BRPI0411843B1 - ácido nucleico compreendendo um promotor de beta-actina, vetor e método de produzir uma proteína - Google Patents

ácido nucleico compreendendo um promotor de beta-actina, vetor e método de produzir uma proteína Download PDF

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Abstract

"promotores rps21 e beta-actina e usos destes". a invenção refere-se ao isolamento de novos promotores de s21 (rps21) de proteína ribossômica e usos destes. em particular, esta invenção caracteriza seqüências de nucleotídeo para promotores de <225>-actina de roedor incluindo, hamster, rato e camundongo, e rps21 de hamster.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ÁCIDO NUCLÉICO COMPREENDENDO UM PROMOTOR DE BETA-ACTINA, VETOR E MÉTODO DE PRODUZIR UMA PROTEÍNA.
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade de Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos n° 60/480. 768, depositado em 24 de junho de 2003, o teor inteiro do qual é incorporado por referência.
Campo da Invenção [002] Esta invenção se refere a elementos de gene regulador tal como promotores e usos destes, por exemplo, para expressão de proteínas. Mais especificamente, esta invenção se refere a promotores de gene S21 de proteína ribossômica e β-actina.
Antecedentes da Invenção [003] Todo gene eucariótico contém elementos reguladores impelindo a transcrição daquele gene. Tais elementos reguladores incluem promotores, que estão tipicamente posicionados imediatamente a montante da sequência de codificação em um gene. Os promotores regulam a transcrição fornecendo sítios de ligação para fatores de transcrição, que são uma parte do mecanismo de transcrição. Os promotores são comumente empregados para expressar proteínas em cultura celular e in vivo. Muitos promotores são conhecidos e empregados para a expressão de proteínas em vários sistemas de expressão. Exemplos de promotores incluem promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), repetições terminais longas de genoma grande de genoma de vírus de sarcoma Rous (RSV), promotor de Vírus Simiano 40 (SV40), promotor de gene interferon, promotor de metalotioneína, e o promotor de timidina cinase e outros, por exemplo, como descrito em Fernandez e outros (1999) Gene Expression Systems, Academic Press. Entretanto, existe ainda uma necessidade na técnica de
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2/44 fornecer promotores que sejam capazes de gerar níveis elevados de expressão e/ou sustentar a expressão durante um período de tempo prolongado.
[004] A β-actina é uma proteína estrutural e é usualmente expressa em todas as espécies, de protozoários a eucariotas, incluindo humanos. Os promotores de β-actina de humano e frango foram anteriormente descritos.
[005] O promotor de β-actina, em geral, mostra uma atividade mais ubíqua do que o promotor de CMV que é amplamente empregado (Xu e outro (2001) Gene 272: 149-156). O promotor de β-actina de frango foi mostrado exibir uma atividade mais elevada do que os promotores de SV40 e CMV virais, porém apenas quando está ligado a uma sequência realçadora de CMV (Xue outro, supra) .
[006] A proteína ribossômica S21 (rpS21) que está associada com a subunidade 40S da ribossoma. O promotor do gene rpS21 humano foi anteriormente identificado (GenBank® acession N° AJ250907). Similarmente para a maioria dos promotores de gene ribossômicos, ele carece de elementos de transcrição convencionais tais como a caixa TATA e sequência CAAT (Smirnova e outro (2000) Bioorg. Khim. 26(5) 392-396).
Sumário da Invenção [007] Esta invenção fornece novos promotores de β-actina que têm um baixo nível de homologia de sequência com os promotores de β-actina previamente conhecidos (tais como, por exemplo, humano e de frango). Esta invenção também fornece novos promotores rpS21 que têm um nível baixo de homologia de sequência para os promotores rpS21 anteriormente conhecidos (tal como, por exemplo, humanos e camundongos) .
[008] A presente invenção é com base, em parte, na descrição e isolamento dos promotores rpS21 e β-actina de uma linhagem celular
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3/44 do ovário de hamster chinês (CHO). Esta invenção é também com base, em parte, em uma observação que o promotor de β-actina do hamster tem uma atividade significantemente mais elevada do que o promotor de CMV. A invenção é também com base, em parte, em uma observação de que o promotor rpS21 é pelo menos tão ativo quanto o promotor de β-actina do hamster quando empregado para expressar certos genes. A invenção fornece sequências de nucleotídeo para esses promotores e inclui as variantes das sequências de nucleotídeo tendo a atividade promotora. Em algumas modalidades, um promotor de β-actina da invenção é derivado de um roedor, por exemplo, hamster, rato, e camundongo. O promotor rpS21 é tipicamente derivado de um hamster.
[009] A invenção também fornece vetores compreendendo um promotor de β-actina ou um promotor de rpS21 da invenção operavelmente ligado a um ácido nucléico heterólogo. Em certas modalidades, um vetor da invenção compreende um promotor que está operavelmente ligado a um ácido nucléico heterólogo que codifica um produto de expressão heterólogo tal como, por exemplo, uma proteína terapêutica ou um fragmento desta. Nas modalidades ilustrativas, o produto de expressão é ácido esfinogomielinase (ASM), α-glucosidase (GAA), ou ativador do plasminogênio de tecido (tPA).
[0010] A invenção também fornece células hospedeiras transfectadas com um vetor da invenção. Nas modalidades ilustrativas, a célula hospedeira é uma célula de mamífero tal como, por exemplo, CHO, HEK, e BHK.
[0011] Os métodos para a produção de uma proteína são também fornecidos. Os métodos para a produção de uma proteína incluem, por exemplo, cultivar uma célula transfectada com um vetor compreendendo um promotor de β-actina e/ou um promotor de rpS21 da invenção operavelmente ligado a um ácido nucléico heterólogo codificando
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4/44 uma proteína, e recuperar a proteína. Em algumas modalidades, o produto de expressão de heterólogo é uma proteína secretora, que é recuperada do meio. Nas modalidades Ilustrativas, a proteína é ASM, GAA, ou tPA .
Breve Descrição das Figuras [0012] Figura 1A mostra um alinhamento entre as porções de sequências de nucleotídeo de um promotor de β-actina de hamster (SEQ ID N°: 1) e um promotor de β-actina de rato (SEQ ID N°: 2), demonstrando uma identidade de 79% entre o nucleotídeo (nt) 487 ao nt 893 da SEQ ID N°: 1 e nt 1 ao nt 417 da SEQ ID N°: 2. O promotor de βactina de rato (SEQ ID N°: 2) tem uma identidade de 62% sobre o comprimento total do promotor de β-actina de hamster (SEQ ID N°: 1) . [0013] Figura 1B mostra um alinhamento entre as porções das sequências de nucleotídeo de um promotor de β-actina de hamster (SEQ ID N°: 1) e um promotor de β-actina de rato (SEQ ID N°: 2), demonstrando uma identidade de 83% entre o nt 1047 ao nt 3006 da SEQ ID N°: 1 e nt 546 ao nt 2493 da SEQ ID N°: 2 .
[0014] Figura 2A mostra um alinhamento entre as porções de sequências de nucleotídeo de um promotor de β-actina de hamster (SEQ ID N°: 1) e um promotor de β-actina de camundongo (SEQ ID N°: 3), demonstrando uma identidade de 84% entre o nt 33 ao nt 487 da SEQ ID N°: 1 e nt 1 ao nt 449 da SEQ ID N°: 3. A sequência do promotor de β-actina de camundongo (SEQ ID N°: 3) tem uma identidade de 80% sobre o comprimento total da sequência do promotor de β-actina do hamster da SEQ ID N°: 1.
[0015] Figura 2B mostra um alinhamento entre as porções de sequências de nucleotídeo de um promotor de β-actina de hamster (SEQ ID N°: 1) e um promotor de β-actina de camundongo (SEQ ID N°: 3), demonstrando uma identidade de 83% entre o nt 996 ao nt 3006 da SEQ ID N°: 1 e nt 921 ao nt 2953 da SEQ ID N°: 1.
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5/44 [0016] Figura 3 mostra um alinhamento entre as porções de sequências de nucleotídeo de um promotor de β-actina de hamster (SEQ ID N°: 1) e um gene de β-actina de hamster (No. de Acessão do Genbank® U20114; SEQ ID N°: 4), demonstrando uma identidade de 98% entre o nt 1775 ao nt 3006 da SEQ ID N°: 1 e nt 1 ao nt 1232 da SEQ ID N°: 4. A sequência do gene de β-actina de hamster tem uma identidade de 40% sobre o comprimento total da sequência do promotor de β-actina do hamster da SEQ ID N°: 1.
[0017] Figura 4 mostra um alinhamento entre as porções de sequências de nucleotídeo de um promotor de β-actina de hamster (SEQ ID N°: 1) e um promotor de β-actina humano anteriormente conhecido (No. de Acessão do Genbank® gi28337; SEQ ID N°: 5), demonstrando uma identidade de 94% entre o nt 113 ao nt 148 da SEQ ID N°: 1 e nt 38 ao nt 73 da SEQ ID N°: 5, uma identidade de 83% entre nt 362 ao nt 433 da SEQ ID N°: 1 e nt 303 ao nt 374 da SEQ ID N°: 5, uma identidade de 90% entre nt 1728 ao nt 1764 da SEQ ID N°: 1 e nt 1791 e nt 1830 da SEQ ID N°: 5, e uma identidade de 91% entre o nt 1797 ao nt 1966 da SEQ ID N°: 1 e nt 1840 ao nt 2007 da SEQ ID N°: 5. A sequência do promotor de β-actina humano (SEQ ID N°: 5) mostra uma identidade de 10% sobre o comprimento total da sequência do promotor de β-actina do hamster da SEQ ID N°: 1.
[0018] Figura 5 mostra um alinhamento entre as porções de sequências de nucleotídeo de um promotor de β-actina de hamster (SEQ ID N°: 1) e um promotor de β-actina de frango anteriormente conhecido (No. de Acessão do Genbank® gi2170437; SEQ ID N°: 6), demonstrando uma identidade de 83% entre o nt 1878 ao nt 1919 da SEQ ID N°: 1 e nt 186 ao nt 227 da SEQ ID N°: 6. A sequência do promotor de β-actina de frango (SEQ ID N°: 6) mostra uma identidade de 1% sobre o comprimento total da sequência do promotor de β-actina do hamster da SEQ ID N°: 1.
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6/44 [0019] Figura 6A descreve um Northern Blot para galectina, ferritina, e β-actina em células CHO-K1. Os mRNAs representativos foram isolados das células em 0, 4, 8, 10 e 15 horas seguinte ao tratamento das células com actinomicina D.
