JP2000023682A - ホスホジエステラ―ゼ酵素 - Google Patents
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Abstract
載されている。アミノ酸配列は、SEQ ID No.
2又はSEQ ID No.4又はSEQID No.
15又はSEQ ID No.17又はSEQ ID
No.19として示される配列又はその変異体、相同
体、フラグメント又は誘導体を含む。
Description
明はまたそれをコードするヌクレオチド配列に関する。
ゼ酵素をコードする新規な核酸配列に関する。本発明は
また疾患の診断及び治療における新規な核酸及びアミノ
酸の用途に関する。
調節し得る薬剤を評価する及び/又はスクリーニングす
るための新規な核酸及びアミノの用途に関する。本発明
はさらにホスホジエステラーゼ活性を調節し得る薬剤を
評価する及び/又はスクリーニングするための、新規核
酸及びアミノ酸配列を包含する又は発現させる遺伝子工
学的に処理された宿主細胞に関する。
テラーゼ(PDEs)は、サイクリックヌクレオチドの
分解を触媒する酵素ファミリーである。サイクリックヌ
クレオチド、特にcAMP(サイクリックアデノシン
3',5'−一リン酸)は、重要な細胞内の第二メッセン
ジャーである。PDEsはサイクリックヌクレオチドの
濃度を制御する細胞内の一因子である。
EI〜PDEVII)が、これら酵素の多くのサブタイ
プとともに、基質親和性と補助因子の要求性に基づいて
定義されている(Beavo JA & Reifsn
yder DH,Trends Pharmacol.
Sci.11:150[1990];BeavoJ,
「サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ:構
造、調節及び薬物作用」Beavo J & Hous
ley MD(編)ウィリー:チチェスター、3〜15
頁[1990])。PDEs(即ち、サイクリックヌク
レオチドホスホジエステラーゼ)の例には、Ca2+/カ
ルモジュリン依存性PDEであるPDEI、cGMPに
よって刺激されるPDEであるPDEII、cGMPに
よって阻害されるPDEであるPDEIII、高親和性
cAMP特異的PDEであるPDEIV,cGMP特異
的PDEであるPDEV等がある。
イソ型を含む可能性がある(つまり、2つ又はそれ以上
のPDEアイソザイムがある可能性がある)。例えば、
ショウジョウバエのダンス(Dunce)遺伝子の相同
体である哺乳類のPDEIV(Chen CN等、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.(USA)83:9
313[1986])にはラットで4種のイソ型がある
ことが知られている(Swinnen JV等、Pro
c.Nat.Acad.Sci.(USA)86:53
25[1989])。ヒトPDEsもまたイソ型として
出現し、スプライシングの変異体があることが知られて
いる。例えば、単球由来のヒトPDEIVのイソ型をク
ローン化した1990年の報告がある(Livi GP
等、Mol.Cell.Bio.,10:2678[1
990]。別の例として、他の研究者たちは別々に3種
のPDEIVスプライシング変異体をクローン化した
が、それは今日hPDEIV−B1、hPDEIV−B
2、hPDEIV−B3と命名されている。
ステラーゼ−即ちCN PCDE8−に関する知見がW
O−A−97/35989に見出される。WO−A−9
7/35989によれば、CN PCDE8には2種の
アイソザイムがあり、CNPCDE8A及びCN PC
DE8Bと命名された。「アイソザイム」という用語は
当該技術分野では「イソ型」と言及される場合がある。
々なPDEの多くの阻害剤が同定され、なかには臨床評
価を受けたものもある。例えば、PDEIII阻害剤は
抗血栓薬、降圧薬及び鬱血性心不全の治療に有用である
強心薬として開発されている。PDEIII阻害剤であ
るロリプラム(Rolipram)は既にうつ病の治療
に使われていて、PDEIII阻害剤のなかには抗炎症
剤として評価されているものもある。ロリプラムはま
た、リポ多糖(LPS)によって誘発され、インビトロ
でHIV−1の複製を高めるとされている、α−TNF
の作用を阻害することが示されている。それ故、ロリプ
ラムはHIV−1の複製を阻害する可能性がある(An
gel等、1995 AIDS 9:1137〜4
4)。さらに、TNF−α、TNF−β及びγ−インタ
ーフェロンの産生を抑制する能力に基づいて、ロリプラ
ムは、多発性硬化症の実験動物モデルである脳脊髄炎の
治療に有効であることが示されていて(Sommer
等、1995 Nat Med 1:244〜24
8)、遅発性異常運動症の治療にも有効である可能性が
ある(Sasaki等、1995 Eur J Pha
rmacol 282:71〜76)。
管支喘息等の呼吸器系疾患の治療に使われているテオフ
ィリンや間欠性跛行と糖尿病性末梢血管疾患の治療に使
われているペントキシフィリンのような非特異的PDE
阻害剤もある。呼吸器系疾患の治療において、抗炎症作
用と免疫調節作用を有するテオフィリンは、気道平滑筋
の機能にも作用すると考えられている(Banner
等、1995 Respir J 8:996〜100
0)。CNPDEによるcAMPとcGMPの加水分解
を阻害することによって作用すると考えられている(B
anner等、1995 Monaldi Arch
Chest Dis 50:286〜292)。TNF
−αの産生を妨害することも知られているペントキシフ
ィリンも、HIV−1の複製を阻害する可能性がある
(Angel等、同上)。CNPDE阻害剤のリストが
Beavo(1995、同上)の論文にある。
イプの選択的阻害剤は、より副作用が少なくより効果的
な治療薬になると示唆されている。例えば、Wiesh
aar RE等(J.Med.Chem.,28:53
7[1985])、Giembycz MA(Bioc
hem.Pharm.,43:2041[199
2])、Lowe JAとCheng JB(Drug
s of the Future,17:799〜80
7[1992])の概説を参照されたい。
の個別タイプの選択的阻害を獲得することが望ましい。
それ故、新規PDEのクローン化と発現は、選択的阻害
剤の発見にとって大いに有用であろう。
の説明には本発明の態様が示されている。要約すれば、
本発明の幾つかの態様は、 1.新規アミノ酸 2.新規核酸配列 3.前記新規配列を用いるアッセイ 4.前記アッセイの適用によって同定される化合物/組
成物 5.前記新規配列を包含又は発現させる発現システム 6.前記新規配列に基づいた治療方法 7.前記新規配列に基づいた医薬組成物、に関する。
チド配列に関する他の態様には、本発明の配列を包含又
は発現させ得る構築物、本発明の配列を包含又は発現さ
せ得るベクター、本発明の配列を包含又は発現させ得る
プラスミド、本発明の配列を包含又は発現させ得る組
織、本発明の配列を包含又は発現させ得る器官、本発明
の配列を包含又は発現させ得る形質転換された宿主、本
発明の配列を包含又は発現させ得る形質転換された生物
体、等がある。本発明はまた、本発明の配列を転移させ
る方法と、微生物における発現のように、それを発現さ
せる方法も含む。
下のセクション見出しのもとに論じる。しかしながら、
各セクションの教示は必ずしもそれぞれ特定のセクショ
ンに限定されるものではない。
配列」及び「本発明のアミノ酸配列」は、それぞれ、こ
こに示される1以上のヌクレオチド配列及びここに示さ
れる1以上のアミノ酸配列のことを指す。また、ここに
用いられているように、「アミノ酸配列」とはペプチド
又はタンパク質配列を指し、その一部を指す場合もあ
る。さらに、「本発明のアミノ酸配列」という用語は、
「本発明のポリペプチド配列」と同義である。また、
「本発明のヌクレオチド配列」という用語は、「本発明
のポリヌクレオチド配列」と同義である。
ると、式I又はその変異体、相同体、フラグメント又は
誘導体として示される配列を含む、PDE活性を示すア
ミノ酸配列が提供される。式I ペプチド配列又はアミノ酸Z1〜Z28の1以上を含
む、159アミノ酸残基より長いアミノ酸配列であっ
て、このペプチド配列又はアミノ酸Z1〜Z28の1以
上のいずれもが、適当なペプチド配列又はアミノ酸残基
によって、他のペプチド配列又はアミノ酸Z1〜Z28
から分離されてよい。ここでZ1〜Z28は、 Z1= LTDEKVKAYLSLHPQVLDEFVSESVSAETVEKWLKRK Z2= NK Z3= DE Z4= PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDN Z5= LLLYELSSII Z6= IATKADGFALYFLGECNNSLC Z7= F Z8= PPG Z9= KEG Z10 = PRLIPAGPITQGTT Z11 =SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTA
IGDLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQ
TELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKN
KELYSDLFDIGEEKEGKP Z12 =FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIPDAYADPRFNREVDLYT
GYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFSKTDENNFKMFAVFCAL
ALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSEEWQGLM Z13 = F Z14 = LP Z15 = R Z16 = C Z17 = IELFHFDIGPFENMWPGIFVYM Z18 = HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMY
AILQNN Z19 = LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPL Z20 =ALYSTSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRK
AIIATDLALYFGNRQLEEMYQTGSLNLZ21 = NQSHRDRVIGLMMTACD
LCSVTK Z22 = WPVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDK Z23 = DEVPQGQLGFYNAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNL Z24 = QWEKVIRGEETA Z25 = WIS Z26 = P Z27 = A Z28 = E 便宜上、アミノ酸を示すコード表を示す。
Z18及びZ20、又はその類縁体のうち少なくとも1
つ又はそれ以上を含む。
語は、式Iの配列に類似した配列を有するがアミノ酸の
置換や欠損が悪影響を与えない(つまり、酵素活性に対
して悪影響しない)アミノ酸配列を意味する。
1、Z12、Z18及びZ20、又はその類縁体のうち
少なくとも各々を含む。好ましくは、式Iのアミノ酸配
列は、Z11、Z12、Z18及びZ20のうち少なく
とも各々を含む。
1、Z4、Z17、Z19、Z21、Z22及びZ3
3、又はその類縁体のうち少なくとも1つ又はそれ以上
を含む。好ましくは、式Iのアミノ酸配列は、Z1、Z
4、Z17、Z19、Z21、Z22及びZ33、又は
その類縁体のうち少なくとも各々を含む。
1、Z4、Z17、Z19、Z21、Z22及びZ33
のうち少なくとも各々を含む。式Iとして示される配列
を含むアミノ酸配列の好ましい例は、式II又はその変
異体、相同体、フラグメント又は誘導体として示される
アミノ酸配列である。式II X0-Z1-X1-Z2-X2-X3-Z3-X4-X5-Z4-X6-Z5-X7-Z6-X8-Z7-X9
-Z8-X10-Z9-X11-Z10-X12-Z11-X13-Z12-X14-Z13-X15-Z14
-X16-Z15-X17-Z16-X18-X19-Z17-X20-Z18-X21-X22-Z19-X
23-Z20-X24-Z21-X25-Z22-X26-Z23-X27-Z24-X28-Z25-X29
-Z26-X30-X31-Z27-X32-X33-X34-X35-X36-X37-Z28-X38 ここで、Z1〜Z28はそれぞれ上記に定義したもので
あり、X0〜X38は、適当なペプチド配列又はアミノ
酸から独立して選択され、X0、X28、Z25、X2
9、Z26、X30、X31、Z27、X32、X3
3、X34、X35、X36、X37、Z28及びX3
8の1つ又はそれ以上は任意である。
列のより好ましい例は、式III又はその変異体、相同
体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸配
列である。
5PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDNX6LLLYELSSIIX7IA
TKADGFALYFLGECNNSLCX8FX9PPGX10KEGX11PRLIPAGPITQGTT
X12SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTAIG
DLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQTE
LNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKNKE
LYSDLFDIGEEKEGKPX13FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIPDA
YADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFSKT
DENNFKMFAVFCALALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSEEW
QGLMX14FX15LPX16RX17CX18X19IELFHFDIGPFENMWPGIFVYMX
20HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMYAILQ
NNX21X22LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPLX23ALY
STSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRKAIIATDLA
LYFGNRKQLEEMYQTGSLNLX24NQSHRDRVIGLMMTACDLCSVTKX25W
PVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDKX26DEVPQGQLGFY
NAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNLX27QWEKVIRGEETA ここで、X1は、N又はT、X2は、S又はA、X3は、
E又はK、X4は、S又はP、X5は、A又はS、X
6は、Q又はH、X7は、K又はR、X8は、I又はV、
X9は、T又はI、X10は、I又はM、X11は、K又は
Q、X12は、V又はI、X13は、V又はI、X14は、Q
又はR、X15は、T又はN、X16は、V又はA、X
17は、L又はI、X18は、K又はR、X19は、E又は
D、X20は、V又はI、X21は、H又はN、X22は、T
又はG、X23は、T又はA、X24は、N又はH、X
25は、P又はL、X26は、K又はR、X27は、S又はN
である。
列のより好ましい例は、式IV又はその変異体、相同
体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸配
列である。式IV X0LTDEKVKAYLSLHPQVLDEFVSESVSAETVEKWLKRKX1NKX2X3DEX
4X5PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDNX6LLLYELSSIIX7
IATKADGFALYFLGECNNSLCX8FX9PPGX10KEGX11PRLIPAGPITQG
TTX12SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTA
IGDLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQ
TELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKN
KELYSDLFDIGEEKEGKPX13FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIP
DAYADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFS
KTDENNFKMFAVFCALALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSE
EWQGLMX14FX15LPX16RX17CX18X19IELFHFDIGPFENMWPGIFVY
MX20HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMYAI
LQNNX21X22LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPLX23A
LYSTSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRKAIIATD
LALYFGNRKQLEEMYQTGSLNLX24NQSHRDRVIGLMMTACDLCSVTKX
25WPVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDKX26DEVPQGQL
GFYNAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNLX27QWEKVIRGEETA ここで、X0は、S又はG、X1は、N又はT、X2は、
S又はA、X3は、E又はK、X4は、S又はP、X
5は、A又はS、X6は、Q又はH、X7は、K又はR、
X8は、I又はV、X9は、T又はI、X10は、I又は
M、X11は、K又はQ、X12は、V又はI、X13は、V
又はI、X14は、Q又はR、X15は、T又はN、X
16は、V又はA、X17は、L又はI、X18は、K又は
R、X19は、E又はD、X20は、V又はI、X21は、H
又はN、X22は、T又はG、X23は、T又はA、X
24は、N又はH、X25は、P又はL、X26は、K又は
R、X27は、S又はNである。
列のより好ましい例は、式V又はその変異体、相同体、
フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸配列で
ある。式V X0LTDEKVKAYLSLHPQVLDEFVSESVSAETVEKWLKRKX1NKX2X3DEX
4X5PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDNX6LLLYELSSIIX7
IATKADGFALYFLGECNNSLCX8FX9PPGX10KEGX11PRLIPAGPITQG
TTX12SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTA
IGDLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQ
TELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKN
KELYSDLFDIGEEKEGKPX13FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIP
DAYADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFS
KTDENNFKMFAVFCALALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSE
EWQGLMX14FX15LPX16RX17CX18X19IELFHFDIGPFENMWPGIFVY
MX20HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMYAI
LQNNX21X22LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPLX23A
LYSTSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRKAIIATD
LALYFGNRKQLEEMYQTGSLNLX24NQSHRDRVIGLMMTACDLCSVTKX
25WPVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDKX26DEVPQGQL
GFYNAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNLX27QWEKVIRGEETAX28
WIS ここで、X0は、S又はG、X1は、N又はT、X2は、
S又はA、X3は、E又はK、X4は、S又はP、X
5は、A又はS、X6は、Q又はH、X7は、K又はR、
X8は、I又はV、X9は、T又はI、X10は、I又は
M、X11は、K又はQ、X12は、V又はI、X13は、V
又はI、X14は、Q又はR、X15は、T又はN、X
16は、V又はA、X17は、L又はI、X18は、K又は
R、X19は、E又はD、X20は、V又はI、X21は、H
又はN、X22は、T又はG、X23は、T又はA、X
24は、N又はH、X25は、P又はL、X26は、K又は
R、X27は、S又はN、X28は、T又はMである。
列のより好ましい例は、式VI又はその変異体、相同
体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸配
列である。
4X5PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDNX6LLLYELSSIIX7
IATKADGFALYFLGECNNSLCX8FX9PPGX10KEGX11PRLIPAGPITQG
TTX12SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTA
IGDLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQ
TELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKN
KELYSDLFDIGEEKEGKPX13FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIP
DAYADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFS
KTDENNFKMFAVFCALALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSE
EWQGLMX14FX15LPX16RX17CX18X19IELFHFDIGPFENMWPGIFVY
MX20HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMYAI
LQNNX21X22LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPLX23A
LYSTSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRKAIIATD
LALYFGNRKQLEEMYQTGSLNLX24NQSHRDRVIGLMMTACDLCSVTKX
25WPVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDKX26DEVPQGQL
GFYNAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNLX27QWEKVIRGEETAX28
WISX29PX30X31A ここで、X0は、S又はG、X1は、N又はT、X2は、
S又はA、X3は、E又はK、X4は、S又はP、X
5は、A又はS、X6は、Q又はH、X7は、K又はR、
X8は、I又はV、X9は、T又はI、X10は、I又は
M、X11は、K又はQ、X12は、V又はI、X13は、V
又はI、X14は、Q又はR、X15は、T又はN、X
16は、V又はA、X17は、L又はI、X18は、K又は
R、X19は、E又はD、X20は、V又はI、X21は、H
又はN、X22は、T又はG、X23は、T又はA、X
24は、N又はH、X25は、P又はL、X26は、K又は
R、X27は、S又はN、X28は、T又はM、X29は、S
又はG、X30は、S又はG、X31は、V又はPである。
列のより好ましい例は、式VII又はその変異体、相同
体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸配
列である。式VII X0LTDEKVKAYLSLHPQVLDEFVSESVSAETVEKWLKRKX1NKX2X3DEX
4X5PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDNX6LLLYELSSIIX7
IATKADGFALYFLGECNNSLCX8FX9PPGX10KEGX11PRLIPAGPITQG
TTX12SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTA
IGDLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQ
TELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKN
KELYSDLFDIGEEKEGKPX13FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIP
DAYADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFS
KTDENNFKMFAVFCALALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSE
EWQGLMX14FX15LPX16RX17CX18X19IELFHFDIGPFENMWPGIFVY
MX20HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMYAI
LQNNX21X22LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPLX23A
LYSTSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRKAIIATD
LALYFGNRKQLEEMYQTGSLNLX24NQSHRDRVIGLMMTACDLCSVTKX
25WPVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDKX26DEVPQGQL
GFYNAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNLX27QWEKVIRGEETAX28
WISX29PX30X31AX32X33X34X35X36X37EX38 ここで、X0は、S又はG、X1は、N又はT、X2は、
S又はA、X3は、E又はK、X4は、S又はP、X
5は、A又はS、X6は、Q又はH、X7は、K又はR、
X8は、I又はV、X9は、T又はI、X10は、I又は
M、X11は、K又はQ、X12は、V又はI、X13は、V
又はI、X14は、Q又はR、X15は、T又はN、X
16は、V又はA、X17は、L又はI、X18は、K又は
R、X19は、E又はD、X20は、V又はI、X21は、H
又はN、X22は、T又はG、X23は、T又はA、X
24は、N又はH、X25は、P又はL、X26は、K又は
R、X27は、S又はN、X28は、T又はM、X29は、S
又はG、X30は、S又はG、X31は、V又はP、X
32は、Q又はP、X33は、K又はS、X34は、A又は
K、X35は、A又はS、X36は、A又はT、X37は、S
又はP、X38は、D又はKである。式Iとして示される
配列を含むアミノ酸配列の好ましい例は、SEQ ID
No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID N
o.15又はSEQ ID No.17及び/又はSE
Q ID No.19のアミノ酸またはその変異体、相
同体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸
を含む。式I及び/又は式II〜式VIIのどれか1つ
又はそれ以上について述べることは、SEQ ID N
o.2、SEQ ID No.4、SEQ ID N
o.15又はSEQ ID No.17及び/又はSE
Q ID No.19を含むアミノ酸のどれか1つ又は
それ以上にも同様に適用されることに留意されたい。
1例は、...KRKX1NKX2X 3...の基
が...KRKX1DKX2X3...に置換されている
アミノ酸配列である。
1例は、...LLLYELSSIIX7...の基
が...LLLYELNSSIIX7...に置換され
ているアミノ酸配列である。
IIのどれか1つ又はそれ以上について述べることは、
SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、S
EQID No.15又はSEQ ID No.17及
び/又はSEQ ID No.19を含むアミノ酸のど
れか1つ又はそれ以上のことを意味する。
式VIIのどれか1つ又はそれ以上について述べること
は、SEQ ID No.2又はSEQ ID No.
