TW201833137A - 靶向ｃｄ１２７之抗體和多肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係屬用於治療和診斷應用之靶向CD127(IL7受體之α鏈)之抗體的領域且特別是提供針對CD127(特別是人CD127)之人化單株抗體、該人化單株抗體之治療用途及診斷應用。

Description

靶向ＣＤ１２７之抗體和多肽
本發明係屬用於治療和診斷應用之靶向CD127(IL7受體之α鏈)之多肽或抗體的領域，特別是提供針對CD127(特別是人CD127)之人化單株抗體、該人化抗體之治療用途及診斷應用。
介白素7(IL-7)受體之α鏈(或次單位)被稱為CD127、或p90 IL-7R、或IL-7Rα、或IL-7Rα(有時亦稱為IL-7Ra)。
於一特定之態樣中，本文提供之抗體，特別是單株抗體係針對表現在人細胞上之人IL-7受體的α鏈。於一特定之態樣中，本文提供之抗體對IL-7-IL-7R交互作用具有拮抗劑性質，針對CD127陽性細胞可能呈現細胞有毒活性，但不會增加由TSLP引起之樹突細胞(DC)成熟。特別是，本文提供之抗體識別人CD127抗原決定部位，該人CD127抗原決定部位包含來自CD127之2b位點的序列，特別是該抗原決定部位包含人CD127之結構域D1之序列和CD127之2b位點的序列，特別是該抗原決定部位包含至少一個來自CD127之D1之序列和至少一個來自CD127之2b位點之序列，較佳為來自CD127之2b位點的第三β折疊之序列。或者，或另外地，於一特定之態樣中，本文提供之抗體不會誘導CD127之內化及/或抑制由IL7誘導之CD127內化。於一特定之態樣中，本文提供之抗體為人化的且包含至少80%，較佳為至少84%，或至少85%之人殘基。於一特定之態樣中，本文提供之抗體對效應記憶性T細胞具有快速作用，對效應記憶性T細胞具有長期作用，或者較佳地，對效應記憶性T細胞具有快速且持久之作用。於一特定之態樣中，本文提供之抗體允許有效產製。於一特定之態樣中，可測量CD127、IL-7及/或TSLP之表現水準，以使用，特別是，本文提供之抗CD127抗體評估反應之可能性。除了抗體外，本文提供特別是作為產製抗體之工具及/或用於類似於該抗體之用途的多肽，特別是抗體輕鏈可變結構域或抗體輕鏈、抗原結合片段和來自該等抗體之抗體模擬分子和多核苷酸。
本發明者試圖獲得與WO 2015/189302中揭示之N13B2-h1、N13B2-h2和N13B2-h3抗體相較下經改善之人化抗體。雖然已知在可變結構域框架序列中的某些殘基(包括游標區中之殘基、典型殘基、VH/VL界面處之殘基，等)在抗體之結構中具關鍵性且不應發生突變以保留抗體之生物化學和生物活性，本發明者意外地發現在N13B2之輕鏈可變結構域框架序列內的一些突變(包括一些該等關鍵殘基)允許增加人殘基含量(高於N13B2-h3且高達86.3%)並提高產量(較N13B2-h3高4倍)，且同時保留所有功能特性。
這些突變係由在N13B2之輕鏈可變結構域框架序列內的16個胺基酸取代所組成，特別是另外在位置48之纈胺酸殘基被自胺酸殘基取代(V48L)及/或在位置87之苯丙胺酸殘基被酪胺酸殘基(F87Y)取代。除非另外指明，這些位置及本文提供之抗體鏈內的任何胺基酸位置係使用Kabat編號提供。本文提供由下列序列所組成之經改善的抗體輕鏈可變結構域： 　　- SEQ ID No：9(包括該16個胺基酸取代-該抗體輕鏈可變結構域在下文中稱為N13B2-hVL3)； 　　- SEQ ID No：10(包括該16個胺基酸取代且另外具有突變V48L-該抗體輕鏈可變結構域在下文中稱為N13B2-hVL4)； 　　- SEQ ID No：11(包括該16個胺基酸取代且另外具有突變F87Y-該抗體輕鏈可變結構域在下文中稱為N13B2-hVL5)；及 　　- SEQ ID No：12(包括該16個胺基酸取代且另外同時具有突變V48L和F87Y-該抗體輕鏈可變結構域在下文中稱為N13B2-hVL6)。
因此，本文中稱為N13B2-hVL3之抗體輕鏈可變結構域包含N13B2-h3之CDR、該16個胺基酸取代和在人框架序列內之關鍵位置48和87處之N13B2的原始殘基(即，分別為V和F)且具有SEQ ID No：9之序列。本發明中提供之較佳之經改善的抗體之輕鏈可變結構域(稱為N13B2-hVL6，另外同時包含突變V48L和F87Y)係由SEQ ID No：12組成。
本技藝之技術熟習人士未曾預期該突變(特別是在該輕鏈可變結構域之框架中的該等位置處)會使抗體與CD127之親和力不受影響：V48為典型殘基且F87位於VH/VL界面；如本技藝之技術熟習人士已知且討論於例如Clark，2014中者，該等殘基之突變被預期將影響該抗體之親和力及/或穩定性。如本文所使用者，術語“典型”殘基係指在CDR或框架中定義特定之典型CDR結構的殘基(如Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-907(1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799(1992)所定義者)。根據Chothia等人，許多抗體之CDR的關鍵部分具有幾乎完全相同之肽主鏈構象，儘管在胺基酸序列的層級上差異很大。各典型結構主要為形成環之胺基酸殘基之連續節段具體指定一組肽骨架扭轉角。未能預見的是，同時在二個位置處引入該揭示之突變可改善產製，同時仍保留該抗體之結合特性且有利地保留其他功能特性。
因此，本發明提供多肽，特別是用於製造抗體(特別是抗體輕鏈可變結構域或抗體輕鏈)、其抗原結合片段或如下文定義之抗體模擬分子的多肽，該等抗體(特別是抗體輕鏈可變結構域或抗體輕鏈)係由序列，特別是具有多達250個胺基酸之序列組成，該序列包含SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10；或SEQ ID NO：11；或SEQ ID NO：12所示之序列或由SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10；或SEQ ID NO：11；或SEQ ID NO：12所示之序列組成。於一特定之態樣中，本發明關於本文提供之特異性結合CD127，特別是人CD127的抗體或其抗原結合片段，特別是人化單株抗體，且該抗體或其抗原結合片段包含： 　　- 抗體輕鏈或抗體輕鏈可變結構域，該抗體輕鏈包含選自由下列所組成之群組的序列或該抗體輕鏈可變結構域係由選自由下列所組成之群組的序列所組成：SEQ ID No：9；SEQ ID No：10；SEQ ID No：11；SEQ ID No：12；特別是SEQ ID No：12；及 　　- 抗體重鏈可變結構域，其包含三個由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示之序列組成之CDR，特別是由SEQ ID No：7所示之序列組成的抗體重鏈可變結構域。 　　於一較佳之實施態樣中，本發明關於本文提供之特異性結合CD127，特別是人CD127之抗體或其抗原結合片段，特別是人化單株抗體，且該抗體或其抗原結合片段包含： 　　- 輕鏈可變結構域，其係由選自由下列所組成之群組的序列組成：SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11和SEQ ID No：12，特別是SEQ ID No：12；及 　　- 重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含三個由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示之序列組成的CDR，特別是由SEQ ID No：7所示之序列組成之重鏈可變結構域。
於一特定之態樣中，本文提供之抗體包含輕鏈及重鏈，該輕鏈具有如上述之可變結構域和由選自SEQ ID No：27或28(較佳為SEQ ID No：27)之序列組成之恆定結構域，該重鏈具有如上述之可變結構域和由SEQ ID No：26所示之序列組成的恆定結構域。
本文亦提供經分離之多肽，該多肽係由具有多達250個胺基酸(特別是具有多達217個、多達214個、多達211個胺基酸，更特別為具有多達200個、多達175個、多達150個、多達135個、多達120個、多達107個胺基酸，甚至更特別為具有多達100個、多達90個、多達80個、多達74個、多達70個、多達60個胺基酸)之序列組成，其中該序列包含或由選自由下列所組成之群組的序列組成： 　　- SEQ ID No：9(在人框架序列內之N13B2-h3之CDR)； 　　- SEQ ID No：10(在人框架序列內之N13B2-h3之CDR，包含V48L突變)； 　　- SEQ ID No：11(在人框架序列內之N13B2-h3之CDR，包含F87Y突變)； 　　- SEQ ID No：12(在人框架序列內之N13B2-h3之CDR，同時包含V48L和F87Y突變)；和 　　- 其抗原結合片段，特別是該包含三個CDR之片段，該CDR係由SEQ ID No：4、SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示之序列組成，更特別地，包含至少74個胺基酸之片段，該74個胺基酸係由SEQ ID No：12之胺基酸24至97組成。
本文亦提供編碼本文提供之多肽(特別是本發明之抗體或其抗原結合片段)的多核苷酸。特別是，該等多核苷酸編碼之多肽包含或由選自由SEQ ID No：9至12組成之群組的序列組成，且亦編碼包含或由選自由SEQ ID No：1至3，特別是SEQ ID No：7組成之群組的序列組成之多肽，且亦可編碼包含或由選自由SEQ ID No：26至28組成之群組的序列組成之多肽。特別是，該多核苷酸包含或由具有至少二個分離之核酸序列(分子)的組合物組成：第一經分離之核酸分子和第二經分離之核酸分子，該第一經分離之核酸分子包含或由選自由SEQ ID No：15至18組成之群組的序列組成；特別是SEQ ID No：18；該組合物亦包含或由第二經分離之核酸分子組成且該第二經分離之核酸分子包含或由選自由SEQ ID No：13和SEQ ID No：29至31，特別是SEQ ID No：13組成之群組的序列組成。
特別是，根據本發明之多肽包含抗體輕鏈可變結構域或抗體輕鏈，該多肽包含至少84%，更特別地，至少85%之人殘基。該多肽可為來自本文所揭示之抗體的抗原結合片段及/或抗體模擬分子 。
本文亦提供包含該多肽，特別是抗體輕鏈可變結構域或抗體輕鏈、抗體、其抗原結合片段或其抗體模擬分子之組成物、獲得該抗體之方法、編碼該多肽和抗體之核酸分子及該多肽、抗體和組成物之用途。
因此，本文提供之多肽、抗體輕鏈可變結構域、抗體輕鏈、抗體、抗原結合片段、抗體模擬分子和組成物可在IL-7信號傳導途徑促成與淋巴細胞增殖相關之發病機制時(特別是當樹突細胞成熟增加，更確切地說，共刺激分子上調是不合需求時)用於及/或適合用於治療在人類患者中診斷出之由該發病機制造成的病症。 發明之詳細說明 生物化學
CD127為IL-7受體(IL-7R)和TSLP受體(TSLPR)所共有。IL-7R係由CD127和介白素受體之共通γ鏈(yc)組成之異二聚體構成。該共通之γ鏈yc在本文中和文獻中有時稱為CD132。IL-7R與介白素7結合。TSLP受體為由CD127和細胞因子受體樣因子2(CRLF2)組成之異二聚體。TSLP受體與TSLP結合。在文獻中，TSLPR有時用於指該受體之CRLF2鏈和CD127/CRLF2複合物二者。為了避免混淆，下文中之TSLPR通常係指該複合物。
CD127(Swiss Prot登錄編號P16871)可能以四種同種型存在。該典型同種型，亦稱為H20(Swiss Prot P16871.1)為單次跨膜蛋白且具有459個胺基酸，該459個胺基酸(從N端至C端)係由下列群組所組成：具20個胺基酸之信號肽、具219個胺基酸之胞外結構域、具25個胺基酸之跨膜結構域和具195個胺基酸之胞內結構域。其他同種型分享H20之全部(或大部分)胞外結構域之序列且顯示出不同的C端序列。同種型2和4為分泌型(Swiss Prot P16871-4和P16871-3)，而同種型3(Swiss Prot P16871-2)亦為跨膜蛋白。據報導，CD127具有SEQ ID No：21之序列且其胞外結構域在去除信號肽時具有SEQ ID No：22之序列。除非另外指明，本文中CD127之胺基酸所使用的編號SEQ ID No：22編號。
CD127為細胞因子受體同源性第I類(CRH I)受體。如本技藝所周知者，這些受體之胞外結構域係由二個纖連蛋白3結構域(稱為D1和D2)組成。CD127之精確晶體結構已發表並討論於，例如McElroy等人，2009；McElroy等人，2012和Walsh，2012中，特別是以蛋白質結構數據揭示於結構生物信息學蛋白質數據庫研究協作組(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank(RCSB PDB))數據庫中，登錄號為3UP1。D1通常被認為涉及與IL-7結合，而D2涉及與yc鏈(亦與IL-7)結合。重要的是，結構域D2之位點2b包含三個β折疊，其包含下列序列：SEQ ID No：32(FDLSVIYRE)；SEQ ID No：33(NDFVVTFNTS)和SEQ ID No：34 (TKLTLLQR)。因此，結構域D2之位點2b係包含在SEQ ID No：22之胺基酸109和180之間(參見Walsh, 2012；Verstraete, K.et al ., Nature Com 2017)。結構域D2之位點2b亦可被定義為包含在SEQ ID No：22之胺基酸109和173之間。結構域D2之位點2b亦可被定義為包含在SEQ ID No：22之胺基酸113和180之間。結構域D2之位點2b亦可被定義為包含在SEQ ID No：22之胺基酸113和173之間。特別地，結構域D2之位點2b包含，特別是基本上由SEQ ID No：22之胺基酸109至133，特別是胺基酸109至127(該前二個β折疊位於其中)；和SEQ ID No：22之胺基酸166至180(該第三個β折疊位於其中)組成。更特別地，該2b位點基本上由 SEQ ID No：22之胺基酸113至133，特別是胺基酸113 至127和SEQ ID No：22之胺基酸166至180組成。更特別地，該2b位點基本上由SEQ ID No：22之胺基酸109至133，特別是胺基酸109至127和SEQ ID No：22之胺基酸166至173組成。更特別地，該2b位點基本上由SEQ ID No：22之胺基酸113至133，特別是胺基酸113至127和SEQ ID No：22之胺基酸166至173組成。結構域D2之位點2b對CD127-yc交互作用具關鍵性，特別是在IL-7之存在下允許或增加CD127與yc結合。特別是，在P112和L115處之突變(其已在罹患嚴重複合型免疫缺乏症(SCID)患者中鑑定出)被認為會破壞D2結構域之疏水核心，這可能造成彼等之致病特徵。如上述，該2b位點基本上係由SEQ ID No：22之胺基酸109至180組成，或基本上由SEQ ID No：22之胺基酸109至173組成，或基本上由SEQ ID No：22之胺基酸113至180組成、或基本由 SEQ ID No：22之胺基酸113至173組成。本技藝之技術熟習人士將理解該等結構域之末端可能不一定明確地以單鹼基精確界定，且2b位點可被理解為在所提出之序列的任一端或二端包含1、2、或3個、或更多、或更少個胺基酸。因此，當本文中提及CD127之2b位點時，其應被理解為係指從SEQ ID No：22之位置106、107、108、109、110、111、112或113開始且終止於位置173、174、175、176、177、178、179或180的CD127序列；特別是指該等被認為或顯示出構成與IL7-R之yc鏈的必要結合位點(特別是在IL-7之存在下)之序列。更特別地，本文中當提及CD127之2b位點時，其應被理解為係指從SEQ ID No：22之位置106、107、108、109、110、111、112或113開始且終止於SEQ ID No：22之位置124、125、126、127、128、129、130、131、132 或133的CD127之序列，但亦指從SEQ ID No：22之位置162、163、164、165 或166開始且終止於SEQ ID No：22之位置173、174、175、176、177、178、179或180之CD127的序列。應注意的是，如本文定義之三個β折疊可包含特異於根據本發明之抗體或抗原結合片段或抗原結合模擬物之抗原決定部位序列。根據本發明之抗體、抗原結合片段和抗原結合模擬物可與SEQ ID No：32、SEQ ID No：33及/或SEQ ID No：34特異性結合。此外，包含至少部分之一個β折疊和位於任一β折疊之一端的一些連續胺基酸之胺基酸序列亦可為特異於根據本發明之抗體的抗原決定部位序列。舉例而言，序列SEQ ID No：35(TLLQRKLQPAAMYEI)包含該第三β折疊的最後5個胺基酸和10個位於該第三個β折疊外的額外胺基酸。另一實例為，SEQ ID No：96 (RKLQPAAM)包含一個位於該第三β折疊內之胺基酸和7個位於該第三β折疊外的額外胺基酸。特別是，根據本發明之抗體、或其抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性結合SEQ ID No：22之R173。