TW202330572A - 抗prame結合劑的適應症 - Google Patents

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海科 舒斯特
金斯 弗里切
奧利佛 史古兒
法蘭克 舒烏貝
莉娜 弗羅伊登曼
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Abstract

一種治療在細胞表面上呈現含有SLLQHLIGL (SEQ ID NO：310)之肽的轉移性病變的方法，包括選擇患有轉移性病變的患者及向該患者投與含有表現T細胞受體、或其功能片段之重組T淋巴球或活化T淋巴球的組成物，該T細胞受體、或其功能片段與含有SLLQHLIGL (SEQ ID NO：310)之MHC配位體反應或結合。

Description

抗PRAME結合劑的適應症
相關申請案之交叉引用 參考以符合XML 1.0格式檔案(.xml)形式提交之序列表
按照EFS網路法律框架及37 CFR §§ 1.821-825 (參見MPEP § 2442.03(a))、法規30 EPC、及§11 PatV，呈XML 1.0格式檔案形式之符合WIPO標準ST.26之電子序列表與本申請案同時提交，並且序列表之整個內容以引用方式併入本文。為避免疑義，如果本說明書中提及之序列與電子序列表之間存在差異，則應將說明書中之序列視為正確序列。
本發明係關於用於免疫治療方法中之肽、蛋白、核酸、及細胞。具體而言，本發明係關於癌症之免疫療法。本發明進一步係關於腫瘤相關T細胞肽表位，該等表位為單獨的或與其他腫瘤相關肽組合，例如可作為疫苗組成物之活性醫藥成分，刺激抗腫瘤免疫反應，或離體刺激T細胞並轉移至患者體內。與主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex；MHC)分子結合之肽或肽本身亦可以作為抗體、可溶性T細胞受體及其他結合分子之靶標。
本發明係關於衍生自人類腫瘤細胞之HLA I類分子的幾種新肽序列及其變異體，該等序列及其變異體可用於疫苗組成物中以引發抗腫瘤免疫反應或作為用於開發醫藥/免疫活性化合物及細胞之靶標。
據世界衛生組織(World Health Organization；WHO)統計，2012年，癌症為全球四大非傳染性致命疾病之一。同年，結直腸癌、乳腺癌及呼吸道癌被列入高收入國家十大死因。 癌症免疫療法
癌症之免疫療法代表了在最小化副作用的同時，特異性靶向癌細胞的選擇。癌症之免疫療法利用腫瘤相關抗原之存在。
腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen；TAA)之當前分類包括以下主要組： a) 癌-睾丸抗原：被T細胞識別的首批經鑑定TAA屬此類，最初稱為癌-睾丸(cancer-testis；CT)抗原。由於睾丸細胞不表現I類及II類HLA分子，此等抗原不能被正常組織中之T細胞識別，因此可以被視為免疫腫瘤特異性抗原。CT抗原之熟知實例為MAGE家族成員、PRAME及NY-ESO-1。 b) 分化抗原：此等TAA在腫瘤與產生腫瘤之正常組織之間共享。大多數已知分化抗原存在於黑色素瘤及正常黑色素細胞中。實例包括但不限於用於黑色素瘤之酪胺酸酶及Melan-A/MART-1或用於前列腺癌之PSA。 c) 過度表現之TAA：編碼廣泛表現之TAA的基因已在組織學不同類型之腫瘤以及許多正常組織中偵測到，通常表現位凖較低。正常組織處理及潛在呈現的許多表位可能低於T細胞識別之臨限位準，而它們在腫瘤細胞中之過度表現可藉由破壞先前建立之耐受性觸發抗癌反應。此類TAA之突出實例為Her-2/neu、存活素、端粒酶或WT1。 d) 腫瘤特異性抗原：此等獨特TAA來自正常基因(如β-連環蛋白、CDK4、BCR-ABL等)之突變。其中一些分子變化與腫瘤轉化及/或腫瘤進展有關。腫瘤特異性抗原通常能夠誘導強烈免疫反應，而不會對正常組織產生自體免疫反應。另一方面，在大多數情況下，此等TAA僅與它們被識別的確切腫瘤相關，通常不會在許多個別腫瘤之間共享。在具有腫瘤特異性(相關)亞型的蛋白質的情況下，如果肽來源於腫瘤特異性(相關)外顯子，亦可能產生肽的腫瘤特異性。 e) 致癌病毒蛋白：此等TAA為可能在致癌過程中起關鍵作用的病毒蛋白，因為它們為外來的(非人類來源)，所以它們可以引起T細胞反應。此類蛋白之實例為在宮頸癌中表現之人類乳頭瘤16型病毒蛋白E6及E7。 人類內源性逆轉錄病毒(human endogenous retrovirus；HERV)佔人類基因組的很大一部分(約8%)。此等病毒成分在數百萬年前整合至基因組中，並自彼時起在許多世代中垂直傳播。絕大多數HERV藉由突變或截短失去了功能性活性，但一些內源性逆轉錄病毒，如HERV-K分支的成員，仍然編碼功能性基因，並已被證明形成逆轉錄病毒樣顆粒。HERV前病毒之轉錄受表觀遺傳控制，在正常生理條件下保持沉默。然而，在某些疾病中，尤其在不同類型之癌症中，已經描述了導致病毒蛋白之主動轉譯的再活化及過度表現。HERV衍生蛋白的此腫瘤特異性表現可用於不同類型之癌症免疫療法。 f) 轉譯後修飾異常引起之TAA：此等TAA可能由如下蛋白產生，該等蛋白在腫瘤中既不特異亦不過度表現，但藉由主要在腫瘤中起作用的轉譯後過程而成為腫瘤相關蛋白。此類之實例來自改變的醣化模式，該等模式導致腫瘤中之新表位，如MUC1，或可能具有或可能不具有腫瘤特異性的事件，如降解過程中之蛋白剪接。
基於T細胞之免疫療法靶向由MHC分子呈遞的腫瘤相關或腫瘤特異性蛋白衍生的肽表位。由腫瘤特異性T淋巴球識別的抗原，亦即其表位，可以為源自例如酶、受體、轉錄因子等之所有蛋白質類別的分子，此等蛋白質類別在相應腫瘤之細胞中得以表現，並且與相同來源的未改變細胞相比，通常上調。
有兩類MHC分子，MHC I類及MHC II類。MHC I類分子由α(重)鏈及β-2-微球蛋白(輕鏈，β2m)組成，MHC II類分子由α鏈及β鏈組成。其三維構型形成結合槽，用於與肽之非共價相互作用。
MHC I類分子可以在大多數有核細胞上發現。它們呈遞了主要由內源性蛋白質、缺陷核糖體產物(defective ribosomal product；DRIP)及較大肽之蛋白水解裂解產生的肽。然而，來源於核內體區室或外源的肽亦經常出現在MHC I類分子上。此非經典的I類呈遞方式在文獻中被稱為交叉呈遞(Rock、Gamble、及Rothstein 1990；Brossart及Bevan 1997)。MHC II類分子主要存在於專業抗原呈遞細胞(antigen-presenting cell；APC)上，主要呈遞外源或跨膜蛋白的肽，該等蛋白例如在內吞過程中被APC攝取並隨後進行處理。
肽及MHC I類分子之複合物由攜帶適當T細胞受體(T cell receptor；TCR)的CD8陽性T細胞識別，而肽及MHC II類分子之複合物由攜帶適當TCR的CD4陽性輔助T細胞識別。眾所周知，TCR、肽及MHC因此以1:1:1的化學計量量存在。
CD4陽性輔助T細胞在誘導及維持CD8陽性細胞毒性T細胞之有效反應中發揮重要作用。來自腫瘤相關抗原(tumor associated antigen；TAA)之CD4陽性T細胞表位的鑑定對於開發用於觸發抗腫瘤免疫反應的醫藥產品具有重要意義。在腫瘤部位，T輔助細胞支援細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell；CTL)友好的細胞因子環境，並吸引效應細胞，例如CTL、自然殺傷(natural killer；NK)細胞、巨噬細胞及顆粒球。
根據不同來源，90%以上之癌症死亡由包括轉移的病變引起(Hanahan及Weinberg 2000)。到目前為止，治療此類轉移性病變之治療方案寥寥無幾。
因此，迫切需要對此等病狀進行新的有效治療。亦需要決定代表此類轉移性病變之生物標誌物的因子，從而更好地診斷此類轉移性病變、評估預後及預測治療成功。
在詳細描述本發明之前，應當理解，本發明不限於所描述裝置之特定部件或所描述方法的過程步驟，因為此等裝置及方法可以變化。亦應瞭解，本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且不意欲為限制性的。須指出，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及隨附請求項中所用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括單數個及/或複數個參考物。此外，應理解，如果給出之參數範圍由數值限定，則該等範圍視為包括此等限制值。應當進一步理解，本文揭示之實施例並不意欲被理解為彼此無關的單獨實施例。與一個實施例一起論述之特徵意欲亦結合本文所示其他實施例來揭示。如果在一種情況下，特定特徵沒有與一個實施例一起揭示，而是與另一個實施例一起揭示，則熟習此項技術者將理解，此並不一定意味著該特徵不意欲與該另一實施例一起被揭示。熟習此項技術者將理解，本申請案之要旨係亦針對另一實施例來揭示該特徵，但僅僅為了清楚起見並將本說明書保持在可控制的範圍內，未進行此舉。
此外，本文引用的先前技術文件之內容以引用方式併入。此尤其涉及揭示標準或常規方法的先前技術文件。在此情況下，以引用方式併入之目的主要係提供充分的賦能揭示內容，並避免冗長的重複。
根據本發明之第一態樣，提供包含SEQ ID NO：310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列的肽或其醫藥學上可接受之鹽，該肽用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
該語言被視為包含一些國家接受的瑞士式請求項語言(在此情況下，括號被視為不存在)及EPC2000語言(在此情況下，括號及括號內之內容被視為不存在)。
替代地或附加地，提供治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者的方法。
該方法包括以一或多個治療有效劑量，向患者投與包含SEQ ID NO：310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列的肽或其醫藥學上可接受之鹽。
替代地或附加地，提供用於治療轉移或轉移性病變之醫藥組成物，該組成物包含有包含SEQ ID NO：310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列的肽或醫藥學上可接受之鹽作為有效成分。
在一個實施例中，該治療或組成物不包括與作為前列腺特異性膜抗原(Prostate specific Membrane antigen；PSMA)之片段的肽共同投與(同時或依序)。PSMA之胺基酸序列在UniProt參考號Q04609下揭示。
具體而言，該治療不包括與PSMA 288-297(GLPSIPVHPI，SEQ ID NO：376)或PSMA 288-297I297V(GLPSIPVHPV，SEQ ID NO：377)共同投與(同時或依序)
在一個實施例中，用於治療之肽不包含超出如SEQ ID NO：1中所闡明之序列的任何N末端或C末端殘基。
在一個實施例中，轉移或轉移性病變為PRAME陽性的。如本文使用，術語「PRAME陽性之轉移或轉移性病變」係指包含表現PRAME之細胞的轉移或轉移性病變。在一個實施例中，轉移或轉移性病變在其至少一個細胞之表面上顯示肽，該肽包含SEQ ID NO: 310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列，或與主要組織相容性複合物結合之該胺基酸序列。
術語「轉移」係指原發性腫瘤中癌細胞或組織之擴散。癌症在細胞經過基因改造而快速無限增殖之後發生。細胞最終經歷化生，繼之以發育不良，然後退行發育，導致惡性表型，此通常被稱為「原發性腫瘤」。此惡性腫瘤允許侵入循環，然後侵入第二個腫瘤發生部位。
一些來自原發性腫瘤之細胞獲得穿透淋巴管或血管壁之能力，之後它們能夠經由血流而循環至身體之其他部位及組織。此過程被稱為淋巴或血源性擴散.當腫瘤細胞在另一個部位靜止後，它們重新穿透血管或血管壁並繼續增殖，最終形成另一個臨床可偵測之腫瘤。此新腫瘤被稱為轉移(metastasis)(複數：「轉移(metastases)」，此等兩個術語在本文中可以互換使用)，通常會引起轉移性病變。轉移為癌症的特徵之一，與良性腫瘤有區別。大多數癌症都會轉移，但有些則不會。例如，基底細胞癌很少轉移。
關於命名，以下規則適用： (i) 術語「轉移性乳腺癌」係指作為原發性腫瘤之乳腺癌，它將癌細胞釋放至體內，此等癌細胞可能在同一器官或組織或其他器官或組織中定居或形成轉移。 (ii) 術語「乳腺癌轉移」係指乳腺或其他器官或組織中之轉移，該轉移自作為原發性腫瘤之乳腺癌擴散而來。
該術語亦涉及所有其他腫瘤或癌症類型或轉移，例如 (i) 轉移性肺癌，(ii)肺癌轉移，及/或 (ii) 轉移性肝癌，(iii)肝癌轉移等。
因此，在診斷中，如果患者被診斷為原發性肺癌，則在身體某處發現之轉移通常被認定為肺癌轉移，或者如果患者被診斷為原發性結腸癌，則被認定為結腸癌轉移。
該術語將在整個本申請案中使用。
在一個實施例中，根據本發明之轉移或轉移性病變發生在一個或多個重要器官中。在一個實施例中，重要器官較佳為選自腦、脊髓、心臟、肺、肝、骨髓、血液、氣管、皮膚、腎臟、胰腺、及腸的至少一種。
在一個實施例中，根據本發明之轉移或轉移性病變具有1 cm或更大之直徑。在其一個實施例中，此等轉移或轉移性病變發生在重要器官中。
在一個實施例中，10或更多個轉移或轉移性病變存在於患者中，較佳11或更多個。在其一個實施例中，此等轉移或轉移性病變發生在重要器官中。
在一個實施例中，轉移或轉移性病變已經進展超過淋巴系統。
在一個實施例中，轉移或轉移性病變不受淋巴管限制。
轉移可以並且將經常獲得額外突變，並在其轉移部位獨立於其原始腫瘤進行進化。因此，自研究原發性腫瘤中獲得之資訊不一定適用於其轉移，並且轉移之獨立發展可能導致原發性腫瘤與其衍生之轉移之間的若干差異，此等差異可能影響癌症之臨床結果。
其中一些差異可能影響pHLA之呈現位凖，可能包括但不限於： (a) 抗原肽呈遞複合物之差異。 癌症進化中MHC I類抗原呈遞喪失之概述可參見(Dhatchinamoorthy、Colbert、及Rock 2021)。具體而言，轉移中之抗原處理呈遞複合物之下調已藉由TAP1 (Ling等人2017)、HLA (McGranahan等人2017；Watkins等人2020)以及b 2M (Campo等人2014)之表現降低而得到證實。 (b) 特定基因及抗原之下調 除了轉移中之MHC呈遞途徑之下調外，臨床試驗中使用之腫瘤抗原如TRPM8的表現有所降低(Fuessel等人2006)亦得以報道(Yao等人2019)
此等兩種機制——抗原處理途徑之下調及特異性抗原之下調——可能有助於第42圖所示之效果，第42圖顯示了肽KRT5-004(STASAITPSV，SEQ ID NO: 312)之呈現。
KRT5-004與親本蛋白角蛋白5(亦稱為KRT5、K5或CK5)相關，此為一種在人類中由KRT5基因編碼之蛋白質。它與角蛋白14二聚化並且形成構成基底上皮細胞之細胞骨架的中間絲(IF)。此蛋白與多種疾病有關，包括單純性大皰性表皮松解症、乳腺癌及肺癌。
當將HNSCC (頭頸部鱗狀細胞癌)原發腫瘤與HNSCC轉移進行比較時，KRT5-004之呈現完全丟失：雖然在近50%之原發HNSCC腫瘤樣品中偵測到SEQ ID NO: 312，但在所分析的轉移性HNSCC腫瘤樣品中完全不存在。
此外，當比較來自相同患者之原發性及轉移性腫瘤樣品的化療敏感性時，亦報道了對常見化療藥物之化療敏感性差異(Furukawa等人，2000)
第40圖顯示肽PRAME 004 (SLLQHLIGL，SEQ ID NO: 310)存在於選定轉移上，但不存在於健康組織上。
第43圖顯示了肽PRAME 004 (SLLQHLIGL，SEQ ID NO: 310)在選定轉移及選定原發性腫瘤上以不同方式呈現。
第45圖顯示了肽PRAME 004 (SLLQHLIGL，SEQ ID NO: 310)在原發性三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer；TNBC)及轉移性三陰性乳癌(triple-negative breast cancer；TNBC)上以不同方式呈現。
第48、49A及49B圖顯示了來自患者衍生異種移植物(patient-derived xenograft；PDX)的實驗，其中腫瘤轉移被異種移植到臨床前小鼠模型中，該等模型之腫瘤生物學儘可能接近患者 活體內情況。患者轉移之主要遺傳及組織學特性在一定時間內保持不變(在小鼠中傳代)。因此，所用PDX模型優於細胞株衍生之異種移植物(cell line-derived xenograft；CDX)，後者不具有，更不用說保留轉移之生理特性，包括免疫多肽組。
在一個實施例中，患者對於HLA-A*02呈陽性。此尤其包括單倍型HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、及HLA-A*02:11。在一個實施例中，患者對於HLA-A*02:01呈陽性。
可藉由不同方法來分析是否轉移或轉移性病變在其至少一個細胞之表面上顯示肽，該肽包含SEQ ID NO: 310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列，或與主要組織相容性複合物結合之該胺基酸。
在一個實施例中，取得腫瘤生檢或診斷上合適的另一樣品(如血液、淋巴、液體、唾液或尿液樣品，包括例如漂浮細胞、sHLA、外泌體、腫瘤衍生細胞外囊泡(extracellular vesicle；Ev)等)，並使其經受肽MHC複合物之免疫沉澱，隨後藉由質譜法分析由此獲得之多肽組。相應方法例如揭示於(Fritsche等人2018)，該文獻之內容以引用之方式併入本文中。
另一種可能性係使用對包含SEQ ID NO: 310之肽(SLLQHLIGL)的肽MHC複合物具有特異性的經標記T細胞受體或TCR模擬抗體。在一個實施例中，獲得轉移之生檢或樣品，用常規免疫方法(切片、均質化等)評級，然後與TCR模擬抗體之T細胞受體一起孵育。參見例如(Høydahl等人2019)之方法，該文獻之內容以引用之方式併入本文中。
在另一實施例中，可以例如藉由qRT-PCR或任何其他mRNA偵測技術來決定編碼產生所關注肽之親本蛋白的mRNA或編碼其特定外顯子的mRNA。此等方法為熟習此項技術者的常規方法。參見例如(Wong及Medrano 2005；Moon等人2020)，該文獻之內容以引用之方式併入本文中。
另一種可能性係將RNA-Seq技術應用於轉移。RNA-Seq (作為「RNA測序」之縮寫來命名)係一種測序技術，它使用下一代測序(next-generation sequencing；NGS)，以便藉由分析不斷變化的細胞轉錄組來揭示給定時刻生物樣品中RNA之存在及數量。具體而言，RNA-Seq有助於查找替代基因剪接轉錄物、轉錄後修飾、基因融合、突變/SNP、及基因表現隨時間的變化、或不同組或治療中基因表現之差異的能力。除了mRNA轉錄物以外，RNA-Seq可以查找不同RNA群體，包括總RNA、小RNA，如miRNA、tRNA及核糖體分析。RNA-Seq亦可用於決定外顯子/內含子邊界，並驗證或修正先前注釋的5'及3'基因邊界。RNA-Seq之最新進展包括單細胞測序、固定組織之原位測序及具有單分子即時測序的天然RNA分子測序。
相應HLA狀態可以藉由HLA血清分型及HLA單倍型分析之常規方法決定，如在(Zhang等人2014)中所揭示，該文獻之內容以引用之方式併入本文中。
A2為HLA-A血清型組內的人類白血球抗原血清型。血清型藉由HLA-A α鏈之α2域的抗體識別來決定。對於A2，α鏈藉由HLA-A*02基因來編碼並且β鏈藉由B2M基因座來編碼。
HLA-A*02係HLA-A基因座處的一個特殊I類主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex；MHC)等位基因組。A*02等位基因組可以編碼許多蛋白質；截至2013年12月，共有456種不同的HLA-A*02蛋白。血清分型可以鑑定HLA-A*02，此通常足以防止移植排斥反應(HLA鑑定之原始動機)。基因可以藉由基因測序及分析來進一步分離。HLA可以用多達九個數字僅一個字母來識別(例如HLA-A*02:101:01:02N)。HLA-A*02在全球範圍內很常見，但該等位基因之特定變異體可以亦即地理顯著性來區分。
本文中使用之術語「肽」應包括一系列胺基酸殘基之鹽，通常藉由相鄰胺基酸之α-胺基與羰基之間的肽鍵相互連接。較佳地，鹽為肽之醫藥可接受之鹽，例如氯化物或乙酸鹽(三氟乙酸鹽)。必須注意，根據本說明書之肽的鹽與在 活體內狀態下之肽有很大不同，因為肽在 活體內不是鹽。
如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示肽之衍生物，其中該肽藉由製備試劑之酸或鹼鹽而被修飾。例如，酸鹽由游離鹼(通常其中藥物之中性形式具有中性-NH2基團)製備的，涉及與合適酸之反應。用於製備酸鹽之合適酸包括有機酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等，以及無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸磷酸等。相反，可以存在於肽上之酸部分的鹼性鹽的製備使用醫藥學上可接受之鹼如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等製備的。
例如，醫藥學上可接受之鹽選自氯化物鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、溴化物鹽、丙酸鹽、乙醇酸鹽、丙酮酸鹽、草酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽，肉桂酸鹽、扁桃酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、水楊酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鈣鹽或三甲胺鹽。
SEQ ID NO: 310 (SLLQHLIGL，別名：PRAME-004)係與PRAME相關的肽，PRAME係由PRAME基因編碼的蛋白質。
PRAME (Preferentially Expressed Antigen in Melanoma；黑色素瘤中優先表現之抗原)，亦稱為Opa相互作用蛋白4、CT130及MAPE，係癌症/睾丸抗原組的一種蛋白及腫瘤抗原。PRAME之長度為509個胺基酸，質量為57890 Da。PRAME具有Entrez標識符23532及UniProt標識符P78395。
PRAME在很大比例之腫瘤以及幾種類型之白血病中以高位凖表現。PRAME係富含白胺酸重複序列(leucine-rich repeat；LRR)蛋白之PRAME家族中最好表徵之成員。哺乳動物基因組包含PRAME家族之多個成員，而在其他脊椎動物基因組中，僅鑑定出一種PRAME樣LRR蛋白。PRAME係一種癌/睾丸抗原，在正常成人組織(睾丸除外)中以極低位凖表現，但在多種癌細胞中以高位凖表現。
PRAME-004係一種9個胺基酸之肽，藉由泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin–proteasome system；UPS)降解PRAME而獲得。PRAME-004亦稱為PRA425-433，因為它包含PRAME蛋白之AA殘基425-433。PRAME-004隨後由相應細胞之細胞表面上的主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex；MHC) I類分子呈現。
發明人已經發現PRAME-004以高選擇性顯示在原發性腫瘤之MHC I類分子上(參見例如WO2018172533A2及US20180273602，該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中)。因此，發明人已經描述了PRAME-004可以用作能夠與PRAME-004結合之實體的靶標，用於治療不同原發性腫瘤。
然而，發明人驚奇地發現，PRAME-004亦由轉移及轉移性病變呈現。對於此等癌症類型，迄今為止僅有非常有限的治療選擇。
如本文所用，術語「轉移」應指癌細胞自最初形成的位置(亦即初始或原發部位)擴散至宿主身體之另一部分(亦即不同或次級部位)。在轉移性癌症中，癌細胞脫離原始(原發)腫瘤，穿過血液或淋巴系統，在身體之同一或其他器官或組織中形成新的(繼發)腫瘤。此等新形成之病理部位稱為轉移或轉移性腫瘤。新的(或繼發)轉移性腫瘤與原發性腫瘤屬同一類型的癌症。由於轉移性癌細胞與原發性癌有一些相同的特徵，因此通常藉由與原發性癌症相同的名稱來提及。例如，擴散至肺部之乳腺癌通常被稱為轉移性乳腺癌(而非肺癌)，因此被視為乳腺癌而非肺癌。
在一些轉移性癌症之病例中，無法決定癌症之起源(例如，如果無法定位原發腫瘤)。此類型之癌症被稱為未知原發癌或隱匿原發癌。
自起源位置擴散至身體另一部分的癌症被稱為轉移性癌症。癌細胞直接延伸及滲透至鄰近組織中被稱為「癌症侵襲」，此為轉移過程中之第一步(見下文)。對於許多類型之癌症，轉移性癌症亦稱為晚期癌症或IV (4)期癌症。然而，術語IV (4)期癌症及晚期癌症亦可以係指較大但尚未擴散至另一身體部位的癌症(例如，局部晚期癌症)。
癌細胞擴散至身體其他部位之過程稱為轉移。術語轉移係指致病性因子在宿主體內自初始(原發)部位擴散至不同(繼發)部位。如本文所用，術語轉移應指癌細胞或腫瘤在宿主體內自初始(原發)部位擴散至不同(繼發)部位。因此，如本文所用，轉移性癌症為與轉移相關之癌症，該癌症為來自原發部位(癌症起源位置)之癌症擴散至身體其他部位。
此外，如本文所用，術語轉移意謂在與原始原發性癌症不同及/或遠離的身體部分中發生繼發性腫瘤(Fares等人，2020)。
因此，如本文所用，轉移係腫瘤細胞在多步驟過程中自原發腫瘤擴散至繼發部位，該過程通常被描述為一系列簡單的連續事件：從原發性腫瘤逃逸和局部侵入，在循環中內滲和存活，以及外滲和轉移種植。（Riggio、Varley及Welm 2021）。
轉移可以分為兩個主要階段：癌細胞從原發性腫瘤到鄰近組織的物理播散，以及這些細胞對鄰近組織微環境的適應，這導致成功的定植，即轉移生長為肉眼可見的腫瘤，其包括轉移性病變。在一個實施方案中，術語「轉移瘤」和「轉移性病變」同義使用。
轉移是指癌細胞的積聚，其與原發性腫瘤的類型相同，但與原發性腫瘤的部位局部區域分離。這種積聚可以在相同或不同的器官或組織內，並可能導致腫瘤生長。與原發性腫瘤的分離可以例如通過以下任何侵入性或非侵入性方法或其任何組合來確認： •例如在癌症患者的外科手術或檢查過程中，通過視覺或儀器引導（例如，內窺鏡）檢查轉移形成的宏觀評估。 •從外科手術（包括活檢）中收集的組織的組織病理學評估。對於該評估，本領域技術人員（例如，受過訓練的病理學家）可能想要另外利用收集的組織的不同種類的物理或化學處理（例如，FFPE保存）、用化學試劑染色（例如，包括結合分子或遺傳標記的染料或抗體）或該人員已知的附加分析，其可能進一步促進癌細胞的鑒定以確認轉移形成。 •醫學成像技術，諸如電腦斷層掃描（CT）、磁共振斷層成像（MRI）、正電子發射斷層成像（PET）、超聲、X射線或上述的任何組合（例如PET/MRI）。 •基於生物標記的測定，諸如前列腺血清抗原（PSA）篩選或其他對臨床樣品中指示原發性和/或轉移性癌症的生物分子進行定量的測定，該等臨床樣品包括但不限於血液、尿液、糞便等。
大多數擴散癌細胞在轉移過程中之某個階段死亡。然而，如果在每一步驟中，條件對癌細胞都有利，其中一些癌細胞能夠在身體之其他部位形成新的腫瘤。轉移癌細胞亦可以在遠端部位處保持不活躍許多年，然後再開始增殖(如果增殖的話)。
癌症幾乎可以擴散至身體之任何部位，但是與其他癌症相比，幾種癌症更容易擴散至某些部位。某些器官部位(有時稱為「肥沃土壤」或「轉移生態位」)可能特別允許某些類型之癌細胞進行轉移性播種及定植，此歸因於正常組織固有或由原發性腫瘤之全身作用在遠處誘導的局部特性。癌症幹細胞可以易變地參與原發性腫瘤發生及轉移的一些或所有不同階段(Hanahan及Weinberg 2011)。
在另一個實施例中，由於復發或重現，在手術或全身治療後長時間偵測不到疾病後，轉移癌表現出來。例如，在乳腺癌的情況下，轉移復發可能在最初診斷及治療後數月至數十年發生。
因此，轉移性癌症可以重新發生，在最初診斷時出現轉移，而在偵測之前癌症已經擴散。然而，重新發生通常由復發(重現)引起，在可靠治療後，轉移表現出來(Riggio、Varley及Welm，2021)。
易發生轉移之代表性癌症可包括腎上腺皮質癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、結腸癌、腎細胞癌、前列腺癌、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、膽管癌、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、頭頸部鱗狀細胞瘤、頭頸部腺癌、直腸癌、食道癌、食管癌瘤、肝癌、肝細胞癌、口腔及喉癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、卵巢漿液性囊腺癌、肉瘤、胃腺癌、睾丸生殖細胞腫瘤、胸腺瘤、子宮癌肉瘤、子宮內膜癌及胃癌。在一些實施例中，轉移或轉移性病變可源自選自腎上腺皮質癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、卵巢漿液性囊腺癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、子宮內膜癌、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、胃腺癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、膽管癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
(Liu及Cao 2016)；其內容以引用方式全文併入本文)表明，原發性腫瘤可在繼發性器官及組織部位中為隨後轉移創造有利微環境，亦即轉移前生態位(pre-metastatic niche；PMN)。轉移前生態位可以藉由原發性腫瘤衍生因子、腫瘤動員之骨髓衍生細胞及局部基質成分之間之複雜相互作用來啟動及建立。Liu等人提出了可以定義轉移前生態位的六個特徵，此等特徵能夠使腫瘤細胞定植並促進轉移，包括(1)免疫抑制、(2)炎症、(3)血管生成/血管通透性、(4)淋巴管生成、(5)器官向性、及(6)重編程。
例如，原發性腫瘤衍生成分、腫瘤動員之骨髓衍生細胞(tumor-mobilized bone-marrow-derived cell；BMDC)及宿主之局部基質微環境(或未來轉移器官成分)可以係形成轉移前生態位之關鍵因素。已經在不同腫瘤模型中鑑定了許多有助於轉移前生態位形成之分子及細胞成分。此等生態位促進分子成分除了由腫瘤細胞分泌外，亦可以由髓細胞及基質細胞產生。它們可能與細胞成分共同作用，以便在未來轉移器官中啟動、極化及建立轉移前生態位。
器官特異性轉移之代表性原發性腫瘤決定因素可以在(Liu及Cao 2016)之表1中找到，該文獻之內容以引用方式併入。
腫瘤衍生之細胞外囊泡(extracellular vesicle；Ev)可以遠離其原始位置，作為培養轉移前生態位之潛在介質。EV可分為以下幾類：外泌體(直徑30–100 nm)、微泡(直徑100–1000 nm)及新發現的癌症衍生EV群體，稱為「大癌泡」(直徑1–10 mm)。含有蛋白質、mRNA、微小RNA、小RNA及/或DNA片段之外泌體可以藉由介導腫瘤細胞與周圍成分之間之通信或藉由水平轉移其內容物到受體細胞中來促進轉移前生態位之形成。腫瘤衍生之微泡可能介導腫瘤細胞與繼發微環境中之宿主細胞之間之交叉效應，以形成轉移前生態位。腫瘤衍生之大癌泡含有金屬蛋白酶、RNA、小窩蛋白-1及GTP酶ARF6，這表明轉移性腫瘤細胞可能藉由分泌大癌泡將遠端部位編程為轉移前生態位。
本揭示案之一些實施例可以包括抑制受試者轉移性病變之方法，包括選擇患有癌症之受試者，該癌症在細胞表面呈現由SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)組成之肽，並且相對於轉移性病變之一或多種標誌物之對照外泌體位凖，轉移性病變之一或多種標誌物之外泌體位凖增加，其中轉移性病變之標誌物為選自(Liu及Cao 2016)表1中列出之PMN促進分子中之至少一種，並以有效抑制受試者轉移性病變之量向所選受試者投與本揭示案之T細胞及/或雙特異性分子。
在一個實施例中，治療可以係經歷轉移性癌症之患者。本揭示案之治療亦可以在任何經決定之轉移之前，向轉移性病變之一或多種標誌物之外泌體位凖增加的癌症患者投與，以防止轉移。類似地，可藉由本文所述之方法來治療可能患上潛在惡性腫瘤之患者。需要治療之受試者可以藉由潛在惡性腫瘤之診斷來決定。治療組可能包括無法接受諸如手術、放療或化療之常規癌症治療的受試者。患有轉移性癌症或有癌症轉移風險之患者可能由於其他診斷、身體狀況或併發症而無法接受某些癌症治療。例如，年老或體弱之患者，諸如患有癌症惡病質之患者，可能不適合進行手術，因為有可能無法在侵入性手術中存活。免疫系統受損或慢性感染之患者可能無法接受化療，因為許多化療藥物可能會損害免疫系統。
轉移可以並且將經常獲得額外突變，並在其轉移部位獨立於其原始腫瘤進行進化。因此，自研究原發性腫瘤中獲得之資訊不一定適用於其轉移，並且轉移之獨立發展可能導致原發性腫瘤與其衍生之轉移之間的若干差異，此等差異可能影響癌症之臨床結果。
其中一些差異可能影響pHLA之呈現位凖，可能包括但不限於： (c) 抗原肽呈遞複合物之差異。 癌症進化中MHC I類抗原呈遞喪失之概述可參見(Dhatchinamorthy、Colbert及Rock，2021)。具體而言，轉移中之抗原處理呈遞複合物之下調已藉由TAP1 (Ling等人2017)、HLA (McGranahan等人2017；Watkins等人2020)以及β 2M (Campo等人2014)之表現降低而得到證實。 (d) 特定基因及抗原之下調 除了轉移中之MHC呈遞途徑之下調外，臨床試驗中使用之腫瘤抗原如TRPM8的表現有所降低(Fuessel等人2006)亦得以報道(Yao等人2019)。
此等兩種機制——抗原處理途徑之下調及特異性抗原之下調——可能有助於第42圖所示之效果，第42圖顯示了肽KRT5-004(STASAITPSV，SEQ ID NO: 312)之呈現。
KRT5-004與親本蛋白角蛋白5(亦稱為KRT5、K5或CK5)相關，此為一種在人類中由KRT5基因編碼之蛋白質。它與角蛋白14二聚化並且形成構成基底上皮細胞之細胞骨架之中間絲(intermediate filament；IF)。此蛋白與多種疾病有關，包括單純性大皰性表皮松解症、乳腺癌及肺癌。
當將HNSCC (Head and neck squamous cell carcinoma；頭頸部鱗狀細胞癌)原發腫瘤與HNSCC轉移進行比較時，KRT5-004之呈現完全丟失：雖然在近50%之原發HNSCC腫瘤樣品中偵測到SEQ ID NO: 312，但在所分析的轉移性HNSCC腫瘤樣品中完全不存在。
此外，當比較來自相同患者之原發性及轉移性腫瘤樣品的化療敏感性時，亦報道了對常見化療藥物之化療敏感性差異(Furukawa等人，2000)。
熟習此項技術者可以使用不同常規方法來決定細胞、轉移或轉移性病變是否為PRAME陽性。基於Entrez標識符23532及UniProt標識符P78395，熟習此項技術者可以使用免疫組織化學方法(如ELISA、RIA等)，其中使用結合至合適組織樣品中之PRAME蛋白的抗體或結合劑。作為替代，熟習此項技術者可以藉由RT-PCR或其他常規方法偵測PRAME mRNA之存在或不存在。
在本發明之較佳實施例中，術語轉移或轉移性病變不包括原發性腫瘤。
根據本發明之一個實施例，該肽具有與MHC l類或II類分子結合之能力，及/或該肽在與該MHC結合時能夠被CD4或CD8 T細胞識別。
肽及MHC I類複合物被攜帶適當T細胞受體(T cell receptor；TCR)之CD8陽性T細胞識別。
根據本發明之一個實施例，醫藥學上可接受之鹽為氯化物鹽或乙酸鹽。
根據進一步實施例，肽亦可以具有9至30個胺基酸之總長度。較佳地，其具有9至12個胺基酸。在一個實施例中，該肽在SEQ ID NO:310之C及/或N末端包含1至4個額外胺基酸。詳見表1： 表1：本發明肽之伸長組合
C末端 N末端
4 0
3 0或1
2 0或1或2
1 0或1或2或3
0 0或1或2或3或4
N末端 C末端
4 0
3 0或1
2 0或1或2
1 0或1或2或3
0 0或1或2或3或4
在一個實施例中，該肽具有根據相應SEQ ID NO:310之長度。在一個實施例中，該肽由根據SEQ ID NO:310之胺基酸序列組成或基本上由其組成。
根據本發明之另一態樣，提供了抗體或其功能片段。抗體或功能片段特異性地識別或結合至根據以上描述之肽，或結合至與MHC分子結合的根據以上描述之肽。
提供抗體或功能片段用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
替代地或附加地，提供了一種治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者的方法。
該方法包括以一種或多種治療有效劑量向患者投與抗體或其功能片段，該抗體或功能片段特異性地識別或結合至根據以上描述之肽，或結合至與MHC分子結合的根據以上描述之肽。
替代地或附加地，提供了一種用於治療轉移或轉移性病變之醫藥組成物，該組成物包含作為有效成分的抗體或其功能片段，該抗體或功能片段特異性地識別或結合至根據以上描述之肽，或結合至與MHC分子結合的根據以上描述之肽。
在一個實施例中，該治療或組成物不包括與結合作為前列腺特異性膜抗原(Prostate specific Membrane antigen；PSMA)之片段的肽的抗體或其功能片段共同投與(同時或依序)。
具體而言，該治療不包括與結合至PSMA 288-297(GLPSIPVHPI, SEQ ID NO: 376)或PSMA 288-297I297V (GLPSIPVHPV，SEQ ID NO: 377)的抗體或其功能片段共同投與(同時或依序)。
如本文所用，術語「抗體」應指具有均質抗體群之抗體組成物，亦即，由完整免疫球蛋白或其保留靶結合能力之片段或衍生物組成之均質群。特別較佳地，此抗體選自IgG、IgD、IgE、IgA及/或IgM，或其保留靶結合能力之片段或衍生物。
如本文所用，術語「功能性片段」應指保留靶結合能力之抗體片段，例如 • CDR(互補決定區) • 高變區， • 可變域(Fv) • IgG或IgM重鏈(由VH、CH1、鉸鏈、CH2及CH3區組成) • IgG或IgM輕鏈(由VL及CL區組成)，及/或 • Fab及/或F(ab) 2。
如本文所用，術語「衍生物」應指在結構上不同於普通抗體概念(例如scFv、Fab及/或F(ab) 2以及雙特異性、三特異性或更高特異性之抗體構建體)但仍具有某種結構關係，並進一步保持靶結合能力的蛋白質構建體。所有此等項目之解釋如下。
熟習此項技術者已知之其他抗體衍生物為雙特異抗體、駱駝科抗體、奈米抗體、域抗體、具有由scFv組成之兩條鏈之二價同源二聚體、IgA (由J鏈及分泌成分連接之兩個IgG結構)、鯊魚抗體、由新世界靈長類框架加上非新世界靈長類CDR組成之抗體、包含CH3+VL+VH之二聚體構建體、及抗體偶聯物(例如與毒素、細胞因子、放射性同位素或標誌物連接之抗體或片段或衍生物)。此等類型在文獻中經很好地描述，並且熟習此項技術者可以在本揭示案之基礎上使用，而不增加進一步創造性。
雜交瘤細胞之生產方法揭示於(Köhler及Milstein 1975)。
生產及/或選擇嵌合或人源化mAb之方法為此項技術已知的。例如，Genentech之US6331415描述了嵌合抗體之產生，而Medical Research Council之US6548640描述了CDR移植技術，Celltech之US5859205描述了人源化抗體之產生。
生產及/或選擇完全人類mAb之方法為此項技術已知的。此等可以涉及使用以相應蛋白質或肽來免疫接種之轉殖基因動物，或使用合適展示技術，如酵母展示、噬菌體展示、B細胞展示或核糖體展示，其中來自文庫之抗體在固定相中針對人類iRhom2進行篩選。
在MorphoSys之US6300064及MRC/Scripps/Stratagene之US6248516中揭示了 活體外抗體庫。噬菌體展示技術例如由Dyax在US5223409中揭示。轉殖基因哺乳動物平台例如描述於TaconicArtemis之EP1480515A2中。
IgG、IgM、scFv、Fab及/或F(ab) 2係熟習此項技術者熟知之抗體形式。相關賦能技術可自相應教科書中獲得。
如本文所用，術語「Fab」係指包含抗原結合區之IgG/IgM片段，該片段由抗體之每條重鏈及輕鏈之一個恆定域及一個可變域組成。
如本文所用，術語「F(ab) 2」係指由兩個藉由二硫鍵相互連接之Fab片段組成的IgG/IgM片段。
如本文所用，術語「scFv」係指單鏈可變片段，該片段係免疫球蛋白重鏈及輕鏈之可變區之融合，該等可變區藉由通常絲胺酸(S)或甘胺酸(G)之短連接子連接在一起。此嵌合分子保留了原始免疫球蛋白之特異性，儘管去除了恆定區並引入了連接肽。
修飾之抗體形式係例如雙特異性或三特異性抗體構建體、基於抗體之融合蛋白、免疫偶聯物等。此等類型在文獻中經很好地描述，並且熟習此項技術者可以在本揭示案之基礎上使用，增加了進一步創造性。
能夠結合與MHC結合之肽的抗體有時被稱為「TCR模擬抗體」或「TCR樣抗體」。通常，此等抗體可以用上述方法產生。例如，如何產生TCR樣抗體之方法揭示於(He等人2019)，該文獻之內容以引用方式全文併入本文。
與源自PRAME之HLA限制性肽結合的TCR模擬抗體例如揭示於(Chang等人，2017)，該文獻之內容以引用方式全文併入本文。另請參閱US 2018/0148503 (對於PRAME肽具有特異性之T細胞受體樣抗體)(Eureka Therapeutics Inc)，該文獻之內容以引用方式全文併入本文。
在一個實施例中，轉移或轉移性病變為PRAME陽性的。在一個實施例中，轉移或轉移性病變在其至少一個細胞之表面上顯示肽，該肽包含SEQ ID NO: 310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列，或與主要組織相容性複合物結合之該胺基酸。
在一個實施例中，患者對於HLA-A*02呈陽性。此尤其包括單倍型HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、及HLA-A*02:11。在一個實施例中，患者對於HLA-A*02:01呈陽性。
根據本發明之另一態樣，提供了一種T細胞受體或其功能片段，其與MHC配位體反應或結合，其中該配位體係根據以上描述之肽，或結合至MHC分子的根據以上描述之肽。提供T細胞受體用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
替代地或附加地，提供了一種治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者的方法。
該方法包括以一種或多種治療有效劑量向患者投與與MHC配位體反應或結合之T細胞受體或其功能片段，其中該配位體係根據以上描述之肽，或結合至MHC分子的根據以上描述之肽。
替代地或附加地，提供了一種用於治療轉移或轉移性病變之醫藥組成物，該組成物包含與MHC配位體反應或結合之T細胞受體或其功能片段作為有效成分，其中該配位體係根據以上描述之肽，或結合至MHC分子的根據以上描述之肽。
在一個實施例中，該治療不包括與結合作為前列腺特異性膜抗原(Prostate specific Membrane antigen；PSMA)之片段的肽的T細胞受體或其功能片段共同投與(同時或依序)，該肽結合至MHC分子。
具體而言，該治療不包括與結合至PSMA 288-297(GLPSIPVHPI, SEQ ID NO: 376)或PSMA 288-297I297V (GLPSIPVHPV，SEQ ID NO: 377)的T細胞受體或其功能片段共同投與(同時或依序)，該肽結合至MHC分子。
在一個實施例中，轉移或轉移性病變為PRAME陽性的。在一個實施例中，轉移或轉移性病變在其至少一個細胞之表面上顯示肽，該肽包含SEQ ID NO: 310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列，或與主要組織相容性複合物結合之該胺基酸。
在一個實施例中，患者對於HLA-A*02呈陽性。此尤其包括單倍型HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、及HLA-A*02:11。在一個實施例中，患者對於HLA-A*02:01呈陽性。
根據一個實施例，T細胞受體作為可溶性分子提供。
如本文所用，可溶性T細胞受體係指天然TCR之異二聚體截短變異體，該等變異體包括例如藉由二硫鍵連接的TCR α鏈及β鏈之胞外部分，但缺乏天然蛋白之跨膜及胞質結構域。術語「可溶性T細胞受體α鏈序列及可溶性T細胞接收器β鏈序列」係指缺乏跨膜及胞質結構域之TCR α鏈及β鏈序列。可溶性TCR α鏈及β鏈之序列(胺基酸或核酸)可以與天然TCR中之相應序列相同，或者與相應天然TCR序列相比，可以包括變異可溶性TCR α鏈及β鏈序列。本文使用之術語「可溶性T細胞受體」包括具有變異或非變異可溶性TCR α鏈及β鏈序列之可溶性TCR。此等變異可能在可溶性TCR α鏈及β鏈序列之可變或恆定區域，並且可以包括但不限於胺基酸缺失、插入、替換突變以及核酸序列之變化，此等變化不會改變胺基酸序列。本發明之可溶性TCR在任何情況下都保持其親本分子之結合功能性。 PRAME-004特異性TCR
肽及MHC I類分子之複合物被攜帶適當T細胞受體(T cell receptor；TCR)之CD8陽性T細胞識別，而肽及MHC II類分子之複合物被攜帶適當TCR之CD4陽性輔助T細胞識別。因此，確認TCR、肽及MHC之化學計量比為1:1:1。
此相互作用係高度特異性的。例如，在MHC I類依賴性免疫反應中，肽不僅必須能夠與腫瘤細胞表現之某些MHC I類分子結合，而且亦必須被攜帶特異性T細胞受體(T cell receptor；TCR)之T細胞識別。通常，當藉由根據本發明之該等特異性TCR(例如，可溶性TCR)及抗體來靶向肽-MHC複合物時，呈遞係成功應答之決定因素。
本發明進一步涉及T細胞受體(T cell receptor；TCR)，尤其工程化至自體或同種異體T細胞中之可溶性TCR (sTCR)及選殖TCR，以及製備此等TCR之方法，以及NK細胞或攜帶該TCR或與該等TCR交叉反應之其他細胞。
在結構上，此等T細胞受體(T cell receptor；TCR)之亞組包括α鏈及β鏈(「α/β TCR」)。當由MHC分子呈遞時，此等TCR特異性結合至根據本發明之肽，例如SLLQHLIGL (PRAME-004) (SEQ ID NO:310)。本說明書亦涉及當由HLA分子呈遞時仍能夠特異性結合至根據本發明之肽抗原例如PRAME-004 (SEQ ID NO:310)的根據本發明之此類TCR之片段。此涉及可溶性TCR片段，例如缺失跨膜部分及/或恆定區之TCR、單鏈TCR及其與例如免疫球蛋白(immunoglobulin；Ig)之融合。例如，本揭示案之TCR及其片段可以包括U.S. 20180273602、U.S. 10800832、及U.S. 20200123221中揭示之TCR，該等文獻之內容以引用方式併入本文中。
α/β TCR之α鏈及β鏈以及γ/δ TCR之γ鏈及δ鏈在結構上有兩個「域」，亦即可變域及恆定域。可變域由並置的可變區域(variable region；V)及連接區域(joining region；J)組成。可變域亦可以包括前導區域(leader region；L)。β鏈及δ鏈亦可以包括多樣性區域(diversity region；D)。α及β恆定結構域亦可以包括將α及β鏈錨定至細胞膜的C端跨膜(transmembrane；TM)結構域。
大多數可用TCR結構係αβ TCR，該等TCR由TCRα及TCRβ鏈組成。少量TCR為γδ TCR，由TCRγ及TCRδ鏈組成。TCRβ及TCRδ鏈被認為類似於抗體重鏈，而TCRα及TCRγ鏈被認為與抗體輕鏈類似(Rudolph、Stanfield及Wilson 2006)。
如上所述，每個TCR鏈之特徵在於兩個免疫球蛋白結構域：可變結構域(variable domain；V)及恆定結構域(constant；C)。可變結構域及恆定結構域都具有保守β夾層結構，從而可以對不同TCR可變結構域進行編號及比較(Dunbar及Deane 2016)。IMGT編號已用於TCR之結構分析(Glanville等人，2017；Dunbar等人，2014)。在每個可變域上，有三個具有最高序列及結構變異程度之高變環，稱為互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)。側接CDR的TCR結構之其餘部分統稱為TCR「框架」。
CDR可以包括給定序列之一個或多個「變化」，如取代、添加或缺失，限制條件為TCR保留結合肽:MHC複合物之能力。該變化可能涉及胺基酸對類似胺基酸之取代，例如保守取代。類似胺基酸係分組在一起時，側鏈部分具有相關性質的胺基酸，例如，(i)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸、組胺酸，(ii)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸，(iii)不帶電極性側鏈：門冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸，以及(iv)非極性側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸及半胱胺酸。
除了TCR之可變部分外，TCR結構高度保守，因此只有非常小的一部分鏈產生了TCR譜系之實際特異性。如上所述，TCR係藉由種系TCR基因座之基因組重排產生的，此過程被稱為V(D)J重組，有可能產生TCR之顯著多樣性(估計在10 15至10 61個可能受體範圍內)。
