BR112019023097A2 - anticorpo biespecífico contra ox40 e ctla-4 - Google Patents

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Abstract

A presente invenção fornece polipeptídeos biespecíficos, tal como anticorpos biespecíficos, compreendendo um primeiro domínio de ligação capaz de ligar especificamente a OX40 e um segundo domínio de ligação capaz de ligar especificamente a CTLA-4. A invenção fornece ainda composições dos referidos polipeptídeos biespecíficos, bem como métodos e usos dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “ANTICORPO BIESPECÍFICO CONTRA OX40 E CTLA-4” Campo da Invenção
[001] A presente invenção se refere a polipeptídeos biespecíficos que ligam especificamente a OX40 e CTLA-4 e, em particular, a OX40 humana e CTLA-4 humana.
Fundamentos
[002] Câncer é uma causa líder de mortes prematuras no mundo desenvolvido. Imunoterapia do câncer visa montar uma resposta imune eficaz contra as células tumorais. Isto pode ser conseguido, por exemplo, quebrando a tolerância contra antígeno tumoral, aumentando respostas imunes antitumorais e estimulando respostas de citocinas locais no sítio do tumor. A célula efetora chave de uma resposta imune antitumoral duradoura é a célula T efetora específica do tumor ativada. A expansão potente das células T efetoras ativadas pode redirecionar a resposta imune em direção ao tumor. Neste contexto, células T reguladoras (Treg) desempenham um papel na inibição da imunidade antitumoral.
Depletar, inibir, reverter ou inativar Tregs pode, portanto, proporcionar efeitos antitumorais e reverter a supressão imune no microambiente tumoral. Além disso, a ativação incompleta das células T efetoras por, por exemplo, células dendríticas, pode causar anergia das células T, o que resulta em uma resposta antitumoral ineficiente, ao passo que a indução adequada pelas células dendríticas pode gerar uma expansão potente das células T efetoras ativadas, redirecionando a resposta imune em direção ao tumor. Além disso, as células natural killer (NK) desempenham um papel importante na imunologia tumoral, atacando células tumorais com expressão de antígeno de leucócito humano (HLA) infrarregulado e induzindo citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). A estimulação das células NK pode, assim, reduzir o crescimento do tumor.
[003] OX40 (de outro modo conhecido como CD134 ou TNFRSF4) é um membro da família TNFR que é expresso principalmente em células T ativadas (principalmente células T efetoras CD4+, mas também células T efetoras CD8+ e células T reguladoras (Tregs)). Em camundongos, a expressão é constitutiva ems Tregs, mas não em humanos. A expressão de OX40 ocorre tipicamente dentro de 24 horas da ativação (envolvimento do receptor de célula T) e atinge o pico após 48-72 horas. A estimulação de OX40 é importante para a sobrevivência e proliferação de células T ativadas. O único ligando conhecido para OX40 é OX40L, que é expresso principalmente em células apresentadoras de antígenos, tal como células dendríticas e células B, tipicamente em seguida à sua ativação. O resultado líquido da ativação de célula T mediada por OX40 é a indução de um perfil de ativação de célula T efetora TH1 e uma redução na atividade e/ou nos número de células Treg, por exemplo, via ADCC ou ADCP. No geral, estes efeitos podem contribuir para a imunidade antitumoral. OX40 é superexpressado em células T reguladoras em muitos tumores sólidos, tal como melanoma, câncer de pulmão e câncer renal.
[004] O tratamento de agonista de OX40 de modelos de tumor em camundongos mostrou resultar em efeitos antitumorais e na cura de várias formas diferentes de câncer, incluindo melanoma, glioma, sarcoma, cânceres de próstata, cólon e rim. Os dados são consistentes com uma resposta de célula T específica de tumor, envolvendo ambas as células T CD4+ e CD8+, semelhante ao efeito visto com tratamentos com agonistas de CD40. Foi demonstrado que a adição de IL-12 e outras citocinas e a combinação com outros imunomoduladores e quimioterapia/radioterapia melhora o efeito terapêutico do tratamento com agonista de OX40. Evidências de modelos pré- clínicos sugerem que o efeito dos anticorpos anti-OX40 é dependente da ativação do FcγR. Um estudo clínico de fase I testando o Clone pB12 de OX40 anti-humano de camundongo em pacientes em estágio avançado que tinham falhado em todas as outras terapias foi realizado no Providence Cancer Center.
O anticorpo foi bem tolerado. Foram observados encolhimento do tumor e um aumento na proliferação de células T CD4+ e CD8+. A baixa toxicidade pode ser causada por baixa meia vida e anticorpos antidroga (o anticorpo era um anticorpo de camundongo), mas também pelos níveis de expressão relativamente baixos de OX40 em células T não ativadas. O efeito antitumoral com este anticorpo foi modesto.
[005] Anticorpos existentes tendo como alvo OX40 são em geral dependentes de reticulação através, por exemplo, de Receptores Fcgamma receptores em outras células para induzir sinalização forte em células que expressam o receptor respectivo. Assim, eles não sinalizam de maneira eficiente quando nenhuma reticulação é fornecida. Além disso, a ativação prolongada e contínua através de membros da família de receptores de TNF pode levar à exaustão imune.
[006] O receptor de células T CTLA-4 serve como um regulador negativo da ativação das células T e é suprarregulado na superfície das células T em seguida a ativação inicial. Os ligandos do receptor de CTLA-4, que são expressos pelas células apresentadoras de antígeno, são as proteínas B7. O par de receptores de ligandos correspondente que é responsável pela suprarregulação da ativação das células T é CD28 - B7. A sinalização via CD28 constitui uma via coestimulatória e segue mediante ativação das células T, através do receptor de células T que reconhece o peptídeo antigênico apresentado pelo complexo MHC. Ao bloquear a interação do CTLA-4 para os ligandos B7-1 e/ou B7-2, um dos pontos de verificação normais da resposta imune pode ser removido. O resultado líquido é uma atividade intensificada das células T efetoras que pode contribuir para a imunidade antitumoral. Como com OX40, isto pode ser devido à ativação direta das células T efetoras, mas também pode ser devido a uma redução na atividade e/ou no número de células Treg, por exemplo, via ADCC ou ADCP. Estudos clínicos demonstraram que o bloqueio de CTLA-4 gera efeitos antitumorais, mas a administração de anticorpos anti-CTLA-4 foi associada a efeitos colaterais tóxicos. CTLA-4 é superexpressado em células T reguladoras em muitos tumores sólidos, tal como câncer de pulmão de melanoma e câncer renal.
[007] Há uma necessidade de agentes terapêuticos aprimorados capazes de ativar as células imunes hospedeiras nas proximidades das células tumorais, por exemplo, como uma alternativa a drogas monoespecíficas existentes que têm como alvo apenas uma proteína associada a célula T (tal como OX40 ou CTLA-4).
Sumário da Invenção
[008] Um primeiro aspecto da invenção fornece um polipeptídeo biespecífico compreendendo um primeiro domínio de ligação, designado B1, que é capaz de ligar especificamente a OX40, e um segundo domínio de ligação, designado B2, que é capaz de ligar especificamente a CTLA-
4.
[009] Polipeptídeos biespecíficos, por exemplo, anticorpos dirigidos aos dois alvos de células T CTLA-4 e
OX40, têm o potencial de induzir ativação específica do sistema imune em locais onde ambos os alvos são superexpressados. Notavelmente, CTLA-4 e OX40 são ambos superexpressos em células T reguladoras (Treg) no microambiente tumoral, ao passo que sua coexpressão em células T efetoras é mais baixa. Assim, os polipeptídeos biespecíficos da invenção têm o potencial de direcionar seletivamente células T reguladoras no microambiente tumoral.
[0010] O direcionamento de células Treg no microambiente tumoral com um polipeptídeo biespecífico da invenção também tem o potencial para esgotar ou reverter a função supressiva imunes das Tregs. Este efeito poderia ser mediado por indução de ADCC ou ADCP via a parte Fc do anticorpo bispecífico da invenção (por exemplo, ver Furness et al., 2014 Trends Immunol 35(7):290-8; cuja divulgação é aqui incorporada por referência) ou por sinalização induzida via OX40 e/ou CTLA-4 e/ou por bloqueio da via de sinalização de CTLA-4 (por exemplo, ver Walker, 2014, Nature Reviews 11(12):852-63; cuja divulgação é divulgada aqui por referência). Em células T efetoras, por outro lado, os polipeptídeos biespecíficos da invenção têm o potencial para induzir ativação e função elevada tanto via estimulação de OX40 quanto por bloqueio de ponto de verificação de CTLA-4.
[0011] Os efeitos líquidos dos polipeptídeos biespecíficos direcionados para OX40 e CTLA-4 são assim:
1. Um grau mais alto de ativação imune em comparação com os polipeptídeos monoespecíficos. A ativação imune é mais alta que aquela induzida pela combinação dos polipeptídeos monoespecíficos, isto é, uma ativação sinérgica é alcançada.
2. Um grau mais alto de indução de ADCC em comparação com os polipeptídeos monoespecíficos em combinação.
3. Uma ativação imune mais direcionada/localizada. A ativação imune ocorre apenas em ambientes (por exemplo, tecidos) tendo tanto alta expressão de CTLA-4 quanto expressão de OX40. O microambiente do tumor é um ambiente desse tipo. Isto tem o potencial de aumentar a ativação imune num local de tumor sem os efeitos colaterais tóxicos associados à ativação em outros tecidos/regiões do corpo.
Assim, a janela terapêutica será aumentada.
[0012] Um “polipeptídeo” é usado aqui em seu sentido mais amplo para se referir a um composto de dois ou mais aminoácidos de subunidades, análogos de aminoácidos ou outros peptidomiméticos. O termo “polipeptídeo” inclui, assim, sequências peptídicas curtas e também polipeptídeos e proteínas mais longos. Como usado aqui, o termo “aminoácido” se refere a aminoácidos sejam naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo ambos os isômeros ópticos D ou L e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.
[0013] O termo “biespecífico”, conforme usado aqui, significa que o polipeptídeo é capaz de ligar especificamente a pelo menos duas entidades alvo.
[0014] Numa modalidade, o primeiro e/ou o segundo domínio de ligação podem ser selecionados do grupo que consiste em: anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.
[0015] Por exemplo, o polipeptídeo biespecífico da invenção pode compreender: (i) um primeiro domínio de ligação que compreende ou consiste em um domínio variável de anticorpo ou parte do mesmo e um segundo domínio de ligação que compreende ou consiste em um domínio variável de anticorpo ou parte do mesmo; ou (ii) um primeiro domínio de ligação que compreende ou consiste em um domínio variável de anticorpo ou parte do mesmo e um segundo domínio de ligação que não é um domínio variável de anticorpo ou parte do mesmo.
[0016] Assim, em uma modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo biespecífico.
[0017] Como aqui utilizados, os termos “anticorpo” ou “anticorpos” se referem a moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno, por exemplo, moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina que contêm um sítio de ligação ao antígeno. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou uma subclasse de molécula de imunoglobulina. Anticorpos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos de domínio único, anticorpos de cadeia simples, anticorpos produzidos de forma recombinante, anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, intrabodies, scFvs (por exemplo, incluindo monoespecíficos e biespecíficos, etc.), fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), Fvs ligados a dissulfeto (sdFv), anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer dos acima.
[0018] Os termos anticorpo “dirigido a” ou “dirigido contra” são usados aqui de forma intercambiável e se referem a um anticorpo que é construído para dirigir sua(s) especificidade(s) de ligação a um determinado alvo/marcador/epítopo/antígeno, isto é, um anticorpo que liga imunoespecificamente a um alvo/marcador/epítopo/antígeno. Além disso, a expressão anticorpos “seletivos para” um determinado alvo/marcador/epítopo pode ser utilizada tendo a mesma definição que “direcionado para” ou “direcionado contra”. Um anticorpo biespecífico direcionado para (seletivo para) dois alvos/marcadores/epítopos/antígenos diferentes liga imunoespecificamente a ambos os alvos/marcadores/epítopos/antígenos. Se um anticorpo for direcionado a um certo antígeno alvo, tal como OX40, é assumido assim que o referido anticorpo pode ser direcionado a qualquer epítopo adequado presente na referida estrutura do antígeno alvo.
[0019] Como usado aqui, o termo “fragmento de anticorpo” é uma porção de um anticorpo, tal como F(ab’) 2, F(ab)2, Fab’, Fab, Fv, scFv e similares. Independentemente da estrutura, um fragmento de anticorpo liga ao mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. Por exemplo, um fragmento de anticorpo anti-OX40 liga a OX40. O termo “fragmento de anticorpo” também inclui fragmentos isolados consistindo nas regiões variáveis, tal como os fragmentos “Fv” consistindo nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve e moléculas de polipeptídeo de cadeia simples recombinantes nas quais regiões variáveis leves e pesadas são conectadas por um ligante peptídico (“proteínas scFv”). Como aqui utilizado, o termo “fragmento de anticorpo” não inclui porções de anticorpos sem atividade de ligação ao antígeno, tal como fragmentos Fc ou resíduos de aminoácidos simples.
[0020] ScFv são particularmente preferidos para inclusão nos polipeptídeos biespecíficos da invenção.
[0021] Assim, em modalidades exemplares dos polipeptídeos biespecíficos da invenção: (a) o domínio de ligação B1 e/ou o domínio de ligação B2 é um anticorpo IgG intacto (ou, juntos, formam um anticorpo IgG intacto); (b) o domínio de ligação B1 e/ou o domínio de ligação B2 é um fragmento Fv (por exemplo, um scFv); (c) o domínio de ligação B1 e/ou o domínio de ligação B2 é um fragmento Fab; e/ou (d) o domínio de ligação B1 e/ou o domínio de ligação B2 é um anticorpo de domínio simples (por exemplo, anticorpos e nanocorpos de domínio).
[0022] Será apreciado pelos versados na técnica que os polipeptídeos biespecíficos da invenção podem ser de vários formatos estruturais diferentes (por exemplo, ver Chan & Carter, 2016, Nature Reviews Immunology 10, 301-316, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência).
[0023] Em modalidades exemplares, o polipeptídeo é um anticorpo biespecífico selecionado dos grupos que consistem em: (a) anticorpos biespecíficos bivalentes, tal como anticorpos biespecíficos IgG-scFv (por exemplo, em que B1 é uma IgG intacta e B2 é um scFv fixado a B1 no N-terminal de uma cadeia leve e/ou no C-terminal de uma cadeia leve e/ou no N-terminal de uma cadeia pesada e/ou no C-terminal de uma cadeia pesada da IgG, ou vice-versa); (b) anticorpos biespecíficos monovalentes, tal como DuoBody® (Genmab AS, Copenhague, Dinamarca) ou anticorpo biespecífico ‘knob-in-hole’ (por exemplo, um scFv-KIH, scFv-KIHr, um BiTE-KIH ou um BiTE- KIHr (ver Xu et al., 2015, mAbs 7(1):231-242); (c) anticorpos biespecíficos scFv2-Fc (tal como anticorpos biespecíficos ADAPTIR™ de Aptevo Therapeutics Inc, US); (d) anticorpos biespecíficos BiTE/scFv2; (e) anticorpos biespecíficos para DVD-Ig; (f) anticorpos biespecíficos baseados em DART (por exemplo, DART-Fc, DART2-Fc ou DART); (g) anticorpos biespecíficos DNL-Fab3; e (h) anticorpos biespecíficos scFv-HSA-scFv.
[0024] Será apreciado pelos versados na técnica que a invenção também abrange formatos equivalentes àqueles listados acima, nos quais um dos domínios de ligação é um domínio de ligação não imunoglobulínico (tal como um polipeptídeo CD86 capaz de ligar a CTLA-4).
[0025] Por exemplo, o polipeptídeo biespecífico pode ser um anticorpo IgG-scFv. O anticorpo IgG-scFv pode estar em qualquer orientação VH-VL ou VL-VH. Em uma modalidade, o scFv pode ser estabilizado por uma ponte S-S entre VH e VL.
[0026] Alternativamente, o polipeptídeo biespecífico pode ser uma IgG anti-OX40 (ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma, tal como um scFv) acoplada a um polipeptídeo CD86.
[0027] Em uma modalidade, o domínio de ligação B1 e o domínio de ligação B2 são fundidos diretamente um ao outro.
[0028] Em uma modalidade alternativa, o domínio de ligação B1 e o domínio de ligação B2 são unidos via um ligante polipeptídico. Por exemplo, um ligante polipeptídico pode ser um peptídeo ligante curto entre cerca de 10 a cerca de 25 aminoácidos. O ligante geralmente é rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilidade, e pode conectar o N-terminal da VH ao C- terminal da VL ou vice-versa. Ligantes exemplares incluem um peptídeo de sequência de aminoácido como mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOs. 47 a 50, ou 144.
[0029] Os polipeptídeos biespecíficos da invenção podem ser fabricados por qualquer método adequado conhecido usado na técnica. Os métodos para preparar anticorpos biespecíficos da presente invenção incluem BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab e Mab2 (F-star), Fc-engineered IgGl (Xencor) ou DuoBody (com base na troca de braços Fab, Genmab). Exemplos de outras plataformas úteis para preparar anticorpos biespecíficos incluem, mas não se limitam a, aqueles descritos em WO 2008/119353 (Genmab), WO 2011/131746 (Genmab) e relatados por van der Neut-Kolfschoten et al.
(2007, Science 317 (5844):1554-7). Métodos tradicionais, tal como o hibridoma híbrido e os métodos de conjugação química (Marvin e Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26: 649) também podem ser usados. A coexpressão em uma célula hospedeira de dois anticorpos, consistindo em diferentes cadeias pesadas e leves, leva a uma mistura de possíveis produtos de anticorpos além do anticorpo biespecífico desejado, que pode, então, ser isolado por, por exemplo, cromatografia de afinidade ou métodos similares.
[0030] Será apreciado por versados na técnica que o polipeptídeo biespecífico pode compreender uma região Fc humana, ou uma variante de uma referida região, em que a região é uma região IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, preferencialmente uma região IgG1 ou IgG4.
[0031] As regiões constantes (Fc) dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. A região Fc é preferencialmente uma região Fc humana, ou uma variante de uma referida região. A região Fc pode ser uma região IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, preferencialmente uma região IgG1 ou IgG4. Uma variante de uma região Fc tipicamente liga a receptores Fc, tal como FcgammaR e/ou receptor Fc neonatal (FcRn) com afinidade alterada, proporcionando função melhorada e/ou meia-vida do polipeptídeo. A função biológica e/ou a meia-vida podem ser ou aumentadas ou diminuídas em relação à meia-vida de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc nativa. Exemplos de tais funções biológicas que podem ser moduladas pela presença de uma região Fc variante incluem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e/ou apoptose.
[0032] Uma sequência de aminoácido da região constante da cadeia pesada exemplar que pode ser combinada com qualquer sequência da região VH aqui divulgada (para formar uma cadeia pesada completa) é a sequência da região constante da cadeia pesada da IgG1 aqui reproduzida:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 135)
[0033] Outras sequências da região constante da cadeia pesada são conhecidas na técnica e também podem ser combinadas com qualquer região VH aqui divulgada. Por exemplo, uma região constante preferida é uma região constante de IgG4 modificada, tal como aquela reproduzida aqui:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS
RWQEGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 137)
[0034] Esta sequência de IgG4 modificada exibe ligação de FcRn reduzida e, portanto, resulta em uma meia- vida sérica reduzida em relação à IgG4 do tipo selvagem.
Além disso, ela exibe estabilização da dobradiça do núcleo de IgG4, tornando a IgG4 mais estável, impedindo a troca de braço de Fab.
[0035] Outra região constante preferida é uma região constante de IgG4 modificada, tal como aquela aqui reproduzida:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS
RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 139)
[0036] Essa sequência de IgG4 modificada resulta na estabilização da dobradiça do núcleo de IgG4, tornando a IgG4 mais estável, impedindo a troca de braço de Fab
[0037] Também preferida é uma região constante de IgG4 do tipo selvagem, como aquela aqui reproduzida:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS
RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 138)
[0038] Uma sequência de aminoácido da região constante da cadeia leve exemplar que pode ser combinada com qualquer sequência da região VL aqui divulgada (para formar uma cadeia leve completa) é a sequência da região constante da cadeia capa aqui reproduzida:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ
DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 136)
[0039] Outras sequências da região constante da cadeia leve são conhecidas na técnica e também poderiam ser combinadas com qualquer região VL aqui divulgada.
[0040] O anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tem certas características de ligação e efeitos funcionais preferidos, que são explicados em mais detalhes abaixo. O referido anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, preferencialmente retém estas características de ligação e efeitos funcionais quando incorporado como parte de um polipeptídeo biespecífico da invenção.
[0041] Numa modalidade, o fragmento de ligação ao antígeno pode ser selecionado do grupo que consiste em: um fragmento Fv (tal como um fragmento Fv de cadeia simples, ou um fragmento Fv ligado por dissulfeto), um fragmento tipo Fab (tal como um Fragmento Fab; um fragmento Fab’ ou um fragmento F(ab)2) e anticorpos de domínio.
[0042] Em uma modalidade, o polipeptídeo biespecífico pode ser um anticorpo IgG1 com um polipeptídeo não imunoglobulina (tal como um domínio de ligação a CTLA-
4, por exemplo, CD86 ou uma forma mutada do mesmo, tal como SEQ ID NO: 17; ver abaixo) fundido à parte C-terminal da cadeia capa.
[0043] Numa modalidade, o polipeptídeo biespecífico pode ser um anticorpo IgG1 com um fragmento scFv fundido à extremidade C-terminal da cadeia gama 1 pesada.
[0044] Numa modalidade, o polipeptídeo biespecífico pode conter 2-4 ligações de scFv a dois alvos diferentes.
[0045] Será apreciado por pessoas versadas na técnica que os alvos das células T, CTLA-4 e OX40, podem estar localizados na superfície de uma célula. Por “localizados na superfície de uma célula” significa que o alvo da célula T está associado à célula, de modo que uma ou mais regiões do alvo da célula T estejam presente na face externa da superfície da célula. Por exemplo, o alvo da célula T pode ser inserido na membrana plasmática da célula (isto é, orientado como uma proteína transmembranar) com uma ou mais regiões apresentadas na superfície extracelular.
Isto pode ocorrer no curso da expressão do alvo da célula T pela célula. Assim, em uma modalidade, “localizado na superfície de uma célula” pode significar “expressado na superfície de uma célula”. Alternativamente, o alvo da célula T pode estar fora da célula com interações covalentes e/ou iônicas localizando-o em um local específico ou regiões da superfície celular.
[0046] Será apreciado por pessoas versadas na técnica que os anticorpos biespecíficos da invenção podem ser capazes de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e/ou apoptose.
[0047] Numa modalidade adicional, o polipeptídeo é capaz de induzir imunidade tumoral. Isto pode ser testado in vitro em ensaios de ativação de células T, por exemplo, por medição. Produção de IL-2 e IFNγ. A ativação de células T efetoras implicaria que uma resposta de célula T específica de tumor pode ser alcançada in vivo. Além disso, uma resposta antitumoral em um modelo in vivo, tal como um modelo de camundongo, implicaria que uma resposta imune bem- sucedida em direção ao tumor foi alcançada.
[0048] O anticorpo pode modular a atividade de uma célula que expressa o alvo da célula T (CTLA-4 ou OX40), em que a referida modulação é um aumento ou uma diminuição da atividade da referida célula. A célula é tipicamente uma célula T. O anticorpo pode aumentar a atividade de uma célula efetora CD4+ ou CD8+, ou pode diminuir a atividade de uma célula T reguladora (Treg). Em qualquer caso, o efeito líquido do anticorpo será um aumento na atividade das células T efetoras, particularmente as células T efetoras CD4+. Os métodos para determinar uma mudança na atividade das células
T efetoras são bem conhecidos e incluem, por exemplo, medir um aumento no nível de produção de IL-2 da célula T ou um aumento na proliferação de célula T na presença do anticorpo em relação a o nível de produção de IL-2 de célula T e/ou proliferação de célula T na presença de um controle. Os ensaios para proliferação celular e/ou produção de IL-2 são bem conhecidos e são exemplificados nos Exemplos.
[0049] Os ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação de ligantes em direção a alvos são bem conhecidos na arte incluindo, por exemplo, ELISAs, Western blots, RIAs e análise de citometria de fluxo. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) do polipeptídeo também pode ser avaliada por ensaios padrão conhecidos na técnica, tal como por análise de Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR).
[0050] Os termos “atividade de ligação” e “afinidade de ligação” se destinam a se referir à tendência de uma molécula de polipeptídeo ligar ou não ligar a um alvo. A afinidade de ligação pode ser quantificada determinando a constante de dissociação (Kd) para um polipeptídeo e seu alvo. Uma Kd mais baixa é indicativa de uma afinidade mais alta para um alvo. Da mesma forma, a especificidade da ligação de um polipeptídeo ao seu alvo pode ser definida em termos das constantes de dissociação comparativas (Kd) do polipeptídeo para seu alvo em comparação com a constante de dissociação em relação ao polipeptídeo e a outra molécula não alvo.
[0051] O valor desta constante de dissociação pode ser determinado diretamente por métodos bem conhecidos e pode ser computado mesmo para misturas complexas por métodos tais como aqueles, por exemplo, estabelecidos em Caceci et al. (Byte 9: 340-362, 1984; cujas divulgações são aqui incorporadas por referência). Por exemplo, a Kd pode ser estabelecida utilizando um ensaio de ligação de filtro de nitrocelulose de filtro duplo, tal como aquele divulgado por Wong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993). Outros ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação de ligandos, tal como anticorpos em direção a alvos, são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, análise de ELISAs, Western blots, RIAs e citometria de fluxo. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) do anticorpo também pode ser avaliada por ensaios padrão conhecidos na técnica, tal como por análise de sistema Biacore™.
[0052] Um ensaio de ligação competitivo pode ser conduzido, no qual a ligação do anticorpo ao alvo é comparada à ligação do alvo por outro ligante conhecido desse alvo, tal como outro anticorpo. A concentração na qual ocorre 50% de inibição ocorre é conhecida como a Ki. Sob condições ideais, a Ki é equivalente a Kd. O valor de Ki nunca será menor que Kd, portanto, a medição de Ki pode ser convenientemente substituída para fornecer um limite superior para Kd.
[0053] Medidas alternativas de afinidade de ligação incluem EC50 ou IC50. Neste contexto, EC50 indica a concentração na qual um polipeptídeo atinge 50% de sua ligação máxima a uma quantidade fixa de alvo. IC50 indica a concentração na qual um polipeptídeo inibe 50% da ligação máxima de uma quantidade fixa de competidor para uma quantidade fixa de alvo. Nos dois casos, um nível mais baixo de EC50 ou IC50 indica uma afinidade mais alta para um alvo.
Os valores EC50 e IC50 de um ligando para seu alvo podem ser ambos determinados por métodos bem conhecidos, por exemplo ELISA. Ensaios adequados para avaliar a EC50 e IC50 dos polipeptídeos são estabelecidos nos Exemplos.
[0054] Um polipeptídeo da invenção é preferencialmente capaz de ligar a seu alvo com uma afinidade que é de pelo menos duas vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou maior que sua afinidade para ligar a outra molécula não alvo.
[0055] O polipeptídeo da invenção pode ser produzido por qualquer meio adequado. Por exemplo, todo ou parte do polipeptídeo pode ser expresso como uma proteína de fusão por uma célula compreendendo um nucleotídeo que codifica o referido polipeptídeo.
[0056] Alternativamente, as partes B1 e B2 podem ser produzidas separadamente e, então, subsequentemente unidas juntas. A união pode ser conseguida por qualquer meio adequado, por exemplo, usando os métodos de conjugação química e ligantes delineados acima. A produção separada das partes B1 e B2 pode ser alcançada por qualquer meio adequado.
Por exemplo, pela expressão de nucleotídeos separados opcionalmente em células separadas, como é explicado em mais detalhes abaixo.
Variantes
[0057] Os polipeptídeos biespecíficos ou domínios de ligação constituintes dos mesmos (tal como os domínios de ligação OX40 ou CTLA-4) aqui descritos podem compreender uma variante ou um fragmento de qualquer das sequências de aminoácidos específicas aqui recitadas, desde que o polipeptídeo ou domínio de ligação retenha a ligação a seu alvo. Numa modalidade, a variante de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode reter as sequências de CDR das sequências aqui recitadas. Por exemplo, o anticorpo anti-OX40 pode compreender uma variante ou um fragmento de qualquer uma das sequências de aminoácidos específicas recitadas nas Tabelas B, desde que o anticorpo retenha a ligação a seu alvo. Essa variante ou fragmento pode tipicamente reter as sequências de CDR da referida sequência da Tabela B. O domínio de ligação a CTLA-4 pode compreender uma variante de qualquer das sequências da Tabela C, desde que o domínio de ligação retenha a ligação a seu alvo.
[0058] Um fragmento de qualquer uma das sequências de aminoácidos de cadeia pesada ou leve recitadas neste documento pode compreender pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos consecutivos da referida sequência de aminoácido.
[0059] Uma variante de qualquer uma das sequências de aminoácidos de cadeia pesada ou leve aqui recitadas pode ser uma variante de substituição, deleção ou adição da referida sequência. Uma variante pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, até 10, até 20, até 30 ou mais substituições e/ou deleções de aminoácidos da referida sequência. As variantes de “deleção” podem compreender a deleção de aminoácidos individuais, a deleção de pequenos grupos de aminoácidos, tal como 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, ou a deleção de regiões de aminoácidos maiores, tal como a deleção de domínios de aminoácidos específicos ou outras características. As variantes de “substituição” envolvem preferencialmente a substituição de um ou mais aminoácidos pelo mesmo número de aminoácidos e a realização de substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, um aminoácido pode ser substituído por um aminoácido alternativo tendo propriedades semelhantes, por exemplo, outro aminoácido básico, outro aminoácido acídico, outro aminoácido neutro, outro aminoácido carregado, outro aminoácido hidrofílico, outro aminoácido hidrofóbico, outro aminoácido polar, outro aminoácido aromático ou outro aminoácido alifático.
Algumas propriedades dos 20 aminoácidos principais que podem ser usados para selecionar substituintes adequados são as seguintes:
Ala, A alifático, Met, M hidrofóbico, neutro hidrofóbico, neutro
Cys, C polar, hidrofóbico, Asn, N polar, hidrofílico,
neutro neutro
Asp, D polar, hidrofílico, Pro, P hidrofóbico, neutro carregado (-)
Glu, E polar, hidrofílico, Gln, Q polar, hidrofílico,
carregado (-) neutro
Phe, F aromático, Arg, R polar, hidrofílico,
hidrofóbico, neutro carregado (+)
Gly, G alifático, neutro Ser, S polar, hidrofílico,
neutro
His, H aromático, polar, Thr, T polar, hidrofílico,
hidrofílico, neutro carregado (+)
Ile, I alifático, Val, V alifático, hidrofóbico, neutro hidrofóbico, neutro Lys, K polar, hidrofílico, Trp, W aromático, carregado(+) hidrofóbico, neutro Leu, L alifático, Tyr, Y aromático, polar, hidrofóbico, neutro hidrofóbico
[0060] Os aminoácidos aqui mencionados podem ser referidos por nome completo, código de três letras ou código de letra única.
[0061] “Derivados” ou “variantes” preferidos incluem aqueles nos quais, em vez do aminoácido que ocorre naturalmente, o aminoácido que aparece na sequência é um análogo estrutural do mesmo. Aminoácidos utilizados nas sequências também podem ser derivados ou modificados, por exemplo, marcados, desde que a função do anticorpo não seja significativamente afetada adversamente.
[0062] Os derivados e as variantes descritas acima podem ser preparadas durante a síntese do anticorpo ou por modificação pós-produção ou quando o anticorpo está em forma recombinante usando as técnicas conhecidas de mutagênese dirigida a sítio, mutagênese aleatória ou clivagem enzimática e/ou ligação de ácidos nucleicos.
[0063] Preferencialmente, as variantes têm uma sequência de aminoácido que tem mais de 60%, ou mais de 70%,
por exemplo, 75 ou 80%, de preferência mais de 85%, por exemplo, mais de 90 ou 95% de identidade de aminoácido para uma sequência, como mostrado nas sequências aqui divulgadas.
Este nível de identidade de aminoácido pode ser visto em todo o comprimento da sequência SEQ ID NO relevante ou em uma parte da sequência, tal como em 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 ou mais aminoácidos, dependendo do tamanho do polipeptídeo de comprimento completo.
[0064] Em conexão com sequências de aminoácidos, “identidade de sequência” se refere a sequências que têm o valor declarado quando avaliadas usando ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res . 22(22):4673-80; cujas divulgações são incorporadas aqui por referência) com os seguintes parâmetros:
[0065] Parâmetros de alinhamento em pares - Método: preciso, Matriz: PAM, Penalidade de gap aberto: 10,00, Penalidade de extensão de gap: 0,10;
[0066] Múltiplos parâmetros de alinhamento - Matriz: PAM, penalidade de gap aberto: 10,00,% de identidade para retardo: 30, Penalizar gaps de extremidade: ativado, distância de separação de gap: 0, Matriz negativa: não, Penalidade de extensão de gap: 0,20, Penalidades de gap específicas de resíduos: ativado, Penalidades de gap hidrofílico: ativado, Resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR. A identidade de sequência de um resíduo particular pretende incluir resíduos idênticos que foram simplesmente derivados.
Polinucleotídeos, vetores e células
[0067] A invenção também se refere a polinucleotídeos que codificam todo ou parte de um polipeptídeo da invenção. Assim, um polinucleotídeo da invenção pode codificar qualquer polipeptídeo como aqui descrito, ou a totalidade ou parte de B1 ou a totalidade ou parte de B2. Os termos “molécula de ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são usados aqui de forma intercambiável e se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Exemplos não limitativos de polinucleotídeos incluem um gene, um fragmento de gene, RNA mensageiro (mRNA), cDNA, polinucleotídeos recombinantes, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo da invenção pode ser fornecido na forma isolada ou substancialmente isolada. Por substancialmente isolado, queremos dizer que pode haver isolamento substancial, mas não total, do polipeptídeo de qualquer meio circundante. Os polinucleotídeos podem ser misturados com transportadores ou diluentes que não interferem com seu uso pretendido e ainda são considerados como substancialmente isolados.
[0068] Uma sequência de ácido nucleico que “codifica” um polipeptídeo selecionado é uma molécula de ácido nucleico que é transcrita (no caso de DNA) e traduzida (no caso de mRNA) em um polipeptídeo in vivo quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um códon de partida no terminal 5’ (amino) e um códon de parada de tradução no terminal 3’ (carbóxi). Para os fins da invenção, essas sequências de ácidos nucleicos podem incluir, mas não estão limitadas a, cDNA de mRNA viral, procariótico ou eucariótico, sequências genômicas de DNA ou RNA viral ou procariótico e mesmo sequências de DNA sintéticas. Uma sequência de terminação de transcrição pode estar localizada 3’ para a sequência de codificação.