4のどれか1つ又はそれ以上のことを意味する。
示される配列を含むアミノ酸配列が提供される。本発明
の第三の態様によれば、本発明のアミノ酸配列をコード
する核酸配列が提供される。
D No.1、SEQ ID No.3又はSEQ I
D No.14として示される配列を含むヌクレオチド
配列、又はSEQ ID No.16及び/又はSEQ
ID No.18又はその変異体、相同体、フラグメ
ント又は誘導体を含むヌクレオチド配列が提供される。
D No.1、SEQ ID No.3又はSEQ I
D No.14として示される配列を含むヌクレオチド
配列、又はSEQ ID No.16及び/又はSEQ
ID No.18を含むヌクレオチド配列が提供され
る。
るヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションできるヌ
クレオチド配列が提供される。本発明の第七の態様によ
れば、本発明の第六の態様によるヌクレオチド配列にハ
イブリダイゼーションできるヌクレオチド配列が提供さ
れる。
るヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。本発
明の第九の態様によれば、本発明によるヌクレオチド配
列が取り込まれた宿主細胞が提供される。
の活性又は発現に影響を与え得る薬剤を同定するアッセ
イ方法、つまり、薬剤を本発明によるアミノ酸又は本発
明によるヌクレオチド配列と接触させ、PDE11の活
性又は発現を測定し、a)薬剤の非存在下におけるPD
E活性又は発現とb)薬剤の存在下におけるPDE活性
又は発現との差をもって薬剤のPDE11活性又は発現
への効果の指標とするアッセイ方法が提供される。好ま
しくは、このアッセイは、男性の勃起不全又は女性の性
機能不全のような性機能障害の治療に有用な薬剤をスク
リーニングするためのものである。
発明によるアッセイを実施し、(b)PDE11の活性
又は発現に影響を与える1つ又はそれ以上の薬剤を同定
し、(c)1つ又はそれ以上の同定された薬剤を大量に
製造する工程を含む方法が提供される。
アッセイ方法であるインビトロのアッセイ方法において
PDE11の活性又は発現に影響を与え得る薬剤でイン
ビボのPDE11活性又は発現に影響を与える方法が提
供される。
アッセイ方法によってインビトロでアッセイするときP
DEの活性又は発現に効果を及ぼし得る薬剤の、PDE
11に関連した疾患又は病態の治療に用いる医薬組成物
の製造における用途が提供される。
1に対して産生された抗体と免疫反応し得る酵素が提供
される。本発明の第十五の態様によれば、NCIMB4
0925、NCIMB40926又はNCIMB410
07から得られる、PDEをコードするヌクレオチド配
列が提供される。
B40925、NCIMB40926又はNCIMB4
1007から得られるヌクレオチド配列より発現される
PDEが提供される。
1の活性又はその発現に影響を与える薬剤の、PDE1
1に関連した疾患又は病態の治療に用いる医薬組成物の
製造における用途が提供される。
レオチド配列より選択されるヌクレオチド配列が提供さ
れる:(a)SEQ ID No.1、3又は14とし
て示されるヌクレオチド配列又はSEQ ID No.
16及び/又はSEQ ID No.18を含むヌクレ
オチド配列、(b)SEQ ID No.1、3又は1
4として示されるヌクレオチド配列又はSEQ ID
No.16及び/又はSEQ ID No.18を含む
ヌクレオチド配列の変異体、相同体、誘導体又はフラグ
メントであるヌクレオチド配列、(c)SEQ ID
No.1、3又は14として述べられているヌクレオチ
ド配列又はSEQ ID No.16及び/又はSEQ
ID No.18を含むヌクレオチド配列の相補体で
あるヌクレオチド配列、(d)SEQ ID No.
1、3又は14として示されるヌクレオチド配列又はS
EQ ID No.16及び/又はSEQ ID N
o.18を含むヌクレオチド配列の変異体、相同体、誘
導体又はフラグメントの相補体であるヌクレオチド配
列、(e)SEQ ID No.1、3又は14として
述べられているヌクレオチド配列又はSEQ ID N
o.16及び/又はSEQ ID No.18を含むヌ
クレオチド配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配
列、(f)SEQ ID No.1、3又は14として
示されるヌクレオチド配列又はSEQ ID No.1
6及び/又はSEQ ID No.18を含むヌクレオ
チド配列の変異体、相同体、誘導体又はフラグメントと
ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、(g)SEQ
ID No.1、3又は14として述べられているヌ
クレオチド配列又はSEQ ID No.16及び/又
はSEQ ID No.18を含むヌクレオチド配列と
ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の相補体である
ヌクレオチド配列、(h)SEQ ID No.1、3
又は14として示されるヌクレオチド配列又はSEQ
ID No.16及び/又はSEQ ID No.18
を含むヌクレオチド配列の変異体、相同体、誘導体又は
フラグメントとハイブリダイズし得るヌクレオチド配列
の相補体であるヌクレオチド配列、(i)SEQ ID
No.1、3又は14として述べられているヌクレオ
チド配列又はSEQ ID No.16及び/又はSE
Q ID No.18を含むヌクレオチド配列の相補体
とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、(j)SE
Q ID No.1、3又は14として示されるヌクレ
オチド配列又はSEQ ID No.16及び/又はS
EQ ID No.18を含むヌクレオチド配列の変異
体、相同体、誘導体又はフラグメントの相補体とハイブ
リダイズし得るヌクレオチド配列、(k)(a)、
(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、
(h)、(i)又は(j)で定義されたヌクレオチドに
対して遺伝暗号の結果として縮重しているヌクレオチド
配列、(l)(a)、(b)、(c)、(d)、
(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)及び
/又は(k)のいずれか1つを含むヌクレオチド配列。
本発明による単離されたヌクレオチド配列又はタンパク
質配列。本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又は
その発現産物の活性に影響を与え得る薬剤を同定するア
ッセイ方法であって、本発明のヌクレオチド配列又はそ
の発現産物(「EP」)に薬剤を曝露し、本発明のヌク
レオチド配列又はその発現産物を薬剤が(発現パターン
又は活性に影響を与えるように)調節(モジュレート)
するか否かを決定することから成る、アッセイ方法。
薬剤。本発明のアッセイ方法によって同定され、本発明
によるPDEモジュレーション効果を有することがこれ
まで知られていなかった薬剤。
本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はその発現
産物の活性に影響を与える1つ又はそれ以上の薬剤を同
定し、(c)1つ又はそれ以上の同定された薬剤を大量
に製造する、工程を含む方法。
(b)本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はそ
の発現産物の活性に影響を与える1つ又はそれ以上の薬
剤を同定し、(c)1つ又はそれ以上の同定された薬剤
を含む医薬組成物を製造する、工程を含む方法。
(b)本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はそ
の発現産物の活性に影響を与える1つ又はそれ以上の薬
剤を同定し、(c)1つ又はそれ以上の同定される薬剤
を、本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はその
発現産物に対して別の効果を引き起こすように修飾す
る、工程を含む方法。
又はその発現産物の活性に影響を与える医薬品の製造に
使用する、本発明によるアッセイによって同定された薬
剤の用途。
対し、本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はそ
の発現産物の活性を調節し得る薬剤の有効量をデリバリ
ー(投与又は曝露等)することを含む、対象を治療する
方法。
対し、本発明によるアッセイによって同定された薬剤の
有効量をデリバリー(投与又は曝露等)することを含
む、対象を治療する方法。
はその発現産物を投与し、披検者に免疫応答を引き起こ
す方法。 [PDE11(PDEXI)]以上のように、本発明は
新規PDE酵素−PDE11と呼ぶ(又はPDEXIと
も表記される)−及びそれをコードするヌクレオチド配
列に関する。
の、疾患の診断及び治療における用途に関する。本発明
はまた新規な核酸及びアミノ酸配列の、ホスホジエステ
ラーゼ活性を調節し得る薬剤を評価及び/又はスクリー
ニングするのに使用する用途に関する。本発明はさらに
ホスホジエステラーゼ活性を調節し得る薬剤を評価及び
/又はスクリーニングする新規な核酸及びアミノ酸配列
を包含又は発現する、遺伝子工学的に処理された宿主細
胞に関する。
語はこれまで特徴づけされていなかった新規なPDEフ
ァミリーを指す。例として、我々は2種のヒトPDE1
1のアイソザイム−PDE11A1及びPDE11A2
と呼ぶ(それぞれHSPDE11A1、HSPDE11
A2と言及される場合もある)−を同定した。PDE1
1A2はPDE11A1のスプライシング変異体である
と考えられる。我々はまたマウスの配列−PDE11A
3と呼ぶ(MmPDE11A3と言及される場合もあ
る)−を同定した。我々はまたラットの配列を同定し−
PDE11A4と呼ぶ(RtPDE11A4と言及され
る場合もある)−一部の配列を決定した。
言えば、PDE11A1及び/又はPDE11A2及び
/又はPDE11A3及び/又はPDE11A4を含む
ものとする。
11A1及び/又はPDE11A2)は、様々な源に存
在し、そこから入手できると考えられる。例えば、PD
E11は線条体及び海綿体に見出される。別の例では、
PDE11はヒト及びマウスだけでなく、ラットからも
採取できる。PDE11はまた、例えば、ウシ、羊、
豚、ウマ、といった多くの他の源にも存在していると考
えられる。好ましくは、本発明は上記の源の哺乳類のP
DE11を含むが、それらに限定されるものではない。
同じものでもよいが、本態様にとっては、PDE11
は、好ましくは非天然のアミノ酸配列(即ち、その自然
の形体において及びその自然環境において存在していな
い)であるか又はその変異体、相同体、フラグメント又
は誘導体である。さらに、又は代わりに、PDE11は
単離されたPDE11及び/又は精製されたPDE11
である。PDE11は天然か否かを問わずあらゆる適切
な源から入手又は生成し得るし、合成、半合成又は組換
えのものであってもよい。
ている形体と同じものでもよいが、本態様にとっては、
PDE11のコード配列は、好ましくは非天然のヌクレ
オチド配列(即ち、その自然の形体において及びその自
然環境において存在していない)であるか又はその変異
体、相同体、フラグメント又は誘導体である。さらに、
又は代わりに、PDE11のコード配列は単離されたP
DE11のコード配列及び/又は精製されたPDE11
のコード配列である。PDE11のコード配列は天然か
否かを問わずあらゆる適切な源から入手し又は生成し得
るし、合成、半合成又は組換えのものであってもよい。
を触媒すると考えられる。cGMPは男性の勃起反応に
おけるメッセンジャーである。それ故、PDE11の活
性を阻害すれば、cGMP濃度を高め、男性の勃起反応
を強める可能性がある。従って、PDE11及び/又は
そのコード配列及び/又はそれとハイブリダイズし得る
配列は、男性の勃起不全を治療する薬剤の候補物質をス
クリーニングするのに有用である。さらに、PDE11
及び/又はそのコード配列及び/又はそれとハイブリダ
イズし得る配列は、女性の性機能不全を治療する薬剤の
候補物質をスクリーニングするのに有用であると考えら
れる。また、PDE11及び/又はそのコード配列及び
/又はそれとハイブリダイズし得る配列は、薬剤の候補
物質の様々なPDEに対する選択性を試験するのに有用
である。
1酵素及びPDE11酵素をコードする組換えヌクレオ
チド配列を含む。好ましくは、本発明の組換えPDE1
1酵素及び/又は組換えヌクレオチド配列は、哺乳類の
組換えPDE11酵素及び/又は哺乳類の組換えヌクレ
オチド配列である。
は、式Iとして示された式を少なくとも有する。PDE
11をコードするヌクレオチド配列とPDE11酵素そ
のもののいずれか又は両方は、PDE11活性に影響を
与え得る薬剤をスクリーニングするために利用できる。
特に、PDE11をコードするヌクレオチド配列又はP
DE11酵素そのものは、PDE11活性を阻害し得る
薬剤をスクリーニングするために利用できる。さらに、
PDE11をコードするヌクレオチド配列又はPDE1
1酵素そのものは、PDE11活性を選択的に阻害する
ように、PDE11活性に選択的に影響を与える薬剤を
スクリーニングするために利用できる。
チド配列又はそれと相補的である配列は、ヒト細胞にお
けるPDE11コード配列の存在を検出するアッセイに
利用できる。このアッセイは、この酵素の組織分布及び
特殊な病態との生物学的関連性に関する情報を提供する
だろう。
ラグメント、相同体又は変異体を含む)に対する抗体も
含む。PDE11の抗体は、ヒト細胞におけるPDE1
1の存在を検出するアッセイに利用できる。このアッセ
イは、この酵素の組織分布及び特殊な病態との生物学的
関連性に関する情報を提供する。
PDE11A1及びPDE11A2又はPDE11A3
又はPDE11A4)、それらをコードするヌクレオチ
ド配列、それらと相補的なヌクレオチド配列及びそれら
に対する抗体のうち1つ又はそれ以上は、アイソザイム
の1つに選択的に影響を与える薬剤をスクリーニングす
るアッセイに利用できる。このアッセイは、これらのア
イソザイムそれぞれの組織分布及び特殊な病態との生物
学的関連性に関する情報を提供する。このアッセイはま
た、特殊な組織又は特殊な病態等においてPDE11の
発現又は活性に影響を与えるのに有用な薬剤を、試験し
て同定することを可能にするだろう。 [天然に存在している]ここに使用される「天然に存在
している」は、自然に見出されるアミノ酸配列を有する
PDE11を指す。 [単離/精製された]ここに使用される「単離された]
又は[精製された]は、自然環境から取り出され、本来共
存している少なくとも1つの他の成分から単離又は分離
された、核酸又はアミノ酸、いずれかの分子を指す。 [生理活性がある]ここに使用される「生理活性があ
る」は、天然に存在しているPDE11と類似の構造的
機能(必ずしも同程度ではなくてもよい)及び/又は、
類似の制御機能(必ずしも同程度ではなくてもよい)及
び/又は、類似の生化学的機能(必ずしも同程度ではな
くてもよい)及び/又は、類似の免疫活性(必ずしも同
程度ではない)を有する本発明によるPDE11、例え
ば組換えPDE11を指す。特に、本発明のPDE11
はサイクリックヌクレオチドを加水分解する能力を有す
るが、それは本発明のPDE酵素の有する特徴的な活性
の1つである。 [免疫活性]ここに使用される「免疫活性」は、適切な
動物又は細胞において特異的な免疫反応を引き起こして
特異的な抗体と結合する、天然、組換え又は合成のPD
E11又はそのオリゴペプチドの有する能力として定義
される。 [誘導体]アミノ酸配列と関連して用いられている「誘
導体」という用語は、PDE11の化学修飾を含む。そ
のような修飾の例は、水素をアルキル、アシル又はアミ
ノ基で置換することである。 [欠失]ここに使用される「欠失」は、ヌクレオチド又
はアミノ酸配列において、それぞれヌクレオチド又はア
ミノ酸残基の1つ又はそれ以上が欠損している変化とし
て定義される。 [挿入/付加]ここに使用される「挿入」又は「付加」
とは、天然に存在しているPDEと比較して、それぞれ
1つ又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基の追
加をもたらすヌクレオチド又はアミノ酸配列の変化のこ
とである。 [置換]ここに使用される「置換」は、1つ又はそれ以
上のヌクレオチド又はアミノ酸をそれぞれ別のヌクレオ
チド又はアミノ酸に置き換えることより生じる。 [変異体/相同体]本発明のヌクレオチド配列及び本発
明のアミノ酸配列に関して用いられる「変異体」又は
「相同体」という用語は、配列の対立遺伝子変異と同義
である。
いう用語は「同一性」と同等である。つまり、本発明の
ヌクレオチド配列及び本発明のアミノ酸配列に関する配
列の相同性は、1つ又はそれ以上の配列を他の配列と単
純に「眼球」比較(即ち、厳密な比較)し、他の配列が
当該の配列と少なくとも75%の同一性を有するかどう
か確かめることによって、決定し得る。相対的な配列相
同性(即ち、配列同一性)は、2つ又はそれ以上の配列
間の相同性(%)を計算できる市販のコンピュータ・プ
ログラムによっても決定し得る。CLUSTALはこの
ようなコンピュータ・プログラムの典型的な例である。
性アルゴリズム、例えばデフォルト(default)
・パラメータを利用しても決定され得る。有利には、B
LASTアルゴリズムはパラメータをデフォルト値に設
定して使用される。BLASTアルゴリズムの詳細は、
http://www.ncbi.nih.gov/B
LAST/blast_help.htmlに記載され
ており、これを援用してここに取り込む。検索パラメー
タは以下のように定義され、有利には、定義されたデフ
ォルト・パラメータに設定する。
き、「実質的な相同」とは、少なくとも約7、好ましく
は少なくとも約9、最も好ましくは10又はそれ以上の
EXPECT値に一致する配列に等しい。BLAST検
索におけるEXPECTのデフォルト閾値は通常10で
ある。
lignment SearchTool)は、bla
stp、blastn、blastx、tblastn
及びtblastxというプログラムによって使用され
る帰納的な検索アルゴリズムであり、上記プログラムは
地検の有意性を、KarlinとAltschulの統
計手法(http://www.ncbi.nih.g
ov/BLAST/blast_help.htmlを
参照せよ)にいくつかの改良点を加えた手法を用いて判
断するものである。これらのBLASTプログラムは、
配列類似性を検索するために手を加え、例えば疑義配列
との相同体を同定できるようにしたものである。これら
のプログラムはモチーフのスタイルの検索には一般に有
用ではない。配列データベースの類似性検索における基
本的な課題に関する論議については、Altschul
等の論文(1994)Nature Genetics
6:119〜129を参照せよ。
h.govで入手可能な5つのBLASTプログラムは
以下のタスクを実行する:blastpは、アミノ酸の
疑義配列をタンパク質の配列データベースに対して比較
する。
をヌクレオチドの配列データベースに対して比較する。
blastxは、ヌクレオチドの疑義配列(2本鎖)の
6−フレーム(frame)の概念的翻訳産物をタンパ
ク質の配列データベースに対して比較する。
を全ての6−読み取りフレーム(2本鎖)において力学
的に翻訳されるヌクレオチドの配列データベースに対し
て比較する。
列の6−フレーム翻訳をヌクレオチド配列データベース
の6−フレーム翻訳と比較する。BLASTでは以下の
検索パラメータを用いる。
ヒストグラムを表示する。デフォルトはイエスである
(BLASTマニュアルのパラメータHを参照せよ)。
DESCRIPTIONSは、報告される一致配列の簡
略記載数を特定された数へ制限する。デフォルト限界は
100の記載である(マニュアルのパラメータVの頁を
参照せよ)。また、EXPECT及びCUTOFFも参
照せよ。
メント・ペア(HSP)として報告されるデータベース
配列を所定の数へ制限する。デフォルト限界は50であ
る。これよりも多くのデータベース配列が統計的有意性
の報告閾値を満足させるならば(以下に示すEXPEC
T及びCUTOFFを参照せよ)、最大の統計的有意性
に帰される一致だけが報告される(BLASTマニュア
ルのパラメータBを参照せよ)。
一致を報告する統計的有意性の閾値であり、デフォルト
値は10である。10の一致は、KarlinとAlt
schulの推計モデル(1990)によれば、単なる
偶然によって見出されると期待される。ある一致による
統計的有意性がEXPECT閾値よりも大きければ、こ
の一致は報告されない。より低いEXPECT閾値はよ
り厳格(stringent)であり、一致が報告され
る頻度を低くする。端数値は許容される(BLASTマ
ニュアルのパラメータEを参照せよ)。
・ペア(HSP)の報告をカットオフする値である。デ
フォルト値はEXPECT値より算出される(上記参
照)。データベース配列のHSPが報告されるのは、そ
れらの統計的有意性が、CUTTOFF値に匹敵するス
コアを有する唯一のHSPによるものと少なくとも同じ
くらい高い場合だけである。より高いCUTOFF値を
設けるとより厳格(stringent)になり、偶然
の一致はより報告されない(BLASTマニュアルのパ
ラメータSを参照せよ)。普通、有意性の閾値はEXP
ECTを用いてより直感的に処理し得る。
TX、TBLASTN及びTBLASTXの代替となる
スコアリング・マトリックスを特定する。デフォルト・
マトリックスはBLOSUM62(Henikoff
& Henikoff,1992)である。有効な代替
選択は、PAM40、PAM120、PAM250及び
IDENTITYを含む。BLASTNには代替となる
スコアリング・マトリックスがないので、BLASTN
リクエストにMATRIX指示を特定するとエラー応答
が帰ってくる。
ータベース配列の上側鎖又は下側鎖に制限する、又は、
BLASTN、BLASTX又はTBLASTX検索を
疑義配列の上側又は下側の鎖上の読み取りフレームのみ
に制限する。
on & Federhen(1993)Comput
ers and Chemistry 17:149〜
163のSEGプログラムによって決定されるような組
成上の複雑性が低い疑義配列セグメント又は、Clav
erie & States(1993)Comput
ers and Chemistry 17:191〜
201のXNUプログラム又は、BLASTNの場合は
Tatusov & LipmanのDUSTプログラ
ム(http://www.ncbi.nlm.ni
h.govを参照せよ)によって決定されるような短周
期性の内部リピートから成るセグメントを遮蔽する。フ
ィルタリングは統計的に有意であっても生物学的には興
味のない報告をblastの出力(例えば、酸性、塩基
性又は高プロリンの共通領域に対するヒット)から消去
し、データベース配列に対する特異的な一致のために供
される疑義配列のより生物学的に興味深い領域を残すこ
とができる。
る複雑性が低い配列は、ヌクレオチド配列中ではNによ
り(例えば「NNNNNNNNNNNNN」のよう
に)、タンパク質配列ではXにより(例えば「XXXX
XXXXX」のように)代用される。
産物)にのみ適用され、データベース配列には適用され
ない。デフォルト・フィルタリングは、BLASTNに
対してはDUSTであり、他のプログラムに対してはS
EGである。
ISS−PROTの配列に適用したとき、何もマスクさ
れないことは稀ではないので、フィルタリングがいつで
も効果を生むと期待してはならない。さらに、配列が全
体にマスクされてしまい、フィルターのかかっていない
疑義配列に対して報告されたいかなる一致の統計的有意
性も疑うべきであることを示す場合もある。
sion)及び/又は(遺伝子)座の名称に加えて、N
CBI giの同定記号が出力に示される。最も好まし
くは、配列比較は、http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/BLASTで提供される単純
なBLAST検索アルゴリズムを用いて実行される。
他のコンピュータ・プログラム方法の例には、GCGプ
ログラム・パッケージ(Devereux等(198
4)Nucleic Acids Research
12:387及びFASTA(Atschul等(19
90)J Molec Biol 403〜410)が
あるが、それに限定されるものではない。
naltiesが用いられるならば好ましくは、以下の
パラメータを使用する:
ント」及び「誘導体」は、配列の対立遺伝子変異を包含
する。
クレオチド配列にハイブリダイズできる配列に相補的な
配列も含む。 [ハイブリダイゼーション]ここに使用される「ハイブ
リダイゼーション」という用語は、Dieffenba
ch CW及びGS Dvekslerの論文(199
5、PCRプライマー、研究室マニュアル、コールド・
スプリング・ハーバー出版、プレインビュー、NY)に
記載されているポリメラーゼ連鎖反応において実行され
るような増幅工程だけでなく、「1本鎖の核酸が塩基対
合を介して相補的な鎖と結合する工程」(Coombs
J (1994)「バイオテクノロジー辞典」、スト
ックトン出版、ニューヨーク、NY)も含む。
erとKimmel(1987、分子クローニング技法
のガイド、「酵素学の手法」152巻、アカデミック出
版、サンディエゴ、CA)に示されるように、核酸結合
複合体の融点(Tm)に基づいており、「ストリンジェ
ンシィ」の定義は以下のように説明される。
シィとはポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を指
す。このような条件は当業者には明らかである。当業者
に知られているように、ハイブリッドの安定性は、配列
相同性が1%減少するごとに約1〜1.5℃減少するハ
イブリッドの融点(Tm)に反映される。一般に、ハイ
ブリッドの安定性はナトリウムイオンの濃度及び温度の
関数である。通常、より高位のストリンジェンシィ条件
下でハイブリダイゼーション反応を実施し、その後、様
々なストリンジェンシィで洗浄する。
シィとは1Mナトリウムイオン、65〜68℃において
安定なハイブリッドを形成する核酸配列にのみハイブリ
ダイゼーションを許容する条件を指す。
℃(プローブの融点より5℃低い温度)で起こる。高位
ストリンジェンシィは、プローブの融点より約5℃〜1
0℃低い温度で起こる。高位ストリンジェンシィ条件
は、例えば、6xSSC、5xデンハート(Denha
rdt)液、1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、
0.1Mピロリン酸ナトリウム、非特異的競合物として
の変性サケ精子DNA0.1mg/mlを含む水溶液に
おけるハイブリダイゼーションによってもたらされる。
ハイブリダイゼーションの後、高位ストリンジェンシィ
洗浄が幾つかの工程においてなされてもよく、最終洗浄
(約30分)は、0.2〜0.1xSSC、0.1%S
DS、ハイブリダイゼーション温度という条件下で実施
する。
プローブのTmより約10℃〜20℃低い温度で起こ
る。低位ストリンジェンシィは通常プローブのTmより
約20℃〜25℃低い温度で起こる。
ジェンシィ・ハイブリダイゼーションは同一のポリヌク
レオチド配列を同定又は検出するのに利用され、中位
(又は低位)ストリンジェンシィ・ハイブリダイゼーシ
ョンは類似又は関連したポリヌクレオチド配列を同定又
は検出するのに利用される。
ハイブリダイゼーションと同じだが約60〜62℃であ
る条件を指す。この場合、最終洗浄は、1xSSC、
0.1%SDS、ハイブリダイゼーション温度という条
件下で実施する。
約50〜52℃におけるハイブリダイゼーションに等し
い条件を指す。この場合、最終洗浄は、2xSSC、
0.1%SDS、ハイブリダイゼーション温度という条
件下で実施する。
ルムアミドを基本とする緩衝液)と温度を用いて構築
し、繰り返してよい。デンハート溶液とSSCは他の適
切なハイブリダイゼーション緩衝液と同じように当業者
には良く知られている(例えば、Sambrook等編
(1989)分子クローニング:研究室マニュアル、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、ニ
ューヨーク、又はAusubel等編(1990)分子
生物学の最新プロトコール、John Wiley &
Sons社を参照せよ)。最適なハイブリダイゼーシ
ョン条件は、プローブの長さ及びGC含量もある役割を
果たしているので、経験的に決定されるべきである。 [本発明のポリペプチド]本発明のポリペプチドは実質
的に単離された形態で存在する可能性がある。ポリペプ
チドはその意図された目的を干渉しない担体又は希釈剤
と混合してよく、依然として実質的に単離されたものと
みなされると理解される。本発明のポリペプチドはまた
実質的に精製された形態で存在する可能性もあるが、こ
の場合、一般に、調製物のポリペプチドの90%以上、例
えば、95%、98%又は99%が本発明のポリペプチドであ
る調製物中にポリペプチドを含む。本発明のポリペプチ
ドは、例えばヒスチジン残基の付加によりその精製を支
援する、又はシグナル配列の付加により以下に論じるよ
うな細胞からの分泌を促進するように修飾してもよい。
ば、Geysen等(1996)により記載されているよう
な)又は以下に論じるような組換え技術によって製造で
きる。
配列そのものには、本発明による天然のPDE11は、
それが自然環境に存在して、やはり自然環境に存在して
いる天然のヌクレオチドコード配列によって発現され、
そのヌクレオチド配列がやはり自然環境に存在している
天然のプロモータのコントロール下にある場合は、包含
されない。わかりやすくするために、この好ましい実施
形態を「非天然型アミノ酸配列」と呼ぶ。
異体」、「相同体」又は「フラグメント」という用語
は、その配列から又はその配列に1つ(又はそれ以上)
のアミノ酸が代替、変異、修飾、置換、欠損又は付加し
たものであり、その結果として生じる酵素は、PDE1
1活性、好ましくはSEQ ID No.2又はSEQ
ID No.4又はSEQ ID No.15として示
される酵素と少なくとも同等の生理活性を有する。特
に、「相同体」という用語は構造及び/又は機能に関す
る相同性を包含する。配列相同性に関しては、式Iとし
て示される配列に対して好ましくは少なくとも75%、
より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少な
くとも90%の相同性がある。式Iとして示される配列
に対して、より好ましくは少なくとも95%、より好ま
しくは少なくとも98%の相同性がある。SEQ ID
No.2又はSEQ ID No.4又はSEQ I
DNo.15として示される配列、又はSEQ ID
No.17及び/又はSEQ ID No.19を含む
アミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも75%、
より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少な
くとも90%の相同性がある。SEQ ID No.2
又はSEQ ID No.4又はSEQ ID No.
