CN115379855A - 稳定的igg4抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本披露涉及包含两条重链的IgG4类抗体，其中这些重链中的每一条均包含含有突变的人IgG4恒定区。本披露进一步涉及使用包含两条重链的IgG4抗体治疗障碍或病症的方法，其中这些重链中的每一条均包含含有突变的人IgG4恒定区。

Description

稳定的IGG4抗体及其用途

技术领域

本披露涉及包含两条重链的抗体，其中这些重链中的每一条均包含含有突变的人IgG4恒定区。本披露进一步涉及使用包含两条重链的抗体治疗障碍或病症的方法，其中这些重链中的每一条均包含含有突变的人IgG4恒定区。

背景技术

IgG4是经历称为Fab臂交换的过程的动态分子。重链之间的二硫键瞬时减少，导致两个半抗体与其他IgG4半抗体重新形成完整抗体。体内，治疗性IgG4可以与内源性IgG4重组，产生双特异性抗体的异质混合物。任何治疗性蛋白质在制造期间可能发生的相关问题是链间二硫键减少。对于IgG4，这主要导致纯化过程中持续存在高水平的半mAb。S228P突变已经用于防止IgG4的半mAb形成。然而，具有S228P突变的IgG4在还原环境中会形成半mAb。因此，仍然需要在制造期间不经历还原和/或在体内不形成半抗体的抗体。

发明内容

本文提供了包含两条重链的IgG4抗体，其中这些重链中的每一条均包含人IgG4恒定区，根据EU索引编号，该人IgG4恒定区在该重链的残基219或220处包含至少一个突变。

本文还提供了包含两条重链的IgG4抗体，其中这些重链中的每一条均包含人IgG4恒定区，根据EU索引编号，该人IgG4恒定区在该重链的残基219、220以及228处包含突变。

本文还提供了治疗患有疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本披露的IgG4抗体。

本文还提供了药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的本披露的IgG4抗体、抗体-药物缀合物、抗体-肽缀合物、或抗体-蛋白质缀合物，以及药学上可接受的载剂。

附图说明

图1显示IgG对硫氧还蛋白系统还原的相对稳定性。将IgG1、IgG2以及IgG4 mAb与硫氧还蛋白系统的组分一起孵育。在指定时间点采集样品，并使用毛细管电泳定量完整的mAb。

图2A-2F显示在硫氧还蛋白系统还原期间形成的中间体种类。将IgG1、IgG2以及IgG4 mAb与硫氧还蛋白系统的组分一起孵育。在指定时间点采集样品，并使用毛细管电泳定量mAb片段。对于所有图，完整的mAb(LHHL)在左轴上，并且片段种类(HHL、HH和HL)在右轴上。游离重链和轻链未显示以帮助可视化。

图3描绘了当暴露于还原条件下时，不同IgG同种型形成的主要中间体。

图4显示铰链突变提高了IgG4 mAb的还原稳定性。将具有指定铰链突变的IgG4mAb与硫氧还蛋白系统的组分一起孵育。在指定时间点采集样品，并使用毛细管电泳定量完整的mAb。数据代表一式三份实验的平均值±SD。

图5A-5H显示铰链突变减少了半抗体形成。将具有指定铰链突变的IgG4 mAb与硫氧还蛋白系统的组分一起孵育。在指定时间点采集样品，并使用毛细管电泳定量mAb片段。游离重链和轻链未显示以帮助可视化。数据代表一式三份实验的平均值±SD。

图6A-6C显示铰链突变不影响抗原、FcRn或FcγRIIIa体外结合。图6A显示在ELISA测定中，与未经修饰的IgG4相比，具有指定铰链突变的IgG4 mAb的抗原结合。同种型对照证明在高达5000nM下无结合(数据未显示)。数据代表重复实验的平均值±SD。图6B显示与AlphaLISA测定中未经修饰的IgG4相比，具有铰链突变的IgG4与FcRn的结合，并且图6C显示其与FcγRIIIa的结合。利妥昔单抗在FcγRIIIa AlphaLISA测定中作为已知的阳性对照运行。数据代表重复独立实验的平均值±SD。

图7A-7H显示未经修饰的IgG4(图7A)、IgG4-S228P(图7B)、IgG4-G220C(图7C)、IgG4-Y219C(图7D)、IgG4-Y219C+G220C(图7E)、IgG4-Y219C+S228P(图7F)、IgG4-G220C+S228P(图7G)、以及IgG4-Y219C+G220C+S228P(图7H)的解卷积质谱。

图8显示IgG1、IgG2和IgG4的恒定重链之间的序列比对。

图9A-9C显示不同还原条件下Fab臂交换的定量。图9A显示在与第二、未经修饰的IgG4一起孵育后，具有指定铰链突变的IgG4 mAb的杂交mAb形成。使用毛细管电泳将杂交mAb形成量化为总蛋白百分比。数据代表一式三份实验的平均值±SD。图9B显示未经修饰的IgG4的毛细管电泳的样品电泳图。图9C显示未经修饰的IgG4的质谱数据。

具体实施方式

本披露涉及包含两条重链的抗体，其中这些重链中的每一条均包含含有突变的人IgG4恒定区。本披露进一步涉及使用包含两条重链的IgG4抗体治疗障碍或病症的方法，其中这些重链中的每一条均包含含有突变的人IgG4恒定区。

如根据本披露所使用的，除非另外指出，否则所有技术和科学术语应被理解为具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数形式，并且复数术语应包括单数形式。

如本文所用，术语“抗体”是指能够识别并特异性结合抗原的蛋白质。普通的或常规的哺乳动物抗体包含四聚体，其典型地由两对相同的多肽链构成，每对由一条“轻”链(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(典型地具有约50-70kDa的分子量)组成。如本文所用，术语“重链”和“轻链”是指具有足够的可变结构域序列以赋予对靶抗原的特异性的任何免疫球蛋白多肽。每条轻链和重链的氨基末端部分典型地包括典型地负责抗原识别的约100个至110个或更多个氨基酸的可变结构域。每条链的羧基末端部分典型地定义负责效应子功能的恒定结构域。因此，在天然存在的抗体中，全长重链免疫球蛋白多肽包括可变结构域(V_H)和三个恒定结构域(C_H1、C_H2和C_H3)以及C_H1和C_H2之间的铰链区，其中该V_H结构域位于多肽的氨基末端且该C_H3结构域位于羧基末端，并且全长轻链免疫球蛋白多肽包括可变结构域(V_L)和恒定结构域(C_L)，其中该V_L结构域位于多肽的氨基末端且该C_L结构域位于羧基末端。

