KR20080032139A - Ｓ１―５를 포함하는 단백질 제제 - Google Patents

Ｓ１―５를 포함하는 단백질 제제 Download PDF

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나오코 야기시타
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Abstract

본 발명자들은 S1-5 유전자의 기능을 상실시킨 넉아웃 마우스가 가령성(age-related) 질환 또는 증상을 일으키는 것을 발견하였다. 해당 넉아웃 마우스에서 골염량, 골밀도, 골강도가 저하되고 있는 것이 발견 되었고 골조직의 파골세포수가 증가되고 있는 것이 발견되었다. 또한 생체 외에서 해당 넉아웃 마우스로부터 유래된 골수세포를 이용한 파골세포 형성능력을 분석한 결과,해당 넉아웃 마우스는 야생형 마우스에 비해 파골세포 형성능력이 항진되고, 더 나아가, 파골세포의 크기도 커지고 있는 것이 판명되었다. 또한 이 시험관내(invitro)계에 정제한 S1-5 단백질을 첨가하자, 파골세포 형성능력이 억제되는 것이 판명되었다. 더 나아가, 정제한 S1-5 단백질을 골다공증 모델 마우스에 투여한 결과, 이 단백질이 골다공증 개선 효과가 있음이 나타났다. 상기의 발견은 S1-5 단백질이 골다공증과 같은 가령성 질환의 예방 및 치료에 효과적임을 보여주고 있다.

Description

Ｓ１―５를 포함하는 단백질 제제{PROTEIN PREPARATION CONTAINING S1-5}
본 발명은 S1-5 유전자를 결손시킨 가령성(age-related) 질환 또는 증상을 나타내는 비인간 넉아웃(Knockout) 동물 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 동물에 후보 물질을 투여하는 것을 특징으로 하는 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 비인간 넉아웃 동물에서 분리한 세포 및 그 용도, 또한 S1-5 단백질 및 그 용도에 관한 것이다.
류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis; 이하 RA라고 약칭한다)은 관절의 활막조직에 이상한 증식을 보이는 전신성의 만성 염증성 질환이다. 활막세포(synovial cell)는 관절의 활막에서 1 ~ 6층의 상피-유사층을 형성하는 섬유아세포와 유사한 세포이며, 활액에 프로테오글리칸(proteoglycans) 및 히알론산(hyaluronic acids)을 공급한다. RA 환자의 관절에서는 활막조직의 증식이 있느데, 이 결과에 의해 기인된 다층 구조, 염증성 세포의 침윤이라고 하는 여러 가 지의 증상이 관찰된다.
본 발명자들은 RA의 발병이나 진전과 관련된 분자 레벨의 구조를 해명하는 연구 과정에서 RA 환자의 활막조직에 강하게 발현하는 유전자를 발견하였다. 이 유전자에 의해 코드되는 단백질은 발현하는 조직인 활막세포(synovial cell)의 명칭을 따라서 시노비올린(Synoviolin)이라고 명명하였다(특허 문헌 1).
또한 본 발명자들은 단백질의 생화학적인 결합 실험으로부터 시노비올린의 결합 인자인 S1-5(EFEMP-1, FBNL, 또는 FBLN-3 등의 다른 명칭이 있다)의 존재를 분명히 했다. S1-5는 시노비올린의 결합 인자로서 본 발명자들이 처음으로 분리한 단백질이다.
S1-5는 인간 이배체 섬유아세포(human diploid fibroblast)에서 과잉 발현하는 유전자로서 분리되었다(Leucka-Czernik, B. et al ., Mol. Cell. Biol. 15, 120-128, 1995). 구조적으로는 DNA 합성을 촉진하는(세포 증식) EGF-유사 도메인(Epidermal Growth Factor-like domein) 및 피브린-유사 도메인이 발견되었다. 또한 최근 S1-5의 변이가 말라티아 레벤티네즈(Malattia Leventinese, ML) 및 도이네 벌집 망막 이영양증(Doyne honeycomb retinal dystrophy, DHRD)와 관련 있다는 보고가 있다(비특허 문헌 1).
그러나 S1-5의 상세한 기능은 알려져 있지 않고, S1-5를 결손시킨 개체의 표현형은 분명하지 않다.
특허 문헌 1: 국제 공개 제 WO02/052007호 팜플렛
비특허 문헌 1: Stone, E. M. et al ., Nature Genetics 22: 199-202, 1999
발명이 해결하려고 하는 과제
본 발명은 S1-5 유전자를 결손시킨 가령성(架齡性, age-related) 질환이나 증상을 일으키는 비인간 넉아웃 동물 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 상기 동물에 후보 물질을 투여하는 것을 특징으로 하는 가령성 질환이나 그 증상의 예방제나 치료제 등의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 비인간 넉아웃 동물에서 분리한 세포 및 그 용도, 또한 S1-5 단백질 및 그 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 헌신적으로 연구한 결과, S1-5 유전자의 기능이 상실된 넉아웃 마우스가 가령성 질환 또는 증상을 일으키는 것을 발견하였다. 해당 넉아웃 마우스의 골염량, 골밀도 및 골강도가 감소되고 골조직에서는 파골세포 수가 증가되는 것이 관찰되었다. 또한 시험관내(in vitro)에서는 해당 넉아웃 마우스로부터 유래된 골수세포를 이용한 파골세포 형성능력을 분석한 결과, 해당 넉아웃 마우스에서는 야생형 마우스와 비교하여 파골세포 형성능력이 증진되어 더욱 해당 세포의 크기가 커지고 있는 것이 판명되었다. 또한 상기 시험관내계에 정제한 S1-5 단백질의 첨가로, 파골세포 형성능력이 억제되고 해당 세포의 크기가 작아지게 되었다. 더 나아가, 정제된 S1-5 단백질을 골다공증 모델 마우스와 랫트에 투여한 결과, S1-5 단백질이 골다공증을 호전시키는데 영향이 있음을 보여주었다.
상기의 발견은 S1-5 단백질이 골변형, 골다공증, 골 파젯병(Paget's disease of bone), 부갑상선기능항진증(hyperparathyroidism), 골밀도의 저하, 피질골의 해면골화, 탈모, 조직의 손상 또는 괴사, 종양, 흉부 비대, 복수, 빈혈, 출혈, 피부의 노화(기미, 검버섯, 처짐, 잔주름 또는 점 등) 및 손톱의 노화와 같은 가령성 질환을 치료하고 예방하는데 유용함을 보여줍니다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
〔1〕S1-5 유전자의 전부 또는 일부의 기능을 상실시킨 가령성 질환 또는 증상을 나타내는 비인간 넉아웃 동물.
〔2〕〔1〕에 있어서, S1-5 유전자의 전부 또는 일부의 기능 상실은 S1-5 유전자의 파괴 또는 변이에 의한 동물.
〔3〕〔1〕에 있어서, 가령성 질환 또는 증상은 골변형, 골다공증,골 파젯병, 부갑상선기능항진증, 골밀도의 저하, 피질골의 해면골화, 탈모, 조직의 손상 또는 괴사, 종양, 흉부 비대, 복수, 빈혈, 출혈, 피부의 노화 및 손톱의 노화로 구성된 군으로부터 적어도 1개가 선택되어진 동물.
〔4〕〔1〕에 있어서, 동물은 지브라피시(zebrafish), 마우스, 랫트, 기니피그(guinea pig), 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 개, 소, 원숭이 및 침팬지로 구성된 군으로부터 어떤 하나가 선택되어진 동물.
〔5〕〔1〕~〔4〕의 어느 하나에 기재된 비인간 넉아웃 동물에서 분리한 세포.
〔6〕〔5〕에 있어서, 세포는 파골세포, 각화상피세포, 혈액세포, 암세포, 골수세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 진피세포, 근육세포, 신경세포, 임파구, 혈관평활근세포, 활막세포, 모유두세포, 간세포, 색소세포, 지방세포, 자궁내피세포 또는 폐포상피세포인 세포.
〔7〕S1-5 유전자의 전부 또는 일부의 기능을 상실시키는 것을 특징으로 하는 가령성 질환을 일으키는 비인간 넉아웃 동물의 제작 방법.
〔8〕〔7〕에 있어서, S1-5 유전자의 전부 또는 일부의 기능 상실은 S1-5 유전자의 파괴 또는 변이에 의한 방법.
〔9〕〔7〕에 있어서, 가령성 질환 또는 증상은 골변형, 골다공증, 골 파젯병, 부갑상선기능항진증, 골밀도의 저하, 피질골의 해면골화, 탈모, 조직의 손상 또는 괴사, 종양, 흉부 비대, 복수, 빈혈, 출혈, 피부의 노화 및 손톱의 노화로 구성된 군으로부터 적어도 1개가 선택되어진 방법.
〔10〕〔7〕에 있어서, 동물은 지브라피시(zebrafish), 마우스, 랫트, 기니피그(guinea pig), 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 개, 소, 원숭이 및 침팬지로 구성된 군으로부터 어떤 하나가 선택되어진 방법.
〔11〕〔1〕~〔4〕의 어느 하나에 기재된 비인간 넉아웃 동물에 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 후보 물질을 투여하는 것을 특징으로 하는 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
〔12〕〔1〕~〔4〕의 어느 하나에 기재된 비인간 넉아웃 동물에서 분리한 세포에 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 후보 물질을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
〔13〕〔12〕에 있어서, 세포는 파골세포, 각화상피세포, 혈액세포, 암세포, 골수세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 진피세포, 근육세포, 신경세포, 임파구, 혈관평활근세포, 활막세포, 모유두세포, 간세포, 색소세포, 지방세포, 자궁내피세포 또는 폐포상피세포인 방법.
〔14〕〔11〕~〔13〕의 어느 하나에 있어서, 가령성 질환 또는 증상은 골변형, 골다공증, 골 파젯병, 부갑상선기능항진증, 골밀도의 저하, 피질골의 해면골화, 탈모, 조직의 손상 또는 괴사, 종양, 흉부 비대, 복수, 빈혈, 출혈, 피부의 노화 및 손톱의 노화로 구성된 군으로부터 적어도 1개가 선택되어진 방법.
〔15〕〔1〕~〔4〕의 어느 하나에 있어서, 비인간 넉아웃 동물로부터 유래된 파골세포에 파골세포의 기능 억제제의 후보 물질을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 파골세포의 기능 억제제의 스크리닝 방법.
〔16〕하기 (a) ~ (d)의 어느 하나에 기재되어 있는 분리된 단백질:
(a) 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b) 서열 번호 1 또는 3에 기재된 염기 서열의 코드 영역을 포함하는 DNA에 의해 코드되는 단백질;
(c) 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능이 동일한 단백질; 및
(d) 서열 번호 1또는 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 스트린전트(stringent) 조건하에서 혼성화(hybridize)되는 DNA에 의해 코드되는 단백질이며, 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능이 동일한 단백질.
〔17〕〔16〕의 단백질의 부분 펩티드.
〔18〕〔17〕에 있어서, 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
〔19〕〔16〕에 기재된 단백질,〔17〕또는〔18〕에 기재된 펩티드를 함유하는 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제.
〔20〕〔19〕에 있어서, 가령성 질환 또는 증상은 골변형, 골다공증, 골 파젯병, 부갑상선기능항진증, 골밀도의 저하, 피질골의 해면골화, 탈모, 조직의 손상 또는 괴사, 종양, 흉부비대, 복수, 빈혈, 출혈, 피부의 노화 및 손톱의 노화로 구성된 군으로부터 적어도 1개가 선택되어진 예방 또는 치료제.
〔21〕〔16〕에 기재된 단백질,〔17〕또는〔18〕에 기재된 펩티드를 함유하는 파골세포의 기능 억제제.
〔22〕〔16〕에 기재된 단백질,〔17〕또는〔18〕에 기재된 펩티드에 결합하는 항체.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. S1-5 유전자
S1-5를 코드하는 유전자는 널리 알려져 있다. 그리고, accession number AAA65590(nucleotide accession U03877), I38449, NP_061489(nucleotide accession NM 018894), NP_004096(nucleotide accession NM 004105) 또는 Q12805에 특정지어지는 S1-5 단백질 및 이러한 단백질들과 유사한 단백질인 인간 시노비올린 단백질에 결합하는 활성을 가지는 단백질도 이용될 수 있다(Leucka-Czernik, B. et al ., Mol. Cell. Biol. 15, 120-128, 1995; Heon, E. et al ., Arch. Ophthalmol. 114, 193-198, 1996; Ikegawa, S. et al ., Genomics 35, 590-592, 1996; Katsanis, N. et al ., Hum . Genet . 106, 66-72, 2000; Giltay, R. et al ., Matrix Biol . 18, 469-480, 1999; Stone, E. M. et al ., Nat . Genet . 22, 199-202, 1999).
S1-5 유전자는 마우스 또는 랫트 등의 게놈 라이브러리(library)에서 얻을 수 있다. 예를 들면, 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome, BAC) 라이브러리에서 혼성화(hybridization)으로 원하는 클론을 얻을 수 있다. 또한 PCR 방법으로도 얻을 수 있다.
2. 비인간 넉아웃 동물
본 발명은 1) S1-5 유전자의 전부 또는 일부의 기능을 상실시킨 가령성 질환 또는 증상을 나타내는 비인간 넉아웃 동물 및 2) S1-5 유전자의 전부 또는 일부의 기능을 상실시키는 것을 특징으로 하는 가령성 질환을 일으키는 비인간 넉아웃 동물의 제작 방법을 제공한다. S1-5 유전자의 전부 또는 일부의 기능 상실은 S1-5 유전자의 파괴 또는 변이에 의한 것을 예시로 들 수 있다.
본 발명에서는 S1-5의 전부 또는 일부의 기능을 상실시킨 넉아웃 동물을 제작하기 위하여 유전자 적중이 이용될 수 있다.
S1-5 유전자의 적중(targeting) 벡터는 S1-5 유전자를 파괴함으로써 해당 유전자의 전부 또는 일부의 기능을 상실시키기 위한 것이다. 여기에서 '기능을 상실시킨다'라는 것은 유전자의 기능을 완전히 상실시키는 것, 또는 유전자의 기능이 야생형과 비교하여 저하되는 상태로 만드는 것을 의미한다.
기능을 상실시키기 위해서는 단순히 유전자를 파괴 또는 결손시키거나 또는 유전자에 변이를 도입하여 번역의 단계에서 프레임 시프트(frame shift)가 일어나도록 조작하는 등의 변형을 실시하면 된다.
본 발명의 '넉아웃 동물'은 하기와 같이 제작될 수 있다.
우선, S1-5 유전자의 염기서열의 일부 또는 모두 변형시킨 것을 만능세포(totipotent cell)에 도입하고 변형 S1-5 유전자가 도입된 만능세포를 선별한다. 다음으로, 선별된 유전자가 변형(결손, 파괴 또는 변이 등)된 만능세포를 수정란에 도입하여 키메라 개체를 제작하고, 수득한 키메라 개체를 교배함으로써 상동염색체의 한쪽 편 또는 양쪽 편의 S1-5 유전자를 넉아웃 시킨 개체를 제작한다.
본 발명에 이용되는 동물의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 사람을 제외한 지브라피시(zebrafish), 마우스, 랫트, 기니피그(guineapig), 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 개, 소, 원숭이, 및 침팬지 등이 있다. 본 발명에서는 취급이 쉽고, 번식이 용이한 마우스가 바람직하다.
본 명세서에서는 S1-5 유전자의 기능을 상실시키기 위하여 S1-5 유전자의 염기 서열의 일부 또는 전부를 변형시킬 수 있다. '변형'이란 S1-5 유전자 DNA 일부에 결손, 치환 또는 첨가시키는 변이를 추가하는 것을 말한다. 이러한 변이로는 예를 들면, 유전자 공학적 방법에 따라 염기 서열의 일부 또는 전부를 삭제(결실), 다른 유전자 또는 염기 서열의 삽입 또는 치환을 들 수 있다. 예를 들면, 코돈 해독 틀(reading frame)을 어긋나게 하든지, 프로모터 또는 엑손의 기능을 파괴함으로써 S1-5 결손 유전자를 제작할 수 있다. 그 결과, S1-5 유전자의 발현 산물인 S1-5 단백질의 기능이 발현되지 않는다.
본 발명의 넉아웃 마우스는 공지된 유전자 재조합법(유전자 적중법)으로 제작할 수 있다. 유전자 적중법은 당분야에서 잘 알려진 기술이며, 본 분야의 여러 실험서에 기재되어 있다.
적중 벡터를 설계하는 경우, S1-5 유전자의 구조에 변화를 가져오는 부위는 S1-5 유전자의 기능이 결손되기만 한다면 특별히 한정되지 않는다. 다만, S1-5 유전자의 기능 및 구조를 고려하여 S1-5 유전자의 EGF-유사 도메인 또는 피브린-유사 도메인의 영역이 결실되도록 벡터를 설계하는 것이 특히 바람직하다.
또한 벡터를 도입한 재조합체는 적중 벡터로 도입한 약제 내성 유전자를 이용한 스크리닝과 서던 블럿팅(Southern blotting) 또는 PCR을 이용한 스크리닝을 병용하여 선별하는 것이 바람직하다. 약제 선별의 마커 유전자로서는 네오마이신 내성 유전자 또는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제(hygromycin B phosphotransferase) 유전자 등이 이용될 수 있다. 또한 음성 선별용 유전자에는 HSV 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자 또는 디프테리아 독소 A(diphtheria toxin A) 유전자 등이 이용될 수 있다.
상기의 방법으로 제작한 적중 벡터를 이용하여 상동재조합을 수행한다. 본 명세서에서 '상동 재조합'이란 변형된 S1-5 유전자를 게놈에서 S1-5 유전자의 DNA영역에 인공적으로 재조합시키는 것을 말한다.
