KR20190090005A - Cd127에 대해 지시된 항체 및 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD127, IL7 수용체의 알파 쇄를 표적화하는 치료학적 및 진단학적 적용에 유용한 항체의 분야에 있으며, 특히 CD127, 특히 사람 CD127에 대한 사람화된 모노클로날 항체, 이의 치료학적 용도, 및 진단학적 적용을 제공한다.

Description

CD127에 대해 지시된 항체 및 폴리펩타이드
[1] 본 발명은 CD 127을 표적화(targeting)하는 치료학적 및 진단제 적용에 유용한 폴리펩타이드 또는 항체, IL7 수용체의 알파 쇄의 분야 내에 있으며, 특히, CD 127, 특히 사람 CD 127에 대한 사람화된 모노클로날 항체, 이의 치료학적 용도, 및 진단제 적용을 제공한다.
발명의 간단한 설명
[2] 인터루킨 7(IL-7)에 대한 수용체의 알파 쇄(또는 소단위(subunit))는 CD 127 또는 p90 IL-7R 또는 IL-7R알파 또는 IL-7Rα(때때로 또한 IL-7Rα로 언급됨)로 지정되어 있다. 특수한 국면에서, 본원에 제공된 항체, 특히 모노클로날 항체(monoclonal antibody)는 사람 세포에서 발현된 사람 IL-7에 대한 수용체의 알파 쇄에 대해 지시된다. 특수한 국면에서, 본원에 제공된 항체는 IL-7-IL-7R 상호작용에 대해 길항제 활성을 가지며, CD 127 양성 세포에 대해 세포독성 활성을 나타낼 수 있으나 TSLP에 의해 유도된 수지 세포(DC)의 성숙을 증가시키지 않는다. 특히, 본원에 제공된 항체는 CD127의 2b 부위로부터의 서열을 포함하는 사람 CD 127 에피토프를 인식하며, 특히 에피토프는 도메인 D1 및 CD 127의 2b 부위의 사람 CD 127 서열을 포함하고, 특히 에피토프는 D1으로부터의 적어도 하나의 서열 및 2b 부위로부터, 바람직하게는 CD 127의 2b 부위의 제3 베타 쉬이트(sheet)로부터의 적어도 하나의 서열을 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 특수한 국면에서, 본원에 제공된 항체는 CD 127의 내재화를 유도하지 않고/않거나 CD127의 IL7-유도된 내재화를 억제하지 않는다. 특수한 국면에서, 본원에 제공된 항체는 사람화되고 사람 잔기의 적어도 80% 및 바람직하게는 적어도 84%, 또는 적어도 85%를 포함한다. 특수한 국면에서, 본원에 제공된 항체는 효과기(effector) 기억 T 세포에 대한 신속한 효과, 효과기 기억 T 세포에 대한 장기-지속 효과, 또는, 바람직하게는, 효과기 기억 T 세포에 대한 신속한 및 장기 지속 효과를 갖는다. 특수한 국면에서, 본원에 제공된 항체는 효율적인 생산을 허용한다. 특수한 국면에서, CD 127, IL-7 및/또는 TSLP의 발현 수준은 특히 본원에 제공된 항-CD 127 항체를 사용하여 반응의 경향성을 평가하기 위해 측정될 수 있다. 항체 외에, 특히 항체의 생산 및/또는 상기 항체와 유사한 용도를 위한 도구로서, 폴리펩타이드, 특히 항체 경쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄, 항원-결합 단편 및 이러한 항체 및 폴리뉴클레오타이드로부터의 항체 모사체 분자(antibody mimetic molecule)가 본원에 제공된다.
[3] 본 발명자들은 제WO 2015/189302호에 개시된 N13B2-hl, N13B2-h2 및 N13B2-h3 항체와 비교한 경우 개선된 사람화된 항체를 수득하기 위해 노력하여 왔다. 베르니에 구역(Vernier zone)내 잔기, 기본형(canonical residue), VH/VL 계면에서의 잔기 등을 포함하는 가변 도메인 골격 서열내 일부 잔기는 항체의 구조에 중요하며 항체의 생화학적 및 생물학적 활성을 보존하기 위하여 돌연변이되지 않아야 하는 것으로 알려져 있지만, 본 발명자들은 놀랍게도 이러한 중요한 잔기 중 일부를 포함하는, N13B2의 경쇄 가변 도메인 골격 서열내 일부 돌연변이가 증가하는 사람 잔기 함량(N13B2-h3 보다 더 높은 및 86.3% 이하) 및 모든 기능적 특징을 보존하면서 개선된 생산(N13B2-h3와 비교하여 4배까지)을 허용함을 발견하였다.
[4] 이러한 돌연변이는 N13B2의 경쇄 가변 도메인 골격 서열내 16개의 아미노산 치환 및 특히 추가로 48번 위치에서 발린 잔기의 루이신 잔기(V48L)에 의한 치환 및/또는 87번 위치에서 페닐알라닌 잔기의 타이로신 잔기(F87Y)에 의한 치환으로 이루어진다. 본원에 제공된 항체 쇄와 함께 이러한 위치, 및 임의의 아미노산 위치는, 달리 기술하지 않는 한, 카밧 번호매김(Kabat numbering)을 사용하여 제공된다. 다음의 서열로 이루어진 개선된 항체 경쇄 가변 도메인이 본원에 제공된다:
- 서열 번호: 9(상기 16개의 아미노산 치환 포함 - 상기 항체 경쇄 가변 도메인은 이후에 N13B2-hVL3로 지정된다);
- 서열 번호: 10(상기 16개의 아미노산 치환 및 추가로 돌연변이 V48L 포함 - 상기 항체 경쇄 가변 도메인은 이후에 N13B2-hVL4로 지정된다);
- 서열 번호: 11(상기 16개의 아미노산 치환 및 추가로 돌연변이 F87Y 포함 - 상기 항체 경쇄 가변 도메인은 이후에 N13B2-hVL5로 지정된다); 및
- 서열 번호: 12(상기 16개의 아미노산 치환 및 추가로 V48L 및 F87Y 둘 다를 포함 - 상기 항체 경쇄 가변 도메인은 이후에 N13B2-hVL6으로 지정된다).
[5] 따라서, 본원에 지정된 항체 경쇄 가변 도메인, N13B2-hVL3은 N13B2-h3의 CDR, 상기 16개의 아미노산 치환 및 사람 골격 서열내 중요한 48번 및 87번 위치에서 N13B2의 원래의 잔기(즉, 각각, V 및 F)를 포함하며 서열 번호: 9의 서열을 갖는다. 또한 돌연변이 V48L 및 F87Y 둘 다를 포함하는, N13B2-hVL6로 지정된 본원에 제공된 바람직한 개선된 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열 번호: 12에 제시된 서열로 이루어진다.
[6] 숙련가는 특히 경쇄 가변 도메인의 골격내 이러한 위치에서, 상기 돌연변이가 영향받지 않은 CD 127을 지닌 항체의 친화성을 남길 수 있음을 예측할 수 없었다: V48은 기본형 잔기이고 F87은 VH/VL 계면에 위치하며; 숙련가에게 알려져 있고 예컨대, Clark, 2014에 논의된 바와 같이, 이러한 잔기의 돌연변이는 항체의 친화성 및/또는 안정성에 영향을 미치는 것으로 예측된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "기본형" 잔기는 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901- 907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992)에 의해 정의된 바와 같은 특수한 기본형 CDR 구조를 정의하는 CDR 또는 골격내 잔기를 지칭한다. 초티아(Chothia) 등에 따라서, 많은 항체의 CDR의 주요 부위는 아미노산 서열의 수준에서 큰 다양성에도 불구하고 거의 동일한 펩타이드 골격 구조를 갖는다. 각각의 기본형 구조는 루프(loop)를 형성하는 아미노산 잔기의 연속된 분절에 대한 펩타이드 백본 기울림각(backbone torsion angle)의 세트를 주로 규정한다. 위치 둘 다에서 개시된 돌연변이의 도입이 항체의 결합 특징 및 유리하게는 다른 기능적 특징을 여전히 보존하면서, 개선된 생산을 야기할 수 있다는 것은 예견할 수 없었다.
[7] 따라서, 이러한 항체, 특히 서열 번호 : 9; 서열 번호 : 10; 또는 서열 번호 : 11 ; 또는 서열 번호 : 12에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 특히 250개 이하의 아미노산의 서열로 이루어진, 항체 경쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄, 또는 이후 정의된 바와 같은 항원-결합 단편 또는 이의 항체 모사체 분자의 생산에 특히 유용한 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 특수한 국면에서, 본 발명은 CD 127, 특히 사람 CD 127에 특이적으로 결합하고, 다음을 포함하는, 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 특히 사람화된 모노클로날 항체에 관한 것이다:
- 서열 번호: 9; 서열 번호: 10; 서열 번호: 11 ; 서열 번호: 12; 특히 서열 번호: 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 항체 경쇄 또는 이로 이루어진 항체 경쇄 가변 도메인; 및
- 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3에 제시된 서열로 이루어진 3개의 CDR을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인, 특히 서열 번호: 7에 제시된 서열로 이루어진 항체 중쇄 가변 도메인.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 CD 127, 특히 사람 CD 127에 특이적으로 결합하고 다음을 포함하는, 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 특히 사람화된 모노클로날 항체에 관한 것이다:
- 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 및 서열 번호: 12, 특히 서열 번호: 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인; 및
- 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3에 제시된 서열로 이루어진 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 특히 서열 번호: 7에 제시된 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인.
[8] 특수한 국면에서, 본원에 제공된 항체는 상기와 같은 가변 도메인 및 서열 번호: 27 또는 28, 바람직하게는 서열 번호: 27 중에서 선택된 서열로 이루어진 불변 도메인을 지닌 경쇄 및 상기와 같은 가변 도메인 및 서열 번호: 26에 제시된 서열로 이루어진 불변 도메인을 지닌 중쇄를 포함한다.
[9] 또한, 250개 이하의 아미노산, 특히 217개 이하, 214개 이하, 211개 이하, 보다 특히 200개 이하, 175개 이하, 150개 이하, 135개 이하, 120개 이하, 107개 이하 및 심지어 보다 특히 100개 이하, 90개 이하, 80개 이하, 74개 이하, 70개 이하, 60개 이하의 아미노산의 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드가 본원에 제공되고, 여기서 상기 서열은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
- 서열 번호: 9(사람 골격 서열 내 N13B2-h3의 CDR);
- 서열 번호: 10(V48L 돌연변이를 포함하는, 사람 골격 서열 내 N13B2-h3의 CDR);
- 서열 번호: 11(F87Y 돌연변이를 포함하는, 사람 골격 서열 내 N13B2-h3의 CDR);
- 서열 번호: 12(V48L 및 F87Y 돌연변이 둘 다를 포함하는 사람 골격 서열 내 N13B2-h3의 CDR); 및
- 이의 항원-결합 단편, 특히 상기 단편은 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6에 제시된 서열로 이루어진 3개의 CDR을 포함하고, 보다 특히 단편은 서열 번호: 12의 아미노산 24 내지 97번으로 이루어진 적어도 74개의 아미노산을 포함한다.
[10] 본원에 제공된 폴리펩타이드, 특히 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 9 내지 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 특히 폴리펩타이드를 암호화하고, 또한 서열 번호: 1 내지 3, 특히 서열 번호: 7 중에서 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하며, 또한 서열 번호 26 내지 28로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 특히, 상기 폴리뉴클레오타이드는 적어도 2개의 단리된 핵산 서열(분자)의 조합을 포함하거나 이로 이루어지며, 첫번째의 단리된 핵산 분자는 서열 번호: 15 내지 18; 특히 서열 번호: 18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 상기 조합은 또한 서열 번호: 13 및 서열 번호: 29 내지 31, 특히 서열 번호: 13으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2의 단리된 핵산 분자를 포함하거나 이로 이루어진다.
[11] 특히, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 항체 경쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄를 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 사람 잔기의 적어도 84% 및 보다 특히 적어도 85%를 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 본원에 개시된 항체로부터의 항원-결합 단편 및/또는 항체-모사체 분자일 수 있다.
[12] 상기 폴리펩타이드, 특히 항체 경쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄, 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자를 포함하는 조성물, 상기 항체의 수득 방법, 상기 폴리펩타이드 및 항체를 암호화하는 핵산 분자 및 상기 폴리펩타이드, 항체 및 조성물의 용도가 또한 본원에 제공된다.
[13] 따라서, 본원에 제공된 폴리펩타이드, 항체 경쇄 가변 도메인, 항체 경쇄, 항체, 항원-결합 단편, 항체 모사체 분자 및 조성물은 특히 성숙에 있어서의 증가, 보다 정밀하게는 수지 세포의 공자극성 분자의 상향조절이 요구되지 않는 경우에, IL-7 신호전달 경로가 림프구생성과 관련된 발병에 대한 기여를 제공하는 경우, 상기 발병으로부터 야기되는 사람 환자에서 진단된 상태에 대해 치료하기 위해 사용하는 것으로 의도되고/되거나 적합할 수 있다.
발명의 상세한 설명
생화학(Biochemistry)
[14] CD127은 IL-7 수용체(IL-7R) 및 TSLP 수용체(TSLPR)에 대해 일반적이다. IL-7R은 CD 127의 이종이량체 및 인터루킨 수용체의 일반적인 감마 쇄(γc)로 구성된다. 일반적인 감마 쇄 γc는 때때로 본원에서 및 문헌에서 CD 132로 지칭된다. IL-7R은 인터루킨 7에 의해 결합된다. TSLP 수용체는 CD 127 및 사이토킨 수용체-유사 인자 2(CRLF2)의 이종이량체이다. TSLP 수용체는 TSLP에 의해 결합된다. 문헌에서, TSLPR은 때때로 수용체의 CRLF2 쇄 및 CD127/CRLF2 복합체 둘 다를 지정하기 위해 사용된다. 혼란을 피하기 위하여, TSLPR 다음에 오는 것은 대개 복합체를 지정한다.
[15] CD127(Swiss Prot 수탁 번호 P16871)은 4개의 동형으로 존재할 수 있다. H20(Swiss Prot PI 6871.1)로 또한 명명된 기본형 동형은 단일-통과(single-pass) 막관통 단백질이며 N-으로부터 C-말단까지, 20개의 아미노산 시그날 펩타이드, 219개의 아미노산 세포외 도메인, 25개의 아미노산 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 195개의 아미노산 세포내 도메인으로 이루어진 459개의 아미노산을 갖는다. 다른 동형은 H20의 세포외 도메인 중 모두(또는 대부분)의 서열을 공유하며 다양한 C-말단 서열을 나타낸다. 동형 2 및 4는 분비되나(Swiss Prot P16871-4 및 P16871 -3), 동형 3(Swiss Prot PI 6871-2)은 또한 막관통 단백질이다. CD 127은 서열 번호: 21의 서열, 및 이의 세포외 도메인을 갖는 것으로 보고되어 있으며, 시그날 펩타이드가 제거되는 경우, 서열 번호: 22의 서열을 갖는다. 달리 기술하지 않는 한, CD127의 아미노산에 대해 본원에 사용된 번호매김은 서열 번호: 22로부터의 번호매김이다.
[16] CD 127은 사이토킨 수용체 상동성 부류 I(CRH I) 수용체이다. 당해 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, 이러한 수용체의 세포외 도메인은 D1 및 D2로 명명된 2개의 피브로넥틴 3 도메인으로 이루어진다. CD 127의 정밀한 결정학상 구조는 예컨대, McElroy et al., 2009; McElroy et al., 2012 및 Walsh, 2012에 공개되고 논의되어 있으며 특히 수탁 번호 3UP1과 함께, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank(RCSB PDB) 데이타베이스에 개시되어 왔다. D1은 일반적으로 IL-7과의 결합에 관여하는 것으로 고려되는 반면, D2는 γc 쇄(및 또한 IL-7과의)에 대한 결합에 관여하는 것으로 고려되고 있다. 중요하게도, 도메인 D2의 부위 2b는 다음의 서열을 포함하는 3개의 베타 쉬이트를 포함한다: 서열 번호: 32 (FDLSVIYRE); 서열 번호: 33 (NDFWTFNTS) 및 서열 번호: 34 (TKLTLLQR). 도메인 D2의 부위 2b는 따라서 서열 번호: 22의 아미노산 109번과 180번 사이에 포함된다(참고: Walsh, 2012; Verstraete, K. et al., Nature Com 2017). 도메인 D2의 부위 2b는 또한 서열 번호: 22의 아미노산 109번과 173번 사이에 포함되는 것으로 정의될 수 있다. 도메인 D2의 부위 2b는 또한 서열 번호: 22의 아미노산 113번과 180번 사이에 포함되는 것으로 정의될 수 있다. 도메인 2b의 부위 2b는 또한 서열 번호: 22의 아미노산 113번과 173번 사이에 포함되는 것으로 정의될 수 있다. 특히, 도메인 D2의 부위 2b는 서열 번호: 22의 아미노산 109 내지 133번, 특히 109 내지 127번(여기서 첫번째 2개의 베타 쉬이트가 국재화되어 있다); 및 서열 번호: 22의 아미노산 166 내지 180번(여기서 세번째 베타 쉬이트가 국재화되어 있다)을 포함하고, 특히 이로 필수적으로 이루어진다. 보다 특히, 2b 부위는 서열 번호: 22의 아미노산 113 내지 133번, 특히 113 내지 127번 및 서열 번호: 22의 아미노산 166 내지 180으로 필수적으로 이루어진다. 보다 특히, 2b 부위는 서열 번호: 22의 아미노산 109 내지 133번, 특히 109 내지 127번 및 서열 번호:22의 아미노산 166 내지 173번으로 필수적으로 이루어진다. 보다 특히, 2b 부위는 서열 번호:22의 아미노산 113 내지 133번, 특히 113 내지 127번 및 서열 번호:22의 아미노산 166 내지 173번으로 필수적으로 이루어진다. 도메인 D2의 부위 b2는 CD127-γc 상호작용에 중요하며, 특히 IL-7의 존재하에서 CD 127과 γc의 결합을 허용하거나 이를 증가시킨다. 특히, 중증 복합형 면역부전증(Severe combined immunodeficiency: SCID)을 앓는 환자에서 확인된 P112 및 L115에서의 돌연변이는 이들의 발병 특징을 야기하는 경향이 있는 D2 도메인의 소수성 코어를 탈안정화시키는 것으로 고려된다. 상기한 바와 같이, 2b 부위는 서열 번호: 22의 아미노산 109 내지 180번으로 필수적으로 이루어지거나, 서열 번호: 22의 아미노산 109 내지 173번으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 서열 번호: 22의 아미노산 113 내지 180번으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 서열 번호: 22의 아미노산 113 내지 173번으로 필수적으로 이루어진다. 숙련가는 이러한 도메인의 첨단(extremity)이 단일-염기 정밀성으로 분명하게 필수적으로 정의될 수 없고 2b 부위가 언급한 서열(들)의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 1, 2, 또는 3개 이상 또는 미만의 아미노산을 포함하도록 이해될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본원에서 CD127의 2b 부위를 지칭하는 경우, 이는 서열 번호: 22의 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 또는 113번 위치에서 출발하여 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 또는 180번 위치에서 끝나는 CD 127의 서열; 특히 IL-7의 존재하에서, 특히 IL7-R의 γc 쇄와 필수적인 결합 부위를 구성하는 것으로 고려되거나 밝혀진 이러한 서열을 지칭함을 이해하여야 한다. 보다 특히, 본원에서 CD127의 2b 부위를 지칭하는 경우, 이는 서열 번호: 22의 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112번 또는 113번 위치에서 출발하여 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 또는 133번에서 끝나는 CD 127의 서열 뿐만 아니라 서열 번호: 22의 162, 163, 164, 165 또는 166번에서 출발하여 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 또는 180번 위치에서 끝나는 CD 127의 서열을 지칭하는 것으로 이해하여야 한다. 본원에 정의한 바와 같은 3개의 베타 쉬이트는 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체에 대해 특이적인 에피토프 서열(epitope sequence)을 포함할 수 있음에 주목하여야 한다. 본 발명에 따른 항체, 항원-결합 단편 및 항원-결합 모사체는 서열 번호: 32, 서열 번호: 33 및/또는 서열 번호: 34에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 적어도 하나의 베타 쉬이트의 부위를 포함하는 아미노산 서열 및 임의의 베타 쉬이트 중 하나의 말단에 국재화된 일부 연속된 아미노산은 또한 본 발명에 따른 항체에 대해 특이적인 에피토프 서열일 수 있다. 예로서, 서열 번호: 35(TLLQRKLQPAAMYEI)의 서열은 세번째 베터 쉬이트의 마지막 5개의 아미노산 및 세번째 베타 쉬이트 밖에 국재화된 10개의 가외의(extra) 아미노산을 포함한다. 다른 예로서, 서열 번호: 96(RKLQPAAM)은 세번째 베타 쉬이트 내에 국재화된 하나의 아미노산 및 세번째 베타 쉬이트 밖에 국재화된 7개의 가외의 아미노산을 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 22의 R173에 특이적으로 결합할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 32; 서열 번호: 33; 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 96으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 36(LVEVKCLNFR); 서열 번호: 37(ICGALVEVKCLNFR) 및 서열 번호: 38(LVEVKCLNFRK)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 대안적으로 또는 상보적으로, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 39(K FLLIG); 서열 번호: 40(KKFLLIGKSNI) 및 서열 번호: 41(FIETKKFLLIG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 서열 번호: 36 내지 서열 번호: 41은 CD 127의 도메인 D1 내에 국재화되며 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자에 의해 인식된 에피토프 서열이다. 본 발명의 대안적인 또는 상보적인 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자는 서열 번호: 42(CLNFR) 및 서열 번호: 43(FIETKKF)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 2개의 서열은 CD127의 도메인 D1 내에 국재화된 에피토프 서열이다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 서열 번호: 32; 서열 번호: 33; 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 96으로 이루어진 그룹으로부터, 특히 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 96으로부터 선택된 적어도 하나의 서열; 및 서열 번호: 36; 서열 번호: 37; 서열 번호: 38; 서열 번호: 39; 서열 번호: 40; 서열 번호: 41 ; 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43으로 이루어진 그룹으로부터, 특히 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호 34 및 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43, 특히 서열 번호: 42 및, 서열 번호: 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 35 및 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43, 특히 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 96 및, 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43, 특히 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 35 및 서열 번호: 96의 둘 다의 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43의 서열 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 CD127의 도메인 D2의 부위 2b의 적어도 세번째의 베타 쉬이트를 특이적으로 인식할 수 있다. 세번째 베타 쉬이트는 우선적으로 서열 번호: 34에 상응하는, 서열 번호: 22의 아미노산 166 내지 173 사이에 국재화하는 것으로 정의되며 보다 특히 세번째 베타는 서열 번호: 34에 상응한다. 본 발명의 보다 특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 도메인 D2의 부위 2b 내에 국재화된 베타 쉬이트 중 적어도 2개를 특이적으로 인식할 수 있으며, 보다 특히, 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 본원의 상기에 정의된 바와 같은 도메인 D2의 부위 2b 내에 국재화된 3개의 베타 쉬이트를 특이적으로 인식할 수 있다. 본 발명의 보다 특수한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 도메인 D2의 부위 2b 내에 국재화된 적어도 하나의 베타 쉬이트, 특히 서열 번호: 34에 상응하는 세번째 베타 쉬이트를 특이적으로 인식할 수 있으며, 서열 번호: 36; 서열 번호: 37; 서열 번호: 38; 서열 번호: 39; 서열 번호: 40; 서열 번호: 41; 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열에 결합한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 34에 상응하는 적어도 세번째 베타 쉬이트를 특이적으로 인식할 수 있으며, 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43, 특히 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 특이적으로 인식할 수 있다. 본 발명의 보다 특수한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 35의 아미노산으로 이루어진 선형 펩타이드 또는 선형 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있다. 대안적으로 또는 상보적으로, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 96의 서열의 아미노산으로 이루어진 구조적 펩타이드 또는 구조적 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있다. 보다 특수한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 서열 번호: 35의 아미노산 서열의 선형 에피토프 또는 선형 펩타이드, 및 서열 번호: 96의 구조적 에피토프 또는 구조적 펩타이드를 특이적으로 인식할 수 있다.