在全长轻链和重链内，可变结构域和恒定结构域典型地由约12个或更多个氨基酸的“J”区域连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区域。每个轻/重链对的可变区典型地形成抗原结合位点。天然存在的抗体的可变结构域典型地表现出由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同的一般结构。来自每对的两条链的CDR典型地通过框架区比对，这可以使得能够结合至特定表位。从氨基末端到羧基末端，轻链和重链可变结构域典型地都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

本文所述的氨基酸残基的编号参考是根据EU编号系统进行的(也描述于Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质的序列]，第5版Public Health Service[公共卫生服务]，National Institutes of Health[国立卫生研究院]，马里兰州贝塞斯达(1991)中)。

在特定的实施例中，本文提供了包含两条重链的IgG4抗体，其中这些重链中的每一条均包含含有至少一个突变的人IgG4恒定区。在一些实施例中，重链包含含有SEQ IDNO：11的氨基酸序列的人IgG4恒定区。在其他实施例中，重链包含人IgG4恒定区，该人IgG4恒定区包含具有一个或多个突变的SEQ ID NO：11的氨基酸序列。在其他实施例中，IgG4重链恒定区包含具有一个、两个或单个突变的SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

在特定的实施例中，本文提供了包含两条重链的IgG4抗体，其中这些重链中的每一条均包含人IgG4恒定区，根据EU索引编号，该人IgG4恒定区在该重链的残基219或220处包含至少一个突变。在一些实施例中，人IgG4恒定区在重链的残基219处包含半胱氨酸。在一些实施例中，人IgG4恒定区在重链的残基220处包含半胱氨酸。在一些实施例中，人IgG4恒定区在重链的残基219处包含半胱氨酸，并且在残基220处包含半胱氨酸。在一些实施例中，人IgG4恒定区在重链残基228处进一步包含脯氨酸。在一些实施例中，这些重链中的每一条均包含人IgG4恒定区，根据EU索引编号，该人IgG4恒定区在该重链的残基219、220以及228处包含突变。在一些实施例中，抗体在重链的残基219处包含半胱氨酸，在重链的残基220处包含半胱氨酸，并且在重链的残基228处包含脯氨酸。

在特定的实施例中，本文提供了包含两条重链的IgG4抗体，其中这些重链中的每一条均包含人IgG4恒定区，该人IgG4恒定区在铰链区内包含至少一个突变。术语“铰链”或“铰链区”是指柔性多肽，该柔性多肽包含IgG4抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸。铰链区中的突变可以通过本领域熟知的方法产生，如使用氨基酸插入、缺失、取代以及重排将修饰引入野生型铰链。可以将本文披露的突变铰链区并入分子(包括但不限于抗体及其片段)中。在特定的实施例中，IgG4抗体包含两条重链，其中这些重链中的每一条均在铰链区内包含至少一个突变。在特定的实施例中，IgG4抗体进一步包含两条轻链。表2详细列出了几种突变铰链的氨基酸序列。在特定的实施例中，IgG4抗体包含两条重链，其中这些重链中的每一条均包含含有铰链区的人IgG4恒定区，该铰链区包含以下的氨基酸序列：VESKCGPPCPSCP(SEQ ID NO：1)、VESKYCPPCPSCP(SEQ ID NO：2)、VESKYGPPCPPCP(SEQ IDNO：8)、VESKCGPPCPPCP(SEQ ID NO：9)、VESKYCPPCPPCP(SEQ ID NO：10)、VESKCCPPCPSCP(SEQ ID NO：3)、或VESKCCPPCPPCP(SEQ ID NO：4)。

术语“载体”是指用于将编码信息转移到宿主细胞的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以向其中插入另外的DNA片段的环状双链DNA分子。另一类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA片段插入病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

本文披露的抗体可以与改变给定生物应答的药物或治疗剂缀合。合适的药物包括化学治疗剂、具有所需生物活性的蛋白质或多肽(例如毒素、血栓剂或抗血管生成剂)、或生长因子。此外，抗体可以与治疗部分(如放射性物质或大环螯合剂)缀合。在一些实施例中，本文提供了包含本文披露的IgG4抗体的抗体-药物缀合物。

本披露的IgG4抗体可以与蛋白质或肽融合或化学缀合以产生融合蛋白。融合并非必须是直接的，而可以通过接头序列来发生。在一些实施例中，本文提供了包含本文披露的IgG4抗体的抗体-肽缀合物。在一些实施例中，本文提供了包含本文披露的IgG4抗体的抗体-蛋白质缀合物。

本文披露的抗体包括双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在特定的实施例中，双特异性抗体能够与第一抗原和第二抗原特异性结合。

术语“特异性结合”是指抗体与特定分子或其片段(例如，抗原)结合的能力。例如，如通过例如免疫测定法(BIAcore)或本领域已知的其他测定法所确定，与分子或其片段特异性结合的抗体可以以较低亲和力与其他分子结合。特别地，与至少一种分子或其片段特异性结合的抗体(或其抗原结合片段)可与非特异性结合该分子或其片段的其它分子竞争。本披露涵盖具有多种特异性的抗体(例如，对两种或更多种离散抗原具有特异性的抗体)。例如，双特异性抗体可以与单个靶抗原上的两个相邻表位结合，或者可以与两种不同的抗原结合。

