KR20200002889A - Ox40 및 ctla-4에 대한 이중특이적 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 결합 도메인 및 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 폴리펩타이드, 예컨대, 이중특이적 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 이중특이적 폴리펩타이드의 조성물 뿐만 아니라 이의 방법 및 용도를 제공한다.

Description

OX40 및 CTLA-4에 대한 이중특이적 항체
본 발명은 OX40 및 CTLA-4, 특히 인간 OX40 및 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 이중특이적 폴리펩타이드에 관한 것이다.
암은 선진국에서 조기 사망의 주된 원인이다. 암의 면역요법은 종양 세포에 대해 효과적인 면역 반응을 늘리는 것을 목적으로 한다. 이는 예를 들어, 종양 항원에 대한 관용(tolerance)을 무너뜨리며, 항종양 면역 반응을 증가시키고, 종양 부위에서 국소 사이토카인 반응을 자극함으로써 달성될 수 있다. 장기지속형(long lasting) 항종양 면역 반응의 주된 효과기 세포는 활성화된 종양 특이적 효과기 T 세포이다. 활성화된 효과기 T 세포의 강력한 증대(expansion)는 종양에 대한 면역 반응을 전용(redirect)할 수 있다. 이러한 맥락에서, 조절 T 세포(Treg)는 항종양 면역력을 저해하는 역할을 한다. 따라서, Treg를 격감시키거나, 저해하거나, 복귀시키거나 불활성화시키는 것은 종양 미세환경에서 항종양 효과를 제공하고 면역 억제를 복귀시킬 수 있다. 나아가, 예를 들어, 수지상 세포에 의한 효과기 T 세포의 불완전 활성화는 T 세포 면역성 결여(anergy)를 유발할 수 있으며, 이는 비효율적인 항종양 반응을 초래하는 반면, 수지상 세포에 의한 적절한 유도는 활성화된 효과기 T 세포의 강력한 증대를 발생시켜, 종양에 대한 면역 반응을 전용할 수 있다. 또한, 자연 살해(NK) 세포는 하향-조절된 인간 백혈구 항원(HLA) 발현을 갖는 종양 세포를 공격함으로써, 및 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 유도함으로써 종양 면역학에서 중요한 역할을 한다. 따라서, NK 세포의 자극 또한, 종양 성장을 감소시킬 수 있다.
OX40(그렇지 않다면 CD134 또는 TNFRSF4로서 공지됨)은 주로 활성화된 T 세포(대체로 CD4+ 효과기 T 세포, 뿐만 아니라 CD8+ 효과기 T-세포 및 조절 T 세포(Treg)) 상에서 발현되는 TNFR 계통(family)의 구성원이다. 마우스에서, 이러한 발현은 Treg 상에서 구성적이지만, 인간에서는 그렇지 않다. OX40 발현은 전형적으로, 활성화(T 세포 수용체 참여(engagement))의 24시간 이내에 발생하고, 48 내지 72시간 후에 피크를 형성한다. OX40 자극은 활성화된 T 세포의 생존 및 증식에 중요하다. OX40에 대해 유일한 공지된 리간드는 OX40L이고, 이러한 OX40L은 주로 항원 제시 세포, 예컨대, 수지상 세포 및 B 세포 상에서, 전형적으로 이들의 활성화 후에 발현된다. OX40-매개 T 세포 활성화의 순(net) 결과는 예를 들어, ADCC 또는 ADCP를 통한 TH1 효과기 T 세포 활성화 프로파일의 유도 및 Treg 세포의 활성 그리고/또는 수의 감소이다. 종합적으로 이들 효과는 항종양 면역력에 기여할 수 있다. OX40은 많은 고형 종양, 예컨대, 흑색종, 폐암 및 신장암에서 조절 T 세포 상에서 과발현된다.
마우스에서 종양 모델의 OX40 효능제 치료는 흑색종, 신경교종, 육종, 전립선, 결장암 및 신장암을 포함하여 몇몇 상이한 암 유형의 항종양 효과 및 치유를 초래하는 것으로 제시되었다. 데이터는 CD40 효능제 치료에서 보여진 효과와 유사한, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 모두를 수반하는 종양 특이적 T-세포 반응과 일관된다. IL-12 및 다른 사이토카인의 첨가, 및 다른 면역조절제 및 화학/방사선요법과의 조합은 OX40 효능제 치료의 치료 효과를 향상시키는 것으로 제시되었다. 전임상 모델로부터의 증거는, 항-OX40 항체의 효과가 FcγR를 활성화시키는 데 의존함을 제안한다. 모든 다른 요법에 실패한 말기 환자에서 마우스 항-인간 OX40 클론 9B12를 시험하는 임상 I상 연구는 프로비던스 암센터(Providence Cancer Centre)에서 수행되었다. 상기 항체는 양호하게 관용되었다. 종양 위축과 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식에서의 증가가 관찰되었다. 저독성은 짧은 반감기 및 항-약물 항체(이러한 항체는 마우스 항체였음)에 의해서 유발될 뿐만 아니라 비-활성화된 T 세포 상에서 OX40의 상대적으로 낮은 발현 수준에 의해서도 유발될 수 있다. 이러한 항체의 항종양 효과는 중간(modest)이었다.
OX40을 표적화하는 기존의 항체는 일반적으로, 각각의 수용체를 발현하는 세포 내로 강한 신호전달을 유도하기 위해 다른 세포 상에서 예를 들어, Fc감마 수용체를 통한 가교에 의존한다. 따라서, 이들 항체는, 이러한 가교가 제공되지 않는 경우 효율적으로 신호 전달하지 않는다. 또한, TNF 수용체 계통 구성원을 통한 연장된 및 계속적인 활성화는 면역 고갈(exhaustion)을 초래할 수 있다.
T 세포 수용체 CTLA-4는 T 세포 활성화의 음성 조절자로서 역할을 하고, 초기 활성화 후 T-세포 표면 상에서 상향 조절된다. 항원 제시 세포에 의해 발현되는 CTLA-4 수용체의 리간드는 B7 단백질이다. T 세포 활성화의 상향조절에 관여하는 상응하는 리간드 수용체 쌍은 CD28 - B7이다. CD28을 통한 신호전달은 공동자극 경로를 이루고, T 세포의 활성화 시, MHC 복합체에 의해 제시되는 항원 펩타이드를 인지하는 T 세포 수용체를 통해 뒤따른다. B7-1 그리고/또는 B7-2 리간드에 대한 CTLA-4 상호작용을 차단함으로서, 면역 반응의 정상적인 체크포인트 중 하나가 제거될 수 있다. 순 결과는 효과기 T 세포의 증강된 활성이고, 이는 항종양 면역력에 기여할 수 있다. OX40에서와 같이, 이는 예를 들어, ADCC 또는 ADCP를 통한 효과기 T 세포의 직접적인 활성화로 인한 것일 수 있으며, 뿐만 아니라 Treg 세포의 활성 그리고/또는 수의 감소로 인한 것일 수 있다. 임상 연구는, CTLA-4 차단이 항종양 효과를 발생시키지만, 항-CTLA-4 항체의 투여가 독성 부작용과 연관이 있어 왔음을 실증하였다. CTLA-4는 많은 고형 종양, 예컨대, 흑색종 폐암 및 신장암에서 조절 T 세포 상에서 과발현된다.
예를 들어, 단지 하나의 T 세포-연관 단백질(예컨대, OX40 또는 CTLA-4)을 표적화하는 기존의 단일특이적 약물에 대한 대안으로서, 종양 세포 부근에서 숙주 면역 세포를 활성화시킬 수 있는 향상된 치료제에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 제1 양태는 OX40에 특이적으로 결합할 수 있는, B1로 지칭되는 제1 결합 도메인 및 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있는, B2로 지칭되는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 폴리펩타이드를 제공한다.
2개의 T 세포 표적 CTLA-4 및 OX40을 표적화하는 이중특이적 폴리펩타이드, 예를 들어, 항체는 두 표적 모두가 과발현되는 장소에서 면역계의 특이적인 활성화를 유도하는 잠재력을 가진다. 주목할 만하게는, CTLA-4와 OX40은 둘 모두가 종양 미세환경에서 조절 T 세포(Treg) 상에서 과발현되는 반면, 효과기 T 세포 상에서 이들의 공동-발현은 더 낮다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 종양 미세환경에서 조절 T 세포를 선택적으로 표적화하는 잠재력을 가진다.
종양 미세환경에서 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드를 이용한 Treg 세포의 표적화는 또한, Treg의 면역 억제 기능을 격감시키거나 반전시키는 잠재력을 가진다. 이러한 효과는 본 발명의 이중특이적 항체의 Fc 부분을 통한 ADCC 또는 ADCP 유도에 의해(예를 들어, 문헌[Furness et al., 2014 Trends Immunol 35(7):290-8] 참조; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), 또는 OX40 그리고/또는 CTLA-4를 통해 유도되는 신호전달에 의해 그리고/또는 CTLA-4 신호전달 경로를 차단함으로써(예를 들어, 문헌[Walker, 2014, Nature Reviews 11(12):852-63] 참조; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨) 매개될 수 있을 것이다. 한편, 효과기 T 세포 상에서, 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 OX40 자극과 CTLA-4 체크포인트 차단 둘 모두를 통해 활성화 및 증가된 기능을 유도하는 잠재력을 가진다.
따라서, OX40 및 CTLA-4를 표적화하는 이중특이적 폴리펩타이드의 순(net) 효과는 하기의 효과이다:
1. 단일특이적 폴리펩타이드와 비교하여 더 높은 정도의 면역 활성화. 면역 활성화는 단일특이적 폴리펩타이드의 조합에 의해 유도되는 것보다 더 높으며, 즉, 상승적인 활성화가 달성된다.
2. 조합에서 단일특이적 폴리펩타이드와 비교하여 더 높은 정도의 ADCC 유도.
3. 더 지향적인(directed)/국소화된 면역 활성화. 면역 활성화는 높은 CTLA-4 발현과 OX40 발현 둘 모두를 갖는 환경(예를 들어, 조직)에서만 발생한다. 종양 미세환경은 이러한 환경이다. 이는 신체의 다른 조직/영역에서 활성화와 연관된 독성 부작용 없이 종양 부위에서 면역 활성화를 증가시키는 잠재력을 가진다. 따라서, 치료 범위(therapeutic window)가 증가될 것이다.
"폴리펩타이드"는 본원에서 이의 가장 넓은 의미에서, 2개 이상의 하위단위(subunit) 아미노산, 아미노산 유사체 또는 다른 펩타이드모방체(peptidomimetic)의 화합물을 지칭하는 데 사용된다. 따라서, 용어 "폴리펩타이드"는 짧은 펩타이드 서열, 및 또한 더 긴 폴리펩타이드와 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 D 또는 L 광학이성질체 둘 모두를 포함하여 천연 그리고/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 아미노산 유사체 및 펩타이드모방체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이중특이적"은, 폴리펩타이드가 적어도 2개의 표적 엔터티(entity)에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다.
일 실시형태에서, 제1 그리고/또는 제2 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는
(i) 항체 가변 도메인 또는 이의 부분을 포함하거나 이로 구성된 제1 결합 도메인 및 항체 가변 도메인 또는 이의 부분을 포함하거나 이로 구성된 제2 결합 도메인; 또는
(ii) 항체 가변 도메인 또는 이의 부분을 포함하거나 이로 구성된 제1 결합 도메인 및 항체 가변 도메인 또는 이의 부분이 아닌 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 이중특이적 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체" 또는 "항체들"은, 항원 결합 부위를 함유하는 분자, 예를 들어, 면역글로불린 분자, 및 항원 결합 부위를 함유하는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편을 지칭한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류(subclass)의 면역글로불린 분자일 수 있다. 항체는 합성 항체, 모노클로날 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체를 포함함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인트라바디(intrabody), scFv(예를 들어, 단일특이적 및 이중특이적 등을 포함함), Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화-연결 Fv(sdFv), 항-이디오타입(anti-idiotypic)(항-Id) 항체, 및 상기 중 임의의 에피토프-결합 단편을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
용어 항체 "~에 지향적인" 또는 "~에 대해 지향적인"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 소정의 표적/마커/에피토프/항원에서 이의 결합 특이성(들)을 지향하도록 구축된 항체, 즉, 표적/마커/에피토프/항원에 면역특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 또한, "~에 지향적인" 또는 "~에 대해 지향적인"과 동일한 정의를 갖는, 소정의 표적/마커/에피토프에 "대해 선택적인" 발현 항체가 사용될 수 있다. 2개의 상이한 표적/마커/에피토프/항원에 지향적인(선택적인) 이중특이적 항체는 두 표적/마커/에피토프/ 항원 모두에 면역특이적으로 결합한다. 항체가 소정의 표적 항원, 예컨대, OX40에 지향적이라면, 따라서 상기 항체는 상기 표적 항원 구조 상에 존재하는 임의의 적합한 에피토프에 지향적일 수 있을 것으로 가정된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체 단편"은 항체의 일부, 예컨대, F(ab') 2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv 등이다. 구조와 상관없이, 항체 단편은 온전한(intact) 항체에 의해 인지되는 동일한 항원과 결합한다. 예를 들어, 항-OX40 항체 단편은 OX40에 결합한다. 용어 "항체 단편"은 또한, 가변 영역으로 구성된 단리된 단편, 예컨대, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 "Fv" 단편, 및 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커에 의해 연결된 재조합 단쇄 폴리펩타이드 분자("scFv 단백질")를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체 단편"은 항원 결합 활성이 없는 항체의 부분, 예컨대, Fc 단편 또는 단일 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
ScFv는 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에 포함시키기에 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드의 예시적인 실시형태에서:
(a) 결합 도메인 B1 그리고/또는 결합 도메인 B2는 온전한 IgG 항체이며(또는 함께 온전한 IgG 항체를 형성함);
(b) 결합 도메인 B1 그리고/또는 결합 도메인 B2는 Fv 단편(예를 들어, scFv)이며;
(c) 결합 도메인 B1 그리고/또는 결합 도메인 B2는 Fab 단편이며; 그리고/또는
(d) 결합 도메인 B1 그리고/또는 결합 도메인 B2는 단일 도메인 항체(예를 들어, 도메인 항체 및 나노바디(nanobody))이다.
당업자는 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드가 몇몇 상이한 구조적 포맷으로 존재할 수 있는 것으로 이해할 것이다(예를 들어, 문헌[Chan & Carter, 2016, Nature Reviews Immunology 10, 301-316] 참조, 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
예시적인 실시형태에서, 폴리펩타이드는
(a) 2가 이중특이적 항체, 예컨대, IgG-scFv 이중특이적 항체(예를 들어, 여기서, B1은 온전한 IgG이고, B2는 IgG의 경쇄의 N-말단 그리고/또는 경쇄의 C-말단 그리고/또는 중쇄의 N-말단 그리고/또는 중쇄의 C-말단에서 B1에 부착된 scFv이거나, 또는 그 반대임);
(b) 1가 이중특이적 항체, 예컨대, DuoBody®(Genmab AS, 덴마크 코펜하겐 소재) 또는 '놉-인-홀(knob-in-hole)' 이중특이적 항체(예를 들어, scFv-KIH, scFv-KIHr, BiTE-KIH 또는 BiTE-KIHr)(문헌[Xu et al., 2015, mAbs 7(1):231-242] 참조);
(c) scFv2-Fc 이중특이적 항체(예를 들어, 미국 소재의 Aptevo Therapeutics Inc의 ADAPTIR™ 이중특이적 항체);
(d) BiTE/scFv2 이중특이적 항체;
(e) DVD-Ig 이중특이적 항체;
(f) DART계 이중특이적 항체(예를 들어, DART-Fc, DART2-Fc 또는 DART);
(g) DNL-Fab3 이중특이적 항체; 및
(h) scFv-HSA-scFv 이중특이적 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 이중특이적 항체이다.
당업자는, 본 발명이 또한, 결합 도메인 중 하나가 비-면역글로불린 결합 도메인(예컨대, CTLA-4에 결합할 수 있는 CD86 폴리펩타이드)인 상기 열거된 것들과 동등한 포맷을 포괄함을 이해할 것이다.
예를 들어, 이중특이적 폴리펩타이드는 IgG-scFv 항체일 수 있다. IgG-scFv 항체는 VH-VL 또는 VL-VH 배향으로 존재할 수 있다. 일 실시형태에서, scFv는 VH와 VL 사이에서 S-S 가교에 의해 안정화될 수 있다.
대안적으로, 이중특이적 폴리펩타이드는 CD86 폴리펩타이드에 커플링된 항-OX40 IgG(또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대, scFv)일 수 있다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 B1 및 결합 도메인 B2는 서로 직접적으로 융합된다.
대안적인 실시형태에서, 결합 도메인 B1 및 결합 도메인 B2는 폴리펩타이드 링커를 통해 접합된다. 예를 들어, 폴리펩타이드 링커는 약 10 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩타이드일 수 있다. 상기 링커는 보통, 가요성(flexibility)을 위해 글리신, 뿐만 아니라 용해성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, VH의 N-말단을 VL의 C-말단에 연결하거나 또는 그 반대일 수 있다. 예시적인 링커는 서열번호 47 내지 50, 또는 144 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 당업계에서 사용되는 임의의 공지된 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 BiTE(Micromet), DART(MacroGenics), Fcab 및 Mab2(F-star), Fc-조작 IgGl(Xencor) 또는 DuoBody(Fab 암 교환(arm exchange)을 기초로 함, Genmab)을 포함한다. 이중특이적 항체의 제조에 유용한 다른 플랫폼의 예는 WO 2008/119353(Genmab), WO 2011/131746(Genmab)에 기재되고 문헌[van der Neut- Kolfschoten et al.(2007, Science 317(5844):1554-7)]에 의해 보고된 것들을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 전형적인 방법, 예컨대, 하이브리드 하이브리도마 및 화학적 접합(conjugation) 방법(문헌[Marvin and Zhu(2005) Acta Pharmacol Sin 26: 649])이 또한 사용될 수 있다. 숙주 세포에서 상이한 중쇄 및 경쇄로 구성된 2개의 항체의 공동-발현은 요망되는 이중특이적 항체 외에도 가능한 항체 생산물의 혼합물을 초래하며, 그 후에 이는 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 또는 유사한 방법에 의해 단리될 수 있다.
당업자는, 이중특이적 폴리펩타이드가 인간 Fc 영역, 또는 상기 영역의 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서, 이러한 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 영역, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 영역임을 이해할 것이다.
항체의 불변(Fc) 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적인 보체계의 제1 구성성분(Clq)을 포함하여 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. Fc 영역은 바람직하게는 인간 Fc 영역, 또는 상기 영역의 변이체이다. Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 영역, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 영역일 수 있다. Fc 영역의 변이체는 전형적으로 Fc 수용체, 예컨대, Fc감마R 그리고/또는 신생아(neonatal) Fc 수용체(FcRn)에, 폴리펩타이드의 향상된 기능 그리고/또는 반감기를 제공하는 변경된 친화성으로 결합한다. 생물학적 기능 그리고/또는 반감기는 네이티브(native) Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 반감기에 비해 증가되거나 저하될 수 있다. 변이체 Fc 영역의 존재에 의해 조정될 수 있는 이러한 생물학적 기능의 예는 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포성 식세포작용(ADCP), 보체-의존적 세포독성(CDC) 그리고/또는 세포자멸사를 포함한다.
본원에 개시된 임의의 VH 영역 서열과 조합될 수 있는 예시적인 중쇄 불변 영역 아미노산 서열(완전 중쇄를 형성하기 위해)은 본원에서 재생되는 IgG1 중쇄 불변 영역 서열이다:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(서열번호: 135)
다른 중쇄 불변 영역 서열은 당업계에 공지되어 있고, 또한 본원에 개시된 임의의 VH 영역과 조합될 수 있을 것이다. 예를 들어, 바람직한 불변 영역은 변형된 IgG4 불변 영역, 예컨대, 본원에서 재생된 영역이다:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSLGK
(서열번호: 137)
이러한 변형된 IgG4 서열은 감소된 FcRn 결합을 나타내고, 따라서, 야생형 IgG4에 비해 감소된 혈청 반감기를 초래한다. 또한, 이러한 변형된 IgG4 서열은, IgG4를 보다 안정하게 만들어 Fab 암 교환을 방지하는, IgG4의 코어 힌지(core hinge)의 안정화를 나타낸다.
또 다른 바람직한 불변 영역은 변형된 IgG4 불변 영역, 예컨대, 본원에서 재생된 영역이다:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(서열번호: 139)
이러한 변형된 IgG4 서열은 IgG4를 보다 안정하게 만들어 Fab 암 교환을 방지하는, IgG4의 코어 힌지의 안정화를 초래한다.
야생형 IgG4 불변 영역, 예컨대, 본원에서 재생된 영역이 또한 바람직하다:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(서열번호: 138)
본원에 개시된 임의의 VL 영역 서열과 조합될 수 있는 예시적인 경쇄 불변 영역 아미노산 서열(완전 경쇄를 형성하기 위해)은 본원에서 재생되는 카파 사슬 불변 영역 서열이다:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(서열번호: 136)
다른 경쇄 불변 영역 서열은 당업계에 공지되어 있고, 또한 본원에 개시된 임의의 VL 영역과 조합될 수 있을 것이다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 소정의 바람직한 결합 특징 및 기능적 효과를 가지며, 이는 하기에 보다 상세히 설명된다. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드의 부분으로서 혼입된 경우 이들 결합 특징 및 기능적 효과를 보유한다.
일 실시형태에서, 항원-결합 단편은 Fv 단편(예컨대, 단쇄 Fv 단편 또는 이황화-결합 Fv 단편), Fab-유사 단편(예컨대, Fab 단편; Fab' 단편 또는 F(ab)2 단편) 및 도메인 항체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 이중특이적 폴리펩타이드는 카파 사슬의 C-말단 부분에 융합된 비-면역글로불린 폴리펩타이드(예컨대, CTLA-4 결합 도메인, 예를 들어, CD86 또는 이의 돌연변이화된 형태, 예컨대, 서열번호: 17; 하기 참조)를 갖는 IgG1 항체일 수 있다.
일 실시형태에서, 이중특이적 폴리펩타이드는 중쇄 감마 1 사슬의 C-말단 끝에 융합된 scFv 단편이 있는 IgG1 항체일 수 있다.
일 실시형태에서, 이중특이적 폴리펩타이드는 2개의 상이한 표적에 결합하는 2 내지 4개의 scFv를 함유할 수 있다.
당업자는, T 세포 표적, CTLA-4 및 OX40이 세포의 표면 상에 위치할 수 있음을 이해할 것이다. "세포의 표면 상에 위치하는"이란, T 세포 표적이 세포와 연관되어, T 세포 표적의 하나 이상의 영역이 세포 표면의 외부면 상에 제시됨을 의미한다. 예를 들어, T 세포 표적은 세포외 표면 상에 제시된 하나 이상의 영역과 함께 세포 원형질막 내로 삽입(즉, 막관통 단백질로서 배향)될 수 있다. 이는, 세포에 의한 T 세포 표적의 발현 과정에서 발생할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, "세포의 표면 상에 위치하는"은 "세포의 표면 상에서 발현되는"을 의미할 수 있다. 대안적으로, T 세포 표적은, 이러한 표적을 세포 표면의 특이적인 영역 또는 영역들로 위치시키기는 공유 그리고/또는 이온 상호작용에 의해 세포의 외부에 존재할 수 있다.
당업자는, 본 발명의 이중특이적 항체가 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포성 식세포작용(ADCP), 보체-의존적 세포독성(CDC) 그리고/또는 세포자멸사를 유도할 수 있음을 이해할 것이다.
추가의 실시형태에서, 폴리펩타이드는 종양 면역력을 유도할 수 있다. 이는 시험관내에서 T 세포 활성화 검정법에 의해, 예를 들어, IL-2 및 IFNγ 생산을 측정함으로써 시험될 수 있다. 효과기 T 세포의 활성화는, 종양 특이적 T 세포 반응이 생체내에서 달성될 수 있음을 시사할 것이다. 나아가, 생체내 모델, 예컨대, 마우스 모델에서 항종양 반응은, 종양에 대한 성공적인 면역 반응이 달성되었음을 시사할 것이다.
항체는 T 세포 표적(CTLA-4 또는 OX40)을 발현하는 세포의 활성을 조정할 수 있으며, 여기서, 상기 조정은 상기 세포의 활성에서 증가 또는 저하이다. 세포는 전형적으로 T 세포이다. 항체는 CD4+ 또는 CD8+ 효과기 세포의 활성을 증가시킬 수 있거나, 조절 T 세포(Treg)의 활성을 저하시킬 수 있다. 어느 경우든지간에, 항체의 순 효과는 효과기 T 세포, 특히 CD4+ 효과기 T 세포 활성의 증가일 것이다. 효과기 T 세포의 활성에서 변화를 결정하는 방법은 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 대조군의 존재 하에 T 세포 IL-2 생산의 수준 그리고/또는 T 세포 증식에 비해, 항체의 존재 하에 T 세포 IL-2 생산의 수준의 증가 또는 T 세포 증식의 증가를 측정하는 단계를 포함한다. 세포 증식 그리고/또는 IL-2 생산에 대한 검정법은 잘 공지되어 있고, 실시예에 예시되어 있다.
예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA 및 유세포분석을 포함하여, 표적에 대한 리간드의 결합 능력을 평가하는 표준 검정법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 폴리펩타이드의 결합 동역학(binding kinetics)(예를 들어, 결합 친화성) 또한, 당업계에 공지된 표준 검정법에 의해, 예컨대, 표면 플라즈몬 공명 분석(SPR; Plasmon Resonance analysis)에 의해 평가될 수 있다.
용어 "결합 활성" 및 "결합 친화성"은 표적에 결합하거나 결합하지 않는 폴리펩타이드 분자의 경향을 지칭하고자 한다. 결합 친화성은 폴리펩타이드 및 이의 표적에 대한 해리 상수(Kd)를 결정함으로써 정량화될 수 있다. 더 낮은 Kd는 표적에 대한 더 높은 친화성을 가리킨다. 유사하게는, 폴리펩타이드 표적에의 이의 결합의 특이성은, 폴리펩타이드 및 또 다른 비-표적 분자에 관한 해리 상수와 비교하여, 폴리펩타이드 표적에 대한 이러한 폴리펩타이드의 비교적(comparative) 해리 상수(Kd)의 측면에서 정의될 수 있다.
이러한 해리 상수 값은 잘 공지된 방법에 의해 직접적으로 결정될 수 있고, 방법, 예컨대, Caceci 등에서 제시된 방법에 의해 복합체 혼합물에 대해서도 계산될 수 있다. (문헌[Byte 9:340-362, 1984]; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 예를 들어, Kd는 이중-필터 니트로셀룰로스 필터 결합 검정법, 예컨대, Wong & Lohman(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993])에 의해 개시된 검정법을 사용하여 구축될 수 있다. 예를 들어, ELISAs, 웨스턴 블롯, RIA 및 유세포분석을 포함하여, 표적에 대한 리간드, 예컨대, 항체의 결합 능력을 평가하는 다른 표준 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 항체의 결합 동역학(예를 들어, 결합 친화성) 또한, 당업계에 공지된 표준 검정법, 예컨대, Biacore™ 시스템 분석에 의해 평가될 수 있다.
표적에의 항체의 결합을 해당 표적의 또 다른 공지된 리간드, 예컨대, 또 다른 항체에 의한 상기 표적의 결합과 비교하는 경쟁적 결합 검정법이 수행될 수 있다. 50% 저해가 발생하는 농도는 Ki로 공지된다. 이상적인 조건 하에, Ki는 Kd와 동등하다. Ki 값은 Kd보다 결코 작지 않을 것이며, 따라서, Ki의 측정은 편리하게는 Kd에 대한 상한을 제공하기 위해 대체될 수 있다.
결합 친화성의 대안적인 측정은 EC50 또는 IC50을 포함한다. 이러한 맥락에서, EC50은, 폴리펩타이드가 고정된 양의 표적에 대한 이의 최대 결합의 50%를 달성하는 농도를 가리킨다. IC50은, 폴리펩타이드가 고정된 양의 표적에 대한 고정된 양의 경쟁자의 최대 결합의 50%를 저해하는 농도를 가리킨다. 두 경우 모두에서, 더 낮은 수준의 EC50 또는 IC50은 표적에 대한 더 높은 친화성을 가리킨다. 리간드의 표적에 대한 이러한 리간드의 EC50 및 IC50 값 둘 모두는 잘 공지된 방법, 예를 들어, ELISA에 의해 결정될 수 있다. 폴리펩타이드의 EC50 및 IC50을 평가하기에 적합한 검정법은 실시예에 제시되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는, 또 다른 비-표적 분자에의 결합에 대한 이의 친화성보다 적어도 2-배, 10-배, 50-배, 100-배 또는 그보다 더 큰 친화성으로 이의 표적에 결합할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 임의의 적합한 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 모든 또는 일부 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 의해 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
대안적으로, 부분 B1 및 B2는 별도로 생산되고, 그 후에 후속적으로 함께 접합될 수 있다. 접합은 예를 들어, 상기 언급된 화학적 접합 방법 및 링커를 사용하는 임의의 적합한 수단에 의해 달성될 수 있다. 부분 B1 및 B2의 별도의 생산은 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어, 하기 보다 상세히 설명된 바와 같은, 선택적으로 별도의 세포에서 별도의 뉴클레오타이드로부터의 발현에 의해 달성될 수 있다.
변이체
본원에 기재된 이중특이적 폴리펩타이드 또는 이의 구성분 결합 도메인(예컨대, OX40 또는 CTLA-4 결합 도메인)은 본원에서 언급된 임의의 특이적인 아미노산의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있되, 단, 폴리펩타이드 또는 결합 도메인은 이의 표적에의 결합을 보유한다. 일 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체는 본원에서 언급된 서열의 CDR 서열을 보유할 수 있다. 예를 들어, 항-OX40 항체는 표 B에서 언급된 임의의 특이적인 아미노산의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있되, 단, 항체는 이의 표적에의 결합을 보유한다. 이러한 변이체 또는 단편은 전형적으로, 표 B의 상기 서열의 CDR 서열을 보유할 수 있다. CTLA-4 결합 도메인은 표 C의 임의의 서열의 변이체를 포함할 수 있되, 단, 결합 도메인은 이의 표적에의 결합을 보유한다.