[0069] Polinucleotídeos representativos que codificam exemplos de uma sequência de aminoácido de cadeia pesada ou cadeia leve de um anticorpo podem compreender ou consistir em qualquer uma das sequências de nucleotídeos aqui divulgadas, por exemplo, as sequências estabelecidas na Tabela B. Polinucleotídeos representativos que codificam os polipeptídeos mostrados nas Tabelas D podem compreender ou consistir nas sequências nucleotídicas correspondentes que também são mostradas nas Tabelas D (sequências de íntrons são mostradas em minúsculas). Polinucleotídeos representativos que codificam exemplos de domínios de ligação de CTLA-4 podem compreender ou consistir em qualquer uma das SEQ ID NOS: 25 a 43, como mostrado na Tabela E.
[0070] Uma sequência polinucleotídica adequada pode, alternativamente, ser uma variante de uma destas sequências polinucleotídicas específicas. Por exemplo, uma variante pode ser uma substituição, deleção ou variante de adição de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos acima. Um polinucleotídeo variante pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, até 10, até 20, até 30, até 40, até 50, até 75 ou mais substituições e/ou deleções de ácido nucleico das sequências dadas na listagem de sequências.
[0071] Variantes adequadas podem ser pelo menos 70% homólogas a um polinucleotídeo de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos aqui divulgadas, preferencialmente pelo menos 80 ou 90% e mais preferencialmente pelo menos 95%, 97% ou 99% homólogas. De preferência, homologia e identidade nestes níveis estão presentes pelo menos com respeito às regiões de codificação dos polinucleotídeos. Métodos para medir homologia são bem conhecidos na técnica e será entendido pelos versados na técnica que, no presente contexto, homologia é calculada com base na identidade de ácido nucleico. Essa homologia pode existir através de uma região de pelo menos 15, preferencialmente pelo menos 30,
por exemplo, pelo menos 40, 60, 100, 200 ou mais nucleotídeos contíguos. Essa homologia pode existir através de todo o comprimento da sequência polinucleotídica não modificada.
[0072] Os métodos para medir homologia ou identidade de polinucleotídeo são conhecidos na técnica. Por exemplo, o UWGCG Package fornece o programa BESTFIT que pode ser usado para calcular homologia (por exemplo, usado em seus ajustes default) (Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Research 12:387-395; cujas divulgações são incorporadas aqui por referência).
[0073] Os algoritmos PILEUP e BLAST também podem ser usados para calcular sequências de homologia ou alinhamento (tipicamente em seus ajustes default), por exemplo, como descrito em Altschul, 1993, J Mol Evol 36:290-300; Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:403-10, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência).
[0074] O software para realizar análises BLAST está disponível publicamente através do National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Este algoritmo envolve primeiro identificar o par de sequências de alto escore (HSPs) identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta que ou correspondem ou satisfazem algum escore de limiar de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de base de dados. T é referido como o limiar de escore de palavra vizinhança (Altschul et al, supra). Estes acertos iniciais de palavra vizinha agem como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs que as contenham. Os acertos de palavra são estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência até o ponto em que o escore de alinhamento cumulativo possa ser aumentado.
Extensões para os acertos de palavras em cada direção são interrompidas quando: o escore de alinhamento cumulativo vai a zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de escore negativo; ou o fim de qualquer sequência é atingido. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como default um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de escore BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; cujas divulgações são aqui incorporadas por referência) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4 e uma comparação de ambas as fitas.
[0075] O algoritmo BLAST realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências; ver, por exemplo, Karlin e Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787; cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, uma sequência é considerada semelhante a outra sequência se a menor probabilidade de soma em comparação com a primeira sequência com a segunda sequência for menor que cerca de 1, preferencialmente menor que cerca de 0,1, mais preferencialmente menor que cerca de 0,01 e mais preferencialmente menor que cerca de 0,001.
[0076] O homólogo pode diferir de uma sequência no polinucleotídeo relevante por menos de 3, 5, 10, 15, 20 ou mais mutações (cada uma das quais pode ser uma substituição, deleção ou inserção). Estas mutações podem ser medidas através de uma região de pelo menos 30, por exemplo, pelo menos 40, 60 ou 100 ou mais nucleotídeos contíguos do homólogo.
[0077] Em uma modalidade, uma sequência variante pode variar das sequências específicas dadas na listagem de sequências em virtude da redundância no código genético. O código de DNA tem 4 resíduos primários de ácidos nucleicos (A, T, C e G) e utiliza estes para “soletrar” códons de três letras que representam os aminoácidos que as proteínas codificaram em genes de um organismo. A sequência linear de códons ao longo da molécula de DNA é traduzida para a sequência linear de aminoácidos na(s) proteína(s) codificada(s) por esses genes. O código é altamente degenerado, com 61 códons codificando para os 20 aminoácidos naturais e 3 códons representando sinais de “parada”. Assim, a maioria dos aminoácidos é codificada por mais de um códon - na verdade, vários são codificados por quatro ou mais códons diferentes. Um polinucleotídeo variante da invenção pode, portanto, codificar a mesma sequência polipeptídica que outro polinucleotídeo da invenção, mas pode ter uma sequência de ácido nucleico diferente devido ao uso de códons diferentes para codificar os mesmos aminoácidos.
[0078] Um polipeptídeo da invenção pode assim ser produzido de ou distribuído na forma de um polinucleotídeo que codifica e é capaz de expressá-lo.
[0079] Polinucleotídeos da invenção podem ser sintetizados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, conforme descrito a título de exemplo em Green & Sambrook (2012, Molecular Cloning - a laboratory manualo, 4ª edição; Cold Spring Harbor Press; cujas divulgações são aqui incorporadas por referência).
[0080] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem ser fornecidas na forma de um cassete de expressão que inclui sequências de controle opervelmente ligadas à sequência inserida, permitindo assim a expressão do polipeptídeo da invenção in vivo. Estes cassetes de expressão, por sua vez, são tipicamente fornecidos dentro de vetores (por exemplo, plasmídeos ou vetores virais recombinantes). Uma tal cassete de expressão pode ser administrado diretamente a um sujeito hospedeiro.
Alternativamente, um vetor compreendendo um polinucleotídeo da invenção pode ser administrado a um sujeito hospedeiro.
De preferência, o polinucleotídeo é preparado e/ou administrado usando um vetor genético. Um vetor adequado pode ser qualquer vetor que seja capaz de transportar uma quantidade suficiente de informação genética e permitir a expressão de um polipeptídeo da invenção.
[0081] A presente invenção inclui, assim, vetores de expressão que compreendem essas sequências polinucleotídicas. Tais vetores de expressão são rotineiramente construídos na técnica de biologia molecular e podem, por exemplo, envolver o uso de DNA plasmídico e iniciadores, promotores, intensificadores e outros elementos apropriados, tal como, por exemplo, sinais de poliadenilação que podem ser necessários e que estão posicionados no orientação correta, a fim de permitir a expressão de um peptídeo da invenção. Outros vetores adequados seriam evidentes para os versados na técnica (ver Green & Sambrook, supra).
[0082] A invenção também inclui células que foram modificadas para expressar um polipeptídeo da invenção.
Essas células incluem linhagens de células transientes ou preferivelmente eucarióticas superiores estáveis, tal como células de mamíferos ou células de insetos, células eucarióticas inferiores, tal como células de levedura ou procarióticas, tal como células bacterianas. Exemplos particulares de células que podem ser modificadas por inserção de vetores ou cassetes de expressão codificando para um polipeptídeo da invenção incluem células de mamífero HEK293T, CHO, HeLa, NS0 e COS. De preferência, a linhagem de célula selecionada será uma a qual não é apenas estável, mas também permite glicosilação madura e expressão da superfície celular de um polipeptídeo.
[0083] Tais linhagens de células da invenção podem ser cultivadas usando métodos de rotina para produzir um polipeptídeo da invenção, ou podem ser utilizadas terapeuticamente ou profilaticamente para distribuir anticorpos da invenção a um sujeito. Alternativamente, polinucleotídeos, cassetes de expressão ou vetores da invenção podem ser administrados a uma célula de um sujeito ex vivo e a célula, então, retornada ao corpo do sujeito.
Formulações Farmacêuticas, Usos Terapêuticos e Grupos de Pacientes
[0084] Em outro aspecto, a presente invenção fornece composições compreendendo moléculas da invenção, tal como os anticorpos, polipeptídeos biespecíficos, polinucleotídeos, vetores e células aqui descritos. Por exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma ou mais moléculas da invenção, tal como um ou mais anticorpos e/ou polipeptídeos biespecíficos da invenção e pelo menos um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0085] Como aqui utilizado, “transportador farmaceuticamente aceitável” inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção, e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. De preferência, o transportador é adequado para administração parenteral, por exemplo, intravenosa, intramuscular ou subcutânea (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da rota de administração, o polipeptídeo pode ser revestido em um material para proteger o polipeptídeo da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar ou desnaturar o polipeptídeo.
[0086] Transportadores farmaceuticamente aceitáveis preferidos compreendem transportadores ou diluentes aquosos.
Exemplos de transportadores aquosos adequados que podem ser empregados nas composições da invenção incluem água, água tamponada e salina. Exemplos de outros transportadores incluem etanol, polióis (tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similares) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tal como óleo de olive, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e pelo uso de surfactantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tal como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição.
[0087] Uma composição da invenção também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Estas composições também podem conter adjuvantes, tal como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização, supra, como pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico e similares. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tal como açúcares, cloreto de sódio e similares nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tal como monoestearato de alumínio e gelatina.
[0088] Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de droga.
[0089] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o agente ativo (por exemplo, polipeptídeo) na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de microfiltração de esterilização. Geralmente, dispersões são preparadas incorporando o agente ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dentre aqueles enumerados acima.
No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e liofilização (liofilização) que produzem um pó do agente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução filtrada estéril anteriormente do mesmo.
[0090] As composições particularmente preferidas são formuladas para administração sistêmica ou para administração local. A administração local pode estar no sítio de um tumor ou em um linfonodo de drenagem de tumor.
A composição pode preferencialmente ser formulada para liberação sustentada durante um período de tempo. Assim, a composição pode ser fornecida em ou como parte de uma matriz facilitando a liberação sustentada. Matrizes de liberação sustentada preferidas podem compreender uma montanida ou nanopartículas de ácido y-poliglutâmico (PGA). A liberação localizada de um polipeptídeo da invenção, opcionalmente durante um período de tempo sustentado, pode reduzir potenciais efeitos secundários autoimunes associados à administração de um antagonista de CTLA-4.
[0091] As composições da invenção podem compreender ingredientes ativos adicionais, bem como um polipeptídeo da invenção. Como mencionado acima, as composições da invenção podem compreender um ou mais polipeptídeos da invenção. Eles também podem compreender agentes terapêuticos ou profiláticos adicionais.
[0092] Também dentro do escopo da presente invenção estão kits compreendendo polipeptídeos ou outras composições da invenção e instruções para uso. O kit pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, tal como um agente terapêutico ou profilático adicional, como discutido acima.
[0093] Os polipeptídeos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados em terapia ou profilaxia. Em aplicações terapêuticas, polipeptídeos ou composições são administrados a um sujeito já sofrendo de um distúrbio ou uma condição, em uma quantidade suficiente para curar, aliviar ou interromper parcialmente a condição ou um ou mais de seus sintomas. Esse tratamento terapêutico pode resultar em uma diminuição na severidade de sintomas da doença ou em um aumento na frequência ou duração dos períodos livres de sintomas. Uma quantidade adequada para conseguir isto é definida como “quantidade terapeuticamente eficaz”. Em aplicações profiláticas, polipeptídeos ou composições são administrados a um sujeito ainda não exibindo sintomas de um distúrbio ou uma condição, em uma quantidade suficiente para impedir ou retardar o desenvolvimento de sintomas. Essa quantidade é definida como uma “quantidade profilaticamente eficaz”. O sujeito pode ter sido identificado como estando em risco de desenvolver a doença ou condição por qualquer meio adequado.
[0094] Em particular, anticorpos e polipeptídeos biespecíficos da invenção podem ser úteis no tratamento ou na prevenção de câncer. Por conseguinte, a invenção fornece um anticorpo ou polipeptídeo biespecífico da invenção para uso no tratamento ou na prevenção de câncer. A invenção também fornece um método para tratar ou prevenir câncer compreendendo administrar a um indivíduo um polipeptídeo da invenção. A invenção também fornece um anticorpo ou polipeptídeo biespecífico da invenção para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de câncer.
[0095] O câncer pode ser câncer de próstata, câncer de mama, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer cervical, rabdomiossarcoma, neuroblastoma, mieloma múltiplo, leucemia,
leucemia linfoblástica aguda, melanoma, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de pele, linfoma ou glioblastoma.
[0096] Um anticorpo ou polipeptídeo biespecífico da presente invenção, ou uma composição compreendendo o referido anticorpo ou o referido polipeptídeo, pode ser administrado através de uma ou mais rotas de administração utilizando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado pelos versados na técnica, a rota e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados. Administração sistêmica ou administração local são preferidas. A administração local pode estar no sítio de um tumor ou em um linfonodo de drenagem de tumor. Modos de administração preferidos para polipeptídeos ou composições da invenção incluem modos de administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outros modos de administração parenterais, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase “administração parenteral”, como aqui utilizada, significa modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, geralmente por injeção.
Alternativamente, um polipeptídeo ou uma composição da invenção pode ser administrada por um modo não parenteral, tal como um modo de administração tópica, epidérmica ou de mucosa.
[0097] Uma dosagem adequada de um anticorpo ou polipeptídeo da invenção pode ser determinada por um médico especialista. Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, uma composição e um modo de administração particular, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade do polipeptídeo particular empregado, a rota de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do polipeptídeo, a duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e o histórico médico anterior do paciente sendo tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.
[0098] Uma dose adequada de um anticorpo ou polipeptídeo da invenção pode estar, por exemplo, na faixa de cerca de 0,1 µg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal do paciente a ser tratado. Por exemplo, uma dosagem adequada pode ser de cerca de 1 µg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia ou de cerca de 10 g/kg a cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dia.
[0099] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta ideal desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilitar a administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária como aqui utilizada se refere a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico necessário.
[00100] Anticorpos ou polipeptídeos podem ser administrados em uma dose única ou em doses múltiplas. As doses múltiplas podem ser administradas através da mesma ou de diferentes rotas e no mesmo ou em diferentes locais.
Alternativamente, anticorpos ou polipeptídeos podem ser administrados como uma formulação de liberação sustentada como descrito acima, em cujo caso a administração menos frequente é necessária. A dosagem e a frequência podem variar dependendo da meia-vida do polipeptídeo no paciente e da duração do tratamento que é desejado. A dosagem e a frequência de administração também podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa pode ser administrada em intervalos relativamente infrequentes durante um longo período de tempo. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta pode ser administrada, por exemplo, até que o paciente mostre melhora parcial ou completa de sintomas da doença.
[00101] A administração combinada de dois ou mais agentes pode ser alcançada de várias maneiras diferentes.
Em uma modalidade, o anticorpo ou polipeptídeo e o outro agente podem ser administrados juntos em uma única composição. Em outra modalidade, o anticorpo ou polipeptídeo e o outro agente podem ser administrados em composições separadas como parte de uma terapia combinada. Por exemplo, o modulador pode ser administrado antes, depois ou simultaneamente com o outro agente.
[00102] Um anticorpo, polipeptídeo ou uma composição da invenção também podem ser usados em um método para aumentar a ativação de uma população de células expressando o primeiro e o segundo alvo de célula T, o método compreendendo administrar à referida população de células um polipeptídeo ou uma composição da invenção sob condições adequadas para permitir interação entre a referida célula e um polipeptídeo da invenção. A população de células compreende tipicamente pelo menos algumas células que expressam o primeiro alvo de célula T, tipicamente células T, e pelo menos algumas células que expressam o segundo alvo de célula T. O método é tipicamente realizado ex vivo.
[00103] Por exemplo, um anticorpo, polipeptídeo ou uma composição da invenção também podem ser usados em um método para aumentar a ativação de uma população de células expressando OX40 humano e CTLA-4 humano, o método como descrito acima.
Domínios de ligação para CTLA-4
[00104] Os polipeptídeos biespecíficos da invenção compreendem um domínio de ligação específico para CTLA-4.
[00105] CD86 e CD80 podem ser aqui referidos como proteínas B7 (B7-2 e B7-1, respectivamente). Estas proteínas são expressas na superfície de células apresentadoras de antígenos e interagem com os receptores de células T CD28 e CTLA-4. A ligação das moléculas B7 a CD28 promove a ativação de célula T, enquanto a ligação de moléculas B7 a CTLA-4 desliga a ativação da célula T. A interação entre as proteínas B7 com CD28 e/ou CTLA-4 constitui uma via de sinalização coestimulatória que desempenha um papel importante na ativação e regulação imunes. Assim, as moléculas B7 fazem parte de uma via, passível de manipulação, a fim de desacoplar inibição imune, desse modo, intensificando a imunidade em pacientes.
[00106] A proteína CD86 é um monômero e consiste em dois domínios da superfamília de imunoglobulina extracelular. O domínio de ligação de receptor de CD86 tem uma estrutura típica de conjunto de IgV, enquanto o domínio proximal da membrana tem uma estrutura semelhante a um conjunto de C1. As estruturas de CD80 e CD86 foram determinadas isoladamente ou em complexo com CTLA-4. Os resíduos de contato nas moléculas de CD80 e CD86 estão no domínio extracelular solúvel e estão localizados principalmente nas folhas beta e não nas alças (tipo CDR).
[00107] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácido do domínio extracelular solúvel monomérico de CD86 tipo selvagem humano. Esta sequência tipo selvagem pode opcionalmente carecer de Alanina e Prolina no N-terminal, isto é, posições 24 e 25. Estes aminoácidos podem ser aqui referidos como A24 e P25, respectivamente.
[00108] Um polipeptídeo biespecífico da invenção tem como domínio de ligação de polipeptídeo um domínio que é específico para CTLA-4, um “domínio de ligação de CTLA-4”.
Exemplos adequados de tais domínios de ligação são divulgados em WO 2014/207063, cujo conteúdo é incorporado por referência. O domínio de ligação específico para CTLA-4 também pode ligar a CD28. O termo CTLA-4 como aqui utilizado e refere tipicamente a CTLA-4 humano e o termo CD28 como aqui utilizado se refere tipicamente a CD28 humano. As sequências de CTLA-4 humano e CD28 humano são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. O domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da presente invenção pode ter alguma afinidade de ligação para CTLA-4 ou CD28 de outros mamíferos, por exemplo, CTLA-4 ou CD28 de primata ou murino.
[00109] O domínio de ligação de CTLA-4 tem a capacidade de ligar a CTLA-4 em seu estado nativo e, em particular, a CTLA-4 localizado na superfície de uma célula.
[00110] “Localizado na superfície de uma célula” é como definido acima.
[00111] A parte do domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção pode compreender ou consistir em: (i) sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; ou (ii) uma sequência de aminoácido na qual pelo menos um aminoácido é mudado quando comparado à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, desde que o referido domínio de ligação ligue a CTLA-4 humano com afinidade mais alta que CD86 humano tipo selvagem.
[00112] Em outras palavras, o domínio de ligação de CTLA-4 é um domínio de ligação de polipeptídeo específico para CTLA-4 humano que compreende ou consiste (i) no domínio extracelular solúvel monomérico de CD86 tipo selvagem humano, ou (ii) em uma variante de polipeptídeo do referido domínio extracelular solúvel, desde que a referida variante de polipeptídeo ligue CTLA-4 humano com afinidade mais alta que CD86 humano tipo selvagem.
[00113] Por conseguinte, o domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção pode ter as mesmas propriedades de ligação alvo que CD86 tipo selvagem humano, ou pode ter propriedades de ligação de alvo diferentes em comparação com as propriedades de ligação de alvo de CD86 tipo selvagem humano. Para os fins de comparar tais propriedades, “CD86 tipo selvagem humano” tipicamente se refere ao domínio extracelular solúvel monomérico de CD86 tipo selvagem humano, conforme descrito na seção anterior.
[00114] CD86 tipo selvagem humano liga especificamente a dois alvos, CTLA-4 e CD28. Por conseguinte, as propriedades de ligação do domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção podem ser expressas como uma medida individual da capacidade do polipeptídeo de ligar a cada um destes alvos. Por exemplo, uma variante de polipeptídeo do domínio extracelular monomérico de CD86 tipo selvagem humano liga preferencialmente a CTLA-4 com uma afinidade de ligação mais alta do que aquela de CD86 humano tipo selvagem para CTLA-4. Um tal polipeptídeo pode opcionalmente também ligar a CD28 com uma afinidade de ligação mais baixa do que aquela de CD86 humano tipo selvagem para CD28.
[00115] O domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção é um domínio de ligação de polipeptídeo específico para CTLA-4. Isto significa que ele liga a CTLA-4 preferencialmente com uma maior afinidade de ligação do que aquela na qual ele liga a outra molécula. O domínio de ligação de CTLA-4 liga preferencialmente a CTLA- 4 com a mesma ou com uma afinidade mais alta que aquela de CD86 humano tipo selvagem para CTLA-4.
[00116] De preferência, a Kd do domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção para CTLA-4 humano será de pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 8 vezes ou pelo menos 10 vezes menor que a Kd de CD86 humano tipo selvagem para CTLA-4 humano. Mais preferencialmente, a Kd do domínio de ligação de CTLA-4 para CTLA-4 humano será de pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes menor que a Kd de CD86 humano tipo selvagem para CTLA- 4 humano. Um método preferido para determinar a Kd de um polipeptídeo para CTLA-4 é análise de SPR, por exemplo, com um sistema Biacore™. Protocolos adequados para a análise de SPR de polipeptídeos são estabelecidos nos Exemplos.
[00117] De preferência, a EC50 do domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção para CTLA-4 humano será de pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos
3 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 12 vezes, pelo menos 14 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 17 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes ou pelo menos 50 vezes menor que a EC50 de CD86 humano tipo selvagem para CTLA-4 humano nas mesmas condições. Mais preferencialmente, a EC50 do domínio de ligação de CTLA-4 para CTLA-4 humano será de pelo menos 10 vezes ou pelo menos 25 vezes menor que a EC50 de CD86 humano tipo selvagem para CTLA-4 humano nas mesmas condições. Um método preferido para determinar a EC50 de um polipeptídeo para CTLA-4 é via ELISA. Ensaios ELISA adequados para uso na avaliação da EC50 de polipeptídeos são estabelecidos nos Exemplos.
[00118] Preferencialmente, a IC50 do domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção, quando competindo com CD86 humano tipo selvagem pela ligação a CTLA- 4 humano, será de pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 13 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes ou pelo menos 300 vezes menor que a IC50 de CD86 humano tipo selvagem nas mesmas condições.
Mais preferencialmente, a IC50 do domínio de ligação de CTLA- 4 será de pelo menos 10 vezes ou pelo menos 300 vezes menor que a IC50 de CD86 humano tipo selvagem nas mesmas condições.
Um método preferido para determinar a IC50 de um polipeptídeo da invenção é via ELISA. Ensaios ELISA adequados para uso na avaliação da IC50 de polipeptídeos da invenção são estabelecidos nos Exemplos.
[00119] O domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção também pode ligar especificamente a CD28. Isto é, o domínio de ligação de CTLA-4 pode ligar a CD28 com maior afinidade de ligação do que aquela na qual ele liga a outra molécula, com a exceção de CTLA-4. O domínio de ligação de CTLA-4 pode ligar a CD28 humano com uma afinidade mais baixa que aquela de CD86 humano tipo selvagem para CD28 humano. De preferência, a Kd do domínio de ligação de CTLA-4 para CD28 humano será de pelo menos 2 vezes, preferencialmente de pelo menos 5 vezes, mais preferencialmente de pelo menos 10 vezes mais alta que a Kd de CD86 humano tipo selvagem para CD28 humano.
[00120] As propriedades de ligação do domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção também podem ser expressas como uma medida relativa da capacidade de um polipeptídeo ligar aos dois alvos, CTLA-4 e CD28. Isto é, as propriedades de ligação do domínio de ligação de CTLA-4 podem ser expressas como uma medida relativa da capacidade do polipeptídeo de ligar a CTLA-4 versus sua capacidade de ligar a CD28. Preferencialmente, o domínio de ligação de CTLA-4 tem uma elevada capacidade relativa de ligar a CTLA- 4 versus CD28, quando comparado com a capacidade relativa correspondente de CD86 tipo selvagem humano para ligar a CTLA-4 versus CD28.
[00121] Quando a afinidade de ligação de um polipeptídeo para ambos CTLA-4 e CD28 é avaliada usando o mesmo parâmetro (por exemplo, Kd, EC50), então, a capacidade de ligação relativa do polipeptídeo para cada alvo pode ser expressa como uma razão simples dos valores de o parâmetro para cada alvo. Esta razão pode ser referida como a razão de ligação ou a razão de intensidade de ligação de um polipeptídeo. Para muitos parâmetros usados para avaliar a afinidade de ligação (por exemplo, Kd, EC50), um valor mais baixo indica uma afinidade mais alta. Quando este for o caso, a razão de afinidades de ligação para CTLA-4 versus CD28 é preferencialmente expressa como um único valor numérico calculado de acordo com a seguinte fórmula: Razão de ligação = [afinidade de ligação para CD28] ÷ [afinidade de ligação para CTLA-4]
[00122] Alternativamente, se a afinidade de ligação for avaliada usando um parâmetro para o qual um valor mais alto indica uma afinidade mais alta, o inverso da fórmula acima é preferido. Em qualquer contexto, o domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção tem preferencialmente uma razão de ligação mais alta que CD86 tipo selvagem humano. Será apreciado que a comparação direta da razão de ligação para um dado polipeptídeo com a razão de ligação para outro polipeptídeo tipicamente requer que os mesmos parâmetros sejam utilizados para avaliar as afinidades de ligação e calcular as razões de ligação para ambos os polipeptídeos.
[00123] Preferencialmente, a razão de ligação para um polipeptídeo é calculada determinando a Kd do polipeptídeo para cada alvo e, então, calculando a razão de acordo com a fórmula [Kd para CD28] ÷ [Kd para CTLA-4]. Esta razão pode ser referida como a razão de ligação de Kd de um polipeptídeo. Um método preferido para determinar a Kd de um polipeptídeo para um alvo é análise de SPR, por exemplo, com um sistema Biacore™. Protocolos adequados para a análise de SPR de polipeptídeos da invenção são estabelecidos nos Exemplos. A razão de ligação do domínio de ligação de CTLA- 4 do polipeptídeo da invenção calculada de acordo com este método é preferencialmente de pelo menos 2 vezes ou de pelo menos 4 vezes mais alta que a razão de ligação de CD86 humano tipo selvagem calculado de acordo com o mesmo método.
[00124] Alternativamente, a razão de ligação para um polipeptídeo pode ser calculada determinando a EC50 do polipeptídeo para cada alvo e, então, calculando a razão de acordo com a fórmula [EC50 para OX40] ÷ [EC50 para CTLA-4].
Esta razão pode ser referida como a razão de ligação de EC50 de um polipeptídeo. Um método preferido para determinar a EC50 de um polipeptídeo para um alvo é via ELISA. Ensaios
ELISA adequados para uso na avaliação da EC50 de polipeptídeos da invenção são estabelecidos nos Exemplos. A razão de ligação do domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção calculada de acordo com este método é de pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes ou pelo menos 10 vezes mais alta que a razão de ligação de CD86 humano tipo selvagem calculado de acordo com o mesmo método.
[00125] O domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção pode ter a capacidade de competir de forma cruzada com outro polipeptídeo por ligação a CTLA-
4. Por exemplo, o domínio de ligação de CTLA-4 pode competir de forma cruzada com um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs: 6 a 24 para ligação a CTLA-4. Tais polipeptídeos de competição cruzada podem ser identificados em ensaios de ligação padrão. Por exemplo, análise de SPR (por exemplo, com um sistema Biacore™), ensaios ELISA ou citometria de fluxo podem ser usados para demonstrar competição cruzada.
[00126] Além das características funcionais acima, o domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção tem certas características estruturais preferidas. O domínio de ligação de CTLA-4 ou compreende ou consiste (i) no domínio extracelular solúvel monomérico de CD86 tipo selvagem humano, ou (ii) em uma variante de polipeptídeo do referido domínio extracelular solúvel, desde que a referida variante de polipeptídeo ligue CTLA-4 humano com afinidade mais alta que CD86 humano tipo selvagem.
[00127] Uma variante de polipeptídeo do domínio extracelular solúvel monomérico de CD86 tipo selvagem humano compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido que é derivada daquela de CD86 tipo selvagem humano, especificamente a sequência de aminoácido do domínio extracelular solúvel de CD86 tipo selvagem humano (SEQ ID NO: 3), opcionalmente carecendo de A24 e P25. Em particular, uma variante compreende uma sequência de aminoácido na qual pelo menos um aminoácido é mudado quando comparado com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25). Por “mudado” queremos dizer que pelo menos um aminoácido é deletado, inserido ou substituído em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25). Por “deletado” queremos dizer que o pelo menos um aminoácido presente na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25) é removido, de modo que a sequência de aminoácido seja encurtada por um aminoácido. Por “inserido” queremos dizer que o pelo menos um aminoácido adicional é introduzido na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou na referida sequência carecendo de A24 e P25), de modo que a sequência de aminoácido seja alongada por um aminoácido. Por “substituído” queremos dizer que o pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25) é substituído por um aminoácido alternativo.
[00128] Tipicamente, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos são mudados quando comparados com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25). Tipicamente, não mais que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 2 ou 1 aminoácidos são mudados quando comparados com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25). Será apreciado que qualquer destes limites inferiores pode ser combinado com qualquer um destes limites superiores para definir uma faixa para o número permitido de mudanças em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25). Assim, por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode compreender uma sequência de aminoácido na qual o número permitido de mudanças de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25) está na faixa 2 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 2 a 6, 2 a 7, 2 a 8, 2 a 9, 2 a 10, 3 a 4, 3 a 5, 3 a 6 e assim por diante.
[00129] É particularmente preferido que pelo menos 2 aminoácidos sejam mudados quando comparados com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25). De preferência, o número permitido de mudanças de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25) está na faixa de 2 a 9, 2 a 8 ou 2 a 7.
[00130] Os números e as faixas estabelecidas acima podem ser alcançados com qualquer combinação de deleções, inserções ou substituições em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25). Por exemplo, pode haver apenas deleções, apenas inserções ou apenas substituições em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25), ou qualquer mistura de deleções, inserções ou substituições. Preferencialmente, a variante compreende uma sequência de aminoácido na qual todas as mudanças comparadas com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25) são substituições. Isto é, uma sequência na qual nenhum aminoácido é deletado ou inserido em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25). Na sequência de aminoácido de uma variante preferida, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos são substituídos quando comparados com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25) e nenhum aminoácido é deletado ou inserido em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25).
[00131] De preferência, as mudanças comparadas com a sequência de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25) estão na região de alça FG (posições 114 a 121) e/ou na região de folha beta de SEQ ID NO: 3. As fitas da região de folha beta têm as seguintes posições em SEQ ID NO: 3: A:27-31, B:36-37, C:54-58, C´:64-69, C´´:72-74, D:86- 88, E:95-97, F:107-113, G:122-133.
[00132] Mais preferencialmente, as mudanças comparadas com a sequência de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25) estão em uma ou mais das posições selecionadas de 32, 48, 49, 54, 74, 77, 79, 103, 107, 111, 118, 120, 121, 122, 125, 127 ou 134. Toda a numeração de posições de aminoácidos neste documento é baseada na contagem dos aminoácidos em SEQ ID NO: 4 começando do N terminal. Assim, a primeira posição no N terminal de SEQ ID NO: 3 é numerada 24 (ver diagrama esquemático na Figura 4).
[00133] Inserções particularmente preferidas incluem um único aminoácido adicional inserido entre as posições 116 e 117 e/ou um único aminoácido adicional inserido entre as posições 118 e 119. O aminoácido inserido é preferencialmente Tirosina (Y), Serina (S), Glicina (G), Leucina (L) ou Ácido Aspártico (D).
[00134] Uma substituição particularmente preferida está na posição 122, que é Arginina (R). O polipeptídeo da invenção inclui preferencialmente uma sequência de aminoácido na qual pelo menos a posição 122 é substituída em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25). A substituição mais preferida na posição 122 é substituir Arginina (R) por Lisina (K) ou Asparagina (N), classificada em ordem de preferência. Esta substituição pode ser referida como R122K/N.
[00135] Outras substituições preferidas estão nas posições 107, 121 e 125, que são Leucina (L), Isoleucina (I) e Ácido glutâmico (Q), respectivamente. Além da substituição na posição 122, o polipeptídeo da invenção inclui preferencialmente uma sequência de aminoácido na qual pelo menos um dos aminoácidos nas posições 107, 121 e 125 também é substituído em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (ou a referida sequência carecendo de A24 e P25). A sequência de aminoácido do polipeptídeo da invenção também pode ser substituída em uma ou mais das posições 32, 48, 49, 54, 64, 74, 77, 79, 103, 111, 118, 120, 127 e 134.
[00136] A substituição mais preferida na posição 107 é substituir Leucina (L) por Isoleucina (I), Fenilalanina
(F) ou Arginina (R), classificadas em ordem de preferência.
Esta substituição pode ser referida como L107I/F/R. Notação semelhante é usada para outras substituições aqui descritas.
A substituição mais preferida na posição 121 é substituir Isoleucina (I) por Valina (V). Esta substituição pode ser referida como I121V.
[00137] A substituição mais preferida na posição 125 é substituir Glutamina (Q) por Ácido Glutâmico (E). Esta substituição pode ser referida como Q125E.
[00138] Outras substituições que podem ser preferidas na sequência de aminoácido do polipeptídeo da invenção incluem: F32I, Q48L, S49T, V54I, V64I, K74I/R, S77A, H79D/S/A, K103E, I111V, T118S, M120L, N127S/D e A134T.
[00139] Variantes particularmente preferidas do referido domínio extracelular solúvel de CD86 tipo selvagem humano compreendem ou consistem em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6 a 24, como mostrado na Tabela C.
[00140] As sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 6 a 14 podem opcionalmente incluir os resíduos adicionais AP no N terminal. As sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 15 a 24 podem opcionalmente carecer dos resíduos AP no N terminal. Em qualquer caso, estes resíduos correspondem a A24 e P25 de SEQ ID NO: 3.