儘管存在此潛在多樣性，識別相同pMHC表位之T細胞的TCR通常具有保守序列特徵。分析表明，每一個表位特異性譜系都包含一組群集的受體，該等受體共有核心序列相似性，以及一組分散的不同「離群」序列。藉由識別核心序列中之共有模體，可以突出驅動TCR識別之基本元件的關鍵保守殘基(Glanville等人，2017；Dash等人，2017)，兩種文獻特定地以引用方式併入)。此等分析提供了對表位特異性譜系及適應性免疫識別之可概括、潛在特徵的洞見。
完全關注於CDR3中之高概率接觸位點的序列分析似乎提供了一種藉由共有特異性對TCR進行聚類之方法，因為此等可能接觸大多位於CDR3中，並且只有短的、通常線性胺基酸鏈段與抗原肽殘基接觸(IMGT位置107–116)，而CDR3之莖位置(IMGT位置104、105、106、117及118)從未在抗原之5 Å內(Glanville等人，2017)。儘管總是至少有一個CDR3β接觸，但是在多種情況下，沒有CDR3α接觸，此表明前者係必需的，儘管通常兩者都涉及。因此，目前TCR譜系分析之公認特徵包括CDR3區域之長度、電荷及疏水性、株系多樣性(在個體內)及胺基酸序列共享(在個體間)。例如，使用GLIPH演算法可以將TCR序列組織成個體內或個體組內具有共享特異性之不同組。
因此，特異性T細胞受體之估計數量以及相關可變區之胺基酸序列之譜系相當少，並且即使僅一個抗原決定受體序列之可用性亦可以使熟習此項技術者容易地建置及搜索共有相同特異性之其他相關T細胞受體。由於製備TCR之一般方法係已知的，並且肽-MHC與受體之間的特定相互作用已被廣泛研究，即使關於肽-MHC複合物之知識亦為熟習此項技術者提供足夠資訊，以完全能夠為本發明之T細胞受體(或其所描述之特定片段)產生本文所描述之可變區之特定子集，而不會例如由於缺乏關於受體相關位置的特定說明而承受不適當負擔。
在一個態樣，為了獲得表現本發明TCR之T細胞，將編碼本發明TCR-α及/或TCR-β鏈之核酸選殖到表現載體中，如γ-逆轉錄病毒、慢病毒或非病毒載體，如轉座子、奈米質體及CRISPR。產生重組病毒或載體，然後測試其功能，如抗原特異性及功能親和力。然後將最終產物之等分試樣用於轉導靶T細胞群(通常自患者PBMC中純化)，在輸注到患者體內之前將其擴增。
在另一態樣，為了獲得表現本發明TCR之T細胞，藉由此項技術已知之技術(例如 活體外轉錄系統)合成TCR RNA。然後將 活體外合成之TCR RNA導入藉由電穿孔自健康供體獲得之原代CD8+T細胞中，以重新表現腫瘤特異性TCR-α及/或TCR-β鏈。
在一個實施例中，與未突變之TCR相比，在α鏈中具有至少一個突變及/或在β鏈中具有一個突變的本發明之TCR具有修飾之醣化。
本說明書之α/β異二聚體TCR可以在其恆定結構域之間引入二硫鍵。此類型之較佳TCR包括具有TRAC恆定域序列及TRBC1或TRBC2恆定域序列之TCR，除了TRAC之Thr 48及TRBC1或TRBC2之Ser 57被半胱胺酸殘基取代，該等半胱胺酸在TCR之TRAC恆定域序列及TRBC1或TRBC2恆定域序列之間形成二硫鍵。
在具有或不具有以上提及之鏈間鍵的情況下，α/β異二聚體TCR可以具有TRAC恆定域序列與TRBC1或TRBC2恆定域序列，並且TCR之TRAC恆定域序列及TRBC1或TRBC2恆定域序列可以藉由TRAC外顯子2之Cys4與TRBC1或TRBC2外顯子2之Cys2之間的天然二硫鍵連接。
因此，在一個附加或替代實施例中，本發明之抗原識別構建體以SEQ ID NO:12-128中提供之組合包含CDR1、CDR2、CDR2bis及CDR3序列，該等序列與CDR3序列一起顯示相應可變鏈等位基因。因此，包含至少一個，較佳全部四個CDR序列CDR1、CDR2、CDR2bis及CDR3的本發明之抗原識別構建體為較佳的。較佳地，本發明之抗原識別構建體包含一個個別本文揭示之本發明TCR可變區的相應CDR1、CDR2bis及CDR3 (參見SEQ ID NO:12-128及實例部分)。
在一個實施例中，TCR α可變結構域相對於SEQ ID NO:12-128中所示之TCR α結構域具有至少一個突變，且/或TCR β可變結構域相對於SEQ ID NO:12-228中所示之TCR β結構域具有至少一個變異。在一個實施例中，包含TCR α可變結構域及/或TCR β可變結構域中至少一個突變之TCR對TAA肽-HLA分子複合物具有結合親和力及/或結合半衰期，該結合親和力及/或結合半衰期係包含未突變TCR α結構域及或未突變TCR β可變結構域之TCR的至少兩倍。
本發明之抗原識別構建體可包含TCR α或γ鏈，及/或TCR β或δ鏈，其中TCR α或γ鏈包含具有選自SEQ ID No：14、26、38、50、62、74、86、及110之胺基酸序列之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、或至少五個胺基酸取代的CDR3及/或其中TCR β或δ鏈包含具有選自SEQ ID No：20、32、44、56、68、80、92、及116之胺基酸序列之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、或至少五個胺基酸取代的CDR3。
最佳地，在一些另外實施例中，其中本揭示案涉及包含本文揭示之TCR鏈之CDR1、CDR2、CDR2bis及CDR3區域中之任一個、兩個、三個或全部的抗原識別構建體(參見表1)，包含具有不超過三個、兩個，並且較佳僅一個修飾胺基酸殘基的本發明相應CDR序列的此等抗原識別構建體可為較佳的。修飾胺基酸殘基可以選自胺基酸插入、缺失或取代。最佳地，三個、兩個、較佳僅一個修飾胺基酸殘基係相應CDR序列之第一個或最後一個胺基酸殘基。如果該修飾係取代，則在一些實施例中該取代係保守胺基酸取代為較佳的。
此保守取代可以係例如其中一個胺基酸被具有相似結構及特徵之胺基酸取代，例如疏水性胺基酸被另一個疏水性胺基酸取代。更保守做法係替換相同或相似大小及化學性質之胺基酸，例如用異白胺酸取代白胺酸。在對天然同源蛋白質家族序列變異之研究中，某些胺基酸取代比其他胺基酸取代更容易耐受，此等取代通常證明與原始胺基酸及其置換之間在大小、電荷、極性及疏水性方面之相似性相關，此為定義「保守置換」之基礎。
保守取代在本文中定義為以下五組之一內的交換：第1組-小的脂族、非極性或輕微極性殘基(Ala、Ser、Thr、Pro、Gly)，第2組-極性、帶負電荷殘基及其醯胺(Asp、Asn、Glu、Gln)，第3組-極性、帶正電荷殘(His、Arg、Lys)，及第5組-大的芳族殘基(Phe、Tyr、Trp)。
較不保守的取代可能涉及將一個胺基酸替換為另一個具有相似特徵但大小略有不同之胺基酸，例如將丙胺酸替換為異白胺酸殘基。高度非保守之替換可能涉及用酸性胺基酸替換極性胺基酸，甚至替換鹼性胺基酸。然而，此等「自由基」取代不能被視為潛在無效，因為化學效應不是完全可以預測的，自由基取代很可能會產生根據簡單化學原理無法預測的意外效應。
如果發現多於一個位置之取代導致本發明之抗原識別構建體具有基本上相等或更大抗原結合活性，則將測試此等取代之組合以決定組合取代是否對抗原結合活性產生加性或協同效應。例如，本發明之抗原識別構建體之CR3區域內不超過四個位置、不超過三個位置、不超過兩個位置或不超過一個位置將被同時取代。
若本發明之抗原識別構建體由至少兩個胺基酸鏈組成，諸如雙鏈TCR、或其抗原結合片段，則抗原識別構建體可在第一多肽鏈中包含根據SEQ ID NO：14之胺基酸序列，並且在第二多肽鏈中根據SEQ ID NO：20之胺基酸序列，或在第一多肽鏈中根據SEQ ID NO：26之胺基酸序列，並且在第二多肽鏈中根據SEQ ID NO：32之胺基酸序列，或在第一多肽鏈中根據SEQ ID NO：38之胺基酸序列，並且在第二多肽鏈中根據SEQ ID NO：44之胺基酸序列，或在第一多肽鏈中根據SEQ ID NO：50之胺基酸序列，並且在第二多肽鏈中根據SEQ ID NO：56之胺基酸序列，或在第一多肽鏈中根據SEQ ID NO：62之胺基酸序列，並且在第二多肽鏈中根據SEQ ID NO：68之胺基酸序列，或在第一多肽鏈中根據SEQ ID NO：74之胺基酸序列，並且在第二多肽鏈中根據SEQ ID NO：80之胺基酸序列，或在第一多肽鏈中根據SEQ ID NO：86之胺基酸序列，並且在第二多肽鏈中根據SEQ ID NO：92之胺基酸序列，或在第一多肽鏈中根據SEQ ID NO：110之胺基酸序列，並且在第二多肽鏈中根據SEQ ID NO：116之胺基酸序列。
上述雙鏈TCR中之任一種或其抗原結合片段係本發明之較佳TCR。在一些實施例中，本發明之雙鏈TCR之CDR3可以突變。上述CDR3序列之突變較佳包括不超過三個、較佳兩個、最佳不超過一個胺基酸殘基之取代、缺失、添加或插入。在一些實施例中，第一多肽鏈可以係TCR α或γ鏈，而第二多肽鏈可以係TCR β或δ鏈。較佳為αβ或γδ TCR之組合。
在一些實施例中，TCR或其抗原結合片段由TCR α及TCR β鏈或γ及δ鏈組成。此雙鏈TCR在每個鏈內包含可變區，並且可變區各自包含一個CDR1、一個CDR2，或者更佳一個CDR2bis及一個CD3序列。TCR包含如SEQ ID No：15及21，或27及33，或39及45，或51及57，或63及69，或75及81，或87及93，或111及117之可變鏈胺基酸序列中所包含之CDR1、CDR2、CDR2bis、及CDR3序列。
本發明之一些實施例涉及由TCR α及TCR β鏈組成的TCR、或其片段，其中該TCR包含與選自根據SEQ ID No：15及21，或27及33，或39及45，或51及57，或63及69，或75及81，或87及93，或111及117之α及β鏈的胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或較佳100%序列一致性的可變區序列。
在一個特別較佳實施例中，本發明提供了由TCR α及TCR β鏈組成的經改良之TCR，命名為R11P3D3_KE，其中該TCR包括與選自根據SEQ ID NO:113及119之α及β鏈之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或較佳100%序列一致性的可變區序列。與本文中稱為R11P3D3之親本受體相比，該TCR在腫瘤細胞識別方面顯示出令人驚訝地經改良之功能性。
本發明之TCR進一步可以包括衍生自任何合適物種之恆定區，例如任何哺乳動物，例如人類、大鼠、猴、兔、驢或小鼠。在本發明之一個實施例中，本發明之TCR進一步包括人類恆定區。在一些較佳實施例中，本發明之TCR之恆定區可以稍微修飾，例如藉由引入增加TCR之表現及穩定性的異源序列，較佳小鼠序列。在一些較佳實施例中，本發明之TCR之可變區可以稍微修飾，例如藉由引入單點突變來優化TCR穩定性及/或增強TCR鏈配對。
本發明之一些實施例涉及由TCR α及TCR β鏈組成的TCR、或其片段，其中該TCR包含與選自根據SEQ ID No：16及22，或28及34，或40及46，或52及58，或64及70，或76及82，或88及94，或112及118之α及β鏈的胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或較佳100%序列一致性的恆定區。
本發明之TCR α或γ鏈可進一步包含具有選自SEQ ID No：12、24、36、48、60、72、84及108之胺基酸序列之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、或至少五個胺基酸取代的CDR1，及/或具有選自SEQ ID No：13、25、37、49、61、73、85、及109之胺基酸序列之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、或至少五個胺基酸取代的CDR2，及/或更佳具有選自SEQ ID No：120、121、122、123、124、125、126、及128之胺基酸序列之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、或至少五個胺基酸取代的CDR2bis。
根據本發明，TCR β或δ鏈可進一步包含具有選自SEQ ID No：18、30、42、54、66、78、90、及114之胺基酸序列之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、或至少五個胺基酸取代的CDR1，及/或具有選自SEQ ID No：19、31、43、55、67、79、91、及115之胺基酸序列之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、或至少五個胺基酸取代的CDR2，及/或更佳具有選自SEQ ID No：19、31、43、55、67、79、91、及115之胺基酸序列之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、或至少五個胺基酸取代的CDR2bis。
在另一個實施例中，抗原識別構建體可包含TCR之結合片段，並且其中該結合片段在一個鏈中包含視情況選自具有SEQ ID No：12、13、14、120、11、18、19、20、或24、25、26、121、或30、31、32、或36、37、38、122、或42、43、44、或48、49、50、123、或54、55、56、或60、61、62、124、或66、67、68、或72、73、74、125、或78、79、80、或84、85、86、126、或90、91、92、或108、109、110、128、或114、115、116之胺基酸序列之CDR1、CDR2、CDR2bis及CDR3序列的CDR1、CDR2、CDR2bis及CDR3。
在本發明之進一步實施例中，如本文在別處描述之抗原識別構建體為由至少一個TCR α及一個TCR β鏈序列組成的TCR、或其片段，其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：12至14及120之胺基酸序列的CDR1、CDR2、CDR2bis、及CDR3序列，並且該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：18至20之胺基酸序列的CDR1至CDR3序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：24至26及121之胺基酸序列的CDR1、CDR2、CDR2bis、及CDR3序列，並且該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：30至32之胺基酸序列的CDR1至CDR3序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：36至38及122之胺基酸序列的CDR1、CDR2、CDR2bis、及CDR3序列並且該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：42至44之胺基酸序列的CDR1至CDR3序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：48至50及123之胺基酸序列的CDR1、CDR2、CDR2bis、及CDR3序列，並且該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：54至56之胺基酸序列的CDR1至CDR3序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：60至62及124之胺基酸序列的CDR1、CDR2、CDR2bis、及CDR3序列，並且該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：66至68之胺基酸序列的CDR1至CDR3序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：72至74及125之胺基酸序列的CDR1、CDR2、CDR2bis、及CDR3序列，並且該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：78至80之胺基酸序列的CDR1至CDR3序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：84至86及126之胺基酸序列的CDR1、CDR2、CDR2bis、及CDR3序列，並且該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：90至92之胺基酸序列的CDR1至CDR3序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：108至110及128之胺基酸序列的CDR1、CDR2、CDR2bis、及CDR3序列，並且該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：114至116之胺基酸序列的CDR1至CDR3序列。
在本發明之進一步實施例中，如本文之前描述之抗原識別構建體為包括至少一個TCR α及一個TCR β鏈序列的TCR、或其片段，其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的可變區序列，並且其中該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列的可變區序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的可變區序列，並且其中該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID NO：33之胺基酸序列的可變區序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的可變區序列，並且其中該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的可變區序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID NO：51之胺基酸序列的可變區序列，並且其中該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID NO：57之胺基酸序列的可變區序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID NO：63之胺基酸序列的可變區序列，並且其中該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的可變區序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID NO：75之胺基酸序列的可變區序列，並且其中該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID NO：81之胺基酸序列的可變區序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID NO：87之胺基酸序列的可變區序列，並且其中該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID NO：93之胺基酸序列的可變區序列，或其中該TCR α鏈序列包含具有SEQ ID NO：111之胺基酸序列的可變區序列，並且其中該TCR β鏈序列包含具有SEQ ID NO：117之胺基酸序列的可變區序列。
在本發明之進一步實施例中，如本文之前描述的抗原識別構建體為進一步包括TCR恆定區的TCR、或其片段，該恆定區與選自SEQ ID No：16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、112、及118之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性，較佳其中TCR由至少一個TCR α及一個TCR β鏈序列組成，其中TCR α鏈序列包含與選自SEQ ID No：16、28、40、52、64、76、88、及112之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的恆定區，並且其中TCR β鏈序列包含與選自SEQ ID No：22、34、46、58、70、82、94、及118之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的恆定區。
亦揭示如本文之前描述之抗原識別構建體，其包括與SEQ ID NO：17之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第一TCR鏈，及與SEQ ID NO：23之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第二TCR鏈，本發明亦提供TCR，該等TCR包括與SEQ ID NO：29之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第一TCR鏈，及與SEQ ID NO：35之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第二TCR鏈，在進一步實施例中，本發明提供抗原識別構建體，該等構建體為TCR並且包含與SEQ ID NO：41之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第一TCR鏈，及與SEQ ID NO：47之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第二TCR鏈，在進一步實施例中，本發明提供抗原識別構建體，該等構建體為TCR並且包含與SEQ ID NO：53之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第一TCR鏈，及與SEQ ID NO：59之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第二TCR鏈，在進一步實施例中，本發明提供抗原識別構建體，該等構建體為TCR並且包含與SEQ ID NO：65之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第一TCR鏈，及與SEQ ID NO：71之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第二TCR鏈，在進一步實施例中，本發明提供抗原識別構建體，該等構建體為TCR並且包含與SEQ ID NO：77之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第一TCR鏈，及與SEQ ID NO：83之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第二TCR鏈，在進一步實施例中，本發明提供抗原識別構建體，該等構建體為TCR並且包含與SEQ ID NO：89之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第一TCR鏈，及與SEQ ID NO：95之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第二TCR鏈，在進一步實施例中，本發明提供抗原識別構建體，該等構建體為TCR並且包含與SEQ ID NO：113之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第一TCR鏈，及與SEQ ID NO：119之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列一致性的第二TCR鏈，
如本文所用，術語「鼠科」或「人類」，當意指本文所述抗原識別構建體或TCR或TCR之任何成分(例如，互補決定區(complementarity determining region；CDR)、可變區、恆定區、α鏈及/或β鏈)時，意指分別源自小鼠或人類未重排TCR基因座的TCR(或其成分)。
在本發明之一個實施例中，提供了嵌合TCR，其中TCR鏈包括來自多個物種之序列。較佳地，本發明之TCR可以包括α鏈，該α鏈包括α鏈之人類可變區及例如鼠科TCR α鏈之鼠科恆定區。
根據本發明之另一態樣，提供了一種核酸，該核酸編碼根據以上描述之肽，或編碼根據以上描述之抗體或其片段，或編碼根據以上描述之T細胞受體或其片段。
在不同實施例中，該核酸以DNA或RNA之形式提供。在一個實施例中，該核酸以載體或質體之形式提供。在一個實施例中，核酸包括編碼序列之兩個或兩個以上重複(串聯體)，該等重複由短核苷酸鏈段(「間隔物」)分隔。
替代地或附加地，提供了一種治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者的方法。
該方法包括以一種或多種治療有效劑量向患者投與編碼根據以上描述之肽、或編碼根據以上描述之抗體或其片段、或編碼根據以上描述之T細胞受體或其片段的核酸。
替代地或附加地，提供了一種用於治療轉移或轉移性病變之醫藥組成物，該組成物包含編碼根據以上描述之肽、或根據以上描述之抗體或其片段、或根據以上描述之T細胞受體或其片段的核酸作為有效成分。
在一個實施例中，該治療或組成物不包括與核酸共同投與(同時或依序)，該核酸編碼作為前列腺特定膜抗原(Prostate specific Membrane antigen；PSMA)之片段的肽，或編碼結合與MHC分子結合之此肽的抗體或T細胞受體。
具體而言，該治療不包括與編碼結合至PSMA 288-297(GLPSIPVHPI，SEQ ID NO：376)或PSMA 288-297I297V (GLPSIPVHPV，SEQ ID NO：377)之抗體或T細胞受體或其功能片段的核酸共同投與(同時或依序)，該肽結合至MHC。
在一個實施例中，轉移或轉移性病變為PRAME陽性的。在一個實施例中，轉移或轉移性病變在其至少一個細胞之表面上顯示肽，該肽包含SEQ ID NO: 310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列，或與主要組織相容性複合物結合之該胺基酸。
在一個實施例中，患者對於HLA-A*02呈陽性。此尤其包括單倍型HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、及HLA-A*02:11。在一個實施例中，患者對於HLA-A*02:01呈陽性。
視情況地，提供該核酸用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
此核酸可以係mRNA或DNA。此核酸可以作為質體或線性分子遞送。此核酸可以藉由病毒載體遞送或包封至脂質體中。此mRNA可以包括修飾之核苷，如假尿苷或1-甲基假尿苷，以減少免疫原性作用。此mRNA可以G/C密碼子優化以便具有降低之尿苷含量。
根據本發明之另一態樣，提供了一種重組宿主細胞，其包含根據以上描述之肽、根據以上描述之抗體或其片段、根據以上描述之T細胞受體或其片段或根據以上描述之核酸。
根據本發明之另一態樣，提供了一種重組T淋巴球，其表現至少一種編碼根據以上描述之T細胞受體之載體。
提供T淋巴球用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
替代地或附加地，提供了一種治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者的方法。
該方法包括以一種或多種治療有效劑量向患者投與表現至少一種編碼根據以上描述之T細胞受體之載體的重組T淋巴球。
替代地或附加地，提供了一種用於治療轉移或轉移性病變之醫藥組成物，該組成物包含表現至少一種編碼根據以上描述之T細胞受體之載體的重組T淋巴球作為有效成分。
在一個實施例中，該治療或組成物不包括與表現編碼T細胞受體或其功能片段之載體的重組T淋巴球共同投與(同時或依序)，該T細胞受體或其功能片段結合至前列腺特定膜抗原(Prostate specific Membrane antigen；PSMA)之片段，該肽結合至MHC分子；尤其不結合至PSMA 288-297(GLPSIPVHPI，SEQ ID NO：376)或PSMA 288-297I297V (GLPSIPVHPV，SEQ ID NO：377)，該肽結合至MHC分子。
在一個實施例中，重組T淋巴球藉由一種方法產生，該方法包括自受試者分離細胞，用至少一種編碼T細胞受體之載體轉化細胞，以產生重組T淋巴球，並擴增重組T淋巴球以產生重組T淋巴球群。
在一個實施例中，轉移或轉移性病變為PRAME陽性的。在一個實施例中，轉移或轉移性病變在其至少一個細胞之表面上顯示肽，該肽包含SEQ ID NO: 310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列，或與主要組織相容性複合物結合之該胺基酸。
在一個實施例中，患者對於HLA-A*02呈陽性。此尤其包括單倍型HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、及HLA-A*02:11。在一個實施例中，患者對於HLA-A*02:01呈陽性。
在一個實施例中，重組T淋巴球係CD8+(CD8陽性)T淋巴球。CD8+T淋巴球(亦稱為細胞毒性T細胞CTL、T殺傷細胞、溶細胞T細胞或殺傷T細胞)係一種殺死癌細胞、感染(尤其病毒)之細胞或以其他方式受損之細胞的T淋巴球。
大多數細胞毒性T細胞表現能識別特定抗原的T細胞受體(T cell receptor；TCR)。抗原係一種能夠刺激免疫反應之分子，通常由癌細胞或病毒產生。細胞內之抗原與I類MHC分子結合，並被I類MHC分子帶到細胞表面，在表面處它們可以被T細胞識別。如果TCR對該抗原具有特異性，它會與I類MHC分子及抗原之複合物結合，T細胞會破壞細胞。
為了使TCR與I類MHC分子結合，前者必須伴隨一種稱為CD8之醣蛋白，該醣蛋白與I類MHC分子之恆定部分結合。因此，此等T細胞被稱為CD8+T細胞。
根據若干實施例，T細胞受體包括： (1) 包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的CDR3β鏈，或 (2) 包括SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 25之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的CDR3β鏈，或 (3) 包括SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的CDR3β鏈，或 (4) 包括SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的CDR3β鏈， (5) 包括SEQ ID NO: 60之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 61之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的CDR3β鏈， (6) 包括SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 78之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 79之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 80之胺基酸序列的CDR3β鏈， (7) 包括SEQ ID NO: 84之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 85之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的CDR3β鏈， 其中該T細胞受體能夠結合至與HLA-A*02複合的由SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之胺基酸序列組成之肽。
根據若干實施例，T細胞受體包括： (1) 包括SEQ ID NO: 15之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 21之β鏈可變域，或 (2) 包括SEQ ID NO: 27之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 33之β鏈可變域，或 (3) 包括SEQ ID NO: 39之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 45之β鏈可變域，或 (4) 包括SEQ ID NO: 51之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 57之β鏈可變域，或 (5) 包括SEQ ID NO: 63之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 69之β鏈可變域，或 (6) 包括SEQ ID NO: 75之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 81之β鏈可變域，或 (7) 包括SEQ ID NO: 87之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 93之β鏈可變域，或 (8) 包括SEQ ID NO: 111之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 117之β鏈可變域， 其中該T細胞受體能夠結合至與HLA-A*02複合的由SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之胺基酸序列組成之肽。
根據本發明之另一態樣，提供了一種產生活化T淋巴球之 活體外方法。該方法包括將 活體外T細胞與在合適抗原呈遞細胞或模擬抗原呈遞細胞之人工構建體之表面上表現之負載抗原之人類I類MHC分子接觸一段足以以抗原特異性方式活化該T淋巴球之時間。該抗原係根據以上描述之肽。
根據本發明之另一態樣，提供了藉由根據以上描述之方法產生的活化T淋巴球，其選擇性地識別呈現根據以上描述之肽的細胞。
提供T淋巴球用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
替代地或附加地，提供了一種治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者的方法。
該方法包括以一種或多種治療有效劑量向患者投與由根據以上描述之方法產生的活化T淋巴球，該等淋巴球選擇性地識別呈現根據以上描述之肽的細胞。
替代地或附加地，提供了一種用於治療轉移或轉移性病變之醫藥組成物，該組成物包含藉由根據以上描述之方法產生之活化T淋巴球作為有效成分，該淋巴球選擇性地識別呈現根據以上描述之肽的細胞。
在一個實施例中，該治療不包括與識別細胞之活化T淋巴球共同投與(同時或依序)，該細胞呈遞作為前列腺特定膜抗原(Prostate specific Membrane antigen；PSMA)之片段的肽，尤其不呈遞PSMA 288-297(GLPSIPVHPI，SEQ ID NO：376)或PSMA 288-297I297V (GLPSIPVHPV，SEQ ID NO：377)。
在一個實施例中，轉移或轉移性病變為PRAME陽性的。在一個實施例中，轉移或轉移性病變在其至少一個細胞之表面上顯示肽，該肽包含SEQ ID NO: 310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列，或與主要組織相容性複合物結合之該胺基酸。
在一個實施例中，患者對於HLA-A*02呈陽性。此尤其包括單倍型HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、及HLA-A*02:11。在一個實施例中，患者對於HLA-A*02:01呈陽性。
在一個實施例中，活化之T淋巴球係CD8+(CD8陽性)T淋巴球。 過繼細胞治療：γδ T細胞製造
為了分離γδ T細胞，在一個態樣，可以自受試者或受試者之複雜樣品中分離γδ T細胞。在一個態樣，複雜樣品可以係外周血樣品、臍帶血樣品、腫瘤、幹細胞前驅物、腫瘤生檢、組織、淋巴或來自直接接觸外部環境之受試者的上皮部位或來源於幹前驅物細胞。γδ T細胞可直接自受試者之複雜樣品中分離，例如，藉由用流式細胞術分選表現一種或多種細胞表面標誌物之γδ T淋巴球。野生型γδ T細胞可能表現出許多抗原識別、抗原呈遞、共刺激及黏附分子，此等分子可能與γδ T淋巴球相關。一種或多種細胞表面標誌物，如特異性γδ TCR、抗原識別、抗原呈遞、配位體、黏附分子或共刺激分子，可用於自複雜樣品中分離野生型γδ T細胞。與γδ T細胞相關或由其表現之各種分子可用於自複雜樣品中分離γδ T淋巴球，例如分離Vδ1+、Vδ2+、Vδ3+細胞或其任何組合的混合群體。
例如，外周血單核細胞可以自受試者身上採集，例如，使用單采機，包括Ficoll Paque™ PLUS(GE Healthcare)系統或另一合適設備/系統。γδ T細胞或所需γδ T細胞亞群可以用例如流式細胞術技術自收集樣品中純化。臍血細胞亦可以在受試者出生時自臍血中獲得。
在收集之γδ T細胞上表現之細胞表面標誌物之陽性及/或陰性選擇可用於直接自外周血樣品、臍血樣品、腫瘤、腫瘤生檢、組織、淋巴或受試者之上皮樣品中分離表現類似細胞表面標誌物之γδ T細胞或γδ T細胞群。例如，γδ T細胞可以基於CD2、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD44、Kit、TCR α、TCR β、TCR α、TCR δ、NKG2D、CD70、CD27、CD30、CD16、CD337 (NKp30)、CD336 (NKp46)、OX40、CD46、CCR7及其他合適細胞表面標誌物之陽性或陰性表現自複雜樣品中分離。
該過程可包括自白血球單采產品中收集或獲得白血球或PBMC。白血球除去法可能包括自供體採集全血，並使用單采機分離成分。單采機分離出所需血液成分，並將剩餘血液返回供體循環。例如，可以使用單采設備收集白血球、血漿及血小板，然後將紅血球及嗜中性球返回供體之循環。可在該過程中使用市售白血球單采產品。另一種獲取白血球之方法係自膚色血球層中獲取。為了分離膚色血球層，自供體中獲得抗凝全血並離心。離心後，血液被分離成血漿、紅血球及膚色血球層。膚色血球層係位於血漿及紅血球層之間的層。與膚色血球層收集相比，白血球單採收集可能導致更高純度及顯著增加的單核細胞含量。使用白血球除去法可得到的單核細胞含量通常比自膚色血球層獲得之含量高20倍。為了富集單核細胞，可能需要使用Ficoll梯度進行進一步分離。
為了耗盡PBMC中之αβ T細胞，可以藉由磁分離將αβ TCR表現細胞自PBMC中分離，例如，使用塗有抗αβ TCR抗體之CliniMACS®磁珠，然後冷凍保存耗盡αβ TCR-T細胞之PBMC。為了製造「現成」T細胞產品，在胺基雙膦酸鹽(例如唑來膦酸鹽及/或焦磷酸異戊烯酯(isopentenylpyrophosphate；IPP))及/或細胞因子(例如介白素2 (interleukin 2；IL-2)、介白素15 (interleukin 15；IL-15)及/或介白素18 (interleukin 18；IL-18))及/或其他活化劑例如Toll樣受體2 (Toll-like receptor 2；TLR2)配位體的存在下，冷凍保存之αβ TCR-T細胞耗盡之PBMC可以小/中規模(例如24至4-6孔板或T75/T175燒瓶)或大規模(例如50毫升-100升袋)解凍及活化，持續1-10天，例如2-7天。 工程設計表現αβ-TCR及CD8αβ之γδ T細胞
本揭示案之γδ T細胞可被設計用於治療需要治療病狀之受試者。為了設計表現例如特異性結合至PRAME-004-MHC複合物之αβ-TCR的γδ T細胞，產生了表現αβ-TCR之γ-逆轉錄病毒。由於γδ T細胞可能不表現CD8，因此γδ T淋巴球可能需要CD8α同二聚體或CD8αβ異二聚體以及αβ-TCR來識別靶細胞(例如癌細胞)細胞膜上呈現之PRAME-004/MHC-I複合物。為此，使用本文描述之方法，產生表現αβ-TCR/CD8之γ-逆轉錄病毒，用於轉導分離之γδ T細胞。CD8α或其變異體及CD8β或其變異體之序列可以選自SEQ ID NO:1-11。
藉由用αβ-TCR逆轉錄病毒及CD8αβ逆轉錄病毒轉導Vγ9δ2 T細胞，產生αβ-TCR表現之Vγ9δ2 T細胞(其中αβ-TCR特異性結合至肽-MHC複合物)。 自體T細胞製造方法
本揭示案之實施例可以包括約7至約10天之過程，該過程導致製造超過100億(10 x 10 9)個細胞而不損失效力。此外，可以優化幾種原材料之濃度，以將商品成本降低30%。
本揭示案之T細胞製造方法可以包括在第0天解凍PBMC，然後在沒有細胞因子的情況下靜置一夜，例如24小時，然後用固定在非組織培養處理板上之抗CD3及抗CD28抗體活化靜置之PBMC。IL-7係一種穩態細胞因子，藉由防止凋亡促進T細胞存活。IL-7可在靜置期間添加到PBMC中。
本揭示案之T細胞製造方法可以包括在第1天解凍PBMC，然後在IL-7或IL-7+IL-15存在下或不含細胞因子的情況下靜置4-6小時，然後用固定在非組織培養處理板上之抗CD3及抗CD28抗體活化靜置之PBMC。
本揭示案之T細胞製造方法可包括在第1天解凍PBMC(無靜置並且無細胞因子)，然後用固定在組織培養板上之抗CD3及抗CD28抗體活化解凍之PBMC。可在第8-10天收穫細胞並計數，隨後進行活化組分析。
根據本揭示案之一個實施例，本揭示案之T細胞製造方法可包括將PBMC靜置約4小時之時間段。例如，T細胞製造方法可以包括藉由白血球除去法來分離及冷凍保存PBMC，其中可以測試無菌性；解凍、靜置(例如約4小時)並活化T細胞；用病毒載體轉導；細胞因子擴增；分裂/飼養細胞，其中可測試細胞計數及免疫表型；藥物產品細胞之收穫及冷凍保存，其中可以測試細胞計數及支原體，以及冷凍保存後釋放，其中可以測試生存力、無菌性、內毒素、免疫表型、整合載體之拷貝數及水泡性口炎病毒醣蛋白G(vesicular stomatitis virus glycoprotein G；VSV-g)。
本揭示案之T細胞製造方法可包括將PBMC靜置過夜(約16小時)。例如，T細胞製造方法可包括分離PBMC，其中PBMC可新鮮使用或冷凍儲存直至準備使用，或可用作T細胞製造之起始材料，淋巴球群(例如CD8、CD4或兩者)之選擇亦可能；將淋巴球解凍並靜置過夜，例如約16小時，此舉可使凋亡細胞死亡並恢復T細胞功能(如果使用新鮮材料，則此步驟可能不必要)；淋巴球之活化，其可使用抗CD3及抗CD28抗體(可溶性或表面結合的，例如磁性或可生物降解之珠粒)；用TCR或雙特異性分子轉導，其可以使用編碼TCR或雙特異性分子之慢病毒或逆轉錄病毒構建體，或者可以使用非病毒方法；淋巴球之擴增、收穫及冷凍保存，此舉可以在細胞因子、血清(ABS或FBS)及/或冷凍保存介質的存在下進行。
表2a總結了根據本揭示案之一個實施例以約4小時之短暫靜置及以約16小時之過夜靜置製造之T細胞的特徵。 表2a：使用包括4小時與16小時靜置之方案製造之T細胞的特徵。
靜置持續 擴增倍數 收穫計數 生存力 ≥ 70% %活CD3+ ≥ 80% CD3+中之CD8+% CD8+中之Dex+% ≥ 10%
4小時 78.7 28.0 x 10 9 92.0 99.7 53.4 63.7
16小時 45.0 15.7 x 10 9 86.0 99.5 51.9 53.0
本揭示案之T細胞製造方法可以包括使用新鮮PBMC，其不是藉由解凍冷凍保存之PBMC而獲得的，因此，最小化由於冷凍、解凍及/或靜置PBMC導致之細胞損失，並在製造方法開始時最大化細胞數。例如，T細胞製造方法可以包括第0天，分離新鮮PBMC，在例如包被有抗CD3或抗CD28抗體之例如Saint-Gobain VueLife AC袋的袋中，使用例如抗CD3及抗CD28抗體(可溶性或表面結合的，例如磁性或可生物降解之珠粒)活化新鮮淋巴球；第1天，使用例如編碼TCR或雙特異性分子之慢病毒或逆轉錄病毒構建體或非病毒方法(例如脂質體)，用TCR或雙特異性分子進行轉導；第2天，淋巴球擴增，第5/6天，收穫，在細胞因子、血清(ABS或FBS)及/或冷凍保存介質存在下進行冷凍保存。 工程化表現αβ-TCR及CD8αβ的αβ T細胞
本揭示案之工程化αβ T細胞可用於治療需要治療病狀之受試者。為了工程化表現特異性結合至PRAME-004/MHC複合物的例如如序列表所示αβ-TCR之αβ T細胞，產生了表現αβ-TCR之γ-逆轉錄病毒。CD8+及/或CD4 T細胞中外源性CD8α同二聚體或CD8αβ異二聚體之表現可提高αβ-TCR識別靶細胞(例如癌細胞)細胞膜上之PRAME-004/MHC-I複合物。為此，使用本文所述之方法產生αβ-TCR/CD8表現γ-逆轉錄病毒用於轉導T細胞。CD8α或其變異體及CD8β或其變異體之序列可以選自SEQ ID NO:1–11。 治療方法
含有工程化αβ T細胞(例如CD4+及CD8+T細胞)及/或γδ T細胞之組成物可用於預防性及/或治療性治療，該等細胞表現結合至PRAME-004之重組TCR及/或雙特異性分子。在治療應用中，醫藥組成物可以以足以治癒或至少部分抑制疾病或病狀之症狀的量投與已經患有疾病或病狀之受試者。亦可以投與工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞來降低病情發展、染病或惡化之可能性。用於治療之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞群之有效量可根據疾病或病狀之嚴重程度及病程、先前治療、受試者之健康狀況、體重及/或對藥物之反應及/或治療醫生之判斷而變化。
本揭示案之組成物亦可以包括一種或多種佐劑。佐劑係非特異性增強或強化對抗原之免疫反應(例如，由CD8陽性T細胞及輔助T (helper-T；TH)細胞介導之免疫反應)的物質，因此被認為可用於本發明之藥物中。合適佐劑包括但不限於1018 ISS、鋁鹽、AMPLIVAX®、AS15、BCG、CP-870893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或來源於鞭毛蛋白之TLR5配位體、FLT3配位體、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫德(Imiquimod)(ALDARA®)、瑞西莫德(resiquimod)、ImuFact IMP321、介白素如IL-2、IL-13、IL-21、干擾素α或β或其聚乙二醇化衍生物、IS-Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、JuvImmune®、LipoVac、MALP2、MF59、單磷醯脂質A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、油包水及水包油乳液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、PepTel®載體系統、聚(丙交酯-乙交酯)[poly(lactide co-glycolide)；PLG]基及葡聚糖微粒、半乳鐵蛋白SRL172、病毒體及其他病毒樣顆粒、YF-17D、VEGF陷阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Aquila之QS21刺激素(來源於皂苷、分枝桿菌提取物及合成細菌細胞壁模擬物)以及其他專利佐劑，如Ribi's Detox、Quil或Superfos。佐劑如弗氏或GM-CSF係較佳的。先前已經描述了幾種對於樹突狀細胞具有特異性之免疫佐劑(例如MF59)及其製備(Allison及Krummel 1995)。此外，可以使用細胞因子。幾種細胞因子已與影響樹突狀細胞向淋巴組織遷移(例如TNF-)，加速樹突狀細胞成熟為T淋巴球的有效抗原呈遞細胞(例如GM-CSF、IL-1及IL-4)(U.S. 5,849,589，以引用方式全部併入本文)並作為免疫佐劑(例如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFNα、IFNβ)直接相關。
據報道，CpG免疫刺激性寡核苷酸可增強佐劑在疫苗環境中之作用。不受理論限制，CpG寡核苷酸藉由Toll樣受體(Toll-like receptor；TLR)(主要係TLR9)活化先天(非適應性)免疫系統來起作用。CpG觸發之TLR9活化增強了對多種抗原之抗原特異性體液及細胞反應，包括肽或蛋白抗原、活的或殺死的病毒、樹突狀細胞疫苗、自體細胞疫苗以及預防性及治療性疫苗中之多醣偶聯物。更重要地，它增強了樹突狀細胞之成熟及分化，從而增強了TH1細胞之活化及強烈細胞毒性T淋巴球(cytotoxic T-lymphocyte；CTL)生成，即使在沒有CD4 T細胞之幫助下亦如此。即使在通常促進TH2偏移之疫苗佐劑如明礬或不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant；IFA)的存在下，TLR9刺激誘導之TH1偏移亦保持不變。CpG寡核苷酸在與其他佐劑一起配製或共同投與時，或在諸如微粒、奈米粒子、脂質乳劑或類似製劑的製劑中，表現出甚至更大佐劑活性，當抗原相對較弱時，此舉對於誘導強烈反應尤其必要。在一些實驗(Krieg 2006)中，它們亦可以加速免疫反應，使抗原劑量減少約兩個數量級，並且抗體反應與不含CpG之全劑量疫苗相當。US 6406705 B1描述了CpG寡核苷酸、非核酸佐劑及抗原之聯合使用以誘導抗原特異性免疫反應。CpG TLR9拮抗劑為Mologen (Berlin，Germany)之dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator；雙幹環免疫調節劑)，該調節劑為本發明醫藥組成物之較佳成分。亦可以使用其他TLR結合分子，例如RNA結合TLR 7、TLR 8及/或TLR 9。