[0020] Figura 6B descreve os níveis de expressão de mRNA relativos para os genes de galectina, ferritina, e β-actina. Os mRNAs representativos foram isolados das células em 0, 4, 8, 10, e 15 horas seguinte ao tratamento das células CHO-K1 com actinomicina D.
[0021] Figura 7A descreve as forças do promotor relativas quando medidas nos ensaios de transfecção transiente em células CHO-K1 para os seguintes promotores: CMV, EF-1 humano, GAPDH de hamster, rpS21 de hamster e β-actina de hamster. Os promotores representativos foram clonados a montante de um gene de proteína fluorescente vermelha (RFP) no plasmídeo pDsRED-1. A fluorescência média foi medida por FACS.
[0022] Figura 7B descreve as forças do promotor relativas quando medidas em ensaios de transfecção estável em células CHO-K1 para os seguintes promotores: CMV, EF-1 humano, GAPDH de hamster, rpS21 de hamster, e β-actina de hamster. Os promotores representativos foram clonados a jusante de um gene de proteína fluorescente vermelha (RFP) no plasmídeo pDsRED-1. A fluorescência média foi medida por FACS.
[0023] Figura 8A descreve a expressão da proteína de esfingomielinase de ácido (ASM) nos meios de três grupos das células CHODXB11 transfectadas com um vetor contendo o cDNA ASM operavelmente ligado ou ao promotor de CMV ou ao promotor de β-actina do hamster. A expressão de ASM foi avaliada em um ensaio de atividade enzimática para ASM.
[0024] Figura 8B descreve a expressão de α-glicosidase proteína (GAA) nos meios de três grupos de células CHO-DXB11 transfectadas
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7/44 com um vetor contendo o cDNA GAA operavelmente ligado ou ao promotor de CMV ou ao promotor de β-actina de hamster. A expressão de GAA foi avaliada em um ensaio de atividade enzimática para GAA. [0025] Figura 9 descreve a expressão da proteína tPA nos meios de grupos de células CHO-DXB11 transfectadas com um vetor contendo o cDNA tPA operavelmente ligado ao promotor de β-actina de hamster. A expressão de tPA foi avaliada empregando ELISA. Descrição Detalhada da Invenção [0026] A fim de que a presente invenção seja mais facilmente entendida, certos termos são primeiro definidos. As definições adicionais são apresentadas em toda a descrição detalhada.
[0027] O termo promotor se refere a um elemento regulador que direciona a transcrição de um ácido nucléico ao que está operavelmente ligado. Um promotor pode regular igualmente a taxa e a eficiência da transcrição de um ácido nucléico operavelmente ligado. Um promotor pode também estar operavelmente ligado a outros elementos reguladores que realçam (realçadores) ou reprimem (repressores) a transcrição dependente do promotor de um ácido nucléico. O termo operavelmente ligado se refere a um ácido nucléico colocado em uma ligação funcional com outro ácido nucléico. Um promotor está geralmente posicionado 5' (isto é, a jusante) de um sitio de iniciação de transcrição no ácido nucléico. Um promotor, entretanto, pode incluir sequências 3' (isto é, a jusante) do sítio de iniciação de transcrição. Um promotor pode abranger regiões igualmente 5' e 3' do sítio de iniciação de transcrição do ácido nucléico operavelmente ligado.
[0028] O termo atividade promotora se refere a capacidade de um promotor de iniciar a transcrição de um ácido nucléico ao qual ele está operavelmente ligado. A atividade promotora pode ser medida empregando os procedimentos conhecidos na técnica ou como descrito nos Exemplos. Por exemplo, a atividade promotora pode ser me
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8/44 dida como uma quantidade de mRNA transcrita empregando-se, por exemplo, Northern Blot ou reação em cadeia de polimerase (PCR). Alternativamente, a atividade promotora pode ser medida como uma quantidade do produto de proteína transladada, por exemplo, por Northern Blot, ELISA, ensaio colorimétrico tal como, por exemplo, ensaio de Bradford (Bradford (1976) Anal. Biochem., 72:248), e vários ensaios de atividade, incluindo ensaios de gene repórter e outros procedimentos conhecidos na técnica ou como descrito nos Exemplos.
[0029] O termo vetor se refere a um ácido nucléico viral ou não viral, procariótico ou eucariótico, ácido deoxiribonucléico, ácido ribonucléico ou um análogo de ácido nucléico, que é capaz de carregar outro ácido nucléico. Um vetor pode ou carregar um ácido nucléico dentro de uma célula, referida como célula hospedeira, para que todo ou parte do ácido nucléico seja transcrito ou expressado. Alternativamente, um vetor pode ser empregado em um ensaio de transcrição in vitro. Os vetores são freqüentemente montados como compósitos de elementos derivados de diferentes genes virais, bacterianos, ou mamíferos. Os vetores contêm várias sequências de codificação e não codificação, incluindo a sequência codificando para marcadores selecionáveis (por exemplo, um gene de resistência antibiótica), sequências que facilitam sua propagação nas bactérias, ou uma ou mais unidades de transcrição que são expressadas somente em certos tipos de células. Por exemplo, os vetores de expressão de mamíferos muitas vezes contêm igualmente sequências procarióticas que facilitam a propagação do vetor nas bactérias e uma ou mais unidades de transcrição eucariótica, que são expressas somente nas células eucarióticas. Será apreciado por aqueles versados na técnica que o propósito do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc.
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9/44 [0030] Os vetores incluem, por exemplo, plasmídeos, fagemídeos, e vetores virais. Os vetores que têm um promotor existente podem ser modificados por técnicas de DNA recombinante padrões conhecidas na técnica para substituir o promotor com qualquer das sequências de promotor apresentadas na SEQ ID N°: 1, 2, 3 ou 39 ou uma variante destas. Em geral, os vetores adequados podem ou ser escolhidos daqueles que são comercialmente disponíveis ou eles podem ser construídos empregando técnicas de DNA recombinante padrão conhecidas na técnica. (Observe, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2a Edição, Sambrook e outros, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
[0031] Os termos transformação e transfecção se referem à introdução intracelular de um ácido nucléico. Um ácido nucléico pode ser introduzido dentro de uma célula de planta ou animal ou uma célula procariótica ou eucariótica por vários métodos conhecidos na técnica ou descritos aqui.
[0032] O termo isolado se refere a um ácido deoxiribonucléico, um ácido ribonucléico, ou um análogo de ácido nucléico tendo uma sequência de polinucleotídeo que é separada de outras sequências de ácido nucléico de um tal modo que não ocorra naturalmente. Um ácido nucléico isolado abrange ácidos nucléicos que podem ser parcialmente ou totalmente quimicamente ou recombinantemente sintetizados e/ou purificados por técnicas padrão conhecidas na técnica.
[0033] O termo variante em referência a uma sequência de promotor se refere a uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica sobre o comprimento total desta, desde que o variante tenha atividade promotora.
[0034] As variantes dos promotores de β-actina podem ser do mesmo tamanho como as sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 1, 2 ou 3, ou mais curtas, contanto que elas tenham pelo menos 1250
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10/44 nucleotídeos em comprimento. As variantes dos promotores rpS21 podem ser do mesmo comprimento como a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 39, ou mais curtas, contanto que elas tenham atividade promotora. As variantes do promotor de β-actina podem ser de ocorrência natural, por exemplo, promotores de β-actina de ocorrência natural isolados de espécies exceto humano e frango, ou elas podem ser geradas artificialmente. A identidade entre o promotor de β-actina de hamster apresentado na SEQ ID N°: 1 e uma variante deste, quando idealmente alinhada, é pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% sobre a sequência total da SEQ ID N°: 1 de nt 1 ao nt 3007. Similarmente, a identidade entre o promotor de β-actina de rato apresentado na SEQ ID N°: 2 e uma variante deste é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% sobre a sequência total da SEQ ID N°: 2 de nt 1 ao nt 2493. A identidade entre o promotor de β-actina de camundongo da SEQ ID N°: 3 e uma variante deste é pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% sobre o comprimento total da SEQ ID N°: 3 de nt 1 ao nt 2953. Similarmente, a identidade entre o promotor rpS21 de hamster apresentado na SEQ ID N°: 39 e uma variante deste, quando idealmente alinhada, pode ser pelo menos 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% sobre o comprimento total da SEQ ID N°: 39 de nt 1 ao nt 1958.
[0035] As variantes dos promotores de β-actina podem, por exemplo, incluir ortólogos dos promotores de β-actina em outras espécies, incluindo roedores e outros mamíferos, porém excluindo promotores de β-actina humanos e de frangos e variantes conhecidas destes. As variantes dos promotores da invenção podem também ser encontradas em outras espécies de roedores tal como, por exemplo, cobaias,
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11/44 marmota, rato almiscarado, gerbil, esquilo, chipmunk, prairie dog, castor, porco-espinho, e vole.
[0036] O termo variantes também abrange os fragmentos de qualquer um ou mais promotores da invenção que tenham atividade promotora. Os variantes dos promotores de β-actina têm pelo menos 1250 nucleotídeos no comprimento. Os variantes dos promotores de βactina da invenção podem ser derivados, por exemplo, de truncações 5' do promotor de β-actina de hamster apresentado na SEQ ID N°: 1. Em algumas modalidades, as variantes do promotor de β-actina incluem as sequências de nt 50 ao nt 3000, de nt 100 ao nt 3000, de nt 150 ao nt 3000, de nt 200 ao nt 3000, de nt 250 ao nt 3000, de nt 500 ao nt 3000, de nt 1000 ao nt 3000, ou de nt 1500 ao nt 3000 da SEQ ID N°:
1. Em outras modalidades, as variantes do promotor de β-actina podem ser derivadas pelas truncações 5' da sequência apresentada na SEQ ID N°: 2 e incluem, por exemplo de nt 200 ao nt 2490, de nt 250 ao nt 2490, de nt 500 ao nt 2490, ou de nt 1000 ao nt 2490 da SEQ ID N°: 2. As variantes do promotor de β-actina podem também ser derivadas por truncações 5' da sequência apresentada na SEQ ID N°: 3 e incluem, por exemplo, de nt 50 a nt 2950, de nt 100 a nt 2950, de nt 150 a nt 2950, de nt 200 a nt 2950, de nt 250 a nt 2950, de nt 500 a nt 2950, de nt 1000 a nt 2950, ou de nt 1500 a nt 2950 de SEQ ID N°: 3. Os fragmentos mais longos do promotor de β-actina de hamster podem ser derivados, por exemplo, por truncações 5' da sequência de nucleotídeo do promotor de hamster mais longa apresentada na SEQ ID N°: 7. Tais variantes incluem, por exemplo, as sequências de nt 50 ao nt 3668, de nt 100 ao nt 3668, de nt 150 ao nt 3668, de nt 200 ao nt 3668, de nt 250 ao nt 3668, de nt 500 ao nt 3668, ou de nt 600 ao nt 3668.
