ES2469676T3

ES2469676T3 - Complejos moleculares dim�ricos

Info

Publication number: ES2469676T3
Application number: ES07725501.6T
Authority: ES
Inventors: Tara Heitner; David Light; Kirk Mclean; Renate Parry; Noboru Satozawa; Douglas Schneider; Marian Seto
Original assignee: Bayer Intellectual Property GmbH
Current assignee: Bayer Intellectual Property GmbH
Priority date: 2006-05-25
Filing date: 2007-05-24
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2027-05-24
Also published as: EP2027153B1; WO2007137760A3; US8501185B2; WO2007137760A2; EP2027153A2; EP2799449A1; US20110104058A1; JP5189082B2; JP2010527578A

Abstract

Un complejo molecular dimérico que comprende una primera y una segunda proteína de fusión, en el que cada proteína de fusión comprende de su extremo N a C: (A) un resto efector biológico seleccionado del grupo que consiste en: (1) un anticuerpo monocatenario; (2) un fragmento Fab; (3) un dominio extracelular de un receptor de membrana de tipo I; (4) una citocina; (5) una quimiocina; (6) una enzima; (7) una toxina; y (8) un marcador detectable; (B) una región bisagra de una molécula de IgG unida al resto efector biológico; y (C) un dominio de dimerización CH4 de una molécula de IgE covalentemente unido a la región bisagra, en el que el complejo molecular comprende un enlace disulfuro entre un residuo de cisteína en la región bisagra de la primera proteína de fusión y un residuo de cisteína en la región bisagra de la segunda proteína de fusión.

Description

Complejos moleculares dim�ricos

Resumen de la invención

La presente invención proporciona complejos moleculares dim�ricos que comprenden una primera y segunda proteína

5 de fusión, en los que cada proteína de fusión comprende de su extremo N a C (a) un resto efector biológico, (b) una región bisagra de una molécula de IgG unida al resto efector biológico y (c) un dominio de dimerizaci�n CH4 de una molécula de IgE covalentemente unido a la región bisagra, en los que el complejo molecular comprende un enlace disulfuro entre un residuo de ciste�na en la región bisagra de la primera proteína de fusión y un residuo de ciste�na en la región bisagra de la segunda proteína de fusión.

10 Restos efectores biológicos preferidos son un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab, un dominio extracelular de un receptor de membrana de tipo I, una citocina, una quimiocina, una enzima, una toxina o un marcador detectable. Restos efectores biológicos más preferidos son un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab, una toxina o un marcador detectable.

En una realización, el complejo molecular dim�rico de la invención comprende dos proteínas de fusión que

15 comprenden cada una restos efectores biológicos idénticos. En otra realización, las dos proteínas de fusión dentro del complejo comprenden cada una diferentes restos efectores biológicos. En una realización preferida, los restos efectores biológicos son sitios de unión al ant�geno, con tanto las mismas especificidades de unión como diferentes.

Cada proteína de fusión comprende una región bisagra que comprende los residuos de amino�cidos 223 a 243 de SEC ID N�: 25, en la que las posiciones 240-243 est�n ocupadas por el tetrap�ptido VFLF. En realizaciones preferidas,

20 el tetrap�ptido VFLF se sustituye con un tetrap�ptido seleccionado del grupo que consiste en DSEY, KSKY, DEEY y KRKY. Son más preferidas realizaciones en las que el tetrap�ptido es DSEY o KSKY.

En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión que comprenden los complejos moleculares dim�ricos. En una realización, una molécula de ácido nucleico codifica la proteína de fusión de SEC ID N�: 1.

25 En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen los complejos moleculares dim�ricos objeto.

Breve descripción de las figuras

FIGS. 1A-D. Dibujos esquemáticos de diversos complejos moleculares dim�ricos. En cada caso, enlaces disulfuro se forman entre las ciste�nas en la región bisagra de las proteínas de fusión que comprenden el complejo. FIG. 30 1A, un complejo molecular dim�rico en el que el resto efector biológico es un anticuerpo monocatenario. FIG. 1B, dos complejos moleculares dim�ricos monoespec�ficos en los que el resto efector biológico es un fragmento Fab; los complejos se diferencian entre s� en la secuencia usada para sustituir el tetrap�ptido VFLF “natural” dentro de la bisagra. FIG. 1C, un complejo molecular dim�rico biespec�fico en el que los restos efectores biológicos son dos fragmentos Fab diferentes y en el que cada proteína de fusión comprende además una variante de corte y

35 empalme de IgE M2" diferente en su extremo C (SEC ID N�: 26 y 27). FIG. 1D, un complejo molecular dim�rico en el que el resto efector biológico es un dominio extracelular de un receptor de membrana de tipo I.

FIG. 2. Esquema que muestra la generación del anticuerpo monocatenario 19G9scFv. Las regiones VH y VL se amplificaron por PCR usando cebadores que introdujeron sitios de restricción y sitios para solapar la extensión del ligador de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID N�: 8). Tras 15 ciclos de extensión, scFv se amplificó con

40 los cebadores directos e inversos originales mostrados durante 35 ciclos y luego se clon� por digestión con restricción en el vector de expresión bacteriano pz613. Cebador directo de VH, SEC ID N�: 15; cebador inverso de VH, SEC ID N�: 16; cebador directo de VL, SEC ID N�: 17; cebador inverso de VL, SEC ID N�: 18.

FIG. 3A-B. Esquemas que muestran la construcción de construcciones del dominio de dimerizaci�n CH4 de IgE usadas para preparar el complejo molecular dim�rico que contiene el anticuerpo monocatenario 19G9scFv. FIG. 45 4A, construcción de un dominio de dimerizaci�n CH4 de IgE fusionado con una bisagra de IgG1. Cebador de ATG001, SEC ID N�: 9; cebador de ATG003, SEC ID N�: 11; cebador de ATG004, SEC ID N�: 12; cebador de ATG006, SEC ID N�: 13. FIG. 4B, construcción de un dominio de dimerizaci�n CH4 de IgE fusionado con una bisagra de IgG con cuatro amino�cidos mutados para crear una bisagra más hidrófila (cebador de ATG019, SEC ID N�: 14). La inserción muestra la secuencia alrededor del sitio de mutación que incluye tanto la secuencia de

50 amino�cidos, amino�cidos 252-281 de SEC ID N�: 1, como la secuencia de nucleótidos (nucleótidos 783-869 de SEC ID N�: 2).

FIGS. 4A-B. Secuencias de dos proteínas de fusión 19G9scFv. FIG. 5A, la secuencia de amino�cidos en la parte inferior (SEC ID N�: 3) y la secuencia de ácidos nucleicos en la parte superior (SEC ID N�: 4) de la proteína de fusión 19G9scFv “natural” contienen las regiones VH, cursiva negrita; ligador de scFv, cursiva negrita subrayado; extensión de VL y del extremo C, negrita; bisagra de IgG, cursiva, con tetrap�ptido “natural” subrayado en negrita; CH4 de IgE, sencillo; marca de ep�tope del extremo C, subrayado cursiva. FIG. 5B, la secuencia de amino�cidos

5 en la parte inferior (SEC ID N�: 1) y secuencia de ácidos nucleicos en la parte superior (SEC ID N�: 2) de la proteína de fusión 19G9scFv “mutante” contiene las regiones VH, cursiva en negrita; ligador de scFv, cursiva en negrita subrayado; extensión de VL y del extremo C, negrita; bisagra de IgG, cursiva, con sustitución de tetrap�ptidos hidrófilos subrayado en negrita; CH4 de IgE, sencillo; marca de ep�tope del extremo C, subrayado cursiva.

10 FIG. 5A-B. Caracterización de un complejo molecular dim�rico purificado que comprende dos proteínas de fusión que contienen el anticuerpo monocatenario 19G9scFv (algunas veces denominado complejo molecular dim�rico 19G9scFv). FIG. 6A, perfil de cromatograf�a de exclusión por tamaño (SEC), que indica que la proteína pura es principalmente un d�mero (�90 kDa basado en tiempos de eluci�n de patrones de peso molecular). FIG. 6B, el análisis de SDS-PAGE de proteína de fusión 19G9scFv no reducida (carriles 2 y 3, que contienen 2 μl y 5 μl de

15 proteína, respectivamente) y proteína de fusión 19G9scFv reducida (carriles 5 y 6, que contienen 2μl y 5 μl de proteína, respectivamente) est� de acuerdo con el peso molecular calculado del complejo dim�rico (85,4 kDa) y del mon�mero de la proteína de fusión 19G9scFv (42,7 kDa). Los carriles 1 y 7 contienen marcadores de peso molecular.

FIG. 6. Gráfica que muestra datos de ELISA del complejo molecular dim�rico 19G9scFv purificado (triángulos

20 blancos) que se une a proteína BHK-RG-1 en comparación con la unión del diacuerpo 19G9 correspondiente (cuadrados rellenos). Gran parte de la secuencia del diacuerpo 19G9 es similar a la secuencia de 19G9 scfv (amino�cidos 1-251 en SEC ID N�: 1). Sin embargo, el ligador entre los dominios VH y VL en el diacuerpo solo tiene 5 amino�cidos en longitud (GGGGS).

