CN114085376B - 一种多肽及其制备方法、双特异性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种多肽及其制备方法、双特异性抗体及其应用。该多肽为Fc结合多肽,可用于普适、简单、方便地联接单克隆抗体制备双/多特异性抗体。本发明利用聚谷氨酸(PGLU)或聚天冬氨酸(PASP)侧羧基键合对免疫球蛋白(抗体)恒定区(Fc)具有普遍高亲和力的Fc‑III‑4C多肽制备多价Fc结合多肽PGLU‑Fc‑III‑4C或PASP‑Fc‑III‑4C，多价Fc结合多肽可与多种不同比例的单克隆抗体在水溶液中反应，获得双/多特异性抗体。该双/多特异性抗体制备方法具有如下优点：双/多特异性抗体通过在水环境中直接孵育制备而成，反应条件温和，可最大程度保留单抗的活性；简单、高效、单抗比例可控、普适性强，具有产业化前景。

Description

一种多肽及其制备方法、双特异性抗体及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种多肽及其制备方法、双特异性抗体及其应用。
背景技术
CAR-T(Chimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受体T细胞)细胞治疗是一种非常有前景的癌症治疗方法，它通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞，使T细胞直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活，通过释放穿孔素、颗粒酶素B等直接杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。目前已有6款CAR-T药物获美国食品药品监督管理局FDA批准，并被广泛应用于血液病、骨髓瘤的治疗。然而CAR-T疗法由于其制备工艺复杂耗时，周期长，不适用于需要立即治疗的患者，并且需要针对不同患者特异性定制治疗法案而成本高昂，难以惠及大众。
双特异性T细胞接合器(BiTE)是一种双特异性抗体，其一端与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合，另一端与能够激活T细胞的T细胞受体(通常为CD3)相结合，从而将T细胞募集到肿瘤细胞附近，激活它们杀伤肿瘤细胞。双特异性抗体疗法是一种创新的免疫疗法，自美国安进公司Blincyto获批用于急性淋巴细胞白血病以来，已有3款双特异性抗体获批用于多种癌症的治疗，分别是Trion制药的Catumaxomab、安进的Blinatumomab及罗氏的Emicizumab，且其结构从最初的两个或多个单链可变片段(scFv)演变为含有完整Y型IgG抗体结构的抗体；其靶点也逐步丰富，包括靶向癌细胞抗原-T细胞信号，靶向T细胞上的两个信号，靶向癌细胞上的两个信号。
另一方面，虽然BiTE从一定程度上解决了CAR-T疗法的不足，但是随着CAR-T疗法的升级与优化，其疗效随着细胞因子、CD28、4-1BB、PD1抗体等的引入而改进；所以BiTE也需要引入更多的抗体，才能使其疗效提升。因此多特异性抗体的开发具有重要意义。
目前双特异性抗体研究进展较快，共有3种产品上市，三特异性抗体、四特异性抗体尚无产品上市，有7款处于临床阶段，进展相对较慢，归其原因，是缺少优异的多特异性抗体制备方法。其构建方法主要有：化学方法、双杂交瘤融合法和基因重组法。化学方法大多采用二苯并氮杂环辛炔(DBCO)化学键合抗体多肽片段的端胺基(-NH2)，再利用DBCO上的炔基和叠氮功能化的纳米粒子点击反应，得到多特异性抗体纳米粒子。双杂交瘤融合法制备双特异性抗体，是采用细胞融合的方法将两株不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞株，然后通过杂交瘤筛选法克隆靶细胞，得到双特异性抗体。基因重组法是通过基因工程技术对传统的抗体进行基因工程方面的改造，形成多种形式的双/多特异性抗体。
现有的多特异性抗体构建方法固有缺陷较多，成本高，临床转化进展缓慢。通过化学方法制备多特异性抗体需要将抗体分子与纳米粒子通过在有机溶剂中化学键合，反应机制与纯化步骤复杂，改性过程容易导致抗体失活，且化学方法固定了抗体种类及比例，使多特异性抗体的临床应用受到限制；而双杂交瘤的遗传背景来源于亲代的两种杂交瘤细胞，必然要产生两种重链和两种轻链分子，这些轻重链的随机组合方式至少有十种，理论上只有轻重链同源配对，重链与重链异源配对这一种组合配对方式才能产生所需的双特异性抗体，因此这种制备方法随机性大，效率低，产品生产中的提纯、产品稳定性等问题也难以解决；基因重组的方法同样反应机制和纯化工艺复杂，产业化生产成本高，缺陷较多，成本高，临床转化进展缓慢。