有用佐劑之其他實例包括但不限於化學修飾之CpG(例如CpR、Idera)、dsRNA類似物如Poly(I:C)及其衍生物(例如AmpliGen®、Hiltonol®、Poly-(ICLC)、Poly(IC-R)、Poly(I:C12U)、非CpG細菌DNA或RNA、細菌脂肽Pam3Cys Ser-Ser之模擬物如Pam3Cys-GDPKHPKSF (XS15)。參見(Gouttefangeas and Rammensee 2018；Rammensee等人2019)，該等文獻之賦能揭示內容以引用方式併入本文。
有用佐劑之其他實例包括免疫活性小分子及抗體，如環磷醯胺、舒尼替尼(sunitinib)、免疫檢查點抑制劑，包括伊普利單抗(ipilimumab)、尼沃單抗(nivolumab)、彭布羅利單抗(pembrolizumab)、阿替唑單抗(atezolizumab)、阿韋魯單抗(avelumab)、杜魯單抗(durvalumab)及西米普利單抗(cemiplimab)、Bevacizumab®、塞來昔布(celebrex)、NCX-4016、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、索拉非尼(sorafenib)、替莫唑胺(temozolomide)、替莫西莫司(temsirolimus)、XL-999、CP-547632、帕佐帕尼(pazopanib)、VEGF Trap、ZD2171、AZD21711、抗CTLA4、靶向免疫系統關鍵結構之其他抗體(例如抗CD40、抗TGFβ、抗TNFα受體)及SC58175，其可治療性地及/或作為佐劑起作用。在本發明之情形中有用之佐劑及添加劑之量及濃度可以由熟習此項技術者容易地決定，而無需過度實驗。
較佳佐劑係抗CD40、咪喹莫德、瑞西莫德、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、阿替唑單抗、干擾素α、干擾素β、CpG寡核苷酸及衍生物、聚(I:C)及其衍生物、RNA、西地那非及具有聚(丙交酯-乙交酯)(poly(lactide co-glycolide)；PLG)之顆粒製劑、病毒體及/或介白素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、及IL-23。
在一個較佳實施例中，根據本發明之醫藥組成物中，佐劑選自集落刺激因子，例如顆粒球巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor；GM-CSF，sargramostim)、環磷醯胺、咪喹莫德、瑞西莫德及干擾素α。
在一個較佳實施例中，根據本發明之醫藥組成物中，佐劑選自集落刺激因子，例如顆粒球巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor；GM-CSF，沙格司亭(sargramostim))、環磷醯胺、咪喹莫德及瑞西莫德。在本發明醫藥組成物之較佳實施例中，佐劑係環磷醯胺、咪喹莫德或瑞西莫德。甚至更佳佐劑係Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、聚ICLC(Hiltonol®)及抗CD40 mAB或其組合。
本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可用於治療需要治療例如本文所述之癌症之病狀的受試者。
用工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞治療受試者病狀(例如疾病)之方法可包括向受試者投與治療有效量之工程化αβ T及/或γδ T細胞。本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可以以各種方案(例如，時間、濃度、劑量、治療間隔及/或製劑)投與。在接受本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞之前，受試者亦可以用例如化療、放療或兩者之組合進行預處理。工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞群亦可在向受試者投與前冷凍或冷凍保存。工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞群可以包括兩種或兩種以上表現相同、不同或相同及不同腫瘤識別部分之組合的細胞。例如，工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞群可以包括幾種不同工程化αβ T及/或γδ T細胞，此等細胞被設計為識別不同抗原或相同抗原之不同表位。
在一個態樣，本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可用於治療傳染病。在另一態樣，本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可用於治療傳染病，傳染病可由病毒引起。在另一態樣，本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可用於治療免疫疾病，例如自體免疫疾病。
本揭示案之αβ T細胞及/或γδ T細胞治療可在病狀臨床發作之前、期間及之後提供給受試者。可在疾病臨床發作後1天、1週、6個月、12個月或2年後對受試者進行治療。在疾病臨床發作後，可對受試者提供超過1天、1週、1個月、6個月、12個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更長時間之治療。在疾病臨床發作後，可對受試者提供少於1天、1週、1個月、6個月、12個月或2年之治療。治療亦可以包括在臨床試驗中對人類進行治療。治療可包括向受試者投與包含本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞的醫藥組成物。
在另一態樣，向受試者投與本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可調節受試者體內內源性淋巴球之活性。在另一態樣，向受試者投與工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可向內源性T細胞提供抗原，並可增強免疫反應。在另一態樣，記憶T細胞可以係CD4+T細胞。在另一態樣，記憶T細胞可以係CD8+T細胞。在另一態樣，向受試者投與本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可活化另一種免疫細胞之細胞毒性。在另一態樣，另一種免疫細胞可以係CD8+T細胞。在另一態樣，另一種免疫細胞可以係自然殺傷T細胞。在另一態樣，向受試者投與本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可抑制調節性T細胞。在另一態樣，調節性T細胞可以係FOX3+Treg細胞。在另一態樣，調節性T細胞可以係FOX3− Treg細胞。其活性可由本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞調節之細胞的非限制性實例可包括：造血幹細胞；B細胞；CD4；CD8；紅血球；白血球；樹突狀細胞，包括樹突狀抗原呈遞細胞；白血球；巨噬細胞；記憶B細胞；記憶T細胞；單核球；自然殺傷細胞；嗜中性球顆粒球；輔助T細胞；及T殺傷細胞。
在大多數骨髓移植過程中，通常可採用環磷醯胺與全身照射之組合來防止受試者免疫系統對移植中造血幹細胞(hematopoietic stem cell；HSC)之排斥反應。在一個態樣，可以進行供體骨髓與介白素-2 (interleukin-2；IL-2)離體孵育以增強供體骨髓中殺傷淋巴球之生成。介白素-2(interleukin-2；IL-2)係野生型淋巴球生長、增殖及分化所必需之細胞因子。目前對將αβ T細胞及/或γδ T細胞過繼轉移到人體之研究可能需要αβ T及/或γδ T細胞與介白素-2之共同投與。然而，低劑量及高劑量之IL-2都會產生劇毒副作用。IL-2毒性可表現在多個器官/系統中，最顯著地心臟、肺、腎臟及中樞神經系統。在另一個態樣，本揭示案提供了一種在不共同投與天然細胞因子或其修飾型式(如IL-2、IL-15、IL-12、IL-21)的情況下向受試者投與工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞的方法。在另一態樣，工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可以在不與IL-2共同投與的情況下投與給受試者。在另一個態樣，可以在手術期間(例如骨髓移植)將工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞投與給受試者，而不同時投與IL-2。 投與方法
通常，治療實體，包括疫苗、抗體、TCR、雙特異性或多特異性分子及T細胞，可以藉由各種可行投與方式投與。
在一個實施例中，藉由im(肌肉內)、iv(靜脈內)或sc(皮下)注射或輸注來投與治療實體。在一個實施例中，治療實體不經淋巴管內投與。在一個實施例中，藉由im(肌肉內)、iv(靜脈內)或sc(皮下)而非淋巴管內注射或輸注來投與治療實體。
一個或多個工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞群可以以任何順序或同時投與受試者。如果同時，多個工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可以以諸如靜脈內注射之單一、統一形式提供，或以多個形式例如以多次靜脈內輸液、皮下注射或藥丸形式提供。工程化γδ T細胞可以在單個包裝中或在多個包裝中共同或單獨包裝。一種或全部工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可以以多個劑量來給藥。如果不同時進行，多個劑量之間的時間可能會變化到大約一週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或大約一年。在另一態樣，工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞在投與受試者後可在受試者 活體內擴增。可以冷凍工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞，以提供用相同細胞製劑進行多次治療之細胞。本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞，以及包含該等細胞之醫藥組成物可以包裝成套組。套組可包括關於工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞以及包含該等細胞之組成物的使用說明(例如書面說明)。
在另一態樣，治療癌症之方法包括向受試者投與治療有效量之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞，其中投與治療癌症。在另一個實施例中，治療有效量之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可投與至少約10秒、30秒、1分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或1年。在另一態樣，治療有效量之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可投與至少一週。在另一態樣，治療有效量之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可投與至少兩週。
本文所述之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可以在疾病或病狀發生之前、期間或之後投與，並且投與含有工程化αβ T及/或γδ T細胞之醫藥組成物之時機選擇可以變化。例如，工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可以用作預防劑，並可以連續投與給有病狀或疾病傾向之受試者，以降低疾病或病狀發生之可能性。可在症狀發作期間或症狀發作後儘快向受試者投與工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞。工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞之投與可以在症狀發作後立即開始、在症狀發作的前3小時內、在症狀發作的前6小時內、症狀發作的前24小時內、在症狀發作的48小時內，或者在症狀發作後之任何一段時間內開始。初始投與可以藉由任何可行途徑，例如藉由本文描述之任何途徑，使用本文描述之任何製劑。在另一態樣，本揭示案之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞之投與可以係靜脈內投與。在癌症、傳染病、免疫疾病、敗血症或骨髓移植開始後，可在可行的情況下儘快投與一或多個劑量之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞，並持續治療免疫疾病所需之時間，例如約24小時至約48小時，約48小時至約1週、約1週至約2週、約2週至約1個月、約1個月至約3個月。對於癌症之治療，可以在癌症發病後數年以及其他治療之前或之後投與一或多個劑量之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞。在另一態樣，工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可以投與至少約10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、24小時、至少48小時、至少72小時、至少96小時、至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。治療時間長度因受試者而異。 保存
在一個態樣，αβ T細胞及/或γδ T細胞可以在冷凍介質中配製，並放置在低溫存儲單元諸如液氮冷凍機(−196℃)或超低溫冷凍機(−65℃、−80℃、−120℃或-150℃)中，用於至少約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年、2年、3年或至少5年的長期儲存。冷凍介質可以含有二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide；DMSO)、及/或氯化鈉(NaCl)及/或葡萄糖及/或硫酸葡聚糖及/或羥乙基澱粉(hydroxyethyl starch；HES)以及生理pH緩衝劑，以將pH保持在約6.0至約6.5、約6.5至約7.0、約7.0至約7.5、約7.5至約8.0或約6.5至7.5之間。冷凍保存之αβ T細胞及/或γδ T細胞可以解凍並藉由用本文所述之抗體、蛋白質、肽及/或細胞因子刺激來進一步處理。冷凍保存之αβ T細胞及/或γδ T細胞可以解凍並用如本文所述病毒載體(包括逆轉錄病毒、腺相關病毒(adeno-associated virus；AAV)及慢病毒載體)或非病毒手段(包括RNA、DNA，例如轉座子及蛋白質)進行遺傳修飾。可以進一步冷凍保存經修飾之αβ T細胞及/或γδ T細胞，以在冷凍介質中以每毫升至少約101、102、103、104、105、106、107、108、109或至少約1010個細胞之量產生至少約1、5、10、100、150、200、500個小瓶的細胞庫。冷凍保存之細胞庫可以保留其功能，可以解凍並進一步刺激及擴增。在另一個態樣，解凍細胞可以在合適封閉容器(例如細胞培養袋及/或生物反應器)中刺激及擴增，以產生大量細胞作為同種異體細胞產物。冷凍保存之αβ T細胞及/或γδ T細胞在低溫存儲條件下可維持其生物學功能至少約6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、15個月、18個月、20個月、24個月、30個月、36個月、40個月、50個月或至少約60個月。在另一態樣，製劑中不可使用防腐劑。冷凍保存之αβ T細胞及/或γδ T細胞可以解凍並作為同種異體現成細胞產品注入多個患者體內。
在一態樣，本文描述之工程化αβ T細胞及/或γδ T細胞可以至少1×10 3細胞/ml、至少2×10 3細胞/ml、至少3×10 3細胞/ml、至少4×10 3細胞/ml、至少5×10 3細胞/ml、至少6×10 3細胞/ml、至少7×10 3細胞/ml、至少8×10 3細胞/ml、至少9×10 3細胞/ml、至少1×10 4細胞/ml、至少2×10 4細胞/ml、至少3×10 4細胞/ml、至少4×10 4細胞/ml、至少5×10 4細胞/ml、至少6×10 4細胞/ml、至少7×10 4細胞/ml、至少8×10 4細胞/ml、至少9×10 4細胞/ml、至少1×10 5細胞/ml、至少2×10 5細胞/ml、至少3×10 5細胞/ml、至少4×10 5細胞/ml、至少5×10 5細胞/ml、至少6×10 5細胞/ml、至少7×10 5細胞/ml、至少8×10 5細胞/ml、至少9×10 5細胞/ml、至少1×10 6細胞/ml、至少2×10 6細胞/ml、至少3×10 6細胞/ml、至少4×10 6細胞/ml、至少5×10 6細胞/ml、至少6×10 6細胞/ml、至少7×10 6細胞/ml、至少8×10 6細胞/ml、至少9×10 6細胞/ml、至少1×10 7細胞/ml、至少2×10 7細胞/ml、至少3×10 7細胞/ml、至少4×10 7細胞/ml、至少5×10 7細胞/ml、至少6×10 7細胞/ml、至少7×10 7細胞/ml、至少8×10 7細胞/ml、至少9×10 7細胞/ml、至少1×10 8細胞/ml、至少2×10 8細胞/ml、至少3×10 8細胞/ml、至少4×10 8細胞/ml、至少5×10 8細胞/ml、至少6×10 8細胞/ml、至少7×10 8細胞/ml、至少8×10 8細胞/ml、至少9×10 8細胞/ml、至少1×10 9細胞/ml或更多、約1×10 3細胞/ml至約至少1×10 8細胞/ml、約1×10 5細胞/ml至約至少1×10 8細胞/ml、或約1×10 6細胞/ml至約至少1×10 8細胞/ml之量存在於組成物中。
在一態樣，根據本揭示案之一態樣，本文所述之方法可用於生產自體或同種異體產品。
根據本發明之一個實施例，以上描述之抗體或以上描述之T細胞受體進一步包括效應部分，其選自： a) 毒素，或 b) 免疫調節劑。
免疫調節劑係已知的。它們係藉由直接或間接活化免疫系統之體液或細胞分部，例如藉由活化T細胞來誘導或刺激免疫反應的分子。實例包括：IL-1、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、TNFα、抗CD2抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體、抗D44抗體、抗CD 45RA抗體、抗CD45RB抗體、抗CD45RO抗體、抗CD49a抗體、抗CD49b抗體、抗CD49c抗體、抗CD49d抗體、抗CD49e抗體、抗CD49f抗體、抗CD16抗體、抗CD28抗體、抗IL-2R抗體、病毒蛋白及肽以及細菌蛋白或肽。當免疫調節劑多肽係抗體時，它可以特異性地結合由T細胞呈遞之抗原，並且可以係scFv抗體。
在一個實施例中，免疫調節劑係抗CD3抗體。
在一個實施例中，免疫調節劑結合CD3γ、CD3δ或CD3ɛ。
在一個實施例中，免疫調節劑係抗CD3抗體OKT3。
在一個實施例中，免疫調節劑係抗CD3抗體UCHT-1或其人源化變異體hUCHT-1。
在一個實施例中，免疫調節劑係抗CD3抗體BMA031。
在一個實施例中，免疫調節劑係抗CD3抗體12F6。
在幾個實施例中，可以使用此等抗體之片段，例如V H及V L結構域。熟習此項技術者知道如何自已發表之抗體衍生其V H及V L結構域。
人源化抗體hUCHT1揭示於(Zhu及Carter 1995)，該文獻之內容以引用方式併入本文。特別地，可以使用衍生自UCHT1變異體UCHT1-V17、UCHT1-V17opt、UCHT1-V21或UCHT1-V23之V H及V L結構域，較佳衍生自UCHT1-V17。本文其他地方揭示了該抗體之進一步較佳實施例及變異體。
靶向TCRα/β CD3複合物之抗體BMA031及其人源化型式揭示於(Shearman等人，1991)。特別地，可以使用衍生自BMA031變異體BMA031(V36)或BMA031(V10)之V H及V L結構域，較佳衍生自BMA31(V36)。本文其他地方揭示了該抗體之進一步較佳實施例及變異體。
在進一步實施例中，免疫調節劑結合細胞表面抗原，該細胞表面抗原選自CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD18、CD22、CD25、CD28、CD32a、CD32b、CD33、CD41、CD41b及/或CD42a。
用於與靶向域結合之毒素亦係已知的。例如，參見(Storz 2015)，該文獻之內容以引用方式併入本文。
在一個實施例中，毒素係澳瑞他汀(Auristatin)(MMAE，MMAF)。
在一個實施例中，毒素係類美登醇。
在一個實施例中，毒素係蒽環素或其衍生物。
在一個實施例中，毒素係卡奇黴素(Calichemicin)。
在一個實施例中，毒素係多卡黴素(Duocarmycin)。
在一個實施例中，毒素係紫杉烷。
在一個實施例中，毒素係吡咯苯并二氮呯。
在一個實施例中，毒素係α-鵝膏蕈鹼。
在一個實施例中，毒素係核糖毒素或RNA酶。
在一個實施例中，毒素係Tubulysin。
在一個實施例中，毒素係苯二氮呯衍生物。
根據本發明之一個實施例，提供了根據上述描述之T細胞受體，用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
T細胞受體包括第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中包含與SEQ ID NO 184、187、189、190、195、206、208、210、212、216、218、219、220、221、222、229、230、232、234、236、238、240、241、242、243、244、246、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、265、298、299、300、302或304中之任一者之95%一致性的該第一多肽鏈包含該序列之互補決定區(complementarity determining region；CDR)； 其中第二多肽鏈包括第二鉸鏈結構域及/或第二Fc結構域，其中包含與SEQ ID NO 179、180、181、182、183、185、186、188、191、194、203、205、213、214、215、217、223、224、225、226、227、228、231、233、235、237、239、245、247、248、249、264、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、301或303中之任一者之95%一致性的該第二多肽包含該序列之CDR。
替代地或附加地，提供了一種治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者的方法。
該方法包括向患者投與包含第一多肽鏈及第二多肽鏈之T細胞受體，其中包含與SEQ ID NO 184、187、189、190、195、206、208、210、212、216、218、219、220、221、222、229、230、232、234、236、238、240、241、242、243、244、246、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、265、298、299、300、302或304中之任一者之95%一致性的該第一多肽鏈包含該序列之互補決定區(complementarity determining region；CDR)； 其中第二多肽鏈包括第二鉸鏈結構域及/或第二Fc結構域，其中包含與SEQ ID NO 179、180、181、182、183、185、186、188、191、194、203、205、213、214、215、217、223、224、225、226、227、228、231、233、235、237、239、245、247、248、249、264、266、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、301或303中之任一者之95%一致性的該第二多肽包含該序列之CDR。
該等序列係T細胞受體可變結構域。T細胞受體可變結構域之CDR可基於(Lefranc等人，2003)決定，該文獻之內容以引用方式併入本文。進一步揭示內容可發現於http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/IMGTIGVLsuperfamily.html。
替代地或附加地，提供了一種用於治療轉移或轉移性病變之醫藥組成物，該組成物包含此T細胞受體作為有效成分。
在一個實施例中，轉移或轉移性病變為PRAME陽性的。在一個實施例中，轉移或轉移性病變在其至少一個細胞之表面上顯示肽，該肽包含SEQ ID NO: 310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列，或與主要組織相容性複合物結合之該胺基酸。
在一個實施例中，患者對於HLA-A*02呈陽性。此尤其包括單倍型HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、及HLA-A*02:11。在一個實施例中，患者對於HLA-A*02:01呈陽性。
在一個實施例中，該第一多肽鏈藉由第一鉸鏈結構域與第二鉸鏈結構域之間及/或第一Fc結構域與第二Fc區域之間之共價鍵及/或非共價鍵與該第二多肽鏈融合。
在一個實施例中，該第一多肽鏈藉由第一鉸鏈結構域與第二鉸鏈結構域之間及/或第一Fc結構域與第二Fc區域之間之共價鍵及/或非共價鍵與該第二多肽鏈融合。
在一個實施例中，該第一及第二Fc結構域各自包括至少一個Fc效應功能沉默突變。
例如，一個或兩個，較佳兩個多肽鏈上之Fc結構域可以包括抑制Fcγ受體(Fc gamma receptor；FcyR)結合的一種或多種改變。此等改變可以包括L234A、L235A。
在另一個實施例中，一個或兩個，較佳兩個多肽鏈上之Fc結構域可以包括N297Q突變以去除Fc部分內的N-醣化位點。此突變消除了Fcγ受體相互作用。
在一個實施例中，該第一及第二Fc結構域各自包含CH3結構域，該結構域包含至少一種促進異二聚體形成之突變。
因此，在一些實施例中，一種多肽(例如Fc1)之Fc結構域在其CH3結構域中包含胺基酸取代S354C及T366W (鈕)，另一種多多肽(例如Fc2)之Fc結構域在其CH3結構中包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A及Y407V (孔)，反之亦然。如(Wei等人2017)所述，藉由在一個多肽中包含胺基酸取代K409A，在另一個多肽中包含胺基酸取代F405K，可以進一步擴展此組胺基酸取代。因此，在一些實施例中，一種多肽(例如Fc1)之Fc結構域在其CH3結構域中包含或進一步包含胺基酸取代K409A，而另一多肽(例如Fe2)之Fc結構域在其CH3結構域中包含或進一步包含胺基酸取代F405K，反之亦然。
因此，在一個實施例中，一種多肽(例如Fc1)之Fc結構域包含或進一步包含電荷對取代E356K、E356R、D356R或D356K及D399K或D399R，而另一種多肽(例如Fc2)之Fc結構域包含或進一步包含電荷對取代R409D、R409E、K409E或K409D及N392D、N392E、K392E或K392D，或反之亦然。
在一個實施例中，該第一及第二Fc結構域各自包含CH2及CH3結構域，該等結構域包含至少兩個額外半胱胺酸殘基。
此等半胱胺酸殘基可導致形成二硫橋，從而可改良抗原結合蛋白之穩定性，最理想地不干擾抗原結合蛋白之結合特性。此等半胱胺酸橋可以進一步改良異二聚化。在此項技術中，例如在EP2970484中，已經描述了進一步胺基酸取代，例如帶電對取代，以改良所得蛋白質之異二聚化。
本揭示案之一些實施例可以包括治療轉移性病變之方法，該轉移性病變呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)、基本上由其組成、或由其組成之肽，該方法包括例如：識別轉移性病變並向轉移性病變投與本揭示案之T淋巴球或藉由本文所述方法產生的活化T淋巴球，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、卵巢漿液性囊腺癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、胃腺癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、子宮癌肉瘤、子宮內膜癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
本揭示案之一些實施例可以包括治療轉移性病變之方法，該轉移性病變呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)、基本上由其組成、或由其組成之肽，該方法包括例如：識別轉移性病變並用結合至及/或對於SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)具有特異性之T淋巴球之群體來治療該轉移性病變，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、卵巢漿液性囊腺癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、胃腺癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、子宮癌肉瘤、子宮內膜癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
本揭示案之其他實施例可以包括治療轉移性病變之方法，該轉移性病變呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)、基本上由其組成、或由其組成之肽，該方法包括例如：用結合至及/或對於SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)具有特異性之T淋巴球之群體來治療該轉移性病變，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、卵巢漿液性囊腺癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、胃腺癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、子宮癌肉瘤、子宮內膜癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
本揭示案之其他實施例可以包括治療轉移性病變之方法，該轉移性病變在細胞表面上呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)、基本上由其組成、或由其組成之肽，該方法包括例如：選擇患有轉移性病變之患者並向該患者投與包含本揭示案之T淋巴球或藉由本文所述方法產生的活化T淋巴球的組成物，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、卵巢漿液性囊腺癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、胃腺癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、子宮癌肉瘤、子宮內膜癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
本揭示案之一些實施例可以包括引起對於轉移性病變之免疫反應的方法，該轉移性病變呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)、基本上由其組成、或由其組成之肽，該方法包括例如：識別轉移性病變並在轉移性病變中投與本揭示案之T淋巴球或藉由本文所述方法產生的活化T淋巴球，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、卵巢漿液性囊腺癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、胃腺癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、子宮癌肉瘤、子宮內膜癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
本揭示案之一些實施例可以包括引起對於轉移性病變之免疫反應的方法，該轉移性病變呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)、基本上由其組成、或由其組成之肽，該方法包括例如：識別轉移性病變並用結合至及/或對於SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)具有特異性之T淋巴球之群體來治療該轉移性病變，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、卵巢漿液性囊腺癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、胃腺癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、子宮癌肉瘤、子宮內膜癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
本揭示案之其他實施例可以包括引起對於轉移性病變之免疫反應的方法，該轉移性病變在細胞表面上呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)、基本上由其組成、或由其組成之肽，該方法包括例如：選擇患有轉移性病變之患者並向該患者投與包含本揭示案之T淋巴球或藉由本文所述方法產生的活化T淋巴球的組成物，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、卵巢漿液性囊腺癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、胃腺癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、子宮癌肉瘤、子宮內膜癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
本揭示案之一些實施例可以包括向患者投與至少一種佐劑，該佐劑選自抗CD40抗體、咪喹莫德、瑞西莫德、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、阿替唑單抗、干擾素α、干擾物β、CpG寡核苷酸及衍生物、聚(I:C)及衍生物、RNA、西地那非、具有聚(丙交酯-乙交酯)(poly(lactide co-glycolide)；PLG)之顆粒製劑、病毒體、介白素-1(interleukin-1；IL-1)、介白素-2(interleukin-2；IL-2)、介白素-4(interleukin-4；IL-4)、介白素-7(interleukin-7；IL-7)、介白素-12(interleukin-12；IL-12)、介白素-13(interleukin-13；IL-13)、介白素-15(interleukin-15；IL-15)、介白素-21(interleukin-21；IL-21)、介白素-23(interleukin-23；IL-23)。
本揭示案之一些實施例可以包括製備T細胞群之方法，包括：自PBMC獲得T細胞群；活化所獲得之T細胞群，用本揭示案之核酸轉導經活化之T細胞，擴增經轉導之T細胞群，並且其中在具有或不具有組蛋白去乙醯酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor；HDACi)的情況下，該活化、轉導及擴增在IL-21存在下進行。
在一個實施例中，本揭示案提供了一種用於將抗原特異性效應T細胞(T EFF細胞)重編程為中央記憶T細胞(T CM細胞)的方法，該方法可以包括自受試者獲得包含T EFF之起始淋巴球群體；視情況地自包含T EFF細胞之起始淋巴球群體製備富含T EFF細胞之樣品；以及在各自呈足以將T EFF細胞重編程至T CM細胞之量的HDACi及IL-21的存在下培養包含T EFF細胞之起始淋巴球群體或富含T EFF細胞之樣品，其中與自受試者獲得之包含T EFF細胞之起始淋巴球群體中之T CM細胞之數量相比，該重編程產生了富含T CM細胞之淋巴球群體。
在一些實施例中，獲得包含T EFF細胞之起始淋巴球群體可以包括自受試者獲取腫瘤浸潤淋巴球(tumor infiltrating lymphocyte；TIL)之樣品或包含外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)之樣品。在一些實施例中，該方法可進一步包括自包含T EFF細胞之起始淋巴球群體製備富含T EFF之樣品的步驟。在一些實施例中，自包含T EFF細胞之起始淋巴球群體製備富含T EFF細胞之樣品的步驟可以包括自包含T EFF細胞之起始淋巴球群體分離CD8 +T EFF細胞。
在一些實施例中，IL-21、HDACi或其組合可與本文描述之方法及/或本文描述之ACT過程一起用於癌症治療領域。在一個實施例中，本揭示案提供了將效應T細胞重編程至中央記憶表型的方法，包括用至少一種HDACi及IL-21培養效應T細胞。代表性HDACi包括，例如，曲黴菌素A、曲黴菌素Β、苯丁酸酯、丙戊酸、伏立諾司他(vorinostat)(辛二醯苯胺異羥肟酸(suberanilohydroxamic acid)或SAHA)、貝利諾司他(belinostat)、潘諾司他(panobinostat)、達西諾司他(dacinostat)、恩替尼司他(entinostat)、他西地平(tacedinaline)及莫西替諾司他(mocetinostat)。在特定態樣，HDACi可以係SAHA。在其他態樣，HDACi可以係潘諾司他。 針對PRAME-004之雙特異性分子
本揭示案之分子通常包括第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中該等鏈共同提供對免疫調節細胞表面抗原表位具有特異性的抗體之可變結構域及對MHC相關肽表位例如SLLQHLIGL (PRAME-004) (SEQ ID NO:310)具有特異性的TCR之可變結構域。抗體及TCR衍生之可變結構域藉由位於兩條多肽鏈上之Fc部分或其部分之間形成的共價鍵及非共價鍵來穩定。然後，雙特異性多肽分子能夠同時結合細胞受體及MHC相關肽表位。
如論述，抗體之可變結構域可特異性結合免疫調節細胞表面抗原之表位，該抗原中之至少一者選自由以下組成之群：CD3γ、CD3δ、CD3ɛ、CD3ζ、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD18、CD22、CD25、CD28、CD32a、CD32b、CD33、CD41、CD41b、CD42a、CD42b、CD44、CD45RA、CD49、CD55、CD56、CD61、CD64、CD68、CD94、CD90、CD117、CD123、CD125、CD134、CD137、CD152、CD163、CD193、CD203c、CD235a、CD278、CD279、CD287、Nkp46、NKG2D、GITR、FcɛRI、TCRα/β、TCRγ/δ、及HLA-DR。
在本發明之情形中，可變結構域衍生自能夠藉由特異性結合至該等效應細胞之表面抗原來募集人類免疫調節細胞的抗體。在一個特定實施例中，該等抗體特異性結合至人類T細胞之TCR-CD3複合物之表位，該等表位包括肽鏈TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3δ及CD3δ。
在本發明之情形中，根據本發明之雙親和多肽分子之實例係當以肽-MHC複合物形式存在時結合SLLQHLIGL肽(SEQ ID NO:310)的構建體。
例如，本揭示案之雙親和多肽分子可以包括US20190016801、US20190016802、US20190016803及US20190016804中揭示之彼等，該等文獻之內容以引用方式全文併入本文。
較佳地，根據本發明之雙特異性多肽分子以高特異性結合至免疫調節細胞抗原及以肽-MHC複合物形式呈現之特異性抗原表位，例如，結合親和力(KD)為約100 nM或更小、約30 nM或更小、約10 nM或更小、約3 nM或更小、約1 nM或更小，例如藉由生物層干涉測量法或藉由流式細胞術測定。
較佳者係根據本發明之雙特異性多肽分子，其中孔中鈕突變選自CH3結構域中之作為鈕之T366W，及作為孔之T366'S、L368'A及Y407'V (參見例如WO 98/50431)。此組突變可以藉由包含如(Wei等人2017)所述之突變K409A及F405'K進一步擴展。另一個鈕可以係T366Y，並且孔係Y407’T。
根據(Reiter等人，1994)描述之方法，進行工程設計，以便在有或沒有額外鏈間二硫鍵穩定化的情況下，將孔中鈕突變併入CH3結構域中；去除CH2中之N醣化位點(例如N297Q突變)；引入Fc沉默突變；分別在VL及VH中引入額外二硫鍵穩定化。表1列出了所生產雙特異性TCR/mAb雙抗體、變異體以及相應序列的概述。
較佳者係根據本發明之雙特異性多肽分子，其中該第一及第二多肽鏈進一步包括至少一個鉸鏈結構域及/或Fc結構域或其一部分。在抗體中，「鉸鏈」或「鉸鏈區」或「鉸接結構域」係指位於CH1結構域及CH2結構域之間的重鏈之可撓性部分。它長約25個胺基酸，分為「上鉸鏈」、「中鉸鏈」或「核心鉸鏈」及「下鉸鏈」。「鉸鏈子域」係指上鉸鏈、中(或核心)鉸鏈或下鉸鏈。IgG1分子之鉸鏈之胺基酸序列為IgG1：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 129)，其中根據EU(http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html)編號，E為E216。
較佳者係根據本發明之雙特異性多肽分子，其包含至少一個IgG片段可結晶(fragment crystallizable；Fc)結構域，亦即片段可結晶區(Fc區)、與Fc受體相互作用的抗體之尾部區域及補體系統之一些蛋白質。Fc區在每條多肽鏈中包含兩個或三個重鏈恆定結構域(CH結構域2、3及4)。IgG之Fc區亦具有高度保守之N-醣化位點。Fc片段之醣化對於Fc受體介導之活性至關重要。BiTE ®及DART(約50 kD)等雙特異性分子形式之較小尺寸可導致快速清除及短半衰期。因此，為了改良藥代動力學特性，可以將TCR僅可變區(scTv)-細胞受體(例如CD3)雙特異性多肽分子融合至(人類IgG1) Fc結構域，從而增加分子量。位於CH2及CH3結構域之間之界面處的幾種突變，如T250Q/M428L及M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F，已證明增加了對新生Fc受體(neonatal Fc receptor；FcRn)之結合親和力及 活體內IgG1之半衰期。由此，含Fc分子之血清半衰期可以進一步延長。
在本發明之雙特異性多肽分子中，該Fc結構域可以包括CH2結構域，該CH2結構域包含至少一種Fc效應功能沉默突變。較佳地，將此等突變引入已知與效應功能相關的人類IgG1之ELLGGP (SEQ ID NO:130)序列(殘基233-238)或其他同種型之相應殘基中。原則上，將一個或多個對應於源自IgG2及/或IgG4之殘基的突變引入IgG1 Fc中。較佳為：E233P、L234V、L235A，且236位無殘基或G。另一個突變係P331S。EP1075496揭示了一種重組抗體，其包含源自兩個或兩個以上人類免疫球蛋白重鏈CH2結構域的嵌合結構域，其中人類免疫球蛋白選自IgG1、IgG2及IgG4，並且其中嵌合結構域係在根據EU編號系統之規定位置處具有以下胺基酸區塊的人類免疫球蛋白重鏈CH2結構域：233P、234V、235A及236位置中無殘基或G及327G、330S及331S，並且與具有該等修飾胺基酸之人類IgG1、IgG2或IgG4之CH2序列(殘基231-340)至少98%一致。
根據本發明之本發明雙特異性多肽分子在本文中藉由以下各者來例示：包含有包含SEQ ID NO:131之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO:132之第二多肽鏈之雙特性多肽分子，或包含有包含SEQ ID NO:133之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO:134之第二多肽鏈的雙特異性多肽分子。
在一個態樣，本揭示案提供了與SEQ ID NO:131、132、133或134之胺基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的多肽。
在另一個態樣，本文揭示之多肽或雙特異性多肽分子可以藉由在多肽鏈內的不同、可選擇位點處取代一個或多個殘基來修飾。此等取代可以係保守性質的，例如，其中一個胺基酸被具有相似結構及特徵之胺基酸取代，例如疏水性胺基酸被另一個疏水性胺基酸取代。更保守做法係替換相同或相似大小及化學性質之胺基酸，例如用異白胺酸取代白胺酸。在對天然同源蛋白質家族序列變異之研究中，某些胺基酸取代比其他胺基酸取代更容易耐受，此等取代通常證明與原始胺基酸及其置換之間在大小、電荷、極性及疏水性方面之相似性相關，此為定義「保守置換」之基礎。
在本發明之另一態樣，藉由提供編碼本文所揭示之第一多肽鏈及/或第二多肽鏈之核酸或包含此核酸之表現載體來解決上述目的。
在本發明之另一態樣，藉由提供包含本文定義之載體的宿主細胞來解決上述目的。
在本發明之另一個態樣，藉由提供一種生產根據本發明之雙特異性多肽分子之方法來解決上述目的，該方法包括在合適宿主細胞中適當表現包含所揭示之核酸的該表現載體，以及自細胞及/或其培養基中適當純化分子。
在本發明之另一態樣，藉由提供一種醫藥組成物來解決上述目的，該醫藥組成物包含根據本發明之雙特異性多肽分子、根據本發明之核酸或表現載體或根據本發明之細胞，以及一種或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
在本發明之另一態樣，本發明涉及用於醫學的根據本發明之雙特異性多肽分子、根據本發明之核酸或表現載體、根據本發明之細胞或根據本發明之醫藥組成物。
在本發明之另一態樣，本發明涉及用於治療尤其選自癌症及傳染病的本文所揭示之疾病或病症的根據本發明之雙特異性多肽分子、根據本發明之核酸或表現載體、根據本發明之細胞或根據本發明之醫藥組成物。
在本發明之另一態樣，本發明涉及治療疾病或病症之方法，該方法包括投與治療有效量的根據本發明之雙特異性多肽分子、根據本發明之核酸或表現載體、根據本發明之細胞或根據本發明之醫藥組成物。
在本發明之另一態樣，本發明涉及在患者或受試者中引發免疫反應之方法，包括投與治療有效量之根據本發明之雙特異性多肽分子或根據本發明之醫藥組成物。
在另一態樣，本發明涉及一種殺死患者或受試者中靶細胞之方法，包括向患者投與有效量之根據本發明之雙特異性多肽分子。
此雙特異性分子之實例在表2b中給出。 表2b：根據本發明之示例性雙特異性分子。KiH：孔中鈕；K/O：Fc沉默；KiH ds：用連接CH3:CH3'的人工二硫鍵穩定化之孔中鈕；以及衍生自CD3特異性人源化抗體hUCHT1(Var17)之VH及VL結構域。
分子 TCR mAb SEQ IDs 修飾
IA_5 R16P1C10I hUCHT1(Var17) SEQ ID NO: 131 SEQ ID NO: 132 IgG1 (K/O, KiH-ds)
IA_6 R16P1C10I#6 hUCHT1(Var17) SEQ ID NO: 133 SEQ ID NO: 134 IgG1 (K/O, KiH-ds)
在一個實施例中，如本文所定義之第一可變結構域及第二可變結構域可以包括根據IMGT編號之位置44處之胺基酸取代。在較佳實施例中，44位之該胺基酸被另一合適胺基酸取代，以改良配對。在特定實施例中，其中該抗原結合蛋白係TCR，該突變改良了例如鏈之配對(即α鏈及β鏈之配對或γ鏈及δ鏈之配對)。在一個較佳實施例中，可變結構域中44位之胺基酸被選自Q、R、D、E、K、L、W及V之一個胺基酸取代。