[17] IL-7R 시그날링. IL-7R에 대한 IL-7의 결합은 자누스 키나제(Janus kinase: JAK)-1 및 -3, 시그날 변환인자(transducer) 및 전사 5의 활성인자(STAT5) 및 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3-k)를 포함하는 몇가지 신호전달 경로의 활성화를 개시(trigger)한다. STAT1 및 STAT3 경로는 주요 경로인 것으로 여겨지지는 않지만, 활성화되는 것으로 보고되어 있다. STAT5 경로의 활성화는 항-세포자멸사 단백질 Bcl-2의 유도 및 미토콘드리아내 전(pro)-세포자멸사 단백질 Bax의 도입의 방지 및 따라서 흉선 발달하는 T 세포 전구체의 생존에 요구된다. PI3-k 경로의 활성화는 전-세포자자멸사 단백질 Bad의 포스포릴화 및 세포질성 보유를 야기한다.
[18] TSLPR 시그날링. 흉선 기질 림포포이에틴(Thymic Stromal Lymphopoietin: TSLP)은 림프구생성에 있어서 활성이며 특히 면역계의 세포의 발달의 조절에 관여하는 상피 세포 사이토킨이고, 상기 조절은 특히 상기 세포의 성숙에 영향을 미친다. 사람 TSLP(Genbank 수탁 번호 AF338732)는 수지 세포의 분극화(polarization)를 발휘하고 T 및 B 세포 증식 및 분화를 촉진하는 인자이다. TSLP는 또한 Treg 세포의 생성을 억제한다(Lei et al., 2011).
[19] TSLP-유도된 신호전달 경로는 IL-7-유도된 경로로부터, 분자 수준에서 상이한 것으로 밝혀졌다. 특히, 이의 수용체에 결합하는 TSLP는 또한 Jak-1을 활성화시키지만, 이는 Jak-3을 활성화시키지 않지만, Jak-2를 활성화시킨다. 이러한 차이는 Jak-1이 수용체 둘다에 의해 공유된 CD 127과 연합되어 있지만 Jak-2는 CRLF2와 Jak-3는 γc와 연합되어 있다는 관찰과 일치한다(Rochman et al., 2010). STAT5 경로의 활성화는 또한 TSLP-유도된 신호전달(Zhong et al., 2014)의 경우 보고되어 있다. TSLP의 주요 효과는 수지 세포의 활성화를 초래하며, CD80과 같은 공자극성 분자의 과발현을 유도함으로써 TH-2 매개된 염증성 반응을 촉진한다(Reche et al., 2001 ).
세포 생물학
[20] "CD127-양성 세포"는 이들의 세포 표면에서 CD 127을 발현하는 세포를 나타낸다. 대부분의 경우에, CD127-양성 세포는 IL-7R을 형성하는 복합체(IL-7R-양성 세포) 및/또는 TSLPR을 형성하는 복합체(TSLPR-양성 세포) 내에서 CD 127을 발현한다. CD 127은 기억 및 나이브(naive) T 세포 둘 다를 포함하는, 다양한 세포에 의해 발현된다. CD 127은 특히 휴지기 및 기억 T 세포를 포함하는 효과기 T 세포 (Teff)에 의해, 및 미성숙 B 세포에 의해 발현되지만, 특히 휴지기의 천연의 조절 T 세포(천연의 Treg)에 의해서는 발현되지 않는다. CD 127은 흉선세포 분화 및 림프구의 클론성 확장을 촉진하는데 필수적이다.
[21] 나이브 T-세포 항상성을 위한 IL7-CD 127 경로의 중요성은 통상의 CD4+ T 세포에서 막-결합된 CD127의 발현 수준이 건강한 개인 및 HIV-감염된 환자 뿐만 아니라 MS를 지닌 환자에서 최근의 흉선 이주(RTE)-CD4+ T 세포의 빈도와 관련되어 있음을 나타내는 몇가지 최근 연구에 의해 강조되고 있다(Albuquerque et al., 2007) (Broux et al., 2010). CD 127은 또한 TSLP 수용체의 성분이다. 흉선 모수(thymic medulla)내 상피 세포로 구성된 구조물인, 하쌀 소체(Hassall's corpuscle)에 의한 TSLP의 분비는 CD11c+ 골수성 수지 세포(MDC)를 조절하여 흉선 세포의 Treg내로의 분화를 유도하는 것으로 입증되었다(Watanabe et al., 2005a). 따라서, IL-7 수용체로부터의 신호는 CD127 녹아웃(knockout) 마우스에서 밝혀진 바와 같이 Treg 발달을 위해 요구된다(Mazzucchelli et al., 2008). (Haas et al., 2011)에서, 저자들은 명확한 유전적 영향없이, MS에서 최근 흉선 이주-Treg 빈도의 감소 및 Treg 기능과 함께 통상의 T 세포에서 감소된 CD 127 발현 및 상향조절된 IL-7 혈장 수준을 밝혔다(Haas et al., 2011).
[22] IL-7이 이의 종족 수용체 막 트래피킹(trafficking)을 조절하는 방법의 분석은 림프구 기능에 있어서 IL-7/IL-7R의 역활의 심도있는 이해에 중요하다. 앞서의 연구는 가능하게는 수용체 내재화로 인하여, T 세포의 IL-7 자극이 30분 내에 CD 127의 표면 하향-조절을 초래함을 제시하였다. 이후 시점(2 내지 6 시간)에서, IL-7은 CD127의 전사적 하향-조절을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, IL-7에 의한 CD127 내재화의 실제 역학 및 트래피킹 메카니즘의 조절은 유추되지 않은채 남아있다(Henriques et al., 2010). IL-7-유도된 신호전달이 CD 127 내재화에 의존적이며, 후속적인 수용체 분해가 JAK3 활성에 의존하고 프로테오좀 및 라이소좀에 의해 매개됨은 또한 시사되었다.
생리병리학
[23] 수지 세포는 성숙후, CD80과 같은 공자극성 분자를 고 수준으로 발현하며, 이는 T 세포 매개된 면역 반응을 촉진한다. 이들은 또한 사이토킨 TARC(CCL17)를 생산하며, 이는 T 세포에서 화학주성을 유도한다. 따라서, 성수한 수지 세포는 수개의 면역-매개된 질환의 생리병리학에 기여하며 여기서 T 세포 반응이 예를 들면, 천식, 류마티스 관절염, 결장염, 다발경화증 및 포도막염과 같이 일어난다. 성숙한 수지 세포는 또한 세포, 조직 또는 기관 동종이식편의 거부 과정에서 중요한 역활을 한다. 따라서, 많은 치료학적 전략은 수지 세포 성숙을 방지하는 것을 목표로 한다.
[24] 수지 세포와 같은 항원-제시 세포(APC) 상의 공자극 분자의 존재 또는 부재는 면역 반응의 정성적 및 정량적 특성에 유의적으로 영향을 미친다. 수지 세포에 의한 CD80의 과발현은 DC 성숙을 유발하고 기억 T 세포 활성화를 증가시킨다(Bour- Jordan et al., 2011). 기계적으로, CD28과 CD80의 상호작용은 면역학적 시냅스의 중심적인 군집을 차지하며 관여한 TCR과 함께 동시국재화(colocalize)됨으로써, 면역 시냅스를 안정화시킨다(Dustin and Shaw, 1999)(Grakoui et al., 1999). CD28과 CD 80의 상호작용은 실제로 TCR이 HLA 분자와 효율적으로 상호작용하기에 적절한 공간(spacing)을 생성한다(Shaw and Dustin, 1997).
[25] 다발경화증(MS)은 중추 신경계(CNS)의 염증성 탈수초 질환이다. MS를 지닌 환자의 CNS내에서 탈수초화 패치의 출현은 대식구 및 T 림프구로 주로 구성된 염증성 침윤물과 관련되어 있다. 기계적 수준에서, MS는 자가면역 질환으로 고려된다. MS는 전형적으로 CD4 + T 세포에 의해 주로 매개된 질환으로서 고려된다. CD4 +: Th1 및 보다 최근에 Th17의 특수한 소세트가 질환의 생리병리학에 연루되었다. 현재, 각각의 소집단 Th1 및 Th17에 대한 특수한 역활을 지정하는 것이 여전히 어렵다. 더욱이, 알파4(a4)-인테그린의 길항작용에 의한 백혈구 트래피킹의 억제는 본 발명에 이르러 MS 및 염증성 창자병(IBD)과 같은 염증성 질환의 치료 뿐만 아니라 아테롬성동맥경화증(Zhi et al., 2014)의 치료를 위한 치료학적 시도로서 입증되었다. α4β7은 활성화된 대식구, 림프구의 소세트, NK 세포, 유방 세포 및 호산구를 포함하는 백혈구의 보다 제한된 세트에서 발현된다.
[26] 사람 IL-7은 사람 T 림프구에서 시험관내(in vitro)에서 α4 및 β7 인테그린의 강력한 발현을 유도하고 T 림프구 호밍(homing) 및 장, 뇌 및 피부와 같은 비-림프구 조직내 보유에 필요한, α4, β7 및 α4/β7 인테그린을 발현하는 사람 T 림프구의 빈도를 현저히 증가시킨다(Denucci et al., 2009; Gorfu et al., 2009).
[27] 나이브 T 세포는 이식된 기관 및 조직의 급성 거부에 부분적으로 관여한다. 이러한 세포는 현재의 면역억제 약물(칼시뉴린 억제제)에 의해서 및 공자극을 차단하는 모노클로날 항체(항-부착, CD80/86 억제제)에 의해 제어될 수 있다. 기억 T 세포는 또한 이식 거부에 관여한다. 기억 T 세포는 후천성 면역 역사(immune history), 주로 바이러스에 대한 이전의 반응으로 인하여 남성에서 축적된다. 기억 T 세포는 "이종 면역성"의 결과로서 동종항원에 의해 재활성화될 수 있는 것으로 밝혀져 있으며, 이는 본 발명자의 항-바이러스 방어와 동종항원의 교차-반응이다(Adams et al., 2003). 이종 면역성은 나이브 T 세포와는 달리, 기억 T 세포가 공자극성 신호에 대한 감소된 요구와 함께, 빠르게 활성화하도록 프로그램화되어 있으므로, 면역관용 유도(tolerance induction)에 대해 강력한 장벽을 나타낸다. 기억 T 세포는 또한 만성 거부에 관여될 수 있다. 기관 및 조직 이식에 있어서 이들의 역활 외에, 나이브 및 기억 T 세포는 또한 많은 자가면역 질환에 동시-반응한다. 이는 궤양성 결장염(Shinohara et al., 2011), 류마티스 관절염, 건선 또는 이식체-대-숙주 질환의 경우이다.
[28] 궤양성 결장염(UC) 및 크론병(Crohn's disease: CD)과 같은 염증성 창자병(IBD)은 만성 장 염증, 장 미생물총에 대한 잘못조절된 면역 반응 및 상피 장벽의 기능장애를 특징으로 하는 만성 재발성 위장 장애이다(Khor et at., 2011; Abraham 및 Cho, 2009). IBD의 발생률 및 유병률은 세계적으로 증가중에 있으며 이러한 질환은 현저한 이병률과 관련되어 있고 삶의 질 및 작업 능력에 있어서 주요 영향을 미쳐왔다(Danese and Fiocchi, 2011 ; Baumgart and Sandbom, 2012). 현재 통상적인 치료는 소염제, 면역억제 약물 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα)와 같은 염증성 사이토킨을 표적화하는 생물학적 제제의 점진적인 사용으로 염증을 약화시키는 것을 목표로 한다. IBD의 주요 특징은 또한 염증의 부위에서 백혈구의 신속한 보충 및 연장된 지속성이며, 이는 세포 부착 및 이주를 허용하는 내피 세포에 의해 발현된 동계 수용체와의 인테그린 상호작용에 의해 허용된다(Adams and Eksteen, 2006; Agace, 2006). 신흥 치료요법은 항-부착 분자를 사용하여 소화관에 대한 이러한 출입 문(entry-door)을 표적화하는 것인데, 구체적으로 소화관-특이적인 α4β7 인테그린 경로를 표적화하는 것이다(Feagan et al, 2013; Sandbom et al, 2013)7'8. 그러나, 이러한 치료요법은 환자의 1/2 이상에서 차도를 유지하지 않는데, 재발 반응(relapsing flare)이 1차 반응자 중에서 고 비율로 발생한다. 기회 감염은 또한 일반적인 면역억제의 결과로서 발달한다. 따라서, 하나의 주요 목표는 IBD에 대한 신규 치료를 제공하고 IBD의 만성, 반응 및 재발을 측정하는 마커를 확인하는 것이다.
[29] 추가로, 몇가지 악성 세포가 IL-7R을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이는 시저리 피부 림프종(Sezary cutaneous lymphoma)(이들 중 60%), 또는 어린이 급성 림프아구성 백혈병의 경우이며, 여기서 경우의 약 15%는 CD 127에 있어서 기능 획득 돌연변이(gain-of-function mutation)로 발달하여, 이러한 종양이 부분적으로 IL-7 의존성이 되도록 한다(Shochat et al, 2011).
[30] T 림프구의 고갈은 동종이식 거부를 방해하거나 자가면역성과 싸우는 명백한 면역억제성 시도가 되어 왔다. 그러나, 전체 T 세포 고갈은 면역학적 내성을 유도하는데 우호적이지 않을 수 있다. Treg 세포를 변형시키지 않으면서, T 세포 소집단 또는 선택적으로 활성화된 T 세포는 전-면역허용원성 시도를 구성할 수 있다(Haudebourg et al., 2009). 따라서, 이러한 모노클로날 항체가 효과기를 고갈시키는 잠재능을 가질 수 있지만 조절성 림프구는 아니므로 CD 127은 면역 반응을 조절하는데 목표를 둔 모노클로날 항체에 대한 잠재적이고 매력적인 치료학적 표적으로서 간주될 수 있다. 따라서, 이들은 IL-7-R에 대한 IL-7의 접근을 길항함으로써 T 및 B 세포 기능 및 성장을 제한하여 이식, 자가면역성(Michel et al., 2008) 및 악성에 있어서의 효능을 나타낼 수 있는 것으로 추정되었다.
[31] IL-7 경로 방해하는 CD127+ 세포에 대한 모노클로날 항체를 사용한 치료요법은 Treg 세포를 보존하면서, 나이브 및 기억 T 세포를 제거하고/중화하거나 이들의 수를 감소시킴에 의해, 또는 CD127-양성 악성 세포의 수를 제거하거나 감소시킴에 의해 이러한 목표를 충족시킬 수 있다. CD127+ 세포에 대한 모노클로날 항체를 사용한 치료요법은 그러나, 이것이 수지 세포 활성화를 초래하는 경우 양날의 칼(double edge sword)로서 작용할 수 있다. 실제로, CD 127은 또한 CRLF2와 연합하여 수지 세포에 의해 발현되어, TSLP 수용체를 형성한다. TSLP의 존재하에서, 수지 세포는 활성화되어 T-세포 매개된 면역 반응을 촉진한다 CD 127에 대한 일부 모노클로날 항체는 아마도 TSLP가 TSLP 수용체와 상호작용하는 방식을 변형시킴으로써, TSLP에 의해 유도된 수지 세포의 성숙을 증가시키는 특성을 갖는다. 결과적으로, TSLP에 의해 유도된 수지 세포의 성숙을 증가시키지 않는 CD127에 대한 모노클로날 항체를 사용한 치료요법은 치료학적 장점을 나타낼 수 있다. 이는 TSLP를 함유하는 염증이 있는 환경에서 수지 세포를 활성화시키는 단점없이 IL7R 차단의 이점을 나타낼 수 있다.
[32] 공보(Racape et al., 2009)에서, 저자는 이식에 있어서 잠재적인 치료학적 표적으로서 흥미있는 IL-7 수용체 알파(IL7Rα)를 분석하였다. 다양한 T 세포 및 IL-7 반응성 세포에서 IL7Rα의 발현을 검토하고, 저자는 IL7Rα를 발현하는 기억 T 세포가 마우스에서 동종이식체 생존을 연장시킬 수 있는지를 측정하고 IL-7 또는 IL7Rα를 표적화하는 것이 Treg 세포를 유리하게 절약할 수 있다고 결론지었다. 관점 중에서, 저자는 치료학적 치료에서 IL-7 또는 IL7Rα를 표적화하는 것이 CD 127을 발현하는 세포의 생존에 있어서 상이한 결과를 가질 수 있으며 상이한 유형의 림프구감소증을 유발시킬 수 있음을 지적하였다. 항체가 세포독성 항체를 차단하는지 또는 중화하는지의 여부에 따라서 IL-7Rα에 대해 지시될 수 있는 항체의 효과에 대한 의문이 또한 개념적인 관점으로부터 제기되었다. 저자는 그럼에도 불구하고 이러한 항체를 수득하여 분석하는 것을 나타내지 않았으며 오히려 가설의 관련성을 평가하기 위한 추가의 연구에 대한 필요성을 피력하였다.
[33] 면역 관련된 질환 및 일부 유방암을 포함하는, 상이한 유형의 암과 같이, IL-7/IL-7Rα와 관여된 다른 질환에서 이용가능한 치료학적 시도의 단점 측면에서, 추가의 약물 후보물, 특히 사람 환자에서 면역 활성화를 제어, 예컨대, 조절할 목적을 위한 보다 선택적인 표적과 관련하여 활성인 후보물에 대한 요구가 여전히 존재한다.
[34] 이와 관련하여, IL-7Rα에 대해 길항제 특성을 갖는 IL-7Rα에 대한 모노클로날 항체는 제WO2010/017468호에 및 다발경화증과 같은 자가면역 질환을 치료하는 관점에서 이들의 사람화된 버젼은 제WO2011/094259호에 개시되어 왔다. 기술된 항체는 이의 수용체에 대한 IL-7 결합에 대해 길항제이고, 이들의 CD 127 수용체와의 IL-7 상호작용을 필료로 하는 것으로 일컬어졌던 TH17 및 THI 세포 확장 및 생존에 대해 활성임이 일컬어진다. 면역 세포, 및 특히 수지 세포의 성숙에 있어서 이러한 항체의 효과는 고려되지 않았다. 게다가, 이러한 항체는 TARC의 TSLP-유도된 생산을 억제하지 않는 것으로 일컬어진다(제WO2011/094259호의 107쪽). 유사하게, 당뇨병, 루푸스, 류마티스 관절염 및 다른 자가면역 질환의 치료시 용도에 대해 고려되는, 제WO2011/104687호 또는 제WO2013/056984호에 보고된 항-CD127 항체는 수지 세포의 성숙에 있어서 이들의 가능한 효과와 관련하여 논의되지 않았고 TSLP-유도된 신호전달과 이들의 상호작용은 보고되지 않았다. 또한, 커른(Kern) 등(Kern et al., 2013; Kern et al., 2015)에 의해 발표되고 본원에 나타낸 바와 같이, 선행 기술의 항-CD 127 항체는 수용체의 내재화를 유도한다. CD 127의 내재화를 또한 유도하는 길항제 항-CD 127 항체는 피하 제IV형 과민증을 제어하는데 실패하지만, 내재화를 유도하지 않는 길항제 항-CD 127 항체는 이를 제어하므로, 내재화 공정은 신호전달 경로를 활성화시켜, 항체의 길항제 효과를 완화시킬 수 있다. 마지막으로, 선행 기술의 항체는 CD 127의 2b 부위로부터의 임의의 서열(즉, 특히 서열 번호: 22의 아미노산 109 내지 180번, 또는 특히 서열 번호: 22의 아미노산 109 내지 173번, 또는 서열 번호: 22의 아미노산 113 내지 180번, 또는 특히 서열 번호: 22의 아미노산 113 내지 173번)을 포함하지 않는 에피토프를 인지하며; IL7-R의 γc 쇄와의 CD127의 결합을 파괴하는 것으로 밝혀지지 않았다.
[35] CD127 항체의 발달에 있어서 최근의 관심에도 불구하고, 따라서, IL7-유도된 IL-7R 신호전달의 억제에 있어서 노력이 집중되어 왔다. 그럼에도 불구하고, TSLP 및 TSLPR은 다수의 병리학에 연루되었다. TSLP는 피부 및 폐 질환에서 역활을 하고(He and Geha, 2010) 사람 및 마우스에서 기도 염증 질환 및 아토피성 피부염을 포함하는 다양한 병리학과 연관된 것으로 밝혀졌다(Ying et al., 2008)(Jariwala et al., 2011). 또한, TSLP는 장 면역성 및 염증의 조절과 관련된 것으로 밝혀졌다(Taylor et al., 2009). TSLP 및 TSLPR을 포함하는 다른 병리학은 소아 B-세포 백혈병(van Bodegom et al., 2012), 폐- 및 피부-특이적인 알레르기 장애, 자가면역성-관련 질환(Roan et al., 2012) 및 유방암을 포함하는, 암(Olkhanud et al., 2011)을 포함한다.
[36] 수지 세포의 성숙을 증가시키는 효과를 나타내지 않고/않거나 CD 127의 내재화를 유도하지 않고/않거나 IL7-유도된 내재화를 억제하는 항체가 제WO 2015/189302호에 논의되어 있다. 상기 출원 및 이후에서 N13B2(키메라 항체), N13B2-M, N13B2-h2 및 N13B2-h3(사람화된 N13B2)로 명명된 상기 항체는 특히 생체내에서 높은 효능을 가지며 이후 정의된 바와 같이, 특히 효과기 기억 T 세포에서 신속한 효과를 가진 것으로 밝혀졌다. 그러나, 상기 항체는 제한된 정도로 사람화되며 이들의 생산 효능은 또한 제한된다. 더욱이, 효과기 기억 T 세포에 있어서 상기 항체의 장기-지속되는 효과는 보고되지 않았다.
[37] 본 발명은 IL-7 신호전달 경로를 포함하는 질환이 있거나 질환에 걸릴 위험이 있는 환자에게 투여하기 위한 치료학적 후보물로서 적합한 신규 항체의 설계를 위한 도구에 관한 것이다. 본원에 제공된 다양한 시도에 따라서, 이러한 도구는 사람 숙주에 대한 투여용으로 의도된 항체의 제제를 개선시킨다. 이러한 도구는 사람 숙주에 대한 투여용으로 의도된 항체의 제제를 개선시킨다. 이러한 도구는 N13B2-h3의 CDR 서열 모두를 포함하는 특히 사람화된, 특히 모노클로날, 항체를 포함한다.
[38] 이러한 폴리펩타이드(또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)가 특히 항체(또는 이의 항원-결합 단편)의 생산을 위해 및/또는 특히 CD127에 특이적으로 결합하는 항체(또는 이의 항원-결합 단편)으로서 제공되며; 상기 항체, 특히 모노클로날 항체는 3개의 CDR 서열, 서열 번호: 1에 제시된 VHCDR1, 서열 번호: 2에 제시된 VHCDR2 및 서열 번호: 3에 제시된 VHCDR3를 포함한다. 특히, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호: 7에 제시된 서열로 이루어지거나 추가의 돌연변이, 특히 4개의 잔기, 바람직하게는 3개 또는 2개의 잔기 및 심지어 보다 바람직하게는 1개의 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 지닌 상기 서열을 가지며, 바람직하게는 여기서 상기 돌연변이는 CDR 서열 내에 또는 골결 서열의 기본형 또는 베르니어 위치에 존재하지 않는다.