[00141] O domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção pode compreender ou consistir em qualquer uma das variantes descritas acima do referido domínio extracelular solúvel de CD86 tipo selvagem humano.
Isto é, o domínio de ligação de CTLA-4 do polipeptídeo da invenção pode compreender ou consistir na sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 24, como mostrado na Tabela C.
[00142] O domínio de ligação pode modular a sinalização de CTLA-4, por exemplo, quando administrado a uma célula expressando CTLA-4, tal como uma célula T. De preferência, o domínio de ligação reduz, isto é, inibe ou bloqueia, a referida sinalização e, desse modo, aumenta a ativação da referida célula. Mudanças em sinalização de CTLA-4 e ativação de célula como resultado da administração de um agente de teste (tal como o domínio de ligação) podem ser determinadas por qualquer método adequado. Métodos adequados incluem ensaiar quanto à capacidade de CD86 ligado à membrana (por exemplo, em células Raji) ligar e sinalizar através de CTLA-4 expresso na superfície de células T, quando na presença de um agente de teste ou na presença de um controle adequado . Um nível elevado de produção de IL-2 de célula T ou um aumento na proliferação de célula T na presença do agente de teste em relação ao nível de produção de IL-2 de células T e/ou a proliferação de célula T na presença do controle é indicativo de sinalização reduzida através de CTLA-4 e elevada ativação de célula. Um ensaio típico deste tipo é divulgado no Exemplo 9 de US20080233122.
Domínios de ligação para OX40
[00143] As moléculas de ligação biespecíficas da invenção podem incorporar como um domínio de ligação (por exemplo, como B1) qualquer domínio de ligação de OX40, por exemplo, um anticorpo anti-OX40.
[00144] O anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que liga especificamente a OX40 tem certas características de ligação e efeitos funcionais preferidos, que são explicados em mais detalhes abaixo. O referido anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, preferencialmente retém estas características de ligação e estes efeitos funcionais quando incorporados como parte de um anticorpo biespecífico da invenção. Este domínio de ligação também pode ser fornecido independentemente das moléculas biespecíficas da invenção.
[00145] O anticorpo preferencialmente liga especificamente a OX40, isto é, ele liga ao OX40, mas não liga, ou liga a uma afinidade mais baixa, a outras moléculas.
O termo OX40, como aqui utilizado, se refere tipicamente a OX40 humano. A sequência do OX40 humano é estabelecida em SEQ ID NO: 51 (correspondente a GenBank: NP_003318.1). O anticorpo pode ter alguma afinidade de ligação para OX40 de outros mamíferos, tal como OX40 de um primata não humano (por exemplo, Macaca fascicularis (macaco cynomolgus), Macaca mulatta). O anticorpo preferencialmente não liga ao OX40 de murino e/ou não liga a outros membros da superfamília de TNFR humano, por exemplo, CD137 ou CD40 humanos.
[00146] O anticorpo tem a capacidade de ligar a OX40 em seu estado nativo e, em particular, a OX40 localizado na superfície de uma célula. De preferência, o anticorpo ligará especificamente a OX40. Isto e, um anticorpo da invenção ligará preferencialmente a OX40 com maior afinidade de ligação do que aquela na qual ele liga a outra molécula.
[00147] “Localizado na superfície de uma célula” é como definido acima.
[00148] O anticorpo pode modular a atividade de uma célula expressando OX40, em que a referida modulação é um aumento ou uma diminuição na atividade da referida célula, como definido acima. A célula é tipicamente uma célula T.
O anticorpo pode aumentar a atividade de uma célula efetora CD4+ ou CD8+, ou pode diminuir a atividade de uma célula T reguladora (T reg), como descrito acima.
[00149] Em qualquer caso, o efeito líquido do anticorpo será um aumento na atividade das células T efetoras, particularmente as células T efetoras CD4+.
Métodos para determinar uma mudança na atividade de células T efetoras são bem conhecidos e são descritos acima.
[00150] O anticorpo liga preferencialmente a OX40 humano com um valor de Kd que é inferior a 50x10-10M ou inferior a 25x10-10M, mais preferencialmente menos que 10, 9, 8, 7, ou 6x10-10M, mais preferencialmente menos que 5x10-10M.
[00151] Por exemplo, o anticorpo preferencialmente não liga a OX40 de murino ou a qualquer outro membro da superfamília TNFR, tal como CD137 ou CD40. Portanto, tipicamente, a Kd para o anticorpo em relação a OX40 humano será 2 vezes, preferencialmente 5 vezes, mais preferencialmente 10 vezes menor que a Kd em relação à outra molécula não alvo, tal como o OX40 murino, membros da superfamília de TNFR ou qualquer outro material não relacionado ou material anexo no ambiente. Mais preferencialmente, a Kd será 50 vezes menor, ainda mais preferencialmente 100 vezes menor e ainda mais preferencialmente 200 vezes menor.
[00152] O valor desta constante de dissociação pode ser determinado diretamente por métodos bem conhecidos, como descrito acima.
[00153] Os polipeptídeos da invenção são preferencialmente capazes de ligar a seu alvo com uma afinidade que é de pelo menos duas vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou maior que sua afinidade para ligação a outra molécula não alvo.
[00154] Em resumo, portanto, o anticorpo exibe preferencialmente pelo menos uma das seguintes características funcionais: I. ligação a OX40 humano com um valor KD que é inferior a 10x10-10M; II. não liga a OX40 murino; III. não liga a outros membros da superfamília de TNFR humano, por exemplo CD137 ou CD40 humano.
[00155] O anticorpo é específico para OX40, tipicamente OX40 humano e pode compreender qualquer um, dois, três, quatro, cinco ou todos os seis seguintes: (a) uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que é de 8 aminoácidos de comprimento e compreende a sequência de consenso: “G, F, T, F, G/Y/S, G/Y/S, Y/S, Y/S/A”; (b) uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que é de 8 aminoácidos de comprimento e compreende a sequência de consenso: “ I, G/Y/S/T, G/S/Y, S/Y, G/S/Y, G/S/Y, G/S/Y, T”; (c) uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que é de 9 a 17 aminoácidos de comprimento e que compreende a sequência de consenso de: “A, R, G/Y/S/H, G/Y/F/V/D, G/Y/P/F, -/H/S, -/N/D/H, -/Y/G, -/Y, -/Y, -/W/A/V, -/A/Y, -/D/A/Y/G/H/N, Y/S/W/A/T, L/M/I/F, D, Y”. As sequências de CDR3 de cadeia pesada preferidas dentro desta definição incluem uma sequência de CDR3 de 10 aminoácidos de comprimento que compreende a sequência de consenso “A, R, Y/H, D, Y, A/Y/G,
S/W/A, M/L, D, Y” ou uma sequência de CDR3 de 11 aminoácidos de comprimento que compreende a sequência de consenso “A, R, G/Y, V/F/Y, P, H, G/Y/H, Y, F/I, D, Y”; (d) uma sequência de CDR1 de cadeia leve que consiste na sequência: “Q, S, I, S, S, Y”; (e) uma sequência de CDR2 de cadeia leve que consiste na sequência: “A, A, S”; (f) uma sequência CDR3 de cadeia leve que é de 8 a 10 aminoácidos de comprimento e compreende a sequência de consenso: “Q,Q, S/Y/G, -/Y/H/G, -/S/Y/G/D/W, S/Y/G/D , S/Y/G/T, P/L, Y/S/H/L/F, T”. Um exemplo preferido de uma sequência CDR3 de cadeia leve dentro desta definição consiste na sequência “Q, Q, S, Y, S, T, P, Y, T”
[00156] O anticorpo pode compreender pelo menos uma CDR3 de cadeia pesada como definida em (c) e/ou uma CDR3 de cadeia leve como definida em (f). O anticorpo pode compreender todas as três sequências de CDR de cadeia pesada de (a), (b) e (c) e/ou todas as três sequências de CDR de cadeia leve de (d), (e) e (f).
[00157] Sequências de CDR exemplares são recitadas nas tabelas A(1) e A(2), SEQ ID NOs: 52 a 88.
[00158] Os anticorpos anti-OX40 preferidos podem compreender pelo menos uma CDR3 de cadeia pesada, conforme definido em qualquer linha individual da Tabela A(1) e/ou uma CDR3 de cadeia leve, conforme definida em qualquer linha individual da Tabela A(2). O anticorpo pode compreender todas as três sequências de CDR de cadeia pesada mostradas em uma linha individual da Tabela A(1) (isto é, todas as três CDRs de cadeia pesada de um dado “número VH”) e/ou todas as três sequências de CDR de cadeia leve mostradas em um linha individual da Tabela A(2) (isto é, todas as três CDRs de cadeia leve de um dado “número VL”).
[00159] Exemplos de sequências de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e leve completas são mostrados na Tabela B. Também são mostradas sequências exemplares de ácidos nucleicos codificando cada sequência de aminoácido. A numeração das referidas regiões VH e VL na Tabela B corresponde ao sistema de numeração utilizado como na Tabela A(1) e (2). Assim, por exemplo, a sequência de aminoácido para “1167, VL de cadeia leve” é um exemplo de uma sequência de região VL completas compreendendo todas as três CDRs de número VL 1167 mostradas na Tabela A(2) e a sequência de aminoácido para “1166, VH de cadeia pesada” é um exemplo de uma sequência de região VH completa compreendendo todas as três CDRs de número VH 1166 mostradas na Tabela A(1).
[00160] Os anticorpos anti-OX40 preferidos da invenção incluem uma região VH que compreende todas as três CDRs de um número VH particular e uma região VL que compreende todas as três CDRs de um número VL particular.
Por exemplo: - um anticorpo pode compreender todas as três CDRs de número VH 1166 e todas as três CDRs de número VL 1167. Esse anticorpo pode ser referido como 1166/1167. Um tal anticorpo pode preferencialmente compreender as sequências VH e VL correspondentes completas de 1166 e 1167, como mostrado na Tabela B (SEQ ID NOs: 91 e 89).
- um anticorpo pode compreender todas as três CDRs de número VH 1170 e todas as três CDRs de número VL 1171. Esse anticorpo pode ser referido como 1170/1171. Um tal anticorpo pode preferencialmente compreender as sequências VH e VL correspondentes completas de 1170 e 1171, como mostrado na Tabela B (SEQ ID NOs: 95 e 93).
- um anticorpo pode compreender todas as três CDRs de número VH 1164 e todas as três CDRs de número VL 1135. Esse anticorpo pode ser referido como 1164/1135. Um tal anticorpo pode preferencialmente compreender as sequências VH e VL correspondentes completas de 1164 e 1135, como mostrado na Tabela B (SEQ ID NOs: 99 e 97).
- um anticorpo pode compreender todas as três CDRs de número VH 1168 e todas as três CDRs de número VL 1135. Esse anticorpo pode ser referido como 1168/1135. Um tal anticorpo pode preferencialmente compreender as sequências VH e VL correspondentes completas de 1168 e 1135, como mostrado na Tabela B (SEQ ID NOs: 101 e 97).
- um anticorpo pode compreender todas as três CDRs de número VH 1482 e todas as três CDRs de número VL 1483. Esse anticorpo pode ser referido como 1482/1483. Um tal anticorpo pode preferencialmente compreender as sequências VH e VL correspondentes completas de 1482 e 1483, como mostrado na Tabela B (SEQ ID NOs: 105 e 103).
- um anticorpo pode compreender todas as três CDRs de número VH 1490 e todas as três CDRs de número VL 1135. Esse anticorpo pode ser referido como 1490/1135. Um tal anticorpo pode preferencialmente compreender as sequências VH e VL correspondentes completas de 1490 e 1135, como mostrado na Tabela B (SEQ ID NOs: 107 e 97).
- um anticorpo pode compreender todas as três CDRs de número VH 1514 e todas as três CDRs de número VL 1515. Esse anticorpo pode ser referido como 1514/1515. Um tal anticorpo pode preferencialmente compreender as sequências VH e VL correspondentes completas de 1514 e 1515, como mostrado na Tabela B (SEQ ID NOs: 111 e 109).
- um anticorpo pode compreender todas as três CDRs de número VH 1520 e todas as três CDRs de número VL 1135. Esse anticorpo pode ser referido como 1520/1135. Um tal anticorpo pode preferencialmente compreender as sequências VH e VL correspondentes completas de 1520 e 1135, como mostrado na Tabela B (SEQ ID NOs: 113 e 97).
- um anticorpo pode compreender todas as três CDRs de número VH 1524 e todas as três CDRs de número VL 1525. Esse anticorpo pode ser referido como 1524/1525. Um tal anticorpo pode preferencialmente compreender as sequências VH e VL correspondentes completas de 1524 e 1525, como mostrado na Tabela B (SEQ ID NOs: 117 e 115).
- um anticorpo pode compreender todas as três CDRs de número VH 1526 e todas as três CDRs de número VL 1527. Esse anticorpo pode ser referido como 1526/1527. Um tal anticorpo pode preferencialmente compreender as sequências VH e VL correspondentes completas de 1526 e 1527, como mostrado na Tabela B (SEQ ID NOs: 121 e 119).
- um anticorpo pode compreender todas as três CDRs de número VH 1542 e todas as três CDRs de número VL 1135. Esse anticorpo pode ser referido como 1542/1135. Um tal anticorpo pode preferencialmente compreender as sequências VH e VL correspondentes completas de 1542 e 1135, como mostrado na Tabela B (SEQ ID NOs: 123 e 97).
[00161] O anticorpo pode compreender uma variante ou um fragmento de qualquer das sequências de aminoácidos específicas recitadas na Tabela B, desde que o anticorpo ligue a OX40 humano e exiba pelo menos uma das características funcionais I a III. Essa variante ou fragmento pode tipicamente reter as sequências de CDR da referida sequência da Tabela B.
[00162] Um fragmento de qualquer uma das sequências de aminoácidos de cadeia pesada ou leve mostradas na Tabela B pode compreender pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos consecutivos da referida sequência de aminoácido.
[00163] Uma variante de qualquer uma das sequências de aminoácidos de cadeia pesada ou leve mostradas na Tabela B pode ser uma variante de substituição, deleção ou adição da referida sequência, como definido acima.
[00164] O anticorpo pode ligar ao mesmo epítopo que qualquer dos anticorpos específicos aqui descritos. De preferência, ele liga ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos designados 1166/1167, 1170/1171, 1164/1135, 1168/1135, 1482/ 1483, 1490/1135, 1514/1515, 1520/1135, 1524/1525, 1526/1527 e 1542/1135.
[00165] Sequências de aminoácidos de região constante de cadeia pesada exemplares que pode ser combinadas com qualquer sequência da região VH aqui divulgada (para formar uma cadeia pesada completa), tal como a sequência de região constante de cadeia pesada da IgG1 são descritas acima.
[00166] Sequências de aminoácidos de região constante de cadeia leve exemplares que pode ser combinadas com qualquer sequência da região VL aqui divulgada (para formar uma cadeia leve completa), tal como a sequência de região constante de cadeia capa são descritas acima.
Os polipeptídeos biespecíficos da invenção
[00167] Os polipeptídeos da invenção compreendem domínios de ligação que são específicos para OX40 e CTLA-4, isto é, B1 é específico para OX40 e B2 é específico para CTLA-4.
[00168] Por exemplo, o polipeptídeo biespecífico pode ser Anticorpo “1166/1261” compreendendo uma cadeia leve de IgG fundida a um domínio de CD86, de SEQ ID No: 125, e uma cadeia pesada de IgG compreendendo uma região VH de SEQ ID No: 91. Alternativamente, o polipeptídeo biespecífico pode compreender variantes das referidas sequências, por exemplo, tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 125 e/ou 91, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 125 e/ou 91 identidade de sequência com a SEQ ID No: 125 e/ou 9.
[00169] O polipeptídeo biespecífico da modalidade é capaz de modular a atividade de células do sistema imune em maior extensão do que um agonista individual de OX40 ou CTLA-
4 sozinho, ou do que uma combinação desses agonistas individuais. Em particular, a administração do polipeptídeo biespecífico produz um nível mais alto de atividade de célula T efetora, particularmente atividade de célula T efetora de CD4+. O aumento na atividade de célula T efetora também é mais localizado do que aquele que resulta de administração de um agonista individual de OX40 ou CTLA-4 sozinho (ou uma combinação dos mesmos), porque o polipeptídeo biespecífico exerce o maior efeito apenas em um microambiente no qual o CTLA- 4 e OX40 são ambos altamente expressados. Os tumores são um microambiente. As células T reguladoras (Tregs) infiltrantes no tumor expressam altos níveis de CTLA-4 e OX40, e mais altos que as células T efetoras (ambas CD4 e CD8).
[00170] O aumento na atividade de célula T efetora pode resultar diretamente de estimulação das células T efetoras, via ativação da via OX40 ou via bloqueio da via de inibição de CTLA-4, ou pode resultar indiretamente da depleção ou infrarregulação de Tregs, desse modo, reduzindo seu efeito imunossupressor. A depleção/infrarregulação de Tregs pode ser mediada por mecanismos de fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) ou de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). A alta expressão de ambos CTLA-4 e OX40 em Tregs, em comparação com células T efetoras, pode induzir uma matança significativamente mais alta de
Tregs em comparação com os anticorpos monoespecíficos.
Células T efetoras, tendo expressão mais baixa de CTLA-4 e OX40, não serão depletadas por este mecanismo. No geral, o resultado será uma ativação imune localizada muito poderosa para a geração imediata de atividade tumoricida.
[00171] A medição do efeito de um polipeptídeo biespecífico da invenção em células do sistema imune pode ser conseguida com qualquer ensaio adequado. Por exemplo, elevada atividade de células T efetoras pode ser medida por ensaios, como descritos acima, em relação a componentes individuais B1 e B2 do polipeptídeo biespecífico, e inclui medição de proliferação ou produção de IL-2 por células T CD4+ e/ou CD8+ nas presença do polipeptídeo biespecífico em relação a um controle. Um aumento da proliferação ou produção de IL-2 em relação ao controle é indicativo de elevada ativação celular. Um ensaio típico deste tipo é divulgado no Exemplo 9 de US20080233122. Os ensaios para proliferação celular e/ou produção de IL-2 são bem conhecidos e também são exemplificados nos Exemplos. Quando avaliada no mesmo ensaio, a molécula biespecífica tipicamente induzirá um aumento na atividade de uma célula T efetora que é de pelo menos 1,5 vezes mais alta ou de pelo menos 2 vezes mais alta, mais preferencialmente 3 vezes mais alta, mais preferencialmente 5 vezes mais alta que o aumento na atividade de uma célula T efetora induzida por uma combinação de agentes monoespecíficos ligando aos mesmos alvos.
[00172] O polipeptídeo biespecífico da invenção é capaz de ligar especificamente a ambos CTLA-4 humano e OX40 humano, e compreende B1 e B2 como definido acima.
[00173] Por “capaz de ligar especificamente a ambos CTLA-4 e OX40”, entende-se que a parte B1 liga especificamente a OX40 e a parte B2 liga especificamente a CTLA-4, de acordo com as definições fornecidas para cada parte acima. Preferencialmente, as características de ligação das partes B1 e B2 para seus respectivos alvos são inalteradas ou substancialmente inalteradas quando elas estão presentes como parte de um polipeptídeo da invenção, quando comparadas com as referidas características para as partes B1 e B2 quando presentes como entidades separadas.
[00174] Tipicamente, isto significa que a molécula biespecífica terá uma Kd para OX40 que é preferencialmente substancialmente a mesma que o valor de Kd para OX40 de B1 quando presente sozinha. Alternativamente, se a molécula biespecífica tiver uma Kd para OX40 que é elevada em relação à Kd para OX40 de B1 quando presente sozinha, então, o aumento é de no máximo 10 vezes, de preferência não mais que 9 vezes, 8 vezes, 7 vezes, 6 vezes, 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes ou 2 vezes. A molécula biespecífica liga preferencialmente a OX40 humano com um valor de Kd que é inferior a 50x10-10M,
mais preferivelmente inferior a 25x10-10M, mais preferencialmente inferior a 20x10-10M. Além disso, a molécula biespecífica terá independentemente uma Kd para CTLA-4 que é preferencialmente substancialmente a mesma que o valor de Kd para CTLA4 de B2 quando presente sozinha.
Alternativamente, se a molécula biespecífica tiver uma Kd para CTLA-4 que é elevada em relação à Kd para CTLA-4 de B2 quando presente sozinha, então, o aumento é de no máximo 3 vezes, de preferência não mais que 2 vezes. A molécula biespecífica liga preferencialmente a CTLA-4 humano com um valor de Kd que é inferior a 60x10-9M, mais preferivelmente inferior a 25x10-9M, mais preferencialmente inferior a 10x10- 9M.
[00175] Em outras palavras, a molécula biespecífica pode ter uma Kd para OX40 que é inferior a 50x10-10M, 25x10- 10M ou 20x10-10M e independente tem uma Kd para CTLA-4 que é inferior a 60x10-9M, 25x10-9M ou 10x10-9M. Será apreciado que qualquer dos valores de Kd recitados para OX40 pode ser combinado independentemente com qualquer dos valores de Kd recitados para CTLA-4 para descrever as características de ligação de uma dada molécula biespecífica. Da mesma forma, qualquer das mudanças em vezes recitadas na ligação de OX40 pode ser combinada independentemente com qualquer das mudanças em vezes recitadas na ligação de CTLA-4 para descrever as características de ligação de uma dada molécula biespecífica.
[00176] As características de ligação das partes B1 e B2, quando presentes como parte de um polipeptídeo da invenção, podem ser avaliadas por qualquer ensaio adequado.
Em particular, os ensaios estabelecidos acima para cada parte separada também podem ser aplicados a B1 e B2 quando eles estão presentes como parte de um polipeptídeo da invenção.
Ensaios adequados para avaliar as características de ligação de polipeptídeos biespecíficos da invenção também são apresentados nos Exemplos.
[00177] A molécula biespecífica ativa potentemente o sistema imune quando em um microambiente no qual ambos OX40 e CTLA-4 são altamente expressados. Tipicamente, a molécula biespecífica aumentará a atividade de uma célula efetora CD4+ ou CD8+, ou poderá diminuir a atividade de uma célula T reguladora (T reg). Em qualquer caso, o efeito líquido do anticorpo será um aumento na atividade das células T efetoras, particularmente as células T efetoras CD4+. Quando avaliada no mesmo ensaio, a molécula biespecífica tipicamente induzirá um aumento na atividade de uma célula T efetora que é de pelo menos 1,5 vezes mais alta ou de pelo menos 1,7 vezes mais alta, mais preferencialmente 4,5 vezes mais alta, mais preferencialmente 7 vezes mais alta que o aumento na atividade de uma célula T efetora induzida por uma combinação de agentes monoespecíficos ligando aos mesmos alvos.
[00178] Métodos para determinar uma mudança na atividade de células T efetoras são bem conhecidos e são como descritos anteriormente. Os ensaios para proliferação celular e/ou produção de IL-2 são bem conhecidos e são exemplificados nos Exemplos.
[00179] Por exemplo, o polipeptídeo pode ser capaz de ligar especificamente a CTLA-4 e OX40, e B1 pode ser um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, específico para OX40; e B2 pode ser um domínio de ligação de polipeptídeo específico para CTLA-4, que compreende ou consiste em: i) sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; ou ii) uma sequência de aminoácido na qual pelo menos um aminoácido é mudado quando comparado à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, desde que o referido domínio de ligação ligue a CTLA-4 humano com afinidade mais alta que CD86 humano tipo selvagem.
[00180] O CTLA-4 especificamente ligado ao polipeptídeo pode ser primata ou murino, preferencialmente humano, CTLA-4 e/ou OX40 especificamente ligado pelo polipeptídeo pode ser primata, preferencialmente humano, OX40.
[00181] O polipeptídeo biespecífico da invenção pode compreender o domínio de ligação de OX40 e o domínio de ligação de CTLA-4 dispostos juntos em qualquer formato adequado. Será apreciado que, em qualquer formato biespecífico dado, o domínio de ligação de OX40 e o domínio de ligação de CTLA-4 podem ser cada um independentemente um anticorpo completo ou uma porção de ligação ao antígeno.
Independentemente do formato biespecífico particular usado, polipeptídeos e anticorpos biespecíficos aqui descritos podem ser tipicamente referidos por um esquema de numeração baseado na composição do domínio de ligação de OX40 (que pode ser referido como domínio de ligação 1) e na composição do domínio de ligação de CTLA-4 (que pode ser referido como domínio de ligação 2). O esquema de numeração é, portanto, tipicamente na forma VH1/VL1 para o domínio de ligação de OX40 (domínio de ligação 1) e VH2/VL2 para o domínio de ligação de CTLA-4 (domínio de ligação 2), escritos juntos como VH1/VL1-VH2/VL2. Será apreciado que este esquema de numeração não reflete o número total de domínios de ligação presentes no polipeptídeo ou anticorpo biespecífico, nem a presença ou ausência de quaisquer regiões constantes no polipeptídeo ou anticorpo biespecífico, ambos os quais são determinados pelo formato particular de anticorpo biespecífico que é usado. O número total de domínios de ligação e a presença ou ausência de regiões constantes podem estar de acordo com qualquer formato de anticorpo biespecífico adequado conhecido na técnica.
[00182] Muitos formatos adequados de polipeptídeos ou anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica e o polipeptídeo biespecífico da invenção pode estar em qualquer um destes formatos. Formatos adequados incluem aqueles descritos nas Figuras 1 e 14 (ver também Kontermann & Brinkmann, 2015, Drug Discov Today. 838-847; cujas divulgações são aqui incorporadas por referência).
[00183] Na Figura 14, as regiões constantes são mostradas como preenchidas com cinza; a região de cadeia pesada variável VH1 é mostrada em preto e branco quadriculada; a região de cadeia leve variável VL1 é mostrada preenchida em branco; a região de cadeia pesada variável VH2 é mostrada como preenchida em preto; e a região de cadeia leve variável VL2 é mostrada em branco com linhas diagonais.
Assim, os domínios de ligação de OX40 (referidos como domínio de ligação 1) são tipicamente representados como um par de um domínio preto e branco quadriculado com um domínio preenchido em branco; os domínios de ligação de CTLA-4 (referidos como domínio de ligação 2) são tipicamente representados como um par de um domínio preenchido em preto e um domínio branco com linhas diagonais. No entanto, em todos os formatos mostrados, será apreciado que os domínios de ligação 1 e 2 podem ser comutados. Isto é, um domínio de ligação de OX40 pode ocorrer em qualquer posição mostrada na Figura 14 para um domínio de CTLA-4 e vice-versa.
[00184] Um formato preferido para o polipeptídeo biespecífico é um arranjo de kih ou “knob-in-hole”, que é o primeiro mostrado na segunda linha da Figura 14. Neste arranjo, o domínio de CH3 da cadeia pesada de cada anticorpo é mutado para permitir a heterodimerização entre uma cadeia pesada do anticorpo anti-OX40 e uma cadeia pesada do anticorpo anti-CTLA-4. Cada cadeia pesada associa à sua cadeia leve correspondente para formar um domínio de ligação de OX40 completo e um domínio de ligação de CTLA-4 completo.
Podem ser feitas modificações nas regiões CH1 de cadeia pesada para promover a associação com a cadeia leve correta.
Os anticorpos biespecíficos no formato kih são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Ridgway et al 1996; Protein Eng 9:617-621, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência.
[00185] Outro formato preferido para o anticorpo biespecífico da invenção é o formato scFv2-Fc, que é o segundo mostrado na segunda linha da Figura 14. Neste arranjo, um scFv específico para cada alvo é fundido a domínios de imunoglobulina constantes. As cadeias simples podem ser fundidas à região Fc da cadeia pesada, com uma especificidade fundida à extremidade N-terminal e a outra especificidade fundida à extremidade C-terminal da região Fc
(Park et al., 2000, Mol Immunol 37(18):1123-30; cujas divulgações são aqui incorporadas por referência).
[00186] Outro formato preferido para o polipeptídeo biespecífico da invenção é o formato BITE/scFv2, que é o terceiro formato mostrado na segunda linha da Figura 14.
Nesse arranjo, dois scFv, um específico para OX40 e outro específico para CTLA-4, são fundidos juntos com um ligante (Brischwein et al., 2007, J Immunother 30(8): 798-807; cujas divulgações são incorporadas aqui por referência). O ligante pode opcionalmente incluir uma proteína que aumenta a solubilidade e a meia-vida sérica, tal como albumina sérica humana (HSA), criando anticorpos biespecíficos scFv-HSA- scFv, como mostrado na quarta linha da Figura 14.
[00187] Outro formato preferido para o polipeptídeo biespecífico da invenção são imunoglobulinas de domínio variável duplo (DVD), que é o quarto formato mostrado na segunda linha da Figura 14. Nesta disposição, o segundo domínio variável (VL2) é fundido à primeira cadeia leve variável (VL1) e a segunda cadeia pesada variável (VH2) é fundida à primeira cadeia pesada variável (VH1) de uma molécula de IgG. VH1 e VL1 formam o sítio de ligação 1 e VH2 e VL2 formam o sítio de ligação 2, criando assim um anticorpo biespecífico (Wu, 2007, Nat Biotechnol 25(11):1290-7; cujas divulgações são aqui incorporadas por referência).
[00188] Outro formato preferido para o polipeptídeo biespecífico da invenção é o formato Dual Affinity Retargeting (DART), no qual a VH1 é fundida com VL2 e VH2 fundida com VL1 com um ligante de peptídeo curto forçando- as a formar sítios de ligação VH1/VL1 e VH2/VL2. Este construto pode ser estabilizado pela formação de uma ponte de dissulfeto entre os sítios de ligação. O formato DART pode ser fundido aos domínios Fc de IgG, criando anticorpos biespecíficos monovalentes (DART-Fc) ou anticorpos biespecíficos bivalentes (DART2-Fc) (Moore et al., 2011, Blood 117 (17):4542-51). Os formatos DART, DART-Fc e DART2- Fc são mostrados na terceira linha da Figura 14.
[00189] Outro formato preferido para o polipeptídeo biespecífico da invenção são anticorpos biespecíficos gerados pela tecnologia dock and lock (DNL). Proteína cinase A dependente de cAMP e proteína de ancoragem de cinase A podem ser fundidas a anticorpos, fragmentos Fab ou scFv para cada alvo, gerando assim anticorpos biespecíficos multivalentes, por exemplo, DNL-Fab3 (Chang et al., 2007, Clin Cancer Res 13(18 Pt 2):5586s-5591s, como mostrado na quarta linha da Figura 14; cujas divulgações são aqui incorporadas por referência).
[00190] Um formato particularmente preferido para o polipeptídeo biespecífico da invenção é o formato scFv-IgG.
Quatro arranjos possíveis diferentes desse formato são mostrados na linha superior da Figura 14. Como mostrado na Figura 14, no formato scFv-IgG o anticorpo anti-OX40 é uma molécula de IgG completa e o anticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo scFv conectado ao anticorpo anti-OX40 em qualquer um de quatro locais gerais (região constante de cadeia pesada; região constante de cadeia leve; região variável de cadeia pesada; região variável de cadeia leve). Em cada caso, o arranjo reverso também está previsto. Isto é, com o anticorpo anti-CTLA-4 como uma IgG completa e o anticorpo anti-OX40 como um scFv conectado ao anticorpo anti-CTLA-4 em qualquer um dos quatro locais gerais. No formato scFv-IgG, a molécula de IgG completa pode ser unida diretamente ao scFv ou pode ser unida indiretamente através de um ligante.
Ligantes exemplares incluem um peptídeo de sequência de aminoácido como mostrada em qualquer uma de SEQ ID NOs. 47 a 50 ou 144.
[00191] No primeiro arranjo de scFv-IgG mostrado na Figura 14 (canto superior esquerdo da figura), os anticorpos biespecíficos compreendem duas cópias de uma cadeia polipeptídica que compreende a sequência variável da cadeia pesada VH1 (preto e branco quadriculado), ligada a uma sequência constante da cadeia pesada (Hc; preenchido em cinza), ligado (opcionalmente através de um ligante) a uma sequência de scFv que consiste na sequência variável da cadeia pesada VH2 (preenchido em preto) e na sequência variável da cadeia leve VL2 (branco com linhas diagonais).
Esta cadeia pode ser referida como VH1-Hc-VH2/VL2 (ordenada N-terminal - C-terminal). O anticorpo biespecífico também compreende duas cópias de uma cadeia menor que compreende a sequência variável da cadeia leve VL1 (preenchido em branco) ligada a uma sequência constante da cadeia leve (Lc; preenchido em cinza), que pode ser referida como VL1-Lc (ordenada N terminal - C terminal). Os arranjos alternativos de scFv-IgG mostrados na Figura 14 também compreendem duas cópias cada de duas cadeias diferentes, que podem ser descritas de maneira semelhante. Assim, lendo da esquerda para a direita na linha superior da Figura 22, o segundo arranjo compreende duas cadeias VH1-Hc e duas cadeias VL1- Lc-VH2/VL2. O terceiro arranjo compreende duas cadeias VH1/VH2-VH1-Hc e duas cadeias VL1-Lc. O quarto arranjo compreende duas cadeias VH1-Hc e duas cadeias VH1/VH2-VL1- Lc.
[00192] Numa modalidade, os polipeptídeos biespecíficos da invenção têm o primeiro arranjo de scFv-IgG mostrado na Figura 14 (canto superior esquerdo da Figura).
[00193] A presente invenção fornece um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos estabelecidas nas Tabelas A-E, sejam sozinhas ou, preferencialmente, como parte de um anticorpo monoespecífico ou biespecífico. Em todas as sequências mostradas nas Tabelas A-E, as sequências correspondentes às regiões constantes de cadeia pesada ou leve são exemplares e podem ser substituídas por qualquer outra sequência da região constante da cadeia pesada ou leve adequada.
Sequências de região constante de cadeia pesada e leve preferidas são aquelas de SEQ ID NOs: 135, 136, 137, 138 e
139.
[00194] Será apreciado que a invenção também abrange polipeptídeos biespecíficos equivalentes nos quais um polipeptídeo não anticorpo é usado como um domínio de ligação. Em uma modalidade da invenção, a parte B1 do polipeptídeo da invenção é um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que tipicamente compreende pelo menos uma cadeia pesada (H) e/ou pelo menos uma cadeia leve (L). A parte B2 do polipeptídeo da invenção pode ser fixada a qualquer parte de B1, mas pode tipicamente ser fixada à referida pelo menos uma cadeia pesada (H) ou pelo menos uma cadeia leve (L), de preferência em qualquer do N ou C terminal. A parte B2 do polipeptídeo da invenção pode ser assim fixada seja diretamente ou indiretamente através de qualquer molécula de ligação adequada (um ligante).