在一個實施例中，本發明之抗原結合蛋白之第一可變結構域包括： - 包含選自由胺基酸序列DRGSQS (SEQ ID NO: 135)及DRGSQL (SEQ ID NO: 136)組成之群的胺基酸序列或由其組成的CDRa1，及/或 - 包含選自由胺基酸序列IYSNGD (SEQ ID NO: 137)及IYQEGD (SEQ ID NO: 138)組成之群的胺基酸序列或由其組成的CDRa2，及/或 - 包含選自由胺基酸序列CAAVINNPSGGMLTF (SEQ ID NO: 139)、CAAVIDNSNGGILTF (SEQ ID NO: 140)、CAAVIDNPSGGILTF (SEQ ID NO: 141)、CAAVIDNDQGGILTF (SEQ ID NO: 142)、CAAVIPNPPGGKLTF (SEQ ID NO: 143)、CAAVIPNPGGGALTF (SEQ ID NO: 144)、CAAVIPNSAGGRLTF (SEQ ID NO: 145)、CAAVIPNLEGGSLTF (SEQ ID NO: 146)、CAAVIPNRLGGYLTF (SEQ ID NO: 147)、CAAVIPNTDGGRLTF (SEQ ID NO: 148)、CAAVIPNQRGGALTF (SEQ ID NO: 149)、CAAVIPNVVGGILTF (SEQ ID NO: 150)、CAAVITNIAGGSLTF (SEQ ID NO: 151)、CAAVIPNNDGGYLTF (SEQ ID NO: 152))、CAAVIPNGRGGLLTF (SEQ ID NO: 153)、CAAVIPNTHGGPLTF (SEQ ID NO: 154)、CAAVIPNDVGGSLTF (SEQ ID NO: 155)、CAAVIENKPGGPLTF (SEQ ID NO: 156)、CAAVIDNPVGGPLTF (SEQ ID NO: 157)、CAAVIPNNNGGALTF (SEQ ID NO: 158)、CAAVIPNDQGGILTF (SEQ ID NO: 159)、CAAVIPNVVGGQLTF (SEQ ID NO: 160)、CAAVIPNSYGGLLTF (SEQ ID NO: 161)、CAAVIPNDDGGLLTF (SEQ ID NO: 162)、CAAVIPNAAGGLLTF (SEQ ID NO: 163)、CAAVIPNTIGGLLTF (SEQ ID NO: 164)及CAAVIPNTRGGLLTF (SEQ ID NO: 165)組成之群的胺基酸序列或由其組成的CDRa3，及 第二可變域包括： - 包含選自由胺基酸序列SGHRS (SEQ ID NO: 166)及PGHRA (SEQ ID NO: 167)組成之群的胺基酸序列或由其組成的CDRb1及/或 - 包含選自由胺基酸序列YFSETQ (SEQ ID NO: 169)、YVHGEE (SEQ ID NO: 170)及YVHGAE (SEQ ID NO: 171)組成之群的胺基酸序列或由其組成的CDRb2及/或 - 包含選自由胺基酸序列CASSPWDSPNEQYF (SEQ ID NO: 172)及CASSPWDSPNVQYF (SEQ ID NO: 173)組成之群的胺基酸序列或由其組成的CDRb3。
本發明之發明人在本文揭示之實施例中鑑定了尤其與參考蛋白相比，當該等CDR胺基酸序列用於本發明之抗原結合蛋白，尤其雙特異性抗原結合蛋白，更尤其含Fc之雙特異性TCR/mAb(抗CD3)雙抗體形式中時，TCR變異體「HiAff1」及「LoAff3」增加了包含此等CDR之抗原結合蛋白之結合親和力、穩定性及特異性。
此參考蛋白可以係例如WO2018/172533揭示的包含親本/野生型TCR R16P1C10之CDR的抗原結合蛋白，如本文所述的包含該TCR R16P1C10或參考蛋白之CDR的含F c之雙特異性TCR/mAb(抗CD3)雙抗體係包含該TCR R16C10之CDR的抗原結合蛋白，並且與和其比較之抗原結合蛋白質具有相同形式。此參考蛋白亦可以係例如包含「CDR6」之CDR的抗原結合蛋白，例如本文所述的包含「CDR6」或參考蛋白之CDR的含F c之雙特異性TCR/mAb(抗CD3)雙抗體係包含「CDR6」之CDR的抗原結合蛋白，並且與和其比較之抗原結合蛋白具有相同形式，其中上文揭示了「CDR6」之CDR。
本發明人進一步證明，與包含稱為「CDR6」之參考抗原結合蛋白之CDR的抗原結合蛋白相比，包含上述CDR之本發明抗原結合蛋白具有改良之穩定性，其中稱為「CDR6」之抗原結合蛋白質包含以下α及β CDR： 包含或由胺基酸序列DRGSQS (SEQ ID NO:135)組成之CDRa1、及包含或由胺基酸序列IYSNGD (SEQ ID NO:137)組成之CDRa2、及包含或由胺基酸序列CAAVIDNDQGGILTF (SEQ ID:142)組成之CDRa3、及包含或由胺基酸序列PGHRA (SEQ ID NO:167)組成之CDRb1、及包含或由胺基酸序列YVHGEE (SEQ ID NO:170)組成之CDRb2、及包含或由胺基酸序列CASSPWDSPNVQYF (SEQ ID NO: 173)組成之CDRb3。
在一個特定實施例中，本發明涉及包含所謂「HiAff1」及「LoAff3」變異體及其變異體之CDR的抗原結合蛋白。因此，在一個較佳實施例中，本發明之抗原結合蛋白包括 a) 第一多肽鏈，該多肽鏈包含有包含三個互補決定區(complementary determining region；CDR) CDRa1、CDRa2及CDRa3的第一可變結構域，其中 • 包含或由胺基酸序列DRGSQS (SEQ ID NO：135)或與SEQ ID NO：135至少85%一致之胺基酸序列組成的CDRa1， • 包含或由胺基酸序列IYQEGD (SEQ ID NO：138)組成之CDRa2及 • 包含或由胺基酸序列CAAVIDNDQGGILTF (SEQ ID NO：142)組成之CDRa3，及 b) 第二多肽鏈，該多肽鏈包含有包含三個互補決定區(complementary determining region；CDR) CDRb1、CDRb2及CDRb3的第二可變結構域，其中 • 包含或由胺基酸序列PGHRA (SEQ ID NO：167)或PGHRS (SEQ ID NO：168)，較佳PGHRA (SEQ ID NO：167)，或與SEQ ID NO：167或SEQ ID NO：168，較佳SEQ ID NO：167至少85%一致之胺基酸序列組成的CDRb1； • 包含或由胺基酸序列YVHGEE (SEQ ID NO：170)或與SEQ ID NO：170至少85%一致之胺基酸序列組成的CDRb2，及 • 包含或由胺基酸序列CASSPWDSPNEQYF (SEQ ID NO：172)或CASSPWDSPNVQYF (SEQ ID NO：173)，較佳CASSPWDSPNVQYF (SEQ ID NO：173)，或與SEQ ID NO：172或SEQ ID NO：173，較佳CASSPWDSPNVQYF (SEQ ID NO：173)至少85%一致之胺基酸序列組成的CDRb3。 表3：表現為scTCR-Fab或雙抗體-F c之野生型及成熟TCR的CDR序列及結合親和力
TCR變異體 CDRa1 CDRa2 CDRa3 CDRb1 CDRb2 CDRb3 KD [M]
野生型CDR及框架 DRGSQS (SEQ ID NO: 135) IYSNGD (SEQ ID NO: 137) CAAVISNFGNEKLTF (SEQ ID NO: 26) SGHRS (SEQ ID NO: 166) YFSETQ (SEQ ID NO: 31) CASSPWDSPNEQYF (SEQ ID NO: 172 不能在CHO中以scTCR-Fab或雙抗體-F c形式來表現
穩定化 1 DRGSQS (SEQ ID NO: 135) IYSNGD (SEQ ID NO: 137) CAAVISNFGNEKLTF (SEQ ID NO: 26) PGHRS (SEQ ID NO: 168) YFSETQ (SEQ ID NO: 31) CASSPWDSPNEQYF (SEQ ID NO: 172) 1.2E-06
穩定化 2 DRGSQS (SEQ ID NO: 135) IYSNGD (SEQ ID NO: 137) CAAVISNFGNEKLTF (SEQ ID NO: 26) PGHRS (SEQ ID NO: 168) YFSETQ (SEQ ID NO: 31) CASSPWDSPNEQYF (SEQ ID NO: 172) 9.3E-07
改良 1 DRGSQS (SEQ ID NO: 135) IYSNGD (SEQ ID NO: 137) CAAVIDNSNGGILTF (SEQ ID NO: 26) PGHRS (SEQ ID NO: 168) YVHGAE (SEQ ID NO: 171) CASSPWDSPNEQYF (SEQ ID NO: 172) 1.0E-08
改良 2 DRGSQS (SEQ ID NO: 135) IYSNGD (SEQ ID NO: 137) CAAVIDNSNGGILTF (SEQ ID NO: 26) PGHRS (SEQ ID NO: 168) YVHGAE (SEQ ID NO: 171) CASSPWDSPNEQYF (SEQ ID NO: 172) 8.7E-09
中等親和力 LoAff3 2 DRGSQS (SEQ ID NO: 135) IYQEGD (SEQ ID NO: 138) CAAVIDNDQGGILTF (SEQ ID NO: 26) PGHRS (SEQ ID NO: 168) YVHGEE (SEQ ID NO: 170) CASSPWDSPNEQYF (SEQ ID NO: 172) 1.8E-09
高親和力 CDR6 2 DRGSQS (SEQ ID NO: 135) IYSNGD (SEQ ID NO: 137) CAAVIDNDQGGILTF (SEQ ID NO: 26) PGHRA (SEQ ID NO: 167 YVHGEE (SEQ ID NO: 170) CASSPWDSPNVQYF (SEQ ID NO: 173) 3.9E-10
高親和力 HiAff1 2 DRGSQS (SEQ ID NO: 135) IYQEGD (SEQ ID NO: 138) CAAVIDNDQGGILTF (SEQ ID NO: 26) PGHRA (SEQ ID NO: 167 YVHGEE (SEQ ID NO: 170) CASSPWDSPNVQYF (SEQ ID NO: 173) 3.8E-10
1表現為scTCR-Fab 2表現為雙抗體-F c
所有位置及CDR定義均符合Kabat編號方案。以與人源化UCHT1抗體之Fab片段偶聯的單鏈(scTCR)形式來設計、生產及測試由Vα及Vβ結構域組成之TCR(表4)。重組蛋白表現載體設計為單順反子，由HCMV衍生之啟動子元件pUC19衍生物控制。根據標準培養方法在大腸桿菌中擴增質體DNA，隨後使用市售套組(Macherey & Nagel)進行純化。經純化之質體DNA用於CHO細胞之瞬時轉染。將經轉染之CHO細胞在32℃至37℃下培養10-11天。 表4：雙特異性分子
ID α鏈 β鏈 ID α鏈 β鏈 ID α鏈 β鏈
TPP-70 178 179 TPP-218 230 231 TPP-268 265 286
TPP-71 178 180 TPP-219 240 239 TPP-269 265 287
TPP-72 178 181 TPP-220 242 239 TPP-270 265 288
TPP-73 178 182 TPP-221 244 239 TPP-271 265 289
TPP-74 178 183 TPP-222 246 239 TPP-272 218 290
TPP-93 184 185 TPP-226 222 247 TPP-273 250 291
TPP-79 187 186 TPP-227 189 249 TPP-274 250 292
TPP-105 189 188 TPP-228 250 249 TPP-275 250 293
TPP-106 190 191 TPP-229 251 249 TPP-276 250 294
TPP-108 190 185 TPP-230 344 349 TPP-277 250 295
TPP-109 195 194 TPP-235 253 223 TPP-279 250 296
TPP-110 195 186 TPP-236 254 223 TPP-666 298 297
TPP-111 187 194 TPP-237 255 223 TPP-669 354 359
TPP-112 184 191 TPP-238 256 223 TPP-871 300 249
TPP-113 184 203 TPP-239 257 223 TPP-872 300 301
TPP-114 184 205 TPP-240 258 223 TPP-876 302 225
TPP-115 206 205 TPP-241 259 223 TPP-879 298 303
TPP-116 208 205 TPP-242 260 223 TPP-891 304 225
TPP-117 210 205 TPP-243 261 223 TPP-892 304 297
TPP-118 212 205 TPP-244 262 223 TPP-894 299 303
TPP-119 184 213 TPP-245 263 223 TPP-1292 216 297
TPP-120 184 214 TPP-246 265 264 TPP-1293 219 225
TPP-121 206 214 TPP-247 265 266 TPP-1294 221 297
TPP-122 208 214 TPP-248 265 267 TPP-1295 324 329
TPP-123 210 214 TPP-249 265 268 TPP-1296 304 224
TPP-124 212 214 TPP-250 265 269 TPP-1297 304 226
TPP-125 184 215 TPP-252 265 270 TPP-1298 334 339
TPP-126 206 215 TPP-253 265 271 TPP-1300 299 228
TPP-127 208 215 TPP-254 265 272 TPP-1301 229 303
TPP-128 210 215 TPP-255 265 273 TPP-1302 299 233
TPP-129 212 215 TPP-256 265 274 TPP-1303 299 235
TPP-207 187 217 TPP-257 265 275 TPP-1304 299 237
TPP-208 218 217 TPP-258 265 276 TPP-1305 229 233
TPP-209 220 217 TPP-259 265 277 TPP-1306 229 235
TPP-210 222 217 TPP-260 265 278 TPP-1307 229 237
TPP-211 187 223 TPP-261 265 279 TPP-1308 299 245
TPP-212 218 225 TPP-262 265 280 TPP-1309 299 248
TPP-213 220 225 TPP-263 265 281 TPP-1332 238 249
TPP-214 230 223 TPP-264 265 282 TPP-1333 364 369
TPP-215 232 231 TPP-265 265 283 TPP-1334 243 249
TPP-216 234 231 TPP-266 265 284
TPP-217 236 231 TPP-267 265 285
在該表中，除了TPP-70、TPP-71、TPP-72、TPP-73及TPP74之外，術語「α鏈」係指包含V α之多肽鏈，亦即衍生自TCR α鏈之可變結構域。術語「β鏈」係指包含V β之多肽鏈，亦即衍生自TCR β鏈之可變結構域。對於TPP-70、TPP-71、TPP-72、TPP-73及TPP74，「α鏈」不包含任何TCR衍生之可變結構域，但是「β鏈」包含兩個TCR衍生可變結構域：一個源自TCR α鏈，另一個源自TCR β鏈。
本揭示案提供了一種用於(製造藥物供)治療轉移或轉移性病變之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白選自TPP-1295、TPP-1298、TPP-230、TPP-669或TPP-1333。
替代地或附加地，提供了一種治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者的方法，該方法包括以一種或多種治療有效劑量投與選自TPP-1298、TPP-1295、TPP-230、TPP-669或TPP-1333之抗原結合蛋白。
根據一個實施例，抗原結合蛋白係TPP-1295，具有以下序列組：
TPP-1295 SEQ ID NO:
CDRa1 320
CDRa2 321
CDRa3 322
CDRb1 325
CDRb2 326
CDRb3 327
Vα 323
Vβ 328
α鏈 324
β鏈 329
根據一個實施例，抗原結合蛋白包括連接在一起形成第一抗原結合域及第二抗原結合域之第一多肽鏈及第二多肽鏈， 其中該第一抗原結合域包括 T細胞受體(T cell receptor；TCR) α可變結構域，該結構域包括 互補決定區(complementary determining region；CDR)a1，該區包含SEQ ID NO:320之胺基酸序列， 視情況地，包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列之CDRa2，及 包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之CDRa3，及 TCR β可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:325之胺基酸序列之CDRb1， 視情況地，包含SEQ ID NO:326之胺基酸序列之CDRb2，及 包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列之CDRb3。
抗原結合蛋白之第一抗原結合域結合至與合適地作為HLA-A*02之MHC分子複合的包括或由SLLQHLIGL之胺基酸序列組成之肽。
抗原結合蛋白可以具有包含SEQ ID NO:323之TCR α可變結構域及包含SEQ ID NO:328之TCR β可變結構域。
抗原結合蛋白可以具有包含SEQ ID NO:324之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO:329之第二多肽鏈。
根據一個實施例，抗原結合蛋白係TPP-1298，具有以下序列組：
TPP-1298 SEQ ID NO:
CDRa1 330
CDRa2 331
CDRa3 332
CDRb1 335
CDRb2 336
CDRb3 337
Vα 333
Vβ 338
α鏈 334
β鏈 339
根據一個實施例，抗原結合蛋白包括連接在一起形成第一抗原結合域及第二抗原結合域之第一多肽鏈及第二多肽鏈， 其中該第一抗原結合域包括 TCR α可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:330之胺基酸序列之CDRa1， 視情況地，包含SEQ ID NO:331之胺基酸序列之CDRa2，及 包含SEQ ID NO:332之胺基酸序列之CDRa3，及 TCR β可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:335之胺基酸序列之CDRb1， 視情況地，包含SEQ ID NO:336之胺基酸序列之CDRb2，及 包含SEQ ID NO:337之胺基酸序列之CDRb3。
抗原結合蛋白之第一抗原結合域結合至與合適地作為HLA-A*02之MHC分子複合的包括或由SLLQHLIGL之胺基酸序列組成之肽。
抗原結合蛋白可以具有包含SEQ ID NO:333之TCR α可變結構域及包含SEQ ID NO:338之TCR β可變結構域。
抗原結合蛋白可以具有包含SEQ ID NO:334之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO:339之第二多肽鏈。
根據一個實施例，抗原結合蛋白係TPP-230，具有以下序列組：
TPP-230 SEQ ID NO:
CDRa1 340
CDRa2 341
CDRa3 342
CDRb1 345
CDRb2 346
CDRb3 347
Vα 343
Vβ 348
α鏈 344
β鏈 349
根據一個實施例，抗原結合蛋白包括連接在一起形成第一抗原結合域及第二抗原結合域之第一多肽鏈及第二多肽鏈， 其中該第一抗原結合域包括 TCR α可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:340之胺基酸序列之CDRa1， 視情況地，包含SEQ ID NO:341之胺基酸序列之CDRa2，及 包含SEQ ID NO:342之胺基酸序列之CDRa3，及 TCR β可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:345之胺基酸序列之CDRb1， 視情況地，包含SEQ ID NO:346之胺基酸序列之CDRb2，及 包含SEQ ID NO:347之胺基酸序列之CDRb3。
抗原結合蛋白之第一抗原結合域結合至與合適地作為HLA-A*02之MHC分子複合的包括或由SLLQHLIGL之胺基酸序列組成之肽。
抗原結合蛋白可以具有包含SEQ ID NO:343之TCR α可變結構域及包含SEQ ID NO:348之TCR β可變結構域。
抗原結合蛋白可以具有包含SEQ ID NO:344之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO:349之第二多肽鏈。
根據一個實施例，抗原結合蛋白係TPP-669，具有以下序列組：
TPP-669 SEQ ID NO:
CDRa1 350
CDRa2 351
CDRa3 352
CDRb1 355
CDRb2 356
CDRb3 357
Vα 353
Vβ 358
α鏈 354
β鏈 359
根據一個實施例，抗原結合蛋白包括連接在一起形成第一抗原結合域及第二抗原結合域之第一多肽鏈及第二多肽鏈， 其中該第一抗原結合域包括 TCR α可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:350之胺基酸序列之CDRa1， 視情況地，包含SEQ ID NO:351之胺基酸序列之CDRa2，及 包含SEQ ID NO:352之胺基酸序列之CDRa3，及 TCR β可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:355之胺基酸序列之CDRb1， 視情況地，包含SEQ ID NO:356之胺基酸序列之CDRb2，及 包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列之CDRb3。
抗原結合蛋白之第一抗原結合域結合至與合適地作為HLA-A*02之MHC分子複合的包括或由SLLQHLIGL之胺基酸序列組成之肽。
抗原結合蛋白可以具有包含SEQ ID NO:353之TCR α可變結構域及包含SEQ ID NO:358之TCR β可變結構域。
抗原結合蛋白可以具有包含SEQ ID NO:354之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO:359之第二多肽鏈。
根據一個實施例，抗原結合蛋白係TPP-1333，具有以下序列組：
TPP-1333 SEQ ID NO:
CDRa1 360
CDRa2 361
CDRa3 362
CDRb1 365
CDRb2 366
CDRb3 367
Vα 363
Vβ 368
α鏈 364
β鏈 369
根據一個實施例，抗原結合蛋白包括連接在一起形成第一抗原結合域及第二抗原結合域之第一多肽鏈及第二多肽鏈， 其中該第一抗原結合域包括 TCR α可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:360之胺基酸序列之CDRa1， 視情況地，包含SEQ ID NO:361之胺基酸序列之CDRa2，及 包含SEQ ID NO:362之胺基酸序列之CDRa3，及 TCR β可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:365之胺基酸序列之CDRb1， 視情況地，包含SEQ ID NO:366之胺基酸序列之CDRb2，及 包含SEQ ID NO:367之胺基酸序列之CDRb3。
抗原結合蛋白之第一抗原結合域結合至與合適地作為HLA-A*02之MHC分子複合的包括或由SLLQHLIGL之胺基酸序列組成之肽。
抗原結合蛋白可以具有包含SEQ ID NO:363之TCR α可變結構域及包含SEQ ID NO:368之TCR β可變結構域。
抗原結合蛋白可以具有包含SEQ ID NO:364之第一多肽鏈及包含SEQ ID NO:369之第二多肽鏈。
本文提供之抗原結合蛋白之純化及品質控制可以如下面所例示來進行。
根據若干實施例，轉移或轉移性病變係選自以下組成之群中之至少一者： • ACC轉移 • BLCA轉移 • BRCA轉移 • TNBC轉移 • CRC轉移 • HNSCC轉移 • HNAC轉移 • MEL轉移 • SKCM轉移 • UVM轉移 • LC轉移 • NSCLC轉移 • NSCLCadeno轉移 • NSCLCsquam轉移 • NSCLCother轉移 • SCLC轉移 • CHOL轉移 • ESCA轉移 • CESC轉移 • OC轉移 • OV轉移 • LIHC轉移 • RCC轉移 • KIRC轉移 • KIRP轉移 • SARC轉移 • FS轉移 • LPS轉移 • MPNST轉移 • SS轉移 • STAD轉移 • TGCT轉移 • THYM轉移 • UCS轉移 • UCEC轉移、及/或 • UEC轉移
根據若干實施例，轉移或轉移性病變源於選自由以下組成之群：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸鱗狀細胞癌、頭頸腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝癌、肝細胞癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉部上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦瘤、涎腺管癌及結外T/NK細胞淋巴瘤。
藉由使用Sartoclear Dynamics ®Lab Filter Aid(Sartorius)來過濾(0.22 µm)，清除經調節之細胞上清液。雙特異性分子使用經配備以內聯地執行親和力及尺寸排阻層析的Äkta Pure 25 L FPLC system (GE Lifesciences)進行純化。根據標準親和層析方案在蛋白L柱(GE Lifesciences)上進行親和層析。在自親和管柱溶離(pH 2.8)之後，遵循標準方案，使用Superdex 200 pg 16/600柱(GE Lifesciences)，直接執行尺寸排阻層析。在NanoDrop系統(Thermo Scientific)上使用根據預測蛋白質序列計算之消光係數決定蛋白質濃度。如果需要，可使用Vivaspin裝置(Sartorius)調整濃度。最後，在2-8℃之溫度下，將純化之分子以約1 mg/mL之濃度儲存在磷酸鹽緩衝鹽水中。在完成純化及配製後計算最終產物產率。
在Vanquish uHPLC系統中，在含有300 mM NaCl之50 mM磷酸鈉pH 6.8中運作的MabPac SEC-1管柱(5 µm，4x300 mm)上，藉由HPLC-SEC測定經純化雙特異性分子之品質。
藉由在40℃下將PBS中配製之分子孵育至多兩週來進行壓力穩定性測試。藉由HPLC-SEC分析來分析完整性、聚集物含量以及單體回收率。
發明人藉由LDH釋放檢定證明，抗原結合蛋白，尤其TCER ®分子，在負載靶肽PRAME-004之T2細胞中引起細胞溶解(表5)。本發明人藉由LDH釋放檢定進一步證明，抗原結合蛋白，尤其TCER ®分子，在PRAME陽性腫瘤細胞株中引起細胞溶解，而PRAME陰性腫瘤細胞株不受與TCER ®子共孵育的影響(第35-37圖)。此等 活體外實驗進一步證明了本發明抗原結合蛋白之安全性，並證明了細胞毒性作用對PRAME陽性腫瘤組織具有高度選擇性。因此，本發明之分子顯示出有益安全特性。
TCER ®Slot III變異體TPP-214、-222、-230、-666、-669、-871、-872、-876、-879、-891、-894之另外特徵係它們能夠殺死負載不同位凖靶肽之T2細胞。將相應濃度之PRAME-004負載T2細胞2 h後，在TCER ®變異體濃度遞增的情況下，以5:1之E:T比率，將負載肽之T2細胞與人類PBMC共培養48 h。使用CytoTox 96非放射性細胞毒性檢定套組(Promega)，將釋放至上清液中之LDH位凖定量。所有TCER ®變異體均顯示，在10 nM之肽負載濃度下，具有亞皮莫耳EC 50值的PRAME-004負載之T2細胞之有效殺傷(第38圖，表5)。隨著PRAME-004負載位凖之降低，EC 50值增加。然而，即使在10 pM之非常低PRAME-004負載濃度下，除TPP-214外，所有TCER ®變異體都能誘導殺傷。 表5：TCER ®Slot III變異體對PRAME-004負載之T2細胞的 活體外細胞毒性。T2細胞與人類PBMC以5:1之E/T比共培養48 h。顯示了PRAME-004負載濃度。使用非線性4點曲線擬合計算平台(頂部)中之Ec 50值及細胞毒性位凖。
TCER ®變異體 募集者 Va, Vb (SEQ ID NO:) 10 nM PRAME-004 1 nM PRAME-004 100 pM PRAME-004 10 pM PRAME-004
EC 50[pM] 頂部 EC 50[pM] 頂部 EC 50[pM] 頂部 EC 50[pM] 頂部
TPP-871 H2C 309, 307 0.13 109 1.6 143 76.5 1 90 361 76
TPP-222 H2C 305, 306 完全殺滅 109 完全殺滅 78 2.8 1 127 58 90
TPP-872 H2C 309, 306 完全殺滅 109 完全殺滅 151 4.3 1 84 49 74
TPP-876 BMA031 (V36)A02 309, 306 0.16 111 2.0 113 24.4 100 539 40
TPP-666 BMA031 (V36)A02 305, 308 0.15 113 2.4 113 39.8 100 182 35
TPP-879 BMA031 (V36)A02 305, 307 0.54 106 6.2 109 94.4 117 1070 39
TPP-214 BMA031 (V36) 305, 306 0.22 108 5.0 109 92.8 102 沒有殺滅 20
TPP-891 BMA031 (V36)D01 309, 306 0.19 120 2.2 112 54.0 125 611 45
TPP-894 BMA031 (V36)D01 305, 307 0.87 108 9.9 115 226.0 129 1084 44
TPP-214 BMA031 (V36) 305, 306 0.26 121 5.4 111 105.4 99 沒有殺滅 23
1重複試驗內之高變異性不允許可靠EC 50計算。
根據本發明之另一態樣，提供了一種包含至少一種活性劑之醫藥組成物，該活性劑選自以下至少一種： • 根據以上描述之肽 • 根據以上描述之抗體或其片段 • 根據以上描述之T細胞受體或其片段 • 根據以上描述之核酸或表現載體 • 根據以上描述之宿主細胞， • 根據以上描述之重組T淋巴球，及/或 • 根據以上描述之活化T淋巴球 及醫藥學上可接受之載劑。該組合物用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
替代地或附加地，提供了一種治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者的方法。
該方法包括以一種或多種治療有效劑量，向患者投與至少一種活性成分，該活性成分選自以下至少一種： • 根據以上描述之肽 • 根據以上描述之抗體或其片段 • 根據以上描述之T細胞受體或其片段 • 根據以上描述之核酸或表現載體 • 根據以上描述之宿主細胞， • 根據以上描述之重組T淋巴球，及/或 • 根據以上描述之活化T淋巴球 以及醫藥學上可接受之載劑。
替代地或附加地，提供了一種用於治療轉移或轉移性病變之醫藥組成物，該組成物包含此活性成分作為有效成分。
在一個實施例中，轉移或轉移性病變為PRAME陽性的。在一個實施例中，轉移或轉移性病變在其至少一個細胞之表面上顯示肽，該肽包含SEQ ID NO: 310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列，或與主要組織相容性複合物結合之該胺基酸。
在一個實施例中，患者對於HLA-A*02呈陽性。此尤其包括單倍型HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、及HLA-A*02:11。在一個實施例中，患者對於HLA-A*02:01呈陽性。
在本發明之不同實施例中，轉移或轉移性病變係選自以下至少一者的至少一種轉移或轉移性病變： • ACC (Adrenocortical Carcinoma；腎上腺皮質癌)轉移 • BLCA (Bladder Urothelial Carcinoma；膀胱尿路上皮癌)轉移 • BRCA (Breast Cancer；乳腺癌)轉移 • TNBC (Triple-Negative Breast Cancer；三陰性乳腺癌)轉移 • CRC (Colorectal Cancer；結直腸癌)轉移 • HNSCC (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma；頭頸部鱗狀細胞癌)轉移 • HNAC (Head and Neck Adenocarcinoma；頭頸部腺癌)轉移 • MEL (Melanoma；黑色素瘤)轉移 • SKCM (Skin Cutaneous Melanoma；皮膚黑色素瘤)轉移 • UVM (Uveal Melanoma；葡萄膜黑色素瘤)轉移 • LC (Lung Cancer；肺癌)轉移 • NSCLC (Non-small Cell Lung Cancer；非小細胞肺癌)轉移 • NSCLCsquam (Non-small Cell Lung Squamous Cell Carcinoma；非小細胞肺鱗狀細胞癌)轉移 • NSCLCadeno (Non-small Cell Lung Adenocarcinoma；非小細胞肺腺癌)轉移 • NSCLCother(不能明確歸屬於NSCLCadeno或NSCLCsquam之NSCLC樣品轉移)轉移 • SCLC (Small Cell Lung Cancer；小細胞肺癌)轉移 • CHOL (Cholangiocarcinoma；膽管癌)轉移 • ESCA (Esophageal Carcinoma；食管癌)轉移 • CESC (Cervical Squamous Cell Carcinoma and Endocervical Adenocarcinoma；宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌)轉移 • OC (Ovarian Carcinoma；卵巢癌)轉移 • OV (Ovarian Serous Cystadenocarcinoma；卵巢漿液性囊腺癌)轉移 • LIHC (Liver Hepatocellular Carcinoma；肝細胞癌)轉移 • RCC (Renal Cell Carcinoma；腎細胞癌)轉移 • KIRC (Kidney Renal Clear Cell Carcinoma；腎透明細胞癌)轉移 • KIRP (Kidney Renal Papillary Cell Carcinoma；腎乳頭狀細胞癌)轉移 • SARC (Sarcoma；肉瘤)轉移 • FS (Fibrosarcoma；纖維肉瘤)轉移 • LPS (Liposarcoma；脂肪肉瘤)轉移 • MPNST (Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor；惡性外周神經鞘腫瘤)轉移 • SS (Synovial Sarcoma；滑膜肉瘤)轉移 • STAD (Stomach Adenocarcinoma；胃腺癌)轉移 • TGCT (Testicular Germ Cell Tumor；睾丸生殖細胞腫瘤)轉移 • THYM (Thymoma；胸腺瘤)轉移 • UCS (Uterine Carcinosarcoma；子宮癌肉瘤)轉移及/或 • UEC (Uterine Endometrial Carcinoma；子宮內膜癌)轉移。
根據進一步實施例，提供了以下內容： 1. 一種產生活化T淋巴球之 活體外方法，該活化T淋巴球特異性地用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者，該方法包括以下步驟：提供由SEQ ID NO:310之胺基酸序列組成之合成或重組肽，將 活體外T細胞與在合適抗原呈遞細胞或模擬抗原呈遞細胞之人工構建體之表面上表現的負載抗原之人類I類主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex；MHC)分子接觸一段足以以抗原特異性方式活化該等T淋巴球之時間，其中該抗原係由SEQ ID NO:310之胺基酸序列組成之肽。 2. 藉由根據第1項之方法產生之活化T淋巴球之細胞株，其特徵在於該細胞株能夠選擇性地識別呈現由SEQ ID NO:310之胺基酸序列組成之肽的轉移細胞。 3. 一種製備可溶性T細胞受體之 活體外方法，其特徵在於該方法包括以下步驟： (i) 選擇表現與HLA配位體結合之T細胞受體的特異性T細胞純系，該HLA配位體由包含SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的合成或重組肽組成，視情況地其中該肽結合至MHC，視情況地其中該T細胞純系係藉由用包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列的肽或用包含該肽的肽-MHC複合物來將對於整個人類TCR基因座而言為轉殖基因的基因工程化非人類哺乳動物進行免疫接種而產生的，視情況地藉由酵母、噬菌體或T細胞展示，例如自TCR或CDR突變體之文庫中選擇特異性T細胞受體，該受體結合至視情況與MHC結合的包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列之合成或重組肽；或 (ii) 選擇與HLA配位體結合之特異性T細胞受體，該配位體由包含SEQ ID NO: 310之胺基酸序列的合成或重組肽組成，視情況地，其中該肽與來自噬菌體展示系統之MHC結合， 其中該T細胞受體藉由結合至包含與MHC分子結合的包含SEQ ID NO:310之肽的肽-MHC複合物而能夠與作為所呈遞轉移細胞的HLA配位體反應，該HLA配位體包含SEQ ID NO:310之肽。 4. 一種用於產生與SEQ ID NO:310之胺基酸序列之肽複合的人類主要組織相容性複合物(MHC) I類特異性結合之重組抗體的 活體外方法，其特徵在於該方法包括以下步驟： (i) 用包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列的肽或用包含該肽的肽-MHC複合物來將對於整個人類免疫球蛋白基因座而言為轉殖基因的基因工程化非人類哺乳動物進行免疫接種； (ii) 自該非人類哺乳動物之抗體產生細胞中分離mRNA分子； (iii) 產生噬菌體展示文庫，該文庫展示由該等mRNA分子編碼之蛋白質分子；及 (iv) 自該噬菌體展示文庫中分離至少一種噬菌體，其中該至少一種噬菌體含有該抗體，該抗體特異性結合至與MHC I類分子結合之包含SEQ ID NO:310之肽； 其中該抗體藉由結合至包含與MHC分子結合的包含SEQ ID NO:310之肽的肽-MHC複合物而能夠特異性識別與該MHC分子複合的SEQ ID NO:310之該肽， 其中該SEQ ID NO:310之肽在轉移細胞表面表現。 5. 一種由SEQ ID NO:310之胺基酸序列組成之肽之醫藥學上可接受之鹽，其特徵在於該鹽係乙酸鹽、三氟乙酸鹽或氯化物。 6. 一種醫藥組成物，該組成物包含根據第2項之方法生產之細胞株、根據第3項之 活體外方法生產之TCR或根據第4項之 活體外法生產之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
根據本發明之另一態樣，提供了一種核酸，其包含編碼至少一種由SLLQHLIGL(SEQ ID NO:310)組成之抗原肽的至少一個編碼序列。
在一個實施例中，核酸包括兩個或兩個以上編碼重複序列(「串聯序列」)，該等重複序列由短核苷酸鏈段(「間隔物」)分隔。
核酸可以係或可以包括，例如，去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid；DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid；RNA)、蘇糖核酸(threose nucleic acid；TNA)、乙二醇核酸(glycol nucleic acid；GNA)、肽核酸(peptide nucleic acid；PNA)、鎖定核酸(locked nucleic acid；LNA，包括具有b-D-核糖構型之LNA、具有a-L-核糖構型之a-LNA (LNA之非鏡像異構物)、具有2’-胺基官能化之2’-胺基-LNA、及具有2’-胺基官能化之2’-胺基-a-LNA)、乙烯核酸(ethylene nucleic acid；ENA)、環己烯核酸(cyclohexenyl nucleic acid；CeNA)及/或嵌合體及/或其組合。
根據一個實施例，核酸係mRNA。
根據一個實施例，mRNA包括5’非翻譯區(untranslated region；UTR)及/或3’UTR。
在幾個實施例中，3'-UTR包含或由核酸序列組成，該核酸序列衍生自選自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1及RPS9之基因的3'-UTR或衍生自此等基因中任一者之同源物、片段或變異體。
在幾個實施例中，5'-UTR包含或由核酸序列組成，該核酸序列衍生自選自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B及UBQLN2之基因的5'-UTR或衍生自此等基因中任一者之同源物、片段或變異體。
在幾個實施例中，5’-UTR及異源3’-UTR選自UTR設計a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-3(SLC7A3/PSMB3)、e-2(RPL31/RPS9)及i-3(-/muag)，其中UTR設計a-1(HSD17B4/PSMB3)及i-3(-/muag)。
根據一個實施例，mRNA包括代替尿苷的經修飾核苷。
根據一個實施例，修飾之核苷選自假尿苷(ψ)、N 1-甲基-假尿苷(m 1Ψ)及5-甲基-尿苷(m5U)。
根據一個實施例，與野生型編碼序列相比，核酸包含密碼子優化及/或其中G/C含量增加且尿苷含量減少之編碼序列，其中密碼子優化及/或G/C含量增加較佳不改變編碼胺基酸序列之序列。
G/C含量優化核酸序列(RNA或DNA)之產生可以使用根據W02002/098443之方法進行。在此背景下，W02002/098443之揭示內容包含在本發明之全部範圍內。
在較佳實施例中，核酸可以被修飾，其中至少一個編碼序列中之密碼子可以適應人類密碼子之使用(在本文中稱為「人類密碼子使用適應編碼序列」)。
編碼相同胺基酸之密碼子在人類中以不同頻率出現。因此，核酸之編碼序列較佳地被修改，使得編碼相同胺基酸之密碼子之頻率對應於根據人類密碼子使用的該密碼子之自然出現頻率。例如，在胺基酸丙胺酸的情況下，野生型或參考編碼序列較佳以如下方式進行調整：密碼子「GCC」以0.40之頻率使用，密碼子「GCT」以0.28之頻率使用、密碼子「GCA」以0.22之頻率使用並且密碼子「GCG」以0.10之頻率使用等。因此，對由核酸編碼序列編碼之每個胺基酸應用此程序(例如對於丙胺酸所例示)，以獲得適合人類密碼子使用之序列。
根據若干實施例，核酸係至少一種選自SEQ ID NO： • 314 (PRAME mRNA) • 315 (PRAME mRNA GC富集) • 316 (PRAME cDNA) • 317 (PRAME 004 mRNA) • 318 (PRAME 004 mRNA GC富集) • 319 (PRAME 004 cDNA)
根據本發明之另一態樣，提供了一種包含根據以上描述之核酸的組成物或醫藥製劑。
在一個實施例中，該組成物不包含編碼作為前列腺特異性膜抗原(Prostate specific Membrane antigen；PSMA)片段之肽的核酸，尤其不編碼PSMA 288-297(GLPSIPVHPI，SEQ ID NO:376)或PSMA 288-297I297V(GLPSIVVHPV，SEQ ID NO:377)。
根據一個實施例，組成物包含具有70%或更大RNA完整性的mRNA。
術語「RNA完整性」通常描述液體組成物中是否存在完整RNA序列。RNA完整性低可以係由於RNA降解、RNA裂解、RNA之不正確或不完全化學合成、不正確鹼基配對、修飾之核苷酸之整合或已整合之核苷酸之修飾、缺乏封蓋或不完全封蓋、缺乏聚腺苷酸化或不完全聚腺苷化、或RNA 活體外轉錄不完全。RNA係一種容易降解的脆弱分子，此情況可能由溫度、核糖核酸酶、pH或其他因素(例如親核攻擊、水解等)引起，從而可能會降低RNA完整性，從而降低RNA之功能性。
根據一個實施例，該組成物包含具有70%或更高之封蓋度的mRNA，較佳其中至少70%、80%或90%之mRNA物質包含Cap1結構。
5'-封蓋多核苷酸可使用以下化學RNA蓋帽類似物，在 活體外轉錄反應期間同時完成，以便根據製造商方案，產生5'-鳥苷蓋帽結構：3'-0-Me-m7G(5')ppp(5') G [ARCA蓋帽]；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA)。修飾RNA之5’-封蓋可以在轉錄後使用Vaccinia Vims封蓋酶完成，以生成「蓋帽0」結構：m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA)。蓋帽1結構可以使用Vaccinia Vims封蓋酶及2’-0甲基轉移酶生成：m7G(5')ppp(5')G-2 '-O-甲基。蓋帽2結構可由蓋帽1結構產生，隨後使用2'-0甲基轉移酶對5'-倒數第三核苷酸進行2'-0-甲基化。蓋帽3結構可由蓋帽2結構產生，隨後使用2'-0甲基轉移酶對5'-倒數第四核苷酸進行2'-0-甲基化。酶可以來源於重組源。
根據若干實施例，該至少一種核酸與一種或多種脂質或基於脂質之載劑複合或結合，從而形成較佳包封該至少一種核酸的脂質體、脂質奈米粒子(lipid nanoparticle；LNP)、脂質複合物及/或奈米脂質體。
根據一個實施例，LNP包括 (i) 至少一種陽離子脂質； (ii) 至少一種中性脂質； (iii) 至少一種類固醇或類固醇類似物；及 (iv) 至少一種聚合物偶聯脂質，較佳PEG脂質。
根據一個實施例，(i)至(iv)之莫耳比為約20-60%陽離子脂質、5-25%中性脂質、25-55%固醇及0.5-15% PEG脂質。
根據若干實施例，陽離子脂質係選自以下之至少一種：
a) SM-102(十七烷-9-基-8-{(2-羥乙基)[6-側氧基-6-(十一烷氧基)己基]胺基}辛酸酯)
b) ALC-0315 ([(4-羥基丁基)氮雜二基]雙(己基-6,1-二基)雙(2-己基癸酸)。
根據若干實施例，聚合物偶聯脂質係選自以下之至少一種：
a) 其中n之平均值範圍為≥ 30至≤ 60，較佳其中n之平均值為44或45，較佳1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG2000 DMG)
b) 其中n之平均值範圍為≥ 30至≤ 60，較佳其中n之平均值為49或45，較佳2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙醯胺(ALC-0159)
根據一個實施例，中性脂質係1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。
根據一個實施例，類固醇或類固醇類似物係膽固醇。
根據一個實施例，該組成物或醫藥製劑係疫苗。
根據本發明之另一個態樣，提供了一種引發對腫瘤或轉移性病變之免疫反應的方法，該腫瘤或轉移性病變在細胞表面呈現包含SLLQHLIGL(SEQ ID NO:310)之肽，該方法包括向患者投與根據以上描述之組成物。
根據本發明之另一態樣，提供了根據以上描述之組成物，用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為在細胞表面上呈現包含SLLQHLIGL(SEQ ID NO:310)之肽的腫瘤或轉移性病變，(ii)患有該腫瘤或轉移性病變或(iii)處於患上該腫瘤或轉移性病變之風險中的患者。
根據其若干實施例，該腫瘤選自腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸鱗狀細胞癌、頭頸腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝癌、肝細胞癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉部上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦瘤、涎腺管癌及結外T/NK細胞淋巴瘤。
根據其若干實施例，轉移性病變係選自以下組中之至少一種： • ACC轉移 • BLCA轉移 • BRCA轉移 • TNBC轉移 • CRC轉移 • HNSCC轉移 • HNAC轉移 • MEL轉移 • SKCM轉移 • UVM轉移 • LC轉移 • NSCLC轉移 • NSCLCadeno轉移 • NSCLCsquam轉移 • NSCLCother轉移 • SCLC轉移 • CHOL轉移 • ESCA轉移 • CESC轉移 • OC轉移 • OV轉移 • LIHC轉移 • RCC轉移 • KIRC轉移 • KIRP轉移 • SARC轉移 • FS轉移 • LPS轉移 • MPNST轉移 • SS轉移 • STAD轉移 • TGCT轉移 • THYM轉移 • UCS轉移 • UCEC轉移、及/或 • UEC轉移。