[39] 본원에 제공된 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이며, 이들 항체의 조성물이 항원-결합 특이성의 측면 및 상응하게 가변 영역 조성물의 측면에서 균질한, 특히 동일함을 의미한다.
[40] 본 발명은 N13B2-h3 항체의 CDR을 공유하지만 명백한 경쇄 가변 도메인 골격을 갖는 항체를 제공한다. 본 발명자들은 놀랍게도 N13B2-h3의 경쇄 가변 도메인의 동일한 CDR, 즉 서열 번호: 4 및 5 및 6을 포함하지만 상이한 경쇄 가변 도메인 서열, 즉, 서열 번호: 9; 서열 번호: 10; 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 12의 CDR을 포함하면서; 강력하게 사람화된 항체가 모든 기능적 특징을 보존하면서 N13B2-h3과 비교하여 고도로 생산(4배까지 더 높게)됨을 발혔다.
[41] 본 발명은 IL-7Rα에 대해 특히 특이적인 모노클로날 항체를 포함하는, 본 내용에서 적합한 수단을 제공한다. 특수한 구현예에서, 상기 항체는 TSLP 경로를 부정적으로만 방해한다. 따라서, 바람직한 구현예에서 상기 항체는 TSLP-유도된 수지 세포 성숙을 증가시키지 않는다. 추가로 또는 대안적으로, 특수한 구현예에서, 상기 항체는 CD 127의 내재화를 유도하지 않고/않거나 CD127의 IL7-유도된 내재화를 억제하지 않는다. 특수한 구현예에서, 상기 항체는 이들 DC 성숙- 및/또는 내재화-관련된 특성을 IL-7/IL-7-R 신호전달에 대한 길항제 활성과 조합시킨다. 특수한 구현예에서, 상기 항체는 T 세포내, 특히 생체내에서 α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 IL7-유도된 발현을 억제한다. 특수한 구현예에서, 상기 항체는 이들의 수를 물리적으로 감소시키는(소집단의 축소) 표적 CD 127+ 세포에 대해 세포독성 작용을 발휘한다. 추가로 또는 대안적으로, 특수한 구현예에서 상기 항체는 이후 정의된 바와 같은 사람 잔기의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 84%, 또는 84% 이상 및 심지어 보다 바람직하게는 적어도 85%를 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 특수한 구현예에서 상기 항체는 N13B2-h3와 같이 적어도 효율적으로, 바람직하게는 이후 정의된 바와 같이, 적어도 2배 효율적으로 생산된다. 추가로 또는 대안적으로, 특수한 구현예에서 상기 항체는 효과기 기억 T 세포에 있어서 신속하고/하거나 장기-지속되는 효과를 갖는다.
[42] 특히, 본원에 제공된 항체는 다음의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중(VH) 쇄를 포함한다:
VHCDR1 서열 번호: 1 ;
VHCDR2 서열 번호: 2;
VHCDR3 서열 번호: 3.
본원에 제공된 항체는 바람직하게는 서열 번호: 7에 제시된 서열로 이루어진 VH 쇄를 포함한다:
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAVSGFTLSDYYMAWIRQAPGKGLEWVSTISASGLRTYYPD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYRCARPLSAHYGFNYFDYWGQGTLVTVSS. 상기 가변 중쇄는 특히 서열 번호: 26의 서열로 이루어진 불변 중쇄에 연결되어 완전한 항체 중쇄를 구성한다.
[43] 특히, 본원에 제공된 항체는 서열 번호: 9의 서열, 서열 번호: 10의 서열, 서열 번호: 11의 서열, 및 서열 번호: 12의 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 특히 서열 번호: 12의 서열로 이루어진 VL 쇄를 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYQGLAWYQQKPGKAPKLLLYSANTLHIGVPSRFSG SGSGTDYTLTISSLQPEDFATYRCQQYYDYPLAFGGGTKVEIK. 상기 가변 경쇄는 특히 서열 번호: 27 및 서열 번호: 28, 특히 서열 번호: 27로부터 선택된 서열로 이루어진 불변 경쇄에 연결되어, 완전한 항체 경쇄를 구성한다.
특히, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, CD 127, 특히 사람 CD 127에 특이적으로 결합하며 다음을 포함한다:
- 서열 번호: 9; 서열 번호: 10; 서열 번호: 11; 서열 번호: 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열; 특히 서열 번호: 12의 서열을 포함하는 항체 경쇄 또는 이로 이루어진 항체 경쇄 가변 도메인; 및
- 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3에 제시된 서열로 이루어진 3개의 CDR을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인, 특히 서열 번호: 7에 제시된 서열로 이루어진 항체 중쇄 가변 도메인.
본 발명의 보다 특수한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD 127, 특히 사람 CD 127에 특이적으로 결합하고 다음을 포함한다:
- 특히 서열 번호: 9, 서열 번호: 10; 서열 번호: 11 및 서열 번호: 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 특히 서열 번호: 12로 이루어진, 본 발명에 따른 항체 경쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄; 및
- 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3에 제시된 서열로 이루어진 3개의 CDR을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인, 특히 항체 중쇄 가변 도메인.
CD127의 결합
[44] 본 발명에 따라서, IL-7Rα 단백질에 대한 "결합"은 항원-항체형 상호작용을 지칭하며 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 "특이적인 결합" 특성을 포함하며 이러한 특이적인 결합은 항체 또는 항원-결합 단편이 IL-7Rα 단백질에 결합하지만 이들이 다른 단백질(예컨대, 일반적인 사이토킨 수용체 γ-쇄)에 대해 유의적으로 보다 약한 친화성으로 결합하지 않거나 결합함을 의미한다. 특이적인 결합은 생리학적 조건, 특히 시험하는 용액의 pH 및 염 함량의 측면에서 바람직하게 정의되고/되거나 측정된다. 결합 및 결합 특이성은 실시예에 개시된 시험에 따라서 평가될 수 있으며 특히 바이오센서(biosensor), 블리츠(Blitz), 비아코어(Biacore), ELISA, 또는 웨스턴 블롯 분석(Western Blot analysis)에 의해 검정될 수 있다.
[45] 특수한 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 TSLP-수용체(CCRF2를 지닌; Genbank 수탁 번호 AF338733; Reche et al., 2001)와 복합되는 경우 IL-7-R 알파 쇄를 표적화하여 이에 결합한다. 특수한 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 바이오센서 분석에 의해, 특히 블리츠 방법에 의해 측정될 수 있는 바와 같이, 단리된 단백질로서 CD127에 5E-9 M 이하의 친화성 상수(KD)로 결합한다. 특수한 구현예에서, 항체의 결합 특성은 epl(서열 번호: 19) 및/또는 ep2(서열 번호: 20)의 서열을 포함하는 사람 CD127의 항원을 사용하여 측정되거나 정의된다.. 특수한 구현예에서, 항원은 epl 및 ep2를 포함하는 사람 CD127의 단편을 포함한다(즉, 항원은 epl 및 ep2의 서열 및 사람 CD127의 삽입된(intercalated) 서열을 포함한다). 특수한 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 제WO 2015/189302호에 개시된 N13B2-h3 항체, 및/또는 본원에 개시된 N13B2-hVL6 항체(서열 번호: 7의 서열을 갖는 VH 및 서열 번호: 12의 서열을 갖는 VL을 지님) 및/또는 서열 번호: 7의 서열을 지닌 VH 및 서열 번호: 10의 서열 또는 서열 번호: 11의 서열을 지닌 VL을 지닌 항체와 같이 상기 항원에 대해 적어도 동일한 친화성을 갖는다.
[46] 특히 블리츠 방법을 포함하는, 이들의 표적, 단리되거나 TSLPR 또는 IL7R로서, 완전한 길이의 CD 127, 또는 상기와 같은 이의 항원에 대한 항체의 결합을 시험하는 방법은 숙련가에게 알려져 있고 특히 본원의 도 3, 실시예 3 및 실시예4 및 제WO 2015/189302호의 14쪽의 도 3, 4 및 6 및 각각의 범례, 및 실시예 1, 2, 6, 7에 설명되어 있다.
증가된 TSLP-유도된 수지 세포 성숙의 부재
[47] 본원에 제공된 항체는 TSLP 수용체내 CD 127에 결합할 수 있다(즉, 이것이 CRLF2와 복합체 상태인 경우 CD 127에 결합하여, TSLP 수용체를 형성할 수 있다). 따라서, 본원에 제공된 항체는 TSLP-유도되고/되거나 TSLP 수용체-매개된 신호전달을 방해할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 제공된 항체는 면역 세포, 특히 수지 세포의 성숙을 위해 TSLP와 상승작용하지 않는다. 다시 말해서, 본 발명의 항체는 TSLP에 의해 유도된 면역 세포의 성숙을 증가시키기 않는다.
[48] 이러한 효과는 특히 수지 세포의 성숙에 바람직하다. 이러한 효과를 측정하는 수단은 기술자에게 알려져 있고 특히 제WO 2015/189302호의 16 및 17쪽 및 이의 실시예 9에 개시되어 있다. 특히, 본원에 제공된 항체는 TSLP 단독(항체 부재)을 사용한 자극과 비교하는 경우 CD40의 발현을 50% 이상까지 증가시키지 않는다. 바람직하게는, CD40의 발현은 25% 이상, 바람직하게는 10% 이상 및 심지어 보다 바람직하게는 5% 이상까지 증가되지 않는다. 특히 바람직한 구현예에서, CD40의 발현은 TSLP 단독으로 자극된 세포와 비교하는 경우 TSLP 및 상기 항체로 자극된 세포내에서 증가되지 않거나 감소된다.
α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 IL7-유도된 발현의 억제
[49] 특수한 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 시험관내에서 α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 IL7-유도된 발현을 억제한다. 본원에 사용된 바와 같은, α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 IL-7-유도된 발현은 α4 및 β7 인테그린의 발현 수준에 있어서의 증가 및 α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린을 발현하는 T 림프구의 수 또는 비에 있어서의 증가 중 하나 또는 둘 다를 나타낸다. 억제는 부분적일 수 있는데, 즉, IL7의 존재하에서 α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 발현 수준은 항체의 존재하에서, 기본선 수준(즉, 항체 또는 IL7의 부재하에서의 수준)을 초과하여 증가하지만, 그러나, 항체의 부재하에서보다는 덜 증가하거나; 억제가 완료될 수 있는데, 즉, IL7 및 항체의 존재하에서 α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 발현 수준은 기본선 수준보다 더 높지 않다.
[50] 특수한 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 시험관내에서 α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린의 발현을 억제하는데, 즉, α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린의 발현 수준은 처리되지 않은(즉, 항체 또는 IL7의 부재하에서) 세포에서 보다 항체로 처리된(및 IL7의 존재 및/또는 부재하에서) 세포에서 더 낮다. 억제 정도는 용량-의존적일 수 있다. 발현의 억제는 제WO 2015/189302호, 18쪽, 특히 단락 [58], 및 실시예 16에서 제시된 바와 같이 보다 구체적으로 정의되고/되거나 시험되고/되거나 측정된다.
CD127 내재화의 억제제
[51] 특수한 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 CD 127의 IL7-유도된 내재화를 억제한다. 따라서, 상기 항체와 함께 항온처리되는 경우, IL7의 존재는 CD 127의 세포 표면 발현시 감소를 유도하지 않거나, 항체의 부재하에서 항온처리된 세포보다 CD 127의 세포 표면 발현에 있어서 거의 강력하지 않은 감소를 유도한다. 특수한 구현예에서, 상기 항체와 함께 항온처리하는 경우, 세포를 37℃에서 15분 동안 5 ng/mL IL7와 함께 항온처리하는 경우 CD 127 세포 표면 발현의 수준은 IL7의 부재하에서 항온처리된 세포내 세포 표면 발현 수준의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%이다. 시험관내에서, 세포 표면 발현은 바람직하게는 상기 나타낸 바와 같은 제한된 시간 후에 측정된다. 게다가, 대부분의 세포 내재화 공정은 저온에서 억제되므로, 효과는 생리학적 온도, 특히 37℃에서 일반적으로 가장 우수하게 관찰된다. 그러나, 세포를 저온, 특히 4℃에서 항온처리하는 것이 또한 고려된다.
[52] 바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 CD127의 내재화를 유도하지 않는다. 따라서, 상기 항체의 존재하에서 항온처리된 세포내에서 CD127의 세포 표면 발현은 기타의 경우 동일한 조건에서, 그러나 항체의 부재하에서 항온처리된 세포내 세포 표면 발현에 비해 감소되지 않거나, 유의적으로 감소되지 않는다. 특수한 구현예에서, 37℃에서 30 내지 45분 동안 50 ng/mL의 항체의 존재하에 항온처리하는 경우, CD127 세포 표면 발현의 수준은 항체의 부재하에서 항온처리된 세포내 이의 수준의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%이다. 이러한 효과는 IL7의 부재(항체-처리된 및 -처리되지 않은 세포 둘 다에서) 하에서, IL7의 존재하에서, 및/또는 둘 다에서 관찰될 수 있다.
[53] 상기 기술된 2개의 CD127 내재화-관련 특징(즉, IL7-유도된 내재화의 억제 또는 내재화의 비-유도)는 제WO2015/189302호, 특히 19 내지 20쪽의 단락 [59] 내지 [63] 및 도 16 및 실시예 5에 제시된 바와 같이 추가로 정의되고/되거나 시험될 수 있다.
CD127-γc 쇄 상호작용의 파괴
[54] 특수한 구현예에 따라서, 본원에 제공된 항체는 IL7-R의 γc 쇄에 대한 CD 127의 결합을 파괴할 수 있다. 이는 CD 127 및 γc 쇄가 항체의 부재하에서, 및 특히 IL7의 존재하에서 함께 결합된 조건(특히 화학적 및 물리적 조건)하에서, 상기 항체의 존재는 상기 결합을 유의적으로 감소시킨다. 특수한 구현예에서, 항체 및 IL7의 존재하에서, CD 127은 γc에 결합하지 않는다. 특히, 항체 및 IL7의 존재하에서, CD 127와 연합된(또는 이에 결합된) 것으로 발견된 γc 쇄의 양은 기타의 경우 동일한 조건하에서, 특히 IL7의 존재하에 항체의 부재하에(또는 MD707-13과 같은 다른 항 CD-127 항체의 존재하에) 결합된 양의 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만, 심지어 보다 바람직하게는 25% 미만 또는 10% 미만이다. 항체의 이러한 특징은 단백질의 상호작용을 시험하기 위해 숙련가에게 잘 공지되고 제WO2015/189302호의 실시예 21에 설명된, 동시-면역침전 방법에 의해 평가될 수 있다. 특히, 세포는 시험된 항체의 존재 또는 부재하에 항온처리된 후, 단백질 복합체의 보존을 허용하는 조건 하에서 가용화되고, 수득되는 분해물은 항-CD127 면역침전에 적용될 수 있며 CD127-함유 면역침전된 복합체의 존재는 항-γc 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 평가될 수 있다(역으로, 면역침전은 항-γc 항체를 사용하여 수행될 수 있고 CD 127의 존재는 항-CD 127 항체를 사용하여 평가될 수 있다).
IL7-IL7-R 상호작용에 대한 길항제
[55] 특수한 구현예에 따라서, 본 발명의 거대분자, 특히 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인터루킨 7(IL7)에 대해 길항제 특성을 추가로 가짐으로써 CD127 양성 세포 상에서 CD127에 대한 접근, 즉, 이에 대한 IL7의 결합을 길항한다.
[56] "IL7-IL7-R 상호작용에 대한 길항제 특성"은 IL7-R알파를 표적화하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 이의 결합 파트너 IL7, 특히 사람 IL7에 대한 CD 127 세포 상에서 발현된 IL7 수용체, 특히 사람 효과기 T 세포, 특히 사람 기억 T 세포의 접근성을 방지하는 효과를 가짐을 의미한다. IL7의 결합을 길항하는 결과로서, 본 발명의 항체 또는 이들의 기능성 단편은 IL7-의존성 흉선 T 세포 생성을 방지함으로서 림프구감소증을 초래한다.
[57] 길항제 특성은 특히 IL7에 의해 유도된 IL7-R 신호전달에 대한 길항작용일 수 있다. IL7에 의해 유도된 IL7-R 신호전달의 길항작용은 실시예에 기술된 바와 같이 STAT5 포스포릴화의 억제를 측정함으로써 확인할 수 있다. STAT5의 IL7-유도된 포스포릴화는 IL7-R 활성화의 마커이며 IL7-IL7-R 상호작용을 길항하는 항체는 STAT5의 IL7-유도된 포스포릴화를 감소시키는 것으로 예측된다.
[58] 특수한 구현예에서, 본 발명의 거대분자는 IL7에 의해 유도된 IL7-R 신호전달의 길항제이다. 특수한 구현예에서, 본 발명의 거대분자는 STAT5의 IL7-유도된 포스포릴화를 억제한다. 바람직한 구현예에서, STAT5 포스포릴화의 억제는 55 ng/ml와 같이 낮은 항체 농도에서 50% 이상 높고/높거나 STAT5 포스포릴화의 억제는 100 ng/ml 정도로 낮은 항체 농도에서 80% 이상 높다. STAT5 포스포릴화의 억제는 숙련가에게 공지된 방법에 의해 평가할 수 있으며 특히 제WO2015/189302호의 실시예 단락, 특히 실시예 5, 및/또는 21쪽, 단락 [69] 및 [70] 및 실시예 3에 제시된 방법에 의해 평가할 수 있다.
[59] 또한, 본 발명의 거대분자(특히 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자)는 PI3-k 및/또는 ERK(세포외 신호-조절된 키나제) 신호전달 경로의 활성화를 억제하고/하거나 활성화 또는 증가시키기 않으며 특히 PI3-k 및/또는 ERK 1 및/또는 ERK 2의 포스포릴화를 억제하고/하거나 이를 유도하거나 증가시키지 않는다. 특히, 본원에 제공된 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자, 및 특히 IL-7 - IL-7R 상호작용에 대한 길항제인 이러한 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자는 PI3-k 및/또는 ERK 경로(바람직하게는 PI3-k 및 ERK 경로)의 활성화를 유도하지 않고, 특히 PI3-k 및/또는 ERK 1 및/또는 ERK 2의 포스포릴화를 유도하지 않으며, 보다 특히 PI3-k 및 ERK 1 및 ERK 2의 포스포릴화를 유도하지 않는다. 특히, 본원에 제공된 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자, 및 특히 IL-7 - IL-7R 상호작용에 대한 길항제인 이러한 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자는 PI3-k 및/또는 ERK 경로의 활성화를 억제하고, 특히 PI3-k 및/또는 ERK 1 및/또는 ERK 2의 포스포릴화를 억제하며, 보다 특히 PI3-k 및 ERK 1 및 ERK 2의 포스포릴화를 억제한다. 상기 단백질의 경로의 활성화 및/또는 포스포릴화는 숙련가에게 공지된 방법에 의해 및 특히 도 7 및 실시예 8에 설명된 바와 같은 웨스턴 블롯팅에 의해 시험될 수 있다.
TSLP의 결합에 대한 길항제
[60] 본원에 제공된 항체는 IL7-R내에서 CD 127에 결합하므로, 이들은 TSLPR내에서 CD 127에 결합할 수 있으며, 특히 입체 장애에 의해 및/또는 일반적인 결합 부위에서의 경쟁에 의해, 이들은 TSLPR에 대한 TSLP의 결합을 억제할 수 있다. 다시 말해서, 본원에 제공된 항체는 TSLP의 결합에 대해 길항제 활성을 나타낼 수 있다.
TSLP-유도된 TARC 생산의 억제제
[61] 특수한 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 CD127-양성 세포의 TSLP-유도된 TARC 생산을 억제한다. 상기 언급한 바와 같이, TSLP-자극된 수지 세포는 상승된 수준의 TARC를 생산한다. 이는 TSLPR에 대한 이들의 결합 및 TSLP 결합의 길항제로서 이들의 잠재적인 작용으로부터 야기될 수 있다. 특수한 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 수지 세포의 성숙(예컨대, CD40 및/또는 CD80 세포 표면 마커의 증가된 발현으로 측정되는 성숙)을 증가시키지 않는다.
[62] TSLP-유도된 TARC 생산의 수준은 TSLP 단독으로 처리된 세포에서보다 본원에 제공된 항-CD 127 항체와 함께 TSLP로 처리한 세포내에서 더 낮을 수 있다. 다시 말해서, 본원에 제공된 항체는 TSLP-유도된 TARC 생산의 억제제일 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 TARC 생산의 수준을 감소시킨다. 특수한 구현예에서, TSLP 및 본원에 제공된 항체로 처리된 세포내에서 TARC 생산의 수준은 1 μg/ml 정도로 낮은 항체 농도에서 TSLP 만으로 처리한 세포에서의 수준과 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상 감소된다. TARC 생산의 측정은 기술자에게 알려진 임의의 표준 방법을 사용하여 혈액 샘플로부터의 CD127-양성 면역 세포, 특히 수지 세포에서 수행할 수 있으며, 예컨대, 제WO2015/189302호의 실시예 9에 설명되어 있다.
세포독성 활성
[63] 특수한 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 사람 세포, 특히 CD 127을 발현하는 사람 T 세포에 대해 세포독성이다. 상기 항체의 표적인 IL7 수용체의 쇄로서 CD 127을 발현하는 사람 세포는 주로 T 림프구이며 보다 정밀하게는 나이브 및 기억 T 세포를 포함하는 효과기 T 림프구의 소집단이지만 조절성 T 세포(Treg), 특히 휴지하는 천연 Treg가 아니다. 기억 T 세포는 항원 프라이밍(antigen priming)의 결과로서 생성되며 제2 효과기 및 기억 세포로의 재-활성화 및 분화시 리콜 증식(recall proliferation)을 겪는 능력을 포함하는, 이들의 기능적 특징에 의해 주로 정의된다. 유사하게, 표적화된 TSLP 수용체(IL-7-R 알파 쇄를 포함하는 복합체로서)는 T 헬퍼 림프구, B 세포 및 수지 세포 분화를 조절한다.
[64] 특히, "T 세포에 대한 세포독성 활성" 또는 세포독성 특성을 갖는, 본원에 제공된 항체(세포독성 항체)는 이들 세포를 사멸시킴으로써 효과기 T 세포 집단내 고갈을 유발하며 따라서 투여되는 경우 이들 세포의 수를 감소시킨다. 역으로, 상기 항체는 조절성 T 세포의 소집단을 변경시키지 않거나 이를 유의적인 정도로 변경시키지 않음으로써, Treg 세포가 이들의 기능을 수행하도록 허용한다. 이와 관련하여, 특수한 구현예에서, 조절성 T(Treg) 대 효과기 T(Teff) 세포의 비는 상기 항체의 투여 후 상승된다. 특히, 본원에 제공된 항체는 상기 비를 약 10% 이상 상승시킬 수 있다. 특히, Treg 대 Teff의 비에 있어서의 증가는 약 20%이다.
[65] 특히, 세포독성 항체는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 나타낸다. 대안적으로, 본원에 제공된 항체는 ADCC 특성을 가지지 않는다. 항체 ADCC 효능은 특이적인 세포독성이 예컨대, 10%를 초과하는 경우 양성으로 고려될 수 있다. ADCC 특성은 제WO2015/189302호의 실시예 10에 기술된 시험과 같은 ADCC 검정에서 평가될 수 있다. 항체가 랫트 항체인 경우, ADCC 검정에 사용된 효과기 세포는 바람직하게는 랫트의 LAK(림포카인-활성화된 킬러) 세포이다. 항체가 사람화되는 경우 ADCC 검정은 특히 사람 NK 세포에서 수행될 수 있다.