[00195] A parte B1 compreende preferencialmente pelo menos uma cadeia pesada (H) e pelo menos uma cadeia leve (L) e a parte B2 é preferencialmente fixada ao N ou C terminal de qualquer da referida cadeia pesada (H) ou da referida cadeia leve (L). Um anticorpo exemplar de B1 consiste em duas cadeias pesadas idênticas (H) e duas cadeias leves idênticas (L). Um tal anticorpo é tipicamente arranjado como dois braços, cada um dos quais tem uma H e uma L unidas como heterodímero, e os dois braços são unidos por ligações dissulfeto entre as cadeias H. Assim, o anticorpo é efetivamente um homodímero formado por dois heterodímeros H- L. A parte B2 do polipeptídeo da invenção pode ser fixada a ambas as cadeias H ou a ambas as cadeias L de tal anticorpo, ou a apenas uma cadeia H ou apenas uma cadeia L.
[00196] O polipeptídeo da invenção pode, portanto, ser alternativamente descrito como um anticorpo anti-OX40, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ao qual é fixado pelo menos um domínio de ligação de polipeptídeo específico para CTLA-4, que compreende ou consiste no domínio extracelular solúvel monomérico de CD86 tipo selvagem humano ou uma variante do mesmo. Os domínios de ligação de B1 e B2 podem ser os únicos domínios de ligação no polipeptídeo da invenção.
[00197] O polipeptídeo da invenção pode compreender um polipeptídeo disposto de acordo com qualquer uma das seguintes fórmulas, escritas na direção N-C: (A) L-(X)n-B2; (B) B2-(X)n-L; (C) B2-(X)n-H; e
(D) H-(X)n-B2; em que H é a cadeia pesada de um anticorpo (isto é, de B1), L é a cadeia leve de um anticorpo (isto é, de B1), X é um ligante e n é 0 ou 1. Quando o ligante (X) é um peptídeo, ele tipicamente tem a sequência de aminoácido SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 47), SGGGGSGGGGSAP (SEQ ID NO: 48), NFSQP (SEQ ID NO: 49), KRTVA (SEQ ID NO: 50), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 144) ou (SG)m, em que m = 1 a 7. Representações esquemáticas das fórmulas (A) a (D) são mostradas na Figura
1.
[00198] A presente invenção também fornece um polipeptídeo que consiste em um polipeptídeo disposto de acordo com qualquer uma das fórmulas (A) a (D). O referido polipeptídeo pode ser fornecido como um monômero ou pode estar presente como um componente de uma proteína multimérica, tal como um anticorpo. O referido polipeptídeo pode ser isolado. Exemplos de sequências de aminoácidos de tais polipeptídeos são mostrados na Tabela D. Também são mostradas sequências exemplares de ácidos nucleicos codificando cada sequência de aminoácido.
[00199] A parte B2 pode ser fixada a qualquer parte de um polipeptídeo da invenção, ou a um ligante, por qualquer meio adequado. Por exemplo, as várias partes do polipeptídeo podem ser unidas por conjugação química, tal como com uma ligação peptídica. Assim, o polipeptídeo da invenção pode compreender ou consistir em uma proteína de fusão compreendendo B1 (ou uma parte component da mesmae) e B2, opcionalmente unida por um ligante peptídico. Em tal proteína de fusão, o domínio ou os domínios de ligação de OX40 de B1 e o domínio ou os domínios de ligação de CTLA-4 de B2 podem ser os únicos domínios de ligação.
[00200] Outros métodos para conjugar moléculas a polipeptídeos são conhecidos na técnica. Por exemplo, conjugação de carbodi-imida (ver Bauminger & Wilchek, 1980, Methods Enzymol. 70:151-159; cujas divulgações são aqui incorporadas por referência) pode ser usada para conjugar uma variedade de agentes, incluindo doxorrubicina, a anticorpos ou peptídeos. A carbodi-imida solúvel em água, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDC) é particularmente útil para conjugar uma fração funcional a uma fração de ligação. Como outro exemplo, a conjugação pode ser alcançada por oxidação de periodato de sódio, seguida por alquilação redutiva de reagentes apropriados ou por reticulação de glutaraldeído. No entanto, é reconhecido que, independentemente de qual método seja selecionado, uma determinação deve preferencialmente ser feita de que as partes B1 e B2 retêm ou retêm substancialmente suas propriedades de ligação ao alvo quando presentes como partes do polipeptídeo da invenção.
[00201] As mesmas técnicas podem ser usadas para ligar o polipeptídeo da invenção (diretamente ou indiretamente) a outra molécula. A outra molécula pode ser um agente terapêutico ou um marcador detectável. Agentes terapêuticos adequados incluem uma fração citotóxica ou uma droga.
[00202] Um polipeptídeo da invenção pode ser fornecido na forma isolada ou substancialmente isolada. Por substancialmente isolado, queremos dizer que pode haver isolamento substancial, mas não total, do polipeptídeo de qualquer meio circundante. Os polipeptídeos podem ser misturados com transportadores ou diluentes que não interferem com seu uso pretendido e ainda são considerados como substancialmente isolados.
[00203] Polipeptídeos exemplares da invenção podem compreender ou consistir em qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas na Tabela D. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende ou consiste na sequência de aminoácido selecionada dentre o grupo SEQ ID NOs 125 a 134, opcionalmente em que o referido polipeptídeo é um fornecido como parte componente de um anticorpo.
[00204] Polinucleotídeos representativos que codificam exemplos de uma sequência de aminoácido de cadeia pesada ou cadeia leve de um anticorpo podem compreender ou consistir em qualquer uma das sequências de nucleotídeos estabelecidas na Tabela B. Polinucleotídeos representativos que codificam os polipeptídeos mostrados na Tabela D podem compreender ou consistir nas sequências nucleotídicas correspondentes que também são mostradas na Tabela D (sequências de íntrons são mostradas em minúsculas).
Polinucleotídeos representativos que codificam exemplos de parte B2 podem compreender ou consistir em qualquer uma das SEQ ID NOS: 25 a 43, como mostrado na Tabela E. Um polinucleotídeo adequado pode alternativamente ser uma variante de qualquer uma destas sequências, como definido acima.
[00205] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo biespecífico induz uma ativação sinérgica do sistema imune hospedeiro contra células tumorais, isto é, ele é capaz de induzir um aumento sinérgico na razão CD8 intratumoral/Treg em comparação com o efeito combinado dos polipeptídeos de contraparte monoespecíficos individuais (o domínio de ligação de CTLA-4 ou o anticorpo monoespecífico de OX40 individual).
[00206] Numa modalidade da invenção, o polipeptídeo biespecífico é capaz de induzir memória imunológica no sistema imunológico hospedeiro contra células tumorais.
[00207] Por “memória imunológica” queremos dizer a capacidade do sistema imune de reconhecer rapidamente e especificamente um antígeno no corpo que ele encontrou previamente, tal como um antígeno tumoral, e iniciar uma resposta imune correspondente.
Aspectos relacionados da invenção
[00208] Um segundo aspecto da invenção compreende um polipeptídeo biespecífico de acordo com o primeiro aspecto da invenção para uso em um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição em um indivíduo, como descrito acima.
[00209] Um terceiro aspecto da invenção é um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição em um indivíduo, o método compreendendo administrar a um indivíduo um polipeptídeo biespecífico de acordo com o primeiro ou o segundo aspectos da invenção, como descrito acima.
[00210] Um quarto aspecto da invenção é o uso de um polipeptídeo biespecífico de acordo com o primeiro aspecto da invenção na fabricação de um medicamento.
[00211] Uma modalidade da invenção é um polipeptídeo biespecífico de acordo com o segundo aspecto da invenção ou um método de acordo com o terceiro aspecto da invenção, em que a doença ou condição é câncer e, opcionalmente, em que o indivíduo é humano, ou o uso de acordo com o quarto aspecto da invenção, em que o medicamento é para o tratamento de câncer, opcionalmente em que o indivíduo é humano.
[00212] Em uma modalidade adicional, o método compreende administrar o anticorpo biespecífico sistemicamente ou localmente, tal como no sítio de um tumor ou em um linfonodo de drenagem de tumor, como descrito acima.
[00213] O câncer pode ser câncer de próstata, câncer de mama, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer cervical, rabdomiossarcoma, neuroblastoma, mieloma múltiplo, leucemia, leucemia linfoblástica aguda, melanoma, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de pele, linfoma ou glioblastoma.
[00214] Um quinto aspecto da invenção é um polinucleotídeo codificando pelo menos uma cadeia polipeptídica de um polipeptídeo biespecífico de acordo com o primeiro ou o segundo aspectos da invenção, como descrito acima.
[00215] Um sexto aspecto da invenção é uma composição compreendendo um polipeptídeo biespecífico de acordo com o primeiro ou o segundo aspectos da invenção e pelo menos um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
[00216] Em uma modalidade da invenção, um polipeptídeo de acordo com o primeiro ou o segundo aspectos da modalidade é conjugado com uma fração terapêutica adicional.
[00217] As composições farmacêuticas serão administradas a um paciente em uma dose farmaceuticamente eficaz. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz”, ou
“quantidade eficaz”, ou “terapeuticamente eficaz”, como aqui utilizadas, se refere àquela quantidade que fornece um efeito terapêutico para uma dada condição e regime de administração.
Esta é uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir um efeito terapêutico desejado em associação com o aditivo e diluente necessários, isto é, um transportador ou veículo de administração. Além disso, ela pretende significar uma quantidade suficiente para reduzir e, mais preferencialmente, prevenir, um déficit clinicamente significativo na atividade, função e resposta do hospedeiro.
Alternativamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para causar uma melhoria em uma condição clinicamente significativa em um hospedeiro. Como é apreciado pelos versados na técnica, a quantidade de um composto pode variar dependendo da sua atividade específica.
Quantidades de dosagem adequadas podem conter uma quantidade predeterminada de composição ativa calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente necessário. Nos métodos e no uso para fabricação de composições da invenção, é fornecida uma quantidade terapeuticamente eficaz do componente ativo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada pelo médico ou veterinário versado na técnica com base nas características do paciente, tal como idade, peso, sexo, condição, complicações, outras doenças, etc., como é bem conhecido na técnica. A administração da dose farmaceuticamente eficaz pode ser realizada tanto por administração única na forma de uma dose unitária individual ou ainda várias doses unitárias menores e também por múltiplas administrações de doses subdivididas em intervalos específicos. Alternativamente, as doses podem ser fornecidas como uma infusão contínua durante um período prolongado.
[00218] As composições particularmente preferidas são formuladas para administração sistêmica.
[00219] A composição pode preferencialmente ser formulada para liberação sustentada durante um período de tempo. Assim, a composição pode ser fornecida em ou como parte de uma matriz facilitando a liberação sustentada.
Matrizes de liberação sustentada preferidas podem compreender uma montanida ou nanopartículas de ácido γ- poliglutâmico (PGA).
[00220] Os polipeptídeos de anticorpo podem ser formulados em várias concentrações, dependendo da eficácia/toxicidade do polipeptídeo sendo usado. Por exemplo, a formulação pode compreender o polipeptídeo de anticorpo ativo a uma concentração entre 0,1 µM e 1 mM, mais preferencialmente entre 1 µM e 500 µM, entre 500 µM e 1 mM, entre 300 µM e 700 µM, entre 1 µM e 100 µM, entre 100 µM e 200 µM, entre 200 µM e 300 µM, entre 300 µM e 400 µM, entre 400 µM e 500 µM, entre 500 µM e 600 µM, entre 600 µM e 700 µM, entre 800 µM e 900 µM ou entre 900 µM e 1 mM.
Tipicamente, a formulação compreende o polipeptídeo de anticorpo ativo a uma concentração entre 300 µM e 700 µM.
[00221] Tipicamente, a dose terapêutica do polipeptídeo de anticorpo (com ou sem uma fração terapêutica) em um paciente humano estará na faixa de 100 µg a 700 mg por administração (com base no peso corporal de 70 kg). Por exemplo, a dose terapêutica máxima pode estar na faixa de 0,1 a 10 mg/kg por administração, por exemplo, entre 0,1 e 5 mg/kg ou entre 1 e 5 mg/kg ou entre 0,1 e 2 mg/kg. Será apreciado que essa dose possa ser administrada em diferentes intervalos, conforme determinado pelo oncologista/médico; por exemplo, uma dose pode ser administrada diariamente, duas vezes por semana, semanalmente, bisemanalmente ou mensalmente.
[00222] Será apreciado pelos versados na técnica que as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas sozinhas ou em combinação com outros agentes terapêuticos usados no tratamento de cânceres, tal como antimetabólitos, agentes alquilantes, antraciclinas e outros antibióticos citotóxicos, alquiloides de vinca , etoposídeo, compostos de platina, taxanos, inibidores da topoisomerase I, outras drogas citostáticas, imunossupressores antiproliferativos, corticosteroides, hormônios sexuais e antagonistas de hormônios e outros anticorpos terapêuticos
(tal como anticorpos contra um antígeno associado a tumor ou um modulador de ponto de verificação imune).
[00223] Por exemplo, as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em combinação com um agente imunoterapêutico que liga a um alvo selecionado do grupo que consiste em PD-1/PD-L1, CD137, CD40, GITR, LAG3, TIM3, CD27 e KIR.
[00224] Assim, a invenção abrange terapias de combinação compreendendo um polipeptídeo biespecífico da invenção juntamente com um agente imunoterapêutico adicional, eficaz no tratamento de câncer, que liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imune.
Será apreciado que o benefício terapêutico do agente imunoterapêutico adicional pode ser mediado atenuando a função de uma molécula de ponto de verificação imune inibidora e/ou ativando a função de um ponto de verificação imune estimulante ou molécula coestimuladora.
[00225] Em uma modalidade, o agente imunoterapêutico adicional é selecionado do grupo que consiste em: (a) um agente imunoterapêutico que inibe a função de PD-1 e/ou PD-L1; (b) um agente imunoterapêutico que ativa a função de CD137; e (c) um agente imunoterapêutico que ativa a função de CD40.
[00226] Assim, o agente imunoterapêutico adicional pode ser um inibidor de PD1, tal como um anticorpo anti-PD1, ou um fragmento de ligação a antígeno capaz de inibir a função de PD1 (por exemplo, Nivolumabe, Pembrolizumabe, Lambrolizumabe, PDR-001, MEDI-0680 e AMP-224).
Alternativamente, o inibidor de PD1 pode compreender ou consistir em um anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antígeno capaz de inibir a função de PD1 (por exemplo, Durvalumabe, Atezolizumabe, Avelumabe e MDX-1105).
[00227] Em uma modalidade adicional, o agente imunoterapêutico adicional ativa CD137, tal como um anticorpo anti-CD137 agonístico ou porção de ligação ao antígeno do mesmo.
[00228] Em uma modalidade adicional, o agente imunoterapêutico adicional ativa CD40, tal como um anticorpo anti-CD40 agonístico ou a porção de ligação ao antígeno do mesmo.
[00229] Será apreciado pelos versados na técnica que a presença dos dois agentes ativos (como detalhado acima) pode fornecer um benefício sinérgico no tratamento de um tumor em um sujeito. Por “sinérgico”, incluímos que o efeito terapêutico dos dois agentes em combinação (por exemplo, conforme determinado por referência à taxa de crescimento ou ao tamanho do tumor) é maior que o efeito terapêutico aditivo dos dois agentes administrados por conta própria. Esta sinergia pode ser identificada testando os agentes ativos, isoladamente e em combinação, em um modelo de linhagem de célula relevante do tumor sólido.
[00230] Também dentro do escopo da presente invenção estão kits compreendendo polipeptídeos ou outras composições da invenção e instruções para uso. O kit pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, tal como um agente terapêutico ou profilático adicional, como discutido acima.
[00231] Exemplos preferenciais sem limitação, que incorporam determinados aspectos da invenção, serão descritos agora, com referência às seguintes Figuras:
[00232] A Figura 1 mostra uma representação esquemática da estrutura de arranjos exemplares para os polipeptídeos biespecíficos da invenção. Os domínios variáveis do anticorpo anti-OX40 são preenchidos em preto; domínios constantes em branco. Os domínios de ligação de CTLA-A são sombreados com linhas diagonais.
[00233] A Figura 2 mostra as propriedades de ligação de CTLA-4 de domínios de ligação de CTLA-4 de polipeptídeos da invenção, conforme determinado por um ensaio de ligação ELISA.
[00234] A Figura 3 mostra as propriedades de ligação de CTLA-4 de domínios de ligação de CTLA-4 de polipeptídeos da invenção, conforme determinado por um ensaio de inibição ELISA.
[00235] A Figura 4 fornece uma representação esquemática de sequências de aminoácidos de CD86 tipo selvagem humano aqui divulgadas. (A) é a sequência de aminoácido do domínio extracelular solúvel monomérico de CD86 humano sem sequência sinal N-terminal (SEQ ID NO: 3); (B) é a sequência de aminoácido dos domínios extracelulares e transmembranares monoméricos de CD86 tipo selvagem humano, incluindo a sequência sinal N terminal (SEQ ID NO: 4); (C) é a sequência de aminoácido de comprimento completo de CD86 humano (Genbank ABK41931.1; SEQ ID NO: 44). A sequência em A pode opcionalmente carecer de Alanina e Prolina no N terminal, isto é, posições 24 e 25, mostradas em negrito.
As sequências sinais em B e C estão sublinhadas. A numeração de posições de aminoácidos é baseada em SEQ ID NOs: 4 e 44, começando no N terminal.
[00236] A Figura 5 mostra os resultados de um ELISA de inibição que demonstra que os domínios de ligação de CTLA- 4 de polipeptídeos da invenção têm afinidade de ligação de uma magnitude semelhante para ambos CTLA-4 humano e murino.
[00237] A Figura 6 é um gráfico de constante de taxa de dissociação versus constante de taxa de associação para anticorpos anti-OX40 exemplares, conforme determinado por ressonância de plásmon de superfície.
[00238] A Figura 7 mostra ligação de anticorpos anti- OX40 exemplares ao OX40 humano superexpressado em células de CHO, medida por citometria de fluxo.
[00239] A Figura 8 mostra o nível de produção de IL- 2 pelas células T quando incubadas in vitro com diferentes anticorpos anti-OX40 exemplares. O eixo y é a razão do valor mais alto da produção de IL-2 por um anticorpo testado / o valor mais alto de um anticorpo de referência. Os valores médios e SEM de pelo menos 4 doadores são mostrados.
[00240] A Figura 9 mostra resultados de um ensaio ELISA para ligação de moléculas biespecíficas exemplares a alvos individuais OX40 e CTLA4.
[00241] A Figura 10 mostra resultados da análise de ressonância de plásmon de superfície de ligação de moléculas biespecíficas exemplares a ambos OX40 e CTLA4. Os diferentes anticorpos biespecíficos foram passados sobre o sensor (início indicado por I)). Na quase saturação da superfície, foi aplicado tampão (II) e subsequentemente CTLA-4 (III) foi passado sobre a superfície do sensor, gerando uma segunda fase de associação, representada pela linha cheia. Após três minutos, o tampão (IV) foi aplicado e a fase de dissociação a seguir reflete a dissociação de ambos Ab CTLA-4 e OX40.
Como um controle, apenas tampão, sem CTLA-4 foi adicionado, representado pela linha pontilhada.
[00242] A Figura 11 mostra os resultados de um ensaio ELISA mostrando a ligação de moléculas biespecíficas exemplares a ambos OX40 e CTLA-4 simultaneamente.
[00243] A Figura 12 mostra o nível de produção de IL- 2 por células T quando incubadas in vitro com diferentes moléculas biespecíficas exemplares em uma série de titulações: A) 1164/1141 e 1166/1141 B) 1168/1141 e 1170/1263 C) 1514/1581 e 1520/1141 D) 1526/1585 e 1542/1141 ou uma combinação dos dois anticorpos monoespecíficos correspondentes para cada alvo (anticorpos OX40 monoclonais ou domínio de ligação de CTLA-4 acoplado a um anticorpo IgG isotipo: 1756/1757). O ensaio foi realizado em placas de 96 poços tratadas sem cultura de tecido em forma de U, revestidas com CD3 (UCHT1) e CTLA-4 (Orencia). A média de 4 doadores é apresentada.
[00244] A Figura 13 mostra o nível de produção de IL- 2 por células T quando incubadas in vitro com diferentes moléculas biespecíficas exemplares a 1,49 nM ou uma combinação dos anticorpos monoespecíficos correspondentes para cada alvo (mAbs de a-OX40 ou o domínio de CTLA-4- acoplado a um anticorpo de isotipo: 1756/1757). O ensaio foi realizado em placas de 96 poços tratadas sem cultura de tecidos em forma de U, revestidas com anti-CD3 (UCHT1) com ou sem CTLA-4 (Orencia), indicado por + ou -. A média e o SD de 4 doadores são apresentados.
[00245] A Figura 14 mostra uma representação esquemática da estrutura de formatos exemplares para anticorpos biespecíficos da invenção. Em cada formato, as regiões constantes são mostradas como preenchidas de cinza claro; as regiões de cadeia pesada variáveis VH1 são mostradas em preto e branco quadriculado; as regiões de cadeia leve variáveis VL1 são mostradas preenchidas em branco; as regiões de cadeia pesada variáveis VH2 são mostradas preenchidas em preto; e as regiões de cadeia leve variáveis VL2 são mostradas em branco com linhas diagonais.
Domínios de ligação de OX40 (domínio de ligação 1) são tipicamente representados como um par de um domínio preto e branco quadriculado com um domínio preenchido em branco (VH1/VL1); os domínios de ligação de CD137 (domínio de ligação 2) são tipicamente representados como um par de um domínio preenchido em preto e um domínio branco com linhas diagonais (VH2/VL2). No entanto, em todos os formatos mostrados, será apreciado que os domínios de ligação 1 e 2 podem ser comutados. Isto é, um domínio de ligação de OX40 pode ocorrer em uma posição mostrada nesta figura para um domínio CD137 e vice-versa. Além disso, o domínio de ligação 2 pode ocorrer em diferentes ordens variáveis de cadeia pesada e leve, isto é, na ordem VH2/VL2 ou VL2/VH2.
[00246] A Figura 15 mostra indução de ADCC em diferente concentração por moléculas de ligação monoespecíficas de CTLA-4 (IgG de controle com parte de ligação de CTLA-4, isto é, domínio) e OX40 (1166/1167), sozinhas e em combinação, comparadas a ADCC induzida por um anticorpo biespecífico exemplar direcionado para CTLA-4 e OX40.
[00247] Figura 16. As células expressando ambos CTLA- 4 e OX40 foram coradas com concentrações decrescentes de 1166/1261 ou os dois ligantes monoespecíficos 1166/1167 (anticorpo monoclonal específico de OX40) e IgG de controle com parte de ligação a CTLA-4 (proteína de fusão de IgG de ligação a CTLA4 monoespecífica) (200 nM - 0,0034 nM), seguida por IgG anti-humana conjugada com PE. A fluorescência foi detectada usando citometria de fluxo. ‘Ctr IgG’ é um controle de isotipo negativo.
[00248] Figura 17. HEK-CTLA4 e CHO-OX40 foram corados com PKH26 e PKH67 respectivamente e incubados com 1166/1261 ou uma combinação das duas moléculas de ligação de OX40 e CTLA-4 monoespecíficas (1166/1167 e IgG de Controle com parte de ligação de CTLA-4). A porcentagem de células duplo positivas/agregadas foi quantificada usando citometria de fluxo (experimento representativo).
[00249] Figura 18. Os níveis plasmáticos do anticorpo OX40-CTLA-4 biespecífico 1166/1261 e do anticorpo OX40 monoespecífico 1166/1167 foram medidos em diferentes pontos no tempo após administração. Foram utilizados dois métodos ELISA diferentes, ELISA-1, onde OX40 foi revestido nos poços e anti-Fc foi usado para detectar a ligação e ELISA-2, onde OX40 foi revestido nos poços e CTLA-4 biotinilado foi usado para detecção.
[00250] Figura 19. Células de carcinoma de cólon HT- 29 (4x106) foram inoculadas subcutaneamente no flanco traseiro direito/costas no dia 0. Células PBMC humanas (7x106) foram administradas intraperitonealmente no mesmo dia. Os tratamentos foram feitos por injeções intraperitoneais (667nmol/dose) nos dias 6, 13 e 20.
N(camundongos)=5/doador, n(doador=4), reuniram dados de respondedores de HT29.
[00251] Figura 20 mostra os efeitos farmacodinâmicos de um anticorpo OX40-CTLA-4 biespecífico em camundongos hOX40tg investigados utilizando o modelo de carcinoma de cólon MC38. Dados agrupados de dois experimentos independentes demonstraram efeito estatisticamente significativo na razão CD8 intratumoral/Treg com anticorpo biespecífico em comparação com ambas as contrapartes monoespecíficas.
[00252] A Figura 21 mostra os níveis relativos das diferentes populações de células T no baço e tecidos tumorais de camundongos hOX40tg utilizando o modelo de carcinoma de cólon MC38. O efeito da administração do anticorpo biespecífico é comparado com as contrapartes monoespecíficas. O anticorpo biespecífico reduz Tregs intratumorais, mas não afeta as células T sistêmicas.
[00253] A Figura 22 mostra o efeito antitumor do anticorpo OX40-CTLA-4 biespecífico, investigado em camundongos transgênicos para OX40 humano e utilizando o modelo de carcinoma de cólon MC38. O anticorpo biespecífico demonstrou efeitos estatisticamente significativos na inibição do volume do tumor e eleva sobrevivência. O efeito antitumoral foi mais forte em termos de sobrevivência e inibição do crescimento tumoral do que os anticorpos de controle monoespecíficos.
[00254] A Figura 23 mostra eficácias antitumorais induzidas por anticorpo OX40-CTLA biespecífico 1166/1261. A eficácia antitumoral foi investigada no modelo de carcinoma da bexiga MB49 usando camundongos transgênicos hOX40. Os tratamentos intraperitoneais em camundongos portadores de tumores subcutâneos MB49 foram realizados por intraperitonealmente nos dias 7, 10 e 13. A) Inibição do volume tumoral por 1166/1261 ou pelas contrapartes monoclonais. B) Elevada sobrevivência induzida por 1166/1261. O gráfico do volume do tumor é exemplar de várias médias de volume de tumor realizadas +/- SEM, n=10.
Sobrevivência de Kaplan-Meyer, agrupou dados de dois experimentos individuais, n=18.
[00255] A Figura 24 mostra a memória imunológica, a qual foi demonstrada desafiando de novo respondedores completos com o mesmo tumor como tumor específico ou com um tumor irrelevante. A) Novo desafio de camundongos com o mesmo tumor. Camundongos naïve foram usados como um controle. (n=5). B) Novo desafio de camundongos em um modelo de tumor duplo com um tumor específico MB49 em um flanco e um tumor irrelevante PANC02 no outro flanco. Experimento exemplar, o gráfico mostra média +/- SEM, n=6.
[00256] A Figura 25 mostra os efeitos antitumorais de anticorpos biespecicos em Tregs. Camundongos portadores de câncer de bexiga MB49 subcutâneo foram tratados com injeções intraperitoneais de 1166/1261 ou com as contrapartes monoclonais (1,33 µmol) nos dias 10, 13 e 16. Vinte e quatro horas após a última injeção, os tumores e baços foram colhidos e corados para células Tregs e efetoras. A) Percentagem de Tregs (de CD45) nos tumores B) Células CD8 (de CD45) em tumores C) Razão CD8/Treg em tumores e D) Razão CD8/Treg em baços. Os gráficos mostram média + SD.
[00257] A Figura 26 mostra efeitos anti-tumorais de anticorpos biespecicos em carcinoma de cólon MC38.
Camundongos portadores de carcinoma de cólon MC38 subcutâneo foram tratados com injeções intraperitoneais com 1166/1261 nos dias 10, 13 e 16. Vinte e quatro horas após a última injeção, os tumores foram colhidos e corados para células efetoras e marcadores de ativação. A) Porcentagem de células CD107+ CD8 em tumores (B) Porcentagem de GranzymeB + células CD8 em tumores. Os gráficos mostram média + SD.
[00258] A Figura 27 mostra localização de tumor em camundongos hOX40tg com carcinoma de cólon MC38. Camundongos portadores de carcinoma de cólon MC38 subcutâneo foram tratados intraperitonealmente com veículo, controle de isotipo IgG1 ou 1166/1261 no dia 17. Vinte e quatro horas após a injeção, os tumores e baços foram colhidos, corados com um marcador de viabilidade e anticorpos contra CD45 e hIgG, seguidos por análise de citometria de fluxo. A porcentagem de células hIgG+ de células CD45+ vivas em (A) tumores e (B) baços foi comparada entre os diferentes grupos.
Os gráficos mostram média + SEM.
[00259] A Figura 28 mostra os efeitos combinatórios de anticorpo PD-1 com 1166/1261. Os efeitos antitumorais de 1166/1261 com ou sem tratamento de PD-1 foram investigados em modelo de carcinoma de cólon MC38. Os tratamentos intraperitoneais (1166/1261, 1,33 µmol ou 250 µg de PD-1) foram realizados intraperitonealmente nos dias 7, 10 e 13.
A) Inibição do volume tumoral por 1166/1261 com ou sem combinação de PD-1. B) Elevada sobrevivência induzida por 1166/1261 com ou sem tratamento de PD-1. O gráfico de volume de tumor é um gráfico exemplar e apresenta volume de tumor médio +/- SEM, ou sobrevivência de Kaplan-Meyer, n=9-10.
[00260] A Figura 29 mostra efeitos combinatórios de anticorpo PD-1 com 1166/1261. Os efeitos antitumorais de 1166/1261 com ou sem tratamento de PD-1 foram investigados no modelo de carcinoma de cólon CT26. Os tratamentos intraperitoneais foram realizados nos dias 7, 10 e 13. A) Inibição do volume tumoral por 1166/1261 com ou sem PD-1).
B) Sobrevivência de Kaplan-Meyer por 1166/1261 com ou sem tratamento de PD-1. Os gráficos mostram dois experimentos independentes reunidos juntos, volume do tumor média +/- SEM, n=18.
[00261] A Figura 30 mostra efeito antitumoral de 1166/1261 em câncer pancreático. O efeito antitumoral de anticorpo OX40-CTLA-4 biespecífico 1166/1261 foi investigado em camundongos transgênicos para OX40 humano usando câncer pancreático PANC02. Os tratamentos intraperitoneais foram feitos nos dias 7, 10 e 13. A) Inibição do volume tumoral.
B) Elevada sobrevivência. Os gráficos mostram volume de tumor médio +/- SEM, ou sobrevivência de Kaplan Meyer n=18.
[00262] A Figura 31 mostra a capacidade de 1166/1261 e do controle de isotipo para induzir ativação de células T bloqueando CTLA-4 em células repórter de Jurkat em um ensaio de Repórter de Bloqueio de CTLA-4. Dados compilados de dois experimentos.
[00263] A Figura 32 mostra ativação de célula T. A) produção de IFN-γ em seguida a estimulação de células T CD3+ humanas com 1166/1261, a combinação de anticorpos monoespecíficos ou controle de isotipo. O experimento foi realizado em placas revestidas com CTLA-4 e αCD3. Dados compilados de 4 doadores. B) Liberação de IL-2 por células T CD4+ estimuladas com 1166/1261 ou combinação de anticorpos monoespecíficos na presença de células HEK expressando CTLA- 4 e contas de αCD3. Dados compilados de 6 doadores. C) Proliferação de células T CD4+ em resposta a 1166/1261 ou controle de isotipo. Dados compilados de 6 doadores.
[00264] A Figura 33 mostra ativação de célula T. A liberação de IL-2 por células T CD4+ estimuladas com 1166/1261 ou combinação de anticorpos monoespecíficos na presença de células CHO expressando CD64 e contas de αCD3.
Dados compilados de 8 doadores.
[00265] A Figura 34 mostra a indução de ADCC por 1166/1261. A) Ativação de células efetoras FcγRIIIa (V158) em resposta a 1166/1261, mistura da contraparte monoclonal ou controle de isotipo. Tregs purificadas ativadas por 48 h com contas de αCD3/αCD28 foram usadas como células alvo. Os dados são apresentados como vezes de indução sobre controle de meio. B) A expressão de OX40 e CTLA-4 foi determinada por citometria de fluxo em Tregs antes e após ativação. A média de três doadores é mostrada.
[00266] A Figura 35 mostra ADCC em resposta a 1166/1261. Tregs purificadas ativadas por 48 h com contas de αCD3/αCD28 foram utilizadas como células alvo e células NK alogênicas como células efetoras. As células efetoras e alvo foram cultivadas a uma razão de 15:1 na presença de 1166/1261 ou controle de isotipo. Após 4 h, a liberação de LDH foi medida. Dados compilados de 7 doadores.
[00267] A Figura 36 mostra ativação da ativação de células T de cynomolgus por tratamento de 1166/1261. A) Proliferação das células CD4+ da memória central B) Ativação tardia das células T CD4+.
Descrição das sequências
[00268] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácido de CTLA-4 humano (correspondente a GenBank: AAD00698.1)
[00269] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácido de CD28 humano (correspondente a GenBank: AAA51944.1)
[00270] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácido do domínio extracelular monomérico de CD86 tipo selvagem humano, excluindo uma sequência sinal de 23 aminoácidos do N terminal.
[00271] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácido dos domínios monoméricos extracelulares e transmembranares de CD86 tipo selvagem humano, incluindo sequência sinal N- terminal (ver Figura 4). Toda a numeração de posições de aminoácidos neste documento é baseada nas posições na SEQ ID NO: 4, começando no N terminal. Assim, a Alanina no N terminal da SEQ ID NO: 3 é numerada 24.
[00272] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácido de uma forma mutante do domínio extracelular de CD86 humano divulgada em Peach et al (Journal of Biological Chemistry 1995, vol 270 (36), 21181-21187). H na posição 79 da sequência tipo selvagem é substituído por A na posição correspondente para a sequência de SEQ ID NO: 5. Esta mudança é aqui referida como H79A. A nomenclatura equivalente é utilizada em todas as outras substituições de aminoácidos aqui referidas. A numeração de posições é baseada em SEQ ID NO: 4, conforme delineado acima.
[00273] SEQ ID NOs: 6 a 24 são as sequências de aminoácidos de proteínas específicas da invenção.
[00274] SEQ ID NOs: 25 a 43 são sequências de nucleotídeo codificando as sequências de aminoácidos de cada uma de SEQ ID NOs 6 a 24, respectivamente
[00275] SEQ ID NO: 44 é a sequência de aminoácido de comprimento total de CD86 humano (correspondente a GenBank: ABK41931.1)
[00276] SEQ ID NO: 45 é a sequência de aminoácidos do CTLA-4 murino (correspondente a UniProtKB/Swiss-Prot: P09793.1).
[00277] SEQ ID NO: 46 é a sequência de aminoácido de CD28 murino (correspondente a GenBank: AAA37395.1).
[00278] SEQ ID NOs: 47 a 50 são vários ligantes que podem ser utilizados nos polipeptídeos biespecíficos da invenção.