원하는 상동 재조합체를 얻기 위해서는 다수의 재조합체를 스크리닝할 필요가 있다. 그러나 수정란에서는 다수의 스크리닝을 수행하는 것은 기술적으로 어렵다. 그러므로 수정란과 같이 다분화능력이 있으며, 또한 시험관내에서 배양할 수 있는 세포를 이용하는 것이 바람직하다. 만능 세포로는 마우스(Nature 292:154-156, 1981), 랫트(Iannaccone, P. M. et al , Dev . Biol . 163(1): 288-292, 1994), 원숭이(Thomson, J.A. et al , Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 92(17):7844-7848, 1995) 또는 토끼(Schoonjans, L. et al , Mol . Reprod . Dev . 45(4):439-443, 1996) 등의 배아줄기(Embryonic stem) 세포가 확립되어 있다. 또한 돼지는 EG(embryonic germ) 세포가 확립되어 있다(Shim H. et al , Biol . Reprod, 57(5):1089-1095, 1997).
따라서 본 발명에서는 이러한 동물종들을 대상으로 넉아웃 동물을 제작하는 것이 바람직하다. 특히 마우스가 넉아웃 동물의 제작에 관한 기술이 잘 갖추어져 있으므로 가장 바람직하다. 마우스 ES 세포로는 현재 마우스로부터 유래된 ES 세포주 몇 개가 확립되어 있다. 예를 들면 TT-2 세포주, AB-1 세포주, J1 세포주 또는 R1 세포주 등을 이용할 수 있다. 이러한 것들 중 어떤 ES 세포주를 이용할지는 실험의 목적 또는 방법에 따라 적당히 선택할 수 있다.
ES 세포를 수립할 경우, 일반적으로 수정 후 3.5일째의 배반포(blastocysts)를 이용하지만, 이것 이외에 8 세포기 배아(embryos)를 채란하여 배반포까지 배양하여 이용함으로써 효율적으로 다수의 초기배아를 얻을 수 있다.
이와 같은 방법으로 얻은 ES 세포주는 통상 그 증식성이 매우 좋지만, 개체를 발생할 수 있는 재생능력을 잃기 쉽기 때문에 주의를 기울여 계대 배양하는 것이 필요하다. 예를 들면, STO 섬유아세포와 같은 적당한 피더(feeder) 세포상에서 LIF(leukemia inhibitory factor, 1 ~ 10000 U/㎖) 존재하에 탄산 가스 배양기(바람직하게는 5% 탄산 가스, 95% 공기 또는 5% 산소, 5% 탄산 가스, 90% 공기)내에서 약 37 ℃로 배양한다. 계대시에는 예를 들면, 트립신(trypsin)/EDTA 용액 처리로 단세포화하고 새롭게 준비된 피더 세포상에 이식하는 방법 등이 선택된다. 이러한 계대는 통상 1 ~ 3일마다 하는 것과 동시에 세포의 형태적 관찰을 하는 것이 바람직하다.
ES 세포로의 유전자 도입은 인산칼슘 공침전법(calcium phosphate coprecipitation), 일렉트로포레이션(electroporation), 리포펙션법(lipofection), 레트로바이러스(retroviral) 감염법, 응집법(agglutination), 마이크로인젝션(microinjection) 또는 파티클건법(particle guns) 등의 방법이 이용될 수 있지만, 간단하게 다수의 세포를 처리할 수 있는 일렉트로포레이션이 바람직하다.
수득한 재조합 ES 세포는 상동 재조합의 여부를 위하여 스크리닝을 실시한다. 즉, 우선 네오마이신 등이 도입된 약제 내성 인자에 의한 스크리닝을 실시한다. 약제 내성 유전자로는 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라이제, 디프테리아 독소 A(diphtheria toxin A) 유전자 등을 들 수 있다. 리포터 유전자로는 예를 들면, β-갈락토시다아제 유전자 또는 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase) 유전자 등을 들 수 있다.
또한 수득한 재조합 ES 세포는 S1-5 유전자상 또는 이 근처의 DNA 서열을 프로브(probe)로 이용한 서던 블럿(southern blot) 분석 또는 적중 벡터상의 DNA 서열과 적중 벡터에 이용한 마우스로부터 유래된 S1-5 유전자 이외 근처영역의 DNA서열을 프라이머로 이용한 PCR을 수행함으로써 상동 재조합이 일어났는지를 확실히 스크리닝 할 수 있다.
이러한 분석으로 염색체상에 존재하는 야생형 S1-5 유전자와 도입된 S1-5 유전자 절편 사이에서 올바르게 상동 유전자 재조합이 일어남으로써 염색체상의 S1-5 유전자에 변이가 이전된 세포를 선별할 수 있다.
도입 유전자의 혼합이 확인된 ES 세포를 동종의 비인간 포유동물에서 유래된 배아(embryo) 내에 되돌림으로써, 숙주배아의 세포덩어리에 혼합되어진 키메라 배아(chimeric embryo)가 형성된다. ES 세포를 배반포 등의 배아에 도입하는 방법으로는 마이크로인젝션이나 응집법이 알려져 있지만, 어떠한 방법을 이용해도 가능하며, 당업자가 적당히 수정할 수 있다.
마우스의 경우에는 호르몬제[예를 들면, FSH(follicle stimulating hormone) 유사 작용이 있는 PMSG(pregnant mare's serum gonadotropin) 및 LH(luteinizing hormone) 작용이 있는 hCG(human chorionic gonadotrophin)를 이용]를 이용하여 과배란 처리를 한 암컷 마우스를 수컷 마우스와 교배시킨다. 그 후, 배반포를 이용할 경우에는 수정에서 3.5일째에, 8 세포기 배아를 이용할 경우에는 2.5일째에, 각각의 자궁에서 초기 발생배아를 회수한다. 이렇게 하여 회수한 배아에 적중 벡터를 이용하여 상동 재조합을 실시한 ES 세포를 시험관내(in vitro)에 주입하여 키메라 배아를 제작한다. 또는 마우스 2일 배아(8 세포기 배아)의 투명대를 제거하고 ES 세포와 함께 배양하여 집합체(aggregate)를 생산한다. 이 집합체를 하루 배양하면 배반포가 된다. 이것을 양부모에게 이식하여 발생 및 생육시킴으로써 키메라 마우스를 얻을 수 있다. 양부모로 하기 위한 가짜 임신의 암컷 마우스는 정상적인 성주기의 암컷 마우스를 정관결찰 등으로 거세한 수컷 마우스와 교배시킴으로써 얻을 수 있다. 상기의 방법에 의해 제작한 키메라 배아를 제작된 가짜 임신 마우스의 자궁 내에 이식하여 임신·출산시키는 것으로 키메라 마우스를 제작할 수 있다. 키메라 배아의 착상, 임신이 더욱 확실히 일어나도록 하기 위하여 수정란을 채취하는 암컷 마우스와 양부모가 되는 가짜 임신 마우스는 동일한 성주기에 있는 암컷 마우스군으로부터 제작되는 것이 바람직하다.
그리고 나서 양부모로부터 출생한 새끼 중에서 키메라 마우스를 선별한다. ES 세포 이식배아로부터 유래하는 마우스 개체를 얻은 경우, 이 키메라 마우스를 야생형의 마우스와 교배한 뒤, 차세대 개체에 ES 세포 유래의 형질이 나타났는지를 확인한다. 차세대 개체에 ES 세포 유래의 형질이 나타났을 경우, ES 세포가 키메라 마우스의 생식 계열에 도입된 것으로 간주할 수 있다. ES 세포가 생식 계열에 도입된 것을 확인하는 것은 여러 가지 형질을 지표로 하여 이용할 수 있지만, 확인의 용이함을 고려하면, 피모색(hair color)을 지표로 하는 것이 바람직하다. 마우스는 아구티(agouti)색, 흑색, 황토색, 초콜릿색 및 백색 등의 피모색이 알려져 있다. 또한 몸의 일부(예를 들면, 꼬리 부분 끝)에서 염색체 DNA를 추출하고 서던 블럿 분석 또는 PCR 실험을 통하여 선별하는 것도 가능하다. 키메라의 기여율이 높은 마우스는 ES 세포가 키메라 마우스 생식 계열에 도입될 가능성이 높다. 상기와 같이 키메라 마우스를 선별한 후, 해당 키메라 마우스를 야생형인 암컷과 교배하여 F1를 얻어 변이 마우스 계통을 수립한다.
상기와 같은 방법으로 얻은 키메라 동물은 상동염색체 한쪽에만 유전자 결손이 있는 헤테로접합체(heterozygote)이다. 상동염색체상 양쪽의 S1-5 유전자가 결손된 호모접합체(homozygote)인 넉아웃 동물을 얻으려면, F1 동물 중 상동염색체 한쪽에만 유전자 결손이 있는 헤테로접합체끼리 교잡하면 된다.
획득한 넉아웃 동물의 조직에서 염색체 DNA를 추출하여 서던 블럿 분석 또는 PCR을 수행함으로써 넉아웃 동물의 획득 여부를 확인한다. 또한 해부시, 조직 및 기관의 이상이 관찰될 수도 있다. 그리고 조직에서 RNA를 추출하여 노던 블럿 분석에 의해 유전자의 발현 패턴을 분석할 수도 있다. 또한 필요에 따라서 혈액을 채취하여 혈액검사 및 혈청 생화학적 검사를 하는 일도 가능하다.
여기에서 호모접합체인 넉아웃 동물을 제작하면 태아 사망 등, 성체까지 성장하지 않아 모델 동물로서 적당하지 않은 경우가 있다. 이럴 경우에는 필요한 시기에 넉아웃시키는 것이 바람직하다. 또한 생체 내 어떤 특정한 조직에서 유전자의 기능을 조사하려면 조직 특이적으로 유전자를 넉아웃시키는 것이 바람직하다. 이와 같이 특정의 시기·특정의 세포 계열만을 넉아웃시킨 동물 및 체세포의 한정된 영역만을 넉아웃시킨 동물을 컨디셔널(conditional) 넉아웃 동물이라고 한다(바이오 메뉴얼 시리즈 8, 유전자 타겟팅: ES 세포를 이용한 변이 마우스 제작, 아이자와 신이치저, 요도사, 1995).
컨디셔널 넉아웃 동물을 제작하기 위한 방법으로서 예를 들면, 박테리오파지(bacteriophage) P1 유래의 재조합 시스템인 Cre-loxP 시스템(R. Kuhn et al . Science, 269, 1427-1429, 1995)을 이용한 유전자 적중법을 이용할 수 있다. Cre는 재조합 효소로서 loxP로 불리는 34 염기서열을 인식하여, 이 부위에서 재조합을 일으키는 것이 가능하다. 따라서 적중하고 싶은 유전자를 loxP 서열과 loxP 서열 사이에 넣고, Cre 리콤비나제 유전자를 특이적 프로모터 아랫부분(down stream)에 삽입함으로써 특이적인 부위 및 시기에 Cre가 생성되고 loxP에 사이에 있는 유전자를 잘라낼(즉, 특정 부위 및 시기에 원하는 유전자의 기능이 상실된다) 수 있다. 본 발명은 Cre-loxP의 시스템을 이용하여 적중 벡터를 설계할 경우, S1-5 유전자의 구조에 변화를 가져오는 부위는 S1-5 유전자의 기능이 결손된다면, 특별히 한정되지 않는다. 다만, S1-5 유전자의 기능 및 구조를 고려하여 S1-5 유전자의 EGF-유사 도메인 또는 피브린-유사 도메인의 영역을 결실시키도록 설계하는 것이 특히 바람직하다.
3. 비인간 넉아웃 동물에서 분리한 세포
또한 본 발명은 본 발명의 넉아웃 동물에서 분리한 세포도 제공한다. 본 발명의 넉아웃 동물에서 분리한 세포는 하기에 기재된 것과 같이, 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 스크리닝에 이용될 수 있다.
해당 세포로는 파골세포, 각화상피세포, 혈액세포, 암세포, 골수세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 진피세포, 근육세포, 신경세포, 임파구, 혈관평활근세포, 활막세포, 모유두세포, 간세포, 색소세포, 지방세포, 자궁내피세포 또는 폐포상피세포를 예시할 수 있지만, 이러한 것들로 한정되지 않는다.
이러한 세포들은 당업자에게 공지된 방법에 따라서 해당 넉아웃 동물에서 분리하는 것이 가능하다.
4. 가령성 질환
본 발명의 비인간 넉아웃 동물은 가령성 질환 또는 증상을 나타내는 것이다. 기존의 노화 모델 마우스로는 클로토(Klotho) 변이 마우스(Kuro-o, M. et al ., Nature, 6;390(6655):18-19, 1997), 노화 촉진 모델 마우스(SAM)(Takeda, T. et al., Mech Ageing Dev ., 17(2), 183-194, 1981) 또는 웨르나 증후군(Werner's syndrome) 모델 마우스(Chen, L. et al ., J. Biomed Biotechnol ., 2(2), 46-54, 2002)가 알려져 있지만, 이러한 마우스들은 조기 노화를 나타내며, 그 수명도 짧다. 본 발명의 비인간 넉아웃 동물(예를 들면, S1-5 넉아웃 마우스)은 야생형 마우스와 비교할 때 수명은 변함없지만, 다양한 가령성 질환 또는 증상의 병세가 심해지는 특징이 있다. 본 발명에서 '가령성 질환 또는 증상'이란 골변형, 골다공증, 골 파젯병, 부갑상선기능항진증, 골밀도의 저하, 피질골의 해면골화, 탈모, 조직의 손상 또는 괴사, 종양, 흉부 비대, 복수, 빈혈, 출혈, 피부의 노화(기미, 검버섯, 처짐, 잔주름, 점을 포함하나 여기에 한정되지 않는다.) 및 손톱의 노화 등을 들 수 있으며, 이러한 질환 또는 증상이 단독으로 또는 함께 나타나는 것을 의미한다.
'골변형'이란 가령, RA 또는 골다공증에 의해 골연골의 강도가 저하되고 골 및 연골이 변형하는 것을 의미한다. '골다공증'이란 골성분이 전체적으로 감소하고 골절하기 쉬워진 상태를 말한다. 골다공증의 90 % 이상을 차지하는 것은 분명한 원인 질환을 찾을 수 없는 원발성(primary) 골다공증이며, 그 대부분이 중노년에 일어나는 퇴행기성이다. 또한 이것과는 달리 연발성 골다공증은 바제도병(Basedow's disease), 쿠싱증후군(Cushing's syndrome), 중증 당뇨병, RA, 위 수술, 알코올 다갈증(alcohol polydipsia) 또는 스테로이드제 복용 등이 원인이 되어 발병한다.
골 파젯병은 골교체속도와 잘못된 골 리모델링(disorder bone remodeling)의 증가에 의해 특징지어지는 골 질환이다(Merck Manual of Medical Information homepage: http://mmh.banyu.co.jp/mmhe2j/sec05/ch061/ch061a.html).골 파젯병에서, 파골세포와 골아세포는, 뼈가 재흡수되고 리모델링이 일어나면서, 뼈의 특정지역에서 과도하게 활성화 된다. 이렇게 과도하게 활성화되는 지역은 정상 뼈보다 상대적으로 깨지기 쉽다고 알려져 있다.
"부갑상선기능항진증(hyperparathyroidism)"은 부갑상선 호르몬 PTH의 분비가 증가된 상태이고, 그것의 활성이 비정상적으로 증가된 것을 말한다. 부갑상선기능항진증에서는, 골량(bone content)이 감소하고, 파골세포가 증가하는 등의 증상이 나타난다고 알려져 있다. "부갑상선기능항진증"은 선종(adenoma) 또는 갑상선으로부터 PTH의 분비와 같은 일차적인 부갑상선기능항진증에 한정되는 것이 아니라, 만성신부전(chronic renal failure)이나 임신과 같은 원인에 의하여 부갑상선의 기능이 이차적으로 증가하는 것도 포함한다.
'종양'이란 악성 또는 양성에 제한되지 않고, 모든 종양 형성 세포 성장 및 증식, 모든 전암성 및 암성 세포, 및 조직을 의미한다. 본 발명의 종양은 원발성 종양이어도 되고, 전이성 종양이어도 된다. '암' 및 '암성'이라는 용어는 전형적으로 제어할 수 없게 된 세포 성장을 특징으로 하는 생리학적 상태를 말한다. 본 발명에서 '종양'의 예로는 암종양, 육종양, 백혈병 및 악성 임파종을 들 수 있다. 본 발명에서 암종양으로는 유방암, 전립선암, 대장암, 편평상피세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장암, 췌장암, 신경교아세포종, 자궁경관암, 난소암, 간장암(liver cancer), 방광암, 간세포종, 결장 직장암, 자궁체암, 침샘암, 신장암, 외음암, 갑상선암, 간암(hepatic cancer), 및 여러 가지 종류의 두부 및 경부의 암을 들 수가 있다. 본 발명에서 육종양으로는 악성 골종양, 악성 연부육종, 더욱 구체적으로는, 골육종, 연골육종, 유잉육종(Ewing's sarcoma), 지방육종, 평활근육종 또는 활막육종 등이 있다.
5. 가령성 질환의 치료제 또는 예방약의 스크리닝
본 발명은 비인간 넉아웃 동물에 후보물질을 투여하는 것을 특징으로 하는 가령성 질환 또는 증상의 치료제 또는 예방약의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에서는 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 후보물질 중에서 넉아웃 동물의 표현형을 상보하는 활성을 갖는 물질을 선별한다. 넉아웃 동물의 표현형의 상보에는 완전한 상보뿐만 아니라 불완전한 상보도 포함된다.
구체적으로는, 본 발명의 넉아웃 동물 또는 그 일부에 후보물질을 접촉시키고, 상기 후보물질을 접촉시킨 비인간 동물 또는 그 일부에서 표적이된 질환과 상관관계가 있는 지표값을 측정하여 이를 대조군과 비교한다. 이 비교결과에 근거하여 후보물질이 원하는 가령성 질환에 대한 효과를 평가한다. 예를 들면, 골밀도 상승, 골강도의 상승, 파골세포의 기능 억제, 항종양효과, 혈액세포 등의 증가 또는 지혈 능력의 향상 등을 지표로하여 후보물질의 예방·치료·개선 효과를 실험할 수 있다. 또한 피부의 노화(기미, 검버섯, 처짐, 잔주름 또는 점 등)를 일으킨 동물에게 미백 및 노화방지효과를 가져오는 화장품을 스크리닝하는 실험도 가능하다.
