UA126386C2 - Антитіло до cd127 - Google Patents

Abstract

Винахід стосується антитіла, яке підходить для терапевтичного та діагностичного застосування, що націлене на CD127, альфа-ланцюг рецептора IL7, і передбачає, зокрема, гуманізовані моноклональні антитіла до CD127, зокрема CD127 людини, його терапевтичні та діагностичні застосування.

Description

Винахід відноситься до області поліпептидів або антитіл, що підходять для терапевтичного та діагностичного застосування, націлених на СО127, альфа-ланцюг рецептора 117, і забезпечує, зокрема, гуманізовані моноклональні антитіла проти СО127, зокрема СО127 людини, їх терапевтичне та діагностичне застосування.

Короткий опис винаходу

Альфа-ланцюг (або субодиниця) рецептора інтерлейкіну- 7 (1-7) позначається як СО127 або роб 1-7 або ІЇ-7Кальфа або ІІ -7Ка (іноді також позначається ІІ -7Ка). В конкретному аспекті винаходу антитіла, зокрема моноклональні антитіла, запропоновані у даному документі, спрямовані проти альфа-ланцюга рецептора людського ІЇ-7, що експресується на клітинах людини. В конкретному аспекті винаходу антитіла, запропоновані у даному документі, мають антагоністичні властивості для взаємодії 1 -7-ІІ -7К, здатні проявляти цитотоксичну активність у відношенні СО127-позитивних клітин, але не збільшують дозрівання дендритних клітин (ОС), індуковане Т5І Р. Зокрема, антитіла, запропоновані у даному документі, розпізнають людський епітоп СО127, що містить послідовності з сайту 265 в СО127, зокрема цей епітоп містить людські послідовності СЮО127 домену 01 і сайту 26 С0127, зокрема цей епітоп містить щонайменше одну послідовність з 01 ії щонайменше одну послідовність з сайту 260, переважно з третього бета-шару сайту 265 в СО127. На додаток або в якості альтернативи, в конкретному аспекті винаходу, антитіла, запропоновані у даному документі, не індукують інтерналізацію СО127 й/або інгібують індуковану ІЇ7 інтерналізацію СО127. В конкретному аспекті винаходу антитіла, запропоновані у даному документі, є гуманізованими та містять щонайменше 80 95 і переважно щонайменше 84 95 або щонайменше 85 95 людських залишків. В конкретному аспекті винаходу антитіла, запропоновані у даному документі, роблять швидкий вплив на ефекторні Т-клітини пам'яті, тривалу дію на ефекторні Т-клітини пам'яті або, переважно, швидку та тривалу дію на ефекторні Т-клітини пам'яті. В конкретному аспекті винаходу антитіла, запропоновані у даному документі, дозволяють їх ефективне продукування. В конкретному аспекті винаходу для оцінки ймовірності відповіді можуть бути виміряні рівні експресії СО127, 1-7 і/або Т5І Р, зокрема, з використанням антитіл проти СО127, що запропоновані у даному документі. На додаток до антитіл, запропонованих у даному документі, зокрема, в якості засобів для одержання антитіл іабо для застосувань, подібних зазначеним антитілам, запропоновані поліпептиди, зокрема

Зо варіабельні домени легкого ланцюга антитіла або легкі ланцюги антитіла, антигензв'язуючі фрагменти та молекули-міметики таких антитіл і полінуклеотидів.

Автори даного винаходу прагнули одержати вдосконалені гуманізовані антитіла у порівнянні з антитілами М1382-й1, М1382-п2 і М1382-п3, розкритими у УМО 2015/189302. Хоча відомо, що деякі залишки в каркасних послідовностях варіабельних доменів, включаючи залишки в зоні

Верньє, канонічні залишки, залишки на межі УНЛ/.. і т.д., є критичними в структурі антитіла та не підлягають мутації для збереження біохімічної та біологічної активності антитіла, автори даного винаходу несподівано виявили, що деякі мутації в каркасній послідовності варіабельного домену легкого ланцюга М1382, включаючи деякі з таких критичних залишків, дозволяють збільшувати вміст залишків людини (вище, ніж М1382-п3 й аж до 86,3 95) і підвищити продукування (до 4 разів вище, ніж у М1382-п3) при збереженні всіх функціональних можливостей.

Ці мутації складаються з 16 амінокислотних замін у каркасній послідовності варіабельного домену легкого ланцюга М1382 ії, зокрема, додатково в заміні залишку валіну в положенні 48 залишком лейцину (М481) та/або в заміні залишку фенілаланіну в положенні 87 залишком тирозину (Е87У). Ці положення та будь-які положення амінокислот для ланцюгів антитіл, запропонованих у даному документі, якщо не зазначено інше, позначені з використанням нумерації Кабат. У даному документі запропоновані вдосконалені варіабельні домени легкого ланцюга антитіла, що складаються з наступних послідовностей: - ЗЕО ІО Мо: 9 (включаючи зазначені 16 амінокислотних замін - зазначений варіабельний домен легкого ланцюга антитіла у подальшому позначений М1ІЗВ2-НМІ 3); - ЗЕО ІЮ Мо: 10 (включаючи зазначені 16 амінокислотних замін і, крім того, з мутацією М48Г. - зазначений варіабельний домен легкого ланцюга антитіла у подальшому позначений М1382-

НМ 4); - ЗЕО ІЮ Мо: 11 (включаючи зазначені 16 амінокислотних замін і, крім того, з мутацією Е87У - зазначений варіабельний домен легкого ланцюга антитіла у подальшому позначений М1382-

МІ 5) ;і - ЗЕО ІЮ Мо: 12 (включаючи зазначені 16 амінокислотних замін і, крім того, обидві мутації

М48І і г87У) - зазначений варіабельний домен легкого ланцюга антитіла позначений у подальшому М1382-ПМІ 6). 60 Таким чином, варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, позначений у даному документі М13В82-РМІ 3, містить всі СОК із М1382-п3, зазначені 16 амінокислотних замін і вихідні залишки з М13В2 у критичних положеннях 48 і 87 (тобто відповідно М і Е) у людських каркасних послідовностях і має послідовність ЗЕО ІО Мо: 9. Варіабельний домен легкого ланцюга переважного вдосконаленого антитіла, запропонованого у даному документі, позначений

М1382-пМІ 6, що включає додатково обидві мутації М481 і Е87У, складається з послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮО Мо: 12.

Для фахівця буде несподіваним, що зазначені мутації, особливо у таких положеннях у каркасах варіабельного домену легкого ланцюга, не впливають на афінність антитіла з СО127:

У48 є канонічним залишком, а Е87 розташований на межі МН/Л/І; мутація таких залишків, як відомо фахівцю й описано, наприклад, в Сіагк, 2014, повинна впливати на афінність та/або стабільність антитіла. Використовуваний у даному документі термін "канонічний" залишок відноситься до залишку в СОЕ. або каркасі, який визначає конкретну канонічну структуру СОЕК, як визначено СпПоїпйіа еї аї., У. Мої. Віо!. 196: 901-907 (1987); Споїтіа еї аї., У. Мої. Віої!. 227: 799 (1992). Згідно з Споїйіа єї аї., критичні частини СОК багатьох антитіл мають майже ідентичні конформації пептидного кістяка, незважаючи на велику різноманітність на рівні амінокислотної послідовності. Кожна канонічна структура визначає насамперед набір торсіонних кутів пептидного кістяка для суміжного сегмента амінокислотних залишків, що утворюють петлю.

Неможливо було передбачити, що введення розкритих у винаході мутацій в обох положеннях призведе до поліпшення продукування, при цьому зберігаючи властивості зв'язування та, що досить корисно, інші функціональні властивості цих антитіл.

Відповідно, у даному документі запропонований поліпептид, що підходить, зокрема, для одержання таких антитіл, зокрема варіабельного домену легкого ланцюга антитіла або легкого ланцюга антитіла, що складається з послідовності, зокрема до 250 амінокислот, що включає або складається з послідовності, зазначеної в ХЕО ІЮО МО: 9; ЗЕО ІЮО МО: 10; або 5ЕО ІЮО МО: 11; або ЗЕО ІО МО: 12, або його антигензв'язуючий фрагмент, або його молекулу-міметик антитіла, відповідно до наведеного нижче визначення. В конкретному аспекті винахід відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, запропонованих у даному документі, зокрема до гуманізованих моноклональних антитіл, що специфічно зв'язуються з СО127, зокрема з людським СО127, і містять:

Зо - легкий ланцюг антитіла, що містить, або варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, що складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з ЗЕО ІЮ Мо: 9; 5ЕО ІЮ Мо: 10;

ЗЕО ІЮО Мо: 11; 5ЕО ІО Мо: 12; зокрема 5ЕО ІО Мо: 12; і - варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що містить три СОК, що складаються з послідовностей, наведених в 5ЕО ІЮ Мо: 1, ЗЕО ІО Мо: 2 ії 5ЕО ІЮ Мо: 3, зокрема варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, який складається з послідовності, що зазначена в 5ЕО ІЮО Мо: 7.

