JP7016168B2 - 歯周炎治療薬及び歯周炎治療用組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、歯周炎治療薬及び歯周炎治療用組成物に関する。本願は、２０１６年７月２６日に、日本に出願された特願２０１６－１４６５９３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
成人の約８割が罹患しているとされる歯周病は、歯肉炎と歯周炎に分けられる。歯肉炎は細菌を原因とする疾患であり、治療することができる。一方、歯周炎は最終的に歯が抜け落ちてしまう疾患であり、有効な治療法が確立されていない。
従来、歯周炎は口腔常在菌による感染症であると考えられ、菌を除去する治療が続けられてきた。しかしながら、抜歯の約４０％が歯周炎によるものであり、歯周炎の克服にはまだまだ長い道のりが残されている（例えば、非特許文献１を参照）。
ところで、コラーゲンは細胞組織を支えるタンパク質であり、皮膚や骨等の生体組織の形成において重要な役割を果たしている。コラーゲンは、歯周組織の形成にも関与しており、歯肉及び歯根膜組織のコラーゲン線維が炎症によって破壊されると、歯と歯槽骨との結合組織性付着が喪失し、歯の脱落が起こる。発明者らは以前に、歯周組織におけるコラーゲンの分解をインビボに近い条件で、インビトロにおいて評価することができる三次元培養系を開発した（特許文献１を参照）。
特許第５６７９１４０号公報
大島 光宏、山口 洋子、歯周炎薬物治療のパラダイムシフト、Folia pharmacologica Japonica 141(6)、314-320、2013.
本発明は、歯周炎を効果的に治療することができる歯周炎治療薬を提供することを目的とする。
本発明は以下の通りである。
（１）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）シグナル阻害剤を有効成分として含有する歯周炎治療薬。
（２）前記ＨＧＦシグナル阻害剤が、ＨＧＦ特異的結合物質、ＨＧＦ発現阻害剤、ＨＧＦ活性化酵素特異的結合物質、ＨＧＦ活性化酵素発現阻害剤、ＨＧＦ活性化酵素阻害剤、ｃ－Ｍｅｔ特異的結合物質、ｃ－Ｍｅｔ発現阻害剤及びｃ－Ｍｅｔ阻害剤からなる群より選択される、（１）に記載の歯周炎治療薬。
（３）（１）又は（２）に記載の歯周炎治療薬及び薬学的に許容可能な担体を含む歯周炎治療用組成物。
本発明によれば、歯周炎を効果的に治療することができる歯周炎治療薬を提供することができる。
（ａ）～（ｄ）は、歯肉線維芽細胞のコラーゲンゲル三次元培養系を説明する図である。 （ａ）～（ｈ）は、実験例１においてインキュベートした各コラーゲンゲルを撮影した写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１におけるコラーゲンゲルの薄切切片のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す顕微鏡写真である。 実験例２におけるコラーゲンの定量結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例３においてインキュベート後回収した各コラーゲンゲルを撮影した写真である。 （ａ）～（ｆ）は、実験例４においてインキュベートした各コラーゲンゲルを撮影した写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例４におけるコラーゲンゲルの薄切切片のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す顕微鏡写真である。
［コラーゲンゲル三次元培養系］
まず、発明者らが以前に開発した、歯肉線維芽細胞のコラーゲンゲル三次元培養系について図１（ａ）～（ｄ）を参照しながら説明する。この培養系は、歯周組織におけるコラーゲンの分解に対する被験物質の影響をインビトロにおいて評価することができ、インビボに近い結果を得ることができるものである。
まず、図１（ａ）に示すように、コラーゲンゲルの中に歯周炎患者由来の歯肉線維芽細胞及び被験物質を添加し、シャーレに注ぐ。続いて、３７℃で３０分インキュベートし、コラーゲンゲルを硬化させる。続いて、硬化したコラーゲンゲル上に歯周炎患者由来の歯肉上皮細胞を播種し、一晩インキュベートする。
続いて、図１（ｂ）に示すように、シャーレからコラーゲンゲルを剥がして浮かせる。この際、コラーゲンゲルを浮かべる培地中にも被験物質を添加する。続いて、５日間浮遊培養を継続する。この間に、歯肉線維芽細胞と歯肉上皮細胞との相互作用により産生される各種因子によってコラーゲンゲルが分解され収縮する。また、培地中に添加した被験物質によっては、上記の歯肉線維芽細胞及び歯肉上皮細胞の活動に影響を与え、その結果コラーゲンゲルの分解量が変化する。
続いて、図１（ｃ）に示すように、浮遊培養５日目に、残存するコラーゲン量を定量する。あるいは、この段階でゲルを籠の上に載せて表面を空気に曝して、歯肉上皮細胞の重層化を行ってもよい。
