CN110709421A - 针对ox40和ctla-4的双特异性抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供双特异性多肽，例如双特异性抗体，其包含能够特异性结合OX40的第一结合域和能够特异性结合CTLA‑4的第二结合域。本发明还提供所述双特异性多肽的组合物，以及其方法和用途。
Description
技术领域
本发明涉及与OX40和CTLA-4，特别是与人类OX40和人类CTLA-4特异性结合的双特异性多肽。
背景技术
癌症是发达国家中过早死亡的主要原因。癌症的免疫疗法旨在发动对抗肿瘤细胞的有效免疫应答。这可以通过例如破坏对肿瘤抗原的耐受性，增强抗肿瘤免疫应答以及刺激肿瘤部位处的局部细胞因子应答来实现。持久的抗肿瘤免疫应答的关键效应细胞是激活的肿瘤特异性效应T细胞。激活的效应T细胞的有效扩增可以使免疫应答重新导向肿瘤。在这种背景下，调节性T细胞(Treg)在抑制抗肿瘤免疫中起作用。消耗Treg、抑制Treg、逆转Treg或使Treg失活因此可以提供抗肿瘤作用并且逆转在肿瘤微环境中的免疫抑制。此外，例如树突状细胞对效应T细胞的不完全激活可以引起T细胞无反应性，这导致低效的抗肿瘤应答，而树突状细胞的充分诱导可以产生激活的效应T细胞的有效扩增，从而使免疫应答重新导向肿瘤。此外，自然杀伤(NK)细胞通过攻击具有下调的人类白细胞抗原(HLA)表达的肿瘤细胞以及通过诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)而在肿瘤免疫学中起重要作用。刺激NK细胞因此也可以减少肿瘤生长。
OX40(另外称为CD134或TNFRSF4)是主要在激活的T细胞(主要是CD4+效应T细胞，还有CD8+效应T细胞和调节性T细胞(Treg))上表达的TNFR家族的成员。在小鼠中，所述表达在Treg上是组成型的，但是在人类中不是这样。OX40表达通常在激活(T细胞受体接合)的24小时内发生并且在48-72小时后达到峰值。OX40刺激对于激活的T细胞的存活和增殖来说是重要的。OX40的唯一已知的配体是OX40L，它主要在抗原呈递细胞如树突状细胞和B细胞上表达，通常是在它们的激活后表达。OX40介导的T细胞激活的最终结果是诱导TH1效应T细胞激活谱和例如经由ADCC或ADCP降低Treg细胞的活性和/或数量。总体而言，这些作用可以促进抗肿瘤免疫。OX40在许多实体肿瘤如黑色素瘤、肺癌和肾癌中在调节性T细胞上过表达。
小鼠肿瘤模型的OX40激动剂处理已经被证实会产生抗肿瘤作用并且治愈几种不同的癌症形式，包括黑色素瘤、神经胶质瘤、肉瘤、前列腺癌、结肠癌和肾癌。所述数据与肿瘤特异性T细胞应答相一致，所述应答涉及CD4+T细胞和CD8+T细胞，类似于在CD40激动剂处理的情况下所见的作用。添加IL-12和其它细胞因子以及与其它免疫调节剂和化学疗法/放射疗法的组合已经被证实提高了OX40激动剂处理的治疗作用。来自临床前模型的证据表明抗OX40抗体的作用依赖于激活FcγR。在所有其它疗法均无效的晚期患者中测试小鼠抗人类OX40克隆9B12的I期临床研究已经在普罗维登斯癌症中心(Providence Cancer Centre)进行。所述抗体被良好耐受。观测到肿瘤缩小以及CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖的增加。低毒性可能是由短半衰期和抗药物抗体(所述抗体是小鼠抗体)引起的，而且也可能由非激活的T细胞上OX40的相对低的表达水平所引起。这种抗体的抗肿瘤作用不大。
现有的靶向OX40的抗体一般依赖于经由例如其它细胞上的Fcγ受体的交联以诱导向表达相应受体的细胞中的强烈信号转导。因此，当没有提供这样的交联时，它们不会有效地进行信号转导。此外，经由TNF受体家族成员的长期和连续的激活可能导致免疫耗竭。
T细胞受体CTLA-4用作T细胞激活的负调节因子，并且在初始激活后在T细胞表面上被上调。CTLA-4受体的配体是B7蛋白，它们由抗原呈递细胞表达。引起T细胞激活上调的相应配体受体对是CD28-B7。经由CD28的信号转导构成了共刺激通路，并且通过识别由MHC复合物所呈递的抗原肽的T细胞受体而紧跟在T细胞激活后。通过阻断CTLA-4与B7-1配体和/或B7-2配体的相互作用，免疫应答的正常检查点之一可以被去除。最终结果是可以促进抗肿瘤免疫的效应T细胞的活性增强。如同OX40一样，这可能是由于效应T细胞的直接激活，但也可能是由于Treg细胞的活性和/或数量降低，例如经由ADCC或ADCP。临床研究已经证实，阻断CTLA-4可产生抗肿瘤作用，但是施用抗CTLA-4抗体可能引起毒副作用。CTLA-4在许多实体肿瘤如黑色素瘤、肺癌和肾癌中在调节性T细胞上过表达。
需要改进的治疗剂，其能够激活肿瘤细胞附近的宿主免疫细胞，例如作为仅靶向一种T细胞相关蛋白(例如OX40或CTLA-4)的现有单特异性药物的替代物。
发明内容
本发明的第一个方面提供了一种双特异性多肽，其包含第一结合域，命名为B1，其能够特异性结合OX40；和第二结合域，命名为B2，其能够特异性结合CTLA-4。
靶向两种T细胞靶标CTLA-4和OX40的双特异性多肽(例如抗体)具有在这两种靶标均过表达的部位处诱导免疫系统特异性激活的潜能。值得注意的是，CTLA-4和OX40在肿瘤微环境中在调节性T细胞(Treg)上均过表达，而它们在效应T细胞上的共表达较低。因此，本发明的双特异性多肽具有在肿瘤微环境中选择性靶向调节性T细胞的潜能。
用本发明的双特异性多肽靶向肿瘤微环境中的Treg细胞还具有消耗或逆转Treg的免疫抑制功能的潜能。这种作用可能是通过经由本发明的双特异性抗体的Fc部分诱导ADCC或ADCP(例如参见Furness等,2014Trends Immunol 35(7):290-8；其公开内容以引用的方式并入本文)或通过经由OX40和/或CTLA-4诱导的信号转导和/或通过阻断CTLA-4信号转导通路(例如参见Walker,2014,Nature Reviews 11(12):852-63；其公开内容以引用的方式并入本文)来介导的。在另一方面，在效应T细胞上，本发明的双特异性多肽具有经由OX40刺激和通过CTLA-4检查点阻断来诱导激活和增强的功能的潜能。
靶向OX40和CTLA-4的双特异性多肽的净效应因此是：
1.与单特异性多肽相比，更高程度的免疫激活。所述免疫激活高于单特异性多肽的组合所诱导的免疫激活，即实现协同激活。
2.与单特异性多肽的组合相比，更高程度的ADCC诱导。
3.更定向/局限的免疫激活。免疫激活仅在具有高CTLA-4表达与OX40表达的环境(例如组织)中发生。肿瘤微环境是这样的环境。这可能会增加肿瘤部位的免疫激活，而不会引起与身体其它组织/区域激活相关的毒副作用。因此，治疗窗口将增加。
“多肽”在本文以其最广泛的意义使用以指代两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它拟肽的化合物。术语“多肽”因此包括短肽序列以及更长的多肽和蛋白质。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。
如本文所用的术语“双特异性”意指多肽能够特异性结合至少两种靶标实体。
在一个实施方案中，所述第一结合域和/或第二结合域可选自：抗体或其抗原结合片段。
举例来说，本发明的双特异性多肽可以包含：
(i)包含抗体可变域或其部分或由抗体可变域或其部分组成的第一结合域和包含抗体可变域或其部分或由抗体可变域或其部分组成的第二结合域；或
(ii)包含抗体可变域或其部分或由抗体可变域或其部分组成的第一结合域和并非抗体可变域或其部分的第二结合域。
因此，在一个实施方案中，所述多肽是双特异性抗体。
如本文所用，术语“抗体”是指含有抗原结合位点的分子，例如含有抗原结合位点的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、单域抗体、单链抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、scFv(例如包括单特异性和双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体，以及上述物质中的任一种的表位结合片段。
术语“针对(directed to)……”或“针对(directed against)……”的抗体在本文可互换使用并且是指如下抗体，所述抗体被构建成使其针对特定的靶标/标志物/表位/抗原具有一种或多种结合特异性，即免疫特异性结合靶标/标志物/表位/抗原的抗体。同样，可以使用表述对特定的靶标/标志物/表位“具有选择性”的抗体，这与“针对(directedto)”或“针对(directed against)”具有相同的定义。针对两种不同的靶标/标志物/表位/抗原(对其具有选择性)的双特异性抗体免疫特异性结合这两种靶标/标志物/表位/抗原。如果抗体针对特定靶抗原如OX40，则因此假定所述抗体可以针对所述靶抗原结构上存在的任何合适的表位。
如本文所用，术语“抗体片段”是抗体的一部分，如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不论结构如何，抗体片段都与由完整抗体所识别的相同抗原结合。举例来说，抗OX4抗体片段结合OX40。术语“抗体片段”还包括由可变区组成的分离的片段，例如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段以及其中轻链可变区和重链可变区由肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。如本文所用，术语“抗体片段”不包括抗体的不具有抗原结合活性的部分，例如Fc片段或单个氨基酸残基。
ScFv对于包括在本发明的双特异性多肽中来说是特别优选的。
因此，在本发明的双特异性多肽的示例性实施方案中：
(a)结合域B1和/或结合域B2是完整IgG抗体(或共同形成完整IgG抗体)；
(b)结合域B1和/或结合域B2是Fv片段(例如scFv)；
(c)结合域B1和/或结合域B2是Fab片段；和/或
(d)结合域B1和/或结合域B2是单域抗体(例如结构域抗体和纳米抗体)。
本领域技术人员应理解，本发明的双特异性多肽可以具有几种不同的结构形式(例如参见Chan和Carter,2016,Nature Reviews Immunology 10,301-316，其公开内容以引用的方式并入本文)。
在示例性实施方案中，所述多肽是选自以下的双特异性抗体：
(a)二价双特异性抗体，例如IgG-scFv双特异性抗体(例如其中B1是完整IgG并且B2是在IgG的轻链的N末端处和/或在IgG的轻链的C末端处和/或在IgG的重链的N末端处和/或在IgG的重链的C末端处与B1连接的scFv，或反之亦然)；
(b)单价双特异性抗体，例如
(丹麦哥本哈根的Genmab公司(GenmabAS,Copenhagen,Denmark))或‘杵臼(knob-in-hole)’双特异性抗体(例如scFv-KIH、scFv-KIHr、BiTE-KIH或BiTE-KIHr(参见Xu等,2015,mAbs 7(1):231-242))；
(c)scFv2-Fc双特异性抗体(例如来自美国Aptevo Therapeutics Inc的ADAPTIRTM双特异性抗体)；
(d)BiTE/scFv2双特异性抗体；
(e)DVD-Ig双特异性抗体；
(f)基于DART的双特异性抗体(例如，DART-Fc、DART2-Fc或DART)；
(g)DNL-Fab3双特异性抗体；和
(h)scFv-HSA-scFv双特异性抗体。
本领域技术人员将理解，本发明还涵盖与上面列出的那些相同的形式，其中结合域之一是非免疫球蛋白结合域(例如能够结合CTLA-4的CD86多肽)。
举例来说，所述双特异性多肽可以是IgG-scFv抗体。所述IgG-scFv抗体可以呈VH-VL或VL-VH取向。在一个实施方案中，所述scFv可以通过VH与VL之间的S-S桥来稳定化。
或者，所述双特异性多肽可以是与CD86多肽连接的抗OX40 IgG(或其抗原结合片段，例如scFv)。
在一个实施方案中，结合域B1和结合域B2是彼此直接融合的。
在一个替代性实施方案中，结合域B1和结合域B2经由多肽接头连接。举例来说，多肽接头可以是约10个至约25个氨基酸的短接头肽。所述接头通常富含用于柔性的甘氨酸以及用于溶解性的丝氨酸或苏氨酸，并且可以使VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。示例性接头包括如SEQ ID NO:47至50或144中的任一个所示的氨基酸序列的肽。
本发明的双特异性多肽可以通过本领域所用的任何已知的合适方法来制造。制备本发明的双特异性抗体的方法包括BiTE(Micromet)、DART(MacroGenics)、Fcab和Mab2(F-star)、Fc工程改造的IgGl(Xencor)或DuoBody(基于Fab臂交换，Genmab)。可用于制备双特异性抗体的其它平台的实例包括但不限于WO 2008/119353(Genmab)、WO 2011/131746(Genmab)中所述以及由van der Neut-Kolfschoten等(2007,Science 317(5844):1554-7)所报道的那些。还可以使用传统方法，例如杂合杂交瘤和化学缀合方法(Marvin和Zhu(2005)Acta Pharmacol Sin 26:649)。除了所期望的双特异性抗体之外，由不同的重链和轻链组成的两种抗体在宿主细胞中的共表达还会产生可能的抗体产物的混合物，然后可以通过例如亲和色谱法或类似方法将所述产物分离。
本领域技术人员应理解，所述双特异性多肽可以包含人类Fc区或所述区域的变体，其中所述区域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区，优选是IgG1或IgG4区。
所述抗体的恒定(Fc)区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。所述Fc区优选是人类Fc区或所述区域的变体。所述Fc区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区，优选是IgG1或IgG4区。Fc区的变体通常以改变的亲和力结合Fc受体，例如FcγR和/或新生儿Fc受体(FcRn)，从而提供所述多肽的改进的功能和/或半衰期。相对于包含天然Fc区的多肽的半衰期，生物功能和/或半衰期可以增加或减少。可以通过变体Fc区的存在来调节的这样的生物功能的实例包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或细胞凋亡。
可以与本文所公开的任何VH区序列组合(以形成完整重链)的示例性重链恒定区氨基酸序列是在此再现的IgG1重链恒定区序列：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO:135)
其它重链恒定区序列是本领域已知的并且也可以与本文所公开的任何VH区组合。举例来说，优选的恒定区是修饰的IgG4恒定区，如在此所再现：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO:137)
相对于野生型IgG4，该修饰的IgG4序列表现出降低的FcRn结合并且因此导致血清半衰期缩短。此外，它表现出IgG4的核心铰链的稳定化，从而使得IgG4更稳定，进而防止Fab臂交换。
另一个优选的恒定区是修饰的IgG4恒定区，如在此所再现的：ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO:139)
该修饰的IgG4序列引起IgG4的核心铰链的稳定化，从而使得IgG4更稳定，进而防止Fab臂交换。
还优选的是野生型IgG4恒定区，如在此所再现的：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO:138)
可以与本文所公开的任何VL区序列组合(以形成完整轻链)的示例性轻链恒定区氨基酸序列是在此所再现的κ链恒定区序列：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO:136)
其它轻链恒定区序列是本领域已知的并且也可以与本文所公开的任何VL区组合。
所述抗体或其抗原结合片段具有某些优选的结合特征和功能作用，这在下文更详细地解释。所述抗体或其抗原结合片段在作为本发明的双特异性多肽的一部分被并入时优选地保留这些结合特征和功能作用。
在一个实施方案中，所述抗原结合片段可以选自：Fv片段(例如单链Fv片段或二硫键键合的Fv片段)、Fab样片段(例如Fab片段；Fab'片段或F(ab)2片段)以及结构域抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性多肽可以是具有与κ链的C末端部分融合的非免疫球蛋白多肽(例如CTLA-4结合域，例如CD86或其突变形式，如SEQ ID NO:17；参见下文)的IgG1抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性多肽可以是具有与重γ1链的C末端融合的scFv片段的IgG1抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性多肽可以含有结合两种不同靶标的2-4个scFv。
本领域技术人员应理解，T细胞靶标、CTLA-4和OX40可以被定位在细胞的表面上。“定位在细胞的表面上”意指T细胞靶标与细胞缔合以使得T细胞靶标的一个或多个区域存在于细胞表面的外面上。举例来说，T细胞靶标可以插入细胞质膜中(即作为跨膜蛋白取向)，其中一个或多个区域存在于细胞外表面上。这可以在细胞表达T细胞靶标的过程中发生。因此，在一个实施方案中，“定位在细胞的表面上”可以意指“在细胞表面上表达”。或者，T细胞靶标可以在细胞外部，其中共价相互作用和/或离子相互作用使其定位到细胞表面的一个或多个特定的区域。
本领域技术人员应理解，本发明的双特异性抗体可能能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或细胞凋亡。
在另一个实施方案中，所述多肽能够诱导肿瘤免疫。这可以在体外在T细胞激活测定法中测试，例如通过测量IL-2和IFNγ的产生。效应T细胞的激活将意味着可以在体内实现肿瘤特异性T细胞应答。此外，在体内模型如小鼠模型中的抗肿瘤应答将意味着已经实现成功的对肿瘤的免疫应答。
所述抗体可以调节表达所述T细胞靶标(CTLA-4或OX40)的细胞的活性，其中所述调节是所述细胞的活性增加或降低。所述细胞通常是T细胞。所述抗体可以提高CD4+或CD8+效应细胞的活性，或者可以降低调节性T细胞(Treg)的活性。在任一种情况下，所述抗体的净效应将是效应T细胞，特别是CD4+效应T细胞的活性增加。用于确定效应T细胞的活性变化的方法是众所周知的，并且包括例如相对于在对照存在下T细胞IL-2的产生水平和/或T细胞增殖，测量在所述抗体存在下T细胞IL-2产生水平的增加或T细胞增殖的增加。用于细胞增殖和/或IL-2产生的测定法是众所周知的并且在实施例中举例说明。
评价配体对靶标的结合能力的标准测定法是本领域众所周知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。所述多肽的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法，例如通过表面等离子体共振分析(SPR)来评估。
术语“结合活性”和“结合亲和力”意在指多肽分子与靶标结合或不与靶标结合的倾向。结合亲和力可以通过测定多肽与其靶标的解离常数(Kd)来定量。较低的Kd表示对靶标的亲和力较高。类似地，多肽与其靶标的结合特异性可以根据与关于所述多肽和另一种非靶分子的解离常数相比，所述多肽对其靶标的对比解离常数(Kd)来定义。
该解离常数的值可以通过众所周知的方法直接测定，并且即使是对于复杂混合物，也可以通过诸如例如Caceci等(Byte 9:340-362,1984；其公开内容以引用的方式并入本文)中所述的那些方法的方法来计算。举例来说，Kd可以使用双过滤硝酸纤维素滤膜结合测定法来确定，所述测定法如由Wong和Lohman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5428-5432,1993)所公开。评价配体如抗体对靶标的结合能力的其它标准测定法是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。所述抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法，如通过BiacoreTM系统分析来评估。
可以进行竞争结合测定法，其中将抗体与靶标的结合与该靶标的另一已知配体如另一抗体与所述靶标的结合相比较。发生50％抑制的浓度被称为Ki。在理想条件下，Ki等于Kd。Ki值将决不会小于Kd，因此可以方便地用Ki的测量值来代替以提供Kd的上限。
结合亲和力的替代量度包括EC50或IC50。在这种背景下，EC50表示多肽实现它与固定量的靶标的最大结合的50％的浓度。IC50表示多肽抑制固定量的竞争剂与固定量的靶标的最大结合的50％的浓度。在这两种情况下，较低水平的EC50或IC50表示对靶标的亲和力较高。配体对其靶标的EC50和IC50值两者均可以通过众所周知的方法，例如ELISA来测定。评估多肽的EC50和IC50的合适的测定法阐述于实施例中。
本发明的多肽优选地能够以如下的亲和力结合其靶标，所述亲和力是它与另一非靶分子结合的亲和力的至少2倍、10倍、50倍、100倍或更大。
本发明的多肽可以通过任何合适的手段产生。举例来说，所述多肽的全部或部分可以由包含编码所述多肽的核苷酸的细胞表达为融合蛋白。
或者，B1部分和B2部分可以单独产生，然后连接在一起。连接可以通过任何合适的手段，例如使用上文所述的化学缀合方法和接头来实现。B1部分和B2部分的单独产生可以通过任何合适的手段来实现。例如，通过任选地在单独的细胞中从单独的核苷酸表达，如下文更详细地解释的那样。
变体
本文所述的双特异性多肽或其组成结合域(例如OX40或CTLA-4结合域)可以包含本文所述的特定氨基酸序列中的任一个的变体或片段，前提条件是所述多肽或结合域保持与其靶标的结合。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段的变体可以保留本文所述的序列的CDR序列。举例来说，抗OX40抗体可以包含表B中所述的特定氨基酸序列中的任一个的变体或片段，前提条件是所述抗体保持与其靶标的结合。这样的变体或片段通常可以保留表B的所述序列的CDR序列。CTLA-4结合域可以包含表C的序列中的任一个的变体，前体条件是所述结合域保持与其靶标的结合。
本文所述的重链或轻链氨基酸序列中的任一个的片段可以包含来自所述氨基酸序列的至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个连续氨基酸。
本文所述的重链或轻链氨基酸序列中的任一个的变体可以是所述序列的取代、缺失或添加变体。变体相比于所述序列可以包含1个、2个、3个、4个、5个、至多10个、至多20个、至多30个或更多个氨基酸取代和/或缺失。“缺失”变体可以包含单个氨基酸的缺失，诸如2、3、4或5个氨基酸的小组氨基酸的缺失，或更大的氨基酸区域的缺失，例如特定氨基酸结构域或其它特征的缺失。“取代”变体优选地涉及一个或多个氨基酸被相同数目的氨基酸置换以及进行保守氨基酸取代。举例来说，氨基酸可以被具有类似特性的替代氨基酸取代，例如另外的碱性氨基酸、另外的酸性氨基酸、另外的中性氨基酸、另外的带电荷的氨基酸、另外的亲水性氨基酸、另外的疏水性氨基酸、另外的极性氨基酸、另外的芳族氨基酸或另外的脂族氨基酸。可以用于选择合适取代基的20种主要氨基酸的一些特性如下：