У переважному варіанті реалізації винахід відноситься до антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, запропонованих у даному документі, зокрема до гуманізованих моноклональних антитіл, що специфічно зв'язуються з СО127, зокрема з людським СО127, і містять: - варіабельний домен легкого ланцюга, що складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з ЗЕО ІЮО Мо: 9, 5ЕО ІЮ Мо: 10, 5ЕО ІЮ Мо: 11 ї БЕО ІО Мо: 12, зокрема ЗЕО ІО

Мо: 12; їі - варіабельний домен важкого ланцюга, що містить три СОЖК, що складаються з послідовностей, наведених в 5ЕО ІЮ Мо: 1, ЗЕО ІО Мо: 2 ії 5ЕО ІЮ Мо: 3, зокрема варіабельний домен важкого ланцюга, який складається з послідовності, що зазначена в ЗЕО ІО Мо: 7.

В конкретному аспекті винаходу антитіло, запропоноване у даному документі, містить легкий ланцюг з варіабельним доменом, як зазначено вище, та константний домен, який складається з послідовності, вибраної з БЕО ІЮО Мо: 27 або 28, переважно 5ЕО ІЮО Мо: 27, і важкий ланцюг з варіабельним доменом, як зазначено вище, та константним доменом, що складається з

БО послідовності, що зазначена в ЗЕО ІО Мо: 26.

Також у даному документі запропонований виділений поліпептид, що складається з послідовності до 250 амінокислот, конкретно до 217, до 214, до 211, більше конкретно, до 200, до 175, до 150, до 135, до 120, до 107, і ще більше конкретно, до 100, до 90, до 80, до 74, до 70, до 60 амінокислот, причому зазначена послідовність включає або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з: - БЕО ІЮ Мо: 9 (СОВ-області з М1382-п3 у каркасних послідовностях людини); - ЗЕО ІО Мо: 10 (СОВ-області з М1382-п3 у каркасних послідовностях людини, включаючи мутацію М481І); - ЗЕО ІО Мо: 11 (СОВ-області з М1382-п3 у каркасних послідовностях людини, включаючи бо мутацію Е87У);

- ЗЕО ІО Мо: 12 (СОВ-області з М1382-п3 у каркасних послідовностях людини, включаючи обидві мутації МА8І і Е877); і - відповідний антигензв'язуючий фрагмент, зокрема зазначений фрагмент, що містить три

СОК, які складаються з послідовностей, що наведені в 5ЕО ІЮО Мо: 4, ЗЕО ІО Мо: 5 і 5ЕО ІО Мо: б, більше конкретно фрагмент, що містить щонайменше 74 амінокислоти, включаючи амінокислоти з 24 по 97 із ФЕО ІЮ Мо: 12.

У даному документі також запропоновані полінуклеотиди, що кодують поліпептиди, запропоновані у даному документі, зокрема антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти за винаходом. Такі полінуклеотиди кодують, зокрема, поліпептиди, що містять або складаються з послідовності, вибраної з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 9-12, а також кодують поліпептиди, що містять або складаються з послідовностей, вибраних із 5ЕО ІЮ МО: 1-3, зокрема ЗЕО ІЮО Мо: 7, і можуть також кодувати поліпептиди, що містять або складаються з послідовностей, вибраних із групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 26-28. Зокрема, зазначені полінуклеотиди містять або складаються з комбінації щонайменше двох виділених послідовностей (молекул) нуклеїнових кислот, причому перша виділена молекула нуклеїнової кислоти містить або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з 5ЕО І

МО: 15-18; зокрема 5ЕО ІО Мо: 18; зазначена комбінація також містить або складається з другої виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що містить або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з БЕО ІЮО Мо: 13 ї БЕО ІЮ МО: 29-31, зокрема 5ЕО ІО Мо. 13.

Зокрема, поліпептид за винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або легкий ланцюг антитіла, причому зазначений поліпептид містить щонайменше 84 95 і більше конкретно щонайменше 85 95 людських залишків. Зазначений поліпептид може являти собою антигензв'язуючий фрагмент і/або молекулу-міметик антитіла з антитіла, розкритого у даному документі.

У даному документі також представлені композиції, що містять зазначені поліпептиди, зокрема варіабельні домени легкого ланцюга антитіла або легкі ланцюги антитіла, антитіла, антигензв'язуючий фрагмент або відповідну молекулу-міметик антитіла, способи одержання зазначених антитіл, молекули нуклеїнової кислоти, що кодують зазначені поліпептиди й антитіла, і застосування зазначених поліпептидів, антитіл і композицій.

Відповідно, поліпептиди, варіабельні домени легкого ланцюга антитіла, легкі ланцюги антитіла, антитіла, антигензв'язуючі фрагменти, молекули-міметики антитіла та композиція, запропоновані у даному документі, можуть бути призначені та/або бути підходящими для застосування з метою лікування стану, діагностованого у пацієнта-людини, який виникає в результаті патогенезу, що пов'язаний з лімфопоезом, коли зазначеному патогенезу сприяють сигнальні шляхи 1-7, особливо коли збільшення дозрівання, точніше, активація костимулюючих молекул дендритних клітин є небажаною.

Докладний опис винаходу

Біохімія

СО0127 є загальним для рецептора 1-7 (/-7К) і для рецептора Т5І Р (Т5ІРК). ІС-7А складається з гетеродимера СО127 і загального гамма-ланцюга (ус) рецепторів інтерлейкіну.

Загальний гамма-ланцюг ус іноді позначається у даному документі та в літературі як СО132. І -

ТА зв'язується інтерлейкіном 7. Рецептор Т5І Р являє собою гетеродимер СО127 і фактора 2, подібного рецептору цитокінів (СКІ Е2). Рецептор Т5ІР зв'язується Т5І Р. В літературі Т5І РК іноді використовується для позначення як ланцюги рецептора СКІБЕ2, так і комплексу

С0127/СА 2. Щоб уникнути плутанини у подальшому ТЗІ РК зазвичай означає комплекс.

СОр127 (номер доступу Зм/із5 Ргої Р16871) може існувати в чотирьох ізоформах. Канонічна ізоформа, яку також називають Н20 (Зм/іє5 Ргої Р16871.1), являє собою однопрохідний трансмембранний білок і містить 459 амінокислот, що складаються, від М- до С-кінця, із сигнального пептиду 3 20 амінокислот, позаклітинного домену з 219 амінокислот, трансмембранного домену з 25 амінокислот і внутрішньоклітинного домену з 195 амінокислот.

Інші ізоформи мають загальну послідовність (або більшу частину) позаклітинного домену Н2О Її демонструють різні С-кінцеві послідовності. ІзЗоОформи 2 і 4 є такими, що секретуються (5м/і55

Ргої РІбВ871-4 і РІб871-3), у той час як ізоформа З (Бму/із5 Ргої Р16871-2) також є трансмембранним білком. Повідомляється, що СО127 має послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 21, а його позаклітинний домен, коли сигнальний пептид вилучений, має послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 22.

Якщо не вказано інше, використовувана у даному документі нумерація для амінокислот СО127, являє собою нумерацію з ЗЕО ІЮО Мо: 22.

СОр127 являє собою рецептор із класу гомології цитокінових рецепторів І (СЕН І). Як добре відомо в даній області, позаклітинсний домен цих рецепторів складається з двох доменів бо фібронектину 3, що називають 01 ії 02. Точна кристалографічна структура СО127 була опублікована й обговорена, наприклад, в МеЕїЇгоу еї а!., 2009; МеЕїЇгоу еї аї!., 2012 ії УмаЇїбИ, 2012 і, зокрема, була розкрита у вигляді даних про структуру білка у базі даних білків Колаборації за дослідженням структурної біоінформатики (КСВ РОВ) з номером доступу ЗИиР1. Зазвичай вважається, що 01 бере участь у зв'язуванні з 1І-7, тоді як 02 бере участь у зв'язуванні з ус- ланцюгом (а також з 1-7). Важливо, що сайт 25 домену 02 містить три бета-шари, включаючи наступні послідовності ЗЕО ІО Мо. 32 (ЕІ 5МІМКЕ); 5ЕО ІЮ Мо: 33 (МОРММТЕМТ5) і 5ЕО ІЮ Мо: 34 (ТК ТОК). Таким чином, сайт 265 домену 02 включений між амінокислотами 109 і 180 5ЕО

ІО Мо: 22 (див. УмМаїбєй, 2012; Мегзігаєїе, К. еї аї., Маїшге Сот 2017). Сайт 265 домену 02 також може бути визначений як включений між амінокислотами 109 і 173 5ЕО ІЮО Мо. 22. Сайт 25 домену 02 також може бути визначений як включений між амінокислотами 113 ії 180 5ЕО ІЮ Мо. 22. Сайт 265 домену 26 також може бути визначений як включений між амінокислотами 113 і 173

ЗБО І Мо. 22. Зокрема, сайт 205 домену 02 включає, зокрема, складається, по суті, з амінокислот 109-133 5ЕО ІО Мо: 22, зокрема від 109 до 127, де перші два бета-шари локалізовані; й амінокислот з 166 по 180 5ЕО ІЮ Мо: 22, де третій бета-шар локалізований.