所以，要发展新型的双/多特异性抗体药物，推动其临床发展，关键在于建立一种具有普适性的、简单高效的双/多特异性抗体制备方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种多肽及其制备方法、双特异性抗体及其应用，本发明利用该多肽制备双/多特异性抗体，反应条件温和，可最大程度保留单抗的活性；具有简单、高效、单抗比例可控、普适性强等特性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种多肽，具有式I所示的结构：
Figure BDA0003389140100000031
其中，R1为C2-C10的直链烷基、C3到C10的支链烷基或C6-C20的芳基；
R2为H或阳离子；
R3为结合Fc片段的多肽；
R4为H、C2-C10的直链酰基或C3-C10的支链酰基基团；
L1、L2独立地选自-CH2-或-CH2CH2-；
x为重复单元的含量，0<x<1；y为聚合度，10≤y≤500。
本发明式I所示的多肽以聚氨基酸为主链，由所述聚氨基酸的侧链羧基接枝对免疫球蛋白(抗体)恒定区(Fc)具有普遍高亲和力的多价Fc结合多肽(如Fc-III-4C多肽)制得。
一些实施方案中，R1为C3-C8的直链烷基、C5-C8的支链烷基或C8-C15的芳基；所述R2选自H、金属阳离子或有机阳离子；所述R3为Fc-III-4C、Fc-III或FcRM；所述R4选自H、乙酰基或丙酰基；所述x,y的取值范围为0<x<1，10≤y≤500。
一些实施方案中，R1为乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基、苯基、萘基、联苯基或蒽；所述R2选自H、钠离子、钾离子、铵离子或者带正电荷的氨基酸离子；所述R3为Fc-III-4C，其氨基酸序列为CDCAWHLGELVWCTC；x为重复单元的含量，0<x<1；y为聚合度，10≤y≤500；所述R4选自H、乙酰基或丙酰基。
一些实施方案中，所述多肽中R3为Fc-III-4C，其氨基酸序列为CDCAWHLGELVWCTC；x＝0.875，y＝120；其结构如式II所示：
Figure BDA0003389140100000041
一些实施方案中，所述多肽由聚氨基酸的侧链羧基接枝Fc-III-4C多肽制得，所述聚氨基酸为聚谷氨酸或聚天冬氨酸。
一些实施方案中，所述多肽由聚谷氨酸的侧链羧基接枝Fc-III-4C多肽制得，其中，R1为-(CH2)5CH3，x＝0.875，y＝120，R2为H离子，R4为乙酰基，L1与L2为-CH2CH2-。
一些实施方案中，所述PGLU与Fc-III-4C的摩尔比为120:15。
本发明还提供了所述的多肽在制备双/多特异性抗体中的应用。
本发明还提供一种双/多特异性抗体，包括本发明所述的多肽和含Fc片段的抗体，其中多肽上的R3与抗体的Fc片段相结合；所述抗体包括抗PD1、PD-L1、OX40、OX40L、CD16、4-1BB、EGFR、CD3、CD3ε、CD19、CD28、BCMA、MET、CD47、CTLA-4、EpCAM、CD20、TROP2、CD73、CD69、DNAM-1、NKG2D、CSF1R、TIGIT、CD40、CD80、CD86抗体中的至少一种。
一些具体实施例中，所述双/多特异性抗体为双特异性抗体，所述抗体包括αPD1和αOX40。本发明将其命名为PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb，所述Fc-III-4C、αPD1、αOX40的摩尔比为15:5:5。
本发明还提供了所述双/多特异性抗体的制备方法，包括：将所述多肽和抗体混合，4℃下孵育时间48h，获得所述所述双/多特异性抗体。
本发明还提供了所述的双/多特异性抗体在制备抗癌药物中的应用。
一些实施方案中，所述癌症包括鼻腔及鼻窦恶性肿瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、颅内肿瘤、甲状腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、乙状结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌与壶腹周围癌、胆道癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸恶性肿瘤、阴茎癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、纤维组织细胞癌、横纹肌肉癌、滑膜肉瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤中的一种或几种。
本发明还提供一种抗癌药物，包括所述双/特异性抗体和药学上可接受的辅料。