在一些实施例中，抗体特异性结合促红细胞生成素，β-淀粉样蛋白，血小板生成素，干扰素-α(2a和2b)，干扰素-β(Ib)，干扰素-γ，TNFR I(CD120a)，TNFR II(CD120b)，1型IL-IR(CD121a)，2型IL-IR(CD121b)，IL-2，IL2R(CD25)，IL-2R-β(CD123)，IL-3，IL-4，IL-3R(CD123)，IL-4R(CD124)，IL-5R(CD125)，IL-6R-α(CD126)，IL-6R-β(CD130)，IL-8，IL-10，IL-Il，IL-15，IL-15BP，IL-15R，IL-20，IL-21，TCR可变链，RANK，RANK-L，CTLA4，CXCR4R，CCR5R，TGF-βl、-β2、-β3，G-CSF，GM-CSF，MIF-R(CD74)，M-CSF-R(CD115)，GM-CSFR(CD116)，可溶性FcRI，sFcRII，sFcRIII，FcRn，因子VII，因子VIII，因子IX，VEGF，α-4整联蛋白，Cd11a，CD18，CD20，CD38，CD25，CD74，FcαRI，FcεRI，乙酰胆碱受体，fas，fasL，TRAIL，肝炎病毒，丙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒的包膜E2，组织因子，组织因子和因子VII的复合物，EGFr，HER2，CD4，CD28，VLA-I、2、3、或4，LFA-I，MAC-I，1-选择素，PSGL-I，ICAM-I，P-选择素，骨膜蛋白，CD33(Siglec 3)，Siglec 8，TNF，CCL1，CCL2，CCL3，CCL4，CCL5，CCLU，CCL13，CCL17，CCL18，CCL20，CCL22，CCL26，CCL27，CX3CL1，LIGHT，EGF，VEGF，TGFα，HGF，PDGF，NGF，补体，MBL，因子B，基质金属蛋白酶，CD32b，CD200，CD200R，OX-40，杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)，NKG2D，白细胞相关免疫球蛋白样受体(LAIR)，Iv49，PD-L2，CD26，BST-2，ML-IAP(凋亡蛋白的黑色素瘤抑制剂)，组织蛋白酶D，CD40，CD40R，CD86，B细胞受体，CD79，PD-1，或T细胞受体。

本文披露的IgG4抗体显示出有利的性质。在一些实施例中，抗体具有与不包含突变的IgG4抗体相比改善的还原稳定性。在一些实施例中，抗体具有与不包含突变的IgG4抗体相比大3倍的还原稳定性。在一些实施例中，抗体具有与不包含突变的IgG4抗体相比大6倍的还原稳定性。在一些实施例中，抗体具有与不包含这些突变的IgG4抗体相比减少的半抗体形成。在一些实施例中，抗体具有与不包含这些突变的IgG4抗体相比小至少40％的半抗体形成。在一些实施例中，抗体具有与不包含这些突变的IgG4抗体相比小至少80％的半抗体形成。

在特定的实施例中，本文提供了治疗患有疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本文披露的IgG4抗体。

“疾病”或“病症”是指将从使用本披露的方法进行的治疗中受益的任何病症。“疾病”和“病症”在本文中可互换使用，并且包括慢性和急性障碍或疾病，包括使患者易患所讨论的障碍的那些病理状况。

术语“受试者”旨在包括人和非人动物，特别是哺乳动物。在某些实施例中，受试者是人患者。

如本文所用，术语“治疗(treatment或treat)”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。需要治疗的那些包括患有疾病或病症的受试者，以及易于患上疾病或病症的那些或应预防疾病或病症的那些。

在一些实施例中，本文披露的方法涉及治疗受试者的癌症。在一些实施例中，癌症是黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肝细胞癌、胆管癌或胆道癌、胃癌、食管癌、头颈癌、肾癌、宫颈癌、结直肠癌、或尿路上皮癌。

在一些实施例中，本文披露的方法涉及治疗受试者的神经系统疾病。在一些实施例中，神经系统疾病是缺血性卒中、脑梗死、神经外伤、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(卢伽雷氏病)、或癫痫。

在一些实施例中，本文披露的方法涉及治疗受试者的神经退行性疾病。在一些实施例中，神经退行性疾病是阿尔兹海默病、帕金森病、缺血性痴呆、或亨廷顿病。

在一些实施例中，本文披露的方法涉及治疗受试者的自身免疫病。在一些实施例中，自身免疫病是多发性硬化症、肺纤维化、类风湿性关节炎、1型糖尿病、阿狄森氏病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、银屑病、格雷夫斯病、乳糜泻、桥本氏甲状腺炎、血管炎、或克罗恩病。

在一些实施例中，本文披露的方法涉及治疗受试者的心血管疾病。在一些实施例中，心血管疾病是心律失常、冠心病、脑血管疾病、外周动脉疾病、风湿性心脏病、先天性心脏病、深静脉血栓形成、或肺栓塞。

在一些实施例中，本文披露的方法涉及治疗受试者的代谢疾病。在一些实施例中，代谢疾病是高血糖、胰岛素抗性、糖尿病、血脂异常、或肥胖。

在一些实施例中，本文披露的方法涉及治疗受试者的呼吸疾病。在一些实施例中，呼吸疾病是哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管炎、肺气肿、肺癌、囊性纤维化、肺炎或胸腔积液。

在一些实施例中，本文披露的方法涉及治疗受试者的感染。在一些实施例中，感染是细菌感染或病毒感染。

如本文所用，术语“施用(administration或administering)”是指通过任何适当的途径提供、接触和/或递送一种或多种化合物以实现所需效果。施用可以包括但不限于口服，舌下，肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射)，透皮，局部，颊，直肠，阴道，鼻，眼，经由吸入以及植入物。

如本文所用，术语“共同施用”或“组合”是指同时或顺序施用多种化合物或药剂。第一化合物或药剂可以在施用第二化合物或药剂之前、与其同时或之后施用。第一化合物或药剂和第二化合物或药剂可以在同一天同时或顺序施用，或者可以在1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或1个月内彼此顺序施用。在一些实施例中，化合物或药剂在每种化合物或药剂发挥至少某种生理作用和/或具有剩余功效的期间共同施用。

如本文所用，术语“药物组合物”或“治疗性组合物”是指当适当地向受试者施用时能够诱导所需治疗效果的化合物或组合物。在一些实施例中，本披露提供了药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载剂和治疗有效量的至少一种本披露的抗体、抗体-药物缀合物、抗体-肽缀合物、或抗体-蛋白质缀合物。

“治疗有效剂量”或“治疗剂量”是足以影响期望的临床结果(即实现治疗效果)的量。可以以一次或多次施用，施用治疗有效剂量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”或“生理上可接受的载剂”是指适合于完成或增强本披露的一种或多种抗体的递送的一种或多种配制品材料。