| Ala，A | 脂族，疏水性，中性 | Met，M | 疏水性，中性 |
| Cys，C | 极性，疏水性，中性 | Asn，N | 极性，亲水性，中性 |
| Asp，D | 极性，亲水性，带电荷(-) | Pro，P | 疏水性，中性 |
| Glu，E | 极性，亲水性，带电荷(-) | Gln，Q | 极性，亲水性，中性 |
| Phe，F | 芳族，疏水性，中性 | Arg，R | 极性，亲水性，带电荷(+) |
| Gly，G | 脂族，中性 | Ser，S | 极性，亲水性，中性 |
| His，H | 芳族，极性，亲水性，带电荷(+) | Thr，T | 极性，亲水性，中性 |
| Ile，I | 脂族，疏水性，中性 | Val，V | 脂族，疏水性，中性 |
| Lys，K | 极性，亲水性，带电荷(+) | Trp，W | 芳族，疏水性，中性 |
| Leu，L | 脂族，疏水性，中性 | Tyr，Y | 芳族，极性，疏水性 |
本文的氨基酸可以用全名、三字母代码或单字母代码来指代。
优选的“衍生物”或“变体”包括那些，其中出现在该序列中的氨基酸不是天然存在的氨基酸而是其结构类似物。用于所述序列中的氨基酸也可以被衍生或修饰，例如被标记，前提条件是抗体的功能没有受到显著的不利影响。
如上文所述的衍生物和变体可以在抗体的合成期间或通过产生后修饰，或者在抗体呈重组形式时使用定点诱变、随机诱变、或核酸的酶促切割和/或连接的已知技术来制备。
优选的是，变体具有与如本文所公开的序列所示的序列具有大于60％，或大于70％，例如75％或80％，优选地大于85％，例如大于90％或95％的氨基酸同一性的氨基酸序列。这种氨基酸同一性水平可以是在相关SEQ ID NO序列的全长上或在所述序列的一部分上，例如在20、30、50、75、100、150、200个或更多个氨基酸上所见的，这取决于全长多肽的尺寸。
关于氨基酸序列，“序列同一性”是指在使用ClustalW(Thompson等,1994,NucleicAcids Res.22(22):4673-80；其公开内容以引用的方式并入本文)用以下参数评估时具有指定值的序列：
逐对比对参数：方法：准确，矩阵：PAM，空位开放罚分：10.00，空位延伸罚分：0.10；
多重比对参数：矩阵：PAM，空位开放罚分：10.00，延迟同一性％：30，处罚末端空位：开，空位间距：0，负矩阵：无，空位延伸罚分：0.20，残基特异性空位罚分：开，亲水性空位罚分：开，亲水性残基：GPSNDQEKR。特定残基处的序列同一性意在包括已经被简单衍生化的相同残基。
多核苷酸、载体以及细胞
本发明还涉及编码本发明的多肽的全部或部分的多核苷酸。因此，本发明的多核苷酸可以编码如本文所述的任何多肽、或B1的全部或部分或者B2的全部或部分。术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文可互换使用并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合形式，或其类似物。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以分离的形式或基本上分离的形式提供。基本上分离意指多肽可以基本上但并非完全与任何周围介质分离。多核苷酸可以与不会干扰它们的预期用途的载体或稀释剂混合并且仍被认为是基本上分离的。
“编码”所选多肽的核酸序列是核酸分子，所述核酸分子在被置于适当调节序列的控制下时在体内被转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的边界是由5'(氨基)末端处的起始密码子和3'(羧基)末端处的翻译终止密码子确定的。出于本发明的目的，这样的核酸序列可以包括但不限于来自病毒、原核生物或真核生物mRNA的cDNA，来自病毒或原核生物DNA或RNA的基因组序列，以及甚至合成DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'端。
编码抗体的重链或轻链氨基酸序列的实例的代表性多核苷酸可以包含本文所公开的核苷酸序列中的任一个或由本文所公开的核苷酸序列中的任一个组成，例如表B中所示的序列。编码表D中所示的多肽的代表性多核苷酸可以包含也示于表D中的相应核苷酸序列或由所述相应核苷酸序列组成(内含子序列以小写字母示出)。编码CTLA-4结合域的实例的代表性多核苷酸可以包含如表E中所示的SEQ ID NO:25至43中的任一个或由其组成。
合适的多核苷酸序列可以替代地是这些特定多核苷酸序列之一的变体。举例来说，变体可以是上述核酸序列中的任一个的取代、缺失或添加变体。变体多核苷酸相比于序列表中所给出的序列可以包含1个、2个、3个、4个、5个、至多10个、至多20个、至多30个、至多40个、至多50个、至多75个或更多个核酸取代和/或缺失。
合适的变体可以与本文所公开的核酸序列中的任一个的多核苷酸至少70％同源，优选地与其至少80％或90％同源并且更优选地至少95％、97％或99％同源。优选的是，至少相对于多核苷酸的编码区，存在这些水平的同源性和同一性。测量同源性的方法是本领域众所周知的并且本领域技术人员应了解，在本发明的背景下，同源性是基于核酸同一性计算的。这样的同源性可以在至少15个，优选地至少30个，例如至少40个、60个、100个、200个或更多个连续核苷酸的区域上存在。这样的同源性可以在未修饰的多核苷酸序列的全长上存在。
测量多核苷酸同源性或同一性的方法是本领域已知的。举例来说，UWGCG软件包提供了BESTFIT程序，该程序可以用于计算同源性(例如在其默认设置上使用)(Devereux等,1984,Nucleic Acids Research 12:387-395；其公开内容以引用的方式并入本文)。
PILEUP算法和BLAST算法也可以用于计算同源性或比对序列(通常在其默认设置上)，例如Altschul,1993,J Mol Evol 36:290-300；Altschul等,1990,J Mol Biol 215:403-10(其公开内容以引用的方式并入本文)中所述。
用于进行BLAST分析的软件可经由国家生物技术信息中心(National Centre forBiotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配或满足一定的正值阈值分数T。T被称为相邻字分数阈值(Altschul等,同上)。这些初始相邻字命中用作种子以启动搜索，以寻找含有它们的HSP。所述字命中沿着每个序列在两个方向上延伸，只要可以增加累积比对分数即可。在每个方向上字命中的延伸在下列情况时停止：累积比对分数由于一个或多个负得分残基比对的累加而变为0或低于0；或者到达任何一个序列的末端。BLAST算法参数W、T以及X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用以下各项作为默认值：字长(W)：11；BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919；其公开内容以引用的方式并入本文)；比对(B)：50；期望值(E)：10；M＝5；N＝4；以及两条链的比较。
BLAST算法执行两个序列之间的相似性的统计分析；参见例如Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787；其公开内容以引用的方式并入本文。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小和概率(P(N))，它提供了有关两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率的指示。举例来说，如果第一序列与第二序列比较的最小和概率小于约1，优选地小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，那么所述序列被认为与另一序列相似。
同源物与相关多核苷酸中的序列的不同之处可以在于有少于3个、5个、10个、15个、20个或更多个突变(它们中的每一个可以是取代、缺失或插入)。这些突变可以是在所述同源物的至少30个，例如至少40个、60个或100个或更多个连续核苷酸的区域上测量的。
在一个实施方案中，变体序列可能由于遗传密码的冗余而不同于序列表中所给出的特定序列。DNA密码具有4种主要的核酸残基(A、T、C和G)并且使用这些来“拼出”三字母密码子，这些密码子代表生物体的基因中所编码的蛋白质的氨基酸。密码子沿DNA分子的线性序列被翻译成由那些基因编码的一种或多种蛋白质中的氨基酸的线性序列。所述密码是高度简并的，其中61个密码子编码20种天然氨基酸并且3个密码子代表“终止”信号。因此，大部分的氨基酸是由多于一个密码子编码的，实际上，几个是由四个或更多个不同的密码子编码的。本发明的变体多核苷酸因此可以与本发明的另一多核苷酸编码相同的多肽序列，但是可能由于使用不同的密码子来编码相同的氨基酸而具有不同的核酸序列。
本发明的多肽因此可以由编码并且能够表达它的多核苷酸产生或以所述多核苷酸的形式递送。
本发明的多核苷酸可以根据本领域众所周知的方法来合成，如例如Green和Sambrook(2012,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-a laboratory manual)》,第4版；Cold Spring Harbor Press；其公开内容以引用的方式并入本文)中所述。
本发明的核酸分子可以表达盒的形式提供，所述表达盒包括与插入序列可操作地连接，从而允许本发明的多肽在体内表达的控制序列。这些表达盒进而通常提供于载体(例如质粒或重组病毒载体)内。这样的表达盒可以向宿主受试者直接施用。或者，可以向宿主受试者施用包含本发明的多核苷酸的载体。优选的是，使用遗传载体制备和/或施用所述多核苷酸。合适的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并且允许本发明的多肽表达的任何载体。
本发明因此包括包含这样的多核苷酸序列的表达载体。这样的表达载体在分子生物学领域中是常规构建的并且可以例如涉及使用质粒DNA和适当的起始子、启动子、增强子以及其它元件，例如多聚腺苷酸化信号，所述多聚腺苷酸化信号可能是必要的，并且以正确的取向被定位，以允许本发明的肽的表达。其它合适的载体对本领域技术人员来说将是显而易见的(参见Green和Sambrook,同上)。
本发明还包括已经被修饰以表达本发明的多肽的细胞。这样的细胞包括瞬时的、或优选地稳定的高等真核细胞系，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞；低等真核细胞，例如酵母；或原核细胞，例如细菌细胞。可以通过插入编码本发明的多肽的载体或表达盒来修饰的细胞的具体实例包括哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、NS0和COS细胞。优选的是，所选的细胞系将是不仅稳定，而且还允许多肽的成熟糖基化和细胞表面表达的细胞系。
本发明的这些细胞系可以使用常规方法培养以产生本发明的多肽，或者可以治疗性或预防性用于向受试者递送本发明的抗体。或者，可以向来自受试者的细胞离体施用本发明的多核苷酸、表达盒或载体，然后使所述细胞回到受试者体内。
药物制剂、治疗用途和患者组
在另一个方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含本发明的分子，例如本文所述的抗体、双特异性多肽、多核苷酸、载体和细胞。举例来说，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含本发明的一种或多种分子，例如本发明的一种或多种抗体和/或双特异性多肽，以及至少一种药学上可接受的载体。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选的是，所述载体适用于肠胃外，例如静脉内、肌内或皮下施用(例如通过注射或输注)。根据施用途径，所述多肽可以被包被在材料中以保护所述多肽免于酸和可能使所述多肽失活或变性的其它自然条件的影响。
优选的药学上可接受的载体包括水性载体或稀释剂。可以用于本发明组合物中的合适的水性载体的实例包括水、缓冲水和盐水。其它载体的实例包括乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合适的混合物，植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣材料，在分散液的情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，将优选的是，在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠。
本发明的组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。这些组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序以及通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保对微生物存在的预防。还可能期望将等渗剂如糖、氯化钠等包括到组合物中。此外，可以通过包括诸如单硬脂酸铝和明胶的延迟吸收剂来使可注射的药物形式的吸收延长。
治疗组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌的和稳定的。所述组合物可以被配制成溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。
可以通过将所需量的活性剂(例如多肽)，根据需要连同上文所列举的成分中的一种或组合一起并入到适当的溶剂中，接着灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。一般来说，通过将活性剂并入到含有基本分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需的其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法得到活性剂加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的所期望的成分的粉末。
特别优选的组合物被配制用于全身施用或局部施用。局部施用可以是在肿瘤部位处或向肿瘤引流淋巴结中。所述组合物可以优选地被配制用于在一段时间内持续释放。因此，所述组合物可以在有助于持续释放的基质中提供或作为所述基质的一部分提供。优选的持续释放基质可以包括montanide或γ-聚谷氨酸(PGA)纳米颗粒。本发明的多肽的局部释放，任选地在一段持续的时间内的局部释放可以减少与施用CTLA-4拮抗剂相关的潜在的自身免疫副作用。
本发明的组合物可以包含另外的活性成分以及本发明的多肽。如上所述，本发明的组合物可以包含一种或多种本发明的多肽。它们还可以包含另外的治疗剂或预防剂。
包含本发明的多肽或其它组合物和使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。所述试剂盒还可以含有一种或多种另外的试剂，例如上文所讨论的另外的治疗剂或预防剂。
根据本发明的多肽可以用于治疗或预防。在治疗应用中，向已经患有病症或病状的受试者施用足以治愈、缓解或部分阻止所述病状或其一个或多个症状的量的多肽或组合物。这样的治疗性治疗可以使得疾病症状的严重程度降低，或者无症状期的频率或持续时间增加。足以实现这一目的的量被定义为“治疗有效量”。在预防应用中，向尚未表现出病症或病状的症状的受试者施用足以预防或延缓症状产生的量的多肽或组合物。这样的量被定义为“预防有效量”。所述受试者可以通过任何合适的手段而已经被鉴定为有患上所述疾病或病状的风险。
具体来说，本发明的抗体和双特异性多肽可以用于治疗或预防癌症。因此，本发明提供了用于治疗或预防癌症的本发明的抗体或双特异性多肽。本发明还提供了一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向个体施用本发明的多肽。本发明还提供了用于制造供治疗或预防癌症的药物的本发明的抗体或双特异性多肽。
所述癌症可以是前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴母细胞性白血病、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、头颈部癌、肝癌、皮肤癌、淋巴瘤或胶质母细胞瘤。
本发明的抗体或双特异性多肽，或包含所述抗体或所述多肽的组合物可以经由一种或多种施用途径，使用本领域已知的多种方法中的一种或多种来施用。如将由本领域技术人员所理解，施用途径和/或施用模式将根据所期望的结果而变化。全身施用或局部施用是优选的。局部施用可以是在肿瘤部位处或向肿瘤引流淋巴结中。用于本发明的多肽或组合物的优选的施用模式包括静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其它肠胃外施用模式，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内施用和局部施用以外的施用模式，通常是通过注射。或者，本发明的多肽或组合物可以经由非肠胃外模式，例如局部、表皮或粘膜施用模式来施用。
本发明的抗体或多肽的合适的剂量可以由熟练的执业医师来确定。本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化以获得对于特定患者、组合物以及施用模式来说有效实现所期望的治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的特定多肽的活性，施用途径，施用时间，多肽的排泄速率，治疗持续时间，与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康情况和先前病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。
本发明的抗体或多肽的合适的剂量可以例如在所治疗患者的每公斤体重约0.1μg至约100mg的范围内。举例来说，合适的剂量可以是每天每公斤体重约1μg至约10mg或者每天每公斤体重约10g至约5mg。
可以调整给药方案以提供最佳的所期望的反应(例如治疗反应)。举例来说，可以施用单次推注，可以随时间推移施用几个分次剂量或者剂量可以按比例降低或增加，如由治疗情形的紧急程度所指示。特别有利的是，将肠胃外组合物配制成剂量单位形式以易于施用和保持剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每一个单位含有被计算以产生所期望的治疗作用的预定量的活性化合物联同所需的药物载体。
抗体或多肽可以单次剂量或多次剂量施用。所述多次剂量可以经由相同或不同的途径施用并且施用到相同或不同的部位。或者，抗体或多肽可以作为如上文所述的持续释放制剂施用，在这种情况下，需要不太频繁的施用。剂量和频率可以根据多肽在患者体内的半衰期和所期望的治疗持续时间而变化。施用的剂量和频率也可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防应用中，可以在一段较长的时间内以相对不频繁的时间间隔施用相对低的剂量。在治疗应用中，可以施用相对高的剂量，例如直到患者显示出疾病症状的部分或完全改善为止。
两种或更多种药剂的联合施用可以通过许多不同的方式来实现。在一个实施方案中，所述抗体或多肽和其它药剂可以在单一组合物中一起施用。在另一个实施方案中，所述抗体或多肽和其它药剂可以在独立的组合物中作为联合疗法的一部分施用。举例来说，调节剂可以在其它药剂之前、之后或同时施用。
本发明的抗体、多肽或组合物还可以用于增加表达第一T细胞靶标和第二T细胞靶标的细胞群体的激活的方法中，所述方法包括在适于容许所述细胞与本发明的多肽之间的相互作用的条件下向所述细胞群体施用本发明的多肽或组合物。所述细胞群体通常包含表达第一T细胞靶标的至少一些细胞，通常是T细胞；以及表达第二T细胞靶标的至少一些细胞。所述方法通常是离体进行的。
举例来说，本发明的抗体、多肽或组合物还可以用于增加表达人类OX40和人类CTLA-4的细胞群体的激活的方法中，所述方法如上文所述。
CTLA-4的结合域
本发明的双特异性多肽包含对CTLA-4具有特异性的结合域。
CD86和CD80在本文可以被称为B7蛋白(分别是B7-2和B7-1)。这些蛋白质在抗原呈递细胞的表面上表达并且与T细胞受体CD28和CTLA-4相互作用。B7分子与CD28的结合促进了T细胞激活，而B7分子与CTLA-4的结合切断了T细胞的激活。B7蛋白与CD28和/或CTLA-4之间的相互作用构成了共刺激信号转导通路，该通路在免疫激活和调节中起重要作用。因此，B7分子是通路的一部分，适于操作以解除免疫抑制，从而增强患者的免疫力。
CD86蛋白是单体并且由两个细胞外免疫球蛋白超家族结构域组成。CD86的受体结合域具有典型的IgV组结构，而膜近端结构域具有C1组样结构。CD80和CD86的结构已经被单独确定或在与CTLA-4的复合物中确定。CD80分子和CD86分子上的接触残基处于可溶性细胞外域中，并且主要位于β折叠中而不是(CDR样)环中。
SEQ ID NO:3是人类野生型CD86的单体可溶性细胞外域的氨基酸序列。该野生型序列可以任选地缺少在N末端，即位置24和25处的丙氨酸和脯氨酸。这些氨基酸在本文可以被分别称为A24和P25。
本发明的双特异性多肽具有对CTLA-4具特异性的结构域“CTLA-4结合域”作为多肽结合域。这样的结合域的合适的实例公开于WO 2014/207063中，其内容以引用的方式并入本文。对CTLA-4具有特异性的结合域也可能结合CD28。如本文所用的术语CTLA-4通常是指人类CTLA-4并且如本文所用的术语CD28通常是指人类CD28。人类CTLA-4和人类CD28的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明的多肽的CTLA-4结合域可以对来自其它哺乳动物的CTLA-4或CD28，例如灵长类动物或鼠类CTLA-4或CD28具有一定的结合亲和力。
CTLA-4结合域具有结合天然状态的CTLA-4的能力，特别是结合定位在细胞表面上的CTLA-4的能力。
“定位在细胞表面上”如上文所定义。
本发明的多肽的CTLA-4结合域部分可以包含以下各项或由以下各项组成：
(i)SEQ ID NO:3的氨基酸序列；或
(ii)其中在与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比时至少一个氨基酸被改变的氨基酸序列，前提条件是所述结合域以比野生型人类CD86更高的亲和力结合人类CTLA-4。
换句话说，CTLA-4结合域是对人类CTLA-4具有特异性的多肽结合域，所述多肽结合域包含以下各项或由以下各项组成：(i)人类野生型CD86的单体可溶性细胞外域；或(ii)所述可溶性细胞外域的多肽变体，前提条件是所述多肽变体相比于野生型人类CD86以更高的亲和力结合人类CTLA-4。
因此，本发明的多肽的CTLA-4结合域可以与人类野生型CD86具有相同的靶标结合特性，或者与人类野生型CD86的靶标结合特性相比，可以具有不同的靶标结合特性。出于比较这些特性的目的，“人类野生型CD86”通常是指如前述部分中所述的人类野生型CD86的单体可溶性细胞外域。