根據其若干實施例，轉移性病變源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸鱗狀細胞癌、頭頸腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝癌、肝細胞癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉部上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦瘤、涎腺管癌及結外T/NK細胞淋巴瘤。
一種由SEQ ID NO:310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列組成之肽或其醫藥學上可接受之鹽，用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
一種抗體或其功能片段，其特異性識別或結合至如請求項1至3中任一項所述之肽或結合至與MHC分子結合的如請求項1至3中任一項所述之肽，該抗體或其功能片段用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
一種與MHC配位體反應或結合之T細胞受體或其功能片段，其中該配位體係如請求項1至3中任一項所述之肽，或與MHC分子結合的如請求項1至3中任一項所述之肽，該T細胞受體或其功能片段用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
一種編碼如請求項1至3中任一項所述之肽、如請求項4所述之抗體或其片段、如請求項5所述之T細胞受體或其片段的核酸，該核酸用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
一種重組宿主細胞，其包含如請求項1至3中任一項所述之肽、如請求項4所述之抗體或其片段、如請求項5所述之T細胞受體或其片段或如請求項7所述之核酸。
一種重組T淋巴球，其表現至少一種編碼如請求項5所述之T細胞受體的載體，該重組T淋巴球用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
一種產生活化T淋巴球的 活體外方法，該方法包括將 活體外T細胞與在合適抗原呈遞細胞或模擬抗原呈遞細胞之人工構建體之表面上表現的負載抗原之人類I類MHC分子接觸一段足以以抗原特異性方式活化該T淋巴球之時間，其中該抗原係如請求項1至3中任一項所述之肽。
一種藉由如請求項12所述之方法產生的活化T淋巴球，其選擇性地識別呈遞如請求項1至3中任一項所述之肽的細胞，該活化T淋巴球用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
一種醫藥組成物，該組成物包含至少一種選自由以下中之至少一者組成之群的活性劑 • 如請求項1至3中任一項所述之肽， • 如請求項4或14所述之抗體或其片段 • 如請求項5、6或15至21所述之T細胞受體或其片段 • 如請求項7所述之核酸， • 如請求項8所述之宿主細胞， • 如請求項9至11所述之重組T淋巴球，及/或 • 如請求項13所述之活化T淋巴球， 及醫藥學上可接受之載劑，該組成物用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
一種治療在細胞表面上呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之肽的轉移性病變的方法，該方法包括：選擇患有轉移性病變之患者並向該患者投與包含如請求項9至11中任一項所述之重組T淋巴球或藉由如請求項12所述之方法來產生之活化T淋巴球的組成物，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
一種引起對於轉移性病變之免疫反應的方法，該轉移性病變在細胞表面上呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之肽，該方法包括：選擇患有轉移性病變之患者並向該患者投與包含如請求項9至11中任一項所述之重組T淋巴球或藉由如請求項12所述之方法來產生之活化T淋巴球的組成物，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
一種製備T細胞群之方法，包括： • 自PBMC獲得T細胞群； • 活化所獲得T細胞群， • 用如請求項7所述之核酸來轉導經活化之T細胞群， • 擴增經轉導之T細胞群，以及 • 其中在IL-21存在下，進行活化、轉導、擴增或其組合。
一種治療呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之肽的轉移性病變的方法，該方法包括識別轉移性病變並且用結合SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)之T淋巴球群來治療該轉移性病變，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
一種引起對於轉移性病變之免疫反應的方法，該轉移性病變呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之肽，該方法包括：識別轉移性病變並且用結合SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)之T淋巴球群來治療該轉移性病變，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
一種核酸，其包含編碼由SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)組成之至少一種抗原肽的至少一個編碼序列。
一種組成物或醫藥製劑，其包含如請求項32至38中任一項所述之核酸。
一種引發對腫瘤或轉移性病變之免疫反應的方法，該腫瘤或轉移性病變在細胞表面上呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之肽，該方法包括向患者投與如請求項40至49中任一項所述之組成物。
實例
儘管本發明在附圖及前述描述中已被詳細說明及描述，但此類說明及描述應被視為說明性的或示例性的，而非限制性的；本發明不限於所揭示之實施例。藉由對附圖、本揭示案及所附請求項之研究，熟習此項技術者在實踐所要求保護之發明時可以理解及實現所揭示之實施例之其他變化。在請求項中，「包括」一詞不排除其他要素或步驟，不定冠詞「一(個/種)」不排除複數。在相互不同的附屬請求項書中列舉了某些措施，此事實並不表明不能有效地利用此等措施之組合。請求項中之任何參考符號不應被解釋為限制範圍。
本文揭示之所有胺基酸序列自N端至C端顯示；本文揭示之所有核酸序列顯示為5’-＞3’。 實例1：T細胞受體R11P3D3
TCR R11P3D3 (SEQ ID NO:12–23及120)僅限於HLA-A*02所呈現之PRAME-004 (SEQ ID NO:310)(見第3圖)。
R11P3D3特異性地識別PRAME-004，因為在與負載PRAME-004肽或顯示與PRAME-004高度序列相似性之不同肽的HLA-A*02+靶細胞一起共孵育後，重新表現該TCR之人類原代CD8+T細胞釋放IFNγ (第3圖)。NYESO1-001 (SEQ ID NO:311)肽用作陰性對照。對於HLA-A*02所呈現之PRAME-004 (SEQ ID NO:310)，TCR R11P3D3之EC 50為0.74 nM(第10圖)，結合親和力(K D)為18–26 µM。
R11P3D3在人類原代CD8+T細胞中之重新表現導致HLA-A*02/PRAME-004呈遞腫瘤細胞株之選擇性識別及殺傷(第19、20、25及27圖)。TCR R11P3D3對25種經測試健康、原代或iPSC衍生細胞類型中之任何一種都沒有反應(第19及20圖)，並對另外67種類似肽(其中57種與PRAME-004在3、5、6及7位相同)但與HLA-A*02無關之肽(第3、17及18圖)進行了交叉反應性測試。 實例2：T細胞受體R16P1C10
TCR R16P1C10 (SEQ ID NO:24-35及121)僅限於HLA-A*02所呈現之PRAME-004 (SEQ ID NO:310)(見第4圖)。
R16P1C10特異性地識別PRAME-004，因為在與HLA-A*02+靶細胞共孵育後，重新表現該TCR之人類原代CD8+T細胞釋放IFNγ，並且結合HLA-A*02四聚體(第16圖)，該等四聚體分別負載有PRAME-004肽或顯示與PRAME-004高度序列相似性的不同肽(第4圖)。NYESO1-001 (SEQ ID NO:311)肽用作陰性對照。TCR R16P1C10之EC 50為9.6nM (第11圖)。 實例3：T細胞受體R16P1E8
TCR R16P1E8 (SEQ ID NO:36-47及122)僅限於HLA-A*02所呈現之PRAME-004 (SEQ ID NO:310)(見第5圖)。
R16P1E8特異性地識別PRAME-004，因為在與HLA-A*02+靶細胞一起共孵育時，重新表現該TCR之人類原代CD8+T細胞釋放IFNγ，該等靶細胞負載PRAME-004肽或丙胺酸或顯示與PRAME-004高度序列相似性之不同肽(第5圖)。NYESO1-001 (SEQ ID NO:311)肽(SLLMWITQV，SEQ ID NO:311)用作陰性對照。TCR R16P1E8之EC 50約為1 µM(第12圖)。 實例4：T細胞受體R17P1A9
TCR R17P1A9 (SEQ ID NO:48-59及123)僅限於HLA-A*02所呈現之PRAME-004 (SEQ ID NO:310)(見第6圖)。
R17P1A9特異性地識別PRAME-004，因為在與HLA-A*02+靶細胞一起共孵育時，重新表現該TCR之人類原代CD8+T細胞釋放IFNγ，該等靶細胞負載有PRAME-004肽或顯示與PRAME-004高度序列相似性之不同肽(第6圖)。NYESO1-001 (SEQ ID NO:311)肽用作陰性對照。 實例5：T細胞受體R17P1D7
TCR R17P1D7 (SEQ ID NO:60-71及124)僅限於HLA-A*02所呈現之PRAME-004 (SEQ ID NO:310)(見第7圖)。
R17P1D7特異性地識別PRAME-004，因為在與HLA-A*02+靶細胞一起共孵育時，重新表現該TCR之人類原代CD8+T細胞釋放IFNγ，該靶細胞負載PRAME-004肽或丙胺酸或顯示與PRAME-004高度序列相似性之不同肽(第7圖)。NYESO1-001 (SEQ ID NO:311)肽用作陰性對照。TCR R17P1D7之EC 50為1.83 nM (第13圖)。 實例6：T細胞受體R17P1G3
TCR R17P1G3 (SEQ ID NO:72-83及125)僅限於HLA-A*02所呈現之PRAME-004 (SEQ ID NO:310)(見第8圖)。
R17P1G3特異性地識別PRAME-004，因為在與HLA-A*02+靶細胞一起共孵育時，重新表現該TCR之人類原代CD8+T細胞釋放IFNγ，該靶細胞負載PRAME-004肽或顯示與PRAME-004高度序列相似性之不同肽(第8圖)。NYESO1-001 (SEQ ID NO:311)肽用作陰性對照。TCR R17P1G3之EC 50為8.63 nM (第14圖)。 實例7：T細胞受體R17P2B6
TCR R17P2B6 (SEQ ID NO:84-95及126)僅限於HLA-A*02所呈現之PRAME-004 (SEQ ID NO:310)(見第9圖)。
R17P2B6特異性地識別PRAME-004，因為在與HLA-A*02+靶細胞一起共孵育時，重新表現該TCR之人類原代CD8+T細胞釋放IFNγ，該靶細胞負載PRAME-004肽或丙胺酸或顯示與PRAME-004高度序列相似性之不同肽(第9圖)。NYESO1-001 (SEQ ID NO:311)肽用作陰性對照。對於HLA-A*02所呈現之PRAME-004，TCR R17P2B6之EC 50為2.11 nM (第15圖)，結合親和力(K D)為13 µM。 實例8：增強之T細胞受體R11P3D3_KE
突變之「增強配對」TCR R11P3D3_KE作為R11P3D3之變異體引入，其中天然攜帶αW44/βQ44之α及β可變結構域已突變為αK44/βE44。該雙突變選自PCT/EP2017/081745中之列表，以引用方式具體併入本文。它專門被設計用於恢復TCR支架之最佳相互作用及形狀互補性。
與親代TCR R11P3D3相比，增強之TCR R12P3D3_KE顯示出PRAME-004識別之優越敏感性。與親代TCR R11P3D3相比，增強之TCR R12P3D3_KE對PRAME-004呈遞腫瘤細胞株之反應更強(第25圖)。此外，R11P3D3_KE之細胞溶解活性比R11P3D1更強(第27圖)。如實例1 (R11P3D3，K D=18-26µM)及實例8 (R11B3D3_KE，K D=5.3µM)所述，觀察到的增強之TCR R11P3D3_KE之經改良功能反應與對PRAME-004之結合親和力增加完全一致。 實例9：產生癌症靶向雙特異性TCR/mAb雙抗體分子
為了進一步驗證雙特異性TCR/mAb雙抗體構建體之平台能力，將TCR衍生之可變域與TCR之可變域進行交換，根據先前描述之方法(Smith、Harris及Kranz 2015)，藉由酵母展示使該TCR之穩定性/親和力成熟。TCR可變結構域特異性結合與HLA-A*02結合之腫瘤相關肽PRAME-004 (SEQ ID NO:310)。此外，使用UCHT1抗體之人源化型式hUCHT1(Var17)之可變結構域來產生PRAME-004靶向TCR/mAb雙抗體分子IA_5(包括SEQ ID NO:131及SEQ ID NO:132)。對該分子進行表現、純化及表徵。根據HPLC-SEC分析，最終製劑之純度及完整性超過96%。
藉由生物層干涉法測定雙特異性TCR/mAb雙抗體構建體對PRAME-004:HLA-A*02之結合親和力。使用製造商推薦之設置在Octet RED384系統上進行量測。簡言之，在分析HLA-A*02/PRAME-004之系列稀釋液之前，將純化之雙特異性TCR/mAb雙抗體分子負載到生物感測器(AHC)上。
如藉由LDH釋放檢定決定，藉由評估人類CD8陽性T細胞介導的在腫瘤細胞表面上，在HLA-A*02背景下呈現不同拷貝數之PRAME-004肽(UACC-257-約1100，SW982-約780，U2OS-約240個PRAME-004個拷貝/細胞，如藉由定量MS分析決定)的人類癌細胞株UACC-257、SW982及U2OS之裂解，評估此PRAME-004靶向TCR/mAb雙抗體構建體關於誘導腫瘤細胞裂解的活性。
如第28圖所示，PRAME-004靶向TCR/mAb雙抗體構建體IA_5誘導PRAME-004陽性腫瘤細胞株之濃度依賴性裂解。甚至每個腫瘤細胞表現低至240個PRAME-004拷貝數之腫瘤細胞U2OS亦被該TCR/mAb雙抗體分子有效裂解。此等結果進一步證明，TCR/mAb雙抗體格式可用作分子平台，允許引入不同TCR之可變域以及不同T細胞募集抗體之可變域。 實例10：TCR/mAb雙抗體構建體之可工程性
在構建體IA_5中使用之可變TCR結構域在對PRAME-004之親和力及TCR穩定性方面進一步增強，並用於工程化TCR/mAb雙抗體支架，從而產生構建體IA_ 6 (包括SEQ ID NO:133及SEQ ID NO:134)。對TCR/mAb雙抗體分子IA_5及IA_6進行了表現、純化及表徵。根據HPLC-SEC分析，最終製劑之純度及完整性超過97%。
在細胞毒性實驗中評估了穩定性及親和力增強之TCR/mAb雙抗體變異體IA_6對PRAME-004之效力，在該等實驗中呈現低量之PRAME-004:HLA-A*02的腫瘤細胞株U2OS或未負載之T2細胞作為靶細胞，人類CD8陽性T細胞作為效應細胞。
如第29圖所示，發明人觀察到與前驅物構建體IA_5相比，包含穩定性/親和力增強之TCR變異體之可變結構域的TCR/Ab雙抗體分子IA_6之細胞毒性效力增加。對於兩種構建體IA_5及IA_6，可以確認PRAME-004依賴性裂解，因為未偵測到靶陰性T2細胞之細胞裂解。
將蛋白構建體進一步在40℃下經受長達兩週之熱應激，以分析PRAME-004特異性TCR/mAb雙抗體變異體IA_5及IA_6之穩定性。熱應激後之HPLC-SEC分析顯示，與前驅物構建體IA_5相比，變異體IA_6之穩定性顯著提高(見第30圖)。與IA_5相比，對於IA_6而言，溫度誘導之構建體高分子物質(即，在主峰之前溶離)之增加不太明顯。與此結果一致，熱應激後，IA_5及IA_6之完整單體蛋白回收率分別為87%及92%。
此等示例性工程資料表明，藉由結合穩定性/親和力增強之TCR可變結構域，可以進一步改良高效及穩定TCR/mAB雙抗體構建體，從而產生具有極好特性之治療性蛋白。 實例11：成熟TCR變異體之結合親和力
藉由生物層干涉法分析表現為可溶性雙特異性分子之成熟R16P1C10 TCR變異體(穩定、改良：scTCR/抗CD3 Fab格式；穩定、改良CDR6、HiAff1及LoAff3：TCR/抗CD3雙抗體-F c格式)對HLA-A*02/PRAME-004單體之結合親和力。使用製造商推薦之設置在Octet RED384系統上進行量測。簡言之，使用PBS、0.05% Tween-20、0.1% BSA作為緩衝液，在30℃及1000 rpm搖動速度下量測結合動力學。在分析HLA-A*02/PRAME-004之系列稀釋液之前，將雙特異性分子負載到生物感測器(FAB2G或AHC)上。雖然R16P1C10之穩定型式顯示出約1 µM之親和力(scTCR-Fab為1.2 µM，雙抗體-F c為930 nM)，但對於含有成熟CDR之所有變異體，測定之K D值明顯較低(表5，第31圖)。為了進一步驗證TCR變異體之親和力僅在較小程度上受格式的影響，量測作為scTCR-Fab或雙抗體-F c格式的親和力成熟TCR變異體之K D值。scTCR-Fab及雙抗體-F c格式之K D值分別為10 nM及8.7 nM，進一步突出了不同格式之間的良好可比性(表5，第31圖)。 實例12：靶陽性及靶陰性腫瘤細胞株之殺傷
成熟R16P1C10 TCR變異體被表現為採用TCR/抗CD3雙抗體-F c格式之可溶性雙特異性分子。藉由LDH釋放檢定分析了雙特異性分子分別對PRAME陽性及PRAME陰性腫瘤細胞株之細胞毒活性。因此，在雙特異性分子濃度遞增的情況下，將細胞表面呈現可變量HLA-A*02/PRAME-004之腫瘤細胞株與自兩個健康供體分離之CD8+T細胞一起共孵育。48小時後，使用CytoTox 96非放射性細胞毒性偵測套組(PROMEGA)量測靶細胞株之裂解。如第32圖所示，對於所有測試之PRAME陽性細胞株，高效誘導裂解係可偵測的，並且明顯取決於雙特異性分子之濃度。在利用表現HLA-A*02但未以可偵測位凖呈遞肽PRAME-004之細胞株的類似實驗中，第33圖顯示雙特異性分子未誘導或僅誘導靶之最低限度裂解，表明TCR結構域之特異性。 實例13： 活體內療效
成熟R16P1C10 TCR變異體HiAff1及HIV特異性高親和力對照TCR以TCR/抗CD3雙抗體-F c格式表現為可溶性雙特異性分子。在高度免疫缺陷NOG小鼠品系中進行了一項藥效學研究，該研究被設計來測試雙特異性TCR分子募集及引導人類細胞毒性CD3+T細胞對抗PRAME陽性腫瘤細胞株Hs695T之活性的能力。NOG小鼠品系具有皮下注射之人類腫瘤細胞株Hs695T及靜脈內注射之人類外周血單核細胞異種移植物。當單個腫瘤體積達到50 mm 3時，在24小時內移植人類外周血單核細胞(5x10 6細胞/小鼠，靜脈內注射)。在移植人類血細胞後一小時內開始治療。每組4-5只雌性小鼠接受尾靜脈靜脈推注(5 mL/kg體重，每週兩次，最多七次，隨機分組後一天開始)。PRAME靶向雙特異性TCR分子之注射劑量為每次注射0.5 mg/kg體重(第2組)，載體對照組(第1組)使用PBS，陰性對照物質組(第3組)使用HIV靶向對照TCR雙特異性分子(每次注射0.5 mg/kg體重)。在指定時間點，根據用卡尺量測並計算為長度x寬度 2/2之單個腫瘤體積，計算各組之平均腫瘤體積。如第23天，與載體對照組中自65 mm 3之基礎位凖至1266 mm 3及陰性對照物質組中自66 mm 3之基礎位凖至1686 mm 3之增加相比，腫瘤體積自69 mm 3之基礎位凖(隨機分組開始)至409 mm 3的經減少之增加所指示，PRAME靶向雙特異性TCR分子之治療抑制了腫瘤生長(第34圖)。 實例14：可溶性scTCR-Fab分子之生產及表徵
結合PRAME-004:MHC複合物之TCR可變結構域可選自： V A包含或由SEQ ID NO:305之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:306之胺基酸序列組成； V A包含或由SEQ ID NO:305之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:307之胺基酸序列組成； V A包含或由SEQ ID NO:305之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:308之胺基酸序列組成； V A包含或由SEQ ID NO:309之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:306之胺基酸序列組成； V A包含或由SEQ ID NO:309之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:307之胺基酸序列組成；或 V A包含或由SEQ ID NO:309之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:306之胺基酸序列組成。
最佳地，V A包含或由SEQ ID NO:305之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:306之胺基酸序列組成。為了靶向TCR-CD3複合物，可以使用衍生自CD3特異性人源化抗體hUCHT1之V H及V L結構域(Zhu及Carter 1995)，尤其衍生自UCHT1變異體UCHT1-V17、UCHT1-V17opt、UCHT2-V21或UCHT1-V23之V H域及V L域，較佳衍生自UCHT1-V17，更佳包含或由SEQ ID NO:193組成之V H；及包含或由SEQ ID NO:192組成之V L；或者，可以使用源自靶向TCRα/β CD3複合物之抗體BMA031及其人源化型式之V H及V L結構域(Shearman等人，1991)，尤其源自BMA031變異體BMA031(V36)或BMA031(V10)之V H域及V L域，較佳源自BMA031(V36)，更佳包含或由SEQ ID NO:196；或SEQ ID NO:198；(A02)或SEQ ID NO:199；(D01)或SEQ ID NO:200；(A02_H90Y)或SEQ ID NO: 201；(D01_H90Y)組成之V H及包含或由SEQ ID NO:197組成之V L；作為另一種選擇，可以使用源自CD3ε-特異性抗體H2C (描述於EP 2155783)之V H及V L結構域，尤其包含或由SEQ ID NO:202；或SEQ ID NO:207；(N100D)或SEQ ID NO:209；(N100E)或SEQ ID NO:211；(S101A)組成之V H及包含或由SEQ ID NO:204組成之V L。 實例15：細胞表面呈現之腫瘤相關肽之鑑定及定量 組織樣品
患者之組織獲自：BioIVT (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, UK); Bio-Options Inc. (Brea, CA, USA); BioServe (Beltsville, MD, USA); Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, USA); Conversant Bio (Huntsville, AL, USA); Cureline Inc. (Brisbane, CA, USA); DxBiosamples (San Diego, CA, USA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); Indivumed GmbH (Hamburg, Germany); Kyoto Prefectural University of Medicine (KPUM) (Kyoto, Japan); Osaka City University (OCU) (Osaka, Japan); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); Tissue Solutions Ltd (Glasgow, UK); Universität Bonn (Bonn, Germany); Asklepios Clinic St. Georg (Hamburg, Germany); Val d'Hebron University Hospital (Barcelona, Spain); Center for cancer immune therapy (CCIT), Herlev Hospital (Herlev, Denmark); Leiden University Medical Center (LUMC) (Leiden, Netherlands); Istituto Nazionale Tumori 「Pascale」, Molecular Biology and Viral Oncology Unit (Naples, Italy); Stanford Cancer Center (Palo Alto, CA, USA); University Hospital Geneva (Geneva, Switzerland); University Hospital Heidelberg (Heidelberg, Germany); University Hospital Munich (Munich, Germany); University Hospital Tuebingen (Tuebingen, Germany)。
所有患者之書面知情同意書均在手術或屍檢前獲得。切除後立即休克冷凍組織，並儲存至-70℃或更低溫度下分離TUMAP。 自組織樣品中分離HLA肽
使用HLA-A*02特異性抗體BB7.2、HLA-A、-B、-C特異性抗體w6/32、HLA-DR特異性抗體L243及HLA-DP特異性抗體B7/21、CNBr活化之瓊脂糖、酸處理、及超濾，根據稍加修改之方案(Falk等人1991; Seeger等人1999)，藉由自固體組織免疫沉澱獲得休克冷凍組織樣品之HLA肽庫。 質譜分析
藉由反相層析(nanoAcquity UPLC系統，Waters)根據其疏水性分離所獲得之HLA肽池，並在配備ESI源之LTQ Velos及Fusion混合質譜儀(Thermo)中分析溶離肽。將肽池直接負載到填充有1.7 µm C18反相材料(Waters)之分析熔融二氧化矽微毛細管柱(75 µm i.d. x 250 mm)上，流速為400 nL/min。隨後，以300 nL/min之流速，使用自10%至33% B之兩步180分鐘二元梯度分離肽。梯度由溶劑A (水中之0.1%甲酸)及溶劑B (乙腈中之0.1%甲酸)組成。使用鍍金玻璃毛細管(PicoTip，New Objective)引入奈米ESI源。LTQ Orbitrap質譜儀使用TOP5策略以資料相關模式運行。簡言之，在軌道捕獲器(R=30000)中以高質量精度之全掃描開始掃描循環，隨後在軌道捕獲器(R=7500)中對5種最豐富前驅物離子進行MS/MS掃描，動態排除先前選擇之離子。藉由SEQUEST以固定錯誤發現率(q≤0.05)及額外手動控制來解釋串聯質譜。在所鑑定肽序列不確定的情況下，藉由將生成之天然肽片段模式與合成序列相同參考肽之片段模式進行比較來另外驗證。
藉由離子計數，亦即藉由提取及分析LC-MS特徵，進行無標記相對LC-MS定量(Mueller等人，2007)。該方法假設肽之LC-MS信號面積與其在樣品中之豐度相關。藉由電荷狀態反褶積及保留時間比對進一步處理所提取之特徵(Mueller等人，2008；Sturm等人，2008)。最後，將所有LC-MS特徵與序列鑑定結果進行交叉引用，以將不同樣品及組織之定量資料組合為肽呈現概況。根據考慮到技術及生物複製中變異之中心趨勢，定量資料以雙層方式進行標準化。因此，每個鑑定之肽可以與定量資料相關聯，從而允許樣品及組織之間的相對定量。此外，為確保資料一致性及驗證自動分析之準確性，手動檢查為候選肽採集之所有定量資料。計算呈現概況，該概況顯示平均樣品呈現以及重複變異。此等概況將BRCA (breast cancer metastases；乳腺癌轉移)；CCC (cholangiocellular carcinoma metastases；膽管細胞癌轉移)；CRC (colorectal cancer metastases；結直腸癌轉移)；GC (gastric cancer metastases；胃癌轉移)；HCC (hepatocellular carcinoma metastases；肝細胞癌轉移)；HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma metastases；頭頸部鱗狀細胞癌轉移)；MEL (melanoma metastases；黑色素瘤轉移)；NHL (non-Hodgkin lymphoma metastases；非霍奇金淋巴瘤轉移)；NSCLCadeno (non-small cell lung cancer adenocarcinoma metastases；非小細胞肺癌腺癌轉移)；NSCLCsquam (squamous cell non-small cell lung cancer metastases；鱗狀細胞非小細胞肺癌轉移)；OC (ovarian cancer metastases；卵巢癌轉移)；OSCAR (esophageal cancer metastases；食管癌轉移)；PACA (pancreatic cancer metastases；胰腺癌轉移)；PRCA (prostate cancer metastases；前列腺癌轉移)；RCC (renal cell carcinoma metastases；腎癌轉移)；SCLC (small cell lung cancer metastases；小細胞肺癌轉移)；UBC (urinary bladder carcinoma metastases；膀胱癌轉移)；UEC (uterine endometrial cancer metastases；子宮內膜癌轉移)樣品與正常組織樣品之基線並列。SEQ ID NO:310之呈現概況如第40圖所示。該圖僅將在使用HLA特異性抗體處理的對於相應HLA同種異型呈陽性之組織樣品上所鑑定的彼等肽以點形式來顯示。
表6顯示了SEQ ID NO:310之各種適應症上之肽呈現。該表列出了至少鑑定一次相應肽的所有適應症，不管樣品之HLA分型或用於處理該樣品之抗體。 實例16：細胞表面呈現之腫瘤相關肽之絕對定量
結合物(如抗體及/或TCR)之產生係艱辛的過程，可能只針對一些選定靶標進行。在腫瘤相關及特異性肽的情況下，選擇標準包括但不限於呈現在細胞表面之肽的呈現之排他性及密度。除了實例中描述的肽之分離及相對定量外，發明人亦如WO 2016/107740中描述，分析了每個細胞之絕對肽拷貝數。實體腫瘤樣品中每細胞TUMAP拷貝之定量需要所分離TUMAP之絕對定量、TUMAP分離過程之效率及所分析組織樣品之細胞計數。 藉由奈米LC-MS/MS之肽定量
為了藉由質譜準確定量肽，使用兩種不同同位素標記之肽變異體(TUMAP合成過程中包括一種或兩種同位素標記之胺基酸)，為SEQ ID NO:310/PRAME-004生成校準曲線。此等同位素標記之變異體僅在質量上與腫瘤相關肽不同，但在其他物理化學性質上沒有差異(Anderson等人，2012)。對於肽校準曲線，進行了一系列奈米LC-MS/MS量測，以決定滴定(單同位素標記肽)與恆定(雙同位素標記肽)同位素標記肽的MS/MS信號之比。
將雙同位素標記肽(亦稱為內標)進一步添加到每個MS樣品中，並將所有MS信號標準化為內標之MS信號，以消除MS實驗之間的潛在技術差異。
校準曲線在至少三種不同基質中製備，亦即與常規MS樣品相似的天然樣品中之HLA肽溶離液，並且在重複MS運行中量測每種製劑。為了評估，將MS信號標準化為內標之信號，並藉由邏輯迴歸來計算校準曲線。
為了定量組織樣品中之腫瘤相關肽，亦將相應樣品加入內標；將MS信號標準化為內標，並使用肽校準曲線進行定量。 肽-MHC分離之效率
對於任何蛋白質純化過程，自組織樣品中分離蛋白質與感興趣蛋白質之某種損失有關。為了決定TUMAP分離之效率，為所有選擇用於絕對定量之TUMAP生成肽-MHC複合物。為了能夠將加標物與天然肽-MHC複合物區分，使用了TUMAP之單同位素標記型式，亦即TUMAP合成中包含一個同位素標記之胺基酸。此等複合物被摻入新製備組織裂解物中，亦即在TUMAP分離程序之最早可能點，然後在隨後親和純化中像天然肽-MHC複合物一樣被捕獲。因此，量測單個標記TUMAP之回收率可以得出關於單個天然TUMAP分離效率之結論。
在一小組樣品中分析分離效率，並在此等組織樣品中進行比較。相反，各個肽之分離效率不同。此表明，儘管分離效率僅在有限數量之組織樣品中決定，但可以外推到任何其他組織製劑中。然而，有必要單獨分析每個TUMAP，因為分離效率可能無法自一個肽推斷到其他肽。 固體冷凍組織中細胞計數之測定
為了決定經過絕對肽定量之組織樣品的細胞計數，發明人應用了DNA含量分析。該方法適用於各種不同來源之樣品，最重要地冷凍樣品(Alcoser等人，2011；Forsey及Chaudhuri，2009；Silva等人，2013)。在肽分離方案期間，將組織樣品處理成均質裂解物，從中取出小份裂解物。等分試樣分為三部分，從中分離DNA(QiaAmp DNA Mini Kit，Qiagen，Hilden，Germany)。使用基於螢光之DNA定量分析(Qubit dsDNA HS assay Kit，Life Technologies，Darmstadt，Germany)在至少兩個重複中定量來自每個DNA分離的總DNA含量。
為了計算細胞數，已經自幾個供體分離之健康血細胞之等分試樣中生成了DNA標準曲線，該等供體具有一系列定義之細胞數。標準曲線用於自每個DNA分離之總DNA含量計算總細胞含量。然後，考慮已知裂解物等分試樣體積及總裂解物體積，推斷用於肽分離之組織樣品之平均總細胞計數。 每個細胞之肽拷貝數
利用上述實驗之資料，發明人藉由將總肽量除以樣品之總細胞計數，然後藉由分離效率進行分離，計算出每個細胞之TUMAP拷貝數。SEQ ID NO:310之細胞拷貝數如表7所示。 表7：不同轉移中SEQ ID NO:310之細胞拷貝數
實體 每個細胞之拷貝數(中位值) 樣品數
轉移 ++ 15
BRCA met. +++ 2
HNSCC met. +++ 5
MEL met. + 1
NSCLCadeno met. +++ 1
OC met. ++ 4
OSCAR met. + 2
PRCA met. + 1
BRCA met. =乳腺癌轉移 HNSCC met. =頭頸部鱗狀細胞癌轉移 MEL met. =黑素瘤轉移 NSCLCadeno met. =非小細胞肺腺癌轉移 OC met. =卵巢癌轉移 OSCAR met. =食管鱗癌轉移 PRCA met. =前列腺癌轉移 絕對拷貝數：
下表列出了轉移樣品中絕對肽定量之結果。
≥1 - ＜25 = +
≥25 = ++
≥50 = +++
≥75 = ++++
顯示了可獲得可評估高品質MS資料的樣品數量。
國際專利公開案WO2016107740A1及美國專利申請案14/969423中揭示了對肽進行絕對定量的方法之更詳細揭示，該等文獻之內容以引用方式併入本文。 實例17：編碼本發明肽之基因之表現分析
與正常細胞相比，肽在腫瘤細胞上之過度呈遞或特異性呈遞足以證明其在免疫治療中之有用性，並且一些肽具有腫瘤特異性，儘管其源蛋白亦存在於正常組織中。然而，mRNA表現分析在選擇免疫治療之肽靶標方面增加了額外安全性。尤其對於具有高安全性風險之治療選擇，諸如親和力成熟之TCR，理想靶肽將來源於腫瘤特有、在正常組織中未發現之蛋白質。 RNA來源及製備
在獲得每個患者之書面知情同意後，如上所述提供手術切除之組織樣本(見實例1)。腫瘤組織標本在手術後立即快速冷凍，隨後在液氮下用研缽及研杵均質化。使用TRI試劑(Ambion，Darmstadt，Germany)自此等樣品中製備總RNA，然後使用RNeasy (QIAGEN，Hilden，German)進行清理；兩種方法均根據製造商之方案進行。
用於RNASeq實驗之來自健康人類組織之總RNA獲自：Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, UK); Bio-Options Inc. (Brea, CA, USA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); Tissue Solutions Ltd (Glasgow, UK)。
用於RNASeq實驗之來自腫瘤組織之總RNA獲自：Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, UK); BioCat GmbH (Heidelberg, Germany); BioServe (Beltsville, MD, USA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); Istituto Nazionale Tumori 「Pascale」 (Naples, Italy); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); University Hospital Heidelberg (Heidelberg, Germany)。
在Agilent 2100生物分析儀(Agilent，Waldbronn，Germany)上使用RNA 6000 Pico LabChip套組(Agilet)評估所有RNA樣品之品質及數量。 RNAseq實驗
藉由GENEWIZ Germany GmbH(Leipzig, Germany)之下一代測序(RNAseq)對腫瘤及正常組織RNA樣品進行基因表現分析。簡言之，根據製造商之說明書(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)，使用NEBNext ®Ultra™ II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina自總RNA製備測序文庫，包括mRNA選擇、RNA片段化、cDNA轉化及添加測序配接器。為了測序，根據製造商之說明書將文庫多路複用並負載到Illumina NovaSeq 6000測序器(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)上，每個樣品產生至少8000萬150 bp配對末端原始讀數。在品質控制、配接器修剪及映射至參考基因組後，對支援肽之RNA讀數進行計數，並顯示為本發明之肽之示例性表現概況，此等肽在AML (acute myeloid leukemia metastases；急性髓性白血病轉移)；BRCA (breast cancer metastases；乳腺癌轉移)；CCC (cholangiocellular carcinoma metastases；膽管細胞癌轉移)；CRC (colorectal cancer metastases；結直腸癌轉移)；GBC (gallbladder cancer metastases；膽囊癌轉移)；GC (gastric cancer metastases；胃癌轉移)；HCC (hepatocellular carcinoma metastases；肝細胞癌轉移)；HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma metastases；頭頸部鱗狀細胞癌轉移)；MEL (melanoma metastases；黑色素瘤轉移)；NHL (non-Hodgkin lymphoma metastases；非霍奇金淋巴瘤轉移)；NSCLCadeno (non-small cell lung cancer adenocarcinoma metastases；非小細胞肺癌腺癌轉移)；NSCLCother (不能明確歸屬於NSCLCadeno或NSCLCsquam轉移之NSCLC樣品)；NSCLCsquam (squamous cell non-small cell lung cancer metastases；鱗狀細胞非小細胞肺癌轉移)；OC (ovarian cancer metastases；卵巢癌轉移)；OSCAR (esophageal cancer metastases；食管癌轉移)；PACA (pancreatic cancer metastases；胰腺癌轉移)；PRCA (prostate cancer metastases；前列腺癌轉移)；RCC (renal cell carcinoma metastases；腎癌轉移)；SCLC (small cell lung cancer metastases；小細胞肺癌轉移)；UBC (urinary bladder carcinoma metastases；膀胱癌轉移)；UEC (uterine endometrial cancer metastases；子宮內膜癌轉移)中高度過表現或排他性表現(第41圖)。 實例18：轉移性患者衍生異種移植模型之 活體內療效
TCER ®TPP-1295進行了一項藥效學研究，該研究被設計來測試雙特異性TCR分子募集及引導人類細胞毒性CD3+T細胞對抗PRAME陽性腫瘤之活性的能力。最重要地，此等轉移/轉移腫瘤係患者衍生之異種移植物(patient-derived xenograft；PDX)，該等異種移植物為在具有儘可能接近患者 活體內情況之腫瘤生物學的臨床前模型中進行療效測試提供了機會。患者腫瘤之主要遺傳及組織學特性在一定時間內保持不變(在小鼠中傳代)，使得例如在患者反應之預測值方面，PDX模型優於細胞株衍生異種移植物(cell line-derived xenograft；CDX) (Hidalgo等人2014；Johnson等人2001；Gillet等人2011)。
TCER ®TPP-1295之藥效學評估在高度免疫缺陷之NOG小鼠品系及三種不同轉移性PDX模型中進行：PAXF 1657(胰腺癌之肺轉移)、LXFL 1176(非小細胞肺大細胞癌之淋巴結轉移)及LXFA 1125(非小細胞肺腺癌之卵巢轉移)。將人體腫瘤塊皮下(及單側)植入右背側翼，用卡尺量測腫瘤體積，並藉由(長度x寬度 2)/2計算。一旦單個腫瘤體積達到約80 mm 3，將小鼠隨機化並用人類外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)(1x10 7細胞/小鼠，靜脈內注射)進行人源化。為了解決供體間之差異，使用了來自兩個不同健康隨機供體之PBMC (PBMC供體1：第1組及第3組；PBMC供體2：第2組及第4組)。隨機化24小時內開始治療，每組3只雌性小鼠(每個PDX模型1-4組)接受尾靜脈靜脈內推注(5 mL/kg體重)，每週給藥(PAXF 1657：第1、8及15天；LXFL 1176：第1天、8天、15天及22天；LXFA 1125：第1天、8天及15天)。PRAME靶向雙特異性TCER ®分子TPP-1295分子之注射劑量為每次注射0.25 mg/kg體重(第3組及第4組)，而PBS用作對照載體(第1組及第2組)。每週量測兩次單個腫瘤體積(所示時間點見第48、49A及49B圖)。根據單個腫瘤體積，計算各組及治療組之平均腫瘤體積(對照載體[PBS]：第1組及第2組；TCER ®TPP-1295 0.25 mg/kg體重：第3組及第4組)。PRAME靶向雙特異性TCER ®分子之治療抑制了腫瘤生長，此藉由自基礎位凖(隨機分組開始)起腫瘤體積之增加得以減少來表明。在用0.25 mg/kg TCER ®TPP-1295(第3組及第4組)治療之轉移性胰腺癌PDX模型PAXF 1657中，與載體對照(PBS；第1組及第2組)中觀察到的自80 mm 3(第0天之基礎位凖)到1705 mm 3(第20天)之增加相比，平均基礎腫瘤體積自81 mm 3(第0天)變為873 mm 3(第10天)(第48圖)。在用0.25 mg/kg TCER ®TPP-1295(第3組及第4組)治療之轉移性非小細胞肺大細胞癌PDX模型LXFL 1176中，與載體對照(PBS；第1組及第2組)中觀察到的自86 mm 3(第0天)到1065 mm 3(第30天)之生長相比，平均基礎腫瘤體積自83 mm 3(第0天)變為122 mm 3(第30天)(第49A圖)。在用0.25 mg/kg TCER ®TPP-1295(第3組及第4組)治療之轉移性非小細胞肺腺癌PDX模型LXFA 1125中，與載體對照組(PBS；第1組及第2組)中觀察到的自144 mm 3(第0天)到707 mm 3(第34天)之生長相比，平均基礎腫瘤體積自145 mm 3(第0天)變為261 mm 3(第34天)(第49B圖)。
此等資料令人信服地表明，用本文揭示之藥物治療PRAME陽性轉移或轉移性病變係有前途的選擇。 實例19：PRAME之免疫組織化學(Immunohistochemical；IHC)染色
根據製造商之說明書在自動IHC染色系統(Leica Bond Max)上進行染色。使用以下方案對FFPE組織樣品進行染色： •在60℃下烘烤 •在60℃下脫蠟3× •酒精沖洗，3× •黏結劑清洗，3×每次5分鐘 •表位檢索，100℃下20分鐘 •在35℃下進行4×持續3分鐘的黏結劑清洗 •過氧化物阻斷，1×持續5分鐘 •黏結劑清洗，3×每次5分鐘 •PRAME染色PRAME純系EPR20330，abcam)，15分鐘 •黏結劑清洗，3× •初次後(聚HRP抗小鼠)，8分鐘 •黏結劑清洗，3×持續2分鐘 •聚合物(聚HRP抗兔IgG)，8分鐘 •黏結劑清洗，2×持續2分鐘 •去離子水，1× •DAB定義，10分鐘 •去離子水，3× •蘇木精，8分鐘 •去離子水，1× •黏結劑清洗，1× •去離子水，1× •用cytoseal，將載玻片及蓋玻片脫水
結果如第51及52圖所示。 實例20–TCER ®變異體( Slot III) 生產率及壓力穩定性
編碼選定TCER ®變異體及參考TCER® TPP-1109 (SEQ ID NO:374及375)之DNA構建體用於藉由電穿孔(MaxCyte)轉染CHO-S細胞，以瞬時表現及產生TCER ®變異體。然後獲得相應TCER ®變異體之生產率及壓力穩定性資料。藉由使用Sartoclear Dynamics ®Lab Filter Aid(Sartorius)來過濾(0.22 µm)，清除經調節之細胞上清液。雙特異性分子使用經配備以內聯地執行親和力及尺寸排阻層析的Äkta Pure 25 L FPLC system (GE Lifesciences)進行純化。根據標準親和層析方案在蛋白L柱(GE Lifesciences)上進行親和層析。在自親和管柱溶離(pH 2.8)之後，遵循標準方案，使用Superdex 200 pg 16/600柱(GE Lifesciences)，直接執行尺寸排阻層析。在NanoDrop系統(Thermo Scientific)上使用根據預測蛋白質序列計算之消光係數決定蛋白質濃度。如果需要，可使用Vivaspin裝置(Sartorius)調整濃度。最後，在2-8℃之溫度下，將純化之分子以約1 mg/mL之濃度儲存在磷酸鹽緩衝鹽水中。在完成純化及配製後計算最終產物產率。在Vanquish uHPLC系統中，在含有300 mM NaCl之50 mM磷酸鈉pH 6.8中運作的MabPac SEC-1管柱(5 µm，4x300 mm)上，藉由HPLC-SEC測定經純化雙特異性分子之品質。藉由在40℃下將PBS中配製之分子孵育至多兩週來進行壓力穩定性測試。如上所述，藉由HPLC-SEC分析來分析完整性、聚集物含量以及單體回收率。結果如表8所示。 表8：slot III之TCER ®分子之生產率及壓力穩定性資料匯總。
TCER ®變異體 募集者 最終產物產率(mg/L) 單體 (%) 在40℃下14天後的單體(%)
TPP-230 ID4 73.8 98.83 95.13
TPP-669 BMA31(V36)D01 72.9 97.83 94.66
TPP-1109 UCHT1-V17 13.6 98.10 92.62
親和力、特異性及效力
在LDH釋放試驗中評估了TCER ®分子對HLA-A*02陽性腫瘤細胞株之殺傷能力，此等細胞株在其細胞表面呈現不同位凖之PRAME-004靶肽。此外，評估了HLA-A*02陽性但PRAME-004陰性之腫瘤細胞株(如T98G)，以表徵TCER ®變異體之非特異性或靶外活性。腫瘤細胞株與來自健康HLA-A*02陽性供體之PBMC效應物以1:10之比率在TCER ®濃度遞增的情況下共同孵育。共培養48小時後，藉由量測釋放之LDH來量化TCER ®誘導之細胞毒性。利用非線性4點曲線擬合計算劑量-反應曲線之EC 50值。在使用不同HLA-A*02陽性PBMC供體的不同實驗中，測定了兩種PRAME-004陽性腫瘤細胞株(Hs695T及U2OS)及一種PRAME-004陰性腫瘤細胞株(T98G)之EC 50值。與Hs695T及U2OS相比，T98G之EC 50值增加了約100倍。