[66] CD 127 양성 세포에 대해 세포독성 및 길항제 특성 둘 다를 갖는 본 발명의 항체는 효과기 T 세포, 특히 기억 T 세포의 고갈과 관련하여 이러한 특성의 누적 효과를 가능하도록 함으로써, 보다 강력한 고갈(CD 127+ 세포의 혼주물(pool)의 소진) 및 표적 T 세포의 수에 있어서의 상응하는 감소를 가능하도록 한다.
[67] 상기 단락 뿐만 아니라 실시예는 본원에 제공된 항체의 관련된 바람직한 기능적 특징에 대해 시험하는 방법을 기술한다. 다음의 섹션은 항체의 다양한 구조적 특징 및 가능한 변형을 상세히 설명할 것이다. 이러한 안내의 측면에서, 숙련가는 특히 목적한 기능적 특징을 갖는 N13B2-hVL6 항체로부터 출발하여, 목적한 기능적 특징과 함께 하기 구조적 특징을 갖는 항체를 수득할 수 있을 것이다.
[68] 사람 대상체에 대한 투여용으로 의도된 경우, 항체는 숙련가가 알고 있는 바와 같이, 사람 항체와 가능한 강력하게 상동성으로 존재하는 것이 바람직할 수 있다. 사람 항체와의 동일성 정도는 항체 서열, 특히 항체 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인의 골격내 사람 잔기의 %, 즉, 항체 서열, 특히 항체 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인의 골격내 잔기의 %로 측정되며, 이는 가장 상동성인 공지된 사람 항체내, 특히 가장 상동성인 공지된 사람 항체 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인의 골격내 잔기에 대해 동일한 기능적 위치에서 동일하다. 이러한 특성은 일반적으로 문헌에서와 같이, 본원에서 "항체 A(또는 이의 가변 도메인의 골격 서열)가 xx% 사람 잔기를 가진다"로서 일반적으로 표현되며, 이는 항체 A(또는 이의 가변 도메인의 골격 서열)가 가장 상동성인 공지된 사람 항체(또는 이의 가변 도메인의 골격 서열)의 잔기에 대해 동일한 기능적 위치와 동일한 잔기의 xx%를 가짐을 의미한다. 이러한 동일성 정도는 기술자에게 공지된 수단으로 및 특히 WHO INN Expert Group(April 2015)의 공개회의 동안 명확해진 바와 같은 국제 면역유전학 정보 시스템(International Immunogenetics Information System: IMGT) DomainGapAlign 도구를 사용하여 측정할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 제공된 항체는 특히 DomainGapAlign 도구를 사용하여 측정된 바와 같이, 사람 항체와 80% 이상, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 84%, 84% 초과 및 심지어 보다 바람직하게는 적어도 85% 동일성을 갖는다. 상기 동일성 정도는 경쇄 가변 도메인 단독 또는 경쇄 단독에 대해(사람 항체 경쇄 가변 도메인 또는 경쇄와의 비교에 의함) 또는 경쇄 및 중쇄를 함께 취하여 각각의 쇄를 가장 상동성인 상응하는 사람 항체 쇄와 비교하고, 동일성의 누적된 퍼센트를 보고함으로써 측정할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 항체 경쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄는 사람 잔기의 적어도 80%, 보다 특히 84% 및 심지어 보다 특히 적어도 85%를 포함한다. 본원에 제공된 특수한 항체 경쇄 가변 도메인는 각각 84.2%(서열 번호: 9); 85.3%(서열 번호: 10 및 서열 번호: 11) 및 86.3%(서열 번호: 12)의 사람 잔기를 갖는다. 본원에 제공된 바람직한 항체 중쇄 가변 도메인(서열 번호: 7)은 90.8%의 사람 잔기를 갖는다.
[69] 본원에 제공된 항체 경쇄 가변 도메인은 135개 이하의 아미노산, 바람직하게는 120개 이하의 아미노산 및 심지어 보다 바람직하게는 110 또는 107개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 항체 경쇄 가변 도메인은 적어도 80개, 바람직하게는 적어도 90개 및 심지어 보다 바람직하게는 적어도 100개 또는 106개의 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 항체 경쇄 가변 도메인은 80 내지 135개, 바람직하게는 90 내지 120개 및 심지어 보다 바람직하게는 105 내지 110개의 아미노산을 포함할 수 있다.
[70] 본원에 제공된 항체 경쇄는 250개 이하의 아미노산, 바람직하게는 230개 이하의 아미노산 및 심지어 보다 바람직하게는 214개 또는 211개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 항체 경쇄는 적어도 150개, 바람직하게는 적어도 190개 및 심지어 보다 바람직하게는 적어도 200개 또는 210개의 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 항체 경쇄는 150 내지 250개, 바람직하게는 190 내지 230개 및 심지어 보다 바람직하게는 210 내지 220개의 아미노산을 포함할 수 있다.
[71] (i) 본원에 제공된 항체의 항원-결합 단편, 특히 본원에 제공된 항체 경쇄 또는 항체 경쇄 가변 영역을 포함하거나 이로 이루어진 항원-결합 단편, 본원에 제공된 항체 중쇄 가변 도메인 및/또는 (ii) 본원에 제공된 항체의 항체 모사체 분자인 폴리펩타이드가 본원에 제공된다.
[72] 항원-결합 단편은 관련 섹션(단락부문 [44] 내지 [47])에서 상기 정의한 바와 같은 CD 127 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드이며 N13B2-h3의 적어도 3개의 CDR(서열 번호: 4 내지 6의 서열로 이루어짐), 바람직하게는 상기 CDR 서열을 포함하는 본원에 제공된 경쇄 가변 도메인의 단편(서열 번호: 9 내지 12를 지님)을 포함한다. 항원-결합 단편은 적어도 40개, 바람직하게는 적어도 50개 및 심지어 보다 바람직하게는 적어도 70 또는 74개의 아미노산을 포함한다. 항체-결합 단편은 최대 100개, 바람직하게는 최대 90개 및 심지어 보다 바람직하게는 최대 80 또는 74개의 아미노산을 포함할 수 있다. 항원-결합 단편은 40 내지 100개, 50 내지 90개 및 바람직하게는 60 내지 100개 및 심지어 보다 바람직하게는 50 내지 70개 또는 60 내지 80개의 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 항원-결합 단편은 특히 본원에 제공된 항체와 관련하여 개시된 임의의 적합한 기능적 특징, 특히 단락[47] 내지 [62]에 개시된 특징을 가질 수 있다.
[73] 따라서, 본원에 제공된 단리된 폴리펩타이드는 250개 이하의 아미노산, 특히 217개 이하, 214개 이하, 211개 이하, 보다 특히 200개 이하, 175개 이하, 150개 이하, 135개 이하, 120개 이하, 107개 이하 및 심지어 보다 특히 100개 이하, 90개 이하, 80개 이하, 74개 이하, 70개 이하, 60개 이하의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
[74] 항체 모사체 분자는 항체와 유사한 특성을 갖는, 특히 CD 127과 유사한 결합 특성을 갖는 폴리펩타이드이다. 항체 모사체는, 예를 들면, 아피보디(affibody) 분자, 아필린, 아피머, 안티칼린, 모노바디 등일 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 항체 모사체 분자는 특히 본원에 제공된 항체와 관련하여 개시된 임의의 적합한 기능적 특징, 특히 단락 [47] 내지 [62]에 개시된 특징을 가질 수 있다.
[75] 특히, 본 발명에 따른 항체는 사람화된 항체이며, 이는 사람 불변 도메인으로부터 기원한 불변 도메인을 포함한다. 특히, 항체 경쇄 불변 도메인은 사람 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 기원하고/하거나 항체 중쇄 불변 도메인은 사람 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중쇄 불변 영역으로부터, 특히 사람 IgG4 중쇄 불변 영역으로부터 기원한다. "로부터 기원한"은 IgG4 (S228P) 또는 IgGl(E333A)와 같은 아미노산 치환에 의한 일부 점 돌연변이(punctual mutation)를 의미한다. 숙련가로부터 잘 공지된 이러한 돌연변이는 일반적으로 일부 모 쇄 특성을 변형시킨다. 예를 들면, 이들은 모 항체와 비교하여 면역원성을 거의 초래하지 않거나 Fcγ 수용체 결합을 폐기하거나 단량체 항체의 이량체화를 피하거나 항체가 사람 치료학적 용도를 위해 더 우수하도록 하는 이량체화를 안정화시킨다. 모 중쇄 및 경쇄 불변 도메인으로부터 기원한 본 발명의 항체는 서열 번호: 26, 서열 번호: 27 또는 서열 번호: 28에 제시된 서열 또는 이의 단편 단편 각각을 포함하거나 이로 이루어진다. 보다 특히, 항체 경쇄 불변 도메인은 서열 번호: 27에 제시된 서열로 이루어진다. 특히, 항체 중쇄 불변 도메인은 서열 번호: 26에 제시된 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 이루어진다. 보다 특히 항체 중쇄 불변 도메인은 서열 번호: 26에 제시된 서열로 이루어진다.
[76] 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 또는 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산 분자가 또한 본원에 제공된다. 특히, 상기 핵산 분자는 본원에 제공된 임의의 정의에 따라, 본원에 제공된 항체의 중쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자와 함께, 본원에 제공된 항체의 경쇄 가변 도메인 또는 경쇄를 암호화한다. 특히, 서열 번호: 9; 서열 번호: 10; 서열 번호: 11; 서열 번호: 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자가 본원에 제공된다. 특히, 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 또는 서열 번호: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특히, 상기 단리된 핵산 분자는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3에 제시된 서열로 이루어진 3개의 CDR을 포함하는 중쇄를 암호화하는, 특히 서열 번호: 7에 제시된 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 단리된 핵산 분자, 보다 특히 서열 번호: 13의 서열로 이루어진 제2의 단리된 핵산 분자화 함께 제공된다. 바람직한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산 분자의 조합이 제공되며, 상기 조합은 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1의 단리된 핵산 분자; 및 서열 번호: 13의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2의 단리된 핵산 분자를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 바람직한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산 분자의 조합이 제공되며, 상기 조합은 서열 번호: 18의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1의 단리된 핵산 분자; 및 서열 번호: 13의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2의 단리된 핵산 분자를 포함하거나 이로 이루어진다.
[77] 가변 및 불변 도메인 둘 다를 포함하는, 완전한 경쇄의 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 즉, 특히 서열 번호: 9 내지 12의 서열 및 서열 번호: 27 또는 28의 서열 중 하나를 암호화하는 폴리펩뉴클레오타이드, 특히 서열 번호: 30 또는 서열 번호: 31과 연결된 서열 번호: 15 내지 18의 서열 중 하나를 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 가변 및 불변 도메인 둘 다를 포함하는, 완전한 중쇄의 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 즉, 서열 번호: 7 및 서열 번호: 26을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 특히 서열 번호: 29와 연결된 서열 번호: 13을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오타이드와 함께 제공된다.
[78] 특히, 본원에 제공된 단리된 핵산 분자는 유리하게는 본원에 제공된 항체의 경쇄 및 임의로 중쇄를 암호화하는 서열 외에, 상기 항체 쇄를 암호화하는 서열로부터 상부로, 생산 세포내에서 발현되는 경우 상기 쇄의 분비를 허용하는 신호 펩타이드(signal peptide)를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 이들은 또한 상기 쇄를 검출하고/하거나 이의 정제를 촉진시키기 위한 하나 이상의 마커 펩타이드(들)을 암호화하는 하나 이상의 서열(들)을 포함할 수 있다.
[79] 본원에 제공된 핵산 분자의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터가 또한 본원에 제공된다. 특히, 상기 제공된 벡터는 포유동물 세포내에서 클로닝 및/또는 발현에 적합한 플라스미드이며, 이는 전사 및 발현을 위한 조절 서열을 포함한다. 따라서, 상기 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드, 특히 단락 [76] 내지 [78]에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다.
[80] 또한, 상기한 바와 같은 핵산 분자, 특히 벡터로 재조합된 세포 또는 세포주, 특히 포유동물 또는 조류 세포 또는 특히 도 2에 설명된 바와 같은 세포주가 본원에 제공된다. 예를 들면, 전반적인 푸코실화를 감소시키기 위해 유전적으로 변형된 차이니즈 햄스터 난모 세포(Chinese Hamster Ovary cell)가 있다. 실제로, 코어 푸코실화를 결여한 항체는 유의적으로 향상된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 나타낸다(von Horsten et al., 2010). 다른 예는 천연적으로 낮은 푸코실화 특성을 갖는 EB66 세포이다(Olivier et al., 2010). 항체는 또한 상기한 바와 같은 핵산 분자, 특히 벡터로 일시적으로 형질감염된 세포, 특히 실시예 2에 설명된 바와 같은, 특히 COS 세포에서 생산될 수 있다.
[81] 본원에 제공된 폴리펩타이드, 특히 항체 경쇄 및/또는 모노클로날 항체의 생산을 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 상기 폴리펩타이드, 항체 경쇄 또는 모노클로날 항체(또는 모노클로날 항체의 경쇄 및 임의로 중쇄)를 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포내에서 상기 폴리펩타이드의 회수가 가능하도록 하는 조건 하에서 발현시키는 단계 및 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다. 특히, 항체 또는 이들의 단편은 EB66 조류 세포와 같이, 낮은 푸코실화 특성을 나타내는 세포내에서 제조된다.
[82] 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드(특히 항체 경쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄) 및/또는 이의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자 및/또는 단리된 핵산 분자, 및 약제학적 비히클(vehicle)을 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본원에 제공된다. 상기 약제학적 조성물은 임의로 상이한 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 특히 전신계 투여용, 또는 국소 투여용으로 적합한 제형으로 제공된다. 특히, 국소 투여용, 특히 근육내 또는 피하 주사용, 자기 주사기(또는 주사기 펜(injector pen))을 사용한 주사용, 특히 경피 패치를 사용하는 경피 투여용, 점막내 투여용, 특히 비강내 또는 직장 투여용으로 적합한 조성물이 본원에 제공된다. 특히, 경구 투여를 통한 위장(GI) 관으로의 국소 투여용, 특히, 크론병 또는 UC와 같은 장 질환의 치료용으로 적합한 조성물, 특히 결장에 전달하기에 적합한 조성물이 본원에 제공된다. 특히, 전신계 투여, 특히 비경구 또는 장 투여용, 특히 정맥내 주사 또는 경구 투여용으로 적합한 조성물이 본원에 제공된다. 기술자가 인지하고 있는 바와 같이, 장 투여는 GI 관으로의 국소 투여, 또는 전신계 투여일 수 있다. 이러한 약제학적 조성물 또는 이들의 용도가 본원에 제공되는 곳은 어디에서나, 투여 비히클 및 이들의 용도가 또한 제공될 수 있음이 이해되어야만 하는데, 예를 들면, 주사가능한 약제학적 조성물이 분명하게 제공되는 경우, 조성물이 자체로서 뿐만 아니라 장치 속에 또는 상기 조성물의 투여 및/또는 주사를 허용하는 장치("전달 장치")와 함께 제공됨이 이해되어야만 한다. 전달 장치의 예는 자기 주사기, 특히 멀티체임버 주사기(multichamber syringe), 및 경피 패치를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 따라서, 전달 장치, 특히 자가주사기, 펌프, 또는 상기 조성물을 포함하는 경피 패치, 및 약제학적 조성물과 관련하여 하기 제공된 바와 같은 이의 용도가 본원에 제공된다. 또한 약제학적 조성물을 포함하는 키트(kit) 및 상기 조성물을 함유하고/하거나 상기 조성물의 투여에 적합한 국소 전달 장치, 특히 피하, 장 또는 경구 전달 장치, 특히 예비-충전된 주사기 또는 침이 없는 장치, 및 이의 용도가 본원에 제공된다. 약제학적 조성물은 액제, 특히 멸균 수성 액제로서, 현탁제로서, 고체로서, 특히 동결건조된 고체로서 포함하는 투여를 위해, 패치 상의 흡수(또는 흡착됨)를 위해 및/또는 재현탁 및 용액으로서, 필제, 정제 또는 특히 나노입자와 같이 지연되거나 연장된 방출을 지닌, 경구 투여에 적합한 다른 고체형으로서의 투여를 위해 임의의 적합한 형태로 제공되는데, 예컨대, 조성물은 상기 나노입자 등의 표면 상에, 또는 내부에 흡착된 폴리펩타이드를 지닌 나노입자를 포함한다. 약제학적 조성물의 형태 및 임의로 전달 장치의 특성은 본원에 제공된 바와 같은 활성 성분을 전신계적으로 또는 국소적으로 전달하기에 적합할 수 있는데, 즉, 활성 성분이 표적화된 세포, 조직, 기관에 활성 상태로 도달하기에 적합할 수 있다. 특히, 약제학적 조성물의 형태 및 임의로 전달 장치의 특성은 GI 관, 특히 결장에 전달하기에 적합할 수 있다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것으로 일컬어지나; 약제학적 조성물은 또한 이러한 담체가 약제학적 용도에 필요하지 않는 경우, 예컨대, 생성물이 순수한 동결건조된 고체로서 투여되는 경우, 유사한 용도 및 목적을 위한 담체없이 제공된다. 특히, 투여는 장 방출용, 특히 장 지연된 방출용으로 본원에 기술된 바와 같은 임의의 적합한 수단에 따라 수행된다.
[83] 또한, 활성 성분으로서, 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드(특히 항체 경쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄) 및/또는 항체(특히 모노클로날 항체), 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자를 포함하는 조성물, 또는 상기 정의한 바와 같은 약제학적 조성물이, 사람 환자에게 투여되는 경우, 사람 CD 127 양성 세포 생존 또는 확장, 특히 사람 CD 127 양성 효과기 세포, 특히 CD 127+ 기억 T 세포 생존 또는 확장, 특히 CD127+ 및 CD8+ 둘 다이거나, CD127+ 및 CD4+ 세포 둘 다인 기억 T 세포를 제어하는데 적합한 제형으로 본원에 제공된다. 특히,활성 성분으로서 항체(또는 상기한 바와 같은 다른 제제)를 포함하는 상기 조성물은 환자에게 투여되는 경우 수지 세포의 분화 및/또는 성숙을 제어하는데 적합한 제형이다.
[84] 본 발명자들은 놀랍게도 본원에 제공된 항체의 단일 주사가 지속된 효과를 허용하며, 염증 반응이 제공된 항체의 단일 투여에 의해 처리된 동물에서 상기 단일 투여 후 14개월, 및 심지어 18개월까지 길게 여전히 유의적으로 감소됨을 발견하였다. 본원에 제공된 폴리펩타이드, 특히 항체 경쇄 및 보다 특히 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자의 투여, 및 바람직하게는 단일 투여는, 바람직하게는 효과기 기억 T 세포에 있어서 신속하고/하거나 장기 지속된 효과를 갖는다. 신속한 효과는 상기 폴리펩타이드, 항체 쇄 또는 항체의 투여 후 1주내, 및 보다 바람직하게는 48시간내, 및 심지어 보다 바람직하게는 투여 당일에 관찰된다. 장기-지속 효과는 상기 폴리펩타이드, 항체 쇄 또는 항체의 가장 최근(및, 바람직하게는 단일) 투여 후 바람직하게는 적어도 12개월, 및 보다 바람직하게는 적어도 14개월 째에 관찰된다. 이러한 효과는 특히 가역적이다(특히 T 세포 반응은 새로운 예방접종에 의해 회복될 수 있다). 이러한 효과는 바람직하게는 항원 및/또는 반응-특이적이며 바람직하게는 측정가능한 림프고갈(lymphodepletion)과 관련되지 않는다(즉, 림프구의 전반적인 수는 일반적인 방법에 의해 측정된 바와 같이, 대상체에서 감소되지 않는다). 이러한 효과는 기타의 경우에 기억 T 세포의 클론 고갈로서, 또는 면역 T 기억의 가역적인, 항원 특이적인 고갈로서 정의될 수 있다. 효과기 기억 T 세포에서 이러한 투여 효과는 후에 본원에 제공된 폴리펩타이드, 항체 쇄 또는 모노클로날 항체로 처리된 예방접종된 대상체(특히, 개코원숭이), 및 처리되지 않은 예방접종된 대상체에서, 항원, 예컨대, 투베르쿨린에 대한 반응시 IFN-γ 분비 세포(예컨대, ELISPOT에 의해 측정됨)의 수준을 비교함으로써 평가될 수 있으며: 항원-특이적인 T 세포의 측정된 수준이 처리 후 관련 시점에서, 처리된 대상체에서 유의적으로 더 낮은 경우(바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 40% 더 낮은 경우) 효과가 관찰된다. 이러한 효과는 또한 기타의 경우에 제공된 항원에 대한 염증 반응, 예컨대, 국소 투여된 항원에 대한 반응시 국소, 특히 피부, 염증 반응을 평가함으로써 측정할 수 있다. 대안적으로, MHC 사량체 검정을 사용할 수 있다. 이러한 효과에 대해 시험하는 방법은 기술자에게 알려져 있으며 본원, 특히 실시예 6에 설명되어 있다.
[85] 또한, 본 발명자들은 놀랍게도 본원에 제공된 항체가 특히 T-세포 활성화에 있어서, 특히 염증 조직내에서, 특히 T-세포에 의한 사이토킨의 방출에 있어서 신속한 효과를 가질 수 있음을 밝혔다. 이러한 효과는 항체의 투여 후 1주내, 및 바람직하게는 48시간 내 및 심지어 보다 바람직하게는 24 시간 내에 관찰되며, 특히 IFNγ 생산(또는 방출)에 있어서의 감소로 관찰된다. 이러한 효과는 특히 국소적으로, 즉, 항체의 투여 부위 또는 전달 부위에서 관찰된다. 특히, 본원에 제공된 항체는 신속한 효과, 특히 T-세포에 의한 사이토킨의 방출에 있어서 신속한 국소 효과를 가지며, 특히 투여 24시간내 관찰된 효과를 갖는다. 항체가 국소 전달을 위해 투여되나 의도된 전달 부위에 직접 투여되지 않는 경우, 항체는 상기와 같이 전달 부위에서, 투여로부터 보다는 오히려 전달로부터 동일한 기간 내에 신속한 효과를 가질 수 있으며, 이는 숙련가가 인지하는 바와 같이 투여로부터 지연될 수 있거나 지연되지 않을 수 있다.
[86] 본원에 제공된 조성물은 또한 특히 알레르기 또는 자가면역성에 관여하는 세포에서 치료학적 면역조절 효과를 갖는 추가의 화합물을 포함할 수 있다. 설명의 목적을 위해, 목적한 예시적인 면역조절인자는 항-CD3, 항-ICOS 또는 항-CD28 항체와 같은 T 세포를 표적화하는 다른 모노클로날 항체 또는, CTLA4Ig 또는 항-CD40 항체와 같은 악세서리 세포(accessory cell)를 표적화하는 재조합 단백질 또는 항체이다.
[87] 본원에 제공된 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자, 단리된 핵산 분자, 세포 및/또는 조성물은, 추가의 생성물, 특히 상기와 같은 치료학적 면역조절인자 효과를 지닌, 특히 동시에 별도로 또는 연속적으로 투여하기 위해 의도된 제제를 포함하는 조합 생성물로서 제공될 수 있다. 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드(특히 항체 경쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄) 및/또는 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자, 및/또는 단리된 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포주, 및/또는 약제학적 조성물 및 임의로 다음을 추가로 포함하는 조합 생성물이 본원에 제공된다:
- 특히 예컨대, 본원에 제공된 항체와 함께 투여용으로 의도된, 치료학적 면역조절인자 효과를 지닌 제제(특히 여기서 상기 투여는 시간내 동시 또는 별도이고/이거나 여기서 상기 투여는 동일하거나 상이한 경로를 통한다); 및/또는
- 생성물의 투여를 위한 장치.
