan plave boje i razblažene do gustine od 1x10<7>ćelija/mL.
Postavka za ADCC
[0388] U ploče sa 96-bunara je ispipetirano po 50 µl cilјnih ćelija obeleženih sa<51>Cr i u to je dodato 50 µl antitela, razblaženog u RPMI1640/10% FSC-a (trostuko razblaženje do finalnih koncentracija opsega 0,01-10 µg/mL). Ćelije su inkubirane na sobnoj temperaturi (RT), 15 min), pa je u njih dodato 50 µl efektorskih ćelija, što je rezultovalo odnosom efektorskih i cilјnih ćelija od 100:1 (za određivanje maksimalne lize, umesto efektorskih ćelija dodato je 100 µl 5% Triton-X100; za određivanje spontane lize je korišćeno 50 µL cilјnih ćelija i 100 µL RPMI1640/10% FSC). Ćelije su inkubirane preko noći na 37°C i u 5% CO2. Nakon obaranja ćelija centrifugiranjem (1200 rpm, 10 min), 70 µL supernatanta je prikuplјeno u mikrolitarske epruvete, i prebrojano u gama brojaču. Procenat specifične lize je izračunat na sledeći način:
% specifične lize = (cpm uzorka – cpm ciljne ćelije samostalno)/(cpm maks. lize - cpm ciljne ćelije samostalno)
pri čemu cpm označava broj otkucaja u minuti.
[0389] IgG1-AXL-183-N52Q i IgG1-AXL-733 su indukovali ADCC od 15 do 21% u A431 ćelijama pri koncentraciji od 10 µg/mL (Slika 3). IgG1-AXL-148, IgG1-AXL-726-M101L, IgG1-AXL-171, IgG1-AXL-613, IgG1-AXL-107 i IgG1-AXL-154-M103L nisu indukovali značajnu ADCC u A431 ćelijama u koncentracijama do 10 µg/mL (Slika 3).
Primer 5 – Karakteristike vezivanja za konjugate AXL antitela i leka (AXL-ADC)
[0390] HEK293T ćelije su tranzijentno transfektovane konstruktima ekspresije za humani AXL cele dužine (videti Primer 1). Vezivanje anti-AXL antitela i AXL-ADC za ove ćelije procenjeno je protočnom citometrijom. Tranzijentno transfektovane HEK293 ćelije inkubirane su tokom 30 minuta na 4°C sa serijskim razblaženjima anti-AXL antitela ili AXL-ADC (četvorostruka razblaženja; finalne koncentracije opsega 0,003-10 µg/mL). Nakon tri ispiranja sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, ćelije su inkubirane u mraku u 100 µL sekundarnih antitela, na 4°C tokom 30 minuta. Kao sekundarno antitelo je korišćen kozji anti-humani IgG F(ab')2 konjugovan sa R-Fikoeritrinom (PE) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; kat. br. No.109-116-098) razblažen 1/100 u PBS/0,1% BSA/0,02% azida. Ćelije su potom isprane dva puta u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane upotrebom FACS Cantoll uređaja (BD Biosciences).
[0391] Krive vezivanja su analizirane nelinearnom regresijom (sigmoidna dozno-zavisna kriva sa promenlјivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[0392] Slika 4 pokazuje da je vezivanje anti-AXL antitela za HEK293 ćelije koje eksprimiraju humani AXL-ECD bilo slično vezanju za AXL-ADC-ove.
Primer 6 - In vitro citotoksičnost izazvana konjugatima antitela specifičnog za AXL i leka
[0393] LCLC-103H ćelije (humanog krupnoćelijskog karcinoma pluća) su gajene u kulturi, u RPMI 1640 medijumu sa L-glutaminom (Cambrex; kat. br. no. BE12-115F) dopunjenim sa 10% (vol/vol) toplotom inaktivisanog Cosmic telećeg seruma (Perbio; kat. br. SH30087.03), 2 mM L-glutaminom (Cambrex; kat. br. US17-905C), 50 IU/mL penicilinom i 50 µg/mL streptomicinom (Cambrex; kat. br. DE17-603E). MDA-MB-231 ćelije (humanog kancera dojke) su gajene u DMEM medijumu (Cambrex; kat. br. BE12-709F) sa dodatkom 10% (vol/vol) toplotom inaktivisanog Cosmic telećeg seruma (Perbio; kat. br. SH30087.03), 1 mM natrijum-piruvata (Cambrex; kat. br. BE13-115E), 2 mM L-glutamina (Cambrex; kat. br. US17-905C), 100 µM MEM NEAA (Invitrogen; kat. br.11140), 50 IU/mL penicilina i 50 µg/mL streptomicina (Cambrex; kat. br. DE17-603E). Ćelijske linije su gajene na 37°C u vlažnom inkubatoru pri 5% (vol/vol) CO2. LCLC-103H i MDA-MB-231 ćelije su gajenje do postizanja skoro potpune konfluentnosti, nakon čega su bile tripsinizovane, resuspendovane u medijumu za kulturu i propuštene kroz ćelijski filter (BD Falcon, kat. br.352340) kako bi se dobila suspenzija pojedinačnih ćelija. U svaki bunar ploče za kulturu sa 96-mesta je zasejano 1x10<3>ćelija, pa su ćelije inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi, a potom i tokom 5 sati na 37°C, sa 5% CO2 da bi se omogućilo prijanjanje ćelija za ploču.
[0394] Serijska razblaženja (četvorostruka; finalne koncentracija opsega od 0,00015 do 10 µg/mL) konjugata AXL antitela i leka (AXL-ADC; videti Primer 1), pripremlјena su u medijumu za kulturu i dodata u bunariće ploče. Inkubacija ćelija sa 1 µM staurosporinom (#S6942-200, Sigma) je upotrebljena za dobijanje referentne vrednosti za smrtnost tumorskih ćelija od 100%. Netretirane ćelije su korišćene kao referentna vrednost za 0% smrtnosti tumorskih ćelija. Ploče su inkubirane 5 dana na 37°C, sa 5% CO2. Zatim je u bunariće (20 µL po bunaru) dodat reagens CellTiter-Glo (Promega; kat. br. G7571) i ploče su inkubirane tokom 1,5 sata na 37°C, 5% CO2. Potom je po 180 µL po bunaru prebačeno u bele ploče Optiplate™ sa 96-bunara (PerkinElmer, Waltham, MA; kat. br.6005299), koje su inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. Konačno, izmerena je luminiscencija na EnVision čitaču za više ploča (Envision, Perkin Elmer).
[0395] AXL-ADC tipa IgG1-AXL-148-vcDuo3, IgG1-AXL-183-vcDuo3 i IgG1-AXL-726-vcDuo3 indukovali su citotoksičnost u LCLC-103H ćelijama, sa IC50 vrednostima između 0,01 i 0,06 µg/mL, kao što je prikazano na Slici 5A. Slično tome, Slika 5B prikazuje da ovi AXL-ADC indukuju citoksičnost u MDA-MB-231 ćelijama sa IC50 vrednostima između 0,005 i 0,015 µg/mL.
Primer 7 - Varijante VH i VL regiona antitela koje omogućavaju vezivanje za AXL
[0396] Proteinske sekvence VH i VL regiona anti-AXL antitela iz panela (opisane u Primeru 1) su poravnate i upoređena je njihova sposobnost vezivanja za AXL kako bi se identifikovale kritične ili permisivne promene aminokiselinskih ostataka u ovim regionima. Zbog toga su antitela sa identičnim VH ili VL regionima grupisana i njihovo vezivanje za humani AXL je upoređivano, kao utvrđivane su i razlike u VL ili VH sekvencama, tim redom. Vezivanje za tranzijentno eksprimirani humani AXL u HEK-293F ćelijama, je procenjeno skriningom specifičnim za homogene antigena, kao što je opisano u Primeru 1. U ovom primeru je urađeno numerisanje aminokiselinskih pozicija za poravnanja na osnovu sekvenci izloženih na Slici 6, tj. prva aminokiselina u prikazanom nizu je numerisana kao pozicija „1“, druga kao pozicija „2“ itd.
[0397] Najpre su grupisana antitela sa identičnim VL sekvencama.
[0398] Pokazano je da IgG1-AXL-148 i IgG1-AXL-140 imaju identičnu sekvencu VL regiona i da je prisutna jedna aminokiselinska razlika u HC CDR3 regionu (F je zamenjen sa I na aminokiselinskoj poziciji 109; Slika 6A). Oba antitela se vezuju za humani AXL (Tabela 7), što ukazuje da aminokiselina na poziciji 109 nije esencijalna za vezivanje antitela, pod pretpostavkom da mutacija identifikovana u CDR2 regionu (G zamenjen sa A aminokiselinskoj poziciji 56) ne kompenzuje gubitak sposobnosti vezivanja (Slika 6A).
[0399] Pokazano je da IgG1-AXL-726 i IgG1-AXL-187 imaju identičnu sekvencu VL regiona i da se oba antitela vezuju za humani AXL (Tabela 7). Dve promene aminokiselinskih ostataka u HC CDR3 regionu (R sa S na poziciji 97 i A sa T na poziciji 105; Slika 6B) su moguće bez gubitka vezivanja, pod pretpostavkom da mutacije identifikovane u CDR1regionu (Y zamenjen sa H na poziciji 32) i/ili u uokvirujućim regionima (P3Q, V24I, Y25D, T86A i T117A) ne kompenzuju gubitak sposobnosti vezivanja (Slika 6B).
[0400] Pokazano je da IgG1-AXL-171, IgG1-AXL-172 i IgG1-AXL-181 imaju identičnu sekvencu VL regiona i da se sva antitela vezuju za humani AXL (Tabela 7). CDR3 regioni ova tri antitela su identični, a da je promena aminokiselinskih ostataka u HC CDR1 regionu (S zamenjen sa N na poziciji 31) ili u uokvirujućem regionu (H za Q na poziciji 82) dopuštena bez gubitka sposobnosti vezivanja (Slika 6C).
[0401] Pokazano je da IgG1-AXL-613, IgG1-AXL-608-01, IgG1-AXL-610-01 i IgG1-AXL-620-06 imaju identičnu sekvencu VL regiona i da je prisutna razlika u jednoj aminokiselini u HC CDR3 regionu (N je zamenjen sa D na poziciji aminokiseline 101; Slika 6D). Sva antitela se vezuju za humani AXL (Tabela 7), što ukazuje da aminokiselina na poziciji 101 nije esencijalna, pod pretpostavkom da mutacije identifikovane u HC CDR2 (V zamenjen sa A na poziciji 58) i/ili u uokvirujućim regionima (N35S, M37V, A61V, L70I, S88A) ne kompenzuju gubitak sposobnosti vezivanja (Slika 6D).
[0402] Zatim su grupirana antitela sa identičnim VH sekvencama.
[0403] Pokazano je da IgG1-AXL-613 i IgG1-AXL-613-08 imaju identičnu sekvencu VH regiona i da je prisutno pet razlika u aminokiselinama CDR3 regiona iz LC-a (RSNWL je zamenjeno sa YGSSY na pozicijama od 92 do 96; Slika 6E). Oba antitela se vezuju za humani AXL (Tabela 7), što ukazuje da su dozvolјene varijacije aminokiselina na pozicijama od 92 do 96 i da one ne utiču na vezivanja antitela, pod pretpostavkom da mutacije koje su identifikovane u CDR1 (delecija S na poziciji 30), CDR2 (G51D), i/ili u uokvirujućim regionima (G9A, S54N, R78S, Q100G, L104V) ne kompenzuju gubitak sposobnoti vezivanja (Slika 6E).
Tabela 7
Primer 8 - In vitro citotoksičnost indukovana MMAE-konjugovanim AXL antitelima
Konjugacija MMAE za anti-AXL antitela
[0404] Anti-AXL antitela su prečišćena Protein A hromatografijom, prema standardnim procedurama, i konjugovana su sa vcMMAE. Kompleks linkera i leka tipa vcMMAE je alkilovan na cisteinima antitela koja su redukovana, postupcima koji su opisani u literaturi (videti [150], [151] i [152]). Reakcija je zaustavljena dodavanjem N-acetilcisteina u višku. Bilo koji preostali nekonjugovani lek je uklonjen prečišćavanjem i konačni konjugati anti-AXL antitela i leka su formulisani u PBS-u. Konjugatima anti-AXL antitela i leka su naknadno analizirani koncentracija (apsorbancijom na 280 nm), odnos lek:antitelo (DAR, hromatografijom reverzne faze (RP-HPLC) i hromatografijom hidrofobne interakcije (HIC)), količina nekonjugovanog leka (hromatografijom reverzne faze), procenat agregacije (hromatografijom isklјučenja po veličini, SEC-HPLC) i nivoi endotoksina (LAL). Rezultati su prikazani ispod u Tabela 8.