'넉아웃 동물 또는 그 일부'란 동물 생체의 전신 및 한정된 조직 또는 장기의 둘 모두를 포함한다. 한정된 조직 또는 장기의 경우는 동물에서 적출한 것도 포함한다.
후보 물질로는 예를 들면, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장 등이 있고 이러한 화합물들은 신규 화합물이어도 되고, 널리 알려진 화합물이어도 된다. 이러한 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다. 후보 물질의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산 등)이나 염기(예, 유기산 등) 등의 염이 있고 이 중에서 생리학적으로 허용되는 산첨가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로는 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 취화수소산(hydrobromic acid) 또는 황산 등)의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산 등)의 염 등이 이용된다.
실험 동물을 후보 물질로 처리하는 방법으로는 예를 들면, 경구투여, 정맥주사, 스와빙(swabbing), 피하투여, 피내투여 또는 복강투여 등이 이용되고 있어 실험 동물의 증상, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다. 또한 후보 물질의 투여량은 투여 방법, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다.
예를 들면, 골다공증의 예방·치료·개선약을 스크리닝하는 경우, 본 발명의 넉아웃 동물 등에 후보 물질을 투여하고, 이 동물의 골밀도값, 골강도 및 X선 사진 등을 경시적으로 측정함으로써 유효성을 나타낸 물질을 스크리닝할 수 있다. 특히 본 발명은 넉아웃 동물에서 골다공증과 척추후만은 상관이 있다는 것으로부터 넉아웃 동물의 후만 정도가 골다공증의 진행도를 측정하는 하나의 지표가 되는 것을 의미한다. 이러한 것으로부터, 본 발명의 넉아웃 동물에게 후보 물질을 투여하고, 이 동물의 척추후만 정도를 X선 사진 등으로 경시적으로 측정함으로써 후보 물질이 골다공증에 유효성을 나타내는지의 여부를 비침습적으로 효율 좋게 판단할 수 있다.
또한 본 발명의 넉아웃 동물에서 분리한 세포를 이용하여 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 스크리닝이 가능하다. 구체적으로는, 본 발명의 넉아웃 동물에서 분리한 세포에 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 후보물질을 접촉시키는 과정을 포함하여 상기 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 '접촉'은 예를 들면, 본 발명의 넉아웃 동물에서 분리한 세포의 배양액에 해당후보물질을 첨가함으로써 수행할 수 있다. 또한 해당 후보물질이 단백질인 경우에는 예를 들면, 해당 단백질을 코드하는 DNA를 포함한 벡터를 넉아웃 동물로부터 분리된 세포로도 입하는 것도 가능하다.
본 발명에서는 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 후보 물질 중에서 넉아웃 동물로부터 분리한 세포의 표현형을 상보하는 활성을 갖는 물질을 선택한다. 넉아웃 동물로부터 분리한 세포의 표현형을 상보하는 활성은 특별히 제한은 없지만, 파골세포이면 파골세포 활성 억제, 골수세포이면 파골세포 형성 억제, 각화상피세포이면 각화상피세포 증식, 혈액세포이면 혈액세포 분화 촉진, 암세포이면 암세포 증식 억제, 섬유아세포이면 섬유아세포 증식, 혈관내피세포이면 혈관내피세포 증식, 진피세포이면 모발 형성, 근육세포이면 근육세포 변성 수정, 신경세포이면 신경세포 변성 수정, 임파구이면 임파구 활성화 억제, 혈관평활근세포이면 증식 억제, 활막세포이면 기능 정상화, 모유두세포이면 발모, 간세포이면 기능 정상화, 색소세포이면 멜라닌 생성 억제, 폐포세포이면 활성화의 이상을 수정, 지방세포이면 분화 증식 억제, 자궁내피세포이면 내피세포 증식 억제 등을 예로 들 수 있다. 또한 해당 세포 표현형의 상보에는 완전한 상보뿐만이 아니라 불완전한 상보도 포함된다.
6. 파골세포의 기능 억제제의 스크리닝
본 발명은 넉아웃 동물로부터 분리된 파골세포에 파골세포의 기능 억제제 후보 물질을 접촉시키는 과정을 포함하고 해당 파골세포 기능 억제제의 스크리닝 방법 또한 제공한다. '파골세포의 기능'으로는 흡수공(resorption lacunae) 형성 기능(흡수공 형성 활성), TRAP 생성 능력, 액틴 고리 활성 능력, 프로테아제(카셉신(cathepsin) K, MMP-9) 생산 능력과 산 분비 능력을 예로 들 수 있지만, 이러한 것들로 한정되는 것은 아니고, 그 기능이 직접적 또는 간접적으로 골을 파괴하는 기능이라면, '파골세포의 기능'에 포함된다.
파골세포의 기능 억제제는 예를 들면, 본 발명의 넉아웃 동물로부터 분리된 파골세포의 형성 수의 정도 와 크기 등을 지표로 스크리닝할 수 있지만, 이 방법에 한정되지 않는다. 예를 들면, 실시예에 예시하였듯이, 본 발명의 넉아웃 동물로부터 분리된 골수세포를 다핵거대세포로 분화시켜 TRAP 양성 다핵거대세포수 및 TRAP 양성 다핵거대세포 크기 등을 지표로서 스크리닝하는 것이 가능하다(Takahashi N. et . al ., Endocrinology , 123(5):2600-2, 1988; Yasuda H. et . al., Proc Natl Acad Sci USA ., 31;95(7), 3597-602, 1998).
또한 파골세포의 기능 억제제는 흡수공 형성하는 활성을 지표로서 스크리닝하는 것이 가능하다(Hirayama, T. et . al ., J. Endocrinol . 2002 Oct;175(1):155-63, Udagawa, N. et . al ., Bone . 1999 Nov;25(5):517-23).
해당 스크리닝 방법에 따라 선별된 물질은 파골세포의 기능 억제제로서 연구 분야 또는 의약분야에서 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 파골세포의 기능 억제는 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제로서 응용이 가능하다.
또한 RA 환자의 골 파괴부에서 증식한 활막이 골내로 침입해 나가는 선두를 병리학적으로 실험하면 다수의 다핵거대세포가 관찰된다. 이 세포는 TRAP 양성 즉, 파골세포로서의 표현형을 충족시키는 것이 밝혀져서 RA 골 파괴에서 파골세포가 중요한 역할을 한다는 것이 추측된다(Urushibara, M. et al., Arthritis Rheum . Mar;50(3):794-804, 2004; Takayanagi, H. et al. Biochem Biophys Res Co ㎜ un . Nov 17;240(2):279-86, 1997). 그러므로 본 발명의 파골세포의 기능 억제제는 RA의 예방 또는 치료제로도 이용될 수 있다.
7. 분리된 S1-5 단백질
본 발명은 1) 서열 번호 1 또는 3에 기재된 염기 서열의 코드 영역을 포함하는 DNA에 의해 코드되는, 분리된 S1-5 단백질 및 2) 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 S1-5 단백질을 제공한다. 여기에서 '분리'란 자연 환경에서 취해진 상태를 말한다.
상기 단백질은 예를 들면, 재조합체로서 조제될 수도 있다. 예를 들면, 인간 S1-5 단백질이면 인간 S1-5 단백질을 발현하는 세포[예를 들면, 인간 이배체 섬유아세포(human diploid fibroblast), 활막조직 또는 배양 세포로 회수한 RA 환자에서 유래된 활막세포]로부터 추출된 mRNA를 기초로 cDNA 라이브러리를 얻는다(Short, J. M. et . al ., Nucleic Acid Research , 16, 7583, 1988). 서열 번호 1에 나타낸 염기 서열을 근거로 설정한 프로브를 이용하여, 이 라이브러리에서 혼성화된 클론(hybridizing clone)을 스크리닝함으로써 S1-5 단백질을 코드하는 DNA를 분리할 수 있다. 해당 DNA로부터 코드되는 S1-5 단백질은 당업자에게 널리 알려진 단백질 발현계를 이용하여 얻을 수 있다. 또한 인간 S1-5 단백질은 인간 S1-5 단백질을 발현하는 세포의 배양물로부터 회수·정제될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 S1-5 단백질과 기능적으로 동일한 단백질도 제공한다. 이러한 단백질을 유래하는 생물종은 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 인간, 지브라피시(zebrafish), 마우스, 랫트, 기니피그(guinea pig), 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 개, 소, 원숭이 및 침팬지 등을 예로 들 수 있다.
상기 S1-5 단백질과 기능적으로 동일한 단백질로는 예를 들면, 1) 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 분리된 단백질 및 2) 서열 번호 1 또는 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 스트린전트인 조건하에서 혼성화 하는 DNA에 의해 코드되는 단백질이며, 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 분리된 단백질이 있다.
상기 S1-5 단백질과 기능적으로 동일한 단백질에는 인간의 가령성 질환 또는 증상을 억제하는 기능이 있는 단백질, 본 발명의 넉아웃 동물 또는 본 발명의 넉아웃 동물로부터 분리된 세포의 표현형을 상보하는 기능이 있는 단백질 등이 있다.
또한 상기 S1-5 단백질과 기능적으로 동일한 단백질로는 면역학적으로 동일한 단백질을 들 수 있다. 본 발명에서 'S1-5 단백질과 면역학적으로 동일한 단백질'이란, S1-5 단백질을 특이하게 인식하는 항체와 반응한다면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, S1-5 단백질의 에피토프(epitope) 펩티드, 해당 에피토프를 함유하는 S1-5 단백질의 도메인 또는 해당 도메인을 포함하는 단백질을 S1-5 단백질과 면역학적으로 동일한 단백질로서 들 수 있다.
S1-5 단백질의 절편은 프로테아제(protease)를 이용한 소화에 의해 얻을 수 있다. 또한 서열 번호 1 또는 3에 기재된 S1-5 단백질을 코드하는 DNA를 무작위로 절단하고, 이것을 파지 벡터에 삽입해 도메인 펩티드를 제시하는 파지 라이브러리를 제작하는 것으로도 얻을 수 있다. 이러한 라이브러리를 S1-5 단백질을 인식하는 항체로 면역 스크리닝을 하면 면역학적으로 활성인 도메인을 결정할 수 있다. 클론된 파지의 삽입 절편을 서열분석함으로써 활성 도메인의 아미노산 서열도 분명히 할 수 있다.
본 발명에 의한 S1-5 단백질과 기능적으로 동일한 단백질은 면역학적인 특성뿐만 아니라 시노비올린과의 결합 특성에 근거해서도 정의할 수 있다. 즉, 본 발명은 시노비올린과의 친화성을 가진 S1-5 단백질의 절편을 포함한다. 이러한 변이체는 시노비올린을 이용하여 후보 단백질을 스크리닝함으로써 당업자라면 용이하게 선별할 수 있다. 예를 들면, S1-5 단백질은 시노비올린의 cDNA에서 1233-1592번째에 해당하는 120 아미노산 잔기를 시노비올린과의 결합에 필요한 영역으로 요구한다. 따라서 이 영역을 구성하는 아미노산 서열로 구성된 단백질 또는 이 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 결합된 단백질은 본 발명에 의한 S1-5 단백질과 기능적으로 동일한 단백질을 구성한다.
게다가, 본 발명에 의한 S1-5 단백질과 기능적으로 동일한 단백질은 S1-5 단백질이 갖는 생화학적인 활성에 근거해서도 정의될 수 있다. S1-5 단백질의 생화학적인 활성이란 예를 들면, 파골세포 형성 억제 활성, 세포 증식 제어 활성을 나타낼 수 있다(Leucka-Czernik, B. et al., Mol . Cell . Biol . 1995 15: 120-128).
이러한 S1-5 단백질에 기능적으로 동일한 단백질은 다른 단백질과의 융합 단백질로 구성될 수 있다. 예를 들면, 기능적으로 동일한 단백질은 S1-5 단백질 및 FLAG 태그, HA 태그, 히스티딘(His) 태그, 글루타치온-황-전이효소(glutathion-S-transferase(GST)) 태그 또는 말토오즈 결합 단백질(MBP) 태그 등의 부가적인 아미노산 서열에 기능적으로 동일한 단백질의 성질을 적어도 하나 유지하는 단백질을 포함한다. 첨가되는 단백질이 S1-5 단백질과는 다른 활성을 갖고 있을 경우도 S1-5 단백질이 갖는 적어도 하나의 기능을 유지한다면, 본 발명에서 그 융합 단백질은 기능적으로 동일한 단백질에 포함된다.
상기 S1-5 단백질과 기능적으로 동일한 단백질은 당업자에 의해 널리 알려진 방법(실험 의학 별책·유전자 공학 핸드북, pp246-251, 요도사, 1991년 발행)으로 분리될 수 있다. 예를 들면, 원하는 라이브러리을 대상으로, 서열 번호 1 또는 3에 나타낸 염기 서열(또는 그 절편)을 프로브로서 스크리닝하면 상동성이 높은 염기 서열을 가진 DNA를 클로닝할 수 있다. 이러한 라이브러리으로는 서열 번호 1 또는 3의 염기 서열에 무작위로 변이를 가하는 것, 인간 또는 인간 이외의 종에서 유래된 활막조직의 cDNA 라이브러리를 포함한다.
주어진 염기 서열에 무작위로 변이를 가하는 방법으로는 예를 들면, DNA의 아초산(nitrous acid) 처리에 의한 염기쌍(base pair)의 치환이 알려져 있다(Hirose, S. et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA ., 79:7258-7260, 1982). 이 방법에서는 변이를 도입하고자 하는 세그먼트(segment)를 아초산 처리함으로써 특정의 세그먼트 안에서 무작위로 염기쌍의 치환으로 도입할 수 있다. 또한, 원하는 변이를 임의의 장소로 가져오는 기술로는 갭드 듀플렉스(gapped duplex) 방법 등이 있다(Keamer W. et al., Methods in Enzymol ., 154:350-367, 1987). 변이를 도입해야만 하는 유전자는 환상 두 가닥 사슬 벡터에 클론되고, 이 벡터는 한 가닥 사슬로 분리된 후 원하는 자리에 변이를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드로 혼성화된다. 제한 효소에 의해 절단되어 선상화 된 벡터로부터 유래된 상보성 한 가닥 사슬 DNA는 상기 환상 한 가닥 사슬 벡터에 어닐되고(anneal), 합성 뉴클레오티드와의 사이의 틈을 DNA 폴리머라제(polymerase)로 충진한 다음 라이게이션(ligation)함으로써 완전한 두 가닥 사슬 환상 벡터가 된다.
변이된 아미노산의 수는 전형적으로 50 아미노산 이내이며, 바람직하게는 30 아미노산 이내이며, 더욱 바람직하게는 5 아미노산 이내(예를 들면, 1 아미노산)가 될 수 있다.
아미노산을 인위적으로 치환할 경우, 성질이 비슷한 아미노산으로 치환하면 원래의 단백질 활성이 유지되기 쉽다고 사료된다. 본 발명의 단백질은 상기 아미노산 치환으로는 보존적 치환이 가해진 단백질이며, 인간 S1-5 단백질(서열 번호 2 또는 4)과 기능적으로 동일한 단백질이 포함된다. 보존적 치환은 단백질의 활성에 중요한 도메인의 아미노산을 치환하는 경우 등에서 중요하다고 사료된다. 이러한 아미노산의 보존적 치환은 당업자에게는 잘 알려져 있다.
보존적 치환에 해당하는 아미노산의 그룹으로는 예를 들면, 염기성 아미노산(예를 들면, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 아미노산(예를 들면, 아스파라긴산 및 글루타민산), 비전하(uncharged) 극성 아미노산(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신 및 시스테인), 비극성 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판), β-분지(β-branch) 아미노산 (예를 들면 트레오닌, 발린 및 이소류신) 및 방향족 아미노산(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 히스티딘) 등을 들 수 있다.
또한 비보존적 치환에 의해 단백질의 활성 등을 더욱 상승(예를 들면, 지속적인 활성화형 단백질 등을 포함한다) 또는 하강(예를 들면, 도미넌트 음성 단백질 등을 포함한다)될 수도 있다.
서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 구성된 단백질은 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동일한 단백질이며, 자연적으로 존재하는 단백질을 포함한다. 일반적으로 진핵생물의 유전자는 인터페론 유전자 등에서 알려져 있듯이, 다형현상(polymorphism)을 보인다. 이 다형현상으로 인하여 생긴 염기 서열의 변화로 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가되는 경우가 있다. 이와 같이 자연적으로 존재하는 단백질이며, 또한 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열로 구성된 단백질과 기능적으로 동일한 단백질은 본 발명에 포함된다.
또한 다형현상으로 인한 염기 서열의 변화는 있어도 아미노산 서열은 변함이 없는 경우도 있다. 이러한 염기 서열의 변이는 침묵 돌연변이(silent mutation)라 불린다. 침묵 돌연변이를 갖는 염기 서열로 구성된 DNA에 의해 코드된 단백질도 본 발명에 포함된다. 또한 여기에서 다형현상이란 집단 내에서 어떤 유전자가 개체간에 다른 염기 서열을 갖는 것을 의미한다. 다형현상은 다른 유전자가 발견되는 비율과는 무관하다.