Більше конкретно, сайт 20 складається в основному з амінокислот від 113 до 133, зокрема від 113 до 127, 5ЕО ІЮ Мо: 22 і з амінокислот від 166 до 180 з 5ЕО ІЮО Мо: 22. Зокрема, сайт 265 складається по суті з амінокислот від 109 до 133, зокрема від 109 до 127, з БЕО ІО Мо: 22 й амінокислот від 166 до 173 з БЕО ІЮО Мо: 22. Більше конкретно, сайт 265 складається по суті з амінокислот від 113 до 133, зокрема 113-127, з БЕО ІО Мо: 22 й амінокислот 166-173 з 5ЕО І

Мо: 22. Сайт 25 домену 02 є критичним для взаємодії СО127-ус, зокрема, для дозволу або збільшення зв'язування СО127 з ус у присутності І--7. Зокрема, мутації у Р112 і І 115, які були ідентифіковані у пацієнтів, що страждають від важкого комбінованого імунодефіциту (ЗСІЮ), як вважають, дестабілізують гідрофобне ядро домену 02, що, ймовірно, призводить до їхніх патогенних ознак.

Як зазначено вище, сайт 26 складається, по суті, з амінокислот 109-180 із БЕО ІО Мо: 22, або складається, по суті, з амінокислот 109-173 із БЕО ІЮО Мо. 22, або складається, по суті, З амінокислот 113-180 із БЕО ІО 22 або складається, по суті, з амінокислот 113-173 із ФЕО ІЮ Мо. 22. Фахівець зрозуміє, що кінці такого домену не обов'язково можуть бути однозначно визначені з точністю до однієї основи, і що сайт 265 можна розуміти, як такий, що містить на одному або

Ко) обох кінцях згаданої послідовності(ей) на 1, 2 або З більше або менше амінокислот. Отже, при згадуванні у даному документі сайту 25 або СО127, слід розуміти, що це відноситься до послідовності СЮО127, що починається у положенні 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 або 113 і закінчується у положенні 173, 174, 175 176, 177, 178, 179 або 180 або 5ЕО ІО Мо: 22; зокрема, до такої послідовності, яка, як вважають або показано, складає суттєво важливий сайт зв'язування з ус-ланцюгом 1І7-К, зокрема, у присутності І-7. Більше конкретно, коли у даному документі згадується сайт 265 СО127, слід розуміти, що це відноситься до послідовності СО127, що починається у положенні 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 або 113 і закінчується у положенні 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 або 133 5ЕО ІО Мо: 22, але також і до послідовності

СО127, що починається у положенні 162, 163, 164, 165 або 166 і закінчується у положенні 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 або 180 із БЕО ІЮО Мо: 22. Слід зазначити, що три бета-шари, як визначено у даному документі, можуть містити епітопні послідовності, специфічні для антитіл або антигензв'язуючих фрагментів або антигензв'язуючого міметика відповідно до винаходу.

Антитіла, антигензв'язуючі фрагменти й антигензв'язуючі міметики за винаходом можуть бути здатні специфічно зв'язуватися з 5ЕО ІЮО Мо: 32, 5ЕО ІЮ Мо: 33 і/або 5ЕО ІЮО Мо: 34. Крім того, амінокислотна послідовність, що містить у щонайменше, частину одного бета-шару та деяких суміжних амінокислот, локалізованих на одному кінці будь-якого бета-шару, також може являти собою послідовність епітопу, специфічну для антитіла за винаходом. Як приклад, послідовність

ЗЕО ІЮ Мо: 35 (ТПГОЕКІ ОРААМТЕЇ) містить останні п'ять амінокислот третього бета-шару та десять додаткових амінокислот, локалізованих поза третім бета-шаром. В якості іншого прикладу, 5ЕО ІО Мо: 96 (ККГОРААМ) містить одну амінокислоту, локалізовану у третьому бета-шарі, та сім додаткових амінокислот, локалізованих поза третім бета-шаром. Зокрема, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик за винаходом можуть специфічно зв'язуватися з К173 ЗЕО ІЮО Мо: 22. Зокрема, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик згідно з винаходом можуть специфічно зв'язуватися щонайменше з однією послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮО Мо: 32; 5ЕО ІО Мо: 33; 5ЕО ІЮО Мо: 34, 5ЕО ІО Мо: 35 ії 5ЕО ІЮО Мо: 96.

Зокрема, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик за винаходом можуть специфічно зв'язуватися щонайменше з однією послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮ Мо: 36 (І МЕМКСІ МЕК); ЗЕО ІЮ Мо: 37 (ІССАЇ МЕМКСІ МЕК) і 60 ЗЕО ІО Мо: 38 (І МЕМКСІ МЕКК). В якості альтернативи або доповнення, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик за винаходом можуть специфічно зв'язуватися щонайменше з однією послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮ

Мо: 39 (ККЕГІС); ЗЕО І Мо: 40 (ККЕЦП ІСКЗМІ) ії БЕО ІЮ Мо: 41 (РІЕТККЕЇ ГІС). 5ЕО ІО Мо: 36- 5ЕО ІО Мо: 41 локалізовані в домені 01 із СО127 й являють собою епітопні послідовності, розпізнавані антитілом або його антигензв'язуючим фрагментом або молекулою-міметиком антитіла відповідно до винаходу. В альтернативному або додатковому варіанті реалізації винаходу антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент або молекула-міметик антитіла згідно з винаходом можуть специфічно зв'язуватися щонайменше з однією послідовністю, вибраною з групи, що складається з БЕО ІЮ Мо: 42 (СІ МЕМ) і 5ЕО ІО Мо: 43 (РІЕТККРЕ). Ці дві послідовності являють собою епітопні послідовності, локалізовані в домені ОТ із СО127. В конкретному варіанті реалізації винаходу антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик за винаходом можуть специфічно зв'язуватися щонайменше з однією послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЗЕО ІЮ Мо: 32; 5ЕО ІЮ Мо: 33; ЗЕО

ІО Мо: 34, 5ЕО ІЮО Мо: 35 і 5ЕО ІО Мо: 96, зокрема, з групи, що складається з 5ЕО ІЮО Мо: 34,

ЗЕО ІЮ Мо: 35 і 5ЕО ІЮ Мо: 96; і щонайменше з однією послідовністю, вибраною з групи, що складається з ЗЕО ІЮ Мо: 36; 5ЕО ІЮО Мо: 37; 5ЕО ІЮ Мо: 38; 5ЕО ІЮ Мо: 39; 5ЕО ІЮО Мо: 40; 5ЕО

ІО Мо: 41; 5ЕО ІО Мо: 42 і 5ЕО ІО Мо: 43, зокрема, з групи, що складається з 5ЕО ІО Мо: 42 і

ЗЕО ІО Мо: 43. У переважному варіанті реалізації винаходу антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик можуть специфічно зв'язуватися з ЗЕО ІЮО Мо: 34 і щонайменше з однією послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІО Мо: 42 і 5ЕО

ІО Мо: 43, зокрема, з БЕО ІО Мо: 42 і БЕО ІО Мо: 43. У переважному варіанті реалізації винаходу антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, або антигензв'язуючий міметик можуть специфічно зв'язуватися з ЗЕО ІЮ Мо: 35 і щонайменше з однією послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮО Мо: 42 ії 5ЕО ІО Мо: 43, зокрема, з БЕО ІЮО Мо: 42 ї БЕО ІО Мо: 43. У переважному варіанті реалізації винаходу антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик можуть специфічно зв'язуватися з ЗЕО ІЮО Мо: 96 і щонайменше з однією послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮ Мо: 42 і 5ЕО ІЮ Мо: 43, зокрема з 5ЕО ІО Мо: 42 і 5ЕО ІЮО Мо: 43. У переважному варіанті реалізації винаходу антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик можуть специфічно