Tabela 8 - Pregled različitih karakteristika konjugata antitela i leka.
Ćelijska kultura
LCLC
[0405] Ćelije -103H (humanog krupnoćelijskog kancera pluća) i ćelije A431 (DMSZ, Braunschweig, Germany) su gajene u RPMI 1640 medijumu uz dodatak L-glutamina (Cambrex; kat. br. BE12-115F), 10% (vol/vol) toplotom inaktivisanog Cosmic seruma teleta (Perbio; kat. br. SH30087.03), 2 mM L-glutamina (Cambrex; kat. br. US17-905C), 50 IU/mL penicilina i 50 µg/mL streptomicina (Cambrex; kat. br. DE17-603E). MDA-MB231 ćelije su gajene u DMEM medijumu sa visokom koncentracijom glukoze i HEPES-om (Lonza #BE12-709F), donorksim goveđim serumom sa gvožđem (Life Technologies #10371-029), 2 mM L-glutaminom (Lonza #BE17 -605E), 1 mM natrijum-piruvatom (Lonza #BE13-115E) i MEM neesencijalnim rastvorom aminokiselina (Life Technologies #11140). Ćelijske linije su gajene na 37°C u vlažnom inkubatoru sa 5% (vol/vol) CO2. Ćelije LCLC-103H, A431 i MDA-MB231 su gajene do postizanja skoro potpune konfluentnosti, nakon čega su tripsinizovane, resuspendovane u medijumu za kulturu i propuštene kroz filter za ćelije (BD Falcon, kat. br. 352340) da bi se dobila suspenzija pojedinačnih ćelija.1x10<3>ćelije je zasejano u svaki bunar ploče sa 96-bunara, pa su ćelije inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim tokom 5 sati na 37°C, sa 5% CO2da bi se postiglo prijanjanje za podlogu.
Test citotoksičnosti
[0406] Serijska razblaženja (finalnih koncentracija opsega od 0,00015 do 10 µg/mL) AXL antitela konjugovanih sa MMAE, pripremlјena su u medijumu za kulturu i dodata u bunare. Inkubacija ćelija sa 1 µM staurosporina (#S6942-200, Sigma) je korišćena kao referentna vrednost za smrtnost tumorskih ćelija od 100%. Netretirane ćelije su upotrebljene kao referentna vrednost za rast ćelija od 100%. Ploče su inkubirane 5 dana na 37°C, u 5% CO2. Zatim je u bunare (20 µL po bunaru) dodat reagens CellTiter-Glo (Promega; kat. br. G7571) i ploče su inkubirane tokom 1,5 sata na 37°C, 5% CO2. Potom je po 180 µL iz svakog bunarića prebačeno u bele ploče Optiplate™ sa 96-bunara (PerkinElmer, Waltham, MA; kat. br. 6005299), koje su zatim inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. Konačno, izmerena je luminiscencija na EnVision čitaču za više ploča (Envision, Perkin Elmer).
[0407] MMAE-konjugovana AXL antitela su indukovala smrtnosti LCLC-103H ćelija od 50%, u koncentracijama između 0,004 i 0,219 µg/mL, kao što je prikazano u Tabeli 9a i na Slici 7.
[0408] Slično tome, AXL-ADC su efikasno indukovali citotoksičnost u A431 (Tabela 9b i Slika 15A) i MDA-MB231 ćelijama (Tabela 9b i Slika 15B).
Tabela 9a - Citotoksičnost anti-AXL antitela konj. sa MMAE u LCLC-103H ćelijama (EC50 vrednosti)
Tabela 9b. Citotoksičnost anti-AXL antitela konj. sa MMAE u A431 i MDA-MB-231 ćelijama (EC50).
Primer 9 - Terapijski tretman LCLC-103H tumorskih ksenografta sa anti-AXL antitelima konjugovanim sa MMAE kod SCID miševa
[0409] Kod SCID miševa je određivana in vivo efikasnost anti-AXL antitela konjugovanih sa MMAE u uspostavljenim subkutanim (SC) LCLC-103H ksenograftima tumora. U desni bok ženki SCID miševa potkožno je injecirano 5 x 10<6>LCLC-103H tumorskih ćelija (krupno-ćelijskog karcinoma pluća, dobijene od Leibniz-Institut-a DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)) u 200 µL PBS-a. Počevši od 14-21 dana nakon inokulacije tumorskih ćelija, kada je prosečna veličina tumora iznosila >100-200 mm<3>i kada je primećen jasan rast tumora, intraperitonealno je primenjena jedna injekcija (100 µL/miš) sa 1 mg/kg (20 µg/miš) IgGl-AXL-vcMMAE antitela (kao što je opisano u dodatnom Primeru 1) ili kontrolna injekcija (sa nekonjugovanim IgGl-b12). Volumen tumora je određivan najmanje dva puta nedelјno. Zapremine tumora (mm<3>) su izračunate na osnovu merenja dobijenih upotrebom kalibarskog šestara (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
[0410] Panel anti-AXL-vcMMAE antitela je pokazao širok spektar anti-tumorske aktivnosti kod uspostavljenih SC LCLC-103H tumora (Figura 8). Klonovi IgG1-AXL-733-vcMMAE, IgG1-AXL-107-vcMMAE i IgG1-AXL-148-vcMMAE su indukovali regresiju tumora, klonovi AXL-171-vcMMAE, IgG1-AXL-511-vcMMAE i IgG1-AXL-613-vcMMAE su indukovali inhibiciju rasta tumora, dok klonovi IgG1-AXL-154-M103L-vcMMAE, IgG1-AXL-183-N52Q-vcMMAE i IgG1-AXL-726-M101L-vcMMAE nisu pokazali nikakvu ili samo minornu inhibiciju rasta tumora.
[0411] Statistička analiza je urađena poslednjeg dana, kada su sve grupe bile intaktne (30. dan), upotrebom jednofaktorskog ANOVA testa (Danet-ov test višestrukih poređenja u odnosu na kontrolni IgGl-b12) i ukazala je na veoma značajnu razliku (p<0,0001) u volumenu tumora indukovanog sa IgG1-b12 u odnosu na IgG1-AXL-733-vcMMAE, IgG1-AXL-107-vcMMAE i IgG1-AXL-148-vcMMAE. Kod nekih miševa unutar ovih grupa, tretmana sa ovim klonovima je doveo do potpune redukcije tumora. Tretman sa klonovima IgG1-AXL-171-vcMMAE, IgG1-AXL-511-vcMMAE i IgG1-AXL-613-vcMMAE takođe je pokazao značajnu inhibiciju rasta tumora u poređenju sa IgG1-b12, ali su razlike bile manje izražene (p<0,05 do p<0,001). Rast tumora nije bio značajno promenjen kod miševa koji su tretirani klonovima IgG1-AXL-154-M103L-vcMMAE, IgG1-AXL-183-N52Q-vcMMAE i IgG1-AXL-726-M101L-vcMMAE u poređenju sa kontrolnim IgG1-b12.
[0412] Primećena je anti-tumorska aktivnost anti-AXL-vcMMAE antitela u raznim in vivo modelima tumora. U dva ksenografna modela izvedena iz ćelijskih linija (A431; epidermoidnog adenokarcinoma i MDA-MB-231; kancer dojke), anti-AXL-vcMMAE antitela su indukovala inhibiciju rasta tumora, dok je regresija tumora indukovana antitelom anti-AXL-vcMMAE kod dva ksenografta poreklom od pacijenata, jednog sa karcinomom pankreasa i drugog sa rakom grlića materice.
Primer 10 - Anti-tumorska efikasnost AXL-ADC u ksenograftnom modelu izvedenom iz kancera pankreasa pacijenta (PDKS) sa heterogenom ciljnom ekspresijom
[0413] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-107-vcMMAE, IgG1-AXL-148-vcMMAE i IgG1-AXL-733-vcMMAE je određena u PDX modelu PAXF1657 kancera pankreasa (eksperimenti su izvedeni od strane Oncotest-a, Freiburg, Germany). Tkivo humanog tumora pankreasa je supkutano implantirano u levi bok ženki NMRI nu/nu miševa starih 5-7 nedelјa. Nasumično razvrstavanje životinja je izvedeno na sledeći način: životinje koje nose tumor veličine 50 - 250 mm<3>, poželjno 80 - 200 mm<3>, su raspoređene u 7 eksperimentalnih grupa (8 životinja po grupi), uzimajući u obzir da u grupi budu prisutne uporedive vrednosti medijane i aritmetičke sredine volumena tumora. Na dan nasumičnog razvrstavanja životinja (dan 0), 3 ADC-a su primenjena intravenski (i.v, bilo kao 4 mg/kg ili 2 mg/kg, a kontrolna grupa je primila jednu dozu IgGl-b12 (4 mg/kg). Zapremine tumora (mm<3>) su praćene dva puta nedelјno i izračunate su iz merenja upotrebom kalibarskog šestara (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
[0414] Bojenje PAXF1657 tumora je rađeno standardnim imunohistohemijskim tehnikama. Ukratko, zamrznuta tkiva su fiksirana sa acetonom u trajanju od 10 minuta, pa je endogena peroksidaza blokirana upotrebom vodonik peroksida. Nakon toga, preseci tkiva su blokirani normalnim mišjim serumom i bojenje je urađeno inkubacijom sa 5 µg/mL objedinjenih pet IgG1-AXL antitela (IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-137, IgG1-AXL-148, IgG1 -AXL-183, IgG1-AXL-726). Nakon inkubacije sa sekundarnim antitelom koje je bilo konjugovano sa peroksidazom rena (HRP), HRP je vizuelizovan amino-etil karbazolom (AEC; rezultat je pojava crvene boje). Svaka mikroskopska pločica je kontrastirana hematoksilinom (plav) da bi se identifikovali nukleusi, pa je prekrivena glicergelom i pokrovnim staklom. Preseci imunoobojenih tkiva su digitalizovani na ručnom Zeiss-ovom mikroskopu (AxioSkop) pri uvećanjima do 10x i 40x.
[0415] Slika 9 pokazuje heterogenu AXL ekspresiju u PAXF1657 tumorima. Dok se kod nekih tumorskih ćelija zapaža snažno bojenje AXL-a, druge ćelije ga ne pokazuju. Na crno-beloj fotografiji, AXL bojenje izgleda kao tamno sivo. Bojenje hematoksilinom (jedara) deluje kao svetlo sivo.
[0416] Slika 10A pokazuje da je tretman miševa sa 2 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE, IgG1-AXL-148-vcMMAE i IgG1-AXL-733-vcMMAE značajno smanjio rast PAXF1657 tumora u poređenju sa kontrolnom grupom. Doza od 4 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE, IgG1-AXL-148-vcMMAE i IgG1-AXL-733-vcMMAE je indukovala regresiju PAXF1657 tumora. Četrnaestog dana nakon tretmana, prosečna veličina tumora kod miševa koji su bili tretirani sa 2 mg/kg ili 4 mg/kg IgG1-AXL-107-MMAE, IgG1-AXL-148-MMAE ili IgG1-AXL-733-MMAE je bila značajno manja nego kod miševa koji su tretirani IgG izotipskom kontrolom (IgG1-b12) (p<0,001; Takijev test višestrukih poređenja).
[0417] Tretman miševa nekonjugovanim IgG1-AXL-148 nije doveo do anti-tumorske aktivnosti u PAXF1657 modelu (Slika 10B). Međutim, konjugovani IgG1-AXL-148-vcMMAE je indukovao doznozavisnu antitumorsku aktivnost u ovom modelu (Slika 10B), pokazujući da terapeutski kapacitet AXL-ADC zavisi od citotoksične aktivnosti MMAE.
[0418] Štaviše, tretman miševa sa ADC IgG1-b12-vcMMAE koji nije sa ciljnim dejstvom, nije pokazao anti-tumorsku aktivnost u PAXF1657 modelu (Slika 10C), ilustrujući da terapeutski kapacitet AXL-ADC-ova takođe zavisi od specifičnog cilјanog vezivanja.