또한 S1-5 단백질과 기능적으로 동일한 단백질을 얻는 방법으로는 혼성화을 이용하는 방법이 있다. 즉, 서열 번호 1 또는 3에 나타낸 것과 같이 본 발명에 의한 S1-5 단백질을 코드하는 DNA 또는 그의 절편을 프로브로 하고 이 프로브와 혼성화될 수 있는 DNA를 분리하는 것이다. 혼성화을 스트린전트인 조건하에서 실시하면 상동성이 높은 염기 서열을 가진 DNA가 선별되어 결과적으로 분리되는 단백질에는 S1-5 단백질과 기능적으로 동일한 단백질이 포함될 가능성이 높아진다. 상동성이 높은 염기 서열이란 예를 들면, 70 % 이상, 바람직하게는 90 % 이상의 동일성을 가진 서열을 의미한다.
또한 스트린전트 조건이란 구체적으로 예를 들면, 25℃에서 6×SSC 및 40% 포름아미드(formamide)의 혼성화과 55℃에서 1×SSC의 세척이라는 조건을 들 수 있다. 스트린젠시(stringency)는 염 농도, 포름아미드의 농도 및 온도의 영항을 받지만, 당업자라면 필요한 스트린젠시를 얻기 위한 이러한 조건을 명백히 설정할 수 있다.
혼성화의 이용에 의하여, 예를 들면, 인간 이외의 동물종에서 S1-5 단백질의 호몰로그(homolog)를 코드하는 DNA의 분리가 가능하다. 인간 이외의 동물종, 즉 지브라피시(zebrafish), 마우스, 랫트, 기니피그(guinea pig), 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 개, 소, 원숭이 및 침팬지 등의 동물종으로부터 얻을 수 있는 DNA에 의해 코드되는 S1-5 단백질의 호몰로그는 본 발명의 기능적으로 동일한 단백질을 구성한다.
상기 S1-5 단백질(서열 번호 2 또는 4)에 변이를 도입해 얻은 단백질 또는 상기와 같은 혼성화 기술 등을 이용하여 분리된 DNA가 코드하는 단백질은 통상, 아미노산 서열에서 상기 S1-5 단백질(서열 번호 2 또는 4)의 아미노산 서열과 높은 상동성을 가진다. 높은 상동성이란 적어도 30 % 이상, 바람직하게는 50 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상(예를 들면, 95 % 이상)의 서열 동일성을 말한다. 염기 서열 또는 아미노산 서열의 동일성은 인터넷상에서 호몰로지(homology) 검색 사이트를 이용함으로써 결정될 수 있다{예를 들면, 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)에서 FASTA, BLAST, PSI-BLAST 및 SSEARCH 등의 상동성 검색을 이용할 수 있다［예를 들면, 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ) 웹 사이트 상에서의 상동성 검색(Search and Analysis) 페이지;http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html］. 또한 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 BLAST를 이용한 검색을 할 수 있다(예를 들면, NCBI의 홈페이지 웹사이트의 BLAST 페이지; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/;Altschul,S.F. et al ., J. Mol . Biol . 1990, 215(3):403-10; Altschul, S.F. et al., Meth . Enzymol . 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al ., Nucleic Acids Res . 1997, 25:3389-3402)}.
예를 들면, Advanced BLAST 2.1에서 아미노산 서열의 동일성 산출은 프로그램에 blastp를 이용하고 Expect값은 10, Filter는 모두 OFF로 하고, Matrix에 BLOSUM62를 이용하고, Gap existence cost, Per residue gap cost 및 Lambda ratio를 각각 11, 1, 및 0.85(디폴트 값)로 설정해서 검색하면 동일성(identity) 값(%)을 얻을 수 있다(Karlin, S. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:2264-68 1990; Karlin, S. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-7 1993).
본 발명에 의한 단백질 또는 그 기능적으로 동일한 단백질은 당 사슬(glycoside chain) 등에 의한 생리적인 수식, 형광, 방사성 물질과 같은 표지 또는 다른 단백질과의 융합이라고 하는 다양한 수식이 가해진 단백질일 수 있다. 특히 앞으로 서술할 유전자 재조합체는 발현을 위해 이용된 숙주에 따라 다르게 당화될 수 있다. 그러나 비록 수식이 다를 지라도 본 명세서에 기술된 S1-5 단백질과 유사한 성질을 나타내는 단백질이라면 본 발명에 의한 S1-5 단백질 또는 기능적으로 동일한 단백질이다.
S1-5 단백질은 생체 재료뿐만 아니라 이 단백질을 코드하는 유전자를 적당한 발현계에 조합시킨 유전자 재조합체(recombinant)로서 얻을 수도 있다. S1-5 단백질을 유전자 공학적인 방법에 따라 얻기 위하여 앞서 서술한 S1-5 단백질을 코드하는 DNA를 적당한 발현계에 조합시킨 후 발현시킨다. 본 발명에 이용 가능한 숙주/벡터계로는 예를 들면, 발현 벡터 pGEX 및 대장균을 들 수 있다. pGEX는 외래 유전자를 GST와의 융합 단백질로 발현시킬 수 있으므로(Smith DB, et al., Gene, 67:31-40, 1988), S1-5 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 pGEX를 열충격으로 BL21과 같은 대장균 균주에 도입하고 적당한 배양 시간 후에 GST 융합 S1-5 단백질의 발현 유도를 위하여 이소프로필티오-β-D-갈락토시드(isopropylthio-β-D-galactoside, IPTG)를 첨가한다. S1-5 단백질을 코드하는 유전자는 활막세포의 cDNA 라이브러리 등을 주형으로 이용한 PCR 등의 방법으로 증폭되어진 것에 의해 얻을 수 있다. 본 발명에 의한 GST는 글루타티온 세파로오스(glutathione sepharose) 4B에 흡착하기 때문에 발현 생성물은 어피니티 크로마토그래피(affinity chromatography)로 쉽게 분리·정제될 수 있다.
S1-5 단백질의 재조합체를 얻기 위한 숙주/벡터계로는 이외에도 다음과 같은 것이 응용될 수 있다. 우선, 박테리아을 호스트에 이용할 경우에는 히스티딘 태그, HA 태그, FLAG 태그, GST 태그 또는 MBP 태크 등을 이용한 융합 단백질의 발현용 벡터를 상업적으로 유용하게 이용할 수 있다. 효모의 경우에는 피치아(Pichia)속 효모가 당화된 단백질의 발현에 유효한 것으로 알려져 있다. 당화라는 점에서는 곤충 세포를 숙주로 하는 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터를 이용한 발현도 유용하다(Bio/Technology, 6:47-55, 1988). 더 나아가 CMV, RSV 또는 SV40 등의 프로모터를 이용한 벡터는 포유동물 세포로 도입될 수 있고, 이러한 숙주/벡터계들은 모두 S1-5 단백질의 발현계로서 이용될 수 있다. 또한 유전자는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 이용함으로써 도입될 수 있다.
얻은 본 발명의 단백질은 숙주 세포내 또는 세포외[메디아(media) 등]에서 분리될 수 있고, 실질적으로 순수하고 호모지너스(homogenous)한 단백질로 정제될 수 있다. 단백질의 분리 및 정제는 통상의 단백질의 정제로 이용되고 있는 분리 및 정제 방법의 이용으로 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴 아마이드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석 또는 재결정 등을 적당히 선택, 조합하면 단백질을 분리, 정제할 수 있다.
크로마토그래피로는 예를 들면, 어피니티 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Marshak et al ., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이러한 크로마토그래피들은 예를 들면, HPLC 또는 FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 이용해 실시할 수 있다.
본 발명의 단백질은 무세포계 이외의 발현계를 이용하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 단백질은 생리적인 고차 구조, 당화, 디설파이드 결합(disulfide bond), 지방질 첨가 또는 메틸화 등으로 수식화된 것이 바람직하다. 본 발명의 당사슬(glycoside chain)의 예로서 N 결합 당쇄(N-linked glycosides)와 O 결합 당쇄(O-linked glycoside)를 포함한다. 질소와 연결된 글리코시드(glycosides)의 예로는 높은 만노오즈(mannose) 형태와 복합 형태가 있고, 산소와 연결된 글리코시드의 예로는 뮤신(mucin)(O-AglNAc) 형태, 산소와 연결된 퓨코오스 형태(O-Fuc type) 또는 산소와 연결된 갈락토오스 형태(O-Glc type)등이 있다.
또한 본 발명의 단백질은 실질적으로 정제된 단백질인 것이 바람직하다. 여기에서 '실질적으로 정제되었다'라고 하는 것은 본 발명의 단백질의 정제도(단백질 성분 전체에서 본 발명의 단백질 비율)가 50 % 또는 그 이상, 60 % 또는 그 이상, 70 % 또는 그 이상, 80 % 또는 그 이상, 90 % 또는 그 이상, 95 % 또는 그 이상, 100 % 또는 100 % 에 가까운 것을 의미한다. 100 % 에 가까운 상한은 당업자의 정제 기술 및 분석 기술에 달려있고, 예를 들면, 99.999 %, 99.99 %, 99.9 % 또는 99 % 등이 있다.
상기의 정제된 단백질은 어떠한 정제 방법에 따라서 정제된 것이더라도 실질적으로 정제된 단백질이라면 포함된다. 이러한 단백질의 예를 들자면, 상술의 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴 아마이드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석 또는 재결정 등을 적절히 선택 또는 조합하여 실질적으로 정제된 단백질을 예로 들 수 있지만, 이러한 것들로 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 상술한 본 발명의 단백질의 부분 펩티드(부분 절편)를 제공한다. 부분 펩티드가 본 발명의 단백질과 기능적으로 동일한 것이라면, 부분 펩티드의 길이 등은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 부분 펩티드로는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이며, 본 발명의 단백질보다 짧은 펩티드를 예로 들 수 있다. 이러한 펩티드를 이용함으로써 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료를 할 수 있으며, 파골세포의 활성을 억제할 수도 있다.
8.약제
본 발명은 본 발명의 단백질 또는 그 부분 펩티드(이하 단백질로 기재한다)를 함유하는 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제를 제공한다. '가령성 질환 또는 증상'은 상기에서 언급한 대로이다. 아울러 본 발명은 본 발명의 단백질 등을 함유하는 파골세포의 기능 억제제를 제공한다. 이러한 약제들의 단백질 등은 분리된 것이라면 그 상태에 특별한 제한은 없으며, 상기 약제로서 이용될 수 있는 한, 실질적으로 정제된 단백질 또는 천연 그대로의 정제된 단백질 등에서도 이용될 수 있다. 약제로서의 단백질은 무세포 시스템에서 보다는 다른 발현계에서 생산하는 것이 바람직하다.
이러한 약제들은 인간 또는 인간 이외의 동물(예를 들면, 실험동물, 축산동물 및 애완동물)에서의 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제로서, 또한 파골세포의 기능 억제제로서 이용될 수 있다.
본 발명의 단백질은 약리학상 허용되는 담체 또는 매체 예를 들면, 멸균수 또는 생리 식염수, 안정제, 부형제, 방부제, 계면활성제, 킬레이트제(EDTA 등) 및 결합제 등에 적당히 조합하여 제제화해서 투여될 수 있다.
본 발명의 약제의 형태(제형)로는 주사제형, 동결건조제형 및 용액제형 등을 예로 들 수 있지만, 이러한 것들로 한정되는 것은 아니다.
환자에게 투여는 경구 또는 비경구 투여가 모두 가능하지만 바람직한 것은 비경구 투여로, 예를 들면, 주사 투여가 가능하다. 주사 투여의 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 또는 피내주사 등으로써 전신 또는 국부에 투여할 수 있다.
투여량은 환자의 체중 및 연령, 투여 방법, 증상 등에 따라 달라지지만, 당업자라면 적절한 투여량을 적당히 선택할 수 있다. 일반적인 투여량은 약제의 유효혈중농도 및 대사 시간에 따라 다르지만, 하루 유지량은 약 0.1 ㎎/㎏ ~ 약 1.0 g/㎏일 수 있고, 약 0.1 ㎎/㎏ ~ 약 10 ㎎/㎏이 바람직하며, 약 0.1 ㎎/㎏ ~ 약 1.0 ㎎/㎏이 더욱 바람직하다. 투여는 1회에서 몇 차례로 나누어 실시할 수 있다.
9.항체
본 발명은 S1-5 단백질을 인식하는 항체를 제공한다. 본 발명에 의한 S1-5 단백질 또는 그 절편을 면역원으로 이용함으로써 널리 알려진 방법으로 S1-5 단백질의 항체를 얻을 수 있다(Harlow, E. et al.; Antibodies;A Laboratry manual. Cold Spring Harbor, New York, 1988, Kohler, G. et al., Nature 256: 495-7, 1975).
면역을 위하여, 본 발명의 S1-5 단백질 또는 그 절편을 적절한 보조약(adjuvant)과 함께 면역 동물에 면역시킨다. S1-5 단백질의 절편은 면역원 생산을 위하여 담체 단백질에 결합시킬 수 있다. 면역원을 얻기 위한 담체 단백질에는 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole limpet hemocyanin, KLH) 또는 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 등이 이용될 수 있다.
면역 동물에는 토끼, 마우스, 랫트, 염소, 또는 양 등이 일반적으로 이용된다. 보조약으로는 프로인트 완전보조약(Freund's complete adjuvant, FCA) 등이 일반적으로 이용된다(Freund, J.,Adv. Tubercl. Res., 1:130-148, 1956). 적절한 간격으로 면역을 추가한 후, 항체 값 상승을 확인하고 채혈하여 항혈청을 얻을 수 있다. 더 나아가, 그 항체분획을 정제하면, 정제된 항체[폴리크로날 항체(polyclonal antibodies)]를 얻을 수도 있다.
또한, 항체 생성 세포를 채취해 세포 융합법 등으로 클로닝하여, 단일 클론 항체를 얻을 수도 있다. 단일 클론 항체는 면역학적 검정법에서 높은 감도와 특이성을 달성하기 위한 중요한 도구이다. S1-5 단백질 등을 인식하는 항체를 얻기 위한 또 다른 방법에는 시노비올린을 코드하는 DNA를 무작위로 절단하여, 이 절편을 도메인 펩티드를 제시하는 파지 라이브러리를 생산하기 위하여 파지 벡터에 도입하는 것이 있다. 시노비올린을 인식하는 항체를 이용하여 이러한 라이브러리들을 면역 스크리닝하면 면역학적으로 활성을 갖는 도메인을 동정할 수 있다.
항체 생성 세포로는 면역 동물로부터 유래된 것을 이용할 수도 있다. 더 나아가, 상기와 같이 하여 얻은 면역 동물로부터 유래된 단일 클론 항체 생성 세포의 항체 유전자로부터 키메라 항체 및 인간화 항체가 제조될 수 있다. 항체를 인간에게 투여할 경우, 동물의 항체는 이물질로 배제되기 때문에 바람직하지 않다. 그러므로 항원성이 강한 항체의 불변 영역을 인간의 항체로 치환한 키메라 항체나 또는 불변 영역뿐만 아니라 가변 영역의 구조까지 인간의 유전자로 치환한 인간화 항체가 필요하게 된다.
본 발명의 S1-5 단백질 등을 인식하는 키메라 항체 또는 인간화 항체는 약물 운송 시스템(Drug Delivery System; DDS)에 유용하다. 본 발명에 의한 S1-5 단백질 등을 인식하는 항체를 이용한 DDS와 관련있는 항체에 연결시키는데 유용성을 기대할 수 있는 물질의 예로는 파골세포 기능(비스포스포네이트(bisphosphonate), 오스테오프로테게린(osteoprotegerin))을 억제하는 물질이 있다.
또한 본 발명의 항체는 S1-5 단백질 등의 면역학적 검출용 시약으로 이용될 수 있다. 조직 및 혈중에 존재하는 단백질 등을 면역학적으로 검출하기 위하여 항체를 이용하는 방법은 널리 알려져 있다.
또한 본 발명의 항체는 S1-5 단백질 등 또는 S1-5 단백질 등을 발현하는 세포의 분리 또는 검출에 이용될 수 있다. 항체를 이용한 단백질 등의 분리 정제 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 또한 본 발명의 S1-5 단백질 등은 활막세포 및 인간 이배체 섬유아세포의 마커로서 이용될 수 있다. 즉, S1-5 단백질 등의 발현을 지표로 하여 활막세포 및 인간 이배체 섬유아세포를 검출하거나 분리할 수 있다. 항체는 적절한 형광 등으로 표지된다. 예를 들면, S1-5 단백질 등에 대한 항체를 이용하여 세포 분리(cell sorting) 등으로 S1-5 단백질 등을 발현하는 세포를 분리할 수 있다.
또한 본 명세서에 인용된 모든 선행 기술 문헌은 참조로 하여 본 명세서에 기재하였다.
이하, 실시예로 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 다만, 본 발명은 이러한 실시예들로 한정되는 것은 아니다.
도 1은 S1-5 유전자를 결손되게 만드는 적중(targeting) 벡터의 구조를 보여준다. 마우스 S1-5 유전자 절편의 번역 개시 자리(첫번째 메티오닌으로 번역되는 ATG 코돈; *로 표시)에 lacZ 유전자가 도입되었고, 네오마이신 내성(Neo) 유전자가 파지티브 선별 마커(positive selection marker) 유전자로 도입되었다. 추가적으 로, 디프테리아 독소 A(DT-A) 유전자가 네거티브 마커(negative marker)로 연결되었다. 상동적인 재조합을 일으킨 개체에서는, S1-5 유전자가 결손되고 베타 갈락토시다아제(β-galactosidase)가 대신 발현된다. 이 효소의 활성을 이용하는 LacZ 염색은 S1-5 유전자가 프로모터(promoter)로부터 발현되는 것을 탐지하게 해준다. 또한 이 도 1은 유전자형을 확인하기 위하여 서던 블럿 분석법(Southern blot analysis)에 사용된 프로브(probe)의 위치를 보여준다.
도 2는 S1-5 유전자 돌연변이 마우스들의 유전자형을 분석한 결과를 보여주는 사진이다. (A)는, 마우스 꼬리에서 추출하고, 도 1에서 보인 프로브를 사용하여 서던 블럿 분석을 하기 위해 BamHI으로 처리한 후의 DNA에 대한 결과를 보여준다. (B)는 노던 블럿 분석(Northern blot analysis)의 결과이다.