特別是，根據本發明之抗體、或其抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性結合至少一個選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID No：32；SEQ ID No：33；SEQ ID No：34；SEQ ID No：35和SEQ ID No：96。特別是，根據本發明之抗體、或其抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性結合至少一個選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID No：36 (LVEVKCLNFR)；SEQ ID No：37(ICGALVEVKCLNFR)和SEQ ID No：38(LVEVKCLNFRK)。或者，或補充地，根據本發明之抗體、或其抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性結合至少一個選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID No：39(KKFLLIG)；SEQ ID No：40(KKFLLIGKSNI)和SEQ ID No：41(FIETKKFLLIG)。SEQ ID No：36至SEQ ID No：41係位於CD127之結構域D1內，且為可被根據本發明之抗體、或其抗原結合片段、或抗體模擬分子識別之抗原決定部位序列。在本發明之替換或補充之實施態樣中，根據本發明之抗體、或其抗原結合片段、或抗體模擬分子可特異性結合至少一個選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID No：42(CLNFR)和SEQ ID No：43(FIETKKF)。該二個序列為位於CD127之結構域D1內的抗原決定部位序列。於本發明之一特定實施態樣中，根據本發明之抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性結合至少一個選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID No：32；SEQ ID No：33；SEQ ID No：34；SEQ ID No：35和SEQ ID No：96，特別是選自由下列所組成之群組：SEQ ID No：34、SEQ ID No：35和SEQ ID No：96；和至少一個選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID No：36；SEQ ID No：37；SEQ ID No：38；SEQ ID No：39；SEQ ID No：40；SEQ ID No：41；SEQ ID No：42和SEQ ID No：43，特別是選自由SEQ ID No：42和SEQ ID No：43組成之群組的序列。於本發明之較佳實施態樣中，該抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性結合SEQ ID No：34和至少一個選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID No：42和SEQ ID No 43，特別是SEQ ID No：42和SEQ ID No：43。於本發明之較佳實施態樣中，該抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性結合SEQ ID No：35和至少一個選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID No：42和SEQ ID No 43，特別是SEQ ID No：42和SEQ ID No：43。於本發明之較佳實施態樣中，該抗體或抗原結合片段或抗原結合模擬物可特異性結合SEQ ID No：96和至少一個選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID No：42和SEQ ID No 43，特別是SEQ ID No：42和SEQ ID No：43。於本發明之較佳實施態樣中，該抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可同時與序列SEQ ID No：35和SEQ ID No：96特異性結合。於本發明之較佳實施態樣中，該抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可同時與序列SEQ ID No：42和SEQ ID No：43特異性結合。於本發明之特定實施態樣中，根據本發明之抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性識別至少該CD127之結構域D2之位點2b的第三β折疊。較佳地，該第三β折疊被定義為位在SEQ ID No：22之胺基酸166和173之間，對應於SEQ ID No：34，更特別地，該第三β折疊對應於SEQ ID No：34。於本發明之更特別的實施態樣中，根據本發明之抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性識別至少該位於結構域D2之位點2b內的二個β折疊，且更特別地，根據本發明之抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性識別如上文定義之位於結構域D2之位點2b內的三個β折疊。於本發明之一更特別之實施態樣中，該抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性識別至少一個位在結構域D2之位點2b內的β折疊(特別是該對應於SEQ ID No：34之第三β折疊)並與至少一個選自由下列所組成之群組的序列結合：SEQ ID No：36；SEQ ID No：37；SEQ ID No：38；SEQ ID No：39；SEQ ID No：40；SEQ ID No：41；SEQ ID No：42和SEQ ID No：43。於本發明之一較佳實施態樣中，該抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性識別至少該對應於SEQ ID No：34之第三β折疊和至少一個選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID No：42和SEQ ID No：43，特別是SEQ ID No：42和SEQ ID No：43。於本發明之一更特別之實施態樣中，該抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性識別由SEQ ID No：35之胺基酸組成之線性肽或線性抗原決定部位。或者，或補充地，該抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性識別由序列SEQ ID No：96之胺基酸組成之構象肽或構象抗原決定部位。於一更特別之實施態樣中，該抗體、或抗原結合片段、或抗原結合模擬物可特異性識別SEQ ID No：35之胺基酸序列的線性抗原決定部位或線性肽，及SEQ ID No：96之構象抗原決定部位或構象肽。
IL-7R信號傳導。IL-7與IL-7R結合會觸發幾種信號傳導途徑活化，包括Janus激酶(JAK)-1和-3、信號轉導和轉錄活化蛋白5(STAT5)及磷脂醯肌醇-3-激酶(PI3-k)。據報導，STAT1和STAT3途徑被活化，儘管它們似乎不是主要途徑。STAT5途徑活化對誘導抗凋亡蛋白Bcl-2和阻止線粒體中促凋亡蛋白Bax進入是必要的，因比對胸腺發育T細胞前體之存活是必要的。PI3-k途徑活化導致該促凋亡蛋白質Bad磷酸化和保留在細胞質。
TSLPR信號傳導。胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)為在淋巴細胞生成中活躍之上皮細胞細胞因子，特別是涉及調節免疫系統細胞發育，該調控尤其影響該細胞之成熟。人類TSLP(Genbank登錄編號AF338732)為影響樹突細胞極化之因子並促進T細胞和B細胞增殖和分化。TSLP亦抑制Treg細胞生成(Lei等人，2011)。
由TSLP誘導之信號傳導途徑已證明在分子層級上與由IL-7誘導之途徑不同。特別是，雖然TSLP與其受體結合亦會活化Jak-1，其並不活化Jak-3但會活化Jak-2。這些差異與Jak-1與CD127(由二種受體共有)有關，而Jak-2與CRLF2有關，Jak-3與yc有關之觀察結果相一致(Rochman等人，2010)。據報導，由TSLP誘導之信號傳導亦活化STAT5途徑(Zhong等人，2014)。TSLP的一種主要作用為導致樹突細胞活化，誘導共刺激分子(諸如CD80)過度表現，從而促進由TH-2介導之發炎反應(Reche等人，2001)。 細胞生物學
“CD127陽性細胞”係指其細胞表面表現CD127之細胞。在大多數情況下，CD127陽性細胞在形成IL-7R之複合物(IL-7R陽性細胞)中及/或在形成TSLPR之複合物(TSLPR陽性細胞)中表現CD127。各種不同細胞均可表現CD127，包括記憶性T細胞和初始T細胞。特別是，效應T細胞(Teff)(包括靜息和記憶性T細胞)及未成熟之B細胞表可表現CD127，但特別的是，靜息天然調節性T細胞(天然Treg)不表現CD127。CD127對於促進胸腺細胞分化和淋巴細胞之選殖性擴增是必要的。
最近幾項研究強調IL7-CD127途徑對初始T細胞體內動態平衡的重要性，這些研究顯示出在傳統CD4+ T細胞上之與膜結合的CD127的表現水準與健康個體和被HIV感染之患者以及多發性硬化症(MS)患者(Albuquerque等人，2007)中新遷入之胸腺(RTE)-CD4+ T細胞的頻率相關(Broux等人，2010)。CD127亦為TSLP受體的一種組分。哈氏小體(Hassall corpuscle)(胸腺髓質中上皮細胞所組成之結構)分泌之TSLP已被證明可調節CD11c+ 髓樣樹突細胞(MDC)以誘導胸腺細胞分化成Treg(Watanabe等人，2005a)。因此，如CD127剔除小鼠中所示者，來自IL-7受體之信號對Treg之發展是必要的(Mazzucchelli等人，2008)。在(Haas等人，2011)中，作者證明傳統T細胞上之CD127表現減少和IL-7血漿含量上調，以及MS患者中新遷入之胸腺-Treg頻率和Treg功能降低，無清楚之遺傳影響(Haas等人，2011)。
仔細分析IL-7如何調控其同源受體膜運輸對於深入了解IL-7/IL-7R在淋巴細胞功能中之作用至關重要。先前的研究已表明IL-7刺激T細胞導致表面CD127在30分鐘內下調，此可能係由於受體內化。稍後的時點(2-6小時)，IL-7顯示出誘導CD127的轉錄下調。然而，實際之CD127內化動力學和IL-7對運輸機制之調節仍有待闡明(Henriques等人，2010)。由IL-7誘導之信號傳導亦被提出係依賴CD127內化，而隨後之受體降解係依賴JAK3活性且係由蛋白酶體和溶酶體二者介導。 生理病理學
樹突細胞在成熟後表現大量共刺激分子，諸如CD80，該CD80促進由T細胞介導之免疫反應。樹突細胞亦產生細胞因子TARC(CCL17)，該細胞因子TARC (CCL17)誘導T細胞中之趨化性。因此，成熟之樹突細胞促成數種其中T細胞反應起作用之由免疫介導之疾病(例如哮喘、類風濕性關節炎、結腸炎、多發性硬化症和葡萄膜炎)的生理病理學。成熟之樹突細胞在細胞、組織或器官同種異體移植物之排斥過程中具關鍵作用。因此，許多治療策略係針對防止樹突細胞成熟。
抗原呈遞細胞(APC)(諸如樹突細胞)上存有或不存有共刺激分子會顯著影響免疫反應之品質和定量性質。樹突細胞過度表現CD80會引起DC成熟並增加記憶性T細胞活化(Bour-Jordan等人，2011)。機制上，CD28與CD80之交互作用會佔據免疫突觸之中心簇，並與該接合之TCR共定位，從而穩定該免疫突觸(Dustin和Shaw，1999) (Grakoui等人，1999)。CD28和CD80之間的交互作用實際上產生適當間距以使TCR有效地與HLA分子交互作用(Shaw和Dustin，1997)。
多發性硬化症(MS)為中樞神經系統(CNS)之發炎性脫髓鞘疾病。MS患者之CNS中出現脫髓鞘斑(demyelinating patch)與炎性浸潤液有關，該炎性浸潤液主要由巨噬細胞和T淋巴細胞組成。在機制層級，MS被認為是一種自體免疫性疾病。MS通常被視為主要由CD4+T細胞介導之疾病。CD4+：Th1和更新近之Th17的特定亞群涉及該疾病之病理生理學。目前仍然很難為各亞群Th1和Th17分派特定角色。此外，藉由alpha4(α4)-整聯蛋白之拮抗性來抑制白血球輸送已被證實可作為用於治療發炎性疾病(諸如MS和發炎性腸病(IBD))和治療動脈粥樣硬化的治療方法(Zhi等人，2014)。α4β7表現在更受限的一組白血球上，包括經活化之巨噬細胞、淋巴細胞亞群、NK細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞。
人IL-7在體外誘導α4和β7整聯蛋白強烈表現在人T淋巴細胞上並顯著增加表現α4、β7和α4/β7整聯蛋白之人T淋巴細胞頻率，該α4、β7和α4/β7整聯蛋白對T淋巴細胞歸巢及保留在非淋巴組織，諸如小腸、腦和皮膚是必要的(Denucci et al., 2009; Gorfu et al., 2009)。
初始T細胞部分負責移植器官和組織之急性排斥反應。這些細胞可藉由目前之免疫抑制藥物(鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑)和阻斷共刺激之單株抗體(抗黏附，CD80/86抑制劑)控制。記憶性T細胞亦負責移植物排斥反應。記憶性T細胞由於獲得性免疫史(主要為先前對抗病毒之反應)而累積在人體內。記憶性T細胞已顯示出可由於“異源免疫性”而被同種異體抗原(alloantigen)再活化，該異源免疫性為吾人之抗病毒防禦與同種異體抗原之交叉反應(Adams等人，2003)。相對於初始T細胞，由於記憶性T細胞被編程為快速活化，對共刺激信號之需要減低，所以異源免疫性代表對誘導耐受性的強力屏障。記憶性T細胞亦可能參與慢性排斥反應。除了彼等在器官和組織移植中之作用外，初始和記憶性T細胞亦共同負責許多自體免疫性疾病。此為潰瘍性結腸炎(Shinohara等人，2011)、類風濕性關節炎、牛皮癬或移植物抗宿主病的情況。
發炎性腸病(IBD)，諸如潰瘍性結腸炎(UC)和克隆氏症(CD)為慢性復發性胃腸疾病，其特徵為慢性腸道發炎、對腸道微生物群之免疫反應失調和上皮屏障功能障礙(Khoret at. , 2011; Abraham and Cho, 2009)。全世界之IBD發病率和盛行率持續增加，這些疾病與顯著之發病率有關並對生活品質和工作能力產生重大影響(Danese and Fiocchi, 2011; Baumgart and Sandbom, 2012)。目前之傳統治療針對藉由逐漸使用抗炎劑、免疫抑制藥物和靶向炎性細胞因子(諸如腫瘤壞死因子α(TNFa))之生物製劑來抑制發炎。IBD之關鍵特徵亦為在發炎部位快速募集白血球並延長持續時間，此係由整聯蛋白與內皮細胞所表現之同源受體交互作用而允許細胞黏附和移行促成(Adams and Eksteen, 2006; Agace, 2006)。新興療法藉由抗黏附分子將此入口對準腸道，特別是對準腸道特異性α4β7整聯蛋白途徑(Feaganet al. , 2013; Sandbomet al. , 2013)7,8 。然而，這些療法在一半以上的患者中不能保持緩解，復發爆出在高比率之初級反應者中出現。由於全身性免疫抑制的結果，亦會發展出機會性感染。因此，主要目標之一係提供用於IBD之新穎治療方法並鑑定決定IBD之慢性、反應和復發的標記物。
此外，數種惡性細胞已顯示出顯現IL-7R。在塞扎裡(Sezary)皮膚淋巴瘤(其中之60%)或兒童急性淋巴細胞白血病的情況中，約15%之病例發展出CD127之增益功能突變而使得這些腫瘤為部分IL-7依賴性(Shochat等人，2011)。
消耗T淋巴細胞已成為對抗同種異體移植物排斥或對抗自體免疫的有效免疫抑制方法。然而，總T細胞耗竭可能不利於誘導免疫耐受性。靶向T細胞亞群或選擇性活化之T細胞，而不修飾Treg細胞可構成致耐受性的方法(Haudebourg等人，2009)。因此，CD127可被視為該意欲調節免疫反應之單株抗體(Mab)的潛在具吸引力之治療靶的，因為該等單株抗體可能具有消耗效應子，但不調節淋巴細胞的潛力。因此，推測它們可藉由拮抗IL-7接近IL-7-R，從而限制T和B細胞之功能和生長而在移植、自體免疫(Michel等人，2008)和惡性腫瘤中顯示出效力。
以干擾IL-7途徑之針對CD127+ 細胞的單株抗體進行的療法可藉由排除/中和初始和記憶性T細胞及/或減少彼等之數量，同時保留Treg細胞，或藉由排除或減少CD127陽性惡性細胞之數量來完成此目標。然而，使用針對CD127+ 細胞之單株抗體的療法若導致樹突細胞活化則可能成為雙刃劍。確實，與CRLF2(形成TSLP受體)相關之樹突細胞亦表現CD127。在TSLP之存在下，樹突細胞被活化並促進由T細胞介導之免疫反應。一些針對CD127之單株抗體(據推測係藉由修飾TSLP與TSLP受體交互作用之方式)具有增加由TSLP誘導之樹突細胞成熟的性質。因此，使用針對CD127且不會增加由TSLP誘導之樹突細胞成熟的單株抗體之療法將提供治療益處。該療法將呈現IL7R阻斷之益處，但無在含有TSLP之發炎環境中活化樹突細胞之缺點。