Primer 11 – Vezivanja AXL antitela za Ig1 domen
[0419] Specifičnost AXL domena AXL antitela IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-137 i IgG1-AXL-613 je određena upotrebom panela mutanata himernog AXL-a čoveka i miša. Da bi se potvrdila ekspresija hsAXL-mmECD, uklјučeno je unakrsno-reaktivno humano-mišje monoklonsko AXL antitelo YW327.6S2. Antitelo IgG1-b12 je korišćeno kao izotipska kontrola. Generisano je i eksprimirano u HEK293F, pet različitih himernih AXL molekula, kao što je opisano u Primeru 3. Ukratko, humani domen I sličan Ig (Ig1), domen II sličan Ig (Ig2), humani domen I sličan FNIII (FN1 ) ili humani domen II sličan FNIII (FN2) zamenjeni su njihovim mišjim homolozima. Protočnom citometrijom je određivano vezivanje 1 µg/mL anti-AXL antitela za AXL himere čoveka i miša, kao što je opisano u Primeru 2.
[0420] Sva anti-AXL antitela su pokazala sposobnost vezivanje za humani AXL (Slika 11A), dok je vezivanje poništeno kada je ECD humanog AXL-a zamenjen njegovim mišjim homologom (Slika 11B).
Kao što se i očekivalo, humano-mišje monoklonsko AXL antitelo sa unakrsnom reaktivnošću, YW327.6S2, je pokazalo vezivanje za hsAXL-mmECD, potvrđujući pravilnu ekspresiju hsAXL-mmECD.
[0421] AXL antitela IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-137 i IgG1-AXL-613 su pokazala smanjeno vezivanje za hsAXL-mmIg1 (Slika 11C), ilustrujući prepoznavanje epitopa u AXL Ig1 domenu. U skladu sa time, nije bilo efekata na vezivanje IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-137 i IgG1-AXL-613 za hsAXL-mmIg2 (Slika 11D), hsAXL-mmFN1 (Slika 11E) ili hsAXL-mmFN2 (Slika 11F). Humano-mišje monoklonsko AXL antitelo sa unakrsnom reaktivnosšću, YW327.6S2, pokazalo je vezivanje za sve himerne AXL varijante, potvrđujući pravilnu ekspresiju ovih proteina.
Primer 12 - AXL antitela IgG1-AXL-107 i IgGI-AXL-613 se vezuju za Ig1 domen, ali nisu u kompeticiji vezivanja za Gas6
[0422] Ispitivano je i da li vezivanje AXL antitela IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-107, IgG1-AXL-137 ili IgG1-AXL-613 interferira sa vezanjem AXL liganda Gas6 za AXL. Zbog toga je testirano vezivanje Gas6 za A431ćelije koje su prethodno inkubirane sa 10 µg/mL AXL antitela, kao što je opisano u Primeru 2. Prethodna inkubacija sa AXL antitelom YW327.6S2 je opisana kao ona koja je u komepticiji sa Gas6 u vezivanju za AXL, dok su kao kontrole uključeni IgG1-b12 (izotipska kontrola) ili medijum (negativna kontrola).
[0423] Krive vezivanja su analizirane postupkom nelinearne regresije (sigmoidnom dozno-zavisnom krivom sa promenjivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[0424] Slika 12 i Tabela 11 pokazuju da je vezivanje Gas6 za A431 ćelije koje su prethodno inkubirane sa IgG1-AXL-107 i IgG1-AXL-613 antitelima, bilo slično vezivanju IgG1-b12 i medijuma (negativna kontrola). Ovo ilustruje da vezivanje IgG1-AXL-107 i IgG1-AXL-613 za AXL ne ometa vezivanje Gas6, kao što je prikazano u Primeru 2. Vezivanje Gas6 za A431 ćelije je u velikoj meri smanjeno u prisustvu IgG1-AXL-061, IgG1-AXL-137 i kontrolnog AXL antitela YW327.6S2 u poređenju sa vezivanjem IgG1-b12 i konrolnog medijuma (negativne kontrole).
[0425] U eksperimentima u kojima su A431 ćelije prethodno inkubirane sa Gas6, maksimalne vrednosti vezivanja IgGl-AXL-107 i IgG1-AXL-613 su bile uporedive sa vezivanjem antitela u odsustvu Gas6 (maksimalno vezivanje nakon predinkubacije sa Gas6 je iznosilo 91-108% od vezivanja bez predinkubacije sa Gas6) (Tabela 11). EC50vednosti vezivanja za IgG1-AXL-107 i IgG1-AXL-613 sa ili bez Gas6 predinkubacija su bile istog opsega ili nešto više nakon predinkubacija sa Gas6 (Tabela 11). Ovo pokazuje da IgG1-AXL-107 i IgG1-AXL-613 nisu u kompeticiji sa vezivanjem Gas6.
[0426] Slično kontrolnom antitelu YW327.6S2, vezivanje IgG1-AXL-061 i IgG1-AXL-137 za A431 ćelije je bilo značajno redukovano u prisustvu Gas6 u poređenju sa vezivanjem u njegovom odsustvu (maksimalno vezivanje nakon Gas6 predinkubacije je 40-43% of vezivanja bez prethodne inkubacije sa Gas6; Tabela 11). EC50vrednosti za IgG1-AXL-061 i IgG1-AXL-137 nije bilo moguće pravilno odrediti nakon predinkubacije sa Gas6 (Tabela 11). Ovo pokazuje da su IgG1-AXL-061 i IgG1-AXL-137 u kompeticija sa Gas6 u vezivanju za AXL.
[0427] Navedeni podaci pokazuju da antitela koja se vezuju za AXL Ig1 domen imaju različit efekat na vezivanje Gas6.
Tabela 11
Primer 13 - In vivo anti-tumorska efikasnost AXL-ADC u modelima ksenografta sa i bez autokrine (endogene) proizvodnje Gas6
Proizvodnja Gas6 u A431 i LCLC-103H tumorskim ćelijama
[0428] Ispitivano je dalje da li A431 i LCLC-103H ćelije proizvode Gas6. Zbog toga su ćelije gajene u kompletnom medijumu tokom 3 dana. Nivoi Gas6 u supernatantu su određeni upotrebom Quantikine ELISA testa za humani Gas6 (R&D Systems, Minneapolis, MN), prema uputstvima proizvođača. Ovaj test upotrebljava kvantitativni ELISA sendvič metod. Monoklonsko Ab specifično za humani Gas6 je nanešeno na mikrotitarsku ploču. Standardi i uzorci su ispipetirani u bunare, i bilo koji humani Gas6 prisutan u uzorku je bio vezan sa imobilisanim At. Nakon ispiranja nevezanih supstanci, u bunariće je dodato poliklonsko Ab koje je bilo vezano sa enzimom i specifično za humani Gas6. Nakon ispiranja radi uklanjanja nevezanih Ab-enzim reagensa, u svaki bunarić je dodat supstrat tako da se boja razvijala srazmerno količini prisutnog humanog Gas6 koji je bio vezan u početnom koraku. Razvijanje boje je zatim zaustavljeno i izmeren je intenziteti obojenosti.
[0429] Utvrđeno je da medijum ćelijske kulture A431 ćelijske linije sadrži 2576 ng/mL Gas6, dok je koncentracija Gas6 u medijumu LCLC-103H ćelijske linije bila veća za manje od 20 puta (Tabela 12).
Tabela 12 - Proizvodnja Gas6 u medijumu u kome su gajene tumorske ćelije.
Anti-tumorska aktivnost AXL-ADC in vivo
[0430] In vivo anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-061-vcMMAE (Ig1-veznik), IgG1-AXL-107-vcMMAE (Ig1-veznik), IgG1-AXL-137-vcMMAE (Ig1-veznik), IgG1-AXL-148-vcMMAE (Ig2-veznik), IgG1-AXL-183-vcMMAE (FN1-veznik) i IgG1-AXL-726-vcMMAE (FN2-veznik) je određena u A431modelu tumora (epidermoidnog karcinoma), koji stvara visoke nivoe Gas6, kao i u LCLC-103H modelu tumora (krupnoćelijskog karcinoma pluća), koji produkuje niske nivoe Gas6.
[0431] Indukcija tumora je izvedena je supkutanom injekcijom 5 x 10<6>A431 ili LCLC-103H tumorskih ćelija (obe dobijene od Leibniz-Institut-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)) u 200 µL PBS-a, u desni bok ženki SCID miševa. Tretman je započeo 14-21 dan nakon inokulacije ćelija tumora, kada je prosečna veličina tumora iznosila >100-200 mm<3>i kada se mogao uočiti izražen rast tumora. Miševi su primili jednu injekciju ili ukupno 4 dvonedelјne intraperitonealne injekcije sa IgG1-AXL-vcMMAE ADC ili kontrolnim antitelom (nekonjugovani IgG1-b12), kao što je naznačeno. Zapremine tumora (mm<3>) su određivane dva puta nedeljno i izračunate su na osnovu merenja upotrebom kalibarskog šestara (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
[0432] Slika 13A pokazuje da tretman miševa sa 3 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE, IgG1-AXL-148-vcMMAE i IgG1-AXL-733-vcMMAE indukuje inhibiciju rasta A431 tumora.
[0433] Slika 13B pokazuje da tretman miševa sa 3 mg/kg IgG1-AXL-148-vcMMAE, IgG1-AXL-183-vcMMAE (veznik FN1) i IgG1-AXL-726-vcMMAE (veznik FN2) indukuje inhibiciju rasta A431 tumora.
Nasuprot tome, klonovi IgG1-AXL-061-vcMMAE i IgG1-AXL-137-vcMMAE nisu pokazali anti-tumorsku aktivnost u A431 ksenograftnom modelu.
[0434] Slika 14A pokazuje da tretman miševa sa 3 mg/kg IgG1-AXL-061-vcMMAE, IgG1-AXL-137-vcMMAE, IgG1-AXL-148-vcMMAE, IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE indukuje regresiju tumora u LCLC-103H ksenograftnom modelu. Slično tome, tretman miševa sa 1 mg/kg IgG1-AXL-107-vcMMAE ili 1 mg/kg IgG1-AXL-613-vcMMAE je indukovao regresiju LCLC-103H tumora (Slika 14B).
[0435] Ukratko, svi AXL-ADC su pokazali antitumorsku aktivnost u LCLC-103H ksenograftnom modelu koji produkuje nizak nivo Gas6. U A431 ksenograftnom modelu koji proizvodi visok nivo Gas6, antitumorska aktivnost je uočena samo za one AXL-ADC koji nisu bili u kompeticiji za vezivanje za AXL sa ligandom Gas6.
Primer 14 - AXL ekspresija u tumorima različitih indikacija
[0436] Ekspresija AXL je procenjivana upotrebom sveže isečenih parafinskih kalupa i formalinom fiksiranih (FFPE) serijskih preseka tkiva tumora (TMA) koji su sadržali uzorke centralnog tkiva iz pacijenata sa tumorima štitne žlezde, jednjaka, jajnika, karcinomom pankreasa, pluća, dojke, grlića materice ili endometrijuma, ili pak sa malignim melanomom. TMA su nabavljeni od firme US BioMaxa.
[0437] FFPE mikroskopske pločice sa mikronizovima tumora su deparafinisane i podvrgnute demaskiranju antigena (pH 6), nakon čega je endogena peroksidaza blokirana inkubacijom sa 0,1% H2O2 u citratno/fosfatnom puferu. Da bi se detektovala ekspresija AXL-a, TMA su inkubirani sa zečjim anti-AXL antitelom (Santa Cruz, kat. br: sc-20741) u koncentraciji od 1 µg/mL, tokom 60 min (sobna temperatura (RT)). Da bi se identifikovale (tumorske) ćelije epitelnog porekla, TMA su inkubirani sa zečjim anti-citokeratinskim antitelom (Abcam, kat. br. Ab9377) u razblaženju od 1:50 tokom 60 minuta (RT). Posle koraka ispiranja, TMA su inkubirani sa anti-zečjim IgG dekstranskim polimerom konjugovanim sa peroksidazom (ImmunoLogic, kat. br.: DPVR55HRP) da bi se detektovalo vezivanje zečjeg anti-AXL i zečjeg anti-citokeratinskog antitela. Konačno, vezivanje anti-zečjeg IgG dekstranskog polimera je vizuelizovano di-amin-benzadinom (DAB; smeđa boja; DAKO, cat. no.: K346811). U TMA sa centralnim regionima malignih melanoma, vezivanje anti-zečjeg IgG dekstranskog polimera je vizuelizovano sa amino-etil karbazolom (AEC; crvena boja; Vector, SK4200). Jedra su na TMA vizuelizovana hematoksilinom (plava boja).