15として示される配列に対して、より好ましくは少な
くとも95%、より好ましくは少なくとも98%の相同
性がある。
アミノ酸配列の疎水性/親水性は維持されるべきであ
る。変更後の配列が、本発明によるPDE酵素として作
用する能力を保持している限り、アミノ酸置換、例えば
1、2又は3〜10、20又は30の置換がなされても
よい。アミノ酸置換は、例えば血中半減期を増加させる
ために非天然に存在している類縁体を使用してもよい。
ているヌクレオチド配列の、適切な発現系における発現
によって製造し得る。さらに、又は他に、タンパク質そ
のものの全体又は部分は、PDEのアミノ酸配列を合成
する化学的方法によって製造し得る。例えば、ペプチド
は固相法によって合成し、樹脂から切離し、調製的高速
液体クロマトグラフィーによって精製することができる
(例えば、Creighton(1983)「タンパク
質の構造と分子的原理」、WH Freeman an
d Co.ニューヨーク NY)。合成ペプチドの組成
はアミノ酸分析又は配列決定法(例えば、エドマン分解
法)によって確認し得る。
用してなし得る(RobergeJY等(1995)S
cience 269:202〜204)。自動合成
は、例えばABI 43 1A ペプチド・シンセサイ
ザー(パーキン・エルマー社)を製造業者の指示書に従
って操作することによって、可能である。さらに、PD
Eのアミノ酸配列又はそのいかなる部分も直接合成の間
に変更し得るし、及び/又は化学的方法を用いて、他の
サブユニットからの配列又はそのいかなる部分をも結合
して、変異したポリペプチドを製造することも可能であ
る。
質をコードするために、PDEの天然型、修飾型又は組
換え型の配列を異種の配列と結合させることが可能であ
る。例えば、PDE活性の阻害剤を求めてペプチド・ラ
イブラリーをスクリーニングするためには、市販の抗体
によって認識される異種エピトープを発現するキメラP
DEタンパク質をコードすることが有用であろう。融合
タンパク質はまた、PDE配列と異種タンパク配列の間
に位置する開裂部位を含み、PDEを異種の部分から切
離して精製することができるように設計され得る。
ための1つ又はそれ以上のポリペプチド・ドメインが付
加された組換えタンパク質としても発現される。このよ
うな精製促進ドメインは、固定化金属上の精製を可能に
するヒスチジン−トリプトファン・モジュールのような
金属キレート・ペプチド(Porath J(199
2)Protein Expr Purif 3−.2
6328 1)、固定化免疫グロブリン上の精製を可能
にするプロテインAドメイン及びFLAGS拡張/親和
性精製システム(イミュネクス社、シアトル、WA)に
利用される領域を含むが、これらに限定されない。精製
ドメインとPDEの間にXA因子又はエンテロキナーゼ
(インビトロジェン社、サンディエゴ、CA)のような
切り離し可能なリンカー配列を導入することは、精製を
促進する上で、有用である。
EQ ID No.2及びSEQID No.4及びS
EQ ID No.15及びSEQ ID No.17
及びSEQ ID No.19として示される。しかし
ながら、本発明は、SEQID No.2又は4又は1
5又は17又は19というアミノ酸配列に対して少なく
とも60%の同一性(より好ましくは少なくとも75%
の同一性)を有するアミノ酸配列を含む、PDE11フ
ァミリーに由来する他のものをコードするアミノ酸配列
も含む。すでに示したように、本発明によるPDE11
ファミリーの適切な一般式は式I又は式II〜式VII
の一つとして提示される。
ミノ酸配列及びその変異体のフラグメントを含む。適切
なフラグメントのサイズは少なくとも5つ、例えば、少
なくとも10、12、15又は20個のアミノ酸であ
る。
置換を含めて、1つ又はそれ以上の(例えば、少なくと
も2、3、5又は10)置換、欠失又は挿入を含むよう
に修飾してもよい。
ック及び好ましくは第三カラムの同一ラインのアミノ酸
がお互いに置換される、保守的な置換を示す以下の表に
よってなされる。
レオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列
又はポリペプチドヌクレオチド配列及びその変異体、相
同体、フラグメント及び誘導体(その一部等)を指す。
ヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成又は組換えを起源
とし、センス又はアンチセンス鎖のいずれかを表わす2
本鎖又は1本鎖のDNA又はRNAであり得る。
用語はDNAを意味する。より好ましくは、「ヌクレオ
チド配列」という用語は、組換えDNA技術を利用して
製造されたDNA(即ち、組換えDNA)を意味する。
ている本発明の天然のヌクレオチド配列は、それがやは
り自然環境に存在している天然のプロモータのコントロ
ール下にある場合は、本発明のヌクレオチド配列そのも
のには包含されない。わかりやすくするために、この好
ましい実施形態を「非天然型ヌクレオチド配列」と呼
ぶ。
又は修飾されたヌクレオチドを含む場合がある。オリゴ
ヌクレオチドに対する様々なタイプの修飾が多数この技
術分野で知られている。それはホスホン酸メチル及びホ
スホロチオエート骨格分子の3'及び/又は5'末端にア
クリジン又はポリリジン鎖を付加することを含む。本発
明の目的のためにはここに示されているヌクレオチド配
列は当該技術分野で利用し得るあらゆる方法によって修
飾してよい。このような修飾は本発明のヌクレオチド配
列のインビボ活性又は寿命を高めるために実施され得
る。
的なヌクレオチド配列又はあらゆるその誘導体、フラグ
メント又は誘導体を含む。その配列がそのフラグメント
に相補的であるならば、その配列は他の生物体等に存在
する同様のコード配列を同定するためのプローブとして
利用し得る。
ブリダイズできるヌクレオチド配列又はあらゆるその誘
導体、フラグメント又は誘導体を含む。本発明はまた、
ここに示された配列と相補的である配列にハイブリダイ
ズできるヌクレオチド配列又はあらゆるその誘導体、フ
ラグメント又は誘導体を含む。
れたヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列と相
補的である配列を含む。好ましくは、「変異体」という
用語は、ストリンジェントな条件(例えば、65℃、
0.1xSSC{1xSSCは、0.15M塩化ナトリ
ウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.
0})下でここに示されたヌクレオチド配列にハイブリ
ダイズできる配列と相補的である配列を含む。
補配列を含めて)本発明のヌクレオチド配列にハイブリ
ダイズできるヌクレオチド配列に関する。本発明はま
た、(ここに示された配列の相補配列を含めて)本発明
のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列と相補
的であるヌクレオチド配列に関する。
条件下でここに示されたヌクレオチド配列にハイブリダ
イズできるポリヌクレオチド配列も本発明の範囲に含ま
れる。
ェントな条件(例えば65℃、0.1xSSC)下で本
発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレ
オチド配列を含む。
質をコードして、SEQ ID No.1又はSEQ
ID No.3又はSEQ ID No.14又はSE
QID No.16又はSEQ ID No.18とし
て示されたDNA配列又はそのDNA配列から選択され
たフラグメントにハイブリダイズするヌクレオチド配列
として特徴づけることができる。好ましいのは、高位ス
トリンジェンシィ条件下でSEQ ID No.1又は
SEQ ID No.3又はSEQ IDNo.14又
はSEQ ID No.16又はSEQ ID No.
18の配列とハイブリダイズする、PDE11のコード
配列である。
o.1のフラグメント又はSEQ ID No.3のフ
ラグメント又はSEQ ID No.14又はSEQ
IDNo.16又はSEQ ID No.18のフラグ
メントと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
できる核酸配列を提供する。好ましくは、フラグメント
は長さが15から50塩基である。有利には、長さが約
25塩基である。
オチド配列に関する「変異体」、「相同体」又は「フラ
グメント」という用語は、その配列から又はその配列に
1つ(又はそれ以上)の核酸が代替、変異、修飾、置
換、欠損又は付加したものであり、その結果として生じ
るヌクレオチド配列は、PDE11活性、好ましくはS
EQ ID No.1又はSEQ ID No.3又は
SEQ ID No.14として示される配列によって
コードされる酵素と少なくとも同等の生理活性を有する
酵素をコードする又はコードする能力がある。特に、
「相同体」という用語は構造及び/又は機能に関する相
同性を包含し、得られたヌクレオチド配列はPDE11
活性を有する酵素をコードする又はコードする能力があ
る。配列相同性に関しては、式Iとして示されるアミノ
酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して好ましく
は少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85
%、より好ましくは少なくとも90%の相同性がある。
式Iとして示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列配列に対して、より好ましくは少なくとも95
%、より好ましくは少なくとも98%の相同性がある。
好ましくは、配列相同性に関して、SEQ ID N
o.1又はSEQ ID No.3又はSEQ IDN
o.14又はSEQ ID No.16又はSEQ I
D No.18として示される配列に対して、好ましく
は少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85
%、より好ましくは少なくとも90%の相同性がある。
SEQ IDNo.1又はSEQ ID No.3又は
SEQ ID No.14として示される配列に対し
て、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは
少なくとも98%の相同性がある。
をコードするDNA配列(好ましくはcDNA配列)に
関する。特に、本発明は、PDE11A1又はPDE1
1A2又はPDE11A3又はPDE11A4をコード
するcDNA配列に関する。
SEQ ID No.3又はSEQID No.14又
はSEQ ID No.16又はSEQ ID No.
18又はそれら配列の対立遺伝子変異のDNA配列を含
むDNAセグメントに関する。
立遺伝子変異が取り込まれた宿主細胞における発現によ
って製造されたポリペプチドに関する。本発明の特に好
ましい態様は、(SEQ ID No.2又はSEQ
IDNo.4又はSEQ ID No.15又はSEQ
ID No.17又はSEQ ID No.19のよ
うな)式Iのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関す
る。例えば、本発明は、(SEQ ID No.2又は
SEQ ID No.4又はSEQ ID No.15
又はSEQ ID No.17又はSEQ IDNo.
19のような)式Iのアミノ酸配列を含む単離されたポ
リペプチドに関する。
はSEQ ID No.3又はSEQ ID No.1
4又はSEQ ID No.16又はSEQ ID N
o.18またはその対立遺伝子変異のDNA配列を含む
DNAに関する。
はSEQ ID No.3又はSEQ ID No.1
4又はSEQ ID No.16又はSEQ ID N
o.18またはその対立遺伝子変異のDNA配列を含む
非天然型のDNAに関する。
D No.1又はSEQ ID No.3又はSEQ
ID No.14又はSEQ ID No.16又はS
EQID No.18またはその対立遺伝子変異のDN
A配列を含む組換えDNAに関する。
明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。遺伝暗
号の縮重の結果として、ある特定のアミノ酸をコードす
るのに種々様々なポリヌクレオチドがあることが理解さ
れよう。
によって、本発明のポリペプチドをコードするcDNA
及び/又はゲノム・クローンのような部分長及び全長の
核酸を設計することができる。例えば、本発明のポリヌ
クレオチドはここに示されたアミノ酸配列をコードする
配列をターゲットするように設計されたプライマーを用
いる縮重PCRを利用することによって得られる。通常
プライマーには多種の縮重ポジションがある。しかしな
がら、縮重を最小化するためには、メチオニンのような
唯一のトリプレットによってコードされるアミノ酸を含
む、ここに示したようなアミノ酸配列の領域をコードす
る配列が選択される。さらに、配列は、その核酸がPC
R手法の鋳型DNAとして用いられる生物体のコドン使
用を考慮して選択される。PCRは、既知の配列に対し
て単一の配列(非縮重)プライマーで配列をクローニン
グするのに利用される条件よりも低位のストリンジェン
シィ条件で用いられる。
プチドフラグメントをコードする核酸配列は、ハイブリ
ダイゼーションによりライブラリーをスクリーニングす
る技術を利用して、より大きな配列を得るために利用さ
れる可能性がある。例えば、PCRクローンは放射活性
原子で標識し、他の生物種、好ましくは他の哺乳類由来
のcDNA又はゲノム・ライブラリーをスクリーニング
するために利用される可能性がある。ハイブリダイゼー
ション条件は通常中位から高位のストリンジェンシィ
(例えば、0.03M塩化ナトリウム及び0.03Mク
エン酸ナトリウム、約50℃〜約60℃)である。
ドする縮重核酸プローブを利用して、cDNA及び/又
は他の生物種、好ましくは他の哺乳類由来のゲノム・ラ
イブラリーをプローブしてもよい。しかしながら、初め
にPCR技術を実行して、さらなるスクリーニング工程
に使用する単一の配列を得ることが望ましい。
チドのフラグメント、その融合タンパク質又は機能的同
等物をコードするPDE11のポリヌクレオチド配列
は、適切な宿主細胞におけるPDE11の発現を指令す
る組換えDNA分子を生産するために利用し得る。遺伝
暗号本来の縮重性のために実質的に同じ又は機能的に等
価なアミノ酸配列をコードする他のDNA配列もPDE
11のクローン化及び発現に利用し得る。当業者に理解
されるように、非天然に存在しているコドンを有するP
DEをコードするヌクレオチド配列を製造することが有
利であろう。例えば、PDE11の発現速度を高める又
は天然に存在している配列から産生される転写産物より
半減期が長いというような所望の性質を有する組換えR
NA転写産物を製造するために、特殊な原核又は真核細
胞の宿主(Murray E等(1989)Nuc.A
cid Res.17:477〜508)によって好ま
れるコドンが選択され得る。
発明のポリヌクレオチド配列は、上記に記載した技術を
利用して、さらに別の相同的な配列又は変異体を得るた
めに利用し得る。それはまた、例えばポリヌクレオチド
配列を発現させる特定の宿主細胞のコドン選択性を最適
化することを目的として、多様な宿主細胞系において本
発明のポリペプチドを発現させる用途のために修飾され
得る。制限酵素の認識部位を導入する又はポリヌクレオ
チドによってコードされるポリペプチドの性質又は機能
を変更するためには他の配列変換も望ましい。
DE11のポリヌクレオチド配列は、結果として同一又
は機能的に同等なPDEをコードするポリヌクレオチド
を生じる種々のヌクレオチド残基の欠失、挿入又は置換
を含む。PDE11タンパク質も、潜在的な変化(si
lent change)を生じているが機能的には同
等なPDEとなるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を
有していてもよい。PDEの生理活性が保持され得る範
囲で、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び
/又は両性における類似性を慎重に考慮してアミノ酸置
換はなされるであろう。例えば、電荷が陰性のアミノ酸
にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、電荷が陽
性のアミノ酸にはリジン及びアルギニンがあり、同様の
親水性値を有する非荷電性の極性基頭部を有するアミノ
酸にはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、ア
ラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニ
ン、フェニルアラニン及びチロシンがある。
まれる。ここに使用される、「対立遺伝子」又は「対立
遺伝子配列」とはPDEの別の形態である。対立遺伝子
は突然変異、即ち核酸配列における変化から生じて、一
般に、構造又は機能が変化しているか又は変化していな
い変更されたmRNA又はポリペプチドを産生する。ど
の特定の遺伝子も対立遺伝子の形態を持たないか又は1
つ又は多く持つ。対立遺伝子を生む突然変異的変化は、
通常、アミノ酸の欠失、付加又は置換に帰される。この
ようなタイプの変化はそれぞれ単独で発生するか又は他
の変化とともに、ある特定の配列において1回又はそれ
以上の回数で起こる。
ためにPDEコード配列を変更する−遺伝子産物のクロ
ーニング、プロセシング及び/又は発現を修飾する変更
を含むがそれに限定されない−ために遺伝子工学的に処
理され得る。例えば、新しい制限部位を挿入する、グリ
コシル化パターンを変更する又はコドン選択性を変化さ
せるための部位特異的突然変異誘発のような、本発明技
術分野でよく知られている技術を利用して、突然変異を
導入し得る。
Rプライマー、別の増幅反応用プライマーのようなプラ
イマー、例えば放射活性又は非放射活性標識体を用いる
従来の方法によってラベル標識されている等のプローブ
を製造するために利用し得るし、又はポリヌクレオチド
はベクターに導入してクローン化してもよい。このよう
なプライマー、プローブ及び他のフラグメントの長さは
少なくとも15、好ましくは少なくとも20、例えば少
なくとも25、30又は40のヌクレオチドであり、こ
こで用いられているような本発明のポリヌクレオチドと
いう用語にも含まれる。
には標識ラベルを付してよい。適切なラベルは32P又は
35Sのような放射性同位体、酵素ラベル又はビオチンの
ような他のタンパク質ラベルを含む。このようなラベル
は本発明のポリヌクレオチド又はプライマーに付加して
それ自身知られている技術を用いて検出され得る。
プライマーのようなポリヌクレオチドは、組換え的に、
合成的に又は当業者が利用し得る手段によって製造し得
る。それはまた標準的な技術によってクローン化し得
る。
得るために、1回ごとに1つのヌクレオチドの段階的製
造法によって、合成的手段によって製造される。自動化
技術を利用してこれを達成する技術はこの技術分野で容
易に実用化されている。
手段、例えばPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)クローニ
ング技術を利用して製造される。この方法は、クローン
化が望まれるヌクレオチド配列領域に一対のプライマー
(例えば、約15〜30のヌクレオチド)を製造するこ
と、このプライマーを真菌、植物又は原核細胞より得ら
れるmRNA又はcDNAに接触させること、所望の領
域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実
行すること、増幅されたフラグメントを(例えば反応混
合物をアガロースゲル上で精製して)単離すること、及
び増幅されたDNAを回収すること、を含む。プライマ
ーは、増幅されたDNAが適切なクローニング・ベクタ
ーにクローン化され得るように、適切な制限酵素認識部
位を含むように設計し得る。
増加させるように修飾し得る。可能な修飾には、分子の
5'及び/又は3'末端にフランキング配列を付加するこ
と又は、分子骨格内部のホスホジエステラーゼ結合に代
えてホスホロチオエート又は2'O−メチルを利用する
ことが含まれるが、それに限定されるものではない。
ID No.1又はSEQ IDNo.3又はSEQ
ID No.14又はSEQ ID No.16又はS
EQ ID No.18又はその対立遺伝子変異の全て
又は部分にハイブリダイズできるヌクレオチド配列に関
する。このヌクレオチド配列はPDE11発現を修飾す
るアンチセンス技術に利用できる可能性がある。また、
これらの配列(又はその一部)は、プローブとして、又
はポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとして利用される
ときは、そのような配列の全て又は部分の増幅用に利用
し得る。
列も新薬発見において有用である。ある特定のイソ型の
翻訳タンパク質を阻害するよりそのmRNA転写を阻害
するのに極めて有用である場合がある。このことが特に
PDE11に当てはまるのは、様々なスプライシング変
異体を様々なプロモーターから転写させ得るからであ
る。マウスの脳の2',3'−サイクリック−ヌクレオチ
ド3'ホスホジエステラーゼの転写を複数のプロモータ
に指令させた例がある(Kurihara T等、Bi
ochem.Biophys.Res.Comm.17
0:1074[1990])。
ひとたび判明すれば、各アイソザイム又はスプライシン
グ変異体を特異的に検出するアッセイを設計するのに必
要な情報がもたらされることである。アイソザイム特異
的PCRプライマー対は、アイソザイム又はスプライシ
ング変異体の特異的DNA配列に関する知識に完全に依
存したアッセイの1例にすぎない。このようなアッセイ
によってアイソザイムのmRNAが検出され、各アイソ
ザイムの組織分布やある特定の病態に対する生物学的関
連性を知ることが可能になる。それはまた唯一のアイソ
ザイムを自然に発現している可能性がある細胞系の同定
も可能にするが、この発見があれば組換え遺伝子を発現
させる必要性はなくなる。もし特定のPDE11アイソ
ザイムがある特定の病態に関連していることが示された
ならば、本発明はアイソザイムmRNAの存在を検出す
る診断アッセイの設計において有用であろう。
ドしているヌクレオチド配列の異常レベルは、核酸欠失
又は突然変異のような染色体異常を反映する可能性があ
る。それ故、PDE11をコードしているヌクレオチド
配列は、PDEコード遺伝子における欠損、突然変異又
は染色体転座のような染色体異常を検出する診断に利用
され得るプローブの基礎を提供する。このような病態で
はPDE11遺伝子の発現が変化している可能性がある
か又はPDE11コード遺伝子領域に染色体異常が存在
している可能性がある。
配列は、この技術分野でよく知られている化学的な方法
を利用して、全体的又は部分的に、合成し得る(Car
uthers MH等(1980) Nuc Acid
s Res Symp Ser 215〜23、Hor
n T等(1980) Nuc Acids ResS
ymp Ser 225〜232を参照せよ)。 [調節配列]好ましくは、本発明のポリヌクレオチド
は、選択された宿主細胞によるようなコード配列の発現
を規定し得る調節配列と機能可能に結合している。例え
ば、本発明はこのような調節配列と機能可能に結合した
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを包含する。
即ち、このベクターは発現ベクターである。
は、記載された成分がその意図されたやり方で機能し得
る関係にあるように並置されることを指す。コード配列
に「機能可能に結合している」調節配列は、コントロー
ル配列と同じ条件下でコード配列の発現が達成されるよ
うに結びついている。
エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む。「プロ
モーター」という用語は本技術分野の通常の意味で使わ
れる。例えば、RNAポリメラーゼ結合部位である。
クレオチドの発現を増加させることはまた、例えばプロ
モーターや分泌リーダー領域及び終始領域のような、選
択された発現宿主由来の関心対象となるタンパク質の発
現及び、所望により、分泌を増加させること及び/又は
本発明のポリペプチドの発現の誘導コントロールを規定
することに役立つ異種の調節領域の選択によっても達成
し得る。
少なくともプロモーターに機能可能に結合し得る。本発
明のポリペプチドの発現を指令するためには、本発明の
ポリペプチドをコードしている遺伝子に本来備わってい
るプロモーターとは別に、他のプロモーターを利用し得
る。プロモーターは、所望の発現宿主における本発明の
ポリペプチドの発現を指令する効率性によって選択され
得る。
プチドの発現を指令するために、構成的プロモーターが
選択され得る。このような発現構造体が更なる利点を提
供し得るのは、それが誘導基質を含む培養液で発現宿主
を培養する必要性を無くすからである。
好ましい強力な構成的及び/又は誘導的プロモーターの
例は、キシラナーゼ(xlnA)、フィターゼ、ATP
−シンテターゼ、サブユニット9(oliC)、トリオ
ースリン酸イソメラーゼ(tpi)、アルコールデヒド
ロゲナーゼ(AdhA)、α−アミラーゼ(amy)、
アミログルコシダーゼ(glaA遺伝子由来のAG)、
アセトアミダーゼ(amdS)及びグリセルアルデヒド
−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gpd)の各プロモー
ターの真菌遺伝子から入手できるものである。
ルデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、3−ホスホグリセリ
ン酸キナーゼ及びトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝
子から入手できるものである。
ラーゼ及びSP02のプロモーター及び細胞外プロテア
ーゼ遺伝子由来のプロモーターである。発現構築体の誘
導調節を改善するためにハイブリッド・プロモーターも
利用され得る。
発現を確保又は増加させる特徴を含み得る。例えば、こ
の特徴とは、プリブナウ(Pribnow)ボックス又
はTATAボックスのような保存された領域であり得
る。プロモーターはまた本発明のヌクレオチド配列の発
現レベルに影響を与える(維持、増加、減少させる)他
の配列を含む場合がある。例えば、適切な他の配列に
は、Sh1−イントロン又はADHイントロンがある。
他の配列は、温度、化学品、光又はストレスにより誘導
されるような誘導要素配列を含む。また、転写又は翻訳
を増加させるのに適した要素配列も存在し得る。後者の
例はTMV5'シグナル配列(Sleat、Gene
217[1987]217〜225、及びDawso
n、PlantMol.Biol.23[1993]9
7を参照せよ)である。 [分泌]本発明のポリペプチドが発現宿主から培養液へ
分泌されることがしばしば望ましいのは、そこから本発
明のポリペプチドがより容易に回収されるからである。
本発明によれば、分泌リーダー配列は、望ましい発現宿
主を基に選択され得る。ハイブリッド・シグナル配列も
本発明の文脈に沿って利用され得る。
真菌のアミログルコシダーゼ(AG)遺伝子(例えば、
アスペルギルス属由来のglaA−18及び24アミノ
酸体の双方)、a−ファクター遺伝子(サッカロミセス
属及びクリーベロミセス属のような酵母)又はα−アミ
ラーゼ遺伝子(バシラス属)由来のものである。 [構築体]「結合体」、「カセット」及び「ハイブリッ
ド」のような用語と同義である「構築体」という用語
は、プロモーターと直接的又は間接的に付着した本発明
によるヌクレオチド配列を含む。間接的な付着の例は、
Sh1−イントロン又はADHイントロンのようなイン
トロン配列のような、適当なスペーサーグループがプロ
モーターと本発明のヌクレオチド配列の間に割り込むこ
とである。同じことは、本発明に関連した「融合した」
という用語にも当てはまり、直接的又は間接的な付着を
含む。いずれの場合でも、この用語は、野生型の遺伝子
プロモーターと通常結合していていずれも自然環境に存
在しているタンパク質をコードするヌクレオチド配列の
自然の組み合わせを包含するものではない。
性さえあるが、このマーカーによって、それが転移され
る、例えば枯草菌のような好ましくはバシラス属の細菌
又はポテト、サトウキビのような植物において、この遺
伝的構築体の選択が考慮される。例えば(特に植物の)
マンノース−6−リン酸イソメラーゼをコードしている
マーカー、又は抗生物質への耐性−例えばG418、ヒ
グロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン及びゲン
タマイシンに対する耐性−を規定するマーカーのよう
に、利用し得る様々なマーカーがある。
ターに機能可能に結合した本発明のヌクレオチド配列を
少なくとも含む。 [ベクター]「ベクター」という用語は発現ベクター及
び形質転換ベクター及びシャトルベクターを含む。
ロで発現できる構築体を意味する。「形質転換ベクタ
ー」は、ある実体から別の実体−同じ生物種であるか別
の生物種である−へ転移し得る構築体を意味する。この
構築体がある種から別の種へ転移し得る−例えば、大腸
菌プラスミドからバシラス属のような細菌へ−ならば、
この形質転換ベクターは「シャトルベクター」と呼ばれ
ることがある。これは、大腸菌プラスミドからアグロバ
クテリウム属、植物へ転移される構築体である場合もあ
る。
に適切な宿主細胞へ形質転換されて本発明のポリペプチ
ドの発現を規定し得る。従って、本発明の別の態様で
は、発現ベクターで形質転換された又はそれを移入され
た宿主細胞を、ポリペプチドをコードしているコード配
列の発現をこのベクターによって規定する条件下で培養
すること及び発現されたポリペプチドを回収することを
含む、本発明によるポリペプチドを製造する方法を提供
する。
り上記ポリヌクレオチドの発現プロモーター及び、所望
によりプロモーターの調節部分を備えたプラスミド、ウ
ィルス又はファージベクターである。
択されるマーカー遺伝子を含み得る。工業用微生物に最
も適した選択系は、宿主生物体における突然変異を必要
としない選択マーカーのグループによって形成されるも
のである。真菌の選択マーカーの例は、アセトアミダー
ゼ(amdS)、ATPシンテターゼ、サブユニット9
(oliC)、オロチジン−5'−リン酸デカルボキシ
ラーゼ(pvrA)、フレオマイシン及びベノミル耐性
(benA)の遺伝子である。非真菌の選択マーカーの
例は、細菌のG418耐性遺伝子(これは酵母にも使え
るが糸状真菌には使えない)、アンピシリン耐性遺伝子
(大腸菌)、ネオマイシン耐性遺伝子(バシラス)及び
β−グルクロニダーゼ(GUS)をコードする大腸菌の
uidA遺伝子である。
インビトロで使用でき、又は宿主細胞を感染(トランス
フェクト)又は形質転換するために使用できる。従っ
て、本発明のポリヌクレオチドは組換えベクター(通常
は、複製可能なベクター)、例えばクローニング又は発
現ベクターへ取り込むことができる。ベクターは適合可
能な宿主細胞において核酸を複製するために利用し得
る。従って、別の実施形態では、本発明は、複製可能な
ベクターに本発明のポリペプチドを導入すること、適合
可能な宿主細胞へベクターを導入すること及びベクター
の複製をもたらす条件下で宿主細胞を培養することによ
って、本発明のポリペプチドを製造する方法を提供す
る。ベクターは宿主細胞から回収し得る。適切な宿主細
胞は発現ベクターに関連して以下に記載される。
体、相同体、フラグメント又は誘導体を発現する遺伝子
工学的に処理された宿主細胞の、ホスホジエステラーゼ
活性をモジュレートしてサイクリックヌクレオチドのレ
ベルを調節するPDE11の阻害剤及び拮抗剤を同定す
るスクリーニング方法における用途に関する。このよう
な遺伝子工学的に処理された宿主細胞は、PDE11活
性を調節し得るペプチド・ライブラリー又は有機分子を
スクリーニングするために利用し得る。抗体、ペプチド
又は有機低分子のようなPDE11の拮抗剤及び阻害剤
は、例えば男性の勃起不全に関連した疾患の治療のため
の医薬組成物の基礎を提供する。このような阻害剤又は
拮抗剤は単独で又はこのような疾患の他の治療薬と共に
投与され得る。
ンビボ又はインビトロで製造すること又はPDE11の
発現又は活性に影響を与え得る薬剤をスクリーニングす
ることを目的とする、PDE11をコードするポリヌク
レオチド配列又はその変異体、相同体、フラグメント又
は誘導体を含む発現ベクター及び宿主細胞に関する。 [組織]ここで用いられている「組織」という用語は、
組織そのもの及び器官を含む。 [宿主細胞]本発明に関連した「宿主細胞」という用語
は、本発明による組換えタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列及び/又はそれより得られる産物を含むあら
ゆる細胞を包含するものであって、プロモーターが宿主
細胞の中に存在するとき、それにより本発明によるヌク
レオチド配列が発現できる。
のポリヌクレオチドで形質転換された又はそれに感染し
た宿主細胞を提供する。好ましくは、上記のポリヌクレ
オチドは上記ポリヌクレオチドの複製及び発現のために
ベクターに担われている。宿主細胞は上記ベクターと適
合するものが選択され、例えば原核(例えば細菌)、真
菌、酵母又は植物細胞である。
現の宿主として広く使われている。しかしながら、その
内部では大量の雑多なタンパク質が蓄積しやすい。大腸
菌の細胞内タンパク質全体から所望のタンパク質を引き
続いて精製することは時に困難である。
種宿主として非常に適しているのはタンパク質を培養液
に分泌する能力のためである。宿主として適している他
の細菌は、ストレプトマイセス及びシュードモナス属の
ものである。
クレオチドの性質及び/又は発現されたタンパク質のさ
らなる処理の必要性に照らせば、酵母又は他の真菌のよ
うな真核宿主の方が好まれる。一般に、酵母細胞が真菌
細胞よりも好まれるのはより操作しやすいためである。
しかしながら、酵母細胞から分泌されにくいタンパク質
もあれば、(例えば酵母内の過糖鎖形成(hyperg
lycosylation)のために)うまく処理され
ないタンパク質もある。このような場合は、別の真菌宿
主生物体が選択されるべきである。 本発明の範囲内に
ある適切な発現宿主の例は、アスペルギルス種(EP−
A−0184438及びEP−A−0284603に記
載されているような種)及びトリコデルマ種のような真
菌、バシラス属の細菌(EP−A−0134048及び
EP−0253455に記載されているような種)、ス
トレプトマイセス種及びシュードモナス種、及び、クリ
ーベロミセス種(EP−A−0096430及びEP−
A−0301670に記載されているような種)及びサ
ッカロミセス種のような酵母である。例えば、典型的な
発現宿主は、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス
・ニガー・バー・チュビケニス、アスペルギルス・ニガ
ー・バー・アワモリ、アスペルギルス・アクレアチス、
アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・オー
ブツァエ、トリコデルマ・リーセイ、枯草菌、バシラス
・リシェニフォルミス、バシラス・アミロリクェファシ
エンス、クリーベロミセス・ラクティス及びサッカロミ
セス・セレビシエから選択され得る。
な宿主細胞を用いると、本発明の組換え発現産物に最適
な生理活性を与えるのに必要とされるような翻訳後の修
飾(例えば、ミリスチン酸化、糖鎖形成、切断(トラン
ケーション)、不活性化(ラピデーション)及びチロシ
ン、セリン又はトレオニンのリン酸化)が行われる可能
性がある。 [生物体]本発明に関連した「生物体」という用語は、
本発明による組換えタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列及び/又はそれより得られる産物を含み得るあら
ゆる生物体を包含するものであって、プロモーターが生
物体の中に存在するとき、本発明によるヌクレオチド配
列を発現させる。生物体の例は真菌、酵母又は植物を含
み得る。
物体」という用語は、本発明によるタンパク質をコード
するヌクレオチド配列及び/又はそれより得られる産物
を含むあらゆる生物体を包含するものであって、プロモ
ーターは生物体の内部で、本発明によるヌクレオチド配
列を発現させる。好ましくは、ヌクレオチド配列は生物
体のゲノムの中に取り入れられている。
は、自然環境に存在している天然のヌクレオチドコード
配列がやはり自然環境に存在している天然のプロモータ
のコントロール下にある場合は、本発明による天然のヌ
クレオチドコード配列を包含しない。さらに、本発明
は、天然のタンパク質が自然環境に存在していて、やは
り自然環境に存在している天然のヌクレオチドコード配
列によって発現され、そのヌクレオチド配列がやはり自
然環境に存在している天然のプロモータのコントロール
下にある場合は、本発明による天然のタンパク質を包含
しない。
体は、本発明によるアミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列、本発明による構築体(その組み合わせたもの
を含む)、本発明によるベクター、本発明によるプラス
ミド、本発明による細胞、本発明による組織又はその産
物のうち1つ又はその組み合わせを含む生物体を包含す
る。形質転換された細胞又は生物体は、細胞又は生物体
から容易に回収し得る妥当量の所望化合物を製造し得
る。 [宿主細胞/宿主生物体の形質転換]前述したように、
宿主生物体は、原核又は真核生物である。適切な原核宿
主の例は大腸菌及び枯草菌を含む。原核宿主の形質転換
に関する教示は本技術分野において十分文書化されてい
て、例えばSambrook等(「分子クローニング:
実験マニュアル」第2版、1989、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー出版)及びAusube
l等の「分子生物学の最新プロトコール」(199
5)、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、が参考に
なる。
配列は、イントロン除去のように、形質転換の前に適切
に修飾される必要がある場合がある。別の実施形態で
は、トランスジェニック生物体は酵母である。この点
で、酵母も異種遺伝子発現の運搬体として広く利用され
てきた。サッカロミセス・セレビシエ種は、異種遺伝子
発現の用途を含めて、長いこと工業的に利用されてい
る。サッカロミセス・セレビシエにおける異種遺伝子の
発現は、Goodey等(1987、「酵母のバイオテ
クノロジー」、D R Berry等編、401〜42
9頁、アレン・アンド・アンウィン社、ロンドン)及び
King等(1989、「酵母の分子細胞生物学」E
F Walton及びG T Yarronton編、
107〜133頁、ブラッキィ社、グラスゴー)に概説
されている。
シエは異種遺伝子発現に好適である。第一に、人体に無
害であり、ある種の内毒素を産生できないこと。第二
に、種々の目的で数世紀にわたって産業的に利用され、
長く安全に使用されていること。このために広く一般に
受け入れられている。第三に、この生物体に注がれた広
範な産業利用と研究によって、サッカロミセス・セレビ
シエの大量発酵特性だけでなくその遺伝学及び生理学に
関する豊富な知識がもたらされたこと。
遺伝子発現及び遺伝子産物の分泌に関する原理は、E
Hinchcliffe E Kenny(1993、
「異種遺伝子発現の運搬体としての酵母」、「酵母」、
第5巻、Anthony HRose及びJ Stua
rt Harrison編、第2版、アカデミック・プ
レス社)に概説されている。
クターが実用化されているが、それを維持して自動的に
プラスミド・ベクターを複製させるには宿主ゲノムとの
組換えが必要とされる。
造するには、酵母で発現するように設計された構築体の
中へ本発明のヌクレオチド配列を挿入することによっ
て、発現構築体を製造する。異種発現のために利用され
る幾つかのタイプの構築体が開発されてきた。構築体
は、本発明のヌクレオチド配列に融合した、酵母で活性
のあるプロモーターを含むが、通常は、GAL1プロモ
ーターのような酵母起源のプロモーターが使われる。通
常は、SUC2シグナル・ペプチドをコードする配列の
ような、酵母起源のシグナル配列が使われる。酵母で活
性のあるターミネーターがこの発現系を終了させる。
換プロトコールが開発されてきた。例えば、本発明によ
るトランスジェニック・サッカロミセスは、Hinne
n等(1978、Proceedings of th
e National Academy of Sci
ences of the USA 75,192
9)、Beggs,JD(1978,Nature,L
ondon,275,104)及びIto,H等(19
83,J Bacteriology 153,163
〜168)の教示によって製造し得る。
ーカーを利用して選択される。形質転換のために利用さ
れるマーカーには、LEU2、HIS4及びTRP1の
ような多くの栄養要求性マーカー、及びアミノグリコシ
ド耐性マーカー(例、G418)のような主要抗生物質
耐性マーカーがある。
修飾された植物を構築するときの基本原理は、植物ゲノ
ムに遺伝情報を挿入し、挿入された遺伝物質の安定な維
持体を得ることである。
るが、2つの基本原理は、遺伝情報を直接導入すること
と、ベクター系を利用して遺伝情報を導入することであ
る。一般的な技術の概説は、Potrykus(Ann
u Rev Plant Physiol Plant
Mol Biol[1991]42:205〜22
5)及びChristou(Agro−Food−In
dustry Hi−Tech March/Apri
l 1994 17〜27)の論文にある。植物の形質
転換に関する更なる教示は、EP−A−0449375
に見出せる。
o.1又はSEQ ID No.3又はSEQ ID
No.14又はSEQ ID No.16又はSEQ
IDNo.18として示されたヌクレオチド配列又はそ
の誘導体、相同体、変異体又はフラグメントで宿主細胞
を形質転換する方法を提供する。
された宿主細胞は、コードされたタンパク質が発現し、
細胞培養液から回収されるのに適した条件の下で培養さ
れ得る。組換え細胞によって製造されたタンパク質は分
泌されるか又は使われた配列及び/又はベクターによっ
ては細胞内に封じられる。当業者に理解されるように、
PDEコード配列を含む発現ベクターは、特定の原核又
は真核細胞の膜を介したPDEコード配列の分泌を指示
するシグナル配列を付けて設計され得る。組換え構築物
のなかには、ポリペプチド・ドメインをコードしている
ヌクレオチド配列へPDEコード配列をつなげて、可溶
性タンパク質の精製を促進させ得るものもある(Kro
ll DJ等(1993)DNA Cell Biol
12:441〜53、また、融合タンパク質を含むベ
クターに関する先述の議論も参照のこと)。 [ポリペプチドの生産]本発明によれば、本発明のポリ
ペプチドの生産は、例えば、本発明の1つ又はそれ以上
のポリヌクレオチドで形質転換された微生物の発現宿主
の、従来の栄養源を含む発酵培養液における培養によっ
て影響され得る。培養液の選択は発現宿主の選択及び/
又は発現構築体の調節的要求物に基づいてよい。このよ
うな培養液は当業者にはよく知られている。培養液に
は、所望されるならば、他の汚染している可能性のある
微生物よりも形質転換された発現宿主により好都合な成
分を付加してよい。
有するポリペプチドを生産する方法であって、a)SE
Q ID No.1又はSEQ ID No.3又はS
EQID No.14又はSEQ ID No.16又
はSEQ ID No.18として示されたヌクレオチ
ド配列又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメン
トで宿主細胞を形質転換する、b)この形質転換された
宿主細胞をこのポリペプチドの発現に適した条件で培養
する、という工程を含む方法を提供する。
リペプチドを生産する方法、つまり、a)SEQ ID
No.1又はSEQ ID No.3又はSEQ I
DNo.14又はSEQ ID No.16又はSEQ
ID No.18として示されたヌクレオチド配列又
はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメントで形質
転換された宿主細胞をこのポリペプチドの発現に適した
条件で培養する、b)このポリペプチドを宿主細胞培養
液から回収する、という工程を含む方法を提供する。
リペプチドを生産する方法、つまり、a)SEQ ID
No.1又はSEQ ID No.3又はSEQ I
DNo.14又はSEQ ID No.16又はSEQ
ID No.18として示されたヌクレオチド配列又
はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメントで形質
転換する、b)形質転換された宿主細胞をこのポリペプ
チドの発現に適した条件で培養する、c)このポリペプ
チドを宿主細胞培養液から回収する、という工程を含む
方法を提供する。 [リボザイム]リボザイムはRNAの特異的開裂を触媒
し得る、酵素のようなRNA分子である。リボザイム作
用の機構は、リボザイム分子が相補的なターゲットRN
Aと配列特異的にハイブリダイゼーションした後に、エ
ンドヌクレアーゼのようにそれを開裂することを含む。
本発明の範囲には、PDEのRNA配列をエンドヌクレ
アーゼのように開裂することを特異的かつ効率的に触媒
する、設計されたハンマーヘッド・モチーフ(hamm
erhead motif)のリボザイム分子が含まれ
る。
部に存在するリボザイム特異的な開裂部位は、GUA、
GUU及びGUCという配列を含むリボザイム開裂部位
に対してターゲット分子をスキャンすることによって、
初めは同定される。いったん同定されれば、開裂部位を
含むターゲット遺伝子の領域に相当する15〜20のリ
ボヌクレオチドの短いRNA配列が二次構造上の特徴を
評価されるが、そのような二次構造があるとオリゴヌク
レオチド配列が作用できないことがある。ターゲット候
補の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを利用し
て相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーショ
ンのしやすさを試験することによっても評価され得る。
明のリボザイムは、いずれもRNA分子の合成法として
本技術分野で知られている方法によって製造し得る。こ
れには、固相ホスホルアミダイト(phosphora
midite)化学合成法のような化学的にオリゴヌク
レオチドを合成する技術が含まれる。また、RNA分子
はアンチセンスRNA分子をコードしているDNA配列
のインビトロ又はインビボ転写によって産生し得る。こ
のようなDNA配列は、T7又はSP6のような適切な
RNAポリメラーゼ・プロモーターを有する多様なベク
ターの中へ組み込むことが可能である。また、アンチセ
ンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築体は、
構成的に又は誘導可能的に細胞系、細胞又は組織へ導入
できる。 [検出]PDEコード配列の存在は、SEQ ID N
o.1又はSEQ ID No.3又はSEQ ID
No.14又はSEQ ID No.16又はSEQI
D No.18として示された配列のプローブ、部分又
はフラグメントを用いたDNA−DNA又はDNA−R
NAハイブリダイゼーション又は増幅によって検出され
る。核酸増幅に基づいたアッセイでは、PDEコード配
列に基づいたオリゴヌクレオチド又はオリゴマーを用い
てPDEのDNA又はRNAを含む形質転換体を検出す
る。ここに用いる「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴ
マー」とは、プローブ又はアンプリマーとして利用し得
る、少なくとも約10のヌクレオチドないし約60のヌ
クレオチドであり、好ましくは約15〜30ヌクレオチ
ド、より好ましくは約20〜25のヌクレオチドからな
る核酸配列を指す。好ましくは、オリゴヌクレオチド
は、SEQ ID No.1又はSEQ ID No.
3又はSEQ ID No.14又はSEQ ID N
o.16又はSEQID No.18として示されるヌ
クレオチド配列の3'領域から由来する。
ノクローナル抗体のいずれかを用いるような、PDEポ
リペプチドの発現を検出及び測定する様々なプロトコー
ルが本技術分野で知られている。例えば、酵素結合性免
疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ
(RIA)及び蛍光細胞分析分離(FACS)法であ
る。PDEポリペプチド上の2つの非干渉性エピトープ
に反応するモノクローナル抗体を用いた2部位のモノク
ローナル抗体に基づいたイムノアッセイが好ましいが、
競合的結合アッセイも利用され得る。こういったアッセ
イ及び他のアッセイについては、Hampton R等
(1990、「血清学の方法、実験マニュアル」、AP
S出版、セントポール、MN)及びMaddox DE
等(1983、J EXP Med 15 8:121
1)に詳しい。
知られていて、様々な核酸及びアミノ酸アッセイに利用
し得る。PDEポリヌクレオチド配列を同定するための
標識ハイブリダイゼーション又はPCRプローブを製造
する手段は、オリゴラベリング、ニックトランスレーシ
ョン、エンドラベリング又は標識ヌクレオチドを用いた
PCR増幅を含む。また、PDEコード配列又はその任
意の部分は、mRNAプローブの生産用としてベクター
へ組み込んでクローン化し得る。このようなベクターは
本技術分野で知られていて市販されており、T7、T3
又はSP6のような適切なRNAポリメラーゼ及び標識
ヌクレオチドの付加によるインビトロのRNAプローブ
合成に利用できる。
イ、NJ)、プロメガ(マジソン、WI)及びUSバイ
オケミカル・コープ(クリーブランド、OH)のような
多くの企業が上記手法用のキット製品及びプロトコール
を供給している。適切なレポーター分子又はラベルは、
基質、補助因子、阻害剤、磁性粒子等だけでなく、放射
活性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤又は色素産生剤を
含む。このようなラベルの用途を教示している特許に、
US−A−3,817,837、US−A−3,85
0,752、US−A−3,939,350、US−A
−3,996,345、US−A−4,277,43
7、US−A−4,275,149及びUS−A−4,
366,241がある。また、組換え免疫グロブリン
は、US−A−4,816,567に示されているよう
に生産できる。
ヌクレオチドの放射標識(Melby PC等 199
3 J Immunol Methods 159:2
35〜44)又はビオチニル化(Duplaa C等
1993 Anal Biochem 229〜3
6)、コントロール核酸の共増幅及び実験結果が内挿さ
れる標準曲線を含む。多数の標本の定量化は、対象とな
るオリゴマーが様々な希釈溶液の中にあるELISAフ
ォーマットでアッセイを実行すればスピード・アップで
きるし、分光測光又は熱量測定反応を利用すれば、迅速
に定量される。
遺伝子の存在を示唆するが、その存在及び発現は確証さ
れるべきである。例えば、もしPDEコード配列がマー
カー遺伝子配列中に挿入された場合、PDEコード領域
を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落によっ
て同定される。また、マーカー遺伝子を単一プロモータ
ーのコントロール下でPDEコード配列と並んで配置す
ることもできる。誘導又は選択に反応したマーカー遺伝
子の発現は、通常はPDEの発現も示している。
ド領域を発現する宿主細胞は、当業者の知る様々な手法
によって同定され得る。この手法には、核酸又はタンパ
ク質の検出及び/又は定量のための膜、溶液又はチップ
を利用した技術を含む、DNA−DNA又はDNA−R
NAハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッ
セイ又はイムノアッセイ技術があるが、それに限定され
るものではない。 [抗体]本発明のアミノ酸配列はまた、標準技術の利用
等により、アミノ酸配列に対する抗体を生産するために
利用し得る。
DE11ポリペプチドに対する抗体の製造に利用し得
る。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメン
ト及びFab発現ライブラリーによって生産されたフラ
グメントを含むが、それに限定されるものではない。中
和抗体、即ちPDEポリペプチドの生理活性を阻害する
抗体は、診断薬及び治療薬に特に向いている。
ト、マウス等を含む様々な宿主が、阻害剤又はその一部
分、変異体、相同体、フラグメント又は誘導体、又は免
疫原性を保持するオリゴペプチドの注入によって免疫化
され得る。
疫反応を高めるために利用され得る。このようなアジュ
バントには、フロイント、水酸化アルミニウムのような
無機ゲル及びリゾレシチン、プルロニック(pluro
nic)ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エ
マルジョン、アオガイ(keyhole limpe
t)ヘモシアニン及びジニトロフェノールのような界面
活性剤があるが、それに限定されるものではない。BC
G(カルメット−ゲラニンの桿菌)及びコリネバクテリ
ウム・パルヴムは潜在的に有用なヒトアジュバントとし
て利用され得る。アミノ酸配列に対するモノクローナル
抗体は、継代培養細胞系による抗体分子の製造に供され
る技術を用いても製造され得る。これには、初めKoe
hler及びMilstein(1975 Natur
e 256:495〜497)によって記載されたハイ
ブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Ko
sbor等(1983)Immunol Today
4:72;Cote等(1983)Proc Natl
Acad Sci 80:2026〜2030)及び
EBV−ハイブリドーマ技術(Cole等(1985)
「モノクローナル抗体と癌治療」、アラン・アール・リ
ス社、77〜96頁)があるが、それに限定されるもの
ではない。また、「キメラ抗体」製造のために開発され
た技術、つまり、ヒト抗体遺伝子へマウス抗体遺伝子を
接合し、適切な抗原特異性と生理活性を持った分子を得
る技術も利用し得る(Morrison等(1984)
Proc Natl Acad Sci 81:685
1〜6855;Neuberger等(1984)Na
ture 312:604〜608;Takeda等
(1985)Nature 314:452〜45
4)。また、単鎖抗体の製造のために記載されている技
術(US−A−4946779)を採用して阻害剤特異
的な単鎖抗体を製造し得る。
ボ産生を誘導すること又は、Orlandi等(198
9,Proc Natl Acad Sci 86:3
833〜3837)及びWinter G及びMils
tein C(1991;Nature 349:29
3〜299)に開示されたように、特異性の高い結合反
応物の組換え免疫グロブリンのライブラリー又はパネル
(panel)をスクリーニングすることによって製造
され得る。
フラグメントも製造し得る。例えば、このようなフラグ
メントには、抗体分子のペプシン消化によって製造され
得るF(ab')2フラグメント及びF(ab')2フラグ
メントのジスルフィド結合を還元することによって生じ
るFabフラグメントがあるが、それに限定されるもの
ではない。また、Fab発現ライブラリーは、所望の特
異性を有するモノクローナルFabフラグメントを迅速
かつ簡便に同定できるように構築され得る(Huse
WD等(1989)Science 256:1275
〜1281)。
プチドの発現に関連した病態及び疾患の診断に有用であ
る。確立された特異性を有するポリクローナル又はモノ
クローナル抗体を用いた競合結合又は免疫放射測定アッ
セイの種々のプロトコールが本技術分野でよく知られて
いる。このようなイムノアッセイは通常PDE11ポリ
ペプチドとその特異抗体(又は類似のPDE11結合性
分子)との複合体形成及び複合体形成の測定を含む。特
異的なPDE11タンパク質上の2つの非干渉性エピト
ープに反応するモノクローナル抗体を用いた2部位のモ
ノクローナル抗体に基づいたイムノアッセイが好ましい
が、競合的結合アッセイも利用され得る。このようなア
ッセイについては、Maddox DE等(1983、
J EXP Med 158:1211)に記載されて
いる。
増殖による病態及びHIV感染又はPDE11の異常発
現に特徴づけられる他の障害又は疾患の診断に有用であ
る。PDE11の診断アッセイは、ヒト体液、細胞、組
織又は組織の切片又は抽出物に存在するPDE11ポリ
ペプチドを検出するために抗体及びラベルを利用する方
法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は修飾して又
は修飾せずに使用し得る。しばしば、ポリペプチド及び
抗体は、レポーター分子と共に、共有結合的又は非共有
結合的につなげることによって標識される。様々なレポ
ーター分子が当業者に知られている。 [アッセイ/同定法]本発明はまた、(a)SEQ I
D No.1又はSEQ ID No.3又はSEQ
ID No.14又はSEQ ID No.16又はS
EQ IDNo.18又はその対立遺伝子変異体のDN
A配列から決定されるような、PDE11特異的な一対
のポリメラーゼ連鎖反応プライマーを用いて、そのよう
な細胞由来の(全RNAのような)RNAに対し逆転写
酵素ポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、及び(b)
適切なサイズのPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)フラグ
メントの出現をアガロースゲル電気泳動のような方法で
検出することを含む、(ヒト細胞のような)細胞におけ
るPDE11の存在を検出するアッセイ法に関わる。
はその発現に(阻害する又はそれ以外のやり方で修飾す
るように)影響を与える(化合物、他の物質又はそれを
含む組成物のような)薬剤を同定する方法、つまりPD
E11又はそれをコードするヌクレオチド配列を薬剤に
接触させた後にPDE11の活性及び/又はその発現を
測定する方法に関する。
はその発現に(阻害する又はそれ以外のやり方で修飾す
るように)選択的に影響を与える(化合物、他の物質又
はそれを含む組成物のような)薬剤を同定する方法、つ
まりPDE11又はそれをコードするヌクレオチド配列
を薬剤に接触させた後にPDE11の活性及び/又はそ
の発現を測定する方法に関する。
11A2又はPDE11A3又はPDE11A4の活性
及び/又はその発現に(阻害する又はそれ以外のやり方
で修飾するように)選択的に影響を与える(化合物、他
の物質又はその組成物のような)薬剤を同定する方法、
つまり関連するPDE11又はそれをコードするヌクレ
オチド配列を薬剤に接触させた後に関連するPDE11
の活性及び/又はその発現を測定する方法に関する。
はその発現に(阻害する又はそれ以外のやり方で修飾す
るように)影響を与える(化合物、他の物質又はそれを
含む組成物のような)薬剤を同定する方法、つまりPD
E11の活性及び/又はその発現を薬剤の存在下又は薬
剤の添加後に、(a)SEQ ID No.1又はSE
Q ID No.3又はSEQ ID No.14又は
SEQ ID No.16又はSEQ ID No.1
8又はその対立遺伝子変異体のDNA配列を含む組換え
DNAが取り込まれた細胞系、又は(b)PDE11を
自然にかつ選択的に発現する細胞集団又は細胞系、にお
いて測定する方法に関する。好ましくは、PDE11の
活性は上記のアッセイ法によって決定される。
はその発現に(阻害する又はそれ以外のやり方で修飾す
るように)選択的に影響を与える(化合物、他の物質又
はそれを含む組成物のような)薬剤を同定する方法、つ
まりPDE11の活性及び/又はその発現を薬剤の存在
下又は薬剤の添加後に、(a)SEQ ID No.1
又はSEQ ID No.3又はSEQ ID No.
14又はSEQ IDNo.16又はSEQ ID N
o.18又はその対立遺伝子変異体のDNA配列を含む
組換えDNAが取り込まれた細胞系、又は(b)PDE
11を自然にかつ選択的に発現する細胞集団又は細胞
系、において測定する方法に関する。好ましくは、PD
E11の活性は上記のアッセイ法によって決定される。
11A2又はPDE11A3又はPDE11A4の活性
及び/又はその発現に(阻害する又はそれ以外のやり方
で修飾するように)選択的に影響を与える(化合物、他
の物質又はそれを含む組成物のような)薬剤を同定する
方法、つまりそれぞれのPDE11の活性及び/又はそ
の発現を薬剤の存在下又は薬剤の添加後に、(a)SE
Q ID No.1又はSEQ ID No.3又はS
EQ ID No.14又はSEQ ID No.16
又はSEQ ID No.18又はその対立遺伝子変異
体のそれぞれのDNA配列を含む組換えDNAが取り込
まれた細胞系、又は(b)それぞれのPDE11を自然
にかつ選択的に発現する細胞集団又は細胞系、において
測定する方法に関する。好ましくは、PDE11の活性
は上記のアッセイ法によって決定される。
体、相同体、変異体又はフラグメント)の活性又はそれ
をコードするヌクレオチド配列(その誘導体、相同体、
変異体又はフラグメントを含む)の発現をモジュレート
する(好ましくは、特異的モジュレーション)薬剤をス
クリーニングする方法、つまり、a)候補薬剤を用意す
ること、b)PDE11(又はその誘導体、相同体、変
異体又はフラグメント)又はそれをコードするヌクレオ
チド配列(又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグ
メント)を適切な条件下でのモジュレーションを可能に
するのに十分な時間候補薬剤と結合させること、及び
c)候補薬剤のPDE11(又はその誘導体、相同体、
変異体又はフラグメント)又はそれをコードするヌクレ
オチド配列(又はその誘導体、相同体、変異体又はフラ
グメント)へのモジュレーションを検出し、候補薬剤が
PDE11(又はその誘導体、相同体、変異体又はフラ
グメント)の活性又はそれをコードするヌクレオチド配
列(又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメン
ト)の発現をモジュレートするか確かめること、という
工程を含む方法を提供する。
体、相同体、変異体又はフラグメント)又はそれをコー
ドするヌクレオチド配列(その誘導体、相同体、変異体
又はフラグメントを含む)に対して特異的な結合親和性
を有する薬剤をスクリーニングする方法、つまり、a)
候補薬剤を用意すること、b)PDE11(又はその誘
導体、相同体、変異体又はフラグメント)又はそれをコ
ードするヌクレオチド配列(又はその誘導体、相同体、
変異体又はフラグメント)を適切な条件下での結合を可
能にするのに十分な時間候補薬剤と結合させること、及
びc)候補薬剤のPDE11(又はその誘導体、相同
体、変異体又はフラグメント)又はそれをコードするヌ
クレオチド配列(又はその誘導体、相同体、変異体又は
フラグメント)への結合を検出し、候補薬剤がPDE1
1(又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメン
ト)の活性又はそれをコードするヌクレオチド配列(又
はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント)と結
合するか確かめること、という工程を含む方法を提供す
る。
る能力がある薬剤を同定する方法、つまり、a)PDE
11(又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメン
ト)又はそれをコードするヌクレオチド配列(又はその
誘導体、相同体、変異体又はフラグメント)と薬剤を接
触させること、b)この工程a)の混合物をサイクリッ
クヌクレオチドの加水分解に適した条件下でサイクリッ
クヌクレオチドと共にインキュベーションすること、
c)加水分解したサイクリックヌクレオチドの量を測定
すること、及びd)この工程c)の加水分解したサイク
リックヌクレオチドの量を、PDE11(又はその誘導
体、相同体、変異体又はフラグメント)又はそれをコー
ドするヌクレオチド配列(又はその誘導体、相同体、変
異体又はフラグメント)をその薬剤非存在下でインキュ
ベーションして得られた加水分解したサイクリックヌク
レオチドの量と比較することによって、この薬剤がサイ
クリックヌクレオチドの加水分解に影響を与える(例え
ば、刺激する又は阻害する)かどうかを決定すること、
という工程を含む方法を提供する。
E11又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導
体及び/又はPDE11又はその変異体、相同体、フラ
グメント又は誘導体を発現する細胞系は、ホスホジエス
テラーゼ活性又はその発現のモジュレーターとして作用
する抗体、ペプチド又は有機又は無機分子のような他の
薬剤をスクリーニングすることで、サイクリックヌクレ
オチドのレベルをモジュレートする能力がある治療薬を
同定するために利用され得る。例えば、PDE11の活
性を中和する能力がある抗PDE11抗体は、PDE1
1によるサイクリックヌクレオチドの加水分解を阻害す
ることを介してそのレベルを高めることに利用され得
る。また、組換え体で発現されたPDE11又はその変
異体、相同体、フラグメント又は誘導体、又は細胞系で
発現されたPDE11又はその変異体、相同体、フラグ
メント又は誘導体を用いて、コンビナトリアル・ケミス
トリーによって合成されたペプチド・ライブラリー又は
有機物ライブラリーをスクリーニングすることは、PD
E11によるサイクリックヌクレオチドの加水分解をモ
ジュレートすることによって機能する治療薬の同定に有
用であろう。合成化合物、天然産物及び他の潜在的に生
理活性がある物質は、当業者にはごく普通と考えられて
いる多くのやり方でスクリーニングされ得る。例えば、
PDE11のN末端をコードしているヌクレオチド配列
は、PDE11活性のアロステリックモジュレーター
(作動薬又は拮抗剤)のスクリーニングに利用し得る細
胞系において発現され得る。また、PDE11の保存さ
れた触媒ドメインをコードしているヌクレオチド配列
は、細胞系において発現され、サイクリックヌクレオチ
ドの加水分解を阻害する薬剤のスクリーニングに利用さ
れ得る。
ヌクレオチドの加水分解に干渉する能力があるかどうか
は、(Smith等、1993 Appl.Bioch
em.Biotechnol.41:189−218に
開示されているように)PDE11のレベル又はサイク
リックヌクレオチドのレベルを測定することによって決
定される。また、cAMP及びcGMP測定用イムノア
ッセイキットも市販されている(例えば、アマシャム・
インターナショナル社、アーリントンハイツ、IL及び
デュポン社、ボストン、MA)。PDE11の活性はま
たこの目的のために開発された従来技術を利用して、他
のタンパク質のリン酸化又は脱リン酸化のような他の反
応を測定することでモニターされ得る。
変異体、相同体、フラグメント又は誘導体のサイクリッ
クヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性をモジュレー
トする能力がある化合物を同定する方法、つまり、a)
PDE11又はその変異体、相同体、フラグメント又は
誘導体と化合物を接触させること、b)工程a)の混合
物をサイクリックヌクレオチドの加水分解に適した条件
下でサイクリックヌクレオチドと共にインキュベーショ
ンすること、c)加水分解したサイクリックヌクレオチ
ドの量を測定すること、及びd)工程c)の加水分解し
たサイクリックヌクレオチドの量を、PDE11又はそ
の変異体、相同体、フラグメント又は誘導体をその化合
物非存在下でインキュベーションして得られた加水分解
したサイクリックヌクレオチドの量と比較することによ
って、この化合物がサイクリックヌクレオチドの加水分
解を刺激する又は阻害するかを決定すること、という工
程を含む方法を提供する。本方法の一実施形態では、フ
ラグメントはPDE11のN末端領域由来であり、PD
E11のアロステリックモジュレーターを同定する方法
を提供する。本発明の別の実施形態では、フラグメント
はPDE11のカルボキシル末端領域由来であり、サイ
クリックヌクレオチド加水分解の阻害剤を同定する方法
を提供する。
ラグメント又はそのオリゴペプチドは様々な医薬スクリ
ーニング技術のいずれにおいても治療用化合物をスクリ
ーニングするために利用され得る。このような試験にお
いて使用されるポリペプチドは溶液状態、固体支持体に
固定された状態、細胞表面に埋め込まれた状態又は細胞
内に局在化した状態にあってよい。活性の消失又はPD
E11ポリペプチドと被験薬剤との結合複合体の形成が
測定され得る。
現又はその一部分又はその変異体、相同体、フラグメン
ト又は誘導体のモジュレーション(好ましくは、特異的
な結合親和性のような、特異的モジュレーション)に対
して1つ又は複数の化合物をスクリーニングする方法、
つまり、1つ又は複数の化合物を用意すること、PDE
11又はそれをコードするヌクレオチド配列又はその一
部分又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体
を、適切な条件下でのモジュレーションを可能にするの
に十分な時間、1つ又は複数の化合物の各々と結合させ
ること、及びPDE11又はその一部分又はその変異
体、相同体、フラグメント又は誘導体と複数の化合物の
各々との結合を検出することを介して、PDE11又は
それをコードするヌクレオチド配列をモジュレートする
1つ又は複数の化合物を同定する、という工程を含む方
法を提供する。このようなアッセイでは、複数の化合物
は当業者に知られたコンビナトリアル・ケミストリー技
術によって製造され得る。
11ポリペプチドに対して適度な結合親和性を有する化
合物をハイスループット・スクリーニングする方法であ
り、1984年9月13日に公表されたGeysenの
ヨーロッパ特許出願84/03564に詳細に記載され
た方法に基づいている。要約すると、大量の様々な小さ
なペプチド被験化合物がプラスチックピンのような固体
基質又は他の何らかの表面の上で合成される。ペプチド
被験化合物はPDE11フラグメントと反応させた後洗
浄される。その後、本技術分野で良く知られている方法
を適切に用いる等して、結合したPDE11が検出され
る。精製されたPDE11はまた上記の医薬スクリーニ
ング技術に使用するために直接プレート上でコーティン
グされ得る。また、ペプチドを捕捉しそれを固体支持体
に固定化させるために非中和抗体が利用される。
和抗体がPDE11との結合に対して被験化合物と特異
的に競合する、競合的医薬スクリーニングアッセイの用
途について考察している。このように、この抗体は、P
DE11と1つ又はそれ以上の抗原決定基を共有するペ
プチドの存在を検出するために利用し得る。 [薬剤]本発明はまた本発明のアッセイ法及び同定法に
よって同定される1つ又はそれ以上の薬剤を提供する。
無機化合物である。この薬剤は、例えば、SEQ ID
No.1又はSEQ ID No.3又はSEQ I
DNo.14又はSEQ ID No.16又はSEQ
ID No.18として示される配列の全て又は部分
に対してアンチセンスなヌクレオチド配列で有り得る。
的に許容されるその塩、又は製剤的に許容されるその溶
媒和物)又は上記のいずれをも含む医薬組成物を、医薬
品としての用途のために、提供する。
活性に影響を与える(阻害する、モジュレートする、拮
抗する、等)薬剤の用途を提供する。 [診断薬]本発明はまたPDE11ポリヌクレオチド配
列検出用の診断組成物を提供する。診断組成物は、ポリ
ヌクレオチド、SEQ ID No.1又はSEQ I
DNo.3又はSEQ ID No.14又はSEQ
ID No.16又はSEQ ID No.18又はそ
の変異体、相同体、フラグメント又は誘導体、又はSE
Q ID No.1又はSEQ ID No.3又はS
EQ ID No.14又はSEQ ID No.16
又はSEQ ID No.18又はその対立遺伝子変異
とハイブリダイズし得る配列を含んでよい。
ポリペプチド発現の正常値又は標準値が確立されなけれ
ばならない。このことは、動物又はヒトの正常披検者か
ら採取した体液又は細胞抽出物を、本技術分野でよく知
られている複合体形成に適した条件の下で、PDE11
ポリペプチドの抗体と結合させることによって達成され
る。標準的な複合体形成の量は、既知量の抗体が既知濃
度の精製PDE11ポリペプチドと結合する陽性対象の
希釈系列に対してそれを比較すれば定量化され得る。そ
の後、正常サンプルより得られた標準値は、PDE11
ポリペプチド発現に関連した障害又は疾患に罹患してい
る可能性がある患者より採取した標本より得られる値と
比較される。標準値と披検者の値のズレから疾患状態の
存在が確かめられる。
分は診断薬及び/又は治療化合物の基礎を提供する。診
断目的で、PDE11ポリヌクレオチド配列は、PDE
11活性が影響を与える可能性がある、男性の勃起不全
のような病態、障害又は疾患における遺伝子発現を検出
及び定量化するために利用し得る。
配列はPDE11の発現より生じる疾患の診断に利用し
得る。例えば、PDE11をコードするポリヌクレオチ
ド配列は、PDE11発現における異常を検出する目的
で、生検又は剖検に由来する組織又は血清、骨液又は腫
瘍生検のような生物体液のハイブリダイゼーション又は
PCRアッセイに利用し得る。このような定性的又は定
量的方法には、サザン又はノーザン分析、ドット・ブロ
ットのような膜利用技術、PCR技術、ディップスティ
ック、ピン又はチップ技術及びELISA等の多標本形
式技術がある。これらの技術はすべて本技術分野でよく
知られていて、事実、多くの市販診断キット製品の基礎
になっている。
有効性を評価するように調整可能であり、動物研究、臨
床試験又は各患者の治療モニタリングに利用され得る。
疾患の診断を基礎づけるには、PDE発現の正常又は標
準プロフィールが確立されなければならない。このこと
は、動物又はヒトの正常披検者から採取した体液又は細
胞抽出物を、ハイブリダイゼーション又は増幅に適した
条件の下で、PDE11又はその一部分と結合させるこ
とによって達成される。標準的なハイブリダイゼーショ
ンは、正常披検者から得られた数値を、既知量の精製P
DE11を用いた同一の実験において実施された陽性対
照の希釈系列と比較することによって定量化され得る。
正常サンプルより得られた標準値は、PDEのコード配
列の発現に関連した障害又は疾患に罹患している可能性
がある患者より採取した標本より得られる値と比較され
る。標準値と披検者の値のズレから疾患状態の存在が確
かめられる。疾患が確認されれば、既存の治療薬が投与
され、治療プロフィール又は数値が得られる。最終的
に、このアッセイは定期的に繰り返され、その数値が進
行するか正常又は標準パターンに戻るかどうかが評価さ
れる。継続的な治療プロフィールは、数日又は数ヶ月に
及ぶ治療の有効性を示すことに利用できる。
DE11のレベルを検出及び定量化して診断に利用し得
る抗PDE11抗体を製造するための、PDE11ポリ
ペプチド又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘
導体の用途に関する。
1を検出するための、陽性対照として使用される精製P
DE11及び抗PDE11抗体を含む、診断アッセイ及
びキットを提供する。このような抗体は、PDE11タ
ンパク質の発現、その欠失又は変異体、相同体、フラグ
メント又は誘導体の発現に関連した疾患又は病態を検出
するための、溶液、膜又は組織に基づいた技術に利用さ
れ得る。 [プローブ]本発明の別の態様は、ゲノム配列、PDE
コード領域又は対立遺伝子のような緊密に関連した分子
を含むポリヌクレオチド配列を検出し得る核酸ハイブリ
ダイゼーション又はPCRプローブの提供である。プロ
ーブの特異性(即ち、それが高度に保存された、保存さ
れた又は保存されていない領域又はドメインのいずれか
ら由来しているかということ)及びハイブリダイゼーシ
ョン又は増幅のストリンジェンシィ(高位、中位、低
位)によって、プローブが天然に存在しているPDEコ
ード配列又は関連した配列だけを同定するかどうかが決
定される。関連した核酸配列を検出するプローブは、
3'領域のような、サイクリックヌクレオチドPDEフ
ァミリーメンバーの保存された又は高度に保存されたヌ
クレオチド領域から選択され、そのようなプローブは縮
重プローブのプールで使用され得る。同一の核酸配列を
検出する場合又は最大の特異性が所望される場合、核酸
プローブはPDEポリヌクレオチドの非保存的なヌクレ
オチド領域又はユニーク領域から選択される。ここに用
いられている「非保存的なヌクレオチド領域」という用
語は、ここに開示されたPDEコード配列特有のヌクレ
オチド領域を指し、既知のサイクリックヌクレオチドP
DEのような関連ファミリーメンバーには出現しない。
−4,800,195及びUS−A−4,965,18
8に記載されているPCRは、PDE11配列に基づい
たオリゴヌクレオチドの別の用途を提供する。一般に、
このようなオリゴマーは化学的に合成されるが、酵素に
よって生産されたり、組換え体から製造される場合もあ
る。オリゴマーは一般に、センス配位(5'−>3')及
びアンチセンス配位(3'<−5')という2つのヌクレ
オチド配列を含み、最適な条件下で、特異的な遺伝子又
は病態を同定するために利用される。同じ2つのオリゴ
マー、入れ子状オリゴマー又は縮重オリゴマーのプール
は、よりストリンジェンシィが緩い条件下で、緊密に関
連したDNA又はRNAの配列を検出及び/又は定量化
するために利用し得る。
ム配列のマッピングのために、前述したようなハイブリ
ダイゼーション・プローブを生産するのに利用し得る。
その配列は、既知の技術を利用して、ある特定の染色体
又は染色体の特異領域に対してマップされ得る。この技
術は、染色糸へのインシトゥ(生体内)ハイブリダイゼ
ーション(Verma等(1988)「ヒト染色体:基
本技術マニュアル」、ペルガモン・プレス、ニューヨー
ク市)、流れソート式(flow−sorted)の染
色体調製又は、YAC、細菌性人工染色体(BAC)、
細菌性PI構築体又は単鎖染色体cDNAライブラリー
のような人工染色体の構築を含む。
ゼーション及び確立された染色体マーカーを利用した連
鎖分析のような物理的マッピング技術は、遺伝子地図を
拡張する上で極めて有用である。遺伝子地図の例はSc
ience(1995;270:410f及び199
4;265:1981f)に見出せる。しばしば、ある
遺伝子を別の哺乳類種の染色体に配置すると、たとえ特
定のヒト染色体の番号や腕についてわかっていなくて
も、関連するマーカーが明らかになる。物理的マッピン
グによって、新しい配列が染色体の腕又はその部分に位
置づけられる。このことは位置クローニング又は他の遺
伝子発見技術を利用して疾患遺伝子を捜している研究者
にとって貴重な情報を提供する。毛細管拡張性運動失調
(AT)のような疾患又は症候群が、例えばATが11
q22−23に位置づけられたように(Gatti等
(1988)Nature 336:577〜58
0)、遺伝子連鎖によって特定のゲノム領域におおまか
に位置づけられると、その領域付近の配列マッピングは
更なる研究対象となる関連又は調節遺伝子を表わす可能
性がある。本発明のヌクレオチド配列はまた、転座、逆
位等による染色体の座における、正常人、キャリアー、
罹患者間の違いを検出するのに利用し得る。 医薬品 また、本発明は、PDE11の活性のために同様のもの
を必要とする個人を治療するための医薬組成物をも提供
し、該組成物は治療上有効な量の、該活性に影響を及ぼ
す(例えば、阻害する)薬剤(agent)及び薬学的
に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を含む。
発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はそれらの発
現産生物の活性を調節することが可能な薬剤及び/又は
本発明による検定によって同定される薬剤)を含む医薬
組成物も包含する。これに関して、特にヒトの治療に関
して、本発明の薬剤は単独で投与することもできるが、
一般には、意図する投与経路及び標準的な医薬実務に関
して選択された医薬担体、賦形剤又は希釈剤と混合して
投与される。
は、本発明の薬剤を適切な結合剤(1種もしくは複
数)、滑沢剤(1種もしくは複数)、懸濁剤(1種もし
くは複数)、コーティング剤(1種もしくは複数)、又
は可溶化剤(1種もしくは複数)と混合することができ
る。
日経口もしくは静脈内用量は、0.01ないし50mg
/治療しようとする被験者の体重kg、好ましくは0.
1ないし20mg/kgの範囲と考えられる。また、本
発明の薬剤は静脈内注入により、0.001−10mg
/kg/時間の範囲と考えられる用量で投与することも
できる。
1つずつ又は一度に2つ以上を投与することができる。
また、本発明の薬剤を徐放性製剤として投与することも
可能である。
めに同様のものを必要とする個人を治療するための方法
であって、該個人に有効量の本発明の医薬組成物を投与
することを包む前記方法も提供する。
な実際の投与量を決定し、それは特定の患者の年齢、体
重及び応答に従って変化する。上述の投与量は平均的な
事例の典型的な例である。もちろん、より低い、もしく
はより高い投与量範囲に利点がある個々の事例が存在す
る可能性があり、そのようなものも本発明の範囲内にあ
る。
により、座剤もしくは膣座薬の形態で、ローション、溶
剤、クリーム、軟膏剤もしくは粉剤の形態で局所的に、
皮膚パッチの使用により、デンプンもしくは乳糖のよう
な賦形剤を含む錠剤の形態、又は単独の、もしくは賦形
剤と混合したカプセル剤もしくは膣坐剤(ovule)
の形態、又は香味料もしくは着色料を含むエリキシル、
溶液もしくは懸濁液の形態で経口により投与することが
でき、あるいは非経口的に、例えば、空洞内、静脈内、
筋肉内もしくは皮下に注射することができる。非経口投
与に対しては、これらの組成物は無菌の水溶液の形態で
最良に用いることができ、これは他の物質、例えば、そ
の溶液を血液と等張にするのに十分な塩もしくは単糖を
含んでいてもよい。頬もしくは舌下投与に対してはこれ
らの組成物を錠剤もしくはトローチ剤の形態で投与する
ことができ、これらは慣用された方式で処方することが
できる。
れらの組成物はデンプンもしくは乳糖のような賦形剤を
含む錠剤の形態で、又は単独の、もしくは賦形剤と混合
したカプセル剤もしくは膣坐剤の形態で、又は香味料も
しくは着色料を含むエリキシル、溶液もしくは懸濁液の
形態で経口投与する。
無菌の水溶液の形態で最良に用いられ、これは他の物
質、例えば、その溶液を血液と等張とするのに十分な塩
もしくは単糖を含んでいてもよい。
組成物は錠剤もしくはトローチ剤の形態で投与すること
ができ、これらは慣用ざれた方式で処方することができ
る。被験者(例えば、患者)への経口、非経口、頬及び
舌下投与については、本発明の薬剤の一日投与量は典型
的には10ないし500mg(一回もしくは分割用量
で)であり得る。したがって、そして例として、錠剤又
はカプセルは、適宜1個ずつの又は一度に2個以上の投
与に対して、5ないし100mgの活性薬剤を含むこと
ができる。上に示されるように、医師が個々の患者に最
も適切である実際の投与量を決定し、それは特定の患者
の年齢、体重及び応答に応じて変化する。上述の投与量
は平均的な事例の典型的な例であるが、もちろん、より
高い、もしくはより低い投与量範囲に利点がある個々の
事例が存在する可能性もあり、そのような用量範囲も本
発明の範囲内にある。
経口投与が好ましい経路であり、これは最も好都合で、
かつ、例えば男性の勃起不全(MED)において、空洞
内(i.c.)投与に関与する公知の不利益を回避す
る。典型的な男性に対する、MEDにおける好ましい経
口投与措置は、必要なときに25ないし100mgの薬
剤を投与するものである。レシピエントが嚥下障害を患
い、又は経口投与後の薬物吸収の障害を患う状況におい
ては、この薬物を非経口的に、例えば、舌下又は頬から
投与することができる。
は、典型的には、通常の獣医学的実務に従って適切に受
け入れられる製剤として投与され、獣医が特定の動物に
最も適切である投与措置及び投与経路を決定する。しか
しながら、ヒトの治療と同様に、獣医学的治療のために
この薬剤を単独で投与することも可能である。
動物に使用するためのものであり得る−は、薬学的に許
容し得る希釈剤、担体、賦形剤又は補助剤のいずれか1
種類以上を含む。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択
は、意図する投与経路又は標準的な医薬実務に関して選
択することができる。上に示されるように、この医薬組
成物は、担体、賦形剤もしくは希釈剤として、又はそれ
らに加えて、適切な結合剤(1種もしくは複数)、滑沢
剤(1種もしくは複数)、懸濁剤(1種もしくは複
数)、コーティング剤(1種もしくは複数)、可溶化剤
(1種もしくは複数)を含むことができる。
組成物は下記のものの1つ以上を含む:本発明の検定に
よってスクリーニングされている薬剤;配列番号1、配
列番号2、配列番号3もしくは配列番号4もしくは配列
番号14もしくは配列番号15もしくは配列番号16も
しくは配列番号17もしくは配列番号18もしくは配列
番号19又はそれらの誘導体、断片、相同体もしくは変
異体のいずれか1つ以上と反応することが可能な薬剤、
あるいは配列番号1もしくは配列番号3もしくは配列番
号14もしくは配列番号16もしくは配列番号18とハ
イブリダイズすることが可能な配列。
PDE11の翻訳を阻害するように作用するオリゴヌク
レオチド配列、アンチセンスRNA及びDNA分子並び
にリボザイムが本発明の範囲内に含まれる。このような
ヌクレオチド配列は、環状ヌクレオチドの濃度を高める
ことが好ましい状態、例えば炎症、において用いること
ができる。
DE11の活性の増加に関連する様々な異常な状態、例
えば男性の勃起不全、の治療の基礎を提供し得る。PD
E11核酸アンチセンス分子は、環状ヌクレオチドの濃
度を上昇させることが好ましい状況において、PDE1
1の活性を遮断するのに用いることができる。
スもしくはワクチニアウイルス、又は様々な細菌プラス
ミドから誘導される発現ベクターを、組換えPDE11
センスもしくはアンチセンス分子を標的とされる細胞集
団に送達するために用いることができる。PDE11を
有する組換えベクターを構築するには当業者に公知の方
法を用いることができる。あるいは、組換えPDE11
は、リポソームに封入して標的細胞に送達することがで
きる。
要素は、研究者が遺伝子の機能のセンス(Yousso
ufian H及びHF Lodish 1993 M
olCell Biol 13:98−104)又はア
ンチセンス(Eguchiら (1991) Annu
Rev Biochem 60:631−652)研
究のツールとしてPDE11を用いることを可能にす
る。ゲノムDNAから得られたcDNA又は制御配列か
ら設計されたオリゴヌクレオチドを、イン・ビトロ又は
イン・ビボにおいて、発現の阻止に用いることができ
る。このような技術は現在当該技術分野において公知で
あり、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド
又はより大きい断片をコーディング又は制御領域に沿っ
て様々な位置から設計することができる。長さが20ヌ
クレオチドであり得る適切なオリゴヌクレオチドを、ヒ
トライブラリーからPDE11配列又は密接に関連する
分子を単離するのに用いることができる。
織に、ホスホジエステラーゼの活性を遮断し、それによ
り環状ヌクレオチド濃度を高めることが好ましい状態に
おいて高濃度のPDE11断片を発現する発現ベクター
を形質移入することにより調節することができる。この
ような構築体は細胞を翻訳できないセンスもしくはアン
チセンス配列であふれさせることができる。DNAへの
組み込みが存在しない状態であっても、このようなベク
ターは、そのベクターの全てのコピーが内在性ヌクレア
ーゼによって無能化されるまで、RNA分子を転写し続
けることができる。このような一過性の発現は、非複製
ベクターで1ヶ月もしくはそれ以上、そして適切な複製
要素がそのベクター系の一部である場合はそれよりも長
く持続し得る。
ーター、エンハンサー、及びイントロンに対するアンチ
センス配列を設計することにより、遺伝子の発現を変更
させることができる。
10ないし+10領域から誘導されるオリゴヌクレオチ
ドが好ましい。アンチセンスRNA及びDNA分子は、
転写物がリボソームに結合するのを妨げることにより、
mRNAの翻訳を遮断するように設計することもでき
る。同様に、“三重らせん”塩基対形成としても知られ
るホジブーム塩基対形成法(Hogeboom bas
e−pairing methodology)を用い
て阻害を達成することができる。三重らせん対形成は、
ポリメラーゼ、転写因子、又は調節分子の結合に十分な
程度に開く二重らせんの能力を危ういものにする。
れらの薬学的に許容し得る塩、又はそれらの薬学的に許
容し得る溶媒和物)を薬学的に許容し得る希釈剤、賦形
剤又は担体と共に含む医薬組成物を提供する。
動物に)用いるもの、又はヒトに用いるものであり得
る。したがって、本発明は、有効量のPDE11タンパ
ク質の阻害剤又はアンタゴニスト(アンチセンス核酸配
列を含む)を薬学的に許容し得る希釈剤、担体、賦形剤
又は補助剤(それらの組み合わせを含む)と混合された
状態で含む医薬組成物にも関する。
列、PDE11アンチセンス分子、PDE11ポリペプ
チド、タンパク質、ペプチド、又はPDE11生理活性
の有機修飾因子、例えば阻害剤、アンタゴニスト(抗体
を含む)もしくはアゴニスト、の全てもしくは一部を単
独で、又は少なくとも1種類の他の薬剤、例えば安定化
化合物、との組み合わせで含むことができ、かつ生理食
塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、及び水を含む
がこれらに限定されるものではないあらゆる無菌の生体
適合性医薬担体中で投与することができる医薬組成物に
関する。要約 要約すると、本発明は、とりわけ、以下のものを提供す
る: 1. 新規アミノ酸。
組成物。
現する発現系。 6. 前記新規配列に基づく治療方法。 7. 前記新規配列に基づく医薬組成物。寄託 以下の試料を、ブダペスト条約に従い、AB2 1R
Y、英国スコットランド、アバディーン、マハルドライ
ブ,23ストリートの認定寄託機関ザ・ナショナル・コ
レクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリー
ン・バクテリア・リミッテッド(The Nation
al Collection of Industri
al and Marine Bacteria Li
mited)(NCIMB)に、1998年3月6日に
寄託した。 大腸菌pPDE11A1 NCIMB番号NCIMB 40925 大腸菌pPDE11A2 NCIMB番号NCIMB 40926 NCIMB 40925はHSPDE11A1を含む。
A2を含む。 以下の試料を、ブダペスト条約に従い、AB2 1R
Y、英国スコットランド、アバディーン、マハルドライ
ブ,23ストリートの認定寄託機関ザ・ナショナル・コ
レクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリー
ン・バクテリア・リミッテッド(NCIMB)に、19
99年2月9日に寄託した。 大腸菌pMmPDE11A3 NCIMB番号NCIMB 41007 NCIMB 41007はMmPDE11A3を含む。 また、本発明は、これらの寄託物から誘導可能及び/又
は発現可能である配列並びにそれらを含む態様をも包含
する。また、本発明は、これらの寄託物から誘導可能及
び/又は発現可能である部分的な配列並びにそれらを含
む態様をも包含し、これらの部分的な配列は活性酵素部
位をコードするものである。また、本発明は、これらの
寄託物から誘導可能及び/又は発現可能である配列を含
むタンパク質並びにそれらを含む態様をも包含する。ま
た、本発明は、これらの寄託物から誘導可能及び/又は
発現可能である部分的な配列を含むタンパク質並びにそ
れらを含む態様をも包含し、これらの部分的な配列は活
性酵素部位をコードするものである。
可能及び/又は発現可能である配列並びにそれらを含む
態様をも包含する。実験の部及び図面の序文 本発明を、例のみとして、添付の図面を参照して説明す
る。添付の図面において:図1は模式図を示し;図2は
ノーザンブロットの写真画像を示し;図3は模式図を示
し;図4はヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し;
図5はヌクレオチド配列、アミノ酸配列及びタンパク質
配列の整列を示し;図6はグラフを示し;図7はヘイン
ズプロットを示し;図8は顕微鏡写真を示し;図9は写
真を示し;図10は配列の整列を示し;及び図11は配
列の整列を示す。
AGEクローン298975及びPDE11A1の模式
的整列であり、PDE11A1が他のホスホジエステラ
ーゼと共有する様々な関連機能的ドメイン及びIMAG
Eクローン298975に存在する部分的なPDE11
A1配列が含む領域を示す。
の組織分布を示すノーザンブロットである。多少詳細に
は、図2はPDE11A1の完全長cDNAのクローン
化に用いられる戦略を示す模式図であり、バーは一定の
比率ではなく、CNは尾状核を指す。
て、これはPDE11A1をコードするヌクレオチド配
列であり、ATG翻訳開始が二重下線で示されている。
多少詳細には、図4Bは配列番号2であり、これはPD
E11A1のタンパク質配列である。
て、これはPDE11A2をコードするヌクレオチド配
列であり、ATG翻訳開始コドンが二重下線で示されて
いる。
り、これはPDE11A2のタンパク質配列である。多
少詳細には、図5CはPDE11A1及びPDE11A
2のアミノ末端の整列であり、この2つのスプライス変
異体の間で相違する領域を示す。
しくは疑似感染のいずれかのSf9細胞におけるcAM
PもしくはcGMPに対するPDE11の相対加水分解
活性を示すグラフである。
cGMPのいずれかに対するPDE11A1のKm及び
Vmax値を算出するのに用いられるヘインズプロット
を示す。
を示す様々な組織のPDE11発現顕微鏡写真インサイ
ツハイブリダイゼーション分析のインサイツ分析を示
す。より詳細には、図8は様々な組織におけるPDE1
1の発現を示す顕微鏡写真であって、左側は明視野で撮
影された顕微鏡写真であり、かつ右側は発現部位周辺の
銀粒子の検出を可能にするために暗視野で撮影された顕
微鏡写真である。パネルAは前立腺内の上皮細胞のサブ
セットにおけるPDE11の発現を示し、領域1は前立
腺管におけるPDE11の発現を、領域2は発現のない
前立腺管を示す。パネルBはヒト脳の線条体領域におけ
るPDE11の発現を示す。発現は明らかに灰白質(領
域1)に存在するニューロン核に限定され、これに対し
て白質(領域2)にはPDE11の発現はない。パネル
Cは食道括約筋の神経節細胞におけるPDE11の発現
を示す。パネルDは海綿体血管内の内皮細胞のサブセッ
トにおけるPDE11の発現を示す。矢印は発現の正確
な領域を示す役目を果たす。
PDE11タンパク質を検出できることを示す写真を提
示する。PDE11バキュロウイルスに感染した昆虫細
胞又は非感染細胞からの粗製溶解物をPAGEで電気泳
動した。次に、ゲル上のタンパク質をニトロセルロース
膜にブロットした。このブロットを、2種類のPDE1
1抗体の相対特異性の研究に用いた。Ab−1はペプチ
ド配列番号8から誘導し、Ab−2はペプチド配列番号
9から誘導した。
h Laboratories,1020 East
Meadow Circle, Palo Alto,
California, 94303, USA)か
ら入手したノーザンブロットを1時間、エクスプレスハ
イブ(Expresshyb)ハイブリダイゼーション
溶液(クローンテック−Clontech Labor
atories,1020 East Meadow
Circle, Palo Alto,Califor
nia, 94303, USA)中において55℃で
予備ハイブリダイズさせた後、放射標識PDE11A1
断片(DNAを、メガプライム(Megaprime)
ランダム標識システム(アマシャム(Amersha
m){Amersham place, Little
Chalfont,Bucks, HP7 9NA
UK}を製造者の指示に忠実に従って用いて、50μC
iの32P−dATPで標識した)を新鮮なエクスプレス
ハイブに添加し、55℃で一晩、穏やかに攪拌しながら
ブロットにハイブリダイズさせた。次に、ブロットを室
温で各々10分間、2×SSC(150mM NaC
l、30mMクエン酸Na)中で3回洗浄した後、0.
2×SSC(15mM NaCl、3mMクエン酸N
a)中、55℃で各々20分間、2回洗浄した。その
後、ブロットをオートラジオグラフィーフィルムに露出
した。 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) PCRを標準的な試薬及び条件を用いて行った。簡単に
述べると、全ての反応バッファー及び酵素はキットの体
裁でクローンテック{Clontech Labora
tories,1020 East Meadow C
ircle,Palo Alto, Californ
ia, 94303, USA}(cDNA末端(RA
CE)反応の急速増幅用)又はライフ・テクノロジーズ
(Life Technologies)(3 Fou
ntain Drive, Inchinnan Bu
siness Park, Paisley, PA4
9RF UK)(標準PCR用)のいずれかから入手し
た。オリゴヌクレオチドは市場供給者(OSWEL D
NA services, Lab 5005, Me
dical And Biological Scie
nces Building, University
of Southampton,Bolderwoo
d,Bassett Crescent East,S
outhampton,SO16 7PX UK)から
入手し、400nMの濃度で用いた。反応はMJリサー
チ(MJ Research)PTC−200サーマル
サイクラーで、用いるキットの製造者が推奨するサイク
リングパラメータを用いて行った。 PCR産生物のクローン化 PCR誘導DNA断片を、インビトロゲン(Invit
rogen)(DeSchelp 12, 9351
NV Leek, The Netherlands)
によって供給されるTOPOクローニングシステム(カ
タログ番号K3001−0−1)を用いて、製造者の手
法本に略述される方法に従い、かつ供給される試薬を用
いて単離した。 粗製昆虫細胞溶解物に対するホスホジエステラーゼ検定 粗製溶解物を、[3H]−cGMP又は[3H]−cAM
P(アマシャム−Amersham place, L
ittle Chalfont, Bucks, HP
7 9NA UK)を用いてホスホジエステラーゼ活性
について検定した。25μlの粗製溶解物に15μlの
バッファーC(20mM トリスHCL(pH9.
4)、5mM MgCl2・6H2O)及び25μlのバ
ッファーD(バッファーC+BSA@2mg/ml)を
添加した。50μlの基質を用いて反応を開始させ、管
を振盪しながら30℃で15分間インキュベートした。
次に、これらの管を沸騰水浴に2分間移した後、氷上に
10分間移した。次いで、ヘビ毒(オフィオファグス・
ハンナ(Ophiophagus hannah)、シ
グマ(Sigma){Sigma−Aldrich C
ompany Limited, Fancy Roa
d, Poole, Dorset, BH124QH
UK}、V−0376)の1.5mg/ml水溶液2
5μlを添加して混合し、攪拌しながらさらに10分間
30℃まで戻した。次に、管を氷に戻して5分後に50
0μlの樹脂スラリーを添加し、完全に混合して氷上に
さらに15分間静置した。次いで管を2000rpmで
10分間遠心し、その後、150μlの上清を取り除い
て2mlのスターシント(Starscint)(パッ
クハード(Packhard))を添加し、混合して液
体シンチレーション計数に処した。
下の式によりピコモル/分/mlの割合で表す: {(試料のDPM−ブランクのDPM)/(合計の平均
DPM−バックグランドの平均DPM)}×(625/
150)×(50ピコモル/10分)×100 その後、活性粗製溶解物をドライアイスエタノール浴に
おいてフラッシュ凍結し、−80℃で保存した。 粗製溶解物からのタンパク質の精製 発現したタンパク質−FLAG融合体を含む粗製Sf9
溶解物を、ファルマシア(Pharmacia)FPL
Cシステム(LKB.UV−MII){Pharmac
ia Biotech,23 Grosvenor R
oad, StAlbans, Herts, AL1
3AW.UK}を用いて、FLAG抗体アフィニティ
カラム(精製IgG1モノクローナル抗FLAG抗体が
ヒドラジド結合により結合しているアガロースM2アフ
ィニティゲルビーズ)に流した。精製されたタンパク質
を厳密にアフィニティビーズの製造者によって指定され
る条件下で溶出し、等量に分割して続く分析のために−
80℃で保存した。 アフィニティ精製タンパク質に対するホスホジエステラ
ーゼ検定 14.7μlの[3H]−cGMP(アマシャム−Am
ersham place, Little Chal
font, Bucks, HP7 9NAUK)を2
0μlのバッファーC(上述の通り)に添加することに
より基質を調製した。96ウェルの構成において、25
μlのバッファーD(上を参照)を全てのウェルに添加
した。25μlの試料を全てのウェルに添加した後、5
0μlの基質を添加して反応を開始させた。試料を30
℃で30分間インキュベートした後、50μlのSPA
ビーズを添加し、20分間放置した後シンチレンショー
ンカウンターで読み取った。 ウェスタンブロット 昆虫細胞を遠心によりペレット化し、溶解バッファー
(50mM トリスHCL(pH6.8)、100mM
ジチオトレイトール、2%SDS、0.2%ブロモフ
ェノールブルー、20%グリセロール)に再懸濁し、超
音波処理し、沸騰水浴に10分間入れて、還元条件下に
おいてSDS PAGE(ノベックス(Novex)N
uPAGE 4−12% Bis−TRIS還元ゲル、
キットNP0000)で電気泳動した。次に、これらの
タンパク質を、ノベックスNuPAGEウェスタン移行
システムを用いてニトロセルロース膜に移した。次い
で、このウェスタンブロットをPBS/0.1%ツィー
ン20/5%乾燥ミルク中、4℃で一晩インキュベート
した。その後、このブロットをPBS/0.1%ツィー
ン20/5%乾燥ミルク/一次抗体の1/500希釈液
中で1時間インキュベートした。次に、PBS/ツィー
ン20で3×1分及び1×10分洗浄した後、PBS/
ツィーン20/5%乾燥ミルクで3×1分及び1×10
分洗浄した。次いで、二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG
(H+L)−アルカリホスファターゼ結合体(バイオ−
ラッド(Bio−Rad)1706518)をこの溶液
に添加し、室温で45分間、振盪しながらインキュベー
トした。次に、ブロットをPBS/ツィーン20中で3
×1分及び1×10分洗浄し、その後5−ブロモ−4−
クロロ−3−インドリルホスフェート及びニトロブルー
テトラゾリウム(BCIP/NBT、シグマB1911
{Sigma−Aldrich Company Li
mited, Fancy Road, Poole,
Dorset, BH12 4QH UK})を用い
て検出した。実施例1 PDE11A1の同定 クローン(IMAGEクローン id 298975)
をリサーチ・ジェネティクス(Research Ge
netics)(2130, Memorial Pk
wy,SW Huntsville,AL35880
1,USA)からL−寒天中の穿刺培養として入手し
た。穿刺培養からの細菌を、100mg/mlの濃度の
アンピシリンの存在下において、37mm L−寒天プ
レート上に画線した。37℃で一晩成長させた後、1つ
のクローンを無菌技術を用いて、アンピシリンを100
mg/mlの濃度で含む5mlのLB−ブロスに摘み入
れ、振盪(220rpm)しながら37℃で一晩成長さ
せた。標準的な市販のミニプレップキット(キアゲンTM
(QiagenTM))を用い、製造者の指示に厳密に従
って細菌からプラスミドDNAを単離した。次に、単離
したDNAを、標準的なキット及び試薬及びABI(P
Eアプライド・バイオシステムズ社(PE Appli
ed Biosystems Incorporate
d))自動シーケンサーを用いて、完全長配列決定に処
した。
98975は1779bpのヌクレオチドインサートを
有することが明らかになった。BLAST(ベーシック
・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール(Bas
ic Local Alignment Search
Tool)(Altshul SF (1993)
J. Mol. Evol. 36:290−300;
Altshul, SFら (1990) J. Mo
l. Biol. 215:403−410)を用いる
データベース相同性検索を行い、このIMAGEクロー
ン298975中のDNAインサートがEST(発現し
た配列(発現した配列タグ))データベースに存在する
配列を有し、この配列が既知PDEと相同であり、かつ
298975がESTの5’側に追加DNA配列の大き
な伸長をも有し、これも既知PDEと相同であることが
示された。読取り枠、ATG翻訳開始コドン及びTG
A、TAA、TAG終止コドンの存在を決定するため、
この配列のさらなる分析を行った。これにより、クロー
ン298975が、ATGイニシエーターの塩基対位置
+13からこの配列の3’側限界まで全てにわたって伸
びる推定ORF(読取り枠)を有することが明らかにな
った。このクローンの3’側にはターミネーターコドン
を示すものがなく、このcDNAが3’末端で完全では
ないことが示唆される。 PDEの潜在的な新規クラスの断片を有するIMAGE
クローン298975 298975のインサートと既知PDEとの配列を比較
する詳細な生命情報科学分析により、298975の配
列がPDEsの新規集団のメンバーの断片をコードする
可能性があることが示される。その理由は、例えばPD
E6AとPDE6Bとが比較的類似するのと比較して、
298975と他のPDEとの類似性が比較的欠如して
いることである。298975と他のPDEとの類似性
は、例えばPDE5とPDE6Aとの類似性により匹敵
する。これは表1(下記)に示されており、この表は2
98975、PDE6A、PDE6B及びPDE5の間
の、298975からの配列を利用することができる領
域(同様に以下を参照)全体にわたる類似性のパーセン
テージを示す。
の類似性のパーセンテージを示し、かつ、互いに高い程
度の類似性を有するPDE6とは対照的に、PDE11
がPDE5、PDE6A及びPDE6Bから等しく隔た
っていることを示す。これは、PDE11が既知集団の
サブタイプではなく、新たなPDE遺伝子集団を構成す
ることを示唆する。
298975内に含まれるこの部分配列を、PDE命名
法の現行ガイドライン(Beavoら Molecul
arPharmacology, 46:399−40
5)に従ってPDE11A1と命名した。
インの存在を、それが存在するのであれば、決定するた
め、クラスタル(Clustal)プログラム(Tho
mpsonら (1994) Nucleic Aci
ds Research,22:4673−4680)
を用いて、PDE11A1配列断片とウシPDE5(P
DE5は、これが機能的に最も十分に特徴付けられてい
る既知PDEのうちの1つであることから選択した)と
の整列化を行った。これは図1(パネルB)に模式的に
示され、298975に含まれるPDE11A1の配列
断片が実質的にPDE5と重なるが、PDE5配列の残
基669で終止することを示している。これは、298
975内に含まれるものに加えて、PDE11A1の実
質的な3’配列が存在する可能性があることを示す。P
DE11A1における2つの推定亜鉛結合モチーフ(H
XXXHX8-20D)の存在は、PDE11A1が機能的
ホスホジエステラーゼ酵素をコードするという仮説を支
持する。実施例2 PDE11A1の推定完全長cDNAクロー
ンの単離 コーディング領域の3’末端及びターミネーターコドン
を含むPDE11A1の完全長cDNAの単離を容易に
するため、ノーザンハイブリダイゼーションを用いて一
続きの組織においてPDE11A1の発現を決定した。
このデータ(図2に示される)は、PDE11A1とハ
イブリダイズする伝令RNA(長さ9.5kb)が幾つ
かの組織に存在するものの、それが脳の尾状核及び被殻
領域において特に高度に発現することを示す。したがっ
て、尾状核cDNA(クローンテック−Clontec
k Laboratories,1020 East
Meadow Circle, Palo Alto,
California,94303,USA)を、余分
の3’配列を生成するためのPCRベースのアプローチ
(方法を参照)のテンプレートとして用いた。3’RA
CEでの最初の試みが不成功であったため、代わりの方
策を工夫してさらなる3’配列を生成させた。これは、
以下のオリゴヌクレオチドを用いることにより達成し
た: RP1: 5’−TCNCCYTGRTCRTARAAYTC−3’ (配列番号5) これは、PDE5及び6の整列において観察される保存
配列に基づくものであり、3’プライマーとして用い
た。
イマーも用いた: GSP1: 5’−TACTTCAGAACAATCACACG−3’ (配列番号6) これは既知PDE11A1配列に基づくものである。こ
れらのプライマーを用いて行われたPCR(このPCR
は、PCRリエージェント・システム(PCRReag
ent System)キット(ライフ・テクノロジー
ズ−3 Fountain Drive, Inchi
nnan Business Park, Paisl
ey, PA4 9RF UK)から入手した試薬を用
い、製造者の指示に従って、標準的なサイクリングパラ
メータを用いて設定した)により断片が生成され、これ
は、TOPOベクターにクローン化して完全長配列決定
を行うことにより、IMAGEクローン298975か
ら誘導されるPDE11A1配列とその5’末端が重な
り、かつPDE11A1の3’末端に向かってさらに4
00bp 3’側に伸びることが立証された。しかしな
がら、この断片はターミネーターコドンを含んでおら
ず、これは単離しなければならないさらなるPDE11
A1が3’末端に残ることを示していた。
を、配列番号6(上を参照)を有する尾状核マラトン・
レディTM(Marathon ReadyTM)cDNA
(クローンテック−Clontech Laborat
ories,1020 East Meadow Ci
rcle, Palo Alto,Californi
a,94303,USA)及び3’RACEキットと共
に供給される3’プライマー(クローンテック{Clo
ntech Laboratories,1020 E
ast Meadow Circle,Palo Al
to,California,94303,USA}、
製造者が推奨する試薬及び方法を用いる)で行った。こ
れらのRACE産物を用いて、2000クローンのミニ
ライブラリーをTOPOベクター(インビトロゲン−D
e Schelp 12,9351NV Leek,T
he Netherlands)中に作製した。このミ
ニライブラリーを、上で誘導される伸長断片の3’末端
から誘導されるプローブとのハイブリダイゼーションに
よりスクリーニングした。5つのクローンが同定され、
これらは、配列決定によりさらなる3’PDE関連配列
を有することが立証された。また、これらのクローンは
枠内ターミネーターコドンをも有しており、これはこの
cDNA内の推定コーディング配列の3’限界を示して
いた。完全長PDE11A1 cDNAの単離に用いら
れる手順が図3に模式的にまとめられている。3つの断
片の全てを分析することで2557bpの隣接配列を組
み立てることが可能となり、これは789残基のORF
を含む。PDE11A1の完全長cDNA配列が図4A
(配列番号1)に示され、このcDNA内の最大読取り
枠の翻訳が図4B(配列番号2)に示されている。
動物ホスホジエステラーゼと同様に、PDE11A1
は、触媒活性に必須であるものと考えられるこのタンパ
ク質のカルボキシル末端側半分の約250アミノ酸の保
存触媒ドメイン配列を有する。このセグメントは配列番
号4のアミノ酸499ないし731を含み、図1(パネ
ルC)に模式的に示され、かつ他のPDEの対応領域と
同じ配列保存を示す。実施例3 PDE11A1の5’スプライス変異体の単
離 図4Aに示される翻訳開始コドンであるATGがPDE
11A1における最も5’側のATGである可能性から
守るため、5’RACEを尾状核マラトン・レディTMc
DNA(クローンテック−Clontech Labo
ratories, 1020 East Meado
w Circle, Palo Alto, Cali
fornia,94303,USA)に対して行い、さ
らに上流の配列を単離した。用いた5’プライマーは
5’RACEキット(クローンテック−Clontec
h Laboratories, 1020 East
Meadow Circle,Palo Alto,
California,94303,USA)内に供給
されるアダプタープライマーであり、用いた3’プライ
マーは以下のオリゴヌクレオチドであった: GSP3: 5’−TCTCCAAGGAAATACAGTGC−3’ (配列番号7) 反応条件は製造者の指示によって指定される通りであっ
た。生じた5’RACE産生物をTOPOベクター(イ
ンビトロゲン−De Schelp 12,9351
NV Leek, The Netherlands)
にクローン化し、PDE11A1の5’末端から誘導し
たプローブを用いるハイブリダイゼーションスクリーニ
ングによりPDE11A1関連配列の存在について分析
した。この分析により、上流190bpコーディング配
列の存在が明らかになった。図4Aに示されるATGが
PDE11A1の真の翻訳開始コドンを表し得るものと
結論付けられる。幾つかの5’RACEクローンの配列
解析により、PDE11A2と命名されるPDE11A
1のスプライス変異体の存在が明らかになり、これはコ
ーディング領域が異なり、それによりPDE11A2に
おいては末端23コドンが代わりの25コドンで置換さ
れている。図5Cは、比較のため、PDE11A1及び
A2のアミノ末端の整列を示す。完全なcDNA配列及
び翻訳は図5A及び5Bに示されている。PDE11A
1とPDE11A2とは既知ATG開始コドンに対して
5’側の配列においても異なる。興味深い観察の1つ
は、プロサイト(prosite)プログラム(Bai
rochら,The PROSITE databas
e, its status in 1997.Nuc
leic Acids Res.25:217−221
(1997))を用いて検出した場合、PDE11A2
がプロテインキナーゼA潜在的リン酸化部位を持たない
可能性があることである。実施例4 PDE11A1は、バキュロウイルス系で発
現した場合、環状ヌクレオチド加水分解活性を示す スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera
frugiperda)昆虫細胞(Sf9細胞)のオー
トグラファ・カリフォルニカ(Autographa
californica)核多角体病ウイルス(AcN
PV)感染に基づくバキュロウイルス発現系を用いて、
PDE11A1タンパク質を産生した。簡単に述べる
と、PDE11を、ミニ−Tn7転移要素を有するドナ
ープラスミドpFASTBAC−FLAGにクローン化
した。この組換えプラスミドを、親バクミド(bacm
id)bMON14272(AcNPV感染性DNA)
及びヘルパープラスミドを有するDH10BAC適格細
胞に形質転移した。pFASTBACドナー上のミニ−
Tn7要素はこのバクミド上でattTn7付着部位に
置き換わることが可能であり、それによりPDE11が
ウイルスゲノムに導入される。組換えバクミドを含むコ
ロニーをlacZ遺伝子の破壊により同定する。その
後、PDE11/バクミド構築体を単離して昆虫細胞
(Sf9細胞)に感染させ、それにより感染性組換えバ
キュロウイルス粒子を産生させて組み換えPDE11A
1−FLAG融合タンパク質を発現させることができ
る。
性を、Martinsら, J.Biol. Che
m., 257:1973−1979にcGs−PDE
について記載される検定手順の変法(材料及び方法も参
照)を用いて測定した。細胞を回収し、形質移入の2
4、48及び72時間後に抽出物を調製した。それらの
検定の結果が図6に示され、ここで示される結果は3回
の別々の感染の平均である。昆虫Sf9細胞の感染によ
り、cAMP及びcGMPホスホジエステラーゼ活性の
両者の、疑似感染細胞よりも約10−15倍高い水準の
発現が生じた。これらの結果は、PDE11A1 cD
NAが、cAMP及びcGMPの両者を加水分解するこ
とが可能なホスホジエステラーゼをコードすることを確
証する。
ローナル抗FLAG抗体がヒドラジド結合により結合し
ているアガロースビーズ(M2アフィニティゲル)を収
容するカラム(イーストマン・コダック(Eastma
n Kodak))を用いるFPLCにより精製した。
これは、内在性昆虫タンパク質は溶出液中に洗い流しな
がら、組換え物質(これがFLAGエピトープに融合す
るため)をカラムに特異的に保持させる。次に、この組
換え物質を低pH条件下で洗い流す。この精製物質は詳
細な酵素及び阻害物質研究により適する。この物質の純
度を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動(SDS−PAGE)後のクーマシー染色又
は非染色SDS−PAGE(組換えPDE11A1を含
む)のニトロセルロース膜へのウェスタンブロット及び
IgG1モノクローナル抗FLAGエピトープ抗体を用
いる分析により検定する。PDE11A1−FLAG融
合タンパク質は、抗FLAG抗体とPDE11A1タン
パク質に融合するFLAGエピトープとの相互作用によ
り検出される。
ンパク質のホスホジエステラーゼ活性を、市販のSPA
(シンチレーション近接検定)キット(アマシャム−A
mersham place, Little Cha
lfont,Bucks,Hp7 9NA UK)を用
いて、cAMP又はcGMPのいずれかについて検定し
た。これは、酵素の近似Vmax値の算出を可能にする
所定の範囲の基質濃度での酵素活性を決定することによ
りcAMP及びcGMPに対するPDE11A1のKm
値の決定を可能にするために用いた。これらの実験の結
果が図7に示されており、PDE11A1のKmはcA
MPに対しては400nM、cGMPに対しては約4m
Mであることが示され、これはこの酵素がcAMPに対
してcGMPよりも高い親和性を有することを示す。こ
のように、本発明のPDE11酵素はcAMP及びcG
MPに対する親和性を有するが、cGMPよりもcAM
Pに対して高い親和性を有する。好ましくは、この酵素
は、cGMPよりもcAMPに対して少なくとも約5の
オーダーの親和性、より好ましくはcGMPよりもcA
MPに対して少なくとも約6のオーダーの親和性、より
好ましくはcGMPよりもcAMPに対して少なくとも
約7のオーダーの親和性、より好ましくはcGMPより
もcAMPに対して少なくとも約8のオーダーの親和
性、より好ましくはcGMPよりもcAMPに対して少
なくとも約8のオーダーの親和性、より好ましくはcG
MPよりもcAMPに対して約10(もしくはそれ以
上)のオーダーの親和性を有する。実施例5 PDE11A1を用いるインサイツハイブリ
ダイゼーション研究 この分析は、PDE11A1の潜在機能を研究するため
に、及びこの酵素を阻害することによりどのような治療
機会を開拓することができるのかに関して行った。した
がって、PDE11A1リボプローブ(方法を参照)を
生成し、35Sで放射標識した。この種の分析の例が図
8に示されており、海綿体の内皮細胞、腸における神経
節、前立腺の上皮細胞及び脳の線条体領域のニューロン
核における発現が示されている。これらのデータは、P
DE11の活性の阻害が表し得る多くの機会を説明する
のに役立ち得る。実施例6 PDE11抗体の産生 2種類の抗ペプチドPDE11抗体が、これらの試薬の
商業供給者(ゼネカCRB(Zeneca CRB)−
Cambridge Research Bioche
micals, Gadbrook Park, No
rthwich, Cheshire,CW9 7R
A.UK)により生成されている。
る。
idge Research Biochemical
s, Gadbrook Park, Northwi
ch, Cheshire, CW9 7RA. U
K)による標準手順を用いて生成し、標準的な抗原注射
措置を用いてウサギに注射した。抗体が血清として供給
され、これを組換えにより生じたPDE11A1タンパ
ク質に対するウェスタンブロットにより特徴付けた。こ
の実験からのデータが図9に示され、両抗体(Ab−1
及びAb−2)が、粗製溶解物中に存在する昆虫タンパ
ク質のバックグランド内に存在する場合、組換えPDE
11タンパク質の検出が可能であることが示されてい
る。実施例7 PDE11A1の完全なコーディング配列を含むcDN
Aを、ヒト尾状核cDNA(クローンテックカタログ番
号7191−1{Clontech Laborato
ries, 1020 East Meadow Ci
rcle, Palo Alto,Californi
a,94303,USA}から、ポリメラーゼ連鎖反応
(PCR)及び以下のオリゴヌクレオチド: 5’プライマー: TTCGGATCCGACATGGAAGATGGACC (配列番号10) 及び3’プライマー: GGTGACTAGTGCTCAATCTTCAGATGC (配列番号11) を用い、PCR試薬システム(ライフ・テクノロジー
ズ、カタログ番号10198−018{3 Fount
ain Drive, Inchinnan Busi
ness Park, Paisley, PA4 9
RF UK})を100μlの反応容積で用いて、又は
通常のハイブリダイゼーションスクリーニングを用いる
ことにより得た。
に提供されている。また、我々は、アミノ末端がここに
示されるものとは異なるPDE11A1のスプライス変
異体、すなわちPDE11A2も単離している。PDE
11A2の配列の残部はPDE11A1と同一である。
PDE11A2も、尾状核cDNAから、適切なプライ
マー及びPCRプロトコルを用いて、又はハイブリダイ
ゼーションスクリーニングにより得ることができる。
配列は789アミノ酸残基のタンパク質をコードする。
PDE11A2 cDNAのコーディング配列は791
アミノ酸残基のタンパク質をコードする。
完全な配列である。配列番号2はPDE11A1の翻訳
されたタンパク質の配列である。配列番号3はPDE1
1A2 cDNAの完全な配列である。配列番号4はP
DE11A2の翻訳されたタンパク質の配列である。実施例8 マウスの配列 PDE11のマウス相同体がクローン(IMAGEクロ
ーン760844)中に見出された。この相同体を、ヒ
トPDE11A1について上に提示されるプロトコルに
従って分析した。このクローン内のインサートの完全長
配列決定により、それが1068 bpのインサートを
含み、その内部900 bpがヒトPDE11に非常に
密接に対応することが明らかになった。
44から誘導される部分的ヌクレオチド配列である。下
線を付した配列は、ヒトPDE11と高い相同性を有す
るこのクローンのインサートの領域を示す。 配列番号12 ATTTGCACTGTACTTTCCTTGGAGAGTGCAATAATAGCCTGTGTGTGTTC
ATACCACCCGGGATGAAGGAAGGCCAACCCCGGCTCATCCCTGCGGGGCC
CATCACCCAGGGTACCACCATCTCTGCCTACGTGGCCAAGTCTAGGAAGA
CGTTGTTGGTAGAGGATATCCTTGGGGATGAGCGATTTCCTCGAGGTACT
GGCCTGGAATCAGGAACCCGCATCCAGTCTGTTCTTTGCTTGCCCATTGT
CACTGCCATTGGAGACTTGATTGGCATCCTTGAACTGTACAGGCACTGGG
ACAAAGAGGCCTTCTGCCTCAGCCATCAGGAGGTTGCAACAGCCAATCTT
GCTTGGGCTTCCGTAGCAATACACCAGGTGCAGGTGTGTAGAGGTCTCGC
CAAACAGACCGAACTGAATGACTTCCTACTCGACGTATCAAAGACATACT
TTGATAACATAGTTGCCATAGACTCTCTACTTGAACACATCATAATATAT
GCAAAAAATCTAGTGAACGCCGACCGCTGCGCGCTCTTCCAGGTGGACCA
CAAGAACAAGGAGCTGTACTCGGACCTGTTTGACATTGGGGAGGAGAAGG
AGGGGAAGCCCATCTTCAAGAAGACCAAGGAGATCAGATTTTCCATTGAG
AAAGGGATTGCTGGTCAAGTGGCAAGAACAGGCGAAGTCTTGAACATTCC
CGATGCCTACGCGGACCCTCGCTTTAACAGGGAGGTGGACCTGTACACAG
GCTACACCACGAGGAACATTCTGTGTATGCCCATAGTGAGCCGAGGCAGC
GTGATTGGCGTGGTGCAGATGGTGAACAAGATCAGCGGTAGCGCCTTCTC
CAAGACAGACGAGAACAACTTCAAGATGTTTGCTGTCTTCTGCGCACTGG
CCTTGCACTGTGCTAACGCCAGATGGAAAAGCCTAGCTTCTCTCCCCTGG
GTCAGCTGGGAAGGTTTGCTAGCTTGCCTGCACTGTGGCAAAGACCTGAG
GACCTGGAATGGTGACCACTGTCTGACGTGCACAGTCTTTCCTGCCTCTG
TGACACCCGCTTGGGATA 以下のものは上で下線を付した配列のタンパク質翻訳物
であり、これは300残基の長さであって、ATG翻訳
イニシエーターコドン又はTGA、TAAもしくはTA
Gターミネーターコドンのいずれをも含まない。したが
って、我々は、これがマウスPDE11 cDNAの断
片を表すものと確信した。 配列番号13 FLGECNNSLCVFIPPGMKEGQPRLIPAGPITQGTTISAYVAKSRKTLLVE
DILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTAIGDLIGILELYRHWDKEAF
CLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQTELNDFLLDVSKTYFDNIV
AIDSLLEHIIIYAKNLVNADRCALFQVDHKNKELYSDLFDIGEEKEGKPI
FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIPDAYADPRFNREVDLYTGYTTR
NILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFSKTDENNFKMFAVFCALALHCA 図10はヒトPDE11A1の残基126ないし425
に対する配列の整列を示す。これは、ヒトPDE11A
1タンパク質配列及びマウスPDE11タンパク質配列
のBLASTアルゴリズムを用いて作成した整列であ
る。
760844が、その大部分がヒトPDE11と非常に
密接に関連し、したがって、ヒトPDE11遺伝子のマ
ウス相同体を表すDNA配列を含むものと確信した。こ
のcDNAがマウス遺伝子の断片のみを含む可能性もあ
るが、これはヒトPDE11 cDNA配列の変異体を
表す。
及びそのコーディング配列を完全に配列決定した。これ
に関して、クローン化マウスPDE11の完全なcDN
A配列がここに配列番号14として提供されている。マ
ウスPDE11配列それ自体は配列番号15として示さ
れている。このマウスの配列は時折MMPDE11A3
と呼ばれる。
11A1、HSPDE11A2)とマウスPDE11配
列(MPDE11A3)との配列の比較を示す。見てわ
かるように、これらの配列の間にはほぼ完全な一致が存
在する。
より、MMPDE11A3コーディング配列がマウスの
線条体に高水準で局在することが示された。実施例9 ラットの配列 PDE11のラット相同体が見出され、これを我々はP
DE11A4と命名している。我々はこの相同体の一部
を配列決定することが可能である。これに関して、2種
類のヌクレオチド配列が配列番号16及び配列番号18
に示されている。2種類の、それらのそれぞれのアミノ
酸配列は配列番号17及び配列番号19である。データ
解析により、ここに示されるヒト及びラットの配列に関
する非常に高い相同性が明らかになる。要約 要約すると、とりわけ以下のものを本発明が提供し、か
つ実施例が示す: 1. 新規アミノ酸。
組成物。
現する発現系。 6. 前記新規配列に基づく治療方法。 7. 前記新規配列に基づく医薬組成物。 上記明細において言及される全ての刊行物は参考文献と
して本明細書中に援用される。記載される本発明の方法
及びシステムの様々な変更及び変形は、本発明の範囲及
び精神から逸脱することなく、当業者に明らかであろ
う。本発明を特定の好ましい態様に関して記載している
が、請求される発明はそのような特定の態様に過度に限
定されるべきでないことは理解されるべきである。実
際、生化学及び生物工学又は関連分野における熟練者に
明白である、記載される本発明の実施様式の様々な変更
が以下の請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
す。
ンパク質配列の整列を示す。
Claims (25)
- 【請求項1】 式Iとして示される配列又はその変異
体、相同体、フラグメント又は誘導体を含むアミノ酸配
列。 - 【請求項2】 式Iとして示される配列を含むアミノ酸
配列。 - 【請求項3】 請求項1又は請求項2に記載のアミノ酸
配列をコードするヌクレオチド配列。 - 【請求項4】 SEQ ID No.1又はSEQ I
D No.3又はSEQ ID No.14として示さ
れる配列又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘
導体を含むヌクレオチド配列。 - 【請求項5】 SEQ ID No.1又はSEQ I
D No.3又はSEQ ID No.14として示さ
れる配列を含むヌクレオチド配列。 - 【請求項6】 請求項3〜請求項5のいずれかに記載の
ヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド
配列。 - 【請求項7】 請求項6に記載のヌクレオチド配列とハ
イブリダイズし得るヌクレオチド配列。 - 【請求項8】 請求項3〜請求項7のいずれかに記載の
ヌクレオチド配列を含むベクター。 - 【請求項9】 請求項3〜請求項7のいずれかに記載の
ヌクレオチド配列が取り込まれた宿主細胞。 - 【請求項10】 PDE11の活性又は発現に影響を及
ぼし得る薬剤を同定するアッセイ方法であって、前記ア
ッセイ方法は、 前記薬剤を、請求項1又は請求項2に記載のアミノ酸又
は請求項3〜請求項7のいずれかに記載のヌクレオチド
配列と接触させ、 PDE11の活性又は発現を測定することを含み、 a)前記薬剤の非存在下でのPDE11活性又は発現と
b)前記薬剤存在下でのPDE11活性又は発現の差
を、前記薬剤がPDE11活性又は発現に影響を及ぼす
ことの指標とするアッセイ方法。 - 【請求項11】 前記アッセイが性機能障害の治療に有
用な薬剤をスクリーニングすることを目的とする請求項
10に記載のアッセイ方法。 - 【請求項12】 (a)請求項10又は請求項11に記
載のアッセイを実施し、 (b)PDE11の活性又は発現に影響を及ぼす1つ又
はそれ以上の薬剤を同定し、 (c)1つ又はそれ以上の同定された薬剤を大量に製造
する工程を含む方法。 - 【請求項13】 請求項10又は請求項11に記載のア
ッセイ方法であるインビトロのアッセイ方法において、 PDE11の活性又は発現に影響を及ぼし得る薬剤によ
って、 インビボのPDE11活性又は発現に影響を及ぼす方
法。 - 【請求項14】 PDE11に関連した疾患又は病態を
治療する医薬組成物の製造における、請求項10又は請
求項11に記載のアッセイ方法によってインビトロでア
ッセイされたときPDEの活性又は発現に効果を及ぼし
得る薬剤の用途。 - 【請求項15】 PDE11に対する抗体と免疫反応し
得る酵素。 - 【請求項16】 PDEをコードする、NCIMB40
925又はNCIMB40926又はNCIMB410
07より得られるヌクレオチド配列。 - 【請求項17】 NCIMB40925又はNCIMB
40926又はNCIMB41007より得られるヌク
レオチド配列から発現されるPDE。 - 【請求項18】 PDE11に関連した疾患又は病態を
治療する医薬組成物の製造における、PDE11の活性
又は発現に効果を及ぼし得る薬剤の用途。 - 【請求項19】 PDE11の不均衡又は障害に関連し
た障害を治療及び/又はモジュレートする薬剤の製造に
おける、PDE11の遺伝子及び/又はその発現産物の
用途。 - 【請求項20】 PDE11及び/又はその発現産物が
PDE11及び/又はその発現産物の活性をモジュレー
トし得る薬剤をスクリーニングするのに使われる、請求
項19に記載の用途。 - 【請求項21】 PDE11が請求項1に記載のもので
あるか又はそれをコードするヌクレオチド配列であるP
DE11作動薬。 - 【請求項22】 PDE11が請求項1に記載のもので
あるか又はそれをコードするヌクレオチド配列であるP
DE11拮抗薬。 - 【請求項23】 組換えPDE11酵素。
- 【請求項24】 PDE11酵素をコードする組換えヌ
クレオチド配列。 - 【請求項25】 実質的にここに記載されるようなPD
E11酵素。
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