在一些实施例中，本文披露的IgG4抗体可以与药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂一起配制成药物组合物。在某些实施例中，此类药物组合物适于使用本领域中已知的方法经由任何一个或多个施用途径向人或非人动物施用。术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种无毒材料。此类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载剂以及任选地其他治疗剂。此类药学上可接受的制剂还可以含有适合于施用于人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可以用于在本文所描述的配制品中的其他设想的载剂、赋形剂、和/或添加剂包括：例如，调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)等。适用于在本文所述的配制品中使用的这些和额外已知的药物载剂、赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的，例如，如“Remington：The Science&Practice 0fPharmacy[雷明顿：药学科学与实践]”，第21版，Lippincott Williams&Wilkins[利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司]，(2005)以及“Physician’s Desk Reference[医师案头参考]”，第60版，Medical Economics[医学经济学公司]，蒙特维尔(Montvale)，新泽西州(2005)中所列出。可以选择对于所希望或所要求的施用方式、溶解度和/或稳定性来说适合的药学上可接受的载剂。

在一个实施例中，本披露的配制品是基本上不含内毒素和/或相关热原物质的无热原配制品。内毒素包括限制在微生物体内并且仅当微生物破坏或死亡时才释放出来的毒素。热原物质还包括来自细菌和其他微生物外膜的诱导发热的热稳定物质(糖蛋白类)。如果向人施用这两种物质，会引起发热、低血压和休克。由于潜在的有害影响，即使低量的内毒素也必须从静脉施用的药物溶液中去除。食品与药物管理局(“FDA”)已经针对静脉药物施用，设置了在单个一小时内每公斤体重每剂量的5个内毒素单位(EU)的上限(The UnitedStates Pharmacopeial Convention，Pharmacopeial Forum[美国药典委员会，药典论坛]26(1)：223(2000))。在某些实施例中，组合物中的内毒素和热原水平小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。

当用于体内施用时，本披露的配制品应是无菌的。本披露的配制品可以通过各种灭菌方法(包括例如无菌过滤或辐射)灭菌。在一个实施例中，将该配制品用预先灭菌的0.22微米过滤器进行过滤灭菌。注射用无菌组合物可以按照如在“Remington：TheScience&Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，”第21版，LippincottWilliams&Wilkins[利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司]，(2005)中描述的常规制药实践来配制。

在一些实施例中，可以将治疗组合物配制用于特定施用途径，如口服、鼻、肺、局部(包括颊和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用。如本文所用，术语“肠胃外施用”和“肠胃外施用的”是指除了肠道和局部施用以外的施用方式(通常通过注射)，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。本披露的适合于局部或经皮施用的配制品包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂以及吸入剂。这些抗体和其他活性物可以在无菌条件下与药学上可接受的载剂混合、并且与可能要求的任何防腐剂、缓冲剂、或推进剂混合(参见，例如，美国专利号7,378,110；7,258,873；以及7,135,180；美国专利申请公开号2004/0042972和2004/0042971)。

这些配制品可以以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域已知的任何方法制备。本披露的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化以便于获得有效实现对于特定患者、组合物和施用方式所需的治疗缓解而对该患者无毒的活性成分的量(例如，“治疗有效量”)。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的特定组合物的活性，施用途径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史，以及在医学领域中熟知的类似因素。这些剂量可以每天、每周、每两周、每月或不频繁地施用，例如一年两次，这取决于剂量、施用方法、待治疗的障碍或一种或多种症状以及个体受试者特征。还可以将剂量经由连续输注(如通过泵)施用。施用的剂量还可能取决于施用途径。例如，皮下施用可能需要比静脉内施用更高的剂量。如上所述，任何常用的给药方案(例如，通过每天或每周两次注射或输注来施用1-10mg/kg)可以适配和适合于与治疗人癌症患者有关的方法。

在特定的实施例中，本文提供了体外诊断受试者疾病或病症的方法。本文披露的抗体可以在体外用于免疫测定，其中这些抗体可在液相中使用或与固相载剂结合。此外，可以以各种方式可检测地标记这些免疫测定中的抗体。可利用本文披露的抗体的免疫测定类型的实例是流式细胞术，例如，直接或间接形式的FACS、MACS、免疫组织化学、竞争性和非竞争性免疫测定。

在不限制本披露的情况下，本文出于说明目的描述了本披露的多个实施例。

实例

以下实例说明了本披露的特定实施例及其各种用途。阐述它们仅出于解释目的并且不应以任何方式解释为限制本披露的范围。

材料与方法

还原稳定性

通过将1.2mg/mL的纯化抗体加标至溶液中，来评估mAb对硫氧还蛋白系统还原的相对稳定性，这些溶液含有在含有10mM EDTA的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的2μM硫氧还蛋白(艾博抗公司(Abcam)；剑桥，马萨诸塞州)、0.1μM硫氧还蛋白还原酶(凯曼化学品公司(Cayman Chemical)；安娜堡，密歇根州)、以及0.24mM NADPH(密理博西格玛公司(Millipore-Sigma)；圣路易斯，密苏里州)。使用LabChip GXII Touch HT(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))对形成的完整抗体和中间体的量进行定量。在指定时间点采集样品，将其在-80℃下冷冻储存，并且然后按照珀金埃尔默公司的标准方案，使用非还原条件进行分析。

mAb表达和纯化

使用如前所述的定点诱变将铰链突变全部并入到相同的IgG4序列中(Peng等人，PloS One[公共科学图书馆期刊]7：e36412(2012)；Bezabeh等人，mAbs 9：240-56(2017))。突变IgG4序列通过瞬时转染在CHO细胞中表达，并使用蛋白A色谱法纯化，然后进行尺寸排阻纯化，以将产物聚集体减少至＜2％。

抗原结合ELISA

将96孔板在4℃下用4μg/mL的靶抗原包被过夜。将这些板用在含有0.5％吐温20的PBS中的5％牛奶溶液封闭。用二级抗人IgG4HR-缀合抗体(1：1000稀释，英杰公司(Invitrogen)MH1742)检测初级mAb。添加四甲基联苯胺(TMB)后，将反应用0.2N的硫酸终止，并在450nm下读取吸光度。在所有步骤之间，将孔用含有0.05％吐温20的PBS洗涤4次。