본원에서 언급된 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열 중 어느 하나의 단편은 상기 아미노산 서열로부터 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에서 언급된 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열 중 어느 하나의 변이체는 상기 서열의 치환, 결실 또는 첨가 변이체일 수 있다. 변이체는 상기 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5개, 10개까지, 20개까지, 30개 이상까지의 아미노산 치환 그리고/또는 결실을 포함할 수 있다. "결실" 변이체는 개별 아미노산의 결실, 소그룹의 아미노산, 예컨대, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 결실, 또는 더 큰 아미노산 영역의 결실, 예컨대, 특이적인 아미노산 도메인 또는 다른 특징의 결실을 포함할 수 있다. "치환" 변이체는 바람직하게는 하나 이상의 아미노산을 동일한 수의 아미노산으로 대체하고, 보존적 아미노산 치환을 형성하는 것을 수반한다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 특성을 갖는 대안적인 아미노산, 예를 들어, 또 다른 염기성 아미노산, 또 다른 산성 아미노산, 또 다른 중성 아미노산, 또 다른 하전된 아미노산, 또 다른 친수성 아미노산, 또 다른 소수성 아미노산, 또 다른 극성 아미노산, 또 다른 방향족 아미노산 또는 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적합한 치환기를 선택하는 데 사용될 수 있는 20개의 주요 아미노산의 일부 특성은 하기와 같다:
Figure pct00001
본원에서 아미노산은 풀 네임(full name), 3글자 코드 또는 1글자 코드로 지칭될 수 있다.
바람직한 "유도체" 또는 "변이체"는, 서열 내에서 보이는 아미노산이 자연 발생 아미노산 대신에 이의 구조적 유사체인 것들을 포함한다. 서열에 사용되는 아미노산은 또한, 유도체화되거나 변형, 예를 들어, 표지될 수 있되, 단, 항체의 기능은 유의하게 악영향을 받지 않는다.
상기 기재된 바와 같은 유도체 및 변이체는 항체의 합성 동안 또는 생산-후 변형에 의해, 또는 항체가 재조합 형태인 경우, 핵산의 부위-지향적인 돌연변이생산, 무작위 돌연변이생산, 또는 효소적 절단 그리고/또는 연결의 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
바람직하게는 변이체는 본원에 개시된 서열에 제시된 바와 같은 서열과 60% 초과, 또는 70% 초과, 예를 들어, 75% 또는 80% 초과, 바람직하게는 85% 초과, 예를 들어, 90% 또는 95% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다. 이러한 아미노산 동일성 수준은 관련 서열번호 서열의 전장에 걸쳐, 또는 전장 폴리펩타이드의 크기에 따라 상기 서열의 일부에 걸쳐, 예컨대, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 개 이상의 아미노산에 걸쳐 나타날 수 있다.
아미노산 서열과 관련하여, "서열 동일성"은 하기 매개변수와 함께 ClustalW(문헌[Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(22):4673-80]; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)를 사용하여 평가된 경우 언급된 값을 갖는 서열을 지칭한다:
쌍별 정렬 매개변수 -방법: 정확함, 매트릭스: PAM, 갭 오픈 페널티(Gap open penalty): 10.00, 갭 익스텐션 페널티(Gap extension penalty): 0.10;
다수 정렬 매개변수 -매트릭스: PAM, 갭 오픈 페널티: 10.00, 지연에 대한 % 동일성: 30, 페널라이즈 엔드 갭(Penalize end gap): 온(on), 갭 분리 거리(Gap separation distance): 0, 네거티브 매트릭스: 없음(no), 갭 익스텐션 페널티: 0.20, 잔기-특이적 갭 페널티: 온(on), 친수성 갭 페널티: 온(on), 친수성 잔기: GPSNDQEKR. 특정 잔기에서 서열 동일성은 단순히 유도체화된 동일한 잔기를 포함하고자 한다.
폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 세포
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 폴리펩타이드, 또는 B1의 전부나 일부 또는 B2의 전부나 일부를 인코딩할 수 있다. 용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체성 형태, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예는 유전자, 유전자 단편, 메신저 RNA(mRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 단리된 형태 또는 실질적으로 단리된 형태로 제공될 수 있다. 실질적으로 단리된다는 것이란, 임의의 주변 매질로부터 폴리펩타이드의 실질적인, 그러나 전체적이지 않은 단리가 존재할 수 있음을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는, 이들의 의도된 용도를 방해하지 않을 담체 또는 희석제와 혼합되고, 여전히 실질적으로 단리된 것으로 간주될 수 있다.
선택된 폴리펩타이드를 "인코딩하는" 핵산 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓이는 경우 생체내에서 전사되고(DNA의 경우), 폴리펩타이드로 번역되는(mRNA의 경우) 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에서 출발 코돈 및 3'(카르복시) 말단에서 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 핵산 서열은 바이러스, 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 바이러스 또는 원핵 DNA 또는 RNA로부터의 게놈 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 전사 종결 서열은 코딩 서열에 대해 3'에 위치할 수 있다.
항체의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열의 예를 인코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 본원에 개시된 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 표 B에 제시된 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 표 D에 제시된 폴리펩타이드를 인코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는, 마찬가지로 표 D에 제시된 상응하는 뉴클레오타이드 서열(인트론 서열은 소문자로 제시되어 있음)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. CTLA-4 결합 도메인의 예를 인코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 표 E에 제시된 바와 같은 서열번호: 25 내지 43 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
적합한 폴리뉴클레오타이드 서열은 대안적으로 이들 특이적인 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 변이체는 임의의 상기 핵산 서열의 치환, 결실 또는 첨가 변이체일 수 있다. 변이체 폴리뉴클레오타이드는 서열 목록에 주어진 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5개, 10개까지, 20개까지, 30개까지, 40개까지, 50개까지, 75개 이상까지의 핵산 치환 그리고/또는 결실을 포함할 수 있다.
적합한 변이체는 본원에 개시된 핵산 서열 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 70% 상동성, 바람직하게는 이와 적어도 80% 또는 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 바람직하게는 이들 수준에서 상동성 및 동일성은 적어도 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 대하여 존재한다. 상동성을 측정하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 당업자는 본 맥락에서 상동성이 핵산 동일성을 기초로 계산됨을 이해할 것이다. 이러한 상동성은 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 30개, 예를 들어, 적어도 40, 60, 100, 200개 이상의 인접(contiguous) 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 존재할 수 있다. 이러한 상동성은 비변형된 폴리뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 상동성 또는 동일성을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는 상동성(예를 들어, 이의 디폴트 설정(default setting) 상에서 사용됨)을 계산하는 데 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다(문헌[Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Research 12:387-395]; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 또한, 예를 들어, 문헌[Altschul, 1993, J Mol Evol 36:290-300; Altschul et al, 1990, J Mol Biol 215:403-10](이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재된 바와 같은 상동성을 계산하거나 서열(전형적으로 이들의 디폴트 설정 상에서)을 정렬하는 데 사용될 수 있다.
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학 정보센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 입수 가능하다. 이러한 알고리즘은 우선, 일부 양성-값(positive-valued) 역치 점수 T와 매칭되거나 이를 충족시키는 쿼리(query) 서열에서 길이 W의 짧은 단어(word)를, 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬된 경우 식별함으로써 고득점 서열 쌍(HSP)을 식별하는 단계를 수반한다. T는 이웃 단어 점수 역치(neighbourhood word score threshold)로 지칭된다(상기 Altschul 등). 이들 초기 이웃 단어 히트(hit)는 이들을 함유하는 HSP를 확인하기 위한 탐색을 개시하기 위해 씨드(seed)로서 작용한다. 단어 히트는, 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양방향에서 연장된다. 각각의 방향에서 단어 히트에 대한 연장은: 하나 이상의 음성-득점 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 정렬 점수가 0 또는 그 미만이 되는 경우; 또는 서열의 말단이 도달되는 경우, 중단된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 11의 단어 길이(W), 50의 BLOSUM62 채점 매트릭스(scoring matrix)(문헌[Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919] 참조; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨) 정렬(B), 10의 기대값(E; expectation), M=5, N=4, 및 두 가닥 모두의 비교를 디폴트로서 사용한다.
BLAST 알고리즘은 2개 서열 사이에서 유사성의 통계학적 분석을 수행하며; 예를 들어, 문헌[Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787]을 참조하며; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 측정은 최소 확률 합계(sum probability)(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이에서 매칭이 우연히 발생할 확률의 지표(indication)를 제공한다. 예를 들어, 제1 서열과 제2 서열의 비교에서 최소 확률 합계가 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 이러한 서열은 또 다른 서열과 유사한 것으로 여겨진다.
상동체는 관련 폴리뉴클레오타이드 내의 서열과 3, 5, 10, 15, 20개 이상보다 적은 수의 돌연변이(이들은 각각 치환, 결실 또는 삽입일 수 있음)만큼 상이할 수 있다. 이들 돌연변이는 상동체의 적어도 30개, 예를 들어, 적어도 40, 60 또는 100개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다.
일 실시형태에서, 변이체 서열은 유전자 코드에서의 중복성(redundancy)으로 인해 서열 목록에 주어진 특이적인 서열로부터 다양해질 수 있다. DNA 코드는 4개의 기본적인 핵산 잔기(A, T, C 및 G)를 가지고, 이들을 사용하여, 유기체의 유전자에서 인코딩되는 단백질의 아미노산을 나타내는 3글자 코돈을 "철자한다(spell)". DNA 분자를 따른 코돈의 선형 서열은 이들 유전자에 의해 인코딩되는 단백질(들)에서 아미노산의 선형 서열로 번역된다. 코드는 고도로 축퇴성(degenerate)이며, 이때 61개의 코돈은 20개의 천연 아미노산을 코딩하고, 3개의 코돈은 "정지" 신호를 나타낸다. 따라서, 대부분의 아미노산은 1개 초과의 코돈에 의해 코딩되며 - 사실상, 몇몇 아미노산은 4개 이상의 상이한 코돈에 대해 코딩된다. 따라서, 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 또 다른 폴리뉴클레오타이드와 동일한 폴리펩타이드 서열을 인코딩할 수 있으나, 동일한 아미노산을 인코딩하기 위해 상이한 코돈을 사용함으로 인해 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 이를 인코딩하고 발현할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 형태로 생산되거나 전달될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, Green & Sambrook(2012, Molecular Cloning - a laboratory manual, 4th edition; Cold Spring Harbor Press; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재된 바와 같은 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 발현 카세트의 형태로 제공될 수 있고, 이러한 카세트는 삽입된 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열을 포함하며, 따라서 생체내에서 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 허용한다. 결국, 이들 발현 카세트는 전형적으로 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터) 내에서 제공된다. 이러한 발현 카세트는 숙주 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 숙주 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 유전자 벡터를 사용하여 제조되고/되거나 투여된다. 적합한 벡터는, 충분한 양의 유전 정보를 운반하고 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 허용할 수 있는 임의의 벡터일 수 있다.
따라서, 본 발명은 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 이러한 발현 벡터는 분자생물학 분야에서 일상적으로 구축되고, 예를 들어, 본 발명의 펩타이드의 발현을 허용하기 위해 플라스미드 DNA, 및 필요할 수 있고 올바른 배향으로 위치하는 적절한 개시자, 프로모터, 인핸서 및 다른 요소, 예를 들어, 폴리아데닐화 신호의 사용을 수반할 수 있다. 다른 적합한 벡터는 당업자에게 명백할 것이다(상기 Green & Sambrook 참조).
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하도록 변형된 세포를 포함한다. 이러한 세포는 일시적인, 바람직하게는 안정한 고등(higher) 진핵 세포주, 예컨대, 포유류 세포 또는 곤충 세포, 하등(lower) 진핵 세포, 예컨대, 효모 또는 원핵 세포, 예컨대, 박테리아 세포를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 벡터 또는 발현 카세트의 삽입에 의해 변형될 수 있는 세포의 특정 예는 포유류 HEK293T, CHO, HeLa, NS0 및 COS 세포를 포함한다. 바람직하게는, 선택된 세포주는 안정할 뿐만 아니라 폴리펩타이드의 성숙한 글리코실화 및 세포 표면 발현을 허용하는 세포주일 것이다.
본 발명의 이러한 세포주는 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하기 위해 일상적인 방법을 사용하여 배양될 수 있거나, 본 발명의 항체를 대상체에게 치료적으로 또는 예방적으로 전달하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트 또는 벡터는 생체외에서 대상체로부터의 세포에게 투여되고, 그 후에 상기 세포는 대상체의 신체로 되돌려질 수 있다.
약제학적 제제, 치료 용도 및 환자군
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 분자, 예컨대, 항체, 이중특이적 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 분자, 예컨대, 본 발명의 하나 이상의 항체 그리고/또는 이중특이적 폴리펩타이드, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 융화성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 폴리펩타이드는 이러한 폴리펩타이드를 불활성화시키거나 변성시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 상기 폴리펩타이드를 보호하기 위해 물질에서 코팅될 수 있다.
바람직한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 수성 담체 또는 희석제를 포함한다. 본 발명의 조성물에 이용될 수 있는 적합한 수성 담체의 예는 물, 완충수(buffered water) 및 식염수를 포함한다. 다른 담체의 예는 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물유, 예컨대, 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅 물질, 예컨대, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장성제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 또는 소듐 클로라이드를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 조성물은 또한, 약제학적으로 허용 가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 또한, 보조제, 예컨대, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 예방은 상기 살균 절차와, 다양한 항균 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 둘 모두에 의해 보장될 수 있다. 등장성제, 예컨대, 당, 소듐 클로라이드 등을 조성물 내에 포함시키는 것이 또한, 바람직할 수 있다. 또한, 주사용 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 유도될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로, 제조 및 저장 조건 하에 살균되고 안정해야 한다. 상기 조성물은 높은 약물 농도에 적합한 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 다른 규칙적인 구조물로서 제제화될 수 있다.
살균 주사용액은 필요한 양의 활성제(예를 들어, 폴리펩타이드)를 상기 나열된 성분 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매에 혼입시키고, 필요하다면 살균 정밀여과(microfiltration)함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성제를, 기본적인 분산 매질 및 상기 나열된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 살균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 살균 주사용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은, 활성제 + 임의의 추가의 요망되는 성분의 분말을 이들의 이전에 살균-여과된 용액으로부터 산출하는 진공 건조 및 냉동 건조(동결건조)이다.
특히 바람직한 조성물은 전신 투여 또는 국소 투여를 위해 제제화된다. 국소 투여는 종양 부위에서 또는 종양 배출 림프절 내로 수행될 수 있다. 이러한 조성물은 바람직하게는, 소정의 기간에 걸친 지속 방출(sustained release)을 위해 제제화될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 지속 방출을 용이하게 하는 매트릭스에서 또는 이의 일부로서 제공될 수 있다. 바람직한 지속 방출 매트릭스는 몬타나이드(montanide) 또는 γ-폴리글루탐산(PGA) 나노입자를 포함할 수 있다. 선택적으로 지속 기간(sustained period)에 걸친 본 발명의 폴리펩타이드의 국소 방출(localised release)은 CTLA-4 길항제의 투여와 연관된 잠재적인 자가면역 부작용을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 폴리펩타이드뿐만 아니라 추가의 활성 성분을 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같은, 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 또한, 추가의 치료제 또는 예방제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 다른 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 키트는 추가로, 하나 이상의 추가의 시약, 예컨대, 상기 고찰된 바와 같은 추가의 치료제 또는 예방제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 치료 적용에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 장애 또는 병태를 이미 앓고 있는 대상체에게, 상기 병태 또는 이의 하나 이상의 증상을 치유하거나, 경감시키거나 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 이러한 치료적 치료는 질병 증상의 중증도의 저하, 또는 무증상 기간의 빈도 또는 기간의 증가를 초래할 수 있다. 이를 달성하는 데 적절한 양은 "치료적 유효량"으로 정의된다. 예방 적용에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 장애 또는 병태의 증상을 아직 나타내지 않는 대상체에게, 상기 증상의 발병(development)을 예방하거나 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효량"으로 정의된다. 이러한 대상체는 임의의 적합한 수단에 의해, 질병 또는 병태를 발병시킬 위험에 있는 것으로 식별되었을 수 있다.
특히, 본 발명의 항체 및 이중특이적 폴리펩타이드는 암의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 이에, 본 발명은 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 항체 및 이중특이적 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한, 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 개별 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한, 암의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 항체 및 이중특이적 폴리펩타이드를 제공한다.
암은 전립선암, 유방암, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 폐암, 자궁경부암, 횡문근육종, 신경아세포종, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 흑색종, 방광암, 위암, 두경부암, 간암, 피부암, 림프종 또는 신경교아종일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이중특이적 폴리펩타이드, 또는 상기 항체 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 당업계에 공지된 여러 가지 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자가 이해하게 될 바와 같은, 투여 경로 그리고/또는 방식은 요망되는 결과에 따라 다양할 것이다. 전신 투여 또는 국소 투여가 바람직하다. 국소 투여는 종양 부위에서 또는 종양 배출 림프절 내로 수행될 수 있다. 본 발명의 폴리펩다이드 또는 조성물에 바람직한 투여 방식은 정맥내, 근육내, 피내(intradermal), 복강내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 방식, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 투여를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 어구 "비경구 투여"는 보통 주사에 의한, 경장(enteral) 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미한다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 조성물은 비-비경구 방식, 예컨대, 국소, 표피(epidermal) 또는 점막 투여 방식을 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드의 적합한 투여량은 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게는 독성이 아니면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 요망되는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하기 위해 다양화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 이용되는 특정 폴리펩타이드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 폴리펩타이드의 분비 속도, 치료 기간, 이용되는 특정 조성물과 조합하여 사용하기 위한 다른 약물, 화합물 그리고/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 과거 병력, 및 의료 분야에 잘 공지된 다른 인자를 포함하여 여러 가지 약물동력학적 인자에 의존할 것이다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드의 적합한 용량은 예를 들어, 치료받는 환자의 체중을 기준으로 약 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 예를 들어, 적합한 투여량은 1일 당 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg 체중 또는 1일 당 약 10 g/kg 내지 약 5 mg/kg 체중일 수 있다.
투여량 처방 계획은 최적의 요망되는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스(single bolus)가 투여될 수 있거나, 몇몇 분할된 용량이 일정 기간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 상기 용량은 치료 상황의 긴급 상황에 의해 지시된 바와 같은 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은, 투여량 단위 형태는 치료받는 대상체에 대해 일원화된(unitary) 투여량으로서 맞춰진(suited) 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 요망되는 치료 효과를 생산하도록 계산된 예정된 양의 활성 화합물을 필요한 약제학적 담체와 함께 함유한다.
항체 또는 폴리펩타이드는 단일 용량 또는 다수의 용량으로 투여될 수 있다. 다수의 용량은 동일한 또는 상이한 경로를 통해, 및 동일한 또는 상이한 장소에 투여될 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 폴리펩타이드는 상기 기재된 바와 같은 지속 방출 제제로서 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서 폴리펩타이드의 반감기 및 요망되는 치료 기간에 따라 다양할 수 있다. 투여량 및 투여 빈도는 또한, 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 다양할 수 있다. 예방적 적용에서는, 상대적으로 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 상대적으로 덜 빈번한 간격으로 투여될 수 있다. 치료적 적용에서는, 상대적으로 높은 투여량이, 예를 들어, 환자가 질병 증상의 부분적인 또는 완전한 개선을 보여줄 때까지 투여될 수 있다.
2개 이상의 작용제의 조합 투여는 많은 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 항체 또는 폴리펩타이드 및 다른 작용제는 단일 조성물에서 함께 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 폴리펩타이드 및 다른 작용제는 별도의 조성물에서 병용 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 조정제는 다른 작용제 전에, 후에 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체, 폴리펩타이드 또는 조성물은 또한, 제1 및 제2 T 세포 표적을 발현하는 세포 집단(population)의 활성화를 증가시키는 방법에서 사용될 수 있으며, 상기 방법은 상기 세포와 본 발명의 폴리펩타이드 사이에서 상호작용을 허용하기에 적합한 조건 하에 상기 세포 집단에 본 발명의 폴리펩타이드 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 세포 집단은 전형적으로, 제1 T 세포 표적을 발현하는 적어도 일부의 세포, 전형적으로 T 세포, 및 제2 T 세포 표적을 발현하는 적어도 일부의 세포를 포함한다. 상기 방법은 전형적으로 생체외에서 수행된다.
예를 들어, 본 발명의 항체, 폴리펩타이드 또는 조성물은 또한, 인간 OX40 및 인간 CTLA-4를 발현하는 세포 집단의 활성화를 증가시키는 방법에 사용될 수 있고, 상기 방법은 상기 기재된 바와 같다.
CTLA-4에 대한 결합 도메인
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 CTLA-4에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
CD86 및 CD80은 본원에서 B7 단백질(각각 B7-2 및 B7-1)로서 지칭될 수 있다. 이들 단백질은 항원 제시 세포의 표면 상에 발현되고, T 세포 수용체 CD28 및 CTLA-4와 상호작용한다. CD28에의 B7 분자의 결합은 T 세포 활성화를 촉진하는 한편, CTLA-4에의 B7 분자의 결합은 T 세포의 활성화를 차단시킨다. B7 단백질과 CD28 그리고/또는 CTLA-4 사이의 상호작용은 면역 활성화 및 조절에 중요한 역할을 하는 공동자극 신호전달 경로를 이룬다. 따라서, B7 분자는 면역 저해를 해제시키기 위한 조작을 받아 이로써 환자에서 면역력을 증강시킬 수 있는 경로의 일부이다.
CD86 단백질은 단량체이고, 2개의 세포외 면역글로불린 상과(superfamily) 도메인으로 구성된다. CD86의 수용체 결합 도메인은 전형적인 IgV-세트(set) 구조를 갖는 반면, 막 근위 도메인(membrane proximal domain)은 C1-세트 유사 구조를 가진다. CD80 및 CD86의 구조는 이들 자체 상에서 또는 CTLA-4와의 복합체에서 결정되었다. CD80 및 CD86 분자 상의 접촉 잔기는 가용성 세포외 도메인에 존재하고, 대체로 베타 병풍에 위치하지만(CDR-유사) 루프에는 위치하지 않는다.
서열번호: 3은 인간 야생형 CD86의 단량체성 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열이다. 이러한 야생형 서열은 선택적으로, N 말단, 즉, 24 및 25번 위치에서 알라닌 및 프롤린이 결여되어 있을 수 있다. 이들 아미노산은 본원에서 각각 A24 및 P25로 지칭될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 CTLA-4에 특이적인 도메인, "CTLA-4 결합 도메인"을 폴리펩타이드 결합 도메인으로서 가진다. 이러한 결합 도메인의 적합한 예는 WO 2014/207063에 개시되어 있고, 이의 내용은 원용에 의해 포함된다. CTLA-4에 특이적인 결합 도메인은 CD28에도 결합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 CTLA-4는 전형적으로 인간 CTLA-4를 지칭하고, 본원에 사용된 바와 같은 용어 CD28은 전형적으로 인간 CD28을 지칭한다. 인간 CTLA-4 및 인간 CD28의 서열은 각각 서열번호: 1 및 2로서 제시되어 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 다른 포유류로부터의 CTLA-4 또는 CD28, 예를 들어, 영장류 또는 뮤린 CTLA-4 또는 CD28에 대해 어느 정도의 결합 친화성을 가질 수 있다.
CTLA-4 결합 도메인은 이의 네이티브 상태에서 CTLA-4에, 특히 세포의 표면 상에 위치하는 CTLA-4에 결합하는 능력을 가진다.
"세포의 표면 상에 위치하는"은 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인 부분은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다:
(i) 서열번호: 3의 아미노산 서열; 또는
(ii) 서열번호: 3의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산이 변화되되, 단, 상기 결합 도메인이 인간 CTLA-4에 야생형 인간 CD86보다 더 높은 친화성으로 결합하는 아미노산 서열.
다시 말해, CTLA-4 결합 도메인은 인간 CTLA-4에 특이적인 폴리펩타이드 결합 도메인이며, 이러한 도메인은 (i) 인간 야생형 CD86의 단량체성 가용성 세포외 도메인, 또는 (ii) 상기 가용성 세포외 도메인의 폴리펩타이드 변이체를 포함하거나, 이로 구성되되, 단, 상기 폴리펩타이드 변이체는 야생형 인간 CD86보다 높은 친화성으로 인간 CTLA-4에 결합한다.
이에, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 인간 야생형 CD86과 동일한 표적 결합 특성을 가질 수 있거나, 인간 야생형 CD86의 표적 결합 특성과 비교하여 상이한 표적 결합 특성을 가질 수 있다. 이러한 특성을 비교하기 위해, "인간 야생형 CD86"은 전형적으로, 선행 섹션에서 기재된 바와 같은 인간 야생형 CD86의 단량체성 가용성 세포외 도메인을 지칭한다.
인간 야생형 CD86은 2개의 표적, CTLA-4 및 CD28에 특이적으로 결합한다. 이에, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 결합 특성은, 이들 표적 각각에 결합하는 폴리펩타이드의 능력의 개별 측정으로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 인간 야생형 CD86의 단량체성 세포외 도메인의 폴리펩타이드 변이체는 바람직하게는, CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 결합 친화성보다 높은 결합 친화성으로 CTLA-4에 결합한다. 이러한 폴리펩타이드는 선택적으로, CD28에 대한 야생형 인간 CD86의 결합 친화성보다 낮은 결합 친화성으로 CD28에도 결합할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 CTLA-4에 특이적인 폴리펩타이드 결합 도메인이다. 이는, 상기 폴리펩타이드가 바람직하게는, 이것이 또 다른 분자에 결합하는 결합 친화성보다 더 큰 결합 친화성으로 CTLA-4에 결합함을 의미한다. CTLA-4 결합 도메인은 바람직하게는, CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 친화성과 동일하거나 그보다 높은 친화성으로 CTLA-4에 결합한다.
바람직하게는, 인간 CTLA-4에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 Kd는 인간 CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 Kd보다 적어도 2-배, 적어도 2.5-배, 적어도 3-배, 적어도 3.5-배, 적어도 4-배, 적어도 4.5-배, 적어도 5-배, 적어도 5.5-배, 적어도 8-배 또는 적어도 10-배 더 작을 것이다. 가장 바람직하게는, 인간 CTLA-4에 대한 CTLA-4 결합 도메인의 Kd는 인간 CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 Kd보다 적어도 5-배 또는 적어도 10-배 더 작을 것이다. CTLA-4에 대한 폴리펩타이드의 Kd를 결정하기에 바람직한 방법은 예를 들어, Biacore™ 시스템을 이용한 SPR 분석이다. 폴리펩타이드의 SPR 분석에 적합한 프로토콜은 실시예에 제시되어 있다.
바람직하게는, 인간 CTLA-4에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 EC50은 동일한 조건 하에 인간 CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 EC50보다 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 12-배, 적어도 14-배, 적어도 15-배, 적어도 17-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배 또는 적어도 50-배 더 작을 것이다. 가장 바람직하게는, 인간 CTLA-4에 대한 CTLA-4 결합 도메인의 EC50은 동일한 조건 하에 인간 CTLA-4에 대한 야생형 인간 CD86의 EC50보다 적어도 10-배 또는 적어도 25-배 더 작을 것이다. CTLA-4에 대한 폴리펩타이드의 EC50을 결정하는 데 바람직한 방법은 ELISA를 통해서이다. 폴리펩타이드의 EC50의 평가에 사용하기에 적합한 ELISA 검정법은 실시예에 제시되어 있다.
바람직하게는, 인간 CTLA-4에의 결합에 대해 야생형 인간 CD86과 경쟁할 때 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 IC50은 동일한 조건 하에 야생형 인간 CD86의 IC50보다 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 13-배, 적어도 15-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배 또는 적어도 300-배 더 작을 것이다. 가장 바람직하게는, CTLA-4 결합 도메인의 IC50은 동일한 조건 하에 야생형 인간 CD86의 IC50보다 적어도 10-배 또는 적어도 300-배 더 작을 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 IC50을 결정하는 데 바람직한 방법은 ELISA를 통해서이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 IC50의 평가에 사용하기에 적합한 ELISA 검정법은 실시예에 제시되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 또한, CD28에 특이적으로 결합할 수 있다. 즉, CTLA-4 결합 도메인은 CTLA-4를 제외하고, 이것이 또 다른 분자에 결합하는 결합 친화성보다 큰 결합 친화성으로 CD28에 결합할 수 있다. CTLA-4 결합 도메인은 인간 CD28에 대한 야생형 인간 CD86의 친화성보다 낮은 친화성으로 인간 CD28에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 인간 CD28에 대한 CTLA-4 결합 도메인의 Kd는 인간 CD28에 대한 야생형 인간 CD86의 Kd보다 적어도 2-배, 바람직하게는 적어도 5-배, 보다 바람직하게는 적어도 10-배 더 높을 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 결합 특성은 또한, 폴리펩타이드가 2개의 표적, CTLA-4 및 CD28에 결합하는 능력의 상대적 측정으로서 표현될 수 있다. 즉, CTLA-4 결합 도메인의 결합 특성은 폴리펩타이드가 CTLA-4에 결합하는 능력 대(versus) 상기 폴리펩타이드가 CD28에 결합하는 능력의 상대적 측정으로서 표현될 수 있다. 바람직하게는, CTLA-4 결합 도메인은 CTLA-4 대 CD28에 결합하는 인간 야생형 CD86의 상응하는 상대적 능력과 비교할 때, CTLA-4 대 CD28에 결합하는 증가된 상대적 능력을 가진다.
CTLA-4와 CD28 둘 모두에 대한 폴리펩타이드의 결합 친화성이 동일한 매개변수(예를 들어, Kd, EC50)를 사용하여 평가될 때, 각각의 표적에 대한 상기 폴리펩타이드의 상대적 결합 능력은 각각의 표적에 대한 매개변수의 값의 단비(simple ratio)로서 표현될 수 있다. 이러한 비(ratio)는 폴리펩타이드의 결합비 또는 결합 강도비로서 지칭될 수 있다. 결합 친화성을 평가하는 데 사용되는 많은 매개변수(예를 들어, Kd, EC50)에 대해, 더 낮은 값은 더 높은 친화성을 가리킨다. 이러한 경우, CTLA-4 대 CD28에 대한 결합 친화성의 비는 바람직하게는, 하기 식에 따라 계산된 단일 수치로서 표현된다:
결합비 = [CD28에 대한 결합 친화성] ÷ [CTLA-4에 대한 결합 친화성]
대안적으로, 결합 친화성이, 더 높은 값이 더 높은 친화성을 가리키는 매개변수를 사용하여 평가된다면, 상기 식의 정반대(inverse)가 바람직하다. 어느 맥락이든지, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 바람직하게는 인간 야생형 CD86보다 높은 결합비를 가진다. 주어진 폴리펩타이드에 대한 결합비와 또 다른 폴리펩타이드에 대한 결합비의 직접적인 비교는 전형적으로, 동일한 매개변수가 두 폴리펩타이드 모두에 대한 결합 친화성을 평가하고 결합비를 계산하는 데 사용되는 것을 필요로 함을 이해할 것이다.