[0037] As variantes dos promotores rpS21 podem ser derivadas por truncações 5' e/ou truncações 3' da sequência apresentada na
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SEQ ID N°: 39. Tais variantes incluem, por exemplo, as sequências de nt 50 ao nt 1958, de nt 100 ao nt 1958, de nt 150 ao nt 1958, de nt 200 ao nt 1958, de nt 250 ao nt 1958, de nt 500 ao nt 1958, de nt 1000 ao nt 1958, de nt 1 ao nt 1900, de nt 1 ao nt 1850, de nt 1 ao nt 1800, de nt 1 ao nt 1750, de nt 1 ao nt 1700, de nt 1 ao nt 1600, ou de nt 1 ao nt 1500.
[0038] Em certas modalidades, um promotor de β-actina da invenção compreende uma extensão contígua de pelo menos 1250, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 200, 2500 ou 300 nucleotídeos de SEQ ID N-: 1, 2, ou 3. Tais extensões contíguas da SEQ ID N-: 1, 2 e 3 podem também conter uma mutação (inserção ou deleção) contanto que a sequência mutante retenha pelo menos alguma funcionalidade da sequência original e a capacidade de hibridizar para as respectivas sequências da SEQ ID N-: 1, 2 ou 3 sob condições de rigorosidade baixa, média ou elevada. Uma extensão contígua de um promotor de β-actina pode ser derivado de truncações 5' de qualquer das sequências apresentadas na SEQ ID N°: 1,2, 3 ou 7 ou variantes destes como descrito acima.
[0039] Em outras modalidades, um promotor rpS21 da invenção compreende uma extensão contígua de pelo menos 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1850 ou 1900 nucleotídeos da SEQ ID N°: 39.
[0040] As variantes do promotor de β-actina da invenção também incluem sequências de nucleotídeo que hibridizam para o comprimento total das sequências promotoras de β-actina mostradas nas SEQ ID N-: 1, 2 ou 3, ou seus complementos e que tenham no máximo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45% de ligações imperfeitas de pares de base. Os variantes do promotor rpS21 da invenção incluem as sequências de nucleotídeo que hibridizam para o comprimento total da sequência do promotor rpS21 mostrada na SEQ ID N°: 39, ou seu
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13/44 complemento, e que tem no máximo 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60% de ligações imperfeitas de pares de base. O percentual de ligações imperfeitas de pares de base pode ser determinado pelas técnicas padrão conhecidas na técnica ou como descrito aqui. O termo heterólogo quando empregado em referência a um ácido nucléico, significa um ácido nucléico exceto o ácido nucléico que um promotor esteja operavelmente ligado a um genoma de ocorrência natural. Por exemplo, o termo heterólogo se refere a qualquer ácido nucléico exceto o gene de β-actina de hamster quando um tal ácido nucléico é operavelmente ligado a um promotor de β-actina de hamster. Do mesmo modo, o termo heterólogo se refere a qualquer ácido nucléico exceto o gene de β-actina de rato quando um tal ácido nucléico é operavelmente ligado a um promotor de β-actina de rato. Similarmente, o termo heterólogo se refere a qualquer ácido nucléico quando um tal ácido nucléico é operavelmente ligado ao promotor de βactina de camundongo. Analogamente, este termo também se refere a qualquer ácido nucléico exceto o gene rpS21 de hamster quando um tal ácido nucléico é operavelmente ligado a um promotor rpS21 de hamster.
[0041] O termo transgênico se refere a qualquer animal contendo células geneticamente manipuladas nas quais um promotor da invenção é não mais operavelmente ligado ao mesmo ácido nucléico em um genoma de ocorrência natural. O termo transgênico abrange, por exemplo, um animal contendo células com um promotor da invenção ou uma variante deste integrado no cromossomo do animal. O termo transgênico também abrange um animal contendo células com uma sequência de DNA extracromossomicamente replicante compreendendo um promotor da invenção ou um variante deste. O animal transgênico pode ser um mamífero tal como um roedor ou humano. [0042] Esta invenção é com base, em parte, na descoberta o iso
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14/44 lamento de novos promotores para os genes de β-actina e rpS21. Especificamente, esta invenção caracteriza promotores de β-actina de roedor incluindo, porém não limitado a, hamster, rato e camundongo, e o promotor de rpS21 de hamster. Esta invenção é com base na descoberta e demonstração de que os promotores de β-actina da invenção têm atividade promotora que é mais elevada do que a atividade dos promotores de CMV, como descrito nos Exemplos. A invenção é também com base na descrição de que o promotor de rpS21 de hamster é pelo menos tão ativo quanto o promotor de β-actina de hamster quando empregado para expressar certos genes.
[0043] A invenção fornece sequências de nucleotídeo para promotores de β-actina de roedores, incluindo hamster, ratos, e camundongos, e métodos para o uso deste. A invenção também fornece os métodos para a identificação e isolamento de variantes dos promotores da invenção, incluindo homólogos e fragmentos dos promotores que têm a atividade promotora. Adicionalmente, a invenção fornece uma sequência de nucleotídeo para o promotor de rpS21 de hamster, e os métodos para o uso deste.
[0044] Nos experimentos que induziram à presente invenção, um clone genômico para o promotor de β-actina de hamster foi isolado de células CHO seguindo sua identificação como um promotor ativo por uma técnica chamada Analise Serial de Expressão de Gene ou SAGE (Valculesco e outros (1995) Science, 270: 484-487 e Valculesco e outros (1987) Cell, 88:243-251). A técnica de SAGE pode ser empregada para traçar o perfil de de um genoma inteiro. O promotor de βactina foi identificado como um dos promotores mais ativos nas células CHO empregando SAGE. Isto induziu à clonagem do promotor para βactina nas células CHO. Um método similar foi empregado para o isolamento do promotor de rpS21 de hamster das células CHO. Este método pode ser empregado para traçar o perfil de transcrição de outros
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15/44 genomas para confirmar que os promotores de β-actina correspondentes ou promotores de rpS21 são ativos em outro genoma. Um tal promotor pode ser clonado empregando técnicas padrão conhecidas na técnica ou aquelas descritas aqui. As variantes dos promotores da invenção podem ser identificadas pela hibridização para uma ou mais das sequências promotoras apresentadas na SEQ ID N-: 1, 2, 3 ou
39. É bem conhecido que a temperatura de fusão ™ de um ácido nucléico de filamento duplo diminui de 1-1,5oC com cada 1% de diminuição na homologia (observe, por exemplo, Bonner e outros, (1973) J. Mol. Biol., 81:123). Os homólogos da espécie, desta, podem ser identificados, por exemplo, por hibridização de uma sequência de nucleotídeo putativa com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID N-: 1,2, 3 ou 39, ou uma variante deste, e comparando a temperatura de fusão de um tal híbrido com uma temperatura de fusão de um híbrido compreendendo uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID N-: 1, 2, 3 ou 39, ou uma variante deste e uma sequência de nucleotídeo complementar. O número de ligações imperfeitas de pares de base podem ser calculadas para o híbrido de teste. Portanto, uma diferença menor entre as temperaturas de fusão do híbrido teste e um híbrido contendo um homólogo putativo de qualquer uma das sequências na SEQ ID N-: 1, 2, 3 ou 39, indicará uma homologia maior entre a sequência de nucleotídeo putativa e uma sequência promotora da invenção. Por exemplo, as variantes em outras espécies de roedores tal como cobaias, marmota, rato almiscarado, gerbil, esquilo, chipmunk, prairie dog, castor, porco espinho, e vole, podem exibir uma homologia maior para os promotores da invenção e variantes desta.
[0045] Uma variedade de fatores é conhecida por afetar a eficiência da hibridização de dois filamentos de sequência de nucleotídeo. Essa pode incluir, por exemplo, comprimento da sequência de nucleotídeo, concentração de sal e teor de G/C das sequências. Por exem
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16/44 plo, para a hibridização de fragmentos longos de DNA, Howley e outros (1979) J. Biol. Chem., 254:4876, determinaram que a temperatura de fusão na qual 50% de um DNA é hibridizado para um filamento complementar é definido por:
Tm = 81,5 + 16,6 log M + 41 (% G + % C) - 500/L - (-17,43oC), onde [0046] M é a concentração molar dos cátions monovalentes;
[0047] (%G + %C) é a fração representativa de nucleotídeos G e C nas sequências;
[0048] L é o comprimento do DNA híbrido; e [0049] F é a concentração molar da formamida.
[0050] As condições de hibridização apropriadas podem ser selecionadas por aqueles versados na técnica com experimentação mínima como exemplificado em Ausubel e outros (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, seções 2, 4 e 6. Adicionalmente, as condições rigorosas são descritas em Sambrook e outros (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, capítulos 7, 9 e 11.
[0051] Um exemplo não limitante de condições de hibridização de rigorosidade baixa é como segue. Os filtros contendo DNA são prétratados durante 6 horas em 40oC, em uma solução contendo 35% de formamida, 5 x SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM de EDTA, 0,1% de FicollTM, 1% de BSA, e 500 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. As hibridizações são realizadas na mesma solução com as seguintes modificações: 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll™, 0,2% de BSA, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão, 10% (peso/ volume) de sulfato de dextrano, e sonda rotulada por 32P 5-20 x 106 é empregado. Os filtros são incubados na mistura de hibridização durante 18-20 horas em 40oC, e em seguida lavados durante 1,5 horas em 55oC em uma solução contendo 2 x SSC, 25 mM de Tris-HCl (pH 7,4),
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17/44 mM de EDTA, e 0,1% de SDS. A solução de lavagem é substituída com solução fresca e incubada durante um adicional de 1,5 hora em 60oC. Os filtros são manchados a seco e expostos para autoradiografia. Outras condições de rigorosidade baixa bem conhecidas na técnica podem ser empregadas (por exemplo, como empregado para hibridizações de espécies de cruzamento).