続いて、図１（ｄ）に示すように、１０％ホルマリン中にゲルを入れて固定する。このゲルは、パラフィン包埋して薄切切片を作製し、各種染色及び顕微鏡観察することができる。
以上のようにして、歯肉線維芽細胞をコラーゲンゲル三次元培養することができる。また、コラーゲンの分解に対する被験物質の影響を評価することができる。
［歯周炎治療薬］
１実施形態において本発明は、ＨＧＦシグナル阻害剤を有効成分として含有する歯周炎治療薬を提供する。
発明者らは、上述したコラーゲンゲル三次元培養系を用いて、歯周炎患者の歯周組織におけるコラーゲン分解に影響を与える物質をスクリーニングした。その結果、実施例において後述するように、ＨＧＦシグナル阻害剤が、コラーゲンゲル三次元培養系におけるコラーゲンの分解を顕著に抑制することを見出した。この結果は、インビボにおいても、ＨＧＦシグナル阻害剤が、歯周炎患者の歯周組織におけるコラーゲンの分解を顕著に抑制することを示す。
したがって、本実施形態の歯周炎治療薬によれば、歯周炎を効果的に治療することができる。現在、歯周炎の有効な治療法は確立されていないが、本実施形態の歯周炎治療薬によれば、生物学的な根拠に基づいた分子標的薬による歯周炎の治療が可能となる。
ＨＧＦのシグナルは次のようにして伝達される。まず、ＨＧＦのプロフォーム（１本鎖型）が、ＨＧＦアクチベーター、ウロキナーゼ、カテプシンＧ等のセリンプロテアーゼ（ＨＧＦ活性化酵素）により活性化されて２本鎖型となる。続いて、ＨＧＦがその受容体であるｃ－Ｍｅｔに結合してｃ－Ｍｅｔの２量体が形成される。続いて、ｃ－Ｍｅｔの細胞内ドメインのチロシン残基の自己リン酸化を起点として一連のシグナルが伝達される。
ＨＧＦシグナル阻害剤としては、上記の一連のシグナル伝達経路をいずれかの段階で遮断する物質であれば特に制限されず用いることができる。ＨＧＦシグナル阻害剤としては、例えば、ＨＧＦ特異的結合物質、ＨＧＦ発現阻害剤、ＨＧＦ活性化酵素特異的結合物質、ＨＧＦ活性化酵素発現阻害剤、ＨＧＦ活性化酵素阻害剤、ｃ－Ｍｅｔ特異的結合物質、ｃ－Ｍｅｔ発現阻害剤、ｃ－Ｍｅｔ阻害剤等が挙げられる。
（特異的結合物質）
ＨＧＦ特異的結合物質としては、上述したＨＧＦのプロフォームに特異的に結合し上述したＨＧＦ活性化酵素によるＨＧＦの活性化を阻害するもの、ＨＧＦに特異的に結合しＨＧＦとｃ－ＭＥＴとの結合を阻害するもの、ＨＧＦに特異的に結合しｃ－ＭＥＴの下流へのシグナル伝達を遮断するもの等が挙げられる。
また、ＨＧＦ活性化酵素特異的結合物質としては、上述した、ＨＧＦアクチベーター、ウロキナーゼ、カテプシンＧ等のＨＧＦ活性化酵素に特異的に結合しＨＧＦの活性化を阻害するもの等が挙げられる。
また、ｃ－Ｍｅｔ特異的結合物質としては、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合しＨＧＦとｃ－ＭＥＴとの結合を阻害するもの、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合しｃ－ＭＥＴの下流へのシグナル伝達を遮断するもの等が挙げられる。
ここで、特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に、ＨＧＦタンパク質、ＨＧＦ活性化酵素、ｃ－Ｍｅｔタンパク質又はそれらの断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、市販の抗体であってもよい。
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
より具体的なＨＧＦ特異的結合物質としては、例えば、ヒト化抗体（型式「ＡＶ２９９」、別名「フィクラツズマブ（ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）」、アベオ・オンコロジー社）、ヒト抗体（型式「ＡＭＧ１０２」、別名「リロツムマブ（ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）」、アムジェン社）、特開２００６－１４９３０２号公報に記載された核酸アプタマー等が挙げられる。
また、より具体的なＨＧＦ活性化酵素特異的結合物質としては、例えば、国際公開第２０１１／０４９８６８号に記載された抗ＨＧＦアクチベーター（ＨＧＦＡ）抗体等が挙げられる。ＨＧＦ活性化酵素特異的結合物質は、ＨＧＦを活性化する、ウロキナーゼ、カテプシンＧ等に対する特異的結合物質であってもよい。
また、より具体的なｃ－Ｍｅｔ特異的結合物質としては、例えば、国際公開第２０１２／０１４８９０号に記載された核酸アプタマー、ｃ－Ｍｅｔの競合的阻害剤（型式「ＮＫ４」、クリングルファーマ株式会社）等が挙げられる。なお、ＮＫ４はＨＧＦに対する競合的アンタゴニストである。
（発現阻害剤）
発現阻害剤としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、低分子化合物、ＨＧＦやｃ－Ｍｅｔの発現を阻害する因子等が挙げられる。これらの発現阻害物質を生体に投与することにより、ＨＧＦ、ＨＧＦ活性化酵素、ｃ－Ｍｅｔの発現を阻害することができる。その結果、ＨＧＦシグナルを阻害し、歯周炎を治療することができる。