도 3A는 26개월령된 S1-5 넉아웃 마우스의 표현형을 나타내는 사진이다. S1-5-/-수컷(동물번호: 1101). 척추후만(kyphosis), 탈모, 안면부 피부의 상처, 손톱의 괴사, 흉부 비대, 해부시에 복수, 해부시에 간장에 종양이 있는 사진이다.
도 3B는 26개월령의 S1-5 넉아웃 마우스의 표현형을 나타내는 사진이다. S1-5-/암컷(동물번호: 1097). 척추후만, 지혈이 어렵고, 헤마토크릿(hematocrit) 값이 낮으며, 손톱의 괴사, 안저(ocular fundus)의 혈전, 해부시에 자궁 비대, 해부시에 지방조직 내의 혈전.
도 3C는 26개월령의 S1-5 넉아웃 마우스의 표현형을 나타내는 사진이다. S1-5-/-암컷(동물 번호: 1103). 척추후만.
도 4는 야생형 마우스와 S1-5 넉아웃 마우스에서 골변형된 것을 보여주는 일 련의 X선 사진이다.
도 5는 야생형 마우스와 S1-5 넉아웃 마우스에서 골변형된 것을 보여주는 일련의 X선 사진이다.
도 6은 S1-5 넉아웃 마우스에서 골변형된 것을 보여주는 일련의 X선 사진이다.
도 7에서 (A)는 S1-5 넉아웃 마우스의 척추 만곡 각도를 나타내는 사진이다. (B)는 S1-5 넉아웃 마우스의 척추 만곡의 각도에 기초하여, 각 주령의 그룹에서 척추후만이 발생한 동물의 비율을 정리한 도면으로, 각 주령의 그룹에서 X선사진을 찍어 수행하였고, 척추 만곡 각을 측정하여 각이 95˚ 이하를 척추후만이 발병한 것으로 정의하였다.
도 8은 몇 주 동안 S1-5 넉아웃 마우스의 척추 만곡의 각을 정리한 그래프를 보여준다.
도 9는 S1-5 넉아웃 마우스의 척추의 골밀도( 흉추(10-12), 요추(1-3))를 측정한 결과를 나타내는 사진과 그래프를 보여준다. SB1-855 등은 동물 번호를 나타낸다. 막대 그래프의 숫자는 주령을 나타내며, 괄호안의 숫자는 척추후만의 각을 나타낸다.
도 10은 S1-5 넉아웃 마우스의 척추의 골밀도(흉추(10-12), 요추(1-3))의 골밀도를 측정한 결과이다. 그래프에서 각각의 막대는 각각의 그룹의 평균 값을 나타낸 것이고 막대에 있는 숫자는 "n"을 의미한다.
도 11은 S1-5 넉아웃 마우스의 대퇴골의 골밀도를 측정한 결과를 나타내는 사진과 그래프를 보여준다. SB1-855와 다른 것은 동물 번호를 나타내며, 그 막대 그래프에 있는 숫자는 주령을 나타낸다.
도 12는 S1-5 넉아웃 마우스의 대퇴골의 골밀도를 측정한 결과를 보여준다. 막대에 있는 숫자는 "n"을 나타낸다.
도 13은 S1-5 넉아웃 마우스의 척추(흉추(10-12))의 마이크로 CT 이미지 세트를 보여준다. SB1-855, LB595 등은 동물 번호를 나타낸다.
도 14는 S1-5 넉아웃 마우스에서 pQCT 측정 결과를 나타내는 그래프를 보여준다.
도 15는 S1-5 넉아웃 마우스의 뇨 NTx 값을 나타내는 그래프를 보여준다. 각각에 대하여, 일주일 모아둔 뇨의 시료를 측정하였다.
도 16은 S1-5 넉아웃 마우스의 뇨 NTx 값을 주령에 따라 정리한 그래프를 보여준다.
도 17은 암컷 S1-5 넉아웃 마우스와 야생형 마우스의 대퇴골의 염색된 경조직 표본의 일련의 골조직 사진들이다. SB2-905와 LB574 등은 동물 번호를 나타낸다.
도 18은 도 17에서 보여준 암컷 S1-5 넉아웃 마우스와 야생형 마우스의 대퇴골의 대표적인 예로서 대퇴골의 염색된 경조직 표본의 일련의 골조직 사진이다. SB1-905와 LB574 등은 동물 번호를 나타낸다.
도 19는 S1-5 넉아웃 마우스의 절편에 있는 파골세포를 보여주는 일련의 사진 및 TRAP 양성 세포의 숫자를 보여주는 표이다.
도 20은 S1-5 넉아웃 마우스의 조직 절편에 있는 파골세포에 의해 점유된 면적을 측정한 결과를 나타내는 그래프를 보여준다.
도 21A-C에서 (A)는 실험적인 단계를 보여준다. (B) 와 (C)는 S1-5 넉아웃 마우스로부터 유래한 골수 세포의 파골세포를 형성하는 능력을 측정한 그래프이다. (B)는 TRAP-양성 다핵세포의 숫자를 측정하기 위한 TRAP 염색을 사용한 결과이다. (C)는 TRAP 솔루션 분석의 결과를 나타낸다.
도 21D-E에서 (D)는 TRAP 양성 다핵거대세포에 의해 점유된 지역을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. (E)는 S1-5 넉아웃 마우스로부터 추출한 골수 세포의 파골세포 형성 능력을 보여주는 사진이다.
도 22는 S1-5 넉아웃 마우스의 꼬리를 절개하고, 매 10초마다 새어 나오는 혈액을 흡수한 여과지를 사용한 결과를 보여주는 일련의 사진이다. SB1-727와 LB438 등은 동물 번호를 나타낸다.
도 23은 S1-5 넉아웃 마우스의 헤마토크릿(hematocrit) 값을 보여주는 사진이다. SB1-739와 LB438 등은 동물 번호를 나타낸다.
도 24는 S1-5 넉아웃 마우스의 헤마토크릿(hematocrit) 값을 나타낸다. SB1-739와 LB438 등은 동물 번호를 나타낸다.
도 25는 S1-5 넉아웃 마우스의 꼬리 정맥으로부터 채혈되어 제작된 혈액을 김자염색한(Giemsa-stained) 혈액 표본의 사진을 보여준다. LB438과 LB487 등은 동물 번호를 나타낸다.
도 26은 S1-5-His 단백질을 안정적으로 발현시키는 CHO-K1 세포주(벌 크(bulk))에서 S1-5-His 단백질의 발현을 나타내는 그래프를 보여준다. N은 트랜스펙션이 되지 않은 CHO-K1 세포를 나타내고, P는 S1-5-His 단백질을 일시적으로 발현하는 CHO-K1 세포를 나타낸다.
도 27은 S1-5-His 단백질을 안정적으로 발현하는 클론 CHO-K1 세포주에서 S1-5-His 단백질의 발현을 나타낸 일련의 사진이다. N은 트랜스펙션이 되지 않은 CHO-K1 세포를 나타낸다. P는 S1-5-His 단백질을 일시적으로 발현하는 CHO-K1 세포를 나타낸다.
도 28은 S1-5-His을 안정적으로 발현하는 클론 CHO-K1 세포주에서 S1-5-His 단백질의 분비를 나타낸 사진을 보여준다. N은 트랜스펙션이 되지 않은 CHO-K1 세포를 나타낸다.
도 29는 250 mM 이미다졸(imidazole) 용출분획 중에 포함된 단백질을 10 % SDS-PAGE에 의해 분리 후, 은염색(silver staining, A) 및 항 S1-5 항체를 이용한 웨스턴 블럿(Western blot, B)에 의해 검출한 결과를 나타내는 사진이다.
도 22는 50 mM(A) 및 100 mM(B) 이미다졸 용출 분획 중에 포함된 단백질을 10% SDS-PAGE에 의해 분리한 후, 은염색에 의해 검출한 결과를 나타내는 사진이다.
도 31은 S1-5 트렁케이트(truncate) 단백질의 모식도이다.
도 32A는 S1-5-His 트렁케이트 단백질의 조제 결과를 나타내는 사진이다.
도 32B는 S1-5-FLAG 트렁케이트 단백질의 조제 결과를 나타내는 사진을 보여준다.
도 33은 항 FLAG 항체를 사용해 세포 내에서 정제한 FLAG-S1-5 단백질 (A) 및 항 FLAG 항체를 사용해 배양 상등액으로 정제한 FLAG-S1-5 단백질 (B)를 항 S1-5 항체를 이용하여 웨스턴 블럿(Western blot)에 의해 검출한 결과를 나타내는 사진이다.
도 34는 293F 비 부착성(non adherent) 세포로부터 정제한 S1-5-FLAG 단백질을 찾아내기 위해서, 항 S1-5 항체와 항 FLAG 항체를 이용하여 웨스턴 블럿에 의해 검출한 결과를 나타내는 사진이다.
도 35는 글라이코실펩티다아제 F(glycosylpeptidase F)로 처리한 S1-5-His 단백질을 검출하기 위하여 항 S1-5 항체를 이용하여 웨스턴 블럿에 의해 검출한 결과를 보여주는 일련의 사진이다.
도 36은 대장균에서 정제한 GST-S1-5-His 트렁케이트 단백질과 프리시즌(prescission) 프로테아제로 처리된 GST-S1-5 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블럿에 의해 검출된 결과를 나타내는 사진을 보여준다.
도 37는 대장균으로부터 정제한 MBP-S1-5 단백질을 CBB 염색과 항 S1-5 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 이용하여 검출한 결과를 나타내는 사진을 보여준다.
"1"은 GST-S1-5 단백질을 나타내고, "2"는 MBP-S1-5 단백질을 나타낸다.
도 38은 대장균에서 정제한 프리시즌(prescission) 프로테아제로 처리된 MBP-S1-5 단백질을 검출하기 위해 CBB 염색을 한 결과를 보여주는 사진이다.
도 39에서 (A)는 실험 단계를 보여주며, (B)는 S1-5 넉아웃 마우스로부터 추출된 골수 세포의 파골세포 형성 능력이, CHO-K1 세포에서 추출한 S1-5-His 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 그래프이다. (B)는 TRAP 양성 다핵세포의 수를 도 식화한 것이다.
도 40은 S1-5 넉아웃 마우스로부터 추출된 골수 세포의 파골세포 형성 능력이, CHO-K1 세포에서 추출한 S1-5-His 단백질에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프이다. 이 그래프는 TRAP 양성 다핵거대세포의 수를 보여준다.
도 41은 S1-5 넉아웃 마우스로부터 추출된 골수 세포의 파골세포 형성 능력이 CHO 세포에서 추출한 S1-5-His 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 42A는 CHO 세포에서 추출한 S1-5-His 단백질에 의해, TRAP 양성인 다핵거대세포에 의해 점유되는 면적이 감소됨을 나타내는 그래프이다.
도 42B는 염색된 TRAP 양성인 다핵거대세포의 일련의 사진으로, 그것의 형성은 CHO 세포에서 추출한 S1-5-His 단백질의 농도에 따라 억제된다.
도 43 은 S1-5 넉아웃 마우스에서 추출한 골수 세포의 파골세포 형성 능력이 S1-5-His 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 그래프이다. 이 그래프는 TRAP 양성 다핵세포의 수를 보여준다.
도 44는 S1-5 넉아웃 마우스에서 추출한 골수 세포의 파골세포 형성 능력이 S1-5-His 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 그래프이다. 이 그래프는 TRAP 양성 다핵세포의 수를 보여준다.
도 45는 S1-5 넉아웃 마우스에서 추출한 골수 세포의 파골세포 형성 능력이 S1-5-His 트렁케이트 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 사진이다.
도 46에서 (A)는 실험 단계를 보여주며, (B)는 RAW264.7 세포의 파골세포 형 성 능력이 CHO-K1 세포에서 추출한 S1-5-His 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 그래프이다.
도 47은 RAW264.7 세포의 파골세포 형성 능력이 S1-5-His 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 48은 RAW264.7 세포의 파골세포 형성 능력이 293F 비 부착성 세포로부터 추출한 S1-5-FLAG 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 49는 RAW264.7 세포의 파골세포 형성 능력이 무세포 발현 시스템(cell-free expression system)에서 얻은 S1-5 단백질에 의해 억제되지 않는 것을 보여주는 그래프이다.
도 50은 RAW264.7세포의 파골세포 형성 능력이 GST-S1-5 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 그래프이다.
도 51은 RAW264.7 세포의 파골세포 형성 능력이 GST-S1-5 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 52는 RAW264.7 세포의 파골세포 형성 능력이 GST 단백질에 의해 억제되지 않는 것을 보여주는 그래프이다.
도 53은 RAW264.7 세포의 파골세포 형성 능력이 GST 단백질에 의해 억제되지 않는다는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 54는 RAW264.7 세포의 파골세포 형성 능력이 프리시즌 프로테아제로 처리된 GST-S1-5 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 그래프이다.
도 55는 RAW264.7 세포의 파골세포 형성 능력이 프리시즌 프로테아제로 처리 된 GST-S1-5 단백질에 의해 억제되는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 56은 RAW264.7 세포의 파골세포 형성 능력이 프리시즌 프로테아제로 처리된 GST 단백질에 의해 억제되지 않는 것을 보여주는 사진이다.
도 57은 RAW264.7 세포의 파골세포 형성 능력이 프리시즌 프로테아제로 처리된 GST 단백질에 의해 억제되지 않는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 58은 S1-5 단백질의 첨가로 난소가 제거된(OVX) 랫트의 대퇴골의 골밀도가 회복되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 59는 S1-5 단백질의 첨가로 OVX 랫트의 대퇴골의 골강도가 회복되는 것을나타내는 그래프이다.
도 60은 S1-5 단백질의 첨가로 OVX 랫트의 대퇴골의 골염량이 회복되는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 61에서 (A)는 S1-5 단백질의 첨가로 OVX 랫트의 조직 절편에 있는 파골세포의 수가 억제되는 것을 보여주는 사진이다. (B)도 동일한 것을 보여주는 사진이다.
도 62는 S1-5 단백질의 첨가로 OVX 마우스의 대퇴골의 골밀도가 회복되는 것을 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예로 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 다만, 본 발명은 이러한 실시예들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
S1 -5 유전자의 클로닝 및 적중 벡터 제작
RA 환자 활막세포 유래의 cDNA 발현 라이브러리를 이용하여 시노비올린에 결합하는 인자의 스크리닝을 수행하였다(타케나와 타다오미, 와타나베 토시키 편, 바이오 메뉴얼 UP시리즈 "단백질 분자간 상호작용 실험법", pp.66-67, 요도사; Kaelin, W. G. et al ., Cell 70, 351-364, 1992; Skolnik, E. Y. et al ., Cell 65, 83-90, 1991; Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning, a laboratory manual second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 12. 6-12. 20, 1989). 라이브러리 파지를 대장균(XL1-Blue MRF')에 37 ℃ 에서 20분간 배양하여 감염시키고, 탑(Top) 아가로오스와 혼합한 뒤 플레이트에 스프레딩하였다. 42 ℃에서 3.5 시간 배양한 후, 10 mM IPTG에 침지시킨 뒤 건조된 니트로셀룰로오스 멤브레인을 플레이트에 놓고 추가적으로 37 ℃에서 3.5 시간 배양하였다. 멤브레인을 회수한 뒤, 세척 버퍼［10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.5% Skim milk, 0.1% TritonX-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, protease inhibitor(complete, Boehringer Mannheim coporation)］로 5분간 5번 세척한 뒤, 블로킹 버퍼［10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 5% Skim milk, 0.1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glycerol, protease inhibitor(complete, Boehringer Mannheim coporation)］에 1 시간 침지하였다. 세척 버퍼로 5분간 5번 세척한 뒤, 프로테인키나제 A(proteinkinase A)와 함께 32P 라벨된 GST-시노비올린을 프로브로 첨가하여(약 106 cpm/㎖) 배양하였다. 멤브레인당 수가 약 1 kcpm가 될 때까지 세척 버퍼를 바꾸면서 세척을 반복하여 오토라디오그래피(autoradiography)로 시그널을 검출하였다. 그 결과, 시노비올린에 결합하는 클론을 얻을 수 있었다. 이 cDNA는 그 5'말단 부근의 100 bp 및 3'말단 부근의 100 bp의 염기 서열을 위하여 측정하였다. 얻은 염기 서열 정보를 기본으로 데이타베이스를 검색한 결과, 말단 부분의 100 bp는 S1-5(EFEMP-1, FBNL, 또는 FBLN-3이라고도 불린다)［Lecka-Czernik, B. et al ., Molecular and Cellular Biology , 15, 120-128, 1995; accession number U03877 (cDNA), AAA65590 (protein), Stone, E. M. et al ., Nature Genetics 22, 199-202, 1999; accession number Q12805 (protein)］로 불리는 널리 알려진 유전자와 공통 서열인 것이 분명해졌다. 두개의 유전자 및 그 번역 산물의 크기는 거의 같으므로, 동일한 단백질인 것이 시사되었다. 본 발명에서는 인간 S1-5의 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 각각 서열 번호 1 및 2에 나타낸다.
마우스 S1-5 유전자 절편의 번역 개시 자리(처음으로 메티오닌을 번역하는 ATG 코돈)에 lacZ 유전자를 도입하여 적중 벡터(도 1)를 제작하였다. 마커 유전자로 네오마이신 내성 유전자를 도입하고 또한 디프테리아 독소 A 유전자도 결합시켜 비상동적인 재조합을 일으킨 세포주를 배제할 수 있도록 하였다. 본 발명에서는 마우스 S1-5의 cDNA 서열, 아미노산 서열 및 게놈 서열을 각각 서열 번호 3, 4 및 5에 나타낸다.