藉由生物層干涉法分析TCER ®Slot III變異體TPP-230及TPP-669與靶肽-HLA複合物(HLA-A*02/PRAME-004)之結合親和力。在30℃下在Octet HTX系統上進行量測。使用PBS、0.05% Tween-20、0.1% BSA作為檢定緩衝液，以16通道模式在HIS1K生物感測器上以3 mm之感測器偏移及5 Hz之採集速率進行檢定。重複以下檢定步驟序列以量測所有結合親和力：再生(5 s，10 mM甘胺酸pH 1.5)/中和(5 s，檢定緩衝液；一個再生循環由四次重複的再生/中和組成)、基線(60 s，檢定緩衝液)、負載(120 s，10 µg/ml肽-HLA)、基線(120 s，檢定緩衝液)、締合(300 s，TCER ®之兩倍系列稀釋，範圍為100 nM至1.56 nM或50 nM至0.78 nM，檢定緩衝液作為參考)、解離(300 s，檢定緩衝液)。使用Octet資料分析HT軟體進行資料評估。進行參考感測器減法以減去負載到生物感測器上之肽-HLA之潛在解離(藉由負載有在緩衝液中量測之肽-HLA之生物感測器)。將資料跡線與基線對齊(最後5秒之平均值)，對解離步驟進行步驟間校正，應用Savitzky-Golay濾波，並使用1:1結合模型全域擬合曲線(R max未被感測器鏈接)。發現強結合親和力(表9)。此外，測定了四種先前鑑定之潛在靶外肽的結合親和力：SMARCD1-001 (SEQ ID NO:370)、VIM-009 (SEQ ID NO:371)、FARSA-001 (SEQID NO:372)及GIMAP8-001 (SEQ ID NO:373)。與靶肽-HLA之結合相比，計算K D窗口。在30℃下在Octet RED384或HTX系統上進行量測。使用PBS、0.05% Tween-20、0.1% BSA作為檢定緩衝液，以16通道模式在HIS1K生物感測器上以3 mm之感測器偏移及5 Hz之採集速率進行檢定。重複以下檢定步驟序列以量測所有結合親和力：再生(5 s，10 mM甘胺酸pH 1.5)/中和(5 s，檢定緩衝液；一個再生循環由四次重複的再生/中和組成)、基線(60 s，檢定緩衝液)、負載(120 s，10 µg/ml肽-HLA)、基線(120 s，檢定緩衝液)、締合(300 s，TCER ®之兩倍系列稀釋，範圍為500 nM至7.81 nM，檢定緩衝液作為參考)、解離(300 s，檢定緩衝液)。使用Octet資料分析HT軟體進行資料評估。進行參考感測器減法以減去負載到生物感測器上之肽-HLA之潛在解離(藉由負載有在緩衝液中量測之相應肽-HLA之生物感測器)。將資料跡線與基線對齊(最後5秒之平均值)，對解離步驟進行步驟間校正，應用Savitzky-Golay濾波，並使用1:1結合模型全域擬合曲線(R max未被感測器鏈接)。總之，對於顯示至少60倍至甚至完全沒有結合之窗口的所有變異體而言，與靶肽相比，發現與潛在靶外肽之結合明顯較弱。對於VIM-009，最小量測K D窗口＞100倍(表9)。因此，與VIM-009之結合係不相關的，基於其與VIM-099之結合信號，NOMAP-3-1408結合之親和力測定被認為係不必要的。對於一個相互作用，計算了50倍的K D窗口。然而，對於此相互作用以及其他幾個相互作用，擬合演算法計算之R max值太低，因此假設相互作用比計算的弱，因此窗口更大。各自的相互作用如表9所示。為了進一步分析不同變異體之特異性，藉由量測靶肽-HLA複合物以及位置1、3、4、5、6、7、8之丙胺酸取代變異體之親和力來決定結合模體。在30℃下在Octet HTX系統上進行量測。使用PBS、0.05% Tween-20、0.1% BSA作為檢定緩衝液，以16或8通道模式在HIS1K生物感測器上以3 mm之感測器偏移及5 Hz之採集速率進行檢定。重複以下檢定步驟序列以量測所有結合親和力：再生(5 s，10 mM甘胺酸pH 1.5)/中和(5 s，檢定緩衝液；一個再生循環由四次重複的再生/中和組成)、基線(60 s，檢定緩衝液)、負載(120 s，10 µg/ml肽-HLA)、基線(120 s，檢定緩衝液)、締合(150 s，TCER ®之兩倍系列稀釋，範圍為400 nM至6.25 nM，檢定緩衝液作為參考)、解離(300 s，檢定緩衝液)。使用Octet資料分析HT軟體進行資料評估。進行參考感測器減法以減去負載到生物感測器上之肽-HLA之潛在解離(藉由負載有在緩衝液中量測之相應肽-HLA之生物感測器)。將資料跡線與基線對齊(最後5秒之平均值)，對解離步驟進行步驟間校正，應用Savitzky-Golay濾波，並使用1:1結合模型全域擬合曲線(R max未被感測器鏈接)。一個位置被認為係親和力或結合信號至少降低2倍的結合模體之一部分(針對所分析最高濃度來量測)。所有測試之TCER ®變異體均顯示出廣泛結合模體，可識別至少四個及最多所有分析之肽位置(表10)。對於bA84、aN114L及bA110S/bT115A，觀察到對結合模體之積極影響，此與先前資料一致。為了進行比較，分析了替代PRAME-004靶向TCER ®參考分子(TPP-1109，SEQ ID NO:374及375)之結合模體。該TCER ®識別肽之5-8位，因此結合僅限於該肽段，而TCER ®Slot III變異體識別之位置更均勻地分佈在整個肽中。
TCER ®Slot III變異體TPP-230及TPP-669之另外特徵係它們能夠殺死負載不同位凖靶肽之T2細胞。將相應濃度之PRAME-004負載T2細胞2 h後，在TCER ®變異體濃度遞增的情況下，以5:1之E:T比率，將負載肽之T2細胞與人類PBMC共培養48 h。使用CytoTox 96非放射性細胞毒性檢定套組(Promega)，將釋放至上清液中之LDH位凖定量。所有TCER ®變異體均顯示，在10 nM之肽負載濃度下，具有亞皮莫耳EC 50值的PRAME-004負載之T2細胞之有效殺傷(表11)。隨著PRAME-004負載位凖之降低，EC 50值增加。然而，即使在10 pM之非常低PRAME-004負載濃度下，TCER ®變異體TPP-230及TPP-669亦能誘導殺傷。 表9：藉由TCER ®Slot III變異體之生物層干涉量測法量測的與HLA-A*02/PRAME-004結合之K D值及四種選定靶外肽之K D窗口。
TCER ®變異體 募集者 PRAME-004 K D(M) K DFARSA-001/ K DPRAME-004 K DGIMAP8-001/ K DPRAME-004 K DSMARCD1-001/ K DPRAME-004 K DVIM-009/ K DPRAME-004
TPP-230 ID4 3.05E-09 - 120 1 130 1 -
TPP-669 BMA031(V36)D01 3.65E-09 83 1 50 1 84 165
1 預計 K D 窗口將高於表中給出之值 ( 由於總的較低結合信號，此等相互作用之計算 R max 值太低 ) 。表10：結合至HLA-A*02/PRAME-004之K D值及用於結合模體測定之Ala取代肽變異體之K D窗口，藉由TCER ®Slot III變異體之生物層干涉法量測。對於位置5，K D窗口之臨限值為100。對此位置之識別至少係100倍。
TCER ®變異體 募集者 PRAME-004 K D, 模體(M) 結合模體 K DAla/靶標
A1 A3 A4 A5 A6 A7 A8
TPP-230 ID4 3.03E-09 -x3-5678x 1.2 12.2 1.7 100.0 3.9 25.5 3.0
TPP-669 BMA031 (V36)D01 3.28E-09 -x3-5678x 1.1 9.1 1.2 100.0 2.5 11.0 2.4
TPP-1109 UCHT1-V17 2.47E-09 -x--5678x 0.9 0.8 1.2 49.0 7.9 55.7 4.1
表11：TCER ®Slot III變異體對PRAME-004負載T2細胞之 活體外細胞毒性。T2細胞與人類PBMC以5:1之E/T比共培養48 h。顯示了PRAME-004負載濃度。使用非線性4點曲線擬合計算平台(頂部)中之Ec 50值及細胞毒性位凖。
TCER ®變異體 募集者 10 nM PRAME-004 1 nM PRAME-004 100 pM PRAME-004 10 pM PRAME-004
EC 50[pM] 頂部 EC 50[pM] 頂部 EC 50[pM] 頂部 EC 50[pM] 頂部
TPP-230 ID4 0.09 109 0.9 139 23.2 1 179 145 80
TPP-669 BMA031 (V36)D01 0.22 124 3.2 108 84.0 126 246 31
1 重複試驗內之高變異性不允許可靠 EC 50 計算。安全性評估
在星形細胞及心肌細胞(來源於誘導之多能幹細胞)以及主動脈內皮細胞、間充質幹細胞及氣管平滑肌細胞之殺傷實驗中，評估了TCER ®分子TPP-230之安全性。在TCER ®濃度遞增的情況下，上述正常細胞類型(均表現HLA-A*02)與來自健康HLA-A*02+供體之PBMC效應細胞以1:10之比率(靶細胞:效應細胞)進行共培養。將細胞在相應正常組織細胞培養基及T細胞培養基之1:1混合物中或單獨在T細胞培養液(LDH-AM)中共培養。共培養48小時後，收集上清液，用LDH-Glo™ 套件(Promega)測定乳酸去氫酶(lactate dehydrogenase；LDH)釋放，評估TCER ®誘導之正常組織細胞裂解。為了決定安全窗口，將TCER ®分子與PRAME-004陽性腫瘤細胞株Hs695T在正常組織細胞培養基及T細胞培養基之1:1混合物中共同孵育，然後評估LDH釋放。
即使在最高TCER ®濃度為100 nM時，TPP-230亦未觀察到對正常組織細胞之細胞毒性。與所測試TCER ®分子為100 pM時表現出明顯裂解，甚至在10 pM濃度下表現出裂解的Hs695T腫瘤細胞相比，100 nM濃度下之正常組織細胞裂解表明TPP-230之安全窗口超過1000倍。 實例21–TCER ®變異體(Slot IV) 生產率及壓力穩定性
編碼選定TCER ®變異體之DNA構建體用於藉由電穿孔(MaxCyte)轉染CHO-S細胞，以瞬時表現及產生TCER ®變異體。然後獲得相應TCER ®變異體之生產率及壓力穩定性資料。如上文實例20所述進行分子之純化、配製及初始表徵(生產率及壓力穩定性)。結果如表12所示。 表12：slot IV之TCER ®分子之生產率及壓力穩定性資料匯總。
TCER ®變異體 募集者 最終產物產率(mg/L) 單體 (%) 在40℃ 下14 天後的單體(%)
TPP-1295 BMA031(V36)D01_H90Y 56.5 94.89 91.49
TPP-1298 BMA031(V36)D01 68.1 94.41 89.7
TPP-1333 ID4變異體 61.1 98.52 95.51
親和力、特異性及效力
在LDH釋放試驗中評估了TCER ®分子對HLA-A*02陽性腫瘤細胞株之殺傷能力，此等細胞株在其細胞表面呈現不同位凖之PRAME-004靶肽。此外，評估了HLA-A*02陽性但PRAME-004陰性之腫瘤細胞株(如T98G)，以表徵TCER ®變異體之非特異性或靶外活性。腫瘤細胞株與來自健康HLA-A*02陽性供體之PBMC效應物以1:10之比率在TCER ®濃度遞增的情況下共同孵育。共培養48小時後，藉由量測釋放之LDH來量化TCER ®誘導之細胞毒性。利用非線性4點曲線擬合計算劑量-反應曲線之EC 50值。PRAME-004陽性腫瘤細胞株U2OS及PRAME-004-陰性腫瘤細胞株(T98G)之EC 50值在不同PBMC供體之不同實驗中測定，並總結在表13中。 表13：slot IV之TCER ®分子獲得之LDH釋放檢定資料匯總。
TCER ®變異體 HBC-1005相比於U2OS的EC 50[pM] HBC-1005相比於T98G的EC 50[pM] HBC-848相比於U2OS的EC 50[pM] HBC-848相比於T98G的EC 50[pM]
TPP-1295 150 ＞100,000 663 ＞100,000
TPP-1298 48 37,953 249 ＞100,000
TPP-1333 226 ＞100,000 719 ＞100,000
藉由生物層干涉法分析TCER ®Slot IV變異體TPP-1295、TPP-1298及TPP-1333與靶肽-HLA複合物(HLA-A*02/PRAME-004)之結合親和力。在30℃下在Octet HTX系統上進行量測。使用PBS、0.05% Tween-20、0.1% BSA作為檢定緩衝液，以16通道模式在HIS1K生物感測器上以3 mm之感測器偏移及5 Hz之採集速率進行檢定。重複以下檢定步驟序列以量測所有結合親和力：再生(5 s，10 mM甘胺酸pH 1.5)/中和(5 s，檢定緩衝液；一個再生循環由四次重複的再生/中和組成)、基線(60 s，檢定緩衝液)、負載(120 s，10 µg/ml肽-HLA)、基線(120 s，檢定緩衝液)、締合(300 s，TCER ®之兩倍系列稀釋，範圍為100 nM至1.56 nM或50 nM至0.78 nM，檢定緩衝液作為參考)、解離(300 s，檢定緩衝液)。使用Octet資料分析HT軟體進行資料評估。進行參考感測器減法以減去負載到生物感測器上之肽-HLA之潛在解離(藉由負載有在緩衝液中量測之肽-HLA之生物感測器)。將資料跡線與基線對齊(最後5秒之平均值)，對解離步驟進行步驟間校正，應用Savitzky-Golay濾波，並使用1:1結合模型全域擬合曲線(R max未被感測器鏈接)。發現強結合親和力(表14)。此外，測定了兩種先前鑑定之潛在靶外肽：IFIT-001及MCMB-002之結合親和力。與靶肽-HLA之結合相比，計算K D窗口。在30℃下在Octet RED384或HTX系統上進行量測。使用PBS、0.05% Tween-20、0.1% BSA作為檢定緩衝液，以16通道模式在HIS1K生物感測器上以3 mm之感測器偏移及5 Hz之採集速率進行檢定。重複以下檢定步驟序列以量測所有結合親和力：再生(5 s，10 mM甘胺酸pH 1.5)/中和(5 s，檢定緩衝液；一個再生循環由四次重複的再生/中和組成)、基線(60 s，檢定緩衝液)、負載(120 s，10 µg/ml肽-HLA)、基線(120 s，檢定緩衝液)、締合(300 s，TCER ®之兩倍系列稀釋，範圍為500 nM至7.81 nM，檢定緩衝液作為參考)、解離(300 s，檢定緩衝液)。使用Octet資料分析HT軟體進行資料評估。進行參考感測器減法以減去負載到生物感測器上之肽-HLA之潛在解離(藉由負載有在緩衝液中量測之相應肽-HLA之生物感測器)。將資料跡線與基線對齊(最後5秒之平均值)，對解離步驟進行步驟間校正，應用Savitzky-Golay濾波，並使用1:1結合模型全域擬合曲線(R max未被感測器鏈接)。總之，對於顯示至少10倍至甚至完全沒有結合之窗口的所有變異體而言，與靶肽相比，發現與潛在靶外肽之結合明顯較弱。各自的相互作用如表14所示。為了進一步分析變異體TPP-1295、TPP-1298及TPP-1333之特異性，藉由量測靶肽-HLA複合物以及位置1、3、4、5、6、7、8之丙胺酸取代變異體之親和力來決定結合模體。在30℃下在Octet HTX系統上進行量測。使用PBS、0.05% Tween-20、0.1% BSA作為檢定緩衝液，以16或8通道模式在HIS1K生物感測器上以3 mm之感測器偏移及5 Hz之採集速率進行檢定。重複以下檢定步驟序列以量測所有結合親和力：再生(5 s，10 mM甘胺酸pH 1.5)/中和(5 s，檢定緩衝液；一個再生循環由四次重複的再生/中和組成)、基線(60 s，檢定緩衝液)、負載(120 s，10 µg/ml肽-HLA)、基線(120 s，檢定緩衝液)、締合(150 s，TCER ®之兩倍系列稀釋，範圍為400 nM至6.25 nM，檢定緩衝液作為參考)、解離(300 s，檢定緩衝液)。使用Octet資料分析HT軟體進行資料評估。進行參考感測器減法以減去負載到生物感測器上之肽-HLA之潛在解離(藉由負載有在緩衝液中量測之相應肽-HLA之生物感測器)。將資料跡線與基線對齊(最後5秒之平均值)，對解離步驟進行步驟間校正，應用Savitzky-Golay濾波，並使用1:1結合模型全域擬合曲線(R max未被感測器鏈接)。一個位置被認為係親和力或結合信號至少降低2倍的結合模體之一部分(針對所分析最高濃度來量測)。所有測試之TCER ®變異體均顯示出廣泛結合模體，可識別至少五個及最多所有分析之肽位置(表15)。 表14：藉由TCER ®Slot IV變異體之生物層干涉量測法量測的與HLA-A*02/PRAME-004結合之K D值及兩種選定靶外肽之K D窗口。
TCER ®變異體 PRAME-004 K D(M) K DIFIT-001/ K DPRAME-004 K DMCMB-002/ K DPRAME-004
TPP-1295 3.39E-09 45.2 28.6
TPP-1298 2.47E-09 24.1 17.2
TPP-1333 2.94E-09 27.3 16.0
表15：藉由TCER ®Slot IV變異體之生物層干涉法量測的與HLA-A*02/PRAME-004結合之K D值及用於結合模體測定之Ala取代肽變異體之K D窗口。對於位置5，K D窗口之臨限值為100。對此位置之識別至少係100倍。
TCER ®變異體 PRAME-004 K D, 模體(M) 結合模體 K DAla/靶標
A1 A3 A4 A5 A6 A7 A8
TPP-1295 3.87E-09 1x345678x 2.2 21.8 2.8 20.7 5.2 35.3 5.0
TPP-1298 2.87E-09 -x3-5678x 1.4 10.3 1.6 100.0 2.9 9.6 2.8
TPP-1333 2.60E-09 -x3-5678x 1.4 12.8 2.0 100.0 3.9 21.0 3.7
安全性評估
在對星形細胞、GABA能神經元及心肌細胞(分別來源於誘導之多能幹細胞；iHA、iHN及iHCM)以及肺纖維母細胞(pulmonary fibroblast；HPF)、心臟微血管內皮細胞(cardiac microvascular endothelial cell；HCMEC)、皮膚微血管內皮細胞(dermal microvascular endothelial cell；HDMEC)、主動脈內皮細胞(aortic endothelial cell；HAoEC)、冠狀動脈平滑肌細胞(coronary artery smooth muscle cell；HCASMC)、腎皮質上皮細胞(renal cortical epithelial cell；HRCEpC)及氣管平滑肌細胞(tracheal smooth muscle cell；HTSMC)之殺傷實驗中，評估了TCER ®分子TPP-1295、TPP-1298及TPP-1333之安全性。此外，測試了來自 Slot III之TPP-669。在TCER ®濃度遞增的情況下，以1:10之比率(靶細胞:效應細胞)進行上述正常細胞類型(均表現HLA-A*02)與來自健康HLA-A*02+供體之PBMC效應細胞之共培養。將細胞在相應正常組織細胞培養基及T細胞培養基之1:1混合物中或單獨在T細胞培養液(LDH-AM)中共培養。共培養48小時後，收集上清液，用LDH-Glo™ 套件(Promega)測定LDH釋放，評估TCER ®誘導之正常組織細胞裂解。為了決定安全窗口，將TCER ®分子與PRAME-004陽性腫瘤細胞株Hs695T在正常組織細胞培養基及T細胞培養基之1:1混合物中共同孵育，然後評估LDH釋放。
在濃度為10 nM TCER ®之前，未觀察到任何測試分子對正常組織細胞之細胞毒性。與在所有測試TCER ®分子為100 pM時表現出明顯裂解，而對於一些分子甚至在10 pM濃度下表現出裂解的Hs695T腫瘤細胞相比，100 nM濃度下之正常組織細胞裂解表明安全窗口超過1000倍(TPP-1295、TPP-1298)。 參考文獻 Allison, James P., and Matthew F. Krummel. 1995. 「The Yin and Yang of T Cell Costimulation.」 Science270 (5238): 932–932. https://doi.org/10.1126/science.270.5238.932. Brossart, Peter, and Michael J Bevan. 1997. 「Presentation of Exogenous Protein Antigens on Major Histocompatability Complex Class I Molecules by Dendritic Cells: Pathway of Presentation and Regulation by Cytokines.」 Blood90 (4): 1594–99. https://doi.org/10.1182/blood.v90.4.1594. Campo, Ana B. del, Jon Amund Kyte, Javier Carretero, Svitlana Zinchencko, Rosa Méndez, Gloria González‐Aseguinolaza, Francisco Ruiz‐Cabello, et al. 2014. 「Immune Escape of Cancer Cells with Beta2‐microglobulin Loss over the Course of Metastatic Melanoma.」 International Journal of Cancer134 (1): 102–13. https://doi.org/10.1002/ijc.28338. Chang, A. Y., T. Dao, R. S. Gejman, C. A. 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以下序列構成本申請案之揭示內容之一部分。本申請案亦提供了與WIPO ST26相容之電子序列表。為避免疑義，如果下表中之序列與電子序列表之間存在差異，則本表中之序列應視為正確。
在某些情況下，信號肽可能包含在再現序列中。在此情況下，序列應被視為在有或無信號肽的情況下得以揭示。丹斯克技術大學(Dansk Technical University)在https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP處提供的SignalP-6.0係一種容易獲得的工具，用於識別給定蛋白質序列中之信號肽 表16：序列
SEQ ID 標識符 序列
1 CD8α1 MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV
2 CD8α2 MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGCYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV
3 m1CD8α MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPASVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV
4 m2CD8α MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGCYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPASVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV
5 CD8β1 MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSVLQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQPQGEGISGTFVPQCLHGYYSNTTTSQKLLNPWILKT
6 CD8β2 MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSVLQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGLKGKVYQEPLSPNACMDTTAILQPHRSCLTHGS
7 CD8β3 LQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQFYK
8 CD8β4 LQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQLRLHPLEKCSRMDY
9 CD8β5 LQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQKFNIVCLKISGFTTCCCFQILQISREYGFGVLLQKDIGQ
10 CD8β6 LQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQKFNIVCLKISGFTTCCCFQILQISREYGFGVLLQKDIGQ
11 CD8β7 LQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQPQGEGISGTFVPQCLHGYYSNTTTSQKLLNPWILKT
12 R11P3D3αCDR1 SSNFYA
13 R11P3D3αCDR2 MTL
14 R11P3D3αCDR3 CALYNNNDMRF
15 R11P3D3α 可變域 MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCALYNNNDMRFGAGTRLTVKP
16 R11P3D3α 恆定域 NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
17 R11P3D3α 全長 MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCALYNNNDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
18 R11P3D3βCDR1 SGHNS
19 R11P3D3βCDR2 FNNNVP
20 R11P3D3βCDR3 CASSPGSTDTQYF
21 R11P3D3β 可變域 MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGSTDTQYFGPGTRLTVL
22 R11P3D3β 恆定域 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
23 R11P3D3β 全長 MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGSTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
24 R16P1C10αCDR1 DRGSQS
25 R16P1C10αCDR2 IY
26 R16P1C10αCDR3 CAAVISNFGNEKLTF
27 R16P1C10α 可變域 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAVISNFGNEKLTFGTGTRLTIIP
28 R16P1C10α 恆定域 NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
29 R16P1C10α 全長 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAVISNFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
30 R16P1C10βCDR1 SGHRS
31 R16P1C10βCDR2 YFSETQ
32 R16P1C10βCDR3 CASSPWDSPNEQYF
33 R16P1C10β 可變域 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSPWDSPNEQYFGPGTRLTVT
34 R16P1C10β 恆定域 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
35 R16P1C10β 全長 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSPWDSPNEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
36 R16P1E8αCDR1 NSAFQY
37 R16P1E8αCDR2 TY
38 R16P1E8αCDR3 CAMSEAAGNKLTF
39 R16P1E8α 可變域 MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMSEAAGNKLTFGGGTRVLVKP
40 R16P1E8α 恆定域 NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
41 R16P1E8α 全長 MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMSEAAGNKLTFGGGTRVLVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
42 R16P1E8βCDR1 SGHAT
43 R16P1E8βCDR2 FQNNGV
44 R16P1E8βCDR3 CASSYTNQGEAFF
45 R16P1E8β 可變域 MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSYTNQGEAFFGQGTRLTVV
46 R16P1E8β 恆定域 EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
47 R16P1E8β 全長 MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSYTNQGEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
48 R17P1A9αCDR1 DRGSQS
49 R17P1A9αCDR2 IY
50 R17P1A9αCDR3 CAVLNQAGTALIF
51 R17P1A9α 可變域 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVLNQAGTALIFGKGTTLSVSS
52 R17P1A9α 恆定域 NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
53 R17P1A9α 全長 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVLNQAGTALIFGKGTTLSVSSNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
54 R17P1A9βCDR1 SGDLS
55 R17P1A9βCDR2 YYNGEE
56 R17P1A9βCDR3 CASSAETGPWLGNEQFF
57 R17P1A9β 可變域 MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSAETGPWLGNEQFFGPGTRLTVL
58 R17P1A9β 恆定域 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
59 R17P1A9β 全長 MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSAETGPWLGNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
60 R17P1D7αCDR1 TSESDYY
61 R17P1D7αCDR2 QEAY
62 R17P1D7αCDR3 CAYRWAQGGSEKLVF
63 R17P1D7α 可變域 MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYRWAQGGSEKLVFGKGTKLTVNP
64 R17P1D7α 恆定域 YIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
65 R17P1D7α 全長 MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYRWAQGGSEKLVFGKGTKLTVNPYIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
66 R17P1D7βCDR1 MGHDK
67 R17P1D7βCDR2 SYGVNS
68 R17P1D7βCDR3 CATELWSSGGTGELFF
69 R17P1D7β 可變域 MTIRLLCYMGFYFLGAGLMEADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWYQQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSQYLCATELWSSGGTGELFFGEGSRLTVL
70 R17P1D7β 恆定域 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
71 R17P1D7β 全長 MTIRLLCYMGFYFLGAGLMEADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWYQQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSQYLCATELWSSGGTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
72 R17P1G3αCDR1 DRGSQS
73 R17P1G3αCDR2 IY
74 R17P1G3αCDR3 CAVGPSGTYKYIF
75 R17P1G3α 可變域 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVGPSGTYKYIFGTGTRLKVLA
76 R17P1G3α 恆定域 NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
77 R17P1G3α 全長 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVGPSGTYKYIFGTGTRLKVLANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
78 R17P1G3βCDR1 MNHEY
79 R17P1G3βCDR2 SMNVEV
80 R17P1G3βCDR3 CASSPGGSGNEQFF
81 R17P1G3β 可變域 MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSPGGSGNEQFFGPGTRLTVL
82 R17P1G3β 恆定域 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
83 R17P1G3β 全長 MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSPGGSGNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
84 R17P2B6αCDR1 DRGSQS
85 R17P2B6αCDR2 IY
86 R17P2B6αCDR3 CAVVSGGGADGLTF
87 R17P2B6α 可變域 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVVSGGGADGLTFGKGTHLIIQP
88 R17P2B6α 恆定域 YIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
89 R17P2B6α 全長 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVVSGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
90 R17P2B6βCDR1 PRHDT
91 R17P2B6βCDR2 FYEKMQ
92 R17P2B6βCDR3 CASSLGRGGQPQHF
93 R17P2B6β 可變域 MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSLGRGGQPQHFGDGTRLSIL
94 R17P2B6β 恆定域 EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
95 R17P2B6β 全長 MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSLGRGGQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
96 1G4αCDR1 DSAIYN
97 1G4αCDR2 IQS
98 1G4αCDR3 CAVRPTSGGSYIPTF
99 1G4α 可變域 METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHP
100 1G4α 恆定域 YIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
101 1G4α 全長 METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
102 1G4βCDR1 MNHEY
103 1G4βCDR2 SVGAGI
104 1G4βCDR3 CASSYVGNTGELFF
105 1G4β 可變域 MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVL
106 1G4β 恆定域 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
107 1G4β 全長 MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
108 R11P3D3_KEαCDR1 SSNFYA
109 R11P3D3_KEαCDR2 MTL
110 R11P3D3_KEαCDR3 CALYNNNDMRF
111 R11P3D3_KEα 可變域 MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRKETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCALYNNNDMRFGAGTRLTVKP
112 R11P3D3_KEα 恆定域 NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
113 R11P3D3_KEα 全長 MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRKETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCALYNNNDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
114 R11P3D3_KEβCDR1 SGHNS
115 R11P3D3_KEβCDR2 FNNNVP
116 R11P3D3_KEβCDR3 CASSPGSTDTQYF
117 R11P3D3_KEβ 可變域 MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGSTDTQYFGPGTRLTVL
118 R11P3D3_KEβ 恆定域 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
119 R11P3D3_KEβ 全長 MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGSTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
120 R11P3D3αCDR2bis MTLNGDE
121 R16P1C10αCDR2bis IYSNGD
122 R16P1E8αCDR2bis TYSSGN
123 R17P1A9αCDR2bis IYSNGD
124 R17P1D7αCDR2bis QEAYKQQ
125 R17P1G3αCDR2bis IYSNGD
126 R17P2B6αCDR2bis IYSNGD
127 1G4αCDR2bis IQSSQRE
128 R11P3D3_KEα CDR2bis MTLNGDE
129 IgG1分子之鉸鏈(指示EU編號)以E216開始 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
130 Fc域可以包含一個CH2域，該CH2域包含至少一種效應功能沉默突變 ELLGGP
131 IA_5R16P1C10I hUCHT1(Var17) QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYFSLLIRDSQPSDSATYLCAAVIDNSNGGILTFGTGTRLTIIPNIQNGGGSGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
132 IA_5R16P1C10I hUCHT1(Var17) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPIPGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYVHGAERNKGNFPGRFSGRQFSNSSSEMNISNLELGDSALYLCASSPWDSPNEQYFGPGTRLTVTEDLKNEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
133 IA_6R16P1C10I#6 hUCHT1(Var17) QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAVIDNDQGGILTFGTGTRLTIIPNIQNGGGSGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
134 IA_6R16P1C10I# 6hUCHT1(Var17) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPIPGHRAVSWYQQTPGQGLQFLFEYVHGEERNKGNFPGRFSGRQFSNSSSEMNISNLELGDSALYLCASSPWDSPNVQYFGPGTRLTVTEDLKNEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
135 αCDRa1 DRGSQS
136 αCDRa1 DRGSQL
137 αCDRa2 IYSNGD
138 αCDRa2 IYQEGD
139 αCDRa3 CAAVINNPSGGMLTF
140 αCDRa3 CAAVIDNSNGGILTF
141 αCDRa3 CAAVIDNPSGGILTF
142 αCDRa3 CAAVIDNDQGGILTF
143 αCDRa3 CAAVIPNPPGGKLTF
144 αCDRa3 CAAVIPNPGGGALTF
145 αCDRa3 CAAVIPNSAGGRLTF
146 αCDRa3 CAAVIPNLEGGSLTF
147 αCDRa3 CAAVIPNRLGGYLTF
148 αCDRa3 CAAVIPNTDGGRLTF
149 αCDRa3 CAAVIPNQRGGALTF
150 αCDRa3 CAAVIPNVVGGILTF
151 αCDRa3 CAAVITNIAGGSLTF
152 αCDRa3 CAAVIPNNDGGYLTF
153 αCDRa3 CAAVIPNGRGGLLTF
154 αCDRa3 CAAVIPNTHGGPLTF
155 αCDRa3 CAAVIPNDVGGSLTF
156 αCDRa3 CAAVIENKPGGPLTF
157 αCDRa3 CAAVIDNPVGGPLTF
158 αCDRa3 CAAVIPNNNGGALTF
159 αCDRa3 CAAVIPNDQGGILTF
160 αCDRa3 CAAVIPNVVGGQLTF
161 αCDRa3 CAAVIPNSYGGLLTF
162 αCDRa3 CAAVIPNDDGGLLTF
163 αCDRa3 CAAVIPNAAGGLLTF
164 αCDRa3 CAAVIPNTIGGLLTF
165 αCDRa3 CAAVIPNTRGGLLTF
166 βCDRb1 SGHRS
167 βCDRb1 PGHRA
168 βCDRb1 PGHRS
169 βCDRb2 YFSETQ
170 βCDRb2 YVHGEE
171 βCDRb2 YVHGAE
172 βCDRb3 CASSPWDSPNEQYF
173 βCDRb3 CASSPWDSPNVQYF
174 scTCR-Fab EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYQEGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAVIDNDQGGILTFGTGTRLTIIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPIPGHRAVSWYQQTPGQGLQFLFEYVHGEERNKGNFPGRFSGRQFSNSSSEMNISNLELGDSALYLCASSPWDSPNVQYFGPGTRLTVTEDLKN
175 scTCR-Fab DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
176 雙抗體-Fc QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYQEGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAVIDNDQGGILTFGTGTRLTIIPNIQNGGGSGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
177 雙抗體-Fc EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPIPGHRAVSWYQQTPGQGLQFLFEYVHGEERNKGNFPGRFSGRQFSNSSSEMNISNLELGDSALYLCASSPWDSPNVQYFGPGTRLTVTEDLKNEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
178 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
179 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPTREFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGVEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNNDMRFGAGTRLTVKPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVIQSPRHLVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGSTDTQYFGPGTRLTVL
180 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPTKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGREKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNNDMRFGAGTRLTVKPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVIQSPRHLVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGATDTQYFGPGTRLTVL
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303 QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGGGSGGGGGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGATDKQYFGPGTRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
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305 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNYDMRFGAGTRLTVKP
306 GVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNDSFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGATDKQYFGPGTRLTVL
307 GVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGATDKQYFGPGTRLTVL
308 GVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNDSFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGSTDAQYFGPGTRLTVL
309 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNLDMRFGAGTRLTVKP
310 PRAME-004 SLLQHLIGL
311 NY-ESO1-001 SLLMWITQV
312 KRT5-004 STASAITPSV
313 PRAME (UniProt P78395) MERRRLWGSIQSRYISMSVWTSPRRLVELAGQSLLKDEALAIAALELLPRELFPPLFMAAFDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHLETFKAVLDGLDVLLAQEVRPRRWKLQVLDLRKNSHQDFWTVWSGNRASLYSFPEPEAAQPMTKKRKVDGLSTEAEQPFIPVEVLVDLFLKEGACDELFSYLIEKVKRKKNVLRLCCKKLKIFAMPMQDIKMILKMVQLDSIEDLEVTCTWKLPTLAKFSPYLGQMINLRRLLLSHIHASSYISPEKEEQYIAQFTSQFLSLQCLQALYVDSLFFLRGRLDQLLRHVMNPLETLSITNCRLSEGDVMHLSQSPSVSQLSVLSLSGVMLTDVSPEPLQALLERASATLQDLVFDECGITDDQLLALLPSLSHCSQLTTLSFYGNSISISALQ SLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPN
314 PRAME mRNA (1527個核苷酸，其中有370個U) AUGGAACGAAGGCGUUUGUGGGGUUCCAUUCAGAGCCGAUACAUCAGCAUGAGUGUGUGGACAAGCCCACGGAGACUUGUGGAGCUGGCAGGGCAGAGCCUGCUGAAGGAUGAGGCCCUGGCCAUUGCCGCCCUGGAGUUGCUGCCCAGGGAGCUCUUCCCGCCACUCUUCAUGGCAGCCUUUGACGGGAGACACAGCCAGACCCUGAAGGCAAUGGUGCAGGCCUGGCCCUUCACCUGCCUCCCUCUGGGAGUGCUGAUGAAGGGACAACAUCUUCACCUGGAGACCUUCAAAGCUGUGCUUGAUGGACUUGAUGUGCUCCUUGCCCAGGAGGUUCGCCCCAGGAGGUGGAAACUUCAAGUGCUGGAUUUACGGAAGAACUCUCAUCAGGACUUCUGGACUGUAUGGUCUGGAAACAGGGCCAGUCUGUACUCAUUUCCAGAGCCAGAAGCAGCUCAGCCCAUGACAAAGAAGCGAAAAGUAGAUGGUUUGAGCACAGAGGCAGAGCAGCCCUUCAUUCCAGUAGAGGUGCUCGUAGACCUGUUCCUCAAGGAAGGUGCCUGUGAUGAAUUGUUCUCCUACCUCAUUGAGAAAGUGAAGCGAAAGAAAAAUGUACUACGCCUGUGCUGUAAGAAGCUGAAGAUUUUUGCAAUGCCCAUGCAGGAUAUCAAGAUGAUCCUGAAAAUGGUGCAGCUGGACUCUAUUGAAGAUUUGGAAGUGACUUGUACCUGGAAGCUACCCACCUUGGCGAAAUUUUCUCCUUACCUGGGCCAGAUGAUUAAUCUGCGUAGACUCCUCCUCUCCCACAUCCAUGCAUCUUCCUACAUUUCCCCGGAGAAGGAAGAGCAGUAUAUCGCCCAGUUCACCUCUCAGUUCCUCAGUCUGCAGUGCCUGCAGGCUCUCUAUGUGGACUCUUUAUUUUUCCUUAGAGGCCGCCUGGAUCAGUUGCUCAGGCACGUGAUGAACCCCUUGGAAACCCUCUCAAUAACUAACUGCCGGCUUUCGGAAGGGGAUGUGAUGCAUCUGUCCCAGAGUCCCAGCGUCAGUCAGCUAAGUGUCCUGAGUCUAAGUGGGGUCAUGCUGACCGAUGUAAGUCCCGAGCCCCUCCAAGCUCUGCUGGAGAGAGCCUCUGCCACCCUCCAGGACCUGGUCUUUGAUGAGUGUGGGAUCACGGAUGAUCAGCUCCUUGCCCUCCUGCCUUCCCUGAGCCACUGCUCCCAGCUUACAACCUUAAGCUUCUACGGGAAUUCCAUCUCCAUAUCUGCCUUGCAG AGUCUCCUGCAGCACCUCAUCGGGCUGAGCAAUCUGACCCACGUGCUGUAUCCUGUCCCCCUGGAGAGUUAUGAGGACAUCCAUGGUACCCUCCACCUGGAGAGGCUUGCCUAUCUGCAUGCCAGGCUCAGGGAGUUGCUGUGUGAGUUGGGGCGGCCCAGCAUGGUCUGGCUUAGUGCCAACCCCUGUCCUCACUGUGGGGACAGAACCUUCUAUGACCCGGAGCCCAUCCUGUGCCCCUGUUUCAUGCCUAAC
315 GC富集PRAME mRNA (1527個核苷酸，其中有265個U) AUGGAACGAAGGCGCUUGUGGGGCUCCAUCCAGAGCCGAUACAUCAGCAUGAGCGUGUGGACAAGCCCACGGAGACUCGUGGAGCUGGCAGGGCAGAGCCUGCUGAAGGACGAGGCCCUGGCCAUCGCCGCCCUGGAGUUGCUGCCCAGGGAGCUCUUCCCGCCACUCUUCAUGGCAGCCUUCGACGGGAGACACAGCCAGACCCUGAAGGCAAUGGUGCAGGCCUGGCCCUUCACCUGCCUCCCCCUGGGAGUGCUGAUGAAGGGACAACACCUCCACCUGGAGACCUUCAAAGCCGUGCUCGACGGACUCGACGUGCUCCUCGCCCAGGAGGUCCGCCCCAGGAGGUGGAAACUCCAAGUGCUGGACUUACGGAAGAACUCCCACCAGGACUUCUGGACCGUAUGGUCCGGAAACAGGGCCAGCCUGUACUCAUUCCCAGAGCCAGAAGCAGCCCAGCCCAUGACAAAGAAGCGAAAAGUAGACGGCUUGAGCACAGAGGCAGAGCAGCCCUUCAUCCCAGUAGAGGUGCUCGUAGACCUGUUCCUCAAGGAAGGCGCCUGCGACGAAUUGUUCUCCUACCUCAUCGAGAAAGUGAAGCGAAAGAAAAACGUACUACGCCUGUGCUGCAAGAAGCUGAAGAUCUUCGCAAUGCCCAUGCAGGACAUCAAGAUGAUCCUGAAAAUGGUGCAGCUGGACUCCAUCGAAGACUUGGAAGUGACCUGCACCUGGAAGCUACCCACCUUGGCGAAAUUCUCCCCCUACCUGGGCCAGAUGAUCAACCUGCGCAGACUCCUCCUCUCCCACAUCCACGCAUCCUCCUACAUCUCCCCGGAGAAGGAAGAGCAGUACAUCGCCCAGUUCACCUCCCAGUUCCUCAGCCUGCAGUGCCUGCAGGCCCUCUACGUGGACUCCUUAUUCUUCCUCAGAGGCCGCCUGGACCAGUUGCUCAGGCACGUGAUGAACCCCUUGGAAACCCUCUCAAUAACCAACUGCCGGCUCUCGGAAGGGGACGUGAUGCACCUGUCCCAGAGCCCCAGCGUCAGCCAGCUAAGCGUCCUGAGCCUAAGCGGGGUCAUGCUGACCGACGUAAGCCCCGAGCCCCUCCAAGCCCUGCUGGAGAGAGCCUCCGCCACCCUCCAGGACCUGGUCUUCGACGAGUGCGGGAUCACGGACGACCAGCUCCUCGCCCUCCUGCCCUCCCUGAGCCACUGCUCCCAGCUCACAACCUUAAGCUUCUACGGGAACUCCAUCUCCAUAUCCGCCUUGCAG AGCCUCCUGCAGCACCUCAUCGGGCUGAGCAACCUGACCCACGUGCUGUACCCCGUCCCCCUGGAGAGCUACGAGGACAUCCACGGCACCCUCCACCUGGAGAGGCUCGCCUACCUGCACGCCAGGCUCAGGGAGUUGCUGUGCGAGUUGGGGCGGCCCAGCAUGGUCUGGCUCAGCGCCAACCCCUGCCCCCACUGCGGGGACAGAACCUUCUACGACCCGGAGCCCAUCCUGUGCCCCUGCUUCAUGCCCAAC
316 PRAME cDNA ATGGAACGAAGGCGTTTGTGGGGTTCCATTCAGAGCCGATACATCAGCATGAGTGTGTGGACAAGCCCACGGAGACTTGTGGAGCTGGCAGGGCAGAGCCTGCTGAAGGATGAGGCCCTGGCCATTGCCGCCCTGGAGTTGCTGCCCAGGGAGCTCTTCCCGCCACTCTTCATGGCAGCCTTTGACGGGAGACACAGCCAGACCCTGAAGGCAATGGTGCAGGCCTGGCCCTTCACCTGCCTCCCTCTGGGAGTGCTGATGAAGGGACAACATCTTCACCTGGAGACCTTCAAAGCTGTGCTTGATGGACTTGATGTGCTCCTTGCCCAGGAGGTTCGCCCCAGGAGGTGGAAACTTCAAGTGCTGGATTTACGGAAGAACTCTCATCAGGACTTCTGGACTGTATGGTCTGGAAACAGGGCCAGTCTGTACTCATTTCCAGAGCCAGAAGCAGCTCAGCCCATGACAAAGAAGCGAAAAGTAGATGGTTTGAGCACAGAGGCAGAGCAGCCCTTCATTCCAGTAGAGGTGCTCGTAGACCTGTTCCTCAAGGAAGGTGCCTGTGATGAATTGTTCTCCTACCTCATTGAGAAAGTGAAGCGAAAGAAAAATGTACTACGCCTGTGCTGTAAGAAGCTGAAGATTTTTGCAATGCCCATGCAGGATATCAAGATGATCCTGAAAATGGTGCAGCTGGACTCTATTGAAGATTTGGAAGTGACTTGTACCTGGAAGCTACCCACCTTGGCGAAATTTTCTCCTTACCTGGGCCAGATGATTAATCTGCGTAGACTCCTCCTCTCCCACATCCATGCATCTTCCTACATTTCCCCGGAGAAGGAAGAGCAGTATATCGCCCAGTTCACCTCTCAGTTCCTCAGTCTGCAGTGCCTGCAGGCTCTCTATGTGGACTCTTTATTTTTCCTTAGAGGCCGCCTGGATCAGTTGCTCAGGCACGTGATGAACCCCTTGGAAACCCTCTCAATAACTAACTGCCGGCTTTCGGAAGGGGATGTGATGCATCTGTCCCAGAGTCCCAGCGTCAGTCAGCTAAGTGTCCTGAGTCTAAGTGGGGTCATGCTGACCGATGTAAGTCCCGAGCCCCTCCAAGCTCTGCTGGAGAGAGCCTCTGCCACCCTCCAGGACCTGGTCTTTGATGAGTGTGGGATCACGGATGATCAGCTCCTTGCCCTCCTGCCTTCCCTGAGCCACTGCTCCCAGCTTACAACCTTAAGCTTCTACGGGAATTCCATCTCCATATCTGCCTTGCAG AGTCTCCTGCAGCACCTCATCGGGCTGAGCAATCTGACCCACGTGCTGTATCCTGTCCCCCTGGAGAGTTATGAGGACATCCATGGTACCCTCCACCTGGAGAGGCTTGCCTATCTGCATGCCAGGCTCAGGGAGTTGCTGTGTGAGTTGGGGCGGCCCAGCATGGTCTGGCTTAGTGCCAACCCCTGTCCTCACTGTGGGGACAGAACCTTCTATGACCCGGAGCCCATCCTGTGCCCCTGTTTCATGCCTAAC
317 PRAME 004 mRNA AGUCUCCUGCAGCACCUCAUCGGGCUG
318 GC enriched PRAME 004 mRNA AGCCUCCUGCAGCACCUCAUCGGGCUG
319 PRAME 004 cDNA AGTCTCCTGCAGCACCTCATCGGGCTG
320 TPP-1295αCDR1 VKEFQD
321 TPP-1295αCDR2 FGPYGKE
322 TPP-1295αCDR3 ALYNNYDMR
323 TPP-1295α 可變域 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNYDMRFGAGTRLTVKP
324 TPP-1295α全長 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNYDMRFGAGTRLTVKPGGGSGGGGEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPRNDVTKYAEKFQGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGSYYDYEGFVYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
325 TPP-1295βCDR1 SGHNS
326 TPP-1295βCDR2 FQNTAV
327 TPP-1295βCDR3 ASSPGATDKQY
328 TPP-1295β 可變域 GVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGATDKQYFGPGTRLTVL
329 TPP-1295β 全長 QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGGGSGGGGGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGATDKQYFGPGTRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
330 TPP-1298αCDR1 VKEFQD
331 TPP-1298αCDR2 FGPYGKE
332 TPP-1298αCDR3 ALYNNYDMR
333 TPP-1298α 可變域 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNYDMRFGAGTRLTVKP
334 TPP-1298α 全長 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNYDMRFGAGTRLTVKPGGGSGGGGEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPRNDVTKYAEKFQGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVHYCARGSYYDYEGFVYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
335 TPP-1298βCDR1 SGHNS
336 TPP-1298 βCDR2 FQNTAV
337 TPP-1298 βCDR3 ASSAGSTDAQY
338 TPP-1298β 可變域 GVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNDSFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSAGSTDAQYFGPGTRLTVL
339 TPP-1298β 全長 QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGGGSGGGGGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNDSFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSAGSTDAQYFGPGTRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
340 TPP-230αCDR1 VKEFQD
341 TPP-230αCDR2 FGPYGKE
342 TPP-230αCDR3 ALYNNYDMR
343 TPP-230α 可變域 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNYDMRFGAGTRLTVKP
344 TPP-230α 全長 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNYDMRFGAGTRLTVKPGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
345 TPP-230βCDR1 SGHNS
346 TPP-230βCDR2 FQNTAV
347 TPP-230βCDR3 ASSPGATDKQY
348 TPP-230β 可變域 GVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGATDKQYFGPGTRLTVL
349 TPP-230β 全長 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGSGGGGGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGATDKQYFGPGTRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
350 TPP-669αCDR1 VKEFQD
351 TPP-669αCDR2 FGPYGKE
352 TPP-669αCDR3 ALYNNYDMR
353 TPP-669α 可變域 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNYDMRFGAGTRLTVKP
354 TPP-669α 全長 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNYDMRFGAGTRLTVKPGGGSGGGGEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPRNDVTKYAEKFQGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVHYCARGSYYDYEGFVYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
355 TPP-669βCDR1 SGHNS
356 TPP-669βCDR2 FQNTAV
357 TPP-669βCDR3 ASSPGSTDAQY
358 TPP-669β 可變域 GVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNDSFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGSTDAQYFGPGTRLTVL
359 TPP-669β 全長 QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGGGSGGGGGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNDSFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGSTDAQYFGPGTRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
360 TPP-1333αCDR1 VKEFQD
361 TPP-1333αCDR2 FGPYGKE
362 TPP-1333αCDR3 ALYNNYDMR
363 TPP-1333α 可變域 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNYDMRFGAGTRLTVKP
364 TPP-1333α 全長 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTKFTCSFPVKEFQDLHWYRKETAKSPEFLFYFGPYGKEKKKGRISATLNTKEGYSYLYITDSQPEDSATYLCALYNNYDMRFGAGTRLTVKPGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGESYISYWAYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
365 TPP-1333βCDR1 SGHNS
366 TPP-1333βCDR2 FQNTAV
367 TPP-1333βCDR3 ASSPGATDKQY
368 TPP-1333β 可變域 GVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGATDKQYFGPGTRLTVL
369 TPP-1333β 全長 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGSGGGGGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETPMQGLELLIYFQNTAVIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGATDKQYFGPGTRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
370 SMARCD1-001 IIINHVISV
371 VIM-009 SLNLRETNL
372 FARSA-001 LTLGHLMGV
373 GIMAP8-001 KLLKNLIGI
374 TPP-1109全長1 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPIPGHRAVSWYQQTPGQGLQFLFEYVHGEERNKGNFPGRFSGRQFSNSSSEMNISNLELGDSALYLCASSPWDSPNVQYFGPGTRLTVTEDLKNEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
375 TPP-1109全長1 QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAVIDNDQGGILTFGTGTRLTIIPNIQNGGGSGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
376 PSMA 288-297 GLPSIPVHPI
377 PSMA 288-297I297V GLPSIPVHPV
無
第1圖顯示了在含有IL-2、IL-15及兩性黴素B之決定培養基中使用唑來膦酸鹽(Zometa)進行γδ T細胞擴增。供體20之γδ T細胞絕對數量自第0天至第17天、自第0天至第22天及自第0天至第29天分別增加了3350倍、11060倍及31666倍。類似地，供體21之γδ T細胞絕對數量自第0天至第17天、自第0天至第22天及自第0天至第29天分別增加了4633倍、12320倍及32833倍。相反，如上所述，經典Vγ9δ2 T細胞擴增方案最多只能在14天內使Vγ9δ2 T細胞總數增加100倍，此後，擴增速率降低，此可能由細胞死亡增加所致。在一個態樣，使用前述方法，與第0天之絕對數量相比，在第29天，擴增之後的γδ T細胞之絕對數量之增加倍數可為約1000倍至約40,000倍、約3000倍至約35,000倍、約5000倍至約35,000倍、約6000倍至約35,000倍、約7000倍至約35,000倍、約8000倍至30,000倍、約10,000倍至約35,000倍、約15,000倍至約35,000倍、約20,000倍至約35,000倍、約25,000倍至約35,000倍、約30,000倍至約35,000倍、超過約10,000倍、超過約15,000倍、超過約20,000倍、超過約25,000倍、超過約30,000倍、超過約40,000倍、或超過約40,000倍。
第2A圖顯示，與沒有病毒轉導之Vγ9δ2 T細胞(假)相比，34.9%的用αβ-TCR逆轉錄病毒及CD8αβ-逆轉錄病毒αβ-TCR+CD8轉染之Vγ9δ2 T細胞藉由肽-MHC-dextramer (TAA/MHC-dex)及抗CD8抗體(CD8)染色呈陽性，指示產生在細胞表面上表現αβ-TCR+CD8αβ的Vγ9δ2 T細胞(αβ-TCR +CD8αβ工程化Vg9d2 T細胞)。
CD107a脫顆粒檢定之原理基於藉由顆粒依賴性途徑殺死靶細胞，該途徑利用位於細胞毒性細胞胞漿內的預先形成之溶解顆粒。此等顆粒周圍之脂質雙層含有溶酶體相關膜醣蛋白(lysosomal associated membrane glycoprotein；LAMP)，包括CD107a (LAMP-1)。在藉由T細胞受體複合物識別靶細胞後，細胞凋亡誘導蛋白如顆粒酶及穿孔蛋白迅速釋放到免疫突觸中，此過程被稱為脫顆粒。由此，跨膜蛋白CD107a暴露於細胞表面並可被特異性單株抗體染色。
第2B圖顯示，與沒有病毒轉導之Vγ9δ2 T細胞(假)相比，23.1%的用αβ-TCR逆轉錄病毒及CD8αβ逆轉錄病毒(αβ-TCR+CD8)轉導並且與靶細胞(例如A375細胞)一起孵育之Vγ9δ2 T細胞被抗CD107a抗體染色呈陽性，表明αβ-TCR+CD8α工程化Vg9d2 T細胞，當暴露於A375細胞時，藉由執行脫顆粒來溶解細胞。藉由當T細胞之TCR特異性結合細胞表面抗原呈遞細胞之肽-MHC複合物時所釋放IFN-γ位凖，IFN-γ釋放檢定量測細胞介導的對於抗原呈遞細胞(例如A375細胞)之反應。
第2C圖顯示，與沒有病毒轉導之Vγ9δ2 T細胞(假)相比，19.7%的用αβ-TCR逆轉錄病毒及CD8αβ逆轉錄病毒(αβ-TCR+CD8)轉導之Vγ9δ2 T細胞被抗IFN-γ抗體染色呈陽性，表明αβ-TCR+CD8αβ工程化Vγ9δ2 T細胞，當暴露於A375細胞時，藉由釋放IFN-γ來溶解細胞。在暴露於A375細胞後24小時，藉由門控非CD3 T細胞(即A375細胞)之凋亡來評估細胞溶解活性。藉由用活/死染料將所收穫之培養物染色來評估細胞凋亡。
第2D圖顯示，與沒有病毒轉導之Vγ9δ2 T細胞(假)相比，αβTCR+CD8αβ工程化Vγ9δ2 T細胞在70%之A375細胞中誘導凋亡，表明αβ-TCR+CD8αβ工程化Vγ9δ2 T細胞藉由殺死A375細胞而具有細胞溶解性。在84小時共培養檢定期間，亦即時評估細胞溶解活性。未轉導及αβTCR+CD8αβ轉導之γδ T細胞與靶陽性A375-RFP腫瘤細胞以3:1的效應物與靶標比率共培養。藉由IncuCyte ®活細胞分析系統(Essen BioScience)即時評估靶陽性A375-RFP腫瘤細胞之裂解。使用單獨腫瘤細胞及未轉導及αβTCR轉導之αβ T細胞分別作為陰性及陽性對照。
如第2E圖所示，儘管未轉導之γδ T細胞由於γδ T細胞之固有抗腫瘤特性而表現出細胞毒性潛能，但與αβTCR轉導之αβ T細胞相比，αβTCR+CD8αβ轉導之γδ T細胞表現出類似細胞毒性潛能，表明αβTCR+CD8αβ轉導之γδ T細胞可被工程化以便靶向及殺傷腫瘤細胞。此等資料表明，藉由本揭示案之方法產生之工程化Vγ9δ2 T細胞係功能性的，並且可以用於以肽特異性方式殺死靶細胞，例如癌細胞。
第3圖：與負載有PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)或類似但是不相關肽TMED9-001、CAT-001、DDX60L-001、LRRC70-001、PTPLB-001、HDAC5-001、VPS13B-002、ZNF318-001、CCDC51-001、IFIT1-001、或對照肽NYESO1-001 (SEQ ID NO: 311)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R11P3D3之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。單獨或與未負載靶細胞一起共孵育的RNA電穿孔CD8+ T細胞充當對照。分析不同供體，IFN-040及IFN-041。
第4圖：與負載有PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)或類似但是不相關肽TMED9-001、CAT-001、DDX60L-001、LRRC70-001、PTPLB-001、HDAC5-001、VPS13B-002、ZNF318-001、CCDC51-001、IFIT1-001、或對照肽NYESO1-001 (SEQ ID NO: 311)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R16P1C10之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。單獨或與未負載靶細胞一起共孵育的RNA電穿孔CD8+ T細胞充當對照。分析不同供體，IFN-046及IFN-041。
第5圖：與負載有PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)或類似但是不相關肽TMED9-001、CAT-001、DDX60L-001、LRRC70-001、PTPLB-001、HDAC5-001、VPS13B-002、ZNF318-001、CCDC51-001、IFIT1-001、或對照肽NYESO1-001 (SEQ ID NO: 311)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R16P1E8之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。單獨或與未負載靶細胞一起共孵育的RNA電穿孔CD8+ T細胞充當對照。分析不同供體，IFN-040及IFN-041。
第6圖：與負載有PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)或類似但是不相關肽TMED9-001、CAT-001、DDX60L-001、LRRC70-001、PTPLB-001、HDAC5-001、VPS13B-002、ZNF318-001、CCDC51-001、IFIT1-001、或對照肽NYESO1-001 (SEQ ID NO: 311)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R17P1A9之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。單獨或與未負載靶細胞一起共孵育的RNA電穿孔CD8+ T細胞充當對照。分析不同供體，IFN-040及IFN-041。
第7圖：與負載有PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)或類似但是不相關肽TMED9-001、CAT-001、DDX60L-001、LRRC70-001、PTPLB-001、HDAC5-001、VPS13B-002、ZNF318-001、CCDC51-001、IFIT1-001、或對照肽NYESO1-001 (SEQ ID NO: 311)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R17P1D7之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。單獨或與未負載靶細胞一起共孵育的RNA電穿孔CD8+ T細胞充當對照。分析不同供體，IFN-040及IFN-041。
第8圖：與負載有PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)或類似但是不相關肽TMED9-001、CAT-001、DDX60L-001、LRRC70-001、PTPLB-001、HDAC5-001、VPS13B-002、ZNF318-001、CCDC51-001、IFIT1-001、或對照肽NYESO1-001 (SEQ ID NO: 311)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R17P1G3之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。單獨或與未負載靶細胞一起共孵育的RNA電穿孔CD8+ T細胞充當對照。分析不同供體，IFN-046及IFN-041。
第9圖：與負載有PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)或類似但是不相關肽TMED9-001、CAT-001、DDX60L-001、LRRC70-001、PTPLB-001、HDAC5-001、VPS13B-002、ZNF318-001、CCDC51-001、IFIT1-001、或對照肽NYESO1-001 (SEQ ID NO: 311)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R17P2B6之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。單獨或與未負載靶細胞一起共孵育的RNA電穿孔CD8+ T細胞充當對照。分析不同供體，IFN-040及IFN-041。
第10圖：與負載有10 µM至10 pM之不同肽負載濃度之PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R11P3D3之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。分析不同供體，TCRA-0003及TCRA-0017。
第11圖：與負載有10 µM至10 pM之不同肽負載濃度之PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R16P1C10之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。分析不同供體，TCRA-0003及TCRA-0017。
第12圖：與負載有10 µM至10 pM之不同肽負載濃度之PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R16P1E8之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。分析不同供體，TCRA-0003及TCRA-0017。
第13圖：與負載有10 µM至10 pM之不同肽負載濃度之PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R17P1D7之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。分析不同供體，TCRA-0003及TCRA-0017。
第14圖：與負載有10 µM至10 pM之不同肽負載濃度之PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R17P1G3之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。分析不同供體，TCRA-0003及TCRA-0017。
第15圖：與負載有10 µM至10 pM之不同肽負載濃度之PRAME-004肽(SEQ ID NO: 310)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R17P2B6之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。分析不同供體，TCRA-0003及TCRA-0017。
第16圖：用TCR R16P1C10之α及β鏈RNA來電穿孔之CD8+ T細胞的相應HLA-A*02/PRAME-004 (SEQ ID NO: 310)四聚體或HLA-A*02/NYESO1-001 (SEQ ID NO: 311)四聚體。將用特異性結合至HLA-A*02/NYESO1-001 (SEQ ID NO：311)複合物之1G4 TCR(SEQ ID：85-96)之RNA來電穿孔之CD8+T細胞及假電穿孔CD8+T細胞充當對照。
第17圖：在與負載有100 nM PRAME-004肽(SEQ ID NO：310)或類似(在位置3、5、6、及7中，與PRAME-004一致)但是不相關肽ACPL-001、HSPB3-001、UNC7-001、SCYL2-001、RPS2P8-001、PCNXL3-003、AQP6-001、PCNX-001、AQP6-002TRGV10-001、NECAP1-001、FBXW2-001、或對照肽NYESO1-001(SEQ ID NO：311)的T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R11P3D3 (D103805及D191451)來慢病毒轉導之CD8+T細胞或未轉導細胞(D103805 NT及D191451 NT)的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體D103805及D191451之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。
第18圖：與負載有100 nM PRAME-004肽(SEQ ID NO：310)或類似(在位置3、5、6、及7中，與PRAME-004一致)但是不相關肽或對照肽NYESO1-001 (SEQ ID NO：311)之T2靶細胞一起共孵育之後，用TCR R11P3D3來慢病毒轉導之CD8+T細胞之IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體TCRA-0087及TCRA-0088之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。
第19圖：與不同原代細胞(HCASMC (Coronary artery smooth muscle cell；冠狀動脈平滑肌細胞)、HTSMC (Tracheal smooth muscle cell；氣管平滑肌細胞)、HRCEpC (Renal cortical epithelial cell；腎皮質上皮細胞)、HCM (Cardiomyocyte；心肌細胞)、HCMEC (Cardiac microvascular endothelial cell；心臟微血管內皮細胞)、HSAEpC (Small airway epithelial cell；小氣道上皮細胞)、HCF (Cardiac fibroblast；心臟纖維母細胞))及iPSC衍生細胞類型(HN (Neuron；神經元)、iHCM (Cardiomyocyte；心肌細胞)、HH (Hepatocyte；肝細胞)、HA (astrocyte；星形細胞))共孵育之後，用TCR R11P3D3(D103805及D191451)來慢病毒轉導之CD8+T細胞或未轉導細胞(D103805 NT及D191451 NT)之IFNγ釋放。腫瘤細胞株UACC-257 (衍生自原發性黑素瘤，PRAME-004高)、Hs695T (PRAME-004中等)、U266B1 (衍生自骨髓瘤患者之外周血，PRAME-004很低)及MCF-7 (沒有PRAME-004)每個細胞呈現不同量之PRAME-004。單獨T細胞充當對照。獲得來自兩個不同健康供體D103805及D191451之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。
第20圖：與不同原代細胞(NHEK (Epidermal keratinocyte；表皮角質形成細胞)、HBEpC (Bronchial epithelial cell；支氣管上皮細胞)、HDMEC (Dermal microvascular endothelial cell；皮膚微血管內皮細胞)、HCAEC(Coronary artery endothelial cell；冠狀動脈內皮細胞)，HAoEC (Aortic endothelial cell；主動脈內皮細胞)、HPASMC (Pulmonary artery smooth muscle cell；肺動脈平滑肌細胞)、HAoSMC (Aortic smooth muscle cell；主動脈平滑肌細胞)、HPF (Pulmonary fibroblast；肺纖維母細胞)、SkMC (Skeletal muscle cell；骨骼肌細胞)、HOB (osteoblast；成骨細胞)、HCH (Chondrocyte；軟骨細胞)、HWP (White preadipocyte；白色前脂肪細胞)、hMSC-BM (Mesenchymal stem cell；間充質幹細胞)、NHDF (Dermal fibroblast；皮膚纖維母細胞)共孵育之後，用TCR R11P3D3來慢病毒轉導之CD8+T細胞之IFNγ釋放。腫瘤細胞株UACC-257 (PRAME-004高)、Hs695T (PRAME-004中等)、U266B1 (PRAME-004很低)及MCF-7 (沒有PRAME-004)每個細胞呈現不同拷貝數目之PRAME-004。單獨T細胞充當對照。獲得來自兩個不同健康供體TCRA-0084及TCRA-0085之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。
第21圖：與負載有100nM PRAME-004肽(SEQ ID NO：310)或類似(在位置3、5、6、及7，與PRAME-004一致)但是不相關肽ACPL-001、HSPB3-001、UNC7-001、SCYL2-001、RPS2P8-001、PCNXL3-003、AQP6-001、PCNX-001、AQP6-002、TRGV10-001、NECAP1-001、FBXW2-001、或對照肽NYESO1-001 (SEQ ID NO：311)之T2靶細胞一起共孵育之後，用增強TCR R11P3D3_KE (D103805及D191451)或未轉導細胞(D103805 NT及D191451 NT)來慢病毒轉導之CD8+T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體D103805及D191451之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。
第22圖：與負載有100nM PRAME-004肽(SEQ ID NO：310)或類似(在位置3、5、6及7，與PRAME-004一致)但是不相關肽或對照肽NYESO1-001 (SEQ ID NO：311)之T2靶細胞共孵育之後，用增強TCR R11P3D3_KE來慢病毒轉導之CD8+T細胞的IFNγ釋放。獲得來自兩個不同健康供體TCRA-0087及TCRA-0088之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。
第23圖：與不同原代細胞(HCASMC (Coronary artery smooth muscle cell；冠狀動脈平滑肌細胞)、HTSMC (Tracheal smooth muscle cell；氣管平滑肌細胞)、HRCEpC (Renal cortical epithelial cell；腎皮質上皮細胞)、HCM (Cardiomyocyte；心肌細胞)、HCMEC (Cardiac microvascular endothelial cell；心臟微血管內皮細胞)、HSAEpC (Small airway epithelial cell；小氣道上皮細胞)、HCF (Cardiac fibroblast；心臟纖維母細胞))及iPSC衍生細胞類型(HN (Neuron；神經元)、iHCM (Cardiomyocyte；心肌細胞)、HH (Hepatocyte；肝細胞)、HA (astrocyte；星形細胞))共孵育之後，用增強TCR R11P3D3_KE (D103805及D191451)或未轉導細胞(D103805 NT及D191451 NT)來慢病毒轉導之CD8+T細胞的IFNγ釋放。腫瘤細胞株UACC-257 (PRAME-004高)、Hs695T (PRAME-004中等)、U266B1 (PRAME-004很低)及MCF-7 (沒有PRAME-004)每個細胞呈現不同拷貝數目之PRAME-004。單獨T細胞充當對照。獲得來自兩個不同健康供體D103805及D191451之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。
第24圖：與不同原代細胞(NHEK (Epidermal keratinocyte；表皮角質形成細胞)、HBEpC (Bronchial epithelial cell；支氣管上皮細胞)、HDMEC (Dermal microvascular endothelial cell；皮膚微血管內皮細胞)、HCAEC (Coronary artery endothelial cell；冠狀動脈內皮細胞)，HAoEC (Aortic endothelial cell；主動脈內皮細胞)、HPASMC (Pulmonary artery smooth muscle cell；肺動脈平滑肌細胞)、HAoSMC (Aortic smooth muscle cell；主動脈平滑肌細胞)、HPF (Pulmonary fibroblast；肺纖維母細胞)、SkMC (Skeletal muscle cell；骨骼肌細胞)、HOB (osteoblast；成骨細胞)、HCH (Chondrocyte；軟骨細胞)、HWP (White preadipocyte；白色前脂肪細胞)、hMSC-BM (Mesenchymal stem cell；間充質幹細胞)、NHDF (Dermal fibroblast；皮膚纖維母細胞)共孵育之後，用增強TCR R11P3D3_KE來慢病毒轉導之CD8+T細胞的IFNγ釋放。腫瘤細胞株UACC-257 (PRAME-004高)、Hs695T (PRAME-004中等)、U266B1 (PRAME-004很低)及MCF-7 (沒有PRAME-004)每個細胞呈現不同拷貝數目之PRAME-004。單獨T細胞充當對照。獲得來自兩個不同健康供體TCRA-0084及TCRA-0085之CD8+ T細胞的IFNγ釋放資料。
第25圖：與每個細胞呈現不同量之PRAME-004的腫瘤細胞株UACC-257 (PRAME-004高)、Hs695T (PRAME-004中等)、U266B1 (PRAME-004很低)及MCF-7 (沒有PRAME-004)共孵育之後，用TCR R11P3D3或增強TCR R11P3D3_KE來慢病毒轉導之CD8+T細胞或未轉導細胞的IFNγ釋放。單獨T細胞充當對照。兩種TCR之IFNγ釋放與PRAME-004呈遞相關，與R11P3D3相比，R11P3D3_KE誘導更高反應。
第26圖：評估表現針對PRAME-004陽性腫瘤細胞之TCR R11P3D3或增強TCR R13P3D3_KE之慢病毒轉導之T細胞之細胞溶解活性的效力檢定。針對A-375(原代皮膚癌細胞株，PRAME-004低)或U2OS(原代骨肉瘤，PRAME-1004中等)腫瘤細胞來量測之R11P3D3及R11P3D3_KE轉導及未轉導(NT) T細胞的細胞毒性反應。在基於72小時螢光顯微鏡之細胞毒性檢定中進行檢定。結果顯示腫瘤隨著時間之推移呈倍數增長。
第27圖：評估表現針對PRAME-004陽性腫瘤細胞之TCR R11P3D3或增強TCR R13P3D3_KE之慢病毒轉導之T細胞之細胞溶解活性的效力檢定。針對A-375 (PRAME-004低)或U2OS(PRAME-004中等)腫瘤細胞來量測之R11P3D3及R11P3D3_KE轉導及未轉導(NT)T細胞之細胞毒性反應。在基於72小時螢光顯微鏡之細胞毒性檢定中進行檢定。結果顯示腫瘤隨著時間之推移呈倍數增長。
第28圖顯示了用靶向HLA-A*02上呈現之腫瘤相關肽PRAME-004(SEQ ID NO:310)之雙特異性TCR/mAb雙抗體構建體IA_5進行LDH釋放檢定的結果。在TCR/mAb雙抗體分子濃度遞增的情況下，以5:1之效應物與靶標比率，將自健康供體分離之CD8陽性T細胞與在細胞表面呈現不同量之PRAME-004:HLA-A*02-1複合物(藉由靶向MS分析決定，每個細胞分別約1100、約780及約240個拷貝)的癌細胞株UACC-257、SW982(原代滑膜肉瘤細胞株)及U2OS共孵育。在共培養48小時後，根據製造商之說明書(Promega)，利用LDH釋放檢定對靶細胞裂解進行定量。