FcRn结合AlphaLISA

FcRn竞争结合测定试剂盒(珀金埃尔默公司，目录号AL3095)用于测量相对FcRn结合。与FcRn结合的抗体的浓度增加竞争性地阻断了受体和供体珠近端相互作用的能力，这反过来又降低了测定信号。将IgG4抗体样品在MES缓冲液中制备为起始浓度100μg/mL。制备十点稀释系列并将其在96孔板中在室温下与生物素化FcRn孵育45分钟。将链霉亲和素包被的供体珠和人IgG缀合的受体珠制备为20μg/mL，添加至抗体-FcRn溶液中，并在黑暗中在室温下孵育60分钟。使用Envision光谱仪来定量化学发光，并用SoftMax软件使用4参数拟合来拟合所得数据。

FcγRIIIa结合AlphaLISA

将

FcγRIIIa竞争结合测定试剂盒(珀金埃尔默公司，目录号AL348)用于测量相对FcγRIIIa-158V结合。通过链霉亲和素包被的供体珠捕获生物素化人FcγRIIIa-158V。在不存在抗体样品的情况下，与受体珠缀合的人IgG Fc区结合FcγRIIIa-158V，并使供体和受体珠靠近，产生化学发光发射。将IgG4抗体样品在HiBlock缓冲液中制备为起始浓度20μg/mL，并且在室温下与生物素化人FcγRIIIa-158V预孵育30分钟以促进结合。将受体或供体珠制备为20μg/mL，然后添加至抗体-受体溶液中，并在黑暗中在室温下孵育60分钟。使用Envision光谱仪来定量化学发光，并用SoftMax软件使用4参数拟合来拟合所得数据。利妥昔单抗作为已知的阳性对照运行。

质谱

用Waters SYNAPT G2-Si高清质谱仪结合UPLC系统(沃特世公司(Waters))进行完整质量分析。对于非还原完整质量分析，将1μg的每个样品直接注射至反相柱(AcquityUPLC BEH300，C4，1.7μm，2.1mm×50mm；沃特世公司)上，并且在使用流动相A(包含在水中的0.1％FA和0.01％TFA)和流动相B(包含在乙腈中的0.1％FA和0.01％TFA)的线性梯度上洗脱。在500-4,500m/z的范围中收集质谱。使用MassLynx软件(沃特世公司)中的MaxEnt I，通过反卷积质量数据来测定分子质量。

实例1：IgG同种型的还原动力学和途径的比较

通过将各mAb与硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和NADPH一起孵育来测试多种mAb还原的相对稳定性。评估的mAb的文库包括IgG1、IgG2以及IgG4。此外，这些mAb中的四种具有λ轻链，五种具有κ轻链，并且这些IgG4中的一种具有常用的S228P突变。发现对于还原，IgG2比IgG1更稳定，并且具有κ轻链的mAb比具有λ轻链的mAb更稳定(图1)(Hutterer等人，mAbs 5：608-13(2013))。有趣的是，尽管IgG4倾向于形成半mAb，但发现对于还原，IgG4 mAb比IgG1更稳定。已将S228P突变并入至几种治疗性IgG4中，以防止形成半mAb(Kaplon等人，mAbs 11：219-38(2019))。正如预期，对于还原，具有S228P突变的IgG4比具有野生型铰链序列的IgG4更稳定。

接下来，在通过硫氧还蛋白系统将mAb从完整的mAb还原为游离重链和轻链时，检查每种mAb形成的中间体种类。图2显示了含有IgG1、IgG2、以及IgG4的代表性组之间的比较，每组都有κ或λ轻链。结果证明，IgG1和IgG2形成了相似的中间体种类，并且这些种类取决于轻链类型。有λ轻链的IgG1和IgG2 mAb形成的主要中间体种类是重链二聚体(HH)，而有κ轻链的IgG1和IgG2 mAb形成与重链二聚体(HH)相比数量相似或更多的半mAb(HL)。这些结果证明，λ轻链和重链之间的二硫键比κ轻链和重链之间的二硫键更容易被还原。

IgG4 mAb形成的中间体不取决于轻链同种型，或甚至不取决于S228P铰链突变的存在。如图2中所示，由于被硫氧还蛋白系统还原，两种IgG4几乎只形成半mAb(HL)。具有S228P突变的IgG4对于硫氧还蛋白系统还原更稳定，但结果证明，还原后，mAb仍仅形成半mAb(HL)。考虑到已将S228P突变工程化至多种治疗性mAb中，以防止形成半mAb和Fab臂交换，这是令人惊讶的。然而，尽管在比未经修饰的IgG4所需的还原条件更强的还原条件下，这一结果与观察到的含有S228P突变的铰链稳定的IgG4 mAb可以经历Fab臂交换一致(Labrijn等人，Nat.Biotechnol.[自然生物技术]27：767-71(2009)；Stubenrauch等人，Drug Metab.Dispos.[药物代谢与处置]38(1)：84-91(2010))。此外，这些结果证明，在所有情况下，半mAb形成和还原稳定性不相关。IgG4 mAb比IgG1对于还原更稳定，但IgG1形成的半mAb水平相对较低。图2中的结果如图3中所示，图3说明了不同mAb类型在被硫氧还蛋白系统还原时形成的主要中间体种类。

实例2：铰链突变防止半mAb形成并提高还原稳定性

比较了IgG1、IgG2以及IgG4的重链铰链序列(表1)。IgG1和IgG2 mAb在位置228处均含有脯氨酸，而IgG4mAb含有丝氨酸。S228P突变已被广泛用于整个行业，以防止Fab臂交换，并且因此被纳入评估中。

表1.使用EU编号的IgG1、IgG2以及IgG4抗体的铰链区的氨基酸序列比较。评估的突变位置以粗体文本表示。

鉴定基于IgG2 mAb的铰链序列的两种另外的新型突变。IgG1、IgG2以及IgG4 mAb在位置226和229处含有二硫键，而IgG2在另外的219和220位置处含有二硫键。IgG2 mAb对于还原最稳定，并且假设这至少部分是由于铰链区有四个二硫键，而相比IgG1和IgG4 mAb只有两种铰链二硫键。基于序列比对(表1)，评估了IgG4中的Y219C和G220C突变；这些突变中的每一个都在铰链区的重链之间添加了一个另外的二硫键。