人类野生型CD86特异性结合两种靶标，即CTLA-4和CD28。因此，本发明的多肽的CTLA-4结合域的结合特性可以被表示为多肽结合这些靶标中的每一种的能力的单独量度。举例来说，人类野生型CD86的单体细胞外域的多肽变体优选地以比野生型人类CD86对CTLA-4的结合亲和力更高的结合亲和力结合CTLA-4。这样的多肽也可以任选地以比野生型人类CD86对CD28的结合亲和力更低的结合亲和力结合CD28。
本发明的多肽的CTLA-4结合域是对CTLA-4具有特异性的多肽结合域。这意味着它优选地以比它结合另一分子的结合亲和力更大的结合亲和力结合CTLA-4。与野生型人类CD86对CTLA-4的亲和力相比，所述CTLA-4结合域优选地以相同的亲和力或更高的亲和力结合CTLA-4。
优选的是，本发明的多肽的CTLA-4结合域对人类CTLA-4的Kd将是野生型人类CD86对人类CTLA-4的Kd的至多1/2、至多2/5、至多1/3、至多2/7、至多1/4、至多2/9、至多1/5、至多2/11、至多1/8或至多1/10。最优选的是，CTLA-4结合域对人类CTLA-4的Kd将是野生型人类CD86对人类CTLA-4的Kd的至多1/5或至多1/10。用于确定多肽对CTLA-4的Kd的优选方法是SPR分析，例如使用BiacoreTM系统。用于多肽的SPR分析的合适的方案阐述于实施例中。
优选的是，本发明的多肽的CTLA-4结合域对人类CTLA-4的EC50将是在相同的条件下野生型人类CD86对人类CTLA-4的EC50的至多2/3、至多1/2、至多1/3、至多1/5、至多1/10、至多1/12、至多1/14、至多1/15、至多1/17、至多1/20、至多1/25或至多1/50。最优选的是，CTLA-4结合域对人类CTLA-4的EC50将是在相同的条件下野生型人类CD86对人类CTLA-4的EC50的至多1/10或至多1/25。用于确定多肽对CTLA-4的EC50的优选方法是经由ELISA。用于评估多肽的EC50的合适的ELISA测定法阐述于实施例中。
优选的是，在与野生型人类CD86竞争结合人类CTLA-4时本发明的多肽的CTLA-4结合域的IC50将是在相同的条件下野生型人类CD86的IC50的至多1/2、至多1/3、至多1/4、至多1/5、至多1/10、至多1/13、至多1/15、至多1/50、至多1/100、或至多1/300。最优选的是，CTLA-4结合域的IC50将是在相同的条件下野生型人类CD86的IC50的至多1/10或至多1/300。用于确定本发明的多肽的IC50的优选方法是经由ELISA。用于评估本发明的多肽的IC50的合适的ELISA测定法阐述于实施例中。
本发明的多肽的CTLA-4结合域也可以特异性结合CD28。也就是说，CTLA-4结合域可以比它结合除CTLA-4外的另一分子的结合亲和力更大的结合亲和力结合CD28。CTLA-4结合域可以比野生型人类CD86对人类CD28的亲和力更低的亲和力结合人类CD28。优选的是，CTLA-4结合域对人类CD28的Kd将是野生型人类CD86对人类CD28的Kd的至少2倍，优选地至少5倍，更优选地至少10倍。
本发明的多肽的CTLA-4结合域的结合特性也可以被表示为多肽结合两种靶标CTLA-4和CD28的能力的相对量度。也就是说，CTLA-4结合域的结合特性可以被表示为多肽结合CTLA-4的能力相对于它结合CD28的能力的相对量度。优选的是，当与人类野生型CD86结合CTLA-4相对于结合CD28的相应相对能力比较时，CTLA-4结合域具有增加的结合CTLA-4相对于结合CD28的相对能力。
当使用相同的参数(例如Kd、EC50)评估多肽对CTLA-4和CD28这两者的结合亲和力时，则所述多肽对每一种靶标的相对结合能力可以被表示为对每一种靶标的参数值的简单比率。该比率可以被称为多肽的结合比或结合强度比。对于用于评估结合亲和力的许多参数(例如Kd、EC50)，较低的值表示较高的亲和力。当在这种情况下时，对CTLA-4相对于对CD28的结合亲和力的比率优选地被表示为根据下式计算的单一数值：
结合比＝[对CD28的结合亲和力]÷[对CTLA-4的结合亲和力]
或者，如果使用较高值表示较高亲和力的参数来评估结合亲和力，则上式的倒数是优选的。在任一种情形下，本发明的多肽的CTLA-4结合域优选地具有比人类野生型CD86更高的结合比。应理解，直接比较给定多肽的结合比与另一多肽的结合比通常需要使用相同的参数来评估结合亲和力以及计算这两种多肽的结合比。
优选的是，多肽的结合比是通过测定所述多肽对每一种靶标的Kd，然后根据式[对CD28的Kd]÷[对CTLA-4的Kd]计算比率来计算的。该比率可以被称为多肽的Kd结合比。用于确定多肽对靶标的Kd的优选方法是SPR分析，例如使用BiacoreTM系统。用于本发明的多肽的SPR分析的合适的方案阐述于实施例中。根据该方法计算的本发明的多肽的CTLA-4结合域的结合比优选地是根据相同的方法计算的野生型人类CD86的结合比的至少2倍或至少4倍。
或者，多肽的结合比可以通过测定多肽对每一种靶标的EC50，然后根据式[对OX40的EC50]÷[对CTLA-4的EC50]计算比率来计算。该比率可以被称为多肽的EC50结合比。用于确定多肽对靶标的EC50的优选方法是经由ELISA。用于评估本发明多肽的EC50的合适的ELISA测定法阐述于实施例中。根据该方法计算的本发明多肽的CTLA-4结合域的结合比是根据相同的方法计算的野生型人类CD86的结合比的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
本发明的多肽的CTLA-4结合域可以具有与另一多肽交叉竞争结合CTLA-4的能力。举例来说，CTLA-4结合域可以与具有SEQ ID NO:6至24中的任一个的氨基酸序列的多肽交叉竞争结合CTLA-4。这样的交叉竞争多肽可以在标准结合测定法中被鉴定。举例来说，可以使用SPR分析(例如使用BiacoreTM系统)、ELISA测定法或流式细胞术来证实交叉竞争。
除了上述功能特征之外，本发明的多肽的CTLA-4结合域还具有某些优选的结构特征。CTLA-4结合域包含以下各项或由以下各项组成：(i)人类野生型CD86的单体可溶性细胞外域；或(ii)所述可溶性细胞外域的多肽变体，前提条件是所述多肽变体以比野生型人类CD86更高的亲和力结合人类CTLA-4。
人类野生型CD86的单体可溶性细胞外域的多肽变体包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列衍生自人类野生型CD86的氨基酸序列，特别是人类野生型CD86的可溶性细胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)，任选地缺少A24和P25。具体来说，变体包含其中当与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比时至少一个氨基酸被改变的氨基酸序列。“改变”意指与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比，至少一个氨基酸被缺失、插入或取代。“缺失”意指SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)中存在的至少一个氨基酸被去除，以使得所述氨基酸序列缩短一个氨基酸。“插入”意指至少一个另外的氨基酸被引入到SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)中，以使得所述氨基酸序列延长一个氨基酸。“取代”意指SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)中的至少一个氨基酸被替代氨基酸置换。
通常，当与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比时，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸被改变。通常，当与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比时，不多于10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、2个或1个氨基酸被改变。应理解，这些下限中的任一个可以与这些上限中的任一个组合以限定与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比容许的改变数量的范围。因此，例如，本发明的多肽可以包含如下的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比容许的氨基酸改变的数量在2个至3个、2个至4个、2个至5个、2个至6个、2个至7个、2个至8个、2个至9个、2个至10个、3个至4个、3个至5个、3个至6个等范围内。
特别优选的是，当与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比时，至少2个氨基酸被改变。优选的是，与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比容许的氨基酸改变的数量在2个至9个、2个至8个或2个至7个的范围内。
上述数量和范围可以用与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比的缺失、插入或取代的任何组合来实现。举例来说，与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比，可以仅存在缺失，仅存在插入，或仅存在取代，或者存在缺失、插入或取代的任何混合物。优选的是，所述变体包含其中与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比所有改变都是取代的氨基酸序列。也就是说，其中与SEQ ID NO:3的序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比没有氨基酸被缺失或插入的序列。在优选变体的氨基酸序列中，当与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比时，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸被取代，并且与SEQ ID NO:3的序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比，没有氨基酸被缺失或插入。
优选的是，与SEQ ID NO:3的序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比的改变在SEQID NO:3的FG环区域(位置114至121)和/或β折叠区域中。β折叠区域的链在SEQ ID NO:3中具有以下位置：A：27-31，B：36-37，C：54-58，C'：64-69，C”：72-74，D：86-88，E：95-97，F：107-113，G：122-133。
最优选的是，与SEQ ID NO:3的序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比的改变在选自以下各项的位置中的一个或多个处：32、48、49、54、74、77、79、103、107、111、118、120、121、122、125、127或134。本文的氨基酸位置的所有编号都是基于从N末端开始对SEQ IDNO:4中的氨基酸进行计数。因此，SEQ ID NO:3的N末端处的第一个位置被编号为24(参见图4中的示意图)。
特别优选的插入包括在位置116与117之间插入的单个另外的氨基酸和/或在位置118与119之间插入的单个另外的氨基酸。插入的氨基酸优选地是酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)或天冬氨酸(D)。
特别优选的取代在位置122处，它是精氨酸(R)。本发明的多肽优选地包括其中与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比至少位置122处被取代的氨基酸序列。位置122处最优选的取代是用赖氨酸(K)或天冬酰胺(N)置换精氨酸(R)，这是按优先顺序排列的。该取代可以被称为R122K/N。
其它优选的取代在位置107、121和125处，它们分别是亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和谷氨酸(Q)。除了位置122处的取代之外，本发明的多肽优选地包括如下的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比，位置107、121和125处的氨基酸中的至少一个也被取代。本发明的多肽的氨基酸序列也可以在位置32、48、49、54、64、74、77、79、103、111、118、120、127和134中的一个或多个处被取代。
位置107处最优选的取代是用异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)或精氨酸(R)置换亮氨酸(L)，这是按优先顺序排列的。该取代可以被称为L107I/F/R。类似的符号用于本文所述的其它取代。位置121处最优选的取代是用缬氨酸(V)置换异亮氨酸(I)。该取代可以被称为I121V。
位置125处最优选的取代是用谷氨酸(E)置换谷氨酰胺(Q)。该取代可以被称为Q125E。
在本发明的多肽的氨基酸序列中可能优选的其它取代包括：F32I、Q48L、S49T、V54I、V64I、K74I/R、S77A、H79D/S/A、K103E、I111V、T118S、M120L、N127S/D和A134T。
人类野生型CD86的所述可溶性细胞外域的特别优选的变体包含如表C中所示的SEQ ID NO:6至24的氨基酸序列中的任一个或由其组成。
SEQ ID NO:6至14所示的氨基酸序列可以任选地在N末端处包括另外的残基AP。SEQ ID NO:15至24所示的氨基酸序列可以任选地缺少N末端处的残基AP。在任一种情况下，这些残基对应于SEQ ID NO:3的A24和P25。
本发明的多肽的CTLA-4结合域可以包含人类野生型CD86的所述可溶性细胞外域的上述变体中的任一种或由其组成。也就是说，本发明的多肽的CTLA-4结合域可以包含如表C中所示的SEQ ID NO:6至24中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
所述结合域可以调节来自CTLA-4的信号转导，例如在向表达CTLA-4的细胞如T细胞施用时。优选的是，所述结合域减少(即抑制或阻断)所述信号转导并且从而增加所述细胞的激活。由于施用测试剂(例如所述结合域)所引起的CTLA-4信号转导和细胞激活的变化可以通过任何合适的方法来测定。合适的方法包括当在测试剂存在下或在合适的对照存在下时测定膜结合型CD86(例如在Raji细胞上)结合T细胞表面上表达的CTLA-4并且经由所述CTLA-4进行信号转导的能力。相对于在对照存在下T细胞IL-2产生水平和/或T细胞增殖，在测试剂存在下T细胞IL-2产生水平的增加或T细胞增殖的增加则表示经由CTLA-4的信号转导减少和细胞激活增加。该类型的典型测定法公开于US20080233122的实施例9中。
OX40的结合域
本发明的双特异性结合分子可以包含任何OX40结合域，例如抗OX40抗体作为结合域(例如作为B1)。
特异性结合OX40的抗体或其抗原结合片段具有某些优选的结合特征和功能作用，这在下文更详细地解释。所述抗体或其抗原结合片段在作为本发明的双特异性抗体的一部分被并入时优选地保留这些结合特征和功能作用。该结合域也可以独立于本发明的双特异性分子提供。
所述抗体优选地特异性结合OX40，即它结合OX40，但是不结合或以较低的亲和力结合其它分子。如本文所用的术语OX40通常是指人类OX40。人类OX40的序列如SEQ ID NO:51(对应于GenBank:NP_003318.1)所示。所述抗体对来自其它哺乳动物的OX40，例如来自非人类灵长类动物(例如食蟹猴(Macaca fascicularis/cynomolgus monkey)、恒河猴(Macaca mulatta))的OX40可以具有一定的结合亲和力。所述抗体优选地不结合鼠类OX40和/或不结合其它人类TNFR超家族成员，例如人类CD137或CD40。
所述抗体具有结合天然状态的OX40的能力，特别是结合定位在细胞表面上的OX40的能力。优选的是，所述抗体将特异性结合OX40。也就是说，本发明的抗体与OX40结合的结合亲和力将优选地大于它与另一分子结合的结合亲和力。
“定位在细胞表面上”如上文所定义。
所述抗体可以调节表达OX40的细胞的活性，其中所述调节是所述细胞活性的增加或降低，如上文所定义。所述细胞通常是T细胞。所述抗体可以提高CD4+或CD8+效应细胞的活性，或者可以降低调节性T细胞(T reg)的活性，如上文所述。
在任一种情况下，所述抗体的净效应将是效应T细胞，特别是CD4+效应T细胞的活性增加。用于测定效应T细胞活性变化的方法是众所周知的并且如上文所述。
所述抗体优选地以小于50×10-10M或小于25×10-10M，更优选地小于10×10-10M、9×10-10M、8×10-10M、7×10-10M或6×10-10M，最优选地小于5×10-10M的Kd值结合人类OX40。
举例来说，所述抗体优选地不结合鼠类OX40或任何其它TNFR超家族成员，如CD137或CD40。因此，通常，所述抗体对人类OX40的Kd将是对其它非靶分子如鼠类OX40、其它TNFR超家族成员、或环境中的任何其它无关物质或伴随物质的Kd的1/2，优选地1/5，更优选地1/10。更优选的是，Kd将是1/50，甚至更优选地1/100，并且还更优选地1/200。
该解离常数的值可以通过众所周知的方法直接测定，如上文所述。
本发明的多肽优选地能够以如下的亲和力结合它的靶标，所述亲和力是它与另一非靶分子结合的亲和力的至少2倍、10倍、50倍、100倍或更多倍。
因此综上所述，所述抗体优选地表现出以下功能特征中的至少一个：
I.以小于10×10-10M的KD值结合人类OX40；
II.不结合鼠类OX40；
III.不结合其它人类TNFR超家族成员，例如人类CD137或CD40。
所述抗体对OX40(通常是人类OX40)具有特异性并且可以包含以下各项中的任一个、两个、三个、四个、五个或所有六个：
(a)重链CDR1序列，所述序列具有8个氨基酸的长度并且包含共有序列：“G、F、T、F、G/Y/S、G/Y/S、Y/S、Y/S/A”；
(b)重链CDR2序列，所述序列具有8个氨基酸的长度并且包含共有序列：“I、G/Y/S/T、G/S/Y、S/Y、G/S/Y、G/S/Y、G/S/Y、T”；
(c)重链CDR3序列，所述序列具有9至17个氨基酸的长度并且包含共有序列：“A、R、G/Y/S/H、G/Y/F/V/D、G/Y/P/F、-/H/S、-/N/D/H、-/Y/G、-/Y、-/Y、-/W/A/V、-/A/Y、-/D/A/Y/G/H/N、Y/S/W/A/T、L/M/I/F、D、Y”。该定义内优选的重链CDR3序列包括具有10个氨基酸的长度并且包含共有序列“A、R、Y/H、D、Y、A/Y/G、S/W/A、M/L、D、Y”的CDR3序列；或具有11个氨基酸的长度并且包含共有序列“A、R、G/Y、V/F/Y、P、H、G/Y/H、Y、F/I、D、Y”的CDR3序列；
(d)轻链CDR1序列，所述序列由序列“Q、S、I、S、S、Y”组成；
(e)轻链CDR2序列，所述序列由序列“A、A、S”组成；
(f)轻链CDR3序列，所述序列具有8至10个氨基酸的长度并且包含共有序列：“Q、Q、S/Y/G、-/Y/H/G、-/S/Y/G/D、S/Y/G/D、S/Y/G/T、P/L、Y/S/H/L/F、T”。该定义内轻链CDR3序列的优选实例由序列“Q、Q、S、Y、S、T、P、Y、T”组成。
所述抗体可以至少包含如(c)中所定义的重链CDR3和/或如(f)中所定义的轻链CDR3。所述抗体可以包含(a)、(b)和(c)的所有三个重链CDR序列和/或(d)、(e)和(f)的所有三个轻链CDR序列。
示例性CDR序列列举在表A(1)和表A(2)中，即SEQ ID NO:52至88。
优选的抗OX40抗体可以至少包含如表A(1)的任何单个行中所限定的重链CDR3和/或如表A(2)的任何单个行中所限定的轻链CDR3。所述抗体可以包含表A(1)的单个行中所示的所有三个重链CDR序列(即给定“VH编号”的所有三个重链CDR)和/或表A(2)的单个行中所示的所有三个轻链CDR序列(即给定“VL编号”的所有三个轻链CDR)。
完整重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的实例示于表B中。还示出了编码每一个氨基酸序列的示例性核酸序列。表B中所述VH区和VL区的编号对应于如表A(1)和表A(2)中所用的编号系统。因此，例如，“1167，轻链VL”的氨基酸序列是包含表A(2)中所示的VL编号1167的所有三个CDR的完整VL区序列的实例，并且“1166，重链VH”的氨基酸序列是包含表A(1)中所示的VH编号1166的所有三个CDR的完整VH区序列的实例。
本发明的优选的抗OX40抗体包括包含特定VH编号的所有三个CDR的VH区和包含特定VL编号的所有三个CDR的VL区。举例来说：
-抗体可以包含VH编号1166的所有三个CDR和VL编号1167的所有三个CDR。这样的抗体可以被称为1166/1167。这样的抗体可以优选地包含如表B中所示的1166和1167的相应完整VH序列和VL序列(SEQ IDNO:91和89)。
-抗体可以包含VH编号1170的所有三个CDR和VL编号1171的所有三个CDR。这样的抗体可以被称为1170/1171。这样的抗体可以优选地包含如表B中所示的1170和1171的相应完整VH序列和VL序列(SEQ ID NO:95和93)。
-抗体可以包含VH编号1164的所有三个CDR和VL编号1135的所有三个CDR。这样的抗体可以被称为1164/1135。这样的抗体可以优选地包含如表B中所示的1164和1135的相应完整VH序列和VL序列(SEQ ID NO:99和97)。
-抗体可以包含VH编号1168的所有三个CDR和VL编号1135的所有三个CDR。这样的抗体可以被称为1168/1135。这样的抗体可以优选地包含如表B中所示的1168和1135的相应完整VH序列和VL序列(SEQ ID NO:101和97)。
-抗体可以包含VH编号1482的所有三个CDR和VL编号1483的所有三个CDR。这样的抗体可以被称为1482/1483。这样的抗体可以优选地包含如表B中所示的1482和1483的相应完整VH序列和VL序列(SEQ ID NO:105和103)。
-抗体可以包含VH编号1490的所有三个CDR和VL编号1135的所有三个CDR。这样的抗体可以被称为1490/1135。这样的抗体可以优选地包含如表B中所示的1490和1135的相应完整VH序列和VL序列(SEQ ID NO:107和97)。
-抗体可以包含VH编号1514的所有三个CDR和VL编号1515的所有三个CDR。这样的抗体可以被称为1514/1515。这样的抗体可以优选地包含如表B中所示的1514和1515的相应完整VH序列和VL序列(SEQ ID NO:111和109)。
-抗体可以包含VH编号1520的所有三个CDR和VL编号1135的所有三个CDR。这样的抗体可以被称为1520/1135。这样的抗体可以优选地包含如表B中所示的1520和1135的相应完整VH序列和VL序列(SEQ ID NO:113和97)。
-抗体可以包含VH编号1524的所有三个CDR和VL编号1525的所有三个CDR。这样的抗体可以被称为1524/1525。这样的抗体可以优选地包含如表B中所示的1524和1525的相应完整VH序列和VL序列(SEQ ID NO:117和115)。