[00279] SEQ ID NO: 51 é a sequência de aminoácido de OX40 humano (correspondente a GenBank: NP_003318.1)
[00280] SEQ ID NOs: 52 a 88 são sequências CDR exemplares de anticorpos anti-OX40 aqui divulgados.
[00281] SEQ ID NOs: 89 a 124 são sequências de aminoácidos e nucleotídeos exemplares das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos aqui divulgados.
[00282] SEQ ID NOs: 125 a 134 são sequências de aminoácidos e nucleotídeos exemplares de polipeptídeos biespecíficos aqui divulgados.
[00283] SEQ ID NO: 135 é uma sequência de aminoácido da região constante da cadeia pesada exemplar.
[00284] SEQ ID NO: 136 é uma sequência de aminoácido da região constante da cadeia leve exemplar.
[00285] SEQ ID NO: 137 é uma sequência de região constante de IgG4 de cadeia pesada humana modificada exemplar com uma mutação de Ser para Pro na região de dobradiça (posição 108) e de His para Arg na região CH3 (posição 315).
As mutações resultam em meia-vida sérica reduzida e estabilização da dobradiça de núcleo de IgG4, tornando a IgG4 mais estável, impedindo a troca de braço de Fab.
[00286] SEQ ID NO: 138 é uma sequência de região constante de IgG4 de cadeia pesada humana tipo selvagem exemplar. Essa é uma sequência carecendo de mutações de SEQ ID NO: 137.
[00287] SEQ ID NO: 139 é uma sequência de região constante de IgG4 de cadeia pesada humana modificada exemplar com uma única mutação de Ser para Pro na região de dobradiça (posição 108). A mutação resulta na estabilização da dobradiça de núcleo de IgG4, tornando a IgG4 mais estável, impedindo a troca de braço de Fab.
[00288] SEQ ID NO: 140 é uma sequência de cDNA exemplar (isto é, carecendo de íntrons) codificando a região constante de IgG4 de SEQ ID NO: 137.
[00289] SEQ ID NO: 141 é uma sequência de DNA genômico exemplar (isto é, incluindo íntrons) codificando a região constante de IgG4 de SEQ ID NO: 137
[00290] SEQ ID NO: 142 é uma sequência de cDNA exemplar (isto é, carecendo de íntrons) codificando a região constante de IgG4 de SEQ ID NO: 138.
[00291] SEQ ID NO: 143 é uma sequência de DNA genômico exemplar (isto é, incluindo íntrons) codificando a região constante de IgG4 de SEQ ID NO: 138
[00292] SEQ ID NO 144 é um ligante que pode ser utilizado nos polipeptídeos biespecíficos da invenção.
[00293] SEQ ID NOs: 145 e 146 são sequências exemplificativas de cDNA e DNA genômico exemplares, respectivamente, codificando a região constante de IgG1 de SEQ ID NO: 135.
[00294] SEQ ID NOs: 147 é uma sequência de DNA exemplar codificando a região capa da cadeia leve de SEQ ID NO: 136.
[00295] SEQ ID NO: 148 é uma sequência de cDNA exemplar (isto é, carecendo de íntrons) codificando a região de IgG4 de SEQ ID NO: 139.
[00296] SEQ ID NO: 149 é uma sequência de DNA genômico exemplar (isto é, incluindo íntrons) codificando a região de IgG4 de SEQ ID NO: 139.
[00297] TABELAS (Sequências) Tabela A(1) - Sequências de CDR da cadeia pesada exemplares (anticorpo OX40) VH número SEQ H CDR1 SEQ H CDR2 SEQ H CDR3 1166 52 GFTFGGYY 60 ISGSGGST 69 ARYDYASMDY 1170 As 1166 61 IPGSGGST 70 ARYDYYWMDY 1164 53 GFTFYGSS 62 IYSSGGYT 71 ARGVPHGYFDY 1168 54 GFTFSGSS 63 ISYYGGYT 72 ARYFPHYYFDY 1482 55 GFTFSSYA 64 ISYYSGYT 73 ARGYGYLDY 1490 As 1482 As 1168 74 ARYYPHHYIDY 1514 56 GFTFGYYY 65 ISSYGSYT 75 ARSGYSNWANSFDY 1520 As 1482 As 1166 76 ARYYYSHGYYVYGTLDY 1524 57 GFTFGSYY 66 IGSYYGYT 77 ARHDYGALDY
1526 58 GFTFSGYS 67 IGYSGYGT 78 ARYYFHDYAAYSLDY
1542 59 GFTFGSSS 68 IGYYSYSTS 79 ARGYPHHYFDY
Tabela A(2) - Sequências de CDR da cadeia leve exemplares (anticorpo OX40)
VL número SEQ L CDR1 SEQ L CDR2 SEQ L CDR3
1167 80 QSISSY 81 AAS 82 QQYYWYGLST
1171 As 1167 As 1167 83 QQGHGSYPHT
1135 As 1167 As 1167 84 QQSYSTPYT
1483 As 1167 As 1167 85 QQYGSLLT
1515 As 1167 As 1167 86 QQGDYTLFT
1525 As 1167 As 1167 87 QQYGPSGLFT
1527 As 1167 As 1167 88 QQYGSDSLLT
Tabela B - Sequências exemplares (anticorpo OX40) SEQ ID NO. CADEIA NO. TIPO SEQUÊNCIA 89 1167, VL aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWY de cadeia QQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT leve LTISSLQPEDFATYYCQQYYWYGLSTFGQGTKLEIK 90 1167, VL nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGC de cadeia GCATCTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGG leve GCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTAT
CAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA CGTTTCAGTGGCAGTGGAAGCGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCA ACTTATTACTGTCAACAGTACTACTGGTACGGTCTG
TCCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA 91 1166, VH aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGGYYMSW de cadeia VRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISR pesada DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYDYASMDYWG
QGTLVTVSS 92 1166, VH nt GAGGTGCAGCTGTTGGAGAGCGGGGGAGGCTTGGTA de cadeia CAGCCTGGGGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCC pesada AGCGGATTCACCTTTGGTGGTTACTACATGTCTTGG
GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGT GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGT GCGCGCTACGACTACGCTTCTATGGACTATTGGGGC
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 93 aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWY 1171, QQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT cadeia LTISSLQPEDFATYYCQQGHGSYPHTFGQGTKLEIK leve VL 94 nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGC 1171, GCATCTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGG cadeia GCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTAT leve VL CAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC
TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA CGTTTCAGTGGCAGTGGAAGCGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCA ACTTATTACTGTCAACAGGGTCATGGTTCTTACCCG
CACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA 95 1170, VH aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGGYYMSW de cadeia VRQAPGKGLEWVSYIPGSGGSTYYADSVKGRFTISR pesada DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYDYYWMDYWG
QGTLVTVSS 96 1170, VH nt GAGGTGCAGCTGTTGGAGAGCGGGGGAGGCTTGGTA de cadeia CAGCCTGGGGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCC pesada AGCGGATTCACCTTTGGTGGTTACTACATGTCTTGG
GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCATACATTCCTGGTTCTGGTGGTTCTACATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGT GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGT GCGCGCTACGACTACTACTGGATGGACTATTGGGGC
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 97 1135, VL aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWY de cadeia QQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT leve LTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK 98 1135, VL nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGC de cadeia GCATCTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGG leve GCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTAT
CAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA CGTTTCAGTGGCAGTGGAAGCGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCA ACTTATTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTTAT
ACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA 99 1164, VH aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYGSSMYW de cadeia VRQAPGKGLEWVSGIYSSGGYTSYADSVKGRFTISR pesada DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVPHGYFDYW
GQGTLVTVSS 100 1164, VH nt GAGGTGCAGCTGTTGGAGAGCGGGGGAGGCTTGGTA de cadeia CAGCCTGGGGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCC pesada AGCGGATTCACCTTTTACGGTTCTTCTATGTACTGG
GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCAGGTATTTACTCTTCTGGTGGTTACACATCTTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGT GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGT GCGCGCGGTGTTCCTCATGGTTACTTTGACTATTGG
GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 101 1168, VH aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSSMSW de cadeia VRQAPGKGLEWVSSISYYGGYTYYADSVKGRFTISR pesada DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYFPHYYFDYW
GQGTLVTVSS 102 1168, VH nt GAGGTGCAGCTGTTGGAGAGCGGGGGAGGCTTGGTA de cadeia CAGCCTGGGGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCC pesada AGCGGATTCACCTTTAGTGGTTCTTCTATGTCTTGG
GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCATCTATTTCTTACTACGGTGGTTACACATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGT GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGT GCGCGCTACTTCCCGCATTACTACTTTGACTATTGG
GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 103 1483, VL aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWY de cadeia QQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT leve LTISSLQPEDFATYYCQQYGSLLTFGQGTKLEIK 104 1483, VL nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGC de cadeia GCATCTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGG leve GCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTAT
CAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA CGTTTCAGTGGCAGTGGAAGCGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCA ACTTATTACTGTCAACAGTACGGTTCTCTGCTCACT
TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA 105 1482, VH aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW de cadeia VRQAPGKGLEWVSYISYYSGYTYYADSVKGRFTISR pesada DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGYLDYWGQ
GTLVTVSS 106 1482, VH nt GAGGTGCAGCTGTTGGAGAGCGGGGGAGGCTTGGTA de cadeia CAGCCTGGGGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCC pesada AGCGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGG
GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCATACATTTCTTACTACTCTGGTTACACATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGT GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGT GCGCGCGGTTACGGTTACTTGGACTATTGGGGCCAG
GGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 107 1490, VH aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW de cadeia VRQAPGKGLEWVSGISYYGGYTYYADSVKGRFTISR pesada DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYPHHYIDYW
GQGTLVTVSS
108 1490, VH nt GAGGTGCAGCTGTTGGAGAGCGGGGGAGGCTTGGTA de cadeia CAGCCTGGGGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCC pesada AGCGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGG
GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCAGGTATTTCTTACTACGGTGGTTACACATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGT GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGT GCGCGCTACTACCCGCATCATTACATTGACTATTGG
GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 109 1515, VL aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWY de cadeia QQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT leve LTISSLQPEDFATYYCQQGDYTLFTFGQGTKLEIK 110 1515, VL nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGC de cadeia GCATCTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGG leve GCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTAT
CAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA CGTTTCAGTGGCAGTGGAAGCGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCA ACTTATTACTGTCAACAGGGTGATTACACTCTGTTC ACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
111 1514, VH aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGYYYMSW de cadeia VRQAPGKGLEWVSGISSYGSYTYYADSVKGRFTISR pesada DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYSNWANSF
DYWGQGTLVTVSS 112 1514, VH nt GAGGTGCAGCTGTTGGAGAGCGGGGGAGGCTTGGTA de cadeia CAGCCTGGGGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCC pesada AGCGGATTCACCTTTGGTTACTACTACATGTCTTGG
GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCAGGTATTTCTTCTTACGGTAGTTACACATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGT GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGT GCGCGCTCTGGTTACTCTAACTGGGCTAACTCTTTT GACTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCC
TCA 113 1520, VH aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW de cadeia VRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISR pesada DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYYSHGYYVY
GTLDYWGQGTLVTVSS 114 1520, VH nt GAGGTGCAGCTGTTGGAGAGCGGGGGAGGCTTGGTA de cadeia CAGCCTGGGGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCC pesada AGCGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGG
GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGT GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGT GCGCGCTACTACTACTCTCATGGTTACTACGTTTAC GGTACTTTGGACTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTC
ACCGTCTCCTCA 115 1525, VL aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWY de cadeia QQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT leve LTISSLQPEDFATYYCQQYGPSGLFTFGQGTKLEIK 116 1525, VL nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGC de cadeia GCATCTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGG leve GCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTAT
CAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA CGTTTCAGTGGCAGTGGAAGCGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCA ACTTATTACTGTCAACAGTACGGTCCGTCTGGTCTG
TTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA 117 1524, VH aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYYMGW de cadeia VRQAPGKGLEWVSSIGSYYGYTYYADSVKGRFTISR pesada DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHDYGALDYWG
QGTLVTVSS
118 1524, VH nt GAGGTGCAGCTGTTGGAGAGCGGGGGAGGCTTGGTA de cadeia CAGCCTGGGGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCC pesada AGCGGATTCACCTTTGGTTCTTACTACATGGGTTGG
GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCATCTATTGGTTCTTACTACGGTTACACATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGT GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGT GCGCGCCATGACTACGGTGCTTTGGACTATTGGGGC
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA 119 1527, VL aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWY de cadeia QQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT leve LTISSLQPEDFATYYCQQYGSDSLLTFGQGTKLEIK 120 1527, VL nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGC de cadeia GCATCTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGG leve GCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTAT
CAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA CGTTTCAGTGGCAGTGGAAGCGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCA ACTTATTACTGTCAACAGTACGGTTCTGATTCTCTG CTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
121 1526, VH aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYSMYW de cadeia VRQAPGKGLEWVSGIGYSGYGTYYADSVKGRFTISR pesada DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYFHDYAAYS
LDYWGQGTLVTVSS 122 1526, VH nt GAGGTGCAGCTGTTGGAGAGCGGGGGAGGCTTGGTA de cadeia CAGCCTGGGGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCC pesada AGCGGATTCACCTTTTCTGGTTACTCTATGTACTGG
GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCAGGTATTGGTTACTCTGGTTACGGTACATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGT GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGT GCGCGCTACTACTTCCATGACTACGCTGCTTACTCT TTGGACTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCCTCA 123 1542, VH aa EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSSSMYW de cadeia VRQAPGKGLEWVSGIGYYSYSTSYADSVKGRFTISR pesada DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYPHHYFDYW
GQGTLVTVSS 124 1542, VH nt GAGGTGCAGCTGTTGGAGAGCGGGGGAGGCTTGGTA de cadeia CAGCCTGGGGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCC pesada AGCGGATTCACCTTTGGTTCTTCTTCTATGTACTGG
GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCAGGTATTGGTTACTACTCTTACTCTACATCTTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGT GACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGT GCGCGCGGTTACCCGCATCATTACTTTGACTATTGG
GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA Tabela C - Variantes exemplares do domínio do CD86 humano
SEQ ID DESIGNAÇÃO SEQUÊNCIA NO.
6 900 LKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVY
LGKEKFDSVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCVIH
HKKPSGLVKIHEMNSELSVLA 7 901 LKIQAYFNETADLPCQFANSQNLTLSELVVFWQDQENLVLNEVY
LGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCVIH
HKKPTGMIKIHEMNSELSVLT 8 904 LKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELIVFWQDQENLVLNEVY
LGKERFDAVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCIIH
HKKPSGMVKIHQMDSELSVLA 9 906 LKIQAYINETADLPCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNEVY
LGKERFDSVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGFYQCIIH HKKPTGLVKIHEMNSELSVLA
10 907 LKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVY
LGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIH
HKKPTGMIKIHEMNSELSVLA 11 908 LKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVY
LGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCIIH
HKKPTGMVKIHEMNSELSVLA 12 910 LKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVY
LGKEKFDSVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCIIH
HKKPTGMVKIHEMNSELSVLA 13 915 LKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLILNEVY
LGKEKFDSVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGFYQCIIH
HKKPSGLIKIHQMDSELSVLA 14 938 LKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLILNEVY
LGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCIIH
HKKPTGMVKIHQMNSELSVLA 15 1038 APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNE
VYLGKEKFDSVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCI
IHHKKPTGMVKIHEMNSELSVLA 16 1039 APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNE
VYLGKEKFDSVSSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCI
IHHKKPSGMVKIHQMDSELSVLA 17 1040 APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNE
VYLGKERFDSVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGRYQCI IHHKKPTGMINIHQMNSELSVLA
18 1041 APLKIQAYLNETADLPCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNE
VYLGKEKFDSVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCI
IHHKKPTGLVKIHEMNSELSVLA 19 1042 APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNE
VYLGKEIFDSVSSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCI
IHHKKPSGMVKIHQMDSELSVLA 20 1043 APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNE
VYLGKEKFDSVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCI
IHHKKPTGMIKIHEMNSELSVLA 21 1044 APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNLTLSELVVFWQDQENLVLNE
VYLGKEKFDSVSSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCI
IHHKKPTGMIKIHEMSSELSVLA 22 1045 APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNLTLSELVVFWQDQENLVLNE
VYLGKEKFDSVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCI
IHHKKPTGLVKIHEMNSELSVLA 23 1046 APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNE
VYLGKEKFDSVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIEDKGIYQCI
IHHKKPSGMVKIHQMDSELSVLA 24 1047 APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNE
VYLGKEKFDSVDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGIYQCI
IHHKKPTGLVKIHEMNSELSVLA Tabela D - Polipeptídeos exemplares para OX40 e CTLA-4
SEQ ID DESIGNAÇÃO TIPO SEQUÊNCIA NO.
125 1261 = aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKP VL de cadeia GKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP leve 1167, com EDFATYYCQQYYWYGLSTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFP sequência PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS capa QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ constante, GLSSPVTKSFNRGECSGGGGSGGGGSAPLKIQAYFNETAD ligante LPCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKERFDS (sublinhado) VDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGRYQCIIHHKKP e mutante de TGMINIHQMNSELSVLA CD86 1040 NB. A CADEIA LEVE MONTA PREFERENCIALMENTE
COM UMA CADEIA PESADA COMPREENDENDO A SEQUÊNCIA VH 1166 ASSIM, A MOLÉCULA COMPLETA PODE SER DESIGNADA 1166/1261 126 1261 = 1267 VL nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGCGCAT de cadeia CTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCA leve, com GAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA sequência GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT capa TGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGAAG constante, CGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT ligante e GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTACTACTGGT mutante de ACGGTCTGTCCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGAT CD86 1040 CAAACgtgagtcgtacgctagcaagcttgatatcgaattc taaactctgagggggtcggatgacgtggccattctttgcc taaagcattgagtttactgcaaggtcagaaaagcatgcaa agccctcagaatggctgcaaagagctccaacaaaacaatt tagaactttattaaggaatagggggaagctaggaagaaac tcaaaacatcaagattttaaatacgcttcttggtctcctt gctataattatctgggataagcatgctgttttctgtctgt ccctaacatgccctgtgattatccgcaaacaacacaccca agggcagaactttgttacttaaacaccatcctgtttgctt ctttcctcagGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCT
TCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTC TGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCA GACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCC ATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAG GGGAGAGTGTAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGA AGCGCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTG CAGACTTACCGTGTCAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAG CCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGATCAGGAGAAC CTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGCGGTTCG ACAGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGA TAGCGACAGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATC AAAGATAAGGGTAGGTACCAGTGCATTATCCACCATAAGA AGCCGACGGGTATGATTAATATTCACCAAATGAACTCCGA
GTTGTCTGTCCTGGCG 127 1263 = 1171 VL aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKP de cadeia GKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP leve, com EDFATYYCQQGHGSYPHTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFP sequência PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS capa QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ constante, GLSSPVTKSFNRGECSGGGGSGGGGSAPLKIQAYFNETAD ligante LPCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKERFDS (sublinhado) VDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGRYQCIIHHKKP e mutante de TGMINIHQMNSELSVLA CD86 1040
A CADEIA LEVE MONTA PREFERENCIALMENTE
MONTA COM UMA CADEIA PESADA COMPREENDENDO A SEQUÊNCIA VH 1170 ASSIM, A MOLÉCULA COMPLETA PODE SER DESIGNADA 1170/1263 128 1263 = 1171 VL nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGCGCAT da cadeia CTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCA leve, com GAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA sequência GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT capa TGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGAAG constante, CGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT ligante e GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGGTCATGGTT mutante de CTTACCCGCACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGAT CD86 1040 CAAACgtgagtcgtacgctagcaagcttgatatcgaattc taaactctgagggggtcggatgacgtggccattctttgcc taaagcattgagtttactgcaaggtcagaaaagcatgcaa agccctcagaatggctgcaaagagctccaacaaaacaatt tagaactttattaaggaatagggggaagctaggaagaaac tcaaaacatcaagattttaaatacgcttcttggtctcctt gctataattatctgggataagcatgctgttttctgtctgt ccctaacatgccctgtgattatccgcaaacaacacaccca agggcagaactttgttacttaaacaccatcctgtttgctt ctttcctcagGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCT
TCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTC TGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCA GACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCC ATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAG GGGAGAGTGTAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGA AGCGCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTG CAGACTTACCGTGTCAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAG CCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGATCAGGAGAAC CTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGCGGTTCG ACAGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGA TAGCGACAGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATC AAAGATAAGGGTAGGTACCAGTGCATTATCCACCATAAGA AGCCGACGGGTATGATTAATATTCACCAAATGAACTCCGA
GTTGTCTGTCCTGGCG 129 1141 = 1135 VL aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKP da cadeia GKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP leve, com EDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP sequência SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ capa ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG constante, LSSPVTKSFNRGECSGGGGSGGGGSAPLKIQAYFNETADL ligante PCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKERFDSV (sublinhado) DSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGRYQCIIHHKKPT e mutante de GMINIHQMNSELSVLA CD86 1040
A CADEIA LEVE MONTA PREFERENCIALMENTE COM
UMA CADEIA PESADA COMPREENDENDO QUALQUER UMA DAS SEQUÊNCIAS DE VH 1164, 1168, 1520 OU 1542 ASSIM, MOLÉCULAS COMPLETAS PODEM SER DESIGNADAS 1164/1141, 1168/1141, 1520/1141 OU 1542/1141 130 1141 = 1135 VL nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGCGCAT da cadeia CTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCA leve, com GAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA sequência GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT capa TGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGAAG constante, CGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT ligante e GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGAGTTACAGTA mutante de CCCCTTATACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAA CD86 1040 ACgtgagtcgtacgctagcaagcttgatatcgaattctaa actctgagggggtcggatgacgtggccattctttgcctaa agcattgagtttactgcaaggtcagaaaagcatgcaaagc cctcagaatggctgcaaagagctccaacaaaacaatttag aactttattaaggaatagggggaagctaggaagaaactca aaacatcaagattttaaatacgcttcttggtctccttgct ataattatctgggataagcatgctgttttctgtctgtccc taacatgccctgtgattatccgcaaacaacacacccaagg gcagaactttgttacttaaacaccatcctgtttgcttctt tcctcagGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCC
CGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGT TGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAA GTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACT CCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCAC CTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGAC TACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGG AGAGTGTAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGC GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAG ACTTACCGTGTCAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAGCCT GAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGATCAGGAGAACCTG GTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGCGGTTCGACA GCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAG CGACAGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAA GATAAGGGTAGGTACCAGTGCATTATCCACCATAAGAAGC CGACGGGTATGATTAATATTCACCAAATGAACTCCGAGTT
GTCTGTCCTGGCG 131 1581 = 1515 VL aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKP da cadeia GKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP leve, com EDFATYYCQQGDYTLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP sequência SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ capa ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG constante, LSSPVTKSFNRGECSGGGGSGGGGSAPLKIQAYFNETADL ligante PCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKERFDSV (sublinhado) DSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGRYQCIIHHKKPT e mutante de GMINIHQMNSELSVLA CD86 1040
A CADEIA LEVE MONTA PREFERENCIALMENTE COM
UMA CADEIA PESADA COMPREENDENDO A SEQUÊNCIA VH 1514
ASSIM, A MOLÉCULA COMPLETA PODE SER DESIGNADA 1514/1581 132 1581 = 1515 VL nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGCGCAT da cadeia CTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCA leve, com GAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA sequência GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT capa TGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGAAG constante, CGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT ligante e GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGGTGATTACA mutante de CTCTGTTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAA CD86 1040 ACgtgagtcgtacgctagcaagcttgatatcgaattctaa actctgagggggtcggatgacgtggccattctttgcctaa agcattgagtttactgcaaggtcagaaaagcatgcaaagc cctcagaatggctgcaaagagctccaacaaaacaatttag aactttattaaggaatagggggaagctaggaagaaactca aaacatcaagattttaaatacgcttcttggtctccttgct ataattatctgggataagcatgctgttttctgtctgtccc taacatgccctgtgattatccgcaaacaacacacccaagg gcagaactttgttacttaaacaccatcctgtttgcttctt tcctcagGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCC
CGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGT TGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAA GTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACT CCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCAC CTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGAC TACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGG AGAGTGTAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGC GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAG ACTTACCGTGTCAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAGCCT GAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGATCAGGAGAACCTG GTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGCGGTTCGACA GCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAG CGACAGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAA GATAAGGGTAGGTACCAGTGCATTATCCACCATAAGAAGC CGACGGGTATGATTAATATTCACCAAATGAACTCCGAGTT
GTCTGTCCTGGCG 133 1585 = 1527 VL aa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKP da cadeia GKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP leve, com EDFATYYCQQYGSDSLLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFP sequência PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS capa QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ constante, GLSSPVTKSFNRGECSGGGGSGGGGSAPLKIQAYFNETAD ligante LPCQFANSQNLSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKERFDS (sublinhado) VDSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGRYQCIIHHKKP e mutante de TGMINIHQMNSELSVLA CD86 1040
A CADEIA LEVE MONTA PREFERENCIALAMENTE
COM UMA CADEIA PESADA COMPREENDENDO A SEQUÊNCIA VH 1526 ASSIM, A MOLÚCULA COMPLETA PODE SER DESIGNADA 1526/1585
134 1585 = 1527 VL nt GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGAGCGCAT da cadeia CTGTAGGAGACCGCGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCA leve, com GAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA sequência GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT capa TGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGAAG constante, CGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT ligante e GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTACGGTTCTG mutante de ATTCTCTGCTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGAT CD86 1040 CAAACgtgagtcgtacgctagcaagcttgatatcgaattc taaactctgagggggtcggatgacgtggccattctttgcc taaagcattgagtttactgcaaggtcagaaaagcatgcaa agccctcagaatggctgcaaagagctccaacaaaacaatt tagaactttattaaggaatagggggaagctaggaagaaac tcaaaacatcaagattttaaatacgcttcttggtctcctt gctataattatctgggataagcatgctgttttctgtctgt ccctaacatgccctgtgattatccgcaaacaacacaccca agggcagaactttgttacttaaacaccatcctgtttgctt ctttcctcagGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCT
TCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTC TGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCA GACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCC ATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAG GGGAGAGTGTAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGA AGCGCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTG CAGACTTACCGTGTCAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAG CCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGATCAGGAGAAC CTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGCGGTTCG ACAGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGA TAGCGACAGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATC AAAGATAAGGGTAGGTACCAGTGCATTATCCACCATAAGA AGCCGACGGGTATGATTAATATTCACCAAATGAACTCCGA
GTTGTCTGTCCTGGCG Tabela E - Polinucleotídeos exemplares que codificam B2 - CTLA-4
SEQ ID 25 900 CTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGTCAGTTT
GCCAATTCGCAGAATCAAAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGAT CAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAATTCGAC AGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGACAGCTGG ACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTACCAGTGC GTGATCCACCATAAGAAGCCGAGCGGTCTGGTGAAGATTCACGAGATGAAC
TCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 26 901 CTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGTCAGTTT
GCCAATTCGCAGAATCTGACCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGAT CAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAATTCGAC AGCGTGCATAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGACAGCTGG ACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTACCAGTGC GTGATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTATGATTAAGATTCACGAGATGAAC
TCCGAGTTGTCTGTCCTGACC 27 904 CTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGTCAGTTT
GCCAATTCGCAGAATCAAAGCCTGAGCGAACTGATCGTTTTCTGGCAGGAT CAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGCGGTTCGAC GCCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGACAGCTGG ACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTACCAGTGC ATTATCCACCATAAGAAGCCGAGCGGTATGGTGAAGATTCACCAAATGGAC
TCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 28 906 CTCAAAATCCAAGCGTACATCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGTCAGTTT
GCCAATTCGCAGAATCTGAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGAT CAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGCGGTTCGAC AGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGACAGCTGG ACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTTTCTACCAGTGC ATTATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTCTGGTGAAGATTCACGAGATGAAC
TCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 29 907 CTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGTCAGTTT
GCCAATTCGCAGAATCAAAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGAT CAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAATTCGAC AGCGTGCATAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGACAGCTGG ACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTCTGTACCAGTGC ATTATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTATGATTAAGATTCACGAGATGAAC
TCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 30 908 CTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGTCAGTTT
GCCAATTCGCAGAATCAAAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGAT CAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAATTCGAC AGCGTGCATAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGACAGCTGG ACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTACCAGTGC ATTATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTATGGTGAAGATTCACGAGATGAAC TCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG
31 910 CTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGTCAGTTT
GCCAATTCGCAGAATCAAAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGAT CAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAATTCGAC AGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGACAGCTGG ACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTACCAGTGC ATTATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTATGGTGAAGATTCACGAGATGAAC
TCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 32 915 CTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGTCAGTTT
GCCAATTCGCAGAATCAAAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGAT CAGGAGAACCTGATCCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAATTCGAC AGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGACAGCTGG ACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTTTCTACCAGTGC ATTATCCACCATAAGAAGCCGAGCGGTCTGATTAAGATTCACCAAATGGAC
TCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 33 938 CTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGTCAGTTT
GCCAATTCGCAGAATCTGAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGGCAGGAT CAGGAGAACCTGATCCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGCGGTTCGAC AGCGTGCATAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGACAGCTGG ACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTCTGTACCAGTGC ATTATCCACCATAAGAAGCCGAGCGGTATGGTGAAGATTCACGAGATGAAC
TCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 34 1038 GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGT
CAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGG CAGGATCAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAA TTCGACAGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGAC AGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTAC CAGTGCATTATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTATGGTGAAGATTCACGAG
ATGAACTCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 35 1039 GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGT
CAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGG CAGGATCAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAA TTCGACAGCGTGAGTAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGAC AGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTAC CAGTGCATTATCCACCATAAGAAGCCGAGCGGTATGGTGAAGATTCACCAA
ATGGACTCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 36 1040 GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGT
CAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGG CAGGATCAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGCGG TTCGACAGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGAC AGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTAGGTAC CAGTGCATTATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTATGATTAATATTCACCAA
ATGAACTCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 37 1041 GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACCTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGT
CAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGG CAGGATCAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAA TTCGACAGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGAC AGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTAC CAGTGCATTATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTCTGGTGAAGATTCACGAG
ATGAACTCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 38 1042 GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGT
CAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGG CAGGATCAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGATT TTCGACAGCGTGAGTAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGTGAC AGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTAC CAGTGCATTATCCACCATAAGAAGCCGAGCGGTATGGTGAAGATTCACCAA
ATGGACTCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 39 1043 GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGT
CAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGG CAGGATCAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAA TTCGACAGCGTGGATAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGAC AGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTAC CAGTGCATTATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTATGATTAAGATTCACGAG
ATGAACTCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 40 1044 GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGT
CAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGACCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGG CAGGATCAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAA TTCGACAGCGTGTCTAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGAC AGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTAC CAGTGCATTATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTATGATTAAGATTCACGAG
ATGAGCTCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 41 1045 GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGT
CAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGACCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGG CAGGATCAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAA TTCGACAGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGAC AGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTCTGTAC CAGTGCATTATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTCTGGTGAAGATTCACGAG ATGAACTCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG
42 1046 GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGT
CAGTTTGCCAATTCGCAGAATCAAAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGG CAGGATCAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAA TTCGACAGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGAC AGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCGAAGATAAGGGTATCTAC CAGTGCATTATCCACCATAAGAAGCCGAGCGGTATGGTGAAGATTCACCAA
ATGGACTCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG 43 1047 GCCCCCCTCAAAATCCAAGCGTACTTCAACGAAACTGCAGACTTACCGTGT
CAGTTTGCCAATTCGCAGAATCTGAGCCTGAGCGAACTGGTGGTTTTCTGG CAGGATCAGGAGAACCTGGTTCTGAACGAAGTCTATCTGGGCAAAGAGAAA TTCGACAGCGTGGACAGCAAGTATATGGGCCGCACCAGCTTTGATAGCGAC AGCTGGACCCTGCGTCTGCACAATCTGCAAATCAAAGATAAGGGTATCTAC CAGTGCATTATCCACCATAAGAAGCCGACGGGTCTGGTGAAGATTCACGAG
ATGAACTCCGAGTTGTCTGTCCTGGCG Outras sequências SEQ ID NO: 1 (CTLA-4 humano)
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMM GNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIY
VIAKEKKPSYNRGLCENAPNRARM SEQ ID NO: 2 (CD28 humano)
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRAS LHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCK IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTV AFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO: 3
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS
VHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA SEQ ID NO: 4
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELV VFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIH HKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVL LRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSP
FSIELEDPQPPPDHIP SEQ ID NO: 5
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDS
VASKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA SEQ ID NO: 44 (CD86 humano)
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELV VFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIH HKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVL LRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSP FSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMERE
ESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF SEQ ID NO: 45 (CTLA-4 murino)
MACLGLRRYKAQLQLPSRTWPFVALLTLLFIPVFSEAIQVTQPSVVLASSHGVA SFPCEYSPSHNTDEVRVTVLRQTNDQMTEVCATTFTEKNTVGFLDYPFCSGTFNESRVN LTIQGLRAVDTGLYLCKVELMYPPPYFVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILVAVSL
GLFFYSFLVSAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN SEQ ID NO: 46 (CD28 murino)
MTLRLLFLALNFFSVQVTENKILVKQSPLLVVDSNEVSLSCRYSYNLLAKEFRA SLYKGVNSDVEVCVGNGNFTYQPQFRSNAEFNCDGDFDNETVTFRLWNLHVNHTDIYFC KIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVAL
CVIWTNSRRNRLLQVTTMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP SEQ ID NO: 51 (OX40 humano)
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVS RCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGT QPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPP ATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPL
AILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI SEQ ID NO: 140 gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accttgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgctacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a
SEQ ID NO: 141 agctttctgg ggcaggccgg gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac gcaggtggcg ccagccaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggaccctgca tggaccatcg cggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcttcc accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc cggctgtgca gccccagccc agggcagcaa ggcatgcccc atctgtctcc tcacccggag gcctctgacc accccactca tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc ccggcaccac aggctggatg cccctacccc aggccctgcg catacagggc aggtgctgcg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcaga caccttctct cctcccagat ctgagtaact cccaatcttc tctctgcaga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccttg cccaggtaag ccaacccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccgctacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg
SEQ ID NO: 142 gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a
SEQ ID NO: 143 agctttctgg ggcaggccgg gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac gcaggtggcg ccagccaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggaccctgca tggaccatcg cggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcttcc accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc cggctgtgca gccccagccc agggcagcaa ggcatgcccc atctgtctcc tcacccggag gcctctgacc accccactca tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc ccggcaccac aggctggatg cccctacccc aggccctgcg catacagggc aggtgctgcg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcaga caccttctct cctcccagat ctgagtaact cccaatcttc tctctgcaga gtccaaatat ggtcccccat gcccatcatg cccaggtaag ccaacccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg
SEQ ID NO: 145 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa
SEQ ID NO: 146 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttggtgag aggccagcac agggagggag ggtgtctgct ggaagccagg ctcagcgctc ctgcctggac gcatcccggc tatgcagccc cagtccaggg cagcaaggca ggccccgtct gcctcttcac ccggaggcct ctgcccgccc cactcatgct cagggagagg gtcttctggc tttttcccca ggctctgggc aggcacaggc taggtgcccc taacccaggc cctgcacaca aaggggcagg tgctgggctc agacctgcca agagccatat ccgggaggac cctgcccctg acctaagccc accccaaagg ccaaactctc cactccctca gctcggacac cttctctcct cccagattcc agtaactccc aatcttctct ctgcagagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctcagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag ggccacatgg acagaggccg gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa
SEQ ID NO: 147 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t
SEQ ID NO: 148 gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accttgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a
SEQ ID NO: 149 agctttctgg ggcaggccgg gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac gcaggtggcg ccagccaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggaccctgca tggaccatcg cggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcttcc accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc cggctgtgca gccccagccc agggcagcaa ggcatgcccc atctgtctcc tcacccggag gcctctgacc accccactca tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc ccggcaccac aggctggatg cccctacccc aggccctgcg catacagggc aggtgctgcg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcaga caccttctct cctcccagat ctgagtaact cccaatcttc tctctgcaga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccttg cccaggtaag ccaacccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg
EXEMPLOS
[00298] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitantes adicionais. O conteúdo de todas as figuras e todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo deste pedido é aqui expressamente incorporado por referência.