在一出版物(Racapé等人，2009)中，該作者分析IL-7受體α(IL7Rα)作為移植中之潛在治療靶的之利益。在審查IL-7Rα在各種T細胞和IL-7反應性細胞上之表現後，作者測定靶向表現IL-7Rα之記憶性T細胞是否可延長同種異體移植物在小鼠中之存活，並歸結出：靶向IL-7或IL-7Rα將有利地不損耗Treg細胞。在治療展望中，作者指出在治療性治療中靶向IL-7或IL-7Rα對表現CD127之細胞的存活可能有不同的結果且可能引發不同類型之淋巴細胞減少症。針對IL-7Rα之抗體的效果係取決於它們是否為阻斷或中和或細胞毒性抗體的問題亦從概念觀點被提出。然而，作者並未證實已經獲得並分析該等抗體而是表示需要進一步研究以評估該假設之相關性。
鑑於在免疫相關疾病和其他涉及IL-7/IL-7Rα之疾病(諸如不同類型之癌症，包括一些乳癌)中可用之治療方法的缺點，對於其他候選藥物(特別是對更多選擇性靶的具有活性之候選藥物)仍有需要以用來控制，例如調控人類患者中之免疫活化。
在此背景下，具有朝向IL-7Rα之拮抗劑性質的針對IL-7Rα之單株抗體已揭示於WO 2010/017468中，其人化形式揭示於WO 2011/094259中以治療自體免疫疾病(如多發性硬化症)。所描述之抗體被認為是IL-7與其受體結合之拮抗劑，且在對抗TH 17和TH 1細胞擴增和存活上具有活性，該TH 17和TH 1細胞之擴增和存活被認為需要IL-7與其CD127受體交互作用。這些抗體對免疫細胞，特別是樹突細胞成熟的影響並未被列入考慮。此外，這些抗體被認為不會抑制由TSLP誘導之TARC產製(WO 2011/094259之p.107)。類似地，WO 2011/104687或WO 2013/056984中報導之抗CD127抗體(其被考慮用來治療糖尿病、狼瘡、類風濕性關節炎和其他自體免疫性疾病)對樹突細胞成熟的可能效果未曾被討論且其與由TSLP誘導之信號傳導的交互作用也未曾被報導。此外，如Kern等人所發表(Kern等人，2013；Kern等人，2015)及如本文所示者，先前技藝之抗CD127抗體誘導該受體內化。由於亦誘導CD127內化之拮抗劑抗-CD127抗體不能控制第IV型皮膚過敏反應，而不會誘導內化之拮抗劑抗-CD127抗體可以，所以內化過程可能會活化信號傳導途徑，降低該抗體之拮抗劑效果。最後，先前技藝之抗體識別之抗原決定部位不包含任何來自CD127之2b位點的序列(即，特別是來自SEQ ID No：22之胺基酸109-180，或特別是來自SEQ ID No：22之胺基酸109-173，或特別是來自SEQ ID No：22之胺基酸113-180，或特別是來自SEQ ID No：22之胺基酸113-173)；且先前技藝之抗體未曾顯示出破壞CD127與IL7-R之γc鏈結合。
儘管最近有興趣研發CD127抗體，目前的努力集中在抑制由IL7誘導之IL-7R信號傳導。雖然如此，TSLP和TSLPR已涉及許多病狀。TSLP已被證明皮膚和肺部疾病中具有作用(He and Geha, 2010)且被證明與人類和小鼠中之各種病狀有關，包括氣道發炎性疾病和異位性皮膚炎(Ying et al., 2008)(Jariwala et al., 2011)。此外，TSLP已被證明與調節腸道免疫性和發炎有關(Taylor等人，2009)。其他涉及TSLP和TSLPR之病狀包括兒科B細胞白血病(van Bodegom等人，2012)、肺和皮膚特異性過敏性病症、自體免疫性相關之疾病(Roan等人，2012)和癌症，包括乳癌(Olkhanud等人，2011)。
WO 2015/189302中揭示不顯示出增加樹突細胞成熟之效果及/或不會誘導CD127內化及/或抑制由IL7誘導之內化的抗體。在該申請案和下文中，該稱為N13B2(嵌合抗體)、N13B2-h1、N13B2-h2和N13B2-h3(人化N13B2)之抗體對效應記憶性T細胞具有高效能，特別是在體內，尤其是被證明對效應記憶性T細胞具有快速作用(如下文所定義)。然而，該抗體被人化之程度有限且其產製效率亦受到限制。再者，該抗體未曾被報導對效應記憶性T細胞具持久效果。
本發明關於用於設計適合作為用於投予患者之治療候選物的新穎抗體之工具，該患者罹患涉及IL-7信號傳導途徑之疾病或處於罹患該疾病之風險中。根據本文提供之各種方法，該等工具改善意圖投予人類宿主之抗體的製備方法。特別是，該等工具包含人化抗體，特別是包含N13B2-h3之所有CDR序列的人化單株抗體。
該等多肽(或編碼該等多肽之多核苷酸)係特別提供用於產製特異性結合CD127之抗體(或其抗原結合片段)及/或作為抗體(或其抗原結合片段)；該抗體，特別是單株抗體，包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含三個CDR序列，SEQ ID No：1所示之VHCDR1、SEQ ID No：2所示之VHCDR2及SEQ ID No：3所示之VHCDR3。特別是，該重鏈可變結構域係由SEQ ID No：7所示之序列組成，或具有該序列加上額外之突變，特別是，該額外之突變具有四個殘基(較佳為三個或二個殘基，再更佳為一個殘基)之取代、缺失或插入，較佳地，其中該突變既不在CDR序列中，亦不在該框架序列之典型或游標位置。
本文所提供之抗體較佳為單株抗體，意指這些抗體之組成在抗原結合特異性方面，且因此在可變區組成方面是均勻的，特別是相一致的。
本發明提供與N13B2-h3抗體分享CDR，但具有不同輕鏈可變結構域框架之抗體。本發明者意外證明該包含與N13B2-h3之輕鏈可變結構域相同CDR(即，具有SEQ ID No：4、和SEQ ID No：5和SEQ ID No：6之CDR)，但包含不同輕鏈可變結構域序列(即，具有SEQ ID No：9；SEQ ID No：10；SEQ ID No：11或SEQ ID No：12之序列)之抗體；雖然被廣泛地人化，但與N13B2-h3相較下產量高(高達4倍)且同時保留所有功能特性。
本發明提供適合此背景之裝置，特別是包含針對IL-7Rα之特異性單株抗體。於特定之實施態樣中，該抗體僅負向干擾TSLP途徑。因此，於較佳之實施態樣中，該抗體不會增加由TSLP誘導之樹突細胞成熟。此外，或者是，於特定之實施態樣中，該抗體不會誘導CD127內化及/或抑制由IL7誘導之CD127內化。於特定之實施態樣中，該抗體組合這些與DC成熟及/或內化相關之特性和針對IL-7/IL-7-R信號傳導之拮抗劑活性。於特定之實施態樣中，該抗體抑制T細胞中由IL7誘導之α4、β7和α4/β7整聯蛋白表現，特別是在體內。於特定之實施態樣中，該抗體發揮針對靶的CD127+細胞之細胞毒性作用，實際上減少其數目(縮小該亞群)。此外，或者是，於特定之實施態樣中，該抗體包含至少80%，較佳為至少84%，或多於84%，再更佳為至少85%之如下文定義的人殘基。此外，或者是，於特定之實施態樣中，該抗體之產製至少與N13B2-h3同樣有效，較佳為至少二倍效率(如下文所定義者)。此外，或者是，於特定之實施態樣中，該抗體對效應記憶性T細胞具有快速及/或持久之效果。
特別是，本文提供之抗體包含可變重鏈(VH)，該可變重鏈(VH)包含下列胺基酸序列：本文提供之抗體較佳為包含由SEQ ID No：7所示之序列組成的VH鏈：尤其是，該可變重鏈連接由SEQ ID No：26之序列組成的恆定重鏈以構成完整的抗體重鏈。
特別是，本文提供之抗體包含VL鏈，該VL鏈係由選自由下列所組成之群組的序列組成：SEQ ID No：9之序列、SEQ ID No：10之序列、SEQ ID No：11之序列和SEQ ID No：12之序列，特別是SEQ ID No：12之序列：特別是，該可變輕鏈連接由選自SEQ ID No：27和SEQ ID No：28之序列組成(特別是由SEQ ID No：27組成)的恆定輕鏈，以構成完整的抗體輕鏈。 　　特別是，根據本發明之抗體或其抗原結合片段特異性結合CD127，特別是結合人CD127且該抗體或其抗原結合片段包含： 　　- 抗體輕鏈或抗體輕鏈可變結構域，該抗體輕鏈包含選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID No：9；SEQ ID No：10；SEQ ID No：11；SEQ ID No：12；特別是SEQ ID No：12，該抗體輕鏈可變結構域係由選自由下列所組成之群組的序列組成：SEQ ID No：9；SEQ ID No：10；SEQ ID No：11；SEQ ID No：12；特別是SEQ ID No：12；及 　　- 抗體重鏈可變結構域，其包含三個由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示之序列組成之CDR，特別是由SEQ ID No：7所示之序列組成的抗體重鏈可變結構域。 　　於本發明之更特定的實施態樣中，該抗體或其抗原結合片段特異性結合CD127，特別是人CD127且該抗體或其抗原結合片段包含： 　　- 根據本發明之抗體輕鏈可變結構域或抗體輕鏈，特別地，其係由選自由下列所組成之群組的序列組成：SEQ ID No：9；SEQ ID No：10；SEQ ID No：11；SEQ ID No：12；特別是SEQ ID No：12；及 　　- 抗體重鏈可變結構域，其包含三個由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示之序列組成之CDR，特別是由SEQ ID No：7所示之序列組成的抗體重鏈可變結構域。 與CD127結合
根據本發明，與IL-7Rα蛋白“結合”係指抗原-抗體型交互作用且包含該抗體或抗原結合片段之“特異性結合”性質，該特異性結合意指該抗體或抗原結合片段與IL-7Rα蛋白結合，但它們不與或以明顯較弱之親和力與其他蛋白(例如常見之細胞因子受體γ-鏈)結合。較佳地，特異性結合係在生理條件下界定及/或確定，特別是就該測試溶液之pH和鹽含量而言。結合和結合特異性可根據實施例中揭示之試驗分析，特別是可藉由生物感測器、Blitz、Biacore、ELISA或Western點墨分析來析。
於特定之實施態樣中，當IL-7-Rα鏈在與TSLP受體(具有CCRF2；GenBank登錄編號AF338733；Reche等人，2001)之複合物中時，本文提供之抗體靶向IL-7-Rα鏈並與其結合。於特定之實施態樣中，本文提供之抗體以等於或低於5E-9M之親和常數(KD)與為分離之蛋白質形式的CD127結合，此可藉由生物感測器分析測定，特別是藉由Blitz法測定。於特定之實施態樣中，該抗體之結合特性係使用包含ep1(SEQ ID No：19)及/或ep2(SEQ ID No：20)之序列的人CD127之抗原測定或定義。於特定之實施態樣中，該抗原包含同時包含ep1和ep2之人CD127的片段(即，該抗原包含ep1和ep2之序列及人CD127之插入序列)。於特定之實施態樣中，本文提供之抗體對該抗原之親和力至少與下列抗體相同：WO 2015/189302中揭示之N13B2-h3抗體及/或本文揭示之N13B2-hVL6抗體(具有VH和VL，該VH具有SEQ ID No：7所示之序列且該VL具有SEQ ID No：12所示之序列)及/或其VH具有SEQ ID No：7所示之序列且其VL具有SEQ ID No：10或SEQ ID No：11所示之序列的抗體。
本技藝之技術熟習人士已知測試該抗體與其靶的(無論是全長CD127、經分離的或為TSLPR或IL7R或如上述之其抗原)結合之方法(特別是包含Blitz方法)且該等方法說明於，特別是本文之第3圖、實施例3和實施例4及WO 2015/189302之第14頁、第3、4和6圖及各自之說明和實施例1、2、6、7中。 由TSLP誘導之樹突細胞成熟未增加
本文提供之抗體可與TSLP受體中之CD127結合(即，當CD127與CRLF2複合而形成TSLP受體時，本文提供之抗體可與CD127結合)。因此，本文提供之抗體可能干擾由TSLP誘導及/或由TSLP受體介導之信號傳導。較佳地，本文提供之抗體不與TSLP協同熟化免疫細胞，特別是樹突細胞。換言之，本發明之抗體不會增加由TSLP誘導之免疫細胞成熟。
此效果對樹突細胞成熟特別有利。測量該等效果之方式為本技藝之技術熟習人士已知且揭示於，特別是WO 2015/189302，第16-17頁及其實施例9中。特別是，與單獨使用TSLP(無抗體)刺激相比較，本文提供之抗體造成之CD40表現增加不超過50%。較佳地，CD40之表現增加不超過25%，較佳為增加不超過10%，再更佳為增加不超過5%。於特佳之實施態樣中，與單獨使用TSLP刺激相比較，使用TSLP和該抗體刺激之細胞中CD40之表現沒有增加或減少。 抑制由IL7誘導之α4、β7和α4/β7整聯蛋白之表現
於特定之實施態樣中，本文提供之抗體在玻管內抑制由IL7誘導之α4、β7和α4/β7整聯蛋白之表現。如本文所使用者，由IL7誘導之α4、β7和α4/β7整聯蛋白表現特指α4和β7整聯蛋白其中一者或二者之表現水準增加及表現α4、β7和α4/β7整聯蛋白之T淋巴細胞的數量或比率增加。抑制可為部分的，即，在IL7之存在下，α4、β7和α4/β7整聯蛋白在抗體存在下之表現水準增加超過基線水準(即，既無抗體也無IL7時之水準)，但低於無抗體存在時之水準；或者抑制可為完全的，即，在IL7和抗體之存在下，α4、β7和α4/β7整聯蛋白之表現水準不高於基線水準。
於特定之實施態樣中，本文提供之抗體抑制α4、β7及/或α4/β7整聯蛋白在玻管內之表現，即，以抗體處理(及在有及/或無IL7存在下)之細胞中之α4、β7及/或α4/β7整聯蛋白的表現水準低於未經處理之細胞(即，無抗體或IL7)中之水準。抑制程度可能為劑量依賴性。對表現之抑制情況可依WO 2015/189302之p.18中，特別是段落[58]和實施例16中所提出者更具體地定義、測試及/或測量。 CD127內化之抑制劑
於一特定之實施態樣中，本文提供之抗體抑制由IL7誘導之CD127內化。因此，當將細胞與該抗體一起培育時，與無抗體一起培育之細胞相比較，存有IL7不會使細胞表面之CD127表現減少，或使細胞表面之CD127表現減少較少。於特定之實施態樣中，當與該抗體一起培育時，當將細胞與5 ng/mL之IL7在37℃下一起培育15分鐘時，細胞表面之CD127表現水準為未與IL7一起培育之細胞表面的CD127表現水準之至少80%，較佳為至少90%。在玻管內，該細胞表面之表現較佳為在如上文中指明之限定時間後測量。此外，由於大多數細胞內化過程在低溫下受到抑制，該效果通常在生理溫度，特別是37℃下觀察最佳。然而，亦考慮在低溫，特別是4℃下培育細胞。
於較佳之實施態樣中，本文提供之抗體不會誘導CD127內化。因此，相對於在其他同等條件，但無抗體存在下培育之細胞中的細胞表面CD127表現，在該抗體存在下培育之細胞中的CD127之細胞表面表現並未降低或未明顯降低。於特定之實施態樣中，當在50 ng/mL抗體之存在下，在37℃培育30至45分鐘時，細胞表面之CD127表現水準為無該抗體存在下培育之細胞表面的CD127表現水準之至少80%，較佳為至少90%。此效果可在無IL7存在(在經抗體處理和未經抗體處理的二種細胞中)、有IL7存在及/或二種情況中觀察到。
上述之二種與CD127內化相關之特性(即，抑制由IL7誘導之內化或非誘導之內化)可進一步依WO 2015/189302中，特別是第19-20頁之段落[59]-[63]及第16圖和實施例5中提出之方式定義及/或測試。 破壞CD127-γc鏈交互作用
根據特定之實施態樣中，本文提供之抗體可破壞CD127與IL7-R之γc鏈結合。此意指在其中CD127與γc結合在一起且無抗體存在，特別是存有IL7之條件下(特別是在化學和物理條件下)，該抗體之存在明顯減少該結合。於特定之實施態樣中，在抗體和IL7之存在下，CD127不與γc鏈結合。特別是，在抗體和IL7之存在下，被發現與CD127聯結(或結合)之γc鏈的量少於在其他條件完全相同，但無抗體存在(或存有另一抗CD-127抗體，諸如MD707-13)，特別是存有IL7之條件下的結合量之80%，較佳為少於50%，再更佳為少於25%或10%。該等抗體之特性可藉由本技藝之技術熟習人士所熟知之用於測試蛋白質之交互作用的方法，特別是共免疫沉澱法進行評估，且這些方法說明於，例如WO 2015/189302之實施例21中。特別是，可在存有或不存有該測試抗體下培育細胞，然後在允許保存蛋白質複合物之條件下溶解之，所得之溶胞化物可能經受抗CD127免疫沉澱法，且使用抗γc抗體，藉由西方點墨可評估含有CD127之免疫沉澱複合物中是否存有γc(相反地，該免疫沉澱可使用抗γc抗體進行且CD127之存在係使用抗-CD127抗體評估)。 對IL7-IL7-R交互作用之拮抗劑
根據特定之實施態樣，大分子，特別是本發明之抗體或其抗原結合片段進一步具有對介白素7(IL7)之拮抗劑性質，從而拮抗IL7接近(即，結合)CD127陽性細胞上之CD127。
“對IL7-IL7-R交互作用之拮抗劑性質”意指靶向IL7-Rα之本發明的抗體或其抗原結合片段具有防止表現在CD127細胞(特別是人效應T細胞，特別是人記憶性T細胞)上之IL7受體提供其結合伴侶IL7，特別是人IL7可接近性之效果。由於拮抗IL7之結合，本發明之抗體或其功能片段藉由阻止IL7依賴性胸腺T細胞產生而導致淋巴細胞減少。