[0438] AXL i citokeratinski imunoobojeni TMA su digitalizovani upotrebom Aperio skenerom mikroskopskih pločica pri uvećanju od 20 puta, a imunohistohemijsko bojenje preseka tkiva je kvantifikovano kompjuterskim programom za analizu slika tkiva (Definiens Tissue Studio Software, verzija 3.6.1), upotrebom algoritma zasnovanog na ćelijama. Algoritam je dizajniran tako da identifikuje i kvantifikuje procenat AXL- ili citokeratin-pozitivnih ćelija u biopsijama (opseg 0 - 100%) i da kvantifikuje intenzitet bojenja AXL-a u AXL-pozitivnim ćelijama (optička gustina (OD); opseg 0 - 3) u svakom centralnom regionu tumora. Tumorske ćelije su ocenjivane kao AXL pozitivne, kada je OD AXL-a bio najmanje 0,1. Procenat AXL-pozitivnih ćelija tumora po centralnom regionu tumora (opseg 0 -100%) je izračunat delјenjem ukupnog broja AXL-pozitivnih ćelija sa ukupnim brojem citokeratinpozitivnih ćelija u sekvencijalnim presecima centralnog regiona tumora. Prosečan intenzitet bojenja AXL (OD) u svakom centralnom regionu tumora je izračunat dijelјenjem sume AXL OD svih AXL-pozitivnih tumorskih ćelija sa brojem AXL-pozitivnih tumorskih ćelija.
[0439] TMA iz pacijenata sa malignim melanomom je bodovan ručno. Intenzitet bojanja sa AXL je procenjivan kao slab (1+), umeren (2+) ili jak (3+), a procenat AXL pozitivnih ćelija melanoma je procenjivan u intervalima od 10% (raspon 0 - 100%).
[0440] Slika 16 prikazuje grafički prikaz AXL ekspresije u centralnom regionu tumora štitne žlezde, jednjaka, jajnika, dojke, pluća, pankreasa, grlića materice i endometrijuma. Tabela 13 prikazuje procenat centralnih regiona tumora koji su ispoljili AXL ekspresiju u više od 10% tumorskih ćelija, za svaku indikaciju. Slika 17 prikazuje reprezentativni primer jezgra tkiva imunološki obojenog za AXL, za svaku indikaciju. Slike ilustruju heterogenu ekspresiju AXL u tumorima.
Tabela 13
Primer 15 - AXL antitela specifično vezuju AXL, ali ne i ostale članove familije TAM receptora.
Ekspresija humanih AXL, MER i TYRO3 u HEK-293F ćelijama
[0441] Generisane su sledeće konstrukti optimizovanih kodona za ekspresiju različitih proteina pune dužine: humani (Homo sapiens) AXL (Genbank pristupni br. NP_068713.2), humani MER (Genbank pristupni br. EAV52096.1) i humani TYRO3 (Genbank pristupni br. Q06418.1) Konstrukti su sadržavali pogodna restrikciona mesta za kloniranje i optimalnu Kozak sekvencu (GCCGCCACC) [Kozak et al. (1999) Gene 234: 187-208]. Konstrukti su klonirani u sisarski ekspresioni vektor pcDNA3.3 (Invitrogen).
[0442] FreestileTM 293-F ćelije (subklon HEK-293 prilagođen rastu u suspenziji i hemijski definisanom Freestyle medijumu, (HEK-293F)) su nabavljene od firme Invitrogen- i transfektovane su sa ekspresionim plazmidima upotrebom 293fectin reagensa (Invitrogen), prema uputstvima proizvođača, a potom su ostaljvene da rastu tokom 24-48 sati.
Studija vezivanja AXL antitela za humani AXL, humani MER ili humani TYRO3
[0443] U HEK-293F ćelijama tranzijentno transfektovanim sa ekspresionim konstruktima za humane AXL, MER ili TYRO3 pune dužine, protočnom citometrijom je određivan stepen vezivanje HuMab-AXL antitela. Transfektovane HEK-293F ćelije su inkubirane sa serijskim razblaženjima AXL antitela (četvorostruka razblaženja; finalni opseg koncentracija 0,002-10 µg/mL) tokom 30 minuta na 4°C. Nakon tri ispiranja u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, ćelije su inkubirane sa kozjim anti-humanim IgG F(ab')2 konjugovanim sa R-fikoeritrinom (PE) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; kat. br. 109-116-098) koji je razblaživan kao 1/100 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu (finalna zapremina od 100 µL). Ćelije su potom isprane dva puta u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane upotrebom FACS Cantoll uređaja (BD Biosciences). Za kontrolu ekspresije je uklјučeno bojenje sa mišjim anti-humanim Mer (R&D Systems, kat. br. Mab8912) i mišjim anti-humanim TYRO3 (Dtk) (R&D Systems, kat. Br. MAB859), a IgG1-b12 je uklјučen kao nevezujuće kontrolno izotipsko antitelo. Krive vezivanja su analizirane postupkom nelinearne regresije (sigmoidnom dozno-zavisnom krivom sa promenjivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[0444] Slika 18A prikazuje da Humab-AXL antitela pokazuju dozno-zavisno vezivanje za HEK293 ćelije koje eksprimiraju humani AXL. Nasuprot tome, nije primećeno vezanje HuMab-AXL antitela za ćelije koje eksprimiraju MER (Slika 18B) ili TYRO3 (Slika 18C) ili za netransfektovane HEK293 ćelije (Slika 18D). Bojenje sa antitelom specifičnim za MER i TYRO3 je potvrdilo da transfektovane ćelije pokazuju pravilnu ekspresiju MER (Slika 18F) ili TYRO3 (Slika 18G), tim redom.
Primer 16 - Internalizacija anti-AXL antitela vezanih za površinu ćelije
Internalizacija HuMab-AXL vezanih za ćelijsku površinu upotrebom protočne citometrije.
[0445] Internalizacija HuMab-AXL vezanih za ćelijsku površinu MDA-MB-231 i Calu-1 ćelije (ćelijska linija humanog karcinoma pluća; ATCC, kataloški broj HTB-54) je procenjena protočnom citometrijom. Po 50.000 ćelija je zasejano u ploče za kulturu tkiva sa 96-mesta i potom je ostavlјeno da se ćelije pričvrste za podlogu tokom 6 sati na 37°C. Ploče su inkubirane na 4°C tokom 30 minuta pre inkubacije sa serijskim razblaženjima AXL antitela (opseg finalnih koncentracija 0,0032-10 µg/mL) na 4°C tokom 1 sata. Nakon toga, medijum je zamenjen medijumom kulture tkiva bez antitela i ćelije su inkubirane preko noći (16-18 sati) na 37°C ili 4°C. Ćelije su zatim odvojene od podloge sa 40 µL toplog rastvora tripsina, isprane ledeno hladnim PBS/0,1% BSA/0,02% azidom, i inkubirane tokom 30 minuta na 4°C sa kozjim anti-humanim IgG F(ab')2 konjugovanim sa R-fikoeritrinom (PE) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; kat. br.109-116-098) koji je bio razblažen kao 1/100 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu (finalna zapremina od 100 µL). Ćelije su konačno isprane dva puta u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, resuspendovane u 120 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane upotrebom FACS Cantoll uređaja (BD Biosciences).
[0446] Krive vezivanja su analizirane postupkom nelinearne regresije (sigmoidnom dozno-zavisnom krivom sa promenjivim nagibom) upotrebom GraphPad Prism V5.04 kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[0447] Slika 19 pokazuje da je za sva AXL HuMab antitela i pri svim ispitivanim koncentracijama, više antitela detektovano na plazma membranama ćelija koje su inkubirane na 4°C nakon vezivanja antitela, u poređenju sa ćelijama koje su inkubirane na 37°C. Ovo ilustruje da su na 37°C antitela AXL bila internalizovana po vezanju za plazma membranu.
Internalizacija Fab-TAMRA/QSY7 i ispitivanje unutarćelijske degradacije
[0448] Internalizacija AXL antitela je ispitivana u testu internalizacije Fab-TAMRA/QSY7. Ovaj test koristi uparenu fluoroforu (TAMRA) i prigušivač (eng. quencher) (QSY7). Na primer, nakon konjugacije sa istim proteinom, a kada su u neposrednoj blizini, TAMRA fluorescencija biva prigušena sa QSY7. U ovom primeru, fragmenti kozjeg anti-humanog IgG-a (Jackson Immunoresearch) konjugovani su sa TAMRA/QSY7 (Fab-TAMRA/QSY7) kao što je opisano (Ogawa i saradnici, Mol Pharm 2009; 6(2): 386-395). I AXL HuMab (1,5 µg/mL) je prethodno inkubiran sa Fab-TAMRA/QSY7 (12 pg/mL; 30 min, 4°C). Kompleks je zatim dodat u LCLC-103H ćelije, nakon čega su ćelije inkubirane tokom 24 h u mraku, uz treskanj (200 rpm, 37°C). Internalizacija kompleksa HuMab-Fab-TAMRA/QSY7 i unutarćelijska degradacija u endozomima i lizozomima je izazvala disocijaciju TAMRA/QSY7, što dovodi do oslobađanja TAMRA. Na FACS Cantoll uređaju (BD Biosciences) je izmerena fluorescencija TAMRA u LCLC-103H ćelijama koja su bile inkubirane sa AXL antitelom koje je bilo u kompleksu sa Fab-TAMRA/QSY7.
[0449] Kao što je prikazano u Slika 20, intenzitet fluorescencije LCLC-103H ćelija je pojačan nakon inkubacije sa kompleksom AXL-antitelo-Fab-TAMRA/QSY7, u poređenju sa inkubacijom koja je podrazumevala IgGl-b12-Fab-TAMRA/QSY7 ili sam Fab-TAMRA/QSY7 kompleks. Navedeno ilustruje da se AXL antitela internalizuju po vezivanju za LCLC-103H ćelije.
Primer 17 - Anti-tumorska efikasnost AXL-ADC u modelu ksenografta koji potiče od pacijenata (PDX) sa kancerom jednjaka
[0450] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-107-vcMMAE je ispitivana i u subkutanom PDX modelu tumora jednjaka ES0195 u BALB/c “golim” miševima (eksperimenti su izvedeni u Crown Bioscience. Taicang Jiangsu Province, China). Fragmenti tumora iz donorskog miša sa ksenograftima tumora jednjaka poreklom iz pacijenta (ES0195) su upotrebljeni za inokulaciju u BALB/c “gole” miševe. Svaki miš je inokuliran supkutano na desnom boku sa jednim fragmentom tumora (prečnika 2-3 mm) i tumori su ostavlјeni da rastu sve dok volumen tumora nije iznosio oko 150 mm<3>. Nasumično razvrstavanje životinja je izvedeno na sledeći način: životinje koje nose tumor veličine oko 150 mm<3>, raspoređene su u 5 eksperimentalnih grupa (8 životinja po grupi), uzimajući u obzir da po grupama budu prisutne uporedive vrednosti medijane i aritmetičke sredine volumena tumora. Tretirane grupe su bile: IgGl-b12, IgGl-b12-vcMMAE, IgGl-AXL-107, IgGl-AXL-107-vcMMAE i paklitaksel. Antitela i ADC-ovi su dozirani intravenski (i.v.), u koncentraciji od 4 mg/kg, na dan razvrstavanja (dan 0) i sedmog dana. Paklitakel je doziran intraperitonealno (i.p.), u koncentraciji od 20 mg/kg, dana 0, 7 i 14. Zapremine tumora (mm<3>) su praćene dva puta nedeljno i izračunate su na osnovu merenja upotrebom kalibarskog šestara (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
[0451] Slika 21 prikazuje da je tretman miševa sa IgG1-AXL-107-vcMMAE indukovao regresiju ES0195 tumora u poređenju sa kontrolnim grupama IgG1-b12 i IgG1-b12-MMAE (p<0,001, 23. dana, jednofaktorska ANOVA). Tretman miševa sa IgG1-b12-vcMMAE ADC koga ne karakteriše ciljano dejstvo, nije pokazao anti-tumorsku aktivnost u ovom modelu, ilustrujući da terapeutski kapacitet AXL-ADC zavisi od specifičnog cilјanog vezivanja. Miševi koji su tretirani paklitakselom je karakterisalo inhibiran rasta tumora, ali i manje efikasna inhibicija u poređenju sa IgGl-AXL-107-vcMMAE tretmanom (p<0,05, 23. dana, jednofaktorska ANOVA).
Primer 18 - Anti-tumorska efikasnost AXL-ADC u modelu ksenografta koji potiče od pacijenta (PDX) sa kancerom grlića materice
[0452] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE je potom ispitivana na CEXF 773 modelu ksenografta koji potiče od pacijenta (PDX) sa kancerom grlića materice u NMRI nu/nu miševima (Harlan, Netherlands). Eksperimente je uradio Oncotest (Freiburg, Germany).