Зо зв'язуватися з обома послідовностями 5ЕО ІЮО Мо: 35 і ЗЕО ІО Мо: 96. У переважному варіанті реалізації винаходу антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, або антигензв'язуючий міметик можуть специфічно зв'язуватися з обома послідовностями ЗЕО ІЮ Мо: 42 і 5ЕО ІЮО Мо: 43. У конкретному варіанті реалізації винаходу антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик за винаходом можуть специфічно розпізнавати щонайменше третій бета-шар сайту 25 домену Ю2 СО127. Третій бета-шар переважно визначається як локалізований між амінокислотами 166 і 173 5ЕО ІО Мо: 22, що відповідає 5ЕО ІЮО Мо. 34, Її більше конкретно, третій бета-шар відповідає ЗЕО ІЮ Мо. 34. У більше конкретному варіанті реалізації винаходу антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик відповідно до винаходу можуть специфічно розпізнавати щонайменше два з бета- шарів, що локалізовані в сайті 20 домену 02, і більше конкретно, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик згідно з винаходом можуть специфічно розпізнавати три бета-шари, локалізованих в сайті 205 домену 02, згідно з визначенням вище. У більше конкретному варіанті реалізації винаходу антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, або антигензв'язуючий міметик можуть специфічно розпізнавати щонайменше один бета-шар, локалізований в сайті 25 домену 02, зокрема третій бета-шар, що відповідає ЗЕО ІЮ Мо. 34, і зв'язуються щонайменше з однією послідовністю, вибраною з групи, що складається з БЕО ІЮ Мо: 36; 5ЕО ІЮ Мо: 37; 5ЕО ІЮ Мо: 38; 5ЗЕО ІО Мо: 39; 5ЕО ІЮ Мо: 40;

ЗБЕО ІО Мо: 41; 5ЕБЕО ІЮ Мо: 42 і 5ЕО ІО Мо: 43. У переважному варіанті реалізації винаходу антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, або антигензв'язуючий міметик можуть специфічно розпізнавати щонайменше третій бета-шар, що відповідає 5ЕБЕО ІЮО Мо: 34, і щонайменше одну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ Мо: 42 і 5ЕО ІЮО Мо: 43, зокрема, з ЗЕО ІЮ Мо: 42 і ЗЕО ІО Мо: 43. У більше конкретному варіанті реалізації винаходу антитіло або антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик можуть специфічно розпізнавати лінійний пептид або лінійний епітоп, що складається з амінокислот ЗЕО ІО Мо: 35.

На додаток або в якості альтернативи, антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, або антигензв'язуючий міметик можуть специфічно розпізнавати конформаційний пептид або конформаційний епітоп, що складається з амінокислот з послідовністю 5ЕО ІЮО Мо 96. У більше конкретному варіанті реалізації антитіло або антигензв'язуючий фрагмент або антигензв'язуючий міметик можуть специфічно розпізнавати лінійний епітоп або лінійний пептид 60 з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ Мо: 35 і конформаційний епітоп або конформаційний пептид ЗЕО ІО Мо: 96.

Передача сигналів ІІ -7К. Зв'язування 1-7 з ІЇ-7К запускає активацію декількох сигнальних шляхів, включаючи Янус-кінази (ФАК)-1 і -3, трансдуктор сигналу й активатор транскрипції 5 (З5ТАТ5) ії фосфатидилінозол-З-кіназу (РІЗ-К). Повідомляється, що шляхи ТАТІ і 5ТАТЗ активовані, хоча вони не є основними шляхами. Активація шляху 5ТАТ»Ь5 необхідна для індукції антиапоптотичного білка Всі-2 і запобігання проникнення проапоптотичного білка Вах у мітохондрію та, таким чином, для виживання в тимусі попередників Т-клітин, що розвиваються.

Активація шляху РІЗ-К призводить до фосфорилювання та цитоплазматичного утримання проапоптотичного білка Вад.

Передача сигналів Т5І РЕ. Тимічний стромальний лімфопоетин (ТЗІ Р) являє собою цитокін епітеліальних клітин, який активний при лімфопоезі та, зокрема, бере участь в регуляції розвитку клітин імунної системи, причому ця регуляція впливає, зокрема, на дозрівання зазначених клітин. Т5І Р людини (номер доступу сСепВапк АЕ338732) є фактором, який викликає поляризацію дендритних клітин і сприяє проліферації та диференціюванню Т- і В-клітин. ТІ Р також пригнічує утворення клітин Тгеад (І єї еї а!., 2011).

Було показано, що сигнальні шляхи, індуковані Т5І Р, на молекулярному рівні відрізняються від індукованих 1-7 шляхів. Зокрема, хоча зв'язування Т5Іі Р з його рецептором також активує

Уак-1, воно не активує Чак-3, але активує Чак-2. Ці відмінності узгоджуються зі спостереженням, що ЧУак-1 асоціюється з СО127, загальним для обох рецепторів, у той час як Удак-2 асоціюється з

СКГЕ2 й дак-З3 з ус (Косптап еї аї!., 2010). Також повідомляється про активацію шляху 5ТАТ5 для передачі сигналів, індукованого Т5І Р (2попо еї аї., 2014). Одним із основних ефектів Т5І Р є те, що він призводить до активації дендритних клітин, індукуючи надекспресію костимулюючих молекул, таких як СО80, тим самим стимулюючи опосередковані ТН-2 запальні реакції (Кеспе еї а!., 2001).

Клітинна біологія

Термін "С0О127-позитивні клітини" означає клітини, що експресують СО127 на своїй клітинній поверхні. У більшості випадків СЮО127-позитивні клітини експресують СО127 в комплексі, що утворює 1-7В (І -7В-позитивні клітини), і/або в комплексі, що утворює ТЗІ РЕ (Т5І РЕ-позитивні клітини). СО127 експресується різними клітинами, у тому числі як Т-клітинами пам'яті, так і

Зо наївними Т-клітинами. СО127, зокрема, експресується ефекторними Т-клітинами (Тей), у тому числі спочиваючими та Т-клітинами пам'яті, і незрілими В-клітинами, але зокрема не експресується спочиваючими природними регуляторними Т-клітинами (природними Тгед).

СО0127 необхідний для стимулювання диференціювання тимоцитів і клональної експансії лімфоцитів.

Важливість шляху І/7-СО0127 для гомеостазу наївних Т-клітин підкреслюється декількома недавніми дослідженнями, що показують, що рівні експресії мембранозв'язаного СО127 на звичайних СО4-- Т-клітинах корелюють з частотами недавніх емігрантів тимуса (ЕТЕ)-С04--1Т- клітин в здорових людей та ВІЛ-інфікованих пацієнтів, а також у пацієнтів із РОС (АІбидиегдиеє єї а. 2007) (Вгоих еї аї., 2010). СО0127 також є компонентом рецептора Т5ІР. Було продемонстровано, що секреція Т5ЇР тільцями Хассала, структурами, що складаються з епітеліальних клітин у мозковій речовині тимуса, кондиціонує СО1ТТсжмієлоїдні дендритні клітини (МОС) для індукції диференціювання тимоцитів в Тгед (УМмаїапабре еї аї., 2005а).

Відповідно, сигнали від рецептора ІЇ/-7 необхідні для розвитку Тгед, як показано в мишей, нокаутних за СО127 (Маллисспеїїї еї аїЇ., 2008). В роботі Нааб5 сеї аї.,, 2011, автори продемонстрували зниження експресії СО127 на звичайних Т-клітинах і підвищений рівень 1-7 у плазмі, а також зниження частот недавніх емігрантів тимуса-Тгед і функції Тгед при РС без явного генетичного впливу (Нааз еї аї!., 2011).

Розгляд питання про те, як ІЇ-7 регулює міграцію своїх родинних рецепторів через мембрану, має вирішальне значення для глибокого розуміння ролі І/-7/ЛІ/-7МК у функції лімфоцитів. Попередні дослідження показали, що стимуляція Т-клітин І/-7 призводить до поверхневої понижувальної модуляції СО127 протягом 30 хвилин, можливо, через інтерналізацію рецептора. Було показано, що у більше пізні моменти часу (2-6 годин) 1-7 індукує транскрипційне подавлення СО127. Проте, фактичну динаміку інтерналізації СО127 і регуляції механізмів переносу 1ІЇ/-7 ще належить з'ясувати (Непгіднез еї аї!., 2010). Було також висловлене припущення, що ІІ -7-індукована передача сигналів залежить від інтерналізації

СОр127 і що наступна деградація рецептора залежить від активності "АКЗ й опосередковується як протеасомами, так і лізосомами.

Патофізіологія

Дендритні клітини експресують високі рівні костимулюючих молекул після дозрівання, таких бо як СО80, що стимулює опосередковані Т-клітинами імунні відповіді. Вони також продукують цитокін ТАКС (ССІ 17), який індукує хемотаксис у Т-клітинах. В такій якості, зрілі дендритні клітини вносять вклад у фізіопатологію деяких імуноопосередкованих захворювань, в яких проявляються відповіді Т-клітин, наприклад, при астмі, ревматоїдному артриті, коліті, розсіяному склерозі й увеїті. Зрілі дендритні клітини також відіграють ключову роль у процесі відторгнення клітин, тканин або алотрансплантатів органів. Тому багато терапевтичних стратегій спрямовані на запобігання дозрівання дендритних клітин.