与现有技术相比，本发明提供了一种具有普适性的、简单方便的制备多特异性抗体的方法。本发明制备的多价Fc结合多肽PGLU-Fc-III-4C可以结合多种不同抗体，从而简单高效地制备多特异性抗体。本发明制备的双/多特异性抗体可以激活动物的适应性免疫，可用于癌症治疗、抗感染等领域，具有极高的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中得到的聚谷氨酸PGLU的核磁共振氢谱；
图2为本发明实施例2中得到的PGLU-Fc-III-4C多肽的核磁共振氢谱；
图3为本发明实施例2中得到的PGLU-Fc-III-4C多肽与实施例3中得到的PGLU-Fc-III-4C-IgG的粒径分布；
图4为发明实施例4中得到的PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb的粒径、发明实施例2中得到的PGLU-Fc-III-4C多肽的粒径、抗PD1抗体、抗OX40抗体及抗PD1抗体与抗OX40抗体混合物的粒径分布；
图5为实施例2中得到的PGLU-Fc-III-4C多肽与发明实施例4中得到的PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb的流式细胞分析结果；
图6为本发明实施例4中得到的PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb治疗CT26荷瘤小鼠后，治疗方案(A)、皮下荷瘤小鼠的肿瘤体积变化(B)、小鼠体重变化(C)及小鼠生存期(D)，图中Group I-IX依次指PBS、PGLU-Fc-III-4C、抗PD1抗体、抗OX40抗体、奥沙利铂(后文缩写为OXA)、抗PD1抗体+抗OX40抗体、PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb、OXA+抗PD1抗体+抗OX40抗体、OXA+PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb组；
图7为本发明实例4中得到的PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb治疗CT26荷瘤小鼠后小鼠肿瘤中CD8+T细胞(A)、CD4+T细胞(B)、MDSCs(C)、巨噬细胞M1/M2(D)、OX40+(E)、NK细胞(F)、DC细胞(G、H)的变化；
图8为本发明实例4中得到的PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb治疗CT26荷瘤小鼠后小鼠肿瘤中IFN-γ(A)、TFN-α(B)、IL-6(C)、IL-12(D)的变化。
具体实施方式
本发明提供了一种多肽及其制备方法、双特异性抗体及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
所述多肽具有式I所示的结构：
Figure BDA0003389140100000061
式(I)中，R1为C2-C10的直链烷基、C3-C10的支链烷基或C6-C20的芳基；优选为C3-C8的直链烷基、C5-C8的支链烷基或C8-C15的芳基；进一步优选为乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基、苯基、萘基、联苯基或蒽；
R2为H或者阳离子；优选为H、金属阳离子或有机阳离子；更优选为H、钠离子、钾离子、铵离子或者带正电荷的氨基酸离子；
R3为结合Fc片段的多肽，具体为Fc-III-4C、Fc-III或FcRM；优选为Fc-III-4C。本发明对于上述Fc-III-4C的来源不进行限定，市售或者本领域技术人员熟知的方法制备即可；优选可以按照CN 107556385A公开的方法制备，其氨基酸序列为CDCAWHLGELVWCTC。
R4为H、C2-C10的直链酰基或C3-C10的支链酰基基团；优选为H、乙酰基或丙酰基。
L1、L2独立的选自-CH2-或-CH2CH2-；
x为重复单元的含量，0<x<1；y为聚合度，10≤y≤500；一些具体实施例中，x＝0.875，y＝120，结构式如式II；
Figure BDA0003389140100000071
式II中，R1、R2、R4、L1、L2的选择同式I结构，在此不做赘述。
按照本发明，所述R1为C3-C8的直链烷基、C5-C8的支链烷基或C8-C15的芳基，更优选为正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基、苯基、萘基、联苯基或蒽。
所述R2优选为H、金属阳离子或有机阳离子，更优选为H、钠离子、钾离子、铵离子或者带正电荷的氨基酸离子。
所述R4为H、甲酰基、乙酰基、丙酰基或丁酰基，优选为乙酰基。