FIG. 7. Diagrama del vector pPEP MF-J DSEY2 usado para expresar el complejo de d�meros de Fab, como se 25 muestra esquemáticamente en la FIG. 1B.

FIG. 8. Bio-distribución in vivo del complejo molecular dim�rico 19G9scFv en comparación con otros formatos de anticuerpo (IgG de 19G9, anticuerpo monocatenario scFv monom�rico 19G9 y diacuerpo 19G9). El eje Y representa el porcentaje promedio de dosis inyectada por gramo (% medio de DI por gramo) para cuatro tejidos: sangre (S), tumor (T), hígado (H) y ri��n (R). Los valores se muestran para tejidos recogidos 0,25, 3, 6 y 48 h tras

30 la inyección de 2 μCi de anticuerpo marcado con 111In por animal. El % de DI por gramo para la muestra tumoral de 48 h se indica con una flecha. Mientras que el tumor se marca bien por tanto el complejo molecular dim�rico 19G9 scFv como IgG de 19G9, un alto porcentaje de IgG de 19G9 también es retenido en la sangre 48 h, a diferencia del complejo molecular dim�rico. scFv y el diacuerpo no marcan bien el tumor y también producen una acumulación de marca en los riñones.

35 FIG. 9. Esquema que muestra la generación del pl�smido pIE-J_DSEY usado para expresar la proteína de fusión J_DSEY, como se describe en el Ejemplo 5.

FIG. 10. Unión del complejo molecular dim�rico J_DSEY a la proteína de ant�geno biotinilado para la proteína ABJ de anticuerpo en comparación con la unión de la forma Fab de ABJ. El complejo molecular dim�rico J_DSEY y la forma Fab de ABJ tienen actividad equivalente, con una CE50 que es aproximadamente nanomolar. Estudios

40 previos que comparan formas de Fab monom�rico y de IgG dim�rica de ABJ en ensayos similares muestran que los anticuerpos monom�ricos y dim�ricos se unen a concentraciones similares. Las concentraciones de anticuerpo se calcularon basándose en pesos moleculares de 125 kD para el complejo molecular dim�rico, 50 kD para Fab y 150 kD para IgG. El anticuerpo secundario usado en el ensayo fue HRP-anticuerpo anti-Fab humano (Jackson ImmunoResearch).

45 FIG. 11. Análisis de cromatograf�a de exclusión por tamaño (SEC). Tanto el complejo molecular dim�rico J_DSEY como la expresión heterogénea de J_DSEY y J_KSKY dieron el pico principal a aproximadamente 125 kD, sugiriendo la formación del complejo dim�rico. El complejo molecular dim�rico J_KSKY también mostr� un pico a aproximadamente 125 kD, aunque no es el pico principal.

FIG. 12. Análisis de masas de MALDI-TOF. El complejo dimolecular J_DSEY (0,26 mg/ml) se mezcl� con 10 50 mg/ml de matriz de MALDI de ácido sinap�nico en 50 % de acetonitrilo, 0,1 % de TFA a una relación entre 1:1 y

1:5 y 1 pmol de proteína mínima se eligió como diana por mancha. El análisis de masa de MALDI-TOF se realizó usando un instrumento Bruker UTT calibrado linealmente con patrones II de proteína Bruker. Se registraron espectros de iones positivos con un potencial de aceleración de 25 kV para 100 disparos de láser, acumulados durante 15 eventos. La masa molecular indicada de 123.962,2 Da est� de acuerdo con el peso molecular

55 esperado para el complejo molecular dim�rico de Fab J_DSEY intacto y est� de acuerdo con la SEC y masa calculada.

FIG. 13. Unión del complejo molecular dim�rico 25_DSEY a proteína de ant�geno biotinilado para tanto el anticuerpo AB25 (mismo que el ant�geno para ABJ anterior) en comparación con la unión de la forma de Fab de AB25 como la forma de IgG de AB25. La actividad de unión del complejo molecular dim�rico (25_DSEY) mejor� en comparación con la de Fab, y equivalente a la unión encontrada con la forma de IgG. La CE50 para el d�mero 5 de Fab dim�rico 25_DSEY y la IgG est�n ambas en el intervalo sub-nanomolar. Estudios previos que comparan las formas de Fab monom�rico y de IgG dim�rica de AB25 en ensayos similares muestran que la IgG dim�rica se unió con mayor afinidad que Fab monom�rico, de acuerdo con estos resultados. La concentración de anticuerpo se calcul� basándose en pesos moleculares de 125 kD para el complejo molecular dim�rico, 50 kD para Fab y 150 kD para IgG. El mismo HRP-anticuerpo anti-Fab humano como se muestra en el Ejemplo 6 se us� como

10 anticuerpo secundario.

Descripci�n detallada de la invención

La invención explota las propiedades de auto-dimerizaci�n del dominio CH4 de IgE para proporcionar complejos moleculares dim�ricos que comprenden restos efectores biológicos. Un “resto efector biológico” es un polip�ptido que comprende la porción biol�gicamente activa de moléculas tales como anticuerpos, receptores de membrana de tipo I y

15 tipo II, citocinas, enzimas, y similares. Restos efectores biológicos útiles incluyen anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, dominios extracelulares de receptores de membrana de tipo I o tipo II, citocinas (incluyendo quimiocinas), dominios de sitios activos de enzimas, hormonas de proteína y moléculas efectoras de p�ptidos.

Los restos efectores biológicos en cada una de las dos proteínas de fusión que comprenden un complejo molecular dim�rico pueden ser idénticos o pueden ser restos con dos funciones diferentes (por ejemplo, un sitio de unión al

20 ant�geno y una toxina). Restos efectores biológicos que tienen una función terapéutica útil o dirigida específicamente a tejido son especialmente útiles.

Las regiones constantes de inmunoglobulinas se fusionan frecuentemente con restos biol�gicamente activos para crear proteínas quiméricas. La configuración de la fusión y los dominios de inmunoglobina varían dependiendo de la función prevista. Por ejemplo, el documento WO 2005/017148 desvela una construcción que contiene una región variable 25 monocatenaria (scFV) fusionada con una bisagra de IgG mutante, en la que se han sustituido las ciste�nas que forman disulfuro y los dominios CH3-CH4 de IgE. La construcción resultante es monom�rica. M. Ochino y col. (International Journal of Molecular Medicine, vol 14, n� 3, 2004, pág. 383-388) también muestran una fusión entre scFV y el dominio CH4 de IgE. Esta construcción carece de la región bisagra flexible presente en inmunoglobulinas tales como IgG. Bestagno y col. (Biochemistry, vol 40, n� 25, 2001 pág. 10696-10692) presentan otro ejemplo de una construcción de

30 fusión dim�rica basada en la familia de IgE que carece de una región bisagra flexible.

Los complejos moleculares dim�ricos son estables in vivo y se unen a una diana de interés con una afinidad similar a la de la molécula nativa de la que se deriva el resto efector biológico.

Los complejos moleculares dim�ricos de la invención comprenden dos proteínas de fusión. En algunas realizaciones, cada proteína de fusión comprende lo siguiente, del extremo N a C: (a) un resto efector biológico, (b) una región

35 bisagra de una molécula de IgG unida al resto efector biológico; y (c) un dominio de dimerizaci�n CH4 de IgE covalentemente unido a la región bisagra. La dimerizaci�n de los dominios de dimerizaci�n CH4 de la primera y segunda proteínas de fusión se produce por formación de enlaces disulfuro entre ciste�nas en la región bisagra de cada proteína de fusión. Véanse las FIG. 1A-D.

La molécula efectora puede estar covalentemente unida directamente a la secuencia nativa de la bisagra de IgG1. En

40 otras realizaciones puede emplearse un amino�cido ligador. En tales realizaciones, la molécula efectora est� unida covalentemente al ligador, que est� unido covalentemente a la bisagra de IgG1. La bisagra de IgG es preferentemente una bisagra de IgG1, preferentemente derivada de IgG1 humana, aunque pueden usarse regiones bisagra de IgG1 de otras especies (por ejemplo, ratón, conejo, etc.). En otras realizaciones pueden usarse regiones bisagra de otras IgG (por ejemplo, IgG2, IgG3 e IgG4).

45 La bisagra de IgG1, como se usa en el presente documento, comprende los residuos de amino�cidos 223 a 243 de dentro de la primera cadena beta del dominio CH2 de IgG1, en los que la numeración se basa en la secuencia de la cadena pesada de IgG1 de Eu (SEC ID N�: 25) como se describe por Edelman y col. (1969) Proc. Natl. Acad. Science USA, 63, pág. 78 - 85. Esta secuencia contiene un tetrap�ptido hidrófobo, VFLF, en las posiciones 240-243 (correspondientes a las posiciones 277-280 en SEC ID N�: 3). En una realización preferida, este tetrap�ptido hidrófobo

50 est� sustituido con un tetrap�ptido de amino�cidos hidrófilos, Asp, Ser, Glu y Tyr (DSEY) (residuos de amino�cidos 277-280 en SEC ID N�: 1), para aumentar la solubilidad. Las secuencias de CH2 bisagra y del extremo N de IgG2, IgG3

o IgG4 también contienen el tetrap�ptido VFLF y, por tanto, las regiones bisagra de estas moléculas de inmunoglobulina proporcionan las mismas oportunidades de sustitución en estas posiciones.