[0052] Um exemplo não limitante de condições de hibridização de rigorosidade baixa é como segue. A pré-hibridização dos filtros contendo DNA é realizada durante 8 horas durante a noite em 65oC em tampão contendo 6 x SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de EDTA, 0,02% de PVP, 0,02% de FicollTM, 0,02% de BSA, e 500 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Os filtros são hibridizados durante 48 horas em 65oCna mistura de pré-hibridização contendo 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e 5-20 x 106 com de sondas rotuladas por 32P. A lavagem dos filtros é feita em 37oC durante 1 hora em uma solução contendo 2 x SSC, 0,01% de PVP, 0,01% de FicollTM, e 0,01% de BSA. Isto é seguido por uma lavagem em 0,1 x SSC em 50oC durante 45 minutos.
[0053] Um exemplo não limitante de condições de hibridização de rigorosidade moderada inclui a pré-lavagem dos filtros em 5 x SSC, 0,5% de SDS, 1,0 mM de EDTA, pH 8,0, hibridização em 50% de formamida, 6 x SSC em 42oC, e lavagem dos filtros em 0,5 x SSC, 0,1% de SDS em 60oC.
[0054] As variantes, dos promotores da invenção, podem também ser identificada, por percentual de identidade entre as sequências de nucleotídeo para as variantes putativas e as sequências apresentadas na SEQ ID N— 1, 2, 3 ou 39, ou seus filamentos complementares. O percentual de identidade pode ser determinado, por exemplo, por inspeção visual ou empregando-se vários programas de computador conhecidos na técnica ou como descrito nos Exemplos. Por exemplo, o
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18/44 percentual de identidade de duas sequências de nucleotídeo pode ser determinado comparando-se a informação da sequência empregando o programa de computador GAP descrito por Vevereux e outros (1984) Nucl. Acids. Res., 12:387 e disponíveis da University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). O percentual de identidade pode também ser determinado por alinhamento de duas sequências de nucleotídeo empregando o programa BLAST® (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) como descrito por Tatusova e outros (1999) FEMS Microbiol. Lett., 174:247. Por exemplo, para os alinhamentos das sequências de nucleotídeo empregando o programa BALST®, os ajustes padrão são como seguem: recompensa para o par é 2, penalidade para a ligação imperfeita é -2, as penalidades para intervalo aberta e intervalo de extensão são 5 e 2 respectivamente, intervalo x dropoff é 50, esperado é 10, tamanho da palavra é 11, e o filtro está Desligado.
[0055] Os promotores da invenção identificados pela identidade de sequência incluem, por exemplo, as sequências apresentadas na SEQ ID N—: 2 e 3 para promotores de β-actina de rato e camundongo, que mostram 67% e 80% de identidade, respectivamente, para nt 1 ao nt 3007 da sequência de promotor de β-actina de hamster apresentada na SEQ ID N°: 1. As variantes adicionais podem ser facilmente identificadas empregando as várias técnicas descritas aqui e aquelas conhecidas na técnica.
[0056] O percentual de identidade entre o promotor de β-actina de hamster (SEQ ID N°: 1) e promotores de β-actina conhecidos pode ser determinado como descrito. Por exemplo, quando SEQ ID N°: 1 é comparada com o promotor de β-actina humano (SEQ ID N°: 5) empregando o alinhamento de sequência BLAST® com parâmetros padrão, ela exibe somente cerca de uma identidade de 10% sobre o comprimento total da SEQ ID N°: 1. Similarmente, quando SEQ ID N°:
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19/44 é comparada como o promotor de β-actina de frango (SEQ ID N°: 6), ela exibe somente cerca de uma identidade de 1% sobre o comprimento total da SEQ ID N°: 1. Devido a tais níveis baixos de homologia, os promotores de β-actina humano e de frango não são considerados serem variantes da sequência do promotor de β-actina de hamster de SEQ ID N°: 1. Além disso, a porção 3' da SEQ ID N°: 1 mostra homologia significante à porção 5' da sequência de gene de β-actina de hamster (No. de Acessão do GenBank® U20114; SEQ ID N°: 4). Em particular, os primeiros 1232 nucleotídeos de SEQ ID N°: 4 mostram uma identidade de 98% com a porção 3' de SEQ ID N°: 1, como descrito na Figura 3. Esta identidade está na região do primeiro íntron no gene de β-actina de hamster. A SEQ ID N°: 4, total, mostra somente 40% da identidade sobre o comprimento total da SEQ ID N°: 1. Além disso, nenhuma atividade promotora foi descrita para SEQ ID N°: 4, ou fragmentos desta.
[0057] Empregando o alinhamento de sequência BALST® com os parâmetros padrão, nenhuma homologia é detectada entre o promotor de rpS21 humano anteriormente conhecido (nt 1-2344 de No. de Acessão GenBank® No. AJ 250907) e nt 1 ao 1958 de promotor de rpS21 de hamster da SEQ ID N°: 39. O nível muito baixo de homologia é detectado entre o promotor de rpS21 de hamster da SEQ ID N°: 39 e DNA genômico de camundongo que abrange o gene de rpS21 de camundongo (No. de Acessão GenBank® NT_ 039212). Existem duas regiões de homologia nas sequências de camundongo. A primeira é de nt 1775 ao nt 1945 da SEQ ID N°: 39 (137 fora do par de 172 nts). A segunda é de nt 580 ao nt 851 da SEQ ID N°: 39 (208 fora do par de 274 nts). Essas duas regiões de homologia são separadas por 923 nts na sequência de hamster (SEQ ID N°: 39) e por 1745 nts na sequência genômica de camundongo (NT_039212).
[0058] Conseqüentemente, em algumas modalidades, um promo
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20/44 tor isolado ou variante deste tendo atividade promotora compreende a sequência(s) de nucleotídeos como apresentado de nt 1775 ao nt 1945 da SEQ ID N°: 39 e/ou de nt 580 ao nt 851 da SEQ ID N°: 39. Opcionalmente, um tal promotor ou variante também compreende toda ou uma porção da SEQ ID N°: 39 como apresentado de nt 852 ao nt 1774.
[0059] As sequências de nucleotídeo apresentadas nas SEQ ID N-: 1, 2, 3 ou 30, ou variantes destas, podem ser empregadas como sondas para avaliação de bibliotecas genômicas para o isolamento de sequências genômicas que hibridizam para uma ou mais sequências apresentadas nas SEQ ID N-: 1,2, 3 ou 39, ou variantes destas.
[0060] Um promotor, de acordo com a invenção, ou uma variante deste é operavelmente ligado a um ácido nucléico heterólogo que ele expressa. O promotor pode ser empregado ou sozinho ou em combinação com outros elementos reguladores tal como, por exemplo, realçadores e repressores. Alternativamente, um tal promotor pode ser integrado dentro de um genoma de uma célula hospedeira ou animal, por meio da qual para expressar um gene endógeno no hospedeiro. Um promotor de acordo com a invenção pode ser empregado em um vetor para a expressão de ácidos nucléicos heterólogos. Em certas modalidades, o ácido nucléico heterólogo codifica uma proteína terapêutica. Os exemplos de proteínas terapêuticas incluem, porém não estão limitados a, α-glicosidase, ácido esfingomielinase, insulina, ativador do plasminogênio de tecido, hormônio de estimulação de tirogênio, eritropoietina, glicocerebrosidase, α-galactosidase e vários anticorpos. Os exemplos de anticorpos incluem porém não estão limitados a, anticorpos que ligam membros da família TGF-β tal como, por exemplo, TGF-e-1, 2, e 3.
[0061] Esta invenção também fornece vetores compreendendo um promotor da invenção ou um variante deste que tenha atividade pro
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21/44 motora. Em algumas modalidades, os vetores da invenção incluem um sítio de enzima de restrição adequada à jusante do promotor para a inserção do ácido nucléico heterólogo. Um tal sítio de enzima de restrição pode incluir um sitio de restrição para uma única enzima de restrição ou pode incluir sítios de restrição para uma variedade de enzimas de restrição a fim de facilitar a inserção de muitos ácidos nucléicos heterólogos diferentes. Um vetor de acordo com a invenção pode também conter uma sequência de poliadenilação a jusante do sítio para inserção de um ácido nucléico heterólogo. Os vetores compreendendo os promotores da invenção podem também conter os elementos de DNA procarióticos para a replicação bacteriana e um marcador de seleção de antibiótico para o crescimento e seleção do vetor nas células bacterianas e elementos de DNA adicionais que controlam o processamento de transcrições tal como, por exemplo, sinais de terminação. Os vetores podem também conter sequências de DNA para direcionar a secreção de uma proteína fora das células hospedeiras.
[0062] Em certas modalidades, um vetor contendo uma sequência promotora da invenção é um vetor bicistrônico. Os vetores bicistrônicos são designados, tal que dois ácidos nucléicos possam ser transcritos para produzir uma única transcrição. Uma tal transcrição geralmente contém uma primeira porção que é transladada dentro de uma proteína e uma segunda porção transladada dentro de uma segunda proteína. Uma proteína pode ser uma proteína de interesse tal como, uma proteína terapêutica, e uma segunda proteína podem ser empregadas como um marcador selecionável. Os vetores bicistrônicos geralmente contêm um promotor e um sítio de entrada de ribossomo interno ou IRES posicionado entre os dois ácidos nucléicos. Isto permite a transcrição dos dois ácidos nucléicos como um único mRNA bicistrônico. Deste modo, um vetor pode ser construído o qual inclua um promotor de β-actina da invenção ou um variante deste e um IRES entre os dois
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22/44 ácidos nucléicos heterólogos. Um vetor bicistrônico contendo um promotor de β-actina da invenção ou um variante deste pode ser empregado para expressar uma proteína terapêutica tal como, por exemplo, ácido esfinglomielinase ou α-glicosidase, em conjunto com um gene repórter.
[0063] A invenção também fornece os ensaios para a identificação daquelas variantes de β-actina e promotores de rpS21 da invenção que tenham a atividade promotora. Por exemplo, um promotor da invenção ou variante deste é inserido em um vetor adequado a montante de um gene repórter e a expressão do gene repórter é empregada como um determinante da atividade promotora. Por exemplo, para identificação das variantes dos promotores da invenção que tenham a atividade promotora, uma tal variante é clonada a montante de um gene repórter. Um gene repórter pode codificar uma enzima que catalisa uma reação que produz um sinal visualmente detectável. Os exemplos de tais genes repórteres incluem β-galactosidase e luciferase. Os exemplos de outros genes repórteres incluem fosfatase alcalina, nopalina sintase, octopina sintase, β-glicoronidase, cloremfenicol acetiltransferase. Nos Exemplos apresentados abaixo, um gene repórter codificando uma proteína fluorescente vermelha striata Discosoma (RFP) é empregado para medir a atividade promotora. Aqueles versados na técnica, entretanto, podem usar qualquer gene repórter adequado e técnica de ensaio para determinar a atividade promotora. A expressão de um gene repórter do promotor pode ser ensaiada em um sistema de expressão in vitro ou pode ser intracelular (por exemplo, in vivo).