-抗体可以包含VH编号1526的所有三个CDR和VL编号1527的所有三个CDR。这样的抗体可以被称为1526/1527。这样的抗体可以优选地包含如表B中所示的1526和1527的相应完整VH序列和VL序列(SEQ ID NO:121和119)。
-抗体可以包含VH编号1542的所有三个CDR和VL编号1135的所有三个CDR。这样的抗体可以被称为1542/1135。这样的抗体可以优选地包含如表B中所示的1542和1135的相应完整VH序列和VL序列(SEQ ID NO:123和97)。
所述抗体可以包含表B中所述的特定氨基酸序列中的任一个的变体或片段，前提条件是所述抗体结合人类OX40并且表现出功能特征I至III中的至少一个。这样的变体或片段通常可以保留表B的所述序列的CDR序列。
表B中所示的重链或轻链氨基酸序列中的任一个的片段可以包含来自所述氨基酸序列的至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个连续氨基酸。
表B中所示的重链或轻链氨基酸序列中的任一个的变体可以是所述序列的取代、缺失或添加变体，如上文所定义。
所述抗体可以与本文所述的特异性抗体中的任一种结合相同的表位。优选的是，它与被命名为1166/1167、1170/1171、1164/1135、1168/1135、1482/1483、1490/1135、1514/1515、1520/1135、1524/1525、1526/1527和1542/1135的抗体中的任一种结合相同的表位。
可以与本文所公开的任何VH区序列组合(以形成完整重链)的示例性重链恒定区氨基酸序列如IgG1重链恒定区序列描述于上文中。
可以与本文所公开的任何VL区序列组合(以形成完整轻链)的示例性轻链恒定区氨基酸序列如κ链恒定区序列描述于上文中。
本发明的双特异性多肽
本发明的多肽包含对OX40和CTLA-4具有特异性的结合域，即B1对OX40具有特异性，而B2对CTLA-4具有特异性。
举例来说，所述双特异性多肽可以是抗体“1166/1261”，其包含与SEQ ID No:125的CD86结构域融合的IgG轻链，和包含SEQ ID No:91的VH区的IgG重链。或者，所述双特异性多肽可包含所述序列的变体，其例如与SEQ ID No:125和/或91具有至少70％序列同一性，例如与SEQ ID No:125和/或91具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
所述实施方案的双特异性多肽能够比单独的OX40或CTLA-4的单独激动剂或这样的单独激动剂的组合在更大程度上调节免疫系统的细胞的活性。具体来说，双特异性多肽的施用产生更高水平的效应T细胞活性，特别是CD4+效应T细胞活性。效应T细胞活性的增加也比由单独施用单独的OX40或CTLA-4激动剂(或其组合)所引起的增加更局限，这是因为所述双特异性多肽仅在其中CTLA-4和OX40两者均高度表达的微环境中发挥最大的作用。肿瘤是这样的微环境。肿瘤浸润性调节性T细胞(Treg)表达高水平的CTLA-4和OX40，并且高于效应T细胞(CD4和CD8两者)。
效应T细胞活性的增加可以直接由经由激活OX40通路或经由阻断CTLA-4抑制通路来刺激效应T细胞所引起，或者可以间接地由Treg的消耗或下调，从而降低其免疫抑制作用所引起。Treg的消耗/下调可以由抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)机制所介导。与效应T细胞相比，CTLA-4和OX40在Treg上的高表达可能比单特异性抗体诱导显著更高的Treg杀伤。CTLA-4和OX40表达较低的效应T细胞不会通过该机制所消耗。总体来说，结果将是非常强效的、局限的免疫激活以用于立即产生杀肿瘤活性。
本发明的双特异性多肽对免疫系统细胞的作用的测量可以使用任何合适的测定法来实现。举例来说，效应T细胞的增加的活性可以通过如上文关于双特异性多肽的单个组分B1和B2所述的测定法来测量，并且包括相对于对照测量在双特异性多肽存在下CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的增殖或IL-2产生。相对于对照，增殖或IL-2产生的增加表示细胞激活增加。该类型的典型测定法公开于US20080233122的实施例9中。用于细胞增殖和/或IL-2产生的测定法是众所周知的并且也在实施例中举例说明。当在相同的测定法中评估时，双特异性分子通常将诱导效应T细胞的活性增加，所述增加是由结合相同靶标的单特异性药剂的组合所诱导的效应T细胞活性增加的至少1.5倍或至少2倍，更优选地3倍，最优选地5倍。
本发明的双特异性多肽能够与人类CTLA-4和人类OX40特异性结合，并且包含如上文所定义的B1和B2。
“能够特异性结合CTLA-4和OX40两者”意指根据上文对于每一个部分所提供的定义，B1部分特异性结合OX40并且B2部分特异性结合CTLA-4。优选的是，B1部分和B2部分对其相应靶标的结合特征在它们作为本发明的多肽的一部分存在时，在与在作为单独实体存在时B1部分和B2部分的所述特征相比时没有变化或基本上没有变化。
通常，这意味着所述双特异性分子将具有优选地与在单独存在时B1对OX40的Kd值基本上相同的对OX40的Kd。或者，如果所述双特异性分子具有相对于在单独存在时B1对OX40的Kd增加的对OX40的Kd，则所述增加是增加不多于10倍，优选地不多于9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍。所述双特异性分子优选地以小于50×10-10M，更优选地小于25×10-10M，最优选地小于20×10-10M的Kd值结合人类OX40。此外，所述双特异性分子将独立地具有优选地与在单独存在时B2对CTLA-4的Kd值基本上相同的对CTLA-4的Kd。或者，如果所述双特异性分子具有相对于在单独存在时B2对CTLA-4的Kd增加的对CTLA-4的Kd，则所述增加是增加不多于3倍，优选地不多于2倍。所述双特异性分子优选地以小于60×10-9M，更优选地小于25×10-9M，最优选地小于10×10-9M的Kd值结合人类CTLA-4。
换句话说，所述双特异性分子可以具有小于50×10-10M、25×10-10M或20×10-10M的对OX40的Kd，并且独立地具有小于60×10-9M、25×10-9M或10×10-9M的对CTLA-4的Kd。应理解，对于OX40所述的Kd值中的任一个可以独立地与对于CTLA-4所述的Kd值中的任一个组合以描述给定双特异性分子的结合特征。类似地，OX40结合的任何所述变化倍数可以独立地与CTLA-4结合的任何所述变化倍数组合以描述给定双特异性分子的结合特征。
在作为本发明的多肽的部分存在时B1部分和B2部分的结合特征可以通过任何合适的测定法来评估。具体来说，上文对于每一个单独的部分所述的测定法在B1和B2作为本发明的多肽的部分存在时也可以应用于它们。用于评估本发明的双特异性多肽的结合特征的合适的测定法也阐述于实施例中。
当在其中OX40和CTLA-4两者均高度表达的微环境中时，所述双特异性分子强效地激活免疫系统。通常，所述双特异性分子将增加CD4+效应细胞或CD8+效应细胞的活性，或者可以降低调节性T细胞(Treg)的活性。在任一种情况下，所述抗体的净效应将是效应T细胞，特别是CD4+效应T细胞的活性增加。当在相同的测定法中评估时，双特异性分子通常将诱导效应T细胞的活性增加，所述增加是由结合相同靶标的单特异性药剂的组合所诱导的效应T细胞活性增加的至少1.5倍或至少1.7倍，更优选地4.5倍，最优选地7倍。
用于测定效应T细胞活性变化的方法是众所周知的并且如先前所述的那样。用于细胞增殖和/或IL-2产生的测定法是众所周知的并且在实施例中举例说明。
举例来说，所述多肽可能能够特异性结合CTLA-4和OX40这两者，并且B1可以是对OX40具有特异性的抗体或其抗原结合片段；并且B2可以是对CTLA-4具有特异性的多肽结合域，所述多肽结合域包含以下或由以下组成：
i)SEQ ID NO:3的氨基酸序列；或
ii)其中在与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比时至少一个氨基酸被改变的氨基酸序列，前提条件是所述结合域以比野生型人类CD86更高的亲和力结合人类CTLA-4。
由所述多肽特异性结合的CTLA-4可以是灵长类动物或鼠类，优选地人类CTLA-4，和/或由所述多肽特异性结合的OX40可以是灵长类动物，优选地人类OX40。
本发明的双特异性多肽可以包含以任何合适的形式排列在一起的OX40结合域和CTLA-4结合域。应理解，在任何给定的双特异性形式中，OX40结合域和CTLA-4结合域可以各自独立地是全抗体或其抗原结合部分。不论所用的特定双特异性形式如何，本文所述的双特异性多肽和抗体通常可以通过基于OX40结合域(其可以被称为结合域1)的组成和CTLA-4结合域(其可以被称为结合域2)的组成的编号方案来参考。所述编号方案因此通常呈以下形式：OX40结合域(结合域1)的VH1/VL1和CTLA-4结合域(结合域2)的VH2/VL2，在一起写成VH1/VL1-VH2/VL2。应理解，该编号方案并不反映所述双特异性多肽或抗体中存在的结合域的总数，也不反映所述双特异性多肽或抗体中任何恒定区的存在或不存在，这两方面都是由所使用的双特异性抗体的具体形式决定的。结合域的总数和恒定区的存在或不存在可以根据本领域已知的任何合适的双特异性抗体形式。
双特异性多肽或抗体的许多合适的形式是本领域已知的并且本发明的双特异性多肽可以呈这些形式中的任一种。合适的形式包括图1和图14中所述的那些(还参见Kontermann和Brinkmann,2015,Drug Discov Today.838-847；其公开内容以引用的方式并入本文)。
在图14中，恒定区以填充的淡灰色示出；可变重链区VH1以方格黑白色示出；可变轻链区VL1以填充的白色示出；可变重链区VH2以填充的黑色示出；并且可变轻链区VL2以带有对角线的白色示出。因此，OX40结合域(被称为结合域1)通常被表示为一对方格黑白色结构域和填充的白色结构域；CTLA-4结合域(被称为结合域2)通常被表示为一对填充的黑色结构域和带有对角线的白色结构域。然而，在所示的所有形式中，应理解，结合域1和结合域2可以交换。也就是说，OX40结合域可以存在于图14中对于CTLA-4结构域所示的任何位置处，反之亦然。
双特异性多肽的优选形式是kih或“杵臼”排列，它是图14的第二行中所示的第一个。在该排列中，每一种抗体的重链的CH3结构域被突变成允许来自抗OX40抗体的重链与来自抗CTLA-4抗体的重链之间的异二聚化。每一条重链与其相应的轻链缔合以形成一个完整的OX40结合域和一个完整的CTLA-4结合域。可以对重链CH1区进行修饰以促进与正确轻链的缔合。Kih形式的双特异性抗体是本领域众所周知的。参见例如Ridgway等,1996；ProteinEng 9:617-621，该文献的公开内容以引用的方式并入本文。
本发明的双特异性抗体的另一种优选的形式是scFv2-Fc形式，它是图14的第二行中所示的第二个。在该排列中，对每一种靶标具有特异性的一个scFv与恒定免疫球蛋白结构域融合。单链可以与重链的Fc区融合，其中一条与Fc区的N末端特异性融合并且另一条与Fc区的C末端特异性融合(Park等,2000,Mol Immunol 37(18):1123-30；其公开内容以引用的方式并入本文)。
本发明的双特异性多肽的另一种优选形式是BITE/scFv2形式，它是图14的第二行中所示的第三种形式。在这种排列中，两个scFv(一个对OX40具有特异性并且另一个对CTLA-4具有特异性)与接头融合在一起(Brischwein等,2007,J Immunother 30(8):798-807；其公开内容以引用的方式并入本文)。所述接头可以任选地包括增加溶解度和血清半衰期的蛋白质，例如人类血清白蛋白(HSA)，从而形成scFv-HSA-scFv双特异性抗体，如图14的第四行中所示。
本发明的双特异性多肽的另一种优选形式是双可变域(DVD)免疫球蛋白，它是图14的第二行中所示的第四种形式。在这种排列中，第二可变域(VL2)与第一可变轻链(VL1)融合，并且第二可变重链(VH2)与IgG分子的第一可变重链(VH1)融合。VH1和VL1形成结合位点1并且VH2和VL2形成结合位点2，从而形成双特异性抗体(Wu,2007,Nat Biotechnol 25(11):1290-7；其公开内容以引用的方式并入本文)。
本发明的双特异性多肽的另一种优选形式是双亲和重靶向(DART)形式，其中用短的肽接头使VH1与VL2融合并且使VH2与VL1融合，从而迫使它们形成VH1/VL1和VH2/VL2结合位点。这种构建体可以通过在结合位点之间形成二硫桥来稳定化。DART形式可以与IgG Fc结构域融合，从而形成单价双特异性抗体(DART-Fc)或二价双特异性抗体(DART2-Fc)(Moore等,2011,Blood 117(17):4542-51)。DART形式、DART-Fc形式以及DART2-Fc形式示于图14的第三行中。
本发明的双特异性多肽的另一种优选形式是由对接和锁定技术(dock and locktechnology，DNL)产生的双特异性抗体。cAMP依赖性蛋白激酶A和A激酶锚定蛋白可以与针对每一种靶标的抗体、Fab片段或scFv融合，从而产生多价双特异性抗体，例如DNL-Fab3(Chang等,2007,Clin Cancer Res 13(18Pt 2):5586s-5591s，如图14的第四行中所示；其公开内容以引用的方式并入本文)。
本发明的双特异性多肽的特别优选的形式是scFv-IgG形式。该形式的四种不同的可能排列示于图14的顶行中。如图14中所示，在scFv-IgG形式中，抗OX40抗体是全IgG分子并且抗CTLA-4抗体是在四个一般位置(重链恒定区；轻链恒定区；重链可变区；轻链可变区)中的任一个处与抗OX40抗体连接的scFv抗体。在每种情况下，还设想了相反的排列。也就是说，抗CTLA-4抗体是全IgG并且抗OX40抗体是在四个一般位置中的任一个处与抗CTLA-4抗体连接的scFv。在scFv-IgG形式中，全IgG分子可以与scFv直接连接或者可以经由接头间接连接。示例性接头包括如SEQ ID NO:47至50或144中的任一个所示的氨基酸序列的肽。
在图14中所示的第一个scFv-IgG排列(图的顶部左侧)中，双特异性抗体包含多肽链的两个拷贝，所述多肽链包含重链可变序列VH1(方格黑白色)，所述VH1与重链恒定序列(Hc；填充的灰色)连接，所述重链恒定序列与scFv序列连接(任选地经由接头)，所述scFv序列由重链可变序列VH2(填充的黑色)和轻链可变序列VL2(带有对角线的白色)组成。该链可以被称为VH1-Hc-VH2/VL2(按N末端-C末端的顺序)。所述双特异性抗体还包含更小链的两个拷贝，该链包含轻链可变序列VL1(填充的白色)，所述VL1与轻链恒定序列(Lc；填充的灰色)连接，可以被称为VL1-Lc(按N末端-C末端的顺序)。图14中所示的替代scFv-IgG排列也包含各自两个拷贝的两条不同的链，它们可以类似方式描述。因此，在图22的顶行中从左向右阅读，第二个排列包含两条VH1-Hc链和两条VL1-Lc-VH2/VL2链。第三个排列包含两条VH1/VH2-VH1-Hc链和两条VL1-Lc链。第四个排列包含两条VH1-Hc链和两条VH1/VH2-VL1-Lc链。
在一个实施方案中，本发明的双特异性多肽具有图14中所示的第一个scFv-IgG排列(图的顶部左侧)。
本发明提供了一种单独的或优选地作为单特异性抗体或双特异性抗体的一部分的多肽，所述多肽包含表A-E中所示的氨基酸序列中的任一个或由其组成。在表A-E中所示的所有序列中，对应于重链恒定区或轻链恒定区的序列是示例性的并且可以被任何其它合适的重链或轻链恒定区序列置换。优选的重链和轻链恒定区序列是SEQ ID NO:135、136、137、138和139的那些。
应理解，本发明还涵盖其中非抗体多肽用作结合域的等效双特异性多肽。在本发明的一个实施方案中，本发明的多肽的B1部分是抗体或其抗原结合片段，其通常包含至少一条重链(H)和/或至少一条轻链(L)。本发明的多肽的B2部分可以与B1的任何部分连接，但是通常可以优选在N或C末端连接到所述至少一条重链(H)或至少一条轻链(L)。本发明的多肽的B2部分可以直接地或间接地经由任何合适的连接分子(接头)连接。
B1部分优选地包含至少一条重链(H)和至少一条轻链(L)并且B2部分优选地与所述重链(H)或所述轻链(L)的N末端或C末端连接。B1的示例性抗体由两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)组成。这样的抗体通常排列成两个臂，它们中的每一个具有被连接成异二聚体的一个H和一个L，并且这两个臂由H链之间的二硫键连接。因此，所述抗体实际上是由两个H-L异二聚体形成的同二聚体。本发明的多肽的B2部分可以与这样的抗体的两条H链或两条L链连接，或者仅与一条H链连接，或者仅与一条L链连接。
本发明的多肽因此可以替代地被描述为与对CTLA-4具有特异性的至少一个多肽结合域连接的抗OX40抗体或其抗原结合片段，所述多肽结合域包含人类野生型CD86的单体可溶性细胞外域或其变体或由人类野生型CD86的单体可溶性细胞外域或其变体组成。B1和B2的结合域可以是本发明的多肽中仅有的结合域。
本发明的多肽可以包含根据下式中的任一个排列(按方向N-C书写)的多肽：
(A)L-(X)n-B2；
(B)B2-(X)n-L；
(C)B2-(X)n-H；和
(D)H-(X)n-B2；
其中H是抗体(即B1)的重链，L是抗体(即B1)的轻链，X是接头并且n是0或1。在接头(X)是肽的情况下，它通常具有氨基酸序列SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:47)、SGGGGSGGGGSAP(SEQ ID NO:48)、NFSQP(SEQ ID NO:49)、KRTVA(SEQ ID NO:50)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:144)或(SG)m，其中m＝1至7。式(A)至(D)的示意图示于图1中。
本发明还提供了一种多肽，所述多肽由根据式(A)至(D)中的任一个排列的多肽组成。所述多肽可以作为单体提供或可以作为多聚蛋白如抗体的组分存在。所述多肽可以是分离的。这样的多肽的氨基酸序列的实例示于表D中。还示出了编码每一个氨基酸序列的示例性核酸序列。
B2部分可以通过任何合适的手段与本发明的多肽的任何部分或与接头连接。举例来说，多肽的各个部分可以通过化学缀合，例如以肽键连接。因此，本发明的多肽可以包含融合蛋白或由融合蛋白组成，所述融合蛋白包含B1(或其组成部分)和B2，它们任选地由肽接头连接。在这样的融合蛋白中，B1的一个或多个OX40结合域和B2的一个或多个CTLA-4结合域可以是仅有的结合域。
用于使分子与多肽缀合的其它方法是本领域已知的。举例来说，可以使用碳化二亚胺缀合(参见Bauminger和Wilchek,1980,Methods Enzymol.70:151-159；其公开内容以引用的方式并入本文)来使多种药剂(包括多柔比星(doxorubicin))与抗体或肽缀合。水溶性碳化二亚胺1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)对于使功能部分与结合部分缀合是特别有用的。作为另一个实例，缀合可以通过适当反应物的高碘酸钠氧化，接着还原性烷基化；或通过戊二醛交联来实现。然而，应当认识到，不论选择哪种方法，应当优选地确定B1部分和B2部分在作为本发明的多肽的部分存在时保留或基本上保留它们的靶标结合特性。
可以使用相同的技术使本发明的多肽与另一分子(直接地或间接地)连接。所述另一分子可以是治疗剂或可检测的标记。合适的治疗剂包括细胞毒性部分或药物。
本发明的多肽可以分离的形式或基本上分离的形式提供。基本上分离意指多肽可以基本上，但并非完全与任何周围介质分离。多肽可以与不会干扰它们的预期用途的载体或稀释剂混合并且仍被认为是基本上分离的。
本发明的示例性多肽可以包含表D中所示的氨基酸序列中的任一个或由其组成。在一个实施方案中，所述多肽包含选自SEQ ID NO 125至134的氨基酸序列或由选自SEQ IDNO 125至134的氨基酸序列组成，任选地其中所述多肽作为抗体的组成部分提供。
编码抗体的重链或轻链氨基酸序列的实例的代表性多核苷酸可以包含表B中所示的氨基酸序列中的任一个或由其组成。编码表D中所示的多肽的代表性多核苷酸可以包含也示于表D中的相应核苷酸序列或由其组成(内含子序列以小写字母示出)。编码B2部分的实例的代表性多核苷酸可以包含如表E中所示的SEQ ID NO:25至43中的任一个或由其组成。合适的多核苷酸可以替代地是如上文所定义的这些序列中的任一个的变体。
在本发明的一个实施方案中，双特异性多肽诱导针对肿瘤细胞的宿主免疫系统的协同激活，即与单个单特异性对应多肽(CTLA-4结合域，或单个OX40单特异性抗体)的组合作用相比，它能够诱导肿瘤内CD8/Treg比率的协同增加。
在本发明的一个实施方案中，双特异性多肽能够在宿主免疫系统中诱导针对肿瘤细胞的免疫记忆。
“免疫记忆”意指免疫系统快速且特异性地识别其体内先前遇到的抗原(例如肿瘤抗原)并启动相应免疫应答的能力。
本发明的相关方面
本发明的第二个方面包括根据本发明的第一个方面的双特异性多肽，所述双特异性多肽用于在个体中治疗或预防疾病或病状的方法中，如上文所述。
本发明的第三个方面是一种在个体中治疗或预防疾病或病状的方法，所述方法包括向个体施用根据本发明的第一个方面或第二个方面的双特异性多肽，如上文所述。
本发明的第四个方面是根据本发明的第一个方面的双特异性多肽的用途，其用于制造药物。
本发明的一个实施方案是根据本发明的第二个方面的双特异性多肽或根据本发明的第三个方面的方法，其中所述疾病或病状是癌症，并且任选地其中所述个体是人类，或根据本发明的第四个方面的用途，其中所述药物是用于治疗癌症，任选地其中所述个体是人类。
在另一个实施方案中，所述方法包括全身地或局部地，例如在肿瘤部位处或向肿瘤引流淋巴结中施用所述双特异性抗体，如上文所述。
所述癌症可以是前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴母细胞性白血病、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、头颈部癌、肝癌、皮肤癌、淋巴瘤或胶质母细胞瘤。
本发明的第五个方面是编码根据本发明的第一个方面或第二个方面的双特异性多肽的至少一条多肽链的多核苷酸，如上文所述。
本发明的第六个方面是一种组合物，所述组合物包含根据本发明的第一个方面或第二个方面的双特异性多肽和至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。
在本发明的一个实施方案中，根据实施方案的第一个方面或第二个方面的多肽与额外的治疗部分缀合。
药物组合物将以药物有效剂量施用于患者。如本文所用，“治疗有效量”或“有效量”或“治疗有效”是指对于给定的病状和施用方案提供治疗效果的量。这是经计算可与所需的添加剂和稀释剂(即载体或施用媒介物)结合产生所需的治疗效果的活性物质的预定量。此外，其意在是指足以减少并且最优选防止宿主的活性、功能和反应的临床上显著不足的量。或者，治疗有效量足以引起宿主临床上显著病状的改善。如本领域技术人员所理解，化合物的量可以根据其比活性而变化。合适的剂量可以包含经计算可与所需稀释剂结合产生所需的治疗效果的活性组合物的预定量。在用于制造本发明的组合物的方法和用途中，提供了治疗有效量的活性组分。如本领域中众所周知的，治疗有效量可以由普通熟练的医学或兽医工作者基于患者的特征例如年龄、体重、性别、状况、并发症、其它疾病等来确定。药学有效剂量的施用既可以单个剂量单位或者几个较小剂量单位的形式单次施用，也可以特定的时间间隔多次施用细分剂量来进行。或者，剂量可以在一段长时间内连续输注提供。