Exemplo 1 - Domínios de ligação a CTLA-4
[00299] Polipeptídeos de domínio de ligação de CTLA- 4 foram selecionados e expressados como descrito em WO 2014/207063 (ver Exemplos) e foram ensaiados quanto à ligação a CTLA-4 por pelo menos um de ELISA e ressonância de plásmon de superfície, conforme descrito abaixo.
ELISA de ligação
[00300] Placas de alta ligação de fundo plano de 96 poços (Greiner, #655074) foram revestidas com qualquer de CTLA4-Fc (Fitzgerald, #30R-CD152) ou CD28-Fc (R&D systems, 342-CD) incubando durante a noite a 4ºC. As placas foram lavadas (tampão de lavagem: PBS+0,05% Tween 20 (PBST) Medicago, #09-9410-100) e, então, bloqueadas em PBST +3% de BSA (Merck, #1.12018.0100). As placas foram lavadas novamente e amostras ou controles (diluídos em série 1/5 de 200-0,001 µg/ml) foram adicionados aos poços. As amostras foram incubadas por 1 h em temperatura ambiente e, então, lavadas. Anticorpo de detecção, Fcγ-HRP de IgG anti-humano de cabra (Jackson, #109-035-098) foi adicionado e as placas foram subsequentemente reveladas usando substrato Quimioluminescente SuperSignal Pico (Thermo Scientific, #37069) e detectadas com um leitor Envision (Perkin Elmer).
Os valores de EC50 foram calculados para ambos CTLA4 e CD28.
A razão de ligação (razão de ligação EC50 = [EC50 para CD28] ÷ [EC50 para CTLA-4]) foi calculada para cada polipeptídeo e é mostrada na Tabela 1.1.
Ressonância de Plásmon de Superfície
[00301] Qualquer de CTLA4-Fc (Fitzgerald, #30R-CD152) ou CD28-Fc (R&D Systems, 342-CD) foi imobilizado no chip de sensor Biacore™, CM5, usando acoplamento de amina convencional. As moléculas mutantes e controles de CD86
(diluídos em série 1/2 100 - 1,5 nM) foram analisados quanto à ligação em HBS-P (GE, BR-1003-68) a uma taxa de fluxo de 30 µl/ml. A associação foi seguida por 3 minutos e a dissociação por 10 minutos. A regeneração foi realizada duas vezes usando NaOH 5 mM por 30 segundos. Os parâmetros cinéticos e as constantes de afinidade foram calculados usando o software BIAevaluation 4.1 (Tabela 1.3).
ELISA de inibição
[00302] Placas de alta ligação de fundo plano de 96 poços (Greiner, #655074) foram revestidas com CD86-Fc (R&D Systems, #7625-B2) incubando durante a noite a 4ºC. As placas foram lavadas (tampão de lavagem: PBS+0,05% Tween 20 (PBST) Medicago, #09-9410-100) e, então, bloqueadas em PBST +3% de BSA (Merck, #1.12018.0100). A amostra (proteína mutante ou tipo selvagem de CD86; diluída em série 1/4 de 30.000 a 0,3ng/ml) foi incubada com CTLA4 biotinilado (Fitzgerald, #30R-CD152) em temperatura ambiente 1 h, a mistura foi, então, adicionada ao poços bloqueados na placa de ELISA. A detecção foi realizada com Estreptavidina-HRP (Pierce, #21126) e as placas foram subsequentemente reveladas usando substrato Quimioluminescente SuperSignal Pico (Thermo Scientific, #37069) e detectadas com um leitor Envision (Perkin Elmer). Os resultados são mostrados na Figura 2. Os valores de IC50 foram calculados e são mostrados nas tabelas abaixo. Todas as moléculas testadas apresentaram melhor valor de IC50 do que ambos tipo selvagem e H79A, a IC da melhor molécula de CD86 mutante foi melhorada em mais de 100 vezes em comparação com o tipo selvagem. Os resultados para moléculas exemplares 900, 901, 904, 906, 907, 908, 910, 915 e 938 são mostrados na Tabela 1.1. Razão de ligação de Kd = [Kd para CD28] ÷ [Kd para CTLA-4]. As sequências de aminoácidos completas para as moléculas exemplares 900, 901, 904, 906, 907, 908, 910, 915 e 938 são fornecidas como SEQ ID NOs: 6 a 14, respectivamente.
Tabela 1.1 Posições mutadas e mudança de aminoácido Razão de Razão de Amostra em relação ao tipo selvagem ligação ligação (posições numeradas como na Figura 4) EC50 Kd H79D,L107I,I111V,T118S, M120L, I121V, 900 3,5 ND* R122K, Q125E 901 Q48L,S49T,L107I,I111V,R122K,Q125E,A134T 17,2 2,7 V54I,K74R,S77A,H79D,L107I,T118S,I121V,R 904 12,2 6,8 122K,N127D F32I,Q48L,K74R, H79D,L107F, 906 16,2 0,8 M120L,I121V,R122K,Q125E 907 R122K,Q125E 30,5 5,6 908 L107I,I121V,R122K,Q125E 6,2 4,7 910 H79D,L107I,I121V,R122K,Q125E 7,7 5,1 915 V64I,H79D,L107F,T118S,M120L,R122K,N127D 9,9 1,9 938 V64I,L107I,I121V,R122K 2,0 5,5 Tipo selvagem 3,4 1,6
* Nenhuma ligação detectável foi visa na análise BIAcoreTM nem ELISA de ligação
[00303] Os resultados para as moléculas exemplares 1038, 1039, 1040, 1041,1042, 1043, 1044, 1045, 1046 e 1047 são mostrados nas Tabelas 1.2 e 1.3 e nas Figuras 2 e 3. As sequências de aminoácidos completas para as moléculas exemplares 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1044, 1045, 1046 e 1047 são fornecidas como SEQ ID NOs: 15 a 24, respectivamente.
Tabela 1.2 Amostra EC50 Amostra IC50 1038 0,14 - - 1039 0,039 - - 1040 0,0076 1040 0,049 1041 0,087 1041 3,1 1042 0,29 1042 4,3 1043 0,035 1043 4,0 1044 0,029 1044 1,4 1045 0,047 1045 2,6 1046 0,019 1046 1,1 1047 0,037 1047 0,98 Tipo Tipo selvagem 0,51 selvagem 15
Técnica anterior 0,81 H79A 25
Controle Nenhuma Controle Nenhuma negativo atividade negativo atividade
Tabela 1.3
Posições mutadas e mudança de aminoácido ka kd KD Amostra (posições numeradas como na (1/Ms) (1/s) (nM)
Figura 4)
Q48L, H79D, L107I, I121V, 12 1038 1,0e6 0,012 R122K, Q125E
Q48L, H79S, L107I, T118S, 8,5e- 8 1039 1,0e6 I121V, R122K, N127D 3
Q48L, K74R, H79D, L107R, 3,2e- 3 1040 1,0e6 R122N 3
F32L, Q48L, H79D, L107I, 8,4e- 12 1041 7,0e5 M120L, I121V, R122K,125E 3
Q48L, K74I, H79S, L107I, 25 1042 4,4e5 0,011 T118S, I121V, R122K, N127D
Q48L, H79D, L107I, R122K, 10 1043 1,1e6 0,011 Q125E
1044 Q48L, S49T, H79S, L107I, 1,1e6 9,4e- 8
R122K, Q125E, N127S 3
1045 Q48L, S49T, H79D, M120L, 9,4e5 8,3e- 9 I121V, R122K, Q125E 3 1046 H79D, K103E, L107I, T118S, 1,4e6 8,0e- 6 I121V, R122K, N127D 3 1047 Q48L, H79D, L107I, M120L, 8,5e5 8,4e- 10 I121V, R122K, Q125E 3 Tipo 4,6e5 0,023 50 selvagem H79A 3,4e5 0,022 63 Exemplo 2 - Reatividade cruzada a CTLA-4 murino do polipeptídeo exemplar do clone 1040
[00304] A afinidade relativa para CTLA-4 murino e humano de uma molécula de CD86 mutante exemplar 1040 foi investigada utilizando um ensaio de ligação ELISA de inibição. A molécula 1040 usada nestes experimentos foi conjugada com um anticorpo anti-CD40 como parte de uma molécula biespecífica. As propriedades de ligação de CTLA- 4 da molécula de CD86 não são afetadas por esta conjugação (dados não mostrados).
[00305] Em resumo, placas de alta ligação de placa de fundo plano de 96 poços (Greiner, #655074) foram revestidas com CTLA-4 humano (Fitzgerald) incubando durante a noite a 4ºC. As placas foram lavadas (tampão de lavagem: PBS+0,05%
Tween 20 (PBST) Medicago, #09-9410-100) e, então, bloqueadas em PBST +3% de BSA (Merck, #1.12018.0100).
[00306] A amostra (mutante de CD86 exemplar) foi pré- incubada à temperatura ambiente por 1 hora com CTLA4 humano biotinilado solúvel (Fitzgerald #30R-CD152) ou CTLA-4 murino solúvel (R&D systems) em diferentes concentrações (diluições em série 1/4 de 30.000 a 0,3 ng/ml).
[00307] A mistura foi, então, adicionada aos poços bloqueados na placa de ELISA. A detecção foi realizada com Estreptavidina-HRP (Pierce, #21126) e as placas foram subsequentemente reveladas usando substrato Quimioluminescente SuperSignal Pico (Thermo Scientific, #37069) e detectadas com um leitor Envision (Perkin Elmer).
Os resultados são mostrados na Figura 5. As curvas de inibição observadas com CTLA-4 murino e humano demonstram que a afinidade de ligação do mutante de CD86 exemplar (1040) às duas formas de CTLA-4 é de magnitude semelhante.
Verificou-se também que os outros clones testados no Exemplo 1 ligam a CTLA-4 murino (dados não mostrados).
Exemplo 3 - Caracterização de anticorpos OX40
[00308] As características de anticorpos OX40 exemplares estão resumidas na Tabela 3.1 abaixo.
Tabela 3.1
ELISA de resposta à dose M.
FACS de ligação a huOX40 Constante de dissociação de de Comprimento de H3 de CDR de taxa taxa Agonista de célula T associação ka (1/Ms) associação kd (1/s) Índice hidrofático Ponto isoelétrico OX40 (IMGT) de de de Anticorpo Constante Constante Ligação mulatta KD (M) (IgG) (CHO) 1166/1167 10 < 1 Sim Sim Sim - 3,22E- 9,01E+04 2,90E-05 nM 0,392 9,11 10 1170/1171 10 < 1 Sim Sim Sim - 2,50E- 1,45E+06 3,63E-04 nM 0,415 9,11 10 1164/1135 11 < 1 Sim Sim Sim - 3,08E- 2,51E+05 7,73E-05 nM 0,398 9,21 10 1168/1135 11 < 1 Sim Sim Sim - 3,27E- 5,18E+05 1,69E-04 nM 0,404 9,19 10 1482/1483 9 < 1 Sim Sim Sim - 7,53E- 7,76E+05 5,84E-04 nM 0,381 9,19 10 1490/1135 11 < 1 Sim Sim Sim - 3,07E- 3,87E+06 1,19E-03 nM 0,407 9.18 10 1514/1515 14 < 1 Sim Sim Sim - 6,40E- 2,57E+05 1,64E-04 nM 0,399 9,11 10 1520/1135 17 < 1 Sim Sim Sim - 5,55E- 6,20E+05 3,44E-04 nM 0,394 9,18 10 1524/1525 10 < 1 Sim Sim Sim - 8,11E- 1,71E+06 1,39E-03 nM 0,391 9,11 10 1526/1527 15 < 1 Sim Sim Sim - 4,30E- 4,35E+05 1,87E-04 nM 0,388 8,99 10 1542/1135 11 < 1 Sim Sim Sim - 4,63E- 2,16E+05 1,00E-04 nM 0,411 9,2 10
[00309] Dois anticorpos anti-OX40 foram sintetizados unicamente para uso como anticorpos de referência para fins de comparação nestes estudos. Eles são designados aqui como “72” or “72/76”, e “74” ou “74/78”, respectivamente.
Medição de constantes cinéticas por ressonância de plásmon de superfície
[00310] OX40 humano (R&D systems, #3358_OX) foi imobilizado no chip de sensor Biacore™, CM5, usando acoplamento de amina convencional. Os anticorpos testados e os controles (diluídos em série 1/3 ou 1/2 100-2 nM) foram analisados quanto à ligação em HBS-P (GE, #BR-1003-68) a uma taxa de fluxo de 30 µl/ml. A associação foi seguida por 3 minutos e a dissociação por 20 minutos. A regeneração foi realizada duas vezes usando NaOH 50 mM por 60 segundos. Os parâmetros cinéticos e as constantes de afinidade foram calculados usando o modelo de Langmuir 1:1 com linha de base de deslocamento. Os anticorpos testados estavam em geral na faixa subnanomolar - nanomolar, com taxas variáveis de associação e dissociação (Figura 6 e Tabela 3.1). A maioria dos anticorpos tinha afinidades < 5 nM. Os parâmetros cinéticos e as constantes de afinidade foram calculados usando o software BIAevaluation 4.1.
Medição por ELISA de ligação a OX40 humano e murino e a CD137 e CD40 por ELISA
[00311] As placas ELISA foram revestidas com OX40 humano (R&D Systems, 3388-OX), CD40 (Ancell) ou CD137 (R&D Systems) a 0,1 ou 0,5 µg/ml. As placas ELISA foram lavadas com PBST e, então, bloqueadas com PBST+2% de BSA por 1 h à temperatura ambiente e, então, lavadas novamente com PBST.
Os anticorpos foram adicionados em séries de diluição às placas ELISA por 1 h em temperatura ambiente e, então, lavados com PBST. A ligação foi detectada usando HRP de cadeia leve capa anti-humana de cabra, incubada por 1 h à temperatura ambiente. SuperSignal Pico Luminescent foi usado como substrato e a luminescência foi medida usando Fluostar Optima.
[00312] Todos os anticorpos OX40 testados ligaram a OX40 humano e exibiram valor de EC50 abaixo de 1 nM. Os anticorpos não ligaram a OX40 murino ou a outros membros da superfamília de TNFR testados (dados não mostrados).
Medição de ligação a OX40 humano siperexpressada em células de CHO
[00313] A parte extracelular de OX40 humano foi fundida à parte transmembranar e intracelular de hCD40 e clonada em pcDNA3.0. O vetor foi subsequentemente transfectado de maneira estável para as células CHO. A expressão de OX40 foi confirmada incubando com anticorpo OX40 comercial (huOX40, BD Biosciences) por 30 minutos a 4°C e, então, detectada com a-huIgG-PE (Jackson Immunoresearch) 30 min. 4°C. Para o ensaio, as células transfectadas foram incubadas com os anticorpos de teste e controles por 30 min.
a 4°C e, então, detectadas com a-huIgG-PE (Jackson
Immunoresearch) 30 min. 4°C. As células foram analisadas por citometria de fluxo com FACS Verse (BD Biosciences).
[00314] Todos os clones ligaram a hOX40 superexpressado em células de CHO de uma maneira dependente da dose (Figura 7).
Exemplo 4 - Análise de sequência de anticorpos OX40
[00315] As sequências de CDR de ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram analisadas para cada anticorpo. A Tabela 4.1 ilustra a análise como conduzida para as sequências de CDR3 VH. As posições na Tabela 4.1 são definidas de acordo com o sistema de numeração IMGT. Os seguintes padrões foram identificados.
[00316] As regiões VH compreendem todas: (a) uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que é de 8 aminoácidos de comprimento e compreende a sequência de consenso: “G, F, T, F, G/Y/S, G/Y/S, Y/S, Y/S/A”; (b) uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que é de 8 aminoácidos de comprimento e compreende a sequência de consenso: “ I, G/Y/S/T, G/S/Y, S/Y, G/S/Y, G/S/Y, G/S/Y, T”; e (c) uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que é de 9 a 17 aminoácidos de comprimento e que compreende a sequência de consenso de: “A, R, G/Y/S/H, G/Y/F/V/D, G/Y/P/F, -/H/S, -/N/D/H, -/Y/G, -/Y, -/Y, -/W/A/V, -/A/Y, -/D/A/Y/G/H/N, Y/S/W/A/T, L/M/I/F, D, Y”.
As regiões VL compreendem todas: (a) uma sequência de CDR1 de cadeia leve que consiste na sequência: “Q, S, I, S, S, Y”; (b) uma sequência de CDR2 de cadeia leve que consiste na sequência: “A, A, S”; (c) uma sequência CDR3 de cadeia leve que é de 8 a 10 aminoácidos de comprimento e compreende a sequência de consenso: “Q,Q, S/Y/G, -/Y/H/G, -/S/Y/G/D/W, S/Y/G/D , S/Y/G/T, P/L, Y/S/H/L/F, T”.
[00317] Dentro da sequência de consenso para a CDR3 de cadeia pesada, duas subfamílias foram identificadas. Cada anticorpo na primeira subfamília compreende uma sequência de CDR 3 de 10 aminoácidos de comprimento que compreende a sequência de consenso “A, R, Y/H, D, Y, A/Y/G, S/W/A, M/L, D, Y”. Os anticorpos nesta família são referidos como família Z e são identificados como tal na Tabela 4.1. Cada anticorpo na segunda subfamília compreende uma sequência de CDR3 VH de 11 aminoácidos de comprimento, que compreende a sequência de consenso “A, R, G/Y, V/F/Y, P, H, G/Y/H, Y, F/I, D, Y”. Os anticorpos nesta família são referidos como família P e são identificados como tal na Tabela 4.1. Os anticorpos da família Z ou P são preferidos. Anticorpos tendo uma sequência VH na família P também incluem tipicamente uma sequência VL com uma sequência de CDR3 de “Q, Q, S, Y, S, T, P, Y, T”, uma sequência de CDR1
“Q,S,I,S,S,Y” e uma sequência de CDR2 de “A,A,S”. Por conseguinte, os anticorpos com uma região VL compreendendo estas três sequências de CDR são preferidos.
Tabela 4.1
COMPRIMENTO DE CDRH3
VH FAMÍLIA
111.1
111.2
112.2
112.1 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 A 1R G Y G Y L D Y 9 482 A 1R Y D Y A S M D Y 10 Z 166 A 1R Y D Y Y W M D Y 10 Z 170 A 1R H D Y G A L D Y 10 Z 524 A 1R G V P H G Y F D Y 11 P 164 A 1R Y F P H Y Y F D Y 11 P 168 A 1R Y Y P H H Y I D Y 11 P 490 A 1 R G Y P H H Y F D Y 1 P 542 1 A 1 R S G Y S N W A N S F D Y 1 514 4 A 1 R Y Y F H D Y A A Y S L D Y 1 526 5
A 1 R Y Y Y S H G Y Y V Y G T L D Y 1 520 7 Exemplo 5 - Mapeamento de Domínio de Anticorpos OX40
[00316] A parte extracelular de OX40 consiste em quatro domínios, cada um dos quais pode ser subdividido em dois módulos. Os genes das quimeras OX40 humano/camundongo foram sintetizados utilizando técnicas laboratoriais padrão.
As diferentes quimeras foram projetadas trocando domínios ou módulos do OX40 humano pelo OX40 de camundongo correspondente. As quimeras foram projetadas com base na avaliação das sequências humanas e de camundongos e na investigação 3D do OX40 humano. Os genes sintetizados receberam números de ID específicos do projeto (ver Tabela
5.1). Os construtos foram clonadas no vetor pcDNA3.1 (Invitrogen).
[00317] As quimeras de camundongo/humanas foram transfectadas transientemente para células 293-F FreeStyle (Invitrogen), incubadas 48 horas em meio de expressão 293 Freestyle (Invitrogen) 37C, 8% de CO2, 135rpm. As células transfectadas foram incubadas com anticorpos OX40 humanos, OX40L humano (hOX40L, RnD Systems), OX40L de camundongo (mOX40L, RnD Systems) e controles por 30 min. 4°C e, então, detectadas com a-huIgG-PE (Jackson Immunoresearch) 30 min.
4°C. As células foram analisadas com FACS Verse (BD Biosciences). A ligação aos diferentes construtos quiméricos foi calculada como MFI relativa (intensidade média de fluorescência) em comparação com a ligação do controle do isotipo. Os resultados são mostrados na Tabela 5.2.
[00318] Nenhum dos anticorpos OX40 humanos testados liga a OX40 murino. Por conseguinte, se um dado anticorpo não ligar a uma quimera particular, isto indica que o anticorpo é específico para um dos domínios que foram substituídos por um domínio murino nessa quimera.
Tabela 5.1 Identidade de construtos quiméricos Construto Descrição da região de codificação dos construtos de ID de DNA quimérico OX40 humano com domínios de camundongo 1A, 1B e 1544 2A (aa 30-81) OX40 humano com domínios de camundongo 1B, 2A e 1545 2B (aa 43-107) OX40 humano com domínios de camundongo 2A, 2B e 1546 módulo 3 (aa 66-126) OX40 humano com domínio de camundongo 2B, módulo 1547 3 e domínio 4A (aa 83-141) OX40 humano com módulo de camundongo 3 e domínios 1548 4A e 4B (aa 108-167) OX40 humano com domínios de camundongo 1A e 4B e 1549 região extracelular não anotada região (aa 30-65 e aa 127-214) Construto contendo a sequência OX40 de 84 comprimento completo 57 Vetor vazio (controle negativo)
[00319] Pelo menos quatro padrões de ligação separados foram identificados.
Padrão A:
[00320] Os anticorpos 1170/1171, 1524/1525 e 1526/1527 exibem um padrão de ligação semelhante e dependem de resíduos nos mesmos domínios para ligação. Os resíduos de aminoácidos críticos para ligação provavelmente estão localizados no módulo B no domínio 2 e no módulo A do domínio
2. A maioria dos anticorpos com família de CDRH3 “Z” ligam de acordo com o padrão A (1166/1167 sendo a exceção) indicando que os anticorpos com este tipo de CDRH3 são predispostos a ligar este epítopo.
Padrão B:
[00321] Os anticorpos 1168/1135, 1542/1135, 1520/1135, 1490/1135, 1482/1483 e 1164/1135 exibem um padrão de ligação semelhante e dependem principalmente dos resíduos localizados no Domínio 3 para ligação. Todos os anticorpos da família de CDRH3 “P” ligam a este padrão, demonstrando que a similaridade na sequência de CDRH3 revela um epítopo de ligação comum.
Padrão C:
[00322] O anticorpo 1166/1167 tem um padrão de ligação único e provavelmente depende dos resíduos localizados no módulo A e no módulo B no domínio 2 para ligação. No entanto, ambos os módulos devem ser trocados simultaneamente para abolir a ligação, sugerindo um epítopo estruturalmente complexo.
Padrão D:
[00323] O anticorpo 1514/1515 exibe um perfil de ligação exclusivo e provavelmente depende principalmente dos aminoácidos localizados no módulo B no domínio 2 para ligação.
[00324] O anticorpo de referência 72 liga de acordo com o padrão B. O padrão de ligação do ligando de OX40 humano é semelhante ao padrão C.
Tabela 5.2 Resultados do experimento de mapeamento de domínio OX40 anticorpo policlonal Construto quimérico Anticorpo 1490/1135 1170/1171 1524/1525 1526/1527 1482/1483 1514/1515 1164/1135 1168/1135 1520/1135 1542/1135 1166/1167 1544 4,2 2,0 1,5 1,1 8,4 11,6 14,0 13,2 9,4 7,1 14,2 50,9 1545 28, 9 1,0 0,9 1,3 44,4 1,2 37,3 46,6 32,6 40,2 1,0 58,6 1546 1,0 0,8 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,8 30,0 1547 1,1 2,3 1,0 1,0 1,0 1,1 1,0 1,0 0,9 1,0 15,2 43,9 1548 1,1 20,3 15,4 12,7 1,1 17,2 1,0 1,0 1,1 1,2 15,8 31,7 1549 5,9 12,1 11,2 8,5 8,7 10,6 14,1 15,1 8,5 13,0 11,3 26,3 84 14, 2 33,4 31,4 21,4 24,9 25,9 27,5 29,6 25,4 29,4 27,6 53,2 57 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,1 1,0 0,9 1,0 1,1 1,0 1,2 Exemplo 6 - Reatividade cruzada com Macaca mulatta
[00325] A parte extracelular de OX40 de Macaca mulatta foi fundida à parte transmembranar e intracelular de hCD40 e clonada em pcDNA3.0. O vetor foi subsequentemente transfectado de maneira estável para as células HEK (macOX40- HEK).
[00326] A expressão de OX40 foi confirmada incubando com anticorpo OX40 comercial (huOX40, BD Biosciences) por 30 minutos a 4°C e, então, detectada com a-huIgG-PE (Jackson Immunoresearch) 30 min. 4°C. Para o ensaio, as células transfectadas foram incubadas com os anticorpos de teste e controles por 30 min. a 4°C e, então, detectadas com a-huIgG- PE (Jackson Immunoresearch) 30 min. 4°C. As células foram analisadas por citometria de fluxo com FACS Verse (BD Biosciences).
[00327] Conforme mostrado na Tabela 6.1 abaixo, os anticorpos testados ligam à OX40 de Macaca mulatta com valores de EC50 comparáveis àqueles alcançados para OX40 humano, sugerindo que Macaca mulatta será adequada para uso em estudos de toxicologia.
[00328] Macaca mulatta é geneticamente muito semelhante à Macaca fascicularis (macaco cynomolgus), tornando muito provável que o macaco cynomolgus também seja uma espécie adequada para estudos de toxicologia.
Tabela 6.1 Ligação a OX40 humano e de macaco (intervalos de confiança de 95%) Anticorpo Ligação a OX40 de M Ligação a OX40 humano, OX40 mulatta, EC50 (µg/ml) EC50 (µg/ml) 1166/1167 0,1595 a 0,2425 0,1415 a 0,2834
1168/1135 0,09054 a 0,1939 0,06360 a 0,1308 1482/1483 0,1565 a 0,3120 0,08196 a 0,1822 1520/1135 0,1632 a 0,3587 0,09247 a 0,2749 1526/1527 0,2921 a 0,5888 0,1715 a 0,4292 1542/1135 0,7221 a 1,414 0,3223 a 0,5525 Exemplo 7 - Atividade agonística em um ensaio de célula T humana
[00329] Células T humanas foram obtidas pelo kit de seleção de célula T negativo de Miltenyi de PBMC de filtros de leucócito obtido no banco de sangue (Lund University Hospital). Os anticorpos OX40 foram revestidos na superfície de uma placa de cultura de 96 poços (placas em forma de U Corning Costar (#3799) e cultivados com uma combinação de anticorpo anti-CD3 imobilizado (UCHT1), a 3 µg/ml, e anticorpo anti-CD28 solúvel (CD28.2), a 5 µg/ml. O anti-CD3 foi pré-revestido durante a noite a 4°C. No dia seguinte, após uma lavagem com PBS, os anticorpos OX40 foram revestidos 1-2 h a 37°C. Após 72 h de incubação numa câmara de umidade a 37°C, 5% de CO2 os níveis de IL-2 no sobrenadante foram medidos.
[00330] A capacidade dos anticorpos para estimular células T humanas a produzir IL-2 foi comparada com o anticorpo de referência 74 e a atividade relativa é exibida na Figura 8. A maioria dos anticorpos forneceu níveis de ativação de célula T que eram comparáveis ao anticorpo de referência. Uma série de anticorpos forneceu níveis mais altos de ativação de célula T.
Moléculas biespecíficas
[00331] Nos exemplos a seguir, as moléculas biespecíficas testadas são referidas por número, por exemplo, 1164/1141. Isto significa que a molécula compreende as sequências de aminoácidos das respectivas regiões VH e VL mostradas nas Tabelas B e D. Por exemplo, 1164/1141 compreende a sequência da região VH da cadeia pesada 1164 mostrada na Tabela B (SEQ ID NO: 99), e o número de cadeia biespecífica 1141 mostrado na Tabela D (SEQ ID NO: 129). A sequência da região VH especificada de uma dada molécula é tipicamente fornecida ligada (como parte de uma cadeia polipeptídica contígua simples) à sequência da região constante da cadeia pesada de IgG1 da SEQ ID NO: 135. Esta sequência está tipicamente presente na extremidade C- terminal C de uma sequência da região VH especificada na Tabela B.
Exemplo 8 - Afinidade de moléculas biespecíficas exemplares para ligação a alvos simples
[00332] Medição de constantes cinéticas por ressonância de plásmon de superfície
[00333] OX40 humano (R&D systems, #3358_OX) foi imobilizado no chip de sensor Biacore™, CM5, usando acoplamento de amina convencional. Os anticorpos testados e os controles (diluídos em série 1/3 ou 1/2 100-2 nM) foram analisados quanto à ligação em HBS-P (GE, #BR-1003-68) a uma taxa de fluxo de 30 µl/ml. A associação foi seguida por 3 minutos e a dissociação por 20 minutos. A regeneração foi realizada duas vezes usando NaOH 50 mM por 30 segundos. Os parâmetros cinéticos e as constantes de afinidade foram calculados usando o modelo de Langmuir 1:1 com linha de base de deslocamento. As moléculas testadas tinham taxas de associação e dissociação variadas com afinidade geralmente mais baixa para OX40 do que para os anticorpos monoméricos correspondentes, mas ainda estavam na faixa nanomolar (Tabela 8.1).
Tabela 8.1 ka KD BsAb (1/Ms) kd (1/s) (nM) 1164/1141 8,87E+04 1,72E-04 1,94 1168/1141 2,84E+05 3,05E-04 1,07 1166/1261 7,04E+04 1,12E-04 1,59 1170/1263 5,18E+05 6,39E-04 1,23 Medição por ELISA
[00334] Placas ELISA foram revestidas com humano com CTLA-4 (BMS, Orencia) ou OX40 humano (R&D Systems, 3388-OX) a 0,4 ou 0,5 µg/ml, respectivamente. As placas ELISA foram lavadas com PBST e, então, bloqueadas com PBST+2% de BSA por 1 h à temperatura ambiente e, então, lavadas novamente com PBST. As moléculas biespecíficas foram adicionadas em séries de diluição às placas e incubadas por 1 h à temperatura ambiente. As placas de ELISA foram lavadas e a ligação foi detectada usando HRP de cadeia leve capa anti-humana de cabra por 1 h à temperatura ambiente. SuperSignal Pico Luminescent foi usado como substrato e a luminescência foi medida usando Fluostar Optima.
[00335] Todas as moléculas biespecíficas testadas ligaram a ambos os alvos e os valores de EC50 estão na faixa que seria esperada com base em sua afinidade como anticorpos monoespecíficos (Figura 9).
Exemplo 9 - Ligação dupla a ambos os alvos de moléculas biespecíficas exemplares Medição por ressonância de plásmon de superfície
[00336] OX40 humano (R&D systems, #3358_OX) foi imobilizado no chip de sensor Biacore™, CM5, usando acoplamento de amina convencional. As moléculas biespecíficas testadas (0,5 µM ou 0,25 µM) e os controles foram passados sobre o chip a uma taxa de fluxo de 30 µl/ml.
A associação foi seguida por 3 minutos e a dissociação por 3 minutos. CTLA4-Fc (BMS, Orencia) foi, então, injetado e a associação foi seguida por 3 minutos e a dissociação por 3 minutos. Como um controle, um PBS bruto foi injetado em vez de CTLA4.
[00337] Todas as moléculas biespecíficas testadas ligaram a ambos os alvos simultaneamente, como é mostrado na Figura 10).
Medição por ELISA
[00338] As placas ELISA foram revestidas com OX40-Fc (R&D systems, #3358_OX) (0,4 µg/ml) durante a noite a 4°C.
As placas ELISA foram lavadas com PBST e, então, bloqueadas com PBST+2% de BSA por 1 h à temperatura ambiente e, então, lavadas novamente com PBST. Moléculas biespecíficas foram adicionadas em diluições às placas e incubadas por 1 h à temperatura ambiente. As placas de ELISA foram lavadas e CTLA-4 biotinilado (1 µg/ml) foi adicionado e incubado nas placas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas e estreptavidina marcada com HRP foi utilizada para detecção de ligação. SuperSignal Pico Luminescent foi usado como substrato e a luminescência foi medida usando Fluostar Optima.
[00339] A ligação a ambos os alvos foi confirmada para todas as moléculas biespecíficas testadas. Como é mostrado na Figura 11, as moléculas biespecíficas testadas poderiam ser detectadas em uma concentração de 0,1 nM, que corresponde a 0,015 µg/ml. Os valores relativos no ensaio correspondem bem às afinidades medidas pela ressonância de plásmon de superfície.
Exemplo 10 - Atividade agonística de moléculas biespecíficas exemplares em um ensaio de célula T CD4 humana
[00340] Células T CD4 humanas foram isoladas por seleção de célula T CD4 negativa (Miltenyi, Kit de Isolamento de célula T CD4+ humana 130-096-533) de PBMC de filtros de leucócitos obtido no banco de sangue (Lund University Hospital). CTLA-4 (Orencia, 2,5 µg/ml) e anti-CD3 (UCHT-1, 1 ug/ml) foram revestidos à superfície de uma placa de cultura de 96 poços (cultivado sem tecido tratado, placas de 96 poços em forma de U (Nunc, VWR #738-0147) durante a noite a 4°C. Por revestimento com ambois CTLA-4 e CD3, o ensaio fornece um modelo experimental de um microambiente tumoral com CTLA-4 superexpressado. CTLA-4 foi omitido de alguns poços como um controle.