En otra realización pueden hacerse modificaciones en la región bisagra para aumentar la capacidad para conjugar 55 diversas moléculas con el complejo molecular dim�rico. Aunque los residuos de lisina ya presentes en el d�mero pueden usarse para la conjugación, sitios adicionales para la conjugación pueden proporcionarse alterando el mismo tetrap�ptido hidrófobo (es decir, VFLF, en las posiciones 277-280 en SEC ID N�: 3) que se cambi� a DSEY (produciendo SEC ID N�: 1) a, por ejemplo, el tetrap�ptido, KSKY. Los residuos de lisina adicionales proporcionados por esta sustitución pueden usarse para añadir poliglicoles (por ejemplo, PEG, POG) a una molécula dimerizada para

5 mejorar la eliminación. Alternativamente, moléculas tales como toxinas, marcas detectables, moléculas radiactivas, etc., pueden conjugarse con proteínas de fusión del complejo molecular dim�rico mediante estos residuos de lisina. Los procedimientos de conjugación son muy conocidos en la técnica.

Complejos moleculares dim�ricos usando anticuerpos como efector biológico

Restos

10 D�meros de scFv y Fab

Los complejos moleculares dim�ricos de la invención pueden formarse usando proteínas de fusión que comprenden anticuerpos como restos efectores biológicos. En algunas realizaciones, los restos efectores biológicos de cada proteína de fusión comprenden sitios de unión al ant�geno. Los sitios de unión al ant�geno pueden proporcionarse, por ejemplo, por un anticuerpo monocatenario (scFv) o un fragmento Fab. El complejo molecular dim�rico resultante

15 comprender� dos sitios de unión al ant�geno, que pueden ser de especificidades iguales o diferentes (es decir, que forman complejos moleculares dim�ricos monoespec�ficos o biespec�ficos, respectivamente).

Un complejo molecular dim�rico monoespec�fico en el que el resto efector biológico en ambas proteínas de fusión es un anticuerpo monocatenario se muestra esquemáticamente en la FIG. 1A. La FIG. 1B es una representación esquemática de complejos moleculares dim�ricos monoespec�ficos en los que el resto efector biológico en cada

20 proteína de fusión es un fragmento Fab (es decir, “d�mero de Fab”). La FIG. 1C es una representación esquemática de un complejo molecular dim�rico biespec�fico en el que los restos efectores biológicos en las proteínas de fusión son fragmentos Fab con especificidades diferentes.

Los complejos moleculares dim�ricos relacionados con anticuerpos de la invención tienen perfiles farmacocin�ticos y de biodistribuci�n superiores cuando se comparan con los de anticuerpos monocatenarios monom�ricos, diacuerpos, o

25 IgG dim�ricas de tamaño completo. Cuando se comparan con un anticuerpo IgG completo, los complejos moleculares de la invención proporcionan una mayor relación de concentración en tumor con respecto a sangre en un momento de tiempo más temprano después de la administración in vivo y muestran mejor penetraci�n en un tumor. Tales complejos también muestran una mayor acumulación en el tumor con menos acumulación en el ri��n en comparación con tanto anticuerpos monocatenarios monom�ricos como diacuerpos (véase la FIG. 8).

30 Los complejos moleculares dim�ricos relacionados con anticuerpos de la invención pueden usarse diagn�sticamente y terapéuticamente. Por ejemplo, un complejo molecular dim�rico puede usarse para la obtención de imágenes in vivo, tal como obtención de imágenes de PET, o para diagnósticos in vitro. Cuando se conjuga con una molécula terapéutica, un complejo molecular dim�rico puede usarse para dirigir la molécula terapéutica a una diana particular.

En una realización preferida, las dos proteínas de fusión dentro del complejo dim�rico comprenden cada una

35 anticuerpos monocatenarios ligados al dominio CH4 de IgE mediante la región bisagra y amino�cidos del extremo N que incluyen una porción de la primera hoja β del dominio CH2 de IgG1 humana. El beneficio de esta unión es que los enlaces disulfuro entre las dos proteínas de fusión se localizarán en el centro del complejo molecular dim�rico, estabilizando as� el complejo. Tales complejos moleculares dim�ricos normalmente tienen un peso molecular entre 50 kD y 150 kD.

40 Un ejemplo de una proteína de fusión que contiene scFv usada en un complejo dim�rico de la invención es SEC ID N�: 1 (FIG. 5B), que contiene el anticuerpo monocatenario 19G9scFv.

La región bisagra en esta proteína de fusión THTCPPCPAPELLGGPSDSEY (SEC ID N�: 5; residuos de amino�cidos 260-280 de SEC ID N�: 1) contiene el tetrap�ptido hidrófilo 'DSEY' en los residuos de amino�cidos 277-280, en lugar del tetrap�ptido 'VFLF' “natural” (residuos de amino�cidos 277-280 de SEC ID N�: 3).

45 Esta proteína de fusión es soluble y se une al ant�geno con una afinidad similar a la de la inmunoglobulina parental.

El ligador entre los dominios VH y VL en la molécula de la proteína de fusión 19G9scFv consiste en los residuos de amino�cidos 125-144 de SEC ID N�: 1: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID N�: 8).

Esta proteína de fusión particular también comprende una marca de ep�tope del extremo C (GAPVPYPDPLEPRAA (SEC ID N�: 23)) en los residuos de amino�cidos 391-405 de SEC ID N�: 1. Tales marcas de ep�topes se usan

50 frecuentemente para ayudar en la purificación de moléculas expresadas. En otras realizaciones de la invención, los complejos moleculares dim�ricos de la invención se producen usando proteínas de fusión que no contienen una marca de ep�tope o con diferentes marcas de ep�topes (por ejemplo, ESSEEGGC (SEC ID N�: 24)).

Los complejos moleculares dim�ricos de la invención también pueden prepararse usando fragmentos de la cadena pesada de Fab en lugar de anticuerpos monocatenarios como moléculas efectoras biológicas en las proteínas de fusión que constituyen el complejo dim�rico (véanse los Ejemplos 5-8). Cuando se forma un complejo molecular dim�rico que comprende los fragmentos Fab, el dominio CH1 de la cadena pesada puede estar directamente unido a la

5 región bisagra como en una molécula de inmunoglobulina normal, reduciendo adicionalmente la cantidad de secuencias inmunog�nicas no nativas en la molécula. Cuando las cadenas ligeras de Fab se combinan con el complejo molecular dim�rico de las cadenas pesadas de Fab, se forma un complejo molecular dim�rico de Fab.

Un d�mero de Fab que tiene la misma afinidad que una IgG, pero un menor peso molecular, puede construirse eliminando la región Fc. El menor peso molecular de un d�mero tal puede producir una elevada penetraci�n tumoral. 10 Además, tales d�meros de Fab no se unirán a receptores de Fc celulares (FcR), reduciéndose as� las interacciones relacionadas con FcA no deseadas. Por ejemplo, un complejo molecular dim�rico que usa tales d�meros de Fab puede usarse para preparar conjugados de toxina que no se unirán a células con FcγR o el receptor de Fc neonatal (FcRn). La FIG. 7 muestra un vector usado para generar un complejo molecular dim�rico que contiene Fab tal que comprende una cadena ligera (SEC ID N�: 19 y 21, secuencias de amino�cidos y de ácidos nucleicos, respectivamente) y una cadena

15 pesada y dominio de IgE (SEC ID N�: 20 y 22, secuencias de amino�cidos y de ácidos nucleicos, respectivamente). Un complejo tal tiene un enlace disulfuro interno entre las cadenas ligeras y pesadas del Fab, además de enlaces disulfuro entre las regiones bisagra de las dos proteínas de fusión. Esta molécula no provocar� ningún receptor de Fc o actividades mediadas por C1q in vivo.

Cuando el dominio de unión de Fc se incluye en una proteína de fusión de Fc, el complejo molecular dim�rico

20 generado puede unirse no solo al receptor de Fc, sino también a otras proteínas (por ejemplo, FcγIIIa, FcγIIb, C1q, etc.) y puede desencadenar las funciones efectoras de estas moléculas. La unión a receptores de Fc permite que un conjugado de anticuerpo-toxina se dirija a células que expresan el receptor de Fc. Las propiedades in vivo de un anticuerpo que pueden mediarse por la interacción de receptores de Fc incluyen citotoxicidad celular dependiente de ant�geno (ADCC), fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento, elevada semivida en suero y eliminación

25 disminuida, etc. Los términos 'proteína de fusión de Fc' o 'fusión de Fc' se usan ampliamente para referirse a la práctica de dimerizar proteínas usando la bisagra de IgG y los dominios CH2 y CH3. Tales 'fusiones de Fc' retienen la habilidad de unirse a receptores de Fc.

Realizaciones preferidas de Fab que contienen complejos moleculares dim�ricos comprenden regiones bisagra en las que el tetrap�ptido 'VFLF' “natural” dentro de la región bisagra est� sustituido con el tetrap�ptido DSEY “mutante” más

30 hidrófilo o con el tetrap�ptido 'KSKY', que proporciona lisinas adicionales para la conjugación (véanse SEC ID N�: 5 y 7, respectivamente).