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１～２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０～９５℃で約１分程度変性させた後、３０～７０℃で約１～８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）は、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に約２０塩基の微小ＲＮＡとなる機能性核酸である。ｍｉＲＮＡは、機能性のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ、非コードＲＮＡ：タンパク質に翻訳されないＲＮＡの総称）に分類されており、他の遺伝子の発現を調節するという、生命現象において重要な役割を担っている。特定の塩基配列を有するｍｉＲＮＡを生体に投与することにより、ＨＧＦ、ＨＧＦ活性化酵素、ｃ－Ｍｅｔの発現を阻害することができる。
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
より具体的なＨＧＦ発現阻害剤としては、例えば、ＨＧＦ特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸、ｍｉＲ－１９９１－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ、バルプロ酸、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β等が挙げられる。
また、より具体的なＨＧＦ活性化酵素発現阻害剤としては、例えば、ＨＧＦ活性化酵素特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸等が挙げられる。
また、より具体的なｃ－Ｍｅｔ発現阻害剤としては、例えば、ｃ－Ｍｅｔ特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸等が挙げられる。
（ＨＧＦ活性化酵素阻害剤）
ＨＧＦ活性化酵素阻害剤とは、ＨＧＦのプロフォーム（１本鎖型）を活性化して２本鎖型に変化させる酵素を阻害する物質である。具体的なＨＧＦ活性化酵素阻害剤としては、例えば、ＨＧＦアクチベーターインヒビター タイプ－１、ＨＧＦアクチベーターインヒビター タイプ－２、ＨＧＦ活性化酵素に対する抗体（例えば、抗ＨＧＦＡ抗体）等が挙げられる。
（ｃ－Ｍｅｔ阻害剤）
ｃ－Ｍｅｔ阻害剤とは、ｃ－Ｍｅｔの下流のシグナル伝達を遮断する低分子化合物である。具体的には、例えば、ＰＨＡ６６５７５２（ＣＡＳ番号：４７７５７５－５６－７）、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ（ＣＡＳ番号：１１７－３９－５）、ＭＳＣ２１５６１１９Ｊ（ＣＡＳ番号：１１００５９８－３０－８）、Ｔｉｖａｎｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ番号：９０５８５４－０２－６）、ＸＬ８８０（ＣＡＳ番号：８４９２１７－６４－７），ＰＦ－０２３４１０６６（ＣＡＳ番号：８７７３９９－５２－５）、漢方方剤の一種である麻黄湯等が挙げられる。
以上に例示したようなＨＧＦシグナル阻害剤を、歯周炎治療薬として用いることができる。
［歯周炎治療用組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した歯周炎治療薬及び薬学的に許容可能な担体を含む歯周炎治療用組成物を提供する。
本実施形態の歯周炎治療用組成物は、経口的に使用される剤型又は非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられる。
薬学的に許容される担体としては、通常製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができ、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
歯周炎治療用組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤等が挙げられる。
歯周炎治療用組成物は、上記の薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
患者への投与は、例えば、歯肉への局所投与が挙げられる。好ましい剤型としては、注射剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられる。歯周炎治療用組成物の投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
例えば歯周炎治療用組成物の剤型が注射剤であり、患者が成人（体重約６０ｋｇ）である場合の１日あたりの投与量としては、例えば、部位あたり約１μｇ～１ｍｇの有効成分（上述した歯周炎治療薬）を局所投与することが挙げられる。歯周炎治療用組成物の投与は、上記の量を１回で投与してもよいし、複数回に分けて投与してもよい。