Наявність або відсутність костимулюючих молекул на антиген-презентуючих клітинах (АРС), таких як дендритні клітини, значно впливає на якісний та кількісний характер імунної відповіді.

Надекспресія СО8О дендритними клітинами викликає дозрівання ОС і збільшує активацію Т- клітин пам'яті (Воиг-Чогдап еї аї., 2011). Механістично взаємодія СО28 з СО80 займає центральний кластер імунологічного синапса та колокалізується із залученим ТСЕК, тим самим стабілізуючи імунний синапс (Оизіїп апа Зпаму, 1999) (Сгакоиі єї а!., 1999). Взаємодія між СО28 і

Сор8о фактично створює відповідний просторовий розподіл для ТСК для ефективної взаємодії з молекулами НГА (ЗПауг апа ризіп, 1997).

Розсіяний склероз (РС) - це запальне демієлінізуюче захворювання центральної нервової системи (ЦНС). Поява демієлінізуючих бляшок у ЦНС у пацієнтів із РС асоційоване із запальним інфільтратом, що в основному складається з макрофагів і Т-лімфоцитів. На механістичному рівні РОС розглядається як аутоїмунне захворювання. РС зазвичай розглядається як захворювання, у першу чергу опосередковане СО4-Т-клітинами. Визначені субпопуляції СО4-: Тп1 ії зовсім недавно Тп17 були названі причетними до патофізіології захворювання. У даний час поки важко привласнити конкретні ролі кожній підгрупі ТА1 і Тп17.

Крім того, у даний час інгібування переносу лейкоцитів за рахунок антагонізму альфа (а4)- інтегрину підтверджено в якості терапевтичного підходу для лікування запальних захворювань, таких як РС і запальне захворювання кишечнику (З3З3К), а також для лікування атеросклерозу (2пі еї аіІ.,, 2014). а487 експресується на більше обмеженому наборі лейкоцитів, включаючи активований макрофаг, субпопуляції лімфоцитів, МК-клітини, тучні клітини й еозинофіли.

Людський 1-7 індукує сильну експресію інтегринів ай4 і В7 іп міго на Т-лімфоцитах людини та різко збільшує частоту Т-лімфоцитів людини, експресуючих інтегрини са4, В7 і а4/В7, які необхідні для хомінгу й утримання Т-лімфоцитів в. нелімфоїдних тканинах, таких як кишечник, мозок і шкіра (Оеєписсі еї аї., 2009; сСопи еї аї., 2009).

Наївні Т-клітини частково відповідальні за гостре відторгнення трансплантованих органів і тканин. Ці клітини можуть контролюватися сучасними імунодепресантами (інгібіторами кальциневрину) та моноклональними антитілами, які блокують костимуляцію (антиадгезивні, інгібітори СО80/86). Т-клітини пам'яті також відповідальні за відторгнення трансплантата. Т- клітини пам'яті накопичуються в людини завдяки набутій імунній історії, в основному - попереднім реакціям на віруси. Було показано, що Т-клітини пам'яті можуть реактивуватися алоантигенами в результаті "гетерологічного імунітету", який є перехресною реакцією нашого антивірусного захисту з алоантигенами (Адатв5 еї аї., 2003). Гетерологічний імунітет являє собою потужний бар'єр для індукції толерантності, оскільки Т-клітини пам'яті, на відміну від наївних Т-клітин, запрограмовані на швидку активацію, зі зменшеною потребою в костимулюючих сигналах. Т-клітини пам'яті також можуть бути залучені в хронічне відторгнення.

Крім своєї ролі в трансплантації органів і тканин, наївні Т-клітини та Т-клітини пам'яті також несуть частину відповідальності за багато аутоїмунних захворювань. Це стосується виразкового коліту (Зпіпойага еї аї., 2011), ревматоїдного артриту, псоріазу або хвороби "трансплантат проти хазяїна".

Запальні захворювання кишечнику (ЗЗК), такі як виразковий коліт (ВК) і хвороба Крона (СО), являють собою хронічні рецидивуючі шлунково-кишкові розлади, що характеризуються хронічним кишковим запаленням, розрегульованими імунними відповідями на мікробіоту кишечнику та дисфункцію епітеліального бар'єра (Кпог еї аї. аї., 2011; Абганат апа Спо, 2009).

Рівні захворюваності та поширеності ЗЗ3К в усьому світі ростуть, причому ці захворювання асоційовані з вираженою захворюваністю та значно впливають на якість життя та працездатність (Оапезе апа Біосспі, 2011; Ваштдай апа Запарот, 2012). Сучасні загальноприйняті способи лікування спрямовані на ослаблення запалення з поетапним використанням протизапальних агентів, імунодепресантів і біологічних агентів, націлених на запальні цитокіни, такі як фактор некрозу пухлини альфа (ТМЕа). Ключовою особливістю ЗЗ3К також є швидкий рекрутинг і тривала персистенція лейкоцитів у місці запалення, чому сприяє взаємодія інтегринів з родинними рецепторами, які експресуються ендотеліальними клітинами, що призводить до клітинної адгезії та трансміграції (Адат5 апа ЕКеїееп, 2006; Адасе, 2006).

Інноваційні способи лікування націлюються на ці "вхідні двері" у кишечник за допомогою бо молекул антиадгезії, зокрема націлюються на кишково-специфічний шлях інтегринів а4р7

(Евадап єї аї., 2013; Запарот еї аї.,, 2013)7,8. Однак ці способи лікування не підтримують ремісію більше ніж у половини пацієнтів, і рецидивні спалахи виникають у високої частки первинних відповівших. Також розвиваються опортуністичні інфекції як наслідок загальної імуносупресії. Таким чином, одна з основних цілей полягає в створенні нових способів лікування

ЗЗК і виявленні маркерів, що визначають ймовірність хронічності, відповіді та рецидивів ЗЗК.

Крім того, було показано, що деякі злоякісні клітини також демонструють 1І--7К. Це вірно для шкірної лімфоми Сезарі (60 95 з них) або дитячого гострого лімфобластного лейкозу, при якому приблизно у 15 95 випадків розвивається мутація з посиленням функції в СО127, що робить ці пухлини частково залежними від ІІ -7 (5поснаї єї аї., 2011).

Виснаження Т-лімфоцитів було очевидним імуносупресивним підходом для протидії відторгненню алотрансплантата або боротьбі з аутоїмунітетом. Однак повне виснаження Т- клітин може бути не сприятливим для індукції імунологічної толерантності. Про-толерогенний підхід може містити в собі націлювання на субпопуляції Т-клітин або селективно активовані Т- клітини без модифікації Тгед-клітин (Напдероигу еї аї., 2009). Таким чином, СО127 можна розглядати як потенційно привабливу терапевтичну мішень для моноклональних антитіл (Маб), націлених на модулювання імунних відповідей, оскільки такі моноклональні антитіла можуть мати здатність виснажувати ефектор, але не регуляторні лімфоцити. Відповідно, було припущено, що вони можуть проявляти ефективність при трансплантації, аутоїмунності (Місне! еї аіІ., 2008) та злоякісних новоутвореннях шляхом антагоністичного доступу 1-7 до 1--7-К і, таким чином, обмеження функції та росту Т- і В-клітин.

Терапія моноклональним антитілом проти клітин СО127ж-, яка перешкоджає шляху 1-7, могла б досягти цієї мети шляхом усунення/нейтралізації наївних Т-клітин і Т-клітин пам'яті та/або зменшення їх кількості при збереженні клітин Тгед або шляхом усунення або зменшення кількості СО127-позитивних злоякісних клітин. Однак терапія моноклональним антитілом проти клітин СО127- може діяти як обоюдогострий меч, якщо вона призводить до активації дендритних клітин. Дійсно, СО127 також експресується дендритними клітинами в асоціації з

СКІГЕ2, утворюючи рецептор Т5ІР. У присутності Т5І Р дендритні клітини активуються та стимулюють опосередковані Т-клітинами імунні відповіді. Деякі моноклональні антитіла проти

СО0127, приблизно, шляхом зміни способу взаємодії Т5І Р з рецептором Т5І Р, мають здатність збільшувати дозрівання дендритних клітин, індуковане Т5ІР. Як наслідок, терапія моноклональним антитілом проти СО127, яка не буде збільшувати дозрівання дендритних клітин, індуковане Т5І Р, буде забезпечувати терапевтичну перевагу. Це дало би перевагу у вигляді блокування ІІ 7К без недоліку, пов'язаного з активацією дендритних клітин в запаленому оточенні, що містить Т5І Р.