該拮抗劑性質可能特別拮抗由IL7誘導之IL7-R信號傳導。由IL7誘導之IL7-R信號傳導的拮抗劑可依實施例中之描述藉由測量對STAT5磷酸化之抑制來鑑定。由IL7誘導之STAT5磷酸化為IL7-R活化之標記，而拮抗IL7-IL7-R交互作用之抗體預期會減少由IL7誘導之STAT5磷酸化。
於特定之實施態樣中，本發明之大分子為由IL7誘導之IL7-R信號傳導的拮抗劑。於一特定之實施態樣中，本發明之大分子抑制由IL7誘導之STAT5磷酸化。於較佳之實施態樣中，當抗體濃度低至55 ng/ml時，對STAT5磷酸化之抑制超過50%及/或當抗體濃度低至100 ng/ml時，對STAT5磷酸化之抑制超過80%。對STAT5磷酸化之抑制可藉由本技藝之技術熟習人士已知之方法，特別是藉由WO 2015/189302之實施例部分，特別是實施例5及/或第21頁，段落[69]和[70]及實施例3中提出之方法評估。
亦令人滿意的是，本發明之大分子(特別是抗體、其抗原結合片段或抗體模擬分子)抑制PI3-k及/或ERK(細胞外信號調節之激酶)信號傳導途徑活化及/或不活化或增加活化，特別是抑制PI3-k及/或ERK1及/或ERK2磷酸化及/或不誘導或增加PI3-k及/或ERK1及/或ERK2之磷酸化。特別是，本文提供之抗體、其抗原結合片段或抗體模擬分子，特別是該等作為IL-7-IL-7R交互作用拮抗劑之抗體、其抗原結合片段或抗體模擬分子不會誘導PI3-k及/或ERK途徑(較佳為PI3-k和ERK途徑)活化，特別是不會誘導PI3-k及/或ERK1及/或ERK2磷酸化，更特別地，不會誘導PI3-k及ERK 1和ERK 2磷酸化。特別是，本文提供之抗體、其抗原結合片段或抗體模擬分子，特別是作為IL-7-IL-7R交互作用拮抗劑之抗體、其抗原結合片段或抗體模擬分子抑制PI3-k及/或ERK途徑活化，特別是抑制PI3-k及/或ERK1及/或ERK2磷酸化，更特別地，抑制PI3-k及ERK1和ERK2磷酸化。該途徑之活化及/或該蛋白質之磷酸化可藉由本技藝之技術熟習人士已知之方法測試，特別是藉由如第7圖和實施例8中說明之西方點墨法測試。 TSLP之結合作用的拮抗劑
由於本文所提供之抗體可與IL7-R中之CD127結合，它們亦可與TSLP中之CD127結合，特別是，藉由空間位阻及/或藉由競爭共同的結合位點，本文提供之抗體可抑制TSLP與TSLPR結合。換言之，本文提供之抗體可對TSLP之結合作用呈現拮抗劑活性。 由TSLP誘導之TARC產製的抑制劑
於特定之實施態樣中，本文提供之抗體抑制由TSLP誘導之TARC產生CD127陽性細胞。如上述，受TSLP刺激之樹突細胞會增加TARC之產生量。這可能是由於它們與TSLPR結合及它們作為TSLP結合之拮抗劑的潛在作用。於一特定之實施態樣中，本文提供之抗體不會增加樹突細胞成熟(成熟之測定為，例如測定CD40及/或CD80細胞表面標記之表現增加)。
在以TSLP加上本文提供之抗CD127抗體處理之細胞中，由TSLP誘導之TARC產生量可能較以單獨之TSLP處理的細胞低。換言之，本文提供之抗體可能為由TSLP誘導之TARC產製的抑制劑。於本發明之一實施態樣中，本文提供之抗體減少TARC之產製量。於一特定之實施態樣中，與以單獨之TSLP處理的細胞中之產製量相比較，當抗體濃度低至1μg/ml時，以TSLP和本文提供之抗體處理之細胞中的TARC之產製量降低超過10%，較佳為超過20%。測量TARC之產製可使用本技藝之技術熟習人士已知之任何標準方法及說明於，例如WO 2015/189302之實施例9中的方法在來自血液樣品之CD127陽性免疫細胞，特別是樹突細胞上進行。 細胞毒活性
於一特定之實施態樣中，本文提供之抗體對人細胞，特別是表現CD127之人T細胞具細胞毒性。表現為IL7受體鏈之CD127(其為該抗體之靶的)的人類細胞主要為T淋巴細胞，更精確地說為包括初始和記憶性T細胞之效應T淋巴細胞亞群，但不是調節性T細胞(Treg)，特別是不為休眠天然Treg。記憶性T細胞之產生為抗原促發導致，主要係藉由彼等之功能特徵(包括在再活化時經歷召回增殖並分化成二級效應細胞和記憶細胞之能力)定義。類似地，該被靶向之TSLP受體(為包含IL-7-Rα鏈之複合物形式)調節T輔助淋巴細胞、B細胞和樹突細胞分化。
特別是，本文提供之具有“針對T細胞之細胞毒性活性”或細胞毒性性質的抗體(細胞毒性抗體)藉由殺死效應T細胞群造成效應T細胞群耗盡並因此減少這些細胞的數目。相反地，該抗體不會改變調節性T細胞亞群或不會大幅度改變它，允許該Treg細胞執行其功能。在此背景下，於一特定之實施態樣中，在投予該抗體後，調節性T細胞(Treg)對效應T細胞(Teff)之比例提高。特別是，本文提供之抗體能夠將該比例提高約10%或更多。特別是，Treg對Teff之比例增加約20%。
特別是，該細胞毒性抗體顯示出抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。或者，本文提供之抗體不具有ADCC性質。當特定之細胞毒性超過，例如10%時，抗體之ADCC潛能可被認為是正向的。ADCC性能可在ADCC分析中評估，諸如描述於WO 2015/189302之實施例10中的試驗。當該抗體為大鼠抗體時，用於ADCC分析中之效應細胞較佳為大鼠之LAK細胞(經淋巴因子活化之殺手細胞)。特定是，當該抗體被人化時，該ADCC分析可在人NK細胞上進行。
對CD127陽性細胞同時具有細胞毒性和拮抗劑性質之本發明抗體能使這些性質在耗盡效應T細胞(特別是記憶性T細胞)時效果累加，從而能更強烈耗盡(耗竭該CD127+細胞庫)並使靶的T細胞之數目對應地減少。
上述段落及實施例中描述如何測試本文提供之抗體的相關所需功能特性。下列章節將詳細說明該抗體之各種結構特徵和可能的修飾。鑑於這些指導方針，技術熟習之人士將能夠取得具有下列結構特徵與理想之功能特徵的抗體，特別是從具有所需功能特徵之N13B2-hVL6抗體開始取得。
當意圖用於投予人類個體時，如本技藝之技術熟習人士所知，該抗體與人抗體盡可能同源是較理想的。與人抗體之同一性程度的測量結果係以在該抗體序列中(特別是在該抗體輕鏈或重鏈可變結構域之框架中)之人殘基的百分比表示，即，在該抗體序列(特別是在該抗體輕鏈或重鏈可變結構域之框架)中，與最同源之已知人抗體(特別是在該最同源之已知人抗體輕鏈或重鏈可變結構域之框架)之相同功能位置處的殘基為同一殘基之殘基%。此特性在本文中，如同在文獻中般，通常以“抗體A(或其可變結構域之框架序列)具有xx%之人殘基”表示，這意味抗體A(或其可變結構域的框架序列)具有xx %之殘基與最同源之已知人抗體(或其可變結構域之框架序列)之相同功能位置處的殘基相一致。該同一性程度可藉由本技藝之技術熟習人士已知之方式測量，特別是可藉由在WHO INN專家組公開會議期間(2015年4月)所闡明之國際免疫遺傳學信息系統(IMGT)DomainGapAlign工具測量。較佳地，本文提供之抗體與人抗體具有超過80%，更佳為至少84%，超過84%，再更佳為至少85%之同一性(特別是使用DomainGapAlign工具所測定者)。該同一性程度可僅針對輕鏈可變結構域或僅針對輕鏈(藉由與人抗體輕鏈可變結構域或輕鏈相比較)測定，或可針對輕鏈和重鏈一起測定，此係藉由將各鏈與最同源之對應的人抗體鏈相比較並報告同一性之累積百分比來進行。特別地，根據本發明之抗體輕鏈可變結構域或抗體輕鏈包含至少80%，更特別地84%，再更特別地至少85%之人殘基。本文提供之特定的抗體輕鏈可變結構域分別具有84.2%(SEQ ID No：9)；85.3%(SEQ ID No：10和SEQ ID No：11)和86.3%(SEQ ID No：12)之人殘基。本文提供之較佳的抗體重鏈可變結構域(SEQ ID No：7)具有90.8%之人殘基。
本文提供之抗體輕鏈可變結構域可包含至多135個胺基酸，較佳為至多120個胺基酸且甚至更佳為至多110或107個胺基酸。本文提供之抗體輕鏈可變結構域可包含至少80個，較佳為至少90個，再更佳為至少100個或106個胺基酸。本文提供之抗體輕鏈可變結構域可包含80至135個，較佳為90至120個，再更佳為105至110個胺基酸。
本文提供之抗體輕鏈可包含至多250個胺基酸，較佳為至多230個胺基酸且再更佳為至多214或211個胺基酸。本文提供之抗體輕鏈可包含至少150個，較佳為至少190個，再更佳為至少200或210個胺基酸。本文提供之抗體輕鏈可包含150至250個，較佳為190至230個，再更佳為210至220個胺基酸。
本文亦提供多肽，該多肽為(i)本文提供之抗體的抗原結合片段，特別是由本文提供之抗體輕鏈的片段或抗體輕鏈可變區、本文提供之抗體重鏈可變結構域組成之抗原結合片段，或包含本文所提供之抗體輕鏈的片段或抗體輕鏈可變區、本文提供之抗體重鏈可變結構域的抗原結合片段，及/或(ii)本文提供之抗體的抗體模擬分子。
抗原結合片段為與如上述相關章節(第[44]至[0047])中定義之CD127蛋白特異性結合之多肽且包含至少三個N13B2-h3之CDR(由SEQ ID Nos：4至6之序列組成)，較佳為本文提供之包含該CDR序列的輕鏈可變結構域(具有SEQ ID Nos：9至12)之片段。抗原結合片段可包含至少40個，較佳為至少50個，再更佳為至少70或74個胺基酸。抗體結合片段可包含至多100個，較佳為至多90個，再更佳為至多80或74個胺基酸。抗原結合片段可包含40至100個、50至90個，且較佳為60至100個，再更佳為50至70個、或60至80個胺基酸。特別是，如本文提供之抗原結合片段可具有關於本文提供之抗體的任何揭示之合適的功能特性，特別是揭示於段落[47]至[62]中之特性。
因此，本文提供之經分離之多肽可由具有多達250個胺基酸之序列組成，特別是由具有多達217個、多達214個、多達211個，更具體地，多達200個、多達175個、多達150個、多達135個、多達120個、多達107個，甚至更特別地，多達100個、多達90個、多達80個、多達74個、多達70個、多達60個胺基酸之序列組成。
抗體模擬分子為具有類似於抗體之性質，特別是類似之與CD127結合之性質的多肽。抗體模擬分子可為，例如親和體(affibody)分子、親和素(affilin)、黏合素(affimer)、抗運載蛋白(anticalin)、單抗體，等。特別是，如本文提供之抗體模擬分子可具有任何相關於本文提供之抗體之揭示的合適功能特性，特別是揭示於段落[47]至[62]中之特性。
特別是，根據本發明之抗體為人化抗體，其包含源自人恆定結構域之恆定結構域。特別是，該抗體輕鏈恆定結構域係源自人κ輕鏈恆定結構域及/或該抗體重鏈恆定結構域係源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區，特別是源自人IgG4重鏈恆定區。“源自”意指藉由胺基酸取代引起的一些點突變，諸如IgG4(S228P)或IgG1(E333A)。本技藝之技術熟習人士熟知的這些突變通常會修飾某些母鏈性質。例如，與親本抗體相比較，這些突變導致較少之致免疫性或廢止Fcγ受體結合，或避免單體抗體二聚體化或穩定該二聚體化使該抗體更好用於人類治療用途。源自親本重鏈和輕鏈恆定結構域之本發明抗體包含分別列於SEQ ID No：26、SEQ ID No：27或SEQ ID No：28之序列或其片段，或由SEQ ID No：26、SEQ ID No：27或SEQ ID No：28所示之序列或其片段組成。更特別地，該抗體輕鏈恆定結構域係由SEQ ID No：27所示之序列組成。特別是，該抗體重鏈恆定結構域包含SEQ ID No：26所示之序列或其片段或由SEQ ID No：26所示之序列或其片段組成。更特別地，該抗體重鏈恆定結構域係由SEQ ID No：26所示之序列組成。
本文亦提供編碼根據本發明之多肽、或本文提供之抗體或其抗原結合片段的經分離之核酸分子。特別是，該核酸分子編碼本文提供之抗體的輕鏈可變結構域或輕鏈，其與經分離之核酸分子組合，該經分離之核酸分子編碼根據本文提供之任何定義之抗體的重鏈。特別是，本文提供編碼多肽之經分離之核酸分子，該多肽包含選自由下列所組成之群組的序列或由彼等組成：SEQ ID No：9；SEQ ID No：10；SEQ ID No：11；SEQ ID No：12。特別是，根據本發明之經分離之核酸分子包含選自由下列所組成之群組的序列或由彼等組成：SEQ ID No：15；SEQ ID No：16；SEQ ID No：17或SEQ ID No：18。特別是，該經分離之核酸分子係與編碼重鏈(其包含三個由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示之序列組成之CDR)，特別是編碼抗體重鏈可變結構域(其係由SEQ ID No：7所示之序列組成)之經分離的核酸分子組合提供，更特別地，該經分離之核酸分子係由SEQ ID No：13所示之序列組成。於較佳之實施態樣中，提供編碼抗體或其抗原結合片段之經分離之核酸分子的組合，該組合包含第一經分離之核酸分子和第二經分離之核酸分子或由第一經分離之核酸分子和第二經分離之核酸分子組成，該第一經分離之核酸分子包含或由選自由下列所組成之群組的序列組成：SEQ ID No：15、SEQ ID No：16、SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；該第二經分離之核酸分子包含或由SEQ ID No：13之序列組成。於另一較佳之實施態樣中，提供編碼抗體或其抗原結合片段之經分離之核酸分子的組合，該組合包含第一經分離之核酸分子和第二經分離之核酸分子或由第一經分離之核酸分子和第二經分離之核酸分子組成，該第一經分離之核酸分子包含或由序列SEQ ID No：18組成；該第二經分離之核酸分子包含或由SEQ ID No：13之序列組成。
本文亦提供編碼完整輕鏈之多肽序列的多核苷酸，該多核苷酸同時包含可變結構域和恆定結構域，即，特別是，提供編碼SEQ ID No：9至12之序列其中一者及SEQ ID No：27或28之序列的多核苷酸，特別是提供包含序列SEQ ID No：15至18其中一者或由序列SEQ ID No：15至18其中一者組成之多核苷酸，該序列SEQ ID No：15至18與SEQ ID No：30或SEQ ID No：31連結。特別是，該等多核苷酸與編碼完整重鏈之多核苷酸組合提供，該多核苷酸同時包含可變結構域和恆定結構域，即，特別是，提供編碼SEQ ID No：7和序列SEQ ID No：26 之多核苷酸，特別是提供包含或由序列SEQ ID No：13組成之多核苷酸，該序列SEQ ID No：13與SEQ ID No：29連結。
特別是，本文提供之經分離之核酸分子除了編碼本文提供之抗體的輕鏈及可選擇地，編碼本文提供之抗體的重鏈之序列外，可在編碼該抗體鏈之上游可有利地包含編碼信號肽之序列，從而當在產製細胞中表現時可允許該鏈分泌。本文提供之經分離之核酸分子亦可包含一或多個編碼一或多種標記肽之序列以用於檢測及/或促進該鏈之純化。
本文亦提供用於選殖及/或用於表現本文提供之核酸分子的載體。特別是，該提供之載體為適合用於在哺乳動物細胞中選殖及/或表現之質粒，其包含用於轉錄和表現之調控序列。因此，本文提供包含如上文中揭示之多核苷酸，特別是如段落[76]至[78]中揭示之多核苷酸的載體。
此外，本文提供與如上述之核酸分子重組的細胞或細胞株，特別是載體，特別是哺乳動物或鳥類細胞或細胞株，特別是如第2圖中所詳述者。例如中國倉鼠卵巢細胞，其係經基因修飾以減少全面岩藻糖基化。確實，缺乏核心岩藻糖基化之抗體顯示出明顯增強之抗體依賴性之細胞介導的細胞毒性(ADCC)(von Horsten等人，2010)。另一實例為EB66細胞株，其天然具有低岩藻糖基化性質(Olivier等人，2010)。抗體亦可特別依實施例2中之詳細描述在以如上述之核酸分子瞬時轉染的細胞，特別是載體，特別是COS細胞中產製。
本文亦提供用於產製本文提供之多肽(特別是抗體輕鏈及/或單株抗體)的方法，該方法包含在能夠回收該多肽之條件下和回收該多肽之步驟中在包含編碼該多肽之核酸分子的細胞中表現該多肽、抗體輕鏈或單株抗體(或單株抗體之輕鏈及可選擇地，該重鏈)的步驟。特別是，該抗體或其片段係在呈現低岩藻糖基化性質之細胞(諸如EB66禽細胞)中製備。
本文亦提供醫藥組成物，該醫藥組成物包含多肽(特別是抗體輕鏈可變結構域或抗體輕鏈)及/或抗體或其抗原結合片段或抗體模擬分子及/或如上述定義之經分離之核酸分子和藥學載劑。該醫藥組成物可以視需要地進一步包含不同活性成分。特別是該組成物係提供在適合用於全身性投予或局部投予之配製劑中。特別是，本文提供適合用於局部投予之組成物，特別是適合用於肌肉內或皮下注射、用於使用諸如自動注射器(或注射器筆)之裝置進行注射、用於經皮投予，特別是使用經皮貼劑、用於經黏膜投予，特別是用於鼻內或直腸投予。特別是，本文提供適合用於局部投予至胃腸(GI)道，特別是透過口服投予之組成物，特別是用於治療腸道疾病(諸如克隆氏症或UC)之組成物，特別是適合遞送至結腸之組成物。特別是，本文提供適合用於全身性投予之組成物，特別是用於腸胃道外或腸內投予之組成物，特別是用於靜脈內注射或口服投予之組成物。如本技藝之技術熟習人士所知，腸道投予可為局部投予至胃腸道或全身性投予。必須理解的是，本文中提供該等醫藥組成物或其用途之處亦可提供該投予載劑及其用途，例如當明確提供可注射之醫藥組成物時，必須理解的是，該組成物係提供在裝置中或是與允許投予及/或注射該組成物之裝置(“遞送裝置”)組合。遞送裝置之實例包括，但不限於自動注射器，特別是多隔室注射器和經皮貼劑。因此，本文提供包含該組成物之遞送裝置，特別是自動注射器、泵或經皮貼劑及彼等之用途(如提供在下文中與該醫藥組成物相關者)。本文亦提供包含醫藥組成物和含有該組成物及/或適合用於投予該組成物之局部遞送裝置(特別是皮下、腸內或口服遞送裝置，特別是預填充注射器或無針裝置)的套組及彼等之用途(如提供在下文中與該醫藥組成物相關者)。該醫藥組成物係以任何適合用於投予之形式提供，包括溶液形式，特別是無菌水溶液、懸浮液形式、固體形式，特別是凍乾之固體，特別是用於吸附在(或被吸附在)貼劑上及/或用於再懸浮並以溶液形式投予者、適合用於口服投予之丸劑形式、片劑形式、或其他固體形式(特別是具有延遲或延長釋出者)、奈米顆粒形式，例如包含奈米顆粒之組成物，該奈米顆粒具有吸附在其表面上之多肽或者該多肽係包含在奈米顆粒內，等。該醫藥組成物之形式及可選擇地，該遞送裝置之性質可適合用於全身或局部遞送如本文提供之活性成分，即，可適合活性成分以活性狀態到達靶細胞、組織、器官。特別地，該醫藥組成物之形式及可選擇地，該遞送裝置之性質可適合用於遞送至胃腸道，特別是遞送至結腸。該醫藥組成物據稱包含醫藥上可接受之載體；然而，當藥物用途不需要該等載體時(例如若該產品係以純凍乾固體形式投予)，亦提供不含載體之用於類似用途和目的之醫藥組成物。特別是，該投予係根據本文所描述之任何用於腸道釋出，特別是用於腸道延遲釋出之合適方式執行。