特别优选的组合物被配制用于全身施用。
所述组合物可以优选地被配制用于在一段时间内持续释放。因此，所述组合物可以在有助于持续释放的基质中提供或作为所述基质的一部分提供。优选的持续释放基质可以包括montanide或γ-聚谷氨酸(PGA)纳米颗粒。
取决于所使用的多肽的功效/毒性，可以各种浓度配制抗体多肽。举例来说，制剂可包含浓度为0.1μM至1mM，更优选1μM至500μM、500μM至1mM、300μM至700μM、1μM至100μM、100μM至200μM、200μM至300μM、300μM至400μM、400μM至500μM、500μM至600μM、600μM至700μM、800μM至900μM或900μM至1mM的活性抗体多肽。通常，所述制剂包含浓度为300μM至700μM的活性抗体多肽。
通常，人类患者中抗体多肽(具有或不具有治疗部分)的治疗剂量将在每次施用100μg至700mg(基于70kg体重)的范围内。举例来说，每次施用的最大治疗剂量可以在0.1至10mg/kg的范围内，例如0.1至5mg/kg或1至5mg/kg或0.1至2mg/kg。应理解，可以按照肿瘤学家/医师所确定的不同时间间隔来施用这种剂量；例如，剂量可以每天一次、每周两次、每周一次、每两周一次或每月一次施用。
本领域技术人员应理解，本发明的药物组合物可以单独施用或与用于治疗癌症的其它治疗剂组合施用，所述其它治疗剂例如抗代谢物，烷化剂，蒽环类和其它细胞毒性抗生素，长春花生物碱，依托泊苷，铂化合物，紫杉烷类，拓扑异构酶I抑制剂，其它细胞抑制药物，抗增殖免疫抑制剂，皮质类固醇，性激素和激素拮抗剂，以及其它治疗性抗体(例如针对肿瘤相关抗原或免疫检查点调节剂的抗体)。
举例来说，本发明的药物组合物可以与结合选自PD-1/PD-L1、CD137、CD40、GITR、LAG3、TIM3、CD27和KIR的靶标的免疫治疗剂组合施用。
因此，本发明涵盖了组合疗法，其包含本发明的双特异性多肽以及可有效治疗癌症的另外的免疫治疗剂，所述免疫治疗剂特异性结合免疫检查点分子。应理解，可以通过减弱抑制性免疫检查点分子的功能和/或通过激活刺激性免疫检查点或共刺激分子的功能来介导另外的免疫治疗剂的治疗益处。
在一个实施方案中，所述另外的免疫治疗剂选自：
(a)抑制PD-1和/或PD-L1的功能的免疫治疗剂；
(b)激活CD137的功能的免疫治疗剂；和
(c)激活CD40的功能的免疫治疗剂。
因此，所述另外的免疫治疗剂可以是能够抑制PD1功能的PD1抑制剂，例如抗PD1抗体或其抗原结合片段(例如，纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、拉姆珠单抗(Lambrolizumab)、PDR-001、MEDI-0680和AMP-224)。或者，PD1抑制剂可以包含以下或由以下组成：能够抑制PD1功能的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段(例如，德瓦鲁单抗(Durvalumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)和MDX-1105)。
在另一个实施方案中，所述另外的免疫治疗剂激活CD137，例如激动性抗CD137抗体或其抗原结合部分。
在另一个实施方案中，所述另外的免疫治疗剂激活CD40，例如激动性抗CD40抗体或其抗原结合部分。
本领域技术人员将理解，两种活性剂(如上所述)的存在可以在治疗受试者的肿瘤中提供协同益处。“协同”包括两种药剂组合的治疗效果(例如，如通过参考生长速率或肿瘤大小所确定)大于两种药剂单独施用的累加治疗效果。可以通过在实体肿瘤的相关细胞系模型中单独和组合测试活性剂来鉴定这种协同作用。
试剂盒也包括在本发明的范围内，所述试剂盒包括本发明的多肽或其它组合物和使用说明书。所述试剂盒可进一步包含一种或多种额外的试剂，例如如上文所讨论的额外的治疗剂或预防剂。
附图说明
现在将参考以下附图描述体现本发明某些方面的优选的非限制性实施例：
图1示出了本发明的双特异性多肽的示例性排列的结构的示意图。抗OX40抗体可变域以黑色填充；恒定域以白色填充。CTLA-A结合域以对角线加阴影。
图2示出了如通过ELISA结合测定法所测定的本发明多肽的CTLA-4结合域的CTLA-4结合特性。
图3示出了如通过ELISA抑制测定法所测定的本发明多肽的CTLA-4结合域的CTLA-4结合特性。
图4提供了本文所公开的人类野生型CD86氨基酸序列的示意图。(A)是不具有N末端信号序列的人类CD86的单体可溶性细胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)；(B)是包括N末端信号序列的人类野生型CD86的单体细胞外和跨膜结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)；(C)是人类CD86的全长氨基酸序列(Genbank ABK41931.1；SEQ ID NO:44)。A中的序列可以任选地缺少N末端处，即位置24和25处的丙氨酸和脯氨酸(以粗体示出)。B和C中的信号序列加下划线。氨基酸位置的编号是基于SEQ ID NO:4和44，从N末端开始。
图5示出了抑制ELISA的结果，所述结果表明本发明多肽的CTLA-4结合域对人类CTLA-4和鼠类CTLA-4这两者均具有类似量值的结合亲和力。
图6是如通过表面等离子体共振所测定的示例性抗OX40抗体的解离速率常数与缔合速率常数的关系图。
图7示出了通过流式细胞术测量的示例性抗OX40抗体与在CHO细胞上过表达的人类OX40的结合。
图8示出了当在体外与不同的示例性抗OX40抗体一起温育时T细胞的IL-2产生的水平。y轴是测试抗体的IL-2产生的最高值/参考抗体的最高值的比率。示出了来自至少4个供体的平均值和SEM值。
图9示出了示例性双特异性分子与单独的靶标OX40和CTLA4的结合的ELISA测定法的结果。
图10示出了示例性双特异性分子与OX40和CTLA4这两者的结合的表面等离子体共振分析的结果。使不同的双特异性抗体在传感器上通过(开始由I指示)。在表面接近饱和时，施加缓冲液(II)，并且随后使CTLA-4(III)在传感器表面上通过，从而产生第二缔合阶段，由实线表示。在三分钟后，施加缓冲液(IV)，并且随后的解离阶段反映了CTLA-4和OX40Ab这两者的解离。作为对照，仅添加缓冲液，而不添加CTLA-4，由虚线表示。
图11示出了ELISA测定法的结果，所述结果显示示例性双特异性分子同时与OX40和CTLA-4这两者的结合。
图12示出了当在体外与滴定系列中不同的示例性双特异性分子一起温育时T细胞的IL-2产生的水平：A)1164/1141和1166/1141；B)1168/1141和1170/1263；C)1514/1581和1520/1141；D)1526/1585和1542/1141；或针对每一种靶标的两种相应的单特异性抗体(单克隆OX40抗体或与同种型IgG抗体偶联的CTLA-4结合域：1756/1757)的组合。在包被有CD3(UCHT1)和CTLA-4(Orencia)的U形非组织培养处理的96孔板中进行所述测定法。呈现了来自4个供体的平均值。
图13示出了当在体外与1.49nM的不同示例性双特异性分子或针对每一种靶标的相应单特异性抗体(抗OX40 mAb或与同种型抗体偶联的CTLA-4结构域：1756/1757)的组合一起温育时T细胞的IL-2产生的水平。在存在或不存在CTLA-4(Orencia)的情况下(用+或-指示)，在包被有抗CD3(UCHT1)的U形非组织培养处理的96孔板中进行所述测定法。呈现了来自4个供体的平均值和SD。
图14示出了本发明的双特异性抗体的示例性形式的结构的示意图。在每一种形式中，恒定区以填充的淡灰色示出；可变重链区VH1以方格黑白色示出；可变轻链区VL1以填充的白色示出；可变重链区VH2以填充的黑色示出；并且可变轻链区VL2以带有对角线的白色示出。OX40结合域(结合域1)通常被表示为一对方格黑白色结构域和填充的白色结构域(VH1/VL1)；CD137结合域(结合域2)通常被表示为一对填充的黑色结构域和带有对角线的白色结构域(VH2/VL2)。然而，在所示的所有形式中，应理解，结合域1和结合域2可以交换。也就是说，OX40结合域可以存在于该图中对于CD137结构域所示的位置处，反之亦然。此外，结合域2可以按不同的可变重链和轻链顺序，即按VH2/VL2或VL2/VH2顺序存在。
图15示出了与由靶向CTLA-4和OX40的示例性双特异性抗体诱导的ADCC相比，由单独和组合的单特异性CTLA-4(具有CTLA-4结合部分、即结构域的对照IgG)和OX40(1166/1167)结合分子在不同浓度下的ADCC诱导。
图16.将表达CTLA-4和OX40两者的CHO细胞用递减浓度的1166/1261或者两种单特异性结合剂1166/1167(OX40特异性单克隆抗体)和具有CTLA-4结合部分的对照IgG(单特异性CTLA4结合IgG融合蛋白)(200nM-0.0034nM)染色，接着用PE缀合的抗人类IgG染色。使用流式细胞术检测荧光。‘Ctr IgG’是阴性同种型对照。
图17.将HEK-CTLA4和CHO-OX40分别用PKH26和PKH67染色并且与1166/1261或两种单特异性OX40结合分子和CTLA-4结合分子(1166/1167和具有CTLA-4结合部分的对照IgG)的组合一起温育。使用流式细胞术定量双阳性/聚集细胞的百分比(代表性实验)。
图18.在施用后的不同时间点测量的双特异性OX40-CTLA-4抗体1166/1261和单特异性OX40抗体1166/1167的血浆水平。使用两种不同的ELISA方法，即ELISA-1，其中将OX40包被到孔上并且使用抗Fc检测结合；以及ELISA-2，其中将OX40包被到孔上并且使用生物素化的CTLA-4进行检测。
图19.在第0天将HT-29结肠癌细胞(4×106个)皮下接种到右后侧腹/背部。在同一天经腹膜内施用人类PBMC细胞(7×106个)。通过在第6天、第13天以及第20天进行腹膜内注射(667nmol/剂)进行处理。N(小鼠)＝5只/供体，n(供体＝4)，来自HT29应答者的汇总数据。
图20示出了使用MC38结肠癌模型在hOX40tg小鼠中研究的双特异性OX40-CTLA-4抗体的药效学作用。来自两个独立实验的汇总数据显示，与两个单特异性对应物相比，双特异性抗体对肿瘤内CD8/Treg比率具有统计学显著作用。
图21示出了使用MC38结肠癌模型的hOX40tg小鼠的脾脏和肿瘤组织中不同T细胞群体的相对水平。将双特异性抗体的施用作用与单特异性对应物进行比较。双特异性抗体减少肿瘤内Treg，但不影响全身性T细胞。
图22示出了在人类OX40的转基因小鼠中使用MC38结肠癌模型研究的双特异性OX40-CTLA-4抗体的抗肿瘤作用。所述双特异性抗体显示对肿瘤体积抑制和存活率增加具有统计学显著作用。就存活率和肿瘤生长抑制而言，抗肿瘤作用比单特异性对照抗体更强。
图23示出了由双特异性OX40-CTLA抗体1166/1261诱导的抗肿瘤功效。使用hOX40转基因小鼠在MB49膀胱癌模型中研究了抗肿瘤功效。在第7、10和13天经腹膜内对带有皮下MB49肿瘤的小鼠进行腹膜内治疗。A)1166/1261或单克隆对应物引起的肿瘤体积抑制。B)由1166/1261诱导的存活率增加。肿瘤体积图是几次执行的示例性图，肿瘤体积平均值+/-SEM，n＝10。Kaplan-Meyer存活率，来自两个单独实验的汇总数据，n＝18。
图24示出了免疫记忆，这通过用与特异性肿瘤相同的肿瘤或用无关肿瘤再次攻击完全应答者来证实。A)用相同肿瘤再次攻击小鼠。初始小鼠用作对照。(n＝5)。B)在双肿瘤模型中在一个侧腹用一个特异性肿瘤MB49和在另一侧腹用一个无关肿瘤PANC02再次攻击小鼠。示例性实验，图显示平均值+/-SEM，n＝6。
图25示出了双特异性抗体对Treg的抗肿瘤作用。在第10、13和16天，利用腹膜内注射1166/1261或利用单克隆对应物(1.33μmol)治疗带有皮下MB49膀胱癌的小鼠。最后一次注射后24小时，收集肿瘤和脾脏，并对Treg和效应细胞进行染色。A)肿瘤中(CD45的)Treg百分比；B)肿瘤中(CD45的)CD8细胞；C)肿瘤中的CD8/Treg比率；和D)脾脏中的CD8/Treg比率。该图显示平均值+SD。
图26示出了双特异性抗体对MC38结肠癌的抗肿瘤作用。在第10、13和16天，利用腹膜内注射1166/1261治疗带有皮下MC38结肠癌的小鼠。在最后一次注射后24小时，收集肿瘤，并对效应细胞和激活标志物进行染色。A)肿瘤中的CD107+CD8细胞百分比；(B)肿瘤中的颗粒酶B+CD8细胞百分比。该图显示平均值+SD。
图27示出了在具有MC38结肠癌的hOX40tg小鼠中的肿瘤定位。在第17天，用媒介物、IgG1同种型对照或1166/1261经腹膜内治疗带有皮下MC38结肠癌的小鼠。注射后24小时，收集肿瘤和脾脏，用活力标志物和针对CD45和hIgG的抗体染色，接着进行流式细胞术分析。比较不同组之间(A)肿瘤和(B)脾脏中的活CD45+细胞中hIgG+细胞的百分比。该图显示平均值+SEM。
图28示出了PD-1抗体与1166/1261的组合作用。在MC38结肠癌模型中研究了存在或不存在PD-1治疗下1166/1261的抗肿瘤作用。在第7、10和13天经腹膜内进行腹膜内治疗(1166/1261，1.33μmol或250μg PD-1)。A)1166/1261联合或不联合PD-1的肿瘤体积抑制。B)存在或不存在PD-1治疗下1166/1261诱导的存活率增加。肿瘤体积图是示例性图，并呈现平均肿瘤体积+/-SEM或Kaplan-Meyer存活率，n＝9-10。
图29示出了PD-1抗体与1166/1261的组合作用。在CT26结肠癌模型中研究了存在或不存在PD-1治疗下1166/1261的抗肿瘤作用。在第7、10和13天进行腹膜内治疗。A)1166/1261联合或不联合PD-1的肿瘤体积抑制。B)存在或不存在PD-1治疗下1166/1261的Kaplan-Meyer存活率。该图示出了汇总在一起的两个独立实验，肿瘤体积平均值+/-SEM，n＝18。
图30示出了1166/1261在胰腺癌中的抗肿瘤作用。在使用PANC02胰腺癌的人类OX40转基因小鼠中研究了双特异性OX40-CTLA-4抗体1166/1261的抗肿瘤作用。第7、10和13天进行腹膜内治疗。A)肿瘤体积抑制。B)存活率增加。图显示平均肿瘤体积+/-SEM，或Kaplan Meyer存活率n＝18。
图31示出了1166/1261和同种型对照通过在CTLA-4阻断报告基因测定法中阻断Jurkat报告细胞上的CTLA-4来诱导T细胞激活的能力。来自两个实验的编译数据。
图32示出了T细胞激活。A)用1166/1261、单特异性抗体的组合或同种型对照刺激人类CD3+T细胞后的IFN-γ产生。该实验在涂有CTLA-4和αCD3的板中进行。来自4个供体的汇编数据。B)在表达CTLA-4的HEK细胞和αCD3珠粒的存在下，用1166/1261或单特异性抗体的组合刺激的CD4+T细胞的IL-2释放。来自6个供体的汇编数据。C)响应于1166/1261或同种型对照的CD4+T细胞的增殖。来自6个供体的汇编数据。
图33示出了T细胞激活。在表达CD64的CHO细胞和αCD3珠粒存在下，用1166/1261或单特异性抗体的组合刺激的CD4+T细胞的IL-2释放。来自8个供体的汇编数据。
图34示出了1166/1261的ADCC诱导。A)响应于1166/1261、单克隆对应物的混合物或同种型对照的FcγRIIIa(V158)效应细胞激活。用αCD3/αCD28珠粒激活48小时的纯化Treg用作靶细胞。数据呈现为相比于培养基对照的诱导倍数。B)在激活之前和之后，通过流式细胞术在Treg上测定OX40和CTLA-4的表达。示出了三个供体的平均值。
图35示出了响应于1166/1261的ADCC。用αCD3/αCD28珠粒激活48小时的纯化Treg用作靶细胞并且同种异体NK细胞用作效应细胞。在1166/1261或同种型对照的存在下，以15:1比率培养效应细胞和靶细胞。4小时后，测量LDH释放。来自7个供体的汇编数据。
图36示出了通过1166/1261处理来激活恒河猴T细胞激活。A)中枢记忆CD4+细胞的增殖；B)CD4+T细胞的晚期激活。
序列说明
SEQ ID NO:1是人类CTLA-4的氨基酸序列(对应于GenBank:AAD00698.1)。
SEQ ID NO:2是人类CD28的氨基酸序列(对应于GenBank:AAA51944.1)。
SEQ ID NO:3是不包括来自N末端的具有23个氨基酸的信号序列的人类野生型CD86的单体细胞外域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是包括N末端信号序列的人类野生型CD86的单体细胞外和跨膜结构域的氨基酸序列(参见图4)。本文的氨基酸位置的所有编号均是基于从N末端开始的SEQ IDNO:4中的位置。因此，SEQ ID NO:3的N末端处的丙氨酸被编号为24。
SEQ ID NO:5是Peach等(Journal of Biological Chemistry 1995,第270(36)卷,21181-21187)中所公开的人类CD86的细胞外域的突变形式的氨基酸序列。野生型序列的位置79处的H在SEQ ID NO:5的序列的相应位置处被A取代。该改变在本文被称为H79A。在全文对于本文所提到的其它氨基酸取代使用等同的命名法。位置的编号是基于如上文所概述的SEQ ID NO:4。
SEQ ID NO:6至24是本发明的特定蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25至43分别是编码SEQ ID NO:6至24中的每一个的氨基酸序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:44是人类CD86的全长氨基酸序列(对应于GenBank:ABK41931.1)。
SEQ ID NO:45是鼠类CTLA-4的氨基酸序列(对应于UniProtKB/Swiss-Prot:P09793.1)。
SEQ ID NO:46是鼠类CD28的氨基酸序列(对应于GenBank:AAA37395.1)。
SEQ ID NO:47至50是可以用于本发明的双特异性多肽中的各种接头。
SEQ ID NO:51是人类OX40的氨基酸序列(对应于GenBank:NP_003318.1)。
SEQ ID NO:52至88是本文公开的抗OX40抗体的示例性CDR序列。
SEQ ID NO:89至124是本文公开的抗体的重链可变区和轻链可变区的示例性氨基酸序列和核苷酸序列。
SEQ ID NO:125至134是本文公开的双特异性多肽的示例性氨基酸序列和核苷酸序列。
SEQ ID NO:135是示例性重链恒定区氨基酸序列。
SEQ ID NO:136是示例性轻链恒定区氨基酸序列。
SEQ ID NO:137是具有铰链区(位置108)中从Ser向Pro的突变和CH3区(位置315)中从His向Arg的突变的示例性修饰的人类重链IgG4恒定区序列。突变引起血清半衰期缩短和IgG4的核心铰链的稳定化，从而使得IgG4更稳定，进而防止Fab臂交换。
SEQ ID NO:138是示例性野生型人类重链IgG4恒定区序列。那是缺少SEQ ID NO:137的突变的序列。
SEQ ID NO:139是在铰链区(位置108)中具有从Ser向Pro的单一突变的示例性修饰的人类重链IgG4恒定区序列。突变引起IgG4的核心铰链的稳定化，从而使得IgG4更稳定，进而防止Fab臂交换。
SEQ ID NO:140是编码SEQ ID NO:137的IgG4恒定区的示例性cDNA序列(即缺少内含子)。
SEQ ID NO:141是编码SEQ ID NO:137的IgG4恒定区的示例性基因组DNA序列(即包括内含子)。
SEQ ID NO:142是编码SEQ ID NO:138的IgG4恒定区的示例性cDNA序列(即缺少内含子)。
SEQ ID NO:143是编码SEQ ID NO:138的IgG4恒定区的示例性基因组DNA序列(即包括内含子)。
SEQ ID NO:144是可以用于本发明的双特异性多肽中的接头。
SEQ ID NO:145和146分别是编码SEQ ID NO:135的IgG1恒定区的示例性cDNA序列和基因组DNA序列。
SEQ ID NO:147是编码SEQ ID NO:136的轻链κ区的示例性DNA序列。
SEQ ID NO:148是编码SEQ ID NO:139的IgG4区的示例性cDNA序列(即缺少内含子)。
SEQ ID NO:149是编码SEQ ID NO:139的IgG4区的示例性基因组DNA序列(即包括内含子)。
表格(序列)
表A(1)–示例性重链CDR序列(OX40抗体)
表A(2)–示例性轻链CDR序列(OX40抗体)
| VL编号 | SEQ | L CDR1 | SEQ | L CDR2 | SEQ | L CDR3 |
| 1167 | 80 | QSISSY | 81 | AAS | 82 | QQYYWYGLST |
| 1171 | 作为1167 | 作为1167 | 83 | QQGHGSYPHT | ||
| 1135 | 作为1167 | 作为1167 | 84 | QQSYSTPYT | ||
| 1483 | 作为1167 | 作为1167 | 85 | QQYGSLLT | ||
| 1515 | 作为1167 | 作为1167 | 86 | QQGDYTLFT | ||
| 1525 | 作为1167 | 作为1167 | 87 | QQYGPSGLFT | ||
| 1527 | 作为1167 | 作为1167 | 88 | QQYGSDSLLT |
表B–示例性序列(OX40抗体)
表C-人类CD86的结构域的示例性变体
表D-OX40和CTLA-4的示例性多肽
表E-编码B2的示例性多核苷酸–CTLA-4
其它序列
SEQ ID NO:1(人类CTLA-4)
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIAKEKKPSYNRGLCENAPNRARM
SEQ ID NO:2(人类CD28)
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO:3
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA
SEQ ID NO:4
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP
SEQ ID NO:5
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVASKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA
SEQ ID NO:44(人类CD86)
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF
SEQ ID NO:45(鼠类CTLA-4)
MACLGLRRYKAQLQLPSRTWPFVALLTLLFIPVFSEAIQVTQPSVVLASSHGVASFPCEYSPSHNTDEVRVTVLRQTNDQMTEVCATTFTEKNTVGFLDYPFCSGTFNESRVNLTIQGLRAVDTGLYLCKVELMYPPPYFVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN
SEQ ID NO:46(鼠类CD28)