本发明对于上述Fc-III-4C的来源不进行限定，市售或者本领域技术人员熟知的方法制备即可；优选可以按照CN 107556385A公开的方法制备，其氨基酸序列为CDCAWHLGELVWCTC。
本发明提供了一种双/多特异性抗体，包含式I结构的多肽和，本文中命名为多价Fc结合多肽。一些具体实施方案中，所述多肽为PGLU-Fc-III-4C或PASP-Fc-III-4C。
所述双/多特异性抗体为包含PGLU-Fc-III-4C(或PASP-Fc-III-4C)和两种或多种不同比例的含Fc片段的抗体。由于PGLU-Fc-III-4C和PASP-Fc-III-4C多肽的Fc-III-4C对人免疫球蛋白IgG(包括抗体)的解离常数(Kd)仅为2.45nM，并不影响抗体活性，且抗体Fc片段具有高度保守性，所以PGLU-Fc-III-4C和PASP-Fc-III-4C多肽可以结合两种或多种不同比例的含Fc片段的抗体，制备双/多特异性抗体。
一些具体实施方案中，本发明提供的双特异性抗体包含PGLU-Fc-III-4C(或PASP-Fc-III-4C)，以及抗PD1抗体和抗OX40抗体。
程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)是免疫检查点阻断剂类抗体药物，是近年肿瘤免疫疗法研究的热点，OX40(又称CD134)是一种在活化的人T细胞上短暂表达的共刺激分子，在T细胞活化、扩增、分化、生成和维持记忆T细胞中起作用。临床数据表明将免疫检查点阻断剂与T细胞激动剂联合使用可有效治疗转移性疾病(癌症)，抗PD-1抗体和OX40抗体可以分别阻断T细胞抑制和诱导T细胞活化，当T细胞同时结合这两种抗体药物时，将获得最大的T细胞激活。但现阶段使用的将这两种抗体通过游离方式混合给药的方式治疗效果并不理想，并且出现了显著的自身免疫介导毒性。疗效不理想的原因是两种抗体可能并未同时与T细胞结合，或者是两种抗体依次与T细胞结合，单次或顺次的结合方式导致T细胞的活化、治疗效果及免疫记忆的形成均达不到理想效果。因此制备PD1/OX40双特异性抗体，可以诱导抗PD1抗体与抗OX40抗体同时聚集于T细胞表面，实现充分的免疫细胞激活，与抗PD1/抗OX40抗体组合相比，可以增强抗肿瘤效果。PD1/OX40双特异性抗体将发挥两种功能：通过PD1抑制恢复抗原特异性T细胞抗肿瘤效果，通过参与OX40激活进一步增强T细胞介导的抗肿瘤反应。此外，与抗OX40单抗相比，PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb可以降低OX40激活带来的全身毒性，改善安全性。因此本发明以PD1/OX40双特异性抗体相关实施例验证双/多特异性抗体制备方法的可行性及药物的有效性。
本发明开发了一种新的制备多特异性抗体的方法，包括上述技术方案所提供的抗体组合和其他可以应用的单克隆抗体药物。
本发明还提供了一种用于抑制肿瘤生长的制备抗体药物的方法，所述的对象为哺乳动物或所述哺乳动物的肿瘤细胞，所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。所述对象可以是罹患肿瘤的患者，或者为罹患肿瘤的患者的离体肿瘤细胞。基于此，本发明研究发现双特异性抗体药物起到了更加明显的肿瘤治疗效果。
按照本发明，更换抗体种类与组合后，所述肿瘤包括鼻腔及鼻窦恶性肿瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、颅内肿瘤、甲状腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、乙状结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌与壶腹周围癌、胆道癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸恶性肿瘤、阴茎癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、纤维组织细胞癌、横纹肌肉癌、滑膜肉瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤中的一种或几种。
本发明通过一系列体外实验，所制备的双特异性抗体粒径分布均匀，体内实验，发现在CT26模型上，PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb会明显抑制抑制肿瘤生长，提高荷瘤小鼠生存期，并对小鼠的体重没有太大的影响，减小了抗OX40抗体的体内毒性。本发明利用PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb，可显著诱导CD8+T细胞向肿瘤浸润并活化，提高药物治疗效果，为癌症的临床治疗提供了新的治疗思路和方案策略，具有很好的应用前景。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 制备聚(L-谷氨酸)均聚物(PGLU)
将γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体(BLG-NCA)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌溶解后加入1.0mL正己胺(n-HA)，密封，在温度为25℃的条件下，搅拌反应72h。然后加入乙酸酐反应6h，反应结束后，将得到的反应液沉降到2.0L的乙醚中，依次经过过滤和乙醚洗涤，在室温下真空干燥24h，得到中间产物聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)(PBLG)。
将10.0g上述制备的聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)用100mL二氯乙酸溶解，在搅拌的条件下，加入30mL质量含量为33％的溴化氢/冰醋酸溶液，在温度为30℃的条件下搅拌反应1h。之后，将得到的反应液沉降到1.0L的乙醚中，离心，所得沉淀用DMF复溶，再用去离子水透析，经冻干，得到聚(L-谷氨酸)均聚物(PGLU)。
对制备的聚(L-谷氨酸)均聚物进行核磁共振分析(如图1)，用氘代水为氘代试剂，结果表明，化学位移δ4.43ppm为主链上次甲基的信号峰，化学位移δ2.21ppm为侧基上与羰基相连的亚甲基的信号峰，化学位移δ1.91ppm和δ1.71ppm为侧基上与主链相连的亚甲基的信号峰。根据核磁计算，所得聚(L-谷氨酸)的聚合度为120。
实施例2：制备多价Fc结合多肽PGLU-Fc-III-4C
制备式(II)结构的多肽，其中，R1为-(CH2)5CH3，x＝0.875，y＝120，R2为H离子，R4为乙酰基，L1与L2为-CH2CH2-。
将聚(L-谷氨酸)均聚物(PGLU)与N，N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(N,N'-Disuccinimidyl carbonate)在无水条件下溶于DMF，加入三乙胺反应48h，再加入Fc-III-4C和三乙胺，30℃反应2h后，将反应物先用DMF透析12h，然后在pH 6.8-7.4之间(1MNaOH调节)的水中透析72h。产物冻干后以氘代水为溶剂对得到的PGLU-Fc-III-4C进行核磁共振分析，结果见图2，结果表明Fc-III-4C成功接枝到PGLU侧链，且合成过程可实现PGLU聚合度、Fc-III-4C结合多肽的结合度的精准可调。
实施例3：制备PGLU-Fc-III-4C-IgG
利用PGLU-Fc-III-4C上Fc-III-4C段对单克隆抗体(如PD1、OX40、IgG等)Fc区的高度亲和力，水溶液孵育条件下制备多特异性抗体PGLU-Fc-III-4C-MsAb。本发明先采取与IgG反应探索制备多特异性抗体的反应条件。利用动态光散射(Dynamic LightScattering，DLS)筛选粒径适中(50～100nm)、抗体结合效率高(＞95％)的孵育条件，针对不同种类的抗体组合摸索合适的制备工艺，建立普适性强的多特异性抗体制备策略。研究证明，纳米粒子粒径范围在8～200nm时，可以有效减少肾脏、肝脏和脾脏的清除。
对所得的PGLU-Fc-III-4C进行动态光散射分析，测定在水中形成的粒子的流体力学半径。图为实例2制备的PGLU-Fc-III-4C以浓度0.5mg/mL在水中的动态光散射结果，从图3中可以看出，该多价结合多肽的力学半径在20-90nm之间，粒径分布均匀。
对所得的PGLU-Fc-III-4C-IgG进行动态光散射分析，测定在水中形成的粒子的流体力学半径。图3为实例3制备的PGLU-Fc-III-4C-IgG以浓度0.5mg/mL在水中的动态光散射结果，从图中可以看出，该多价结合多肽的力学半径在40-110nm之间，粒径分布均匀。从与IgG的反应结果甄选出最佳制备条件：PGLU-Fc-III-4C：IgG为15：10，孵育时间为48h，反应温度为4℃。
实施例4：制备PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb
利用PGLU-Fc-III-4C上Fc-III-4C肽段对单克隆抗体(αPD1、αOX40)Fc区的高度亲和力，水溶液孵育条件下制备双特异性抗体PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb。反应条件：PGLU-Fc-III-4C：αPD1：αOX40为15：5：5，4℃下孵育时间48h。