바람직하게는, 폴리펩타이드에 대한 결합비는 각각의 표적에 대한 폴리펩타이드의 Kd를 결정하고, 그 후에 식 [CD28에 대한 Kd] ÷ [CTLA-4에 대한 Kd]에 따라 상기 비를 계산함으로써 계산된다. 이러한 비는 폴리펩타이드의 Kd 결합비로서 지칭될 수 있다. 표적에 대한 폴리펩타이드의 Kd를 결정하는 데 바람직한 방법은 예를 들어, Biacore™ 시스템을 이용한 SPR 분석이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 SPR 분석에 적합한 프로토콜은 실시예에 제시되어 있다. 이러한 방법에 따라 계산된 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 결합비는 바람직하게는, 동일한 방법에 따라 계산된 야생형 인간 CD86의 결합비보다 적어도 2-배 또는 적어도 4-배 더 높다.
대안적으로, 폴리펩타이드에 대한 결합비는 각각의 표적에 대한 폴리펩타이드의 EC50을 결정하고, 그 후에 식 [OX40에 대한 EC50] ÷ [CTLA-4에 대한 EC50]에 따라 상기 비를 계산함으로써 계산될 수 있다. 이러한 비는 폴리펩타이드의 EC50 결합비로서 지칭될 수 있다. 표적에 대한 폴리펩타이드의 EC50을 결정하는 데 바람직한 방법은 ELISA를 통해서이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 EC50의 평가에 사용하기에 적합한 ELISA 검정법은 실시예에 제시되어 있다. 이러한 방법에 따라 계산된 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 결합비는 동일한 방법에 따라 계산된 야생형 인간 CD86의 결합비보다 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배 또는 적어도 10-배 더 높다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 CTLA-4에의 결합에 대해 또 다른 폴리펩타이드와 교차-경쟁하는 능력을 가질 수 있다. 예를 들어, CTLA-4 결합 도메인은 서열번호: 6 내지 24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 CTLA-4에의 결합에 대해 교차-경쟁할 수 있다. 이러한 교차-경쟁 폴리펩타이드는 표준 결합 검정법에서 식별될 수 있다. 예를 들어, SPR 분석(예를 들어, Biacore™ 시스템을 이용함), ELISA 검정법 또는 유세포분석이 교차-경쟁을 실증하는 데 사용될 수 있다.
상기 기능적 특징 외에도, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 소정의 바람직한 구조적 특징을 갖는다. CTLA-4 결합 도메인은 (i) 인간 야생형 CD86의 단량체성 가용성 세포외 도메인, 또는 (ii) 상기 가용성 세포외 도메인의 폴리펩타이드 변이체를 포함하거나, 이로 구성되되, 단, 상기 폴리펩타이드 변이체는 야생형 인간 CD86보다 높은 친화성으로 인간 CTLA-4에 결합한다.
인간 야생형 CD86의 단량체성 가용성 세포외 도메인의 폴리펩타이드 변이체는 인간 야생형 CD86의 아미노산 서열로부터 유래되는 아미노산 서열, 구체적으로는, 선택적으로 A24 및 P25가 결여된, 인간 야생형 CD86의 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열(서열번호: 3)을 포함하거나 이로 구성된다. 특히, 변이체는, 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교한 경우 적어도 하나의 아미노산이 변화된 아미노산 서열을 포함한다. "변화된"이란, 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 적어도 하나의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 것을 의미한다. "결실된"이란, 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)에 존재하는 적어도 하나의 아미노산이 제거되어, 상기 아미노산 서열이 하나의 아미노산만큼 짧아진 것을 의미한다. "삽입된"이란, 적어도 하나의 추가의 아미노산이 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)에 도입되어, 상기 아미노산 서열이 하나의 아미노산만큼 길어진 것을 의미한다. "치환된"이란, 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열) 내의 적어도 하나의 추가의 아미노산이 대안적인 아미노산으로 대체된 것을 의미한다.
전형적으로, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 아미노산이 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 변화된다. 전형적으로, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 2 또는 1개 이하의 아미노산이 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 변화된다. 임의의 이들 하한은 임의의 이들 상한과 조합되어, 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 변화의 허용된 수에 대한 범위를 정의할 수 있는 것으로 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는, 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 아미노산 변화의 허용된 수가 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 2 내지 7, 2 내지 8, 2 내지 9, 2 내지 10, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6 등의 범위인 아미노산을 포함할 수 있다.
적어도 2개의 아미노산이 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 변화된 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 아미노산 변화의 허용된 수는 2 내지 9, 2 내지 8, 또는 2 내지 7의 범위이다.
상기 제시된 수 및 범위는 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여, 결실, 삽입 또는 치환의 임의의 조합으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 단지 결실, 단지 삽입, 또는 단지 치환만 존재할 수 있거나, 결실, 삽입 또는 치환의 임의의 혼합이 존재할 수 있다. 바람직하게는, 변이체는 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 모든 변화가 치환인 아미노산 서열을 포함한다. 즉, 어떠한 아미노산도 서열번호: 3의 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 결실되거나 삽입되지 않은 서열이다. 바람직한 변이체의 아미노산 서열에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산이 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 치환되고, 어떠한 아미노산도 서열번호: 3의 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 결실되거나 삽입되지 않는다.
바람직하게는, 서열번호: 3의 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 변화는 서열번호: 3의 FG 루프 영역(114 내지 121번 위치) 그리고/또는 베타 병풍 영역에 존재한다. 베타 병풍 영역의 가닥은 서열번호: 3에서 하기 위치를 가진다: A:27-31, B:36-37, C:54-58, C':64-69, C'':72-74, D:86-88, E:95-97, F:107-113, G:122-133.
가장 바람직하게는, 서열번호: 3의 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 변화는 32, 48, 49, 54, 74, 77, 79, 103, 107, 111, 118, 120, 121, 122, 125, 127 또는 134로부터 선택되는 위치 중 하나 이상에 존재한다. 본원에서 아미노산 위치의 모든 넘버링은 서열번호: 4에서 N 말단으로부터 출발하여 아미노산을 계수하는 것을 기초로 한다. 따라서, 서열번호: 3의 N 말단에서 제1 위치는 24로 넘버링된다(도 4의 도식도 참조).
특히 바람직한 삽입은 116과 117번 위치 사이에 삽입된 단일 추가의 아미노산 그리고/또는 118과 119번 위치 사이에 삽입된 단일 추가의 아미노산을 포함한다. 삽입된 아미노산은 바람직하게는 티로신(Y), 세린(S), 글리신(G), 류신(L) 또는 아스파르트산(D)이다.
특히 바람직한 치환은 122번 위치에서이고, 이는 아르기닌(R)이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는, 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 적어도 122번 위치가 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 122번 위치에서 가장 바람직한 치환은, 아르기닌(R)을 선호도의 순서대로 등급 매겨진 라이신(K) 또는 아스파라긴(N)으로 대체하는 것이다. 이러한 치환은 R122K/N으로 지칭될 수 있다.
다른 바람직한 치환은 107, 121 및 125번 위치에서이고, 이는 각각 류신(L), 이소류신(I) 및 글루탐산(Q)이다. 122번 위치에서의 치환 외에도, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는, 107, 121 및 125번 위치에서 아미노산 중 적어도 하나가 또한, 서열번호: 3의 아미노산 서열(또는 A24 및 P25가 결여된 상기 서열)과 비교하여 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 또한, 32, 48, 49, 54, 64, 74, 77, 79, 103, 111, 118, 120, 127 및 134번 위치 중 하나 이상에서 치환될 수 있다.
107번 위치에서 가장 바람직한 치환은 류신(L)을 선호도의 순서대로 등급 매겨진 이소류신(I), 페닐알라닌(F) 또는 아르기닌(R)으로 대체하는 것이다. 이러한 치환은 L107I/F/R로 지칭될 수 있다. 유사한 표기(notation)는 본원에 기재된 다른 치환에 사용된다. 121번 위치에서 가장 바람직한 치환은 이소류신(I)을 발린(V)으로 대체하는 것이다. 이러한 치환은 I121V로 지칭될 수 있다.
125번 위치에서 가장 바람직한 치환은 글루타민(Q)을 글루탐산(E)으로 대체하는 것이다. 이러한 치환은 Q125E로 지칭될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 바람직할 수 있는 다른 치환은: F32I, Q48L, S49T, V54I, V64I, K74I/R, S77A, H79D/S/A, K103E, I111V, T118S, M120L, N127S/D 및 A134T를 포함한다.
인간 야생형 CD86의 상기 가용성 세포외 도메인의 특히 바람직한 변이체는 표 C에 제시된 바와 같은 서열번호: 6 내지 24의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성된다.
서열번호: 6 내지 14에 제시된 아미노산 서열은 선택적으로, N-말단에 추가의 잔기 AP를 포함할 수 있다. 서열번호: 15 내지 24에 제시된 아미노산 서열은 선택적으로, N-말단에 잔기 AP가 결여되어 있을 수 있다. 어느 경우든지 간에, 이들 잔기는 서열번호: 3의 A24 및 P25에 상응한다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 인간 야생형 CD86의 상기 가용성 세포외 도메인의 임의의 상기 기재된 변이체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인은 표 C에 제시된 바와 같은 서열번호: 6 내지 24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
결합 도메인은 예를 들어, CTLA-4를 발현하는 세포, 예컨대, T 세포에 투여된 경우, CTLA-4로부터의 신호전달을 조정할 수 있다. 바람직하게는 결합 도메인은 상기 신호전달을 감소시키며, 즉, 저해하거나 차단하고, 이로써 상기 세포의 활성화를 증가시킨다. 시험 작용제(예컨대, 결합 도메인)의 투여 결과, CTLA-4 신호전달 및 세포 활성화의 변화는 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 적합한 방법은, 막-결합 CD86(예를 들어, Raji 세포 상에 존재)이 시험 작용제의 존재 하에 또는 적합한 대조군의 존재 하에 T 세포의 표면 상에 발현된 CTLA-4에 결합하고 신호 전달하는 능력을 검정하는 단계를 포함한다. 대조군의 존재 하에 T 세포 IL-2 생산 수준 그리고/또는 T 세포 증식에 비해 시험 작용제의 존재 하에 T 세포 IL-2 생산의 증가된 수준 또는 T 세포 증식의 증가는 CTLA-4를 통한 감소된 신호전달 및 증가된 세포 활성화를 가리킨다. 이러한 유형의 전형적인 검정법은 US20080233122의 실시예 9에 개시되어 있다.
OX40에 대한 결합 도메인
본 발명의 이중특이적 결합 분자는 임의의 OX40 결합 도메인, 예를 들어, 항-OX40 항체를 결합 도메인으로서(예를 들어, B1로서) 혼입할 수 있다.
OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 보다 상세히 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 결합 특징 및 기능적 효과를 가진다. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 항체의 일부로서 혼입된 경우 이들 결합 특징 및 기능적 효과를 보유한다. 이러한 결합 도메인은 또한, 본 발명의 이중특이적 분자와 독립적으로 제공될 수 있다.
이러한 항체는 바람직하게는 OX40에 특이적으로 결합하며, 즉, 상기 항체는 OX40에 결합하지만 다른 분자에는 결합하지 않거나 더 낮은 친화성으로 결합한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 OX40은 전형적으로 인간 OX40을 지칭한다. 인간 OX40의 서열은 서열번호:51(GenBank: NP_003318.1에 상응함)에 제시되어 있다. 상기 항체는 다른 포유류로부터의 OX40, 예컨대, 비-인간 영장류(예를 들어, 마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)(게먹이 원숭이(cynomolgus monkey)), 마카카 물라타(Macaca mulatta))로부터의 OX40에 대해 어느 정도의 결합 친화성을 가질 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는 뮤린 OX40에 결합하지 않고/않거나 다른 인간 TNFR 상과 구성원, 예를 들어, 인간 CD137 또는 CD40에 결합하지 않는다.
상기 항체는 이의 네이티브 상태에서 OX40에, 특히 세포의 표면 상에 위치하는 OX40에 결합하는 능력을 가진다. 바람직하게는, 항체는 OX40에 특이적으로 결합할 것이다. 즉, 본 발명의 항체는 바람직하게는, 이것이 또 다른 분자에 결합하는 결합 친화성보다 큰 결합 친화성으로 OX40에 결합할 것이다.
"세포의 표면 상에 위치하는"은 상기 정의된 바와 같다.
항체는 OX40을 발현하는 세포의 활성을 조정할 수 있으며, 여기서, 상기 조정은 상기 정의된 바와 같은 상기 세포의 활성에서 증가 또는 저하이다. 세포는 전형적으로 T 세포이다. 항체는 상기 기재된 바와 같은 CD4+ 또는 CD8+ 효과기 세포의 활성을 증가시킬 수 있거나, 조절 T 세포(T reg)의 활성을 저하시킬 수 있다.
어느 경우든지간에, 항체의 순 효과는 효과기 T 세포, 특히 CD4+ 효과기 T 세포 활성의 증가일 것이다. 효과기 T 세포의 활성의 변화를 결정하는 방법은 잘 공지되어 있고, 상기 기재되어 있다.
항체는 바람직하게는 50x10-10 M 미만 또는 25x10-10 M 미만, 보다 바람직하게는 10, 9, 8, 7 또는 6x10-10 M 미만, 가장 바람직하게는 5x10-10 M 미만인 Kd 값으로 인간 OX40에 결합한다.
예를 들어, 상기 항체는 바람직하게는 뮤린 OX40 또는 임의의 다른 TNFR 상과 구성원, 예컨대, CD137 또는 CD40에 결합하지 않는다. 따라서, 전형적으로, 인간 OX40에 대한 항체의 Kd는 환경에서 다른 비-표적 분자, 예컨대, 뮤린 OX40, 다른 TNFR 상과 구성원, 또는 임의의 다른 비관련 물질 또는 수반된 물질에 관한 Kd보다 2-배, 바람직하게는 5-배, 보다 바람직하게는 10-배 작을 것이다. 보다 바람직하게는, Kd는 50-배 미만, 보다 더 바람직하게는 100-배 미만, 더욱 더 바람직하게는 200-배 미만일 것이다.
이러한 해리 상수 값은 상기 기재된 바와 같은 잘 공지된 방법에 의해 직접적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는, 또 다른 비-표적 분자에의 결합에 대한 이의 친화성보다 적어도 2-배, 10-배, 50-배, 100-배 더 큰 친화성으로 이의 표적에 결합할 수 있다.
따라서, 요약하자면, 상기 항체는 바람직하게는, 하기 기능적 특징 중 적어도 하나를 나타낸다:
I. 10x10-10 M 미만인 KD 값으로 인간 OX40에 결합한다;
II. 뮤린 OX40에 결합하지 않는다;
III. 다른 인간 TNFR 상과 구성원, 예를 들어, 인간 CD137 또는 CD40에 결합하지 않는다.
이러한 항체는 OX40, 전형적으로 인간 OX40에 특이적이고, 하기 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두를 포함할 수 있다:
(a) 8개 아미노산 길이이고, 공통 서열(consensus sequence): "G, F, T, F, G/Y/S, G/Y/S, Y/S, Y/S/A"를 포함하는 중쇄 CDR1 서열;
(b) 8개 아미노산 길이이고, 공통 서열: "I, G/Y/S/T, G/S/Y, S/Y, G/S/Y, G/S/Y, G/S/Y, T"를 포함하는 중쇄 CDR2 서열;
(c) 9 내지 17개 아미노산 길이이고, 공통 서열: "A, R, G/Y/S/H, G/Y/F/V/D, G/Y/P/F, -/H/S, -/N/D/H, -/Y/G, -/Y, -/Y, -/W/A/V, -/A/Y, -/D/A/Y/G/H/N, Y/S/W/A/T, L/M/I/F, D, Y"를 포함하는 중쇄 CDR3 서열. 이러한 정의 내에서 바람직한 중쇄 CDR3 서열은, 10개 아미노산 길이이고 공통 서열 "A, R, Y/H, D, Y, A/Y/G, S/W/A, M/L, D, Y"를 포함하는 CDR3 서열 또는 11개 아미노산 길이이고 공통 서열 "A, R, G/Y, V/F/Y, P, H, G/Y/H, Y, F/I, D, Y"를 포함하는 CDR3 서열을 포함한다;
(d) 서열: "Q, S, I, S, S, Y"로 구성된 경쇄 CDR1 서열;
(e) 서열: "A, A, S"로 구성된 경쇄 CDR2 서열;
(f) 8 내지 10개 아미노산 길이이고, 공통 서열: "Q,Q, S/Y/G, -/Y/H/G, -/S/Y/G/D/W, S/Y/G/D, S/Y/G/T, P/L, Y/S/H/L/F, T"를 포함하는 경쇄 CDR3 서열. 이러한 정의 내에서 경쇄 CDR3 서열의 바람직한 예는 서열 "Q, Q, S, Y, S, T, P, Y, T"로 구성된다.
상기 항체는 적어도 (c)에 정의된 바와 같은 중쇄 CDR3 그리고/또는 (f)에 정의된 바와 같은 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 항체는 (a), (b) 및 (c)의 모든 3개의 중쇄 CDR 서열 그리고/또는 (d), (e) 및 (f)의 모든 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 CDR 서열은 표 A(1) 및 A(2), 서열번호: 52 내지 88에 언급되어 있다.
바람직한 항-OX40 항체는 적어도 표 A(1)의 임의의 개별 열(row)에 정의된 바와 같은 중쇄 CDR3 그리고/또는 표 A(2)의 임의의 개별 열에 정의된 바와 같은 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 표 A(1)의 개별 열에 제시된 모든 3개의 중쇄 CDR 서열(즉, 주어진 "VH 번호"의 모든 3개의 중쇄 CDR) 그리고/또는 표 A(2)의 개별 열에 제시된 모든 3개의 경쇄 CDR 서열(즉, 주어진 "VL 번호"의 모든 3개의 경쇄 CDR)을 포함할 수 있다.
완전 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열의 예는 표 B에 제시되어 있다. 각각의 아미노산 서열을 인코딩하는 예시적인 핵산 서열이 또한 제시되어 있다. 표 B에서 상기 VH 및 VL 영역의 넘버링은 표 A(1) 및 (2)에서와 같이 사용된 넘버링 시스템에 상응한다. 따라서, 예를 들어, "1167, 경쇄 VL"에 대한 아미노산 서열은 표 A(2)에 제시된 VL 번호 1167의 모든 3개의 CDR을 포함하는 완전 VL 영역 서열의 일례이고, "1166, 중쇄 VH"에 대한 아미노산 서열은 표 A(1)에 제시된 VH 번호 1166의 모든 3개의 CDR을 포함하는 완전 VH 영역 서열의 일례이다.
본 발명의 바람직한 항-OX40 항체는 특정 VH 번호의 모든 3개의 CDR을 포함하는 VH 영역 및 특정 VL 번호의 모든 3개의 CDR을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 예를 들어,:
- 항체는 VH 번호 1166의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 1167의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 1166/1167로 지칭될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는, 표 B에 제시된 바와 같은 1166 및 1167의 상응하는 완전 VH 및 VL 서열(서열번호: 91 및 89)을 포함할 수 있다.
- 항체는 VH 번호 1170의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 1171의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 1170/1171로 지칭될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는, 표 B에 제시된 바와 같은 1170 및 1171의 상응하는 완전 VH 및 VL 서열(서열번호: 95 및 93)을 포함할 수 있다.
- 항체는 VH 번호 1164의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 1135의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 1164/1135로 지칭될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는, 표 B에 제시된 바와 같은 1164 및 1135의 상응하는 완전 VH 및 VL 서열(서열번호: 99 및 97)을 포함할 수 있다.
- 항체는 VH 번호 1168의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 1135의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 1168/1135로 지칭될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는, 표 B에 제시된 바와 같은 1168 및 1135의 상응하는 완전 VH 및 VL 서열(서열번호: 101 및 97)을 포함할 수 있다.
- 항체는 VH 번호 1482의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 1483의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 1482/1483으로 지칭될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는, 표 B에 제시된 바와 같은 1482 및 1483의 상응하는 완전 VH 및 VL 서열(서열번호: 105 및 103)을 포함할 수 있다.
- 항체는 VH 번호 1490의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 1135의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 1490/1135로 지칭될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는, 표 B에 제시된 바와 같은 1490 및 1135의 상응하는 완전 VH 및 VL 서열(서열번호: 107 및 97)을 포함할 수 있다.
- 항체는 VH 번호 1514의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 1515의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 1514/1515로 지칭될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는, 표 B에 제시된 바와 같은 1514 및 1515의 상응하는 완전 VH 및 VL 서열(서열번호: 111 및 109)을 포함할 수 있다.
- 항체는 VH 번호 1520의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 1135의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 1520/1135로 지칭될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는, 표 B에 제시된 바와 같은 1520 및 1135의 상응하는 완전 VH 및 VL 서열(서열번호: 113 및 97)을 포함할 수 있다.
- 항체는 VH 번호 1524의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 1525의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 1524/1525로 지칭될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는, 표 B에 제시된 바와 같은 1524 및 1525의 상응하는 완전 VH 및 VL 서열(서열번호: 117 및 115)을 포함할 수 있다.
- 항체는 VH 번호 1526의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 1527의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 1526/1527로 지칭될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는, 표 B에 제시된 바와 같은 1526 및 1527의 상응하는 완전 VH 및 VL 서열(서열번호: 121 및 119)을 포함할 수 있다.
- 항체는 VH 번호 1542의 모든 3개의 CDR 및 VL 번호 1135의 모든 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 1542/1135로 지칭될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는, 표 B에 제시된 바와 같은 1542 및 1135의 상응하는 완전 VH 및 VL 서열(서열번호: 123 및 97)을 포함할 수 있다.
항체는 표 B에서 언급된 임의의 특이적인 아미노산 서열의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있되, 단, 상기 항체는 인간 OX40에 결합하고, 기능적 특징 I 내지 III 중 적어도 하나를 나타낸다. 이러한 변이체 또는 단편은 전형적으로, 표 B의 상기 서열의 CDR 서열을 보유할 수 있다.
표 B에 제시된 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열 중 어느 하나의 단편은 상기 아미노산 서열로부터 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.
표 B에 제시된 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열 중 어느 하나의 변이체는 상기 정의된 바와 같은 상기 서열의 치환, 결실 또는 첨가 변이체일 수 있다.
이러한 항체는 본원에 기재된 임의의 특이적인 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직하게는 상기 항체는 1166/1167, 1170/1171, 1164/1135, 1168/1135, 1482/ 1483, 1490/1135, 1514/1515, 1520/1135, 1524/1525, 1526/1527 및 1542/1135로 지칭되는 항체 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합한다.
본원에 개시된 임의의 VH 영역 서열, 예컨대, IgG1 중쇄 불변 영역 서열과 조합될 수 있는(완전 중쇄를 형성하기 위해) 예시적인 중쇄 불변 영역 아미노산 서열은 상기 기재되어 있다.
본원에 개시된 임의의 VL 영역 서열, 예컨대, 카파 사슬 불변 영역 서열과 조합될 수 있는(완전 경쇄를 형성하기 위해) 예시적인 경쇄 불변 영역 아미노산 서열은 상기 기재되어 있다.
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드
본 발명의 폴리펩타이드는 OX40 및 CTLA-4에 특이적인 결합 도메인을 포함하며, 즉, B1은 OX40에 특이적이고, B2는 CTLA-4에 특이적이다.
예를 들어, 이중특이적 폴리펩타이드는 서열번호:125의, CD86 도메인에 융합된 IgG 경쇄, 및 서열번호:91의 VH 영역을 포함하는 IgG 중쇄를 포함하는 항체 "1166/1261"일 수 있다. 대안적으로, 이중특이적 폴리펩타이드는 예를 들어, 서열번호:125 그리고/또는 91과 적어도 70%의 서열 동일성, 예를 들어, 서열번호:125 그리고/또는 91과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성, 서열번호:125 그리고/또는 9와 서열 동일성을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함할 수 있다.
실시형태의 이중특이적 폴리펩타이드는 면역계의 세포의 활성을, OX40 또는 CTLA-4 단독의 개별 효능제보다, 또는 이러한 개별 효능제의 조합보다 큰 정도까지 조정할 수 있다. 특히, 이중특이적 폴리펩타이드의 투여는 더 높은 수준의 효과기 T 세포 활성, 특정 CD4+ 효과기 T 세포 활성을 생산한다. 효과기 T 세포 활성의 증가는 또한, 개별 OX40 또는 CTLA-4 효능제 단독(또는 이들의 조합)의 투여로 인한 것보다 더 국소화되는데, 왜냐하면 이중특이적 폴리펩타이드는 CTLA-4와 OX40 둘 모두가 고도로 발현되는 미세환경에서만 가장 큰 효과를 발휘하기 때문이다. 종양은 이러한 미세환경이다. 종양 침윤성 조절 T 세포(Treg)는 높은 수준의 CTLA-4 및 OX40을 효과기 T 세포(CD4와 CD8 둘 모두)보다 더 높게 발현한다.
효과기 T 세포 활성의 증가는, OX40 경로의 활성화를 통한 또는 CTLA-4 저해 경로의 차단을 통한 효과기 T 세포의 자극으로부터 직접적으로 초래될 수 있거나, Treg의 격감 또는 하향조절과 이로써 이들의 면역억제 효과를 감소시키는 것으로부터 간접적으로 초래될 수 있다. Treg의 격감/하향조절은 항체-의존적 세포성 식세포작용(ADCP) 또는 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC) 기전에 의해 매개될 수 있다. 효과기 T 세포와 비교하여 Treg 상에서 CTLA-4와 OX40 둘 모두의 높은 발현은 단일특이적 항체와 비교하여 Treg의 유의하게 더 높은 사멸화를 유도할 수 있다. CTLA-4 및 OX40의 더 낮은 발현을 갖는 효과기 T 세포는 이러한 기전에 의해 격감되지 않을 것이다. 전반적으로, 그 결과는 살종양(tumoricidal) 활성의 즉각적인 발생을 위한 매우 강력하며 국소화된 면역 활성화일 것이다.
면역계 세포 상에서 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드의 효과의 측정은 임의의 적합한 검정법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 효과기 T 세포의 증가된 활성은 이중특이적 폴리펩타이드의 개별 구성성분 B1 및 B2의 측면에서 상기 기재된 바와 같은 검정법에 의해 측정될 수 있고, 대조군에 비해 이중특이적 폴리펩타이드의 존재 하에 CD4+ 그리고/또는 CD8+ T 세포에 의한 증식 또는 IL-2 생산의 측정을 포함할 수 있다. 대조군에 비해 증식 또는 IL-2 생산의 증가는 증가된 세포 활성화를 가리킨다. 이러한 유형의 전형적인 검정법은 US20080233122의 실시예 9에 개시되어 있다. 세포 증식 그리고/또는 IL-2 생산에 대한 검정법은 잘 공지되어 있고, 또한 실시예에 예시되어 있다. 동일한 검정법에서 평가되는 경우, 이중특이적 분자는 전형적으로, 동일한 표적에 결합하는 단일특이적 작용제의 조합에 의해 유도되는 효과기 T 세포의 활성에서의 증가보다 적어도 1.5배 더 높은 또는 적어도 2배 더 높은, 보다 바람직하게는 3배 더 높은, 가장 바람직하게는 5배 더 높은 효과기 T 세포의 활성에서의 증가를 유도할 것이다.
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 인간 CTLA-4와 인간 OX40 둘 모두에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 정의된 바와 같은 B1 및 B2를 포함한다.
"CTLA-4와 OX40 둘 모두에 특이적으로 결합할 수 있는"이란, 상기 각각의 부분에 대해 제공된 정의에 따라 부분 B1이 OX40에 특이적으로 결합하고, 부분 B2가 CTLA-4에 특이적으로 결합함을 의미한다. 바람직하게는, 이들 각각의 표적에 대한 부분 B1과 B2의 결합 특징은, 이들이 본 발명의 폴리펩타이드의 부분으로서 존재하는 경우, 부분 B1 및 B2에 대한 상기 특징과 비교한 경우, 별개의 엔터티로서 제시된 경우 변하지 않거나 실질적으로 변하지 않는다.
전형적으로 이는, 이중특이적 분자가, 바람직하게는 단독으로 제시된 경우 B1의 OX40에 대한 Kd 값과 실질적으로 동일한, OX40에 대한 Kd를 가질 것임을 의미한다. 대안적으로, 이중특이적 분자가, 단독으로 제시된 경우 B1의 OX40에 대한 Kd에 비해 증가된 OX40에 대한 Kd를 갖는다면, 이러한 증가는 10배 이하, 바람직하게는 9배, 8배, 7배, 6배, 5배, 4배, 3배 또는 2배 이하만큼이다. 이중특이적 분자는 바람직하게는 50x10-10 M 미만, 보다 바람직하게는 25x10-10 M 미만, 가장 바람직하게는 20x10-10 M 미만인 Kd 값으로 인간 OX40에 결합한다. 또한, 이중특이적 분자는 독립적으로, 바람직하게는 단독으로 제시된 경우 B2의 CTLA4에 대한 Kd 값과 실질적으로 동일한 CTLA-4에 대한 Kd를 가질 것이다. 대안적으로, 이중특이적 분자가, 단독으로 제시된 경우 B2의 CTLA-4에 대한 Kd에 비해 증가된 CTLA-4에 대한 Kd를 갖는다면, 이러한 증가는 3배 이하, 바람직하게는 2배 이하만큼이다. 이중특이적 분자는 바람직하게는 60x10-9 M 미만, 보다 바람직하게는 25x10-9 M 미만, 가장 바람직하게는 10x10-9 M 미만인 Kd 값으로 인간 CTLA-4에 결합한다.
다시 말해, 이중특이적 분자는 50x10-10 M, 25x10-10 M 또는 20x10-10 M 미만인 OX40에 대한 Kd를 가질 수 있고, 독립적으로 60x10-9 M, 25x10-9 M 또는 10x10-9 M 미만인 CTLA-4에 대한 Kd를 가질 수 있다. OX40에 대해 언급된 임의의 Kd 값은 독립적으로 CTLA-4에 대해 언급된 임의의 Kd 값과 조합되어, 주어진 이중특이적 분자의 결합 특징을 기재할 수 있음을 이해할 것이다. 유사하게는, OX40 결합에서 임의의 언급된 배수 변화는 독립적으로 CTLA-4에서 임의의 언급된 배수 변화와 조합되어, 주어진 이중특이적 분자의 결합 특징을 기재할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 부분으로서 존재하는 경우 부분 B1 및 B2의 결합 특징은 임의의 적합한 검정법에 의해 평가될 수 있다. 특히, 각각의 별개의 부분에 대해 상기 제시된 검정법은 또한, B1 및 B2가 본 발명의 폴리펩타이드의 부분으로서 존재하는 경우 이들에 적용될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드의 결합 특징을 평가하는 데 적합한 검정법은 또한, 실시예에 제시되어 있다.