[0453] Fragmenti tumora su dobijeni iz ksenografta u serijskom pasažiranju kod golih miševa. Nakon uklanjanja iz donorskog miša, tumori su isečeni na fragmente (prečnika 4-5 mm) i smeštani u PBS (sa 10% penicilina/streptomicina) do trenutka potkožne implantacije. Miševima su pod izofluoranskom anestezijom, jednostrano postavljeni potkožni implantati tumora u bok. Tumori su ostavljeni da rastu sve dok zapremina tumora nije iznosila 50-250 mm<3>.
[0454] Nasumično razvrstavanje životinja je urađeno na sledeći način: životinje sa tumorom volumena 50-250 mm<3>su raspodelјene u 4 eksperimentalne grupe (8 životinja po grupi), uzimajući u obzir da unutar grupa budu uporedive vrednosti medijane i aritmetičke sredine volumena tumora. Grupe za tretman su bile: IgGl-b12, IgGl-b12-vcMMAE, IgGl-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE. Antitela i ADC su dozirani intravenski (i.v.) sa koncentracijom od 4 mg/kg, na dan razvrstavanja u grupe (dan 0) i sedmog dana. Zapremine tumora (mm<3>) su praćene dva puta nedeljno i izračunate su na osnovu merenja upotrebom kalibarskog šestara (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
[0455] Slika 22 prikazuje da je tretman miševa sa IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE indukovao regresiju CEXF 773 tumora u poređenju sa kontrolnim grupama tretiranim sa IgGl-b12 i IgGl-b12-MMAE. Tretman miševa sa IgG1-b12-vcMMAE ADC koga ne karakteriše ciljano dejstvo, nije pokazao anti-tumorsku aktivnost u ovom modelu, ilustrujući da terapeutski kapacitet AXL-ADC zavisi od specifičnog cilјanog vezivanja. Statistička analiza veličine tumora 28. dana (Kruskal-Wallis i Mantel-Cox koristeći cut-off za veličinu tumora od 500 mm<3>), je pokazala da je prosečna veličina tumora kod miševa tretiranih sa IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE značajno manja nego kod miševa koji su tretirani sa IgG1-b12 i IgG1-b12-vcMMAE (p<0,001). IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE su bili podjednako efikasni.
Primer 19 - Anti-tumorska efikasnost AXL-ADC u ortotopskom ksenograftnom modela kancera dojke
[0456] Anti-tumorska aktivnost IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE je zatim ispitivana u ortotopskom MDA-MB-231 D3H2LN ksenograftnom modelu.
[0457] MDA-MB-231-luc D3H2LN Bioware ćelije (adenokarcinom mlečne žlezde; Perkin Elmer, Waltham, MA) su implantirane u masno tkivo mlečne žlezde ženki SCID miševa (CB-17/lcrPrkdcscid/CRL) (Charles-River) starosti 6-11 nedelјa, pod izofluoranskom anestezijom. Tumorima je dozvolјeno da rastu, a miševi su nasumično razvrstani kada su tumori dostigli volumen od ∼325 mm<3>. Životinje su tada i nasumično razvrstane u 4 eksperimentalne grupe (6-7 životinja u grupi), uzimajući u obzir da u okviru grupa budu uporedive vrednosti medijane i aritmetičke sredine volumena tumora. Tretirane grupe su bile: IgGl-b12, IgGl-b12-vcMMAE, IgGl-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE. Životinje su primile ukupno 4 dvonedeljne doze od 3 mg/kg antitela ili ADC, počevši od dana razvrstavanja u grupe. Zapremine tumora (mm<3>) su praćene dva puta nedeljno i izračunate su na osnovu merenja upotrebom kalibarskog šestara (PLEXX) kao: 0,52 x (dužina) x (širina)<2>.
[0458] Slika 23 pokazuje da je tretman miševa sa IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE indukovao regresiju MDA-MB-231 tumora u poređenju sa kontrolnim grupama IgGl-b12 i IgG1-b12-MMAE. Tretman miševa sa IgG1-b12-vcMMAE ADC koji je bez ciljanog dejstva, nije pokazao antitumorsku aktivnost u ovom modelu, pokazujući da terapeutski kapacitet AXL-ADC zavisi od specifičnog cilјanog vezivanja. Statistička analiza veličine tumora 32. dana (jednofaktorska ANOVA) pokazala je da je prosečna veličina tumora kod miševa koji su tretirani s IgG1-AXL-183-vcMMAE ili IgG1-AXL-726-vcMMAE bila statistički značajno manja nego kod miševa koji su su tretirani sa IgGl-b12 i IgGl-b12-vcMMAE (P<0,001). Nisu primećene razlike između tretiranih grupa IgG1-AXL-183-vcMMAE i IgG1-AXL-726-vcMMAE, ilustrujući da su ovi ADC indukovali podjednako efikasnu anti-tumorsku aktivnost.
Primer 20 - In vitro citotoksičnost indukovana konjugatima AXL-specifičnih antitela i leka je zavisna od cilјne ekspresije
[0459] Citotoksičnost IgG1-AXL-107-vcMMAE je testirana in vitro, na ćelijskim linijama humanih tumora sa različitim nivoima ekspresije AXL.
Ćelijska kultura
[0460] LS174T ćelije (ćelijska linija humanog kolorektalnog adenokarcinoma; ATCC, kat. br. CL-188) su gajene u minimalnom esencijalnom medijumu (MEM) sa glutamax-om, hepes-om i fenol crvenim (Life Technologies, kat. br. 42360-024). Komponente medijuma su bile 10% donorski goveđi serum sa gvožđem (DBSI) (Life Technologies, kat. br.10371-029), 1% natrijum-piruvat (100 mM; Lonza, kat. br. BE13-115E) i 1% penicilin/streptomicina (Lonza, kat. br. DE17-603E).
[0461] NCI-H226 ćelije (ćelijska linija humanog karcinoma skvamoznih ćelija; ATCC, kat. br. CRL-5826), NCI-H661 ćelije (humani krupnoćelijski kancer pluća; ATCC, kat. br. HTB-183) i NCI-H1299 ćelije (humani nesitnoćelijksi kancer pluća; ATCC, kat. br. CRL-5803) su gajene u RPMI 1640 medijumu (ATCC modifikacija; Life Technologies, kat. br. A10491-01). Komponente medijuma su bile sa 10% donorskog goveđeg seruma sa gvožđem (DBSI; Life Technologies, kat. br.10371-029) i 1% penicilin/streptomicina (Lonza, kat. br. DE17-603E).
[0462] SKOV-3 ćelije (humani adenokarcinom jajnika; ATCC, kat. br. HTB-77) su gajene u McCoy-evom 5A medijumu sa L-glutaminom i HEPES-om (Lonza, kat. br. BE12-168F). Komponente medijuma su bile 10% donorski goveđi serum sa gvožđem (DBSI; Life Technologies, kat. br. 10371-029) i 1% penicilin/streptomicin (Lonza, kat. br. DE17-603E).
[0463] Calu-1 ćelije (humani epidermoidni karcinom pluća; ATCC, kat. br. HTB-54) su gajene u McCoy -evom 5A medijumu sa katopeptonom, bez HEPES-a (Life Technologies, kat. br. 26600-023). Komponente medijuma su bile 10% donorski goveđi serum sa gvožđem (DBSI; Life Technologies, kat. br. 10371-029), 1% L-glutamin (200 nM) u 0,85% rastvoru NaCl (Lonza, kat. br. BE17-605F) i 1% penicilin/streptomicin (Lonza, kat. br. DE17-603E). Calu-1 ćelije su rezistentne na EGFR cilјanu terapiju.
[0464] LCLC-103H ćelije (humani krupnoćelijski kancer pluća), A431 ćelije (humani epidermoidni adenokarcinom) i MDA-MB-231 ćelije (humani kancer dojke) su gajene kao što je opisano u Primeru 8.
Kvantifikacija AXL ekspresije na plazma membrani ćelijskih linija humanih tumora
[0465] Ekspresija AXL-a na plazma membranama ćelija humanih tumora je ispitivana indirektnom imunofluorescencijom upotrebom QIFIKIT kompleta (DAKO, kat. br. K0078) sa mišjim monoklonskim antitelom Z49M (Santa Cruz biotechnology, kat. br. sc-73719). Zalepljene ćelije su tripsinizovane i propuštene kroz ćelijski filter da bi se dobila suspenzija pojedinačnih ćelija. Ćelije su oborene centrifugiranjem tokom 5 minuta pri brzini od 1.200 obrtaja/min, isprane PBS-om i resuspendovane u koncentraciji od 1x10<6>ćelija/mL. Sledeći koraci su izvedeni na ledu. Po 100 µL suspenzija pojedinačnih ćelija (sa 100.000 ćelija po bunaru) je zasejano u polistirenske ploče sa 96-bunara i sa okruglim dnom (Greiner Bio-One, kat. br.650101). Ćelije su zatim oborene centrifugiranjem tokom 3 minuta pri brzini od 300xg i resuspendovane u koncentraciji od 10 µg/mL u po 50 µL uzorka antitela ili mišje IgG1 izotipske kontrole (BD/Pharmingen, kat. br.555746). Nakon inkubacije od 30 minuta na 4°C, ćelije su istaložene, pa resuspendovane u 150 µL FACS pufera. Kuglice za podešavanje i kalibraciju su dodate na ploču prema uputstvima proizvođača. Ćelije i kuglice su paralelno isprane dva puta sa 150 µL FACS pufera i resuspendovane u 50 µL kozjeg anti-mišjeg IgG konjugovanog sa FITC-om (1/50; DAKO, kat. br. K0078). Sekundarno antitelo je inkubirano tokom 30 minuta na 4°C u mraku. Ćelije i kuglice su isprane dva puta sa 150 µL FACS pufera i resuspendovane u 100 µL FACS pufera. Imunofluorescencija je merena na FACS CantoII uređaju (BD Biosciences)i zabeleženo je 10.000 događaja u okviru vijabilnih ćelija. Srednji intenzitet fluorescencije kuglica za kalibraciju je korišćen za izračunavanje kalibracione krive upotrebom GraphPad Prism kompjuterskog programa (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Za svaku ćelijsku liniju su izračunati kapacitet vezivanja antitela (ABC), kao procena broja AXL molekula koja je eksprimirana na membrane, a koja je izračunata upotrebom srednje vrednosti intenziteta fluorescencije ćelija obojenih AXL antitelom, na osnovu jednačine kalibracione krive (interpolacija nepoznatih vrednosti sa standardne krive je urađena upotrebom GraphPad kompjuterskog programa).
Test citotoksičnosti
[0466] Za ćelije LCLC-103H, A431, MDA-MB-231, NCI-H226, NCI-H661, NCI-H1299, LS174T i SKOV-3, je urađen in vitro test citotoksičnosti, kao što je opisano u Primeru 8. Za Calu-1, test citotoksičnosti je urađen kao što je opisano u Primeru 8, sa prilagođenom dužinom inkubacije ćelija sa 5 na 11 dana. Dozno-zavisne krive su generisane postupkom nelinearne regresije upotrebom GraphPad Prism kompjuterskog programa. Procenat vijabilnih ćelija pri koncentraciji IgGl-AXL-107-vcMMAE od 1 µg/mL je interpolisan iz krive zavisnosti doza.
[0467] Kao što je prikazano na Slici 24, IgG1-AXL-107-vcMMAE je indukovao najsnažniju citotoksičnost u ćelijskim linijama sa visokom ekspresijom AXL-a, dok je citotoksičnost bila niska ili je izostala u ćelijskim linijama sa niskom ekspresijom AXL-a. Slika takođe ilustruje da je IgG1-AXL-107-vcMMAE efikasan u indukciji citotoksičnosti u ćelijama otpornim na EGFR cilјanu terapiju, kao što su Calu-1 ćelije.