对所得的PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb进行动态光散射分析，测定在水中形成的粒子的流体力学半径。图4为实例4制备的PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb以浓度0.5mg/mL在水中的动态光散射结果，从图中可以看出，该多价结合多肽的力学半径在100～300nm之间。
验证制备的PGLU-Fc-III-4C是否同时连接上了两种单克隆抗体，将PerCP-Cy5.5标记的OX40抗体与BV421标记的PD1抗体与PGLU-Fc-III-4C共孵育48h，然后用流式细胞术检测了双色荧光，采集的数据通过FlowjoTM10进行分析，结果见图5。从图5看出，PGLU-Fc-III-4C同时结合了两种抗体，并且没有PGLU-Fc-III-4C残留。
实施例5：PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb在CT26肿瘤模型的治疗效果
体内抑瘤效果评价：选取BALB/c小鼠(6周，体重20g左右，54只)为实验动物，皮下注射小鼠结肠癌细胞(CT26)构建结肠癌肿瘤模型，待肿瘤长至80-100mm3时，分为9组，I-IX组依次分别为PBS组，PGLU-Fc-III-4C组，αPD1组，αOX40组，OXA组，αPD1+αOX40组，PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb，OXA+αPD1+αOX40组，OXA+PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb组，并记为第0天，在第1天以3mg/kg的计量腹腔注射奥沙利铂(Oxaliplatin，图文中缩写为OXA)，在第3天和第5天通过尾静脉注射αPD1、αOX40、αPD1+αOX40或PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb等抗体药物，给药剂量为50μg/dose，每周量瘤3次监测肿瘤体积和体重变化，直至第40天观察结束，以此评估药物的靶向能力与治疗肿瘤的能力，评价抑瘤效果。肿瘤体积通过以下公式进行计算：
小鼠肿瘤体积计算公式：V＝(a×b2)/2
肿瘤抑制率(TSR,％)＝[(Ac-Ax)/Ac]×100％
其中a是肿瘤长径，b是肿瘤短径；Ac是对照组平均肿瘤体积，Ax是治疗组平均肿瘤体积。
如图6(B)所示，与对照组(PBS，Group I)相比，治疗组静脉注射PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb(Group IX)能有效的抑制肿瘤生长，治疗结束时，联合组的肿瘤抑制率(TSR％)为88.07％，高于将两种单克隆抗体混合(OXA+αPD1+αOX40，Group VIII)的肿瘤抑制率73.76％，是以静脉注射PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BSAb具有更好的治疗效果，这表明纳米粒子可以提高两种抗体协同杀伤肿瘤细胞的能力。
在治疗的初始阶段，如图6(C)，实验治疗组OXA+αPD1+αOX40与OXA+PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb组均出现了较为明显的体重下降，这是由于奥沙利铂的毒性所致，在第5天后，OXA+PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb治疗组体重恢复正常并上涨10％左右，而OXA+αPD1+αOX40组体重仍旧较低，毒性主要来自于αOX40。这种差异表明，将αPD1与αOX40组合到结合多肽上所制备的双特异性抗体可以减轻αOX40的毒性。
图6(D)为小鼠存活曲线：与对照组相比，实验组的存活时间显著延长，40天后，OXA+PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BaAb组的生存率是66.67％，而其他对照组的存活率均为20％以下，证明PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb药物可有效延长原发性结肠癌CT26模型荷瘤小鼠的生存期。
鉴于抑瘤效果提升和小鼠耐受良好的情况，PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb最终显著延长了小鼠的生存期，具有较低的毒副作用，且具有显著的抑瘤能力，因此更利于肿瘤治疗。
实施例6：流式细胞术分析PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb的抗肿瘤机制