이러한 이중특이적 분자는, OX40과 CTLA-4 둘 모두가 고도로 발현되는 미세환경에 존재하는 경우 면역계를 강력하게 활성화시킨다. 전형적으로, 이중특이적 분자는 CD4+ 또는 CD8+ 효과기 세포의 활성을 증가시킬 것이거나, 조절 T 세포(Treg)의 활성을 저하시킬 수 있다. 어느 경우든지간에, 항체의 순 효과는 효과기 T 세포, 특히 CD4+ 효과기 T 세포 활성의 증가일 것이다. 동일한 검정법에서 평가된 경우, 이중특이적 분자는 전형적으로, 동일한 표적에 결합하는 단일특이적 작용제의 조합에 의해 유도되는 효과기 T 세포의 활성에서의 증가보다 적어도 1.5배 더 높은 또는 적어도 1.7배 더 높은, 보다 바람직하게는 4.5배 더 높은, 가장 바람직하게는 7배 더 높은 효과기 T 세포의 활성에서의 증가를 유도할 것이다.
효과기 T 세포의 활성에서 변화를 결정하는 방법은 잘 공지되어 있고, 이전에 기재된 바와 같다. 세포 증식 그리고/또는 IL-2 생산에 대한 검정법은 잘 공지되어 있고, 실시예에 예시되어 있다.
예를 들어, 폴리펩타이드는 CTLA-4와 OX40 둘 모두에 특이적으로 결합할 수 있고, B1은 OX40에 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있고; B2는 CTLA-4에 특이적인 폴리펩타이드 결합 도메인일 수 있으며, 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
i) 서열번호: 3의 아미노산 서열; 또는
ii) 서열번호: 3의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산이 변화되되, 단, 상기 결합 도메인이 인간 CTLA-4에 야생형 인간 CD86보다 더 높은 친화성으로 결합하는 아미노산 서열.
폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합되는 CTLA-4는 영장류 또는 뮤린, 바람직하게는 인간 CTLA-4일 수 있고/있거나 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합되는 OX40은 영장류, 바람직하게는 인간 OX40일 수 있다.
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 임의의 적합한 포맷으로 함께 배열된 OX40 결합 도메인 및 CTLA-4 결합 도메인을 포함할 수 있다. 임의의 주어진 이중특이적 포맷에서, OX40 결합 도메인 및 CTLA-4 결합 도메인은 각각 독립적으로 전체 항체 또는 이의 항원 결합부일 수 있음을 이해할 것이다. 사용되는 특정 이중특이적 포맷과는 상관없이, 본원에 기재된 이중특이적 폴리펩타이드 및 항체는 전형적으로, OX40 결합 도메인(결합 도메인 1로 지칭될 수 있음)의 조성물 및 CTLA-4 결합 도메인(결합 도메인 2로 지칭될 수 있음)의 조성물을 기초로 한 넘버링 체제에 의해 지칭될 수 있다. 따라서, 넘버링 체제는 전형적으로, OX40 결합 도메인(결합 도메인 1)에 대해 형태 VH1/VL1 및 CTLA-4 결합 도메인(결합 도메인 2)에 대해 VH2/VL2이고, 함께 VH1/VL1-VH2/VL2로서 기재된다. 이러한 넘버링 체제는 이중특이적 폴리펩타이드 또는 항체에 존재하는 결합 도메인의 총 수 또는 이중특이적 폴리펩타이드 또는 항체에서 임의의 불변 영역의 존재 또는 부재 중 어느 것도 반영하지 않으며, 이들 둘 모두는 사용되는 이중특이적 항체의 특정 포맷에 의해 결정됨을 이해할 것이다. 결합 도메인의 총 수 및 불변 영역의 존재 또는 부재는 당업계에 공지된 임의의 적합한 이중특이적 항체 포맷에 따를 수 있다.
이중특이적 폴리펩타이드 또는 항체의 많은 적합한 포맷은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 임의의 이들 포맷으로 존재할 수 있다. 적합한 포맷은 도 1 내지 14에 기재된 것들을 포함한다(문헌[Kontermann & Brinkmann, 2015, Drug Discov Today 838-847]을 또한 참조; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
도 14에서, 불변 영역은 채워진 밝은 회색으로 제시되며; 가변 중쇄 영역 VH1은 체크무늬 흑백으로 제시되며; 가변 경쇄 영역 VL1은 채워진 백색으로 제시되며; 가변 중쇄 영역 VH2는 채워진 검정색으로 제시되고; 가변 경쇄 영역 VL2는 대각선과 함께 백색으로서 제시된다. 따라서, OX40 결합 도메인(결합 도메인 1로 지칭됨)은 전형적으로, 채워진 백색 도메인과 함께 체크무늬 흑백 도메인의 쌍으로 표시되어 있고; CTLA-4 결합 도메인(결합 도메인 2로 지칭됨)은 전형적으로, 대각선과 함께 채워진 검정색 도메인 및 백색 도메인의 쌍으로 표시되어 있다. 그러나, 제시된 모든 포맷에서, 결합 도메인 1 및 2는 스위치될 수 있음을 이해할 것이다. 즉, OX40 결합 도메인이 도 14에서 CTLA-4 도메인에 대해 제시된 임의의 위치에서 발생할 수 있고, 그 반대일 수도 있다.
이중특이적 폴리펩타이드에 바람직한 포맷은 kih 또는 "놉-인-홀" 배열이며, 이는 도 14의 두번째 열에 제시된 첫번째 것이다. 이러한 배열에서, 각각의 항체의 중쇄의 CH3 도메인은 돌연변이화되어, 항-OX40 항체로부터의 중쇄와 항-CTLA-4 항체로부터의 중쇄 사이에서 헤테로이량체화를 허용한다. 각각의 중쇄는 이의 상응하는 경쇄와 결합하여, 1개의 완전한 OX40 결합 도메인 및 1개의 완전한 CTLA-4 결합 도메인을 형성한다. 변형은 중쇄 CH1 영역에 이루어져서, 올바른 경쇄와의 결합을 촉진할 수 있다. Kih 포맷 이중특이적 항체는 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Ridgway et al 1996; Protein Eng 9:617-621]을 참조하며, 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 이중특이적 항체에 대한 또 다른 바람직한 포맷은 scFv2-Fc 포맷이고, 이는 도 14의 두번째 열에 제시된 두번째 것이다. 이러한 배열에서, 각각의 표적에 특이적인 1개의 scFv는 불변 면역글로불린 도메인에 융합된다. 단쇄는 중쇄의 Fc 영역에 융합될 수 있으며, 이때 하나의 특이성은 Fc 영역의 N-말단 끝에 융합되고 다른 특이성은 C-말단 끝에 융합된다(문헌[Park et al., 2000, Mol Immunol 37(18):1123-30]; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에 대한 또 다른 바람직한 포맷은 BITE/scFv2 포맷이고, 이는 도 14의 두번째 열에 제시된 세번째 포맷이다. 이러한 배열에서, OX40에 특이적인 하나와 CTLA-4에 특이적인 또 다른 하나인 2개의 scFv는 링커를 이용하여 함께 융합된다(문헌[Brischwein et al., 2007, J Immunother 30(8):798-807]; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 상기 링커는 선택적으로, 용해성 및 혈청 반감기를 증가시키는 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA)을 포함하여, 도 14의 네번째 열에 제시된 바와 같은 scFv-HSA-scFv 이중특이적 항체를 생산할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에 대한 또 다른 바람직한 포맷은 이중 가변 도메인(DVD) 면역글로불린이며, 이는 도 14의 두번째 열에 제시된 네번째 포맷이다. 이러한 배열에서, 제2 가변 도메인(VL2)은 IgG 분자의 제1 가변 경쇄(VL1)에 융합되고, 제2 가변 중쇄(VH2)는 제1 가변 중쇄(VH1)에 융합된다. VH1 및 VL1은 결합 부위 1을 형성하고, VH2 및 VL2는 결합 부위 2를 형성하며, 따라서 이중특이적 항체를 생산한다(문헌[Wu, 2007, Nat Biotechnol 25(11):1290-7]; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에 대한 또 다른 바람직한 포맷은 이중 친화성 재표적화(DART) 포맷이며, 이러한 포맷에서 짧은 펩타이드 링커를 이용하여 VH1은 VL2에 융합되고 VH2는 VL1에 융합되어, 이들이 VH1/VL1 및 VH2/VL2 결합 부위를 형성하게 한다. 이러한 구축물은 결합 부위 사이에서 이황화 가교의 형성에 의해 안정화될 수 있다. DART 포맷은 IgG Fc 도메인에 융합되어, 1가 이중특이적 항체(DART-Fc) 또는 2가 이중특이적 항체(DART2-Fc)를 생산할 수 있다(문헌[Moore et al., 2011, Blood 117(17):4542-51]). DART, DART-Fc 및 DART2-Fc 포맷은 도 14의 세번째 열에 제시되어 있다.
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에 대한 또 다른 바람직한 포맷은 닥 앤드 락(DNL; dock and lock) 기술에 의해 발생된 이중특이적 항체이다. cAMP 의존적 단백질 키나제 A 및 A 키나제 앵커링 단백질은 각각의 표적에 대한 항체, Fab 단편 또는 scFv에 융합되어, 이로써 다가 이중특이적 항체, 예를 들어, DNL-Fab3를 발생시킬 수 있다(도 14의 네번째 열에 제시되 바와 같은 문헌[Chang et al., 2007, Clin Cancer Res 13(18 Pt 2):5586s-5591s]; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에 특히 바람직한 포맷은 scFv-IgG 포맷이다. 이러한 포맷의 4개의 상이한 가능한 배열은 도 14의 상부 열에 제시되어 있다. 도 14에 제시된 바와 같은, scFv-IgG 포맷에서, 항-OX40 항체는 전체 IgG 분자이고, 항-CTLA-4 항체는 4개의 일반적인 장소(중쇄 불변 영역; 경쇄 불변 영역; 중쇄 가변 영역; 경쇄 가변 영역) 중 어느 하나에서 항-OX40 항체에 연결된 scFv 항체이다. 각각의 경우, 반전 배열이 또한, 고려된다. 즉, 전체 IgG로서 항-CTLA-4 항체 및 4개의 일반적인 장소 중 어느 하나에서 항-CTLA-4 항체에 연결된 scFv로서 항-OX40 항체. scFv-IgG 포맷에서, 전체 IgG 분자는 scFv에 직접적으로 접합될 수 있거나, 링커를 통해 간접적으로 접합될 수 있다. 예시적인 링커는 서열번호 47 내지 50, 또는 144 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 펩타이드를 포함한다.
도 14(도면의 상부 좌측)에 제시된 제1 scFv-IgG 배열에서, 이중특이적 항체는 중쇄 가변 서열 VH2(채워진 검정색) 및 경쇄 가변 서열 VL2(대각선과 함께 백색)로 구성된 scFv 서열에 연결된(선택적으로 링커를 통해) 중쇄 불변 서열(Hc; 채워진 회색)에 연결된 중쇄 가변 서열 VH1(체크무늬 흑백)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬의 2개의 복사체를 포함한다. 이러한 사슬은 VH1-Hc-VH2/VL2(N 말단으로부터 C 말단까지 순서대로)로 지칭될 수 있다. 이러한 이중특이적 항체는 또한, 경쇄 불변 서열(Lc; 채워진 회색)에 연결된 경쇄 가변 서열 VL1(채워진 백색)을 포함하는 더 작은 사슬의 2개의 복사체를 포함하며, 이는 VL1-Lc(N 말단으로부터 C 말단까지 순서대로)로 지칭될 수 있다. 도 14에 제시된 대안적인 scFv-IgG 배열은 또한, 2개의 상이한 사슬의 2개 복사체 각각을 포함하고, 이는 유사한 방식으로 기재될 수 있다. 따라서, 도 22의 상부 열에서 좌측으로부터 우측으로 읽으면, 제2 배열은 2개의 VH1-Hc 사슬 및 2개의 VL1-Lc-VH2/VL2 사슬을 포함한다. 제3 배열은 2개의 VH1/VH2-VH1-Hc 사슬 및 2개의 VL1-Lc 사슬을 포함한다. 제4 배열은 2개의 VH1-Hc 및 2개의 VH1/VH2-VL1-Lc 사슬을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드는 도 14(도면의 상부 좌측)에 제시된 제1 scFv-IgG 배열을 가진다.
본 발명은 표 A 내지 E에 제시된 임의의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드를 단독으로 또는 바람직하게는 단일특이적 또는 이중특이적 항체의 부분으로서 제공한다. 표 A 내지 E에 제시된 모든 서열에서, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역에 상응하는 서열은 예시적이고, 임의의 다른 적합한 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 서열로 대체될 수 있다. 바람직한 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열은 서열번호: 135, 136, 137, 138 및 139의 것들이다.
본 발명은 또한, 비-항체 폴리펩타이드가 결합 도메인으로서 사용되는 동등한 이중특이적 폴리펩타이드를 또한 포괄함을 이해할 것이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 부분 B1은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 이는 전형적으로 적어도 하나의 중쇄(H) 그리고/또는 적어도 하나의 경쇄(L)를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 부분 B2는 B1의 임의의 부분에 부착될 수 있으나, 전형적으로, 바람직하게는 N 또는 C 말단에서 상기 적어도 하나의 중쇄(H) 또는 적어도 하나의 경쇄(L)에 부착될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 부분 B2는 직접적으로 또는 임의의 적합한 연결 분자(링커)를 통해 간접적으로 부착될 수 있다.
부분 B1은 바람직하게는 적어도 하나의 중쇄(H) 및 적어도 하나의 경쇄(L)를 포함하고, 부분 B2는 바람직하게는 상기 중쇄(H) 또는 상기 경쇄(L)의 N 또는 C 말단에 부착된다. B1의 예시적인 항체는 2개의 동일한 중쇄(H) 및 2개의 동일한 경쇄(L)로 구성된다. 이러한 항체는 전형적으로 2개의 암(arm)으로서 배열되며, 각각의 암은 헤테로이량체로서 접합된 1개의 H 및 1개의 L을 갖고, 2개의 암은 H 사슬 사이에서 이황화 결합에 의해 접합된다. 따라서, 상기 항체는 효과적으로 2개의 H-L 헤테로이량체로 형성된 호모이량체이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 부분 B2는 이러한 항체의 2개의 H 사슬 모두 또는 2개의 L 사슬 모두에, 또는 단지 1개의 H 사슬 또는 단지 1개의 L 사슬에 부착될 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 대안적으로 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 기재될 수 있으며, 여기에 CTLA-4에 특이적인 적어도 하나의 폴리펩타이드 결합 도메인이 부착되고 이러한 도메인은 인간 야생형 CD86 또는 이의 변이체의 단량체성 가용성 세포외 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. B1 및 B2의 결합 도메인은 본 발명의 폴리펩타이드에서 유일한 결합 도메인일 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 방향 N-C로 작성된 하기 식 중 어느 하나에 따라 배열된 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며:
(A) L-(X)n-B2;
(B) B2-(X)n-L;
(C) B2-(X)n-H; 및
(D) H-(X)n-B2;
여기서, H는 항체(즉, B1)의 중쇄이고, L은 항체(즉, B1)의 경쇄이며, X는 링커이고, n은 0 또는 1이다. 링커(X)가 펩타이드인 경우, 이는 전형적으로 아미노산 서열 SGGGGSGGGGS(서열번호: 47), SGGGGSGGGGSAP(서열번호: 48), NFSQP(서열번호:49), KRTVA(서열번호: 50), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 144) 또는 (SG)m을 가지며, 여기서, m은 1 내지 7이다. 식 (A) 내지 (D)의 도식도는 도 1에 제시되어 있다.
본 발명은 또한, 임의의 식 (A) 내지 (D)에 따라 배열된 폴리펩타이드로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 단량체로서 제공될 수 있거나, 다량체성 단백질, 예컨대, 항체의 구성성분으로서 제시될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 단리될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 예는 표 D에 제시되어 있다. 각각의 아미노산 서열을 인코딩하는 예시적인 핵산 서열이 또한 제시되어 있다.
부분 B2는 임의의 적합한 수단에 의해 본 발명의 폴리펩타이드의 임의의 부분에 또는 링커에 부착될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 다양한 부분은 화학적 접합에 의해, 예컨대, 펩타이드 결합을 이용하여 접합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 선택적으로 펩타이드 링커에 의해 접합된, B1(또는 이의 구성성분 부분) 및 B2를 포함하는 융합 단백질을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이러한 융합 단백질에서, OX40-결합 도메인 또는 B1의 도메인 및 CTLA-4-결합 도메인 또는 B2의 도메인이 유일한 결합 도메인일 수 있다.
분자를 폴리펩타이드에 접합시키는 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 카르보디이미드 접합(문헌[Bauminger & Wilchek, 1980, Methods Enzymol. 70:151-159] 참조; 이의 개시내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)은 독소루비신을 포함한 여러 가지 작용제를 항체 또는 펩타이드에 접합시키는 데 사용될 수 있다. 수용성 카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)는 특히, 기능적 모이어티를 결합 모이어티에 접합시키는 데 유용하다. 추가의 예로서, 접합은 소듐 퍼요오데이트 산화, 뒤이어 적절한 반응물의 환원적 알킬화에 의해, 또는 글루타르알데하이드 가교에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 어떤 방법이 선택되든지 상관없이, 부분 B1 및 B2가 본 발명의 폴리펩타이드의 부분으로서 존재하는 경우 이들의 표적 결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유하는지의 결정이 바람직하게 이루어져야 하는 것으로 인지된다.
동일한 기술을 사용하여, 본 발명의 폴리펩타이드를 또 다른 분자에 연결(직접적으로 또는 간접적으로)할 수 있다. 다른 분자는 치료제 또는 검출 가능한 표지일 수 있다. 적합한 치료제는 세포독성 모이어티 또는 약물을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 단리된 형태 또는 실질적으로 단리된 형태로 제공될 수 있다. 실질적으로 단리된다는 것이란, 임의의 주변 매질로부터 폴리펩타이드의 실질적인, 그러나 전체적이지 않은 단리가 존재할 수 있음을 의미한다. 폴리펩타이드는, 이들의 의도된 용도를 방해하지 않을 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있고, 여전히 실질적으로 단리된 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 예시적인 폴리펩타이드는 표 D에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 그룹 서열번호 125 내지 134로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 선택적으로 여기서 상기 폴리펩타이드는 항체의 구성성분 부분으로서 제공된다.
항체의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열의 예를 인코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 표 B에 제시된 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 표 D에 제시된 폴리펩타이드를 인코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 표 D(인트론 서열은 소문자로 제시되어 있음)에 또한 제시된 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 부분 B2의 예를 인코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 표 E에 제시된 바와 같은 서열번호: 25 내지 43 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 적합한 폴리뉴클레오타이드는 대안적으로, 상기 정의된 바와 같은 임의의 이들 서열의 변이체일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 이중특이적 폴리펩타이드는 종양 세포에 대한 숙주 면역계의 상승적인 활성화를 유도하며, 즉, 상기 폴리펩타이드는 개별 단일특이적 대응 폴리펩타이드(CTLA-4 결합 도메인, 또는 개별 OX40 단일특이적 항체)의 조합 효과와 비교하여 종양내 CD8/Treg 비에서 상승적인 증가를 유도할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 이중특이적 폴리펩타이드는 숙주 면역계에서 종양 세포에 대한 면역 기억을 유도할 수 있다.
"면역 기억"이란 본 발명자들은, 신체에서 면역계가 이미 마주친 항원, 예컨대, 종양 항원을 신속하고 특이적으로 인지하고, 상응하는 면역 반응을 개시하는 면역계의 능력을 의미한다.
본 발명의 관련 양태
본 발명의 제2 양태는 상기 기재된 바와 같은 개체에서 질병 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 제1 양태에 따른 이중특이적 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 제3 양태는 개체에서 질병 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법이며, 상기 방법은 상기 기재된 바와 같은 개체에게 본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 이중특이적 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제4 양태는 약제의 제조에서 본 발명의 제1 양태에 따른 이중특이적 폴리펩타이드의 용도이다.
본 발명의 일 실시형태는, 질병 또는 병태가 암이고 선택적으로 개체가 인간인 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 폴리펩타이드 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 방법, 또는 약제가 암 치료를 위한 것이고 선택적으로 개체가 인간인 본 발명의 제4 양태에 따른 용도이다.
추가의 실시형태에서, 이러한 방법은 상기 기재된 바와 같은 이중특이적 항체를 전신적으로 또는 국소적으로, 예컨대, 종양 부위에서 또는 종양 배출 림프절 내로 투여하는 단계를 포함한다.
암은 전립선암, 유방암, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 폐암, 자궁경부암, 횡문근육종, 신경아세포종, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 흑색종, 방광암, 위암, 두경부암, 간암, 피부암, 림프종 또는 신경교아종일 수 있다.
본 발명의 제5 양태는 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 이중특이적 폴리펩타이드의 적어도 하나의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명의 제6 양태는 본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 이중특이적 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 실시형태의 제1 또는 제2 양태에 따른 폴리펩타이드는 추가의 치료 모이어티에 접합된다.
약제학적 조성물은 환자에게 약제학적 유효 용량으로 투여될 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 '치료적 유효량', '유효량' 또는 '치료적으로 효과적인'은 주어진 조건 및 투여 처방 계획에 대해 치료 효과를 제공하는 해당 양을 지칭한다. 이는 필요한 첨가제 및 희석제, 즉 담체 또는 투여 비히클과 연관되어 요망되는 치료 효과를 생산하도록 계산된 활성 물질의 예정된 양이다. 나아가, 이러한 양은 숙주의 활성, 기능 및 반응에서 임상적으로 유의한 결함을 감소시키고 가장 바람직하게는 예방하기에 충분한 양을 의미하고자 한다. 대안적으로, 치료적 유효량은 숙주에서 임상적으로 유의한 병태에서 향상을 유발하기에 충분하다. 당업자가 이해하는 바와 같은, 화합물의 양은 이의 특이적인 활성에 따라 다양할 수 있다. 적합한 투여량은 필요한 희석제와 연관되어 요망되는 치료 효과를 생산하도록 계산된 활성 조성물의 예정된 양을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제조를 위한 방법 및 용도에서, 치료적 유효량의 활성 구성성분이 제공된다. 치료적 유효량은 당업계에 잘 공지된 바와 같은 환자의 특징, 예컨대, 연령, 체중, 성별, 상태, 합병증, 다른 질환 등을 기초로 통상적인 숙련된 의료 또는 수의학 종사자에 의해 결정될 수 있다. 약제학적 유효 용량의 투여는 개별 용량 단위 또는 심지어 몇몇의 더 작은 용량 단위 형태에서 단일 투여와, 또한 특이적인 간격에서 하위구분된 용량의 다수 투여 둘 모두에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 용량은 연장된 기간에 걸친 계속적인 주입으로서 제공될 수 있다.
특히 바람직한 조성물은 전신 투여를 위해 제제화된다.
이러한 조성물은 바람직하게는, 소정의 기간에 걸친 지속 방출을 위해 제제화될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 지속 방출을 용이하게 하는 매트릭스 내에서 또는 이의 일부로서 제공될 수 있다. 바람직한 지속 방출 매트릭스는 몬타나이드 또는 γ-폴리글루탐산(PGA) 나노입자를 포함할 수 있다.
항체 폴리펩타이드는 사용되는 폴리펩타이드의 효능/독성에 따라 다양한 농도로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 제제는 활성 항체 폴리펩타이드를 0.1 μM 내지 1 mM, 보다 바람직하게는 1 μM 내지 500 μM, 500 μM 내지 1 mM, 300 μM 내지 700 μM, 1 μM 내지 100 μM, 100 μM 내지 200 μM, 200 μM 내지 300 μM, 300 μM 내지 400 μM, 400 μM 내지 500 μM, 500 μM 내지 600 μM, 600 μM 내지 700 μM, 800 μM 내지 900 μM, 또는 900 μM 내지 1 mM의 농도로 포함할 수 있다. 전형적으로, 제제는 활성 항체 폴리펩타이드를 300 μM 내지 700 μM 농도로 포함한다.
전형적으로, 인간 환자에서 항체 폴리펩타이드(치료 모이어티가 있거나 없음)의 치료 용량은 1회 투여 당 100 μg 내지 700 mg(70 kg 체중을 기초로 함)의 범위일 것이다. 예를 들어, 최대 치료 용량은 0.1 내지 10 mg/kg/투여, 예를 들어, 0.1 내지 5 mg/kg, 또는 1 내지 5 mg/kg, 또는 0.1 내지 2 mg/kg의 범위일 수 있다. 이러한 용량은 종양학자/의사에 의해 결정된 바와 같은 상이한 간격으로 투여될 수 있으며; 예를 들어, 용량은 매일, 1주에 2회, 1주 1회, 격주로 또는 매달 투여될 수 있음을 이해할 것이다.
당업자는, 본 발명의 약제학적 조성물이 단독으로, 또는 암 치료에 사용되는 다른 치료제, 예컨대, 항대사물질, 알킬화제, 안트라사이클린 및 다른 세포독성 항생제, 빈카 알칼로이드, 에토포사이드, 백금 화합물, 탁산, 토포이소머라제 I 저해제, 다른 세포정지 약물, 항증식 면역억제제, 코르티코스테로이드, 성 호르몬 및 호르몬 길항제, 및 다른 치료적 항체(예컨대, 종양-연관항원에 대한 항체 또는 면역 체크포인트 조정제)와 조합하여 투여될 수 있음을 이해할 것이다.
예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 PD-1/PD-L1, CD137, CD40, GITR, LAG3, TIM3, CD27 및 KIR로 구성된 군으로부터 선택되는 표적에 결합하는 면역치료제와 조합하여 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드를 암 치료에 효과적인 추가의 면역치료제와 함께 포함하는 병용 요법을 포괄하며, 상기 면역치료제는 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합한다. 추가의 면역치료제의 치료적 이익은 저해성 면역 체크포인트 분자의 기능을 약화시킴으로써 그리고/또는 자극성 면역 체크포인트 또는 공동-자극 분자의 기능을 활성화시킴으로써 매개될 수 있음을 이해할 것이다.
일 실시형태에서, 추가의 면역치료제는 하기의 면역치료제로 구성된 군으로부터 선택된다:
(a) PD-1 그리고/또는 PD-L1의 기능을 저해하는 면역치료제;
(b) CD137의 기능을 활성화시키는 면역치료제; 및
(c) CD40의 기능을 활성화시키는 면역치료제.
따라서, 추가의 면역치료제는 PD1 저해제, 예컨대, PD1 기능을 저해할 수 있는 항-PD1 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 람브롤리주맙(Lambrolizumab), PDR-001, MEDI-0680 및 AMP-224)일 수 있다. 대안적으로, PD1 저해제는 PD1 기능을 저해할 수 있는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 두르발루맙(Durvalumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab) 및 MDX-1105)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 추가의 면역치료제는 CD137, 예컨대, 효능적 항-CD137 항체 또는 이의 항원-결합부를 활성화시킨다.
추가의 실시형태에서, 추가의 면역치료제는 CD40, 예컨대, 효능적 항-CD40 항체 또는 이의 항원-결합부를 활성화시킨다.
당업자는 2개 활성제(상기 상술된 바와 같음)의 존재가 대상체에서 종양의 치료에서 상승적인 이익을 제공할 수 있음을 이해할 것이다. "상승적인"이란 본 발명자들은, 조합에서 2개 작용제의 치료 효과(예를 들어, 종양의 성장 속도 또는 크기를 참조로 결정된 바와 같음)가 이들 자체가 투여된 2개 작용제의 첨가적인 치료 효과보다 크다는 것을 포함한다. 이러한 상승작용은 고형 종양의 관련 세포주 모델에서 활성제를 단독으로 또는 조합하여 시험함으로써 식별될 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 다른 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 키트는 추가로, 하나 이상의 추가의 시약, 예컨대, 상기 고찰된 바와 같은 추가의 치료제 또는 예방제를 함유할 수 있다.
이제, 본 발명의 소정의 양태를 구현하는 바람직한 비제한적인 예가 하기 도면을 참조로 기재될 것이며:
도 1은 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에 대한 예시적인 구조의 도식도를 보여준다. 항-OX40 항체 가변 도메인은 검정색으로 채워져 있고; 불변 도메인은 백색으로 채워져 있다. CTLA-A 결합 도메인은 대각선으로 음영처리되어 있다.
도 2는 ELISA 결합 검정법에 의해 결정된 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 CTLA-4 결합 특성을 보여준다.
도 3은 ELISA 저해 검정법에 의해 결정된 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인의 CTLA-4 결합 특성을 보여준다.
도 4는 본원에 개시된 인간 야생형 CD86 아미노산 서열의 도식도를 보여준다. (A)는 N-말단 신호 서열이 없는 인간 CD86의 단량체성 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열(서열번호: 3)이며; (B)는 N-말단 신호 서열을 포함하는 인간 야생형 CD86의 단량체성 세포외 및 막관통 도메인의 아미노산 서열(서열번호: 4)이고; (C)는 인간 CD86의 전장 아미노산 서열(Genbank ABK41931.1; 서열번호: 44)이다. A에서 서열은 선택적으로, N 말단, 즉, 볼드체로 제시된 24 및 25번 위치에서 알라닌 및 프롤린이 결여되어 있을 수 있다. B 및 C에서 신호 서열은 밑줄 표시되어 있다. 아미노산 위치의 넘버링은 N 말단으로부터 출발하여 서열번호: 4 및 44를 기초로 한다.
도 5는, 본 발명의 폴리펩타이드의 CTLA-4 결합 도메인이 인간과 뮤린 CTLA-4 둘 모두에 대해 유사한 규모(magnitude)의 결합 친화성을 가짐을 실증하는 저해 ELISA의 결과를 보여준다.
도 6은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같은, 예시적인 항-OX40 항체에 대한 해리 속도 상수 대 결합 속도 상수의 플롯이다.
도 7은 유세포분석에 의해 측정된, CHO 세포 상에서 과발현된 인간 OX40에의 예시적인 항-OX40 항체의 결합을 보여준다.
도 8은 시험관내에서 상이한 예시적인 항-OX40 항체와 함께 인큐베이션된 경우, T 세포에 의한 IL-2 생산의 수준을 보여준다. y-축은 시험 항체에 의한 IL-2 생산의 상위 값(top value) / 참조 항체의 상위 값의 비이다. 적어도 4명의 공여자로부터의 평균 및 SEM 값이 제시되어 있다.
도 9은 개별 표적 OX40 및 CTLA4에의 예시적인 이중특이적 분자의 결합에 대한 ELISA 검정법의 결과를 보여준다.
도 10은 OX40과 CTLA4 둘 모두에의 예시적인 이중특이적 분자의 결합의 표면 플라즈몬 공명 분석 결과를 보여준다. 상이한 이중특이적 항체를 센서에 걸쳐 통과시켰다(출발은 I에 의해 지시됨). 표면의 근포화(near saturation)에서, 완충제를 적용하였고(II), 후속해서 CTLA-4(III)를 센서 표면에 걸쳐 통과시켜, 실선으로 표시된 제2 결합상(association phase)을 발생시켰다. 3분 후, 완충제(IV)를 적용하였고, 하기 해리상(dissociation phase)은 CTLA-4와 OX40 Ab 둘 모두의 해리를 반영한다. 대조군으로서, CTLA-4가 없는 완충제만 첨가하였으며, 점선으로 표시되어 있다.