[0064] A invenção também fornece células hospedeiras que tenham sido transfectadas com um vetor da invenção compreendendo um promotor operavelmente ligados a um gene heterólogo. Uma tal célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou uma célula eu
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23/44 cariótica. As células hospedeiras podem ser ou células in culture ou estar presente em um animal. Os exemplos das células hospedeiras in culture incluem, porém não estão limitadas às células HeLa, células CHO, NS0, células HEK, células BHK, NIH-3T3, células MDCK, e células COS. As células hospedeiras em cultura podem ser crescidas ou em suspensão ou em microportadores, como descrito nos Exemplos. [0065] Muitos métodos adequados podem ser empregados para introduzir os ácidos nucléicos da invenção dentro de uma célula hospedeira. Os vetores compreendendo as sequências promotoras da invenção podem ser introduzidos dentro ou de células procarióticas ou eucarióticas. Os exemplos de técnicas que podem ser empregadas para a introdução de ácidos nucléicos dentro de células eucarióticas incluem, por exemplo, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-Dextran, eletroporação, transfecção mediada por lipossoma, transdução empregando vetores virais, etc.
[0066] Muitos sistemas de expressão adequados podem ser empregados para a produção de proteínas empregando os promotores da invenção. Um tal sistema de expressão emprega um gene de diidrofolato reductase (DHFR) que é introduzido dentro do vetor compreendendo um promotor da invenção ou um variante deste operavelmente ligado a um ácido nucléico heterólogo. Alternativamente, um vetor de expressão expressando DHFR pode ser co-transfectado dentro da célula hospedeira, se uma célula deficiente de DHFR é empregada para expressão. Quando as concentrações crescentes de metotrexato (MTX), um inibidor competitivo da enzima essencial DHFR, são aplicados às células transfectadas, somente as células com níveis de expressão mais elevados de DHFR sobrevivem. Quando os níveis de MTX são aumentados também, somente as células que amplificam o número de cópias do gene DHFR sobrevivem. Desse modo, aumentando-se o número de cópias do vetor compreendendo o promotor, a
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24/44 expressão aumentada do ácido nucléico heterólogo pode ser obtida, por meio da qual induzindo a produção de proteína aumentada. Um segundo sistema de expressão emprega um gene de glutamina sintase (GS) que é introduzido dentro do vetor compreendendo um promotor da invenção ou um variante deste operavelmente ligado a um ácido nucléico heterólogo. A adição de um inibidor competitivo de GS, por exemplo, sulfoximina de metionina (MSX), é empregada para aumentar o número de cópias do vetor induzindo à produção de proteína aumentada.
[0067] Qualquer sistema de expressão procariótica ou eucariótica adequado pode ser empregado para a expressão de proteínas empregando os promotores da invenção. Os exemplos de sistemas de expressão incluem, porém não estão limitados a, células de planta, baculovírus, levedura, bacteriana, drosofila, mamífero e sistemas de expressão livres de célula. Os métodos padrões para a introdução dos vetores de expressão dentro das células de mamíferos, bacterianas, leveduras, inseto e plantas, são fornecidos, por exemplo, por Ausubel (1995), supra.
[0068] Em certas modalidades, os promotores da invenção e variantes destes são empregados nos métodos de terapia de gene. Por exemplo, um promotor da invenção ou um variante deste é clonado dentro de um vetor de terapia de gene viral ou não viral tal que ele esteja operavelmente ligado a um gene de interesse. O promotor direciona a expressão do gene codificando uma proteína terapêutica quando o vetor é liberado a um indivíduo, por exemplo, um paciente humano. [0069] Os seguintes exemplos fornecem as modalidades ilustrativas da invenção. Um dos versados na técnica reconhecerá as numerosas modificações e variações que podem ser realizadas sem alterar o espírito e escopo da presente invenção. Tais modificações e variações são abrangidas dentro do escopo da invenção. Os exemplos de
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25/44 maneira alguma não limitam a invenção.
Exemplos [0070] Os seguintes descrevem os materiais e métodos empregados nos Exemplos subseqüentes.
A. Cultura de células CHO-K1 [0071] As células CHO-K1 foram obtidas de American Type Culture Collection (Manassas, VA) (ATCC, No. CRL-9618). As células foram cultivadas em 250 ml de culturas spinner contendo 15 g/L de microportadores (Whatman, Kent, UK) em meio 925 de cultura de célula com soro de bezerro doador a 10% (DCS) (Invitrogen). As células foram mantidas a 37oC empregando uma sobreposição de 20-40% de O2 e 5% de CO2 e agitadas em aproximadamente 60 rpm durante seis dias. Seguindo o crescimento das células na presença de soro, as culturas foram submetidas a uma substituição de 80% (volume/ volume) diária com meio 925 livre de soro. As células foram desenvolvidas em meio livre de soro durante 11 dias antes da extração do RNA de células. Para a determinação da meia vida do mRNA, 7 mg/ml de actinomicina D foram adicionados às culturas na fase livre de soro.
B. Extração e Análise de RNA [0072] O RNA foi isolado das células CHO-K1 empregando o kit RNAgents de Promega (Madison, WI). A expressão de gene foi analisada por Northern Blot. Para a análise de Northern Blot, 5 pg de RNA foram separados por eletroforese em uma desnaturação de gel de glicoxal/dimetilsulfóxido empregando um kit NorthernMax®-Gly. (Ambion, Austin, TX). O RNA foi subseqüentemente transferido para membranas de náilon (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha). As manchas foram sondadas com as seguintes sondas de gene amplificadas por PCR: Galectina (No. de Acessão GenBank® M96676, nt 14-383); βactina (No. de Acessão GenBank® U20114, nt 238-381); EF-1 (No. de Acessão GenBank® D00522, nt 7-192), rpS21 (No. de Acessão Gen
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Bank® X79059, nt 68-340); ferritina (No. de Acessão GenBank® M99692, nt 182-303) ou um fragmento de desidrogenase de 3-fosfato de glicerildeído comercialmente disponível (GAPDH) (Ambion, Austin, TX). Cada produto de PCR foi radiorrotulado por preparação aleatória. Os iniciadores de PCR para a amplificação de cada dos genes são listados na Tabela 1.
Tabela 1
Gene Iniciador Sequence SEQ ID N°
β-actina Avançado GCTC 1 1 1 CTTCGCCGCTCC 8
β-actina reverso ACCACCCTCCAGCCTTCCC 9
EF-1 Avançado GAACGCAGGTGTTGTGAAAA 10
EF-1 reverso CTCGGCAGCCTCCTTCT 11
rpS21 Avançado GTGGACCTGTACGTGC 12
rpS21 reverso TTCTCAC IIIIAIIIATGAC 13
ferritina Avançado CGCCAGAACTACCACCAGGAC 14
ferritina reverso TTCAGAGCCACATCATCCCG 15
galectina Avançado TGGTCGCAAGCAACCTGAATC 16
galectina reverso TTGAAGTCACCGTCTGCCGC 17
C. Transfecção de células CHO-K1 [0073] Para transfecção transiente, as células CHO-K1 foram semeadas em placas de 6 poços em meio 925 com 10% de soro bovino fetal (FBS) (Invitrogen). As células foram desenvolvidas a 50-75% de confluência antes da transfecção empregando LipofectaminaTM (Invitrogen). O plasmídeo pDsRED-1 (Clontech, Palo Alto, CA) foi cotransfectado com o plasmídeo pSV40-CD20, que codifica um marcador CD20 de superfície de célula empregado para identificar as células transfectadas. Este plasmídeo pDsRED-1 codifica uma proteína fluorescente vermelha striata Discosoma (RFP), a expressão da qual pode
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27/44 ser detectada por FACS. As transfecções foram realizadas como por instruções dos fabricantes. Resumidamente, as células foram incubadas com complexos de lipídeo-DNA durante 16 horas em meio OptiMEMtm livre de soro (Invitrogen). O meio foi substituído com meio 925 com 10 de FBS, e as células foram colhidas 48 horas pós-transfecção.
D. Análise de Classificação de Célula Ativada por Fluorescência [0074] Para análise FACS, 1 x 106 células foram tripsinizadas e lavadas com PBS frio contendo 2% de FBS. As células foram subseqüentemente incubadas com um anticorpo anti-CD20 rotulado com FITC (Pharmingen, San Diego, CA) durante 30 minutos no gelo. As células foram então lavadas com PBS frio contendo 2% de FBS e novamente suspensas em 1 ml de PBS frio/ 2% de FBS. A análise FACS foi realizada empregando FACSaliburTM (BD Biosciences, San Diego, CA). Todos os eventos CD20-positivos foram avaliados quanto à intensidade de fluorescência média de proteína fluorescente vermelha para avaliar a força do promotor.
E. Ensaio de ASM [0075] Os meios de células transfectadas com um vetor codificando o ácido esfingomielinase (ASM) foram incubadas a 37oC com o substrato sintético 2-(N-hexadecanoilamino)-4-nitrofenilfosforilcloro (Calbiochem, San Diego, CA) na concentração de 12,5 mM em 250 mM de acetato de sódio, pH 5,5, contendo 0,1 mM de acetato de zinco, 0,25 mg/ml de albumina de soro bovino (BSA) e 0,15% de Tween
20. As reações foram paradas pela adição de 0,2 M de glicina-NaOH contendo 50% de etanol. A atividade ou quantidade de ASM foi medida pela quantidade de 2-(N-hexadecanoilamino)-4-nitrofenolato produzido empregando um ensaio colorimétrico medindo-se a densidade óptica em 415 nm.