本文亦提供在配製劑中之組成物，該組成物包含如上述定義之作為活性成分之多肽(特別是抗體輕鏈可變結構域或抗體輕鏈)及/或抗體(特別是單株抗體)、其抗原結合片段或抗體模擬分子，或如上述定義之醫藥組成物，該配製劑當投予人類患者時適合用於控制人CD127陽性細胞存活或擴增，特別是人CD127陽性效應細胞，尤其是CD127+記憶性T細胞存活或擴增，特別是同時為CD127+和CD8+之記憶性T細胞，或同時為CD127+和CD4+二記憶性T細胞。特別是，該包含該抗體(或如上述之其他試劑)作為活性成分之組成物係在當投予患者時適合用於控制樹突細胞分化及/或成熟之配製劑中。
令人驚訝地，本發明者已證明單次注射本文提供之抗體可允許持續之效果，且在該藉由單次注射本文提供之抗體來治療的動物中，在該單次注射後該發炎反應仍明顯減少長達14個月，甚至是長達18個月。投予(較佳為單次投予)本文提供之多肽，特別是抗體輕鏈且更特別是該抗體、其抗原結合片段或抗體模擬分子較佳為對效應記憶性T細胞具有快速及/或長期作用。較佳地，在投予該多肽、抗體鏈或抗體的一週內，更佳為48小時內，再更佳為一天內觀察到快速作用。較佳地，在最近(且較佳為單次)投予該多肽、抗體鏈或抗體的至少12個月，更佳為至少14個月可觀察到長期作用。特別是該作用為可逆的(特別是T細胞反應可藉由新的疫苗接種恢復)。該等作用較佳為抗原及/或反應特異性，且較佳為與可測量之淋巴細胞耗盡無關(即，藉由常用方法測量時，該個體中之淋巴細胞的總體數量未減少)。或者，該等作用可被定義為記憶性T細胞株落缺失，或為可逆性抗原特異性免疫記憶性T細胞缺失。該等投予對效應記憶性T細胞之效果可藉由比較在稍後接受本文提供之多肽、抗體鏈或單株抗體治療之經免疫接種的個體(特別是狒狒)和未經治療之經免疫接種的個體中對抗原(例如結核菌素)反應時之IFN-γ分泌細胞的量(例如藉由ELISPOT測量)來評估：若在治療後之相關時間點該經治療之個體中測得之抗原特異性T細胞的量明顯較少(較佳為至少低10%，更佳為至少低40%)，則觀察到效果。該等效果亦可藉由另外評估對指定抗原之發炎反應來測量，例如測量對局部投予之抗原的局部(特別是皮膚)發炎反應。或者，可使用MHC四聚體分析。測試該等效果之方法為本技藝之技術熟習人士已知且說明於本文中，特別是在實施例6中。
此外，令人驚訝地，本發明者證明本文提供之抗體可具有快速作用，特別是對T細胞活化，特別是對T細胞釋出細胞因子，特別是對發炎組織具有快速作用。特別是，該等作用係在投予該抗體之一週內觀察到，且較佳為在48小時內，再更佳為在24小時內觀察到，特別是觀察到IFN-γ之產生(或釋出)減少。特別是，該作用係在局部觀察到，即，在投予抗體之部位或在遞送部位觀察到。特別地，本文提供之抗體特別對T細胞釋出細胞因子具有快速作用，特別是快速之局部作用，特別是在投予之24小時內觀察到作用。當投予之抗體係用於局部遞送而非直接投予在意圖遞送之部位時，該抗體在從遞送開始，而非從投予開始之相同期間內在該遞送位點具有如上述之快速效果，如技術熟習人士所知者，該抗體之作用從投予開始可能會或可能不會延遲。
本文提供之組成物可進一步包含具有治療性免疫調節效果(特別是對涉及過敏或自體免疫之細胞)之額外化合物。為了說明的目的，所欲之示例性免疫調節劑為其他靶向T細胞之單株抗體，諸如抗CD3、抗ICOS或抗CD28抗體或重組蛋白或靶向輔助細胞(諸如CTLA4Ig)之抗體或抗CD40抗體。
本文提供之多肽、抗體、其抗原結合片段或抗體模擬分子、經分離之核酸分子、細胞及/或組成物可提供在組合產品中，該組合產品包含另外之產品，特別是具有如上述之治療性免疫調節劑效果的藥劑，特別是意圖用於同時、分開或依序投予者。本文提供組合產品，該組合產品包含多肽(特別是抗體輕鏈可變結構域或抗體輕鏈)及/或抗體、其抗原結合片段或抗體模擬分子、及/或經分離之核酸分子、載體、細胞或細胞株、及/或如上述定義之醫藥組成物，且可選擇地進一步包含： 　　- 具有治療性免疫調節劑作用之藥劑，特別是意圖與，例如本文提供之抗體組合投予之藥劑，特別是其中該投予係同時或在不同時間，及/或其中該投予係通過相同或不同途徑；及/或 　　- 用於投予該產品之裝置。
提供之多肽，特別是抗體輕鏈及/或抗體，特別是單株抗體及/或其抗原結合片段或抗體模擬分子及/或核酸、載體、細胞或細胞株及/或醫藥組成物或如上述定義之組成物係特別用於人類患者以治療受免疫反應影響，特別是受記憶性T細胞反應影響之病狀或病理學病症。該等病症或病狀包含那些由移植物排斥所引發者、自體免疫性疾病、過敏性疾病、呼吸系統疾病、慢性病毒感染、慢性發炎性疾病，特別是慢性腸發炎疾病、淋巴瘤、白血病或其他癌症疾病，包括那些由實體瘤引起者(其中這些病狀係與CD127陽性細胞及IL-7信號傳導途徑相關，特別是其中必須避免樹突細胞成熟增加者)。因此，本發明者證明可考慮使用該藥劑來治療特定之過敏性皮膚病、發炎性腸病(IBD)，特別是克隆氏症(Crohn's disease)(CD)或潰瘍性結腸炎(UC)、或原發性修格連氏症候群(primary sjögren syndrome)、或系統性紅斑狼瘡或全身性硬化症或多發性硬化症、或第I型糖尿病、或急性淋巴母細胞性白血病(例如T-ALL)或何杰金氏淋巴瘤、或與CD127+細胞相關之乳癌、腎癌、膀胱癌、肺癌、胰臟癌或用於治療T細胞皮膚淋巴瘤，諸如Sezary淋巴瘤、或用於治療具有IL-7-R/TSLP途徑之功能獲得性突變的急性淋巴母細胞樣白血病、或用於治療移植物排斥及/或需要移植及/或將要進行移植及/或已經歷移植之患者。於較佳之實施態樣中，考慮治療發炎性腸病(IBD)，特別是克隆氏症(CD)、或潰瘍性結腸炎(UC)、或原發性修格連氏症候群、或系統性紅斑狼瘡、或全身性硬化症、或多發性硬化症、或第I型糖尿病。特別是，本發明關於作為藥品之根據本發明的多肽、或抗體或其抗原結合片段或抗體模擬分子、或經分離之核酸分子、或醫藥組成物，更特別的是，該藥品係用於預防或治療器官或組織移植物排斥或選自由下列所組成之群組的疾病：自體免疫性疾病，特別是類風濕性關節炎、全身性硬化症、多發性硬化症、第I型糖尿病、自體免疫性甲狀腺炎、全身性紅斑狼瘡、原發性修格連氏症候群和發炎性疾病，特別是發炎性腸病(IBD)，更特別的是克隆氏症和潰瘍性結腸炎、腦脊髓炎和過敏性疾病和癌症疾病及與移植和呼吸疾病相關之疾病，該藥品較佳為經由局部途徑投予。
本文提供該多肽、抗體輕鏈或抗體、其抗原結合片段或抗體模擬分子於治療病理狀況之用途，該病理狀況涉及改變人類患者之免疫反應而導致顯性致耐受性狀態或相反地，缺乏耐受性，在該病理狀況中將需要控制該免疫反應水準及破壞惡性CD127陽性細胞。
“治療 ”或“治療性治療 ”意指執行之投予步驟導致有此需要之罹患與IL-7途徑相關(即，涉及CD127陽性細胞之活化或增殖)之病症的動物或人類患者的臨床病況改善。該等治療意圖藉由排除或減輕與IL-7途徑相關(即，涉及CD127陽性細胞之活化或增殖)之病症的症狀來改善動物或人類患者之臨床狀態。較佳地，本文提供之治療能夠恢復健康。較佳地，該治療不會因為增加免疫細胞，特別是樹突細胞成熟而有不欲有之負面影響。
於治療患者之特定態樣中，提供多肽、抗體、抗原結合片段、抗體模擬分子、多核苷酸、細胞或細胞株、或組成物，該多肽、抗體、抗原結合片段、抗體模擬分子、多核苷酸、細胞或細胞株、或組成物意圖及/或適合用於耗盡CD127陽性細胞但同時保留CD127陰性細胞。
於治療患者之特定態樣中，提供多肽、抗體、抗原結合片段、抗體模擬分子、多核苷酸、細胞或細胞株、或組成物之用途，該多肽、抗體、抗原結合片段、抗體模擬分子、多核苷酸、細胞或細胞株、或組成物意圖及/或適合用於防止CD127陽性細胞分化及/或擴增及/或成熟，特別是由IL-7及/或TSLP誘導之分化、擴增或成熟，同時對CD127陰性細胞幾乎沒有或沒有直接影響。
於治療患者之特定態樣中，提供多肽、抗體、抗原結合片段、抗體模擬分子、多核苷酸、細胞或細胞株、或組成物之用途，該多肽、抗體、抗原結合片段、抗體模擬分子、多核苷酸、細胞或細胞株、或組成物意圖及/或適合藉由干擾由IL-7誘導之信號傳導來排除/中和初始和記憶性T細胞，但同時保留Treg細胞。
於治療患者之特定態樣中，提供多肽、抗體、抗原結合片段、抗體模擬分子、多核苷酸、細胞或細胞株、或組成物之用途，該多肽、抗體、抗原結合片段、抗體模擬分子、多核苷酸、細胞或細胞株、或組成物意圖及/或適合用於藉由該抗體之細胞毒性作用(但可能非絕對透過ADCC(抗體依賴性細胞毒性)而可選擇地藉由CDC(補體依賴性細胞毒性))來耗盡淋巴細胞亞群或其他表現CD127之細胞群(包括正常或病理性T和B淋巴細胞、NK細胞、樹突細胞和其他細胞類型，包括上皮細胞)。
本文亦提供在組合物或有此需要之患者的附加治療方案中作為活性成分之多肽，特別是抗體輕鏈及/或抗體、其抗原結合片段、抗體模擬分子、多核苷酸、細胞或細胞株、或如上述定義之組成物。亦提供在組合物或有此需要之患者的附加治療方案中作為治療活性成分之多肽，特別是抗體輕鏈及/或抗體、其抗原結合片段、抗體模擬分子、多核苷酸、細胞或細胞株、或如上述定義之組成物的用途。
於上述之態樣中，所設想之用途亦適用於上文提供之核酸、載體、細胞、細胞株、組成物和醫藥組成物。
本文提供意圖及/或適合用於病狀之裝置和產品，該病狀為諸如那些由移植物排斥所引發之疾病、自體免疫性疾病、過敏性疾病、呼吸系統疾病、慢性病毒感染、慢性發炎性疾病，特別是慢性腸發炎疾病、淋巴瘤、白血病或其他癌症疾病，包括那些由實體瘤引起者(其中這些病狀係與CD127陽性細胞及IL-7信號傳導途徑相關，特別是其中必須避免樹突細胞成熟增加者)。因此，該裝置和產品特別是意圖及/或適合用於治療特定之過敏性皮膚病、發炎性腸病(IBD)，特別是克隆氏症(CD)或潰瘍性結腸炎(UC)、或急性淋巴母細胞性白血病(例如T-ALL)或何杰金氏淋巴瘤、或與CD127+細胞相關之乳癌、腎癌、膀胱癌、肺癌、胰臟癌或用於治療T細胞皮膚淋巴瘤，諸如Sezary淋巴瘤、或用於治療具有IL-7-R /TSLP途徑之功能獲得性突變的急性淋巴母細胞樣白血病、或用於治療移植物排斥及/或需要移植及/或將要進行移植及/或已經歷移植之患者。
特別是，本文提供使用多肽，特別是抗體輕鏈及/或抗體、抗原結合片段、抗體模擬分子、核酸、細胞、細胞株或組成物來治療人類患者中由移植物排斥所引發之疾病、自體免疫性疾病、過敏性疾病、呼吸系統疾病、慢性病毒感染、慢性發炎性疾病，特別是慢性腸發炎疾病、淋巴瘤、白血病或其他癌症疾病，包括那些由實體瘤引起者(其中這些病狀係與CD127陽性細胞及IL-7信號傳導途徑相關，特別是其中必須避免樹突細胞成熟增加者)。因此，該產品特別是用於治療特定之過敏性皮膚病、發炎性腸病(IBD)，特別是克隆氏症(CD)或潰瘍性結腸炎(UC)、或急性淋巴母細胞性白血病(例如T-ALL)或何杰金氏淋巴瘤、或與CD127+細胞相關之乳癌、腎癌、膀胱癌、肺癌、胰臟癌或用於治療T細胞皮膚淋巴瘤，諸如Sezary淋巴瘤、或用於治療具有IL-7-R/TSLP途徑之功能獲得性突變的急性淋巴母細胞樣白血病、或用於治療移植物排斥及/或需要移植及/或將要進行移植及/或已經歷移植之患者、自體免疫疾病、或過敏性疾病、或用於治療白血病，諸如急性淋巴母細胞性白血病、或用於治療淋巴瘤、或用於治療癌症疾病、或用於治療慢性病毒感染、或用於治療發炎性疾病，特別是IBD，特別是CD或UC、或用於治療呼吸系統疾病、或用於預防及/或治療與移植相關之症狀。
特別是，本文提供治療方法，該治療方法包含投予人類患者多肽(特別是抗體輕鏈可變結構域或抗體輕鏈)及/或抗體、抗原結合片段、抗體模擬分子、或經分離之核酸分子、細胞及/或細胞株、或如上述定義之組成物及/或醫藥組成物以用於治療下列病症及/或病狀：由移植物排斥所引發之疾病、自體免疫性疾病、過敏性疾病、呼吸系統疾病、慢性病毒感染、慢性發炎性疾病，特別是慢性腸發炎疾病、淋巴瘤、白血病或其他癌症疾病，包括那些由實體瘤引起者(其中這些病狀係與CD127陽性細胞及IL-7信號傳導途徑相關，特別是其中必須避免樹突細胞成熟增加者)。因此，該方法特別用於治療特定之過敏性皮膚病、發炎性腸病(IBD)，特別是克隆氏症(CD)或潰瘍性結腸炎(UC)、或急性淋巴母細胞性白血病(例如T-ALL)或何杰金氏淋巴瘤，或與CD127+細胞相關之乳癌、腎癌、膀胱癌、肺癌、胰臟癌、或用於治療T細胞皮膚淋巴瘤，諸如Sezary淋巴瘤、或用於治療具有IL-7-R/TSLP途徑之功能獲得性突變的急性淋巴母細胞樣白血病、或用於治療移植物排斥及/或需要移植及/或即將進行移植及/或已經歷移植之患者、自體免疫疾病、或過敏性疾病、或用於治療白血病，諸如急性淋巴母細胞性白血病、或用於治療淋巴瘤、或用於治療癌症疾病、或用於治療慢性病毒感染、或用於治療發炎性疾病，特別是IBD，特別是CD或UC、或用於治療呼吸系統疾病、或用於預防及/或治療與移植相關之症狀。
本發明者已進一步證明在UC患者中，IL7、CD127及/或TSLPR mRNA之量可允許預測對傳統免疫抑制治療之反應：反應者(即，對治療反應時表現出明顯症狀減少之患者)較非反應者具有較少量之IL-7和CD127及較多量之TLSPR。因此，本文提供在體內評估患有潰瘍性結腸炎(UC)之患者(特別是人類患者)對免疫抑制治療之反應可能性之方法，該方法包含測量從該患者獲得之樣品中的IL7、CD127及/或TLSPR mRNA或蛋白質之量，並歸結出：與參考組相比較，當所測得之IL7及/或CD127量低於該群組之平均量及/或當所測得之TSLPR的量高於該群組之平均量時，反應可能性增加。進行所需測量之方法為本技藝之技術熟習人士已知且可能涉及使用針對CD127之抗體，特別是用於測量CD127之蛋白質表現水準者。上文提供之多肽，特別是抗體輕鏈及/或單株抗體係特別用於該等方法且提供之該等方法特別是使用該等多肽、抗體輕鏈及/或單株抗體。
特別地，本文提供從由抗體、其抗原結合片段和抗體模擬分子組成之群組中選擇化合物之方法，該方法包含下列步驟至少一者： 　　i.測試該化合物與CD127，特別是與人CD127，特別是與來自CD127之結構域D1及/或CD127之結構域D2之位點2b的抗原決定部位序列之結合。來自結構域D1及/或結構域D2之位點2b的抗原決定部位序列可為其中所描述之任一抗原決定部位序列，特別是如段落[016]中所揭示者，特別是選自由下列所組成之群組的抗原決定部位序列：SEQ ID No：32、SEQ ID No：33、SEQ ID No：34、SEQ ID No：35、SEQ ID No：36或SEQ ID No：96，且更特別是SEQ ID No 34、SEQ ID No：35和SEQ ID No：96。於本發明之特定的體實施態樣中，該結合試驗可包含測試該化合物與選自由下列所組成之群組的抗原決定部位序列之結合：SEQ ID No：34、SEQ ID No：35和SEQ ID No：96及測試該化合物與選自由下列所組成之群組的抗原決定部位序列之結合：SEQ ID No：42和SEQ ID No：43。該化合物之結合能力可藉由本技藝已知之任一種方法測試，特別是可藉由本技藝之技術熟習人士已知且說明於本文之第3圖、實施例3和實施例4及WO 2015/189302之第14頁、第3、4和6圖和對應圖例、及實施例1、2、6、7中之Blitz方法，及/或本文所揭示之實施例10中之方法測試；及/或 　　ii.在該化合物之存在下測試對由IL7誘導之IL7-R信號傳導之抑制作用，特別是對STAT5磷酸化之抑制作用。在該化合物之存在下抑制由IL7之誘導作用可藉由本文實施例8及/或實施例11中揭示之方法測試；及/或 　　iii.在該化合物之存在下測試該磷脂醯肌醇3-激酶之活化。在該化合物之存在下，該磷脂醯肌醇3-激酶之活化可根據本文實施例8及/或實施例11中揭示之方法測試；及/或 　　iv.在該化合物之存在下測試該ERK信號傳導途徑之活化。在該化合物之存在下，該ERK信號傳導途徑之活化可根據本文實施例8及/或實施例11中揭示之方法測試； 　　v.測試該化合物與CD127之結構域D2之位點2b的至少一個β折疊結合(特別是至少與位點2b之第三β折疊(定義為SEQ ID No：34之核酸)結合及/或與選自由SEQ ID No：35和SEQ ID No：96所組成之群組之至少一個胺基酸序列結合)之能力。該化合物之結合能力可藉由本技藝已知之任一種方法測試，特別是可藉由本技藝之技術熟習人士已知且特別說明於本文第3圖、實施例3和實施例4及WO 2015/189302之第14頁、第3、4和6圖和對應圖例、及實施例1、2、6、7中之Blitz方法，及/或本文所揭示之實施例10中之方法測試。 　　該方法可進一步包含任一下列可選擇之步驟或至少一種下列可選擇之步驟： 　　vi.在該化合物之存在下測試CD127(特別是人CD127)與細胞因子受體之γc共同鏈的結合。在化合物之存在下CD127與細胞因子受體之γc共同鏈的結合可藉由，特別是本技藝之技術熟習人士熟知之用於測試蛋白質之交互作用的共免疫沉澱方法評估且該方法說明於，例如WO 2015/189302之實施例21中。特別是，可在存有或不存有該測試化合物之情況下培育細胞，然後在允許保存蛋白質複合物之條件下溶解之，將所產生之溶胞產物進行抗CD127免疫沉澱，並使用抗-γc抗體，藉由西方點墨評估該含有CD127之免疫沉澱複合物中是否存有γc(相反地，該免疫沉澱法可使用抗-γc抗體進行及使用抗-CD127抗體評估是否存有CD127)；及/或 　　vii.在該化合物之存在下測試CD127，特別是人CD127之內化及/或由IL7誘導之CD127內化。本文段落[51]至[53]中定義之CD127的內化可依WO 2015/189302，特別是第19-20頁之段落[59]-[63]和第16圖及實施例5中所闡述者進一步定義及/或測試；及/或 　　viii.在該化合物之存在下測試由TSLP誘導之樹突細胞成熟。由TSLP誘導之樹突細胞成熟定義於本文之段落[47]和[48]中。測量該等效果之方式為本技藝之技術熟習人士已知且揭示於，特別是WO 2015/189302之第16-17頁及其實施例9中。特別地，測量該等效果之方式包含測量以該化合物刺激之細胞與以單獨之TSLP刺激之細胞(無化合物)之間的CD40表現。 　　於該方法之一特定之實施態樣中，其中選擇該與CD127(特別是人CD127)特異性結合之化合物為由IL-7誘導之IL-7R信號傳導的拮抗劑，其不會誘導磷脂醯肌醇3-激酶和/或ERK信號傳導途徑活化。於該方法之更特定之實施態樣中，其中選擇該與CD127(特別是人CD127)特異性結合之化合物為由IL-7誘導之IL-7R信號傳導的拮抗劑，其不會誘導磷脂醯肌醇3-激酶且不會誘導ERK信號傳導途徑活化。