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、ＨＧＦシグナル阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、歯周炎の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、歯周炎の治療のためのＨＧＦシグナル阻害剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、歯周炎治療薬を製造するためのＨＧＦシグナル阻害剤の使用を提供する。
上記の各実施形態において、ＨＧＦシグナル阻害剤としては、上述したものが挙げられる。
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
コラーゲンゲル三次元培養系を用いて、歯周炎患者由来の歯肉線維芽細胞によるコラーゲンの分解に対するＨＧＦ中和抗体の影響を検討した。
（歯肉線維芽細胞の調製）
歯周外科手術の際に切除され不要となった歯肉片由来の組織を細切後、組織片を細胞培養プレートの底に静置した。続いて、組織片から外生した細胞を第１代として継代培養を行い、ヒト歯肉線維芽細胞を得た。
得られた歯肉線維芽細胞は、一度上述したコラーゲンゲル三次元培養系で培養してコラーゲン分解能を観測し、コラーゲンゲルを極度に分解する（コラーゲンゲルが分解されて収縮した）歯肉線維芽細胞を選別して実験に使用した。コラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞としては、直径３５ｍｍのコラーゲンゲルが直径３ｍｍ程度まで収縮した歯肉線維芽細胞を選別した。
また、コラーゲンゲルの分解能が低い歯肉線維芽細胞（以下、「ノーマルな歯肉線維芽細胞」という場合がある。）を対照に用いた。直径３５ｍｍのコラーゲンゲルの収縮が直径１０ｍｍ程度までに留まった歯肉線維芽細胞をノーマルな歯肉線維芽細胞として用いた。
なお、発明者らの過去の検討により、歯周炎患者の歯肉からは、コラーゲンゲル三次元培養系で培養した場合に、コラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞が得られることが分かっている。一方、健常者の歯肉からはコラーゲンを極度に分解する歯肉線維芽細胞は得られないことが分かっている。
（歯肉上皮細胞の調製）
歯周外科手術の際に切除され、不要となった歯肉片をＤｉｓｐａｓｅ処理した後、結合組織部分から剥離した上皮組織を細切し、組織片をプレートの底に静置した。続いて、組織片から外生した細胞を第１代として継代培養を行い、ヒト歯肉上皮細胞を得た。
（コラーゲンゲルの調製）
セルマトリックスｔｙｐｅＩ－Ａ（新田ゼラチン）、５×ＤＭＥＭ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン）を混合し、コラーゲン混合溶液を作製した。このコラーゲン混合溶液に、ＨＧＦ中和抗体（型式「ＡＢ－２９４－ＮＡ」、Ｒ＆Ｄ社）を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加した。
また、比較のために、被験物質を含まない試料（対照）、ＨＧＦ（型式「１００－３９」、ぺプロテック社）を終濃度２５ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加した試料も作製した。
続いて、これらのコラーゲン混合溶液に、上述したコラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞を混合し、細胞密度２．５×１０５個／ウェルとなるように６ウェルプレートに播種した。続いて、３７℃で３０分間インキュベートしてコラーゲンゲルを硬化させた。
続いて、上述した歯肉上皮細胞をトリプシン処理により分散させた後、上記のコラーゲンゲル上に２×１０５個／ウェルずつ播種し、単層の上皮細胞の層を形成させた。
また、比較のために、コラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞の代わりに、上述したノーマルな歯肉線維芽細胞を使用した点以外は上述したものと同様のコラーゲンゲルも作製した。
（コラーゲンゲルのインキュベート）
続いて、作製した各コラーゲンゲルを３７℃でインキュベートし、２４時間後にコラーゲンゲルをプレートから剥がし、ゲルを浮遊させた（培養１日目）。培地には上述したものと同濃度の各被験物質（ＨＧＦ中和抗体及びＨＧＦ）を添加した。続いて、３７℃でコラーゲンゲルの浮遊培養を継続し、浮遊培養開始後５日目にコラーゲンゲルを観察した。
図２（ａ）～（ｈ）は浮遊培養開始後５日目の各コラーゲンゲルを撮影した写真である。図２（ａ）～（ｈ）において、各ウェルの中に浮遊している塊がコラーゲンゲルである。図２（ａ）～（ｄ）は、コラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞を含むコラーゲンゲルの結果である。また、図２（ｅ）～（ｈ）は、ノーマルな歯肉線維芽細胞を含むコラーゲンゲルの結果である。