도 11은 예시적인 이중특이적 분자가 OX40과 CTLA-4 둘 모두에 동시적으로 결합하는 것을 보여주는 ELISA 검정법의 결과를 보여준다.
도 12는 시험관내에서 적정 시리즈에서 상이한 예시적인 이중특이적 분자와 함께 인큐베이션된 경우 T 세포에 의한 IL-2 생산의 수준을 보여준다: A) 1164/1141 및 1166/1141, B) 1168/1141 및 1170/1263, C) 1514/1581 및 1520/1141, D) 1526/1585 및 1542/1141, 또는 각각의 표적에 대한 2개의 상응하는 단일특이적 항체의 조합(이소형(isotype) IgG 항체: 1756/1757에 커플링된 모노클로날 OX40 항체 또는 CTLA-4-결합 도메인). 이러한 검정법을 CD3(UCHT1) 및 CTLA-4(Orencia)로 코팅된 U자형 비-조직 배양 처리된 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 4명의 공여자로부터의 평균이 제시된다.
도 13은 시험관내에서 1.49 nM에서 상이한 예시적인 이중특이적 분자 또는 각각의 표적에 대한 상응하는 단일특이적 항체의 조합(이소형 항체: 1756/1757에 커플링된 a-OX40 mAb 또는 CTLA-4- 도메인)과 함께 인큐베이션된 경우 T 세포에 의한 IL-2 생산의 수준을 보여준다. 이러한 검정법을, + 또는 -로 지시된 CTLA-4(Orencia)가 있거나 없이 항-CD3(UCHT1)로 코팅된 U자형 비-조직 배양 처리된 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 4명의 공여자로부터의 평균 및 SD가 제시된다.
도 14는 본 발명의 이중특이적 항체에 대한 예시적인 포맷의 구조의 도식도를 보여준다. 각각의 포맷에서, 불변 영역은 채워진 밝은 회색으로 제시되며; 가변 중쇄 영역 VH1은 체크무늬 흑백으로 제시되며; 가변 경쇄 영역 VL1은 채워진 백색으로 제시되며; 가변 중쇄 영역 VH2는 채워진 검정색으로 제시되어 있고; 가변 경쇄 영역 VL2는 대각선과 함께 백색으로 제시된다. OX40 결합 도메인(결합 도메인 1)은 전형적으로, 채워진 백색 도메인과 함께 체크무늬 흑백 도메인의 쌍(VH1/VL1)으로 표시되어 있고; CD137 결합 도메인(결합 도메인 2)은 전형적으로, 대각선과 함께 채워진 검정색 도메인 및 백색 도메인의 쌍(VH2/VL2)으로 표시되어 있다. 그러나, 제시된 모든 포맷에서, 결합 도메인 1 및 2는 스위치될 수 있음을 이해할 것이다. 즉, OX40 결합 도메인이 이 도면에서 CD137 도메인에 대해 제시된 위치에서 발생할 수 있고, 그 반대일 수도 있다. 더욱이, 결합 도메인 2는 상이한 가변 중쇄 및 경쇄 순서로, 즉 VH2/VL2 또는 VL2/VH2 순서로 발생할 수 있다.
도 15는 CTLA-4 및 OX40을 표적화하는 예시적인 이중특이적 항체에 의해 유도된 ADCC와 비교하여, 상이한 농도에서 단일특이적 CTLA-4(CTLA-4 결합 부분, 즉, 도메인을 갖는 대조군 IgG) 및 OX40(1166/1167) 결합 분자 단독 및 조합에 의한 ADCC의 유도를 보여준다.
도 16. CTLA-4와 OX40 둘 모두를 발현하는 CHO 세포를, 저하하는 농도의 1166/1261, 또는 2개의 단일특이적 결합제 1166/1167(OX40 특이적인 모노클로날 항체) 및 CTLA-4 결합 부분을 갖는 대조군 IgG(단일특이적 CTLA4 결합 IgG 융합 단백질)(200 nM 내지 0.0034 nM)로 염색하고, 뒤이어 PE-접합 항-인간 IgG로 염색하였다. 형광을 유세포분석을 사용하여 검출하였다. 'Ctr IgG'는 음성 이소형 대조군이다.
도 17. HEK-CTLA4 및 CHO-OX40을 PKH26 및 PKH67로 각각 염색하고, 1166/1261 또는 2개의 단일특이적 OX40 및 CTLA-4 결합 분자의 조합(1166/1167 및 CTLA-4 결합 부분을 갖는 대조군 IgG)과 함께 인큐베이션하였다. 이중-양성/응집된 세포의 백분율을 유세포분석(대표적인 실험)을 사용하여 정량화하였다.
도 18. 투여 후 상이한 시점에서 측정된 이중특이적 OX40-CTLA-4 항체 1166/1261 및 단일특이적 OX40 항체 1166/1167의 혈장 수준이다. 2개의 상이한 ELISA 방법, OX40을 웰 상에 코팅하고 항-Fc를 결합을 검출하는 데 사용한 ELISA-1, 및 OX40을 웰 상에 코팅하고 비오틴화된 CTLA-4를 검출에 사용한 ELISA-2를 사용하였다.
도 19. HT-29 결장암종 세포(4x106)를 제0일에 우측 뒷다리/등에 피하 접종하였다. 인간 PBMC 세포(7x106)를 동일한 일자에 복강내 투여하였다. 치료를 제6일, 제13일 및 제20일에 복강내 주사(667 nmol/용량)에 의해 수행하였다. N(마우스)=5/공여체, n(공여체=4), HT29 반응체로부터의 풀링된(pooled) 데이터.
도 20은 hOX40tg 마우스에서 MC38 결장암종 모델을 사용하여 조사된 이중특이적 OX40-CTLA-4 항체의 약력학적 효과를 보여준다. 2개의 독립적인 실험으로부터 풀링된 데이터는, 2개의 단일특이적 대응물 모두와 비교하여 이중특이적 항체를 이용한 경우 종양내 CD8/Treg 비에 미치는 통계학적으로 유의한 효과를 실증하였다.
도 21은 MC38 결장암종 모델을 사용하는 hOX40tg 마우스의 비장 및 종양 조직에서 상이한 T 세포 집단의 상대 수준을 보여준다. 이중특이적 항체의 투여 효과를 단일특이적 대응물과 비교한다. 이중특이적 항체는 종양내 Treg를 감소시키지만, 전신 T-세포에는 영향을 주지 않는다.
도 22는 인간 OX40에 대한 유전자이식(transgenic) 마우스에서 MC38 결장암종 모델을 사용하여 조사된 이중특이적 OX40-CTLA-4 항체의 항종양 효과를 보여준다. 이중특이적 항체는 종양 부피 저해 및 증가된 생존에 미치는 통계학적으로 유의한 효과를 실증하였다. 항종양 효과는 생존 및 종양 성장 저해의 측면에서 단일특이적 대조군 항체보다 강하였다.
도 23은 이중특이적 OX40-CTLA 항체 1166/1261에 의해 유도된 항종양 효능을 보여준다. 항종양 효능을 MB49 방광암종 모델에서 hOX40 유전자이식 마우스를 사용하여 조사하였다. 피하 MB49 종양을 갖는 마우스에서 복강내 치료를 제7일, 제10일 및 제13일에 복강내로 수행하였다. A) 1166/1261 또는 모노클로날 대응물에 의한 종양 부피 저해. B) 1166/1261에 의해 유도된 증가된 생존. 종양 부피 그래프는 몇몇의 수행된 종양 부피 평균 +/- SEM의 예시이며, n=10이다. 2개의 개별적인 실험으로부터의 카플란-마이어 생존, 풀링된 데이터, n=18.
도 24는 특이적인 종양과 동일한 종양을 이용하거나 무관한 종양을 이용하여 완전 반응체에게 재-시도함으로써 실증된 면역 기억을 보여준다. A) 동일한 종양을 이용한 마우스의 재-시도. 네이브(naive) 마우스를 대조군으로서 사용하였다. (n=5). B) 한쪽 옆구리에서 하나의 특이적인 종양 MB49 및 다른쪽 옆구리에서 하나의 무관한 종양 PANC02를 이용한 트윈 종양 모델에서 마우스의 재-시도. 예시적인 실험에서, 그래프는 평균 +/- SEM을 보여주며, n=6이다.
도 25는 Treg 상에서 이중특이적 항체의 항종양 효과를 보여준다. 피하 MB49 방광암을 갖는 마우스를, 제10일, 제13일 및 제16일에 1166/1261 또는 모노클로날 대응물(1.33 μmol)의 복강내 주사로 치료하였다. 마지막 주사 후 24시간째에, 종양 및 비장을 수합하고, Treg 및 효과기 세포에 대해 염색하였다. A) 종양에서 Treg(CD45의)의 백분율, B) 종양에서 CD8 세포(CD45의)의 백분율, C) 종양에서 CD8/Treg 비, 및 D) 비장에서 CD8/Treg 비이다. 그래프는 평균 + SD를 보여준다.
도 26은 MC38 결장암종에 미치는 이중특이적 항체의 항종양 효과를 보여준다. 피하 MC38 결장암종을 갖는 마우스를 제10일, 제13일 및 제16일에 1166/1261로 복강내 주사로 치료하였다. 마지막 주사 후 24시간째에, 종양을 수합하고, 효과기 세포 및 활성화 마커에 대해 염색하였다. A) 종양에서 CD107+ CD8 세포의 백분율, 및 (B) 종양에서 그랜자임B+ CD8 세포의 백분율이다. 그래프는 평균 + SD를 보여준다.
도 27은 MC38 결장암종을 갖는 hOX40tg 마우스에서 종양 국소화를 보여준다. 피하 MC38 결장암종을 갖는 마우스를 제17일에 비히클, IgG1 이소형 대조군 또는 1166/1261로 복강내 치료하였다. 주사 후 24시간째에, 종양 및 비장을 수합하고, CD45 및 hIgG에 대한 생존력 마커 및 항체로 염색하고, 뒤이어 유세포분석 분석하였다. (A) 종양 및 (B) 비장에서 살아 있는 CD45+ 세포 중에서 hIgG+ 세포의 백분율을 상이한 그룹 사이에서 비교하였다. 그래프는 평균 + SEM를 보여준다.
도 28은 PD-1 항체와 1166/1261의 조합 효과를 보여준다. PD-1 치료와 함께 또는 없을 때의 1166/1261의 항종양 효과를 MC38 결장암종 모델에서 조사하였다. 복강내 치료(1166/1261, 1.33 μmol 또는 250 μg PD-1)를 제7일, 제10일 및 제13일에 복강내로 수행하였다. A) PD-1 조합과 함께 또는 없을 때 1166/1261에 의한 종양 부피 저해. B) PD-1 조합과 함께 또는 없을 때 1166/1261에 의해 유도된 증가된 생존. 종양 부피 그래프는 예시적인 그래프이고, 평균 종양 부피 +/- SEM, 또는 카플란-마이어 생존을 제시하며, n=9 내지 10이다.
도 29는 PD-1 항체와 1166/1261의 조합 효과를 보여준다. PD-1 치료와 함께 또는 없을 때의 1166/1261의 항종양 효과를 CT26 결장암종 모델에서 조사하였다. 복강내 치료를 제7일, 제10일 및 제13일에 수행하였다. A) PD-1과 함께 또는 없을 때 1166/1261에 의한 종양 부피 저해. B) PD-1 치료와 함께 또는 없을 때 1166/1261에 의한 카플란-마이어 생존. 그래프는 함께 풀링된 2개의 독립적인 실험을 보여주었으며, 종양 부피 평균 +/- SEM이며, n=18이다.
도 30은 췌장암에서 1166/1261의 항종양 효과를 보여준다. 이중특이적 OX40-CTLA-4 항체 1166/1261의 항종양 효과를 인간 OX40에 대한 유전자이식 마우스에서 PANC02 췌장암을 사용하여 조사하였다. 복강내 치료를 제7일, 제10일 및 제13일에 수행하였다. A) 종양 부피 저해. B) 증가된 생존. 그래프는 평균 종양 부피 +/-SEM, 또는 카플란 마이어 생존을 보여주며, n=18이다.
도 31은 CTLA-4 차단 리포터 검정법에서 Jurkat 리포터 세포 상에서 CTLA-4를 차단함으로써 T 세포 활성화를 유도하는 1166/1261 및 이소형 대조군의 능력을 보여준다. 2개 실험으로부터의 편집된 데이터이다.
도 32는 T 세포 활성화를 보여준다. A) 1166/1261, 단일특이적 항체 또는 이소형 대조군의 조합을 이용하여 인간 CD3+ T 세포를 자극한 후의 IFN-γ 생산이다. 실험을 CTLA-4 및 αCD3로 코팅한 플레이트에서 수행하였다. 4명의 공여자로부터의 편집된 데이터이다. B) CTLA-4-발현 HEK 세포 및 αCD3 비드의 존재 하에 1166/1261 또는 단일특이적 항체의 조합을 이용하여 자극된 CD4+ T 세포에 의한 IL-2 방출이다. 6명의 공여자로부터의 편집된 데이터이다. C) 1166/1261 또는 이소형 대조군에 대한 반응에서 CD4+ T 세포의 증식이다. 6명의 공여자로부터의 편집된 데이터이다.
도 33은 T 세포 활성화를 보여준다. CD64-발현 CHO 세포 및 αCD3 비드의 존재 하에 1166/1261 또는 단일특이적 항체의 조합을 이용하여 자극된 CD4+ T 세포에 의한 IL-2 방출이다. 8명의 공여자로부터의 편집된 데이터이다.
도 34는 1166/1261에 의한 ADCC 유도를 보여준다. A) 1166/1261, 모노클로날 대응물의 혼합물 또는 이소형 대조군에 대한 반응에서 FcγRIIIa(V158) 효과기 세포의 활성화이다. αCD3/αCD28 비드를 이용하여 48시간째에 활성화된 정제된 Treg를 표적 세포로서 사용하였다. 데이터는 배지 대조군에 걸친 배수 유도로서 제시된다. B) OX40 및 CTLA-4의 발현을 활성화 전 및 후에 Treg 상에서 유세포분석에 의해 결정하였다. 3명의 공여자의 평균이 제시된다.
도 35는 1166/1261에 대한 반응에서 ADCC를 보여준다. αCD3/αCD28 비드를 이용하여 48시간째에 활성화된 정제된 Treg를 표적 세포로서 사용하고, 동종이계 NK 세포를 효과기 세포로서 사용하였다. 효과기 및 표적 세포를 1166/1261 또는 이소형 대조군의 존재 하에 15:1의 비에서 배양하였다. 4시간 후, LDH 방출을 측정하였다. 7명의 공여자로부터의 편집된 데이터이다.
도 36은 1166/1261 치료에 의한 게먹이원숭이 T 세포 활성화의 활성화를 보여준다. A) 중심 기억 CD4+ 세포의 증식, B) CD4+ T 세포의 후기(late) 활성화이다.
서열의 설명
서열번호: 1은 인간 CTLA-4의 아미노산 서열(GenBank: AAD00698.1에 상응함)이다.
서열번호: 2는 인간 CD28의 아미노산 서열(GenBank: AAA51944.1에 상응함)이다.
서열번호: 3은 N 말단으로부터 23-아미노산 신호 서열을 배제하여, 인간 야생형 CD86의 단량체성 세포외 도메인의 아미노산 서열이다.
서열번호: 4는 N-말단 신호 서열을 포함하여, 인간 야생형 CD86의 단량체성 세포외 및 막관통 도메인의 아미노산 서열이다(도 4 참조). 본원에서 아미노산 위치의 모든 넘버링은 N 말단으로부터 출발하여 서열번호: 4에서의 위치를 기초로 한다. 따라서, 서열번호: 3의 N 말단에서 알라닌은 24로 넘버링된다.
서열번호: 5는 Peach 등에 개시된 인간 CD86의 세포외 도메인의 돌연변이체 형태의 아미노산 서열이다(문헌[Journal of Biological Chemistry 1995, vol 270(36), 21181-21187]). 야생형 서열의 79번 위치에서 H는 서열번호: 5의 서열에 대한 상응하는 위치에서 A로 치환된다. 이러한 변화는 본원에서 H79A로 지칭된다. 동등한 명명법은 본원에서 지칭되는 다른 아미노산 치환 전반에 걸쳐 사용된다. 위치의 넘버링은 상기 열거된 바와 같은 서열번호: 4를 기초로 한다.
서열번호: 6 내지 24는 본 발명의 특이적인 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호: 25 내지 43은 서열번호 6 내지 24의 각각의 아미노산 서열을 각각 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호: 44는 인간 CD86의 전장 아미노산 서열(GenBank: ABK41931.1에 상응함)이다.
서열번호: 45는 뮤린 CTLA-4의 아미노산 서열(UniProtKB/Swiss-Prot: P09793.1에 상응함)이다.
서열번호: 46은 뮤린 CD28의 아미노산 서열(GenBank: AAA37395.1에 상응함)이다.
서열번호: 47 내지 50은 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에서 사용될 수 있는 다양한 링커이다.
서열번호: 51은 인간 OX40의 아미노산 서열(GenBank: NP_003318.1에 상응함)이다.
서열번호: 52 내지 88은 본원에 개시된 항-OX40 항체의 예시적인 CDR 서열이다.
서열번호: 89 내지 124는 본원에 개시된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호: 125 내지 134는 본원에 개시된 이중특이적 폴리펩타이드의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호: 135는 예시적인 중쇄 불변 영역 아미노산 서열이다.
서열번호: 136은 예시적인 경쇄 불변 영역 아미노산 서열이다.
서열번호: 137은 힌지 영역(108번 위치)에서 Ser으로부터 Pro으로, 및 CH3 영역(315번 위치)에서 His으로부터 Arg으로의 돌연변이를 갖는 예시적인 변형된 인간 중쇄 IgG4 불변 영역 서열이다. 돌연변이는 IgG4의 감소된 반감기 및 코어 힌지의 안정화를 초래하여, IgG4를 더욱 안정하게 만들어, Fab 암 교환을 방지한다.
서열번호: 138은 예시적인 야생형 인간 중쇄 IgG4 불변 영역 서열이다. 상기 서열은 서열번호: 137의 돌연변이가 결여된 서열이다.
서열번호: 139는 힌지 영역(108번 위치)에서 Ser으로부터 Pro으로의 단일 돌연변이를 갖는 예시적인 변형된 인간 중쇄 IgG4 불변 영역 서열이다. 돌연변이는 IgG4의 코어 힌지의 안정화를 초래하여, IgG4를 더욱 안정하게 만들어, Fab 암 교환을 방지한다.
서열번호: 140은 서열번호: 137의 IgG4 불변 영역을 인코딩하는 예시적인 cDNA 서열(즉, 인트론이 결여됨)이다.
서열번호: 141은 서열번호: 137의 IgG4 불변 영역을 인코딩하는 예시적인 cDNA 서열(즉, 인트론을 포함함)이다.
서열번호: 142는 서열번호: 138의 IgG4 불변 영역을 인코딩하는 예시적인 cDNA 서열(즉, 인트론이 결여됨)이다.
서열번호: 143은 서열번호: 138의 IgG4 불변 영역을 인코딩하는 예시적인 DNA 서열(즉, 인트론을 포함함)이다.
서열번호 144는 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드에 사용될 수 있는 링커이다.
서열번호: 145 및 146은 각각 서열번호: 135의 IgG1 불변 영역을 인코딩하는 예시적인 cDNA 및 게놈 DNA 서열이다.
서열번호: 147은 서열번호: 136의 경쇄 카파 영역을 인코딩하는 예시적인 DNA 서열이다.
서열번호: 148은 서열번호: 139의 IgG4 영역을 인코딩하는 예시적인 cDNA 서열(즉, 인트론이 결여됨)이다.
서열번호: 149는 서열번호: 139의 IgG4 영역을 인코딩하는 예시적인 DNA 서열(즉, 인트론을 포함함)이다.
표(서열)
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기타 서열
서열번호: 1(인간 CTLA-4)
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIAKEKKPSYNRGLCENAPNRARM
서열번호: 2(인간 CD28)
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
서열번호: 3
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA
서열번호: 4
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP
서열번호: 5
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVASKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA
서열번호: 44(인간 CD86)
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF
서열번호: 45(뮤린 CTLA-4)
MACLGLRRYKAQLQLPSRTWPFVALLTLLFIPVFSEAIQVTQPSVVLASSHGVASFPCEYSPSHNTDEVRVTVLRQTNDQMTEVCATTFTEKNTVGFLDYPFCSGTFNESRVNLTIQGLRAVDTGLYLCKVELMYPPPYFVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN
서열번호: 46(뮤린 CD28)
MTLRLLFLALNFFSVQVTENKILVKQSPLLVVDSNEVSLSCRYSYNLLAKEFRASLYKGVNSDVEVCVGNGNFTYQPQFRSNAEFNCDGDFDNETVTFRLWNLHVNHTDIYFCKIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRLLQVTTMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP
서열번호: 51(인간 OX40)
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
서열번호: 140
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accttgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgctacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a
서열번호: 141
agctttctgg ggcaggccgg gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac gcaggtggcg ccagccaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggaccctgca tggaccatcg cggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcttcc accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc cggctgtgca gccccagccc agggcagcaa ggcatgcccc atctgtctcc tcacccggag gcctctgacc accccactca tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc ccggcaccac aggctggatg cccctacccc aggccctgcg catacagggc aggtgctgcg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcaga caccttctct cctcccagat ctgagtaact cccaatcttc tctctgcaga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccttg cccaggtaag ccaacccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccgctacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg
서열번호: 142
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a
서열번호: 143
agctttctgg ggcaggccgg gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac gcaggtggcg ccagccaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggaccctgca tggaccatcg cggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcttcc accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc cggctgtgca gccccagccc agggcagcaa ggcatgcccc atctgtctcc tcacccggag gcctctgacc accccactca tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc ccggcaccac aggctggatg cccctacccc aggccctgcg catacagggc aggtgctgcg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcaga caccttctct cctcccagat ctgagtaact cccaatcttc tctctgcaga gtccaaatat ggtcccccat gcccatcatg cccaggtaag ccaacccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg
서열번호: 145
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa
서열번호: 146
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서열번호: 147
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서열번호: 148
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accttgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a
서열번호: 149
agctttctgg ggcaggccgg gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac gcaggtggcg ccagccaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggaccctgca tggaccatcg cggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcttcc accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc cggctgtgca gccccagccc agggcagcaa ggcatgcccc atctgtctcc tcacccggag gcctctgacc accccactca tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc ccggcaccac aggctggatg cccctacccc aggccctgcg catacagggc aggtgctgcg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcaga caccttctct cctcccagat ctgagtaact cccaatcttc tctctgcaga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccttg cccaggtaag ccaacccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 더 예시되며, 이러한 실시예는 추가로 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 본 출원 전반에 걸쳐 모든 도면 및 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 명백하게 포함된다.
실시예 1 - CTLA-4 결합 도메인
CTLA-4 결합 도메인 폴리펩타이드를 WO 2014/207063(실시예 참조)에 기재된 바와 같은 선택하고 발현시켰으며, 하기 기재된 바와 같은 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명 중 적어도 하나에 의해 CTLA-4에의 결합에 대해 검정하였다.
결합 ELISA
96-웰 편평 바닥 고(high) 결합 플레이트(Greiner, #655074)를 CTLA4-Fc(Fitzgerald, #30R-CD152) 또는 CD28-Fc(R&D Systems, 342-CD)로 4℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 코팅시켰다. 상기 플레이트를 세척하고(세척 완충제: PBS+0.05% Tween 20(PBST) Medicago, #09-9410-100), 그 후에 PBST+3% BSA(Merck, #1.12018.0100)에서 블라킹시켰다(blocked). 상기 플레이트를 다시 세척하고, 시료 또는 대조군(200으로부터 0.001 μg/ml까지 1/5 단계 희석함)을 상기 웰에 첨가하였다. 시료를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 후에 세척하였다. 검출 항체, 염소-항-인간 IgG Fcγ-HRP(Jackson, #109-035-098)를 첨가하고, 상기 플레이트를 후속적으로 SuperSignal Pico 화학발광 기질(Thermo Scientific, #37069)을 사용하여 발색시키고, Envision 판독기(Perkin Elmer)를 이용하여 검출하였다. EC50 값을 CTLA4와 CD28 둘 모두에 대해 계산하였다. 결합비(EC50 결합비 = [CD28에 대한 EC50] ÷ [CTLA-4에 대한 EC50])를 각각의 폴리펩타이드에 대해 계산하였으며, 표 1.1에 제시한다.
표면 플라즈몬 공명
CTLA4-Fc(Fitzgerald, #30R-CD152) 또는 CD28-Fc(R&D Systems, 342-CD)를 종래의 아민 커플링을 사용하여 Biacore™ 센서 칩, CM5에 고정시켰다. CD86 돌연변이체 분자 및 대조군(100으로부터 1.5 nM까지 1/2 단계 희석함)을 30 μl/ml의 유속에서 HBS-P(GE, BR-1003-68)에서 결합에 대해 분석하였다. 결합을 3분 동안 수행하고, 해리를 10분 동안 수행하였다. 재생을 5 mM NaOH를 사용하여 30초 동안 2회 수행하였다. 동역학(kinetic) 매개변수 및 친화성 상수를 BIAevaluation 4.1 소프트웨어(표 1.3)를 사용하여 계산하였다.
저해 ELISA
96-웰 편평 바닥 플레이트 고 결합 플레이트(Greiner, #655074)를 야생형 CD86-Fc(R&D Systems, #7625-B2)로 4℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 코팅시켰다. 상기 플레이트를 세척하고(세척 완충제: PBS+0.05% Tween 20(PBST) Medicago, #09-9410-100), 그 후에 PBST+3% BSA(Merck, #1.12018.0100)에서 블라킹시켰다. 시료(CD86 돌연변이체 또는 야생형 단백질; 30000으로부터 0.3 ng/ml까지 1/4 단계 희석시킴)를 실온에서 비오틴화된-CTLA4(Fitzgerald, #30R-CD152)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 후에 혼합물을 ELISA 플레이트에서 블라킹된 웰에 첨가하였다. 검출을 스트렙타비딘-HRP(Pierce, #21126)를 이용하여 수행하고, 상기 플레이트를 후속적으로 SuperSignal Pico 화학발광 기질(Thermo Scientific, #37069)을 사용하여 발색시키고, Envision 판독기(Perkin Elmer)를 이용하여 검출하였다. 그 결과를 도 2에 제시한다. IC50 값을 계산하고, 하기 표에 제시한다. 시험된 모든 분자는 야생형과 H79A 둘 모두보다 양호한 IC50을 보여주었으며, 최상의 돌연변이체 CD86 분자의 IC는 야생형과 비교하여 100-배 넘게 향상되었다. 예시적인 분자 900, 901, 904, 906, 907, 908, 910, 915 및 938에 대한 결과는 표 1.1에 제시한다. Kd 결합비 = [CD28에 대한 Kd] ÷ [CTLA-4에 대한 Kd]. 예시적인 분자 900, 901, 904, 906, 907, 908, 910, 915 및 938에 대한 전체 아미노산 서열을 서열번호: 6 내지 14로서 각각 제공한다.
Figure pct00024
예시적인 분자 1038, 1039, 1040, 1041,1042, 1043, 1044, 1045, 1046 및 1047에 대한 결과는 표 1.2와 1.3, 및 도 2와 3에 제시된다. 예시적인 분자 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1044, 1045, 1046 및 1047에 대한 완전 아미노산 서열은 각각 서열번호: 15 내지 24로서 제공된다.
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예 2 - 클론 1040으로부터의 예시적인 폴리펩타이드의 뮤린 CTLA-4에 대한 교차-반응성
예시적인 돌연변이체 CD86 분자 1040의 뮤린 및 인간 CTLA-4에 대한 상대 친화성을 저해 ELISA 결합 검정법을 사용하여 조사하였다. 이들 실험에 사용된 1040 분자를 항-CD40 항체에 이중특이적 분자의 부분으로서 접합시켰다. CD86 분자의 CTLA-4 결합 특성은 이러한 접합에 의해 영향을 받지 않는다(데이터는 제시되지 않음).
간략하게는, 96-웰 편평 바닥 플레이트 고 결합 플레이트(Greiner #655074)를 인간 CTLA-4(Fitzgerald)로 4℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 코팅시켰다. 상기 플레이트를 세척하고(세척 완충제: PBS+0.05% Tween 20(PBST) Medicago, #09-9410-100), 그 후에 PBST+3% BSA(Merck, #1.12018.0100)에서 블라킹시켰다.
시료(예시적인 CD86 돌연변이체)를 실온에서 상이한 농도(30000으로부터 0.3 ng/ml까지 1/4 단계 희석)의 가용성 비오틴화된-인간 CTLA4(Fitzgerald #30R-CD152) 또는 가용성 뮤린 CTLA-4(R&D Systems)와 함께 1시간 동안 예비-인큐베이션하였다.
그 후에 혼합물을 ELISA 플레이트에서 블라킹된 웰에 첨가하였다. 검출을 스트렙타비딘-HRP(Pierce, #21126)를 이용하여 수행하고, 상기 플레이트를 후속적으로 SuperSignal Pico 화학발광 기질(Thermo Scientific, #37069)을 사용하여 발색시키고, Envision 판독기(Perkin Elmer)를 이용하여 검출하였다. 그 결과를 도 5에 제시한다. 관찰된 저해 곡선은, 뮤린 및 인간 CTLA-4가 2개 형태의 CTLA-4에의 예시적인 CD86 돌연변이체(1040)의 결합 친화성이 유사한 규모임을 실증한다. 실시예 1에서 시험된 다른 클론은 또한, 뮤린 CTLA-4에 결합하는 것으로 확인되었다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 3 - OX40 항체의 특징화
예시적인 OX40 항체의 특징을 하기 표 3.1에 요약한다.
Figure pct00027
2개의 항-OX40 항체를 이들 연구에서 비교 목적을 위해 참조 항체로서 사용하기 위해 단독으로 합성하였다. 이들은 본원에서 "72" 또는 "72/76", 및 "74" 또는 "74/78"로 각각 지칭된다.