表2.使用EU编号的IgG4抗体的铰链区的氨基酸序列。突变位置以粗体文本表示。

检查了一组IgG4(IgG4、IgG4-Y219C、IgG4-G220C以及IgG4-S228P)对硫氧还蛋白系统还原的相对稳定性(图4)。图4中的结果适用于一阶指数衰减模型，以计算每种mAb的半衰期。mAb的半衰期代表了mAb对硫氧还蛋白系统还原的稳定性，并且含有铰链突变的IgG4与未经修饰的IgG4的半衰期比较提供了稳定性的相对改善(表3)。

表3.通过将图4中的结果拟合为一阶指数衰减来评估IgG4的相对稳定性，以确定每种mAb的半衰期。

一个或多个IgG4铰链区突变	减少50％(min)	改善倍数
			未经修饰的	12.3	NA
Y219C	15.9	1.3
			G220C	27.5	2.2
S228P	37.3	3.0
			Y219C+S228P	44.0	3.6
G220C+S228P	59.0	4.8
			Y219C+G220C	32.1	2.6
Y219C+G220C+S228P	83.9	6.8
			IgG1λ	3.2	0.3
IgG2λ	41.7	3.4

这些结果显示，Y219C突变仅提供了最小程度的稳定性改善，而G220C和S228P突变分别提供了大于2倍和3倍的还原稳定性提高。接下来，评估了这四种mAb还原时形成的中间体种类，以确定形成的半mAb的量是否存在差异。与早期结果一致(图2)，未经修饰的IgG4和IgG4-S228P两者均主要形成半mAb，因为它们被硫氧还蛋白系统还原。有趣的是，与野生型IgG4相比，Y219C突变几乎消除了半mAb的形成，而G220C突变减少了半mAb的量。总之，Y219C突变仅提供了对还原稳定性的最小程度的提高，但几乎消除了半mAb的形成，G220C突变既提高了mAb的还原稳定性，又减少了半mAb的形成，并且S228P突变提高了mAb的还原稳定性，但不影响半mAb的形成量。

实例3：铰链突变的作用是累加的

评估了铰链突变的组合，以确定当在同一分子中组合时，每个单独的突变的有益作用是否为累加的。

评估的第一个双突变体含有Y219C和S228P突变两者。单独地，Y219C突变防止半mAb的形成，最小程度的提高还原稳定性，并且S228P突变提高还原稳定性，而不改变形成的半mAb的量。与未经修饰的IgG4相比，IgG4-Y219C+S228P显著改善了还原稳定性(图4，表3)，并且减少了半mAb形成(图5)。重要的是，与IgG4-S228P mAb相比，IgG4-Y219C+S228P略微改善了还原稳定性，并且与IgG4-Y219C相比，具有相当的半mAb形成。这些结果显示，突变的作用是累加的；在含有S228P突变的IgG4中添加Y219C突变略微提高了mAb的还原稳定性，同时也几乎消除了半mAb的形成。

评估的第二个双突变体含有G220C和S228P突变两者。单独地，G220C突变提高还原稳定性，减少半mAb形成，并且S228P突变提高还原稳定性，而不改变半mAb的形成量。与未经修饰的IgG4相比，IgG4-G220C+S228P显著改善了还原稳定性(图4，表3)，并且减少了半mAb形成(图5)。重要的是，IgG4-G220C+S228P具有比单独的G220C或S228P IgG4更高的还原稳定性。此外，IgG4-G220C+S228P减少了半mAb形成，如在IgG4-G220C中观察到的。这些结果进一步证明突变的作用是累加的；G220C突变提高还原稳定性且减少半mAb形成，并且S228P突变提高还原稳定性。

评估的最后一个双突变体含有Y219C和G220C突变两者。单独地，Y219C突变防止半mAb的形成，最小程度的提高还原稳定性，并且G220C突变提高还原稳定性，减少形成的半mAb的量。与未经修饰的IgG4相比，IgG4-Y219C+G220C显著改善了还原稳定性(图4，表3)，并且减少了半mAb形成(图5)。与IgG4-G220C相比，IgG4-Y219C+G220C具有改善的还原稳定性，然而，半mAb的形成量也与IgG4-G220C相似。在这种情况下，向G220C mAb中添加Y219C突变轻微改善了稳定性，然而没有观察到半mab形成的另外减少。此分子的完整质谱分析显示，铰链区仅形成两个二硫键，而不是预期的四个(表4，表5，图7A-7H)。

表4.各突变对铰链二硫键数量、相对还原稳定性和半mAb形成的影响汇总。

表5.含有和不含铰链区突变的IgG4 mAb的完整质谱分析的汇总。

评估的最后的mAb含有所有这三个突变。IgG4-Y219C+G220C+S228P具有最大的总体还原稳定性(图4，表3)，并且形成非常少的半mAb(图5)。此mAb的三个突变的作用是加和性的，而在双突变IgG4-Y219C+G220C的情况下，它们不是累加的。三重突变mAb的完整质谱分析证明，形成了所有四个铰链二硫键。除IgG4-Y219C+G220C外，此研究中的所有mAb均具有预期数量的铰链二硫键(表4，表4，图7)。对具有S228P突变的IgG4 mAb的先前分析表明，稳定性提高是铰链区构象变化的结果，这是由于取代丝氨酸的氨基酸脯氨酸氨基酸柔性较差。在这种情况下，可能在IgG4-Y219C+G220C+S228P中，正确排列和形成四个铰链二硫键需要S228P突变引起的铰链构象变化。

实例4：铰链突变不影响抗原结合、FcRn结合或Fc效应子功能

评估的三个突变均位于铰链区，并且因此预期不会影响抗原结合。然而，IgG4铰链区的另外的二硫键可能会改变mAb的构象，以削弱抗原结合。因此，在ELISA测定中，将铰链区突变的所有七种mAb的抗原结合与未经修饰的IgG4进行比较。如图6A中所示，所有七种mAb展示与未经修饰的IgG4类似的抗原结合。这一结果证明，这些突变可以并入IgG4而不影响抗原结合。