特別是，本文提供用於產生本發明之抗體或其抗原結合片段之方法，該抗體或其抗原結合片段係針對CD127產生，可能從非人類動物之免疫化產生，諸如可從比利時Louvain大學取得之LOU/C Igk1a種系大鼠產生)。免疫化可使用作為免疫原之SEQ ID No：22之胺基酸序列的片段，特別是包含如本文定義之抗原決定部位序列的SEQ ID No：22片段，特別是SEQ ID No：35及/或SEQ ID No：96進行。雜交瘤可經由將脾單核細胞與LOU大鼠免疫細胞瘤IR983F融合來取得。雜交瘤可根據該分泌出之單株抗體與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列結合之能力篩選：SEQ ID No：22、SEQ ID No：35和SEQ ID No：96，特別是SEQ ID No：35及/或SEQ ID No：96。因此，本發明亦包含免疫原化合物，該免疫原化合物為SEQ ID No：22之胺基酸序列的片段，特別是包含至少一個選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之片段：SEQ ID No：32、SEQ ID No：33、SEQ ID No：34、SEQ ID No：35和SEQ ID No：96，特別是SEQ ID No：34、SEQ ID No：35和SEQ ID No：36，更特別的是SEQ ID No：96。於本發明之一特定的實施態樣中，該免疫原化合物為線性肽，特別是包含SEQ ID No：96之胺基酸序列的線性肽，更特別的是包含或由SEQ ID No：35之胺基酸序列組成之線性肽，較佳為由SEQ ID No：35之胺基酸序列組成。
實施例1. 輕鏈之人化
除非另有規定，本文報告之所有實驗中使用下列重鏈N13B2人化_VH，核苷酸序列(SEQ ID No：13)：N13B2人化_VH，胺基酸序列(SEQ ID NO：7)：參見第1A圖 　　使用下列經優化之核苷酸序列來產生抗體輕鏈(其胺基酸序列提供於第1B圖中)：藉由基因合成取得各VL序列，將基因插入選殖載體(pUC57)中(具有BsiWI5'和3'端)並將Kozak序列(GCCACC)添加在ATG之前。使用含有人IgG1之CLkappa恆定結構域之pFuseCLIg-hk表現質粒(Invivogen)作為表現載體。 　　使用BsiWI限制酶分解各選殖質粒(VL-pUC57-Genscript) 以提取該VL插入子(400bp)。將純化之插入子接合在表現質粒pFuseCLIg-hk中，該表現質粒pFuseCLIg-hk藉由BsiWI分解而線性化並去磷酸化。將陽性選殖株(其具有以正確方向插在人恆定結構域之前的VL片段)擴增並使用不含內毒素之Midiprep(Macherey-Nagel)純化以用於轉染步驟。使用由SEQ ID No：26組成之恆定結構域，以類似之方式選殖該重鏈。 實施例2. 產生人化之輕鏈
在測試之人化抗CD127抗體方面，根據常規方法轉染和選擇穩定之選殖株。為各抗體製備對應於不同之重鏈(HC)和輕鏈(LC)轉染比的三種上清液並測試之：HC：LC為2：1、1：1.3和1：2。所得之效價報告在第2圖中，該效價係在CHO細胞(以300'000個細胞/mL；無抗生素接種)中製造後根據常規方法取得：在該對應抗體之固定的抗人IgG(Fc)上藉由ELISA分析效價，並使用小鼠抗人κmAb加經過氧化物酶標記之驢抗小鼠抗體揭露及使用TMB受質藉由比色法在450nm揭露。 　　亦在瞬時轉染實驗中測試N13B2-h3和N13B2-hVL6之產生。在轉染前一天，以100000個細胞/孔將COS細胞接種在具有完整培養基(DMEM SVF10%(Hyclone)+PS 1%+Glu 1%)之P12盤中，並在37℃，5%CO2下培育。轉染當天，使用50至90%匯合之COS細胞。以PBS清洗細胞並保持在500μl之完全培養基中。將0.6μg VH變體+0.4μg VL變體在200μl之OptiMEM培養基中混合，並添加1μl之Plus試劑(Invitrogen)(在室溫下培育15分鐘)。在混合物中加入3.5 μl之脂質體(lipofectamine)LTX(Invitrogen)+100μl，並在室溫下培育25分鐘。將全部混合物逐滴置於COS細胞上並在37℃，5%CO2下培育48小時。48小時後，收獲上清液並離心(1500rpm 10分鐘，4℃)。以ELISA n° TH-MO-43定量上清液。以ELISA TH-MO-44進行活性分析。 實施例3. 與CD127結合-Elisa
在夾心ELISA方面，以1.2μg/ml將驢抗人IgG(Fc特異性)抗體塗層在P96-盤上並加入純化之抗體以測量功能濃度之標準範圍。在培育和清洗之後，加入小鼠抗人輕鏈κ特異性(Effimune，選殖株NaM76-5F3)加經過氧化物酶標記之驢抗小鼠(Jackson Immunoresearch，參考715-036-151)抗體並藉由傳統方法揭露。 　　在活性ELISA分析方面，將1μg/ml之重組hCD127 (Sino Biologicals，中國北京；編號10975-H08H)固定在塑料上並加入抗CD127抗體之稀釋液以測量結合。培育並清洗後，加入小鼠抗人輕鏈(κ特異性)加經過氧化物酶標記之驢抗小鼠抗體並使用TMB受質，藉由傳統方法，藉由比色法在450nm測定。 　　取得下列ED50值(取得50%最大信號所需之濃度)：藉由將抗體在4℃、25℃和42℃培育7天、14天或30天來研究抗體之穩定性。即使在培育30天後，抗體與CD127之結合仍然很好。培育30天後藉由ELISA測定之ED50值報告於表2中。實施例4. 與CD127結合-Blitz
該方法係使用Blitz(FortéBio，C22-2 No 61010-1)進行。 　　藉由Fc片段將50μg/ml之重組hCD127(Sino Biologicals，中國北京；編號10975-H08H)/重組蛋白(Sino Biological目錄編號：11612-H08H)固定在抗人IgG Fc(AHC)生物感測器(FortéBio，18-5063)中30秒。然後，添加20μg/mL(飽和濃度)之抗-CD127抗體以結合為期120秒，隨後在動力學緩衝液中使抗-CD127抗體解離120秒。使用Blitz pro 1.2軟體進行數據分析，該Blitz pro 1.2軟體計算結合常數(ka)和解離常數(kd)並測定親和力常數KD(ka/kd)。結果報告於表3中。實施例5. 對STAT5磷酸化之抑制作用
為了在功能分析中測試對IL7R之抑制作用，將抗體與人PBMC在37℃培育30分鐘，再以0.1ng/ml之IL7 (AbD Serotec，編號PHP046)在37℃下刺激15分鐘。在4℃下終止反應，並以Perm Wash緩衝液清洗後再以Cytofix/Cytoperm套組(BD Bioscience，編號 554722)在4℃下固定15分鐘。清洗細胞並以經FITC標記之抗CD3(BD Bioscience，編號557694)在4℃下染色30分鐘。然後，將細胞在4℃下，在Perm Buffer Ⅲ(BD Bioscience，編號558050)中培育30分鐘使細胞具通透性。以PBS BSA1%疊氮化物0.1%清洗後，以經Alexa-647標記之抗pStat5抗體(BD Bioscience，編號612599)在室溫下將細胞染色30分鐘。在BD CantoⅡ細胞螢光計(cytofluorometer)上分析樣品。受IL7刺激之hPBMC-CD3+被誘導pStat5磷酸化，然而無IL7時，吾人未檢測到磷酸化。結果報告於第4圖和下表中，其顯示ED50，即，在該分析中該指明之抗體達到50%信號之濃度。該實驗確認藉由人化胺基酸修飾種系和修飾結構殘基不會改變抗CD127抗體之生物活性。所有測試之變體(N13B2-h3、N13B2-hVL3、N13B2-hVL4、N13B2-hVL5、N13B2-hVL6)可在IL7刺激後抑制hPBMC上之Stat5磷酸化，如同先前產生之N13B2參考批次。聚焦在N13B2-hVL6(最為人化和最優化的)，吾人注意到該N13B2-hVL6能保持其抑制Stat5磷酸化之生物活性，其程度與編號N13B2-h3相同。此外，該變體在42℃、25℃或4℃下培育14天後仍非常穩定，其不會誘導聚集體形成且保持其結合活性。 實施例6.對記憶性T細胞之效果
由結核菌素誘導之遲發型過敏反應模型 　　在遲發型過敏反應(DTH)皮膚測試前4週和2週，以卡介苗(0.1ml；2-8×105 CFU; Sanofi Pasteur MSD，法國里昂)在狒狒腿部上方區域進行二次皮內免疫接種。經由皮內注射2000或1000 UI之結核菌素純蛋白衍生物(Tuberculin Purified Protein Derivative)(PPD; Symbiotics Corporation，加州聖地牙哥)執行皮內反應(IDR)。使用鹽水(0.1ml)作陰性對照組。由至少二名觀察者使用卡尺測量注射部位之皮膚反應，當直徑＞4mm時被認為是陽性。在三週之清除期後進行第二次IDR且動物接受一次靜脈內注射10mg/Kg之N13B2(n=7)或10mg/kg(V915GA、AA892BB、32257、33874) (n=4)之人化N13B2或等體積之賦形劑(n=4)。注射後每個月進行額外之IDR。在清洗期後，經由皮內途徑為一些狒狒(先前以N13B2處理過)接種二次BCG再次將牠們免疫化，再進行新的IDR。記錄讀數之平均值並繪製每個時間點之歇值。為了比較數種實驗條件，使用計算用之Graph Pad Prism軟體將紅斑反應量化為曲線下面積(AUC)(第5A和B圖)。 酶聯免疫斑點法(Elispot) 　　根據製造商之說明書，在以結核菌素重新刺激之新鮮分離的PBMC上藉由IFN-g ELISPOT分析(非人靈長類動物IFN-g ELISPOT套組；R＆D System，明尼蘇達州Minneapolis)追蹤Ag-特異性T細胞頻率。 　　簡單地說，在Elispot MultiScreen® HTS Filter Plates (Merck Millipore)的每個孔中加入捕獲抗體(R＆D systems，目錄編號SEL961)並在4℃培育一晚。清洗三次後，加入阻斷緩衝液並將盤在周圍溫度下培育2小時。藉由Ficoll梯度離心(GE Healthcare Life Science，法國巴黎)從狒狒之血液中新鮮萃取出狒狒之PBMC。然後將紅血球溶解並清洗細胞，然後在有或無結核菌素純化蛋白衍生物之存在下在培養基(補充有青黴素-鏈黴素(Gibco)之TexMacs培養基)中重構成適當濃度。將盤在37℃和5%CO2下培育18至24小時。以清洗緩衝液清洗三次後，加入檢測抗體(R＆D systems，目錄編號SEL961)並在4℃下培育24小時。清洗三次後加入鏈親和素-AP(R＆D systems，目錄編號SEL002)並在2小時之期間內在周圍溫度下培育2小時。完成三次清洗。添加BCIP/NBT(R＆D systems，目錄編號SEL002)並放置在黑暗中30分鐘。需要以清洗緩衝液清洗數次並以去離子水清洗一次(第5C圖)。 動物 　　從法國國家科學研究中心靈長類學中心(Rousset，法國)取得狒狒(Papio anubis；7-14 kg)。將這些動物安置在INSERM單位1064之大型動物設施中。動物研究係由法國國家倫理委員會批准。 結果 　　在第一個實驗中，在經接種BCG疫苗之狒狒上以結核菌素進行第一次IDR，該狒狒在那時並未接受處理(第30天)。在一個月之清洗期後，在靜脈內(i.v.)注射10mg/Kg之N13B2(白色長條)後4小時進行第二次IDR並在每個月進行IDR。使用BCG進行新的疫苗接種(抗體注射後14個月)後進行最後一次IDR。對照動物(黑色長條)接受類似體積之賦形劑i.v.注射並接受相同方案之挑戰。結果顯示抗IL7Ra嵌合抗體可在單次投予後誘導非常長期之保護(長達14個月)。反應僅在新的疫苗接種後才恢復。 　　於另一實驗中，在經接種BCG之狒狒上以結核菌素進行第一次IDR(虛線條-例如為V915GA進行之IDR1)。在一個月的清洗期後，在靜脈內注射10mg/Kg之人化N13B2後4小時進行第二次IDR並在每個月進行IDR(實心長條-例如為V915GA進行之IDR2-6)。使用BCG進行新的疫苗接種並以結核菌素後進行最後一次之IDR(虛線-例如為V915GA進行之IDR7)。對照動物(黑色長條)接受類似體積之賦形劑i.v.注射，並接受相同方案之挑戰。結果顯示，在3/4之經評估的狒狒中，單次投予人化N13B2後亦可誘導長期之保護。“33874”動物最初在注射抗體後立即反應，但一個月後自發性地恢復反應。 　　在體外以結核菌素再次刺激血液PBMC。在經接種BCG之狒狒(虛線條)上以或不以結核菌素進行第一次IFNγ elispot。在注射10mg/kg之人化N13B2(填滿之長條)後4天進行第二次IFNγ elispot。然後每個月以結核菌素在體內進行新的IDR時進行新的ELISPOT。在接種新的BCG疫苗(虛線條)後進行最後一次IFNγ elispot。結果顯示投予人化N13B2可在長期反應動物中誘導抗原特異性記憶性T細胞缺失。“33874”狒狒在DTH模型中未顯示出結核菌素特異性記憶性T細胞顯著減少同時無長期保護。接種新的BCG疫苗後，長期反應之動物顯示出恢復至基礎水準(注射mAb前)之增加的抗原特異性記憶性T細胞頻率，且這與恢復體內之DTH反應有關。總之，這些結果證明由人化N13B2誘導之長期保護與抗原特異性記憶性T細胞缺失有關，此解釋該藥物之長期效應。 實施例7.IL-7、CD127和TSLP在IBD患者中之表現
依第6圖圖例中之詳細說明分析該依Planell et al.Gut 2013中之詳細描述所取得之原始mRNA表現數據。 實施例8. 以抗CD127抗體加IL7刺激之人PBMC的信號傳導途徑
從在37℃下與10μg/ml之可溶性抗人CD127抗體一起培育30分鐘並使用5 ng/ml之IL7(AbD Serotec，編號PHP046)在37℃下刺激10分鐘之人PBMC的細胞溶解物研究IL7信號傳導途徑。在還原條件下，使用20μg之溶胞產物的蛋白質，在7.5%聚丙烯醯胺凝膠中進行西方點墨，並點墨在硝酸纖維素膜(GeHealthcare)上。以5% BSA-Tris緩衝液鹽水(TBS)使點墨飽和，並先與在1%BSA-TBS中之1/1000磷酸-Stat5、Phospho-PI3-激酶p85、Phospho-Akt和Phospho-ERK1/2抗體(Cell Signalling Technolog)培育(在4℃下隔夜)，再與1/2000之經辣根過氧化物酶標記之多株山羊抗兔子抗體(Cell Signaling Technology)在室溫下培育1小時，或先與在1%BSA-TBS中之1/1000 GAPDH抗體(Santa Cruz)培育(在4℃下隔夜)，再與1/2000之經辣根過氧化物酶標記之多株山羊抗小鼠抗體(Jackson Immunoresearch)在室溫下培育1小時。使用LAS-3000成像系統(Fujifilm)藉由化學發光來顯露膜。由此可分析下列抗人CD127抗體：N13B2-h3和N13B2-hVL6(此二者同時為本文揭示之抗位點1/2b抗體)；MD707-13-G4(“抗位點1抗體”，揭示於國際專利申請案WO 2013/056984中)和1A11 (揭示於GSK專利WO 2011/094259中)。 實施例9.對IBD組織中之T細胞釋出細胞因子的效果