MTLRLLFLALNFFSVQVTENKILVKQSPLLVVDSNEVSLSCRYSYNLLAKEFRASLYKGVNSDVEVCVGNGNFTYQPQFRSNAEFNCDGDFDNETVTFRLWNLHVNHTDIYFCKIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRLLQVTTMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP
SEQ ID NO:51(人类OX40)
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:140
SEQ ID NO:141
SEQ ID NO:142
SEQ ID NO:143
SEQ ID NO:145
SEQ ID NO:146
SEQ ID NO:147
SEQ ID NO:148
SEQ ID NO:149
具体实施方式
实施例
进一步通过以下实施例来说明本发明，所述实施例不应当被视为构成进一步的限制。在整个本申请中所引用的所有附图以及所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容明确地以引用的方式并入本文。
实施例1-CTLA-4结合域
如WO 2014/207063(参见实施例)中所述选择和表达CTLA-4结合域多肽，并且通过如下文所述的ELISA和表面等离子体共振中的至少一种测定与CTLA-4的结合。
结合ELISA
通过在4℃温育过夜将96孔平底高结合板(Greiner,#655074)用CTLA4-Fc(Fitzgerald，#30R-CD152)或CD28-Fc(R&D systems，342-CD)包被。将板洗涤(洗涤缓冲液：PBS+0.05％Tween 20(PBST)Medicago，#09-9410-100)，然后在PBST+3％BSA(Merck，#1.12018.0100)中封闭。将板再次洗涤并且将样品或对照(连续稀释1/5，200-0.001μg/ml)添加到孔中。将样品在室温下温育1小时，然后洗涤。添加检测抗体山羊抗人类IgG Fcγ-HRP(Jackson，#109-035-098)并且随后使用SuperSignal Pico化学发光底物(ThermoScientific，#37069)将板显影并且使用Envision读数器(Perkin Elmer)检测。计算对CTLA4和CD28这两者的EC50值。计算每一种多肽的结合比(EC50结合比＝[对CD28的EC50]÷[对CTLA-4的EC50])并且示于表1.1中。
表面等离子体共振
使用常规的胺偶联将CTLA4-Fc(Fitzgerald，#30R-CD152)或CD28-Fc(R&DSystems，342-CD)固定到BiacoreTM传感器芯片CM5。在HBS-P(GE，BR-1003-68)中以30μl/ml的流速分析CD86突变型分子和对照(连续稀释1/2，100nM-1.5nM)的结合。跟踪缔合3分钟并且跟踪解离10分钟。使用5mM NaOH将再生进行两次，持续30秒。使用BIAevaluation 4.1软件计算动力学参数和亲和常数(表1.3)。
抑制ELISA
通过在4℃温育过夜将96孔平底板高结合板(Greiner，#655074)用野生型CD86-Fc(R&D Systems，#7625-B2)包被。将板洗涤(洗涤缓冲液：PBS+0.05％Tween 20(PBST)Medicago，#09-9410-100)，然后在PBST+3％BSA(Merck，#1.12018.0100)中封闭。在室温将样品(CD86突变型或野生型蛋白；连续稀释1/4，从30000ng/ml到0.3ng/ml)与生物素化的CTLA4(Fitzgerald，#30R-CD152)一起温育1小时，然后将混合物添加到ELISA板中的封闭的孔中。使用抗生蛋白链菌素-HRP(Pierce，#21126)进行检测并且随后使用SuperSignalPico化学发光底物(Thermo Scientific，#37069)将板显影，并且使用Envision读数器(Perkin Elmer)检测。结果示于图2中。计算IC50值并且示于下表中。所测试的所有分子都显示出比野生型和H79A两者更好的IC50值，最好的突变型CD86分子的IC与野生型相比改进了超过100倍。示例性分子900、901、904、906、907、908、910、915和938的结果示于表1.1中。Kd结合比＝[对CD28的Kd]÷[对CTLA-4的Kd]。示例性分子900、901、904、906、907、908、910、915和938的完全氨基酸序列分别作为SEQ ID NO:6至14提供。
表1.1
*在BIAcoreTM分析或结合ELISA中均未发现可检测到的结合
示例性分子1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046和1047的结果示于表1.2和1.3中，以及图2和图3中。示例性分子1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046和1047的完全氨基酸序列分别作为SEQ ID NO:15至24提供。
表1.2
| 样品 | EC50 | 样品 | IC50 |
| 1038 | 0.14 | - | - |
| 1039 | 0.039 | - | - |
| 1040 | 0.0076 | 1040 | 0.049 |
| 1041 | 0.087 | 1041 | 3.1 |
| 1042 | 0.29 | 1042 | 4.3 |
| 1043 | 0.035 | 1043 | 4.0 |
| 1044 | 0.029 | 1044 | 1.4 |
| 1045 | 0.047 | 1045 | 2.6 |
| 1046 | 0.019 | 1046 | 1.1 |
| 1047 | 0.037 | 1047 | 0.98 |
| 野生型 | 0.51 | 野生型 | 15 |
| 现有技术 | 0.81 | H79A | 25 |
| 阴性对照 | 无活性 | 阴性对照 | 无活性 |
表1.3
实施例2–来自克隆1040的示例性多肽对鼠类CTLA-4的交叉反应性
使用抑制ELISA结合测定法研究示例性突变型CD86分子1040对鼠类CTLA-4和人类CTLA-4的相对亲和力。将这些实验中所用的1040分子作为双特异性分子的一部分与抗CD40抗体缀合。CD86分子的CTLA-4结合特性没有受到该缀合的影响(数据未示出)。
简单地说，通过在4℃温育过夜将96孔平底板高结合板(Greiner#655074)用人类CTLA-4(Fitzgerald)包被。将板洗涤(洗涤缓冲液：PBS+0.05％Tween 20(PBST)Medicago#09-9410-100)，然后在PBST+3％BSA(Merck，#1.12018.0100)中封闭。
将样品(示例性CD86突变体)在室温以不同浓度(连续稀释1/4，从30000ng/ml至0.3ng/ml)与可溶性生物素化的人类CTLA4(Fitzgerald#30R-CD152)或可溶性鼠类CTLA-4(R&D systems)一起预温育1小时。
然后将混合物添加到ELISA板中的封闭的孔中。使用抗生蛋白链菌素-HRP(Pierce，#21126)进行检测并且随后使用SuperSignal Pico化学发光底物(ThermoScientific，#37069)将板显影，并且使用Envision读数器(Perkin Elmer)检测。结果示于图5中。用鼠类CTLA-4和人类CTLA-4所观测到的抑制曲线证实示例性CD86突变体(1040)与这两种形式的CTLA-4的结合亲和力具有类似的量值。还发现实施例1中所测试的其它克隆与鼠类CTLA-4结合(数据未示出)。
实施例3–OX40抗体的表征
示例性OX40抗体的表征汇总于下表3.1中。
表3.1
两种抗OX40抗体仅被合成以用作参考抗体以在这些研究中用于比较的目的。它们在本文分别被命名为“72”或“72/76”和“74”或“74/78”。
通过表面等离子体共振测量动力学常数
使用常规的胺偶联将人类OX40(R&D systems，#3358_OX)固定到BiacoreTM传感器芯片CM5。在HBS-P(GE，#BR-1003-68)中以30μl/ml的流速分析所测试的抗体和对照(连续稀释1/3或1/2，100-2nM)的结合。跟踪缔合3分钟并且跟踪解离20分钟。使用50mM NaOH将再生进行两次，持续60秒。使用具有漂移基线的1:1朗缪尔模型(Langmuir model)计算动力学参数和亲和常数。所测试的抗体总体上在亚纳摩尔浓度-纳摩尔浓度范围内而具有不同的结合速率和解离速率(图6和表3.1)。大部分的抗体具有亲和力<5nM。使用BIAevaluation 4.1软件计算动力学参数和亲和常数。
通过ELISA测量与人类OX40和鼠类OX40的结合并且通过ELISA测量与CD137和CD40的结合
将ELISA板用0.1μg/ml或0.5μg/ml的人类OX40(R&D Systems，3388-OX)、CD40(Ancell)或CD137(R&D Systems)包被。将ELISA板用PBST洗涤，然后在室温用PBST+2％BSA封闭1小时，然后再次用PBST洗涤。在室温将抗体以稀释系列添加到ELISA板中，持续1小时，然后用PBST洗涤。使用山羊抗人类κ轻链HRP检测结合，在室温下温育1小时。使用SuperSignal Pico Luminescent作为底物并且使用Fluostar Optima测量发光。
所有测试的OX40抗体均与人类OX40结合并且显示低于1nM的EC50值。所述抗体不与鼠类OX40或所测试的其它TNFR超家族成员结合(数据未示出)。
测量与在CHO细胞上过表达的人类OX40的结合
使人类OX40的细胞外部分与hCD40的跨膜和细胞内部分融合并且克隆到pcDNA3.0中。随后将载体稳定地转染到CHO细胞中。通过在4℃与商业OX40抗体(huOX40，BDBiosciences)一起温育30分钟来确定OX40的表达，然后在4℃用a-huIgG-PE(JacksonImmunoresearch)检测30分钟。对于测定法，在4℃将转染的细胞与测试抗体和对照一起温育30分钟，然后在4℃用a-huIgG-PE(Jackson Immunoresearch)检测30分钟。通过流式细胞术用FACS Verse(BD Biosciences)分析细胞。
所有克隆均以剂量依赖性方式与在CHO细胞上过表达的hOX40结合(图7)。
实施例4–OX40抗体的序列分析
分析每一种抗体的重链可变区和轻链可变区两者的CDR序列。表4.1示出了如对于VH CDR3序列所进行的分析。表4.1中的位置是根据IMGT编号系统定义的。鉴定了以下模式。
VH区均包含：
(a)重链CDR1序列，所述序列具有8个氨基酸的长度并且包含共有序列：“G、F、T、F、G/Y/S、G/Y/S、Y/S、Y/S/A”；
(b)重链CDR2序列，所述序列具有8个氨基酸的长度并且包含共有序列：“I、G/Y/S/T、G/S/Y、S/Y、G/S/Y、G/S/Y、G/S/Y、T”；以及
(c)重链CDR3序列，所述序列具有9至17个氨基酸的长度并且包含共有序列：“A、R、G/Y/S/H、G/Y/F/V/D、G/Y/P/F、-/H/S、-/N/D/H、-/Y/G、-/Y、-/Y、-/W/A/V、-/A/Y、-/D/A/Y/G/H/N、Y/S/W/A/T、L/M/I/F、D、Y”。
VL区均包含：
(a)轻链CDR1序列，所述序列由序列“Q、S、I、S、S、Y”组成；
(b)轻链CDR2序列，所述序列由序列“A、A、S”组成；
(c)轻链CDR3序列，所述序列具有8至10个氨基酸的长度并且包含共有序列：“Q、Q、S/Y/G、-/Y/H/G、-/S/Y/G/D/W、S/Y/G/D、S/Y/G/T、P/L、Y/S/H/L/F、T”。
在重链CDR3的共有序列内，鉴定出两个亚家族。第一个亚家族中的每一种抗体均包含具有10个氨基酸的长度并且包含共有序列“A、R、Y/H、D、Y、A/Y/G、S/W/A、M/L、D、Y”的VHCDR3序列。该家族中的抗体被称为家族Z并且如表4.1中所鉴定。第二个亚家族中的每一种抗体均包含具有11个氨基酸的长度并且包含共有序列“A、R、G/Y、V/F/Y、P、H、G/Y/H、Y、F/I、D、Y”的VH CDR3序列。该家族中的抗体被称为家族P并且如表4.1中所鉴定。家族Z或P的抗体是优选的。具有家族P中的VH序列的抗体通常还包括具有“Q、Q、S、Y、S、T、P、Y、T”的CDR3序列、“Q、S、I、S、S、Y”的CDR1序列以及“A、A、S”的CDR2序列的VL序列。因此，具有包含这三个CDR序列的VL区的抗体是优选的。
表4.1
实施例5–OX40抗体的结构域定位
OX40的细胞外部分由四个结构域组成，它们中的每一个可以被细分成两个模块。使用标准实验室技术合成OX40人类/小鼠嵌合体的基因。通过将人类OX40的结构域或模块与相应的小鼠OX40交换来设计不同的嵌合体。基于对人类序列和小鼠序列的评价以及对人类OX40的三维研究来设计嵌合体。对合成的基因指定项目特定的ID号(参见表5.1)。将构建体克隆到pcDNA3.1载体(Invitrogen)中。
将小鼠/人类嵌合体瞬时转染到FreeStyle 293-F细胞(Invitrogen)中，在37℃、8％CO2、135rpm下在FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen)中温育48小时。在4℃将转染的细胞与人类OX40抗体、人类OX40L(hOX40L，RnD Systems)、小鼠OX40L(mOX40L，RnDSystems)以及对照一起温育30分钟，然后在4℃用a-huIgG-PE(Jackson Immunoresearch)检测30分钟。用FACS Verse(BD Biosciences)分析细胞。将与不同嵌合构建体的结合计算为与同种型对照的结合相比的相对(平均荧光强度)MFI。结果示于表5.2中。
所测试的人类OX40抗体都不与鼠类OX40结合。因此，如果给定抗体不与特定嵌合体结合，则这表示所述抗体对该嵌合体中已经被鼠类结构域置换的结构域之一具有特异性。
表5.1
嵌合构建体的特征
鉴定出至少四种单独的结合模式。
模式A：
抗体1170/1171、1524/1525和1526/1527显示出类似的结合模式并且依赖于相同结构域中的残基来进行结合。对于结合来说关键的氨基酸残基可能位于结构域2中的模块B和结构域2的模块A中。具有CDRH3家族“Z”的大多数抗体根据模式A结合(1166/1167除外)，这表示具有该类型的CDRH3的抗体倾向于结合该表位。
模式B：
抗体1168/1135、1542/1135、1520/1135、1490/1135、1482/1483和1164/1135显示出类似的结合模式并且主要依赖于位于结构域3中的残基进行结合。具有CDRH3家族“P”的所有抗体均以该模式结合，这表明CDRH3序列中的相似性揭示了共同结合表位。
模式C：
抗体1166/1167具有独特的结合模式并且可能依赖于位于结构域2中的模块A和模块B中的残基进行结合。然而，这两个模块必须被同时交换以消除结合，这表明了结构上复杂的表位。
模式D：
抗体1514/1515显示出独特的结合谱并且可能主要依赖于位于结构域2中的模块B中的氨基酸进行结合。
参考抗体72根据模式B结合。人类OX40配体的结合模式类似于模式C。
表5.2
来自结构域定位实验的结果
实施例6–与恒河猴的交叉反应性
使来自恒河猴的OX40的细胞外部分与hCD40的跨膜和细胞内部分融合并且克隆到pcDNA3.0中。随后将载体稳定地转染到HEK细胞(macOX40-HEK)中。
通过在4℃与商业OX40抗体(huOX40，BD Biosciences)一起温育30分钟来确定OX40的表达，然后在4℃用a-huIgG-PE(Jackson Immunoresearch)检测30分钟。对于测定法，在4℃将转染的细胞与测试抗体和对照一起温育30分钟，然后在4℃用a-huIgG-PE(Jackson Immunoresearch)检测30分钟。通过流式细胞术用FACS Verse(BD Biosciences)分析细胞。
如下表6.1中所示，测试抗体以与对人类OX40所实现的EC50值相当的EC50值与恒河猴OX40结合，这表明恒河猴将适用于毒理学研究中。
恒河猴在遗传上非常类似于食蟹猴(Macaca fascicularis/cynomolgusmonkey)，这使得食蟹猴非常可能也是适用于毒理学研究的物种。
表6.1
与人类OX40和猴OX40的结合(95％置信区间)
实施例7–在人类T细胞测定法中的激动活性
通过来自Miltenyi的阴性T细胞选择试剂盒，从来自从血库(隆德大学医院(LundUniversity Hospital))获得的白细胞过滤器的PBMC获得人类T细胞。将OX40抗体包被到96孔培养板(Corning Costar U形板(#3799))的表面并且与3μg/ml固定的抗CD3抗体(UCHT1)和5μg/ml可溶性抗CD28抗体(CD28.2)的组合一起培养。在4℃将抗CD3预先包被过夜。第二天，在用PBS洗涤一次后，在37℃将OX40抗体包被1-2小时。在37℃、5％CO2下在保湿室中温育72小时后，测量上清液中的IL-2水平。
将抗体刺激人类T细胞产生IL-2的能力与参考抗体74相比较并且相对活性示于图8中。大多数抗体提供了与参考抗体相当的T细胞激活水平。许多抗体提供了更高水平的T细胞激活。
双特异性分子
在以下实施例中，所测试的双特异性分子是以编号例如1164/1141指代的。这意指所述分子包含表B和表D中所示的相应VH区和VL区的氨基酸序列。举例来说，1164/1141包含表B中所示的重链VH区序列1164(SEQ ID NO:99)和表D中所示的双特异性链编号1141(SEQID NO:129)。给定分子的指定VH区序列通常是以与SEQ ID NO:135的IgG1重链恒定区序列连接(作为单个连续多肽链的一部分)的形式提供的。该序列通常存在于表B的指定VH区序列的C末端处。
实施例8–示例性双特异性分子与单一靶标结合的亲和力
通过表面等离子体共振测量动力学常数
使用常规的胺偶联将人类OX40(R&D systems，#3358_OX)固定到BiacoreTM传感器芯片CM5。在HBS-P(GE，#BR-1003-68)中以30μl/ml的流速分析所测试的抗体和对照(连续稀释1/3或1/2，100-2nM)的结合。跟踪缔合3分钟并且跟踪解离20分钟。使用50mM NaOH将再生进行两次，持续30秒。使用具有漂移基线的1:1朗缪尔模型计算动力学参数和亲和常数。测试分子具有不同的结合速率和解离速率，对OX40的亲和力一般低于相应的单体抗体，但是仍在纳摩尔浓度范围内(表8.1)。
表8.1
| BsAb | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(nM) |
| 1164/1141 | 8.87E+04 | 1.72E-04 | 1.94 |
| 1168/1141 | 2.84E+05 | 3.05E-04 | 1.07 |
| 1166/1261 | 7.04E+04 | 1.12E-04 | 1.59 |
| 1170/1263 | 5.18E+05 | 6.39E-04 | 1.23 |
通过ELISA测量
将ELISA板用分别0.4或0.5μg/ml的人类CTLA-4(BMS，Orencia)或人类OX40(R&DSystems，3388-OX)包被。将ELISA板用PBST洗涤，然后在室温用PBST+2％BSA封闭1小时，然后再次用PBST洗涤。将双特异性分子以稀释系列添加到板中，并且在室温下温育1小时。洗涤ELISA板，并且在室温使用山羊抗人类κ轻链HRP检测结合，持续1小时。使用SuperSignalPico Luminescent作为底物并且使用Fluostar Optima测量发光。
所有所测试的双特异性分子均与这两种靶标结合并且EC50值在基于它们作为单特异性抗体的亲和力所预期的范围内(图9)。
实施例9–示例性双特异性分子与这两种靶标的双重结合
通过表面等离子体共振测量
使用常规的胺偶联将人类OX40(R&D systems，#3358_OX)固定到BiacoreTM传感器芯片CM5。使所测试的双特异性分子(0.5μM或0.25μM)和对照以30μl/ml的流速在芯片上流过。跟踪缔合3分钟并且跟踪解离3分钟。然后注入CTLA4-Fc(BMS，Orencia)并且跟踪缔合3分钟以及跟踪解离3分钟。作为对照，注入空白PBS代替CTLA4。
所有所测试的双特异性分子均同时与这两种靶标结合，如图10中所示。
通过ELISA测量
在4℃将ELISA板用OX40-Fc(R&D systems，#3358_OX)(0.4μg/ml)包被过夜。将ELISA板用PBST洗涤，然后在室温用PBST+2％BSA封闭1小时，然后再次用PBST洗涤。将双特异性分子以稀释液形式添加到板中，并且在室温下温育1小时。洗涤ELISA板并且添加生物素化的CTLA-4(1μg/ml)并且在室温在板上温育。洗涤板并且使用HRP标记的抗生蛋白链菌素来检测结合。使用SuperSignal Pico Luminescent作为底物并且使用Fluostar Optima测量发光。
所有所测试的双特异性分子均证实与这两种靶标结合。如图11中所示，所测试的双特异性分子可以在浓度0.1nM被检测到，这对应于0.015μg/ml。测定中的相对值很好地对应于通过表面等离子体共振所测量的亲和力。
实施例10-在人类CD4 T细胞测定法中示例性双特异性分子的激动活性
通过来自从血库(隆德大学医院)获得的白细胞过滤器的PBMC的阴性CD4 T细胞选择(Miltenyi，人类CD4+T细胞分离试剂盒130-096-533)来分离人类CD4 T细胞。在4℃将CTLA-4(Orencia，2.5μg/ml)和抗CD3(UCHT-1，1μg/ml)包被到96孔培养板(非组织培养处理的U形96孔板(Nunc，VWR#738-0147))的表面过夜。通过用CTLA-4和CD3这两者包被，所述测定法提供了具有过表达的CTLA-4的肿瘤微环境的实验模型。CTLA-4从作为对照的一些孔中被省去。
将待测试的双特异性分子在连续稀释下以可溶状态添加到孔中并且在相同的摩尔浓度与对照比较。对于所测试的每一种双特异性分子，使用两种不同的对照。第一对照是被命名为1756/1757的双特异性分子(与1040CTLA4结合区融合的同种型对照抗体＝结合CTLA4，但不结合OX40)。第二对照是双特异性1756/1757对照和单特异性OX40抗体的混合物，它对应于所测试的双特异性分子。在37℃、5％C02下在保湿室中温育72小时后，测量上清液中的IL-2水平。
如图12中所示，双特异性分子存在剂量依赖性作用，所述双特异性分子当在包被有CTLA-4的板中培养时诱导人类T细胞激活的增加(通过IL-2产生的增加所测量)。对照不是这样。图13示出了在存在或不存在CTLA-4的情况下对于双特异性抗体和对照(1.5nM)在固定浓度下进行时相同测定法的结果。在不存在CTLA-4的情况下没有观测到T细胞激活的增加。与单特异性分子的相应组合相比，由每一种双特异性分子所诱导的IL-2水平的变化倍数示于表10.1中。每一种双特异性分子或对照的所产生的IL-2(pg/ml)的平均值示于表10.2中。
由于该测定法代表了具有过表达的CTLA-4的肿瘤微环境的实验模型，因此结果表明可以预期所测试的双特异性分子在这样的微环境中比单特异性抗体具有更大的作用。
表10.1
在1.5nM与单特异性分子的相应组合相比，由双特异性分子诱导的IL-2水平的变化倍数
| 1164/1141 | 1166/1261 | 1168/1141 | 1170/1141 | 1514/1581 | 1520/1141 |
| 7.6 | 7.8 | 7.2 | 4.7 | 5.5 | 1.7 |
表10.2.