第29圖顯示了分別利用針對HLA-A*02上呈現之腫瘤相關肽PRAME-004(SEQ ID NO:310)之穩定性/親和力成熟TCR及其增強型式的雙特異性TCR/mAb雙抗體構建體IA_5及IA_6的LDH釋放檢定之結果。在TCR/mAb雙抗體分子濃度遞增的情況下，將自健康供體分離之CD8陽性T細胞與每細胞呈現約240個拷貝之PRAME-004:HLA-A*02:1複合物之癌細胞株U2OS或未負載之PRAME-004陰性T2細胞(效應物:靶標比率為5:1)一起共孵育。在共培養48小時後，根據製造商之說明書(Promega)，利用LDH釋放檢定對靶細胞裂解進行定量。
第30圖顯示了分別利用針對HLA-A*02上呈現之腫瘤相關肽PRAME-004(SEQ ID NO:310)之穩定性/親和力成熟TCR及其增強型式的TCR/mAb雙抗體構建體IA_5及IA_6之熱應激穩定性研究結果。為此，蛋白質在PBS中以1 mg/mL之濃度配製，隨後在40℃下儲存兩週。使用HPLC-SEC評估蛋白質完整性及回收率。由此，根據主峰之前溶離之峰面積百分比決定高分子量物質之量。藉由比較未應激及應激樣品之主峰面積來計算單體蛋白之回收率。
第31圖：包含不同R16P1C10變異體之雙特異性分子之結合動力學。FAB2G感測器用於scTCR-Fab格式(20 µg/ml負載120秒)，AHC感測器用於雙抗體-F c格式(10 µg/ml負載120秒用於改良變異體；5 µg/m負載120秒，用於穩定變異體LoAff3、CDR6、HiAff1)。HLA-A*02/PRAME-004之分析濃度以nM表示。圖表顯示了量測資料及計算擬合之曲線。
第32圖：在來自兩個健康供體(HBC-887及HBC-889)之CD8+T細胞存在下，分別由含有CDR6、HiAff1或LoAff3 TCR變異體之雙特異性分子誘導之PRAME陽性腫瘤細胞株之裂解。共孵育48小時後，藉由定量釋放之LDH來決定裂解度。相應地，CDR6顯示為黑色圓圈，HiAff1顯示為淺灰色正方形，LoAff3顯示為深灰色三角形，沒有bsTCR之對照組顯示為開放倒三角形。
第33圖：在來自兩個健康供體(HBC-887及HBC-889)之CD8+T細胞存在下，分別由含有CDR6、HiAff1或LoAff3 TCR變異體之雙特異性分子誘導之PRAME陰性腫瘤細胞株之裂解。共孵育48小時後，藉由定量釋放之LDH來決定裂解度。相應地，CDR6顯示為黑色圓圈，HiAff1顯示為淺灰色正方形，LoAff3顯示為深灰色三角形，沒有bsTCR之對照組顯示為開放倒三角形。
第34圖： 活體內療效。用人類PBMC移植攜帶約50 mm 3之Hs695T腫瘤之NOG小鼠，並用PBS(組1)、0.5 mg/kg體重HiAff1/抗CD3雙抗體-Fc(組2)或0.5 mg/kg抗HIV/抗CD3雙抗體-Fc(組3)每週靜脈內注射兩次。用卡尺量測腫瘤體積，並按長度x寬度 2/2計算。
第35圖：TCER ®分子對靶陽性及靶陰性腫瘤細胞株之 活體外細胞毒性。在TCER ®濃度遞增的情況下，來自健康HLA-A*02陽性供體之PBMC與靶陽性腫瘤細胞株Hs695T(●)或靶陰性但HLA-A*02陽性腫瘤細胞株T98G(膠質母細胞瘤細胞株(陰性對照)(○)以1:10之比率一起孵育。共培養48小時後，藉由量測釋放之LDH來量化TCER ®誘導之細胞毒性。評估TPP-93及TPP-79之實驗結果分別顯示在上圖及下圖中。
第36圖：TCER ®分子TPP-105對靶陽性及靶陰性腫瘤細胞株之 活體外細胞毒性。在TPP-105濃度遞增的情況下，來自健康HLA-A*02陽性供體之PBMC與靶陽性腫瘤細胞株Hs695T(●)或靶陰性但HLA-A*02陽性腫瘤細胞株T98G(○)以1:10之比率一起孵育。共培養48小時後，藉由量測釋放之LDH來量化TCER ®誘導之細胞毒性。
第37圖：TCER ®Slot III分子之細胞毒性資料匯總。利用非線性4點曲線擬合計算LDH釋放檢定中獲得之劑量-反應曲線之EC 50值。對於每個所評估TCER ®分子，描述對於靶陽性腫瘤細胞株Hs695T (●)、U2OS (○)及靶陰性但HLA-A*02陽性腫瘤細胞株T98G(*)之EC 50值。因此，每個符號表示一種利用來自各種HLA-A*02陽性供體之PBMC的檢定。對於TPP-871/T98G，估計EC 50，因為TPP-871未識別T98G。
第38圖：TCER ®Slot III變異體對負載不同濃度靶肽之T2細胞的 活體外細胞毒性。藉由定量釋放到上清液中之LDH來決定細胞毒性。以5:1之E:T比，使用人類PBMC作為效應細胞。48 h後進行讀出。
第39圖：選定TCER ®Slot III變異體之正常組織細胞安全性分析。
與針對PRAME-004陽性Hs695T腫瘤細胞的細胞毒性相比，評估了TCER ®介導的對表現HLA-A*02之5種不同正常組織細胞類型之細胞毒性。來自健康HLA-A*02+供體之PBMC以10:1之比率與正常組織細胞培養基或Hs695T腫瘤細胞(一式三份)在相應正常組織細胞培養基(4、10a或13a)及T細胞培養基(LDH-AM)之1:1混合物中或單獨在T細胞培養基中共培養。48小時後，藉由量測LDH釋放(LDH-Glo™ 套組，Promega)來評估正常組織細胞及Hs695T細胞之裂解。
第40圖：SEQ ID NO:310在不同腫瘤轉移中之過度表現
該圖顯示了與正常組織相比，SEQ ID NO:310在不同腫瘤轉移中之過度表現。上部：來自技術重複量測之中位數MS信號強度被繪製為HLA-A*02上所鑑定之SEQ ID NO:310之單個正常(灰色點，圖左部分)及轉移樣品(黑色點，圖右部分)的點。盒顯示標準化信號強度之中位數、第25及第75個百分位，而須延伸至仍在下四分位之1.5個四分位間距(interquartile range；IQR)內之最低資料點及仍在上四分位1.5個四分位間距內之最高資料點。下部：每個器官中之相對肽偵測頻率如脊柱圖所示。圖下方之數字表示在針對每個器官(N=762)或轉移適應症(對於HLA-A*02陽性轉移樣品，N=102)所分析之樣品總數中偵測到肽的樣品之數量。
如果在樣品上偵測到肽，但由於技術原因無法量化，則該樣品包含在偵測頻率之表示中，但圖之上部未顯示點。組織(自左到右)： 正常樣品：脂肪(脂肪組織)；adrenal gl (腎上腺)；膽管；膀胱；血細胞；bloodvess (血管)；骨髓；腦；乳腺；esoph (食管)；眼睛；gall bl (膽囊)；頭部及頸部；心；intest. la (大腸)；intest. sm(小腸)；腎；肝臟；肺；淋巴結；nerve cent (中樞神經)；nerve periph (周圍神經)；卵巢；胰；parathyr (甲狀旁腺)；perit (腹膜)；pituit (垂體)；胎盤；胸膜；前列腺；skel. mus (骨骼肌)；皮膚；脊髓；脾臟；胃；睾丸；胸腺；甲狀腺；氣管；輸尿管；子宮。
轉移樣品：BRCA (breast cancer metastasis；乳腺癌轉移)；CCC (cholangiocellular carcinoma metastasis；膽管細胞癌轉移)；CRC (colorectal cancer metastasis；結直腸癌轉移)；GC (gastric cancer metastasis；胃癌轉移)；HCC (hepatocellular carcinoma metastasis；肝細胞癌轉移)；HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma metastasis；頭頸部鱗狀細胞癌轉移)；MEL (melanoma metastasis；黑色素瘤轉移)；NHL (non-Hodgkin lymphoma metastasis；非霍奇金淋巴瘤轉移)；NSCLCadeno (non-small cell lung cancer adenocarcinoma metastasis；非小細胞肺癌腺癌轉移)；NSCLCsquam (squamous cell non-small cell lung cancer metastasis；鱗狀細胞非小細胞肺癌轉移)；OC (ovarian cancer metastasis；卵巢癌轉移)；OSCAR (ovarian cancer metastasis；食管癌轉移)；PACA (pancreatic cancer metastasis；胰腺癌轉移)；PRCA (prostate cancer metastasis；前列腺癌轉移)；RCC (renal cell carcinoma metastasis；腎癌轉移)；SARC (sarcoma metastasis；肉瘤轉移)；SCLC (small cell lung cancer metastasis；小細胞肺癌轉移)；UBC (urinary bladder carcinoma metastasis；膀胱癌轉移)；UEC (uterine endometrial cancer metastasis；子宮內膜癌轉移)。
第41圖：PRAME之表現譜
腫瘤(黑點)及正常(灰點)樣品根據起源器官進行分組。盒須圖表示中位數、第25及第75百分位(盒)加上須，須延伸至仍在下四分位之1.5個四分位間距(interquartile range；IQR)內之最低資料點及仍在上四分位1.5個四分位間距內之最高資料點。組織(自左到右)： 正常樣品：脂肪(脂肪組織)；adrenal gl (腎上腺)；膽管；膀胱；血細胞；bloodvess (血管)；骨髓；腦；乳腺；esoph (食管)；眼睛；gall bl (膽囊)；頭部及頸部；心；intest. la (大腸)；intest. sm (小腸)；腎；肝臟；肺淋巴結；nerve periph (周圍神經)；卵巢；胰；parathyr (甲狀旁腺)；perit (腹膜)；pituit (垂體)；胎盤；胸膜；前列腺；skel. mus (骨骼肌)；皮膚；脊髓；脾臟；胃；睾丸；胸腺；甲狀腺；氣管；輸尿管；子宮。
轉移樣品：AML (acute myeloid leukemia metastasis；急性髓系白血病轉移)；BRCA (breast cancer metastasis；乳腺癌轉移)；CCC (cholangiocellular carcinoma metastasis；膽管細胞癌轉移)；CRC (colorectal cancer metastasis；結直腸癌轉移)；GBC (gallbladder cancer metastasis；膽囊癌轉移)；GC (gastric cancer metastasis；胃癌轉移)；HCC (hepatocellular carcinoma metastasis；肝細胞癌轉移)；HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma metastasis；頭頸部鱗狀細胞癌轉移)；MEL (melanoma metastasis；黑色素瘤轉移)；NHL (non-Hodgkin lymphoma metastasis；非霍奇金淋巴瘤轉移)；NSCLCadeno (non-small cell lung cancer adenocarcinoma metastasis；非小細胞肺癌腺癌轉移)；NSCLCother (不能明確歸屬於NSCLCadeno或NSCLCsquam之NSCLC樣品之轉移)；NSCLCsquam (squamous cell non-small cell lung cancer metastasis；鱗狀細胞非小細胞肺癌轉移)；OC (ovarian cancer metastasis；卵巢癌轉移)；OSCAR (esophageal cancer metastasis；食管癌轉移)；PACA (pancreatic cancer metastasis；胰腺癌轉移；PRCA (prostate cancer metastasis；前列腺癌轉移)；RCC (renal cell carcinoma metastasis；腎癌轉移)；SCLC (small cell lung cancer metastasis；小細胞肺癌轉移)；UBC (urinary bladder carcinoma metastasis；膀胱癌轉移)；UEC(uterine endometrial cancer metastasis；子宮內膜癌轉移)。
第42圖：KRT5-004(SEQ ID NO:312)在原發性腫瘤及轉移上之表現。
可以看出，當將HNSCC原發腫瘤與HNSCC轉移進行比較時，SEQ ID NO:312之呈現完全丟失：雖然在近50%之原發HNSCC腫瘤樣品中偵測到SEQ ID NO：312，但在所分析的轉移性HNSC腫瘤樣品中完全不存在。
第43圖：PRAME-004 (SLLQHLIGL) (SEQ ID NO:310)在正常組織、原發性腫瘤及轉移性癌組織上之表現。
轉移樣品：BRCA (breast cancer metastasis；乳腺癌轉移)；CCC (cholangiocellular carcinoma metastasis；膽管細胞癌轉移)；CRC (colorectal cancer metastasis；結直腸癌轉移)；GC (gastric cancer metastasis；胃癌轉移)；HCC (hepatocellular carcinoma metastasis；肝細胞癌轉移)；HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma metastasis；頭頸部鱗狀細胞癌轉移)；MEL (melanoma metastasis；黑色素瘤轉移)；NHL (non-Hodgkin lymphoma metastasis；非霍奇金淋巴瘤轉移)；NSCLCadeno (non-small cell lung cancer adenocarcinoma metastasis；非小細胞肺癌腺癌轉移)；NSCLCsquam (squamous cell non-small cell lung cancer metastasis；鱗狀細胞非小細胞肺癌轉移)；OC (ovarian cancer metastasis；卵巢癌轉移)；OSCAR (esophageal cancer metastasis metastasis；食管癌轉移轉移)；PACA (pancreatic cancer metastasis；胰腺癌轉移)；PRCA (prostate cancer metastasis；前列腺癌轉移)；RCC (renal cell carcinoma metastasis；腎癌轉移)；SARC (sarcoma metastasis；肉瘤轉移)；SCLC (small cell lung cancer metastasis；小細胞肺癌轉移；UBC (urinary bladder carcinoma metastasis；膀胱癌轉移)；UEC (uterine endometrial cancer metastasis；子宮內膜癌轉移)。
第44圖：PRAME-004 (SLLQHLIGL) (SEQ ID NO:310)在正常組織及癌組織上之表現，該等癌組織結合了原發性及轉移性癌組織。
第45圖：PRAME-004 (SLLQHLIGL) (SEQ ID NO:310)在正常組織、原發性三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer；TNBC)及符合TNBC標準之轉移上的表現。
第46圖：PRAME-004 (SLLQHLIGL) (SEQ ID NO:310)在正常組織及TNBC上之表現，該TNBC結合了原發性TNBC及符合TNBC標準之轉移。
第47A圖：PRAME陽性患者腫瘤生檢中基線PRAME表現
患者參與了一項臨床試驗，並用表現PRAME-004特異性TCR之工程化T細胞治療。箭頭表示試驗中總體反應最佳的頭頸部腺癌患者1及患者2之PRAME表現(見第47B圖)。
第47B圖：臨床試驗之初步結果
與基線相比，試驗中用表現PRAME-004特異性TCR之工程化T細胞治療頭頸部腺癌之患者1及患者2分別表現出9.7%及13.1%之腫瘤減少。
第48圖：轉移性胰腺癌患者衍生異種移植(patient-derived xenograft；PDX)模型之 活體內療效。
攜帶約80 mm 3之PAXF 1657(胰腺癌肺轉移)腫瘤之雌性NOG小鼠用人類PBMC移植，並在第1、8及15天用5 mL/kg體重PBS(第1、2組)或0.25 mg/kg體重TCER ®TPP-1295(第3、4組)處理。用卡尺量測腫瘤體積，並按(長度x寬度 2)/2，長度＞寬度計算。
第49A圖：轉移性非小細胞肺癌患者衍生異種移植(patient-derived xenograft；PDX)模型之 活體內療效。
攜帶約80 mm 3之LXFL 1176(非小細胞肺大細胞癌淋巴結轉移)腫瘤之雌性NOG小鼠用人類PBMC移植，並在第1、8、15及22天用5 mL/kg體重PBS(第1、2組)或0.25 mg/kg體重TCER ®TPP-1295(第3、4組)處理。用卡尺量測腫瘤體積，並按(長度x寬度 2)/2，長度＞寬度計算。
第49B圖：轉移性非小細胞肺腺癌患者衍生異種移植(patient-derived xenograft；PDX)模型之 活體內療效。
攜帶約80 mm 3之LXFA 1125(非小細胞肺腺癌之卵巢轉移)腫瘤之雌性NOG小鼠用人類PBMC移植，並在第1、8及15天，用5 mL/kg體重PBS(第1、2組)或0.25 mg/kg體重TCER ®TPP-1295(第3、4組)處理。用卡尺量測腫瘤體積，並按(長度x寬度 2)/2，長度＞寬度計算。
第50圖：PRAME-004在具有不同腫瘤適應症之轉移癌患者中之患病率。
使用專用靶向PRAME-004 qPCR偵測(IMADetect ®)自轉移癌患者之腫瘤生檢樣品中決定腫瘤陽性。使用配對PRAME-004免疫肽質譜及外顯子表現資料來決定PRAME-004陽性之臨限值(Fritsche等人，2018)。
第50圖中之表格列出了患者衍生轉移樣品中PRAME陽性之結果
≥1 - ＜25% = +
≥25 = ++
≥50 = +++
≥75 = ++++
顯示了所評估之患者衍生轉移樣品之數量。
亦可確立以下腫瘤適應症之PRAME-004陽性。PRAME陽性之樣品數量如下：鱗狀細胞肛門癌(5)、胃癌(2)、扁桃體癌(1)、支氣管癌(2)、黏膜黑色素瘤(1)、食管黑色素瘤(1)、肛門黑色素瘤(1)、直腸癌(1)、胰腺神經內分泌瘤(1)、舌癌(1)、惡性外周神經鞘瘤(1)。
第51圖：PRAME-004在具有不同腫瘤適應症之癌症患者中之患病率。
藉由PRAME免疫組織化學染色分析癌症患者之腫瘤生檢樣品決定腫瘤陽性。具有≥ 1 (%)之P評分之腫瘤樣品被認為PRAME陽性。
第51圖中之表格列出了藉由免疫組織化學評估之患者衍生轉移腫瘤樣品中PRAME陽性之結果
≥1 - ＜25% = +
≥25 = ++
≥50 = +++
≥75 = ++++
顯示了所評估之患者衍生腫瘤樣品之數量。
第52圖 PRAME陽性癌症之免疫組織化學染色
肛門癌(左影像)、小細胞肺癌(中影像)及子宮癌肉瘤(右影像)之示例性PRAME陽性組織切片
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無
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Claims (60)

  1. 一種由SEQ ID NO:310 (SLLQHLIGL)之胺基酸序列組成之肽或其醫藥學上可接受之鹽， 該肽或其醫藥學上可接受之鹽用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
  2. 如請求項1所述之肽，其中 • 該肽具有與MHC l類分子結合之能力，及/或 • 其中當該肽與該MHC結合時，能夠被CD8 T細胞識別。
  3. 如請求項1至2中任一項所述之肽，其中該醫藥學上可接受之鹽係氯化物鹽或乙酸鹽。
  4. 一種抗體或其功能片段，其特異性識別或結合至如請求項1至3中任一項所述之肽或結合至與MHC分子結合的如請求項1至3中任一項所述之肽， 該抗體或其功能片段用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
  5. 一種與MHC配位體反應或結合之T細胞受體或其功能片段，其中該配位體係如請求項1至3中任一項所述之肽，或與MHC分子結合的如請求項1至3中任一項所述之肽， 該T細胞受體或其功能片段用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
  6. 如請求項5所述之T細胞受體，其作為可溶性分子提供。
  7. 一種編碼如請求項1至3中任一項所述之肽、如請求項4所述之抗體或其片段、如請求項5所述之T細胞受體或其片段的核酸， 該核酸用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
  8. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項1至3中任一項所述之肽、如請求項4所述之抗體或其片段、如請求項5所述之T細胞受體或其片段或如請求項7所述之核酸。
  9. 一種重組T淋巴球，其表現至少一種編碼如請求項5所述之T細胞受體的載體， 該重組T淋巴球用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
  10. 如請求項9所述之重組T淋巴球，其中該T細胞受體包括 (1) 包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的CDR3β鏈，或 (2) 包括SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 25之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的CDR3β鏈，或 (3) 包括SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的CDR3β鏈，或 (4) 包括SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的CDR3β鏈， (5) 包括SEQ ID NO: 60之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 61之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 66之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 67之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 68之胺基酸序列的CDR3β鏈， (6) 包括SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 73之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 74之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 78之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 79之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 80之胺基酸序列的CDR3β鏈 (7) 包括SEQ ID NO: 84之胺基酸序列的CDR1α鏈、包括SEQ ID NO: 85之胺基酸序列的CDR2α鏈、包括SEQ ID NO: 86之胺基酸序列的CDR3α鏈、包括SEQ ID NO: 90之胺基酸序列的CDR1β鏈、包括SEQ ID NO: 91之胺基酸序列的CDR2β鏈、及包括SEQ ID NO: 92之胺基酸序列的CDR3β鏈， 其中該T細胞受體能夠結合至與HLA-A*02複合的由SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之胺基酸序列組成之肽。
  11. 如請求項9或10所述之重組T淋巴球，其中該T細胞受體包括 (1) 包括SEQ ID NO: 15之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 21之β鏈可變域，或 (2) 包括SEQ ID NO: 27之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 33之β鏈可變域，或 (3) 包括SEQ ID NO: 39之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 45之β鏈可變域，或 (4) 包括SEQ ID NO: 51之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 57之β鏈可變域，或 (5) 包括SEQ ID NO: 63之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 69之β鏈可變域，或 (6) 包括SEQ ID NO: 75之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 81之β鏈可變域，或 (7) 包括SEQ ID NO: 87之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 93之β鏈可變域，或 (8) 包括SEQ ID NO: 111之α鏈可變域、及包括SEQ ID NO: 117之β鏈可變域， 其中該T細胞受體能夠結合至與HLA-A*02複合的由SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之胺基酸序列組成之肽。
  12. 一種產生活化T淋巴球的 活體外方法，該方法包括以下步驟：將 活體外T細胞與在合適抗原呈遞細胞或模擬抗原呈遞細胞之人工構建體之表面上表現的負載抗原之人類I類MHC分子接觸一段足以以抗原特異性方式活化該T淋巴球之時間，其中該抗原係如請求項1至3中任一項所述之肽。
  13. 一種藉由如請求項12所述之方法產生的活化T淋巴球，其選擇性地識別呈遞如請求項1至3中任一項所述之肽的細胞， 該活化T淋巴球用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
  14. 如請求項4所述之抗體或如請求項5或6所述之T細胞受體，其進一步包含效應部分，該效應部分選自由以下組成之群： a) 毒素 b) 免疫調節劑。
  15. 如請求項14所述之T細胞受體，該T細胞受體用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者， 該T細胞受體包括第一多肽鏈及第二多肽鏈， 其中該第一多肽鏈包括第一鉸鏈結構域及/或第一Fc結構域，其中包含與SEQ ID NO 184、187、189、190、195、206、208、210、212、216、218、219、220、221、222、229、230、232、234、236、238、240、241、242、243、244、246、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、265、298、299、300、302或304中之任一者之95%一致性的該第一多肽鏈包括該序列之互補決定區(CDR)； 其中該第二多肽鏈包括第二鉸鏈結構域及/或第二Fc結構域，其中包含與SEQ ID NO 179、180、181、182、183、185、186、188、191、 194、 203、 205、 213、214、215、217、223、224、225、226、227、228、231、233、235、237、239、245、247、248、249、264、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、301、或303中之任一者之95%一致性的該第二多肽鏈包括該序列之CDR。
  16. 如請求項15所述之T細胞受體，其中該第一多肽鏈藉由該第一鉸鏈結構域與該第二鉸鏈結構域之間及/或該第一Fc結構域與該第二Fc區域之間之共價鍵及/或非共價鍵與該第二多肽鏈融合。
  17. 如請求項15或16所述之T細胞受體，其中該第一及第二Fc結構域各自包含至少一個Fc效應功能沉默突變。
  18. 如請求項15至17中任一項所述之T細胞受體，其中該第一及第二Fc結構域各自包含CH3結構域，該CH3結構域包含至少一種促進異二聚體形成之突變。
  19. 如請求項15至18中任一項所述之T細胞受體，其中該第一及第二Fc結構域各自包含CH2及CH3結構域，該等CH2及CH3結構域包含至少兩個額外半胱胺酸殘基。
  20. 如請求項15至19中任一項所述之T細胞受體，其包括 a) 第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含有包含三個互補決定區(CDR) CDRa1、CDRa2及CDRa3的第一可變結構域，其中 • 該CDRa1包含或由胺基酸序列DRGSQS (SEQ ID NO: 135)或與SEQ ID NO: 135至少85%一致之胺基酸序列組成， • 該CDRa2包含或由胺基酸序列IYQEGD (SEQ ID NO: 138)組成，及 • 該CDRa3包含或由胺基酸序列CAAVIDNDQGGILTF (SEQ ID NO: 142)組成，以及 b) 第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含有包含三個互補決定區(CDR) CDRb1、CDRb2及CDRb3的第二可變結構域，其中 • 該CDRb1包含或由胺基酸序列PGHRA (SEQ ID NO: 167)或PGHRS (SEQ ID NO: 168)，較佳PGHRA (SEQ ID NO: 167)，或與SEQ ID NO：167或SEQ ID NO: 168，較佳SEQ ID NO：167至少85%一致的胺基酸序列組成； • 該CDRb2包含或由胺基酸序列YVHGEE (SEQ ID NO: 170)或與SEQ ID NO：170至少85%一致的胺基酸序列組成，以及 • 該CDRb3包含或由胺基酸序列CASSPWDSPNEQYF (SEQ ID NO:172)或CASSPWDSPNVQYF (SEQ ID NO: 173)，較佳CASSPWDSPNVQYF (SEQ ID NO: 173)，或與SEQ ID NO：172或SEQ ID NO:173，較佳CASSPWDSPNVQYF (SEQ ID NO: 173)至少85%一致的胺基酸序列組成。
  21. 如請求項15至20中任一項所述之T細胞受體，其包括 a) 結合PRAME-004:MHC複合物之TCR可變域可變域 該等可變域選自以下對： • V A包含或由SEQ ID NO:305之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:306之胺基酸序列組成； • V A包含或由SEQ ID NO:305之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:307之胺基酸序列組成； • V A包含或由SEQ ID NO:305之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:308之胺基酸序列組成； • V A包含或由SEQ ID NO:309之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:306之胺基酸序列組成； • V A包含或由SEQ ID NO:309之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:307之胺基酸序列組成；或 • V A包含或由SEQ ID NO:309之胺基酸序列組成；並且V B包含或由SEQ ID NO:308之胺基酸序列組成； 及 b) 結合CD3之抗體V H及V L結構域，該等結構域選自以下對： • 包含或由SEQ ID NO:193組成之V H；及包含或由SEQ ID NO:192組成之V L； • 包含或由SEQ ID NO:196；或SEQ ID NO:198；(A02)或SEQ ID NO:199；(D01)或SEQ ID NO:200；(A02_H90Y)或SEQ ID NO: 201；(D01_H90Y)組成之V H及包含或由SEQ ID NO:197組成之V L； • 包含或由SEQ ID NO:202；或SEQ ID NO:207；(N100D)或SEQ ID NO:209；(N100E)或SEQ ID NO:211；(S101A)組成之V H及包含或由SEQ ID NO:204組成之V L。
  22. 一種醫藥組成物，該組成物包含至少一種選自由以下中之至少一者組成之群的活性劑 • 如請求項1至3中任一項所述之肽， • 如請求項4或14所述之抗體或其片段 • 如請求項5、6或15至21所述之T細胞受體或其片段 • 如請求項7所述之核酸， • 如請求項8所述之宿主細胞， • 如請求項9至11所述之重組T淋巴球，及/或 • 如請求項13所述之活化T淋巴球， 及醫藥學上可接受之載劑， 該組成物用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為轉移或轉移性病變，(ii)患有轉移或轉移性病變或(iii)處於患上轉移或轉移性病變之風險中的患者。
  23. 如請求項1至3中任一項所述之肽、如請求項4或14所述之抗體或其片段、如請求項5、6或15至21所述之T細胞受體或其片段、如請求項7所述之核酸或表現載體、如請求項8所述之宿主細胞、如請求項9至11所述之重組T淋巴球、如請求項13所述之活化T淋巴球、或如請求項13所述之醫藥組成物，其中該轉移或轉移性病變係選自由以下中之至少一者組成之群的至少一種： • ACC轉移 • BLCA轉移 • BRCA轉移 • TNBC轉移 • CRC轉移 • HNSCC轉移 • HNAC轉移 • MEL轉移 • SKCM轉移 • UVM轉移 • LC轉移 • NSCLC轉移 • NSCLCadeno轉移 • NSCLCsquam轉移 • NSCLCother轉移 • SCLC轉移 • CHOL轉移 • ESCA轉移 • CESC轉移 • OC轉移 • OV轉移 • LIHC轉移 • RCC轉移 • KIRC轉移 • KIRP轉移 • SARC轉移 • FS轉移 • LPS轉移 • MPNST轉移 • SS轉移 • STAD轉移 • TGCT轉移 • THYM轉移 • UCS轉移、及/或 • UEC轉移 。
  24. 一種治療在細胞表面上呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之肽的轉移性病變的方法，該方法包括以下步驟：選擇患有轉移性病變之患者並向該患者投與包含如請求項9至11中任一項所述之重組T淋巴球或藉由如請求項12所述之方法來產生之活化T淋巴球的組成物，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
  25. 一種引起對於轉移性病變之免疫反應的方法，該轉移性病變在細胞表面上呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之肽，該方法包括以下步驟：選擇患有轉移性病變之患者並向該患者投與包含如請求項9至11中任一項所述之重組T淋巴球或藉由如請求項12所述之方法來產生之活化T淋巴球的組成物，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
  26. 如請求項24或25所述之方法，進一步包括以下步驟：向該患者投與至少一種選自由以下組成之群的佐劑：抗CD40抗體、咪喹莫德、瑞西莫德、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、阿替唑單抗、干擾素α、干擾物β、CpG寡核苷酸及衍生物、聚(I:C)及衍生物、RNA、西地那非、具有聚(丙交酯-乙交酯)(PLG)之顆粒製劑、病毒體、介白素-1 (IL-1)、介白素-2 (IL-2)、介白素-4 (IL-4)、介白素-7 (IL-7)、介白素-12 (IL-12)、介白素-13 (IL-13)、介白素-15 (IL-15)、介白素-21 (IL-21)、介白素-23 (IL-23)。
  27. 一種製備T細胞群之方法，包括以下步驟： •自PBMC獲得T細胞群； •活化所獲得T細胞群， •用如請求項7所述之核酸來轉導經活化之T細胞群， •擴增經轉導之T細胞群，以及 •其中在IL-21存在下，進行活化、轉導、擴增或其組合。
  28. 一種治療呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之肽的轉移性病變的方法，該方法包括以下步驟：識別轉移性病變並且用結合SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)之T淋巴球群來治療該轉移性病變，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
  29. 一種引起對於轉移性病變之免疫反應的方法，該轉移性病變呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之肽，該方法包括以下步驟：識別轉移性病變並且用結合SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 310)之T淋巴球群來治療該轉移性病變，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
  30. 如請求項28及29中任一項所述之方法，其中該T淋巴球群包括如請求項9至11中任一項所述之重組T淋巴球群或藉由如請求項12所述之方法產生的活化CD8+細胞毒性T淋巴球群。
  31. 如請求項24至26及28至30中任一項所述之方法，其中該肽由SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)組成。
  32. 一種核酸，其包含編碼由SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)組成之至少一種抗原肽的至少一個編碼序列。
  33. 如請求項32所述之核酸，其為mRNA。
  34. 如請求項33所述之核酸，其中該mRNA包括5’非翻譯區(UTR)及/或3’UTR。
  35. 如請求項33至34中任一項所述之核酸，其中該mRNA包含代替尿苷的經修飾核苷。
  36. 如請求項33至35中任一項所述之核酸，其中該經修飾核苷選自假尿苷(ψ)、N 1-甲基-假尿苷(m 1Ψ)及5-甲基-尿苷(m5U)。
  37. 如請求項33至36中任一項所述之核酸，其包含經密碼子優化且/或與野生型編碼序列相比，G/C含量增加且尿苷含量減少的編碼序列，其中該密碼子優化及/或該G/C含量之增加較佳不改變所編碼胺基酸序列之序列。
  38. 如請求項32至37中任一項所述之核酸，該核酸為選自由以下組成之群的至少一者：SEQ ID NO： • 314 (PRAME mRNA) • 315 (PRAME mRNA GC富集) • 316 (PRAME cDNA) • 317 (PRAME 004 mRNA) • 318 (PRAME 004 mRNA GC富集) • 319 (PRAME 004 cDNA)。
  39. 一種組成物或醫藥製劑，其包含如請求項32至38中任一項所述之核酸。
  40. 如請求項33至39中任一項所述之組成物或醫藥製劑，其中該組成物包含具有70%或更大RNA完整性的mRNA。
  41. 如請求項33至40中任一項所述之組成物或醫藥製劑，其中該組成物包含具有70%或更大封蓋度之mRNA，較佳其中至少70%、80%或90%之該mRNA物質包含Cap1結構。
  42. 如請求項33至41中任一項所述之組成物或醫藥製劑，其中該至少一種核酸與一種或多種脂質或基於脂質之載劑複合或結合，從而形成較佳包封該至少一種核酸的脂質體、脂質奈米粒子(LNP)、脂質複合物及/或奈米脂質體。
  43. 如請求項42所述之組成物或醫藥製劑，其中該LNP包括 (i) 至少一種陽離子脂質 (ii) 至少一種中性脂質 (iii) 至少一種類固醇或類固醇類似物；及 (iv) 至少一種聚合物偶聯脂質，較佳PEG脂質。
  44. 如請求項43所述之組成物或醫藥製劑，其中(i)至(iv)之莫耳比為約20-60%陽離子脂質、5-25%中性脂質、25-55%固醇及0.5-15% PEG脂質。
  45. 如請求項43至44中任一項所述之組成物或醫藥製劑，其中該陽離子脂質係選自由以下組成之群的至少一種： a) SM-102 (十七烷-9-基-8-{(2-羥乙基)[6-側氧基-6-(十一烷氧基)己基]胺基}辛酸酯) b) ALC-0315 ([(4-羥基丁基)氮雜二基]雙(己基-6,1-二基)雙(2-己基癸酸)。
  46. 如請求項43至45中任一項所述之組成物或醫藥製劑，其中該聚合物偶聯脂質係選自由以下組成之群的至少一種： a) 其中n之平均值範圍為≥ 30至≤ 60，較佳其中n之平均值為44或45，較佳1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG2000 DMG) b) 其中n之平均值範圍為≥ 30至≤ 60，較佳其中n之平均值為49或45，較佳2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙醯胺(ALC-0159)。
  47. 如請求項43至46中任一項所述之組成物或醫藥製劑，其中該中性脂質係1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。
  48. 如請求項43至47中任一項所述之組成物或醫藥製劑，其中該類固醇或類固醇類似物係膽固醇。
  49. 如請求項40至48中任一項所述之組成物或醫藥製劑，其為疫苗。
  50. 一種引發對腫瘤或轉移性病變之免疫反應的方法，該腫瘤或轉移性病變在細胞表面上呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之肽，該方法包括以下步驟：向患者投與如請求項40至49中任一項所述之組成物。
  51. 如請求項40至49中任一項所述之組成物，其用於(製造藥物供)治療(i)被診斷為腫瘤或轉移性病變，(ii)患有腫瘤或轉移性病變或(iii)處於患上腫瘤或轉移性病變之風險中的患者，該腫瘤或轉移性病變在細胞表面呈現包含SLLQHLIGL (SEQ ID NO:310)之肽。
  52. 如請求項50所述之方法或如請求項51所述之供使用的組成物，其中該腫瘤選自由以下組成之群：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
  53. 一種用於(製造藥物供)治療轉移或轉移性病變的抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白選自由以下組成之群：TPP-1295、TPP1298、TPP-230、TPP-669或TPP-1333。
  54. 如請求項53所述之抗原結合蛋白，其中TPP-1295包括連接在一起形成第一抗原結合域及第二抗原結合域的第一多肽鏈及第二多肽鏈， 其中該第一抗原結合域包括 T細胞受體(TCR) α可變結構域，該結構域包括 互補決定區(CDR)a1，該區包含SEQ ID NO:320之胺基酸序列， 視情況地，包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列之CDRa2，及 包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之CDRa3，及 TCR β可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:325之胺基酸序列之CDRb1， 視情況地，包含SEQ ID NO:326之胺基酸序列之CDRb2，及 包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列之CDRb3。
  55. 如請求項53所述之抗原結合蛋白，其中TPP-1298包括連接在一起形成第一抗原結合域及第二抗原結合域的第一多肽鏈及第二多肽鏈， 其中該第一抗原結合域包括 TCR α可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:330之胺基酸序列之CDRa1， 視情況地，包含SEQ ID NO:331之胺基酸序列之CDRa2，及 包含SEQ ID NO:332之胺基酸序列之CDRa3，及 TCR β可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:335之胺基酸序列之CDRb1， 視情況地，包含SEQ ID NO:336之胺基酸序列之CDRb2，及 包含SEQ ID NO:337之胺基酸序列之CDRb3。
  56. 如請求項53所述之抗原結合蛋白，其中TPP-230包括連接在一起形成第一抗原結合域及第二抗原結合域的第一多肽鏈及第二多肽鏈， 其中該第一抗原結合域包括 TCR α可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:340之胺基酸序列之CDRa1， 視情況地，包含SEQ ID NO:341之胺基酸序列之CDRa2，及 包含SEQ ID NO:342之胺基酸序列之CDRa3，及 TCR β可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:345之胺基酸序列之CDRb1， 視情況地，包含SEQ ID NO:346之胺基酸序列之CDRb2，及 包含SEQ ID NO:347之胺基酸序列之CDRb3。
  57. 如請求項53所述之抗原結合蛋白，其中TPP-669包括連接在一起形成第一抗原結合域及第二抗原結合域的第一多肽鏈及第二多肽鏈， 其中該第一抗原結合域包括 TCR α可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:350之胺基酸序列之CDRa1， 視情況地，包含SEQ ID NO:351之胺基酸序列之CDRa2，及 包含SEQ ID NO:352之胺基酸序列之CDRa3，及 TCR β可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:355之胺基酸序列之CDRb1， 視情況地，包含SEQ ID NO:356之胺基酸序列之CDRb2，及 包含SEQ ID NO:357之胺基酸序列之CDRb3。
  58. 如請求項53所述之抗原結合蛋白，其中TPP-1333包括連接在一起形成第一抗原結合域及第二抗原結合域的第一多肽鏈及第二多肽鏈， 其中該第一抗原結合域包括 TCR α可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:360之胺基酸序列之CDRa1， 視情況地，包含SEQ ID NO:361之胺基酸序列之CDRa2，及 包含SEQ ID NO:362之胺基酸序列之CDRa3，及 TCR β可變結構域，該結構域包括 包含SEQ ID NO:365之胺基酸序列之CDRb1， 視情況地，包含SEQ ID NO:366之胺基酸序列之CDRb2，及 包含SEQ ID NO:367之胺基酸序列之CDRb3。
  59. 如請求項50所述之方法、如請求項51所述之供使用的組成物、或如請求項53至58中任一項所述之抗原結合蛋白，其中該轉移或轉移性病變係選自由以下組成之群的至少一種： • ACC轉移 • BLCA轉移 • BRCA轉移 • TNBC轉移 • CRC轉移 • HNSCC轉移 • HNAC轉移 • MEL轉移 • SKCM轉移 • UVM轉移 • LC轉移 • NSCLC轉移 • NSCLCadeno轉移 • NSCLCsquam轉移 • NSCLCother轉移 • SCLC轉移 • CHOL轉移 • ESCA轉移 • CESC轉移 • OC轉移 • OV轉移 • LIHC轉移 • RCC轉移 • KIRC轉移 • KIRP轉移 • SARC轉移 • FS轉移 • LPS轉移 • MPNST轉移 • SS轉移 • STAD轉移 • TGCT轉移 • THYM轉移 • UCS轉移 • UCEC轉移、及/或 • UEC轉移。
  60. 如請求項50所述之方法、如請求項51所述之供使用的組成物、或如請求項53至58中任一項所述之抗原結合蛋白，其中該轉移或轉移性病變來源於選自由以下組成之群的癌症：腎上腺皮質癌、肺癌、非小細胞肺癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、間皮瘤、乳腺癌、乳腺癌瘤、三陰性乳腺癌、原發性腦癌、卵巢癌、子宮癌、子宮癌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、頭頸部腺癌、結腸癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、惡性外周神經鞘腫瘤、滑膜肉瘤、生殖細胞瘤、淋巴瘤、睾丸癌、睾丸生殖細胞腫瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鱗癌、急性髓系白血病、幽門螺桿菌誘導之MALT非霍奇金淋巴瘤、膠質母細胞瘤、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌、肝細胞癌、肝癌、尤因肉瘤、子宮內膜癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、非典型腦膜瘤、甲狀腺乳頭狀癌、胸腺瘤、腦腫瘤、涎腺管癌、及結外T/NK細胞淋巴瘤。
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