실시예 2
S1 -5 넉아웃 마우스의 제작
실시예 1의 적중 벡터를 마우스의 TT-2 세포주에 일렉트로포레이션(Electroporation)으로 도입하여 상동 재조합이 일어난 세포주를 선별하였다. 얻은 세포를 8 세포기 배(embryo)에 주입하여 직접 대리모의 난관에 이식 또는 하루동안 배양해 배반포까지 발생시킨 것을 대리모의 나팔관에 이식하였다. 얻은 헤테로 변이 마우스(F1)끼리 교배시켜, 헤테로 및 호모 변이 마우스를 얻었다. 이렇게 해서 얻은 변이 마우스에서는 원래 S1-5가 발현해야 할 조직에서 S1-5를 대신해서 β-갈락토시다아제 단백질이 발현한다.
유전자형은 서던 블럿으로 확인하였다. 생후 2주령 정도의 마우스 꼬리 말단 3 ㎜정도에서 DNA를 추출해서 수득한 DNA를 제한 효소 BamHI로 제한한 것을 이용하였다. 야생형에서는 2.4 kbp 위치에서, 호모 변이 마우스에서는 5.4 kbp 위치에서, 헤테로 변이 마우스에서는 양쪽 모든 위치에서 밴드(band)가 검출되었다(도 2A). 또한 노던 블럿 분석으로 폐의 S1-5 유전자의 mRNA의 발현을 확인하였더니 해당 유전자의 mRNA의 발현은 확인되지 않았다(도 2B).
실시예 3
S1 -5 넉아웃 동물의 분석
13 ~ 117주령(3 ~ 29개월령)의 S1-5 넉아웃 마우스는 부검 및 X선 사진으로 분석한 결과, 고령 마우스(8개월 또는 그 이상)는 척추후만(kyphosis), 탈모, 안면부의 피부에 상처, 손톱의 괴사, 흉부 비대, 복수, 간장의 종양, 안저(ocular fundus) 및 지방조직 내의 혈전, 비대를 볼 수 있었다(도 3 ~ 6).
실시예 4
S1 -5 넉아웃 마우스에서 척추후만(kyphosis)의 분석
S1-5 넉아웃 마우스의 척추의 만곡을 수치화하기 위하여, X선 사진을 이용하여 만곡하는 각도를 계측하였다. 그 결과, 야생형 마우스에서는 95 °이하의 각도를 나타내는 개체는 적었는데, 이에 비해 S1-5 넉아웃 마우스에서는 95 °이하의 각도를 나타내는 개체가 자주 발견되었다. 여기에서 95 °이하를 후만발병이라고 정의하고 21주령마다 발병율을 정리하였다. 수컷과 비교했을 때 암컷의 발병 빈도가 더욱 높았고, 또한 발병 시기도 빨라 22주령경부터 나타났고 주령에 따라 심각성이 증가하였다(도 7 및 18).
실시예 5
골밀도 측정과 S1 -5의 미세 단층 촬영 분석
S1-5 넉아웃 마우스의 골조직에서 이상이 발견되었기 때문에, 척추(흉추(throracic vertebrae)(10-12), 요추(lunbar vertebrae)(1-3) 와 대퇴골(femora))를 야생형과 S1-5 넉아웃 마우스에서 제거한뒤 70% 에탄올에 고정시켰 다. 그 후 골밀도를 측정하였다. 골밀도는 초당 10 mm의 속도로 1mm 두께의 조각을 조사하기 위하여 DCS-600EX-ⅢR(Aloka)를 이용하여 얻은 값을 평균하여 계산하였다.
그 결과로, 척추(흉추(10-12)와 요추(1-3))의 골밀도가 수컷과 암컷 S1-5 넉아웃 마우스 모두에서 감소됨이 밝혀졌다. 골밀도는 특정 부분에서 측정되었는데, 그 결과로 수컷 S1-5 넉아웃 마우스의 흉추(10-12)와 암컷 S1-5 넉아웃 마우스의 요추에서 특별한 감소가 일어남을 보여준다(도 9 및 10)
골밀도는 S1-5 넉아웃 마우스의 암컷과 수컷의 대퇴골에서는 모두 감소가 됨이 관찰되었다. 또한 골밀도는 특정부위에서도 측정되었는데, 수컷 S1-5 넉아웃 마우스에서는 대퇴골의 골간(diaphysis)의 중간 부분에서 감소가 보였고, 암컷 S1-5 넉아웃 마우스에서는 대퇴골의 모든 부위에서 감소되는 것이 보여졌다.
S1-5 넉아웃 마우스와 야생형 마우스의 미세 CT 영상을 촬영하였고, 흉추의 3차원 미세 CT 영상도 촬영하여, 그러한 영상에서 야생형 마우스의 가운데 표면은 매끄러운데 반해, 넉아웃 마우스에서는 눈에 현저하게 평평하지 않음이 나타났다.
실시예 6
pQCT 에 의한 S1 -5 넉아웃 마우스의 분석
또한, pQCT(peripheral quantitative Computed Tomography)를 측정하여 상세한 분석을 수행하였다. 그 결과, S1-5 넉아웃 마우스는 골염량과 골밀도의 저하가 인정되었다(도 14). 이 현상은 특히 암컷 개체에서 현저했다. 또한 스트레 스/긴장 지표(stress/strain index(SSI))는 야생형 마우스에 비해 S1-5 넉아웃 마우스에서 현저하게 감소하고 있어서 골강도가 저하되고 있는 것이 분명해졌다. 강도가 저하되고 있는 것이 분명해졌다.
실시예 7
S1 -5 넉아웃 마우스에서 뇨( urine ) NTx 검사
뇨나 혈청에 있는 N 텔로펩타이드(NTx)와 교차 연결된 타입I콜라겐(collagen)은 골밀도와 부정적 상관관계가 있으며, 증가된 골 흡수를 반영한
다고 알려져 있다(Taguchi Y et al., Calcif. Tissue Int. 62; 395-399, 1998). 그러므로, 뇨 NTx는 S1-5 넉아웃 마우스에서 감소된 골밀도가 증가된 골흡수 때문인지 아닌지를 조사하기 위해 측정된다. 그 결과로 43주령 이상된 암컷 S1-5 넉아웃 마우스에서 뇨 NTx 값이 높게 나타나서, S1-5 넉아웃 마우스에서 골흡수가 증가함을 나타낸다(도 15 및 16).
실시예 8
S1 -5 넉아웃 마우스의 대퇴골의 조직학적 분석( Histological analysis )
S1-5 넉아웃 마우스와 야생형 마우스의 대퇴부를 제거하고, 골 주변의 연조직(soft tissue)을 제거한 후 70% 에탄올로 고정시킨다. 조직 표본과 염색된 경조직 표본을 준비하고, 뼈 조직을 조사한다. 그 결과, S1-5 넉아웃 마우스에서 피질골(cortical bone)의 해면골화가 관찰되었다(도 17 및 18). 부갑상선기능항진 증(hyperparathyroidism)은, 피질골의 해면골화를 야기하는 혈중 PTH 수치를 증가시키고 높은 골대사 회전율을 초래한다고 알려져 있다. 피질골의 해면골화는 또한 증가된 골대사 회전율과 무질서한 리모델링으로 특징지어지는 골 파젯 병에서도 관찰된다.
실시예 9
TRAP 염색에 의한 S1 -5 넉아웃 마우스의 분석
골조직 표본은 조직안에 있는 파골세포의 수를 확인하기 위하여 TRAP 염색을 하였다. 또한 같은 배율로 촬영한 각 웰(well) 화상을 컴퓨터로 캡처하여, 이미지(Image)J(NIH에 의한 반포된 것)로 파골세포에 해당하는 부분을 선으로 둘러싸고 그 면적을 픽셀로 산출하였다. 그 결과, S1-5 넉아웃 마우스는 파골세포의 수가 증가하였고(도 19), 그 크기도 커지고 있었다(도 20).
실시예 10
S1 -5 넉아웃 마우스로부터 유래된 골수 세포에서의 파골세포 형성 능력의 분석
S1-5 넉아웃 마우스로부터 유래된 골수세포를 이용하여 시험관내에서의 파골세포 형성능력의 분석을 수행하였다. 골수세포 1×105개를 96 웰 플레이트에 이식해서 M-CSF(macrophage colony stimulating facter)를 최종 농도 50 ng/㎖가 되도록 첨가하고, 2일 후에 RANKL(Receptor Activator of NF-κB Ligand)을 최종 농도 10, 30 및 100 ng/㎖가 되도록 첨가하였다. 7일 후에 세포를 고정하고 TRAP 염색을 하여 파골세포 형성능력을 관찰하였다(도 21A). 시험은 n=6으로 실시하였다. 그 결과, RANKL 최종 농도 30 및 100 ng/㎖ 존재하에서 파골세포 형성 수가 유의하게 상승하고 있는 것이 확인되었다(도 21B). S1-5 넉아웃 마우스에서는 TRAP(tartrate resistant acid phosphatas) 솔루션 분석에 따른 TRAP 활성치가 상승하고 있었다(도 21C). 또한 RANKL을 최종 농도 100 ng/㎖로 첨가한 경우에 TRAP 염색 결과, 야생형에 비교하여 S1-5 넉아웃 마우스에서는 TRAP 양성 다핵거대세포의 크기가 더욱 커지고 있었다(도 21D 및 E). 이러한 결과는 S1-5가 파골세포의 분화 억제에 관여하고 있는 것이 시사한다.
실시예 11
S1 -5 넉아웃 마우스의 지혈 분석
8주령부터 111주령(26개월)된 S1-5 넉아웃 마우스의 꼬리를 자른뒤, 지혈 정도를 검사하기 위해, 흘러나오는 혈액을 흡수하고자 매 초마다 필터 페이퍼(filter paper)를 사용하였다. 그 결과로 S1-5 넉아웃 마우스에서 지혈(hemostasis)을 하기가 어려움이 나타났다(도 22).
실시예 12
S1 -5 넉아웃 마우스에서 헤마토크릿 ( Hematocrit ) 값의 분석
헤마토크릿 측정(Capillay tubes for microhematocrits, 75mm length, 헤파린 처리(heparinized), Drummond Scientific Co.)을 위해, 모세관 한쪽 끝을 혈액에 놓고, 혈액을 모세관 현상으로 모세관 전체 길이의 3분의 2까지 끌어올리기 위해 적당한 각도를 유지한다. 혈액이 들어온 후 한 쪽 끝에 퍼티(putty)를 넣어서 막는다. 한쪽끝이 봉해진 모세관은 11,000rpm에서 5분간 원심분리기에서 돌린 후, 측정판을 이용해서 퍼센트(%)를 읽는다. 그 결과로 S1-5 넉아웃 마우스는 낮은 헤마토크랫 값을 갖는 경향이 있고, 빈혈 증상이 있는 것으로 나타났다(도 23 및 24).
실시예 13
S1 -5 넉아웃 마우스의 말초 혈액의 김자염색 ( Giemsa - staing )
15주령에서 110주령된 S1-5 넉아웃 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액을 모은다. 이 혈액을 PBS로 1000배 묽힌 후, 사이토스핀(cytospin)에서 돌린 후(800rpm, 5분), 말초 혈액을 김자 용액을 사용하여 염색을 한다. 그 결과로 S1-5 넉아웃 마우스에서 빈혈증이 나타났고, 특히, 적혈구(erythrocyte)수의 감소, 비 정상적인 적혈구(원형 적혈구)와 염색에서의 차이 등이 관찰되었다(도 25).
실시예 14
S1 -5- His 단백질을 안정하게 발현하는 CHO - K1 세포 제작
S1-5-His 단백질을 대량 정제하기 위하여 S1-5-His 단백질을 안정하게 발현 하는 CHO-K1 세포를 제작하였다. CHO-K1 세포(10 ㎝ dish × 1)에 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 이용해 20 ㎍의 pCAGGS-S1-5-His 및 0.7 ㎍ pcDNA3을 동시에 트랜스펙션하고 24시간 후에 10배 희석하여 10 ㎝ 접시(dish) 6개에 이식하였다. 그 다음으로, 24시간 후에 800 ㎍/㎖의 제네티신(Geneticin)에서 선별을 개시하고 11일 후에 콜로니를 픽업하였다. 10 ㎝ 접시(dish) 1개에 16개 콜로니(합계 96 클론)를 96-웰 플레이트에 이식하여 24-웰 플레이트, 6-웰 플레이트 크기로 키웠다. 동시에 벌크(bulk) 6 종류를 10 ㎝ 접시에 각각 이식하여 융합(confluent)에 이른 벌크 6 종류를 무혈청 배지로 교환한 후, 24 시간 후에, 세포 추출한 것과 배양 상등액에서 S1-5-His의 발현을 체크하기 위하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. S1-5 펩타이드(42-56: 15-amino acid CKDIDECDIVPDACK: 밑줄친 부분은 예상되는 T 세포의 에피토프(epitope)이다.)를 면역원으로 사용하여 토끼를 면역반응시켜서 항원을 생산한 후, 그것이 S1-5 단백질을 인지하는지 확인하기 위해 웨스턴 블럿 방법을 사용하였다. 한편, 6-웰 플레이트에서 융합에 이른 클론화된 세포도 이와 같이 S1-5-His 단백질의 발현 체크를 실시하였다. 6-웰 플레이트의 1 웰은 무혈청 배지 1 ㎖를 이용해서 그 TCA 침전물 반의 양을 발현 체크에 이용하였다. 그 결과, 6 종류의 벌크는 모두, S1-5-His의 발현이 세포 추출액 및 배양 상등액에서 확인되었고, 특히 벌크 No. 1, 2 및 3에서 강한 발현이 인정되었다. 더 나아가, CHO-K1 세포 내재성의 S1-5 단백질이 배양 상등액 중에 분비되고 있는 것이 인정되었다(도 26). 한편, 픽업 한 96 클론 중, 증식이 인정된 90 클론에 대하여 배양 상등액에 있는 S1-5-His 단백질의 발현을 체크하였다(도 27). 이 중, 클론 No. 1, 6, 10, 11, 13, 25, 38, 43, 44, 61 및 96을 다시 S1-5-His 단백질의 발현을 체크하였다(도 28). 그 결과, 클론 No. 1, 6, 44 및 96에서 S1-5-His 단백질의 발현이 벌크 No. 1보다 강하게 검출되었다. 최종적으로 클론 No. 96을 선별하여 이후의 실험에 이용하였다.
실시예 15
S1 -5- His 단백질의 정상 발현 CHO - K1 세포 배양 상등액에서 S1 -5- His 단백질의 정제　　
S1-5-His 단백질의 정상 발현 CHO-K1 세포 배양 상등액 60 ㎖를 필터 여과한 후, 센트리플러스(Centriplus)로 약 10 ㎖를 농축하였다. 농축한 시료를 정제용 버퍼[20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 500 mM NaCl, 10% glycerol]로 투석했다. 투석 후의 시료를 1 ㎖의 히스트랩(HisTrap) 컬럼에 첨가하여 컬럼을 10 ㎖의 정제용 버퍼로 세척하였다. 흡착된 단백질을 10 mM 및 250 mM 이미다졸(imidazole)을 포함한 정제용 버퍼로 용출하였다(1 ㎖/fr.). 250 mM 이미다졸 용출분획 중에 포함되어 있는 단백질을 10 % SDS-PAGE로 분리한 뒤, 은염색(silver stsining, 도 29A) 또는 항 S1-5 항체를 이용한 웨스턴 블럿에 의해 검출하였다(도 29B). 그 결과, 항 S1-5 항체에 의해 1개의 밴드가 검출되었다.
그리고 S1-5-His 단백질을 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포 배양 상등액 280 ㎖를 필터 여과(0. 22 ㎛)한 뒤, 1 ㎖의 HisTrap 컬럼에 첨가했다. 컬럼을 10 ㎖의 정제용 완충액(20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 500 mM NaCl, 10% glycerol) 및 10 mM 이미다졸을 포함한 정제용 완충액으로 세척하고 흡착된 단백질을 50 mM 및 100 mM 이미다졸을 포함한 정제용 완충액으로 용출하였다(1 ㎖/fraction.). 용출분획을 회수하여(약 4 ㎖) 1 L의 PBS으로 하룻밤 투석한 뒤, 시료를 필터 여과(0.22 ㎛)하였다. 50 mM 및 100 mM 이미다졸 용출분획 중에 포함되어 있는 단백질을 10 % SDS-PAGE로 분리한 뒤, 은염색으로 검출하였다(도 30). 그 결과, 50 mM 이미다졸과 비교하여 100 mM　이미다졸을 포함한 정제용 완충액에서의 용출분획은 여분의 밴드가 소실되어 더욱 정제된 S1-5 단백질을 얻을 수 있었다.
실시예 16
CHO - K1 세포로부터 S1 -5- His 트렁크케이트 ( truncate ) 단백질 제조
S1-5의 서열 중에는 6개의 EGF-유사 도메인이 있다. S1-5의 기능을 조사하기 위하여, EGF-유사 도메인을 C 말단쪽에서부터 1개씩 삭제하여 6개의 컨스트럭트를 제작하였다(도 31).
CHO-K1 세포에 FuGENE6(Roche)를 이용해서 S1-5-E1-His/pME18S, S1-5-E1-2-His/pME18S, S1-5-E1-3-His/pME18S, S1-5-E1-4-His/pME18S, S1-5-E1-5-His/pME18S, S1-5-E1-6-His/pME18S 및 S1-5 full-His/pME18S를 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션한 지 8 시간 후, 배지를 무혈청 배지로 교환해서 24 시간 배양하였다. 배양 상등액을 회수하여 Ni-아가로오스를 첨가하고 4 ℃에서 8 시간 회전시켰다. Ni-아가로오스를 세척 버퍼[20 mM Tris(pH 7.5), 500 mM NaCl, 10% Glycerol, 10 mM Imidazole]로 3회 세척하고, 그 뒤, 용출버퍼[20 mM Tris(pH 7.5), 500 mM NaCl, 10% Glycerol, 250 mM Imidazole]를 이용해 S1-5 단백질을 용출하였다. 용출분획은 PBS 버퍼 교환으로 투석하였고, 웨스턴 블럿으로 S1-5 단백질 농도를 산출하였다(도 32A).