また、図２（ａ）及び（ｅ）は、被験物質を含まない試料（対照）の結果であり、図２（ｂ）及び（ｆ）はＨＧＦを終濃度２５ｎｇ／ｍＬとなるように添加した試料の結果であり、図２（ｃ）及び（ｇ）はＨＧＦを終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した試料の結果であり、図２（ｄ）及び（ｈ）はＨＧＦ中和抗体を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加した試料の結果である。
その結果、コラーゲンゲルにＨＧＦを終濃度５０ｎｇ／ｍＬ添加することにより（図２（ｃ））、対照（図２（ａ））と比較して明らかにコラーゲンの分解が促進されることが明らかとなった。
また、コラーゲンゲルにＨＧＦ中和抗体を終濃度２０μｇ／ｍＬ添加することにより、（図２（ｄ））、対照（図２（ａ））と比較してコラーゲンの分解が顕著に抑制されることが明らかとなった。この結果は、ＨＧＦシグナル阻害剤が、インビボにおいても歯周炎患者の歯周組織におけるコラーゲンの分解を抑制することを示す。
一方、図２（ｅ）～（ｈ）においては、いずれのコラーゲンゲルにおいても差は認められなかった。この結果は、ノーマルな歯肉線維芽細胞を含むコラーゲンゲルにＨＧＦ又はＨＧＦ中和抗体を添加しても、コラーゲンの分解に差が生じないことを示す。
（コラーゲンゲルの薄切切片の顕微鏡観察）
続いて、図２（ａ）及び図２（ｄ）のコラーゲンゲルをパラホルムアルデヒド固定後パラフィン包埋して薄切切片を作製した。続いて、これらの薄切切片をヘマトキシリン・エオジン染色して顕微鏡観察した。図３（ａ）及び（ｂ）は、ヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す顕微鏡写真である。図３（ａ）は、対照である図２（ａ）のコラーゲンゲルの薄切切片の染色結果を示す写真である。また、図３（ｂ）は、ＨＧＦ中和抗体を添加した図２（ｄ）のコラーゲンゲルの薄切切片の染色結果を示す写真である。
その結果、図３（ａ）に示すように、対照のコラーゲンゲルでは、細胞がコラーゲンを分解し、細胞の周りに空隙が形成されている様子が観察された。図３（ａ）中、空隙を矢頭で示す。これに対し、図３（ｂ）に示すように、ＨＧＦ中和抗体を添加したコラーゲンゲルでは、細胞の周りに空隙はほとんど認められなかった。この結果は、ＨＧＦシグナル阻害剤が、歯周炎患者の歯周組織におけるコラーゲンの分解を抑制することを更に支持するものである。
［実験例２］
実験例１と同様のコラーゲンゲル三次元培養系を用いて、歯周炎患者由来の歯肉線維芽細胞によるコラーゲンの分解に対するＨＧＦ中和抗体の影響を検討した。本実験例では、分解されずに残存したコラーゲンの定量を行った。
（コラーゲンゲルの調製）
セルマトリックスｔｙｐｅＩ－Ａ（新田ゼラチン）、５×ＤＭＥＭ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン）を混合し、コラーゲン混合溶液を作製した。このコラーゲン混合溶液に、ＨＧＦ中和抗体（型式「ＡＢ－２９４－ＮＡ」、Ｒ＆Ｄ社）を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加した。また、比較のために、被験物質を含まない試料（対照）も作製した。
続いて、これらのコラーゲン混合溶液に、実験例１と同様の、コラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞を混合し、細胞密度２．５×１０５個／ウェルとなるように６ウェルプレートに播種した。続いて、３７℃で３０分間インキュベートしてコラーゲンゲルを硬化させた。
続いて、実験例１と同様の歯肉上皮細胞をトリプシン処理により分散させた後、上記のコラーゲンゲル上に２×１０５個／ウェルずつ播種し、単層の上皮細胞の層を形成させた。
また、比較のために、コラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞の代わりに、実験例１と同様のノーマルな歯肉線維芽細胞を使用したコラーゲンゲルも作製した。
（コラーゲンゲルのインキュベート）
続いて、作製した各コラーゲンゲルを３７℃でインキュベートし、２４時間後にコラーゲンゲルをプレートから剥がし、ゲルを浮遊させた（培養１日目）。試験群の培地には上述したものと同濃度のＨＧＦ中和抗体を添加した。続いて、３７℃でコラーゲンゲルの浮遊培養を継続した。
（残存コラーゲンの定量）
浮遊培養開始後５日目にコラーゲンゲルを回収し、ゲル中のコラーゲン残量を定量した。回収したゲルを熱処理によって可溶化し、コラーゲンを定量した。コラーゲンの定量には、市販のキット（商品名「Ｓｉｒｃｏｌ Ｓｏｌｕｂｌｅ／Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、バイオカラー社製）を使用した。