使用來自IBD患者之活檢組織作為體外發炎疾病模型且本文已證明在培養24小時後會自發釋出大量促炎細胞因子(UC：IFNγ，130±19 pg/ml；IL-6，4042±529 pg/ml；IL-8，25626±1640 pg/ml-CD：IFNγ，180±38 pg/ml；IL-6，3653±734 pg/ml；IL-8，15540±2452 pg/ml [分別為UC和CD之平均值±sem])。 　　將10μg/ml之抗CD127mAb與10μg/ml之IgG對照mAb或阻斷抗人IL-7Rα mAb施用在該使用從20位IBD患者(10位患有克隆氏症，10位患有潰瘍性結腸炎)取得之發炎結腸黏膜手術標本的器官培養分析中並在37℃下，在培養基中培養24小時(參見下文之採樣和培養條件的細節)。自每位患者採取配對之對照樣本並培養在相同條件下，但以IgG對照組代替抗CD127抗體。藉由ELISA(詳述於下)測量在體外培養之樣品之上清液中的細胞因子濃度。 　　由體外生長之UC活檢樣品產生之IFNγ明顯受抗IL7Rα mAb抑制。類似的結果可在一些分泌大量IFNγ之CD活檢樣品中觀察到。 體外器官採樣和培養 　　若使用黏膜切除組織，則使用剪刀切出小的活檢大小之片段。接著，將活檢組織或活檢組織大小之片段置於300μL之輔以下列物質的無血清HL-1培養基(Lonza, Cambridge BioScience，大英國協)中：L-麩胺醯胺、100 U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素和50μg/mL慶大黴素。將黏膜外植體在37℃和5%CO2 下培育24小時。在培育時間開始時將10μg/mL之各別測試之抗體(N13B2)或IgG對照組加入培養基中。最後，將上清液和活檢材料快速冷凍並儲存在-70℃以供未來分析使用。 酶聯免疫吸附(ELISA)分析 　　藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)測量活檢上清液中產製之細胞因子。根據製造商之指示使用來自ImmunoTools之人重組IFN-ɣ(＃31673539，德國Friesoythe)。 實施例10. 相關於抗人IL7-Rα抗體之抗原決定部位的表徵來比較抗人IL7-Rα抗體：
質譜分析：使用肽微陣列進行抗體剖析 　　肽科技公司之PepStarTM肽微陣列包含源自抗原之純化的合成肽或經化學選擇且共價固定在玻璃表面上之其他來源。將優化之親水性連接子部分插在玻璃表面和源自抗原之肽序列之間以避免由空間位阻引起之偽陰性。由於技術原因，所有肽類均含有C端甘胺酸。在由52個肽類組成之肽集合庫上進行樣品之剖析實驗。該肽類之完整列表顯示於下：使用多孔-格式將總共4個樣品培育在微陣列玻片上。在N13B2-h3VL6抗體和其他樣品(MD707-13、HAL和1A11)方面，施用6種不同濃度(10μg/ml；2μg/ml；1μg/ml；0.1 μg/ml；0.01μg/ml；0.001μg/ml)。將系列樣品稀釋液在30℃下，在含有21個個別迷你陣列(每一樣品稀釋液一個迷你陣列)的多孔微陣列載玻片上培育1小時。在樣品培育後，加入1μg/ml之第二抗人IgG抗體並令其反應1小時。同時在相同之微陣列載玻片上進行僅施加第二抗體之額外的對照培育以評估與肽之偽陽性結合。清洗並乾燥後，以高解析雷射掃描儀在635nm掃描該載玻片以取得螢光強度變化形廓。定量所產生之圖像以產生各個肽之平均像素值。定量該圖像以產生各個肽之平均像素值。以1 μg/ml之Cy5標記第二抗人IgG抗體。 　　緩衝液和溶液。所使用之緩衝液為包含0.05%吐溫20(JPT)之TBS緩衝液和分析緩衝液T20(Pierce, SuperBlock TBS T20，#37536)。使用肽微陣列(JPT Peptide Technologies GmbH，德國柏林；批次＃2668，多孔培育室，Axon Genepix掃描儀4200AL)進行採集和分析。微陣列係使用高解析螢光掃描儀掃描。所有進行之測量的雷射設置和施用之解析完全相同。分析所產生之圖像並使用點識別軟體GenePix(Molecular Devices)定量之。設法獲取每個點的平均信號強度(介於0和65535個任意單位之間)。 　　為了進一步評估數據，測定所謂的MMC2值。MMC2等於微陣列上所有三個事例之平均值，除了當變異係數(CV)-標準偏差除以平均值-大於0.5以外。在此情況中，該二個最接近之數值(MC2)的平均值被指定為MMC2。 氘分析 　　使用HDX-2系統(Waters S.A./N.V.；比利時Zellik)將重組人CD127與0或1莫耳當量之mAb混合在一起並在99.9% D2 O、10mM磷酸鈉、100mM NaCl，pH6.8中稀釋成最終D2 O含量為90%且CD127或CD127/mAb複合物濃度為27.5μM。在20.0℃下進行氫-氘交換30分鐘。經由在1.0℃下以100mM磷酸鈉、4M胍žHCl、0.4 M TCEP，pH 2.3將樣品進行1：1(v/v)稀釋使最終pH為2.5來淬滅該氫-氘交換。2分鐘後，將經淬滅之樣品裝填在HDX管理器上以用於在20.0℃下之線上胃蛋白酶分解(Enzymate BEH Pepsin，2.1×30mm；5μm)，接著脫鹽(Acquity BEH C18 Vanguard 2.1 mm×5mm；1.7μm)，再在0.0℃，流速40μl/min下使用梯度為5%-40%之在乙腈中之0.2%甲酸溶液(pH 2.5)中進行逆相分離(Acquity BEH C18 1.0mm x 100mm；1.7μM)10分鐘。在具有鎖閉校正之Waters Xevo G2-XS ESI-Q-TOF質譜儀上之正離子模式中進行質譜分析。使用溫和來源條件(溫度：90℃，毛細管電壓：2.5kV，採樣錐：30V，去溶劑化氣體流量：800L/小時，去溶劑化溫度：250℃)以使返回交換最小化同時確保適當之去溶劑化(73)。肽之鑑定係使用PLGS 3.0.2和UNIFI 1.8，藉由碰撞引致解離協助，以MSE模式收集。在DynamX 3.0中測定併入之氘。使用PyMOL 1.8.2.3 (SchrödingerLLC，美國麻薩諸塞州Cambridg)從PDB ID 3DI3(19)製備結構圖。從Sigma Aldrich(Schnelldorf，德國)購買可取得之最高純度的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉、氯化鈉、鹽酸胍、鹽酸三(2-羧乙基)膦(TCEP)、50%氫氧化鈉和甲酸。LC-MS級溶劑係來自Biosolve Chimie (Dieuze，法國)、氧化氘(99.9% D)和在氧化氘(99.9% D)中之20%氯化氘係來自Cambridge同位素實驗室(Andover，美國麻薩諸塞州)、鹽酸37%係來自VWR國際公司(Fontenay-sous-Bois，法國)且牛細胞色素C分解物係來自Thermo Fisher Scientific (Germering，德國)。Amicon超離心過濾器(0.5mL；10kDa截留)係從Merck Millipore(Molsheim，法國)取得。 結果 　　藉由不同抗IL7Ra mAb之線性肽陣列進行之抗原決定部位表徵鑑定出二種類型之拮抗劑mAb：(1)結合至與IL-7交互作用之區域(位點1)之mAb，如先前藉由其他二個群組描述者(選殖株1A11描述於WO/2011/094259，選殖株HAL描述於WO/2011/104687中)且包括MD707-13，和(2)結合位點1和抗原決定部位之mAb，即本發明之N13B2-h3VL6，該抗原決定部位與預測之介於IL-7Rα和γ-鏈次單位之間的異二聚化結構域(位點2b)重疊(Walsh 2012)。 　　將具有高且類似之親和力的N13B2-h3VL6和MD707-13(以2.10-10 M之KD與位點1/2b結合之結合劑及以5.10-10 M之類似KD與位點1結合之結合劑)與人IgG4 Fc同種型重組表現(含有S228P鉸鏈突變以防止Fab臂交換)，並與先前描述之其他具有類似親和力之位點1 mAb，選殖株1A11 (描述於WO/2011/094259(KD為6.10-10 M)中，在臨床中研發時與人IgG1 Fc同種型重組表現(NCT02293161))比較。使用氫氘交換質譜法(HDX-MS)分析構象抗原決定部位可確認先前之觀察並證明本發明之抗體，即N13B2-h3VL6(位點1/2b mAb)可防止氘併入數種位點1之肽類，但亦防止併入與位點2b重疊之肽，而其他二種mAb (MD707-13和1A11)僅明顯防止氘併入位點1之肽類(數據未顯示)。 　　本發明之抗體為唯一能識別位於人CD127結構域1之位點1上的構象抗原決定部位和位於人CD127之位點2b上之構象抗原決定部位的抗體。 實施例11. 比較抗人IL-7Rα抗體作為IL-7途徑之激動劑及/或拮抗劑之能力。
西方點墨 　　將新鮮分離出之人PBMC與10μg/ml之抗人IL-7Rα mAb在37℃下一起培育30分鐘，然後單獨地或與5ng/ml之重組人IL-7(AbDSerotec)一起在37℃下培養10分鐘。在冰上停止反應後，以RIPA緩衝液(具有蛋白酶抑制劑混合物(Protease Inhibitor Cocktail))製備細胞溶胞化物。在還原條件下將蛋白質(15μg)在7.5%聚丙烯醯胺凝膠上解析並使用標準方法將其固定在硝酸纖維素膜(GeHealthcare)上。以5% BSA-Tris緩衝液鹽水清洗點墨並與在1%BSA-TBS中之磷酸-STAT 5、磷酸-PI3K p55或磷酸-ERK特異性抗體一起培育(在4℃下隔夜)，隨後與多株山羊抗-兔子經辣根過氧化物酶標記之抗體(Cell Signaling Technology)在室溫下一起培育1小時。或者，使用在1% BSA-TBS中之GAPDH抗體(Santa Cruz)將點墨染色(在4℃下隔夜)，然後在室溫下以多株山羊抗小鼠經辣根過氧化物酶標記之抗體(Jackson Immunoresearch)染色1小時。使用LAS-3000成像系統(Fujifilm)藉由化學發光來揭露膜。 RNA測序 　　將新鮮分離出之人PBMCs與10μg/ml之抗人IL-7Rα mAb一起培育(在37℃下30分鐘)，然後單獨地或與5ng/ml之重組人IL-7(AbDSerotec)一起在37℃下培養3小時。在冰上停止反應，並將細胞小丸重新懸浮於含有1%β巰基乙醇(在不含RNase/DNase之水中)之RLT緩衝液(Qiagen)中並儲存於-80℃。根據製造商之說明書(Qiagen)使用RNA迷你萃取套組萃取RNA。藉由紅外光譜法(Nanodrop)和安捷倫生物分析儀(Agilent RNA 6000 Pico 套組)評估RNA之品質和量。Smart-Seq2集合庫係由Broad Technology Lab製備，並由Broad Genomics Platform根據經過一些修飾之SmartSeq2方案進行測序。簡單地說，使用RNA-SPRI小珠純化總RNA，將polyA+mRNA逆轉錄成cDNA並使經擴增之cDNA基於轉座子片段化，該片段化係使用雙重索引，以特異於各樣品之條碼組合將每個轉化之轉錄子的每個片段條碼化。每個索引使用額外之8個週期以雙端2×25bp之規格進行測序。藉由條碼分開數據並使用具有默認設置之Tophat版本2.0.10比對。使用Cuffquant版本2.2.1，藉由Broad Technology Labs運算線定量轉錄子。簡單地說，若50%之測序片段(reads)匹配且若每個樣品至少有100,000對匹配，則透過CuffNorm處理數據。標準化使用該默認設置，包括“幾何”標準化並使用表現水準信息，如log2轉換之FPKM值(每百萬個比對之片段中的轉錄子之每千個鹼基中所包含的片段數(Fragments per kilobase of transcript per million mapped fragments))進行隨後的分析。為了鑑別差別基因，使用經驗貝氏(Bayes)統計程序以估計之均值-方差關係(limma-trend)建立線性模型係使用R.Genes之limma軟體包進行，其中Benjamini和Hochberg調整之p值＜5%且倍數變化(FC)＞1.5被認為具差別表現。在基因表現之表示方面，分別使用ade4/adegraphics和pheatmap包以R v3.3.2版進行主要成分分析(PCA)及聚類分析。使用R clusterProfiler包評估選定之基因的生物學意義。選擇富集錯誤發現率(FDR)＜5%且具有至少5個代表性基因之基因本體(GO)類別。RNA-seq數據可在GEO登錄編號GSE下存取。 結果 STAT5、PIK3和ERK信號傳導途徑 　　然後比較抗人IL-7Rα mAb(N13B2-h3VL6、MD707-13、1A11和HAL)活化或阻斷先前與IL-7R信號傳導相關之STAT5、PI3K和ERK信號傳導途徑的能力(第9和10圖)。如前文說明者(參見例如第7圖)，IL-7對人PBMC誘導有效之STAT5磷酸化而所有測試之mAb均為該STAT5磷酸化之有效抑制劑(參見第7圖)。相反地，如第9和10圖所示，本發明者發現雖然IL-7誘導多變之PI3K磷酸化且不會誘導ERK磷酸化，與根據本發明之抗體相反的，先前技藝之抗體(即，MD707-13、1A11和HAL)即使無外源IL-7存在時仍顯著誘導ERK磷酸化及較低程度之PI3K信號。這些發現顯示先前技藝之抗人IL-7Rα抗體具有部分激動劑特性，因此被認為是人IL-7R之雙重激動劑/拮抗劑mAb。相反地，根據本發明之抗體(特別是N13B2-h3VL6)對人IL-7R僅具有拮抗劑性質。 　　本發明者評估該具有激動劑/拮抗劑性質之抗體是否可遞送能夠修飾人T細胞之有效激動劑信號。使用基於RNA之次世代測序(RNA-SEQ)來分析下述群組之人PBMC的轉錄組(transcriptome)：在無外源性人IL-7之存在下培育3.5小時、與人IL-7一起培育3.5小時、與IL-7和抗體(MD707-13、1A11位點1(分別為IgG4＃1或IgG1＃2)或N13B2-hVL6位點1/2b(IgG4))一起培育3.5小時。與對照條件相比較，共有481個基因差別表現在與抗人IL-7Rα mAb一起培育之人PBMC中，而與對照條件相比較，單獨以人IL-7刺激時共有334個基因差別表現。 維恩圖(第11C圖)分析使用三種單株抗體鑑定61種常見之差別表現的基因，無任何特定之GoMiner基因本體富集。不管61個共同基因，本發明之抗體僅誘導31個顯著基因修飾，無基因本體富集。相反地，先前技藝的二種抗體誘導人PBMC轉錄組之重要轉錄修飾，位點1IgG4＃1 mAb誘導245個差別表現基因，而位點1IgG1＃2 mAb誘導237個差別表現基因。此二個位點1 mAb之間有78個差別表現基因為共通的，但以N13B2-hVL6刺激PBMC時這些基因並無差別表現。 　　IL-7識別標籤之主成分分析(PCA)顯示出由先前技藝之抗體誘導的差別表現基因與由IL-7誘導之差別表現基因大不相同。GoMiner基因本體富集表明先前技藝的二種抗體均修飾PBMC生物學功能，諸如白血球活化、增殖、移行、趨化性、細胞因子分泌和與MAPK/ERK途徑相關之發炎反應。 　　與對照條件相比較，在由IL-7誘導之差別表現的334個基因中，93個基因之差別表現具高倍數變化(＞2)且藉由熱圖分析分為3個不同簇(第11A圖)。藉由基因本體富集評估之第1下調基因簇主要涉及白血球分化和凋亡，第2高度上調基因簇與白血球黏附、分化和活化相關，而第3上調基因簇具有混合之基因本體。有趣的是，所有測試之mAb (位點1或位點1/2b二者)藉由阻止第1簇和第2簇修飾但不影響第3簇顯示出類似之效果(第11B圖)。 　　總而言之，轉錄分析確認儘管位點1和位點1/2b抗人IL-7Rα mAb分享類似之拮抗劑特性，現有技藝中描述之二種位點1 mAb誘導與T細胞活化相容之人PBMC的明顯轉錄修飾和由MAPK/ERK途徑誘導之發炎反應。 　　與現有技藝中描述之二種位點1 mAb相比較，本發明之位點1/2b抗人IL-7Rα mAb，即，N13B2-hVL6誘導較少之人PBMC的轉錄修飾。 　　缺乏較大物種之特異性和“僅具拮抗劑性質”之抗IL-7Rα mAb已阻止此作用在靈長類動物或人類中驗證。本發明者發現抗IL-7Rα mAb之激動劑/拮抗劑性質取決於該被靶向之特異性抗原決定部位，因為現有技藝之結合位點1IL-7交互作用結構域的抗體似乎同時具有激動劑/拮抗劑特性，而本發明之結合IL-7Rα/γc(位點2b)之二聚體化結構域的抗體顯示出絕對之拮抗劑活性。本發明者提出本發明之抗體可干擾受體內化和信號傳導所需之IL-7Rα/γc二聚體化。即使是在慢性抗原刺激後，針對IL-7R之“僅具拮抗劑性質”之抗體可防止靈長類動物中由長期記憶性T細胞介導之皮膚發炎，而不引起淋巴細胞減少或多株T細胞功能或代謝失調。 　　IL-7顯示出主要藉由活化JAK/STAT途徑以透過IL-7R信號傳導誘導增殖和抗凋亡信號。IL-7R信號傳導亦被認為涉及PI3K/AKT途徑，但這已在轉化之永生化細胞株或初代胸腺細胞中觀察到且這些信號在周圍初始或人類記憶性T淋巴細胞中未檢測到(Watanabe, J. Exp. Med, 1998)。數篇報告亦提出IL-7R信號傳導能在T淋巴細胞或祖B細胞亞群中擴大ERK磷酸化(Deshpande P. I. Immunol, 2013; Fleming HE and Paige CJ, Immunity, 2001)。這些途徑在成熟和人類T細胞中之IL-7R信號傳導中的作用較不清楚。使用來自經高濃度之重組人IL-7(5000 pg/ml，而在非淋巴細胞減少情況中血清中之濃度為〜5 pg/ml(Wong H-L, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008))刺激之健康自願者的新鮮分離之初代人PBMC(主要由T和B淋巴細胞、單核細胞和NK細胞組成)，本發明者確認IL-7誘導可複製之STAT5磷酸化。PI3K信號活化更加多變，且他們未觀察到任何ERK磷酸化。雖然本研究中使用之所有抗IL7Rα mAb為由IL-7誘導之pSTAT5的有效抑制劑且顯示出類似之轉錄拮抗劑性質，吾人發現現有技藝之二種位點1 mAb誘導PI3K/ERK激動劑信號及與T細胞活化和由MAPK/ERK途徑誘導之發炎反應相關的重要轉錄修飾。某些mAb的這些相反雙重激動劑/拮抗劑性質並不獨特，因為其他靶的，諸如IL-4、IL-6R、IL-15、CD28、CD38、CD40或HER2在受體內吞/內化後顯示類似之活性。 　　該位點2b與TSLPR之異二聚體化最近亦被確認且證實係為受體信號傳導做準備，如同對IL-7Rα和γ鏈已做之預測(Verstraete K., Nature Communications, 2017)。有趣的是，該預測之介於IL-7Rα/γ鏈和IL-7Rα/ TSLPR之間的異二聚體化位點重疊，暗示二個受體之間分享由異二聚體化介導之信號傳導機制。 　　吾人發現玻管內之pSTAT5抑制分析不能預測抗IL-7R抗體在體內之效力。在先前之報告中，另一抗IL7Rα mAb在實驗性自體免疫性腦炎(EAE)狨猴模型中可在玻管內和體外防止靈長類動物中由IL-7誘導之pSTAT5，但不會防止腦部發炎(Dunham J., J. Neuroimmune. Pharmacol, 2016)。 　　IL-7在小鼠中維持外周初始和記憶T淋巴細胞池已被充分描述。然而，IL-7在維持靈長類動物之外周T細胞穩態上的重要性可能因此較不顯明及/或冗餘機制可能解釋物種之間的差異。 　　這些數據顯示出抗-IL-7Rα mAb之拮抗劑性質和體內效力不僅與防止IL-7結合和pSTAT5抑制有關。這些數據顯示，亦靶向受體異二聚體化位點(位點2b)之本發明抗體“僅具拮抗劑性質”且在體內導致較高之抑制T細胞反應的效力。 　　靶向IL7R之“僅具拮抗劑性質”抗體具有調節抗原特異性記憶性T細胞存活和累積之潛力，因此可能促進防止自體免疫和發炎性疾病之長期復發。