[00341] Moléculas biespecíficas a serem testadas foram adicionadas solúveis em uma diluição em série aos poços e comparadas nas mesmas concentrações molares com os controles. Dois controles diferentes foram utilizados para cada molécula biespecífica testada. O primeiro controle é uma molécula biespecífica designada 1756/1757 (um anticorpo de controle de isotipo fundido à região de ligação de CTLA4 1040 = liga CTLA4, mas não OX40). O segundo controle é uma mistura do controle 1756/1757 biespecífico e do anticorpo OX40 monoespecífico, que corresponde à molécula biespecífica testada. Após 72 h de incubação em uma câmara de umidade a 37°C, 5% de C02, os níveis de IL-2 foram medidos no sobrenadante.
[00342] Como mostrado na Figura 12, há um efeito dependente da dose das moléculas biespecíficas que induz um aumento na ativação das células T humanas (medida por um aumento na produção de IL-2) quando cultivadas em placas revestidas com CTLA-4. Os controles não. A Figura 13 mostra os resultados do mesmo ensaio quando realizado em uma concentração fixa para os anticorpos biespecíficos e e controles (1,5 nM) na presença ou ausência de CTLA-4. O aumento na ativação de célula T não é observado na ausência de CTLA-4. A mudança em vezes nos níveis de IL-2 induzida por cada molécula biespecífica em comparação com a combinação correspondente de moléculas monoespecíficas é mostrada na Tabela 10.1. O valor médio da IL-2 produzida (pg/ml) para cada molécula biespecífica e controles é mostrado na Tabela
10.2.
[00343] Uma vez que este ensaio representa um modelo experimental de um microambiente tumoral com CTLA-4 superexpressado, os resultados sugerem que se pode esperar que as moléculas biespecíficas testadas tenham um efeito maior que os anticorpos monoespecíficos em tal microambiente.
Tabela 10.1 1164/114 1166/126 1168/114 1170/114 1514/158 1520/114 1 1 1 1 1 1 7,6 7,8 7,2 4,7 5,5 1,7 Mudança em vezes no nível de IL-2 induzida por molécula biespecífica em comparação com a combinação correspondente das moléculas monoespecíficas a 1,5 n z
Tabela 10.2.
Nível de IL-2 médio (pg/ml) induzido a 1,5 nM de anticorpo biespecífico ou controle 1164/1135+ 1756/1757 1166/1167+ 1756/1757 1168/1135+ 1756/1757 1170/1171+ 1756/1757 1164/1141 1166/1261 1168/1141 1170/1141 1514/1581 1520/1141 Média 5.024 4.292 665 550 2.681 2.575 371 552 5.109 1.303 SD 1.058 1.333 273 456 954 992 162 285 2.600 812 1514/1515+ 1756/1757 1520/1135+ 1756/1757 1526/1527+ 1756/1757 1542/1543+ 1756/1757 1526/1585 1542/1141 1756/1757 Média 927 774 3.200 2.671 746 697 1.047 SD 653 451 1.350 1.016 346 418 601 Exemplo 11 - Estabilidade de moléculas biespecíficas exemplares
[00344] O ponto de fusão dos anticorpos foi analisado por fluorimetria de varredura diferencial (DSF). As amostras de anticorpos em PBS foram misturadas com SYPRO Orange, que foi diluído 1000 vezes. A varredura térmica entre 25 e 95°C foi realizada em uma máquina de PCR em tempo real com medições feitas a cada grau. Foi utilizado um anticorpo de referência 250/251 para comparação e foi determinada a diferença na temperatura de fusão Tm (ΔTm) em relação à referência. Diferenças de Tm de mais do que 1,1°C em comparação com a referência são considerados estatisticamente significativas. Como mostrado na Tabela
11.1, todas as moléculas biespecíficas testadas exibiram boa termoestabilidade com valores de 65°C ou acima.
Tabela 11.1 Anticorpo Temperatura de fusão (°C) 1168/1141 65,6 1164/1141 65,5 1160/1259 68,5 1166/1261 67,8 1170/1263 66,4 1514/1581 65,3 1520/1141 65,0 1526/1585 67,6 1542/1141 66,3 Exemplo 12 - Sinergia na indução de ADCC por anticorpos biespecíficos exemplares direcionando CTLA4 e OX40 (em comparação com o efeito de anticorpos monoespecíficos, sozinhos ou em combinação) Materiais e métodos
[00345] Avaliação da citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC)
[00346] Células Jurkat engenheiradas para expressar de maneira estável o receptor FcγRIIIa (variante V158) e um elemento de resposta NFAT dirigindo a expressão da luciferase do vaga-lume (Promega Corporation) foram utilizadas como células efetoras na avaliação de ADCC. Anticorpos foram titulados em poços em duplicata em uma placa de luminescência opaca de 96 poços e células efetoras e células alvo expressando ambos OX40 e CTLA4 foram adicionadas numa razão de 5:1. Após 6 h de incubação num incubador umidificado a 37°C, 95% de O2, o substrato do ensaio da luciferase (Promega Corporation) foi adicionado a todos os poços, incluindo poços de controle médios (por subtração em branco) e a luminescência foi detectada num leitor de microplaca FLUOstar Optima (BMG LabTech). O ADCC induzido por vezes foi calculado como: (lise alvo - branco)/(lise espontânea - branco). Os valores de topo foram calculados com base em log(agonista) vs. adequação de curva de resposta (três parâmetros) usando Prism 6.0 (Graphpad, La Jolla, CA, EUA).
Anticorpos • “1166/1167” = anticorpo OX40 monoespecífico • “IgG de controle com parte de ligação a CTLA-4” = domínio de ligação a CTLA4 monoespecífico fundido a uma proteína de IgG • “1166/1261” = anticorpo biespecífico exemplar direcionando OX40 e CTLA4 (contendo a parte de ligação de OX40 e CTLA-4 idêntica como os ligantes monoespecíficos descritos acima).
• “Ctrl IgG” = controle de isotipo negativo Resultados
Anticorpo biespecífico exemplar 1166/1261 exibe indução superior de ADCC
[00347] Como mostrado na Figura 15, níveis detectáveis de ADCC foram induzidos por todos os componentes testados. O controle do isotipo negativo não induziu nenhuma ADCC (dados não mostrados). Mais notavelmente, o anticorpo 1166/1261 biespecífico induziu ~123 vezes ADCC em comparação com o controle. O anticorpo OX40 monoespecífico (1166/1167) induziu ~29 vezes e o domínio de ligação de CTLA-4 monoespecífico (62/376) induziu ~10 vezes ADCC, ao passo que a mistura dos dois componentes monoespecíficos (1166/1167 + 62/376) induziu ~31 vezes ADCC.
[00348] Existe assim uma sinergia inesperada e acentuada obtida pela molécula biespecífica ligando a OX40 e CTLA-4.
Exemplo 13 - Anticorpos biespecíficos direcionando OX40 e CTLA4 - Ligação específica a células expressando OX40 e CTLA4 Fundamentos
[00349] O objetivo deste estudo foi determinar a eficácia de ligação e EC50 de 1166/1261 e as entidades de ligação monoespecíficas correspondentes a células expressando ambos OX40 e CTLA4 usando citometria de fluxo.
O anticorpo biespecífico é projetado para ligar ambos OX40 e CTLA4 simultaneamente. Para este fim, usamos células de
CHO transfectadas com uma expressão estável de nossos alvos.
As células P4 de CHO têm um alto nível de expressão de ambos OX40 e CTLA4.
Métodos e Resultados
[00350] As células de CHO transfectadas duas vezes expressando ambos OX40 e CTLA4 foram originalmente classificadas por FACS (Beckton Dickinson) em um pool de células expressando altos níveis de ambos os alvos (denotados CHO P4). A expressão de alvo foi mantida estável cultivando as células sob pressão de seleção de geneticina e zeocina.
Células de tipo selvagem de CHO não transfectadas foram usadas como controles.
[00351] As células foram coradas com concentrações decrescentes de 1166/1261 (um anticorpo biespecífico exemplar direcionando OX40 e CTLA4), ou dos dois ligantes monoespecíficos 1166/1167 (anticorpo monoclonal específico de OX40) e IgG de Controle com parte de ligação a CTLA-4 (proteína de fusão de IgG de ligação a CTLA4 monoespecífica) (200 nM - 0,0034 nM), seguida por IgG anti-humana conjugada com PE. A fluorescência foi detectada usando um instrumento FACSverse e a aquisição foi analisada usando software FlowJo.
A intensidade fluorescente mediana (MFI) foi determinada para cada coloração.
[00352] As curvas de eficácia de ligação para CHO P4 são apresentadas na Figura 16 (um experimento representativo de três). 1166/1261 liga a células com alta expressão de OX40 e CTLA4 melhor que 1166/1167 ou a IgG de Controle com uma entidade de ligação a CTLA-4. Este é provavelmente um efeito aditivo de 1166/1261 sendo capaz de ligar dois alvos simultaneamente.
Exemplo 14 - Anticorpos biespecíficos direcionando OX40 e CTLA4 - Ligação dupla de células expressando OX40 e CTLA4 medida por citometria de fluxo Objetivo
[00353] Medir ligação simultânea por 1166/1261 a ambos OX40 e CTLA4 superexpressados em células medindo o número de células agregadas usando citometria de fluxo.
Materiais e métodos
[00354] As células CHO-OX40 e as células HEK-CTLA4 foram coradas intracelularmente com os corantes fluorescentes PKH-67 (corante verde fluorescente), respectivamente, PKH-26 (corante fluorescente vermelho) (Sigma-Aldrich). Após verificar a população de células coradas homogeneamente, as células foram misturadas e incubadas com qualquer de 1166/1261 (um anticorpo biespecífico exemplar direcionando OX40 e CTLA4) ou uma combinação dos dois anticorpos monoclonais 1166/1167 (um anticorpo anti-OX40 monoespecífico) e uma IgG de controle compreendendo um domínio de ligação a CTLA4. Após coloração, as células foram imediatamente fixadas e o número de células agregadas, duplo positivas, foi quantificado usando FACS- verse (BD biosciences). Análise dos dados e regressão não linear foram realizadas usando Graph Pad Prism v6.
Resultados e conclusões
[00355] O anticorpo biespecífico exemplar 1166/1261 aumenta o número de células agregadas com concentração crescente (Figura 17) (um experimento representativo em dois).
Exemplo 15 - Anticorpos biespecíficos direcionando OX40 e CTLA4 - Farmacocinética em camundongos Materiais e métodos Anticorpos • 1166/1261 (um anticorpo biespecífico exemplar direcionando OX40 e CTLA4) • 1166/1167 (um anticorpo de controle monoespecífico direcionando OX40) Estudos in vivo
[00356] Camundongos fêmeas C57BL/6 (7-8w) de Taconic’s Denmark foram usados nos experimentos. Todos os experimentos foram feitos por aprovação do comitê de ética de Malmö/Lund.
[00357] Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 100µg de cada anticorpo e o sangue foi extraído via veia safena ou no término via veia cava em tubos heparinizados após 0h, 1h, 4h, 8h, 24h, 72h e após 1 semana. Foram utilizados 3 camundongos para cada ponto no tempo. O sangue foi centrifugado a 2.500 rpm por 30 min. e o plasma foi congelado a -80°C para análises posteriores.
Ensaios para determinação dos níveis de 1166/1261 e 1166/1167 no plasma
[00358] Foram utilizados dois ensaios diferentes. Um alvo simples ELISA (ELISA1) e um ELISA duplo (ELISA2).
Resumidamente, os ensaios consistiam nas seguintes etapas.
Placas LIA de fundo plano de alta ligação brancas (Greiner Bio-One, Áustria) foram revestidas durante a noite com 0,8 µg/mL de humanOX40-Fc (RnD Systems, MN, EUA). Após lavagem com tampão de lavagem (salina de tampão fosfatase suplementada com 0,05% de Tween 20 (PBST), Medicago, Suécia), os poços foram bloqueados usando PBST com 2% de albumina de soro bovino (BSA) (Merck, Alemanha) por 1 hora à temperatura ambiente (ART) com agitação e lavados novamente antes que as amostras de plasma serem diluídas 1:200 e 1:5.000 em tampão de ensaio (PBST + 0,5% BSA) juntamente com amostras de curva de calibração (1166/1261, conc. 6-0,0012 µg/mL) fossem adicionadas. Após incubação em ART por 1 h com agitação e lavagem subsequente, foi adicionado reagente secundário, consistindo em qualquer de conjugado da peroxidase de rábano (HRP) anticorpo anti-capa humano (AbD Serotec, UK) para o alvo simples ELISA ou CTLA-Fc humano biotinilado (Orencia) a 1 µg/mL, seguido de estreptavidina-HRP (Thermo Fisher
Scientific, MN, EUA), de acordo com as instruções do fabricante para o ELISA duplo. O sinal foi obtido usando substrato de HRP SuperSignal Pico Luminescence (Thermo Fisher Scientific). As medições de luminescência foram coletadas após 10 minutos de incubação no escuro com agitação usando um Flurostar Optima (MBG Labtech, Alemanha). Os dados foram analisados usando o programa GraphPad Prism.
Resultados
[00359] As amostras coletadas nos diferentes pontos no tempo após injeção com 1166/1261 e 1166/1167 foram analisadas com somente ELISA de alvo simples ou ELISA de alvo simples e ELISA duplo para determinação dos níveis plasmáticos de 1166/1261 e 1166/1167, respectivamente. Os resultados mostram que os níveis de 1166/1261 e 1166/1167 no plasma aumentaram em torno das primeiras 4 horas após a injeção peritoneal e, então, reduziram (Figura 18 painel superior). Os níveis detectáveis de ambos 1166/1261 e 1166/1167 estão presentes no plasma após uma semana (Figura 18 painéis do meio e inferior).
[00360] Os níveis de 1166/1261 no plasma são semelhantes aos níveis obtidos para o anticorpo monoclonal 1166/1167, indicando que 1166/1261 exibe uma boa meia-vida in vivo, comparável àquela de um anticorpo anti-OX40 monoespecífico equivalente.
Referências
Hemerle T., Wulhfard S., Neri D., (2012) A critical evaluation of the tumour-targeting properties of bispecific antibodies based on quantitative biodistribution data.
Protein Engineering and Design, 25, pp 851-854.
Exemplo 16 - Anticorpos específicos direcionando OX40 e CTLA4 - Efeito antitumoral in vivo no modelo de câncer de cólon HT-29 Sumário
[00361] O efeito antitumoral de 1166/1261 (um anticorpo biespecífico exemplar direcionando OX40 e CTLA4) foi investigado usando camundongos imunodeficientes humanizados de hPBMC e modelos de tumor subcutâneo de carcinoma de cólon HT-29.
[00362] 1166-1261 demonstraram inibição do volume do tumor estatisticamente significativa.
Materiais e métodos
[00363] Camundongos SCID-Bege fêmeas (6-9w) de Taconic’s Denmark foram usados nos experimentos. Todos os experimentos foram feitos com a aprovação do comitê de ética Malmö/Lund.
[00364] Células de câncer de cólon HT-29 foram obtidas da ATCC e cultivadas de acordo com as recomendações da ATCC. A linhagem de células HT-29 crescendo em fase logarítmica foi injetada subcutaneamente (4x106 células em 100-200 µL no dia 0 (D0)). PBMC humano (7 x 106 em 200 µL)
isolado de concentrados de leucócitos foi injetado intraperitonealmente no mesmo dia. Tratamentos intraperitoneais (667pmol) foram feitos nos dias 6, 13 e 20.
[00365] Concentrados de leucócitos foram obtidos do Lund University Hospital.
[00366] O tumor foi medido com uma pinça na largura, no comprimento e na altura, dos qual o volume do tumor foi calculado (w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). Os animais foram terminados antes que o volume do tumor atingisse 2cm3, no ferimento, ou afetasse a saúde dos camundongos.
[00367] Os dados foram analisados por teste de Mann- Whitney, utilizando o programa GraphPad Prism. Os doadores respondedores foram considerados aqueles doadores responsivos ao anticorpo de referência 1874. O mínimo de 10% de inibição média do tumor durante o período de crescimento exponencial do tumor foi considerado como uma resposta.
Resultados
[00368] Dados agrupados de camundongos enxertados com doadores respondedores (4 doadores de dois experimentos separados) demonstraram eficácia antitumoral estatisticamente significativa nos dias 12 a 16 na forma de inibição do crescimento tumoral quando tratados com o anticorpo 1166/1261 (p = 0,0469 a p = 0,0074, Mann-Whitney não paramétrico, 2 caudas) em comparação com o grupo de veículo (ZZ). A porcentagem de inibição do volume do tumor variou de 22 a 36% com 1166/1261 entre os dias 10 e 21 (ver Figura 19 e Tabela 31.1).
[00369] Em conclusão, o efeito antitumoral de 1166/1261 foi investigado usando camundongos imunodeficientes humanizados de hPBMC e modelos de tumor subcutâneo de carcinoma de cólon HT-29. 1166/1261 demonstrou inibição do volume do tumor estatisticamente significativa.
Tabela 31.1 Análise estatística e porcentagem de inibição do tumor Dia após a Inibição do valor de p inoculação do crescimento (Mann-Whitney 2-caudas) tumor tumoral (volume tumoral) comparado ao veículo (%) D10 22,8 0,1298 D12 35,4 0,0315 D14 35,9 0,0074 D16 31,5 0,0469 D19 30,8 0,1059 D21 22,1 0,1067 Exemplo 17 - Anticorpos biespecíficos direcionando OX40 e CTLA4 - Efeito antitumoral in vivo no modelo de linfoma de Raji Sumário
[00370] O efeito antitumoral de 1166/1261 (um anticorpo biespecífico exemplar direcionando OX40 e CTLA4) foi investigado usando camundongos imunodeficientes humanizados de hPBMC e modelos de tumor subcutâneo de linfoma de célula B de Raji.
[00371] 1166/1261 demonstrou inibição do volume do tumor estatisticamente significativa.
Materiais e métodos
[00372] Camundongos SCID-Bege fêmeas (6-9w) de Taconic’s Denmark foram usados nos experimentos. Todos os experimentos foram feitos por aprovação do comitê de ética de Malmö/Lund.
[00373] Linfoma de célula B de Raji foi obtido da ATCC e cultivado de acordo com as recomendações da ATCC. A linhagem celular de Raji crescendo em fase log foi injetada subcutaneamente (10x106 células) junto com PBMC humano (10x106 em 200µL), isolada de crostas inflamatórias. Os tratamentos intraperitoneais (667pmol) foram feitos nos dias 0, 7 e 14.
[00374] Crostas inflamatórias foram obtidas do Kalmar University Hospital.
[00375] O tamanho do tumor foi medido com um paquímetro em largura, comprimento e altura, dos quais o volume do tumor foi calculado (w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). Os animais foram terminados antes que o volume do tumor atingisse 2cm3, no ferimento, ou afetasse a saúde dos camundongos.
[00376] Os dados foram analisados por teste de Mann- Whitney, utilizando o programa GraphPad Prism. Os doadores respondedores foram considerados aqueles doadores responsivos ao anticorpo de referência 1874. O mínimo de 10% de inibição média do tumor durante o período de crescimento exponencial do tumor foi considerado como uma resposta.
Resultados e Conclusões
[00377] Dados agrupados de grupos experimentais com doadores respondedores, o anticorpo biespecífico 1166/1261 demonstrou eficácia antitumoral estatisticamente significativa nos dias 14 e 21 (p = 0,0068 e p = 0,0288, Mann-Whitney, 2 caudas) em comparação com o veículo (Tabela
32.1).
Tabela 32.1 Análise estatística e porcentagem de inibição do tumor Dia após a Volume tumoral Volume tumoral Inibição do crescimento valor de p inoculação em animais em animais tumoral (volume tumoral) (Mann- do tumor tratados com tratados com comparado ao veículo (%) Whitney 2- veículo 1166/1261 caudas) D10 14,2 13,8 6,1 0,6842 D12 35,7 21,5 39,9 0,0603 D14 61,8 33,6 45,7 0,0068 D17 105,3 76,0 27,8 0,3527 D19 205,1 133,3 35 0,0524 D21 314,8 187,0 40,6 0,0288 D24 467,5 299,9 37,2 0,054 D26 529,7 360,1 32 0,063 Exemplo 18 - Efeito antitumoral in vivo em modelo de câncer de cólon MC38 Sumário
[00378] Os efeitos antitumorais do anticorpo biespecífico OX40-CTLA-4 1166/1261 foram investigados usando camundongos transgênicos para OX40 humano e modelos de tumores subcutâneos de carcinoma do cólon MC38.
[00379] 1166/1261 demonstrou um efeito estatisticamente significativo na razão CD8/Treg em comparação com as contrapartes monoclonais.
Materiais e métodos
[00380] Camundongos transgênicos fêmeas para OX40 humano (modelo de camundongo knock-in de OX40 humano homozigoto, desenvolvido por GenOway) foram usados nos experimentos. Todos os experimentos foram feitos com a aprovação do comitê de ética Malmö/Lund.
[00381] Câncer de cólon MC38 foi cultivado em RPMI, soro fetal de bezerro inativado por calor a 10%, piruvato de sódio, hepes e 2-mercaptoetanol. A linhagem de célula MC38 crescendo em fase logarítmica foi injetada subcutaneamente (1x106 células em 100µL no dia 0 (D0)) e tratamentos (1,33mol) foram feitos intraperitonealmente nos dias 10, 13 e 16. Vinte e quatro horas após as últimas injeções, os tumores e baços foram colhidos, corados para marcador de viabilidade, marcadores de linhagem CD11b, C19, MHCII, NK1.1, CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, Ki-67 e analisados usando citometria de fluxo.
Resultados
[00382] Os efeitos farmacodinâmicos de um anticorpo OX40-CTLA-4 biespecífico foram investigados em camundongos hOX40tg usando o modelo de carcinoma de cólon MC38. Dados agrupados dois experimentos independentes demonstraram efeito estatisticamente significativo na razão CD8/Treg intratumoral com anticorpo biespecífico em comparação com ambas as contrapartes monoespecíficas (Figura 20). Nenhuma mudança na razão CD8/Treg pode ser vista no baço, com respeito à razão CD8/Treg nem ao nível de expressão de Ki- 67 nas Tregs (Ki-67 é um marcador para proliferação). Isto mostra que 1166/1261 induz um efeito significativo nas Tregs no tumor que é maior que a soma dos efeitos obtidos pelos dois anticorpos de controle monoespecíficos sem afetar as células T na periferia. O efeito é, assim, direcionado para o microambiente tumoral, que pode proporcionar uma janela terapêutica maior, isto é, um alto efeito antitumoral com baixa toxicidade sistêmica. Os níveis relativos das diferentes populações de células T estão delineados na Figura
21.
Exemplo 19 - Efeito antitumoral in vivo no modelo de câncer de cólon MC38 Sumário
[00383] Os efeitos antitumorais do anticorpo biespecífico OX40-CTLA-4 1166/1261 foram investigados usando camundongos transgênicos para OX40 humano e modelos de tumores subcutâneos de carcinoma do cólon MC38.
[00384] 1166/1261 demonstrou eficácia antitumoral estatisticamente significativa na forma de inibição do volume tumoral.
Materiais e métodos
[00385] Camundongos transgênicos fêmeas para OX40 humano (modelo de camundongo knock-in de OX40 humano homozigoto, desenvolvido por GenOway) foram usados nos experimentos. Todos os experimentos foram feitos com a aprovação do comitê de ética Malmö/Lund.
[00386] Câncer de cólon MC38 foi obtido de Stanford University e cultivado em RPMI, soro fetal de bezerro inativado por calor a 10%, piruvato de sódio, hepes e 2- mercaptoetanol. A linhagem de célula MC38 crescendo em fase logarítmica foi injetada subcutaneamente (1x106 células em 100µL no dia 0 (D0)) e tratamentos (1,33mol) foram feitos intraperitonealmente nos dias 7, 10 e 13.
[00387] O tumor foi medido com uma pinça na largura, no comprimento e na altura, dos qual o volume do tumor foi calculado (w/2x l/2xh/2x pi x (4/3)). Os animais foram terminados antes que o volume do tumor atingisse 2cm3, no ferimento, ou afetasse a saúde dos camundongos.
[00388] Os dados foram analisados quanto ao anticorpo biespecífico de inibição do volume tumoral em comparação com anticorpos monoclonais e veículo usando o programa GraphPad Prism e Excel.
Resultados
[00389] Dados agrupados de três experimentos independentes (n=26-28) demonstraram efeito estatisticamente significativo na inibição do volume tumoral e na sobrevivência.
[00390] Em conclusão, o efeito antitumoral do anticorpo de OX40-CTLA-4 biespecífico foi investigado em camundongos transgênicos para OX40 humano e usando o modelo de carcinoma do cólon MC38. O anticorpo biespecífico demonstrou efeitos estatisticamente significativos na inibição do volume do tumor e eleva sobrevivência. O efeito antitumoral foi mais forte em termos de sobrevivência e inibição do crescimento tumoral do que os anticorpos de controle monoespecíficos (Figura 22).
Exemplo 20 - Efeito antitumoral in vivo no modelo de câncer de bexiga MB49 Sumário
[00391] O efeito antitumoral do anticorpo biespecífico OX40-CTLA-4 1166/1261 foi investigado usando camundongos transgênicos para OX40 humano e modelos de tumores subcutâneos de carcinoma de bexiga MB49.
[00392] 1166/1261 demonstrou eficácia antitumoral estatisticamente significativa na forma de inibição do volume tumoral e elevada sobrevivência.
Materiais e métodos
[00393] Camundongos transgênicos fêmeas para OX40 humano (modelo de camundongo knock-in de OX40 humano homozigoto, desenvolvido por GenOway) foram usados nos experimentos. Todos os experimentos foram feitos com a aprovação do comitê de ética Malmö/Lund.
[00394] A linhagem celular MB49 crescendo na fase logarítmica foi injetada subcutaneamente (0,25x106 células) no dia 0 e tratamentos (1,33 µmol) foram feitos intraperitonealmente nos dias 7, 10 e 13.
[00395] Os volumes tumorais foram medidos com uma paquímetro em largura, comprimento e altura, dos quais o volume tumoral foi calculado ((w/2) x (l/2) x (h/2) x pi x (4/3)). Os animais foram terminados antes que o volume do tumor atingisse 2cm3, no ferimento, ou afetasse a saúde dos camundongos. A análise estatística foi feita para o volume do tumor usando o teste de Mann-Whitney, não paramétrico, de 2 caudas e para sobrevivência Kaplan-Meyer Log-Rank usando Graph Pad Prism.
Resultados
[00396] O efeito antitumoral de anticorpo OX40-CTLA- 4 biespecífico 1166/1261 foi investigado em camundongos transgênicos para OX40 humano usando modelo de carcinoma da bexiga MB49. O anticorpo biespecífico demonstrou efeitos estatisticamente significativos na inibição do volume do tumor (Figura 23A, p=0,0003) e elevada sobrevivência (Figura 23B p<0,0001).
Exemplo 21 - Memória imunológica induzida por 1166/1261 Sumário
[00397] Considera-se que os imunomoduladores induzem respostas curativas a longo prazo contra câncer, pois eles induzem memória imunológica. Para demonstrar essa memória imunológica, camundongos nos quais 1166/1261 haviam induzido regressão completa do tumor foram novamente desafiados com o mesmo tumor específico, a linhagem de célula MB49 ou com a linhagem de célula tumoral irrelevante PANC02.
[00398] O experimento de novo desafio demonstrou que 1166/1261 gerou memória imunológica específica de tumor contra câncer de bexiga MB49, mas não contra o tumor irrelevante PANC02.
Materiais e métodos
[00399] Camundongos knock-in para OX40 humano (hOX40tg), gerados por genOway, nos quais 1166/1261 induziu regressão completa do tumor do câncer de bexiga MB49, foram novamente desafiados com MB49 como um tumor específico em um único modelo de tumor ou junto com tumor irrelevante PANC02 usando modelo de tumor duplo. Camundongos naïve foram usados como controle de crescimento tumoral.
[00400] MB49 e PANC02 crescendo em fase logarítmica foram injetados subcutaneamente (0,25x106 células) como um tumor único ou tumores duplos, um em cada lado do flanco. O volume do tumor foi medido três vezes por semana com um paquímetro e o volume do tumor foi calculado usando a fórmula (¾x π x (largura/2) x (comprimento/2) x (altura/2).
Resultados
[00401] A memória imunológica foi examinada em camundongos mostrando regressão completa do tumor após tratamento com 1166/1261, desafiando novamente estes camundongos com o tumor específico MB49 ou com um tumor irrelevante. Os respondedores completos demonstraram memória imunológica contra o tumor específico MB49 quando os novos tumores deixaram de crescer (Figura 24A). Camundongos naïve foram usados como um controle positivo para crescimento do tumor. Além disso, foi demonstrado que a memória imunológica é específica do tumor, pois os respondedores completos desafiados novamente com MB49 e com tumor irrelevante PANC02 em um modelo de tumor duplo, demonstraram crescimento apenas do tumor irrelevante, mas não do tumor MB49 encontrado anteriormente (Figura 24B). Estes dados demonstram que 1166/1261 induz memória imunológica específica do tumor.
Exemplo 22 - Efeitos antitumorais in vivo no modelo de câncer de bexiga MB49 por avaliação da razão CD8/Treg intratumoral Sumário
[00402] No ambiente tumoral, as Tregs têm uma alta expressão de ambos OX40 e CTLA-4. Espera-se que os anticorpos biespecíficos OX40-CTLA-4 induzam a depleção de Tregs neste ambiente tumoral. A capacidade de 1166/1261 de induzir a depleção de Tregs intratumorais foi investigada usando camundongos transgênicos para OX40 humano e modelos de tumor subcutâneo de câncer de bexiga MB49.
[00403] 1166/1261 demonstraram efeitos estatisticamente significativos na depleção de Treg, na ativação de células efetoras e na razão CD8/Treg elevada em comparação com contrapartes monoclonais. Este efeito estava localizado principalmente no ambiente do tumor, pois não foram observados efeitos significativos no baço na forma de razão CD8/Treg alterada.
Materiais e métodos
[00404] Homozigotos fêmeas para OX40 humano (hOX40tg) com idades de 7-14w, gerados por genOway, França, foram utilizados nos experimentos. Todos os experimentos foram feitos com a aprovação do comitê de ética Malmö/Lund.
[00405] Câncer de bexiga MB49 crescendo na fase logarítmica foi injetada subcutaneamente (0,25 x 106 células) no dia 0 e tratamentos (1,33 µmol) foram feitos intraperitonealmente nos dias 10, 13 e 16. Vinte e quatro horas após a última injeção, os tumores e baços foram colhidos, corados para CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3,
assim como marcadores de linhagem (CD19, NK1.1, MHCII) e analisados por citometria de fluxo. Análise estatística foi feita usando mann-Whitney, não paramétrica, de 2 caudas, se não indicado de outra forma, usando Graph Pad Prism.
Resultados
[00406] Os efeitos farmacodinâmicos do anticorpo OX40-CTLA-4 biespecífico foram investigados em camundongos hOX40tg usando o câncer de bexiga MB49. Os experimentos demonstraram que 1166/1261 induziu efeito estatisticamente significativo no teor de Treg intratumoral (p=0,0087, 2 caudas), (Figura 25A), números de CD8 em tumores (p=0,047, 1 cauda), (Figura 25B) e razão CD8/Treg p=0,0043 2 caudas) (Figura 25C). Nenhuma mudança pode ser observada na razão CD8/Treg no baço, indicando localização tumoral de 1166/1261 (Figura 25D).
Exemplo 23 - Efeitos antitumorais in vivo no modelo de carcinoma do cólon MC38 por avaliação da ativação de células efetoras Sumário
[00407] Além da depleção de célula T reguladora, parte do modo de ação dos anticorpos biespecíficos OX40- CTLA-4 é considerada ser a ativação das células T efetoras.
Estes efeitos antitumorais do anticorpo biespecífico OX40- CTLA-4 1166/1261 foram investigados usando camundongos transgênicos para OX40 humano e modelos de tumor subcutâneo de carcinoma do cólon MC38.
[00408] 1166/1261 demonstrou um efeito estatisticamente significativo na ativação de CD8 efetora no microambiente tumoral na forma de expressão elevada de Granzyme B e CD107a.
Materiais e métodos
[00409] Camundongos transgênicos fêmeas para OX40 humano (modelo de camundongo knock-in de OX40 humano homozigoto, desenvolvido por GenOway) foram usados nos experimentos. Todos os experimentos foram feitos com a aprovação do comitê de ética Malmö/Lund.
[00410] Câncer de cólon MC38 crescendo em fase logarítmica foi injetado subcutaneamente (1x106 células) no dia 0 e tratamentos (1,33 µmol) foram feitos intraperitonealmente nos dias 10, 13 e 16. Vinte e quatro horas após as últimas injeções, os tumores e baços foram colhidos, corados para marcador de viabilidade, marcadores de linhagem (CD11b, C19, MHCII, NK1.1), CD45, CD3, CD4, CD8, Granzyme B e CD107a e analisados usando citometria de fluxo.
Os dados foram analisados usando teste de Mann-Whitney, não paramétrico de 2 caudas.
Resultados
[00411] Os efeitos de farmacodinâmica de um anticorpo OX40-CTLA-4 biespecífico foram investigados em camundongos hOX40tg usando carcinoma de cólon MC38. Os experimentos demonstraram que 1166/1261 induziu ativação estatisticamente significativa das células CD8 efetoras na área do tumor na forma de indução de CD107a (Figura 26A, p = 0,0079) e Granzyme B (Figura 26B, p=0,0159).
Exemplo 24 – Anticorpo biespecífico exemplar ‘1166/1261’ localiza ao tumor Sumário
[00412] OX40 e CTLA-4 são altamente expressados em células T no ambiente tumoral, particularmente em Tregs.
Assim, espera-se que os anticorpos biespecíficos OX40-CTLA- 4 induzam localização do tumor devido ao direcionamento duplo. A capacidade de 1166/1261 de localizar o tumor foi investigada usando camundongos transgênicos para OX40 humano e modelos de tumor subcutâneo de carcinoma do cólon MC38.
1166/1261 demonstrou localização de tumor estatisticamente significativa em comparação com animais tratados com veículo ou controle de isotipo. Nenhuma localização foi vista no baço.
Material e Métodos
[00413] Camundongos fêmeas transgênicos para OX40 humano (modelo de camundongo knock-in de OX40 humano homozigoto, desenvolvido por GenOway) foram usados nos experimentos. Todos os experimentos foram feitos por aprovação do comitê de ética de Malmö/Lund.