[88] 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드, 특히 항체 경쇄 및/또는 항체, 특히 모노클로날 항체 및/또는 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자 및/또는 핵산, 벡터, 세포 또는 세포주 및/또는 약제학적 조성물 또는 조성물은, 면역 반응, 특히 기억 T 세포 반응에 의해 영향받는 병리학 또는 병리학적 상태를 치료하기 위해 사람 환자에서 사용하기 위해 제공된다. 이러한 상태 또는 병리학은 이식 거부, 자가면역 질환, 알레르기 질환, 호흡성 질환, 만성 바이러스 감염, 만성 염증성 질환, 특히 만성 장 염증 질환, 림프종, 백혈병 또는 이러한 병리학이 CD 127 양성 세포 뿐만 아니라 IL-7 신호전달과 관련된 경우, 특히 수지 세포의 성숙에 있어서의 증가가 피해져야만 하는 경우, 고형 종양으로부터 야기되는 것들을 포함하는 다른 암 질환에 의해 유발된 것들을 포함한다. 따라서, 본 발명자들은 상기 제제의 사용을 특수한 알레르기성 피부 장애, 염증성 창자병(IBD), 특히 크론병(CD) 또는 궤양성 결장염(UC), 또는 원발성 쇼그렌 증후군(Primary Sjoegren Syndrome), 또는 전신 홍반성 루프스, 또는 전신 경화증 또는 다발 경화증, 또는 제I형 당뇨병 또는 급성 림프모구성 백혈병(예컨대, T-ALL) 또는 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 또는 CD 127+ 세포와 관련된 유방암, 신장암, 방광암, 폐암, 췌장암의 치료를 위해, 또는 시저리 림프종(Sezary lymphoma)과 같은 T 세포 피하 림프종의 치료를 위해, 또는 IL-7-R/TSLP 경로의 기능-획득 돌연변이를 지닌 급성 림프모구성 백혈병의 치료를 위해 또는 이식 거부 및/또는 이식이 필요하고/하거나 거의 이식하려고 하고/하거나 이식 중인 환자의 치료를 위해 고려될 수 있음을 입증하고 있다. 염증성 창자병(IBD), 특히 크론병(CD) 또는 궤양성 결장염(UC), 또는 원발성 소그렌 증후군, 또는 전신 홍반 루푸스, 또는 전신 경화증 또는 다발 경화증, 또는 제I형 당뇨병의 치료가 바람직한 구현예에서 고려된다. 특히, 본 발명은 바람직하게는 국소 투여에 의한, 의약으로서 사용하기 위한, 보다 특히 기관 또는 조직 이식 거부 또는, 자가면역 질환, 특히 류마티스 관절염, 전신 경화증, 다발 경화증, 제I형 당뇨병, 자가면역 갑상선염, 전신 홍반 루푸스, 원발성 소그렌 증후군, 및 염증성 질환, 특히 염증성 창자병(IBD), 보다 특히 크론병 및 궤양성 결장염 및 뇌척수염 및 알레르기성 질환 및 암 질환 및, 이식 및 호흡성 질환과 관련된 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료시 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체, 또는 단리된 핵산 분자, 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
[89] 우세한 면역관용 상태 또는, 대조적으로, 면역 반응의 수준의 제어가 요구될 수 있는 내성의 결여 뿐만 아니라 악성 CD127-양성 세포의 파괴도 초래하는 사람 환자내 면역 반응의 변경을 포함하는 병리학적 상태의 치료시 폴리펩타이드, 항체 경쇄 또는 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자의 용도가 본원에 제공된다.
[90] "치료(treatment)" 또는 "치료학적 치료(therapeutic treatment)"는, 수행된 투여 단계가 IL-7 경로와 관련된, 즉, CD 127 양성 세포의 활성화 또는 증식에 관여된 질환(들)을 앓고 있는 동물 또는 사람 환자의 임상 상태의 개선을 야기함을 의미한다. 이러한 치료는 IL-7 경로와 관련된, 즉, CD 127 양성 세포의 활성화 또는 증식에 관여하는 장애(들)와 관련된 증상을 제거하거나 완화시킴으로써, 동물 또는 사람 환자의 임상 상태를 개선시킴을 목표로 한다. 바람직하게는, 본원에 제공된 치료는 건강을 회복할 수 있도록 한다. 바람직하게는, 상기 치료는 면역 세포, 특히 수지 세포의 증가된 성숙으로 인하여 바람직하지 않은 부정적인 효과를 갖지 않는다.
[91] 특히 환자의 치료의 특수한 국면에서, 폴리펩타이드, 항체, 항원-결합 단편, 항체 모사체 분자, 폴리뉴클레오타이드, 세포 또는 세포주, 또는 조성물이 CD127-음성 세포를 보존하면서 CD127-양성 세포를 고갈시키는데 사용하기 위해 제공되고/되거나 의도되고/되거나 적합하다.
[92] 환자의 치료의 특수한 국면에서, 폴리펩타이드, 항체, 항원-결합 단편, 항체 모사체 분자, 폴리뉴클레오타이드, 세포 또는 세포주, 또는 조성물이 CD127-음성 세포에 있어 직접적인 효과가 거의 없거나 없으면서, CD127-양성 세포의 분화 및/또는 확장 및/또는 성숙, 특히 IL-7 및/또는 TSLP에 의해 유도된 분화, 확장, 또는 성숙을 방지하는데 사용하기 위해 제공되고/되거나 의도되고/되거나 적합하다.
[93] 환자의 치료의 특수한 국면에서, 폴리펩타이드, 항체, 항원-결합 단편, 항체 모사체 분자, 폴리뉴클레오타이드, 세포 또는 세포주, 또는 조성물이 Treg 세포를 보존하면서, IL-7-유도된 신호전달을 방해함으로써 나이브 및 기억 T 세포를 제거하고/중화시키는데 사용하기 위해 제공되고/되거나, 의도되고/되거나 적합하다.
[94] 환자의 치료의 특수한 국면에서, 폴리펩타이드, 항체, 항원-결합 단편, 항체 모사체 분자, 폴리뉴클레오타이드, 세포 또는 세포주, 또는 조성물이 항체의 세포독성 작용의 결과로서, 가능하게는 그러나 전적으로는 아니게 ADCC(항체-의존성 세포 세포독성) 및 임의로 CDC(상보체-의존성 세포독성)를 통해 림프구의 소집단, 또는 CD 127(정상 또는 병리학적 T 및 B 림프구, NK 세포, 수지 세포 및, 상피 세포를 포함하는 다른 세포 유형)을 발현하는 다른 세포 집단을 고갈시키는데 사용하기 위해 제공되고/되거나, 의도되고/되거나 적합하다.
[95] 또한 조합물 속의 활성 성분으로서 또는 이를 필요로 하는 환자에서 추가의 치료학적 요법으로서 사용하기 위한, 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드, 특히 항체 경쇄 및/또는 항체, 항원-결합 단편, 항체 모사체 분자, 폴리뉴클레오타이드, 세포 또는 세포주, 또는 조성물이 본원에 제공된다. 또한 이를 필요로 하는 환자에서 추가의 치료학적 요법에서 또는 조합물 속의 치료학적 활성 성분으로서 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드, 특히 항체 경쇄 및/또는 항체, 항원-결합 단편, 항체 모사체 분자, 폴리뉴클레오타이드, 세포 또는 세포주, 또는 조성물의 용도가 제공된다.
[96] 상기 국면에서, 고려된 용도는 또한 상기 제공된 핵산, 벡터, 세포, 세포주, 조성물 및 약제학적 조성물에 적용가능하다.
[97] 이식 거부, 자가면역 질환, 알레르기 질환, 호흡 질환, 만성 바이러스 감염, 만성 염증성 질환, 특히 만성 장 염증 질환, 림프종, 백혈병 또는 이들 병리학이 CD 127 양성 세포 뿐만 아니라 IL-7 신호전달 경로와 관련된 경우, 특히 수지 세포의 성숙에 있어서의 증가가 피해져야만 하는 경우의 고형 종양으로부터 야기되는 것들을 포함하는 다른 암 질환에 의해 유도된 것들과 같은 병리학에서 사용하기 위해 의도되고/되거나 적합한 상기 수단 및 생성물이 본원에 제공된다. 따라서, 상기 수단 및 생성물은 특히 알레르기성 피부 장애, 염증성 창자병(IBD), 특히 크론병(CD) 또는 궤양성 결장염(UC), 또는 급성 림프모구성 백혈병(예컨대, T-ALL) 또는 호지킨 림프종, 또는 CD 127+ 세포와 관련된 유방암, 신장암, 방광암, 폐암, 췌장암의 치료를 위해, 또는 시저리 림프종과 같은 T 세포 피하 림프종의 치료를 위해, 또는 IL-7-R/TSLP 경로의 기능-획득 돌연변이를 지닌 급성 림프모구성 백혈병의 치료를 위해 또는 이식 거부 및/또는 이식이 필요하고/하거나 거의 이식하려고 하고/하거나 이식 중인 환자의 치료를 위해 특히 의도되고/되거나 적합하다.
[98] 특히, 이식 거부, 자가면역 질환, 알레르기 질환, 호흡성 질환, 만성 바이러스 감염, 만성 염증성 질환, 특히 만성 장 염증 질환, 림프종, 백혈병 또는 이러한 병리학이 CD 127 양성 세포 뿐만 아니라 IL-7 신호전달 경로와 관련된 경우, 특히 수지 세포의 성숙에 있어서의 증가가 피해져야만 하는 경우, 고형 종양으로부터 야기되는 것들을 포함하는 다른 암 질환에 의해 유발된 상태 및/또는 병리학의 치료를 위해 사람에서 폴리펩타이드, 특히 항체 경쇄 및/또는 항체, 항원-결합 단편, 항체 모사체 분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 조성물의 용도가 본원에 제공된다. 따라서, 상기 생성물은 특히 알레르기성 피부 장애, 염증성 창자병(IBD), 특히 크론병(CD) 또는 궤양성 결장염(UC), 또는 급성 림프모구성 백혈병(예컨대, T-ALL) 또는 호지킨 림프종, 또는 CD 127+ 세포와 관련된 유방암, 신장암, 방광암, 폐암, 췌장암의 치료를 위해, 또는 시저리 림프종과 같은 T 세포 피하 림프종의 치료를 위해, 또는 IL-7-R/TSLP 경로의 기능-획득 돌연변이를 지닌 급성 림프모구성 백혈병의 치료를 위해 또는 이식 거부 및/또는 이식이 필요하고/하거나 거의 이식하려고 하고/하거나 이식 중인 자가면역질환 또는 알레르기성 질환의 환자의 치료를 위해 또는 급성 림프모구성 백혈병과 같은 백혈병의 치료를 위해 또는 림프종의 치료를 위해, 또는 암 질환의 치료를 위해, 또는 만성 바이러스 감염의 치료를 위해, 또는 염증성 질환, 특히 IBD, 특히 CD 또는 UC의 치료를 위해, 또는 호흡성 질환의 치료를 위해, 또는 이식과 관련된 증상의 예방 및/또는 치료를 위해서이다.
[99] 특히, 이식 거부, 자가면역 질환, 알레르기 질환, 호흡성 질환, 만성 바이러스 감염, 만성 염증성 질환, 특히 만성 장 염증 질환, 림프종, 백혈병 또는 이러한 병리학이 CD 127 양성 세포 뿐만 아니라 IL-7 신호전달 경로와 관련된 경우, 특히 수지 세포의 성숙에 있어서의 증가가 피해져야만 하는 경우, 고형 종양으로부터 야기되는 것들을 포함하는 다른 암 질환에 의해 유발된 상태 및/또는 병리학의 치료를 위해 사람 환자에서 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드(특히 항체 경쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄) 및/또는 항체, 항원-결합 단편, 항체 모사체 분자, 또는 단리된 핵산 분자, 세포, 및/또는 세포주 또는 조성물 및/또는 약제학적 조성물의 투여를 포함하는 치료 방법이 본원에 제공된다. 따라서, 상기 방법은 특히 알레르기성 피부 장애, 염증성 창자병(IBD), 특히 크론병(CD) 또는 궤양성 결장염(UC), 또는 급성 림프모구성 백혈병(예컨대, T-ALL) 또는 호지킨 림프종, 또는 CD 127+ 세포와 관련된 유방암, 신장암, 방광암, 폐암, 췌장암의 치료를 위해, 또는 시저리 림프종과 같은 T 세포 피하 림프종의 치료를 위해, 또는 IL-7-R/TSLP 경로의 기능-획득 돌연변이를 지닌 급성 림프모구성 백혈병의 치료를 위해 또는 이식 거부 및/또는 이식이 필요하고/하거나 거의 이식하려고 하고/하거나 이식 중인 자가면역질환 또는 알레르기성 질환의 환자의 치료를 위해 또는 급성 림프모구성 백혈병과 같은 백혈병의 치료를 위해 또는 림프종의 치료를 위해, 또는 암 질환의 치료를 위해, 또는 만성 바이러스 감염의 치료를 위해, 또는 염증성 질환, 특히 IBD, 특히 CD 또는 UC의 치료를 위해, 또는 호흡성 질환의 치료를 위해, 또는 이식과 관련된 증상의 예방 및/또는 치료를 위해 특히 적합하다.
[100] 본 발명자들은 UC를 앓는 환자에서, IL7, CD127 및/또는 TSLPR mRNA의 수준이 통상의 면역억제성 치료에 대한 반응을 예측하도록 함을 밝혔다: 반응자(즉, 치료에 대한 반응시 현저한 증상 감소를 나타내는 환자)는 비-반응자보다 낮은 수준의 IL-7 및 CD 127 및 보다 높은 수준의 TLSPR을 갖는다. 따라서, 궤양성 결장염(UC)를 갖는 환자, 특히 사람 환자로부터 수득한 샘플 속에서 IL7, CD 127 및/또는 TLSPR mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 단계, 및 IL7 및/또는 CD 127의 측정된 수준이 참고 그룹에서의 평균 수준보다 낮은 경우 및/또는 TSLPR의 측정되니 수준이 상기 그룹에서의 평균 수준보다 더 높은 경우 반응의 경향성이 상기 그룹과 비교하여 증가된 것으로 결론짓는 단계를 포함하여, 상기 환자에서 면역억제 치료에 대한 반응의 경향성을 평가하는 생체내(in vivo) 방법이 본원에 제공된다. 요구된 측정을 수행하는 방법은 숙련가에게 공지되어 있으며 특히 CD17의 단백질 발현 수준의 측정을 위한 CD127에 대한 항체의 용도를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드, 특히 상기 제공된 항체 경쇄 및/또는 모노클로날 항체는 특히 상기 방법에서 사용하기 위해 제공되며 이러한 방법은 특히 이러한 폴리펩타이드, 항체 경쇄 및/또는 모노클로날 항체를 사용하여 제공된다.
[101] 특히, 항체, 이의 항원-결합 단편 및 항체 모사체 분자로 이루어진 그룹으로부터 화합물을 선택하는 방법이 본원에 제공되며, 이러한 방법은 다음 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:
i. CD 127, 특히 사람 CD 127, 특히 CD 127의, 도메인 D1으로부터 및/또는 도메인 D2의 부위 2b로부터의 에피토프 서열에 대한 화합물의 결합을 시험하는 단계. 본원에 기술된, 특히 단락 [016]에 개시된 바와 같은, 도메인 D1으로부터 및/또는 도메인 D2의 부위 2b으로부터의 에피토프 서열, 특히 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36 또는 서열 번호: 96, 및 보다 특히 서열 번호 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 96으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 에피토프 서열 중 임의의 하나일 수 있다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 결합 시험은 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 96으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 에피토프 서열에 대한 화합물의 결합을 시험하는 단계, 및 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 에피토프 서열에 대한 화합물의 결합을 시험하는 단계를 포함할 수 있다. 화합물의 결합능은 당해 분야에 공지된 방법 중 임의의 하나, 특히 기술자에게 공지되고 특히 본원의 도 3 및 실시예 4 및 제WO 2015/189302호의 14쪽, 도 3, 4 및 6 및 각각의 범례, 및 실시예 1, 2, 6, 7에 설명된 블리츠 방법에 의해, 및/또는 본원에 개시된 실시에 10의 방법에 의해 시험될 수 있다; 및/또는
ii. 화합물의 존재하에서 IL-7, 특히 STAT5 포스포릴화에 의해 유도된 IL7-R 신호전달의 억제를 시험하는 단계. 화합물의 존재하에 IL7에 의해 유도된 억제는 본원의 실시예 8 및/또는 실시예 11에 개시된 방법에 의해 시험될 수 있다; 및/또는
iii. 화합물의 존재하에서 포스파티딜이노시톨 3-키나제의 활성화를 시험하는 단계. 화합물의 존재하에서 포스파티딜이노시톨 3-키나제의 활성화는 본원의 실시예 8 및/또는 실시예 11에 개시된 방법에 따라 시험할 수 있다; 및/또는
iv. 화합물의 존재하에서 ERK 신호전달 경로의 활성화를 시험하는 단계. 화합물의 존재하에서 ERK 신호전달 경로의 활성화는 본원의 실시예 8 및/또는 실시예 11에 개시된 방법에 따라 시험할 수 있다;
v. CD127의 도메인 D2의 부위 2b의 적어도 하나의 베타 쉬이트, 특히 적어도 서열 번호: 34의 핵산인 것으로 정의된, 부위 2b의 제3 베타 쉬이트에 대한, 및/또는 서열 번호: 35 및 서열 번호: 96의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열에 대한 화합물의 결합력을 시험하는 단계. 화합물의 결합력은 당해 분야에 공지된 방법 중 임의의 하나, 특히 숙련가에게 공지되고 특히 본원의 도 3, 실시예 3 및 실시예 4 및 제WO 2015/189302호의 14쪽, 도 3, 4 및 6 및 각각의 범례, 및 실시예 1, 2, 6, 7에 설명된 블리츠 방법에 의해, 및/또는 본원에 개시된 실시에 10의 방법에 의해 시험될 수 있다.
방법은 다음의 임의의 단계 중 임의의 하나, 또는 다음의 임의의 단계 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다:
vi. 화합물의 존재하에서 사이토킨 수용체의 γc 일반적인 쇄에 대한 CD 127, 특히 사람 CD 127의 결합을 시험하는 단계. 화합물의 존재하에서 사이토킨 수용체의 γc 일반적인 쇄에 대한 CD 127의 결합은 특히 단백질의 상호작용의 시험에 대해 숙련가에게 잘 알려지고, 예를 들면, 제WO2015/189302호의 실시예 21에 설명된 동시-면역침전 방법에서 평가할 수 있다. 특히, 세포는 시험된 화합물의 존재 또는 부재하에서 항온처리한 후, 단백질 복합체의 보존을 허용하는 조건 하에서 가용화하고, 수득되는 분해물을 항-CD127 면역침전에 적용시킬 수 있으며 CD127-함유 면역침전된 복합체 속의 γc의 존재를 항-γc 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 분석할 수 있다(역으로, 면역침전은 항-γc 항체를 사용하여 수행할 수 있고 CD127의 존재를 항-CD127 항체를 사용하여 평가할 수 있다); 및/또는
vii. 화합물의 존재하에서 CD127, 특히 사람 CD127의 내재화, 및/또는 CD127의 IL7-유도된 내재화를 시험하는 단계. 단락 [51] 내지 [53]에 정의된 본원의 CD127의 내재화는 추가로 정의되고/되거나 제2015/189302호, 특히 19 내지 20쪽의 단락 [59] 내지 [63] 및 도 16 및 실시예 5에 제시된 바와 같이 시험될 수 있다.
viii. 화합물의 존재하에서 TSLP에 의해 유도된 수지 세포의 성숙을 시험하는 단계. TSLP에 의해 유도된 수지 세포의 성숙은 본원의 단락 [47] 및 [48]에서 정의된다. 이러한 효과를 측정하는 수단은 숙련가에게 공지되어 있고 제WO 2015/189302호의 16 및 17쪽 및 이의 실시예 9에 개시되어 있다. 특히, 이러한 효과를 측정하는 수단은 화합물로 자극된 세포와 TSLP 만으로(화합물의 부재하에서) 자극된 세포 사이의 CD40의 발현의 측정을 포함한다.
방법의 특수한 구현예에서, IL7에 의해 유도된 IL7-R 신호전달의 길항제이고, 포스파디틸이노시톨 3-키나제 및/또는 ERK 신호전달 경로의 활성화를 유도하지 않는, CD127, 특히 사람 CD127에 특이적으로 결합하는 화합물이 선택된다. 방법의 보다 특수한 구현예에서, IL7에 의해 유도된 IL7-R 신호전달의 길항제이고, 포스파디틸이노시톨 3-키나제의 활성화를 유도하지 않고 ERK 신호전달 경로의 활성화를 유도하지 않는, CD127, 특히 사람 CD127에 특이적으로 결합하는 화합물이 선택된다.
[102] 특히, CD127에 대해 생성되고, 가능하게는 루바인(Louvain) 대학(벨기에 소재)에서 이용가능한 LOU/C Igkl 균주의 랫트와 같은, 비-사람 동물의 면역화로부터 생성된, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 면역화는 서열 번호: 22의 아미노산 서열의 단편, 및 특히 본원에 정의된 바와 같은 에피토프 서열을 포함하는 서열 번호; 22의 단편, 및 특히 서열 번호: 35 및/또는 서열 번호: 96의 단편을 면역원으로서 사용하여 수행할 수 있다. 하이브리도마는 비장 단핵 세포를 LOU 랫트 면역세포종 IR983F와 융합시켜 수득할 수 있다. 하이브리도마는 서열 번호: 22, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 96, 특히 서열 번호: 35 및/또는 서열 번호: 96으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 결합하는 분비된 모노클로날 항체의 능력에 따라 선별할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 면역원 화합물을 포함하며, 상기 면역원 화합물은 서열 번호: 22의 아미노산 서열의 단편, 특히 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 96, 특히 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 96, 보다 특히 서열 번호: 96의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단편이다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 면역원 화합물은 선형 펩타이드, 특히 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 선형 펩타이드, 보다 특히, 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 바람직하게는 이루어진 선형 펩타이드이다.
도면의 간단한 설명
도 1. 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열
패널 A. 중쇄(VH)의 서열. CDR은 굵은 글자체이다.
패널 B. N13B2로부터 기원한 사람화된 경쇄(LH)의 서열. CDR은 굵은 글씨체이다. N13B2-VL3은 48번 및 87번 위치에서 N13B2-h3의 원래의 골격 잔기(밑줄침)를 포함하고; N13B2-VL4-V48L 및 N13B2-VL5-F87Y는 상응하는 사람화된 골격 잔기를 포함하며; N13B2-VL6-V48L-F87Y는 사람화된 골격 잔기 둘 다를 포함한다.
도 2. 항체의 생산 - 안정한 형질감염
3개의 상이한 뱃치(batch)를 시판되는 혈청-유리된 배지를 사용하여, 통상의 방법에 따라 CHO-M 세포내에서 언급된 항체 각각에 대해 수행하였고, ELISA 검정에 의해 측정된, 대표적인 실험에서 수득된 역가를 여기에 기록한다. 수평 축은 배양 시간을 일 단위로 나타내는 반면, 수직 축은 수득된 항체 역가를 μg/mL 단위로 나타낸다.
도 3. CD127에 대한 결합
재조합 CD 127에 대한 나타낸 항체의 결합을 실시예 3에 설명된 방법에 따라 ELISA로 평가하였다. 수평 축은 항체의 농도를 ng/mL의 단위로 나타내고, 수직 축은 450 nm에서의 광학 밀도를, 임의의 단위로 나타낸다.
도 4. STAT5 포스포릴화의 억제
나타낸 항체에 의한 STAT5 포스포릴화의 억제는 실시예 5에 설명된 방법에 따라 세포형광분석법(cytofluorometry)으로 검정하였다. pSTAT5 항체로 염색된 CD3+ 세포의 퍼센트는 패널 A(수평축: ng/mL 단위의 항체 농도) 및 CD3+ 세포에 대한 pSTAT5 시그날의 평균 형광 강도(임의의 단위)는 패널 B에 지록되어 있다.