図４は、定量したコラーゲン量を示すグラフである。図４中、「ＰＡＦ」はコラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞をコラーゲンゲル中に播種したコラーゲンゲルの結果を示し、「ｎｏｎＰＡＦ」は、ノーマルな歯肉線維芽細胞をコラーゲンゲル中に播種したコラーゲンゲルの結果を示す。
その結果、コラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞を播種したコラーゲンゲルにおいて、ノーマルな歯肉線維芽細胞をコラーゲンゲル中に播種したコラーゲンゲルよりも顕著なコラーゲンゲルの分解が認められた。また、対照（ＨＧＦ中和抗体を添加しなかった群）のコラーゲンゲルと比較して、ＨＧＦ中和抗体を添加したコラーゲンゲルでは、コラーゲンゲルの分解が顕著に抑制された。
［実験例３］
実験例１と同様のコラーゲンゲル三次元培養系を用いて、歯周炎患者由来の歯肉線維芽細胞によるコラーゲンの分解に対するＨＧＦ中和抗体の影響を、ＤＮＡマイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析により検討した。
（コラーゲンゲルの調製）
セルマトリックスｔｙｐｅＩ－Ａ（新田ゼラチン）、５×ＤＭＥＭ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン）を混合し、コラーゲン混合溶液を作製した。このコラーゲン混合溶液に、ＨＧＦ中和抗体（型式「ＡＢ－２９４－ＮＡ」、Ｒ＆Ｄ社）を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加した。また、比較のために、被験物質を含まない試料（対照）及び、ＨＧＦ（型式「１００－３９」、ぺプロテック社）を終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した試料も作製した。
続いて、これらのコラーゲン混合溶液に、実験例１と同様の、コラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞を混合し、細胞密度２．５×１０５個／ウェルとなるように６ウェルプレートに播種した。続いて、３７℃で３０分間インキュベートしてコラーゲンゲルを硬化させた。コラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞として、２種類の細胞を使用した（以下、「ＰＡＦ１」、「ＰＡＦ２」という。）。
続いて、実験例１と同様の歯肉上皮細胞をトリプシン処理により分散させた後、上記のコラーゲンゲル上に２×１０５個／ウェルずつ播種し、単層の上皮細胞の層を形成させた。
（コラーゲンゲルのインキュベート）
続いて、作製した各コラーゲンゲルを３７℃でインキュベートし、２４時間後にコラーゲンゲルをプレートから剥がし、ゲルを浮遊させた（培養１日目）。試験群の培地には上述したものと同濃度のＨＧＦ中和抗体を添加した。続いて、３７℃でコラーゲンゲルの浮遊培養を継続した。
（残存コラーゲンの定量及びＲＮＡの調製）
浮遊培養開始後５日目にコラーゲンゲルを回収し、質量を測定した。図５（ａ）及び（ｂ）は回収したコラーゲンゲルの写真である。図５（ａ）は上述したＰＡＦ１を用いた結果を示し、図５（ｂ）は上述したＰＡＦ２を用いた結果を示す。図５（ａ）及び（ｂ）中、「対照」は対照のコラーゲンゲルであることを示し、「ＨＧＦ」はＨＧＦを添加したコラーゲンゲルであることを示し、「ＨＧＦ中和抗体」はＨＧＦ中和抗体を添加したコラーゲンゲルであることを示す。また、下記表１に、各コラーゲンゲルの質量を測定した結果を示す。
Figure 0007016168000001
その結果、実験例１の結果と同様に、対照のコラーゲンゲルと比較して、ＨＧＦを添加したコラーゲンゲルでは、コラーゲンゲルの分解が顕著に促進された。更に、ＨＧＦ中和抗体を添加したコラーゲンゲルでは、コラーゲンゲルの分解が顕著に抑制された。この結果は、ＨＧＦシグナル阻害剤が、インビボにおいて歯周炎患者の歯周組織におけるコラーゲンの分解を抑制することを更に支持するものである。
続いて、市販のＲＮＡ抽出キット（ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、回収した各コラーゲンゲルからＲＮＡを抽出した。続いて、対照のコラーゲンゲルから抽出したＲＮＡ及びＨＧＦ中和抗体を添加したコラーゲンゲルから抽出したＲＮＡを試料として、ＤＮＡマイクロアレイ（型式「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ」、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いたトランスクリプトーム解析により、遺伝子発現の変動を解析した。なお、コラーゲンゲル全体からＲＮＡを抽出したため、上皮細胞と線維芽細胞の遺伝子が混在した状態での解析である。その結果、ＨＧＦ中和抗体を添加することにより、下記表２に示す遺伝子の発現量が顕著に低下したことが明らかとなった。また、ＨＧＦ中和抗体の添加により発現上昇した遺伝子もいくつか認められたが、その発現上昇の程度は概ね低かった。