У публікації (Касаре еї аї., 2009) автори проаналізували цікавість альфа-рецептора 1-7 (І/7УКа) в якості потенційної терапевтичної мішені при трансплантації. Розглянувши експресію

І/-7Ка на різних Т-клітинах і клітинах, що реагують на 1Ї/-7, автори визначили, чи може націлювання на Т-клітини пам'яті, що експресують 1/-7Ка, продовжити виживаність алотрансплантата в мишей, та дійшли до висновку, що націлювання на 1ЇІ--7 або ІІ-7Ка буде з користю зберігати клітини Тгед. Серед перспектив автори вказали, що націлювання або на І! -7, або на І/-7Ка у терапевтичному лікуванні може мати різні наслідки для виживання клітин, експресуючих СО127, і може викликати різні типи лімфопенії. Питання про ефекти антитіл, які будуть спрямовані проти І/-7Ка залежно від того, чи будуть вони блокувальними або нейтралізуючими, або цитотоксичними антитілами, також було поставлено з концептуальної точки зору. Автори, проте, не показали, що одержали та проаналізували такі антитіла, а скоріше виразили необхідність подальших досліджень, щоб оцінити актуальність цієї гіпотези.

Через недоліки доступних терапевтичних підходів при пов'язаних з імунітетом захворюваннях й інших захворюваннях, пов'язаних з 1 -7/І-7Ка, таких як різні види раку, включаючи деякі види раку молочної залози, все ще існує потреба в додаткових лікарських препаратах, особливо для кандидатів, активних відносно більше селективних мішеней з метою контролю, наприклад, модулювання імунної активації в людей.

У цьому контексті моноклональні антитіла проти 1Ї/-7/Ка, що мають антагоністичні властивості у відношенні ІЇ-7Ма, були розкриті у УМО2010/017468, й їх гуманізовані версії - у

УММО2011/094259 з метою лікування аутоїмунних захворювань, таких як розсіяний склероз.

Вважається, що описані антитіла є антагоністом для зв'язування ІЇ/-7 з його рецептором й активні проти розмноження та виживання клітин ТП17 і ТИ1, для яких, як була сказано, потрібна взаємодія ІЇ/-7 з їхнім рецептором СО127. Вплив цих антитіл на дозрівання імунних клітин, і зокрема дендритних клітин, не розглядався. Крім того, повідомляється, що ці антитіла не інгібують Т5І Р-індуковане вироблення ТАКС (стор.107 М/О 2011/094259). Аналогічно, анти- 60 Ср127-антитіла, описані у М/О2011/104687 або у М/О2013/056984, які передбачаються для застосування при лікуванні діабету, вовчанки, ревматоїдного артриту й інших аутоїмунних захворювань, не обговорювалися у відношенні їх можливого впливу на дозрівання дендритних клітин, і про їхню взаємодію з Т5І Р-індукованою передачею сигналів не повідомлялося. Крім того, як опубліковано Кегп еї аї. (Кегп еї аї!., 2013; Кепт еї аї., 2015) й як показано у даному документі, анти-СО127-антитіла попереднього рівня техніки індукують інтерналізацію рецептора. Оскільки антагоністичні анти-СО127-антитіла, які також індукують інтерналізацію

СО127, не здатні контролювати гіперчутливість шкірного типу ІМ, тоді як антагоністичні анти-

СОр127-антитіла, які не індукують інтерналізацію, здатні на це, можливо, що процес інтерналізації активує сигнальний шлях, пом'якшуючи антагоністичний ефект антитіла. Нарешті, антитіла попереднього рівня техніки розпізнають епітоп, який не містить ніякої послідовності з сайту 25 СО127 (тобто, зокрема, із амінокислот 109-180 5ЕО ІО Мо: 22 або, зокрема, із амінокислот 109-17 із БЕО ІО Мо: 22 або, зокрема, із амінокислот 113-180 із ЕО ІЮ Мо: 22 або, зокрема, із амінокислот 113-173 із БЕО ІЮ Мо: 22); і не було показано, що вони порушують зв'язування СО127 з ус-ланцюгом 1І-7-В8.

Таким чином, незважаючи на недавній інтерес до розробки антитіл проти СО127, зусилля, були зосереджені на інгібуванні ІІ-7-індукованої передачі сигналів І/-7К. Разом з тим, Т5ІР і

Т5І РК також виявилися залученими у ряд патологій. Було показано, що Т5І Р відіграє деяку роль у захворюваннях шкіри та легенів (Не апа Сепа, 2010) й асоціюється з різними патологіями, включаючи запальні захворювання дихальних шляхів й атопічний дерматит в людини та мишей (Хіпу еї аї!., 2008) (дапугаіа еї аІ. 2011). Крім того, було показано, що Т5І Р асоціюється з регуляцією кишкового імунітету та запалення (Тауїог еї аї!., 2009). Інші патології, що включають ТОЇ Р і Т5І РК, включають В-клітинний лейкоз у дітей (мап Водедот еї аї., 2012), алергійні захворювання легенів і шкіри, аутоїмунні захворювання (Коап еї аї., 2012) ї рак, включаючи рак молочної залози (ОїКкпапиа еї а!., 2011).

Антитіла, які не проявляють ефекту збільшення дозрівання дендритних клітин й/або які не викликають інтерналізацію СО127 й/або які інгібують інтерналізацію, індуковану 17, були розкриті у УМО 2015/189302. Зазначені антитіла, названі М13В2 (химерне антитіло), М1382-Н1,

М1382-п2 ії М1382-п3 (гуманізоване М1382) у зазначеній заявці та далі у даному документі, мають високу ефективність, особливо іп мімо, і, зокрема, як було показано, швидко впливають на ефекторні Т-клітини пам'яті, як визначено далі. Однак зазначені антитіла гуманізовані в обмеженому ступені, й їх ефективність продукування також обмежена. Більше того, не повідомлялося про тривалий вплив зазначених антитіл на ефекторні Т-клітини пам'яті.

Винахід відноситься до інструментів для конструювання нових антитіл, що підходять в якості терапевтичних кандидатів для введення пацієнтам із захворюванням, що включає сигнальні шляхи 1-7, або з ризиком такого захворювання. Згідно з різними підходами, запропонованими у даному документі, такі засоби поліпшують приготування антитіл, призначених для введення людям-хазяїнам. Такі засоби включають, зокрема, гуманізовані, зокрема моноклональні, антитіла, які містять всі СОК-послідовності М13В2-Н3.

Такі поліпептиди (або полінуклеотиди, що кодують такі поліпептиди) запропоновані, зокрема, для одержання антитіл (або їх антигензв'язуючих фрагментів) й/або у вигляді антитіл (або їх антигензв'язуючих фрагментів), зокрема, які специфічно зв'язуються з СО127; зазначені антитіла, зокрема моноклональні антитіла, містять варіабельний домен важкого ланцюга, що містить три СОК-послідовності МНСОКТ, наведені в 5ЕО ІЮ Мо: 1, МНСОКО, які наведені в ЗЕО

ІО Мо: 2, і МНСОКЗ, що зазначені в 5ЕО ІО Мо: 3. Зокрема, зазначений варіабельний домен важкого ланцюга складається з послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮО Мо: 7, або має зазначену послідовність з додатковими мутаціями, зокрема заміною, делецією або вставкою чотирьох залишків, переважно трьох або двох залишків і навіть більше переважно одного залишку, переважно, де зазначені мутації не перебувають ні у послідовностях СОК, ні у канонічних положеннях або положеннях Верньє каркасних послідовностей.

Антитіла, запропоновані у даному документі, переважно являють собою моноклональні антитіла, що означає, що композиція цих антитіл є гомогенною, зокрема - ідентичною, з точки зору антигензв'язуючої специфічності та, відповідно, з точки зору складу варіабельної області.

Винахід відноситься до антитіл, які мають загальні СОК з антитілом М13В82-п3, але мають відмінну структуру варіабельного домену легкого ланцюга. Автори даного винаходу несподівано показали, що антитіла, які містять співпадаючі СОМ варіабельного домену легкого ланцюга

М1382-п3, тобто СОК з ЗЕО ІЮО Мо: 4 їі 5 і 6, але містять іншу послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, тобто ЗЕО ІЮО Мо: 9; 5ЕО ІЮ Мо: 10; 5ЕО ІЮО Мо: 11 або 5ЕО ІО Мо: 12; будучи в значній мірі гуманізованими, забезпечують високе продукування у порівнянні з М13В2- "З (до 4 разів вище), зберігаючи при цьому всі функціональні особливості. 60 Винахід відноситься до засобів, доцільних у цьому контексті, що включають, зокрема,

специфічні моноклональні антитіла проти ІЇ/-7Ка. У приватних варіантах реалізації зазначені антитіла втручаються тільки негативно в шлях Т5ІР. Відповідно, у переважних втіленнях зазначені антитіла не збільшують викликане Т5І Р дозрівання дендритних клітин. На додаток або в якості альтернативи, у приватних варіантах реалізації, зазначені антитіла не індукують інтерналізацію СО127 й/або інгібують індуковану ІЇ/7 інтерналізацію СО127. У приватних варіантах реалізації зазначені антитіла поєднують ці властивості, пов'язані з дозріванням ОС й/або інтерналізацією, з антагоністичною активністю відносно передачі сигналів 1І-7/І-7-К. У приватних варіантах реалізації зазначені антитіла інгібують індуковану 1-7 експресію інтегринів а4, В7 ії а4/87 у Т-клітинах, зокрема іп мімо. У приватних варіантах реалізації зазначені антитіла здійснюють цитотоксичну дію проти клітин-мішеней СО127-, яка фізично зменшує їхню кількість (скорочення субпопуляції). На додаток або в якості альтернативи, у приватних варіантах реалізації зазначені антитіла включають щонайменше 80 95, переважно щонайменше 84 95 або більше ніж 84 95 і навіть більше переважно щонайменше 85 95 людських залишків, відповідно до наведеного нижче визначення. На додаток або в якості альтернативи, у приватних варіантах реалізації зазначені антитіла виробляються щонайменше так само ефективно, як М1382-Н3, переважно щонайменше у два рази ефективніше, відповідно до наведеного нижче визначення.

На додаток або в якості альтернативи, у приватних варіантах реалізації зазначені антитіла роблять швидку та/або тривалу дію на ефекторні Т-клітини пам'яті.

Зокрема, антитіла, запропоновані у цьому документі, містять варіабельний важкий (УН) ланцюг, що містить наступні амінокислотні послідовності:

МНООВІ1 5ЕО ІЮ Мо: 1;

МНООНВ2 5ЕО І Мо: 2;

МНОСОВЗ 5ЕО ІО Мо: 3.

Антитіла, запропоновані у даному документі, переважно містять ланцюг УН, що складається з послідовності, яка наведена в ЗЕО ІЮО Мо: 7:

ОМОГ МЕЗССОЇ МКРОСІБІ ВІ БСАУЗаОИЕТІ БОМ УМАУМІВОА РОКИ ЕМУУЗТІЗАБаї ВТИМРОБМ

КавеЕтТІЗВОМАКМ5І М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВРІ БАНУХЯЕМУЕО УМ СОС,ТІ МТУ.

Зазначений варіабельний важкий ланцюг, зокрема, пов'язаний з константним важким ланцюгом, що складається з послідовності ЗЕ ІЮО Мо: 26, з утворенням повного важкого

Зо ланцюга антитіла.

Зокрема, антитіла, запропоновані у даному документі, містять ланцюг Мі, що складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з послідовності 5ЕО ІО Мо: 9, 5ЕО ІЮО Мо: 10, послідовності БЕО ІЮ Мо: 11 та послідовності БЕО ІЮО Мо: 12, зокрема послідовність ХЕО ІЮО Мо: 12:

РІОМТО5РБОБІ БАБМАОВМТІТСВТЗЕВІМОСІ АМ/МООКРОКАРКИ І МЗАМТІ НІСМРОВЕЗИ5

ООТОУТІ ТІ ОРЕОБАТУУСООМУОУРІ АЕЄОССТКМЕЇК. Зазначений варіабельний легкий ланцюг, зокрема, пов'язаний з константним легким ланцюгом, що складається з послідовності, вибраної з 5ЕО ІЮ Мо: 27 і ЗЕО ІЮ Мо: 28, зокрема ЗЕО ІО Мо: 27, з утворенням повного легкого ланцюга антитіла.

Зокрема, антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за винаходом специфічно зв'язується з СЮО127, зокрема з людським СО127, і містить: - легсий ланцюг антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, що складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з ЗЕО ІЮ Мо: 9; 5ЕО ІЮ Мо: 10;

ЗЕО ІЮО Мо: 11; 5ЕО ІО Мо: 12; зокрема 5ЕО ІО Мо: 12; а також - варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що містить три СОК, що складаються з послідовностей, наведених в 5ЕО ІЮ Мо: 1, ЗЕО ІО Мо: 2 ії 5ЕО ІЮ Мо: 3, зокрема варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що складається з послідовності, зазначеної в ЗЕО ІО Мо: 7.

У більше конкретному варіанті реалізації винаходу антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент специфічно зв'язується з СО127, зокрема з людським СО127, і містить: - варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або легкий ланцюг антитіла за винаходом, зокрема, що складаються з послідовності, вибраної з групи, що складається з ЗЕО ІЮ Мо: 9,

ЗЕО ІЮ Мо: 10; 5ЕО ІО Мо: 11 ї БЕО ІО Мо: 12, зокрема 5ЕО ІО Мо: 12; і - варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що містить три СОК, що складаються з послідовностей, наведених в 5ЕО ІЮ Мо: 1, 5ЕО ІЮ Мо: 2 і 5ЕО ІО Мо: 3, зокрема варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що складається з послідовності, зазначеної в ЗЕО ІО Мо: 7.

Зв'язування СО127

Відповідно до винаходу термін "зв'язування" з білком ІІ-7Ка відноситься до взаємодії типу антиген-антитіло й охоплює властивості "специфічного зв'язування" антитіл або їх антигензв'язуючих фрагментів, причому "специфічне зв'язування" означає, що антитіла або бо антигензв'язуючі фрагменти зв'язуються з білком ІІ -7Ка, у той час як вони не зв'язуються або зв'язуються зі значно більше слабкою афінністю з іншими білками (наприклад, загальним у- ланцюгом рецептора цитокінів). Специфічне зв'язування краще встановлюють та/або визначають у фізіологічних умовах, особливо з точки зору рН і вмісту солі в досліджуваному розчині. Зв'язування та специфічність зв'язування можна аналізувати відповідно до тестів, розкритих у Прикладах, і, зокрема, можна аналізувати за допомогою біосенсора, систем Війя,

Віасоге, ЕГІЗА або вестерн-блот-аналізу.

У приватних варіантах реалізації антитіла, запропоновані у даному документі, націлені на та зв'язують альфа-ланцюг ІІ -7-К, коли він утворює комплекс в рецепторі Т5І Р (з ССКЕ2; номер доступу Сепрапк АЕ338733; Кеспе еї аї., 2001). У приватних варіантах реалізації антитіла, запропоновані у даному документі, зв'язуються з СО127 у вигляді виділеного білка з константою афінністі (КО), рівною або меншою 5 х 10-9 М, що може бути визначено біосенсорним аналізом, зокрема, методом ВІй7. У приватних варіантах реалізації властивості зв'язування антитіл встановлюють або визначають з використанням антигену людського СО127, що містить послідовності ері (ЗЕО ІЮ Мо: 19) й/або ер2 (ЗЕО ІО Мо: 20). У приватних варіантах реалізації антиген містить фрагмент людського СО127, що містить як ер'ї, так й ер2 (тобто антиген містить послідовності ері! й ер2 й інтеркальовані послідовності людського СО127). У приватних варіантах реалізації антитіла, запропоновані у даному документі, мають щонайменше таку саму афінність до зазначеного антигену, що й антитіло М1382-п3, розкрите у УМО 2015/189302, й/або як антитіло М1382-пМІ 6, розкрите в даному ЗЕО ІЮО Мо: 12) і/або що й антитіло з МН, що має послідовність 5ЕО ІЮО Мо: 7, і МІ з послідовністю 5ЕО ІЮО Мо: 10 або з послідовністю ЗЕО ІЮ Мо: 11.

Способи дослідження на зв'язування антитіл з їхньою мішенню, або повнорозмірним СО127, виділеним, або у вигляді Т5І РЕ або ІІ УР, або їх антигеном, як зазначено вище, включаючи, зокрема, метод Вій7, відомі фахівцю в даній області та проілюстровані, зокрема, на фіг.3, у прикладі З і прикладі 4 у даному документі та на с. 14, фіг. 3, 4 і 6 й у відповідних поясненнях, а також у прикладах 1, 2, 6, 7 у УМО 2015/189302.

Відсутність підвищеного Т5І Р-індукованого дозрівання дендритних клітин

Антитіла, запропоновані у даному документі, можуть зв'язувати СО127 в рецепторі Т5ІЇ Р (тобто можуть зв'язувати СО127, коли він перебуває в комплексі з СК Е2, утворюючи рецептор

Зо Т5І/Р). Отже, антитіла, запропоновані у даному документі, можуть втручатися у передачу сигналів, викликану ТОЇ Р і/або рецептором Т5І Р. Переважно антитіла, запропоновані у даному документі, не діють синергічно з Т5І Р для дозрівання імунних клітин, зокрема дендритних клітин. Інакше кажучи, антитіла за винаходом не збільшують дозрівання імунних клітин, індукованих ТОЇ Р.

Цей ефект особливо бажаний для дозрівання дендритних клітин. Засоби для вимірювання такого ефекту відомі фахівцю та розкриті, зокрема, у УМО 2015/189302 на сторінках 16-17 й у

Прикладі 9 звідти. Зокрема, антитіла, запропоновані у даному документі, не збільшують експресію СО40 більше ніж на 50 95 у порівнянні зі стимуляцією тільки Т5І Р (без антитіла).