第1圖.本文提供之抗體的胺基酸序列 　　A圖.重鏈(VH)之序列。該CDR以粗體字顯示。 　　B圖.源自N13B2之人化輕鏈(LH)的序列。該CDR以粗體字顯示。N13B2-VL3在位置48和87包含N13B2-h3之原始框架殘基(下方劃線)；N13B2-VL4-V48L和N13B2-VL5-F87Y包含對應之人化框架殘基且N13B2-VL6-V48L-F87Y同時包含二個人化框架殘基。
第2圖.產生抗體-穩定轉染 　　根據常用方法，使用市售之無血清培養基在CHO-M細胞中為每一種提及之抗體進行三個不同的產製批次，在典型之實驗中取得效價，藉由ELISA分析測量之並報告於此處。橫軸代表以天為單位之培養時間，縱軸代表所獲得之以μg/mL為單位的抗體效價。
第3圖.與CD127結合 　　根據實施例3中詳述之方法，藉由ELISA分析所指明之抗體與重組CD127之結合。橫軸代表以ng/mL為單位之抗體濃度，縱軸代表為任意單位之在450nm的光密度。
第4圖.對STAT5磷酸化之抑制作用 　　根據實施例5中詳述之方法，藉由細胞螢光測定法分析該指定抗體對STAT5磷酸化的抑制作用。A圖中報告以pSTAT5抗體染色之CD3+細胞的百分比(橫軸：以ng/mL為單位之抗體濃度)，B圖中報告CD3+細胞之pSTAT5信號的平均螢光強度(為任意單位)。
第5圖.對記憶性T細胞之效果 　　A圖：注射N13B2後狒狒中之DTH反應(紅斑曲線之曲線下面積)。 　　在投予N13B2(n=7隻狒狒)或賦形劑(n=4隻狒狒)後，根據實施例6中詳述之方法，藉由測量真皮反應來分析經接種疫苗之狒狒對結核菌素挑戰之反應中的遲發型過敏。縱軸代表為任意單位之紅斑曲線下之面積。紀錄在投予N13B2或賦形劑(在第0天投予)之前或之後的指定之時間點進行之皮內反應的數值，以天數表明在在橫軸上。“BCG之後”對應於接種新的BCG疫苗後進行之真皮反應的結果(nd=未測定)。 　　在150和180天和“後BCG”未測定賦形劑對照組(nd)。 　　B圖. 　　注射人化N13B2後狒狒中之DTH反應(紅斑曲線之曲線下面積)。 　　在投予人化之N13B2(AA892BB、32257、V915GQ、33874)或緩衝液後，根據實施例6中詳述之方法，藉由測量真皮反應來分析經接種疫苗之狒狒對結核菌素挑戰之反應中的遲發型過敏。縱軸代表為任意單位之紅斑曲線下之面積。紀錄在投予人化N13B2或緩衝液之前(“IDR1”，每隻狒狒從左邊開始的第一個長條)、投予人化N13B2或緩衝液4小時後(“IDR2”，從左邊開始的第二個長條)、投予人化N13B2或緩衝液後1、2和3個月(“IDR3-5”，從左邊開始的第3至5個長條)和4個月(“IDR6”，從左邊開始的第6個長條，僅在V915GA方面)及接種新的BCG疫苗後(“IDR7”，從左邊開始的最後一個長條)之數值。 　　C圖. 　　以結核菌素挑戰經接種BCG之狒狒並以人化N13B2治療後在該狒狒之血液PBMC上進行之IFNγ ELISPOT。 　　根據實施例6中詳述之方法，該經接種疫苗之狒狒在投予人化N13B2(AA892BB、32257、V915GQ、33874)或緩衝液後藉由IFNγ ELISPOT分析以結核菌素挑戰後之AG特異性T細胞頻率。縱軸代表100.000個細胞之標定頻率。紀錄在無抗原存在(W/o Ag，左邊長條)或結核菌素抗原之存在下(右邊長條)在下列時點執行Elispot所得之數值：投予人化N13B2或緩衝液(從每一組長條之左邊開始的第一個長條)之前、投予人化N13B2或緩衝液之後4天(“IDR2”)、投予人化N13B2或緩衝液之後1、2和3個月(“IDR3-5”)和4個月(“IDR6”，僅用於V915GA)及接種新的BCG疫苗後(從左邊開始的最後一個長條，虛線)。
第6圖.IBD患者中之IL-7、CD127和TSLP的表現 　　根據實施例7中詳述之方法測量下列樣品中之IL-7、CD127(IL-7Rα之可溶形式)和TSLP(全長)的mRNA表現量：來自健康對照個體(非IBD對照組)之組織樣品、來自對抗炎治療沒有反應(或不再反應)之患有活躍潰瘍性結腸炎(UC)之患者的健康和生病(發炎)結腸之活檢樣品及來自具有靜息疾病-即，已被治癒或在採樣期間緩解之UC患者(反應者)的樣品。縱軸代表相對螢光單位。繪製指定組中之每一樣本的數值，水平長條代表該組之平均值且該誤差條代表標準偏差。“*”表示p值＜0.05；“**”表示p值＜0.01；“****”表示p值＜0.0001。
第7圖.對CD127信號傳導途徑之抑制作用 　　藉由實施例8中詳述之西方點墨法評估各種抗人CD127抗體對信號傳導途徑活化的作用。該圖形代表來自6個不同供體之代表性結果。“無IL-7”係對應於未受IL-7刺激之樣品。“C”係對應於無抗CD127抗體存在時以IL-7刺激之對照樣品。點墨左側之水平線代表指定之分子量標記之移行。點墨右側之箭頭指示酪胺酸磷酸化之STAT5、酪胺酸199-磷酸化之PI3-k p55、磷酸化之Akt、磷酸化之ERK 1/2及作為加載參考之GAPDH的移行。
第8圖.對從UC活檢組織中釋出T細胞細胞因子之遏制作用 　　A圖.由玻管內生長之UC活檢樣品產生之IFNγ。B圖.由玻管內生長之CD活檢樣品產生之IFNγ。 　　在二個圖中，該樣品係依實施例9中之詳細描述取得和處理。每個符號代表一個與IgG(“Ctrl Ab”)或抗CD127抗體(“aIL-7Rα”)一起培養之來自患者的樣品。連接之符號為來自同一患者之成對樣品。**藉由Wilcoxon配對組試驗(Wilcoxon matched pairs test)p＜0.01。IFNγ之產生明顯受抗IL7Rα mAb抑制。CD活檢樣品可觀察到類似之結果。
第9圖.抗人IL-7Rα mAb和激動劑信號 　　依實施例11中之詳述，藉由西方點墨評估各種抗人CD127抗體對STAT5、PI3K和ERK信號傳導途徑之活化的影響。第9A圖顯示在無外源性重組人IL7之存在下，7個不同供體細胞其中之一的圖形。A圖.“培養基”對應於不具任何抗人CD127抗體之樣品。“無IL7”意指該4個樣品未經IL-7刺激。以10μg/mL之一種抗IL-7Rα mAb(N13B2-hVL6或MD707-13-G4或1A11-G1)預先處理三個樣品。 　　B圖.將pI3K和pERK之定量對GAPDH表現校正並對培養基對照條件標準化(n=7個不同供體)。縱軸代表對對照組標準化之表現。繪製在單一組別中之各樣品的數值，水平長條代表該組之平均值，誤差條代表標準偏差。
第10圖.抗人IL7-Rα mAb對IL7途徑活化之效果 　　將磷酸-STAT5信號之定量對GAPDH表現校正並對培養基對照條件標準化。以10μg/mL之一種抗-IL7-Rα mAb (N13B2-hVL6或MD707-13-G4或1A11)預先處理PBMC，然後與5ng/mL之人IL7在37℃下一起培育10分鐘。將磷酸-STAT5信號之定量對GAPDH表現校正(n=7個不同之供體)。虛線代表使用單獨之培養基而不處理的情況。繪製單一群組中之每個樣本的數值，水平長條代表該組之平均值，誤差條代表標準偏差。“*”表示指定組之間p值＜0.05。
第11圖.雙重激動劑/拮抗劑抗IL7-Rα mAb誘導轉錄修飾 　　分析與下列群組一起培育3.5小時之人PBMC(n=7)的RNA序列(1)5ng/ml之人IL7，(2)無IL7，(3,4,5)5ng/mL之人IL7和不同之抗人IL7-Rα mAb((3)：10μg/mL之N13B2-hVL6；(4)：10μg/mL之MD707-13-Ig4；(5)：10μg/mL之1A11)。 　　A圖.在IL7刺激和對照條件之間93種最差別表現之基因(偽發現率(FDR)5%，倍數變化(FD)＞2)的表現熱圖。 　　B圖.在經IL7刺激、對照和IL7及抗人IL7-Rα mAb條件下該三種IL7誘導簇之中位數分佈圖的定量。 　　C圖：在無IL-7之情況下與不同抗人IL-7Rα mAb (10μg/mL之N13B2-hVL6、10μg/mL之MD707-13-Ig4＃1或10μg/mL之1A11)一起培育3.5小時之人PBMC(n=7)的RNA序列分析之維恩圖(venn diagram)。該481個差別表現之基因(FDR 5%，FC＞1.5)的維恩圖比較抗人IL-7Rα mAb和培養基對照條件。圓圈大小與各個類別之基因數量成比例。

Claims (16)

  1. 一種特異性結合CD127(特別是人CD127)之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含： 　　-抗體輕鏈或抗體輕鏈可變結構域，該抗體輕鏈包含選自由下列所組成之群組的序列或該抗體輕鏈可變結構域係由選自由下列所組成之群組的序列組成：SEQ ID No：9；SEQ ID No：10；SEQ ID No：11；SEQ ID No：12；特別是SEQ ID No：12；及 　　-抗體重鏈可變結構域，其包含三個由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示之序列組成之CDR，特別是由SEQ ID No：7所示之序列組成的抗體重鏈可變結構域。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人化單株抗體，特別是其中該抗體輕鏈恆定結構域係源自人κ輕鏈恆定結構域，特別是其中該輕鏈恆定結構域係由SEQ ID No：27或28之序列組成，且其中該抗體重鏈恆定結構域係源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定結構域，特別是源自人IgG4重鏈恆定結構域，特別是其中該抗體重鏈恆定結構域係由SEQ ID No：26之序列組成。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈包含SEQ ID No：12或者該抗體輕鏈可變結構域係由SEQ ID No：12組成，且其中該抗體重鏈可變結構域係由SEQ ID No：7組成。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段為由IL-7誘導之IL-7R信號傳導之拮抗劑且不會誘導磷脂醯肌醇3-激酶及/或ERK信號傳導途徑活化。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段識別包含取自CD127之2b位點之序列的抗原決定部位及/或破壞CD127與細胞因子受體之γc共同鏈之結合，特別是至少識別CD127之位點2b的第三β折疊。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段不會誘導CD127內化及/或會抑制由IL7誘導之CD127內化。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段不會增加由TSLP誘導之樹突細胞成熟。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段具有長期效果及/或快速效果，特別是具有快速之局部效果。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段如藉由生物感測器分析可測定者以低於5E-9M之親和常數KD與人CD127特異性結合。
  10. 一種經分離之核酸分子的組合，該等經分離之核酸分子編碼如申請專利範圍第1至9項中任一項之抗體或其抗原結合片段，特別是第一經分離之核酸分子包含選自由下列所組成之群組的序列或由選自由下列所組成之群組的序列組成：SEQ ID NO：15、SEQ ID No：16、SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；且第二經分離之核酸分子包含或由SEQ ID NO：13之序列組成。
  11. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至9項中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如申請專利範圍第10項之經分離之核酸分子的組合和藥學載劑。
  12. 如申請專利範圍第11項之醫藥組成物，其適合用於局部投予，特別是用於局部皮下、腸內或口服投予，更特別地用於遞送至結腸。
  13. 一種套組，其包含如申請專利範圍第11或12項之醫藥組成物及適合用於局部(特別是皮下、腸內或口服)投予之遞送裝置，更特別地該裝置包含預填充之注射器或無針裝置。
  14. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之抗體或其抗原結合片段、或如申請專利範圍第10項之經分離之核酸分子的組合、或如申請專利範圍第11或12項之醫藥組成物、或如申請專利範圍第13項之套組，其係作為藥物。
  15. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之抗體或其抗原結合片段、或如申請專利範圍第10項之經分離之核酸分子的組合、或如申請專利範圍第11或12項之醫藥組成物、或如申請專利範圍第13項之套組，其於如申請專利範圍第14項係用於預防或治療器官或組織移植物排斥或選自由下列所組成之群組的疾病：自體免疫性疾病，特別是類風濕性關節炎、全身性硬化症、多發性硬化症、第I型糖尿病、自體免疫性甲狀腺炎、全身性紅斑狼瘡、原發性修格連氏症候群(primary sjögren syndrome)和發炎性疾病，特別是發炎性腸病(IBD)，更特別的是克隆氏症(Crohn's disease)和潰瘍性結腸炎、腦脊髓炎和過敏性疾病和癌症疾病及與移植和呼吸疾病相關之疾病。
  16. 一種自選自由抗體、其抗原結合片段或抗體模擬分子組成之群組選擇化合物之方法，該方法包含至少一個下列步驟或由至少一個下列步驟組成： 　　i.測試該化合物與CD127，特別是與人CD127，特別是與來自人CD127之結構域D1及/或人CD127之結構域D2之位點2b的抗原決定部位序列結合的能力； 　　ii.在該化合物之存在下測試對由IL7誘導之IL7-R信號傳導之抑制作用，特別是STAT-5磷酸化之抑制作用； 　　iii.在該化合物之存在下測試該磷脂醯肌醇3-激酶之活化； 　　iv.在該化合物之存在下測試該ERK信號傳導途徑之活化； 　　v.測試該化合物與CD127(特別是人CD127)之位點2b的至少第三β折疊結合之能力； 　　且可選擇地進一步包含至少一個下列步驟： 　　vi.在該化合物之存在下測試CD127與細胞因子受體之γc共同鏈的結合； 　　vii.在該化合物之存在下測試CD127之內化及/或由IL7誘導之CD127的內化； 　　viii.在該化合物之存在下測試由TSLP誘導之樹突細胞成熟； 　　特別是其中選擇該與CD127特異性結合之化合物為由IL-7誘導之IL-7R信號傳導的拮抗劑，其不會誘導磷脂醯肌醇3-激酶和/或ERK信號傳導途徑活化。
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