Figure 0007016168000002
表２に示すように、ＨＧＦ中和抗体の添加により、ＩＬ１Ａ及びＩＬ１Ｂの発現が顕著に低下した。ＩＬ１Ａ及びＩＬ１Ｂは、線維芽細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の産生を誘導することが知られている。また、発明者らは以前に、ＩＬ－１βや歯肉上皮細胞に由来するＩＬ－１αが歯根膜及び歯肉線維芽細胞のコラゲナーゼ産生（主にＭＭＰ－１）を促進することを明らかにしている。また、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β共に線維芽細胞のＨＧＦ産生を誘導することが知られている。したがって、ＨＧＦ中和抗体の添加によって、ＩＬ１Ａ及びＩＬ１Ｂの発現が顕著に低下したことは、ＨＧＦシグナル阻害剤が歯周炎治療薬として有効であることを更に支持するものである。
また、表２に示すように、ＨＧＦ中和抗体の添加により、ＰＬＡＵの発現が顕著に低下した。ＰＬＡＵの遺伝子産物であるウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）は、プラスミノゲンをプラスミンに活性化することを通じて数多くのＭＭＰｓの活性化に関与している。更にｕＰＡは、１本鎖型のＨＧＦのプロフォームを２本鎖の活性型に変換する役割も有している。したがって、ＨＧＦ中和抗体の添加によって、ＰＬＡＵの発現が顕著に低下したことは、ＨＧＦシグナル阻害剤が歯周炎治療薬として有効であることを更に支持するものである。
また、表２に示すように、ＨＧＦ中和抗体の添加により、各種癌マーカーや浸潤促進因子等の癌関連遺伝子の発現が顕著に低下した。具体的には、ＫＲＴ６Ａ、Ｓ１００Ａ１２、ＹＷＨＡＺ、ＣＳＴＡ、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、ＥＭＰ１、ＣＣＮＤ２、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＴＳＶ、ＭＭＰ１０、ＫＬＫ７、ＨＢＥＧＦ、ＲＩＯＫ３、ＦＧＦＢＰ１、ＭＡＬＡＴ１の発現が顕著に低下した。発明者らは、以前に、歯周炎原因細胞であると考えられる歯周炎関連線維芽細胞（ＰＡＦｓ）が、癌関連線維芽細胞と類似の遺伝子を高発現することを明らかにしている。したがって、ＨＧＦ中和抗体の添加によって、癌関連遺伝子の発現が顕著に低下したことは、ＨＧＦシグナル阻害剤が歯周炎治療薬として有効であることを更に支持するものである。
また、表２に示すように、ＨＧＦ中和抗体の添加により、変形性関節症や関節リウマチに関連する、ＭＭＰ１０、ＡＲＥＧの発現が顕著に低下したことが明らかとなった。特に、ＡＲＥＧは関節リウマチとの関連からも歯周炎の増悪因子として注目に値するものである。したがって、ＨＧＦ中和抗体の添加によって、ＡＲＥＧの発現が顕著に低下したことは、ＨＧＦシグナル阻害剤が歯周炎治療薬として有効であることを更に支持するものである。
また、表２に示すように、ＨＧＦ中和抗体の添加により、従来歯周炎との関連が報告されている、ＳＥＲＰＩＮＥＢ２、Ｆ３、ＶＥＧＦＡの発現が顕著に低下したことが明らかとなった。中でもＶＥＧＦＡ受容体の１つであるＦＬＴ１は、発明者らが歯周炎の原因候補遺伝子として以前に見出したものである。したがって、ＨＧＦ中和抗体の添加によって、ＳＥＲＰＩＮＥＢ２、Ｆ３、ＶＥＧＦＡの発現が顕著に低下したことは、ＨＧＦシグナル阻害剤が歯周炎治療薬として有効であることを更に支持するものである。
［実験例４］
本発明の歯周炎治療薬をヒトに臨床応用する前に、サルを用いた実験を行うことが必要となる。そこで、実験例１と同様のコラーゲンゲル三次元培養系を用いて、歯周炎を自然発症したサル由来の歯肉線維芽細胞によるコラーゲンの分解に対するＨＧＦ中和抗体の影響を検討した。なお、サルの歯肉上皮細胞は培養が困難であるため、歯肉上皮細胞としてはヒトの歯肉上皮細胞を使用した。
（歯肉線維芽細胞の調製）
歯周炎を自然発症したサル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、霊長類医科学研究センター飼育）の安楽死個体由来の歯肉片の組織を細切後、組織片を細胞培養プレートの底に静置した。続いて、組織片から外生した細胞を第１代として継代培養を行い、サル歯肉線維芽細胞を得た。
得られた歯肉線維芽細胞は、一度上述したコラーゲンゲル三次元培養系で培養してコラーゲン分解能を観測し、コラーゲンゲルを極度に分解する（コラーゲンゲルが分解されて収縮した）歯肉線維芽細胞を選別して実験に使用した。コラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞としては、直径３５ｍｍのコラーゲンゲルが直径３ｍｍ程度まで収縮した歯肉線維芽細胞を選別した。
（コラーゲンゲルの調製）