En otras realizaciones de complejos moleculares dim�ricos que contienen tanto scFv como Fab, secuencias de tetrap�ptidos distintas de las dos descritas anteriormente pueden usarse para sustituir el tetrap�ptido hidrófobo VFLF, que est� presente en el dominio de dimerizaci�n “natural” (residuos de amino�cidos 277-280 en SEC ID N�: 3) de la 35 proteína de fusión. La sustitución de este tetrap�ptido con diferentes tetrap�ptidos en la primera y segunda proteínas de fusión que constituyen la construcción dim�rica es de particular utilidad en ayudar a promover la formación de heterod�meros. En realizaciones preferidas, las sustituciones incluyen: SESE o SDSD en una proteína de fusión con SKSK o SRSR en la segunda proteína de fusión. La sustitución de secuencias adicionales para el tetrap�ptido hidrófobo que pueden usarse para promover la formación de heterod�meros de este modo incluyen: SESY o SDSY con 40 SKSY o SRSY; o DEEY, DDDY, DDEY, DEDY, EEEY, EDDY, EDEY, o EEDY con RRRY, RKRY, RRKY, RKKY, KKKY, KRRY, KRKY, o KKRY. En la estructura de IgG1 humana, los dos residuos de Phe en el tetrap�ptido hidrófobo empezando en Val240 (V240FLF) indican hacia adentro, hacia los residuos de Phe correspondientes de la otra cadena pesada en el d�mero de IgG1. Estos residuos de Phe se extienden hacia estructuras de hidrato de carbono unidas a CH2 y localizadas entre los dos dominios CH2 (Saphire (2002) J Mol Biol 319, pág. 9-18). Los residuos de Val y Leu en 45 el tetrap�ptido VFLF indican hacia afuera, lejos de los hidratos de carbono y hacia los residuos de amino�cidos en CH2. La sustitución de residuos dentro del tetrap�ptido VFLF con residuos menos hidrófobos (Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Gly, His, Lys, Arg, Cys o Ala) disminuye el número de cadenas laterales hidrófobas expuestas, mejorando as� la solubilidad del complejo molecular dim�rico. La sustitución con Lys o Cys también proporciona sitios para modificaciones químicas. Para promover la formación de heterod�meros, uno o ambos de los residuos de Phe dentro 50 de una proteína de fusión del complejo molecular dim�rico est�n sustituidos con residuos que poseen una carga opuesta que est� presente en la segunda proteína de fusión en el complejo molecular dim�rico. La colocación de residuos de carga opuesta dirigidos los unos hacia los otros de cada proteína de fusión que comprende el heterod�mero permite la interacción de carga para promover la formación de heterod�meros. En general, si X es cualquier amino�cido que no sea hidrófobo, entonces las siguientes combinaciones de secuencias podrían usarse para

55 preparar heterod�meros por sustitución del tetrap�ptido VFLF en las dos moléculas del heterod�mero: 1) XEXY o XDXY con XKXY o XRXY; 2) XEXE, XEXD, XDXE o XDXD con XRXR, XRXK, XKXR o XKXK; o 3) XRXE, XRXD, XKXE o XKXD con XEXR, XEXK, XDXK o XDXR.

En otras realizaciones, la secuencia de tetrap�ptidos hidrófobos naturales 'VFLF' y el residuo de prolina adyacente (residuos de amino�cidos 277-281 de SEC ID N�: 3) pueden sustituirse con secuencias de amino�cidos del bucle que conecta CH3 y CH4 en la secuencia de IgE humana (SEC ID N�: 45). Este estiramiento de cinco amino�cidos (VFLFP) puede sustituirse con tanto LysThrSerGly (residuos de amino�cidos 315 a 318 de SEC ID N�: 45) como ThrLysThrSerGly (residuos de amino�cidos 314 a 318 de SEC ID N�: 45). Similarmente, los residuos 277 a 281 en SEC

5 ID N�: 1 (DSEYP) o residuos de amino�cidos 263 a 267 en SEC ID N�: 20 (DSEYP) también pueden sustituirse con estas secuencias derivadas de IgE con el fin de crear complejos moleculares dim�ricos compuestos enteramente de la secuencia nativa de tanto IgG como IgE humana.

Normalmente, un dominio CH4 de IgE se usa para dimerizar proteínas de fusión de la invención. Sin embargo, con el fin de estabilizar adicionalmente los heterod�meros, variantes de corte y empalme de CH4 de IgE M2" pueden añadirse

10 en los extremos C de las proteínas de fusión que comprenden el complejo molecular dim�rico. En una proteína de fusión, una forma ácida de la variante de corte y empalme de CH4 de IgE M2" (ESSEEGGC (SEC ID N�: 26)) se añade al extremo C, mientras que en la segunda proteína de fusión se añade una variante de corte y empalme de CH4 de IgE M2" que contiene amino�cidos básicos (ESSRRGGC (SEC ID N�: 27). Véase la FIG. 1C.

Complejos moleculares dim�ricos usando otros restos efectores biológicos

15 Puede usarse una variedad de restos efectores biológicos distintos de moléculas relacionadas con anticuerpos en las proteínas de fusión que comprenden los complejos moleculares dim�ricos de la invención. En tales proteínas puede o puede no usarse un amino�cido ligador entre el resto efector biológico y la región bisagra. Si se incluye, el amino�cido ligador es preferentemente un ligador de poli Gly de 1 a 10 o más amino�cidos y puede incluir otros amino�cidos, que incluyen Ala, Ser, Thr y Asp. Dependiendo del uso previsto, los complejos moleculares dim�ricos pueden comprender

20 proteínas de fusión en las que los dos restos efectores biológicos son iguales o diferentes (es decir, homod�meros o heterod�meros, respectivamente). Los heterod�meros se estabilizan de un modo similar al descrito anteriormente.

A. Dominios extracelulares de receptores de membrana de tipo I

Un complejo molecular dim�rico que comprende proteínas de fusión en las que el resto efector biológico es un dominio extracelular de un receptor de membrana de tipo I se muestra esquemáticamente en la FIG. 1D y tales complejos son

25 útiles como efectores biológicos o para unirse a ligandos. Los receptores de membrana de tipo I útiles en la invención incluyen receptores de TNF, efrinas, Eph, receptores de VEGF, receptores de IGF, trombospondina, trombomodulina, receptores de PDGF, IL-2R, componentes complejos de TCR, receptores de EGF, receptores de TGF, factor de tejido, receptores de factores de crecimiento, receptor de HGH, receptores de IFN, HER2, receptor de insulina, etc.

B. Citocinas

30 En algunas realizaciones, el resto efector biológico es una citocina útil para modular respuestas biológicas de células. Citocinas útiles en la invención incluyen linfocinas tales como factor activador de macr�fagos (MAF), factor de inhibición de la migración de macr�fagos (MMIF), factor de inhibición de la migración de leucocitos (MCF), factor de inhibición de la migración de leucocitos (LMIF), un factor liberador de histamina (HRF), o factor de transferencia (TF). Factores de necrosis tumoral, tales como TNF-α (caquectina) y TNF-β (linfotoxina) puede ser restos efectores biológicos. Las

35 interleucinas, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, y IL-15, IL-17, pueden ser restos efectores biológicos. Los interferones, tales como IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-ω y IF-τ pueden ser restos efectores biológicos.

Otras citocinas útiles incluyen factores estimulantes de colonias, quimiocinas y proteínas de estr�s. Ejemplos de factores estimulantes de colonias incluyen factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante

40 de colonias de granulocitos y macr�fagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macr�fagos (M-CSF) y multi-CSF (IL-3).

Ejemplos de α-quimiocinas incluyen IL-8, NAP-2 (proteína 2 activadora de neutr�filos), PF-4 (factor 4 de plaquetas) y βTG (β-tromboglobulina). Las β-quimiocinas incluyen MCP-1 (proteína 1 quimioatrayente de monocitos), MCP-3, MIP1α (proteína 1α inflamatoria de macr�fagos), MIP-1β y RANTES (“quimiocina expresada y supuestamente secretada

45 regulada tras la activación de T normales”). Otras quimiocinas útiles incluyen, por ejemplo, quimiocinas CCL; quimiocinas CXC (SCYS) o quimiocinas CX3C; quimiocinas XC; y quimiocinas CC, tales como CCL2, CCL7, CCL11, CCL8, CCL13, CCL1, CCL5, CCL16, CCL14, CCL15, CCL23, CCL18, CCL3 y CCL4.

Las proteínas de estr�s incluyen proteínas de choque térmico (HSP), proteínas reguladas por glucosa (GRP), ubiquitina y super�xido dismutasa.

50 C. Enzimas

En otras realizaciones, un resto efector biológico es una enzima, por ejemplo, una enzima proteol�tica (una amino peptidasa, una aspartil proteasa, una serina proteasa, una metaloproteasa, una cisteinil proteasa, pepsina, tripsina, trombina, lisozima, factor VII, factor X, factor IX). También pueden usarse otras enzimas, tales como glicosidasas, esterasas, hidrolasas, nucleasas, sintasas, isomerasas, polimerasas, cinasas, fosfatasas, reductasas, que incluyen oxido-reductasas, transferasas, ligasas, enzimas de restricción, amidasas, ATPasas, carbohidrasas, lipasas, celulasas, deshidrogenasas y oxidasas.