Reference
[0468]
[1] Paccez i saradnici, Int. J. Cancer: 134, 1024-1033 (2013)
[2] Leconet i saradnici, Oncogene, 1-10 (2013)
[3] Linger i saradnici, Expert Opin. Ther. Targets, 14(10):1073-1090 (2010)
[4] Li i saradnici, Oncogene, 28, 3442-3455 (2009)
[5] Ye i saradnici, Oncogene, 1-11 (2010)
[6] Alley i saradnici, Current Opinion in Chem. Bio., 4, 529-537 (2010)
[7] lida i saradnici, Anticancer Research, 34:1821-1828 (2014)
[8] WO 2012/175691; INSERM
[9] WO 2012/175692; INSERM
[10] WO 2013/064685; PF Medicament
[11] WO 2013/090776; INSERM
[12] WO 2009/063965; Chugain Pharmaceuticals
[13] WO 2010/131733
[14] Hfizi i saradnici, 2006, FEBS Journal, 273; 5231-5244
[15] WO 2007/059782; Genmab A/S
[16] Ward i saradnici, Nature 341, 544-546 (1989)
[17] Holt et al; Trends Biotechnol.2003 Nov;21(11):484-90
[18] Revets et al; Expert Opin Biol Ther.2005 Jan;5(1):111-24
[19] Bird i saradnici, Science 242, 423-426 (1988)
[20] Huston i saradnici, PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)
[21] Fundamental Immunology Ch.7 (Paul W., ur., 2.izd. Raven Press, N.Y. (1989)
[22] Lefranc MP. i saradnici, Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999
[23] Brochet X. Nucl. Acids Res.36, W503-508 (2008)
[24] Korshunov i saradnici, Clinical Science, 2012
[25] Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pog.15
[26] Kabat, E.A. i saradnici, Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No.91-3242, pp 662,680,689 (1991) [27] WO 2004/010957; Seattle Genetics, Inc.
[28] US 7,659,241; Seattle Genetics, Inc.
[29] Wu i saradnici, Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)
[30] WO 2011/131746; Genmab A/S
[31] WO/2002/020039; Trion Pharma/Fresenius Biotech
[32] WO9850431; Genetech
[33] WO2011117329; Roche
[34] EP1870459; Amgen
[35] WO2009089004; Amgen
[36] US201000155133; Chugai
[37] WO2010129304; Oncomed
[38] WO2007110205; EMD Serono
[39] WO 2010/015792; Regeneron
[40] WO11143545; Pfizer/Rinat
[41] WO2012058768: Zymeworks/Merck
[42] WO2011028952; Xencor
[43] WO 2009/080254; Roche
[44] WO2008003116; F-Star
[45] US 7,262,028; Crucell/Merus
[46] US 7,612,181; Abbott
[47] WO20100226923; Unilever, Sanofi Aventis
[48] US7,951,918; Biogen Idec
[49] CN 102250246; Changzhou Adam Biotech Inc
[50] WO2012025525; Roche
[51] WO2012025530; Roche
[52] WO2008157379; Macrogenics
[53] WO2010/080538; Macrogenics
[54] Goodman i saradnici, Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8th Ed., Macmillan Publishing Co., 1990
[55] Vitetta, Immunol. Today 14, 252 (1993)
[56] US 5,194,594
[57] US 2005/0238649
[58] WO 2013/173391; Concortis Biosystems, Corp.
[59] Junghans i saradnici, u Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2. izdanje, Chafner i Longo, ur., Lippincott Raven (1996))
[60] US 4,681,581
[61] US 4,735,210
[62] US 5,101,827
[63] US 5,102,990
[64] US 5,648,471
[65] US 5,697,902
[66] US 4,766,106
[67] US 4,179,337
[68] US 4,495,285
[69] US 4,609,546
[70] Hunter i saradnici, Nature 144, 945 (1962), David i saradnici, Biochemistry 13, 1014 (1974) [71] Pain i saradnici, J. Immunol. Meth.40, 219 (1981)
[72] Nygren, J. Histochem. and Cytochem.30, 407 (1982)
[73] Antibody Engineering Handbook, ur. Osamu Kanemitsu, objavljeno kod Chijin Shokan (1994) [74] WO 2002/083180; Syngenta BV
[75] WO 2004/043493; Syngenta BV
[76] WO 2007/018431; Syngenta BV
[77] WO 2007/089149; Syngenta BV
[78] WO 2009/017394; Syngenta BV
[79] WO 2010/62171; Syngenta BV
[80] US 6,989,452; Medarex
[81] Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. izdanje, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995
[82] Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ur., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
[83] Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)
[84] US 6,077, 835
[85] WO 00/70087
[86] Schakowski i saradnici, Mol Ther 3, 793-800 (2001)
[87] WO 00/46147
[88] Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986)
[89] Wigler i saradnici, Cell 14, 725 (1978)
[90] Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)
[91] US 5,589,466
[92] US 5,973,972
[93] Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989)
[94] F. Ausubel i saradnici, izd. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)
[95] Grant i saradnici, Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)
[96] Lonberg, N. i saradnici, Nature 368, 856859 (1994)
[97] Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49101 (1994)
[98] Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol.136593 (1995)
[99] Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764536546 (1995)
[100] Taylor, L. i saradnici, Nucleic Acids Research 20, 62876295 (1992)
[101] Chen, J. i saradnici, International Immunology 5, 647656 (1993)
[102] Tuaillon i saradnici, J. Immunol.152, 29122920 (1994)
[103] Taylor, L. i saradnici, International Immunology 6, 579591 (1994)
[104] Fishwild, D. i saradnici, Nature Biotechnology 14, 845851 (1996)
[105] US 5,545,806
[106] US 5,569,825
[107] US 5,625,126
[108] US 5,633,425
[109] US 5,789,650
[110] US 5,877,397
[111] US 5,661,016
[112] US 5,814,318
[113] US 5,874,299
[114] US 5,770,429
[115] US 5,545,807
[116] WO 98/024884
[117] WO 94/025585
[118] WO 93/001227
[119] WO 92/022645
[120] WO 92/003918
[121] WO 01/009187.
[122] Shieh, Neoplasia 2005
[123] Koorstra, Cancer Biol Ther 2009
[124] Hector, Cancer Biol Ther 2010
[125] Sun, Ann Oncol 2003
[126] Srivastava (ur.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988), Chase
[127] "Medical Applications of Radioisotopes," u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, Gennaro i saradnici (ur.), pp.624-652 (Mack Publishing Co., 1990)
[128] Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto i saradnici (ur.) (Chapman & Hall 1993)
[129] US 5,057,313
[130] US 6,331,175
[131] US 5,635,483
[132] US 5,780,588
[133] Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother.45(12): 3580-3584
[134] US5663149
[135] Pettit i saradnici (1998) Antimicrob. Agents and Chemother.42:2961-2965
[136] Senter i saradnici, Proceedings of the American Association for Cancer Research. Volume 45, broj apstrakta 623, prezentovan 28. marta 2004.
[137] US 2005/0238649
[138] US 7,498,298; Seattle Genetics, Inc.
[139] US 2009/0047296; Seattle Genetics, Inc.
[140] WO 2005/081711; Seattle Genetics, Inc.
[141] Kozak i saradnici (1999) Gene 234: 187-208
[142] EP 2220131; U3 Pharma
[143] WO 2011/159980; Genentech
[144] Barbas, CF. J Mol Biol.1993 Apr 5;230(3):812-23
[145] US 7,829,531; Seattle Genetics, Inc.
[146] US 7,851,437; Seattle Genetics, Inc.
[147] US 2008-0035001; Seattle Genetics, Inc.
[148] WO 2013/173392; Concortis Biosystems, Corp.
[149] WO 2013/173393; Concortis Biosystems, Corp.
[150] Sun i saradnici (2005) Bioconjugate Chem.16: 1282-1290
[151] McDonagh i saradnici (2006) Protein Eng. Design Sel.19: 299-307
[152] Alley i saradnici (2008) Bioconjugate Chem.19: 759-765

Claims (49)

  1. Patentni zahtevi 1. Antitelo koje se vezuje za AXL, pri čemu - antitelo nije u kompeticiji sa ligandom specifičnim za zaustavljanje rasta tipa 6 (Gas6) pri vezivanju za AXL i - antitelo obuhvata najmanje jedan region za vezivanje, koji obuhvata region varijabilnog teškog (VH) i region (VL) varijabilnog lakog lanca izabranog iz grupe koja obuhvata; a) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37, i 38, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS, i 40, redom, [107]; b) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 93, 94, i 95, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 96, GAS, i 97, redom, [613]; c) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 98, 99, i 100, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 101, DAS, i 102, redom, [613-08]; d) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 93, 94, i 95, redom, i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 128, XAS, pri čemu X je D ili G, i 129, redom, [613 / 613-08]; i e) VH region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.:93, 126, i 127, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 96, GAS, i 97, redom [613 / 608-01 / 610-01 / 620-06].
  2. 2. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo obuhvata varijabilni region (VH) teškog lanca i varijabilni region (VL) lakog lanca sa najviše 10 mutacija ili supstitucija, najviše 5 mutacija ili supstitucija, kao što je najviše 4 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 3 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 2 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 1 mutacija ili supstitucija, duž navedenog VH regiona i navedenog VL regiona, pri čemu su VH region i VL region izabrani iz grupe koju čine; a) VH region koji obuhvata SEQ ID No: 1 i VL region koji obuhvata SEQ ID No: 2 [107]; b) VH region koji obuhvata SEQ ID No: 25 i VL region koji obuhvata SEQ ID No: 26 [613]; c) VH region koji obuhvata SEQ ID No:21 i VL region koji obuhvata SEQ ID No:22 [608-01]; d) VH region koji obuhvata SEQ ID No:23 i VL region koji obuhvata SEQ ID No:24 [610-01]; e) VH region koji obuhvata SEQ ID No:27 i VL region koji obuhvata SEQ ID No:28 [613-08]; i f) VH region koji obuhvata SEQ ID No:29 i VL region koji obuhvata SEQ ID No:30 [620-06].
  3. 3. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu najmanje jedan region za vezivanje obuhvata VH region i VL region izabran iz grupe koja obuhvata; a) VH region koji obuhvata SEQ ID No: 1 i VL region koji obuhvata SEQ ID No: 2 [107]; b) VH region koji obuhvata SEQ ID No: 25 i VL region koji obuhvata SEQ ID No: 26 [613]; c) VH region koji obuhvata SEQ ID No:21 i VL region koji obuhvata SEQ ID No:22 [608-01]; d) VH region koji obuhvata SEQ ID No:23 i VL region koji obuhvata SEQ ID No:24 [610-01]; e) VH region koji obuhvata SEQ ID No:27 i VL region koji obuhvata SEQ ID No:28 [613-08]; i f) VH region koji obuhvata SEQ ID No:29 and a VL region koji obuhvata SEQ ID No:30 [620-06].
  4. 4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde najmanje jedan region za vezivanje obuhvata VH region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 36, 37, u 38, redom; i VL region koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence SEQ ID Nos.: 39, GAS, i 40, redom [107].
  5. 5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu antitelo obuhvata varijabilni region (VH) teškog lanca i varijabilni region (VL) lakog lanca sa najviše 10 mutacija ili supstitucija, najviše 5 mutacija ili supstitucija, kao što je najviše 4 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 3 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 2 mutacije ili supstitucije, kao što je najviše 1 mutacija ili supstitucija, duž navedenog VH regiona i navedenog VL regiona, pri čemu VH region obuhvata SEQ ID No: 1 i VL region obuhvata SEQ ID No: 2 [107].
  6. 6. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde najmanje jedan region za vezivanje obuhvata VH region koji obuhvata SEQ ID No: 1 i VL region koji obuhvata SEQ ID No: 2 [107].
  7. 7. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu i) maksimalno vezivanje antitela za AXL u prisustvu Gas6 je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 97%, kao što je najmanje 99%, kao što je 100% od vezivanja u odsustvu Gas6 , što je određeno postupkom prikazanim u Primeru 2; ii) maksimalno vezivanje antitela za AXL u prisustvu Gas6 je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 97%, kao što je najmanje 99%, kao što je najmanje 100%, od vezivanja u odsustvu Gas6, kao što je određeno testom kompeticije, pri čemu je kompeticija između vezivanja navedenog antitela za AXL i navedenog Gas6 određena na A431 ćelijama preinkubiranim sa Gas6 i bez Gas6; iii) navedeno antitelo karakteriše afinitet vezivanja (KD) za humani AXL u opsegu od 0.3x10<-9>do 63x10<-9>M, a pri čemu je pomenuti afinitet vezivanja izmeren korišćenjem Interferometrije Bio-sloja korišćenjem rastvorljivog AXL vanćelijskog domena; i/ili iV) pomenuto antitelo karakteriše brzina disocijacije od 9.7x10<-5>do 4.4x10<-3>s<-1>sa AXL-a, i pri čemu je brzina disocijacije izmerena Interferometrijom Bio sloja korišćenjem rastvorljivog rekombinovanog AXL vanćelijskog domena.
  8. 8. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je AXL humani AXL kao što je naznačeno u SEQ ID NO:130 i/ili AXL makaki majmuna kao što je naznačeno u SEQ ID NO:147.