S1-5-FLAG 트렁케이트(truncated) 단백질과 S1-5 FLAG 단백질을 유사하게 생산하였고(도 32B), 그것의 각각의 발현 벡터를 CHO-K1 세포(6 웰 플레이트)로 트랜스펙션시켰다. 4시간 후에, 배양액(media)은 무혈청배양액(serum free media)(1 mL)으로 교체되었고, 24시간 배양후에, 배양 상등액(900㎕)을 TCA 침전에 넣었다. 그후에, TCA 침전물과 세포 추출 용액은 항 FLAG 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하기 위하여 이용되었다. 그 결과는 모든 트렁케이트 단백질의 발현 정도는 S1-5 전장 단백질의 발현 수치보다 높았으며, S1-5(E1-3)-FLAG 단백질의 발현 정도는 특히 높았다.
실시예 17
HEK293 세포로부터 얻은 FLAG - S1 -5 트렁케이트 ( truncated ) 단백질의 정제
HEK293 세포(다이니혼 제약)에서 발현되는 FLAG-S1-5 트렁케이트 단백질을 정제하였다. HEK293 세포를 80 ~ 90 %가 융합되도록 150 ㎜ 접시(dish, IWAKI)에 이식하였다. 다음날, FuGENE6를 이용해 트랜스펙션을 하였다. 조작 방법은 첨부 프로토콜에 따랐다. 그리고 2일 후, 세포를 회수해서 용해 버퍼[50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF]를 300 μL 첨가해 얼음 위에서 20분간 배양하였다. 아가로오스 비즈(agarose beads)에 결합시킨 항 FLAG 항체(SIGMA)를 100 μL 첨가하여 4 ℃에서 회전 교반하면서 하룻밤 배양하였다. 세척 버퍼[50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF]로 비즈를 5회 세척한 뒤에, 100 ㎍/㎖ FLAG 펩티드(SIGMA) 100μL를 더해 4 ℃에서 회전교반하면서 2 시간 배양하였다. 원심 분리로 상등액을 회수하고 이들 각각의 10 μL에 SDS-PAGE를 실시하였으며 웨스턴 블럿으로 세포 내에서 정제한 FLAG-S1-5 트렁케이트의 동정(도 33 A) 및 CBB 염색으로 농도를 산출하였다.
한편, 트랜스펙션 48 시간 후에 배양 상등액을 회수하여 아가로오스 비즈에 결합시킨 항 FLAG 항체 100 μl를 첨가하여 4 ℃에서 회전교반하면서 하룻밤 배양하였다. 그 후 상기와 같은 조작을 하여 배양 상등액 중에서 정제된 FLAG-S1-5 단백질을 동정해 농도를 산출하였다(도 33 B). 그 결과, 세포 내 및 배양 상등액에서 S1-5 단백질이 정제된 것을 볼 수 있었다(도 33AB).
실시예 18
293F 비 부착성 세포로부터 얻은 S1 -5- FLAG 단백질과 프리시즌 프로테아제로 처리된 S1 -5- FLAG 단백질의 정제
293F 비 부착성 세포에서 강제로 발현시켜, S1-5-FLAG 단백질을 정제하였다.첫번째로, 293F 세포의 세포질에서 발현되는 S1-5-FLAG 단백질을 다음과 같은 단계로 정제하였다: pcDNA3-S1-5-prescission-FLAG plasmid를 트랜스펙트한 293F 세포를 90mL의 양으로 부유 배양시키고, 48시간후에 세포를 수집하였다. Lysis buffer(50mM Tris-HCl(pH 7.4), 420 mM NaCl, 1mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0.5mM DTT, 1mM PMSF, 0.5% NP-40)를 첨가하고, 이것을 20분동안 얼음에서 배양하였다. 이때, 아가로오즈 비즈(agarose beads)에 붙은 항 FLAG 항체(SIGMA) 100㎕를 첨가해준다. 이것을 4 ℃에서 회전시키며 하룻밤동안 배양시킨다. 이 비즈를 washing buffer(50mM Tris-HCL (pH 7.4),150mM NaCl, 0.5mM DTT, 1mM PMSF, 0.5%NP-40)로 5회 세척한뒤, 미니 컬럼에다 옮기고, 200㎍/mL FLAG 펩티드(SIGMA) 100㎕으로 3회 용출한다. 용출액을 프리시즌 버퍼(prescission buffer)(50mM Tris-HCl(pH7.0),150mM NaCl,1mM EDTA, 1mM DTT)로 하룻밤동안 투석하였다. 프리시즌 버퍼를 20U를 첨가한뒤, 반응이 4℃에서 5시간 동안 일어나게 하였다. 글루타치온 세파로오즈 비즈(glutathione sepharose beads)를 50㎕ 첨가하고, 그 혼합용액을 4℃에서 회전시키면서 1시간동안 배양하였다. 상등액을 모은 뒤, 이것을 SDS-PAGE에 정제한 각 단계의 표본과 함께 넣어서, 웨스턴 블럿으로 그 단백질을 확인하였다. 그 다음으로, 트랜스펙트한 293F 세포의 배양 상등액으로부터 얻은 S1-5-FLAG 단백질을 정제하였다. 이 배양 상등액을 트랜스펙션 후 48시간 후에 회수하여, 아가로오즈 비즈에 부착된 항 FLAG 항체 100 ㎕를 첨가하고, 이것을 4℃에서 회전시키면서 하룻밤동안 배양하였다. 그 후에, 정제는 위에서 설명한 동일한 과정으로 수행한 뒤, SDS-PAGE와 웨스턴 블럿을 수행하였다. 그 결과는 도 34에서 보여주고 있다. 세포질에 있는 S1-5-FLAG 단백질을 아가로오즈 비즈에 붙은 항 FLAG 항체를 사용하여 정제하였다. 항 S1-5 항체를 사용한 때와는 달리, 항 FLAG 항체를 사용하여 마지막 정제를 한 경우에는 S1-5가 거의 발견되지 않았는데, 이것은 프리시즌 프로테아제(prescission protease) 절단이 일어난 것을 시사한다. 또한, 정제의 어느 단계에서의 배양 상등액에서도 웨스턴 블럿으로 밴드를 확인하지 못하였다. 이러한 결과는 이 방법은 세포질로부터 FLAG 태그없이 S1-5 단백질을 정제할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 19
S1 -5 단백질의 당화 ( glycosylation ) 조사
S1-5 단백질이 실제로 당화가 되었는지 여부를 조사하였다. S1-5-His 단백질을 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포의 배양 상등액으로부터 정제한 S1-5-His 단백질, CHO-K1 세포의 세포 추출물과 HT1080 세포의 배양 상등액으로부터 면역침강 시킨 S1-5 단백질에 대해 글라이코실펩티다아제(glycosylpeptidase) F 처리(37℃, 17시간)를 하였고, 항 S1-5 항체를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다(도 35).결과로서, 글라이코실펩티다아제(glycosylpeptidase) F 처리는 순수한 S1-5-His 단백질(20ng)의 밴드 이동을 야기함이 밝혀졌다. 유사하게, S1-5 단백질의 밴드 이동은 HT1080 세포의 배양 상등액으로부터 면역침강시킨 S1-5 단백질에서도 또한 관찰되었다(도 35 오른쪽 도면). 이 결과는 S1-5가 N결합당쇄(N-linked glycosylation)을 겪는다는 것을 암시한다. 사실, S1-5 단백질은 한쪽 부분에 공통된 서열(NX(S/T) X≠P)을 공유한다. 낮은 농도에서 관찰하기 어려운 넓은 밴드는 단백질양을 증가(120ng)시켜 조사하였는데, 이 때 전체적인 밴드 이동이 관찰되었다. 그 러나, 넓은 밴드부분은 사라지지 않았는데, 이것은 S1-5 단백질이 또한 O-링크드-글리코실레이션을 겪는 것을 나타낸다(도 35 가운데 도면).
실시예 20
대장균(E.coli)에서 얻은 S1 -5- His 트렁케이트 단백질의 정제
GST 융합 S1-5-His 단백질을 발현하는 pGEX 벡터를 준비하였고, 대장균을 이 벡터를 이용하여 형질변화 시킨후 콜로니를 분리하였다. 분리한 콜로니를 10 ㎖의 LB-암피실린 배지(50 ㎎/㎖ 암피실린)에 배양하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다[전배양(pre-culture)]. 전배양한 대장균을 200 ㎖의 LB-암피실린 배지에 첨가해 37℃에서 2 시간 반 배양 후[본배양(main culture)], 최종 농도 0.5 mM IPTG를 첨가하고 다시 30℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 원심 분리로 균체를 회수하여 BC500[20 mM Tris-HCl(pH 8), 0.5 mM EDTA, 500 mM KCl, 20% glycerol, 1% NP-40, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 1 ㎍/㎖ of aprotinin, pepstatin, and leupeptin] 5 ㎖ 및 100 ㎎/㎖ 리소자임을 100 μL 첨가하여 현탁하고, 초음파(sonication)로 균을 파쇄했다. 원심 분리로 상등액을 회수하고 아가로오즈 비즈에 결합된 글루타치온 S 트랜스퍼라제 (glutathione S Transferase conjugated agarose beads)(GST)(Amersham Pharmacia) GST 레진을 500 μL 첨가하여 4 ℃에서 회전시키면서 하룻밤 배양하였다. GSH 레진을 BC500에서 5회 세척한 뒤, 마이크로 컬럼(Biorad)에 적용하고 프리시즌 프로테아제(PreScission protease) 용액(10U prescission protease, 50 mM Tris-HCl(pH 7.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 500 μL를 더해 뚜껑을 닫고 4℃에서 24 시간 배양하였다. 컬럼에서 용출한 용액을 절단된 S1-5-His 단백질 용액으로 회수하여 웨스턴 블럿에서 동정(도 26) 및 CBB 염색에서 농도를 측정하였다. 그 결과, 대장균에서 S1-5 단백질이 정제된 것을 볼 수 있었다(도 36).
실시예 21
대장균으로 추출한 MBP - S1 -5 단백질과 프리시즌 프로테아제( prescission protease)처리한 MBP - S1 -5 단백질의 정제
MBP-S1-5 단백질의 정제는 MBP-fused-S1-5 단백질을 빌현하는 pGEX 벡터를 제외하고, 실시예 20과 유사한 추출방법에 의해 수행하였다. 그 결과로 가장 효율적인 용출은 10mM 말토오즈를 사용했을 때 얻어진다. MBP-S1-5는 450㎍/500mL 배양에서 GST-S1-5 보다 효율적으로 얻어진다(도 37). 또한,용액에 프리시즌 프로테아제 처리가, GST-S1-5에 프리시즌 프로테아제 처리를 한 것처럼, MBP를 자른다는 것이 확인되었다(도 38).
실시예 22
S1 -5 넉아웃 마우스로부터 유래된 골수세포에서의 CHO - K1 세포 배양 상등액 유래의 S1 -5 단백질이 파골세포 형성능력에 미치는 영향
S1-5 넉아웃 마우스로부터 유래된 골수세포 및 실시예 15의 정제한 단백질을 이용하여 정제한 S1-5 단백질이 시험관내에서의 파골세포 형성능력에 미치는 영향 을 조사하였다. 골수세포 1×105개를 96 웰 플레이트에 이식하고, M-CSF를 최종 농도 50 ng/㎖가 되도록 첨가해, 2일 후에 RANKL을 최종 농도 100 ng/㎖가 되도록 첨가했다. S1-5는 PBS로 희석하여 배양액의 최종 농도가 0, 10, 30 및 100 ng/㎖가 되도록 M-CSF 첨가시부터 계속적으로 첨가하였다. 5일 후에 세포를 고정하고 TRAP 염색을 하여 S1-5-His 단백질이 파골세포 형성능력에 미치는 영향을 조사하였다. 시험은 n=5로 실시하였다. 그 결과, S1-5-His 단백질의 농도 의존적으로 TRAP 양성 다핵세포 수에 의미 있는 억제가 확인되었다(도 39 및 41). 또한 TRAP 양성 다핵거대세포 형성 수도 S1-5-His 단백질의 농도 의존적으로 억제되고 있었다(도 40 및 41). 또한 S1-5-His protein을 최종 농도 0, 10, 30, 100, 200 및 500 ng/㎖로 첨가하는 것 외에는 상기에서 설명한 것과 같이 하였다. TRAP 양성 다핵거대세포가 차지하는 면적을 측정하였는데, 농도 의존적으로 TRAP 양성 다핵거대세포의 크기가 작아지는 것을 보여주었다(도 42A, 42B 및 42C).
실시예 23
S1 -5 넉아웃 마우스로부터 유래된 골수세포에서 S1 -5- His 트렁케이트 단백질이 파골세포 형성능력에 미치는 영향
S1-5 넉아웃 마우스로부터 유래된 골수세포 및 실시예 16에서 정제한 단백질을 이용하여, 정제한 S1-5-E1-2 단백질이 시험관내에서의 파골세포 형성능력에 미치는 영향을 조사하였다. 방법은 S1-5-E1-2를 최종 농도 0 및 10 ng/㎖가 되도록 첨가하는 것 외에는 실시예 22와 같다. 그 결과, S1-5 트렁케이트에 의해 TRAP 양성 다핵세포 수가 억제되는 것이 확인되었다(도 43 및 45). 또한 TRAP 양성 다핵거대세포 형성 수도 더욱 현저하게 억제되는 것이 확인되었다(도 44 및 45). S1-5-E1-2의 아미노산 서열을 서열 번호 6에 나타낸다.
실시예 24
RAW264 .7 세포에서 CHO - K1 세포 배양 상등액에서 유래된 S1 -5- His 단백질의 파골세포 형성능력에 미치는 영향
RAW264.7 세포[마우스의 대식 세포(macrophage)로부터 유래된 세포] 및 실시 15에서 정제한 단백질을 사용하여, CHO-K1 세포 배양 상등액에서 유래된 정제된 S1-5-His 단백질이 시험관내에서 파골세포 형성능력에 미치는 영향을 조사하였다. RAW264.7 세포 2.5×105 개를 96 웰 플레이트에 이식하여 RANKL을 최종 농도 100 ng/㎖가 되도록 첨가하였다. S1-5-His 단백질은 PBS로 희석하여 배양액에 최종 농도 0, 10, 30, 100, 200 및 500 ng/㎖가 되도록 계속적으로 첨가하였다. 3일 후에 세포를 고정하고 TRAP 염색을 하여 S1-5-His 단백질이 파골세포 형성능력에 미치는 영향을 조사하였다. 시험은 n=5로 실시하였다. 그 결과, S1-5-His 단백질의 농도 의존적으로 TRAP 양성 다핵세포 수가 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 46 및 47).
실시예 25
RAW264 .7 세포내에서 , 293F 비 부착성 세포에서 유래한 S1 -5- FLAG 단백질이 파골세포 형성 능력에 미치는 영향
RAW264.7 세포와 실시예 18에서 정제한 단백질을 이용하여, 파골세포 형성 능력에 미치는 정제된 S1-5-FLAG 단백질의 효과를 조사하였다. 이 방법은 293F 비 부착성 세포에서 유래한 S1-5-FLAG 단백질이라는 점, 무세포 발현계(Abnova, Cat. No. H00002202-P01)에서 생산된 S1-5 단백질을 0,10,40,100 과 200ng/mL의 마지막 농도에서 넣어주는 점 이외는 실시예 24와 동일하다. 그 결과는 실시예 18에서 정제한 S1-5-FLAG 단백질이 첨가되었을 때, 파골세포 형성 능력이 S1-5-FLAG 단백질의 농도에 의존적으로 억제되는 것을 보여주었다(도 48). 그러나, 이러한 억제 효과는 무세포발현계에서 얻어진 S1-5 단백질을 첨가했을 때는 관찰되지 않았다(도 49).
실시예 26
RAW264 .7 세포에서, 대장균에서 유래한 GST - S1 -5 단백질과 프로시즌 프로테아제 처리를 한 GST - S1 -5 단백질이 파골세포 형성 능력에 미치는 영향의 조사
정제된 GST-S1-5 단백질과 프로시즌 프로테아제가 처리된 GST-S1-5 단백질이 파골세포 형성 능력에 미치는 효과를 RAW264.7 세포와 실시예 20에서 정제한 단백질을 이용하여 조사였다. 이 방법은 대장균에서 유래한 GST-S1-5 단백질과 0, 1, 3, 10, 30, 100 및 200ng/mL의 마지막 농도에서 GST 단백질이 첨가되는 것 및 0, 1, 3, 10 및 30 ng/mL의 마지막 농도에서 프로시즌 프로테아제 처리된 GST-S1-5 단백질과 프로시즌 처리된 GST 단백질을 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 24와 동일하다. 그 결과로서, GST-S1-5 단백질과 프로시즌 프로테아제가 처리된 GST-S1-5 단백질이 첨가되었을때, 억제 효과가 농도 의존적임이 밝혀졌다(도 50, 51, 54 및 55). 그러나, GST 단백질과 프로시즌 처리된 GST 단백질은 파골세포 형성 능력에 영향을 주지 못하였다(도 52, 53, 56 및 57). GST 태그가 프로시즌 프로테아제 처리에 의해 제거된 S1-5 단백질은, 태그 제거의 결과로서, 활성이 유지될 뿐만 아니라 활성이 증가되었다.