セルマトリックスｔｙｐｅＩ－Ａ（新田ゼラチン）、５×ＤＭＥＭ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン）を混合し、コラーゲン混合溶液を作製した。このコラーゲン混合溶液に、ＨＧＦ中和抗体（型式「ＡＢ－２９４－ＮＡ」、Ｒ＆Ｄ社）を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加した。また、比較のために、被験物質を含まない試料（対照）及び、ＨＧＦ（型式「１００－３９」、ぺプロテック社）を終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した試料も作製した。
続いて、これらのコラーゲン混合溶液に、コラーゲンゲルを極度に分解するサル歯肉線維芽細胞を混合し、細胞密度２．５×１０５個／ウェルとなるように６ウェルプレートに播種した。続いて、３７℃で３０分間インキュベートしてコラーゲンゲルを硬化させた。
続いて、実験例１と同様にして調製したヒト歯肉上皮細胞をトリプシン処理により分散させた後、上記のコラーゲンゲル上に２×１０５個／ウェルずつ播種し、単層の上皮細胞の層を形成させた。ヒト歯肉上皮細胞として、２種類の細胞を使用した（以下、「ＳＡＦ１」、「ＳＡＦ２」という。）。
（コラーゲンゲルのインキュベート）
続いて、作製した各コラーゲンゲルを３７℃でインキュベートし、２４時間後にコラーゲンゲルをプレートから剥がし、ゲルを浮遊させた（培養１日目）。試験群の培地には上述したものと同濃度のＨＧＦ中和抗体を添加した。続いて、３７℃でコラーゲンゲルの浮遊培養を継続した。
（残存コラーゲンの観察）
図６（ａ）～（ｆ）は浮遊培養開始後５日目の各コラーゲンゲルを撮影した写真である。図６（ａ）～（ｃ）は上述したＳＡＦ１を用いた結果を示し、図６（ｄ）～（ｆ）は上述したＳＡＦ２を用いた結果を示す。
また、図６（ａ）及び（ｄ）は、被験物質を含まない試料（対照）の結果であり、図６（ｂ）及び（ｅ）はＨＧＦを終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した試料の結果であり、図６（ｃ）及び（ｆ）はＨＧＦ中和抗体を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加した試料の結果である。
その結果、コラーゲンゲルにＨＧＦを終濃度５０ｎｇ／ｍＬ添加することにより（図６（ｂ）及び（ｅ））、対照（図６（ａ）及び（ｄ））と比較してコラーゲンの分解が促進されたことが明らかとなった。特にＳＡＦ１を使用した場合において、コラーゲンの分解が促進された傾向が認められた。
また、コラーゲンゲルにＨＧＦ中和抗体を終濃度２０μｇ／ｍＬ添加することにより、（図６（ｃ）及び（ｆ））、対照（図６（ａ）及び（ｄ））と比較してコラーゲンの分解が顕著に抑制されることが明らかとなった。この結果は、歯周炎自然発症サルモデル由来の歯肉線維芽細胞を用いた場合においても、歯周炎患者由来の歯肉線維芽細胞を用いた場合と同様に、ＨＧＦシグナル阻害剤が、歯周組織におけるコラーゲンの分解を抑制することを示す。
（コラーゲンゲルの薄切切片の顕微鏡観察）
続いて、図６（ａ）及び（ｃ）のコラーゲンゲルをパラホルムアルデヒド固定後パラフィン包埋して薄切切片を作製した。続いて、これらの薄切切片をヘマトキシリン・エオジン染色して顕微鏡観察した。
図７（ａ）及び（ｂ）は、ヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す顕微鏡写真であり、それぞれ図６（ａ）及び（ｃ）のコラーゲンゲルに対応する。図７（ａ）は被験物質を含まない試料（対照）の結果であり、図７（ｂ）はＨＧＦ中和抗体を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加した試料の結果である。
その結果、図７（ａ）に示すように、対照のコラーゲンゲル及びＨＧＦを添加したコラーゲンゲルでは、細胞がコラーゲンを分解し、細胞の周りに空隙が形成されている様子が観察された。これに対し、図７（ｂ）に示すように、ＨＧＦ中和抗体を添加したコラーゲンゲルでは、細胞の周りに空隙はほとんど認められなかった。
以上の結果から、歯周炎を発症したサルにおいても、歯周炎患者と同様にコラーゲンゲルを極度に分解する歯肉線維芽細胞が存在することが明らかとなった。また、サルにおいても、ヒトと同様に、ＨＧＦシグナル阻害剤が、歯周組織におけるコラーゲンの分解を抑制することが明らかとなった。
本発明によれば、歯周炎を効果的に治療することができる歯周炎治療薬を提供することができる。

Claims (2)

  1. 肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）中和抗体を有効成分として含有する歯周炎治療薬。
  2. 請求項１に記載の歯周炎治療薬及び薬学的に許容可能な担体を含む歯周炎治療用組成物。
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Citations (2)

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