F. Ensaio de GAA [0076] Os meios de células transfectadas com um vetor codifican
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28/44 do α-glicosidase (GAA) foram incubados a 37oC com o substrato sintético p-nitrofenil-D-a-glicopiranosídeo (Sigma, St. Louis, MO) em uma concentração de 40 mM em 50 mM de acetato de sódio, pH 4,3, contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). As reações foram paradas pela adição de 0,3 M de glicina, pH 10,6. A atividade ou quantidade de GAA foi medida pela quantidade de p-nitrofenila produzida empregando um ensaio colorimétrico medindo-se a densidade óptica em 400 nm.
Exemplo 1: Identificação do Promotor de β-Actina em Células CHO-K1 [0077] A Análise Serial da Expressão de Gene (SAGE) foi empregada para analisar o perfil de transcrição total das células CHO-K1 que foram desenvolvidas em uma cultura spinner perfundida livre de soro. [0078] A primeira etapa na SAGE envolveu a síntese do DNA de filamento duplo de mRNA isolado de células CHO-K1 empregando técnicas padrão. O cDNA foi subseqüentemente clivado com uma endonuclease de restrição Nlalll, também chamada uma enzima de ancoramento, que é esperada clivar a maioria das transcrições pelo menos uma vez. A porção 3' de cada cDNA clivado foi isolada ligando-se às contas de estraptavidina. O grupo de cDNA foi então dividido na metade e ligado através do ancoramento do sítio de restrição a um ligador contendo um sítio de endonuclease de restrição tipo II (por exemplo, Fokl). As endonucleases de restrição tipo II clivam em uma distância definida até 20 pares de bases longe de seus sítios de reconhecimento assimétricos. A enzima tipo II é tipicamente chamada uma enzima de rotulação. A clivagem do produto de ligação com a enzima de rotulação resulta na liberação do ligador com pedaços pequenos do cDNA. Uma combinação das enzimas de ancoramento e rotulação produz um rótulo de 10 pares de base, que é único para um gene.
[0079] Empregando este método, os rótulos da sequência para cada gene foram representados pela maioria do sítio Nlalll 3' seguido
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29/44 por uma única sequência de 10 pb. Nos casos onde os rótulos não podem ser designados pelos genes conhecidos, um cDNA de biblioteca de SAGE foi amplificado por PCR empregando o rótulo de SAGE e um iniciador avançado M13 (GTTTTCCCAGTCACGAC, SEQ ID N°: 18). Os produtos de PCR foram subseqüentemente clonados dentro do vetor pCR2.1 (Invitrogen) e seqüenciados empregando técnicas padrão. A identificação dos genes foi com base na homologia da sequência dos produtos de PCR para conhecer as sequências em GenBank® (www.ncbi.nim.nih.gov/qenbank).
[0080] Um alinhamento BLAST® (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) de sequências de nucleotídeo para suas contrapartes de rato e/ou camundongo foi realizado para identificar o gene do qual o rótulo foi derivado. Dos dezesseis rótulos mais abundantes identificados nesta análise (Tabela 2), o gene para todos com a exceção de um rótulo foi identificado. Desses quinze genes identificados, cinco foram mitocondriais na origem e três foram elementos repetitivos nucleares. A ocorrência de cópias múltiplas desses genes em cada célula foi a causa provável de sua abundância na produção de SAGE. Tais sequências não foram consideradas para outra avaliação.
Tabela 2
Abundância Rótulo Gene SEQ ID N°: Identifica- do
38 CATGGAAGCAGAAT Repetição de Alu 19 J00052
33 CATGCAGGAGCTTC Mito COX I 20 PCR
27 CATGGGGGAGCGTT Proteína S21 ribossômica 21 PCR
27 CATGGTACTGACAC Mito COX III 22 PCR
20 CATGGCCTCCAAGG GAPDH 23 X52123
20 CATGATAATACGTA Mito ATPase 6 24 M14311
19 CATGCCI I IAAICC Repetição B-1 25 PCR
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Abundância Rótulo Gene SEQ ID N°: Identifica- do
18 CATGAATCGGAGGC Mito Citocroma B 26 J01436
18 CATGAGGCAGACAG EF-1 27 D00522
18 CATGGCGGCA- GACG Galectina (L-14) 28 M96676
16 CATGGTGGCTCACA Repetição de Alu 29 J00056
15 CATGTTGGCTGCCG Cadeia Pesada de ferritina 30 M99692
14 CATGCCCTGTGCCG Nenhum par 31
13 CATGAGAGCGAAGT Proteína L41 ribossômica 32 X82550
13 CATGAGGAGGCCTA NADH desidrogenase mitocondrial 33 PCR
12 CATGCCCTGAGTCC β-Actina 34 AF014363
[0081] Empregando este método, os promotores de quatro genes foram identificados como sendo os mais ativos nas células CHO-K1. Esses promotores foram: β-actina, proteína S21 ribossômica (rpS21), fator 1 de alongamento (EF-1), e 3-fosfato desidrogenase de gliceraldeído (GAPDH). Os níveis elevados desses mRNAs nas células CHOK1 podem ser ou devido à atividade do promotor de seus respectivos promotores ou devido à estabilidade inata dos mRNAs. Embora a análise SAGE forneça uma quantificação dos níveis de estado estável total para os mRNAs para genes, ela não distingue entre a atividade promotora do gene e a estabilidade do mRNA como a base da expressão elevada do mRNA. Desse modo, a fim de distinguir entre as duas possibilidades, a meias vidas dos mRNAs foram medidas. Resumidamente, a expressão dos genes candidatos foi avaliada pela análise de Northern Blot das células CHO-K1 em culturas spinner em pontos variantes seguindo o tratamento de células com actinomicina D.
[0082] Inicialmente, os genes rpS21, GAPDH e EF-1 foram analisados, e foram todos constatados terem mRNAs relativamente está
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31/44 veis, com meias vidas maiores do que 8 horas. Esses resultados sugeriram que a abundância maior desses mRNAs resultou da estabilidade maior dos mRNAs e não necessariamente das atividades maiores dos respectivos promotores.
[0083] A meia vida de mRNAs de galectina, ferritina, e β-actina foi também medida por análise de Northern Blot, como descrito acima, em 0, 4, 8, 10, e 15 horas seguindo o tratamento das células com actinomicina D. Um Northern Blot representativo é mostrada na Figura 6A. Os níveis de mRNA relativos são representados graficamente na Figura 6A. Os níveis de mRNA relativos são representados graficamente na Figura 6B. Esses dados mostram que embora ambas galectina e ferritina tenham meias vidas maiores do que 8 horas, o mRNA de βactina renovou-se mais rapidamente com uma meia vida de aproximadamente 6 horas. Desse modo, a contribuição relativa da força do promotor para os níveis de mRNA de estado estável total foi maior para β-actina do que os outros candidatos em células CHO-K1. Conseqüentemente, sob essas condições, o promotor de β-actina pode ser caracterizado como um promotor forte.
Exemplo 2: Isolamento e Caracterização dos Promotores de rpS21 e βactina de Hamster.
[0084] Levando em consideração os resultados descritos no Exemplo 1, o candidato com a maior abundância (rpS21) e o candidato com a renovação de mRNA mais rápida (β-actina) foram selecionados para outro estudo. Uma biblioteca genômica λ FIX II CHO-K1 (Stratagene, LaJolla, CA) foi avaliada para isolar os DNAs genômicos para promotores de rpS21 e β-actina de hamster.
[0085] A fim de isolar os clones genômicos de rpS21 e β-actina, as cepas bacterianas de E. coli, MRA XL1-Azul (P2) foram desenvolvidas em meio LB contendo 10 mM de sulfato de magnésio e 0,2% de mal
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32/44 tose. As células bacterianas foram pelotadas e novamente suspensas em 10 mM de sulfato de magnésio em uma leitura de absorbância de 0,5 em 600 nm. Aproximadamente um milhão de fago da biblioteca foram incubados com as células bacterianas durante 15 minutos em 37oC. A agarose fundida foi adicionada à mistura de fago/ bactérias e as bactérias foram sobrepostas em placas BioAssay contendo Agar (Nunc, Rochester, NY). Seguindo a têmpera da agarose de topo, as placas foram invertidas e desenvolvidas a 30oC durante a noite. As placas foram subseqüentemente esfriadas e sobrepostas duas vezes com filtros de náilon Genescreen PlusTM (Perkin Elmer Life Sciences, Wellesley, MA). Os filtros de náilon foram desnaturados durante 2 minutos em 0,1 M de hidróxido de sódio com 1,5 M de cloreto de sódio e subseqüentemente neutralizados. Os filtros foram sondados e reticulados por UV.
[0086] Uma sonda empregada para o isolamento do promotor de β-actina de hamster foi derivada de PCR aleatório da extremidade 5' do gene de β-actina (nt 238-381 de No. de Acessão GenBank® U20114). Uma sonda empregada para o isolamento do promotor de rpS21 de hamster foi derivada por PCR empregando os iniciadores apresentados na SEQ ID N-: 12 e 13. Os fagos de hibridização para ambos promotores de rpS21 e β-actina foram purificados empregando técnicas padrão. O DNA do fago isolado dos lisados de fago foi purificado por extrações seqüenciais com clorofórmio, fenol, fenol/ clorofórmio (1:1), e finalmente, clorofórmio.
[0087] Para o isolamento dos promotores de gene de β-actina de hamster, seguindo a precipitação de etanol, o DNA foi digerido com enzimas de restrição que tiveram os sítios na posição 5' do gene de hamster de β-actina e submetidas a Southern Blot empregando a mesma sonda que foi empregada para avaliar a biblioteca genômica. [0088] Empregando este método, um fragmento Avrii de aproxi
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33/44 madamente 7 kb e um fragmento Sall de aproximadamente 5,5 kb foram gerados, ambos dos quais hibridizados pela sonda. Esses foram subseqüentemente clonados dentro de plasmídeos pBluescript II KS (Stratagene). O fragmento AvrII de 7 kb tem o No. de Referência de ATCC PTA-5309, depositado em 3 de julho, de 2003 com a American Tissue Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, U.S.A.
[0089] Os plasmídeos contendo fragmentos Avrll e Sall foram digeridos com Sfol para remover a extremidade 3' dos fragmentos que continham uma porção da estrutura de leitura aberta do gene de β-actina. Esses fragmentos foram então clonados dentro do plasmídeo pDsRED-1 (Clontech) para criar as construções denominadas pDsREDAvr (6,5 kb) e pDsRED-Avr (5,1 kb). A fim de gerar uma construção contendo todo íntron 1 do gene de β-actina, o PCR foi realizado empregando os seguintes iniciadores:
[0090] Avançados: AGGCCCAGCTTGGGACCAAGACAGAA (SEQ ID N°: 35) [0091] Reverso: CGCGGATCCGGCGAACTATATCAGGGC (SEQ
ID N°: 36).