실시예 27
골다공증 모델 랫트에서 골밀도를 낮추는가에 대한 S1 -5 단백질의 효과 검사
표준 방법에 따라, 7주령된 위스털(Wister) 랫트에서 난소를 제거하고(OVX), 실시예 20에서 정제한 단백질을 피하로 투여하였다. 난소 제거 후 매일 1.0mg/kg의 양으로 매주 5번씩 단백질을 투여하였다. 이러한 시술후 4주가 지난뒤에 쥐를 살해한 후, 왼쪽과 오른쪽의 대퇴골을 제거하고 70% 에탄올에서 고정시키고, 골밀도를 측정하였다. 대퇴골의 원위(distal) 4분의 1지점에서 1mm 두께의 슬라이스를 만들고, 먼쪽부터 가까운 쪽으로 초당 10mm/s의 속도로 20번 스캔을 하는 방식으로 DCS-600EX-IIIR Model(Aloka)에서 골밀도를 측정하였다. 샴(sham) 랫트와 비교해볼때, GST와 프로시즌 프로테아제가 처리된 OVX 랫트는 골밀도가 약 10%정도 감소된것을 볼 수 있다. 골밀도가 10%이상 감소되면, OVX 모델이 만들어졌다고 판단하였 다(Modder, UI. et al., Endcrinology 145 : 913-921, 2004). 반대로 프로시즌 프로테아제가 처리된 GST-S1-5 단백질을 넣은 OVX 랫트는 골밀도가 증가함을 보였다. 이 결과는 S1-5 단백질이 골다공증을 개선시킨다는 것을 나타낸다(도 58).
실시예 28
골다공증 모델 랫트에서 골밀도의 감소에 대한 S1 -5 단백질의 효과 검사
실시예 27에서 조사한 랫트의 대퇴골에서 골강도를 분석하였다. 지점간 거리는 13mm, 헤드 스피드(head speed)는 10mm/min이고, 500N 로드셀(load cell) 로 MZ-500S(Maruto)에서 3접점 굽힘(three point bending test)를 실시하였다.
그 결과 GST 단백질과 프리시즌 프로테아제를 처리한 OVX 랫트는 샴(sham) f랫트보다 골강도가 감소함이 나타났으나, 실시예 20에서 정제한 단백질을 투여한 경우에는 골강도가 증가되었다(도 59).
실시예 29
미세 단층 촬영( micro CT )을 이용하여 골다공증 모델 랫트에서 S1 -5 단백질의 효과 분석
실시예 27에서 조사한 랫트에서 대퇴골을 제거하고, 뼈 주변의 연조직을 제거한 후 70% 에탄올에서 고정하였다. 성장판연골(growth plate cartilage)로부터 골간을 10% 아래 위치에서 미세 단층 촬영을 하였다. 샴 랫트와 비교하면, GST 단백질과 프리시즌 프로테아제를 넣은 OVX 랫트에서 해면골(cancellous bone)의 감소 를 보였다. 그러나, 실시예 20에서 정제한 단백질을 처리한 OVX 랫트에서는 해면골의 감소가 개선되었다(도 60). 이 이미지는 S1-5 단백질이 골다공증을 억제하는 효과가 있음을 입증하고 있음을 보여준다.
실시예 30
골다공증 모델 랫트에서 S1 -5 단백질의 효과에 대한 조직학적 분석
실시예 27에서 조사한 랫트로부터 경골을 제거하고, 뼈 주위로부터 연조직을 제거한 후 70% 에탄올에서 고정하였다. 그 후, 골조직 표본을 TRAP 염색하였고, 조직에 있는 파골세포의 수를 측정하였다. 그 결과, 샴 랫트에 비해, GST 단백질과 프로시즌 프로테아제를 넣은 OVX 랫트는 경우에는 경골(Tibia)의 근위(proximal) 골간단(metaphysis)의 파골세포의 수의 증가가 나타났으나, 실시예 20에서 정제한 단백질을 넣은 OVX에서는 파골세포의 수의 증가는 억제되었다(도 61).
실시예 31
골다공증 마우스 모델에서 S1 -5 단백질의 효과 검사
표준 방법에 따라, 7주령된 C57BL/6j 마우스에서 난소를 제거한 후, 실시예 20에서 정제한 단백질을 피하로 투여하였다. 난소제거 후 1.0mg/kg/day의 양으로 일주일에 5회 단백질을 투여하였다. 이러한 시술 후 8주후에 마우스를 살해하고, 대퇴골을 제거하고 70% 에탄올에서 고정한 뒤, 그것의 골밀도를 측정한다. 골밀도를 DCS-600EX-IIIR Model (Aloka)를 사용하여 대퇴골의 먼쪽 4분의 1지점에서 1mm 두께로 절편을 만들고 먼 위치에서 가까운 위치로 초당 10mm 속도로 20번 스캔을 하여 측정하였다. 랫트에 대한 경우에, 그 결과는 OVX 마우스에서 골밀도는 샴 마우스보다 10%정도 낮게 나옴을 보여주고 있다. 반면, 실시예 20에서 정제한 단백질을 넣어준 OVX 마우스는 골밀도가 증가함을 보여주었다. 이러한 결과는 S1-5 단백질이 골다공증의 개선에 효과가 있음을 의미한다(도 62).
본 발명은 S1-5 유전자에 흠결이 있고, 가령성 질환을 일으키는 넉아웃 동물과 그러한 동물을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 동물은 골변형(bone deformation), 탈모(hair loss), 조직 손상(tissue injury) 및 종양 발생(tumor develpoment)과 같은 다양한 가령성 질환과 증상을 일으키기 때문에, 그 동물의 가령성 질환의 치료나 예방을 위해, 효과적인 물질을 투여하는 것으로 치료나 개선 효과를 가진 약학적 조성물의 스크린을 위한 모델 동물로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 넉아웃 동물로부터 분리한 세포를 제공한다. 이러한 세포의 사용은 가령성 질환의 치료나 예방을 위한 약제의 스크리닝을 가능하게 해준다. 넉아웃 마우스로부터 분리한 골수 세포는 , 파골세포로 분화할 때 야생형의 골수세포보다 타르타르산 저항성 포스파타아제(tarate-resistant acid phosphatase)(TRAP) 양성 다핵거대세포를 형성하는 능력이 크기 때문에, TRAP 양성 다핵거대세포의 수나 크기를 지표로서 사용하여 파골세포 기능을 억제하는 약제를 스크리닝 할 수 있다.
본 발명은 또한 S1-5 단백질에 결합하는 분리된 S1-5 단백질과 S1-5 단백질 과 결합할 수 있는 항체를 제공한다. 이렇게 분리된 S1-5 단백질은 가령성 질환의 치료와 예방 및 파골세포의 기능 억제를 가능하게 해준다.
<110> LOCOMOGENE INC. <120> Protein preparation containing S1-5 <130> 8fpi-01-04 <150> PCT/JP05/012251 <151> 2005-07-01 <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2742 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctagtattct actagaactg gaagattgct ctccgagttt tttttttgtt attttgttaa 60 aaaataaaaa gcttgagcag caattcatat tactgtcaca ggtatttttg ctgtgctgtg 120 caaggtaact ctgctagcta agattcacaa tgttgaaagc ccttttccta actatgctga 180 ctctggcgct ggtcaagtca caggacaccg aagaaaccat cacgtacacg caatgcactg 240 acggatatga gtgggatcct gtgagacagc aatgcaaaga tattgatgaa tgtgacattg 300 tcccagacgc ttgtaaaggt ggaatgaagt gtgtcaacca ctatggagga tacctctgcc 360 ttccgaaaac agcccagatt attgtcaata atgaacagcc tcagcaggaa acacaaccag 420 cagaaggaac ctcaggggca accaccgggg ttgtagctgc cagcagcatg gcaaccagtg 480 gagtgttgcc cgggggtggt tttgtggcca gtgctgctgc agtcgcaggc cctgaaatgc 540 agactggccg aaataacttt gtcatccggc ggaacccagc tgaccctcag cgcattccct 600 ccaacccttc ccaccgtatc cagtgtgcag caggctacga gcaaagtgaa cacaacgtgt 660 gccaagacat 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ccatctcact ccacagacat gaatttcagc accattcaat gtttctataa 180 agattagaaa tacacctcag tcaaatgtgt gatggatgtt aagtagatag atggtgctga 240 tgaagcctaa ctttgtcaaa cagacaagga aggctgggat tgacaagctg atcagagtca 300 cactcacctg tgatgccaga actcagatag tgacagccaa cggatctgga gttcaaggat 360 gaccttagga ctacaaagca agaccctata tcaaaataaa tgaatttgaa atgagaagga 420 aggaaatgag aagggaagaa aggggagagg aaagacgttt cttctgatct ttgactcttc 480 cactgccaag tgtgaatttg aacacctcat ctcctcggta agcctcttca tggagcaggg 540 gaaatggatc cccatttttc tataaagagg atccatctgc tcttatgctt tgaaaaccct 600 ctctgagctt gtcattcttc caactgaact gaacaaattc aatacaattt tataattctt 660 gaccctttta aaaattaact gcaatggaag catctgcttg aacagagatc ttaaggaaag 720 aaaaggactg aaatccaagc aatatccatg taaagtgtgt cttgtgggta agtaaacttt 780 taacctctta ccttgaatga atggatttcc ttatttgacc tatttaatca tcagtaaaag 840 tcagacatgt cattccgtag attttgtctg ctagcagaat actataaatt ctaaatggaa 900 agtattttct ttggtctttc cacattctgc aatgagaaag aagttaatac tagtttatca 960 aaatgattta tgttttaaat 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tcctgtgttt ctttaaggga gttattaatg tccttcttta 89940 aatcctctac cagcatcatg agatataatt ctacatccta atcttgctat ttctgtgtat 90000 t 90001 <210> 6 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Leu Lys Ala Leu Phe Leu Thr Met Leu Thr Leu Ala Leu Val Lys 1 5 10 15 Ser Gln Asp Thr Glu Glu Thr Ile Thr Tyr Thr Gln Cys Thr Asp Gly 20 25 30 Tyr Glu Trp Asp Pro Val Arg Gln Gln Cys Lys Asp Ile Asp Glu Cys 35 40 45 Asp Ile Val Pro Asp Ala Cys Lys Gly Gly Met Lys Cys Val Asn His 50 55 60 Tyr Gly Gly Tyr Leu Cys Leu Pro Lys Thr Ala Gln Ile Ile Val Asn 65 70 75 80 Asn Glu Gln Pro Gln Gln Glu Thr Gln Pro Ala Glu Gly Thr Ser Gly 85 90 95 Ala Thr Thr Gly Val Val Ala Ala Ser Ser Met Ala Thr Ser Gly Val 100 105 110 Leu Pro Gly Gly Gly Phe Val Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Gly Pro 115 120 125 Glu Met Gln Thr Gly Arg Asn Asn Phe Val Ile Arg Arg Asn Pro Ala 130 135 140 Asp Pro Gln Arg Ile Pro Ser Asn Pro Ser His Arg Ile Gln Cys Ala 145 150 155 160 Ala Gly Tyr Glu Gln Ser Glu His Asn Val Cys Gln Asp Ile Asp Glu 165 170 175 Cys Thr Ala Gly Thr His Asn Cys Arg Ala Asp Gln Val Cys Ile Asn 180 185 190 Leu Arg Gly Ser Phe Ala Cys Gln Cys Pro Pro Gly Tyr Gln Lys Arg 195 200 205 Gly Glu Gln Cys Val 210 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Cys Lys Asp Ile Asp Glu Cys Asp Ile Val Pro Asp Ala Cys Lys 1 5 10 15

Claims (22)

  1. S1-5 유전자의 전부 또는 일부의 기능을 상실시킨 가령성(age-related)질환 또는 증상을 나타내는 비인간 넉아웃 동물.
  2. 제1항에 있어서, S1-5 유전자의 전부 또는 일부의 기능상실은 S1-5 유전자의 파괴 또는 변이에 의한 동물.
  3. 제 1항에 있어서, 가령성 질환 또는 증상은 골변형, 골다공증, 골 파젯병(Paget's disease of bone), 부갑상선기능항진증(hyperparathyroidism), 골밀도의 저하, 피질골의 해면골화(cancellous transformation of cortical bone), 탈모, 조직의 손상 또는 괴사, 종양, 흉부비대, 복수, 빈혈, 출혈, 피부의 노화 및 손톱의 노화로 구성된 군으로부터 적어도 1개가 선택되어지는 것을 특징으로 하는 동물.
  4. 제1항에 있어서, 동물은 지브라피시( zebrafish), 마우스, 랫트, 기니피그(guinea pig), 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 개, 소, 원숭이 및 침팬지로 구성된 군으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는 동물.
  5. 제1항 내지 제4항 어느 한 항에 기재된 비인간 넉아웃 동물에서 분리한 세포.
  6. 제5항에 있어서, 세포는 파골세포, 각화상피세포, 혈액세포, 암세포, 골수세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 진피세포, 근육세포, 신경세포, 골아세포, 임파구, 혈관평활근세포, 활막세포, 모유두세포, 간세포, 색소세포, 지방세포, 자궁내피세포, 또는 폐포상피세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  7. S1-5 유전자의 전부 또는 일부의 기능을 상실시키는 것을 특징으로 하는 가령성질환을 일으키는 비인간 넉아웃 동물의 제작방법.
  8. 제7항에 있어서, S1-5 유전자의 전부 또는 일부의 기능의 상실은 S1-5 유전자의 파괴 또는 변이에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 가령성 질환 또는 증상은 골변형, 골다공증, 골 파젯병, 부갑상선기능항진증, 골밀도의 저하, 피질골의 해면골화, 탈모, 조직의 손상 또는 괴사, 종양, 흉부비대, 복수, 빈혈, 출혈, 피부의 노화 및 손톱의 노화로 구성된 군으로부터 적어도 1개가 선택되어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 동물은 지브라피시(zebrafish), 마우스, 랫트, 기니피그(guinea pig), 토끼, 닭, 돼지, 양,염소, 개, 소, 원숭이 및 침팬지로 구성된 군으로부터 어떤 하나가 선택되어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 비인간 넉아웃 동물에 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 후보 물질을 투여하는 것을 특징으로 하는 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
  12. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 비인간 넉아웃 동물에서 분리한 세포에 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 후보물질을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 세포는 파골세포, 각화상피세포, 혈액세포, 암세포, 골수세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 진피세포, 근육세포, 신경세포, 임파구, 혈관평활근세포, 활막세포, 모유두세포, 간세포, 색소세포, 지방세포, 자궁내피세포, 또는 폐포상피세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 가령성 질환 또는 증상은 골변형, 골다공증, 골 파젯병, 부갑상선기능항진증, 골밀도의 저하, 피질골의 해면골화, 탈모, 조직의 손상 또는 괴사, 종양, 흉부비대, 복수, 빈혈, 출혈, 피부의 노화 및 손톱의 노화로 구성된 군으로부터 적어도 1개가 선택되어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 비인간 넉아웃 동물에서 유래된 파골세포에 파골세포의 기능억제제의 후보물질을 접촉시키는 것을 특징으로하는 파골세포의 기능억제제의 스크리닝 방법.
  16. 하기 (a)~(d)의 어느 하나에 기재되어 있는 분리된 단백질:
    (a) 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열 번호 1 또는 3에 기재된 염기 서열의 코드 영역을 포함한 DNA에 의해 코드되는 단백질;
    (c) 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열 번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질; 및
    (d) 서열 번호 1 또는 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 스트린전트(stringent)인 조건하에서 혼성화(hybridize) 되는 DNA에 의해 코드되는 단백질이며, 서열번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질.
  17. 제 16항의 단백질의 부분 펩티드.
  18. 제 17항에 있어서, 펩티드는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
  19. 제 16항에 기재된 단백질, 제17항 또는 제18항에 기재된 펩티드를 함유하는 가령성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료제.
  20. 제 19항에 있어서, 가령성 질환 또는 증상은 골변형, 골다공증, 골 파젯병, 부갑상선기능항진증, 골밀도의 저하, 피질골의 해면골화, 탈모, 조직의 손상 또는 괴사, 종양, 흉부비대, 복수, 빈혈, 출혈, 피부의 노화 및 손톱의 노화로 구성된 군으로부터 적어도 1개가 선택되어진 예방 또는 치료제.
  21. 제 16항에 기재된 단백질, 제17항 또는 제18항에 기재된 펩티드를 함유하는 파골세포의 기능 억제제.
  22. 제 16항에 기재된 단백질, 제 17항 또는 제 18항에 기재된 펩티드에 결합하 는 항체.
KR1020087002714A 2005-07-01 2005-12-28 Ｓ１―５를 포함하는 단백질 제제 KR20080032139A (ko)

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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009016855A1 (ja) * 2007-08-02 2009-02-05 National University Corporation Kanazawa University 脱毛の抑制方法および毛髪の脱色素化の抑制方法
JP5308651B2 (ja) * 2007-11-16 2013-10-09 株式会社 ジェンテック Ｄｒｐ１欠損非ヒト哺乳動物
WO2009132357A1 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 New York Blood Center, Inc. Abi1/hssh3bp1 conditional knockout mouse
EP2131199A1 (en) * 2008-06-03 2009-12-09 Université de Liège Biomarker for osteoarthritis and/or other ageing-related diseases, and use thereof
EP2975411A1 (en) * 2008-06-03 2016-01-20 Universite De Liege Biomarker for osteoarthritis and use thereof
AT508638B1 (de) * 2009-08-21 2011-08-15 Affiris Ag Verwendung von peptiden und polypeptiden zur behandlung und/oder prävention von synukleinopathien
CN103689607A (zh) * 2013-11-26 2014-04-02 雷家荃 林蛙高蛋白钙粉在制备补钙保健品或药物中的应用
JP2017112836A (ja) * 2014-04-22 2017-06-29 中島　利博 骨粗鬆症モデル動物の作成方法
CN111903604B (zh) * 2020-07-23 2022-05-24 北京市华都峪口禽业有限责任公司 白羽肉鸡配套制种方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6770461B1 (en) * 1998-10-23 2004-08-03 Genome Therapeutics Corporation High bone mass gene of 11q13.3
CA2402410A1 (en) * 2000-04-05 2001-10-18 Genome Therapeutics Corporation The high bone mass gene of 11q13.3
WO2002052007A1 (fr) * 2000-12-22 2002-07-04 Locomogene, Inc. Proteine de cellule de membrane synoviale

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