도 5. 기억 T 세포의 효과
패널 A. N13B2 주사 후 개코원숭이에서 DTH 반응(홍반 곡선의 곡선하 영역(Area under curve of erythema curves)).
투베르쿨린 챌린지에 대한 반응시 지연된-유형의 과민증을 예방접종된 개코원숭이에서, N13B2(n=7마리의 개코원숭이) 또는 부형제(n=4마리의 개코원숭이)의 투여 후, 실시예 6에 상세히 설명된 방법에 따라 피부 반응을 측정함으로써, 검정하였다. 수직 축은 임의의 단위로서, 홍반 곡선하 영역을 나타낸다. 값은 제공된 시점에서 수행된 피내 반응에 대해 기록되며, N13B2 또는 부형제(0일째에 투여됨)의 투여 전 또는 후에, 수평 축에 일 단위로 나타낸다. "Post-BCG"는 BCG를 사용한 새로운 예방접종 후 수행된 피부 반응 결과에 상응한다(nd = 측정되지 않음).
부형제 대조군은 150 및 180일 째에 및 "BCG-후" 측정되지 않았다(nd).
패널 B.
사람화된 N13B2 주사 후 개코원숭이에서의 DTH 반응(홍반 곡선의 곡선 하 영역)
투베르쿨린 챌린지에 대한 반응시 지연된-유형의 과민증을 예방접종된 개코원숭이에서, N13B2((AA892BB, 32257, V915GQ, 33874) 또는 완충액의 투여 후, 실시예 6에 상세히 설명된 방법에 따라 피부 반응을 측정함으로써, 검정하였다. 수직 축은 임의의 단위로서, 홍반 곡선하 영역을 나타낸다. 값은 사람화된 N13B2 또는 완충액의 투여 전("IDR1', 각각의 개코원숭이에 대해 좌측으로부터 첫번째 바아(bar)), 사람화된 N13B2 또는 완충액의 투여 후 4시간("IDR2", 좌측으로부터 두번째 바아), 사람화된 N13B2 또는 완충액의 투여 후 1, 2, 및 3개월("IDR3-5", 좌측으로부터 3 내지 5번째 바아) 및 4개월("IDR6", 단지 V915GA의 경우, 좌측으로부터 6번째 바아) 및 BCG를 사용한 새로운 예방접종 후("DDR7", 좌측으로부터 마지막 바아) 수행된 피내 반응에 대해 기록된다.
패널 C.
IFNγ ELISPOT를 투베르쿨린으로 챌린지하고 사람화된 N13B2로 처리한 BCG-예방접종된 개코원숭이에서 혈액 PBMC에서 수행하였다.
투베르쿨린 챌린지 후 AG-특이적인 T 세포 빈도를 사람화된 N13B2(AA892BB, 32257, V915GQ, 33874) 또는 완충액의 투여 후, 실시예 6에 상세히 설명된 방법에 따라 IFNγ ELISPOT 검정에 의해 검정하였다. 수직 축은 100.000개의 세포에 대한 스폿 빈도(spot frequency)를 나타낸다. 값은 항원의 부재하에 (W/o Ag, 좌측 바아) 또는 사람화된 N13B2 또는 완충액의 투여 전(바아의 각각의 그룹에 대해 좌측으로부터 첫번째 바아), 사람화된 N13B2 또는 완충액의 투여 4일 후(""IDR2"), 사람화된 N13B2 또는 완충액의 투여 후 2 및 3개월"IDR3-5") 및 4개월(단지 V915GA에 대해 "IDR6") 및 BCG를 사용한 새로운 예방접종 후(좌측으로부터 마지막 바아, 대시 기호처리됨)에 수행된 투베르쿨린 항원(우측 바아)를 사용하여 엘리스폿에 대해 기록되어 있다.
도 6. IBD 환자에서 IL-7, CD127 및 TSLP의 발현
IL-7, CD 127(IL-7Rα의 가용성 형태) 및 TSLP(완전한 길이)의 mRNA 발현 수준을 건강한 대조군 대상체(비-IBD 대조군), 소염 치료에 대해 반응하지 않았던(또는 더이상 반응하지 않는) 활성의 궤양성 결장염(UC)을 지닌 환자로부터의 건강하고 질환이 있는(염증이 있는) 결장 생검 샘플 및 정지성 질환, 즉, 샘플링 시기에 치유되었거나 완화된 UC 환자(반응자)로부터의 샘플에서 실시예 7에 상세히 설명된 방법에 따라 측정하였다. 수칙 축은 상대적인 형광성 단위를 나타낸다. 값은 제공된 그룹에서 각각의 샘플에 대해 플롯팅되고, 수평 바아는 그룹에 대한 평균 값을 나타내고 오차 바아는 표준 편차를 나타낸다. "*"는 p-값 < 0.05을 나타내고; "**"는 p-값 < 0.01을 나타내며; "****"는 p-값 < 0.0001을 나타낸다.
도 7. CD127 신호전달 경로의 억제
신호 경로의 활성화에 있어서 다양한 항-사람 CD 127 항체의 효과를 실시예 8에서 설명한 바와 같이 웨스턴 블롯으로 평가하였다. 도는 6명의 상이한 공여체(donor)로부터의 대표적인 결과를 나타낸다. "IL-7 없음"은 IL-7에 의해 모의시험되지 않았던 샘플에 상응한다. "C"는 항-CD 127 항체의 부재하에서 IL-7로 자극된, 대조군 샘플에 상응한다. 블롯의 좌측의 수평 선은 나타낸 분자량 마커의 이동을 나타낸다. 블롯의 우측의 화살표는 타이로신-포스포릴화된 STAT5, 타이로신 199-포스포릴화된 PI3-k p55, 포스포릴화된 Akt, 포스포릴화된 ERK 1/2, 및, 로딩 참고로서, GAPDH의 이동을 나타낸다.
도 8. UC 생검으로부터 T-세포 사이토킨 방출의 스모더링(smothering)
패널 A. 생체외(ex-vivo) 성장한 UC 생검 샘플에 의한 IFNγ 생산. 패널 B. 생체외 성장한 CD 생검 샘플에 의한 IFNγ 생산.
패널 둘 다에서, 샘플을 수득하고 실시예 9에 상세히 설명한 바와 같이 처리하였다. 각각의 기호는 IgG("Ctrl Ab") 또는 항-CD127 항체("aIL-7Rα")와 함께 배양된, 환자로부터의 하나의 샘플을 나타낸다. 연결된 기호는 동일한 환자로부터의 쌍을 이룬 샘플이다. ** 윌콕슨(Wilcoxon) 매치된 쌍 시험을 사용한 p<0.01. IFNy 생산은 항-IL7Rα mAb에 의해 유의적으로 억제되었다. 유사한 결과가 CD 생검 샘플에 대해 관찰되었다.
도 9. 항-사람 IL- 7Rα mAb 및 효능제 신호
STAT5, PI3K 및 ERK 신호전달 경로의 활성화에 있어서 다양한 항-사람 CD 127 항체의 효과를 실시예 11에 상세히 설명한 바와 같이 웨스턴 블롯으로 평가하였다. 도 9a는 외인성 재조합 사람 IL7의 존재하에서 7개의 상이한 공여체 세포 외의 하나로부터 나타낸다. 패널 A. "배지"는 임의의 항-사람 CD 127 항체가 없는 샘플에 상응한다. "IL7 없음"은 4개의 샘플이 IL-7로 자극되지 않았음을 의미한다. 3개의 샘플은 10μg/mL의 하나의 항-IL-7Rα mAb (N13B2-hVL6 또는 MD707-13-G4 또는 1A11-G1)로 예비처리되었다.
패널 B. pI3K 및 pERK의 정량화를 GAPDH 발현에 대해 교정하고 배지 대조군 조건으로 표준화하였다(n=7명의 상이한 공여체). 수직 축은 대조군에 대해 표준화된 발현을 나타낸다. 값은 단일 그룹에서 각각의 샘플에 대해 플롯팅되며, 수평 바아는 각각의 그룹에 대한 평균 값을 나타내고, 오차 바아는 표준 편차를 나타낸다.
도 10. IL7 경로 활성화에 대한 항-사람 IL7-Ra mAb의 효과
포스포-STAT5 시그날의 정량화는 GADPH 발현을 교정하며 배지 대조군 조건에 대해 표준화하였다. PBMC를 l0μg/mL의 하나의 항-IL7-Ra mAb(N13B2-hVL6 또는 MD707-13-G4 또는 1A11)로 예비처리한 후 10분 동안 37℃에서 5 ng/mL의 사람 IL7와 함께 항온처리하였다. 포스포-STAT5 신호의 정량화를 GAPDH 발현에 대해 교정하였다(n=7명의 상이한 공여체). 점선은 처리없이 배지만을 사용한 상태를 나타낸다. 값은 단일 그룹 중 각각의 샘플에 대해 플롯팅하고, 수평 바아는 그룹에 대한 평균 값을 나타내며, 오차 바아는 표준 편차를 나타낸다. "*"는 나타낸 그룹 사이의 p-값 < 0.05을 나타낸다.
도 11. 이중 효능제/길항제 항-IL7-Rα mAb는 전사 변형을 유도한다.
3.5 시간 동안 (1) 5ng/ml의 사람 IL7과 함께, (2) IL7의 부재하에, (3,4,5) 5ng/mL의 사람 IL7 및 상이한 항-사람 IL7-Ra mAb와 함께 ((3): 10μg/mL N13B2-hVL6; (4): 10μg/mL MD707-13-Ig4; (5): 10μg/mL 1A11)과 함께 항온처리한 사람 PBMC(n=7)의 RNA 서열 분석.
패널 A. IL7 자극과 대조군 조건 사이의 93개의 가장 차등적으로 발현된 유전자의 발현의 히트맵(heatmap)(거짓 발견율(False Discovery Rate: FDR) 5%, 배 변화(Fold change: FD) > 2).
패널 B. IL7 자극된, 대조군 및 IL7 및 항-사람 IL7-Rα mAb 조건에서 3개의 IL7 유도된 집단의 중간 프로파일의 정량화.
패널 C. 3.5 시간 동안 상이한 항-사람 IL-7Rα mAb(10 μg/mL의 N13B2-hVL6, 10μg/mL MD707-13-Ig4#l, 또는 10μg/mL 1A11)과 함께 IL-7의 부재하에 항온처리한 사람 PBMC(n=7)의 RNA 서열 분석의 벤다이어그램. 항-사람 IL-7Rα mAb 및 배지 대조군 조건과 비교한 481개의 차등적으로 발현된 유전자의 벤다이어그램(FDR 5%, FC > 1.5). 원 크기는 각각의 범주에 대한 유전자의 수에 비례한다.
실시예
실시예 1. 경쇄의 사람화 (Humanization)
달리 제공하지 않는 한, 다음의 중쇄를 본원에 기록된 모든 실험에서 사용하였다:
N13B2 사람화된 VH, 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 13):
CAGGTGCAGCTGGTCGAATCAGGGGGGGGACTGGTCAAACCCGGGGGCTCACTGCGTCTGTCATGTGCCG TCTCAGGCTTCACACTGAGCGACTACTATATGGCATGGATCCGACAGGCACCAGGCAAGGGACTGGAGTGG GTGTCTACTATTTCTGCCAGTGGCCTGAGGACCTACTATCCTGACAGTGTCAAGGGAAGGTTCACAATCTCAC GGGATAACGCTAAAAATTCCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAAGACACCGCTGTGTACTATT GCGCTCGCCCACTGTCCGCACACTATGGCTTCAATTACTTTGATTATTGGGGGCAGGGTACCCTGGTGACAG TCTCCAGC
N13B2 사람화된 VH, 아미노산 서열(서열 번호: 7): 도 1a 참고
다음의 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 항체 경쇄의 생산에 사용하였다(이의 아미노산 서열은 도 1b에 제공된다):
N13B2-h3 (서열 번호: 14):
GAGATCGTCATGACGCAGTCCCCCGCAACGCTCTCCGTCTCCCCGGGGGAACGCGCGACC CTGTCGTGCAGGACCTCCGAGGACATCTACCAAGGCCTCGCGTGGTATCAGCAGAAGCCC GGCCAGGCCCCGCGGCTGTTGATCTACTCCGCGAACACCTTGCACATCGGCATCCCGGCG CGCTTCTCGGGGTCAGGGAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCGTCGCTCCAGAGC GAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACGACTACCCCCTGGCGTTCGGGGGC GGGACCAAGGTGGAGATCAAG
N13B2hVL3 (서열 번호: 15):
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACG
ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG
GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGGTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC
CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG
GAAGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC
GGCACCAAGGTCGAGATCAAG
N13B2hVL4 (서열 번호: 16):
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACG
ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG
GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGCTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC
CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG
GAAGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC
GGCACCAAGGTCGAGATCAAG
N13B2hVL5 (서열 번호: 17):
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACG
ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG
GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGGTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC
CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG
GAAGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC
GGCACCAAGGTCGAGATCAAG
N13B2hVL6 (서열 번호: 18):
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACG
ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG
GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGCTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC
CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG
GAAGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC
GGCACCAAGGTCGAGATCAAG
각각의 VL 서열은 유전자 합성에 의해 수득하고, BsiWI 5' 및 3' 끝(extremity)을 지니고 코작(Kozak) 서열(GCCACC)을 ATG 앞에 첨가한 클로닝 벡터(pUC57) 내에 삽입하였다. 발현 벡터로서, 사람 IgG1의 CLkappa 불변 도메인을 함유하는, pFuseCLIg-hk 발현 플라스미드(Invivogen)를 사용하였다.
각각의 클로닝 플라스미드(VL-pUC57-Genscript)를 BsiWI 제한 효소로 분해하여 VL 삽입물(400 bp)을 추출하였다. 정제된 삽입물을 BsiWI 분해로 선형화된 발현 플라스미드 pFuseCLIg-hk 속에 연결시키고 탈포스포릴화하였다. 사람 불변 도메인 앞의 우측 배향으로 삽입된 VL 단편을 갖는 양성 클론을 증폭시키고 미니프렙-내독소 유리(Macherey-Nagel)에 의해 형질감염 단계에서 정제하였다. 중쇄를 유사한 방식으로 클로닝하였으며, 불변 도메인은 서열 번호:26로 이루어진다.
실시예 2. 사람화된 경쇄의 생산
시험한 사람화된 항-CD 127 항체의 경우, 안정한 클론의 형질감염 및 선택은 통상의 방법에 따라 수행되었다. 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)의 상이한 형질감염의 비에 상응하는 각각의 항체에 대한 3개의 상층액을 제조하여 2:1, 1:1.3, 및 1:2의 HC:LC를 시험하였다. 수득된 역가는 도 2에 기록하고, 300'000개의 세포/mL에서; 항생제의 부재하에서 통상의 방법에 따라 씨딩한 CHO 세포내에서 생산 후 수득하였다: 역가는 상응하는 항체의 고정된 항-사람 IgG(Fc)에서 ELISA로 검정하였으며 새로운 사실을 마우스 항-사람 카파 mAb 및 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-마우스 항체를 사용하여 수행하고 450nm에서 TMB 기질을 사용하여 비색법으로 나타내었다.
N13B2-h3 및 N13B2-hVL6의 생산을 또한 일시적인 형질감염 실험에서 시험하였다. 형질감염 1일 전에, COS 세포를 완전 배지(DMEM SVF10%(Hyclone) +PS 1% + Glu 1%)가 들어있는 P12 플레이트 속에 100 000 세포/웰(cell/well)에서 씨딩(seeding)하고 37℃에서 5% C02에서 배양하였다. 형질감염일에, COS 세포를 50 내지 90% 합치율(confluence)에서 사용하였다. 이들을 PBS로 세척하고 완전 배지 속에서 500μl로 유지시켰다. 0.6 μg의 VH 변이체 + 0.4μg VL 변이체를 200μl의 OptiMEM 배지 속에서 혼합하고 1 μl의 플러스 시약(Plus Reagent)(Invitrogen)을 가하였다(실온에서 15분 항온처리). 3.5μl의 리포펙타민 LTX(ΙNVITROGEN)+100μl를 혼합물에 가하고 25분 동안 실온에서 항온처리하였다. 전체 혼합물을 COS 세포 상에 1방울씩 침착시키고 48시간 동안, 37% 5% C02에서 항온처리하였다. 48시간 후, 상층액을 수거하고 원심분리하였다(1500rpm 1O분 4℃). 상층액을 ELISA n°TH-MO-43로 정량화하였다. 활성 검정은 ELISA TH-MO-44로 수행하였다.
실시예 3. CD127 - Elisa에 대한 결합
샌드위치 ELISA를 위해, 당나귀 항-사람 IgG(Fc 특이적인) 항체를 l.2μg/ml에서 P96-플레이트 위에서 코팅하고 정제된 항체를 가하여 표준 범위의 기능에서 농도를 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, 마우스 항-사람 경쇄, 카파 특이적인(Effimune, 클론 NaM76-5F3) 및 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-마우스(Jackson Immunoresearch, 참고 715-036-151) 항체를 가하고 통상의 방법으로 나타내었다.
활성 ELISA 검정을 위해, 재조합 hCD127(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 10975-H08H)을 플라스틱 위에서 1μg/ml에서 고정시키고 항-CD 127 항체의 희석물을 가하여 결합을 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, 마우스 항-사람 경쇄(카파 특이적인) 및 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-마우스 항체를 가하고 450nm에서 TMB 기질을 사용하여 통상의 방법으로 비색계로 나타내었다.
다음의 ED50 값을 수득하였다(50%의 최대 시그날을 달성하는데 필요한 농도):
Figure pct00001
표 1. 항체의 CD127에 대한 결합에 대한 ED50 값(ng/ml)
항체의 안정성은 항체를 7, 14, 또는 30일 동안 4℃, 25℃ 및 42℃에서 항체를 항온처리함으로써 연구하였다. CD127에 대한 항체의 결합은 항온처리 30일 후에서조차 여전히 탁월하였다. 항온처리 30일 후 ELISA에 의해 측정된 ED50의 값은 표 2에 기록한다.
Figure pct00002
표 2. 나타낸 온도에서 30일 항온처리 후, 항체의 CD127에 대한 결합에 대한 ED50 값(ng/ml)
실시예 4 CD127에 대한 결합 - 블리츠
본 방법은 블리츠(Forte Bio, C22-2 No 61010-1)를 사용하여 수행하였다.
재조합 hCD127(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 10975-H08H)/재조합 단백질(Sino Biological 제품 번호: 11612-H08H)을 50μg/ml에서 Fc 단편에 의해 항-사람 IgG Fc(AHC) 바이오센서(Forte Bio, 18-5063)내로 30초 동안 고정시켰다. 이후에, 항-CD127 항체를 20μg/mL(포화 농도)에서 120초의 연합 기간 동안에 이어, 동역학 완충액 속에서 120초 동안 항-CD 127 항체의 해리기간 동안 가하였다. 데이타 분석을 Blitz pro 1.2 소프트웨어로 수행하였으며, 이는 연합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 계산하였으며, 친화성 상수 KD(ka/kd)를 측정하였다. 결과는 표 3에 기록한다.
Figure pct00003
표 3. 사람 CD127 재조합 단백질에 있어서 항-CD127의 블리츠에 의한 친화성 분석
실시예 5. STAT5 포스포릴화의 억제
기능성 검정에서 IL7R의 억제를 시험하기 위해, 항체를 사람 PBMC와 함께 30분 동안 37℃에서, IL7(AbD Serotec, 참고 PHP046)로 O.1ng/ml에서 15분 동안 37℃에서 자극하기 전에, 항온처리하였다. 반응을 4℃에서 정지시키고, Cytofix/Cytoperm 키트(BD Bioscience, 참고 554722)로 15분 동안 4℃에서 고정시키기 전에 Perm 세척 완충액으로 세척하였다. 세포를 세척하고 FITC-표지된 항-CD3(BD Bioscience, 참고 557694)로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 이후에, 세포를 항온처리 Perm 완충액 III(BD Bioscience, 참고 558050) 속에서 30분 동안 4℃에서 투과시켰다. PBS BSA 1% 아지드 0.1%로 세척 후, 세포를 항-pStat5 항체(BD Bioscience, 참고 612599)로 표지된 Alexa-647로 30분 동안 실온에서 염색하였다. 샘플을 BD CantoII 세포형광분석기로 분석하였다. hPBMC-CD3+과 IL7은 pStat5의 포스포릴화를 유도하였지만, IL7의 부재하에서, 본 발명자들은 포스포릴화를 유도하지 못하였다. 결과는 도 4 및 하기 표 4에 나타내며, ED50, 즉, 당해 검정에서 신호의 50%에 도달하는 나타낸 항체의 농도를 나타낸다.
Figure pct00004
표 4. 항-CD127 항체에 의한 STAT5 포스포릴화의 억제
본 실험은 사람화된 아미노산에 의한 배선(germline)의 변형 및 구조적 잔기의 변형이 항-CD 127 항체의 생물학적 활성을 변화시키지 않았음을 입증하였다. 모든 시험한 변이체(N13B2-h3, N13B2-hVL3, N13B2-hVL4, N13B2-hVL5, N13B2-hVL6)는 N13B2의 앞서 생산된 참고 뱃치와 같이, hPBMC에서 IL7 자극 후 Stat5 포스포릴화를 억제할 수 있었다. N13B2-hVL6(최대로 사람화되고 최대로 최적화된)에 집중하여, 본 발명자들은 이것이 Stat5 포스포릴화를 억제하는데 있어서 이의 생물학적 활성을 참고 N13B2-h3보다 동일한 정도로 유지할 수 있었음을 알았다. 더욱이, 이러한 변이체는 42℃, 25℃ 또는 4℃에서 14일 항온처리 후에 매우 안정하였으며, 이는 응집 형성을 유도하지 않았고 이의 결합 활성을 유지하였다.
실시예 6. 기억 T 세포에 대한 효과
투베르쿨린-유도된 지연된 형태의 과민증 모델
개코원숭이를 바실러스 칼메테-구에린(bacillus Calmette-Guerin) 백신(0.1 ml; 2-8 105 CFU; Sanofi Pasteur MSD, 프랑스 리옹 소재)을 사용하여 다리의 상부 부위에 지연된 유형의 과민증(DTH) 피부 시험 4 및 2주 전에 2회 경피적으로 면역화시켰다. 피내 반응(IDR)을 2000 또는 1000 UI의 투베르쿨린 정제된 단백질 유도체(PPD; Symbiotics Corporation, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)의 피내 주사로 수행하였다. 염수(0.1 ml)를 음성 대조군으로 사용하였다. 주사 부위에서 피부 반응을 적어도 2명의 관찰자에 의해 슬라이드 캘리퍼(caliper square)를 사용하여 측정하고 직경이 > 4 mm인 경우 양성으로 고려하였다. 제2의 IDR을 3주 세척 기간 후 수행하고 동물에게 10 mg/Kg의 N13B2(n = 7) 또는 lOmg/kg(V915GA, AA892BB, 32257, 33874)(n = 4)의 사람화된 N13B2 또는 등가의 용적의 부형제(n = 4)의 1회 정맥내 주사로 제공하였다. 추가의 IDR을 주사 후 매달 수행하였다. 세척 기간 후, 일부 개코원숭이(N13B2로 이미 처리됨)를 BCG로 2회에 이어서 새로운 IDR로 경피내에 다시 면역화하였다. 판독물의 평균을 기록하고 각각의 시점에 대해 플롯팅하였다. 다수의 실험 조건을 비교하기 위하여, 홍반 반응을 계산을 위한 Graph Pad Prism 소프트웨어를 사용하여 곡선하 영역(AUC)으로서 정량화하였다.