[0092] O fragmento de PCR gerou dois produtos: um produto predito de aproximadamente 7 kb e um produto de 3 kb inesperado menor. Ambos desses produtos de PCR foram clonados no plasmídeo pDsRED-1 (Clontech) para gerar as construções pDsRED-Avr(1)-7 e pDsRED-Avr(1)-3.
[0093] Cada dos fragmentos do promotor de hamster de β-actina que foi clonado dentro do plasmídeo pDsRED-1 (Clontech) foi transfectado dentro das células CHO-K1. As forças do promotor relativas de cada dos fragmentos do promotor de β-actina de hamster foram medidos empregando FACS como descrito acima. Os resultados dos ensaios da atividade são sumarizados abaixo.
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34/44 [0094] O fragmento Avr(1)-3 do promotor de β-actina que abrange de nt -1970 ao nt +1037 exibiu a atividade promotora mais elevada. O fragmento Avr(1)-7 que abrange de nt -6000 ao nt + 1037 exibiu uma atividade que foi 47% da atividade exibida por Avr(1)-3. Os fragmentos de Avr (6,5 Kb), Sal (5,1 Kb), Actina (3 kb), e Actina-P (2,8 kb) exibiram somente 2%, 2%, 2% e 0% da atividade promotora, respectivamente, quando comparados com o fragmento Avr(1)-3.
[0095] O fragmento Avr(1)-3 foi subseqüentemente seqüenciado, e a sequência é apresentada na SEQ ID N°: 1. Adicionalmente, a região 660 nt a jusante da 5' de Avr(1) 3 foi também seqüenciada. Esta sequência mais longa de nt -2622 ao nt +1037 é apresentada na SEQ ID N°: 7.
[0096] Para o isolamento do promotor rpS21, seguindo o isolamento do DNA do fago de hibridização, o DNA foi amplificado por PCR empregando os seguintes parâmetros:
[0097] Avançado: AGCTCTAATACGACTCACTATAGGGC (SEQ
ID N°: 40) [0098] Reverso: CTCTAGGCCAGCGGAGCGCAG (SEQ ID N°:
41).
[0099] O produto de PCR foi clonado no vetor PCR2.1 (Invitrogen) e subsequentemente seqüenciado. A sequência de nucleotídeo do promotor rpS21 de hamster é mencionada na SEQ ID N°: 39. O promotor foi excisado empregando-se sítios EcoRI flanqueando os sítios de clonagem e clonado no vetor pDsRED1-1 (Clontech). A sequência promotora de rpS21 de hamster de 2 kb tem Número de Referência ATCC PTA-6194, depositado em 5 de agosto de 2005, com a Coleção de Cultura de Tecido Americana, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, U.S.A.
Exemplo 3: Comparação Funcional dos Promotores CMV e β-Actina de Hamster.
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35/44 [00100] A atividade promotora de Avr(1)-3 foi comparada àquela do promotor precoce imediato de CMV (Invitrogen) e o promotor EF-1 humano (Invitrogen).
[00101] As células CHO-K1 foram transitoriamente transfectadas com plasmídeo pDsRED-1 contendo ou ASvr(1)-3, o promotor precoce imediato de CMV , ou o promotor EF-1 humano, cada qual operavelmente ligado ao gene de RFP. A expressão de RFP foi avaliada por FACS 48 horas após a transfecção.
[00102] Como mostrado na Figura 7A, em células transfectadas com Avr(1)-3, a sequência promotora de β-actina (SEQ ID N°: 1) mostrou um nível mais elevado de expressão de RFP quando comparado aos promotores CMV ou EF-1. Em particular, a expressão foi aproximadamente duas vezes maior comAvr(1)-3 do que como o promotor.
[00103] A fim de determinar se seu perfil de expressão observado é sustentável nos transfectantes estáveis, as células CHO-K1 transfectadas foram selecionadas durante duas semanas com G418TM. A expressão de RFP nos grupos sobreviventes das células foi então avaliada. Como descrito na Figura 7B, similarmente às células transfectadas transientes, a expressão de RFP mais elevada foi observada nas células transfectadas com Avr(1)-3, a sequência de promotor de βactina apresentada na SEQ ID N°: 1.
Exemplo 4: Atividade do Promotor de β-actina de Hamster em células BHK-21 e HEK293 [00104] A atividade do promotor de β-actina de hamster foi comparada com aquela do promotor de CMV em células BHK-21 (No. de ATCC CCL 10) e KEK293 (N° de ATCC CRL-1573) empregando ensaios de transfecção estável como descrito no Exemplo 3. Como observado anteriormente nas células CHO-K1, a expressão de RFP em células BHK-21 foi significantemente mais elevada quando empregando o promotor de β-actina ao invés do promotor de CMV (Tabela 3).
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Nas células HEK293, o promotor de β-actina de hamster resultou na expressão de RFP em níveis aproximadamente equivalentes àqueles do promotor de CMV.
Tabela 3
Linhagem celular Promotor de CMV Promotor de β-actina
BHK-21 8,3 ± 0,4 121 ± 99,8
HEK293 139 ± 9,9 102 ± 8,3
Exemplo 5: Promotores de β-actina de Rato e Camundongo [00105] As bases de dados publicamente disponíveis de sequências de nucleotídeo foram pesquisadas empregando ajustes padrão para homólogos potenciais da sequência de promotor de β-actina apresentada na SEQ ID N°:1.
[00106] A porção 5' de um gene de hamster de β-actina (No. de Acessão de GenBank® U21104; SEQ ID N°: 4) exibe 98% de identidade para a porção 3' da sequência de promotor de β-actina de hamster. Esta homologia, entretanto, é somente 40% sobre o comprimento total da sequência promotora de β-actina de hamster apresentada na SEQ ID N°: 1. Nenhuma atividade promotora é conhecida para esta porção.
[00107] Os promotores de β-actina anteriormente conhecidos: humano (No. de Acessão de GenBank® gi28337A) e frango (No. de Acessão de GenBank® gi2170437) foram alinhados com o promotor de β-actina de hamster para a determinação da homologia com o programa BLAST® empregado os ajustes padrões. As sequências de promotor de β-actina humana e de frango tiveram somente 10% e 1% de identidade, respectivamente, para o promotor de β-actina de hamster (SEQ ID N°: 1).
[00108] Um supercontig genômico de rato (Rattus norvegcus) (No. de Acessão de BankGene® NW_042778) foi identificado no cromossomo 12 do genoma do rato como contendo uma sequência de nucleotídeo tendo uma identidade de 67% sobre o comprimento total da
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SEQ ID N°: 1.
[00109] Similarmente, um contig (No. de Acessão de GenBank® NT_039324) foi identificado no cromossomo 5 do genoma do camundongo (Mus musculus) como tendo uma identidade de 80% sobre o comprimento total da SEQ ID N°: 1.
[00110] Os alinhamentos de sequência do promotor de β-actina de hamster (SEQ ID N°: 1) com a sequência de gene de hamster, e os promotores de β-actina de humano, frango, rato e camundongo são descritos nas Figuras 3, 4, 5, 1 e 2 respectivamente.
Exemplo 6: Atividades dos Promotores de β-actina de Rato e Camundongo.
[00111] As sequências de promotor de rato e camundongo, apresentadas nas SEQ ID N-: 2 e 3, respectivamente, são clonadas dentro dos plasmídeos pDsRED-1 (Clontech). O promotor de CMV é também clonado a jusante do gene de RFP no plasmídeo pDsRED-1. Esses plasmídeos são transfectados dentro da célula CHO-K1, ou outra linhagem celular. A expressão do RFP é avaliada por FACS 48 horas pós-transfecção.
[00112] As células transfectadas com o promotor de β-actina de camundongo ou rato são esperadas mostrar uma expressão de RFP mais elevada do que o promotor de CMV sob condições similares.
Exemplo 7: Expressão de Proteínas Empregando o Promotor de βactina de Hamster.
[00113] Para também avaliar a atividade do promotor de β-actina de hamster, um sistema de expressão utilizando a seleção de diidrofolato reductase (DHFR) e amplificação de metotrexato (MTX) foi empregado. O vetor pGZ6 foi derivado do plasmídeo pCLHAXSV2DHFR, a fim de conter o promotor de β-actina de hamster de 3 kb (SEQ ID N°: 1) além de um gene DHFR sob i controle do promotor precoce SV40. O plasmídeo pCLHAXSV2DHFR foi anteriormente descrito por Cole e
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38/44 outros (1993) Biotechnology, 11: 1014-1024. Resumidamente, o promotor de metalotionina (MT) no vetor pCLHAXSV2DHFR foi substituído com o promotor de β-actina para criar o vetor de pGZ6. Os cDNAs para duas proteínas de interesse terapêutico, ácido esfingomileinase (ASM) e α-glicosidase (GAA) foram operavelmente ligados ao promotor de β-actina de hamster. O cDNA de ASM foi obtido através da sociedade IMAGE™ (No. de Acessão de GenBank® AI587087). O cDNA para GAA foi obtido de Dr. Martinuik na New York University School of Medicine. As sequências de nucleotídeo dos cDNAs de ASM e GAA são apresentadas nas SEQ ID N-: 37 e 38, respectivamente. Similarmente, os dois cDNAs foram também clonados a montante do promotor de CMV em um vetor contendo o mesmo cassete de expressão de DHFR. A linhagem celular CHO-K1 deficiente de DHFR DXB11 foi transfectada em triplicata com ambos grupos de vetores de expressão. Após duas semanas de seleção em meios deficientes de nucleotídeo contendo 20 nM de MTX, um grupo não clonado heterogêneo de células foi lavado com PBS e transferido para os meios livres de soro. Vinte e quatro horas depois, os níveis de ASM ou GAA nos meios foram medidos. Os resultados de um tal experimento são demonstrados nas Figuras 8A e 8B. Os níveis de ASM gerados do promotor de β-actina de hamster nos grupos estáveis foram de 2 a 15 vezes maiores do que com o promotor de CMV, e no caso dos grupos de GAA, 2 a 15 vezes maiores.