皮下CT26肿瘤模型、荷瘤鼠分组、药物给药方式与实施例3相同。治疗第3天，处死小鼠，以注射器研磨肿瘤与脾脏处理，得到单分散的细胞。以荧光标记PD1、OX40、CD3、CD4、CD49b、CD11c、CD80、CD206直接标记单细胞，以流式细胞仪检测并分析瘤内组织中细胞毒性T淋巴细胞(CD8+T细胞、CD4+T细胞)、OX40+表达的细胞、髓系来源巨噬细胞(myeloid-derived suppressorcell,MDSC)、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、树突状细胞(dendritic cell，DC)的情况，结果见图7。
通过流式细胞术分析双特异性抗体抑制肿瘤生长的机制，CD8+T细胞可以通过释放穿孔蛋白和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而CD4+T细胞可以表达共刺激标志物，如CD40L，这提供了更强的APC激活和更持久的肿瘤控制。在荷瘤小鼠的肿瘤组织中，CD4+T细胞和CD8+T细胞均上调，证明在免疫反应中T细胞起到了杀伤肿瘤的作用。MDSCs是一群异质性的细胞群体，包括髓系细胞前体、未成熟粒细胞、单核细胞和树突状细胞。MDSC既能通过抑制NK、巨噬细胞的抗肿瘤作用而抑制固有免疫反应，又能通过阻断CD4+/CD8+T细胞的活化、诱导产生Treg等机制抑制适应性免疫反应，在本实验中实验组MDSCs细胞数量下调。巨噬细胞是血液中的单核细胞，在肿瘤细胞、间质细胞及免疫细胞分泌的趋化因子的作用下，被募集到肿瘤细胞周围，分化成为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)。TAM是肿瘤免疫微环境中数量最多的一类免疫细胞，存在于肿瘤发展的各个阶段，根据巨噬细胞平衡假说，M1型TAM发挥抗肿瘤作用，M2型促进肿瘤细胞的侵袭转移，本实验中M1/M2实验组上调。NK细胞是来源于骨髓的CD3-CD56+淋巴细胞群，是抗肿瘤固有免疫的主要细胞类型，具有识别溶解肿瘤细胞、产生免疫调节性细胞因子的功能，肿瘤组织中的NK细胞大多数为CD56brightCD16NK细胞亚群，该亚群通过分泌IL-12等多种细胞因子参与抗肿瘤免疫调控，本实验中NK细胞实验组数量明显增多。DC细胞主要通过与淋巴细胞CD4+CTL，CD8+CTL相互作用，发挥抗肿瘤效应，成熟DC细胞高表达的MHC分子与抗原结合后，可以直接将抗原提呈给CD8+的T细胞，诱导细胞杀伤反应，另一方面DC细胞可以促进CD8+T细胞的增殖和分化，也可分化为Th1或Th2细胞从而引发相应的免疫应答。DC细胞会分泌IL-12，与Th表面的IL-12受体结合，促进Th0细胞向Th1细胞方向分化，同时并分泌IFN-γ，IFN-γ又可反向作用于DC细胞，促进IL-12的分泌。这种正反馈机制可使机体在短时间产生强大的抗肿瘤免疫应答。DC细胞还可以产生多种细胞因子如IL-6，TFN-α及IFN-γ等调节免疫应答。DC细胞还能激活穿孔素P-颗粒酶B和Fas-FasL介导的途径，增强NK细胞的细胞毒作用，DC细胞通过分泌如IL-12，IFN-γ等血管抑制因子，影响肿瘤血管的形成，从而抑制肿瘤细胞的生长，本实验中实验组DC细胞数量增多。
综上，本实验中治疗组IX与对照组相比，MDSCs下调(图7-C)，M1/M2比例上调(图7-D)，表达OX40的细胞(图7-E)、NK细胞(图7-F)和DC(图7-G～H)细胞数量均上调，可证明小鼠的适应性免疫得到了激活，起到了杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的作用。
实施例7：酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb的抗肿瘤机制
皮下CT26肿瘤模型建立、荷瘤鼠分组、药物给药方式与实施例3相同。治疗第3天，处死小鼠，加入PBS并以注射器研磨肿瘤，制备肿瘤基质液，以ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-12的水平，结果见图8A～D。
细胞因子分析显示，经过本发明制备的双特异性抗体PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb处理后，IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-12均有上调，IFN-γ、TNF-α由DC细胞分泌，可抑制肿瘤血管的形成，并且TNF-α还具有杀死或抑制肿瘤细胞增殖的作用，对机体的免疫功能具有调节能力，可提高T细胞及其他杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。IL-6可促进T细胞增殖，IL-12在Th1免疫反应中起关键作用，也能激活NK细胞，被称为NK细胞刺激因子。这些细胞因子在抑制肿瘤生长的过程中起到了重要作用。