엘리스폿
Ag-특이적인 T 세포 빈도를 IFN-g ELISPOT 검정(비-사람 영장류 IFN-g ELISPOT 키트; R&D Systems, 미네소타주 미네아폴리스 소재)을 사용하여 투베르쿨린으로 재자극시킨 새로이 분리된 PBMC 상에서 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다.
요약하면, 포획 항체(R&D systems, 제품 번호 SEL961)를 Elispot MultiScreen® HTS 필터 플레이트(Merck Millipore)의 각각의 웰에 가하고 4℃에서 일야 동안 항온처리하였다. 3회 세척한 후, 차단 완충액을 가하고 플레이트를 2시간 동안 주위 온도에서 항온처리하였다. 개코원숭이 PBMC를 개코원숭이의 혈액으로부터 피콜 구배 원심분리(Ficoll gradient centrifugation)(GE Healthcare Life Science, 프랑스 파리 소재)에 의해 새로이 추출하였다. 적혈구 세포를 이후에 분해하고 세포를 적절한 농도에서 투베르쿨린 정제된 단백질 유도체가 있거나 없는 배양 배지(페니실린-스트렙토마이신이 보충된 TexMacs 배지(Gibco)) 속에서 재구성시키기 전에 세척하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% C02에서 18 내지 24시간 동안 항온처리하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 검출 항체(R&D systems, 제품 번호 SEL961)를 가하고 4℃에서 24시간 동안 항온처리하였다. 스트렙타비딘-AP(R&D systems, 제품 번호 SEL002)를 3회 세척 후 가하고 주위 온도에서 2시간 동안 2시간 항온처리하였다. 3회 세척을 수행하였다. BCIP/NBT(R&D systems, 제품 번호 SEL002)를 가하고 암실에서 30분 동안 두었다. 세척 완충액을 사용한 수회 세척 및 탈이온수를 사용한 1회 세척이 필수적이었다(도 5c).
동물
개코원숭이(아누비스 캐코원숭이(Papio anubis); 7-14 kg)를 기관(Centre National de la Recherche Scientifique Centre de Primatologie)(프랑스 로세 소재)으로부터 입수하였다. 동물을 INSERM unit 1064의 대형 동물 시설에 가두었다. 동물 연구는 프랑스 국립 윤리 위원회(French National Ethics Committee)에 의해 승인되었다.
결과
제1 실험에서, 투베르쿨린을 사용한 첫번째 IDR을 이 시기(-30일)에 치료를 받지 않은 BCG-예방접종된 개코원숭이에서 수행하였다. 1개월의 세척 기간 후, 두번째 IDR을 10 mg/Kg의 N13B2의 정맥내 주사 후 4시간 및 매월 수행하였다(백색 바아). 마지막 IDR은 BCG를 사용한 새로운 예방접종(항체 주사 후 14개월) 후 수행하였다. 대조군 동물(검정색 바아)에게 유사한 용적의 부형제를 정맥내 제공하고 동일한 프로토콜을 사용하여 챌린지하였다. 결과는 항-IL7Ra 키메라 항체가 단일 투여 후 매우 긴 기간 보호(14개월까지)를 유도하였음을 나타내었다. 반응은 새로운 예방접종 후에만 회복되었다.
다른 실험에서, 투베쿨린을 사용한 첫번째 IDR을 BCG-예방접종된 개코원숭이(대쉬처리된 바아 - 예컨대, V915GA의 경우 IDR1)에서 수행하였다. 1개월의 세척 기간 후, 두번째 IDR을 10 mg/Kg의 사람화된 N13B2(실선 바아 - 예컨대, V915GA의 경우 IDR2-6)를 정맥내 주사한 후 4시간째에 및 매월 수행하였다. 마지막 IDR을 BCG 및 투베르쿨린(점선처리된 바아 - 예컨대, V915GA의 경우 IDR7)을 사용한 새로운 예방접종 후 수행하였다. 대조군 동물(검정색 바아)에게 유사한 용적의 부형제를 정맥내 제공하고 동일한 프로토콜로 챌린지하였다. 결과는 사람화된 N13B2가 또한 4마리의 평가된 개코원숭이 중 3마리에서 단일 투여 후 장기간 보호를 유도하였음을 나타내었다. "33874" 동물은 항체 주사 직 후 초기 반응자이었지만 반응은 1개월 후 자발적으로 발견되었다.
혈액 PBMC을 투베르쿨린으로 생체외에서 재-자극시켰다. 투베르쿨린의 존재 또는 부재하에서 첫번째 IFNγ 엘리스폿을 BCG-예방접종된 개코원숭이(대쉬처리된 바아)에서 수행하였다. 두번째 IFNγ 엘리스폿을 10 mg/Kg의 사람화된 N13B2(채워진 바아)를 주사한 후 4일째에 수행하였다. 이후에 새로운 ELISPOT을 생체내에서 투베르쿨린을 사용한 각각의 새로운 IDR에서 매달 수행하였다. 마지막 IFNγ 엘리스폿을 BCG(점선처리된 바아)를 사용한 새로운 예방접종 후 수행하였다. 결과는 사람화된 N13B2가 장기간 반응자 동물에서 항원-특이적인 기억 T 세포 고갈을 유도하였음을 나타내었다. "33874" 개코원숭이는 DTH 모델에서 장기간 보호되지 않는 것과 동등하게 투베르쿨린-특이적인 기억 T 세포의 유의적인 감소를 나타내지 않았다. BCG를 사용한 새로운 예방접종 후, 장기간 반응자 동물은 기본 수준(mAb 주사 전)으로 회복하는 항원-특이적인 기억 T 세포의 증가된 빈도를 나타내었고 이는 생체내에서 DTH 반응의 회복과 관련되어 있다. 이와 함께, 이러한 결과는 사람화된 N13B2에 의해 유도된 장기간 보호가 약물의 장기간 효과를 설명하는 항원-특이적인 기억 T 세포와 관련되어 있음을 입증하였다.
실시예 7. IBD 환자에서 IL-7, CD127 및 TSLP의 발현
Plane 11 et al. Gut 2013에 상세히 설명된 바와 같이 수득한 미가공 mRNA 발현 데이타를 도 6에 대한 범례에서 상세히 설명된 바와 같이 분석하였다.
실시예 8. 항-CD127 항체와 IL7을 사용하여 자극시킨 사람 PBMC의 신호전달 경로
IL7 신호전달 경로를 37℃에서 30분 동안 10 μg/ml의 가용성 항-사람 CD 127 항체와 함께 항온처리하고, IL7(AbD Serotec, 참고 PHP046)로 5 ng/ml에서 10분 동안 37℃에서 자극시킨 사람 PBMC의 분해물로부터 연구하였다. 웨스턴 블롯을 7.5% 폴리아크릴아미드 겔 속에서 세포 분해물의 20 μg 단백질을 사용한 환원 조건 하에서 수행하고 니트로셀룰로즈 막(GeHealthcare)에 블롯팅하였다. 블롯을 5% BSA-트리스 완충액 염수(TBS)로 포화시키고 1% BSA-TBS 중 1/1000(4℃에서 밤새)에서 포스포-Stat5, 포스포-PI3-키나제 p85, 포스포-Akt 및 포스포-ERKl/2 항체(Cell Signalling Technology)를 사용한 후 1/2000에서 1시간 동안 실온에서 폴리클로날 염소 항-토끼 표지된 서양고추냉이 퍼옥시다제 항체(Cell Signaling Technology), 또는 1% BSA-TBS중 1/1000(4℃에서 밤새)에서 GAPDH 항체(Santa Cruz)에 이어서 1/2000에서 폴리클로날 염소 항-마우스 표지된 서양고추냉이 퍼옥시다제 항체(Jackson Immunoresearch)에 의해 1시간 동안 실온에서 사용하여 포화시켰다. 막은 LAS-3000 영상 시스템(Fujifilm)을 사용하여 화학발광성으로 나타내었다. 따라서 다음의 항-사람 CD127 항체를 검정하였다: N13B2-h3 및 N13B2-hVL6(본원에 개시된, 항-부위 l/2b 항체 둘 다); MD707-13-G4(국제 특허원 제WO2013/056984호에 개시된 "항-부위 1 항체") 및 1A11(GSK 특허 제WO2011/094259호에 개시됨).
실시예 9. IBD 조직에서 T-세포 사이토킨 방출에 대한 효과
IBD를 지닌 환자로부터의 생검을 생체외 질환의 염증 모델로서 사용할 수 있으며 배양 24시간 후 높은 수준의 전염증성 사이토킨을 자발적으로 방출하는 것으로 본원에 밝혀져 있다(UC: IFNy, 130± 19 pg/ml; IL-6, 4042 ± 529 pg/ml; IL-8, 25626 ± 1640 pg/ml - CD: IFNy, 180± 38 pg/ml; IL-6, 3653 ± 734 pg/ml; IL-8, 15540 ± 2452 pg/ml [UC 및 CD 각각에 대한 평균 ± sem]).
항-CD 127 mAb를 IBD를 지닌 20명의 환자(크론 질환을 지닌 10명 및 궤양성 결장염을 지닌 10명)의 염증이 있는 결장 점막으로부터 취한 외과 표본을 사용하여 본 기관 배양물 검정에서 10μg/ml로 적용시키고 배양물은 37℃에서 24시간 동안 10μg/ml의 IgG 대조군 mAb 또는 차단하는 항-사람 IL-7Rα mAb가 들어있는 배지 속에서 수행하였다. 각각의 환자로부터의 쌍을 이룬 대조군 표본을 샘플링하고 동일한 조건 하에 항-CD 127 항체 대신 IgG를 대조군을 사용하여 배양하였다. 사이토킨 농도를 생체외 배양된 샘플의 상층액 속에서 ELISA(하기 설명한 바와 같이)로 측정하였다.
생체외 성장한 UC 생검 샘플에 의한 IFNγ 생산은 항-IL7Ra mAb에 의해 유의적으로 억제되었다. 유사한 결과가 다량의 IFNγ를 분비하는 일부 CD 생검 샘플에 대해 관찰되었다.
생체외 기관 샘플링 및 배양
점막 절제 조직을 사용한 경우, 작은 생검 크기의 단편을 가위를 사용하여 절단하였다. 다음에 생검 또는 생검-크기 단편을 L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 50 μg/mL 겐타마이신이 보충된 300 μL의 혈청 유리된 HL-1 배지(Lonza, Cambridge Bioscience, 영국) 속에 두었다. 점막 이식체를 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 항온처리하였다. 10μg/mL에서 사용된 각각의 시험된 항체(N13B2) 또는 IgG 대조군을 항온처리 시간의 시작시에 배지에 가하였다. 최종적으로, 상층액 및 생검 물질을 급속 동결시키고 추가의 분석을 위해 -70℃에서 저장하였다.
효소-연결된 면역흡착(ELISA) 검정
생검 상층액 속의 사이토킨 생산을 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA)으로 측정하였다. ImmunoTools(#31673539, Friesoythe, 독일)로부터의 사람 재조합 IFN-γ을 제조업자의 설명서에 따라 사용하였다.
실시예 10. 에피토프 특징화와 관련된 항-사람 IL7-Ra 항체의 비교:
질량 분광법 분석: 펩타이드 미세배열을 사용한 항체 프로파일링
펩타이드 테크놀로지즈(peptide Technologies)의 PepStarTM 펩타이드 미세배열(microarray)은 유리 표면에 화학선택적으로 및 공유결합으로 고정된 항원 또는 다른 공급원으로부터 기원한 정제된 합성 펩타이드를 포함한다. 최적화된 친수성 링커 모이어티를 유리 표면과 항원-기원한 펩타이드 서열 사이에 삽입하여 입체 장애로 유발된 거짓 음성을 피한다. 기술적 이유로, 모든 펩타이드는 C-말단 글리신을 함유한다. 샘플의 프로파일링 실험을 52개의 펩타이드로 이루어진 펩타이드 라이브러리에서 수행하였다. 펩타이드의 완전한 목록은 하기 나타낸다:
Figure pct00005
표 5. 펩타이드 미세배열 검정에 사용된 펩타이드의 목록
총 4개의 샘플을 다중웰-양식(Multiwell-format)을 이용하여 미세배열 슬라이스 상에서 항온처리하였다. N13B2-h3VL6 항체 및 다른 샘플(MD707-13, HAL 및 1A11)의 경우, 6개의 상이한 농도를 적용하였다(10 μg/ml; 2 μg/ml; 1 μg/ml; 0.1 μg/ml; 0.01 μg/ml; 0.001 μg/ml). 일련의 샘플 희석물을 1시간 동안 30℃에서 21개의 개개 미니-배열(샘플 희석당 1개의 미니-배열)을 함유하는 다중-웰 미세배열 슬라이스 위에서 1시간 동안 30℃에서 항온처리하였다. 샘플 항온처리 후, 제2의 항 사람 IgG 항체를 1 μg/ml에서 가하고 1시간 동안 반응시켰다. 제2의 항체 만을 적용하는 추가의 대조군 항온처리를 동일한 미세배열 슬라이스에서 나란이 수행하여 펩타이드에 대한 거짓-양성 결합을 평가하였다. 세척 및 건조 후, 슬라이드를 고-해상도 레이저 스캐너를 사용하여 635 nm에서 스캐닝하여 형광성 강도 프로파일을 수득하였다. 수득되는 영상을 정량화하여 각각의 펩타이드에 대한 평균 픽셀 값(pixel value)을 수득하였다. 영상을 정량화하여 각각의 펩타이드에 대한 평균 픽셀 값을 수득하였다. 제2의 항체 항-사람 IgG를 Cy5로 1 μg/ml에서 표지하였다.
완충액 및 용액. 사용된 완충액은 0.05% 트윈20(JPT)을 함유하는 TBS-완충액 및 검정 완충액 T20(Pierce, SuperBlock TBS T20, #37536)이었다. 획득 및 분석을 펩타이드 미세배열(JPT Peptide Technologies GmbH, 독일 베를린 소재; 뱃치 #2668, 다중-웰 항온처리 챔버, Axon Genepix Scanner 4200AL)을 사용하여 수행하였다. 미세배열을 고 해상도 형광성 스캐너를 사용하여 스캐닝하였다. 레이저 설정 및 적용된 해상도는 모든 수행된 측정에 대해 동일하였다. 수득되는 영상을 분석하고 스폿-인식 소프트웨어 GenePix(Molecular Devices)를 사용하여 정량화하였다. 각각의 스폿의 경우, 평균 신호 강도를 추출하였다(0 내지 65535 임의 단위).
추가의 데이타 평가를 위해, 소위 MMC2 값을 측정하였다. MMC2는 변이 계수(CV) - 평균 값으로 나눈 표준-편차가 0.5보다 큰 경우를 제외하고는 미세배열에서 모든 3개의 예의 평균 값과 동일하다. 이 경우 2개의 가장 가까운 값(MC2)의 평균을 MMC2로 지정한다.
중수소 분석
HDX-2 시스템(Waters S.A./N.V.; 벨기에 젤릭 소재)을 사용하여, 재조합 사람 CD 127 및, 0 또는 1 몰 당량의 mAb를 혼합하고 99.9% D2O, 1OmM 인산나트륨, 1OOmM NaCl, pH 6.8 속에서 90%의 최종 D2O 함량 및 27.5μΜ의 CD127 또는 CD127/mAb 복합체 농도로 희석시켰다. 수소-중수소 교환을 20.0℃에서 30분 동안 수행하였다. 교환을 1:1(v/v) 희석의 샘플과 1OOmM 인산나트륨, 4M 구아니딘-HCl, 0.4M TCEP, pH 2.3에 의해, 1.0℃에서 정량화하여 2.5의 최종 pH를 생성시켰다. 2분 후, 퀀칭된(quenched) 샘플을 20.0℃에서 온라인 펩신 분해를 위해(Enzymate BEH Pepsin, 2.1 x 30 mm; 5μm) HDX 매니저(manager)에 로딩한 후, 탈염(Acquity BEH CI 8 Vanguard 2.1 mm x 5 mm; 1.7 μm) 및 아세토니트릴(pH 2.5) 중 0.2% 포름산의 5% 내지 40% 구배를 사용한 역상 분리(Acquity BEH CI 8 1.0 mm x 100 mm; 1.7 μΜ)를 10분 동안 40μ1/min의 유동 속도로 0.0℃에서 수행하였다. 질량 분광법 분석을 Waters Xevo G2-XS ESI-Q-TOF 질량 분광기에서 양성 이온 방식으로, 록스프레이 교정(lockspray correction)으로 수행하였다. 약한 공급원 조건(온도: 90℃, 모세관 전압: 2.5kV, 샘플링 콘(sampling cone): 30V, 탈용매화 가스 유동: 800L/h, 탈용매화 온도: 250℃)을 사용하여 적절한 탈용매화를 보증하면서 역-교환을 최소화시켰다(73). 펩타이드 확인은 PLGS 3.0.2 및 UNIFI 1.8을 사용하여, MSE 방식으로 수집된 충돌 유도된 해리에 의해 보조되었다. 중수소 혼입을 DynamX 3.0에서 측정하였다. 구조적 도를 PDB ID 3DI3(19)으로부터 PyMOL 1.8.2.3(Schroedinger LLC, Cambridge, 미국 매사츄세츠 소재)를 사용하여 제조하였다. 일염기성 및 이염기성 인산나트륨, 염화나트륨, 구아니딘 하이드로클로라이드, 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP), 50% 수산화나트륨, 및 포름산은 Sigma Aldrich(Schnelldorf, 독일)로부터 최대 이용가능한 순도에서 구입하였다. LC-MS 구배 용매는 Biosolve Chimie (Dieuze, 프랑스), 중수소 산화물(99.9%> D) 및 중수소 산화물 중 20%> 염화중수소(99.96%> D)는 Cambridge Isotope Laboratories (Andover, 미국 메사츄세츠)로부터, 염산 37%은 VWR International (Fontenay-sous-Bois, 프랑스)로부터, 및 소 사이토크롬 C 분해물은 Thermo Fisher Scientific (Germering, 독일)으로부터 구입하였다. Amicon 초-원심분리 필터(0.5 niL; 10 kDa 컷오프(cutoff))는 Merck Millipore (Molsheim, 프랑스)로부터 구입하였다.
결과
상이한 항-IL7Ra mAb의 선형 펩타이드 배열에 의한 에피토프 특성화는 2개 유형의 길항제 mAb를 확인하였다: (1) 2개의 다른 그룹(제WO/2011/094259호에 기술된 클론 1 A11 및 제WO/2011/104687호에 기술된 클론 HAL)에 의해 앞서 기술된 바와 같고, MD707-13을 포함하는, IL-7과의 상호작용의 영역(부위-1)에 대한 mAb 결합, 및 (2) 부위-1 및 IL-7Rα와 γ-쇄 소단위 사이의 이종이량체화의 예측된 도메인(부위 -2b)(Walsh 2012)을 중첩하는 에피토프 둘 다에 결합하는, 본 발명의 mAb, 즉, N13B2-h3VL6.
고도로 및 유사한 친화성(KD가 2.10-10M인 부위-1/2b에 대한 결합제 및 유사한 KD가 5.10-10M인 부위-1에 대한 결합제)을 지닌 N13B2-h3VL6 및 MD707-13을 사람 IgG4 Fc 동형(Fab-아암(arm) 교환을 방지하기 위한 S228P 힌지 돌연변이 함유)을 사용하여 재조합적으로 발현시키고 제WO/2011/094259호에 기술된 유사한 친화성을 지닌, 앞서 기술된 다른 부위-1 mAb, 클론 1A11(6.10-10M의 KD)와 비교하여 클리닉(NCT02293161)에서 개발된 바와 같은 사람 IgGl Fc 동형을 사용하여 재조합적으로 발현시켰다. 질량 분광법을 사용한 수소 중수소 교환(Hydrogen Deuterium Exchange with Mass Spectrometry: HDX-MS)을 사용한 구조적 에피토프의 분석은 앞서의 관찰을 확인하였으며 본 발명의 항체, 즉, N13B2-h3VL6(부위-1/2b mAb)가 부위-1의 수개의 펩타이드내 중수소 혼입으로부터 부위-2b를 중첩하는 펩타이드까지 보호하였지만, 다른 2개의 mAb(MD707-13 및 1A11)는 부위-1으로부터의 펩타이드내 중수소 혼입만을 유의적으로 방지하였음을 입증하였다(데이타는 나타내지 않음).
본 발명의 항체는 도메인 1으로부터 부위 1 상에 국재화된 구조적 에피토프 및 사람 CD127의 부위 2b 상에 국재화된 구조적 에피토프를 인식하는 유일한 것이었다.
실시예 11. IL-7 경로의 효능제 및/또는 길항제가 되도록 하는 이들의 능력에 대한 항-사람 IL-7Rα 항체의 비교
웨스턴 블롯팅
새로이 단리된 사람 PBMC를 30분 동안 37℃에서 10μg/ml의 항-사람 IL-7Rα mAb와 함께 항온처리한 후, 단독으로 또는 5ng/ml의 재조합 사람 IL-7(AbDSerotec)과 함께 10분 동안 37℃에서 배양하였다. 빙상에서의 반응을 중지시킨 후, 세포 분해물을 RIPA 완충액(프로테아제 억제제 콕테일 함유)을 사용하여 제조하였다. 단백질(15μg)을 환원 조건 하에서 7.5% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 용해하고 니트로셀룰로즈 막(GeHealthcare)에 표준 방법을 사용하여 고정시켰다. 블롯을 5% BSA-트리스 완충액 염수로 세척하고 1% BSA-TBS 중 포스포-STAT 5, 포스포-PI3K p55 또는 포스포-ERK 특이적인 항체와 함께 항온처리(4℃에서 밤새)한 후, 폴리클로날 염소 항-토끼 서양고추냉이 퍼옥시다제-표지된 항체(Cell Signaling Technology)를 사용하여 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 대안적으로, 블롯을 1% BSA-TBS 중 GAPDH 항체(Santa Cruz)룰 사용하여 염색(4℃에서 밤새)한 후, 폴리클로날 염소 항-마우스 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 항체(Jackson Immunoresearch)를 사용하여 1시간 동안 실온에서 염색하였다. 막은 LAS-3000 영상 시스템(Fujifilm)을 사용하여 화학발광성에 의해 나타내었다.