[00114] Os grupos estáveis foram também empregados para avaliar a capacidade do promotor de β-actina de prolongar a expressão de proteína a longo prazo. Tipicamente, para produção industrial de proteínas, a expressão elevada é obtida selecionando-se células com um número de cópias de gene mais elevado através de um processo que envolve aumentar o número de etapas de seleção e/ou concentração de MTX. A fim de determinar se uma expressão mais elevada pode ser
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39/44 obtida através desta estratégia com o promotor de β-actina (SEQ ID N°: 1), os grupos de ASM inicialmente selecionados em 20 nM de MTX foram amplificados por seleção durante duas semanas em níveis mais elevados dez vezes de MTX (200 nM). Como resumido na Tabela 4, dois dos três grupos de β-actina testados mostraram níveis 2-3 vezes maiores de ASM após a amplificação relativa para os grupos de 20 nM de iniciação. Em contraste, somente um dos grupos de CMV testado mostrou níveis mais elevados do que grupo de 20 nM, do qual ele foi derivado. Entre os seis grupos de ASM gerados com qualquer dos dois promotores, o grupo de β-actina de expressão mais elevada gerou seis vezes a quantidade de ASM obtida com o grupo de expressão mais elevado gerado com o promotor de CMV. Isto demonstra que, pelo menos sob as condições testadas, o promotor de β-actina de hamster é superior ao promotor de CMV.
Tabela 4
Grupo Expressão de ASM em 20 nM de MTX Expressão de ASM em 200 nM de MTX
Grupo A de CMV-ASM 4,3 8,2
Grupo B de CMV-ASM 16,9 9,5
Grupo C de CMV-ASM 3,6 3,7
Grupo A de β-actina- ASM 33,5 100,0
Grupo B de β-actina- ASM 59,3 27,9
Grupo C de β-actina- ASM 45,6 90,5
[00115] Em um experimento separado, o promotor de β-actina de hamster foi empregado para expressar a proteína ativadora de plasminogênio de tecido (tPA), que é um agente trombolítico empregado em pacientes para dissolver os coágulos de sangue. As células CHO-DXB 11 foram transfectadas com um vetor de expressão pGZ6-tPA no qual o promotor de β-actina de hamster está operavelmente ligado ao gene tPA. Os transfectantes estáveis foram selecionados por crescimento
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40/44 em meio deficiente não clonado contendo 2000 nM de MTX. O grupo resultante de células não clonadas foi então submetido a 500 nM de MTX para amplificar o número de cópias de transgene. Este grupo de células foi removido de MTX, expandido e semeado em 2 microportadores CytoporeTM em uma cultura spinner de 1 litro. As células foram desenvolvidas durante 7 dias em um meio contendo soro. Durante os próximos 4 dias, o soro foi removido por alterações de 80% diárias com meio livre de soro. Os meios colhidos foram então coletados durante 15 dias e analisados quanto à expressão de tPA empregando um kit ELISA comercialmente disponível (kit tPA TintElize®, Biopool International, Inc., Ventura, CA). Como descrito na Figura 9 deste experimento, o uso do promotor de β-actina de hamster resultou na expressão de tPA em uma concentração de cerca de 30 mg/L por dia. Este resultado se compara favoravelmente com os relatos recentemente publicados nos quais cerca de 30-40 mg/L de tPA foi produzido após 4-8 dias empregando outros promotores (Senger e outros, (2003) Biotechnology Progress 19: 1199-1209; Dowd e outros (2000) Biotechnology Progress 16:786-794).
Exemplo 8: Produção de Anticorpos Empregando o Promotor de βactina de Hamster.
[00116] A fim de produzir um anticorpo para um membro da família de TGF-β, o ácido nucléico codificando ou uma cadeia leve de anticorpo anti-TGF-β ou uma cadeia pesada de anticorpo TGF-β é clonado a montante do promotor de β-actina em dois vetores de expressão separados pGZ6.
[00117] A linhagem celular CHO-K1 deficiente de DHFR DXB11 é transfectada em cujos ambos vetores de expressão. Após duas semanas de seleção em meios deficientes de nucleotídeo contendo MTX, os níveis de anticorpo anti-TGF-β, incluindo ambas a cadeia leve e a cadeia pesada, são medidos nos meios.
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Exemplo 9: Expressão das Proteínas Empregando o Promotor rpS21 de Hamster.
[00118] A atividade promotora rpS21 de hamster foi comparada com a atividade promotora de β-actina de hamster para a expressão em célula CHO-DXB11. As células CHO-DXB11 foram transfectadas com os vetores de expressão contendo α-glicosidase humana (rhGAA) operavelmente ligada ou ao promotor rpS21 de hamster de SEQ ID N°: 39 (pGZ3IC-GAA) ou ao promotor de β-actina de hamster de SEQ ID N°: 1 (pGZ6IC-GAA). Em ambos casos o gene rhGAA foi ligado ao gene codificando um marcador de superfície celular (CD20) através de uma sequência de sítio de entrada de ribossomo interno (IRES). Após a seleção das células com 0,2 μΜ de MTX em meio deficiente de nucleotídeo, as células foram rotuladas com um anticorpo conjugado com FIT para CD20 e classificadas por FACS quanto aos clones de expressão elevada. As células selecionadas foram semeadas em placas de 96 poços e expandidas para avaliação da expressão de rhGAA. 38 clones foram analisados para o promotor rpS21 de hamster, e 29 clones foram analisados para o promotor de β-actina de hamster. A Tabela 5 mostra a distribuição de faixas de expressão nos clones resultantes para ambos os promotores.
Tabela 5
Vetor < 2 pg/ célula/ hora de expressão de GAA 2-5 pg/ célula/ hora de Expressão de GAA 5-8 pg/ célula/ hora de Expressão de GAA 8-10 pg/ célula/ hora de Expressão de GAA
pGZ3IC-GAA 16% 50% 26% 8%
pGZ6IC-GAA 52% 34% 14% 0%
[00119] Em um experimento separado, o promotor rpS21 de hamster foi empregado para expressar ASM em células CHO-DXB11. A atiPetição 870170043760, de 26/06/2017, pág. 47/58
42/44 vidade do promotor rpS21 foi comparada com as atividades de ambos promotores de β-actina e CMV. As células CHO-DXB11 foram transfectadas em triplicata e ou selecionadas diretamente em 200 nM de MTX, ou inicialmente selecionadas em 20 nM de MTX e em seguida amplificadas durante duas semanas em 2000 nM de MTX, como descrito no Exemplo 7. Os níveis de ASM foram medidos nos meios como descrito. A expressão de ASM nas células não transfectadas foi indetectável.
[00120] Como resumido na Tabela 6, todos três grupos rpS21 mostraram níveis 2 a 3 vezes maiores de ASM após a amplificação relativa ao s grupo de 20 nM de iniciação, dos quais eles foram derivados. Além disso, os níveis de ASM gerados foram mais elevados do que os níveis gerados com o promotor de CMV (Exemplo 7).
Tabela 6
Grupo Expressão de ASM nU/ célula/ 24 horas (em 20 nM de MTX) Expressão de ASM nU/ célula/ 24 horas (em 200 nM de MTX)
Grupo A de rpS21-ASM 12 34
Grupo B de rpS21-ASM 13 30
Grupo C de rpS21-ASM 16 41
[00121] Os níveis de expressão de ASM gerados com a seleção dos grupos diretamente em 200 nM de MTX são sumarizados na Tabela 7.
Tabela 7
Grupo Expressão de ASM
Grupo A de CMV-ASM 38
Grupo B de CMV-ASM 193
Grupo C de CMV-ASM 44
Grupo A de β-actina- ASM 381
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Grupo Expressão de ASM
Grupo B de β-actina- ASM 125
Grupo C de β-actina- ASM 515
Grupo A de rpS21-ASM 342
Grupo B de rpS21-ASM 60
Grupo C de rpS21-ASM 51
[00122] Os níveis de ASM gerado do promotor de rpS21 de hamster em 200 nM de MTX foram em média cerca de 1 a 2 vezes maiores do que aqueles com o promotor de CMV. Os níveis de ASM gerado do promotor de β-actina, pro outro lado, fora em média cerca de 3 a 4 vezes maiores do que aqueles com o promotor de CMV. Desse modo, o promotor de rpS21 foi pelo menos tão ativo quanto o promotor de βactina quando empregado para expressar GAA, entretanto, exibiu atividade menor do que o promotor de β-actina quando empregado para expressar ASM. Ambos promotores, entretanto, foram mais ativos do que o promotor de CMV.
[00123] O relatório descritivo é mais completamente entendido levando em consideração os ensinamentos das referencias citadas no relatório descritivo, que estão por meio das quais incorporadas por referência. As modalidades no relatório descritivo fornecem uma ilustração das modalidades da invenção e não devem ser interpretadas para limitar o escopo da invenção. O técnico versado facilmente reconhece que muitas outras modalidades são abrangidas pela invenção. Todas as publicações e patentes citadas e sequências identificadas pelos números de referência da base de dados ou acessão nesta descrição são incorporados por referência em sua totalidade. Na medida em que o material incorporado por referência contradiz ou é inconsistente com o presente relatório descritivo, o presente relatório descritivo super cederá qualquer tal material. A citação de qualquer referência aqui não é uma admissão de que tais referências são técnicas anteriores à prePetição 870170043760, de 26/06/2017, pág. 49/58
44/44 sente invenção.
[00124] A menos que de outro modo indicado, todos os números expressando quantidades de ingredientes, cultura de célula, condições de tratamento, e assim por diante empregados no relatório descritivo, incluindo, reivindicações, são para serem entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo cerca de. Conseqüentemente, a menos que de outro modo indicado ao contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podem depender muito das propriedades desejadas procuradas ser obtida pela presente invenção. A menos que de outro modo indicado, o termo pelo menos precedendo uma série de elementos é para ser entendido referir-se a cada elemento na série. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar empregando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes são destinados a serem abrangidos pelas seguintes reivindicações.

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência promotora como definida em SEQ ID N°: 1, em que o ácido nucleico é operacionalmente ligado a um ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína.
  2. 2. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico isolado como definido na reivindicação 1.
  3. 3. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico heterólogo codifica uma proteína terapêutica.
  4. 4. Vetor de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é selecionada do grupo consistindo em esfingomielinase, α-glicosidase, e ativador de plasminogênio de tecido.
  5. 5. Método de produzir uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) cultivar uma célula hospedeira transfectada com o vetor como definido na reivindicação 2; e (b) recuperar a proteína.
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se a um membro das família TGF-β.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma proteína terapêutica.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é selecionada do grupo consistindo em ácido esfingomielinase, α-glicosidase, e ativador de plasminogênio de tecido.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de mamífero.
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