  9. 9. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu se pomenuto antitelo vezuje za epitop u Ig1-sličnom domenu AXL, pomenuti epitop obuhvata ili zahteva jednu ili više aminokiselina koje odgovaraju položajima L121 do Q129 ili T112 do Q124 humanog AXL.
  10. 10. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu pomenuto antitelo obuhvata teški lanac izotipa izabranog iz grupe koja obuhvata IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4.
  11. 11. Antitelo prema zahtevu 10, pri čemu je izotip IgG1, opciono alotipa IgG1m(f).
  12. 12. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje je monoklonsko antitelo pune dužine, kao što je monoklonsko IgG1,κ antitelo pune dužine.
  13. 13. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu pomenuto antitelo je antitelo koje je deficijentno za efektorsku fukciju, stabilizovano IgG4 antitelo ili monovalentno antitelo.
  14. 14. Antitelo prema zahtevu 13, pri čemu je pomenuti teški lanac modifikovan tako da je delecijom uklonjen čitav zglobni region.
  15. 15. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je pomenuto antitelo jednolančano antitelo.
  16. 16. Bispecifično antitelo koje obuhvata prvi vezujući region antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva, i drugi vezujući region koji se vezuje za različit ciljni molekul ili epitop u odnosu na prvi vezujući region.
  17. 17. Bispecifično antitelo prema zahtevu 16, pri čemu pomenuto bispecifično antitelo obuhvata prvi i drugi teški lanac, svaki od navedenog prvog i drugog teškog lanca obuhvata najmanje region zgloba, CH2 i CH3 region, pri čemu je u pomenutom prvom teškom lancu supstituisana najmanje jedna od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama izabranim iz grupe koja obuhvata K409, T366, L368, K370, D399, F405, i Y407 u teškom lancu humanog IgG1, dok je u pomenutom drugom teškom lancu supstituisana najmanje jedna od aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama izabranim iz grupe koja obuhvata F405, T366, L368, K370, D399, Y407, i K409 u humanom IgG1 teškom lancu, i pri čemu pomenute supstitucije pomenutih prvih i pomenutih drugih teških lanaca nisu na istim pozicijama.
  18. 18. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 16 do 17, pri čemu aminokiselina u položaju koji odgovara K409 u humanom IgG1 teškom lancu je R u pomenutom prvom teškom lancu, i aminokiselina na položaju koji odgovara F405 u humanom IgG1 teškom lancu je L u pomenutom drugom teškom lancu, ili obrnuto.
  19. 19. Imunokonjugat koji obuhvata antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 15, ili bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 16 do 18, i terapijski ostatak, kao što je citotoksično sredstvo, hemoterapijski lek, citokin, imunosupresant, antibiotik ili radioizotop.
  20. 20. Imunokonjugat prema zahtevu 19, pri čemu je terapeutski ostatak citotoksično sredstvo.
  21. 21. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 20, pri čemu je pomenuto citotoksično sredstvo je spojeno sa pomenutim antitelom sa linkerom koji je podložan cepanju, kao što je N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)-pentanoat (SSP), maleimidokaproil-valin-citrulin-paminobenziloksikarbonil (mc-vc-PAB) ili AV-1 K-lock valin-citrulin.
  22. 22. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 20, pri čemu je pomenuto citotoksično sredstvo je spojeno sa pomenutim antitelom, ili njegovim fragmentom, sa linkerom koji nije podložan cepanju, kao što je sukcinimidil-4(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (MCC) ili maleimidokaproil (MC).
  23. 23. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 22, pri čemu pomenuto citotoksično sredstvo je izabrano iz grupe: sredstava koja ciljano deluju na DNK, npr. DNK alkilujućih agensa i umreživača, kao što su kaliheamicin, duokaricin, rahelmicin (CC-1065), pirolo[2,1-c][1,4] benzodiazepini (PBDs), i indolinobenzodiazepin (IGN); agenasa koja ciljano deluju na mikrotubule, kao što je duostatin poput duostatina-3, auristatina, kao što je monometilauristatin E (MMAE) i monometilauristatin F (MMAF), dolastatin, maitanzin, N(2’)-deacetil-N -(3-markapto-1-oksopropil)-maitanzin (DM1), i tubulizin; i nukleozidni analozi; ili njihovi analozi, derivati ili prolekovi.
  24. 24. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 23, pri čemu pomenuti imunokonjugat obuhvata kombinaciju; i) navedenog citotoksičnog sredstva i pomenutog linkera koji je podložan cepanju, koga karakteriše kapacitet sporednog ubijanja ćelija; ii) navedenog citotoksičnog sredstva i pomenutog linkera koji je podložan cepanju, koga ne karakteriše kapacitet sporednog ubijanja ćelija; iii) navedenog citotoksičnog sredstva i pomenutog linkera koji nije podložan cepanju, koga karakteriše kapacitet sporednog ubijanja ćelija; ili iv) navedenog citotoksičnog sredstva i pomenutog linkera koji nije podložan cepanju, koga ne karakteriše kapacitet sporednog ubijanja ćelija.
  25. 25. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 21, i 23 do 24, pri čemu je pomenuti linker mc-vc-PAB i citotoksično sredstvo je MMAE; ili je linker SSP i citotoksično sredstvo je DM1.
  26. 26. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 25, pri čemu pomenuti imunokonjugat obuhvata pomenuti linker mc-vc-PAB, pomenuto citotoksično sredstvo je MMAE i pomenuto antitelo obuhvata najmanje jedan region za vezivanje koji obuhvata VH region i VL region izabran iz grupe koja obuhvata; a) VH region koji obuhvata SEQ ID No: 1 i VL region koji obuhvata SEQ ID No: 2 [107]; b) VH region koji obuhvata SEQ ID No: 25 i VL region koji obuhvata SEQ ID No: 26 [613]; c) VH region koji obuhvata SEQ ID No:21 i VL region koji obuhvata SEQ ID No:22 [608-01]; d) VH region koji obuhvata SEQ ID No:23 i VL region koji obuhvata SEQ ID No:24 [610-01]; e) VH region koji obuhvata SEQ ID No:27 i VL region koji obuhvata SEQ ID No:28 [613-08]; i f) a VH region koji obuhvata SEQ ID No:29 i VL region koji obuhvata SEQ ID No:30 [620-06].
  27. 27. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 219, i 21 do 22, pri čemu pomenuti linker je MMC i citotoksično sredstvo je DM1; ili linker je MC i citotoksično sredstvo je MMAF.
  28. 28. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 21 i 23 do 27, pri čemu citotoksično sredstvo je monometil auristatin E (MMAE);
    MMAE je spojen sa antitelom preko valin-citrulinskog (VC) linkera na azotu (N) na levoj strani strukture MMAE.
  29. 29. Imunokonjugat prema zahtevu 28, gde MMAE je povezan sa antitelom preko linkera, koji je valincitrulin-p-aminobenziloksikarbonil (mc-vc-PAB).
  30. 30. Imunokonjugat prema zahtevu 29, pri čemu citotoksično sredstvo monometil auristatin E (MMAE) je spojeno sa antitelom preko valin-citrulinskog (VC) linkera i maleimidokaproilskog (MC) linkera, pri čemu kombinacija citotoksičnog sredstva i linkera ima hemijsku strukturu;
    pri čemu MAt je antitelo.
  31. 31. Kompozicija koja obuhvata antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 15, bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 16 do 18, ili imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 30.
  32. 32. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 15, bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 16 do 18, ili imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 30, i farmaceutski prihvatljivi nosač.
  33. 33. Konstrukt nukleinske kiseline koji kodira antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 15.
  34. 34. Ekspresioni vektor koji obuhvata jedan ili više konstrukata nukleinskih kiselina prema zahtevu 33.
  35. 35. Ćelija domaćina koja obuhvata vektor prema zahtevu 34.
  36. 36. Ćelija domaćina prema zahtevu 35, pri čemu pomenuta ćelija domaćina je rekombinantna ćelija domaćina, kao što je rekombinantna prokariotska, rekombinantna eukariotska, ili rekombinantna mikrobna ćelija domaćina.
  37. 37. Ćelija domaćina prema bilo kom od zahteva 35 do 36, pri čemu ćelija domaćina proizvodi antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 15, ili bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 16 do 18.
  38. 38. Hibridom koji proizvodi antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 15.
  39. 39. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 15, bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 16 do 18, ili imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 30, za upotrebu kao lek.
  40. 40. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 15, bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 16 do 18, ili imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 30, za upotrebu u lečenju kancera.
  41. 41. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 39 do 40, pri čemu je kancer čvrsti tumor koji eksprimira AXL ili hematološki kancer koji eksprimira AXL.
  42. 42. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 41, pri čemu je hematološki kancer izabran iz grupe koja obuhvata leukemiju, kao što je hronična limfocitna leukemija, mijeloidna leukemija, akutna mijeloidna leukemija (AML) i hronična mijeloidna leukemija, limfom kao što je Ne-Hodčkinov limfom i multipli mijelom.
  43. 43. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 41, pri čemu čvrsti tumor koji eksprimira AXL je kancer pluća ili epidermoidni karcionom.
  44. 44. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 41, pri čemu je kancer izabran iz grupe koja obuhvata kolorektalni kancer, kao što je kolorektalni karcionom i kolorektalni adenokarcinom, kancer bešike, kancer kostiju kao što je hondrosarkom, kancer grudi kao što je trostruko negativni kancer grudi, kanceri centralnog nervnog sistema kao što su glioblastom, astrocitom, neuroblastom, cervikalni kancer, kancer vezivnog tkiva, kancer endometrijuma, kancer fibroblasta, kancer želuca kao što je karcinom želuca, kancer glave i vrata, kancer bubrega, kancer jetre kao što je hepatoćelijski karcinom, kancer pluća kao što je NSCLC i karcinom skvamoznih ćelija pluća, kancer mišića, kancer nervnog tkiva, kancer ovarijuma, kancer pankreasa kao što je pankreasni duktalni karcinom i pankreasni adenokarcinom, kancer kože kao što je maligni melanom i sarkom mekih tkiva.
  45. 45. Postupak za proizvodnju antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 15, pomenuti postupak obuhvata korake a) gajenja u kulturi ćelije domaćina prema bilo kom od zahteva 35 do 37 ili hibridoma prema zahtevu 38, i b) prečišćavanja antitela iz medijuma kulture.
  46. 46. Dijagnostička kompozicija koja obuhvata antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 15 ili bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 16 do 18.
  47. 47. Postupak za detekciju prisustva AXL antitela, ili ćelije koja eksprimira AXL, u uzorku koji obuhvata korake; a) dovođenja u kontakt uzorka sa antitelom prema bilo kom od zahteva 1 do 15, bispecifičnog antitela prema bilo kom od zahteva 16 do 18, ili imunokonjugata prema bilo kom od zahteva 20 do 30, pod uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa između antitela, bispecifičnog antitela ili imunokonjugata i AXL; i b) analiziranja da li se kompleks obrazovao.
  48. 48. Komplet za detekciju prisustva AXL antigena, ili ćelije koja eksprimira AXL, u uzorku koji obuhvata i) antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 15, bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 16 do 18, ili imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 19 do 30; i ii) instrukcije za upotrebu navedenog kompleta.
  49. 49. Anti-idiotipsko antitelo koje se vezuje za anti-AXL antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 15.