与新生儿Fc受体(FcRn)结合为IgG提供了长的血清半衰期，使得可每月给药一次或更低频率给药(Pyzik等人，J.Immunol.[免疫学杂志]194：4595-603(2015))。FcRn结合位点位于CH3和CH2结构域之间的重链上，并且因此未预测会受到铰链突变的影响。然而，由于FcRn结合对治疗性mAb的功效的重要性，证明铰链突变不抑制FcRn结合至关重要。图6B中的结果证明，具有铰链突变的所有IgG4具有与未经修饰的IgG4相似的与FcRn的结合。此结果证明，铰链突变不减少体外FcRn结合。此外，由于Fab部分保持不变，与未经修饰的IgG4相比，铰链突变不太可能对药代动力学产生不利影响。

为确认铰链修饰不太可能增加ADCC活性，评估了FcγRIIIa结合。图6C中的结果证明，此研究中评估的所有IgG4的FcγRIIIa结合可忽略。因此，图6所示的结果证明，铰链突变不太可能影响体内Fc效应子功能。

实例5：铰链突变减少Fab臂交换

在不同氧化还原条件下，评估每种IgG4 mAb的Fab臂交换：(1)氧化；(2)轻度还原；以及(3)还原。使用氧化型谷胱甘肽(GSSG)创造氧化条件。使用1∶1比率的氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽(GSSG：GSH)创造轻度还原条件。使用还原型谷胱甘肽(GSH)创造还原条件。在不同的氧化还原条件下，分别将每种IgG4与未经修饰的IgG4孵育。通过使用毛细管电泳(图9A)定量杂交mAb形成量占总蛋白的百分比来测量Fab臂交换，并使用质谱进行确认(图9C)。

图9A中的结果显示出，与未经修饰的IgG4相比，有铰链突变的所有IgG4 mAb均具有显著减少的Fab臂交换。IgG4-Y219C mAb在轻度还原条件下显示低水平的Fab臂交换，在更强的还原型GSH条件下显示增加。IgG4-G220C mAb在所有氧化还原条件下显示不可检测水平的Fab臂交换。IgG4-S228P mAb在氧化和轻度还原条件下显示不可检测水平的Fab臂交换，但在更强的还原型GSH条件下显示中等水平的Fab臂交换。包括有S228P突变的第二IgG4(S228P-2)以用于比较，并且产生了相似结果。

此外，铰链突变的组合在减少Fab臂交换中显示累加作用。IgG4-Y219C+S228P mAb显示与IgG4-S228P mAb相比略微提高的还原稳定性，以及与单独的IgG4-Y219C或IgG4-S228P mAb相比更低的Fab臂交换。与IgG4-G220C mAb一致，IgG4-G220C+S228P mAb在所有氧化还原条件下均具有不可检测水平的Fab臂交换。IgG4-Y219C+G220C mAb在氧化和轻度还原条件下具有不可检测的Fab臂交换，但最强还原条件下的Fab臂交换水平与在相同条件下观察到的IgG4-Y219C mAb的水平相似。IgG4-Y219C+G220C+S228P mAb在所有氧化还原条件下均显示最大的还原稳定性和不可检测的Fab臂交换。这些结果显示，铰链突变的作用在降低Fab臂交换的量中是累加的。

序列表

<110> 免疫医疗有限责任公司

<120> 稳定的IGG4抗体及其用途

<130> 20-171-PRO

<160> 11

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

Val Glu Ser Lys Cys Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 2

Val Glu Ser Lys Tyr Cys Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 3

Val Glu Ser Lys Cys Cys Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

Val Glu Ser Lys Cys Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 6

Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 7

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 8

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 9

Val Glu Ser Lys Cys Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 10

Val Glu Ser Lys Tyr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 11

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

Claims (47)

1.一种包含两条重链的IgG4抗体，其中这些重链中的每一条均包含人IgG4恒定区，根据EU索引编号，该人IgG4恒定区在该重链的残基219或220处包含至少一个突变。

2.如权利要求1所述的IgG4抗体，其中根据EU索引编号，该人IgG4恒定区在该重链的残基219处包含半胱氨酸。

3.如权利要求2所述的IgG4抗体，其中该人IgG4恒定区包含铰链区，该铰链区包含SEQID NO：1的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的IgG4抗体，其中根据EU索引编号，该人IgG4恒定区在该重链的残基220处包含半胱氨酸。

5.如权利要求4所述的IgG4抗体，其中该人IgG4恒定区包含铰链区，该铰链区包含SEQID NO：2的氨基酸序列。

6.如权利要求1、2和4中任一项所述的IgG4抗体，其中根据EU索引编号，该人IgG4恒定区在该重链的残基219处包含半胱氨酸并在该重链的残基220处包含半胱氨酸。

7.如权利要求1、2、4和6中任一项所述的IgG4抗体，其中该人IgG4恒定区包含铰链区，该铰链区包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

8.如权利要求1-7中任一项所述的IgG4抗体，其中根据EU索引编号，该人IgG4恒定区在该重链的残基228处进一步包含脯氨酸。

9.一种包含两条重链的IgG4抗体，其中这些重链中的每一条均包含人IgG4恒定区，根据EU索引编号，该人IgG4恒定区在该重链的残基219、220以及228处包含突变。

10.如权利要求9所述的IgG4抗体，其中根据EU索引编号，该抗体在该重链的残基219处包含半胱氨酸，在该重链的残基220处包含半胱氨酸，并且在该重链的残基228处包含脯氨酸。

11.如权利要求9或权利要求10所述的IgG4抗体，其中该人IgG4恒定区包含铰链区，该铰链区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