D. Toxinas

5 También pueden usarse toxinas terapéuticamente útiles como restos efectores biológicos en las proteínas de fusión que comprenden los complejos moleculares dim�ricos de la invención. Hay numerosos ejemplos de tales toxinas, muy conocidos para aquellos expertos en la materia, tales como las toxinas bacterianas exotoxina A de Pseudomonas y toxina dift�rica, y las toxinas de planta ricina, abrina, modecina, saporina y gelonina.

Producci�n de complejos moleculares dim�ricos

10 Las proteínas de fusión para complejos moleculares dim�ricos de la invención pueden producirse recombinantemente

o sintéticamente, o usando una combinación de los dos enfoques. Para la producción recombinante, la invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión de la invención (véase más adelante).

Es posible producir una proteína de fusión de la invención usando procedimientos químicos para sintetizar la secuencia de amino�cidos de la proteína de fusión. Los procedimientos incluyen síntesis directa de p�ptidos usando técnicas en 15 fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge y col., Science 269, 202-204, 1995). La síntesis de proteínas puede realizarse usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, usando el sintetizador de p�ptidos Applied Biosystems 431 A (Perkin Elmer). Opcionalmente, los fragmentos de una proteína de fusión pueden sintetizarse por separado y combinarse usando procedimientos químicos para producir una proteína de fusión de longitud completa. Véase el documento WO

20 01/98340.

Mol�culas de ácidos nucleicos

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique la proteína de fusión deseada. Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención incluyen ADN mono y bicatenario (incluyendo ADNc) y ARNm. Muchos kits para construir proteínas de fusión est�n disponibles de empresas

25 tales como Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL International Corporation (MIC; Watertown, MA) y Quantum Biotechnologies (Montreal, Canadá; 1-888-DNA-KITS).

Procedimientos que son muy conocidos para aquellos expertos en la materia pueden usarse para construir moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro y técnicas

30 sintéticas. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989) y en Ausubel y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 1989.

En algunas realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos son construcciones de expresión que contienen los elementos necesarios para la transcripción y traducción de una secuencia codificante insertada que codifica una proteína de fusión. Las construcciones de expresión de d�meros de Fab pueden incluir una secuencia codificante para

35 la cadena ligera con una ciste�na del extremo C. Una construcción de expresión puede estar presente en un vector adecuado para introducir proteínas de fusión de la invención en una célula.

Las proteínas de fusión de la invención pueden expresarse recombinantemente en una variedad de células huésped. éstas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN en bacteri�fago, pl�smido o c�smido recombinantes; levadura transformada con vectores de expresión en 40 levadura, sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión en virus (por ejemplo, baculovirus), sistemas de células de planta transformados con vectores de expresión en virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, pl�smidos Ti

o pBR322), o sistemas de célula animal, particularmente sistemas de mamífero, que incluyen sistemas humanos. Véase el documento WO 01/98340, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. La

45 elección de componentes de vector y células huésped apropiadas est� perfectamente dentro de las capacidades de los expertos en la materia.

En algunas realizaciones de la presente invención, ambas proteínas de fusión de un complejo molecular dim�rico se expresan en la misma célula, preferentemente del mismo pl�smido, por ejemplo, como un oper�n dicistr�nico (Skerra y col., Protein Eng. 4, 971,1991). Una secuencia señal puede incluirse para dirigir las proteínas de fusión a la localización

50 celular deseada. La expresión de las dos proteínas de fusión de un complejo molecular dim�rico del mismo pl�smido conduce a que se forme una elevada cantidad de d�mero biespec�fico, ya que cantidades equivalentes de cada componente est�n siendo producidas dentro de la célula.

Opcionalmente, una proteína de fusión puede comprender un resto que puede usarse como marca de detección o de purificación, tal como p�ptidos que comprenden al menos cinco residuos de histidina, o las marcas c-myc y FLAG comúnmente usadas.

Procedimientos de diagnóstico

Los complejos moleculares dim�ricos de la invención también pueden ser útiles para fines de diagnóstico. Por ejemplo, 5 el complejo puede comprender dos proteínas de fusión, una proteína que comprende un resto efector biológico diseñado para unirse a un analito de interés y la otra proteína que comprende una molécula efectora biológica que es,

o est� unida a, una marca detectable que puede cuantificarse fácilmente, por ejemplo, una enzima, una proteína fluorescente, un radion�clido, etc.

Procedimientos terapéuticos

10 Los complejos moleculares dim�ricos de la invención pueden proporcionarse en una composición farmacéutica para administración a un mamífero, preferentemente un ser humano. Los complejos compuestos de fragmentos de anticuerpos (tanto mono- como bi-específicos) son particularmente útiles en terapia tumoral. Por ejemplo, una proteína de fusión del complejo puede comprender una molécula que se une a un marcador tumoral y la otra proteína de fusión puede comprender una molécula que se une a un ep�tope de linfocitos T, una toxina, o un p�ptido o proteína que se

15 une a radion�clido para llevar una función destructora próxima a la célula tumoral.

Para preparar composiciones farmacéuticas adecuadas que comprenden complejos moleculares dim�ricos de la invención, un experto en la materia pueden usar disoluciones estériles fisiológicamente aceptables inyectables conocidas. Para preparar una disolución lista para uso para inyección parenteral o infusión, disoluciones isot�nicas acuosas, tales como, por ejemplo, solución salina o disoluciones de proteína plasm�tica correspondientes, est�n

20 fácilmente disponibles. Las composiciones farmacéuticas pueden estar presentes como liofilizados o preparaciones secas, que pueden reconstituirse con una disolución inyectable conocida directamente antes de uso bajo condiciones estériles. Una composición farmacéutica puede complementarse con sustancias de vehículo o/y aditivos conocidos (por ejemplo, albúmina de suero, dextrosa, bisulfito de sodio, EDTA, etc.).

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por diferentes vías de administración

25 conocidas para un experto en la materia, particularmente mediante inyección intravenosa o inyección directa a los tejidos diana. Para administración sist�mica pueden usarse vías intravenosa, intravascular, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, oral o intratecal. Más administración local puede efectuarse subcut�neamente, intracut�neamente, intrac�rdicamente, intralobalmente, intramedularmente, intrapulmonarmente o directamente en o cerca del tejido que va a tratarse (tejido conjuntivo, óseo, muscular, nervioso, epitelial). Dependiendo de la duración y eficacia deseada del

30 tratamiento, las composiciones pueden administrarse una vez o varias veces, también intermitentemente, por ejemplo, diariamente durante varios días, semanas o meses y en diferentes dosificaciones.

La dosificación depender� de la edad, condición, sexo y grado de la enfermedad en el paciente y puede variar de 0,1 mg/kg a 200 mg/kg, preferentemente de 0,1 mg/kg o 100 mg/kg/dosis, en una o más administraciones de dosis diarias, durante uno a varios días.

35 Todas las patentes, solicitudes de patente y referencias citadas en esta divulgación se incorporan expresamente en el presente documento por referencia. La divulgación anterior, en general, describe la presente invención. Puede obtenerse un entendimiento más completo por referencia a los siguientes ejemplos específicos, que se proporcionan solamente a fin de ilustración y no pretenden limitar el ámbito de la invención.

Ejemplo 1

40 Producción de complejos moleculares dim�ricos de scFv

Este ejemplo demuestra la producción de dos complejos moleculares dim�ricos con la estructura mostrada en la FIG. 1A. Se prepararon dos construcciones. En ambas construcciones se a�adi� un ligador de poli-Gly al extremo N de la región bisagra de IgG1 natural. En una construcción “natural”, éste fue seguido de la secuencia nativa de alguna de la primera cadena beta de CH2 de IgG1 humana. En la construcción “mutante”, las mutaciones se introdujeron para 45 eliminar residuos hidrófobos presentes en la cadena beta “natural” que de otro modo se expondrían al disolvente y podrían posiblemente impedir la solubilidad. Dos residuos hidrófobos, Val240 y Ile242 dentro de la región constante pesada de IgG1 (SEC ID N�: 25), tienen interacciones hidrófobas con el dominio CH2 de IgG, y dos fenilalaninas, Phe241 y Phe243, interaccionan con los grupos hidrato de carbono. Estos amino�cidos hidrófobos Val, Phe, Leu y Phe en las posiciones 240-243 de SEC ID N�: 25 se sustituyeron con los residuos hidrófilos Asp, Ser, Glu y Tyr, respectivamente.

50 Dos grupos de ciste�na en la región bisagra producen enlaces covalentes entre cada proteína de fusión tras la dimerizaci�n de las regiones CH4.

Generaci�n del anticuerpo monocatenario

Se gener� un anticuerpo monocatenario llamado 19G9scFv a partir de las cadenas de VH y VL que se amplificaron por PCR usando cebadores que introdujeron sitios de restricción y sitios para solapar la extensión del ligador de 16 amino�cidos GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID N�: 5). Después de 15 ciclos de extensión, scFv se amplificó

5 con los cebadores directos e inversos originales y se clon� por digestión con restricción en el vector de expresión bacteriano pz613. Véase la FIG. 2.