1.5nM双特异性抗体或对照诱导的平均IL-2水平(pg/ml)
实施例11-示例性双特异性分子的稳定性
通过差示扫描荧光测定法(DSF)分析抗体的熔点。将PBS中的抗体样品与稀释1000倍的SYPRO Orange混合。在实时PCR机器中进行25℃与95℃之间的热扫描，在每一度均进行测量。使用参考抗体250/251进行比较并且确定相对于参考的熔融温度Tm的差异(ΔTm)。与参考相比Tm差异大于1.1℃被认为具有统计显著性。如表11.1中所示，所有所测试的双特异性分子均显示出良好的热稳定性，具有65℃或高于65℃的值。
表11.1
实施例12–靶向CTLA4和OX40的示例性双特异性抗体在诱导ADCC中的协同作用(与单独或组合的单特异性抗体的作用相比)
材料和方法
评估抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
使用被工程化以稳定表达FcγRIIIa受体(V158变体)和驱动萤火虫荧光素酶表达的NFAT响应元件(Promega公司)的Jurkat细胞作为效应细胞以评估ADCC。在96孔不透明发光板中的两个重复孔中滴定抗体，并且以5:1的比率添加效应细胞和表达OX40和CTLA4这两者的靶细胞。在37℃、95％O2加湿温育箱中温育6小时后，将荧光素酶测定底物(Promega公司)添加到包括培养基对照孔(用于空白扣除)的所有孔中，并且在FLUOstar Optima微孔板读数器(BMG LabTech)上检测发光。将ADCC诱导倍数计算为：(靶标裂解-空白)/(自发裂解-空白)。使用Prism 6.0(美国加利福尼亚州拉霍亚的Graphpad公司)基于log(激动剂)对响应(三个参数)曲线拟合来计算最高值。
抗体
·“1166/1167”＝单特异性OX40抗体
·“具有CTLA-4结合部分的对照IgG”＝与IgG蛋白融合的单特异性CTLA4结合域
·“1166/1261”＝靶向OX40和CTLA4的示例性双特异性抗体(与上文所述的单特异性结合剂含有相同的OX40和CTLA-4结合部分)。
·“对照IgG”＝阴性同种型对照
结果
示例性双特异性抗体1166/1261表现出优异的ADCC诱导
如图15中所示，所有所测试的组分均诱导可检测水平的ADCC。阴性同种型对照不诱导任何ADCC(数据未示出)。最值得注意的是，与对照相比，双特异性1166/1261抗体诱导约123倍的ADCC。单特异性OX40抗体(1166/1167)诱导约29倍的ADCC并且单特异性CTLA-4结合域(62/376)诱导约10倍的ADCC，而两种单特异性组分的混合物(1166/1167+62/376)诱导约31倍的ADCC。
因此，由结合OX40和CTLA-4的双特异性分子获得出乎意料和显著的协同作用。
实施例13–靶向OX40和CTLA4的双特异性抗体——与表达OX40和CTLA4这两者的细胞的特异性结合
背景
该研究的目的在于使用流式细胞术确定1166/1261和相应单特异性结合实体对表达OX40和CTLA4这两者的细胞的结合功效和EC50。所述双特异性抗体被设计成同时结合OX40和CTLA4这两者。出于该目的，我们使用具有我们的靶标的稳定表达的转染的CHO细胞。CHO P4细胞具有OX40和CTLA4这两者的高表达水平。
方法和结果
最初通过FACS(Beckton Dickinson)将表达OX40和CTLA4这两者的双重转染的CHO细胞分选到表达高水平的这两种靶标的细胞池中(表示为CHO P4)。通过在遗传霉素(geneticine)和博莱霉素(zeocine)的选择压力下培养细胞来保持靶标表达稳定。使用未转染的CHO野生型细胞作为对照。
将细胞用递减浓度的1166/1261(靶向OX40和CTLA4的示例性双特异性抗体)、或两种单特异性结合剂1166/1167(OX40特异性单克隆抗体)和具有CTLA-4结合部分的对照IgG(单特异性CTLA4结合IgG融合蛋白)(200nM-0.0034nM)染色，接着用PE缀合的抗人类IgG染色。使用FACSverse仪器检测荧光，并且使用FlowJo软件分析采集。确定每一种染色的中值荧光强度(MFI)。
CHO P4的结合功效曲线呈现于图16中(来自三次实验的一次代表性实验)。1166/1261比1166/1167或具有CTLA-4结合实体的对照IgG更好地与具有高OX40和CTLA4表达的细胞结合。这很可能是1166/1261能够同时结合两种靶标的累加作用。
实施例14–靶向OX40和CTLA4的双特异性抗体——通过流式细胞术测量的表达OX40和CTLA4的细胞的双重结合
目的
通过使用流式细胞术测量聚集细胞的数目来测量1166/1261与在细胞上过表达的OX40和CTLA4这两者的同时结合。
材料和方法
将CHO-OX40细胞和HEK-CTLA4细胞分别用荧光染料PKH-67(绿色荧光染料)或PKH-26(红色荧光染料)(Sigma-Aldrich)细胞内染色。在验证均匀染色的细胞群体后，将细胞与1166/1261(靶向OX40和CTLA4的示例性双特异性抗体)或两种单克隆抗体1166/1167(单特异性抗OX40抗体)和包含CTLA4结合域的对照IgG的组合混合并温育。在染色后，立即将细胞固定并且使用FACS-verse(BD biosciences)定量聚集的双阳性细胞的数目。使用GraphPad Prism v6进行数据分析和非线性回归。
结果和结论
示例性双特异性抗体1166/1261随着浓度增加而增加聚集细胞的数目(图17)(来自两次实验的一次代表性实验)。
实施例15–靶向OX40和CTLA4的双特异性抗体——在小鼠中的药物代谢动力学
材料和方法
抗体
·1166/1261(靶向OX40和CTLA4的示例性双特异性抗体)
·1166/1167(靶向OX40的单特异性对照抗体)
体内研究
在实验中使用来自Taconic丹麦公司的雌性C57BL/6(7-8周)小鼠。所有实验均是在马尔默/隆德伦理委员会(
ethical committee)批准下进行的。
向小鼠腹膜内注射100μg的每一种抗体并且在0小时、1小时、4小时、8小时、24小时、72小时后以及在1周后经由隐静脉或在结束时经由腔静脉将血液抽取到肝素化的管中。每个时间点使用3只小鼠。将血液以2500rpm旋转30分钟并且将血浆冷冻到-80℃以用于进一步分析。
测定血浆中的1166/1261和1166/1167水平的测定法
使用两种不同的测定法。单一靶标ELISA(ELISA1)和双重ELISA(ELISA2)。简单地说，所述测定法由以下步骤组成。将白色高结合平底LIA板(Greiner Bio-One，Austria)用0.8μg/mL人类OX40-Fc(美国明尼苏达州的RnD Systems公司)包被过夜。在用洗涤缓冲液(补充有0.05％Tween 20的磷酸酶缓冲盐水(PBST)，瑞典的Medicago公司)洗涤后，在环境室温(ART)在振荡下使用含有2％牛血清白蛋白(BSA)(德国Merck)的PBST将孔封闭1小时，并且再次洗涤，之后添加在测定缓冲液(PBST+0.5％BSA)中1:200和1:5000稀释的血浆样品以及校准曲线样品(1166/1261，浓度：6-0.0012μg/mL)。在ART在振荡下温育1小时并且随后洗涤后，添加二级试剂，该二级试剂由以下组成：用于单一靶标ELISA的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的人类抗κ抗体(英国的AbD Serotec公司)或用于双重ELISA的1μg/mL生物素化的人类CTLA-4-Fc(Orencia)，接着是抗生蛋白链菌素-HRP(美国明尼苏达州的ThermoFisher Scientific公司)(根据制造商的说明书)。使用HRP底物SuperSignalPicoLuminescence(Thermo Fisher Scientific)获得信号。在暗处在振荡下温育10分钟后使用Flurostar Optima(德国的MBG Labtech公司)收集发光测量值。通过使用GraphPadPrism程序分析数据。
结果
仅用单一靶标ELISA或用单一靶标ELISA和双重ELISA来分析在注射1166/1261和1166/1167后的不同时间点收集的样品以分别测定1166/1261和1166/1167的血浆水平。结果显示血浆中1166/1261和1166/1167的水平在腹膜注射后的约前4小时增加，然后降低(图18上图)。一周后在血浆中存在可检测水平的1166/1261和1166/1167这两者(图18中图和下图)。
血浆中1166/1261的水平类似于对于单克隆抗体1166/1167所获得的水平，这表明1166/1261表现出良好的体内半衰期，与等同的单特异性抗OX40抗体的体内半衰期相当。
参考文献
Hemerle T.,Wulhfard S.,Neri D.,(2012)A critical evaluation of thetumour-targeting properties of bispecific antibodies based on quantitativebiodistribution data.Protein Engineering and Design,25,pp 851-854。
实施例16–靶向OX40和CTLA4的双特异性抗体——在HT-29结肠癌模型中的体内抗肿瘤作用
总结
使用hPBMC人源化免疫缺陷小鼠和HT-29结肠癌的皮下肿瘤模型来研究1166/1261(靶向OX40和CTLA4的示例性双特异性抗体)的抗肿瘤作用。
1166-1261表现出统计显著性肿瘤体积抑制。
材料和方法
在实验中使用来自Taconic丹麦公司的雌性SCID-Beige小鼠(6-9周)。所有实验均是在马尔默/隆德伦理委员会批准下进行的。
从ATCC获得HT-29结肠癌细胞并且根据ATCC建议来培养。皮下注射在对数期生长的HT-29细胞系(于100-200μL中4×106个细胞，在第0天(D0))。在同一天经腹膜内注射从白细胞浓缩物分离的人类PBMC(于200μL中7×106个)。在第6天、第13天和第20天进行腹膜内处理(667pmol)。
白细胞浓缩物是从隆德大学医院获得的。
使用卡尺测量肿瘤的宽度、长度和高度，由此计算肿瘤体积(w/2×l/2×h/2×π×(4/3))。在肿瘤体积达到2cm3、破损或影响小鼠的健康之前将动物处死。
使用GraphPad Prism程序，通过Mann-Whitney检验分析数据。应答者供体被认为是对参考抗体1874有应答的那些供体。在指数肿瘤生长期间最小值10％的平均肿瘤抑制被认为是应答。
结果
来自接受应答者供体(来自两次独立实验的4个供体)移植的小鼠汇总数据显示与媒介物组(ZZ)相比，当用1166/1261抗体处理时，在第12-16天呈肿瘤生长抑制形式的统计显著性抗肿瘤功效(p＝0.0469至p＝0.0074，Mann-Whitney非参数，双尾)。在第10天至第21天，1166/1261的肿瘤体积抑制百分比在22-36％的范围内(参见图19和表31.1)。
总之，使用hPBMC人源化免疫缺陷小鼠和HT-29结肠癌的皮下肿瘤模型来研究1166/1261的抗肿瘤作用。1166/1261表现出统计显著性肿瘤体积抑制。
表31.1
统计分析和肿瘤抑制百分比
实施例17–靶向OX40和CTLA4的双特异性抗体——在Raji淋巴瘤模型中的体内抗肿瘤作用
总结
使用hPBMC人源化免疫缺陷小鼠和Raji B细胞淋巴瘤的皮下肿瘤模型来研究1166/1261(靶向OX40和CTLA4的示例性双特异性抗体)的抗肿瘤作用。
1166/1261表现出统计显著性肿瘤体积抑制。
材料和方法
在实验中使用来自Taconic丹麦公司的雌性SCID-Beige小鼠(6-9周)。所有实验均是在马尔默/隆德伦理委员会批准下进行的。
从ATCC获得Raji B细胞淋巴瘤并且根据ATCC建议来培养。皮下注射在对数期生长的Raji细胞系(10×106个细胞)以及从白细胞层分离的人类PBMC(于200μL中10×106个)。在第0天、第7天和第14天进行腹膜内处理(667pmol)。
白细胞层是从卡尔马大学医院(Kalmar University Hospital)获得的。
使用卡尺在宽度、长度和高度上测量肿瘤尺寸，由此计算肿瘤体积(w/2×l/2×h/2×π×(4/3))。在肿瘤体积达到2cm3、破损或影响小鼠的健康之前将动物处死。
使用GraphPad Prism程序，通过Mann-Whitney检验分析数据。应答者供体被认为是对参考抗体1874有应答的那些供体。在指数肿瘤生长期间最小值10％的平均肿瘤抑制被认为是应答。
结果和结论
来自使用应答供体的实验组的汇总数据，与媒介物相比，双特异性1166/1261抗体在第14天和第21天表现出统计显著性抗肿瘤功效(p＝0.0068和p＝0.0288，Mann-Whitney，双尾)(表32.1)。
表32.1
统计分析和肿瘤抑制百分比
实施例18–在MC38结肠癌模型中的体内抗肿瘤作用
总结
使用人类OX40转基因小鼠和MC38结肠癌的皮下肿瘤模型研究了OX40-CTLA-4双特异性抗体1166/1261的抗肿瘤作用。
与单克隆对应物相比，1166/1261对CD8/Treg比率显示出统计学显著作用。
材料和方法
实验中使用人类OX40的雌性转基因小鼠(纯合人类OX40敲入小鼠模型，由GenOway开发)。所有实验均是在马尔默/隆德伦理委员会批准下进行的。
在RPMI、10％热灭活胎牛血清、丙酮酸钠、hepes和2-巯基乙醇中培养MC38结肠癌。皮下注射在对数期生长的MC38细胞系(于100μL中1×106个细胞，在第0天(D0))，并在第10、13和16天经腹膜内进行处理(1.33mol)。在最后一次注射后24小时，收集肿瘤和脾脏，对活力标志物、谱系标志物CD11b、C19、MHCII、NK1.1、CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3、Ki-67进行染色，并使用流式细胞术进行分析。
结果
使用MC38结肠癌模型，在hOX40tg小鼠中研究了双特异性OX40-CTLA-4抗体的药效学作用。来自两个独立实验的汇总数据显示，与两个单特异性对应物相比，双特异性抗体对肿瘤内CD8/Treg比率具有统计学显著作用(图20)。关于CD8/Treg比率以及Treg中Ki-67(Ki-67是一种增殖标志物)的表达水平，脾脏中未见CD8/Treg比率的变化。这表明1166/1261诱导对肿瘤中Treg的显著作用，该作用大于通过两个单特异性对照抗体获得的作用的总和，而不影响外周T细胞。因此，该作用是针对肿瘤微环境，它可以提供更大的治疗窗口，即抗肿瘤作用高而全身毒性低。图21概述了不同T细胞群体的相对水平。
实施例19–在MC38结肠癌模型中的体内抗肿瘤作用
总结
使用人类OX40转基因小鼠和MC38结肠癌的皮下肿瘤模型研究了OX40-CTLA-4双特异性抗体1166/1261的抗肿瘤作用。
1166/1261以肿瘤体积抑制的形式证实了统计学显著性抗肿瘤功效。
材料和方法
实验中使用人类OX40的雌性转基因小鼠(纯合人类OX40敲入小鼠模型，由GenOway开发)。所有实验均是在马尔默/隆德伦理委员会批准下进行的。
MC38结肠癌获自斯坦福大学(Stanford University)并在RPMI、10％热灭活胎牛血清、丙酮酸钠、hepes和2-巯基乙醇中培养。皮下注射在对数期生长的MC38细胞系(于100μL中1×106个细胞，在第0天(D0))，并在第7、10和13天经腹膜内进行处理(1.33mol)。
使用卡尺测量肿瘤的宽度、长度和高度，由此计算肿瘤体积(w/2×l/2×h/2×π×(4/3))。在肿瘤体积达到2cm3、破损或影响小鼠的健康之前将动物处死。
使用GraphPad Prism和Excel程序分析双特异性抗体与单克隆抗体和媒介物相比的肿瘤体积抑制的数据。
结果
来自三个独立实验(n＝26-28)的汇总数据显示对肿瘤体积抑制和存活率具有统计学显著作用。
总之，使用MC38结肠癌模型在人类OX40转基因小鼠中研究了双特异性OX40-CTLA-4抗体的抗肿瘤作用。所述双特异性抗体对肿瘤体积抑制和存活率增加显示统计学显著作用。就存活率和肿瘤生长抑制而言，抗肿瘤作用强于单特异性对照抗体(图22)。
实施例20–在MB49膀胱癌模型中的体内抗肿瘤作用
总结
使用人类OX40转基因小鼠和MB49膀胱癌的皮下肿瘤模型研究OX40-CTLA-4双特异性抗体1166/1261的抗肿瘤作用。
1166/1261以肿瘤体积抑制和存活率增加的形式显示出统计学显著性抗肿瘤功效。
材料和方法
实验中使用人类OX40的雌性转基因小鼠(纯合人类OX40敲入小鼠模型，由GenOway开发)。所有实验均是在马尔默/隆德伦理委员会批准下进行的。
在第0天皮下注射在对数期生长的MB49细胞系(0.25×106个细胞)，并在第7、10和13天经腹膜内进行处理(1.33μmol)。
使用卡尺以宽度、长度和高度测量肿瘤体积，由此计算肿瘤体积((w/2)×(l/2)×(h/2)×π×(4/3))。在肿瘤体积达到2cm3、破损或影响小鼠的健康之前将动物处死。使用Mann-Whitney、非参数、双尾检验对肿瘤体积进行统计分析，并使用Graph Pad Prism对存活率Kaplan-Meyer对数秩进行统计分析。
结果
使用MB49膀胱癌模型在人类OX40转基因小鼠中研究双特异性OX40-CTLA-4抗体1166/1261的抗肿瘤作用。所述双特异性抗体显示出对肿瘤体积抑制(图23A，p＝0.0003)和存活率增加(图23B，p<0.0001)的统计学显著作用。
实施例21–由1166/1261诱导的免疫记忆
总结
免疫调节剂被认为可以诱导针对癌症的长期治疗反应，因为它们可诱导免疫记忆。为了证实这种免疫记忆，将1166/1261诱导完全肿瘤消退的小鼠用相同的特异性肿瘤、MB49细胞系或无关的肿瘤细胞系PANC02再次攻击。
再次攻击实验证实1166/1261产生了针对MB49膀胱癌的肿瘤特异性免疫记忆，但未产生针对无关肿瘤PANC02的肿瘤特异性免疫记忆。
材料和方法
由genOway生成的人类OX40敲入雌性小鼠(hOX40tg)(其中1166/1261已诱导MB49膀胱癌的完全肿瘤消退)在单肿瘤模型中利用MB49作为特异性肿瘤或使用双肿瘤模型与无关肿瘤PANC02一起再次攻击。初始小鼠用作肿瘤生长对照。
将对数生长期的MB49和PANC02作为单肿瘤或双肿瘤(侧腹每侧各一个)皮下注射(0.25×106个细胞)。每周用卡尺测量三次肿瘤体积，并使用公式(3/4×π×(宽度/2)×(长度/2)×(高度/2)计算肿瘤体积。
结果
在小鼠中研究免疫记忆，显示通过用特异性肿瘤MB49或用无关肿瘤再次攻击这些小鼠，在1166/1261治疗后肿瘤完全消退。完全应答者表现出针对特异性肿瘤MB49的免疫记忆，因为新肿瘤无法生长(图24A)。初始小鼠被用作肿瘤生长的阳性对照。此外，由于完全应答者在双肿瘤模型中用MB49和无关肿瘤PANC02再次攻击，证实免疫记忆具有肿瘤特异性，这表明仅无关肿瘤生长，而先前遇到的MB49肿瘤无生长(图24B)。该数据表明1166/1261诱导了肿瘤特异性免疫记忆。
实施例22–通过评估肿瘤内CD8/Treg比率研究在MB49膀胱癌模型中的体内抗肿瘤作用
总结
在肿瘤环境中，Treg具有OX40和CTLA-4的高表达。OX40-CTLA-4双特异性抗体预期在这种肿瘤环境中诱导Treg消耗。使用人类OX40转基因小鼠和MB49膀胱癌的皮下肿瘤模型，研究1166/1261诱导肿瘤内Treg消耗的能力。
与单克隆对应物相比，1166/1261显示出对Treg消耗、效应细胞激活和CD8/Treg比率增加的统计学显著作用。这种作用主要局限于肿瘤环境，因为在脾脏中未观察到呈CD8/Treg比率改变形式的显著作用。
材料和方法
实验中使用法国genOway公司生产的7-14周龄的人类OX40雌性纯合子(hOX40tg)。所有实验均是在马尔默/隆德伦理委员会批准下进行的。
在第0天皮下注射以对数期生长的MB49膀胱癌(0.25×106个细胞)，并在第10、13和16天经腹膜内进行治疗(1.33μmol)。最后一次注射后24小时，收集肿瘤和脾脏，对CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3以及对谱系标志物(CD19、NK1.1、MHCII)进行染色并使用流式细胞术分析。如果没有另外说明，则使用Graph Pad Prism，使用mann-Whitney、非参数、双尾检验进行统计分析。
结果
使用MB49膀胱癌在hOX40tg小鼠中研究双特异性OX40-CTLA-4抗体的药效学作用。实验表明1166/1261诱导对肿瘤内Treg含量(p＝0.0087，双尾)(图25A)、肿瘤中的CD8数量(p＝0.047，单尾)(图25B)和CD8/Treg比率(p＝0.0043，双尾)(图25C)的统计学显著作用。脾脏中未见到CD8/Treg比率变化，表明1166/1261的肿瘤定位(图25D)。
实施例23–通过评估效应细胞激活研究在MC38结肠癌模型中的体内抗肿瘤作用
总结
除调节性T细胞消耗外，OX40-CTLA-4双特异性抗体的部分作用模式也被认为是效应T细胞的激活。使用人类OX40转基因小鼠和MC38结肠癌的皮下肿瘤模型，研究OX40-CTLA-4双特异性抗体1166/1261的这些抗肿瘤作用。
1166/1261以增加的颗粒酶B和CD107a表达的形式证实了在肿瘤微环境中对效应CD8激活的统计学显著作用。
材料和方法
实验中使用人类OX40的雌性转基因小鼠(纯合人类OX40敲入小鼠模型，由GenOway开发)。所有实验均是在马尔默/隆德伦理委员会批准下进行的。
在第0天皮下注射在对数期生长的MC38结肠癌(1×106个细胞)，并在第10、13和16天经腹膜内进行处理(1.33μmol)。最后一次注射后24小时，收集肿瘤和脾脏，对活力标志物、谱系标志物(CD11b、C19、MHCII、NK1.1)、CD45、CD3、CD4、CD8、颗粒酶B和CD107a进行染色，并使用流式细胞术分析。使用Mann-Whitney、非参数、双尾检验分析数据。
结果
使用MC38结肠癌在hOX40tg小鼠中研究双特异性OX40-CTLA-4抗体的药效学作用。实验证实1166/1261以诱导CD107a(图26A，p＝0.0079)和颗粒酶B(图26B，p＝0.0159)的形式在肿瘤区域中诱导统计学显著的效应CD8细胞激活。
实施例24–示例性双特异性抗体‘1166/1261’定位于肿瘤
总结
OX40和CTLA-4在肿瘤环境中在T细胞上高度表达，特别是在Treg上高度表达。因此，由于双重靶向，预期OX40-CTLA-4双特异性抗体诱导肿瘤定位。使用人类OX40转基因小鼠和MC38结肠癌的皮下肿瘤模型研究1166/1261定位于肿瘤的能力。与用媒介物或同种型对照处理的动物相比，1166/1261显示出统计学显著的肿瘤定位。脾脏中未见定位。
材料和方法
实验中使用人类OX40转基因雌性小鼠(纯合人类OX40敲入小鼠模型，由GenOway开发)。所有实验均是在马尔默/隆德伦理委员会批准下进行的。
在第0天皮下注射在对数期生长的MC38结肠癌(1×106个细胞)。在第17天向小鼠给予一次治疗(经腹膜内给予1.33μmol Ab)。注射后24小时，收集肿瘤和脾脏，对活力标志物、APCeFluor780标记的抗CD45和PE标记的抗hIgG进行染色，并通过流式细胞术分析。比较不同组之间的活CD45+细胞中的hIgG+细胞的百分比。使用Mann-Whitney、非参数、双尾检验分析数据。
结果和结论
使用MC38结肠癌在hOX40tg小鼠中研究1166/1261诱导肿瘤定位的能力。实验证实，治疗后在肿瘤中检测到1166/1261，而未检测到同种型对照(图27A)。在脾脏中未检测到1166/1261(图27B)，表明定位到肿瘤。
实施例25–在MC38结肠癌模型中PD-1的组合作用
总结
PD-1单克隆抗体和其它免疫检查点抑制剂的成功临床试验为癌症治疗开辟了新途径。但是，仍然有很大一部分癌症患者没有应答，这促使人们对联合疗法进行了深入研究。使用人类OX40的转基因小鼠和使用MC38结肠癌模型，以PD-1组合研究OX40-CTLA-4双特异性抗体。
仅1166/1261以肿瘤体积抑制和存活率增加的形式表现出统计学显著的抗肿瘤作用。另外，1166/1261能够显著增强PD-1治疗的抗肿瘤作用。这些数据显示了将1166/1261与PD-1抗体联合用于患者的潜在益处。
材料和方法
实验中使用法国genOway公司生产并在室内饲养的7-14周龄的人类OX40雌性纯合子(hOX40tg)。所有实验均是在马尔默/隆德伦理委员会批准下进行的。
在第0天皮下注射在对数期生长的MC38结肠癌(1×106个细胞)，并在第7、10和13天经腹膜内进行1166/1261(1.33μmol)和/或抗小鼠PD-1(250μg，RPM1-14，BioXcell,US)抗体的治疗。每周用卡尺测量3次肿瘤体积，并使用公式(3/4×π×(宽度/2)×(长度/2)×(高度/2)来计算肿瘤体积。在伦理肿瘤极限下将小鼠处死。使用Mann-Whitney、非参数、双尾检验分析肿瘤体积并使用Graph Pad Prism分析存活率Kaplan-Meyer对数秩。
结果
使用MC38结肠癌模型在hOX40tg小鼠中研究双特异性OX40-CTLA-4抗体和抗PD-1的组合抗肿瘤作用。实验证实了由1166/1261诱导的抗肿瘤作用，呈肿瘤体积抑制和存活率增加的形式，p＝0.0124(图28A和图28B)。1166/1261与PD-1组合治疗显著增加了抗肿瘤作用(p<0.0001)。这些数据表明1166/1261可以增强临床上用PD-1抗体获得的抗肿瘤作用。
实施例26–在CT26结肠癌模型中PD-1的组合作用
总结
PD-1单克隆抗体和其它免疫检查点抑制剂的成功临床试验为癌症治疗开辟了新途径。但是，仍有很大一部分癌症患者没有应答，这促使人们对联合疗法进行了深入研究。使用人类OX40转基因小鼠和使用CT26结肠癌模型，以PD-1组合研究OX40-CTLA双特异性抗体。
仅1166/1261以肿瘤体积抑制和存活率增加的形式表现出统计学显著的抗肿瘤作用。另外，1166/1261能够显著增强PD-1治疗的抗肿瘤作用。这些数据表明1166/1261可以增强临床上用PD-1抗体获得的抗肿瘤作用。
材料和方法
实验中使用法国genOway公司生产并在室内饲养的7-14周龄的人类OX40雌性纯合子(hOX40tg)。所有实验均是在马尔默/隆德伦理委员会批准下进行的。