综上，PGLU-Fc-III-4C-(αPD1+αOX40)-BsAb药物可以诱导适应性免疫的激活，抑制小鼠结肠肿瘤的生长与发展，并延长了荷瘤小鼠的生存期。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种多肽，其特征在于，具有式(I)所示的结构：
Figure FDA0003895751850000011
其中，R1为C2-C10的直链烷基、C3-C10的支链烷基或C6-C20的芳基；
R2为H或阳离子；
R3为Fc-III-4C；
R4为H、C2-C10的直链酰基或C3-C10的支链酰基基团；
L1、L2独立地选自-CH2-或-CH2CH2-；
x为重复单元的含量，0<x<1；y为聚合度，10≤y≤500。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，R1为C3-C8的直链烷基、C5-C8的支链烷基或C8-C15的芳基；所述R2选自H、金属阳离子或有机阳离子；所述R4选自H、乙酰基或丙酰基；所述x,y的取值范围为0<x<1，10≤y≤500。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，R1为乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基、苯基、萘基、联苯基或蒽；所述R2选自H、钠离子、钾离子、铵离子或者带正电荷的氨基酸离子；所述R3为Fc-III-4C，其氨基酸序列为CDCAWHLGELVWCTC；所述R4为乙酰基；所述x,y的取值范围为0<x<1，10≤y≤500。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述R3为Fc-III-4C，其氨基酸序列为CDCAWHLGELVWCTC；x＝0.875，y＝120；其结构如式II所示：
Figure FDA0003895751850000021
5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其由聚氨基酸的侧链羧基接枝Fc-III-4C多肽制得；所述聚氨基酸为聚谷氨酸或聚天冬氨酸。
6.根据权利要求5所述的多肽，其特征在于，其由聚谷氨酸的侧链羧基接枝Fc-III-4C多肽制得；其中，所述R1为-(CH2)5CH3，x＝0.875，y＝120，R2为H离子，R4为乙酰基，L1为-CH2CH2-。
7.权利要求1～6任一项所述的多肽在制备双/多特异性抗体中的应用。
8.一种双/多特异性抗体，其特征在于，包括权利要求1～6任一项所述的多肽和含Fc片段的抗体，其中多肽上的R3与抗体的Fc片段相结合；所述抗体包括抗PD1、PD-L1、OX40、OX40L、CD16、4-1BB、EGFR、CD3、CD3ε、CD19、CD28、BCMA、MET、CD47、CTLA-4、EpCAM、CD20、TROP2、CD73、CD69、DNAM-1、NKG2D、CSF1R、TIGIT、CD40、CD80、CD86抗体中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的双/多特异性抗体，其特征在于，所述抗体包括抗PD1抗体(αPD1)和抗OX40抗体(αOX40)，所述Fc-III-4C、αPD1、αOX40的摩尔比为15:5:5。
10.权利要求8或9所述的双/特异性抗体的制备方法，其特征在于，将所述多肽和抗体混合，4℃下孵育时间6-72小时。
11.权利要求8或9所述的双/多特异性抗体在制备抗癌药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述癌症包括鼻腔及鼻窦恶性肿瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、颅内肿瘤、甲状腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、乙状结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌与壶腹周围癌、胆道癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸恶性肿瘤、阴茎癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、纤维组织细胞癌、横纹肌肉癌、滑膜肉瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤中的一种或几种。
13.一种抗癌药物，其特征在于，包括权利要求8或9所述的双/多特异性抗体和药学上可接受的辅料。
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