Cebador directo de VH: GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTC (SEC ID N�: 15);

Cebador inverso de VH:

CCACCGGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGAAGAGAC GGTGACC 10 (SEC ID N�: 16);

Cebador directo de VL:

GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAAATTGTGTTGACGCAGTC (SEC ID N�: 17);

Cebador inverso de VL: GCGGCCGCTTTGATCTCCACCTTGGTCC (SEC ID N�: 18).

Generaci�n del dominio de dimerizaci�n CH4

15 El dominio CH4 de IgE se clon� a partir de ARNm comprado de Invitrogen (clon 2132581) usando cebadores de PCR “ATG001” (IgECH4_bk_a): CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC CCCGCGTGCT GCCCCGGAAG (SEC ID N�: 9) y “ATG003” (IgECH4_for_a): CGGATACGGC ACCGGCGCAC CTTTACCGGG ATTTACAGAC (SEC ID N�: 11). La región bisagra de IgG1 y la primera cadena beta de CH2 de IgG1 se introdujo por PCR usando el cebador “ATG002”: TTCCTCTTCC CCCCGCGTGC TGCCCCGGAA G (SEC ID N�: 10). Se introdujeron sitios Not1 y SgrA1 por los

20 cebadores ATG001 y ATG003, respectivamente. Estos sitios permitieron la clonaci�n directa por digestión con restricción de la fusión de la región bisagra de IgG1-CH4 de IgE en el vector monocatenario (“19G9”). Véase la FIG. 3.

La secuencia de amino�cidos de la proteína de fusión “natural” 19G9scFv, algunas veces denominada 19G9M1 (SEC ID N�: 3) se muestra en la FIG. 5A. La secuencia de amino�cidos de la proteína de fusión “mutada”, denominada 19G9M2 (SEC ID N�: 1), que contiene la secuencia DSEY en los residuos de amino�cidos 277-280 en el dominio de

25 dimerizaci�n, se muestra en la FIG. 4B.

Ejemplo 2

Expresi�n, purificación y función de complejos moleculares dim�ricos de scFv

La construcción del complejo molecular dim�rico 19G9scFv “mutante” (19G9M2; SEC ID N�: 1) descrita en el Ejemplo 1 se clon� en el vector de expresión de mamífero pPEP1 poly y se expres� en células CHO. La purificación se llev� a

30 cabo usando cromatograf�a de afinidad por marca de ep�tope, y el complejo purificado se prob� para la unión, especificidad por ant�genos y afinidad usando un ELISA. Véase la FIG. 5A. El peso molecular del complejo purificado (reducido y no reducido) se analizó en un sistema de SDS-PAGE. Se us� 4 %-12 % de SDS-PAGE, con un tampón de electroforesis de MES SDS en 40 minutos a 120 mA, 200 V. Véase la FIG. 5B.

La FIG. 6 muestra los resultados de la unión del complejo molecular dim�rico 19G9M2 a la proteína BHK-RG-1 en

35 comparación con la unión del diacuerpo correspondiente (el anticuerpo monocatenario dim�rico preparado a partir de VH y VL de 19G9 ligadas por un ligador de cinco amino�cidos acortado). El diacuerpo y la IgG de 19G9 tienen actividad equivalente. La CE50 es aproximadamente nanomolar. La concentración de anticuerpo se calcul� basándose en pesos moleculares de 80 kD para el complejo molecular dim�rico y 50 kD para el diacuerpo. El anticuerpo secundario usado en el ensayo fue HRP-anticuerpo anti-marca E.

40 Ejemplo 3

Demostraci�n de la formación de enlaces disulfuro en la región bisagra

La FIG. 5B es un gel de SDS-poliacrilamida teñido con azul de Coomassie que demuestra que la preparación del complejo molecular dim�rico descrita en los Ejemplos 1 y 2 comprende predominantemente d�meros de disulfuro (carriles 2 y 3) con solo una pequeña contaminación por mon�mero. Tras la reducción, todos los d�meros de disulfuro

45 colapsan a mon�meros (carriles 5 y 6). Este resultado demuestra que la región bisagra de la IgG1 funciona apropiadamente y que los enlaces disulfuro se forman en la bisagra después de dimerizarse el dominio CH4 de IgE. Carriles, de izquierda a derecha: 1, 10 μl de marcador; 2, 2 μl de 19G9 M2; 3, 5 μl de 19G9 M2; 4, blanco; 5, 2 μl de 19G9 M2 reducido; 6, 5 μl de 19G9 M2 reducido; 7, 10 μl de marcador.

Ejemplo 4

Biodistribuci�n in vivo del complejo molecular dim�rico 19G9

Procedimientos de radiomarcado y de unión a quelante se adaptaron de Nikula y col. (1995), Nucl. Med. Biol., 22, 387

390. El complejo molecular dim�rico 19G9scFv purificado, IgG de 19G9, 19G9scFv y el diacuerpo 19G9 se

5 caracterizaron por SEC y SDS-PAGE antes de uso. El marcado se realizó usando 111 In, en tampones y equipo que se convirtieron en libres de metal por aclarado repetido con disolución 10 mM de EDTA y tratamiento con Chelex antes de la filtración. El quelante p-SCN-CHX-A"-DPTA se compr� de Macrocyclics Inc. El tampón usado para la conjugación contuvo carbonato 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5. El radiomarcado se realizó en un tampón que contenía NaAc 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5.

10 Las disoluciones de anticuerpo radiomarcado con 111In (PBS) de los cuatro grupos de anticuerpos descritos anteriormente se inyectaron en 8 ratones portadores de tumor LNCaP por grupo (2 μCi por animal). Dos animales por grupo se pesaron, se sacrificaron y los tejidos se recogieron 15 min, 3 h, 6 h y 48 h tras la inyección de anticuerpo marcado. El tumor, tejido o muestra de sangre se pes� y se determin� la radiactividad total. mCi por gramo de muestra se compar� con mCi total por peso de animal para determinar el porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido y

15 el promedio se calcul� para cada grupo y momento de tiempo (% medio de DI por gramo). Los resultados se muestran en la FIG. 8.

Ejemplo 5

Producci�n de proteínas de fusión de Fab y expresión de complejos moleculares dim�ricos de Fab

Este ejemplo demuestra la producción de complejos moleculares dim�ricos de Fab con la estructura mostrada en la

20 FIG. 1B (es decir, un complejo molecular dim�rico monoespec�fico en el que el resto efector biológico es un fragmento Fab). Esta construcción no tiene ninguna secuencia de ligador entre el extremo C del dominio CH1 de Fab y el extremo N de la región bisagra de IgG1 y la secuencia en esta región es la misma que en una IgG.

En la región bisagra de IgG1, cuatro amino�cidos hidrófobos, Val, Phe, Leu y Phe (residuos de amino�cidos 263-266 de SEC ID N�: 20) localizados en el extremo C de la región bisagra, se sustituyeron con los residuos hidrófilos Asp, Ser,

25 Glu y Tyr respectivamente, para evitar la posible dificultad en la solubilidad. Los dos grupos de ciste�na presentes en la región bisagra producen enlaces covalentes entre cada proteína de fusión tras la dimerizaci�n de las regiones CH4. Otra ciste�na también se localiza en el extremo C de tanto CH1 como CL para permitir que estos dominios se unan por un enlace disulfuro covalente.

(a) Inserción de la región bisagra de IgG1 y dominio CH4 de IgE en el vector de expresión de IgG1

30 El ADN que codifica la región bisagra de IgG1 y el dominio CH4 de IgE se amplificó por PCR usando cebadores que introdujeron sitios de restricción Pcil y Fsel, y entonces esta región se clon� por digestión con restricción en el vector de clonaci�n pCR2.1_TOPO para producir pCR2.1_bisagra_IgE CH4 para crear la cadena pesada de la proteína de fusión de Fab del complejo molecular dim�rico J_DSEY.

Cebador directo de ATG47: CTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAC (SEC ID N�: 31);

35 Cebador inverso de ATG46: TGTGGCCGGCCCTATTTACCGGGATTTACAGACACCGCT (SEC ID N�: 32);

Los dominios de VH y CH de un anticuerpo Fab (ABJ) se amplificaron por PCR usando cebadores que introdujeron un sitio de restricción Pcil, y se clonaron por digestión con restricción (EcoRV y Pcil) en pCR2.1_bisagra_IgE CH4.

Cebador directo de ATG51: GTTGAAATTAAACGTACGGTGGCTGC (SEC ID N�: 33);

Cebador inverso de ATG56: GACATGTGTGAGTTTTATCGCAGCTTTTCGGTTCCACTTTTTTATCC (SEC ID N�: 40 34);

El complejo de la cadena pesada entero se amplificó por PCR usando cebadores que introdujeron un sitio de restricción Xma, y luego se clon� por digestión con restricción (BlpI y XmaI) en un vector de expresión de IgG1, pIE_ABJ para producir el vector pIE-J_DSEY. Véase la FIG. 9

Cebador directo de ATG75: CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCG (SEC ID N�: 35);

45 Cebador inverso de ATG76: CGACTCCCGGGTTACTATTTACCGGGATTTACAGACAC (SEC ID N�: 36).

(b) Generación de una segunda proteína de fusión de Fab de la cadena pesada

Se gener� una segunda construcción molecular dim�rica de Fab con un dominio bisagra de IgG1 diferente (más básico) a partir de la cadena pesada del d�mero J_DSEY y el dominio CH4 de IgE (SEC ID N�: 20) sustituyendo los amino�cidos Asp, Ser, Glu y Tyr en las posiciones 263 a 266 de SEC ID N�: 20 con Lys, Ser, Lys y Tyr (KSKY) usando el kit de mutag�nesis dirigida al sitio QuikChange II proporcionado por Stratagene y un conjunto apropiado de cebadores.