在第0天皮下注射在对数期生长的CT26结肠癌(1×106个细胞)，并在第7、10和13天经腹膜内进行1166/1261(1.33μmol)和/或抗小鼠PD-1(250μg，RPM1-14，BioXcell,US)抗体的治疗。每周用卡尺测量3次肿瘤体积，并使用公式(3/4×π×(宽度/2)×(长度/2)×(高度/2)来计算肿瘤体积。使用Mann-Whitney、非参数、双尾检验分析肿瘤体积并使用GraphPad Prism分析存活率Kaplan-Meyer对数秩。
结果
使用CT26结肠癌模型在hOX40tg小鼠中研究双特异性OX40-CTLA-4抗体和抗PD-1的组合抗肿瘤作用。实验证实1166/1261的统计学显著作用，呈肿瘤体积抑制和存活率增加形式，而单独使用PD-1抗体未显示任何有效的抗肿瘤功效(图29A和图29B)。在PD-1治疗中添加1166/1261可显著提高PD-1抗体的抗肿瘤功效。这些数据证实1166/1261可以增强临床上用PD-1抗体获得的抗肿瘤作用。
实施例27–1166/1261针对PANC02胰腺癌的抗肿瘤功效
总结
胰腺癌是一种侵袭性类型的癌症。胰腺癌患者通常预后很差，在美国，该癌症类型是第四大最常见的癌症死因。使用hOX40转基因小鼠研究1166/1261针对PANC02胰腺癌的抗肿瘤作用。
1166/1261以肿瘤体积抑制和存活率增加的形式表现出统计学显著的抗肿瘤功效。
材料和方法
实验中使用由GenOway生成的人类OX40敲入的雌性小鼠(hOX40tg)。所有实验均经过马尔默/隆德伦理委员会批准。
在第0天皮下注射在对数期生长的PANC02胰腺癌(0.25×106个细胞)，并在第7、10和13天经腹膜内进行1166/1261(1.33μmol)处理。使用Mann-Whitney、非参数、双尾检验分析肿瘤体积，并使用Graph Pad Prism分析存活率Kaplan.meyer对数秩。
结果
使用hOX40转基因小鼠和PANC02胰腺癌研究1166/1261针对胰腺癌的抗肿瘤功效。1166/1261以肿瘤生长抑制(图30A)和增加的存活率(图30B)的形式表现出显著的抗肿瘤功效。
实施例28–1166/1261通过CTLA-4阻断来恢复T细胞激活
总结
在CTLA-4阻断报告基因测定法中研究了1166/1261阻断CTLA-4并增加T细胞共刺激和激活的能力。1166/1261能够阻断CD80/CD86与CTLA-4的结合，并经由CD28恢复共刺激，从而导致T细胞激活。
材料和方法
该测定法使用表达TCR激活子的Raji细胞和CD80/CD86来共刺激利用luc2P元件与IL2启动子连接的表达TCR、CTLA-4和CD28的Jurkat报告T细胞。以发光测量激活。在不存在CTLA-4抗体的情况下，CD80/CD86与CTLA-4的结合比与CD28的结合亲和力更高，从而阻断信号。通过添加CTLA-4结合抗体，将阻断CD80/CD86与CTLA-4的结合，因此，经由CD28对T细胞的共刺激作用会增加，导致T细胞激活。
将连续稀释的1166/1261和同种型对照固定在板上并温育过夜，接着加入Jurkat报告细胞和Raji细胞。温育过夜后，以发光测量T细胞激活。
结果和结论
如图31所示，1166/1261能够恢复T细胞激活，而同种型对照未见到作用。
实施例29–在CTLA-4交联后1166/1261诱导的T细胞激活
总结
在CTLA-4交联后的系列激动测定法中研究1166/1261激活T细胞的能力。1166/1261以分泌IFN-γ、IL-2或T细胞增殖增加的形式显示出激动性T细胞激活。
材料和方法
使用阴性选择(Pan T细胞分离试剂盒或CD4+T细胞分离试剂盒，Miltenyi)从隆德大学医院血库的白细胞过滤器获得的PBMC中纯化人类CD3+或CD4+T细胞，并与连续稀释的1166/1261、单特异性抗体1166/1167+同种型对照/1261的混合物或同种型对照一起培养。
在用CTLA-4(Orencia，5μg/ml)和αCD3(OKT3，3μg/ml)预先包被的板中，用测试抗体培养T细胞(100,000个细胞/孔)后，测量CD3+T细胞的IFN-γ释放。72小时温育期后，通过ELISA测量上清液中的IFN-γ水平。
通过在含有稳定表达CTLA-4(800,000个受体/细胞)的经辐照HEK细胞(30,000个细胞/孔)和αCD3珠粒(UCHT-1，细胞:珠粒比率1:1.1)的板中用测试抗体培养T细胞(50,000个细胞/孔)来测量CD4+T细胞的IL-2释放。72小时后，通过ELISA测量上清液中的IL-2水平。
在用CTLA-4(Orencia，5μg/ml)和αCD3(UCHT-1，0.1μg/ml)预先包被的板中，通过用测试化合物培养CD4+T细胞(50,000个细胞/孔)来确定增殖。72小时后，用CellTitreGlow(Promega)测量增殖。
结果和结论
研究了1166/1261在差异性T细胞激活中的激动活性。图32中的结果证实了1166/1261在IFN-γ和IL-2释放以及增殖方面的剂量依赖性作用，而单特异性OX40和CTLA-4抗体的组合则未见到这种作用。结果表明1166/1261对CTLA-4交联具有强烈的激动作用。
实施例30–在FcγR交联后1166/1261诱导的T细胞激活
总结
在FcγR交联后的激动测定法中研究了1166/1261激活T细胞的能力。1166/1261显示呈IL-2分泌形式的激动性T细胞激活。
材料和方法
将稳定转染以表达CD64(FcγRI)的CHO细胞进行辐照，铺板(100,000个细胞/孔)并使其粘附过夜。将连续稀释的1166/1261、单特异性抗体组合(1166/1167+对照IgG/1261)或同种型对照添加到孔中。添加涂有αCD3(OKT3)的珠粒以用于次佳的T细胞激活。使用阴性选择(CD4+ T细胞分离试剂盒，Miltenyi)从隆德大学医院血库的白细胞过滤器获得的PBMC中纯化人类CD4+T细胞，并添加至孔中(50,000个细胞/孔)。72小时温育期后，通过ELISA测量IL-2分泌。该测定中共测试了8个供体。
结果和结论
如图33所示，显示了1166/1261的剂量依赖性激活，而单特异性OX40和CTLA-4抗体的组合未见到此作用。结果表明1166/1261对FcγR交联具有强烈的激动作用。
实施例31-1166/1261消耗原始Treg的能力
总结
在肿瘤环境中，调节性T细胞具有OX40和CTLA-4两者的高表达。OX40-CTLA-4双特异性抗体预期诱导靶标表达细胞的ADCC，特别是在肿瘤环境中。作为ADCC的替代，使用针对人类FcγRIII(V158)具特异性的ADCC报告基因测定法，研究了1166/1261诱导ADCC的能力。1166/1261表现出效应细胞的显著激活，并且与单独(数据未示出)或组合的单克隆对应物相比，这种诱导的活性更高。
材料和方法
使用FcγRIIIa(V158)ADCC报告基因测定法(Promega)来确定ADCC诱导。使用EasySepTM人类CD4+CD127低CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies)通过阴性选择来分离CD4+CD25+CD127低Treg。在αCD3/αCD28 Dynabeads(Gibco)存在下，将Treg激活48小时，以上调靶标表达并用作靶细胞。将连续稀释的1166/1261、单特异性抗体组合(1166/1167+对照IgG/1261)或同种型对照与效应细胞和靶细胞(5:1比率)一起培养6小时。通过流式细胞术测定培养前和培养后的OX40和CTLA-4的表达。
结果和结论
通过ADCC报告基因测定法评估1166/1261在体外诱导调节性T细胞消耗的能力。如图34A所示，1166/1261具有诱导原始人类Treg中的ADCC的能力。所述诱导显著高于单独的单克隆对应物(数据未示出)或它们的混合物。结果与OX40和CTLA-4的表达水平相关。新鲜的或未刺激的Treg表达的OX40和CTLA-4水平低，而用αCD3/αCD28激活后所述水平明显上调(图34B)。
实施例32-1166/1261消耗原始Treg的能力
总结
在肿瘤环境中，调节性T细胞具有OX40和CTLA-4两者的高表达。OX40-CTLA-4双特异性抗体预期诱导靶标表达细胞的ADCC，特别是在肿瘤环境中。使用利用同种异体NK细胞作为效应细胞的LDH释放测定法研究了1166/1261诱导ADCC的能力。1166/1261诱导强烈的NK细胞介导的Treg裂解。
材料和方法
使用EasySepTM人类CD4+CD127低CD25+调节性T细胞分离试剂盒(StemcellTechnologies)通过阴性选择分离CD4+CD25+CD127低Treg。在αCD3/αCD28 Dynabeads(Gibco)存在下，将Treg激活48小时，以上调靶标表达，然后用作靶细胞。作为效应细胞，使用利用EasySepTM人类NK细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies)使用阴性选择从PBMC中分离的同种异体NK细胞。将效应细胞和靶细胞以15:1的比率与连续稀释的1166/1261或同种型对照一起培养4小时。此后，测量上清液中的LDH水平。
结果和结论
如图35所示，1166/1261具有以剂量依赖性方式诱导原始人类Treg中的ADCC的能力。用同种型对照未见这种作用。
实施例33–试验性食蟹猴tox研究中对1166/1621的评估
总结
对食蟹猴进行了单剂量、剂量范围调查研究。在单次给予1166/1261后，发现早期(CD25+)和晚期(CD69+)T细胞以及增殖性中枢记忆(CD197+CD45RA-Ki67+)的数量增加。
材料和方法
对食蟹猴进行了单剂量、剂量范围调查研究。剂量组由一名雄性和一名雌性组成。所有动物均超过2.5岁。剂量组1-3分别接受3mg/kg；10mg/kg或30mg/kg的1166/1261，在1小时内静脉输注。剂量组4接受30mg/kg的皮下注射。
在给药前(两次)以及给药后第2、8、15、29和43天采集全血样品，进行外周血免疫表型分析。使用Truecount管(BD Biosciences)进行计数，并且用于染色的抗体购自BDBiosciences或Biolegend。通过计算每名个体的给药后样品与两个给药前样品的平均值的差异倍数，比较细胞群体的差异。
结果和结论
接受单剂量1166/1261的食蟹猴表现出对早期(CD69+)和晚期(CD25+)T细胞的数量的影响(图36B)并且发现增殖的中枢记忆(CD197+CD45RA-Ki67+)T细胞(图36A)增加。在四个剂量组之间未见明显差异。
Claims (46)
1.一种双特异性多肽，其包含第一结合域，命名为B1，其能够特异性结合OX40；和第二结合域，命名为B2，其能够特异性结合CTLA-4。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述第一结合域和/或第二结合域选自：抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述抗原结合片段选自：Fv片段(例如单链Fv片段或二硫键键合的Fv片段)、Fab样片段(例如Fab片段；Fab'片段或F(ab)2片段)以及结构域抗体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽是双特异性抗体。
5.根据权利要求4所述的多肽，其中：
(a)结合域B1和/或结合域B2是完整IgG抗体；
(b)结合域B1和/或结合域B2是Fv片段；
(c)结合域B1和/或结合域B2是Fab片段；和/或
(d)结合域B1和/或结合域B2是单域抗体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述双特异性多肽选自：
(a)二价双特异性抗体，例如IgG-scFv双特异性抗体(例如，其中B1是完整IgG并且B2是在所述IgG的轻链的N末端处和/或轻链的C末端处和/或重链的N末端处和/或重链的C末端处与B1连接的scFv，或反之亦然)；
(b)单价双特异性抗体，例如
或‘杵臼(knob-in-hole)’双特异性抗体(例如scFv-KIH、scFv-KIHr、BiTE-KIH或BiTE-KIHr)；
(c)scFv2-Fc双特异性抗体(例如ADAPTIRTM双特异性抗体)；
(d)BiTE/scFv2双特异性抗体；
(e)DVD-Ig双特异性抗体或其它IgG-FAb、FAb-IgG双特异性抗体，无论是否采用二价或接头/连接子；
(f)基于DART的双特异性抗体(例如，DART-Fc、DART2-Fc或DART)；
(g)DNL-Fab3双特异性抗体；和
(h)scFv-HSA-scFv双特异性抗体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其包含人类Fc区或所述区域的变体，其中所述区域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区，优选是IgG1或IgG4区。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或细胞凋亡。
9.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中：
B1是对OX40具有特异性的抗体或其抗原结合片段；并且
B2是对CTLA-4具有特异性的多肽结合域，其包含以下各项或由以下各项组成：
i)SEQ ID NO:3的氨基酸序列；或
ii)其中在与所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比时至少一个氨基酸被改变的氨基酸序列，前提条件是所述结合域以比野生型人类CD86更高的亲和力结合人类CTLA-4。
10.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中被所述多肽特异性结合的CTLA-4是灵长类动物或鼠类CTLA-4，优选是人类CTLA-4，和/或其中被所述多肽特异性结合的OX40是灵长类动物OX40，优选是人类OX40。
11.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B1包含至少一条重链(H)和/或至少一条轻链(L)并且B2与所述至少一条重链(H)或至少一条轻链(L)连接。
12.根据权利要求11所述的多肽，其中B1包含：
-至少一条重链(H)和至少一条轻链(L)并且B2与所述重链或所述轻链连接；或者
-两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)并且B2与两条重链或与两条轻链连接。
13.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其包含根据沿方向N-C书写的下式中的任一个排列的多肽链或由其组成：
(A)L-(X)n-B2；
(B)B2-(X)n-L；
(C)B2-(X)n-H；
(D)H-(X)n-B2；
其中X是接头并且n是0或1。
14.根据权利要求13所述的多肽，其中X是具有氨基酸序列SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:47)、SGGGGSGGGGSAP(SEQ ID NO:48)、NFSQP(SEQ ID NO:49)、KRTVA(SEQ ID NO:50)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:144)或(SG)m的肽，其中m＝1至7。
15.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其以小于50×10-10M、25×10-10M或20×10-10M的Kd与人类OX40结合和/或其以小于60×10-9M、25×10-9M或10×10-9M的Kd值与人类CTLA-4结合。
16.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其诱导效应T细胞，优选CD4+效应T细胞的活性增加，任选地其中所述增加是通过作为单独分子施用于所述T细胞的B1和B2的组合而诱导的效应T细胞的活性增加的至少1.5倍、4.5倍或7倍。
17.根据权利要求16所述的多肽，其中所述T细胞活性增加是所述T细胞的增殖和/或IL-2产生增加。
18.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其与抗体1166/1167竞争结合OX40；和/或其与CD86突变体1040(SEQ ID NO:17)竞争结合CTLA-4。
19.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其与抗体1166/1261竞争结合OX40，和/或其与抗体1166/1261竞争结合CTLA-4。
20.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B2(ii)的所述氨基酸序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸当与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比时被取代；任选地其中与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比不存在插入或缺失。
21.根据权利要求20所述的多肽，其中所述第一结合域的所述氨基酸序列中的所述氨基酸取代中的至少一个在位置122处，并且任选地其中所述氨基酸序列也在位置107、121和125中的至少一个处被取代。
22.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B2的所述氨基酸序列包含以下或由以下组成：选自SEQ ID NO 6至24(如表C中所示)中的任一个的氨基酸序列，或与所述SEQID NO 6至24的氨基酸序列具有大于60％、或大于70％、例如75％或80％、优选大于85％、例如大于90％或95％氨基酸同一性的所述序列的变体。
23.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B2的所述氨基酸序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:17的氨基酸序列(CD86突变体1040，如表C中所示)。
24.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B1当独立于B2存在时表现出以下功能特征中的至少一个：
I.以小于10×10-10M、更优选小于5×10-10M的KD值结合人类OX40；
II.不结合鼠类OX40；并且
III.不结合其它人类TNFR超家族成员，例如人类CD137或CD40。
25.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B1包含独立地选自以下的任何一个、两个、三个、四个、五个或所有六个特征：
(a)重链CDR1序列，所述序列具有8个氨基酸的长度并且包含共有序列：“G、F、T、F、G/Y/S、G/Y/S、Y/S、Y/S/A”；
(b)重链CDR2序列，所述序列具有8个氨基酸的长度并且包含共有序列：“I、G/Y/S/T、G/S/Y、S/Y、G/S/Y、G/S/Y、G/S/Y、T”；
(c)重链CDR3序列，所述序列具有9至17个氨基酸的长度并且包含共有序列：“A、R、G/Y/S/H、G/Y/F/V/D、G/Y/P/F、-/H/S、-/N/D/H、-/Y/G、-/Y、-/Y、-/W/A/V、-/A/Y、-/D/A/Y/G/H/N、Y/S/W/A/T、L/M/I/F、D、Y”；
(d)轻链CDR1序列，所述序列由序列“Q、S、I、S、S、Y”组成；
(e)轻链CDR2序列，所述序列由序列“A、A、S”组成；
(f)轻链CDR3序列，所述序列具有8至10个氨基酸的长度并且包含共有序列：“Q、Q、S/Y/G、-/Y/H/G、-/S/Y/G/D/W、S/Y/G/D、S/Y/G/T、P/L、Y/S/H/L/F、T”；
其中(c)的所述重链CDR3序列优选是具有10个氨基酸的长度并且包含共有序列“A、R、Y/H、D、Y、A/Y/G、S/W/A、M/L、D、Y”的序列；并且
(f)的所述轻链CDR3序列优选由序列“Q、Q、Y、Y、W、Y、G、L、S、T”组成。
26.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B1包含如表A(1)中所示的VH序列的所有三个重链CDR序列和/或如表A(2)中所示的VL序列的所有三个轻链CDR序列，或者其中B1包含如表B中所示的重链VH序列和/或轻链VL序列。
27.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B1包含具有11个氨基酸的长度并且包含共有序列“A、R、Y/H、D、Y、A/Y/G、S/W/A、M/L、D、Y”的重链CDR3序列和SEQ ID NO:89的轻链VL序列(如表B中所示的1167)，任选地其中所述SEQ ID NO:89的轻链VL序列作为SEQ IDNO:125的较长序列(如表D中所示的1261)的一部分存在。
28.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中结合域B1包含SEQ ID NO:89的轻链VL序列(如表B中所示的1167)，和SEQ ID NO:91的重链VH序列(如表B中所示的1166)，或与SEQ ID NO:89和/或SEQ ID NO:91具有大于60％、或大于70％、例如75％或80％、优选大于85％、例如大于90％或95％氨基酸同一性的所述序列的变体。
29.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B1包含人类Fc区或所述区域的变体，其中所述区域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区，优选是IgG1或IgG4区。
30.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO125至134中的任一个的氨基酸序列，任选地其中所述多肽作为抗体的组成部分提供，或与所述SEQ ID NO 125至134的氨基酸序列具有大于60％、或大于70％、例如75％或80％、优选大于85％、例如大于90％或95％氨基酸同一性的所述序列的变体。
31.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO125的氨基酸序列(如表D中所示的1261)。
32.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO125的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:91的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:125和/或SEQ ID NO:91具有大于60％、或大于70％、例如75％或80％、优选大于85％、例如大于90％或95％氨基酸同一性的所述序列的变体。
33.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:125的氨基酸序列(如表D中所示的1261)和SEQ ID NO:91的氨基酸序列(如表B中所示的1161)。
34.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述双特异性多肽与单独的单特异性对应多肽的组合作用相比能够诱导肿瘤内CD8/Treg比率的协同增加。
35.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性多肽，其用作药物。
36.一种根据权利要求1至34中任一项所述的双特异性多肽的用途，其用于制造药物。
37.一种治疗或预防个体中的疾病或病状的方法，所述方法包括对个体施用根据前述权利要求中任一项所述的双特异性多肽。
38.根据权利要求35所述的双特异性多肽或根据权利要求36所述的用途或根据权利要求37所述的方法，其中所述疾病或病状是癌症并且任选地其中所述个体是人类。
39.根据权利要求38所述的双特异性多肽或用途或方法，其中所述方法包括全身地或局部地，例如在肿瘤部位处或向肿瘤引流淋巴结中施用所述双特异性多肽，或者其中所述双特异性多肽是用于全身地或局部地施用，例如在肿瘤部位处或向肿瘤引流淋巴结中。
40.根据权利要求38或39所述的双特异性多肽或方法或用途，其中所述癌症是前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴母细胞性白血病、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、头颈部癌、肝癌、皮肤癌、淋巴瘤或胶质母细胞瘤。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的双特异性多肽或方法或用途，其中所述多肽与一种或多种额外治疗剂组合使用。
42.根据权利要求41所述的双特异性多肽或方法或用途，其中所述一种或多种额外治疗剂是结合选自PD-1/PD-L1、CD137、CD40、GITR、LAG3、TIM3、CD27和KIR的靶标的免疫治疗剂。
43.根据权利要求42所述的双特异性多肽或方法或用途，其中所述一种或多种额外治疗剂是结合PD-1或PD-L1的免疫治疗剂，例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
44.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至34中任一项所述的双特异性多肽的至少一条多肽链。
45.一种组合物，其包含根据权利要求1至34中任一项所述的双特异性多肽和至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。
46.根据权利要求1至34中任一项所述的多肽，其与额外治疗部分缀合。
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