표면 플라즈몬 공명에 의한 동역학 상수의 측정
인간 OX40(R&D Systems, #3358_OX)을 종래의 아민 커플링을 사용하여 Biacore™ 센서 칩, CM5에 고정시켰다. 시험된 항체 및 대조군(100으로부터 2 nM까지 1/3 또는 1/2 단계 희석함)을 30 μl/ml의 유속에서 HBS-P(GE, BR-1003-68)에서 결합에 대해 분석하였다. 결합을 3분 동안 수행하고, 해리를 20분 동안 수행하였다. 재생을 50 mM NaOH를 사용하여 60초 동안 2회 수행하였다. 동역학 매개변수 및 친화성 상수를 드리프팅 기준선과 함께 1:1 Langmuir 모델을 사용하여 계산하였다. 시험된 항체는 전반적으로, 온률(on rate) 및 오프률(off rate)을 다양하게 하면서 하위나노몰 내지 나노몰 범위에 존재하였다(도 6 및 표 3.1). 대부분의 항체는 5 nM 미만의 친화성을 가졌다. 동역학 매개변수 및 친화성 상수를 BIAevaluation 4.1 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
ELISA에 의한 인간과 뮤린 OX40, 및 CD137과 CD40에의 결합의 ELISA에 의한 측정
ELISA 플레이트를 0.1 또는 0.5 μg/ml에서 인간 OX40(R&D Systems, 3388-OX), CD40(Ancell) 또는 CD137(R&D Systems)로 코팅시켰다. ELISA 플레이트를 PBST로 세척하고, 그 후에 실온에서 PBST+2% BSA로 1시간 동안 블라킹시키고, 그 후에 PBST로 다시 세척하였다. 항체를 희석 시리즈로 ELISA 플레이트에 실온에서 1시간 동안 첨가하고, 그 후에 PBST로 세척하였다. 결합을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션된 염소 항 인간 카파 경쇄 HRP를 사용하여 검출하였다. SuperSignal Pico Luminescent를 기질로서 사용하고, 발광을 Fluostar Optima를 사용하여 측정하였다.
모든 시험된 OX40 항체는 인간 OX40에 결합하였고, 1 nM 미만인 EC50 값을 나타내었다. 항체는 시험된 뮤린 OX40 또는 다른 TNFR 상과 구성원에 결합하지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
CHO 세포 상에서 과발현된 인간 OX40에의 결합의 측정
인간 OX40의 세포외 부분을 hCD40의 막관통 및 세포내 부분에 융합시키고, pcDNA3.0 내로 클로닝시켰다. 벡터를 후속적으로 CHO 세포 내로 안정하게 형질감염시켰다. OX40의 발현을, 상업적인 OX40 항체(huOX40, BD Biosciences)를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 확인하고, 그 후에 4℃에서 30분 동안 a-huIgG-PE(Jackson Immunoresearch)로 검출하였다. 검정법에 대해, 형질감염된 세포를 시험 항체 및 대조군과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 그 후에 4℃에서 30분 동안 a-huIgG-PE(Jackson Immunoresearch)로 검출하였다. 세포를 FACS Verse(BD Biosciences)를 이용한 유세포분석에 의해 분석하였다.
모든 클론은 CHO 세포 상에서 과발현된 hOX40에 용량 의존적 방식으로 결합하였다(도 7).
실시예 4 - OX40 항체의 서열 분석
중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두의 CDR 서열을 각각의 항체에 대해 분석하였다. 표 4.1은 VH CDR3 서열에 대해 수행된 바와 같은 분석을 예시한다. 표 4.1에서의 위치는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된다. 하기 패턴을 식별하였다.
VH 영역은 모두 하기의 서열을 포함한다:
(a) 8개 아미노산 길이이고, 공통 서열: "G, F, T, F, G/Y/S, G/Y/S, Y/S, Y/S/A"를 포함하는 중쇄 CDR1 서열;
(b) 8개 아미노산 길이이고, 공통 서열: "I, G/Y/S/T, G/S/Y, S/Y, G/S/Y, G/S/Y, G/S/Y, T"를 포함하는 중쇄 CDR2 서열; 및
(c) 9 내지 17개 아미노산 길이이고, 공통 서열: "A, R, G/Y/S/H, G/Y/F/V/D, G/Y/P/F, -/H/S, -/N/D/H, -/Y/G, -/Y, -/Y, -/W/A/V, -/A/Y, -/D/A/Y/G/H/N, Y/S/W/A/T, L/M/I/F, D, Y"를 포함하는 중쇄 CDR3 서열.
VL 영역은 모두 하기 서열을 포함한다:
(a) 서열: "Q, S, I, S, S, Y"로 구성된 경쇄 CDR1 서열;
(b) 서열: "A, A, S"로 구성된 경쇄 CDR2 서열;
(c) 8 내지 10개 아미노산 길이이고, 공통 서열: "Q,Q, S/Y/G, -/Y/H/G, -/S/Y/G/D/W, S/Y/G/D, S/Y/G/T, P/L, Y/S/H/L/F, T"를 포함하는 경쇄 CDR3 서열.
중쇄 CDR3에 대한 공통 서열 내에서, 2개의 하위계통(sub-family)을 식별하였다. 제1 하위계통 내의 각각의 항체는 공통 서열 "A, R, Y/H, D, Y, A/Y/G, S/W/A, M/L, D, Y"를 포함하는 10개 아미노산 길이의 VH CDR3 서열을 포함한다. 이러한 계통 내의 항체는 계통 Z로서 지칭되고, 표 4.1에서와 같이 식별된다. 제2 하위계통 내의 각각의 항체는 공통 서열 "A, R, G/Y, V/F/Y, P, H, G/Y/H, Y, F/I, D, Y"를 포함하는 11개 아미노산 길이의 VH CDR3 서열을 포함한다. 이러한 계통 내의 항체는 계통 P로서 지칭되고, 표 4.1에서와 같이 식별된다. 계통 Z 또는 P의 항체가 바람직하다. 계통 P 내의 VH 서열을 갖는 항체는 전형적으로 또한, "Q, Q, S, Y, S, T, P, Y, T"의 CDR3 서열, CDR1 서열 "Q, S, I, S, S, Y" 및 "A, A, S"의 CDR2 서열을 갖는 VL 서열을 포함한다. 이에, 이들 3개의 CDR 서열을 포함하는 VL 영역을 갖는 항체가 바람직하다.
Figure pct00028
실시예 5 - OX40 항체의 도메인 맵핑(mapping)
OX40의 세포외 부분은 4개의 도메인으로 구성되며, 이들은 각각 2개의 모듈로 하위구분될 수 있다. OX40 인간/마우스 키메라의 유전자를 표준 실험실 기술을 사용하여 합성하였다. 인간 OX40의 도메인 또는 모듈을 상응하는 마우스 OX40로 교환함으로써 상이한 키메라를 설계하였다. 키메라를 인간 및 마우스 서열의 평가 및 인간 OX40의 3D 조사를 기초로 설계하였다. 합성된 유전자를 프로젝트 특이적인 ID 번호로 지정하였다(표 5.1 참조). 구축물을 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen) 내로 클로닝하였다.
마우스/인간 키메라를 FreeStyle 293-F 세포(Invitrogen) 내로 일시적으로 형질감염시키고, FreeStyle 293 발현 배지(Invitrogen) 37℃, 8% CO2, 135 rpm에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 형질감염된 세포를 인간 OX40 항체, 인간 OX40L(hOX40L, RnD Systems), 마우스 OX40L(mOX40L, RnD Systems) 및 대조군과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 그 후에 a-huIgG-PE(Jackson Immunoresearch)를 이용하여 4℃에서 30분 동안 검출하였다. 세포를 FACS Verse(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 상이한 키메라 구축물에의 결합을 이소형 대조군의 결합과 비교하여 상대 MFI(평균 형광 강도)로서 계산하였다. 그 결과를 표 5.2에 제시한다.
시험된 인간 OX40 항체 중 어느 것도 뮤린 OX40에 결합하지 않는다. 이에, 주어진 항체가 특정 키메라에 결합하지 않는다면, 이는 상기 항체가 해당 키메라에서 뮤린 도메인으로 대체된 도메인 중 하나에 특이적임을 가리킨다.
Figure pct00029
적어도 4개의 별개의 결합 패턴을 식별하였다.
패턴 A:
항체 1170/1171, 1524/1525 및 1526/1527은 유사한 결합 패턴을 나타내고, 결합에 대해 동일한 도메인 내의 잔기에 의존한다. 결합에 결정적인 아미노산 잔기는 도메인 2에서 모듈 B에, 및 도메인 2의 모듈 A에 위치하는 경향이 있다. CDRH3 계통 "Z"를 갖는 대부분의 항체는 패턴 A(1166/1167은 예외임)에 따라 결합하며, 이는 이러한 유형의 CDRH3을 갖는 항체가 이러한 에피토프에 결합하는 성향이 있음을 가리킨다.
패턴 B:
항체 1168/1135, 1542/1135, 1520/1135, 1490/1135, 1482/1483 및 1164/1135는 유사한 결합 패턴을 나타내고, 결합에 대해 도메인 3에 위치한 잔기에 주로 의존한다. CDRH3 계통 "P"를 갖는 모든 항체는 이러한 패턴으로 결합하며, 이는 CDRH3 서열에서 유사성이 공통의 결합 에피토프를 드러냄을 실증한다.
패턴 C:
항체 1166/1167은 독특한 결합 패턴을 갖고, 결합에 대해 도메인 2에서 모듈 A 및 모듈 B에 위치한 잔기에 의존하는 경향이 있다. 그러나, 두 모듈은 모두, 결합을 폐지하기 위해 동시적으로 교환되어야 하고, 이는 구조적으로 복잡한 에피토프를 제안한다.
패턴 D:
항체 1514/1515는 독특한 결합 프로파일을 나타내고, 결합에 대해 도메인 2에서 모듈 B에 위치한 아미노산에 대체로 의존하는 경향이 있다.
참조 항체 72는 패턴 B에 따라 결합한다. 인간 OX40 리간드의 결합 패턴은 패턴 C와 유사하다.
Figure pct00030
실시예 6 - 마카 물라타와의 교차-반응성
마카 물라타로부터의 OX40의 세포외 부분을 hCD40의 막관통 및 세포내 부분에 융합하고, pcDNA3.0 내로 클로닝시켰다. 벡터를 후속적으로 HEK 세포(macOX40-HEK) 내로 안정하게 형질감염시켰다.
OX40의 발현을, 상업적인 OX40 항체(huOX40, BD Biosciences)를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 확인하고, 그 후에 4℃에서 30분 동안 a-huIgG-PE(Jackson Immunoresearch)로 검출하였다. 검정법에 대해, 형질감염된 세포를 시험 항체 및 대조군과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 그 후에 4℃에서 30분 동안 a-huIgG-PE(Jackson Immunoresearch)로 검출하였다. 세포를 FACS Verse(BD Biosciences)를 이용한 유세포분석에 의해 분석하였다.
하기 표 6.1에 제시된 바와 같은, 시험된 항체는, 인간 OX40에 대해 달성된 EC50 값과 비슷한 EC50 값으로 마카 물라타 OX40에 결합하며, 이는 마카 물라타가 독성학 연구에 사용하기에 적합할 것임을 제안한다.
마카 물라타는 마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)(게먹이 원숭이(cynomolgus monkey))와 유전적으로 매우 유사하여, 이러한 게먹이 원숭이가 또한 독성학 연구에 적합한 종이 되게 할 가능성이 크다.
Figure pct00031
실시예 7 - 인간 T 세포 검정법에서 효능 활성
인간 T 세포를, 혈액 은행(룬트 대학교 병원)으로부터 수득된 백혈구 필터로부터의 PBMC로부터 Miltenyi사의 음성 T 세포 선택 키트에 의해 수득하였다. OX40 항체를 96-웰 배양 플레이트(Corning Costar U자형 플레이트(#3799))의 표면에 코팅시키고, 3 μg/ml에서 고정된 항-CD3 항체(UCHT1)와 5 μg/ml에서 가용성 항-CD28 항체(CD28.2)의 조합과 함께 배양하였다. 항-CD3을 4℃에서 밤새 예비-코팅시켰다. 이튿날, PBS로 1회 세척한 후, OX40 항체를 37℃에서 1 내지 2시간 동안 코팅시켰다. 37℃, 5% CO2에서 수분 챔버 내에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, 상층액 내의 IL-2 수준을 측정하였다.
항체가 인간 T 세포를 자극시켜 IL-2를 생산하는 능력을 참조 항체 74와 비교하였고, 상대 활성을 도 8에 나타낸다. 대부분의 항체는 참조 항체와 비슷한 T 세포 활성화 수준을 제공하였다. 많은 항체가 더 높은 수준의 T 세포 활성화를 제공하였다.
이중특이적 분자
하기 실시예에서, 시험된 이중특이적 분자를 번호에 의해 지칭하며, 예를 들어, 1164/1141이다. 이는, 분자가 표 B 및 D에 제시된 각각의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열을 포함함을 의미한다. 예를 들어, 1164/1141은 표 B에 제시된 중쇄 VH 영역 서열 1164(서열번호: 99), 및 표 D에 제시된 이중특이적 사슬 번호 1141(서열번호: 129)을 포함한다. 주어진 분자의 명시된 VH 영역 서열은 전형적으로, 서열번호: 135의 IgG1 중쇄 불변 영역 서열에 연결되어(단일 인접 폴리펩타이드 사슬의 부분으로서) 제공된다. 이러한 서열은 전형적으로, 표 B의 명시된 VH 영역 서열의 C 말단 끝에 존재한다.
실시예 8 - 단일 표적에의 결합에 대한 예시적인 이중특이적 분자의 친화성
표면 플라즈몬 공명에 의한 동역학 상수의 측정
인간 OX40(R&D Systems, #3358_OX)을 종래의 아민 커플링을 사용하여 Biacore™ 센서 칩, CM5에 고정시켰다. 시험된 항체 및 대조군(100으로부터 2 nM까지 1/3 또는 1/2 단계 희석함)을 30 μl/ml의 유속에서 HBS-P(GE, BR-1003-68)에서 결합에 대해 분석하였다. 결합을 3분 동안 수행하고, 해리를 20분 동안 수행하였다. 재생을 50 mM NaOH를 사용하여 30초 동안 2회 수행하였다. 동역학 매개변수 및 친화성 상수를 드리프팅 기준선과 함께 1:1 Langmuir 모델을 사용하여 계산하였다. 시험된 항체는 OX40에 대한 상응하는 단량체성 항체보다 일반적으로 더 낮은 친화성과 함께 다양한 온률 및 오프율을 가졌으나, 나노몰 범위에 여전히 존재하였다(표 8.1).
Figure pct00032
ELISA에 의한 측정
ELISA 플레이트를 0.4 또는 0.5 μg/ml에서 각각 인간 CTLA-4(BMS, Orencia) 또는 인간 OX40(R&D Systems, 3388-OX)로 코팅시켰다. ELISA 플레이트를 PBST로 세척하고, 그 후에 실온에서 PBST+2% BSA로 1시간 동안 블라킹시키고, 그 후에 PBST로 다시 세척하였다. 이중특이적 분자를 희석 시리즈로 상기 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 세척하고, 결합을 실온에서 1시간 동안 염소 항 인간 카파 경쇄 HRP를 사용하여 검출하였다. SuperSignal Pico Luminescent를 기질로서 사용하고, 발광을 Fluostar Optima를 사용하여 측정하였다.
모든 시험된 이중특이적 분자는 두 표적 모두에 결합하였고, EC50 값은 단일특이적 항체로서 이들의 친화성을 기초로 예상될 범위에 존재한다(도 9).
실시예 9 - 예시적인 이중특이적 분자의 두 표적 모두에의 이중 결합
표면 플라즈몬 공명에 의한 측정
인간 OX40(R&D Systems, #3358_OX)을 종래의 아민 커플링을 사용하여 Biacore™ 센서 칩, CM5에 고정시켰다. 시험된 이중특이적 분자(0.5 μM 또는 0.25 μM) 및 대조군을 30 μl/ml의 유속에서 상기 칩에 걸쳐 진행시켰다. 결합을 3분 동안 수행하고, 해리를 3분 동안 수행하였다. 그 후에, CTLA4-Fc(BMS, Orencia)를 주사하고, 결합을 3분 동안 수행하고, 해리를 3분 동안 수행하였다. CTLA4 대신에 블랭크 PBS를 대조군으로서 주사하였다.
모든 시험된 이중특이적 분자는 도 10에 제시된 바와 같은 두 표적 모두에 동시적으로 결합하였다.
ELISA에 의한 측정
ELISA 플레이트를 OX40-Fc(R&D Systems, #3358_OX)(0.4 μg/ml)로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. ELISA 플레이트를 PBST로 세척하고, 그 후에 실온에서 PBST+2% BSA로 1시간 동안 블라킹시키고, 그 후에 PBST로 다시 세척하였다. 이중특이적 분자를 희석으로 상기 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 세척하고, 비오틴화된 CTLA-4(1 μg/ml)을 첨가하고, 상기 플레이트 상에서 실온에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 세척하고, HRP-표지 스트렙타비딘을 결합 검출에 사용하였다. SuperSignal Pico Luminescent를 기질로서 사용하고, 발광을 Fluostar Optima를 사용하여 측정하였다.
두 표적 모두에의 결합을 모든 시험된 이중특이적 분자에 대해 확인하였다. 도 11에 제시된 바와 같은, 시험된 이중특이적 분자는 농도 0.1 nM에서 검출할 수 있을 것이고, 이는 0.015 μg/ml에 상응한다. 검정법에서 상대 값은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 친화성에 양호하게 상응한다.
실시예 10 - 인간 CD4 T 세포 검정법에서 예시적인 이중특이적 분자의 효능 활성
인간 CD4 T 세포를, 혈액 은행(룬트 대학교 병원)으로부터 수득된 백혈구 필터로부터의 PBMC의 음성 CD4 T 세포 선택(Miltenyi, 인간 CD4+ T 세포 단리 키트 130-096-533)에 의해 단리하였다. CTLA-4(Orencia, 2.5 μg/ml) 및 항-CD3(UCHT-1, 1 ug/ml)를 96-웰 배양 플레이트(비-조직 배양 시험된, U자형 96-웰 플레이트(Nunc, VWR #738-0147))의 표면에 4℃에서 밤새 코팅시켰다. CTLA-4와 CD3 둘 모두를 이용하여 코팅시킴으로써, 검정법은 과발현된 CTLA-4와 함께 종양 미세환경의 실험 모델을 제공한다. CTLA-4를 일부 웰로부터 대조군으로서 생략하였다.
시험되는 이중특이적 분자를 일련의 희석으로 웰에 가용성 첨가하고, 동일한 몰 농도에서 대조군과 비교하였다. 2개의 상이한 대조군을 시험된 각각의 이중특이적 분자에 사용하였다. 제1 대조군은 1756/1757(1040 CTLA4 결합 영역에 융합되며 OX40이 아닌 CTLA4에 결합하는 이소형 대조군 항체)로 지칭되는 이중특이적 분자이다. 제2 대조군은 이중특이적 1756/1757 대조군과 단일특이적 OX40 항체의 혼합물이며, 이는 시험된 이중특이적 분자에 상응한다. 37℃, 5% C02에서 수분 챔버에서 72시간 인큐베이션한 후, IL-2 수준을 상층액에서 측정하였다.
도 12에 제시된 바와 같은, 이중특이적 분자의 용량-의존적 효과가 존재하며, 이는 CTLA-4로 코팅된 플레이트에서 배양된 경우 인간 T 세포 활성화에서 증가(IL-2 생산에서 증가에 의해 측정됨)를 유도한다. 대조군은 그렇지 않다. 도 13은 CTLA-4의 존재 또는 부재 하에 고정된 농도에서 이중특이적 항체 및 대조군(1.5 nM)에 대해 수행된 경우, 동일한 검정법의 결과를 보여준다. T 세포 활성화의 증가는 CTLA-4의 부재 하에 나타나지 않는다. 단일특이적 분자의 상응하는 조합과 비교하여 각각의 이중특이적 분자에 의해 유도된 IL-2 수준에서 배수 변화는 표 10.1에 제시되어 있다. 각각의 이중특이적 분자 또는 대조군에 대해 생산된 IL-2의 평균 값(pg/ml)은 표 10.2에 제시되어 있다.
이러한 검정법이 과발현된 CTLA-4이 있는 종양 미세환경의 실험 모델을 나타내기 때문에, 그 결과는 시험된 이중특이적 분자가 이러한 미세환경에서 단일특이적 항체보다 큰 효과를 갖는 것으로 예상될 수 있음을 제안한다.
Figure pct00033
Figure pct00034
실시예 11 - 예시적인 이중특이적 분자의 안정성
항체의 용융점을 시차 주사 열량계(DSF)에 의해 분석하였다. PBS 중 항체 시료를 1000-배 희석된 SYPRO Orange와 혼합하였다. 25℃ 내지 95℃에서의 열적 스캐닝(thermal scanning)을 각각의 정도로 제조된 측정을 이용하여 실시간 PCR에서 수행하였다. 참조 항체 250/251을 비교에 사용하였고, 참조에 비해 용융점 Tm에서의 차이(△Tm)를 결정하였다. 참조와 비교하여 1.1℃ 초과의 Tm 차이는 통계학적으로 유의한 것으로 여겨진다. 표 11.1에 제시된 바와 같은, 모든 시험된 이중특이적 분자는 65℃ 이상의 값을 갖는 양호한 열안정성을 나타내었다.
Figure pct00035
실시예 12 - CTLA4 및 OX40을 표적화하는 예시적인 이중특이적 항체에 의한 ADCC의 유도에서 상승작용(단독으로 또는 조합에서 단일특이적 항체의 효과와 비교함)
재료 및 방법
항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)의 평가
FcγRIIIa 수용체(V158 변이체) 및 파이어플라이 루시퍼라제(Promega Corporation)의 발현을 구동하는 NFAT 반응 요소를 안정하게 발현하도록 조작된 Jurkat 세포를 ADCC의 평가에서 효과기 세포로서 사용하였다. 항체를 96-웰 불투명 발광 플레이트에서 2벌 중복 웰에서 적정하고, 효과기 세포 및 OX40과 CTLA4 둘 모두를 발현하는 표적 세포를 5:1의 비로 첨가하였다. 37℃, 95% O2 습윤화된 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션한 후, 루시퍼라제 검정법 기질(Promega Corporation)을 배지 대조군 웰(블랭크 차감(subtraction)용)을 포함하는 모든 웰에 첨가하고, 발광을 FLUOstar Optima 마이크로플레이트 판독기(BMG LabTech) 상에서 검출하였다. 배수-유도 ADCC를 하기와 같이 계산하였다: (표적 용해 - 블랭크)/(자발적 용해 - 블랭크). 상위 값을 Prism 6.0(Graphpad, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 log(효능제) 대 반응(3개 매개변수) 곡선 적합(curve fit)을 기초로 계산하였다.
항체
· "1166/1167" = 단일특이적 OX40 항체
· "CTLA-4 결합 부분을 갖는 대조군 IgG" = IgG 단백질에 융합된 단일특이적 CTLA4 결합 도메인
· "1166/1261" = OX40 및 CTLA4를 표적화하는 예시적인 이중특이적 항체(상기 기재된 단일특이적 결합제와 동일한 OX40 및 CTLA-4 결합 부분을 함유함).
· "Ctrl IgG" = 음성 이소형 대조군
결과
예시적인 이중특이적 항체 1166/1261은 ADCC의 우수한 유도를 나타낸다
도 15에 제시된 바와 같은, 검출 가능한 수준의 ADCC를 모든 시험된 구성성분에 의해 유도하였다. 음성 이소형 대조군은 임의의 ADCC를 유도하지 않았다(데이터는 제시되지 않음). 가장 주목할만하게는, 이중특이적 1166/1261 항체는 대조군과 비교하여 약 123-배의 ADCC를 유도하였다. 단일특이적 OX40 항체(1166/1167)는 약 29-배를 유도하고, 단일특이적 CTLA-4 결합 도메인(62/376)은 약 10-배의 ADCC를 유도한 반면, 2개의 단일특이적 구성성분의 혼합물(1166/1167 + 62/376)은 약 31-배의 ADCC를 유도하였다.
따라서, OX40 및 CTLA-4에 결합하는 이중특이적 분자에 의해 수득된 예상외의 두드러진 상승작용이 존재한다.
실시예 13 - OX40 및 CTLA4를 표적화하는 이중특이적 항체 - OX40과 CTLA4 둘 모두를 발현하는 세포에의 특이적 결합
배경기술
이 연구의 목적은 OX40과 CTLA4 둘 모두를 발현하는 세포에의 1166/1261 및 상응하는 단일특이적 결합 엔터티의 결합 효능 및 EC50을 유세포분석을 사용하여 결정하는 것이었다.이중특이적 항체는 OX40과 CTLA4 둘 모두에 동시적으로 결합하도록 설계한다. 이 목적을 위해, 본 발명자들은 본 발명자들의 표적의 안정한 발현을 갖는 형질감염된 CHO 세포를 사용하였다. CHO P4 세포는 OX40과 CTLA4 둘 모두의 높은 발현 수준을 가진다.
방법 및 결과
OX40과 CTLA4 둘 모두를 발현하는 이중-형질감염된 CHO 세포를 원래 FACS(Beckton Dickinson)에 의해, 두 표적 모두를 높은 수준으로 발현하는 세포 풀(CHO P4로 지칭됨) 내로 소팅하였다. 세포를 게네티신(geneticine) 및 제오신(zeocine)의 선택적 압력 하에 배양함으로써, 표적 발현을 안정하게 유지시켰다. 형질감염되지 않은 CHO 야생형 세포를 대조군으로서 사용하였다.
세포를 저하하는 농도의 1166/1261(OX40 및 CTLA4를 표적화하는 예시적인 이중특이적 항체), 또는 2개의 단일특이적 결합제 1166/1167(OX40 특이적 모노클로날 항체) 및 CTLA-4 결합 부분을 갖는 대조군 IgG(단일특이적 CTLA4 결합 IgG 융합 단백질)(200 nM 내지 0.0034 nM), 뒤이어 PE-접합 항-인간 IgG로 염색하였다. 형광을 FACSverse 장비를 사용하여 검출하고, 획득을 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 중앙 형광 강도(MFI)를 각각의 염색에 대해 결정하였다.
CHO P4에 대한 결합 효능 곡선을 도 16(3개 중에서 1개의 대표적인 실험)에 제시한다. 1166/1261은 1166/1167 또는 CTLA-4 결합 엔터티를 갖는 대조군 IgG보다 양호한 OX40 및 CTLA4의 높은 발현을 갖는 세포에 결합한다. 이는 아마도, 2개의 표적에 동시적으로 결합할 수 있는 1166/1261의 첨가적인 효과이다.
실시예 14 - OX40 및 CTLA4를 표적화하는 이중특이적 항체 - 유세포분석에 의해 측정된 OX40 및 CTLA4를 발현하는 세포에의 이중 결합
목적
응집된 세포의 수를 유세포분석을 사용하여 측정함으로써, 세포 상에서 과발현된 OX40과 CTLA4 둘 모두에의 1166/1261의 동시적인 결합을 측정한다.
재료 및 방법
CHO-OX40 세포 및 HEK-CTLA4 세포를 형광 염료 PKH-67(녹색 형광 염료) 및 PKH-26(적색 형광 염료)(Sigma-Aldrich) 각각으로 세포내 염색시켰다. 균질하게 염색된 세포 집단을 입증한 후, 세포를 1166/1261(OX40 및 CTLA4를 표적화하는 예시적인 이중특이적 항체) 또는 2개의 모노클로날 항체 1166/1167의 조합(단일특이적 항-OX40 항체) 및 CTLA4-결합 도메인을 포함하는 대조군 IgG와 혼합하고 인큐베이션하였다. 염색한 후, 세포를 즉시 고정하고, 응집된 이중-양성 세포의 수를 FACS-verse(BD biosciences)를 사용하여 정량화하였다. 데이터 분석 및 비-선형 회귀를 Graph Pad Prism v6를 사용하여 수행하였다.
결과 및 결론
예시적인 이중특이적 항체 1166/1261은 증가하는 농도에서 응집된 세포의 수를 증가시킨다(도 17)(2개 중에서 1개의 대표적인 실험).
실시예 15 - OX40 및 CTLA4를 표적화하는 이중특이적 항체 - 마우스에서 약물동력학
재료 및 방법
항체
· 1166/1261(OX40 및 CTLA4를 표적화하는 예시적인 이중특이적 항체)
· 1166/1167(OX40을 표적화하는 단일특이적 대조군 항체)
생체내 연구
Taconic's Denmark사로부터의 암컷 C57BL/6(7 내지 8주령) 마우스를 실험에 사용하였다. 모든 실험을 Malmo/Lund 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
마우스에게 100 μg의 각각의 항체를 복강내 주사하고, 0h, 1h, 4h, 8h, 24h, 72h 및 1주 후에 혈액을 복재정맥을 통해 또는 종료 시 대정맥을 통해 헤파린처리된 튜브 내로 채혈하였다. 3마리의 마우스를 각각의 시점에 사용하였다. 혈액을 2500 rpm에서 30분 동안 회전시키고, 혈장을 추가 분석을 위해 -80℃까지 냉동시켰다.
혈장에서 1166/1261 및 1166/1167 수준의 결정을 위한 검정법
2개의 상이한 검정법을 사용하였다. 단일 표적 ELISA(ELISA1) 및 이중 ELISA(ELISA2). 간략하게는, 검정법은 하기 단계로 구성되었다. 백색 고 결합 편평 바닥, LIA 플레이트(Greiner Bio-One, Austria)를 0.8 μg/mL 인간 OX40-Fc(RnD Systems, 미국 미네소타주 소재)로 밤새 코팅시켰다. 세척 완충제(0.05% Tween 20이 보충된 포스타파제 완충 식염수(PBST), Medicago, 스웨덴 소재)로 세척한 후, 웰을 2% 소 혈청 알부민(BSA)(Merck, 독일 소재)과 함께 PBST를 사용하여 주위 실온(ART)에서 1시간 동안 흔들면서 블라킹시키고, 다시 세척한 후, 혈장 시료를 검정법 완충제(PBST + 0.5% BSA)에서 1:200 내지 1:5000으로 희석시키고, 이와 함께 보정 곡선 시료(1166/1261, 농도 6 내지 0.0012 μg/mL)를 첨가하였다. ART에서 1시간 동안 흔들면서 인큐베이션하고 후속해서 세척한 후, 1 μg/mL에서 단일 표적 ELISA용 인간 항-카파-항체 호스 래디쉬 퍼옥시다제 접합(HRP)(AbD Serotec, 영국 소재) 또는 비오틴화된 인간 CTLA-4-Fc(Orencia)로 구성된 2차 시약, 및 뒤이어 스트렙타비딘-HRP(Thermo Fisher Scientific, 미국 미네소타주 소재)를 이중 ELISA를 위한 제조업체의 설명서에 따라 첨가하였다. 신호를 HRP 기질 SuperSignal Pico Luminescence(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수득하였다. 암실에서 흔들면서 10분 인큐베이션한 후 발광 측정을 Flurostar Optima(MBG Labtech, 독일 소재)를 사용하여 수합하였다. 데이터를 GraphPad Prism 프로그램을 사용함으로써 분석하였다.