5 Cebador directo de ATG85: GGGGGACCGTCAAAAAGCAAATACCCGCCGCGTGC(SEC ID N�: 37);

Cebador inverso de ATG86: GCACGCGGCGGGTATTTGCTTTTTGACGGTCCCCC (SEC ID N�: 38);

produciendo el vector pIE-J_KSKY.

Ejemplo 6

Expresi�n y purificación de los complejos moleculares dim�ricos de Fab J_DSEY y J_KSKY

10 Las construcciones de proteínas de fusión de la cadena pesada de Fab J_DSEY y J_KSKY descritas en el Ejemplo 5 se clonaron cada una en el vector de expresión de mamífero pIE-ABK y se expresaron en células CHO-K1. La purificación de cada producto de expresión se llev� a cabo usando cromatograf�a de afinidad por proteína L, y los complejos purificados se probaron para unión, especificidad por ant�genos y afinidad usando un ELISA. El peso molecular de los complejos purificados se analizó en un sistema de SDS-PAGE bajo condiciones reductoras (4 %-12 %

15 de SDS-PAGE, con un tampón de electroforesis de MOPS SDS en 60 minutos a 120 mA, 200 V) y se mostr� que poseían el peso molecular predicho.

Ejemplo 7

Producci�n de otra proteína de fusión Fab de la cadena pesada

Se produjo otro complejo molecular dim�rico de Fab usando un anticuerpo para el mismo ant�geno (AB25).

20 La región variable de la cadena pesada de AB25 (SEC ID N�: 42) se clon� por PCR usando cebadores que introdujeron un sitio de restricción MfeI, y se insert� por digestión con restricción (NotI y BlpI) en el vector de expresión pIE-J_DSEY.

Cebador directo de ATG 105:

GCGCGGCCGCGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCA GATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCG (SEC ID N�: 39);

25 Cebador inverso de ATG106: CCTTTGGTCGACGCTGAGCT (SEC ID N�: 40);

La región variable de la cadena ligera de AB25 (SEC ID N�: 44) se insert� por digestión con restricción (EcoRI y BsiWI) en el vector de expresión pIE-J_DSEY.

Ejemplo 8

Expresi�n y purificación del complejo molecular dim�rico de Fab 25_DSEY

30 La construcción del complejo molecular dim�rico 25_DSEY Fab descrita en el Ejemplo 7 se expres� en células CHO-K1. La purificación se llev� a cabo usando cromatograf�a de afinidad por proteína L, y el complejo purificado se prob� para la unión, especificidad por ant�genos y afinidad usando un ELISA. El peso molecular del complejo purificado se analizó en un sistema de SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y se mostr� que poseía el peso molecular predicho. Como era de esperar, la actividad de unión del complejo molecular dim�rico (25_DSEY) mejor� en comparación con la

35 de Fab, y equivalente a la unión encontrada con la forma de IgG. La CE50 para el d�mero de Fab 25_DSEY dim�rico y la IgG est�n ambas en el intervalo sub-nanomolar. Estudios previos que compararon las formas de Fab monom�rico y de IgG dim�rica de AB25 en ensayos similares muestran que la IgG dim�rica se unió con mayor afinidad que el Fab monom�rico, de acuerdo con estos resultados. Véase la FIG. 13.

LISTADO DE SECUENCIAS

40 <110> Heitner, Tara Light, David McLean, Kirk Parry, Renate Satozawa, Noboru Schneider, Doug

<120> Complejos moleculares dim�ricos

<130> 53472A

<150> US 60/808.840

<151> 25/05/2006

<160> 45 5

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 405 10 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223>: construcción dim�rica 19G9scFv, bisagra mutante hidrófila 15

<400> 1

<210> 2

<211> 1224

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> proteína de fusión 19G9scFv, bisagra mutante hidrófila

<400> 2

<210> 3

<213> artificial

<220>

<223>: dominio de dimerizaci�n CH4 de IgE, bisagra natural 15

<400> 3

<210> 4

<211> 1224 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223>: construcción dim�rica 19G9scFv, bisagra natural 10

<400> 4

<210> 5

<213> artificial

<220>

<223>: construcción de bisagra mutante hidrófila 10

<400> 5

15 <210> 6

<211> 110

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> dominio CH4 de IgE de complejo molecular dim�rico

<400> 6

<210> 7

<213> artificial

<220>

<223> construcción de variante de lisina-región bisagra mutante 15

<400> 7

20 <210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> ligador

<400> 8 <220>

10: <210> 9 <211> 40 <212> ADN <213> artificial

15: <220> <223> cebador de ATG001 <400> 9 ccgtcagtct tcctcttccc cccgcgtgct gccccggaag 40

20: <210> 10 <211> 31 <212> ADN <213> artificial

25: <220> <223> cebador de ATG002

<400> 10 ttcctcttcc ccccgcgtgc tgccccggaa g: 31

30: <210> 11 <211> 40 <212> ADN <213> artificial

<223> cebador de ATG003

<400> 11 cggatacggc accggcgcac ctttaccggg atttacagac 40

<210> 12

<211> 86

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador de ATG004

<400> 12

<210> 13

<211> 36

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador de ATG006

<400> 13 agatcaaagc ggccgcaggc ggcggtggtt ccactc 36

<210> 14

<211> 113

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador de ATG019

<400> 14

5 10: <210> 15 <211> 41 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cebador directo de VH

15: <400> 15 gcggcccagc cggccatggc ccaggttcag ctggtgcagt c 41

20: <210> 16 <211> 66 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> cebador inverso de VH

25: <400> 16

<210> 17

<211> 50

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador directo de VL

<400> 17 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gaaattgtgt tgacgcagtc 50

<210> 18 5 <211> 28

<212> ADN

<213> artificial

<220> 10 <223> cebador inverso de VL

<400> 18 gcggccgctt tgatctccac cttggtcc 28

15 <210> 19

<211> 234

<212> PRT

<213> artificial

20 <220>

<223> cadena ligera de d�mero de Fab

<220>

<221>: regiones CDR 25 <222> (1)..(234)

<223> Xaa indica bucles de CDR

<220>

<221>: misc_feature 30 <222> (44) . . (54)

<223> Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente

<220>

<221>: misc_feature 35 <222> (69) . . (76)

<223> Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente

<220>

<221> misc_feature

<222> (109)..(116)

<223> Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente

<400> 19

<210> 20

<211> 376

<212> PRT

<213> artificial 5

<220>

<223> proteína de fusión de Fab, cadena pesada y dominio CH4 de IgE

<220>: 10 <221> regiones CDR

<222> (1) . . (376)

<223> Xaa indica bucles de CDR

<220>: 15 <221> misc_feature

<222> (46) . . (54)

<223> Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente

<220>: 20 <221> misc_feature

<222> (66) . . (85)

<223> Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente

<220>: 25 <221> misc_feature

<222> (118) . . (129)

<223> Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente

<400> 20 30

<210> 21

<211> 705

5: <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cadena ligera de d�mero de Fab

10

<220>

<221> región CDR

<222> (1)..(705)

<223> n es bucles de CDR

15

<220>

<221> misc_feature

<222> (130)..(162)

<223> n es a, c, g, o t

20

<220>

<221> misc_feature

<222> (205) . . (228)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (325) . . (348)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 21

<210> 22

<211> 1131 15 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223>: cadena pesada de d�mero de Fab y dominio CH4 de IgE 20

<220>

<221> regiones CDR

<222> (1)..(1131)

<223>: n representa bucles de CDR 25

<220>

<221> misc_feature

<222> (136) . . (162)

<223> n es a, c, g, o t

<220>: 5 <221> misc_feature

<222> (196)..(255)

<223> n es a, c, g, o t

<220>: 10 <221> misc_feature

<222> (352) . . (387)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 22 15

<210> 23 20 <211> 15

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> marca de ep�tope 1

<400> 23

10 <210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

15 <220>

<223> marca de ep�tope 2

<400> 24

<210> 25

<211> 446

<212> PRT 25 <213> homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222>: (1) . . (118) 30 <223> Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente

<220>

<221> región constante pesada de IgG1 de EU

<222>: (119)..(446) 35 <223> Xaa representa la región variable ligera

<400> 25

<210> 26

<211> 8 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante de corte y empalme 1 de IgE de M2" 10

<400> 26

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante de corte y empalme 2 de CH4 de IgE M2"

<400> 27

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante de corte y empalme 3 de CH4 de IgE M2"

<400> 28

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> variante de corte y empalme 4 de CH4 de IgE M2"

<400> 29

5 <210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

10 <220>

<223> variante de corte y empalme 5 de CH4 de IgE M2"