RS20200253A 2014-07-11 2015-07-10 Antitela koja vezuju axl RS60012B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201400380 2014-07-11
DKPA201400489 2014-09-01
DKPA201400746 2014-12-22
DKPA201500283 2015-05-12
PCT/EP2015/065900 WO2016005593A1 (en) 2014-07-11 2015-07-10 Antibodies binding axl
EP15738884.4A EP3169706B1 (en) 2014-07-11 2015-07-10 Antibodies binding axl

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60012B1 true RS60012B1 (sr) 2020-04-30

Family

ID=53673928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200253A RS60012B1 (sr) 2014-07-11 2015-07-10 Antitela koja vezuju axl

Country Status (27)

Country Link
US (6) US10512688B2 (sr)
EP (2) EP3763738A1 (sr)
JP (3) JP6701162B2 (sr)
KR (2) KR20230146665A (sr)
CN (2) CN114621347B (sr)
AU (3) AU2015286569B2 (sr)
CA (1) CA2952758A1 (sr)
CY (1) CY1122721T1 (sr)
DK (1) DK3169706T3 (sr)
EA (1) EA201790173A1 (sr)
ES (1) ES2774428T3 (sr)
HR (1) HRP20200283T1 (sr)
HU (1) HUE048667T2 (sr)
IL (2) IL296633A (sr)
LT (1) LT3169706T (sr)
ME (1) ME03665B (sr)
MX (1) MX370807B (sr)
NZ (1) NZ728019A (sr)
PL (1) PL3169706T3 (sr)
PT (1) PT3169706T (sr)
RS (1) RS60012B1 (sr)
SG (2) SG10202006715SA (sr)
SI (1) SI3169706T1 (sr)
SM (1) SMT202000265T1 (sr)
UA (1) UA127198C2 (sr)
WO (1) WO2016005593A1 (sr)
ZA (1) ZA201608609B (sr)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL296633A (en) 2014-07-11 2022-11-01 Genmab As Antibodies that bind axl
CA2991805A1 (en) * 2015-07-10 2017-01-19 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
JP2019505520A (ja) 2016-01-13 2019-02-28 ゲンマブ エー／エス 抗体およびその薬物コンジュゲートの製剤
KR102606938B1 (ko) 2016-04-15 2023-11-29 바이오아트라, 인코퍼레이티드 항 Axl항체 및 이의 면역접합체와 이것들의 용도
US11306153B2 (en) 2016-05-20 2022-04-19 Agency For Science, Technology And Research Anti-AXL tyrosine kinase receptor antibodies and uses thereof
CN109311858B (zh) 2016-05-26 2021-12-03 里科瑞尔姆Ip控股有限责任公司 Egfr抑制剂化合物
WO2018007592A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Genmab A/S New dosage regimens for antibody drug conjugates based on anti-axl antibodies
SG10202101958YA (en) * 2016-08-31 2021-03-30 Agency Science Tech & Res Methods for the identification, targeting and isolation of human dendritic cell (dc) precursors "pre-dc" and their uses thereof
CN108285487B (zh) * 2017-01-08 2021-02-19 浙江昭华生物医药有限公司 抗5t4抗体-药物偶联物及其应用
MX393780B (es) 2017-01-17 2025-03-24 Heparegenix Gmbh Inhibidores de proteina cinasa para promover la regeneracion hepatica o reducir o prevenir la muerte de hepatocitos
SG11202002331QA (en) * 2017-09-13 2020-04-29 Nat Res Council Canada Axl-specific antibodies and uses thereof
CN107987163B (zh) * 2017-12-04 2018-11-20 杭州尚健生物技术有限公司 单克隆抗体9a及其应用
MA52657A (fr) * 2018-04-10 2021-02-17 Genmab As Anticorps spécifiques d'axl pour le traitement du cancer
CN110483639A (zh) * 2018-05-15 2019-11-22 复旦大学 靶向axl的抗体及抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
CA3104390A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Genmab A/S Method for producing a controlled mixture of two or more different antibodies
EP3856783A1 (en) * 2018-09-26 2021-08-04 Genmab A/S Axl-specific antibodies for treatment of non-small cell lung cancer
AU2019372436A1 (en) * 2018-11-01 2021-05-20 Merck Patent Gmbh Methods of administering anti-TIM-3 antibodies
US20220308062A1 (en) * 2019-05-07 2022-09-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for predicting drug responsiveness in samples from cancer subjects
WO2021013746A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 Genmab A/S Axl antibody-drug conjugates for use in treating cancer
CN112898414B (zh) * 2019-12-04 2024-05-10 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 抗人巨细胞病毒抗体及其用途
US20230090552A1 (en) 2020-01-08 2023-03-23 Synthis Therapeutics, Inc. Alk5 inhibitor conjugates and uses thereof
US20230303675A1 (en) * 2020-08-19 2023-09-28 Pharmabcine Inc. Modified antibody and method for manufacturing same
KR102549520B1 (ko) 2021-01-29 2023-07-03 일리미스테라퓨틱스 주식회사 비염증성 식세포작용 유도 활성을 갖는 융합분자
WO2022261846A1 (zh) * 2021-06-16 2022-12-22 上海鑫湾生物科技有限公司 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用
EP4359439A1 (en) 2021-06-24 2024-05-01 Yeda Research and Development Co. Ltd Combination therapy for the treatment of cancer comprising an anti-egfr antibody and an axl-inhibitor
US20260042848A1 (en) * 2022-08-18 2026-02-12 BioLegend, Inc. Anti-axl antibodies, antigen-binding fragments thereof and methods for making and using the same
PL446349A1 (pl) * 2023-10-11 2025-04-14 Celon Pharma Spółka Akcyjna Przeciwciała bispecyficzne anty-AXL i anty-PD-L1 oraz ich zastosowanie w terapii, zwłaszcza w leczeniu nowotworu

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
ATE172879T1 (de) 1989-08-09 1998-11-15 Rhomed Inc Direkte radioetikettierung von antikörpern und sonstigen proteinen mittels technetium oder rhenium
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5194594A (en) 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
JPH06508880A (ja) 1991-07-08 1994-10-06 ユニバーシティ　オブ　マサチューセッツ　アット　アムハースト サーモトロピック液晶セグメント化ブロックコポリマー
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
DE60013773T2 (de) 1999-02-03 2005-11-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Methoden zur Herstellung von therapeutischen Kalziumphosphat Partikeln
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
IL147765A0 (en) 1999-07-29 2002-08-14 Medarex Inc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO HER2/neu
DE10043437A1 (de) 2000-09-04 2002-03-28 Horst Lindhofer Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen Antikörpern zur Behandlung von malignem Aszites
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US7129261B2 (en) 2001-05-31 2006-10-31 Medarex, Inc. Cytotoxic agents
PT2314629E (pt) 2002-07-18 2014-01-22 Merus B V Produção recombinante de misturas de anticorpos
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
WO2004043493A1 (en) 2002-11-14 2004-05-27 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
CN107213469A (zh) 2003-11-06 2017-09-29 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
US7741568B2 (en) 2005-01-13 2010-06-22 The Wiremold Company Downward facing receptacle assembly for cable raceway
TWI671403B (zh) 2005-03-31 2019-09-11 中外製藥股份有限公司 控制組裝之多肽的製造方法
CA2617907A1 (en) 2005-08-05 2007-02-15 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers and conjugates comprising the same
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AU2006317242A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
CN101415679A (zh) 2006-02-02 2009-04-22 辛塔佳有限公司 水溶性cc-1065类似物及其缀合物
GEP20135917B (en) 2006-03-17 2013-09-10 Biogen Idec Inc Stabilized polypeptide compositions
ES2395969T3 (es) 2006-03-24 2013-02-18 Merck Patent Gmbh Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
EP2070956A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Total Petrochemicals Research Feluy Process for the production of a bimodal polypropylene having low ash content
ES2702087T3 (es) 2007-06-21 2019-02-27 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y sus usos
WO2009017394A1 (en) 2007-08-01 2009-02-05 Syntarga B.V. Substituted cc-1065 analogs and their conjugates
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
TW200936160A (en) 2007-11-15 2009-09-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Monoclonal antibodies that bind to anexelekto and uses thereof
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
WO2010015792A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Argenta Discovery Limited Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors
JP5397668B2 (ja) 2008-09-02 2014-01-22 ソニー株式会社 記憶素子および記憶装置
CA2742568C (en) 2008-11-03 2017-09-26 Syntarga B.V. Novel cc-1065 analogs and their conjugates
SG172254A1 (en) 2008-12-19 2011-07-28 Macrogenics Inc Covalent diabodies and uses thereof
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
CN102459344A (zh) * 2009-05-15 2012-05-16 中外制药株式会社 抗axl抗体
AR077595A1 (es) * 2009-07-27 2011-09-07 Genentech Inc Tratamientos de combinacion
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US9074192B2 (en) 2010-01-22 2015-07-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Inhibition of AXL signaling in anti-metastatic therapy
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
PL2560993T3 (pl) 2010-04-20 2024-11-04 Genmab A/S Heterodimeryczne białka zawierające region FC przeciwciała i sposoby ich wytwarzania
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
WO2011159980A1 (en) 2010-06-18 2011-12-22 Genentech, Inc. Anti-axl antibodies and methods of use
RU2013110876A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Рош Гликарт Аг Активируемые биспецифические антитела
RU2013110875A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СОДЕРЖАЩИЕ СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ ДИСУЛЬФИДОМ ФРАГМЕНТ Fv
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
WO2012175692A1 (en) 2011-06-22 2012-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-axl antibodies and uses thereof
JP6033293B2 (ja) 2011-06-22 2016-11-30 インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル）Ｉｎｓｅｒｍ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｌａ Ｓａｎｔｅ Ｅｔ Ｄｅ Ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ） 抗Ａｘｌ抗体及びその使用
EP2589609A1 (en) 2011-11-03 2013-05-08 Pierre Fabre Medicament Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
US9879061B2 (en) 2011-12-15 2018-01-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Inhibition of AXL/GAS6 signaling in the treatment of liver fibrosis
HK1208216A1 (en) 2012-05-15 2016-02-26 Concortis Biosystems, Corp Drug-conjugates, conjugation methods, and uses thereof
US9624308B2 (en) 2012-11-05 2017-04-18 Pierre Fabre Medicament Antigen binding proteins
WO2014174111A1 (en) 2013-04-26 2014-10-30 Pierre Fabre Medicament Axl antibody-drug conjugate and its use for the treatment of cancer
GB201410825D0 (en) 2014-06-18 2014-07-30 Bergenbio As Anti-axl antibodies
IL296633A (en) 2014-07-11 2022-11-01 Genmab As Antibodies that bind axl
ES2764299T3 (es) 2014-12-09 2020-06-02 Inst Nat Sante Rech Med Anticuerpos monoclonales humanos contra AXL
CA2991805A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment

Also Published As

Publication number Publication date
US10201607B2 (en) 2019-02-12
PL3169706T3 (pl) 2020-05-18
US20170157250A1 (en) 2017-06-08
CN107074948A (zh) 2017-08-18
EP3169706A1 (en) 2017-05-24
EP3169706B1 (en) 2019-12-04
SG11201610777VA (en) 2017-01-27
CY1122721T1 (el) 2021-03-12
DK3169706T3 (da) 2020-03-09
SI3169706T1 (sl) 2020-04-30
US10765743B2 (en) 2020-09-08
UA127198C2 (uk) 2023-06-07
IL249512B (en) 2022-10-01
KR102586656B1 (ko) 2023-10-11
AU2021205074A1 (en) 2021-08-12
CN114621347B (zh) 2026-03-17
SMT202000265T1 (it) 2020-07-08
MX2016016881A (es) 2017-03-27
HUE048667T2 (hu) 2020-08-28
SG10202006715SA (en) 2020-08-28
EP3763738A1 (en) 2021-01-13
ES2774428T3 (es) 2020-07-21
US10500276B2 (en) 2019-12-10
BR112017000316A2 (pt) 2017-10-31
MX370807B (es) 2020-01-08
CN114621347A (zh) 2022-06-14
JP2017522871A (ja) 2017-08-17
AU2015286569A1 (en) 2017-02-02
LT3169706T (lt) 2020-03-25
KR20230146665A (ko) 2023-10-19
CA2952758A1 (en) 2016-01-14
US20190275149A1 (en) 2019-09-12
ME03665B (me) 2020-10-20
NZ766128A (en) 2024-07-05
JP2020141682A (ja) 2020-09-10
CN107074948B (zh) 2022-01-28
IL249512B2 (en) 2023-02-01
US10512688B2 (en) 2019-12-24
JP2024026158A (ja) 2024-02-28
US20200171152A1 (en) 2020-06-04
HRP20200283T1 (hr) 2020-05-29
NZ728019A (en) 2022-09-30
ZA201608609B (en) 2020-12-23
IL296633A (en) 2022-11-01
AU2015286569B2 (en) 2021-04-15
KR20170030585A (ko) 2017-03-17
US20190160170A1 (en) 2019-05-30
US20180214549A1 (en) 2018-08-02
AU2025201717A1 (en) 2025-03-27
WO2016005593A1 (en) 2016-01-14
IL249512A0 (en) 2017-02-28
NZ766131A (en) 2024-07-05
JP6701162B2 (ja) 2020-05-27
PT3169706T (pt) 2020-03-13
AU2021205074B2 (en) 2024-12-12
EA201790173A1 (ru) 2017-06-30
US20240091352A1 (en) 2024-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022259847B2 (en) AXL-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
AU2021205074B2 (en) Antibodies binding AXL
HK40076909A (en) Antibodies binding axl
HK40045319A (en) Antibodies binding axl
HK1238271A1 (en) Antibodies binding axl
HK1238271B (en) Antibodies binding axl
HK1255412B (en) Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment