JP2004000149A

JP2004000149A - 新規ｄｎａおよびその用途

Info

Publication number: JP2004000149A
Application number: JP2003041954A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Kumano; 熊野　聡; Hiroyuki Kobayashi; 小林　博幸; Tetsuya Otaki; 大瀧　徹也
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-02-22
Filing date: 2003-02-20
Publication date: 2004-01-08

Abstract

【課題】新規ＤＮＡおよびその用途などの提供。
【解決手段】本発明のＤＮＡを用いることにより、ノックアウト動物の作出が可能となる。これにより、ＧＡＬＰの生理作用がさらに明らかとなり、ＬＨ分泌不全に関係する各種疾患、ＬＨ過剰分泌に関係する各種疾患、肥満症、摂食障害などの予防・治療作用を有する化合物の探索・評価の実施が可能となる。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガラニン・レセプターに対するリガンドペプチドのゲノムＤＮＡおよびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプターを通じて生体機能を調節している。これらのレセプターの多くは共役しているグアニンヌクレオチド結合性タンパク質（ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、以下Ｇタンパク質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行う。Ｇタンパク質共役型レセプターであるガラニン・レセプター・サブタイプ２（ＧＡＬＲ２）に対するペプチド性リガンドとして、ブタ型のリガンド、ヒト型のリガンドおよびラット型のリガンド（特開２０００−１５７２７３号公報）、さらにマウス型のリガンド（配列番号：１６）（特許文献１　ＷＯ　０１／７７１６６号公報）が取得されている。これらのリガンドを、Ｇａｌａｎｉｎ−ｌｉｋｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＡＬＰ）と略称することもある（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４巻，　３７０４１頁，　１９９９年参照）。ＧＡＬＰは、ガラニン・レセプターに結合するガラニンに比べてＧＡＬＲ２に強い親和性を示す。ＧＡＬＰは、血中黄体形成ホルモン（ＬＨ）濃度の特異的な上昇作用（ＬＨ分泌促進作用）を有し、その反応性はレプチン受容体に異常が見られるＺｕｃｋｅｒ　ｆａｔｔｙラットにおいて亢進すること、ＧＡＬＰはＬＨの分泌促進作用を有するため、ＬＨ分泌不全に関係する各種疾患の予防・治療剤として有用なこと、ＧＡＬＰは、そのレセプターとの親和性が高いため、ＧＡＬＰまたはＧＡＬＰをコードするＤＮＡの投与量が増えるとＬＨ分泌に対し脱感作が起こる結果、ＬＨ分泌を抑制する作用も有するため、ＧＡＬＰはＬＨ分泌抑制剤として、ＬＨ過剰分泌に関係する各種疾患の予防・治療薬としても用いることができることが報告されている（特許文献２　ＷＯ　０２／６６０６４号公報）。また、ラットの脳室内にＧＡＬＰを投与すると、投与直後の摂餌量が著しく亢進すること（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　３２２巻，　６７−６９頁，　２００２年；Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　１４巻，　８５３−８６０頁）、その逆に投与後２４時間後の摂食量が減少すること（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　１４巻，　８５３−８６０頁）も報告されている。また、ＧＡＬＰを脳室内投与されたマウスにおいては、投与１時間後および２４時間後の摂食量が何れも減少したことが報告されている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　１４４巻，　８１３−８２２頁，　２００３年）。
【特許文献１】
ＷＯ　０１／７７１６６号公報
【特許文献２】
ＷＯ　０２／６６０６４号公報
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＧＡＬＰ遺伝子の発現を破壊した動物または部分的に不完全にした動物、すなわちノックアウト（ｋ／ｏ）動物は、ＧＡＬＰの生理作用をさらに明らかにし、ＧＡＬＰ発現異常に伴う疾患、例えば、ＬＨ分泌不全に関係する疾患、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患、肥満症、摂食障害などの予防・治療作用を有する薬物の探索・評価を実施する上でたいへん有用である。このようなノックアウト動物は、マウスを用いて作出される場合が多いが、その作出にはゲノム上のマウスＧＡＬＰ遺伝子の構造を明らかにする必要があったものの、マウスＧＡＬＰ遺伝子の構造は明らかにされていなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、マウスＧＡＬＰのゲノムＤＮＡを見出すことに成功した。さらに、本発明者らは、この知見に基づきこのゲノムＤＮＡを用いてノックアウト動物の作出が可能であることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１７で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含有するＤＮＡ、
（２）配列番号：９で表される塩基配列を含有する前記（１）記載のＤＮＡ、
（３）配列番号：１９で表される塩基配列を含有する前記（１）記載のＤＮＡ、（４）ゲノムＤＮＡである前記（１）記載のＤＮＡなどを提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
配列番号：１７で表される塩基配列は、マウスＧＡＬＰ遺伝子のエキソン１、イントロン１、エキソン２、イントロン２、エキソン３、イントロン３、エキソン４、イントロン４、エキソン５、イントロン５およびエキソン６を有する塩基配列である。
配列番号：１７で表される塩基配列と実質的同一の塩基配列を含有するＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記することもある）としては、例えば、配列番号：１７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、マウスＧＡＬＰをコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：１７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１７で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
配列番号：１７で表される塩基配列を含有するＤＮＡとしては、例えば、配列番号：９で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが挙げられる。配列番号：９で表される塩基配列を含有するＤＮＡとしては、配列番号：１９で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが挙げられる。
【０００７】
本発明のＤＮＡのクローニングの手段としては、マウスＧＡＬＰをコードする塩基配列の一部分を含有する合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによる選別があげられる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造）、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−Ｋ（宝酒造）等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ　ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。
本発明のクローン化されたＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のＤＮＡを含有する発現ベクターは、例えば、（イ）マウスＧＡＬＰをコードするＤＮＡを含有する、例えばｃＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【０００８】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Ｌプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【０００９】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００１０】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６０巻，１６０　（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９　（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７　（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９　（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０　（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５　（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７　（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
【００１１】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ^ＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ　細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ），１３，　２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２
（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、６９巻、２１１０　（１９７２）；Ｇｅｎｅ、１７巻、１０７　（１９８２）などに記載の方法に従って行うことができる。
【００１２】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６８巻、１１１　（１９７９）などに記載の方法に従って行うことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４巻、１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、７５巻、１９２９　（１９７８）などに記載の方法に従って行うことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻、４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行うことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻、４５６　（１９７３）に記載の方法に従って行うことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００１３】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｋ．　Ｌ．　ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，７７巻，４５０５　（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｇ．　Ａ．　ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　１９５，　７８８　（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１　（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６　（１９５９）〕，ＲＰＭＩ　１６４０培地〔Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９巻，５１９　（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外にマウスＧＡＬＰを生成せしめることができる。
【００１４】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００１５】
本発明のＤＮＡは、ノックアウト動物作成のために用いられる。
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）上記（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００１６】
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
ターゲティングベクターとしては、マウスＧＡＬＰ遺伝子のエキソン１、イントロン１およびエキソン２を欠損させたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖、エキソン２、イントロン２およびエキソン３を欠損させたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖などが挙げられる。好ましくは、マウスＧＡＬＰ遺伝子のエキソン１、イントロン１およびエキソン２を欠損させたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖である。
【００１７】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知　ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ_１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ_１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ_１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０^６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００１８】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ　ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり（Ｍ．　Ｊ．　Ｅｖａｎｓ及びＭ．　Ｈ．　Ｋａｕｆｍａｎ，　Ｎａｔｕｒｅ，　第２９２巻，　１５４頁，　１９８１年；Ｇ．　Ｒ．　Ｍａｒｔｉｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．　，　第７８巻，　７６３４頁，　１９８１年；Ｔ．　Ｃ．　Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，　第８７巻，　２７頁，　１９８５年）、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００１９】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲティングベクター（例、マウスＧＡＬＰ遺伝子のエキソン１およびエキソン２を欠損させたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖、エキソン２およびエキソン３を欠損させたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖など）をマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することにより、ターゲティングベクター（例、マウスＧＡＬＰ遺伝子のエキソン１およびエキソン２を欠損させたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖、エキソン２およびエキソン３を欠損させたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖など）を染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００２０】
（ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
【００２１】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、視床下部ＧＡＬＰ発現量の異常を来した本発明のＤＮＡ発現非ヒト哺乳動物では、摂食量の増大、摂食量の減少、ホルモン分泌または性成熟の異常などの生殖障害を引き起こすことが予想される。従って、該動物に試験化合物を投与し、その後の摂食量、血中ＬＨレベルおよび思春期の発来（性周期の開始）などを測定し、肥満症、摂食障害またはＬＨ分泌不全に関係する疾患に対する予防・治療作用を有する化合物を探索する。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して予防・治療効果を有し、安全で低毒性な、例えばＬＨ分泌不全に関係する疾患〔例、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症など）、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能不全など〕、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺癌、前立腺肥大症、卵巣癌、子宮内膜症、思春期早発症、ＬＨ産生下垂体腫瘍など）、頻尿、痴呆、糖尿病、肥満症、摂食障害などの予防・治療剤として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００２２】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００２３】
（ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
【００２４】
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
【００２５】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）、塩基などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を促進し、該タンパク質の機能を促進することができるので、例えば、ＬＨ分泌不全に関係する疾患〔例、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症など）、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能不全など〕、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺癌、前立腺肥大症、卵巣癌、子宮内膜症、思春期早発症、ＬＨ産生下垂体腫瘍など）、頻尿、痴呆、糖尿病、肥満症、摂食障害などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を阻害し、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば肥満症、ＬＨ分泌不全に関係する疾患などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００２６】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症の患者において、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００２７】
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の不妊症の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の不妊症の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００２８】
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
Ａ　　　　　　：アデニン
Ｔ　　　　　　：チミン
Ｇ　　　　　　：グアニン
Ｃ　　　　　　：シトシン
ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ　　　　　　　　　　：グリシン
Ａｌａ　　　　　　　　　：アラニン
Ｖａｌ　　　　　　　　　：バリン
Ｌｅｕ　　　　　　　　　：ロイシン
Ｉｌｅ　　　　　　　　　　：イソロイシン
Ｓｅｒ　　　　　　　　　　：セリン
Ｔｈｒ　　　　　　　　　：スレオニン
Ｃｙｓ　　　　　　　　　　：システイン
Ｍｅｔ　　　　　　　　　　：メチオニン
Ｇｌｕ　　　　　　　　　　：グルタミン酸
Ａｓｐ　　　　　　　　　　：アスパラギン酸
Ｌｙｓ　　　　　　　　　　：リジン
Ａｒｇ　　　　　　　　　　：アルギニン
Ｈｉｓ　　　　　　　　　　：ヒスチジン
Ｐｈｅ　　　　　　　　　　：フェニルアラニン
Ｔｙｒ　　　　　　　　　　：チロシン
Ｔｒｐ　　　　　　　　　　：トリプトファン
Ｐｒｏ　　　　　　　　　　：プロリン
Ａｓｎ　　　　　　　　　　：アスパラギン
Ｇｌｎ　　　　　　　　　　：グルタミン
ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
【００２９】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
マウスＧＡＬＰ　ｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
実施例１で用いられたプライマーｍＧ−１３８Ｆの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例１で用いられたプライマーｍＧ−３００Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
実施例１で用いられたプライマーｍＧ−２０１Ｆの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例１で用いられたプライマーｍＧ−２６４Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例１で得られたＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
実施例１で用いられたプライマー３１４８Ｆの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例１で用いられたプライマー３５５８Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例１で得られたマウスＧＡＬＰ遺伝子エキソン１からエキソン６までの配列およびマウスＧＡＬＰ遺伝子のプロモーター部分を含む５’側上流配列ならびに３’側下流配列を含むマウスＧＡＬＰ遺伝子の全塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例１で得られたマウスＧＡＬＰ遺伝子配列のエキソン１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例１で得られたマウスＧＡＬＰ遺伝子配列のエキソン２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例１で得られたマウスＧＡＬＰ遺伝子配列のエキソン３の塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例１で得られたマウスＧＡＬＰ遺伝子配列のエキソン４の塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例１で得られたマウスＧＡＬＰ遺伝子配列のエキソン５の塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
実施例１で得られたマウスＧＡＬＰ遺伝子配列のエキソン６の塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
マウスＧＡＬＰのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
マウスＧＡＬＰ遺伝子エキソン１、イントロン１、エキソン２、イントロン２、エキソン３、イントロン３、エキソン４、イントロン４、エキソン５、イントロン５およびエキソン６を有する塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例２で得られたＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例２で得られたマウスＧＡＬＰ遺伝子エキソン１からエキソン６までの配列およびマウスＧＡＬＰ遺伝子のプロモーター部分を含む５’側上流配列ならびに３’側下流配列を含むマウスＧＡＬＰ遺伝子の全塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例３（１）で用いる５’−アンカー１ＦのＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例３（２）で用いる５’−アンカー２ＦのＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例３（１）で用いる３’−アンカー１ＲのＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例３（２）で用いる３’−アンカー２ＲのＤＮＡの塩基配列を示す。
【００３０】
後述の実施例１で取得された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ／ＢＡＣ−２７７２７は、２００２年３月２２日から、日本国茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９７１として、２００２年３月５日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人　発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６７７８としてそれぞれ寄託されている。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
実施例１
ゲノム　マウスＧＡＬＰ遺伝子配列を含有するバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）のクローニング
マウスＧＡＬＰ　ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１）を基にしてプライマーｍＧ−１３８Ｆ（配列番号：２）、プライマーｍＧ−３００Ｒ（配列番号：３）、プライマーｍＧ−２０１Ｆ（配列番号：４）およびプライマーｍＧ−２６４Ｒ（配列番号：５）を設計した。
マウスゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーｍＧ−１３８ＦおよびプライマーｍＧ−３００Ｒを用いてＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲ反応の反応液はＡｄｖａｎｔａｇｅ　２　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を１　μｌ、添付の１０ｘ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒを５　μｌ、２．５　ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅを４　μｌ、プライマーｍＧ−１３８ＦおよびプライマーｍＧ−３００Ｒ（ともに１０　μＭ）を各１　μｌ、鋳型ＤＮＡ（前述のマウスゲノムＤＮＡ）を１　μｌ、および蒸留水３７μｌを混合して作製した。反応条件は９４℃の変性反応と、それに続く７２℃または６７℃の伸長反応により実施した。すなわち、９４℃・２５秒−７２℃・４分のサイクル反応を７回、９４℃・２５秒−６７℃・４分のサイクル反応を３２回、および６７℃・４分の最終伸長反応とした。続いて、このＰＣＲ反応の反応液を蒸留水で５０倍希釈した溶液を鋳型として用い、プライマーｍＧ−２０１ＦおよびプライマーｍＧ−２６４Ｒを用いてｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを実施した。反応液はＡｄｖａｎｔａｇｅ　２　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を１　μｌ、添付の１０ｘ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒを５　μｌ、２．５　ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅを４　μｌ、プライマーｍＧ−２０１ＦおよびｍＧ−２６４Ｒ（ともに１０　μＭ）を各１　μｌ、該鋳型ＤＮＡ（前述の５０倍希釈した溶液）を１　μｌ、及び蒸留水３７μｌを混合して作製した。反応条件は９４℃の変性反応と、それに続く７２℃または６７℃の伸長反応により実施した。すなわち、９４℃・２５秒−７２℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・２５秒−６７℃・４分のサイクル反応を２０回、および６７℃・４分の最終伸長反応とした。
該ＰＣＲ　産物を１　％アガロースゲル電気泳動を行い、サイバーグリーン染色される約５　ｋｂのＰＣＲ　産物であるバンドを含むゲル片を剃刀で切り出しＧｅｎｅ　Ｃｌｅａｎ　ｓｐｉｎ　ＤＮＡ　抽出キット（ＢＩＯ　１０１社）を用いてＤＮＡ断片ｍＧＡＬＰ−ｉｎｔ１を回収した。該ＤＮＡ断片の塩基配列決定のための反応をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）を用いて行い、蛍光式自動シークエンサー（ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　Ｐｒｉｓｍ　３７７：Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）を用いて塩基配列を解読した。その結果、ＤＮＡ断片ｍＧＡＬＰ−ｉｎｔ１は、配列番号：６で表される塩基配列を有していた。
得られた配列よりプライマー３１４８Ｆ（配列番号：７）およびプライマー３５５８Ｒ（配列番号：８）を作成し、この２つのプライマーをゲノムＤＮＡライブラリーＰＣＲスクリーニングサービス（カタログ番号；ＢＡＣ−４９２２、ライブラリーの種類；マウスＥＳ１２９ＳｖｊＩ、ＫＵＲＡＢＯ社）に供し、この２つのプライマーにより増幅されるｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）クローンを含む大腸菌のスクリーニングを行い、その結果、ＢＡＣクローンＢＡＣ−２７７２７を含む大腸菌Ｅｓｃｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１０Ｂ／ＢＡＣ−２７７２７を取得した。該大腸菌よりＢＡＣクローン　ＢＡＣ−２７７２７　ＤＮＡを精製し、そのＤＮＡの部分配列を蛍光式自動シークエンサー（ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　Ｐｒｉｓｍ：Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）により解読した。その結果、ＢＡＣ−２７７２７　ＤＮＡは、配列番号：９で表される塩基配列を有していた。これは、マウスＧＡＬＰ遺伝子エキソン１からエキソン６までの配列、およびマウスＧＡＬＰ遺伝子のプロモーター部分を含む５’側上流配列ならびに３’側下流配列からなるマウスＧＡＬＰ遺伝子の全塩基配列である。
また、マウスＧＡＬＰ遺伝子配列中に見出された、６個のエキソン（エキソン１〜エキソン６）の塩基配列を、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４および配列番号：１５にそれぞれ示す。該エキソンの塩基配列のサイズおよび配列番号：９で表される塩基配列における位置を〔表１〕に示す。
【００３２】
〔表１〕
　エキソン　　　　サイズ　　　　　　　　位置　　　　　　
エキソン１　　　２６３ｂｐ　　　　　２８３０番−３０９２番
エキソン２　　　８５ｂｐ　　　　　８１８９番−８２７３番
エキソン３　　　４９ｂｐ　　　　１３８５５番−１３９０３番
エキソン４　　　８１ｂｐ　　　　１６６９２番−１６７７２番
エキソン５　　　７８ｂｐ　　　　１９２２７番−１９３０４番
　エキソン６　　　９４ｂｐ　　　　２１４３４番− ２１５２７番　　　
【００３３】
実施例２
ゲノム　マウスＧＡＬＰ遺伝子配列を含有するバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）の塩基配列決定
実施例１で取得したｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　（ＢＡＣ）クローンＢＡＣ−２７７２７　ＤＮＡを鋳型として用いて、ＤＮＡの部分配列を蛍光式自動シークエンサー（ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　Ｐｒｉｓｍ：Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）により解読した。その結果、ＢＡＣ−２７７２７　ＤＮＡは、配列番号：９で表される塩基配列の５’側上流に配列番号：１８で表される塩基配列を有していた。これらの配列を連結して、配列番号：１９で表される塩基配列を得た。これは、マウスＧＡＬＰ遺伝子エキソン１からエキソン６までの配列、およびマウスＧＡＬＰ遺伝子のプロモーター部分を含む５’側上流配列ならびに３’側下流配列からなるマウスＧＡＬＰ遺伝子の全塩基配列である。
【００３４】
実施例３
ターゲティングベクターの構築およびＥＳ相同組み換え体の作製
（１）ＧＡＬＰ遺伝子のエキソン１から上流５ｋｂの配列およびエキソン２（開始コドンを有するエキソン）から下流５ｋｂ配列をアンカー配列としたベクターを考案し、相同組み換え用アンカー配列の間にポジティブマーカーであるネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を挿入し、エキソン１、エキソン２およびイントロン１を欠失させるためのターゲティングベクターを構築する。
エキソン１を含まずエキソン１よりもさらに上流に位置する配列の一部分である５’−アンカー１Ｆ（配列番号：２０）を５’−アンカー配列とし、エキソン２を含まずエキソン２の下流に位置する配列の一部分である３’−アンカー１Ｒ（配列番号：２２）を３’−アンカー配列とする。
上記５’−アンカー配列および３’−アンカー配列は、それぞれ適当な制限酵素を用いて、実施例１で得られたＢＡＣ−２７７２７　ＤＮＡから切り出すか、またはＢＡＣ−２７７２７　ＤＮＡを鋳型として定法に従い任意のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅して取得する。
５’−アンカー配列および３’−アンカー配列それぞれのＤＮＡ断片は、ゲノム上に存在する配列の順序に従い配置し、これらの間に、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）配列を有するＤＮＡ断片を挿入し、Ｔ４　ＤＮＡライゲースによるライゲーション反応により結合する。ネオマイシン耐性遺伝子をコードするＤＮＡ断片はＧＡＬＰ配列の向きとは逆向きに挿入する。ターゲティングベクターの構造の概略を、図１および図２に示す。さらに、結合したＤＮＡ断片の末端に、ネガティブマーカーであるジフテリア毒素遺伝子をコードするＤＮＡ断片を定法に従って結合し、ＤＮＡ断片を作製する。
プラスミドベクターの制限酵素切断部位に対する、上記で得られるターゲティングＤＮＡ断片（５’−アンカー配列−ｎｅｏ配列−３’−アンカー配列）のライゲーション反応を行い、大腸菌を形質転換し、該ＤＮＡ断片を有するターゲティングベクターを取得する。
ジーンパルサー　エレクトロポレーションシステム（バイオラッド社製）を用い、２３０　Ｖ、５００　μＦの条件で、上記ターゲティングベクター（ＤＮＡ量：１０〜１００μｇ）を、１２９ＳｖＥｖ　由来Ｗ９．５細胞（マウスＥＳ細胞）１０^７　ｃｅｌｌｓに導入する。
導入後の細胞を、０．２〜０．５　ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培養液中で、限界希釈法を用いて培養し、単一クローン化する。
単一クローン化したＥＳ細胞　５００株について、サザン解析の一次スクリーニングを行う。マウスゲノムＤＮＡを、制限酵素　Ｂａｍ　ＨＩを用いて３７℃、終夜反応により完全消化する。ターゲティングＤＮＡ断片の３’アンカー配列よりも３’外側に位置する塩基配列の一部を、ＰＣＲ　ＤＩＧ　ｐｒｏｂｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて標識し、標識プローブとする。Ｂａｍ　ＨＩ消化したゲノムに、前述の標識プローブをハイブリダイズ（４２℃、終夜反応）させ、６５℃の０．１ｘ　ＳＳＣに０．１％　ＳＤＳを添加した溶液中で１５分、２回洗浄する。サザン解析の結果、非組み換え由来の１０　ｋｂの断片がバンドとして検出され、該バンドと同程度の濃さで相同組み換え由来の５　ｋｂバンドが検出され、これらのゲノムを採集した１０株のＥＳ細胞は、ＥＳ相同組み換え体であると判断できる。この１０株のＥＳ相同組み換え体のうち生育が良好な５株からＤＮＡを抽出して、二次スクリーニングとして一次スクリーニングと同条件でサザン解析による確認を行う。その結果、一次スクリーニングと同様に、５株に陽性バンドを認める。さらに、三次スクリーニングとしてターゲティングＤＮＡ断片の５’アンカー配列よりも５’外側配列の一部を標識プローブに用い、上記と同様にサザン解析を行い、５株にＥＳ相同組み換え体を示すバンドを認め、サザン解析陽性クローンと判定する。
三次スクリーニングでＤＮＡ組み換えを確認したサザン解析陽性クローンのＥＳ相同組み換え体　５株について、核型解析により、染色体型が正常であることを確認する。それぞれ５０個の核型分析を行って正常率（２ｎ　＝　４０）が　６０％以上である場合、生殖系列移行に関して影響はないと考える。
（２）ＧＡＬＰ遺伝子のエキソン２（開始コドンを有するエキソン）から上流５ｋｂの配列およびエキソン３（活性発現に必要なガラニン相同配列を含むエキソン）から下流５ｋｂ配列をアンカー配列とするベクターを考案し、相同組み換え用アンカー配列の間にポジティブマーカーであるネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を挿入し、エキソン２、エキソン３およびイントロン２を欠失させるためのターゲティングベクターを構築する。
エキソン２を含まずエキソン２よりも上流に位置する配列の一部分である５’−アンカー２Ｆ（配列番号：２１）を５’−アンカー配列と、エキソン３を含まずエキソン３より下流に位置する配列の一部分である３’−アンカー　２Ｒ（配列番号：２３）を３’−アンカー配列とする。
実施例３（１）と同様の操作を行い、ＥＳ相同組み換え体を得る。
【００３５】
実施例４
ノックアウトマウスの作製
実施例３で得られるＥＳ相同組み換え体（ＥＳ細胞）の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウス胚盤胞へのマイクロインジェクションは数回に分けて実施する。
第１回目のインジェクションは、胚盤胞５０個を用いて行い、インジェクションされた胚盤胞は、別途、精管結紮マウスと交配することによって得られた偽妊娠マウス卵管に移植することによって妊娠させる。その結果、８個体の産仔が得られ、そのうち５個体のキメラマウスが得られる。そのうち８０％以上の高いキメラ率を有するマウスを実験に用いる。
第２回目のインジェクションは、第１回目のインジェクションと同様に、５０個の胚盤胞にインジェクションを行う。その結果、８個体の産仔が得られ、そのうち５個体のキメラマウスが得られる。そのうち８０％以上の高いキメラ率を有するマウスを実験に用いる。
キメラ率が、１００％に近い値を示した雄キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６系統雌マウスと交配し、産仔での生殖系列移行の確認およびヘテロマウスの取得を行う。
キメラマウスとＣ５７ＢＬ／６　系統マウスとの交配により、実施例３で得られるＥＳ細胞由来マウスが５０匹得られる。
該ＥＳ細胞由来マウス尾組織から定法によりゲノムＤＮＡを精製し、以下のように合成するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、ヘテロ欠損マウスを得る。
プライマーは、野生型であれば０．２　ｋｂのＤＮＡ断片を検出、ヘテロ欠損マウスであれば、０．２　ｋｂおよび１　ｋｂのＤＮＡ断片を検出できるように設計する。ターゲティングによりヘテロ欠損型では欠失したゲノムＧＡＬＰ領域の３’側に位置する塩基配列に基づいて、野生型検出用およびヘテロ欠損型検出用の３’側用プライマーをデザインして合成する。エキソン１、イントロン１もしくはエキソン２内、またはエキソン２、イントロン２もしくはエキソン３内の塩基配列に基づいて、野生型検出用の５’側用プライマーを、ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列に基づいて、ヘテロ欠損型検出用の５’側用プライマーをそれぞれデザインして合成する。
さらに、サザン解析により遺伝子欠損の確認を行う。
上記ＥＳ細胞由来マウス尾組織から定法によりゲノムＤＮＡを精製し、上記の野生型検出用プライマーを用いて増幅できるＤＮＡ断片をプローブとして用いて、サザン解析を行い、ヘテロ欠損マウスを得る。
サザン解析の結果、野生型由来の１０　ｋｂの断片がバンドとして検出され、該バンドと同程度の濃さで相同組み換え体由来の５　ｋｂバンドが検出されるゲノムを採集した個体は、ヘテロ欠損マウスであることがわかる。
ヘテロ欠損マウスと判定された雄個体および雌個体を交配し、ホモ欠損マウスを取得する。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡを用いることにより、ノックアウト動物の作出が可能となる。これにより、ＧＡＬＰの生理作用がさらに明らとなり、ＬＨ分泌不全に関係する疾患〔例、不妊症（例、月経不順、月経困難症、無月経症、体重減少性無月経症、続発性無月経症など）、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能不全など〕、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺癌、前立腺肥大症、卵巣癌、子宮内膜症、思春期早発症、ＬＨ産生下垂体腫瘍など）、頻尿、痴呆、糖尿病、肥満症、摂食障害などの予防・治療作用を有する化合物またはその塩の探索および評価が可能となる。
【００３７】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】マウスゲノムＤＮＡ上のＧＡＬＰエキソン（エキソン１〜６）の位置および代表的な５’−アンカー配列および３’−アンカー配列の位置関係を示す図である。
【図２】ＧＡＬＰターゲティングベクター中の５’−アンカー配列ならびに３’−アンカー配列およびネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）の位置関係を簡略して示す図である。

Claims

配列番号：１７で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含有するＤＮＡ。
配列番号：９で表される塩基配列を含有する請求項１記載のＤＮＡ。
配列番号：１９で表される塩基配列を含有する請求項１記載のＤＮＡ。
ゲノムＤＮＡである請求項１記載のＤＮＡ。