<400> 30

<210> 31

<211> 33

<212> ADN 20 <213> artificial

<220>

<223> cebador directo de ATG47

25 <400> 31 ctcacacatg tccaccgtgc ccagcacctg aac 33

<210> 32

<211> 39 30 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador inverso de ATG46 35

<400> 32 tgtggccggc cctatttacc gggatttaca gacaccgct: 39

5: <210> 33 <211> 26 <212> ADN <213> artificial

10: <220> <223> cebador directo de ATG51

<400> 33 gttgaaatta aacgtacggt ggctgc: 26

15: <210> 34 <211> 48 <212> ADN <213> artificial

20: <220> <223> cebador inverso de ATG56

25 30: <400> 34 ggacatgtgt gagttttatc gcagcttttc ggttccactt ttttatcc <210> 35 <211> 22 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cebador directo de ATG75 48

35: <400> 35 caggtgcaat tggttcagag cg 22

5: <210> 36 <211> 38 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cebador inverso de ATG76

10: <400> 36 cgactcccgg gttactattt accgggattt acagacac 38

15: <210> 37 <211> 35 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> cebador directo de ATG85

20: <400> 37 gggggaccgt caaaaagcaa atacccgccg cgtgc 35

25: <210> 38 <211> 35 <212> ADN <213> artificial

30: <220> <223> cebador inverso de ATG86 <400> 38 gcacgcggcg ggtatttgct ttttgacggt ccccc 35

35: <210> 39 <211> 100

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador directo de ATG105

<400> 39

<210> 40

<211> 20

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador inverso de ATG106

<400> 40 cctttggtcg acgctgagct 20

<210> 41

<211> 417

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> región variable de la cadena pesada de AB25

<220>

<221> misc_feature

<222> (133)..(162)

<223> n es a, c, g, o t 15 <210> 42

<220>

<221> misc_feature

<222> (196)..(255)

<223> n es a, c, g, o t

5

<220>

<221> misc_feature

<222> (352)..(384)

<223> n es a, c, g, o t

10

<400> 41

<211> 139

<212> PRT

<213> artificial

20 <220>

<223> región variable de la cadena pesada de AB25, secuencia de amino�cidos

<220>

<221>: misc_feature 25 <222> (45) . . (54)

<223> Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente

<220>

<221>: misc_feature 30 <222> (66) . . (85)

<223> Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente

<220>

<221> misc_feature

<222> (118) . . (128)

<223> Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente

<400> 42

<210> 43

<211> 390

<212> ADN 15 <213> artificial

<220>

<223> región variable de la cadena ligera de AB25

20 <220>

<221> misc_feature

<222> (130) . . (165)

<223> n es a, c, g, o t

<220>: 5 <221> misc_feature

<222> (208) . . (231)

<223> n es a, c, g, o t

<220>: 10 <221> misc_feature

<222> (328) . . (351)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 43 15

<210> 44

<211> 130 20 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223>: región variable de la cadena ligera de AB25, secuencia de amino�cidos 25

<220>

<221> misc_feature

<222> (44) . . (55)

<223>: Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente 30

<220>

<221> misc_feature

<222> (70) . . (77)

<223>: Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente 5

<220>

<221> misc_feature

<222> (110)..(117)

<223>: Xaa puede ser cualquier amino�cido que se produce naturalmente 10

<400> 44

15

<210> 45

<211> 427

<212> PRT

<213> homo sapiens

20

<400> 45

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un complejo molecular dim�rico que comprende una primera y una segunda proteína de fusión, en el que cada proteína de fusión comprende de su extremo N a C:

(A)

un resto efector biológico seleccionado del grupo que consiste en: 5 (1) un anticuerpo monocatenario;

(2)

un fragmento Fab;

(3)

un dominio extracelular de un receptor de membrana de tipo I;

(4)

una citocina;

(5)

una quimiocina; 10 (6) una enzima;

(7)

una toxina; y

(8)

un marcador detectable;

(B)

una región bisagra de una molécula de IgG unida al resto efector biológico; y

(C)

un dominio de dimerizaci�n CH4 de una molécula de IgE covalentemente unido a la región bisagra, en el que

15 el complejo molecular comprende un enlace disulfuro entre un residuo de ciste�na en la región bisagra de la primera proteína de fusión y un residuo de ciste�na en la región bisagra de la segunda proteína de fusión.
2. El complejo molecular de la reivindicación 1, en el que los restos efectores biológicos de la primera y segunda proteínas de fusión son idénticos.
3. El complejo molecular de la reivindicación 1, en el que los restos efectores biológicos de la primera y segunda 20 proteínas de fusión son diferentes.
4.

El complejo molecular de la reivindicación 1, en el que los restos efectores biológicos de la primera y segunda proteínas de fusión comprenden cada uno un sitio de unión al ant�geno.
5.

El complejo molecular de la reivindicación 4, en el que los dos sitios de unión al ant�geno tienen la misma especificidad.

25 6. El complejo molecular de la reivindicación 1, en el que la región bisagra de tanto la primera como la segunda proteínas de fusión es de una molécula de IgG1.
7.

El complejo molecular de la reivindicación 6, en el que la región bisagra comprende los residuos de amino�cidos 223 a 243 de SEC ID N�: 25.
8.

El complejo molecular de la reivindicación 6, en el que dentro de la región bisagra de al menos una de las dos

30 proteínas de fusión, el tetrap�ptido VFLF, que ocupa las posiciones 240-243 en la IgG, la región bisagra (SEC ID N�: 25), se sustituye con un tetrap�ptido seleccionado del grupo que consiste en DSEY, KSKY 1CSEY, DSCY, DEEY, KRKY, SESE, SDSD, SKSK, SRSR, SESY, SDSY, SKSY, SRSY, DDDY, DDEY, DEDY, EEEY, EDDY, EDEY, EEDY, RRRY, RKRY, RRKY, RKKY, KKKY, KRRY, KRKY y KKRY.
9. El complejo molecular de la reivindicación 8, en el que el tetrap�ptido es KSKY.

35 10. El complejo molecular de la reivindicación 8, en el que el tetrap�ptido VFLF dentro de la región bisagra de tanto la primera como la segunda proteínas de fusión se sustituye con el mismo tetrap�ptido.
11. El complejo molecular de la reivindicación 10, en el que el tetrap�ptido de sustitución est� seleccionado del grupo que consiste en DSEY, KSKY, DEEY y KRKY.
12.

El complejo molecular de la reivindicación 8, en el que el tetrap�ptido VFLF dentro de la región bisagra de cada una 40 de la primera y segunda proteínas de fusión se sustituye con un tetrap�ptido diferente.
13.

El complejo molecular de la reivindicación 12, en el que el tetrap�ptido VFLF dentro de la región bisagra de la primera proteína de fusión se sustituye con el tetrap�ptido DSEY y dentro de la región bisagra de la segunda proteína de fusión se sustituye con el tetrap�ptido KSKY.
14.

El complejo molecular de la reivindicación 9, que comprende además un resto covalentemente unido a una lisina en la región bisagra, en el que el resto es una toxina o un poliglicol.
15.

El complejo molecular de la reivindicación 1, que comprende además una marca de ep�tope en su extremo C.
16.

El complejo molecular de la reivindicación 15, en el que la marca de ep�tope comprende GAPVPYPDPLEPRAA 5 (SEC ID N�: 23).
17. El complejo molecular de la reivindicación 1, que comprende además una variante de corte y empalme de IgE M2" que tiene la secuencia de SEC ID N�: 26 en el extremo C de la primera proteína de fusión y una variante de corte y empalme de IgE M2" diferente que tiene la secuencia de SEC ID N�: 27 en el extremo C de la segunda proteína de fusión.

10 18. El complejo molecular de la reivindicación 1, que comprende además un ligador de amino�cidos entre el resto efector biológico y la región bisagra, en el que el ligador est� covalentemente unido al extremo C del resto efector y el extremo N de la región bisagra.
19. El complejo molecular de la reivindicación 5, en el que tanto la primera como la segunda proteínas de fusión comprenden la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 1.

15 20. El complejo molecular de la reivindicación 5, en el que tanto la primera como la segunda proteínas de fusión est�n codificadas por la secuencia de nucleótidos de SEC ID N�: 2.
21. El complejo molecular de la reivindicación 19, en el que los residuos de amino�cidos en las posiciones 277-281 de SEC ID N�: 1 (DSEYP) se sustituyen con residuos de amino�cidos KTSG (residuos 315-318 de SEC ID N�: 45) o con residuos de amino�cidos TKTSG (residuos 314-318 de SEC ID N�: 45).

20 22. El complejo molecular de la reivindicación 5, en el que tanto la primera como la segunda proteínas de fusión est�n codificadas por la secuencia de nucleótidos de SEC ID N�: 22.
23. El complejo molecular de la reivindicación 22, en el que los residuos de amino�cidos en las posiciones 263 a 267 de SEC ID N�: 20 se sustituyen con residuos de amino�cidos KTSG (residuos 315-318 de SEC ID N�: 45) o con residuos de amino�cidos TKTSG (residuos 314-318 de SEC ID N�: 45).

25 24. Una composición farmacéutica que comprende: el complejo molecular dim�rico de la reivindicación 1 y un vehículo farmac�uticamente aceptable.