결과
1166/1261 및 1166/1167을 주사한 후 상이한 시점에서 수합한 시료를, 1166/1261 및 1166/1167 각각의 혈장 수준의 결정을 위해 단지 단일 표적 ELISA 또는 단일 표적 및 이중 ELISA를 이용하여 분석하였다. 그 결과는, 혈장 내 1166/1261 및 1166/1167의 수준은 복막 주사 후 처음 4시간 즈음에 증가하였고, 그 후에 감소하였음을 보여준다(도 18 상부 패널). 1166/1261 및 1166/1167 둘 모두의 검출 가능한 수준은 1시간 후에 혈장에 존재한다(도 18 중간 패널 및 하부 패널).
혈장 내 1166/1261의 수준은 모노클로날 항체 1166/1167에 대해 수득된 수준과 유사하고, 이는 1166/1261이 생체내에서 동등한 단일특이적 항-OX40 항체의 반감기와 비슷한 양호한 반감기를 보여줌을 가리킨다.
참조문헌
Hemerle T., Wulhfard S., Neri D., (2012) A critical evaluation of the tumour-targeting properties of bispecific antibodies based on quantitative biodistribution data. Protein Engineering and Design, 25, pp 851-854.
실시예 16 - OX40 및 CTLA4를 표적화하는 이중특이적 항체 - HT-29 결장암 모델에서 생체내 항종양 효과
요약
1166/1261(예시적인 OX40 및 CTLA4를 표적화하는 이중특이적 항체)의 항종양 효과를 hPBMC 인간화 면역결핍 마우스 및 HT-29 결장암종의 피하 종양 모델을 사용하여 조사하였다.
1166-1261은 통계학적으로 유의한 종양 부피 저해를 실증하였다.
재료 및 방법
Taconic's Denmark로부터의 암컷 SCID-Beige 마우스(6 내지 9주령)를 실험에 사용하였다. 모든 실험을 Malmo/Lund 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
HT-29 결장암 세포를 ATCC로부터 입수하고, ATCC 권고사항에 따라 배양하였다. 로그기(log phase)에서 성장중인 HT-29 세포주를 피하 주사하였다(제0일(D0)에 100 내지 200 μL 중 4x106 세포). 백혈구 농축물로부터 단리된 인간 PBMC(200 μL 중 7x106)를 동일한 일자에 복강내 주사하였다. 복강내 치료(667 pmol)를 제6일, 제13일 및 제20일에 수행하였다.
백혈구 농축물을 룬트 대학교 병원로부터 입수하였다.
종양을 폭, 길이 및 높이에서 캘리퍼를 이용하여 측정하고, 이것에서 종양 부피를 계산하였다(w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). 종양 부피가 2 cm3에 도달하기 전에, 상처 시, 또는 마우스의 병에 걸린 건강상태에서 동물을 안락사시켰다.
데이터를 GraphPad Prism 프로그램을 사용하여 만-휘트니 검정에 의해 분석하였다. 반응 공여체는 참조 항체 1874에 반응성인 공여체인 것으로 여겨졌다. 지수 종양 성장 기간 동안 최소 10% 평균 종양 저해는 반응으로서 여겨졌다.
결과
반응 공여체(2개의 별개의 실험으로부터의 4개의 공여체)가 이식된 마우스로부터의 풀링된 데이터는, 비히클 군(ZZ)과 비교하여 1166/1261 항체(p=0.0469 내지 p=0.0074, 만-휘트니 비모수(non-parametric), 2-측(tail))로 치료한 경우 제12일 내지 제16일에 종양 성장 저해의 형태에서 통계학적으로 유의한 항종양 효능을 실증하였다. 종양 부피 저해의 백분율은 제10일 내지 제21일에 1166/1261에서 22% 내지 36%의 범위였다(도 19 및 표 31.1 참조).
결론적으로, 1166/1261의 항종양 효과를 hPBMC 인간화 면역결핍 마우스 및 HT-29 결장암종의 피하 종양 모델을 사용하여 조사하였다. 1166/1261은 통계학적으로 유의한 종양 부피 저해를 실증하였다.
Figure pct00036
실시예 17 - Raji 림프종 모델에서 OX40 및 CTLA4를 표적화하는 이중특이적 항체 - 생체내 항종양 효과
요약
1166/1261(예시적인 OX40 및 CTLA4를 표적화하는 이중특이적 항체)의 항종양 효과를 hPBMC 인간화 면역결핍 마우스 및 Raji B-세포 림프종의 피하 종양 모델을 사용하여 조사하였다.
1166/1261은 통계학적으로 유의한 종양 부피 저해를 실증하였다.
재료 및 방법
Taconic's Denmark로부터의 암컷 SCID-Beige 마우스(6 내지 9주령)를 실험에 사용하였다. 모든 실험을 Malmo/Lund 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
Raji B-세포 림프종을 ATCC로부터 입수하고, ATCC 권고사항에 따라 배양하였다. 로그기에서 성장중인 Raji 세포주를 연막(buffy coat)으로부터 단리된 인간 PBMC(200 μL 중 10x106)와 함께 피하 주사하였다(10x106 세포). 복강내 치료(667 pmol)를 제0일, 제7일 및 제14일에 수행하였다.
연막을 Kalmar University Hospital로부터 입수하였다.
종양 크기를 폭, 길이 및 높이에서 캘리퍼를 이용하여 측정하고, 이것에서 종양 부피를 계산하였다(w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). 종양 부피가 2 cm3에 도달하기 전에, 상처 시, 또는 마우스의 병에 걸린 건강상태에서 동물을 안락사시켰다.
데이터를 GraphPad Prism 프로그램을 사용하여 만-휘트니 검정에 의해 분석하였다. 반응 공여체는 참조 항체 1874에 반응성인 공여체인 것으로 여겨졌다. 지수 종양 성장 기간 동안 최소 10% 평균 종양 저해는 반응으로서 여겨졌다.
결과 및 결론
반응 공여체와 함께 실험군으로부터의 풀링된 데이터는, 이중특이적 1166/1261 항체는 비히클과 비교하여 제14일 내지 제21일에 통계학적으로 유의한 항종양 효능을 실증하였다(p= 0.0068 및 p=0.0288, 만-휘트니, 2-측)(표 32.1).
Figure pct00037
실시예 18 - MC38 결장암 모델에서 생체내 항종양 효과
요약
OX40-CTLA-4 이중특이적 항체 1166/1261의 항종양 효과를 인간 OX40에 대한 유전자이식 마우스 및 MC38 결장암종의 피하 종양 모델을 사용하여 조사하였다.
1166/1261은 모노클로날 대응물과 비교하여 CD8/Treg 비에 대해 통계학적으로 유의한 효과를 실증하였다.
재료 및 방법
인간 OX40에 대한 암컷 유전자이식 마우스(동형접합성 인간 OX40 녹-인(knock-in) 마우스 모델, GenOway에 의해 개발됨)를 실험에 사용하였다. 모든 실험을 Malmo/Lund 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
MC38 결장암을 RPMI, 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청, 소듐 피루베이트, hepes 및 2-머캅토에탄올에서 배양하였다. 로그기에서 성장중인 MC38 세포주를 피하 주사하고(제0일(D0)에 100 μL 중 1x106 세포), 치료(1.33 mol)를 제10일, 제13일 및 제16일에 복강내로 수행하였다. 마지막 주사 후 24시간째에, 종양 및 비장을 수합하고, 생존력 마커, 계통(lineage) 마커 CD11b, C19, MHCII, NK1.1, CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, Ki-67에 대해 염색하고, 유세포분석을 사용하여 분석하였다.
결과
이중특이적 OX40-CTLA-4 항체의 약력학적 효과를 hOX40tg 마우스에서 MC38 결장암종 모델을 사용하여 조사하였다. 2개의 독립적인 실험으로부터의 풀링된 데이터는 2개 단일특이적 대응물 모두와 비교하여 이중특이적 항체를 이용한 경우 종양내 CD8/Treg 비에 통계학적으로 유의한 효과를 실증하였다(도 20). CD8/Treg 정량의 측면에서 비장에서 CD8/Treg 비 또는 Treg에서 Ki-67 발현 수준(Ki-67은 증식 마커임) 중 어디에서도 어떠한 변화도 나타날 수 없다. 이는, 1166/1261이 말초에서 T 세포에 영향을 주지 않으면서 2개의 단일특이적 대조군 항체에 의해 수득된 효과의 합계보다 큰, 종양에서 Treg에 유의한 효과를 유도함을 보여준다. 따라서, 이러한 효과는 종양 미세환경에 지향적이고, 이는 더 큰 치료 범위, 즉, 낮은 전신 독성과 함께 높은 항종양 효과를 제공할 수 있다. 상이한 T 세포 집단의 상대 수준을 도 21에 표시한다.
실시예 19 - MC38 결장암 모델에서 생체내 항종양 효과
요약
OX40-CTLA-4 이중특이적 항체 1166/1261의 항종양 효과를 인간 OX40에 대한 유전자이식 마우스 및 MC38 결장암종의 피하 종양 모델을 사용하여 조사하였다.
1166/1261은 통계학적으로 유의한 항종양 효능을 종양 부피 저해 형태로 실증하였다.
재료 및 방법
인간 OX40에 대한 암컷 유전자이식 마우스(동형접합성 인간 OX40 녹-인 마우스 모델, GenOway에 의해 개발됨)를 실험에 사용하였다. 모든 실험을 Malmo/Lund 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
MC38 결장암을 스탠포드 대학교로부터 입수하고, RPMI, 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청, 소듐 피루베이트, hepes 및 2-머캅토에탄올에서 배양하였다. 로그기에서 성장중인 MC38 세포주를 피하 주사하고(제0일(D0)에 100 μL 중 1x106 세포), 치료(1.33 mol)를 제7일, 제10일 및 제13일에 복강내로 수행하였다.
종양을 폭, 길이 및 높이에서 캘리퍼를 이용하여 측정하고, 이것에서 종양 부피를 계산하였다(w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). 종양 부피가 2 cm3에 도달하기 전에, 상처 시, 또는 마우스의 병에 걸린 건강상태에서 동물을 안락사시켰다.
데이터를 GraphPad Prism 및 Excel 프로그램을 사용하여 모노클로날 항체 및 비히클과 비교하여 종양 부피 저해 이중특이적 항체에 대해 분석하였다.
결과
3개의 독립적인 실험(n=26 내지 28)으로부터의 풀링된 데이터는 종양 부피 저해 및 생존에 미치는 통계학적으로 유의한 효과를 실증하였다.
결론적으로, 이중특이적 OX40-CTLA-4 항체의 항종양 효과를 인간 OX40에 대한 유전자이식 마우스에서 MC38 결장암종 모델을 사용하여 조사하였다. 이중특이적 항체는 종양 부피 저해 및 증가된 생존에 미치는 통계학적으로 유의한 효과를 실증하였다. 항종양 효과는 생존 및 종양 성장 저해의 측면에서 단일특이적 대조군 항체보다 강하였다(도 22).
실시예 20 - MB49 방광암 모델에서 생체내 항종양 효과
요약
OX40-CTLA-4 이중특이적 항체 1166/1261의 항종양 효과를 인간 OX40에 대한 유전자이식 마우스 및 MB49 방광암종의 피하 종양 모델을 사용하여 조사하였다.
1166/1261은 통계학적으로 유의한 항종양 효능을 종양 부피 저해 및 증가된 생존의 형태로 실증하였다.
재료 및 방법
인간 OX40에 대한 암컷 유전자이식 마우스(동형접합성 인간 OX40 녹-인 마우스 모델, GenOway에 의해 개발됨)를 실험에 사용하였다. 모든 실험을 Malmo/Lund 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
로그기에서 성장중인 MB49 세포주를 제0일에 피하 주사하고(0.25x106 세포), 치료(1.33 μmol)를 제7일, 제10일 및 제13일에 복강내로 수행하였다.
종양 부피를 폭, 길이 및 높이에서 캘리퍼를 이용하여 측정하고, 이것에서 종양 부피를 계산하였다((w/2) x (l/2) x (h/2) x pi x (4/3)). 종양 부피가 2 cm3에 도달하기 전에, 상처 시, 또는 마우스의 병에 걸린 건강상태에서 동물을 안락사시켰다. 통계학적 분석을, 만-휘트니, 비모수, 2-측 검정을 사용하여 종양 부피에 대해, 및 Graph Pad Prism을 사용하여 생존 카플란-마이어 로그-순위(Log-Rank)에 대해 수행하였다.
결과
이중특이적 OX40-CTLA-4 항체 1166/1261의 항종양 효과를 인간 OX40에 대한 유전자이식 마우스에서 MB49 방광암종 모델을 사용하여 조사하였다. 이중특이적 항체는 종양 부피 저해(도 23a, p=0.0003) 및 증가된 생존(도 23b p<0.0001)에 미치는 통계학적으로 유의한 효과를 실증하였다.
실시예 21 - 1166/1261에 의해 유도된 면역학적 기억
요약
면역조절제는 이들이 면역 기억을 유도하기 때문에 암에 대해 장기간 치유 반응을 유도하는 것으로 여겨진다. 이러한 면역 기억을 실증하기 위해, 1166/1261이 완전 종양 퇴화를 유도한 마우스에게 동일한 특이적인 종양, MB49 세포주, 또는 무관한 종양 세포주 PANC02를 재시도하였다.
재시도 실험은, 1166/1261이 MB49 방광암에 대해 종양 특이적 면역 기억을 발생시켰으나 무관한 종양 PANC02에 대해서는 그렇지 않았음을 실증하였다.
재료 및 방법
1166/1261이 MB49 방광암으로부터 완전 종양 퇴화를 유도한 genOway에 의해 발생된 인간 OX40(hOX40tg)에 대한 암컷 녹-인 마우스에게 단일 종양 모델에서 또는 트윈 종양 모델을 사용하여 무관한 종양 PANC02와 함께 특이적인 종양으로서 MB49를 재시도하였다. 네이브 마우스를 종양 성장 대조군으로서 사용하였다.
로그기에서 성장중인 MB49 및 PANC02에게 단일 종양 또는 트윈 종양으로서, 하나는 옆구리의 각각의 면에서 피하 주사(0.25x106 세포)하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 이용하여 1주에 3회 측정하였으며, 종양 부피를 식(¾x п x (폭/2) x (길이/2) x (높이/2)를 사용하여 계산하였다.
결과
면역 기억을, 1166/1261 치료 후 완전 종양 퇴화를 보여준 마우스에서 이들 마우스에게 특이적인 종양 MB49 또는 무관한 종양을 재시도함으로써 검사하였다. 완전 반응체는, 새로운 종양이 성장하는 데 실패하였으므로 특이적인 종양 MB49에 대해 면역 기억을 실증하였다(도 24a). 네이브 마우스를 종양 성장에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 나아가, 트윈 종양 모델에서 MB49 및 무관한 종양 PANC02로 재시도된 완전 반응체가 무관한 종양에서만 성장을 실증하고 이미 마주친 MB49 종양에서는 그렇지 않았기 때문에, 면역 기억은 종양 특이적인 것으로 실증되었다(도 24b). 이러한 데이터는, 1166/1261이 종양 특이적 면역 기억을 유도함을 실증한다.
실시예 22 - MB49 방광암 모델에서 종양내 CD8/Treg 비의 평가에 의한 생체내 항종양 효과
요약
종양 환경에서, Treg는 OX40 및 CTLA-4 둘 모두의 높은 발현을 갖는다. OX40-CTLA-4 이중특이적 항체는 이러한 종양 환경에서 Treg의 격감을 유도하는 것으로 예상된다. 종양내 Treg의 격감을 유도하는 1166/1261의 능력을 인간 OX40에 대한 유전자이식 마우스 및 MB49 방광암의 피하 종양 모델을 사용하여 조사하였다.
1166/1261은 모노클로날 대응물과 비교하여 Treg 격감, 효과기 세포의 활성화 및 증가된 CD8/Treg 비에 미치는 통계학적으로 유의한 효과를 실증하였다. 이러한 효과는 주로 종양 환경에 국소화되었으므로, 변경된 CD8/Treg 비의 형태의 어떠한 유의한 효과도 비장에서는 관찰되지 않았다.
재료 및 방법
프랑스 소재의 genOway에 의해 개발된 7 내지 14주령의 인간 OX40(hOX40tg)에 대한 암컷 동형접합체를 실험에 사용하였다. 모든 실험을 Malmo/Lund 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
로그기에서 성장중인 MB49 방광암을 제0일에 피하 주사하고(0.25x106 세포), 치료(1.33 μmol)를 제10일, 제13일 및 제16일에 복강내로 수행하였다. 마지막 주사 후 24시간째에, 종양 및 비장을 수합하고, CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, 뿐만 아니라 계통 마커(CD19, NK1.1, MHCII)에 대해 염색하고, 유세포분석을 사용하여 분석하였다. 통계학적 분석을, 다르게 언급되지 않는 한, Graph Pad Prism을 사용하여 만-휘트니, 비모수, 2-측 검정을 사용하여 수행하였다.
결과
이중특이적 OX40-CTLA-4 항체의 약력학적 효과를 hOX40tg 마우스에서 MB49 방광암종 모델을 사용하여 조사하였다. 실험은, 1166/1261이 종양내 Treg 함량(p= 0.0087, 2-측)(도 25a), 종양 내 CD8 수(p=0.047, 1-측)(도 25b) 및 CD8/Treg 비(p=0.0043 2-측)(도 25c)에 미치는 통계학적으로 유의한 효과를 유도하였음을 실증하였다. 비장에서는 CD8/Treg 비에서의 어떠한 변화도 관찰될 수 없으며, 이는 1166/1261의 종양 국소화를 가리킨다(도 25d).
실시예 23 - MC38 결장암종 모델에서 효과기 세포 활성화의 평가에 의한 생체내 항종양 효과
요약
조절 T 세포 격감 외에도, OX40-CTLA-4 이중특이적 항체 작용 방식의 일부는 효과기 T 세포의 활성화인 것으로 여겨진다. OX40-CTLA-4 이중특이적 항체 1166/1261의 이들 항종양 효과를 인간 OX40에 대한 유전자이식 마우스 및 MC38 결장암종의 피하 종양 모델을 사용하여 조사하였다.
1166/1261은 종양 미세환경에서 효과기 CD8 활성화에 미치는 통계학적으로 유의한 효과를 증가된 그랜자임 B 및 CD107a 발현의 형태로 실증하였다.
재료 및 방법
인간 OX40에 대한 암컷 유전자이식 마우스(동형접합성 인간 OX40 녹-인 마우스 모델, GenOway에 의해 개발됨)를 실험에 사용하였다. 모든 실험을 Malmo/Lund 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
로그기에서 성장중인 MC38 결장암을 제0일에 피하 주사하고(1x106 세포), 치료(1.33 μmol)를 제10일, 제13일 및 제16일에 복강내로 수행하였다. 마지막 주사 후 24시간째에, 종양 및 비장을 수합하고, 생존력 마커, 계통 마커(CD11b, C19, MHCII, NK1.1), CD45, CD3, CD4, CD8, 그랜자임 B 및 CD107a에 대해 염색하고, 유세포분석을 사용하여 분석하였다. 데이터를 만-휘트니, 비모수, 2-측 검정을 사용하여 분석하였다.
결과
이중특이적 OX40-CTLA-4 항체의 약력학적 효과를 hOX40tg 마우스에서 MC38 결장암종을 사용하여 조사하였다. 실험은, 1166/1261이 종양 영역에서 효과기 CD8 세포의 통계학적으로 유의한 활성화를 CD107a(도 26a, p=0.0079) 및 그랜자임 B(도 26b, p=0.0159)의 유도의 형태로 유도하였음을 실증하였다.
실시예 24 - 종양에 국소화된 예시적인 이중특이적 항체 '1166/1261'
요약
OX40 및 CTLA-4는 종양 환경에서 T 세포, 특히 Treg 상에서 고도로 발현된다. 따라서, OX40-CTLA-4 이중특이적 항체는 이중 표적화로 인해 종양 국소화를 유도하는 것으로 예상된다. 종양으로 국소화하는 1166/1261의 능력을 인간 OX40에 대한 유전자이식 마우스 및 MC38 결장암종의 피하 종양 모델을 사용하여 조사하였다. 1166/1261은 비히클 또는 이소형 대조군으로 치료된 동물과 비교하여 통계학적으로 유의한 종양 국소화를 실증하였다. 비장에서는 어떠한 국소화도 관찰되지 않았다.
재료 및 방법
인간 OX40에 대한 암컷 유전자이식 마우스(동형접합성 인간 OX40 녹-인 마우스 모델, GenOway에 의해 개발됨)를 실험에 사용하였다. 모든 실험을 Malmo/Lund 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
로그기에서 성장중인 MC38 결장암을 제0일에 피하 주사하였다(1x106 세포). 마우스에게 제17일에 하나의 치료(1.33 μmol Ab 복강내)를 제공하였다. 마지막 주사 후 24시간째에, 종양 및 비장을 수합하고, 생존력 마커, APCeFluor780-표지 항-CD45 및 PE-표지 항-hIgG에 대해 염색하고, 유세포분석에 의해 분석하였다. 살아 있는 CD45+ 세포 중 hIgG+ 세포의 백분율을 상이한 그룹 사이에서 비교하였다. 데이터를 만-휘트니, 비모수, 2-측 검정을 사용하여 분석하였다.
결과 및 결론
종양 국소화를 유도하는 1166/1261의 능력을 hOX40tg 마우스에서 MC38 결장암을 사용하여 조사하였다. 실험은, 이소형 대조군이 아닌 1166/1261이 치료 후 종양에서 검출되었음을 실증하였다(도 27a). 1166/1261은 비장에서 검출될 수 없었으며(도 27b), 이는 종양으로의 국소화를 제안한다.
실시예 25 - MC38 결장암종 모델에서 PD-1의 조합 효과
요약
PD-1 모노클로날 항체 및 다른 면역-체크포인트 저해제를 이용한 성공적인 임상 시도는 암 요법에서 새로운 길을 열어 주었다. 그러나, 대규모 하위집단(subset)의 암 환자는 여전히 반응하는 데 실패하며, 이는 병용 요법에 대한 강화된 연구를 촉진한다. OX40-CTLA-4 이중특이적 항체를 PD-1 조합에서 인간 OX40에 대한 유전자이식 마우스를 사용하고 MC38 결장암종 모델을 사용하여 조사하였다.
1166/1261 단독은 통계학적으로 유의한 항종양 효과를 종양 부피 저해 및 증가된 생존의 형태로 실증하였다. 또한, 1166/1261은 PD-1 치료의 항종양 효과를 유의하게 증강시킬 수 있었다. 이들 데이터는 환자에서 1166/1261을 PD-1 항체와 조합하는 것의 잠재적인 이익을 보여준다.
재료 및 방법
프랑스 소재의 genOway에 의해 개발되고 사내(in-house) 사육된 7 내지 14주령의 인간 OX40(hOX40tg)에 대한 암컷 동형접합체를 실험에 사용하였다. 모든 실험을 Malmo/Lund 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
로그기에서 성장중인 MC38 결장암종을 제0일에 피하 주사하고(1x106 세포), 1166/1261(1.33 μmol) 그리고/또는 항-마우스 PD-1(250 μg, RPM1-14, BioXcell, US) 항체의 치료를 제7일, 제10일 및 제13일에 복강내로 수행하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 이용하여 1주에 3회 측정하였으며, 종양 부피를 식(¾x п x (폭/2) x (길이/2) x (높이/2)를 사용하여 계산하였다. 마우스를 윤리적 종양 한계에서 안락사시켰다. 종양 부피를 만-휘트니, 비모수, 2-측 검정을 사용하여 분석하고, 생존 카플란-마이어, 로그-순위를 Graph Pad Prism을 사용하여 분석하였다.
결과
이중특이적 OX40-CTLA-4 항체 및 항 PD-1의 조합 항종양 효과를 hOX40tg 마우스에서 MC38 결장암종 모델을 사용하여 조사하였다. 실험은 1166/1261에 의해 유도된 항종양 효과를 종양 부피 저해 및 증가된 생존 둘 모두의 형태로 실증하였다(p=0.0124(도 28a 및 b)). 1166/1261과 PD-1 치료의 조합은 항종양 효과를 유의하게 증가시켰다(p<0.0001). 이들 데이터는, 1166/1261이 임상에서 PD-1 항체로 수득된 항종양 효과를 증강시킬 수 있음을 실증하였다.
실시예 26 - CT26 결장암종 모델에서 PD-1의 조합 효과
요약
PD-1 모노클로날 항체 및 다른 면역-체크포인트 저해제를 이용한 성공적인 임상 시도는 암 요법에서 새로운 길을 열어 주었다. 그러나, 대규모 하위집단의 암 환자는 여전히 반응하는 데 실패하며, 이는 병용 요법에 대한 강화된 연구를 촉진한다. OX40-CTLA 이중특이적 항체를 PD-1 조합에서 인간 OX40에 대한 유전자이식 마우스를 사용하고 CT26 결장암종 모델을 사용하여 조사하였다.
1166/1261 단독은 통계학적으로 유의한 항종양 효과를 종양 부피 저해 및 증가된 생존의 형태로 실증하였다. 또한, 1166/1261은 PD-1 치료의 항종양 효과를 유의하게 증강시킬 수 있었다.이들 데이터는, 1166/1261이 임상에서 PD-1 항체로 수득된 항종양 효과를 증강시킬 수 있음을 실증하였다.
재료 및 방법
프랑스 소재의 genOway에 의해 개발되고 사내(in-house) 사육된 7 내지 14주령의 인간 OX40(hOX40tg)에 대한 암컷 동형접합체를 실험에 사용하였다. 모든 실험을 Malmo/Lund 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
로그기에서 성장중인 CT26 결장암종을 제0일에 피하 주사하고(1x106 세포), 1166/1261(1.33 μmol) 그리고/또는 항-마우스 PD-1(250 μg, RPM1-14, BioXcell, US) 항체의 치료를 제7일, 제10일 및 제13일에 복강내로 수행하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 이용하여 1주에 3회 측정하였으며, 종양 부피를 식(¾x п x (폭/2) x (길이/2) x (높이/2)를 사용하여 계산하였다. 종양 부피를 만-휘트니, 비모수, 2-측 검정을 사용하여 분석하고, 생존 카플란-마이어, 로그-순위를 Graph Pad Prism을 사용하여 분석하였다.
결과
이중특이적 OX40-CTLA-4 항체 및 항 PD-1의 조합 항종양 효과를 hOX40tg 마우스에서 CT26 결장암종 모델을 사용하여 조사하였다. 실험은 1166/1261에 의한 통계학적으로 유의한 효과를 종양 부피 저해 및 증가된 생존 둘 모두로서 실증한 반면, PD-1 항체 단독을 임의의 강력한 항종양 효능을 실증하지 않았다(도 29a 및 b). PD-1 치료에 1166/1261의 부가는 PD-1 항체의 항종양 효능을 유의하게 증가시켰다. 이들 데이터는, 1166/1261이 임상에서 PD-1 항체로 수득된 항종양 효과를 증강시킬 수 있음을 실증하였다.
실시예 27 - PANC02 췌장암에 대한 1166/1261의 항종양 효능
요약
췌장 선암종은 공격적인 유형의 암이다. 췌장암 환자는 전형적으로 매우 불량한 예후를 갖고, 상기 암 유형은 미국에서 암으로 인한 사망의 네번째로 가장 보편적인 원인이다. 1166/1261의 항종양 효과를 hOX40에 대한 유전자이식 마우스를 사용하여 PANC02 췌장암에 대해 검사하였다.
1166/1261은 통계학적으로 유의한 항종양 효능을 종양 부피 저해 및 증가된 생존의 형태로 실증하였다.
재료 및 방법
genOway에 의해 개발된 인간 OX40(hOX40tg)에 대한 암컷 녹-인 마우스를 실험에 사용하였다. 모든 실험은 Malmo/Lund 윤리 위원회가 승인하였다.
로그기에서 성장중인 PANC02 췌장암을 제0일에 피하 주사하고(0.25x106 세포), 1166/1261(1.33 μmol)을 이용한 치료를 제7일, 제10일 및 제13일에 복강내로 수행하였다. 종양 부피를 만-휘트니, 비모수, 2-측 검정을 사용하여 분석하고, 생존 카플란-마이어 로그-순위를 Graph Pad Prism을 사용하여 분석하였다.
결과
췌장암에 대한 1166/1261의 항종양 효능을 hOX40 유전자이식 마우스 및 PANC02 췌장암을 사용하여 검사하였다. 1166/1261은 유의한 항종양 효능을 종양 성장 저해(도 30a) 및 증가된 생존(도 30b)의 형태로 실증하였다.
실시예 28 - 1166/1261은 CTLA-4 차단을 통해 T 세포 활성화를 복구시킨다
요약
CTLA-4를 차단하고 T 세포의 공동-자극 및 활성화를 증가시키는 1166/1261의 능력을 CTLA-4 차단 리포터 검정법에서 조사하였다. 1166/1261은 CTLA-4에의 CD80/CD86 결합을 차단하고 CD28을 통한 공동-자극을 복구시켜, T 세포 활성화를 초래할 수 있었다.
재료 및 방법
검정법은 TCR 활성자 및 CD80/CD86을 발현하는 Raji 세포를 사용하여, luc2P 요소와 함께 IL2 프로모터와 연결된 TCR, CTLA-4 및 CD28을 발현하는 Jurkat 리포터 T 세포를 공동-자극시켰다. 활성화를 발광으로서 측정한다. CTLA-4 항체의 부재 하에, CD80/CD86은 CD28보다 높은 친화성으로 CTLA-4에 결합하여, 신호를 차단한다. CTLA-4-결합 항체를 첨가함으로써, CTLA-4에의 CD80/CD86 결합은 차단될 것이고, 그 결과 CD28을 통한 T 세포의 공동-자극이 증가되어 T 세포 활성화를 초래할 것이다.
단계 희석된 1166/1261 및 이소형 대조군을 플레이트에 고정시키고, 밤새 인큐베이션한 다음, 뒤이어 Jurkat 리포터 세포 및 Raji 세포를 첨가하였다. 밤새 인큐베이션한 후, T 세포 활성화를 발광으로서 측정하였다.
결과 및 결론
도 31에 제시된 바와 같은, 1166/1261은 T 세포 활성화를 복구시킬 수 있는 반면, 이소형 대조군에서는 어떠한 효과도 관찰되지 않는다.
실시예 29 - CTLA-4 가교 시 1166/1261에 의한 T 세포 활성화
요약
T 세포를 활성화시키는 1166/1261의 능력을 CTLA-4 가교 시 일련의 효능 검정법에서 조사하였다. 1166/1261은 효능 T 세포 활성화를 IFN-γ, IL-2의 분비, 또는 증가된 T 세포 증식의 형태로 실증하였다.