[00414] Câncer do cólon MC38 crescendo em fase logarítmica foi injetado subcutaneamente (1 x 106 células) no dia 0. Os camundongos receberam um tratamento no dia 17 (com 1,33 µmol de Ab intraperitonealmente). Vinte e quatro horas após a injeção, os tumores e baços foram colhidos, corados com um marcador de viabilidade, marcados com APCeFluor780 anti-hIgG e marcados com PE anti-hIgG e analisados por citometria de fluxo. A porcentagem de células hIgG+ de células CD45+ vivas foi comparada entre os diferentes grupos. Os dados foram analisados usando teste de Mann-Whitney, não paramétrico de 2 caudas.
Resultados e conclusões
[00415] A capacidade de 1166/1261 induzir a localização do tumor foi investigada em camundongos hOX40tg usando câncer do cólon MC38. Os experimentos demonstraram que 1166/1261, mas não o controle de isotipo, foi detectado no tumor após tratamento (Figura 27A). 1166/1261 não poderia ser detectado no baço (Figura 27 B), sugerindo localização para o tumor.
Exemplo 25 - Efeitos combinatórios de PD-1 no modelo de carcinoma do cólon MC38 Sumário
[00416] Os ensaios clínicos bem-sucedidos com anticorpos monoclonais PD-1 e outros inibidores do ponto de verificação imune abriram novas avenidas na terapia do câncer. No entanto, um grande subconjunto de pacientes de câncer ainda deixa de responder, levando à pesquisa intensificada sobre terapias de combinação. O anticorpo biespecífico OX40-CTLA-4 foi investigado na combinação de PD-1 usando camundongos transgênicos para OX40 humano e usando o modelo de carcinoma do cólon MC38.
[00417] 1166/1261 sozinho demonstrou efeitos antitumorais estatisticamente significativos na forma de inibição do volume tumoral e sobrevivência elevada. Além disso, 1166/1261 foi capaz de intensificar significativamente os efeitos antitumorais do tratamento de PD-1. Estes dados mostram os benefícios potenciais da combinação de 1166/1261 com anticorpos PD-1 em pacientes.
Materiais e métodos
[00418] Homozigotos fêmeas para OX40 humano (hOX40tg), com idades de 7 a 14w, gerados por genOway, França e criados internamente, foram usados nos experimentos. Todos os experimentos foram feitos com a aprovação do comitê de ética Malmö/Lund.
[00419] Carcinoma do cólon MC38 crescendo em fase logarítmica foi injetado subcutaneamente (1x106 células) no dia 0 e tratamentos de anticorpo 1166/1261 (1,33 µmol) e/ou PD-1 anticamundongo (250µg, RPM1-14, BioXcell, US) foram realizados intraperitonealmente nos dias 7, 10 e 13. O volume do tumor foi medido três vezes por semana com um paquímetro e o volume do tumor foi calculado usando a fórmula (¾x π x (largura/2) x (comprimento/2) x (altura/2). Os camundongos foram terminados no limite ético do tumor. O volume do tumor foi analisado usando teste de Mann-Whitney, não paramétrico, de 2 caudas e sobrevivência Kaplan-Meyer, Log-Rank, usando Graph Pad Prism.
Resultados
[00420] Os efeitos anti-tumorais combinatórios de um anticorpo OX40-CTLA-4 biespecífico e anti PD-1 foram investigados em camundongos hOX40tg utilizando modelo de carcinoma do cólon MC38. Os experimentos demonstraram efeitos antitumorais induzidos por 1166/1261, tanto em forma de inibição do volume do tumor quanto elevada sobrevivência p=0,0124 (Figuras 28A e B). A combinação de 1166/1261 com o tratamento de PD-1 aumentou significativamente o efeito antitumoral (p<0,0001). Estes dados demonstraram que 1166/1261 poderia intensificar os efeitos antitumorais obtidos com os anticorpos PD-1 na clínica.
Exemplo 26 - Efeitos combinatórios de PD-1 em modelo de carcinoma do cólon CT26 Sumário
[00421] Os ensaios clínicos bem-sucedidos com anticorpos monoclonais PD-1 e outros inibidores do ponto de verificação imune abriram novas avenidas na terapia do câncer. No entanto, um grande subconjunto de pacientes de câncer ainda deixa de responder, levando à pesquisa intensificada sobre terapias de combinação. O anticorpo biespecífico OX40-CTLA foi investigado na combinação de PD- 1 usando camundongos transgênicos para OX40 humano e usando o modelo de carcinoma do cólon CT26.
[00422] 1166/1261 sozinho demonstrou efeitos antitumorais estatisticamente significativos na forma de inibição do volume tumoral e sobrevivência elevada. Além disso, 1166/1261 foi capaz de intensificar significativamente os efeitos antitumorais do tratamento de PD-1.Estes dados demonstraram que 1166/1261 poderia intensificar os efeitos antitumorais obtidos com os anticorpos PD-1 na clínica Materiais e métodos
[00423] Homozigotos fêmeas para OX40 humano (hOX40tg), com idades de 7 a 14w, gerados por genOway, França e criados internamente, foram usados nos experimentos. Todos os experimentos foram feitos com a aprovação do comitê de ética Malmö/Lund.
[00424] Carcinoma do cólon CT26 crescendo em fase logarítmica foi injetado subcutaneamente (1x106 células) no dia 0 e tratamentos de anticorpo 1166/1261 (1,33 µmol) e/ou PD-1 anticamundongo (250µg, RPM1-14, BioXcell, US) foram realizados intraperitonealmente nos dias 7, 10 e 13. O volume do tumor foi medido três vezes por semana com um paquímetro e o volume do tumor foi calculado usando a fórmula (¾x π x (largura/2) x (comprimento/2) x (altura/2). O volume do tumor foi analisado usando teste de Mann-Whitney, não paramétrico, de 2 caudas e sobrevivência Kaplan.meyer, Log-Rank, usando Graph pad prism.
Resultados
[00425] Os efeitos anti-tumorais combinatórios de um anticorpo OX40-CTLA-4 biespecífico e anti PD-1 foram investigados em camundongos hOX40tg utilizando modelo de carcinoma do cólon CT26. Os experimentos demonstraram efeito estatisticamente significativo por 1166/1261, tanto como a inibição do volume do tumor quanto elevada sobrevivência, ao passo que o anticorpo PD-1 sozinho não demonstrou qualquer eficácia antitumoral potente (Figuras 29A e B). A adição de 1166/1261 a tratamentos de PD-1 aumentou significativamente a eficácia antitumoral do anticorpo PD-1. Estes dados demonstraram que 1166/1261 poderia intensificar os efeitos antitumorais obtidos com anticorpos PD-1 na clínica.
Exemplo 27 - Eficácia antitumoral de 1166/1261 contra o câncer de pâncreas PANC02 Sumário
[00426] Adenocarcinoma pancreático é um tipo agressivo de câncer. Pacientes com câncer pancreático geralmente têm prognóstico muito ruim e o tipo de câncer é a quarta causa mais comum de morte por câncer nos Estados
Unidos. Os efeitos antitumorais de 1166/1261 foram examinados contra câncer pancreático PANC02 usando camundongos transgênicos para hOX40.
[00427] 1166/1261 demonstrou eficácia antitumoral estatisticamente significativa na forma de inibição do volume tumoral e elevada sobrevivência.
Materiais e métodos
[00428] Camundongos fêmeas knock-in para OX40 humano (hOX40tg), gerados por genOway, foram usados nos experimentos. Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética de Malmo/Lund.
[00429] Câncer pancreático PANC02 crescendo em fase logarítmica foi injetado subcutaneamente (0,25x106 células) no dia 0 e tratamentos com 1166/1261 (1,33 µmol) foram feitos intraperitonealmente nos dias 7, 10 e 13. O volume do tumor foi analisado usando teste de Mann-Whitney, não paramétrico, de 2 caudas e sobrevivência Kaplan.meyer, Log-Rank, usando Graph pad prism.
Resultados
[00430] A eficácia antitumoral de 1166/1261 contra câncer pancreático foi examinada usando camundongos transgênicos hOX40 e câncer pancreático PANC02. 1166/1261 demonstrou eficácia antitumoral significativa na forma de inibição de crescimento tumoral (Figura 30A) e elevada sobrevivência (Figura 30B).
Exemplo 28 – 1166/1261 restaura ativação de célula T através de bloqueio de CTLA-4 Sumário
[00431] A capacidade de 1166/1261 de bloquear CTLA-4 e aumentar a coestimulação e ativação das células T foi investigada em um ensaio repórter de bloqueio de CTLA-4.
1166/1261 foi capaz de bloquear ligação de CD80/CD86 a CTLA- 4 e restaurar a coestimulação via CD28 levando à ativação de célula T.
Material e Métodos
[00432] O ensaio utiliza células Raji expressando um ativador de TCR e CD80/CD86 para coestimular células T repórteres de Jurkat expressando TCR, CTLA-4 e CD28 conectadas a um promotor de IL2 com um elemento luc2P. A ativação é medida como luminescência. Na ausência de anticorpos CTLA-4, CD80/CD86 liga a CTLA-4 com afinidade mais alta que CD28, assim bloqueando o sinal. Ao adicionar anticorpos de ligação a CTLA-4, a ligação de CD80/CD86 a CTLA-4 será bloqueada e, como consequência, a coestimulação de células T via CD28 aumentará, levando à ativação de células T.
[00433] 1166/1261 diluído em série e controle de isotipo foram imobilizados na placa e incubados durante a noite seguidos pela adição de células repórteres Jurkat e células Raji. Após a incubação durante a noite, a ativação das células T foi medida como luminescência.
Resultados e conclusões
[00434] Como mostrado na Figura 31, 1166/1261 é capaz de restaurar a ativação de célula T, ao passo que nenhum efeito é visto com o controle de isotipo.
Exemplo 29 - Ativação de célula T induzida por 1166/1261 mediante reticulação de CTLA-4 Sumário
[00435] A capacidade de 1166/1261 ativar células T foi investigada em ensaios agonísticos em série mediante reticulação de CTLA-4. 1166/1261 demonstrou ativação de célula T agonística na forma de secreção de IFN-g, IL-2 ou elevada proliferação de célula T.
Material e Métodos
[00436] Células T CD3+ ou CD4+ humanas foram purificadas de PBMCs obtido de filtros de leucócitos do banco de sangue do Lund University Hospital usando seleção negativa (Kit de Isolamento de célula T Pan ou Kit de Isolamento de célula T CD4+, Miltenyi) e cultivadas unto com 1166/1261 diluído em série, uma mistura de anticorpos monoespecíficos 1166/1167+ IsoCtr/1261 ou controle de isotipo.
[00437] A liberação de IFN-γ pelas células T CD3+ foi medida após cultivar células T (100.000 células/poço) com anticorpos de teste em placas pré-revestidas com CTLA-4
(Orencia, 5 µg/ml) e αCD3 (OKT3, 3 µg/ml). Após um período de incubação de 72 h, o nível de IFN-γ foi medido nos sobrenadantes por ELISA.
[00438] A liberação de IL-2 pelas células T CD4+ foi medida cultivando células T (50.000 células/poço) com anticorpos de teste em placas contendo células HEK irradiadas (30.000 células/poço) expressando estavelmente CTLA-4 (800.000 receptores/célula) e contas de αCD3 (UCHT-1, razão célula:conta de 1:1,1). Após 72 h, o nível de IL-2 foi medido nos sobrenadantes por ELISA.
[00439] A proliferação foi determinada cultivando células T CD4+ (50.000 células/poço) com composto de teste em placas pré-revestidas com CTLA-4 (Orencia, 5 µg/ml) e αCD3 (UCHT-1, 0,1 µg/ml). Após 72 h, a proliferação foi medida com CellTitre Glow (Promega).
Resultados e conclusões
[00440] A atividade agonística de 1166/1261 foi investigada em ativação de célula T diferencial. Os resultados na Figura 32 demonstram efeitos dependentes da dose de 1166/1261 em termos de liberação de IFN-γ e IL-2, bem como proliferação, embora isto não seja visto com a combinação de anticorpos monoespecíficos OX40 e CTLA-4. Os resultados indicam que 1166/1261 tem um forte efeito agonístico mediante reticulação de CTLA-4.
Exemplo 30 – Ativação de célula T induzida por 1166/1261 mediante reticulação de FcγR Sumário
[00441] A capacidade de 1166/1261 ativar células T foi investigada em ensaios agonísticos mediante reticulação de FcγR. 1166/1261 demonstrou ativação de célula T agonística na forma de secreção de IL-2.
Material e Métodos
[00442] Células de CHO transfectadas estavelmente para expressar CD64 (FcγRI) foram irradiadas, plaqueadas (100.000 células/poço) e deixadas aderir durante a noite.
1166/1261 diluído em série, a combinação de anticorpos monoespecíficos (1166/1167 + Ctr IgG/1261) ou controle de isotipo foram adicionados aos poços. Contas revestidas com αCD3 (OKT3) foram adicionadas para ativação de célula T subótima. Células T CD4+ humanas foram purificadas de PBMCs obtido de filtros de leucócitos do banco de sangue do Lund University Hospital usando seleção negativa (Kit de Isolamento de célula T CD4+, Miltenyi) e adicionadas aos poços (50.000 células/poço). Após um período de incubação de 72 horas, a secreção de IL-2 foi medida por ELISA. No total, 8 doadores foram testados no ensaio.
Resultados e conclusões
[00443] Como mostrado na Figura 33, uma ativação dependente de dose de 1166/1261 é demonstrada, enquanto isto não é visto com a combinação de anticorpos monoespecíficos OX40 e CTLA-4. Os resultados indicam que 1166/1261 tem um forte efeito agonístico mediante reticulação de FcγR.
Exemplo 31 - Capacidade de 1166/1261 esgotar Tregs primárias Sumário
[00444] No ambiente tumoral, células T reguladoras têm uma alta expressão de ambos OX40 e CTLA-4. Espera-se que os anticorpos biespecíficos OX40-CTLA-4 induzam ADCC de células que expressam alvo, especialmente no ambiente tumoral. A capacidade de 1166/1261 induzir ADCC foi examinada usando um ensaio Repórter de ADCC específico para FcgRIII humano (V158) como um substituto para ADCC. 1166/1261 demonstrou ativação significativa de células efetoras e esta indução foi superior em atividade em comparação com as contrapartes monoclonais sozinhas (dados não mostrados) ou em combinação.
Material e Métodos
[00445] Um ensaio Repórter de ADCC de FcγRIIIa (V158) (Promega) foi usado para determinar a indução de ADCC. Tregs CD4+CD25+CD127low foram isoladas por seleção negativa usando o Kit de Isolamento de Célula T Regulatório de CD4+CD127lowCD25+ Humano (Stemcell Technologies). Tregs foram ativadas por 48 h na presença de Dynabeads (Gibco) αCD3/αCD28 para suprarregular a expressão alvo e usadas como células alvo. 1166/1261 diluído em série, a combinação de anticorpos monoespecíficos (1166/1167 + Ctr IgG/1261) ou controle de isotipo foram cultivados junto com células efetoras e alvo (razão 5:1) por 6 horas. A expressão de OX40 e CTLA-4 foi determinada antes e após a cultura por citometria de fluxo.
Resultados e conclusões
[00446] A capacidade de 1166/1261 induzir a depleção de células T reguladoras in vitro foi avaliada por ensaio repórter de ADCC. Como mostrado na Figura 34A, 1166/1261 tem a capacidade para induzir ADCC em Tregs humanas primárias.
A indução foi marcadamente mais alta que com contrapartes monoclonais sozinhas (dados não mostrados) ou com uma mistura delas. Os resultados correlacionaram-se com os níveis de expressão de OX40 e CTLA-4. Tregs frescas ou não estimuladas expressaram baixos níveis de OX40 e CTLA-4, ao passo que os níveis foram claramente suprarregulados após ativação com αCD3/αCD28 (Figura 34B).
Exemplo 32 - Capacidade de 1166/1261 esgotar Tregs primárias Sumário
[00447] No ambiente tumoral, células T reguladoras têm uma alta expressão de ambos OX40 e CTLA-4. Espera-se que os anticorpos biespecíficos OX40-CTLA-4 induzam ADCC de células que expressam alvo, especialmente no ambiente tumoral. A capacidade de 1166/1261 induzir ADCC foi examinada usando um ensaio de liberação de LDH com células NK alogênicas como células efetoras. 1166/1261 induziu uma forte lise mediada por células NK das Tregs.
Material e Métodos
[00448] Tregs CD4+CD25+CD127low foram isoladas por seleção negativa usando o Kit de Isolamento de Célula T Regulatória de CD4+CD127lowCD25+ Humano EasySepTM (Stemcell Technologies). Tregs foram ativadas por 48 h na presença de Dynabeads (Gibco) αCD3/αCD28 para suprarregular a expressão alvo e, após isso, usadas como células alvo. Como células efetoras, foram utilizadas células NK alogênicas isoladas de PBMC usando seleção negativa usando o Kit de Isolamento de Célula NK Humana EasySep™ (Stemcell Technologies). As células efetoras e as células alvo foram cultivadas a uma razão de 15:1, junto com 1166/1261 diluído em série ou controle de isotipo por 4 h. Depois disso, o nível de LDH no sobrenadante foi medido.
Resultados e conclusões
[00449] Como mostrado na Figura 35, 1166/1261 tem a capacidade para induzir ADCC em Tregs primárias humanas de um modo dependente da dose. Nenhum efeito foi visto com o controle de isotipo.
Exemplo 33 - Avaliação de 1166/1621 no estudo de tox de cynomolgus piloto Sumário
[00450] Foi realizado um estudo de descoberta de faixa de dose de dose única em macacos cynomolgus. Verificou- se que o número de células T precoces (CD25+) e tardias (CD69+) e a memória central de proliferação (CD197+CD45RA- Ki67+) aumentaram após uma dose única de 1166/1261.
Materiais e Métodos
[00451] Foi realizado um estudo de descoberta de faixa de dose de dose única em macacos cynomolgus. Os grupos de dose consistiram em um macho e uma fêmea. Todos os animais tinham mais de 2,5 anos de idade. Os grupos de dose 1-3 receberam 3; 10; ou 30 mg/kg de 1166/1261, respectivamente, como infusões intravenosas durante 1 hora. O grupo de dose 4 recebeu uma injeção subcutânea de 30 mg/kg.
[00452] Amostras de sangue total foram colhidas na pré-dose (duas ocasiões) e pós-dose no Dia 2, 8, 15, 29 e 43 para imunofenotipagem do sangue periférico. Tubos Truecount (BD Biosciences) foram utilizados para enumeração e os anticorpos para coloração foram adquiridos da BD Biosciences ou Biolegend. As diferenças nas populações de células foram comparadas calculando a diferença em vezes de amostras pós- dose com a média das duas amostras de pré-dose para cada indivíduo.
Resultados e conclusões
[00453] Os macacos Cynomolgus recebendo uma dose única de 1166/1261 demonstraram efeitos no número de células
T precoces (CD69+) e tardias (CD25+) (Figura 36B) e na memória central de proliferação (células CD197+CD45RA-Ki67+)
(Figura 36A) foram considerados aumentar.
Não foi observada diferença distinguível entre os quatro grupos de doses.

Claims (46)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro domínio de ligação, designado B1, que é capaz de ligar especificamente a OX40, e um segundo domínio de ligação, designado B2, que é capaz de ligar especificamente a CTLA-4.
2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro e/ou o segundo domínios de ligação são selecionados do grupo que consiste em: anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos
3. Polipeptídeo, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado do grupo que consiste em: um fragmento Fv (tal como um fragmento Fv de cadeia simples, ou um fragmento Fv ligado por dissulfeto), um fragmento tipo Fab (tal como um Fragmento Fab; um fragmento Fab’ ou um fragmento F(ab)2) e anticorpos de domínio.
4. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um anticorpo biespecífico.
5. Polipeptídeo, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que:
(a) o domínio de ligação B1 e/ou o domínio de ligação B2 é um anticorpo de IgG intacto; (b) o domínio de ligação B1 e/ou o domínio de ligação B2 é um fragmento Fv; (c) o domínio de ligação B1 e/ou o domínio de ligação B2 é um fragmento Fab; e/ou (d) o domínio de ligação B1 e/ou o domínio de ligação B2 é um anticorpo de domínio simples.
6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo biespecífico é selecionado dos grupos que consistem em: (a) anticorpos biespecíficos bivalentes, tal como anticorpos biespecíficos IgG-scFv (por exemplo, em que B1 é uma IgG intacta e B2 é um scFv fixado a B1 no N-terminal de uma cadeia leve e/ou no C-terminal de uma cadeia leve e/ou no N-terminal de uma cadeia pesada e/ou no C-terminal de uma cadeia pesada da IgG, ou vice-versa); (b) anticorpos biespecíficos monovalentes, tal como um DuoBody® ou um anticorpo biespecífico ‘knob in hole’ (por exemplo, um scFv-KIH, scFv-KIHr, um BiTE-KIH ou um BiTE- KIHr; (c) anticorpos biespecíficos scFv2-Fc (por exemplo, anticorpos biespecíficos ADAPTIR™); (d) anticorpos biespecíficos BiTE/scFv2;
(e) anticorpos biespecíficos DVD-Ig ou outros anticorpos biespecíficos IgG-FAb, FAb-IgG, independentemente da bivalência ou dos ligantes/conectores empregados; (f) anticorpos biespecíficos baseados em DART (por exemplo, DART-Fc, DART2-Fc ou DART); (g) anticorpos biespecíficos DNL-Fab3; e (h) anticorpos biespecíficos scFv-HSA-scFv.
7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fc humana ou uma variante de uma referida região, em que a região é uma região IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, preferencialmente uma região IgG1 ou IgG4.
8. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e/ou apoptose.
9. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que: B1 é um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, específico para OX40; e B2 é um domínio de ligação ao polipeptídeo específico para CTLA-4, que compreende ou consiste em:
i) sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; ou ii) uma sequência de aminoácido na qual pelo menos um aminoácido é mudado quando comparado à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, desde que o referido domínio de ligação ligue a CTLA-4 humano com afinidade mais alta que CD86 humano tipo selvagem.
10. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o CTLA-4 especificamente ligado ao polipeptídeo é primata ou murino, de preferência humano, CTLA-4 e/ou em que o OX40 especificamente ligado ao polipeptídeo é primata, de preferência humano, OX40.
11. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que B1 compreende pelo menos uma cadeia pesada (H) e/ou pelo menos uma cadeia leve (L) e B2 é fixado à referida pelo menos uma cadeia pesada (H) ou pelo menos uma cadeia leve (L).
12. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que B1 compreende: - pelo menos uma cadeia pesada (H) e pelo menos uma cadeia leve (L) e B2 é fixado a qualquer da cadeia pesada ou da cadeia leve; ou
- duas cadeias pesadas idênticas (H) e duas cadeias leves idênticas (L) e B2 é fixado a ambas as cadeias pesadas ou a ambas as cadeias leves.
13. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste em uma cadeia de polipeptídeo disposta de acordo com qualquer uma das seguintes fórmulas, escritas na direção N-C: (A) L-(X)n-B2; (B) B2-(X)n-L; (C) B2-(X)n-H; (D) H-(X)n-B2; em que X é um ligante e n é 0 ou 1.
14. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que X é um peptídeo com a sequência de aminoácido SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 47), SGGGGSGGGGSAP (SEQ ID NO: 48), NFSQP (SEQ ID NO:49), KRTVA (SEQ ID NO: 50), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 144) ou (SG)m, em que m = 1 a 7.
15. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que liga a OX40 humano com uma Kd inferior a 50x10-10M, 25x10-10M, ou 20x10-10M e/ou que liga a CTLA-4 humano com um valor de Kd que é inferior a 60x10-9M, 25x10-9M ou 10x10-9M.
16. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que induz um aumento na atividade de uma célula T efetora, de preferência, uma célula T efetora CD4+, opcionalmente em que o referido aumento é de pelo menos 1,5 vezes, 4,5 vezes ou 7 vezes mais alto que o aumento na atividade de uma célula T efetora induzida por uma combinação de B1 e B2 administrados à célula T como moléculas separadas.
17. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido aumento na atividade de célula T é um aumento na proliferação e/ou produção de IL-2 pelas células T.
18. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compete para ligação a OX40 com anticorpo 1166/1167; e/ou que compete por ligação a CTLA-4 com 1040 mutante de CD86 (SEQ ID NO: 17).
19. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compete para ligação a OX40 com anticorpo 1166/1261; e/ou que compete por ligação a CTLA-4 com anticorpo 1166/1261.
20. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos na referida sequência de aminoácido de B2 (ii) são substituídos quando comparados com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; opcionalmente, em que não há inserções ou deleções em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
21. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das referidas substituições de aminoácidos na referida sequência de aminoácido do referido primeiro domínio de ligação está na posição 122 e, opcionalmente, em que a referida sequência de aminoácido também é substituída em pelo menos uma das posições 107, 121 e 125.
22. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de aminoácido de B2 compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs 6 a 24 (como mostrado na Tabela C), ou variantes das referidas sequências que têm mais de 60%, ou mais de 70%, por exemplo, 75 ou 80%, de preferência mais de 85%, por exemplo, mais de 90 ou 95% de identidade de aminoácido para as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 6 a 24.
23. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de aminoácido de B2 compreende ou consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17 (mutante de CD86 1040, como mostrado na Tabela C).
24. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que: B1 exibe pelo menos uma das seguintes características funcionais quando presente independentemente de B2: I.ligação a OX40 humano com um valor KD que é inferior a 10x10-10M, mais preferencialmente inferior a 5x10-10M; II.não liga a OX40 murino; e III.não liga a outros membros da superfamília de TNFR humano, por exemplo CD137 ou CD40 humano
25. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que B1 compreende qualquer uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as seis características selecionadas independentemente das seguintes: a) uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que é de 8 aminoácidos de comprimento e compreende a sequência de consenso: “G, F, T, F, G/Y/S, G/Y/S, Y/S, Y/S/A”; b) uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que é de 8 aminoácidos de comprimento e compreende a sequência de consenso: “ I, G/Y/S/T, G/S/Y, S/Y, G/S/Y, G/S/Y, G/S/Y, T”; c) uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que é de 9 a 17 aminoácidos de comprimento e que compreende a sequência de consenso de: “A, R, G/Y/S/H, G/Y/F/V/D, G/Y/P/F, -
/H/S, -/N/D/H, -/Y/G, -/Y, -/Y, -/W/A/V, -/A/Y, - /D/A/Y/G/H/N, Y/S/W/A/T, L/M/I/F, D, Y” d) uma sequência de CDR1 de cadeia leve que consiste na sequência: “Q, S, I, S, S, Y”; e) uma sequência de CDR2 de cadeia leve que consiste na sequência: “A, A, S”; f) uma sequência de CDR3 de cadeia leve que é de 8 a 10 aminoácidos de comprimento e compreende a sequência de consenso: “Q,Q, S/Y/G, -/Y/H/G, -/S/Y/G/D/W, S/Y/G/D , S/Y/G/T, P/L, Y/S/H/L/F, T”; em que a sequência de CDR3 da cadeia pesada de (c) é preferencialmente uma sequência de 10 aminoácidos de comprimento que compreende a sequência de consenso “A, R, Y/H, D, Y, A/Y/G, S/W/A, M/L, D, Y”; e a sequência de CDR3 de cadeia leve de (f) consiste preferencialmente na sequência “Q, Q, Y, Y, W, Y, G, L, S, T”.
26. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que B1 compreende todas as três sequências de CDR de cadeia pesada de uma sequência VH, como mostrado na Tabela A(1) e/ou todas as três sequências de CDR de cadeia leve de uma sequência VL, como mostrado na Tabela A(2) ou em que B1 compreende uma sequência VH de cadeia pesada e/ou uma sequência VL de cadeia leve, como mostrado na Tabela B.
27. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que B1 compreende uma sequência de CDR3 de cadeia pesada de 11 aminoácidos de comprimento que compreende a sequência de consenso “A, R, Y/H, D, Y, A/Y/G, S/W/A, M/L, D, Y” e a sequência VL de cadeia leve de SEQ ID NO: 89 (1167 como mostrado na Tabela B), opcionalmente, em que a sequência VL de cadeia leve da SEQ ID NO: 89 está presente como parte da sequência mais longa da SEQ ID NO: 125 (1261 como mostrado na Tabela D).
28. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação B1 compreende a sequência VL de cadeia leve de SEQ ID NO: 89 (1167 como mostrado na Tabela B) e a sequência VH de cadeia pesada de SEQ ID NO: 91 (1166 como mostrado na Tabela B), ou variantes das referidas sequências que têm mais de 60%, ou mais de 70%, por exemplo, 75 ou 80%, de preferência mais de 85%, por exemplo, mais de 90 ou 95% de identidade de aminoácido para SEQ ID NO: 89 e/ou SEQ ID NO: 91.
29. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que B1 compreende uma região Fc humana ou uma variante de uma referida região, em que a região é uma região IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, preferencialmente uma região IgG1 ou IgG4.
30. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste na sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NOs 125 a 134, opcionalmente em que o referido polipeptídeo é fornecido como uma parte componente de um anticorpo, ou variantes das referidas sequências que têm mais de 60%, ou mais de 70%, por exemplo, 75 ou 80%, de preferência mais de 85%, por exemplo, mais de 90 ou 95% de identidade de aminoácido para as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 125 a 134.
31. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NO 125 (1261 como mostrado na Tabela D).
32. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NO 125 e/ou na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 91, ou variantes das referidas sequências que têm mais de 60%, ou mais de 70%, por exemplo, 75 ou 80%, de preferência mais de 85%, por exemplo, mais de 90 ou 95% de identidade de aminoácido para a SEQ ID NO: 125 e/ou SEQ ID NO: 91.
33. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido de SEQ
ID NO: 125 (1261 como mostrado na Tabela D) e uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 91 (1161, como mostrado na Tabela B).
34. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo biespecífico é capaz de induzir um aumento sinérgico na razão CD8/Treg intratumoral em comparação com o efeito combinado dos polipeptídeos de contraparte monoespecíficos individuais.
35. Polipeptídeo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.
36. Uso de um polipeptídeo biespecífico, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento.
37. Método para tratar ou prevenir uma doença ou condição em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo um polipeptídeo biespecífico de qualquer uma das reivindicações anteriores.
38. Polipeptídeo biespecífico, de acordo com a reivindicação 35 ou uso de acordo com a reivindicação 36 ou método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é câncer e, opcionalmente, em que o indivíduo é humano.
39. Polipeptídeo biespecífico ou uso ou método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o polipeptídeo biespecífico sistemicamente ou localmente, tal como no sítio de um tumor ou em um linfonodo de drenagem tumoral, ou em que o polipeptídeo biespecífico é para administração sistemicamente ou localmente, tal como no sítio de um tumor ou em um linfonodo de drenagem do tumor.
40. Polipeptídeo biespecífico ou método ou uso, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de próstata, câncer de mama, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer cervical, rabdomiossarcoma, neuroblastoma, mieloma múltiplo, leucemia, leucemia linfoblástica aguda, melanoma, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de pele, linfoma ou glioblastoma.
41. Polipeptídeo biespecífico ou método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é para uso em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
42. Polipeptídeo biespecífico ou método ou uso, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que um ou mais agentes terapêuticos adicionais e/são um agente imunoterapêutico que liga um alvo selecionado do grupo que consiste em PD-1/PD-L1, CD137, CD40, GITR, LAG3, TIM3, CD27 e KIR.
43. Polipeptídeo biespecífico ou método ou uso, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que os um ou mais agentes terapêuticos adicionais é/são um agente imunoterapêutico que liga PD-1 ou PD-L1, tal como um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1.
44. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica pelo menos uma cadeia de polipeptídeo de um polipeptídeo biespecífico de qualquer uma das reivindicações 1 a 34.
45. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo biespecífico de qualquer uma das reivindicações 1 a 34 e pelo menos um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
46. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que é conjugado com uma fração terapêutica adicional.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11279948B2 (en) 2016-08-31 2022-03-22 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40
CN107815465B (zh) * 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
IL266918B2 (en) 2016-12-07 2024-03-01 Agenus Inc Anti-CTLA-4 antibodies and methods of using them
CN111511762A (zh) 2017-08-21 2020-08-07 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
CA3115545A1 (en) * 2018-11-13 2020-05-22 Jn Biosciences Llc Bispecific antibodies for activation of immune cells
TWI793395B (zh) * 2019-01-25 2023-02-21 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 結合ｐｄ-ｌ１和ｏｘ４０的雙特異性抗體
WO2021076545A1 (en) * 2019-10-17 2021-04-22 Regents Of The University Of Minnesota Clec12a antibody fragment sequences and methods
CN114616247A (zh) * 2019-10-17 2022-06-10 江苏康宁杰瑞生物制药有限公司 Ox40/pd-l1双特异性抗体
WO2021098851A1 (en) * 2019-11-20 2021-05-27 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd Anti-ctla4/ox40 bispecific antibodies and uses thereof
CA3161733A1 (en) 2020-01-07 2021-05-15 Everett Stone Improved human methylthioadenosine/adenosine depleting enzyme variants for cancer therapy
WO2022002009A1 (zh) * 2020-06-30 2022-01-06 和铂医药(上海)有限责任公司 靶向ox40的抗体及其制备方法和应用
CN113861292A (zh) * 2020-06-30 2021-12-31 百奥泰生物制药股份有限公司 抗cd40抗体或抗原结合片段及其应用
US20240018248A1 (en) 2020-12-02 2024-01-18 Vib Vzw An ltbr agonist in combination therapy against cancer
CN114085376B (zh) * 2021-12-02 2022-12-20 中国科学院长春应用化学研究所 一种多肽及其制备方法、双特异性抗体及其应用
WO2023109901A1 (en) * 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use
WO2023109900A1 (en) * 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies, multispecific antibodies and methods of use
WO2023143478A1 (en) * 2022-01-27 2023-08-03 Crown Bioscience Inc. Novel anti-cd4 and anti-pd-l1 bispecific antibodies
WO2023143597A1 (en) * 2022-01-30 2023-08-03 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-ctla4/ox40 bispecific antibodies and uses thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6682736B1 (en) 1998-12-23 2004-01-27 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to CTLA-4
US9212230B2 (en) 2007-03-29 2015-12-15 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
CN110066339A (zh) 2010-04-20 2019-07-30 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
GB201311475D0 (en) 2013-06-27 2013-08-14 Alligator Bioscience Ab Polypeptides
US20170350886A1 (en) * 2014-02-28 2017-12-07 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Expression constructs and methods for selecting host cells expressing polypeptides
BR112017024770A2 (pt) * 2015-05-21 2018-07-31 Alligator Bioscience Ab polipeptídeos inovadores

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