RNA 서열분석
새로이 단리한 사람 PBMC를 10μg/ml의 항-사람 IL-7Rα mAb(37℃에서 30분)와 함께 항온처리한 후 단독으로 또는 5ng/ml의 재조합 사람 IL-7(AbDSerotec)과 함께 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 반응을 빙상에서 중지시키고, 세포 펠렛(pellet)을 RNase/DNase 유리 수(free water) 속의 1% β 머캅토에탄올을 함유하는 RLT 완충액(Qiagen) 속에 재현탁시키고 -80℃에서 저장하였다. RNA를 제조업자의 설명서(Qiagen)에 따라서 RNA 미니 추출 키트를 사용하여 추출하였다. RNA의 품질 및 양을 적외성 분광법(Nanodrop) 및 Agilent 생물분석기(bioanalyzer)(Agilent RNA 6000 Pico Kit)를 사용하여 분석하였다. Smart-Seq2 라이브러리를 Broad Technology Labs를 사용하여 제조하고 Broad Genomics Platform을 사용하여 일부 변형된 SmartSeq2 프로토콜에 따라 서열분석하였다. 요약하면, 총 RNA를 RNA-SPRI 비드를 사용하여 정제하고, 폴리A+ mRNA를 cDNA로 역전사하고, 증폭된 cDNA를 각각의 샘플에 대해 특이적인 바코드의 조합을 사용하여 각각의 변환된 전사체의 각각의 단편을 바코드화하는 이중-색인화(dual-indexing)를 사용한 트랜스포존-기반 단편화에 적용시켰다. 서열분석은 쌍을 이룬-말단 2x25bp로서 각각의 색인에 대해 추가로 8회 주기로 수행하였다. 데이타는 바코드로 분리하고 디폴트 설정을 사용하는 Tophat 버젼 2.0.10을 사용하여 정렬하였다. 전사체를 Cuffquant 버젼 2.2.1을 사용하는 Broad Technology Labs 컴퓨터 파이프라인에 의해 정량화하였다. 요약하면, 판독물의 50%가 정렬된 경우, 및 적어도 100,000개의 쌍이 샘플당 정렬된 경우, 데이타를 CuffNorm를 통해 가공하였다. "기하학적" 표준화, 및 log2 -전환된 FPKM 값(백만 맵핑된 단편당 전사체의 킬로염기당 단편)으로서의 발현 수준 정보를 포함하는, 디폴트 설정을 사용한 표준화를 후속적인 분석에 사용하였다. 차등적인 유전자의 확인을 위해, 실험적 바이스 통계 과정(empirical Bayes statistical procedure)을 사용한 평균-변화 관계(limma-trend)의 평가에 의한 선형 모델링을 벤자미니(Benjamini) 및 호크버그(Hochberg) 조절된 p-값 < 5%를 사용한 R. Genes내 림마 패키지(limma package)를 사용하여 수행하고 배 변화(FC) >1.5를 차등적으로 발현되는 것으로 고려하였다. 유전자 발현 표시를 위해, 기본 성분 분석(PCA) 및 집단화를 R v3.3.2 내에서 ade4/adegraphics 및 피트맵 패키지(pheatmap packages)를 각각 사용하여 수행하였다. 선택된 유전자의 생물학적 유의성을 R clusterProfiler 패키지를 사용하여 평가하였다. 거짓 발견율(false discovery rate: FDR)이 <5%이고 유전자를 나타낸 적어도 5개로 나타낸 유전자가 풍부한 유전자 존재론(Gene ontology; GO) 범주를 선택하였다. RNA-seq 데이타는 GEO 수탁 번호 GSE 하에 수탁할 수 있다.
결과
STAT5, PIK3 및 ERK 신호전달 경로
항-사람 IL-7Rα mAb(N13B2-h3VL6, MD707-13, 1A11 및 HAL)를 이후에 IL-7R 신호전달과 이미 관련된 STAT5, PI3K 및 ERK 신호전달 경로를 활성화하거나 차단하는 이들의 능력에 대해 비교하였다(도 9 및 10). 앞서 설명한 바와 같이(참고: 예를 들면 도 7), IL-7은 사람 pbmc에서 강력한 STAT5 포스포릴화를 유도하며, 모든 시험한 mAb는 이러한 STAT5 포스포릴화의 강력한 억제제이다(참고: 도 7). 대조적으로, 및 도 9 및 10에 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 IL-7가 가변 PI3K 포스포릴화를 유도하고 ERK 포스포릴화를 유도하지 않는 반면, 선행 기술의 항체(즉, MD707-13, 1A11 및 HAL)는 본 발명에 따른 항체와는 대조적으로 ERK 포스포릴화를 유의적으로 유도하며 심지어 외인성 IL-7의 부재하에서도 보다 적은 정도의 PI3K 신호를 유도함을 발견하였다. 이러한 발견은 선행 기술의 항-사람 IL-7Rα 항체가 부분적인 효능제 특성을 가지므로, 사람 IL-7R에 대한 이중 효능제/길항제 mAb로서 고려됨을 나타낸다. 대조적으로, 본 발명에 따른 항체, 및 특히 N13B2-h3VL6는 사람 IL-7R에 대해서만 길항제 특성을 가진다.
본 발명자들은 효능제/길항제 특성을 지닌 항체가 사람 T 세포를 변형시킬 수 있는 효과적인 효능제 신호를 전달할 수 있는지를 평가하였다. 사람 PBMC의 전사체를 외인성 사람 IL-7의 부재하에서, 사람 IL-7 및 IL-7과 함께 3.5 시간 동안 항온처리하고, 항체(MD707-13, 1A11 부위-1(각각 IgG4 #1 또는 IgG1 #2) 또는 N13B2-hVL6 부위-1/2b(IgG4))를 RNA-기반-차세대 서열분석(RNA-SEQ)에 의해 분석하였다. 총 481개의 유전자가 대조군 조건과 비교하여 항-사람 IL-7Rα mAb와 함께 항온처리한 사람 PBMC에서 차등적으로 발현되었지만, 총 334개의 유전자는 대조군 조건과 비교하여 사람 IL-7 자극 단독만으로 차등적으로 발현되었다.
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표 6. 자극되지 않은 세포와 비교하여 항- IL7Rα mAb와 함께 사람 PBMC(n=7)의 항온처리 후 유의적으로 ( FDR 5%) 및 차등적으로(>1 .5의 배 변화) 발현된 유전자의 목록
벤다이어그램(도 11C) 분석은 임의의 특수한 고미너 유전자 존재론 농축(GoMiner gene ontology enrichment)없이 3개의 mAb를 사용하여 61개의 일반적인 차등적으로 발현된 유전자를 확인하였다. 61개의 일반적인 유전자에도 불구하고, 본 발명의 항체는 유전자 존재론 농축없이 31개의 유의적인 유전자 변형만을 유도한다. 대조적으로, 선행 기술의 2개의 항체는 사람 PBMC 전사체의 중요한 전사 변형을 유도하며, 245개의 차등적으로 발현된 유전자는 부위-1 IgG4 #1 mAb에 의해 유도되었고 237개의 차등적으로 발현된 유전자는 부위-1 IgGl #2 mAb에 의해 유도되었다. 78개의 차등적으로 발현된 유전자는 2개의 부위-1 mAb 사이에서 일반적이었으나, 이러한 유전자는 PBMC가 N13B2-hVL6로 자극된 경우 차등적으로 발현되지 않는다.
IL-7 특징(signature)의 기본적인 성분 분석(PCA)은 선행 기술의 항체에 의해 유도된 차등적으로 발현된 유전자가 IL-7에 의해 유도된 차등적으로 발현된 유전자로부터 강력하게 상이함을 나타낸다. 고미너 유전자 존재론 농축은 선행 기술의 항체 둘 다가 백혈구 활성화, 증식, 이동, 화학주성, 사이토킨 분비, 및 MAPK/ERK 경로와 관련된 염증 반응과 같은 생물학적 PBMC 기능을 변형시킴을 시사한다.
대조군 조건과 비교하여 IL7으로 차등적으로 발현된 334개의 유전자 중에서, 93개의 유전자는 높은 배-변화(>2)로 차등적으로 발현되었으며 열-맵 분석에 의해 3개의 명백한 집단으로 분리되었다(도 11a). 유전자 존재론 농축에 의해 평가된 하향조절된 유전자의 제1 집단은 백혈구 분화 및 세포자멸사와 주로 연루되어 있으며, 고도로 상향조절된 유전자의 제2 집단은 백혈병 부착, 분화 및 활성화와 관련되어 있고, 상향조절된 유전자의 제3 집단은 혼합된 종양 존재론을 가졌다. 흥미롭게도, 모든 시험한 mAb(부위-1 또는 부위-l/2b 둘 다)는 집단-1 및 집단-2 변형을 방지함으로써 유사한 효과를 나타내었으마 집단-3에 대해서는 영향이 없었다(도 11b).
전적으로, 전사 분석은, 부위-1 및 부위-1/2b 항-사람 IL-7Rα mAb가 유사한 길항제 특성을 공유했음에도 불구하고, 선행 기술의 상태에서 기술된 2개의 부위-1 mAb가 T-세포 활성화와 양립성의 유의적인 전사 변형을 유도하였으며 염증 반응은 MAPK/ERK 경로에 의해 유도되었음을 확인하였다.
본 발명의 부위-l/2b 항-사람 IL-7Rα mAb, 즉, N13B2-hVL6은 선행 기술의 상태에 기술된 2개의 부위-1 mAb와 비교하여 사람 PBMC의 전사적 변형을 거의 유도하지 않았다.
보다 큰 종에 대한 특이적인 및 "길항제-단독"의 항-IL-7Rα mAb의 결여는 영장류 또는 사람에서 이의 효과의 확인을 방지하였다. 본 발명자들은 부위-1 IL-7 상호작용 도메인에 결합하는 선행 기술의 상태의 항체가 효능제/길항제 특성 둘 다를 가지는 것으로 여겨지는 반면 IL-7Rα/γc(부위 2b)의 이량체화 도메인에 결합하는 본 발명의 항체는 엄격한 길항제 활성을 나타내므로, 항-IL-7Rα mAb의 효능제/길항제 특성이 표적화된 특이적인 에피토프에 의존함을 발견하였다. 본 발명자들은 본 발명의 항체가 수용체 내재화 및 신호전달에 요구되는 IL-7Rα/γc 이량체화를 교란시킬 수 있음을 시사한다. IL-7R에 대한 "길항제-단독"의 항체는 심지어 만성 항원 자극 후, 림프구 감소증 또는 폴리클로날 T-세포 기능 또는 대사 결핍증을 유도하지 않으면서, 영장류에서 장기간 기억 T-세포 매개된 피부 염증을 방지하였다.
IL-7은 JAK/STAT 경로를 활성화시킴으로써 주로 IL-7R 신호 전달을 통해 증식 및 항-세포자멸사 신호를 유도하는 것으로 밝혀졌다. IL-7R 신호전달은 또한 PI3K/AKT 경로에 관여하는 것으로 여겨지지만, 이는 형질전환된 영구증식 세포주 또는 영장류 흉선세포에서 관찰되었으며 이러한 신호는 말초 나이브 또는 기억 사람 T 림프구에서는 검출되지 않았다(Watanabe, J. Exp. Med, 1998). 수개의 보고서는 또한 IL-7R 신호전달이 T 림프구 또는 전-B 세포 소세트에서 ERK 포스포릴화를 증폭시킬 수 있었음을 시사하였다(Deshpande P. I. Immunol, 2013; Fleming HE and Paige CJ, Immunity, 2001). 성숙한 및 사람 T 세포에서 IL-7R 신호전달에 있어서의 이러한 경로의 역활은 거의 명확하지 않다. 건강한 자원자로부터의 1차의 새로이 단리된 사람 PBMC(주로 T 및 B 림프구, 단핵구 및 NK 세포로 구성됨)를 고 농도의 재조합 사람 IL-7(5000pg/ml, 혈청 중 농도는 비-림프구 감소증 조건 하에서 ~ 5 pg/ml이다; Wong H-L, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008))을 사용하여, 본 발명자들은 IL-7이 재생가능한 STAT5 포스포릴화를 유도하였음을 확인하였다. PI3K 신호 활성화는 보다 가변적이었으며, 이들은 어떠한 ERK 포스포릴화도 관찰하지 않았다. 이러한 연구에 사용된 모든 항-IL7Rα mAb는 IL-7-유도된 pSTAT5의 강력한 억제제이었으며 유사한 전사 길항제 특성을 나타내었지만, 본 발명자는 선행 기술의 상태의 2개의 부위-1 mAb가 MAPK/ERK 경로에 의해 유도된 염증 반응 및 T-세포 활성화와 관련된 PI3K/ERK 효능제 신호 및 중요한 전사 변형을 유도하였음을 발견하였다. 일부 mAb의 이러한 대치되는 이중 효능제/길항제 특성은 IL-4, IL-6R, IL-15, CD28, CD38, CD40, 또는 HER2와 같은 다른 표적이 수용체 세포내이입/내재화 후 유사한 활성을 증명하였으므로, 유일하지 않다.
TSLPR을 사용한 이러한 부위 2b의 이량체화는 또한 최근에 확인되었으며 IL-7Rα 및 γ-쇄에 대해 이미 예측된 바와 같은 수용체 신호전달에 대해 취해지는 것으로 입증되었다(Verstraete K., Nature Communications, 2017). 흥미롭게도, IL-7Rα/γ-쇄와 IL-7Rα/TSLPR 사이의 예측된 이종이량체 부위는 중첩되어 있으며, 이는 수용체 둘 다 사이의 이종이량체화-매개된 신호전달 메카니즘을 시사한다.
본 발명자들은 시험관내 pSTAT5 억제 검정이 생체내에서 항-IL-7R 항체 효능을 예측하지 않았음을 발견하였다. 앞서의 보고서에서, 다른 항-IL7Ra mAb는 영장류에서 시험관내 및 생체외 IL-7-유도된 pSTAT5를 방지하였지만 실험적인 자가면역 뇌염(EAE) 마모셋(marmoset) 모델에서 뇌 염증으로부터 보호되지 않았다(Dunham J., J. Neuroimmune.Pharmacol, 2016).
IL-7은 마우스에서 말초 나이브 및 기억 T 림프구의 혼주물을 유지하는데 있어서 잘-설명되어 왔다. 그러나, 영장류에서, 말초 T-세포 항상성을 유지하는데 있어서 IL-7의 중요성은 따라서 거의 명백하지 않고/않거나 과다한 메카니즘은 종들 사이의 차이를 설명할 수 있다.
이러한 데이타는 항-IL-7Rα mAb의 길항제 특성 및 생체내 효능이 IL-7 결합 및 pSTAT5 억제의 방지에만 관련되어 있지 않음을 나타내었다. 이러한 데이타는 수용체 이종이량체화 부위(부위 2b)를 또한 표적화하는 본 발명의 항체가 "길항제-단독"이며 생체내에서 억제성 T 세포 반응의 보다 높은 효능을 생성함을 입증하였다.
IL7R을 "길항제-단독"의 항체로 표적화하는 것은 항원-특이적인 기억 T 세포 생존 및 축적을 조절하는데 효능이 있으므로, 자가면역 및 염증 질환에서 장기간 재발의 방지를 촉진시킬 수 있다.
참고 문헌
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Figure pct00019
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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 28 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 29 <211> 984 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 29 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300 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aacttctacc cccgcgaggc gaaggtgcag 120 tggaaggtgg acaacgccct ccagtcgggc aacagtcagg agagcgtcac ggagcaggac 180 tccaaggact cgacatactc cctgtcctcg acgctgacct tgagcaaagc cgattacgag 240 aagcacaagg tgtacgcgtg cgaggtgacc catcagggcc tgtcctcccc ggtgaccaag 300 tccttcaacc ggggcgaatg ctgat 325 <210> 31 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 31 acggtggccg cgccgtcggt gttcatattc ccgccgagcg acgagcagtt gaagtccggc 60 accgcctccg tcgtgtgcct gctcaacaac ttctaccccc gcgaggcgaa ggtgcagtgg 120 aaggtggaca acgccctcca gtcgggcaac agtcaggaga gcgtcacgga gcaggactcc 180 aaggactcga catactccct gtcctcgacg ctgaccttga gcaaagccga ttacgagaag 240 cacaaggtgt acgcgtgcga ggtgacccat cagggcctgt cctccccggt gaccaagtcc 300 ttcaaccggg gcgaatgctg at 322 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 32 Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 33 Asn Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 34 Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg 1 5 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 35 Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile 1 5 10 15 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 36 Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn Phe Arg 1 5 10 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 37 Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn Phe Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 38 Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 39 Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly 1 5 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 40 Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile 1 5 10 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 41 Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly 1 5 10 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 42 Cys Leu Asn Phe Arg 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 43 Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe 1 5 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 44 Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 45 Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 46 Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr 1 5 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 47 Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu 1 5 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 48 Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 49 Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln His Ser Leu 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 50 Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe 1 5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 51 Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 52 His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 53 Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 54 Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 55 Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 56 Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu 1 5 10 15 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 57 Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys 1 5 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 58 Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile 1 5 10 15 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 59 Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu 1 5 10 15 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 60 Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 61 Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 62 Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 63 Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 64 Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 65 Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 66 Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 67 Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 68 Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 69 Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu 1 5 10 15 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 70 Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 71 Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 72 Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 73 Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val Thr Phe Asn 1 5 10 15 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 74 Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 75 Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 76 Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 77 Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met His Asp Val 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 78 Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 79 Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 80 His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 81 Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His Val Asn Leu 1 5 10 15 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 82 Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys 1 5 10 15 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 83 Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 84 Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu 1 5 10 15 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 85 Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala 1 5 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 86 Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile 1 5 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 87 Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser 1 5 10 15 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 88 Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His 1 5 10 15 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 89 Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly 1 5 10 15 <210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 90 Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu 1 5 10 15 <210> 91 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 91 Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser 1 5 10 15 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 92 Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg 1 5 10 15 <210> 93 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 93 Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 94 Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser 1 5 10 15 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 95 Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp 1 5 10 15 <210> 96 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 96 Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met 1 5

Claims (16)

  1. - 서열 번호: 9; 서열 번호: 10; 서열 번호: 11; 서열 번호: 12; 특히 서열 번호: 12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 항체 경쇄 또는 이로 이루어진 항체 경쇄 가변 도메인; 및
    - 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3에 제시된 서열로 이루어진 3개의 CDR을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인, 특히 서열 번호: 7에 제시된 서열로 이루어진 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는, CD127, 특히 사람 CD127에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 사람화된 모노클로날 항체이고, 특히 항체 경쇄 불변 도메인이 사람 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 기원하고, 특히 여기서 경쇄 불변 도메인이 서열 번호: 27 또는 28의 서열로 이루어지고, 여기서 항체 중쇄 불변 도메인이 사람 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인, 특히 사람 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 기원하며, 특히 항체 중쇄 불변 도메인이 서열 번호:26을 지닌 서열로 이루어진, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 경쇄가 서열 번호: 12를 포함하거나 항체 경쇄 가변 도메인이 서열 번호: 12로 이루어지고, 항체 중쇄 가변 도메인이 서열 번호: 7로 이루어진, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IL-7에 의해 유도된 IL-7R 신호전달의 길항제이고, 포스파티딜이노시톨 3-키나제 및/또는 ERK 신호전달 경로의 활성화를 유도하지 않는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CD 127의 2b 부위로부터 취해진 서열을 포함하는 에피토프를 인식하고/하거나 사이토킨 수용체의 γc 일반적인 쇄에 대한 CD127의 결합을 파괴하며, 특히 CD127의 부위 2b의 적어도 제3의 베타 쉬이트를 인식하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CD 127의 내재화(internalization)를 유도하지 않고/않거나 CD127의 IL7-유도된 내재화를 억제하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, TSLP에 의해 유도된 수지 세포의 성숙을 증가시키지 않는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 지속 효과 및/또는 신속한 효과, 특히 신속한 국소 효과를 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오센서 분석(biosensor analysis)에 의해 측정될 수 있는 바와 같이, 친화성 상수 KD가 5E-9 M보다 낮은 사람 CD127에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산 분자의 조합물(combination), 특히 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1의 단리된 핵산 분자; 및 서열 번호: 13의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2의 단리된 핵산 분자의 조합물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 청구항 10에 따른 단리된 핵산 분자의 조합물, 및 약제학적 비히클(pharmaceutical vehicle)을 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 국소 투여용, 특히 국소 피하용, 장 또는 경구 투여용, 보다 특히 결장 전달용으로 적합한 약제학적 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 따른 약제학적 조성물 및 국소 투여용으로 적합한 전달 장치, 특히 피하, 장 또는 경구 전달 장치를 포함하는 키트(kit)로서, 보다 특히 상기 장치가 예비-충전된 주사기 또는 침이 없는 장치를 포함하는 키트.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항; 제10항; 제11항 또는 제12항; 또는 제13항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 단리된 핵산 분자의 조합물; 약제학적 조성물, 또는 키트.
  15. 제14항에 있어서, 기관 또는 조직 이식 거부의 예방 또는 치료시 사용하거나, 또는 자가면역 질환, 특히 류마티스 관절염, 전신 경화증, 다발 경화증, 제I형 당뇨병, 자가면역 갑상선염, 전신 홍반 루푸스, 원발성 소그렌 증후군, 및 염증성 질환, 특히 염증성 창자병(IBD), 보다 특히 크론병 및 궤양성 결장염 및 뇌척수염 및 알레르기성 질환 및 암 질환 및 이식 및 호흡성 질환과 관련된 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료시 사용하기 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 단리된 핵산 분자의 조합물; 약제학적 조성물; 또는 키트.
  16. 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 항체 모사체 분자(antibody mimetic molecule)로 이루어진 그룹으로부터 화합물을 선택하는 방법으로, 다음의 단계 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어진 방법:
    i. CD 127, 특히 사람 CD 127, 특히 사람 CD 127의 도메인 D1으로부터 및/또는 도메인 D2의 부위 2b로부터의 에피토프 서열에 대한 화합물의 결합력(binding capacity)을 시험하는 단계;
    ii. 화합물의 존재하에서 IL-7, 특히 STAT5 포스포릴화에 의해 유도된 IL7-R 신호전달의 억제를 시험하는 단계;
    iii. 화합물의 존재하에서 포스파티딜이노시톨 3-키나제의 활성화를 시험하는 단계;
    iv. 화합물의 존재하에서 ERK 신호전달 경로의 활성화를 시험하는 단계;
    v. CD127, 특히 사람 CD127의 부위 2b의 적어도 제3의 베타 쉬이트(beta sheet)에 대한 화합물의 결합력을 시험하는 단계;
    및 임의로 다음의 단계 중 적어도 하나를 추가로 포함함;
    vi. 화합물의 존재하에서 사이토킨 수용체의 γc 일반적인 쇄에 대한 CD 127의 결합을 시험하는 단계;
    vii. 화합물의 존재하에서 CD127의 내재화, 및/또는 CD127의 IL7-유도된 내재화를 시험하는 단계;
    viii. 화합물의 존재하에서 TSLP에 의해 유도된 수지 세포의 성숙을 시험하는 단계;
    특히, CD127에 특이적으로 결합하는 화합물은 IL-7에 의해 유도된 IL-7R 신호전달의 길항제이고 포스파티딜이노시톨 3-키나제의 활성화 및/또는 ERK 신호전달 경로를 유도하지 않는 화합물이 선택됨.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020154293A1 (en) * 2019-01-22 2020-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against il-7r alpha subunit and uses thereof
EP3986931A1 (en) 2019-06-21 2022-04-27 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
CA3144567A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 Scott Crowe Polypeptides
JP7427286B2 (ja) 2019-11-05 2024-02-05 メディカイン、インコーポレイテッド ＩＬ－２ＲβγＣ結合化合物
CN110894237B (zh) * 2019-12-05 2021-08-03 山东省分析测试中心 抗cd127的抗体、分泌该抗体的细胞株及其制备方法和应用
US11746139B2 (en) 2020-02-03 2023-09-05 Medikine, Inc. IL-7Rαγc binding compounds
US20220389104A1 (en) 2021-05-28 2022-12-08 Ose Immunotherapeutics Method for Treating CD127-Positive Cancers by Administering an Anti-CD127 Agent
CN113501499A (zh) * 2021-08-11 2021-10-15 无锡贝塔医药科技有限公司 一种高纯无水溴化氘气体的制备方法及其应用
WO2023232826A1 (en) 2022-05-30 2023-12-07 Ose Immunotherapeutics Biomarkers of il7r modulator activity

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011094259A2 (en) * 2010-01-28 2011-08-04 Glaxo Group Limited Cd127 binding proteins
WO2011104687A1 (en) * 2010-02-24 2011-09-01 Rinat Neuroscience Corporation Antagonist anti-il-7 receptor antibodies and methods
WO2015189302A1 (en) * 2014-06-10 2015-12-17 Effimune Antibodies directed against cd127

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY32038A (es) 2008-08-08 2010-03-26 Glaxo Wellcome Mfg Pte Ltd Inmunoblobulinas anti-cd127 y sus usos
EP2583980A1 (en) 2011-10-19 2013-04-24 Effimune Antibodies directed against the alpha chain of IL7 receptor - their use for the preparation of drug candidates
GB201506869D0 (en) * 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011094259A2 (en) * 2010-01-28 2011-08-04 Glaxo Group Limited Cd127 binding proteins
WO2011104687A1 (en) * 2010-02-24 2011-09-01 Rinat Neuroscience Corporation Antagonist anti-il-7 receptor antibodies and methods
WO2015189302A1 (en) * 2014-06-10 2015-12-17 Effimune Antibodies directed against cd127

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