재료 및 방법
인간 CD3+ 또는 CD4+ T 세포를, 룬트 대학교 병원의 혈액 은행으로부터 백혈구 필터로부터 수득된 PBMC로부터 음성 선택(Pan T 세포 단리 키트 또는 CD4+ T 세포 단리 키트, Miltenyi)을 사용하여 정제하고, 단계 희석된 1166/1261, 단일특이적 항체 1166/1167+ IsoCtr/1261의 혼합물 또는 이소형 대조군과 함께 배양하였다.
CTLA-4(Orencia, 5 μg/ml) 및 αCD3(OKT3, 3 μg/ml)로 예비-코팅된 플레이트에서 T 세포(100,000 세포/웰)를 시험 항체와 함께 배양한 후, CD3+ T-세포에 의한 IFN-γ 방출을 측정하였다. 72시간의 인큐베이션 기간 후, IFN-γ의 수준을 상층액에서 ELISA에 의해 측정하였다.
CTLA-4(800,000 수용체/세포)를 안정하게 발현하는 방사선 조사된 HEK 세포(30,000 세포/웰) 및 αCD3 비드(UCHT-1, 세포:비드 비 1:1.1)를 함유하는 플레이트에서 T 세포(50,000 세포/웰)를 시험 항체와 함께 배양함으로써, CD4+ T 세포에 의한 IL-2 방출을 측정하였다. 72시간 후, IL-2의 수준을 상층액에서 ELISA에 의해 측정하였다.
CTLA-4(Orencia, 5 μg/ml) 및 αCD3(UCHT-1, 0.1 μg/ml)로 예비-코팅된 플레이트에서 CD4+ T 세포(50,000 세포/웰)를 시험 항체와 함께 배양함으로써, 증식을 결정하였다. 72시간 후, 증식을 CellTitre Glow(Promega)를 이용하여 측정하였다.
결과 및 결론
1166/1261의 효능 활성을 차별적인 T 세포 활성화에서 조사하였다. 도 32에서의 결과는 IFN-γ 및 IL-2 방출뿐만 아니라 증식의 측면에서 1166/1261의 용량-의존적 효과를 실증하는 한편, 이러한 효과는 단일특이적 OX40과 CTLA-4 항체의 조합에서는 관찰되지 않는다. 이러한 결과는, 1166/1261이 CTLA-4 가교 시 강한 효능 효과를 가짐을 가리킨다.
실시예 30 - FcγR 가교 시 1166/1261에 의해 유도된 T 세포 활성화
요약
T 세포를 활성화시키는 1166/1261의 능력을 FcγR 가교 시 효능 검정법에서 조사하였다. 1166/1261은 효능 T 세포 활성화를 IL-2 분비의 형태로 실증하였다.
재료 및 방법
CD64(FcγRI)를 발현하도록 안정하게 형질감염된 CHO 세포를 방사선조사하고, 평판배양하고(100,000 세포/웰), 밤새 부착되도록 놔두었다. 단계 희석된 1166/1261, 단일특이적 항체의 조합(1166/1167 + Ctr IgG/1261) 또는 이소형 대조군을 웰에 첨가하였다. αCD3(OKT3)로 코팅된 비드를 차선 T 세포 활성화를 위해 첨가하였다. 인간 CD4+ T 세포를, 룬트 대학교 병원의 혈액 은행으로부터 백혈구 필터로부터 수득된 PBMC로부터 음성 선택(CD4+ T 세포 단리 키트, Miltenyi)을 사용하여 정제하고, 웰(50,000 세포/웰)에 첨가하였다. 72시간의 인큐베이션 기간 후, IL-2 분비를 ELISA에 의해 측정하였다. 전체적으로, 8명의 공여자를 검정법에서 시험하였다.
결과 및 결론
도 33에 제시된 바와 같은, 1166/1261의 용량-의존적 활성화가 실증되는 한편, 이러한 활성화는 단일특이적 OX40과 CTLA-4 항체의 조합에서는 관찰되지 않는다. 이러한 결과는, 1166/1261이 FcγR 가교 시 강한 효능 효과를 가짐을 가리킨다.
실시예 31 - 1차 Treg를 격감시키는 1166/1261의 능력
요약
종양 환경에서, 조절 T 세포는 OX40과 CTLA-4 둘 모두의 높은 발현을 갖는다. OX40-CTLA-4 이중특이적 항체는 특히 종양 환경에서 표적-발현 세포의 ADCC를 유도하는 것으로 예상된다. ADCC를 유도하는 1166/1261의 능력을, ADCC에 대한 대리물(surrogate)로서 인간 FcγRIII(V158)에 특이적인 ADCC 리포터 검정법을 사용하여 검사하였다. 1166/1261은 효과기 세포의 유의한 활성화를 실증하였으며, 이러한 유도는 활성 면에서 모노클로날 대응물 단독(데이터는 제시되지 않음) 또는 조합과 비교하여 우수하였다.
재료 및 방법
FcγRIIIa(V158) ADCC 리포터 검정법(Promega)을 사용하여, ADCC 유도를 결정하였다. CD4+CD25+CD127low Treg를 EasySep™ 인간 CD4+CD127lowCD25+ 조절 T 세포 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 음성 선택에 의해 단리하였다. Treg를 αCD3/αCD28 Dynabeads(Gibco)의 존재 하에 48시간 동안 활성화시켜 표적 발현을 상향조절하고, 표적 세포로서 사용하였다. 단계 희석된 1166/1261, 단일특이적 항체의 조합(1166/1167 + Ctr IgG/1261) 또는 이소형 대조군을 효과기 및 표적 세포(5:1 비)와 함께 6시간 동안 배양하였다. OX40 및 CTLA-4의 발현을 배양 전 및 후에 유세포분석에 의해 결정하였다.
결과 및 결론
시험관내에서 조절 T 세포의 격감을 유도하는 1166/1261의 능력을 ADCC 리포터 검정법에 의해 평가하였다. 도 34a에 제시된 바와 같은, 1166/1261은 1차 인간 Treg에서 ADCC를 유도하는 능력을 가진다. 이러한 유도는 모노클로날 대응물 단독(데이터는 제시되지 않음) 또는 이들의 혼합물보다 두드러지게 더 높았다. 이러한 결과는 OX40 및 CTLA-4의 발현 수준과 상관관계가 있었다. 신선한 또는 비자극된 Treg는 낮은 수준의 OX40 및 CTLA-4를 발현한 반면, 이러한 수준은 αCD3/αCD28을 이용한 활성화 후 명확하게 상향 조절되었다(도 34b).
실시예 32 - 1차 Treg를 격감시키는 1166/1261의 능력
요약
종양 환경에서, 조절 T 세포는 OX40과 CTLA-4 둘 모두의 높은 발현을 갖는다. OX40-CTLA-4 이중특이적 항체는 특히 종양 환경에서 표적-발현 세포의 ADCC를 유도하는 것으로 예상된다. ADCC를 유도하는 1166/1261의 능력을, ADCC에 대한 동종이계 NK 세포를 효과기 세포로서 이용하는 LDH 방출 검정법을 사용하여 검사하였다. 1166/1261은 Treg의 강한 NK 세포-매개 용해를 유도하였다.
재료 및 방법
CD4+CD25+CD127low Treg를 EasySep™ 인간 CD4+CD127lowCD25+ 조절 T 세포 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 음성 선택에 의해 단리하였다. Treg를 αCD3/αCD28 Dynabeads(Gibco)의 존재 하에 48시간 동안 활성화시켜 표적 발현을 상향조절하고, 그 이후 표적 세포로서 사용하였다. 효과기 세포로서, EasySep™ 인간 NK 세포 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용한 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 단리된 동종이계 NK 세포를 사용하였다. 효과기 및 표적 세포를 단계 희석된 1166/1261 또는 이소형 대조군과 함께 15:1의 비로 4시간 동안 배양하였다. 이후, 상층액 내 LDH의 수준을 측정하였다.
결과 및 결론
도 35에 제시된 바와 같은, 1166/1261은 1차 인간 Treg에서 ADCC를 유도하는 능력을 용량-의존적 방식으로 가진다. 이소형 대조군에서는 어떠한 효과도 관찰되지 않았다.
실시예 33 - 파일럿 게먹이원숭이 톡스(tox) 연구에서 1166/1621의 평가
요약
단일 용량, 용량-범위 확인 연구를 게먹이 원숭이에서 수행하였다. 단일 용량의 1166/1261 후, 초기(CD25+) 및 후기(CD69+) T 세포 및 증식성 중심 기억(CD197+CD45RA-Ki67+)의 수는 증가하는 것으로 확인되었다.
재료 및 방법
단일 용량, 용량-범위 확인 연구를 게먹이 원숭이에서 수행하였다. 용량 그룹은 1 마리의 수컷 및 1 마리의 암컷으로 구성되었다. 모든 동물은 2.5년령을 초과하였다. 용량 그룹 1 내지 3은 3; 10; 또는 30 mg/kg의 1166/1261을 각각 정맥내 주입으로서 1시간에 걸쳐 받았다. 용량 그룹 4는 30 mg/kg의 피하 주사를 받았다.
전혈 시료를 투약-전(2개 경우), 및 제2일, 제8일, 제15일, 제29일 및 제43일에 투약-후에 말초 혈액 면역표현형분석을 위해 채혈하였다. Truecount 튜브(BD Biosciences)를 계수(enumeration)에 사용하고, 염색용 항체를 BD Biosciences 또는 Biolegend로부터 구입하였다. 각각의 개체에 대해 2개의 투약-전 시료의 평균에 대한 투약-후 시료의 배수-차이를 계산함으로써 세포 집단에서의 차이를 비교하였다.
결과 및 결론
단일 용량의 1166/1261을 받은 게먹이 원숭이는 초기(CD69+) 및 후기 (CD25+) T 세포의 수(도 36b)에 미치는 효과를 실증하였고, 증식성 중심 기억(CD197+CD45RA-Ki67+) T 세포(도 36a)는 증가하는 것으로 확인되었다. 4개의 용량 그룹 사이에서 어떠한 구별 가능한 차이도 관찰되지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> Alligator Bioscience AB <120> NOVEL POLYPEPTIDES <130> ALLBA/P65905PC <140> EPPCT/EP2018/061084 <141> 2018-05-01 <150> GB - 1805873.5 <151> 2018-04-09 <150> GB - 1717958.1 <151> 2017-10-31 <150> GB - 1706915.4 <151> 2017-05-02 <160> 161 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human CTLA-4 <400> 1 Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile 1 5 10 15 Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val 20 25 30 Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys 35 40 45 Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser 50 55 60 Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln 65 70 75 80 Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu 85 90 95 Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile 100 105 110 Tyr Val Ile Ala Lys Glu Lys Lys Pro Ser Tyr Asn Arg Gly Leu Cys 115 120 125 Glu Asn Ala Pro Asn Arg Ala Arg Met 130 135 <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human CD28 <400> 2 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 165 170 175 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 180 185 190 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 195 200 205 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 210 215 220 <210> 3 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Monomeric extracellular domain of human wildtype CD86 <400> 3 Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro 1 5 10 15 Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val 20 25 30 Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly 35 40 45 Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser 50 55 60 Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys 65 70 75 80 Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly 85 90 95 Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala 100 105 110 <210> 4 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Monomeric extracellular and transmembrane domains of human wildtype CD86 <400> 4 Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe 20 25 30 Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln 35 40 45 Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val 50 55 60 Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg 85 90 95 Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile 100 105 110 His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser 115 120 125 Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile 130 135 140 Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile 145 150 155 160 His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys 165 170 175 Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn 180 185 190 Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro 195 200 205 Asp Val Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys 210 215 220 Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln 225 230 235 240 Pro Pro Pro Asp His Ile Pro 245 <210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant form of the extracellular domain of human CD86 <400> 5 Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro 1 5 10 15 Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val 20 25 30 Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly 35 40 45 Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val Ala Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser 50 55 60 Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys 65 70 75 80 Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly 85 90 95 Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala 100 105 110 <210> 6 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 variant 900 <400> 6 Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln 1 5 10 15 Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu 35 40 45 Lys Phe Asp Ser Val Asp Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp 50 55 60 Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys 65 70 75 80 Gly Ile Tyr Gln Cys Val Ile His His Lys Lys Pro Ser Gly Leu Val 85 90 95 Lys Ile His Glu Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala 100 105 <210> 7 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 variant 901 <400> 7 Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln 1 5 10 15 Phe Ala Asn Ser Gln Asn Leu Thr Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu 35 40 45 Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp 50 55 60 Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys 65 70 75 80 Gly Ile Tyr Gln Cys Val Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile 85 90 95 Lys Ile His Glu Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Thr 100 105 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 variant 904 <400> 8 Leu Lys Ile Gln Ala Tyr 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Val 85 90 95 Lys Ile His Glu Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala 100 105 <210> 10 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 variant 907 <400> 10 Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln 1 5 10 15 Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu 35 40 45 Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp 50 55 60 Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys 65 70 75 80 Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile 85 90 95 Lys Ile His Glu Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala 100 105 <210> 11 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 variant 908 <400> 11 Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln 1 5 10 15 Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu 35 40 45 Lys Phe Asp Ser Val 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Ser Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser 50 55 60 Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys 65 70 75 80 Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Ser Gly 85 90 95 Met Val Lys Ile His Gln Met Asp Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala 100 105 110 <210> 17 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 variant 1040 <400> 17 Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro 1 5 10 15 Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Leu Ser Leu Ser Glu Leu Val Val 20 25 30 Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly 35 40 45 Lys Glu Arg Phe Asp Ser Val Asp Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser 50 55 60 Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys 65 70 75 80 Asp Lys Gly Arg Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly 85 90 95 Met Ile Asn Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala 100 105 110 <210> 18 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 variant 1041 <400> 18 Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr 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Gly 35 40 45 Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser 50 55 60 Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys 65 70 75 80 Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly 85 90 95 Met Ile Lys Ile His Glu Met Ser Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala 100 105 110 <210> 22 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 variant 1045 <400> 22 Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro 1 5 10 15 Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Leu Thr Leu Ser Glu Leu Val Val 20 25 30 Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly 35 40 45 Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val Asp Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser 50 55 60 Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys 65 70 75 80 Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly 85 90 95 Leu Val Lys Ile His Glu Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala 100 105 110 <210> 23 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 variant 1046 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caggggacca agctggagat caaa 324 <210> 95 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1170, heavy chain VH <400> 95 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Pro Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Tyr Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 96 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1170, heavy chain VH <400> 96 gaggtgcagc tgttggagag cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgcctc 60 tcctgtgcag ccagcggatt cacctttggt ggttactaca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatac attcctggtt ctggtggttc tacatactat 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtat attattgtgc gcgctacgac 300 tactactgga tggactattg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 97 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1135, light chain VL <400> 97 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 98 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1135, light chain VL <400> 98 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca 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aacagcacgt 1260 accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca 1320 agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca 1380 aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct 1440 gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag 1500 gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1560 ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1620 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1680 agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1740 atgcatgagg ctctgcacaa ccgctacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1800 tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt 1860 ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac 1920 tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc 1980 ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg 2028 <210> 142 <211> 981 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> cDNA sequence 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cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1440 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1500 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1560 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1596 <210> 147 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Light chain kappa region of SEQ ID NO: 136 <400> 147 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 <210> 148 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA sequence encoding the IgG4 region of SEQ ID NO: 139 <400> 148 gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag 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cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1620 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1680 agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1740 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1800 tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt 1860 ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac 1920 tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc 1980 ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg 2028 <210> 150 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker (SG)m where m=2 <400> 150 Ser Gly Ser Gly 1 <210> 151 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker (SG)m where m=3 <400> 151 Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 152 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker (SG)m where m=4 <400> 152 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker (SG)m where m=5 <400> 153 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 154 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker (SG)m where m=6 <400> 154 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 155 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker (SG)m where m=7 <400> 155 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 156 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR1 consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Gly or Tyr or Ser <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Gly or Tyr or Ser <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Tyr or Ser <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Tyr or Ser or Ala <400> 156 Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 157 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR2 consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Gly or Tyr or Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Gly or Ser or Tyr <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Ser or Tyr <220> <221> 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Asn <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Tyr or Ser or Trp or Ala or Thr <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Leu or Met or Ile or Phe <400> 158 Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 159 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR3 consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Ser or Tyr or Gly <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> No amino acid or Tyr or His or Gly <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> No amino acid or Ser or Tyr or Gly or Asp or Trp <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Ser or Tyr or Gly or Asp <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Ser or Tyr or Gly or Thr <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Pro or Leu <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Tyr or Ser or His or Leu or Phe <400> 159 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 1 5 10 <210> 160 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 first sub-family consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Tyr or His <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Ala or Tyr or Gly <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Ser or Trp or Ala <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Met or Leu <400> 160 Ala Arg Xaa Asp Tyr Xaa Xaa Xaa Asp Tyr 1 5 10 <210> 161 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 second sub-family consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Gly or Tyr <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Val or Phe or Tyr <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Gly or Tyr or His <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Phe or Ile <400> 161 Ala Arg Xaa Xaa Pro His Xaa Tyr Xaa Asp Tyr 1 5 10

Claims (46)

  1. 이중특이적 폴리펩타이드로서,
    OX40에 특이적으로 결합할 수 있는, B1로 지칭되는 제1 결합 도메인, 및 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있는, B2로 지칭되는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 그리고/또는 제2 결합 도메인이 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항원-결합 단편이 Fv 단편(예컨대, 단쇄 Fv 단편, 또는 이황화-결합 Fv 단편), Fab-유사 단편(예컨대, Fab 단편; Fab' 단편 또는 F(ab)2 단편) 및 도메인 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 이중특이적 항체인, 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서,
    (a) 결합 도메인 B1 그리고/또는 결합 도메인 B2가 온전한 IgG 항체이며;
    (b) 결합 도메인 B1 그리고/또는 결합 도메인 B2가 Fv 단편이며;
    (c) 결합 도메인 B1 그리고/또는 결합 도메인 B2가 Fab 단편이며; 그리고/또는
    (d) 결합 도메인 B1 그리고/또는 결합 도메인 B2가 단일 도메인 항체인, 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 폴리펩타이드가

    (a) 2가 이중특이적 항체, 예컨대, IgG-scFv 이중특이적 항체(예를 들어, 여기서, B1은 온전한 IgG이고, B2는 IgG의 경쇄의 N-말단 그리고/또는 경쇄의 C-말단 그리고/또는 중쇄의 N-말단 그리고/또는 중쇄의 C-말단에서 B1에 부착된 scFv이거나, 또는 그 반대임);
    (b) 1가 이중특이적 항체, 예컨대, DuoBody® 또는 '놉-인-홀(knob-in-hole)' 이중특이적 항체(예를 들어, scFv-KIH, scFv-KIHr, BiTE-KIH 또는 BiTE-KIHr);
    (c) scFv2-Fc 이중특이적 항체(예를 들어, ADAPTIR™ 이중특이적 항체);
    (d) BiTE/scFv2 이중특이적 항체;
    (e) 2가성(bivalency) 또는 이용되는 링커/연결기와 상관 없이 DVD-Ig 이중특이적 항체 또는 다른 IgG-FAb, FAb-IgG 이중특이적 항체;
    (f) DART계 이중특이적 항체(예를 들어, DART-Fc, DART2-Fc 또는 DART);
    (g) DNL-Fab3 이중특이적 항체; 및
    (h) scFv-HSA-scFv 이중특이적 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Fc 영역 또는 상기 영역의 변이체를 포함하되, 상기 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 영역, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 영역인, 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포성 식세포작용(ADCP), 보체-의존적 세포독성(CDC), 그리고/또는 세포자멸사를 유도할 수 있는, 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    B1이 OX40에 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고;
    B2가 CTLA-4에 특이적인 폴리펩타이드 결합 도메인이며, 이는
    i) 서열번호: 3의 아미노산 서열; 또는
    ii) 서열번호: 3의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산이 변화되되, 단, 상기 결합 도메인이 인간 CTLA-4에 야생형 인간 CD86보다 더 높은 친화성으로 결합하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합되는 상기 CTLA-4가 영장류 또는 뮤린, 바람직하게는 인간 CTLA-4이며, 그리고/또는 상기 폴리펩타이드에 의해 특이적으로 결합되는 OX40이 영장류, 바람직하게는 인간 OX40인, 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, B1이 적어도 하나의 중쇄(H) 그리고/또는 적어도 하나의 경쇄(L)를 포함하고, B2가 상기 적어도 하나의 중쇄(H) 또는 상기 적어도 하나의 경쇄(L)에 부착되는, 폴리펩타이드.
  12. 제11항에 있어서,
    - B1이 적어도 하나의 중쇄(H) 및 적어도 하나의 경쇄(L)를 포함하고, B2가 상기 중쇄 또는 상기 경쇄 중 하나에 부착되거나; 또는
    - B1이 2개의 동일한 중쇄(H) 및 2개의 동일한 경쇄(L)를 포함하고, B2가 중쇄 둘 모두에 또는 경쇄 둘 모두에 부착되는, 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 방향 N-C로 기재된 하기 식 중 어느 하나에 따라 배열된 폴리펩타이드 사슬을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩타이드:
    (A) L-(X)n-B2;
    (B) B2-(X)n-L;
    (C) B2-(X)n-H;
    (D) H-(X)n-B2;
    식 중, X는 링커이고, n은 0 또는 1이다.
  14. 제13항에 있어서, X가 아미노산 서열 SGGGGSGGGGS(서열번호: 47), SGGGGSGGGGSAP(서열번호: 48), NFSQP(서열번호:49), KRTVA(서열번호: 50), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 144) 또는 (SG)m을 갖는 펩타이드이되, m은 1 내지 7인, 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 OX40에 50x10-10 M, 25x10-10 M 또는 20x10-10 M 미만인 Kd로 결합하며, 그리고/또는 인간 CTLA-4에 60x10-9 M, 25x10-9 M 또는 10x10-9 M 미만인 Kd 값으로 결합하는, 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T 세포, 바람직하게는 CD4+ 효과기 T 세포의 활성의 증가를 유도하며, 선택적으로 상기 증가는 T 세포에 별도의 분자로서 투여된 B1과 B2의 조합에 의해 유도된 효과기 T 세포의 활성의 증가보다 적어도 1.5배, 4.5배 또는 7배 더 높은,
    폴리펩타이드.
  17. 제16항에 있어서, T 세포 활성의 상기 증가가 상기 T 세포에 의한 증식 그리고/또는 IL-2 생산의 증가인, 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, OX40에의 결합에 대해 항체 1166/1167과 경쟁하며; 그리고/또는 CTLA-4에의 결합에 대해 CD86 돌연변이체 1040(서열번호: 17)과 경쟁하는, 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, OX40에의 결합에 대해 항체 1166/1261과 경쟁하며, 그리고/또는 CTLA-4에의 결합에 대해 항체 1166/1261과 경쟁하는, 폴리펩타이드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, B2 (ii)의 상기 아미노산 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 서열번호: 3의 아미노산 서열과 비교한 경우 치환되며; 선택적으로 서열번호: 3의 아미노산 서열과 비교하여 삽입 또는 결실이 없는, 폴리펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인의 상기 아미노산 서열에서 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나가 122번 위치에 존재하고, 선택적으로 상기 아미노산 서열이 또한 107, 121 및 125번 위치 중 적어도 하나에서 치환되는, 폴리펩타이드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, B2의 상기 아미노산 서열이 (표 C에 제시된 바와 같은) 서열번호 6 내지 24 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 6 내지 24의 아미노산 서열과 60% 초과, 또는 70% 초과, 예를 들어, 75% 또는 80% 초과, 바람직하게는 85% 초과, 예를 들어, 90% 또는 95% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩타이드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, B2의 상기 아미노산 서열이 서열번호: 17의 아미노산 서열(표 C에 제시된 바와 같은 CD86 돌연변이체 1040)을 포함하거나 이로 구성되는, 폴리펩타이드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, B1은, B2와 독립적으로 존재하는 경우, 하기 기능적 특징 중 적어도 하나를 나타내는, 폴리펩타이드:
    I. 인간 OX40에 10x10-10 M 미만, 보다 바람직하게는 5x10-10 M 미만인 Kd 값으로 결합하는 특징;
    II. 뮤린 OX40에 결합하지 않는 특징; 및
    III. 다른 인간 TNFR 상과(superfamily) 구성원, 예를 들어, 인간 CD137 또는 CD40에 결합하지 않는 특징.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, B1이 하기:
    (a) 8개 아미노산 길이이고, 공통 서열(consensus sequence): "G, F, T, F, G/Y/S, G/Y/S, Y/S, Y/S/A"를 포함하는 중쇄 CDR1 서열;
    (b) 8개 아미노산 길이이고, 공통 서열: "I, G/Y/S/T, G/S/Y, S/Y, G/S/Y, G/S/Y, G/S/Y, T"를 포함하는 중쇄 CDR2 서열;
    (c) 9 내지 17개 아미노산 길이이고, 공통 서열: "A, R, G/Y/S/H, G/Y/F/V/D, G/Y/P/F, -/H/S, -/N/D/H, -/Y/G, -/Y, -/Y, -/W/A/V, -/A/Y, -/D/A/Y/G/H/N, Y/S/W/A/T, L/M/I/F, D, Y"를 포함하는 중쇄 CDR3 서열;
    (d) 서열: "Q, S, I, S, S, Y"로 구성된 경쇄 CDR1 서열;
    (e) 서열: "A, A, S"로 구성된 경쇄 CDR2 서열;
    (f) 8 내지 10개 아미노산 길이이고, 공통 서열: "Q,Q, S/Y/G, -/Y/H/G, -/S/Y/G/D/W, S/Y/G/D, S/Y/G/T, P/L, Y/S/H/L/F, T"를 포함하는 경쇄 CDR3 서열
    로부터 독립적으로 선택된 임의의 1, 2, 3, 4, 5가지 또는 모든 6가지의 특징을 포함하되
    (c)의 상기 중쇄 CDR3 서열이 바람직하게는 공통 서열 "A, R, Y/H, D, Y, A/Y/G, S/W/A, M/L, D, Y"를 포함하는 10개 아미노산 길이의 서열이고;
    (f)의 상기 경쇄 CDR3 서열이 바람직하게는 서열 "Q, Q, Y, Y, W, Y, G, L, S, T"로 구성되는, 폴리펩타이드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, B1이 표 A(1)에 제시된 바와 같은 VH 서열의 모든 3개의 중쇄 CDR 서열 그리고/또는 표 A(2)에 제시된 바와 같은 VL 서열의 모든 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함하거나, 또는 B1이 표 B에 제시된 바와 같은 중쇄 VH 서열 그리고/또는 경쇄 VL 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, B1이 공통 서열 "A, R, Y/H, D, Y, A/Y/G, S/W/A, M/L, D, Y"를 포함하는 11개 아미노산 길이의 중쇄 CDR3 서열 및 서열번호: 89의 경쇄 VL 서열(표 B에서 제시된 바와 같은 1167)을 포함하고, 선택적으로 상기 서열번호: 89의 경쇄 VL 서열이 서열번호: 125의 더 긴 서열(표 D에서 제시된 바와 같은 1261)의 부분으로서 존재하는, 폴리펩타이드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 도메인 B1이 서열번호: 89의 경쇄 VL 서열(표 B에서 제시된 바와 같은 1167) 및 서열번호: 91의 중쇄 VH 서열(표 B에서 제시된 바와 같은 1166), 또는 서열번호: 89 그리고/또는 서열번호: 91과 60% 초과, 또는 70% 초과, 예를 들어, 75% 또는 80% 초과, 바람직하게는 85% 초과, 예를 들어, 90% 또는 95% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는, 폴리펩타이드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, B1이 인간 Fc 영역 또는 상기 영역의 변이체를 포함하되, 상기 영역이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 영역, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 영역인, 폴리펩타이드.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 125 내지 134 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 125 내지 134의 아미노산 서열과 60% 초과, 또는 70% 초과, 예를 들어, 75% 또는 80% 초과, 바람직하게는 85% 초과, 예를 들어, 90% 또는 95% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하거나 이로 구성되며, 선택적으로 상기 폴리펩타이드는 항체의 구성성분 부분으로서 제공되는, 폴리펩타이드.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 125의 아미노산 서열(표 D에서 제시된 바와 같은 1261)을 포함하거나 이로 구성된, 폴리펩타이드.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 125의 아미노산 서열 그리고/또는 서열번호: 91의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 125 그리고/또는 서열번호: 91과 60% 초과, 또는 70% 초과, 예를 들어, 75% 또는 80% 초과, 바람직하게는 85% 초과, 예를 들어, 90% 또는 95% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하거나 이로 구성된, 폴리펩타이드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 125의 아미노산 서열(표 D에서 제시된 바와 같은 1261) 및 서열번호: 91의 아미노산 서열(표 B에서 제시된 바와 같은 1161)을 포함하거나 이로 구성된, 폴리펩타이드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 폴리펩타이드가 개별적인 단일특이적 대응 폴리펩타이드의 조합 효과와 비교하여, 종양내 CD8/Treg 정량(ration)의 상승적인 증가를 유도할 수 있는, 폴리펩타이드.
  35. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 폴리펩타이드.
  36. 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 폴리펩타이드의 용도.
  37. 개체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 폴리펩타이드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제35항, 제36항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 암이고, 선택적으로 상기 개체가 인간인, 이중특이적 폴리펩타이드, 방법 또는 용도.
  39. 제38항에 있어서, 상기 방법이 상기 이중특이적 폴리펩타이드를 전신적으로 또는 국소적으로, 예컨대, 종양 부위에서 또는 종양 배출 림프절(tumor draining lymph node) 내로 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 상기 이중특이적 폴리펩타이드가 전신적으로 또는 국소적으로, 예컨대, 종양 부위에서 또는 종양 배출 림프절 내로의 투여를 위한 것인, 이중특이적 폴리펩타이드, 방법 또는 용도.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 암이 전립선암, 유방암, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 폐암, 자궁경부암, 횡문근육종, 신경아세포종, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 흑색종, 방광암, 위암, 두경부암, 간암, 피부암, 림프종 또는 신경교아종인, 이중특이적 폴리펩타이드, 방법 또는 용도.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 하나 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용하기 위한 것인, 이중특이적 폴리펩타이드, 방법 또는 용도.
  42. 제41항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 치료제가 PD-1/PD-L1, CD137, CD40, GITR, LAG3, TIM3, CD27 및 KIR로 구성된 군으로부터 선택되는 표적에 결합하는 면역치료제인, 이중특이적 폴리펩타이드, 방법 또는 용도.
  43. 제42항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 치료제가 PD-1 또는 PD-L1에 결합하는 면역치료제, 예컨대, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체인, 이중특이적 폴리펩타이드, 방법 또는 용도.
  44. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 폴리펩타이드의 적어도 하나의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  45. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물.
  46. 추가의 치료 모이어티에 접합된(conjugated) 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드.
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