12.如权利要求1-11中任一项所述的IgG4抗体，其中该IgG4抗体包含两条轻链。

13.如权利要求1-12中任一项所述的IgG4抗体，其中该抗体是人抗体或人源化抗体。

14.如权利要求1-13中任一项所述的IgG4抗体，其中该抗体特异性结合促红细胞生成素，β-淀粉样蛋白，血小板生成素，干扰素-α(2a和2b)，干扰素-β(Ib)，干扰素-γ，TNFR I(CD120a)，TNFR II(CD120b)，1型IL-IR(CD121a)，2型IL-IR(CD121b)，IL-2，IL2R(CD25)，IL-2R-β(CD123)，IL-3，IL-4，IL-3R(CD123)，IL-4R(CD124)，IL-5R(CD125)，IL-6R-α(CD126)，IL-6R-β(CD130)，IL-8，IL-10，IL-Il，IL-15，IL-15BP，IL-15R，IL-20，IL-21，TCR可变链，RANK，RANK-L，CTLA4，CXCR4R，CCR5R，TGF-β1、-β2、-β3，G-CSF，GM-CSF，MIF-R(CD74)，M-CSF-R(CD115)，GM-CSFR(CD116)，可溶性FcRI，sFcRII，sFcRIII，FcRn，因子VII，因子VIII，因子IX，VEGF，α-4整联蛋白，Cd11a，CD18，CD20，CD38，CD25，CD74，FcαRI，FcεRI，乙酰胆碱受体，fas，fasL，TRAIL，肝炎病毒，丙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒的包膜E2，组织因子，组织因子和因子VII的复合物，EGFr，HER2，CD4，CD28，VLA-I、2、3、或4，LFA-I，MAC-I，1-选择素，PSGL-I，ICAM-I，P-选择素，骨膜蛋白，CD33(Siglec 3)，Siglec8，TNF，CCL1，CCL2，CCL3，CCL4，CCL5，CCLU，CCL13，CCL17，CCL18，CCL20，CCL22，CCL26，CCL27，CX3CL1，LIGHT，EGF，VEGF，TGFα，HGF，PDGF，NGF，补体，MBL，因子B，基质金属蛋白酶，CD32b，CD200，CD200R，OX-40，杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)，NKG2D，白细胞相关免疫球蛋白样受体(LAIR)，Iv49，PD-L2，CD26，BST-2，ML-IAP(凋亡蛋白的黑色素瘤抑制剂)，组织蛋白酶D，CD40，CD40R，CD86，B细胞受体，CD79，PD-1，或T细胞受体。

15.如权利要求1-14中任一项所述的IgG4抗体，其中该抗体具有与不包含这些突变的IgG4抗体相比改善的还原稳定性。

16.如权利要求1-15中任一项所述的IgG4抗体，其中该抗体具有与不包含这些突变的IgG4抗体相比大3倍的还原稳定性。

17.如权利要求1-16中任一项所述的IgG4抗体，其中该抗体具有与不包含这些突变的IgG4抗体相比大6倍的还原稳定性。

18.如权利要求1-17中任一项所述的IgG4抗体，其中该抗体具有与不包含这些突变的IgG4抗体相比减少的半抗体形成。

19.如权利要求1-18中任一项所述的IgG4抗体，其中该抗体具有与不包含这些突变的IgG4抗体相比小至少40％的半抗体形成。

20.如权利要求1-19中任一项所述的IgG4抗体，其中该抗体具有与不包含这些突变的IgG4抗体相比小至少80％的半抗体形成。

21.如权利要求1-20中任一项所述的IgG4抗体，其中该抗体是双特异性抗体。

22.如权利要求21所述的IgG4抗体，其中该双特异性抗体能够与第一抗原和第二抗原特异性结合。

23.一种抗体-药物缀合物，该抗体-药物缀合物包含如权利要求1-22中任一项所述的IgG4抗体和药物。

24.一种抗体-肽缀合物，该抗体-肽缀合物包含如权利要求1-22中任一项所述的IgG4抗体和肽。

25.一种抗体-蛋白质缀合物，该抗体-蛋白质缀合物包含如权利要求1-22中任一项所述的IgG4抗体和蛋白质。

26.一种治疗患有疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的如权利要求1-22中任一项所述的IgG4抗体、如权利要求23所述的抗体-药物缀合物、如权利要求24所述的抗体-肽缀合物、或如权利要求25所述的抗体-蛋白质缀合物。

27.如权利要求26所述的方法，其中该疾病或病症是癌症。

28.如权利要求27所述的方法，其中该癌症是黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肝细胞癌、胆管癌或胆道癌、胃癌、食管癌、头颈癌、肾癌、宫颈癌、结直肠癌、或尿路上皮癌。

29.如权利要求26所述的方法，其中该疾病或病症是神经系统疾病。

30.如权利要求29所述的方法，其中该神经系统疾病是缺血性卒中、脑梗死、神经外伤、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(卢伽雷氏病)、或癫痫。

31.如权利要求26所述的方法，其中该疾病或病症是神经退行性疾病。

32.如权利要求31所述的方法，其中该神经退行性疾病是阿尔兹海默病、帕金森病、缺血性痴呆、或亨廷顿病。

33.如权利要求26所述的方法，其中该疾病或病症是自身免疫病。

34.如权利要求33所述的方法，其中该自身免疫病是多发性硬化症、肺纤维化、类风湿性关节炎、1型糖尿病、阿狄森氏病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、银屑病、格雷夫斯病、乳糜泻、桥本氏甲状腺炎、血管炎、或克罗恩病。

35.如权利要求26所述的方法，其中该疾病或病症是心血管疾病。

36.如权利要求35所述的方法，其中该心血管疾病是心律失常、冠心病、脑血管疾病、外周动脉疾病、风湿性心脏病、先天性心脏病、深静脉血栓形成、或肺栓塞。

37.如权利要求26所述的方法，其中该疾病或病症是代谢疾病。

38.如权利要求37所述的方法，其中该代谢疾病是高血糖、胰岛素抗性、糖尿病、血脂异常、或肥胖。

39.如权利要求26所述的方法，其中该疾病或病症是呼吸疾病。

40.如权利要求39所述的方法，其中该呼吸疾病是哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管炎、肺气肿、肺癌、囊性纤维化、肺炎或胸腔积液。

41.如权利要求26所述的方法，其中该疾病或病症是感染。

42.如权利要求41所述的方法，其中该感染是细菌感染或病毒感染。

43.一种体外诊断受试者的疾病或病症的方法，该方法使用如权利要求1-22中任一项所述的IgG4抗体、如权利要求23所述的抗体-药物缀合物、如权利要求24所述的抗体-肽缀合物、或如权利要求25所述的抗体-蛋白质缀合物。

44.一种药物组合物，该药物组合物包含

(a)治疗有效量的如权利要求1-22中任一项所述的IgG4抗体、如权利要求23所述的抗体-药物缀合物、如权利要求24所述的抗体-肽缀合物、或如权利要求25所述的抗体-蛋白质缀合物；以及

(b)药学上可接受的载剂。

45.一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码如权利要求1-22中任一项所述的抗体。

46.一种载体，该载体包含如权利要求45所述的核酸分子。

47.一种分离的宿主细胞，该分离的宿主细胞包含如权利要求46所述的载体。

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