Переважно експресія СО40 збільшується не більше ніж на 25 95, переважно не більше ніж на 10 95 ії ще більше переважно не більше ніж на 5 95. В особливо переважних варіантах реалізації експресія СО40 в клітинах, стимульованих Т5І Р і зазначеними антитілами, не збільшується або зменшується у порівнянні з клітинами, стимульованими тільки Т5І Р.

Інгібування ІІ-7-індукованої експресії інтегринів а4, р7 і а4/р7

У приватних варіантах реалізації антитіла, які запропоновані у даному документі, інгібують індуковану 1-7 експресію інтегринів а4, В7 і а«4/87 іп міго. Індукована 1-7 експресія інтегринів а4,

В7 ії а4/87 у даному документі означає або збільшення рівня експресії інтегринів а4 та ДВ7, або збільшення кількості або співвідношення Т-лімфоцитів, експресуючих а4, В7 й/або інтегринів а4/87, або і те, й інше. Інгібування може бути частковим, тобто рівень експресії інтегринів «4, Р7 і а4/р7 у присутності І-7 підвищується у порівнянні з базовим рівнем (тобто рівнем без антитіл або ІІ 7) у присутності антитіл, але менше, ніж під час відсутності антитіл; або інгібування може бути повним, тобто рівень експресії інтегринів а4, В7 і а4/87 у присутності ІЇ-7 й антитіла не вище вихідного рівня.

У приватних варіантах реалізації антитіла, запропоновані у даному документі, інгібують експресію інтегринів а4, р7 і/або а4/р7 іп міго, тобто рівень експресії інтегринів а4, р7 і/або ад/р нижче в клітинах, оброблених антитілами (і з і/або без ІІ 7), ніж в неопрацьованих клітинах (тобто без антитіл або 1/7). Ступінь інгібування може залежати від дози. Інгібування експресії може бути більше конкретно визначене, досліджене та/або виміряне, як викладено у УМО 2015/189302 на с. 18, зокрема у параграфі (58) й у Прикладі 16.

Інгібітори інтерналізації СО127 бо У конкретному варіанті реалізації запропоновані у даному документі антитіла інгібують індуковану 17 інтерналізацію СО127. Таким чином, при інкубації з зазначеними антитілами присутність 7 не викликає зниження експресії СО127 на клітинній поверхні або викликає менше сильне зниження експресії СО127 на клітинній поверхні, ніж клітини, інкубовані без антитіл. У приватних варіантах реалізації при інкубації із зазначеними антитілами рівень експресії на клітинній поверхні СО127, коли клітини інкубують при 37 "С протягом 15 хвилин з 5 нг/мл 1-7, становить щонайменше 80 95, переважно щонайменше 90 95 від рівня експресії на клітинній поверхні в клітинах, інкубованих без І/7. В умовах іп міго експресію на клітинній поверхні переважно вимірюють після закінчення обмеженого періоду часу, як зазначено вище.

Крім того, оскільки при низькій температурі більшість процесів клітинної інтерналізації інгібовані, цей ефект зазвичай краще всього спостерігається при фізіологічній температурі, зокрема при 37 "Сб. Однак також передбачається інкубувати клітини при низькій температурі, зокрема при 46.

У переважному варіанті реалізації антитіла, запропоновані у даному документі, не викликають інтерналізацію СО127. Таким чином, експресія клітинної поверхні СО127 в клітинах, інкубованих у присутності зазначених антитіл, не знижується або суттєво не знижується у порівнянні з експресією клітинної поверхні в клітинах, інкубованих в інших ідентичних умовах, але під час відсутності антитіла. У приватних варіантах реалізації при інкубації при 37 "С протягом від 30 до 45 хвилин у присутності 50 нг/мл антитіла рівень експресії СО127 на клітинній поверхні становить щонайменше 80 95, переважно щонайменше 90 95 від його рівня в інкубованих клітинах під час відсутності антитіла. Цей ефект може спостерігатися і під час відсутності 1-7 (як в оброблених антитілами, так і в необроблених клітинах), й у присутності 1Ї-7, і/або в обох випадках.

Дві описані вище ознаки, пов'язані з інтерналізацією СО127, (тобто інгібування інтерналізації, викликаної Ії 7 або неїіндукція інтерналізації) можуть бути додатково визначені та/або досліджені, як викладено у УМО2015/189302, зокрема у параграфах І591-І63| на сторінках 19-20 і на фіг. 16 й у Прикладі 5.

Порушення взаємодії СО127 - ус-ланцюга

Відповідно до приватного варіанта реалізації, антитіла, запропоновані у цьому документі, можуть порушувати зв'язування СО127 з ус-ланцюгом 1. 7-К. Це означає, що в умовах (зокрема,

Зо хімічних і фізичних умовах), коли СО127 і ус-ланцюг пов'язані один з одним під час відсутності антитіла й, зокрема, у присутності І-7, присутність зазначених антитіл значно знижує зазначений зв'язок. У приватних варіантах реалізації у присутності антитіла й І/7 СО127 не зв'язується з ус. Зокрема, у присутності антитіла й 1-7 кількість ус-ланцюга, виявленого асоційованого з (або зв'язаного) з СО127, становить менше 80 95, переважно менше 50 95, ще більше переважно менше 25 95 або 10 95 від кількості, зв'язаного під час відсутності антитіла (або у присутності іншого антитіла проти СО-127, такого як МО707-13) в інших ідентичних умовах, зокрема у присутності І-7. Така особливість антитіла може бути оцінена, зокрема, за допомогою методів спільної імунопреципітації, добре відомих фахівцю з дослідження взаємодії білків і проілюстрованих, наприклад, у УМО 2015/189302 у прикладі 21. Зокрема, клітини можна інкубувати у присутності або під час відсутності тестованого антитіла, потім солюбілізувати в умовах, що забезпечують збереження білкових комплексів, й отриманий лізат можна піддати імунопреципітації з використанням анти-СО127, й оцінити присутність ус в СО127-вмісному імунопреципітованому комплексі методом вестерн-блотингу з використанням анти-ус-антитіл (і навпаки, імунопреципітацію можна проводити з використанням анти-ус-антитіл, а присутність

С0127 оцінити з використанням анти-СО127-антитіл).

Антагоніст відносно взаємодії 1-7-1Ї 7-8

Відповідно до приватного варіанта реалізації макромолекула, зокрема антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, за винаходом додатково має антагоністичні властивості у відношенні інтерлейкіну 7 (ІІ-7), тим самим антагонізуючи доступ, тобто зв'язування 17 з СО127 на СО127-позитивних клітинах.

Термін "антагоністичні властивості відносно взаємодії 1І-7-ІЇ 7-К" означає, що антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти за винаходом, які націлені на 1/7-Б-альфа, мають ефект запобігання доступності рецептора 7, що експресується на клітинах СО127, особливо людських ефекторних Т-клітинах, зокрема людських Т-клітинах пам'яті, для його зв'язуючого партнера 1-7, особливо людського ІІ 7. В результаті антагоністичного зв'язування ЇЇ 7 антитіла за винаходом або їх функціональні фрагменти призводять до лімфопенії, запобігаючи 1І-7-залежну тимусну генерацію Т-клітин.

Антагоністичні властивості можуть бути, зокрема, антагонізмом відносно передачі сигналів

І/7-К, індукованої І/7. Антагоніст передачі сигналів ІЇ7-К, індукований 1/7, може бути бо ідентифікований шляхом вимірювання інгібування фосфорилювання ЗТАТ5, як описано у прикладах. Індуковане ІЇ7 фосфорилювання 5ТАТЬ5 є маркером активації 1І/7-К, й очікується, що антитіло, яке протидіє взаємодії І-7-ІЇ7-К, зменшить індуковане І/7 фосфорилювання

ЗТАТЬ.

У приватних варіантах реалізації макромолекула за винаходом є антагоністом передачі сигналів 1І-7-К, індукованих 1-7. У конкретному варіанті реалізації макромолекула за винаходом інгібує індуковане І-7 фосфорилювання ЗТАТ5. У переважних варіантах реалізації інгібування фосфорилювання 5ТАТ5 становить більше 50 95 при концентраціях антитіл до 55 нг/мл й/або інгібування фосфорилювання 5ТАТ»5 становить більше 80 95 при концентраціях антитіл до 100 нг/мл. Інгібування фосфорилювання ЗТАТ5 можна оцінювати способами, відомими фахівцю в даній області, і, зокрема, способом, наведеним у розділі прикладів, зокрема, у прикладі 5 і/або на сторінках 21, параграфи І69І і (70) і Приклад З із УМО2015/189302.

Також бажано, щоб макромолекула за винаходом (зокрема антитіло, його антигензв'язуючий фрагмент або молекула-міметик антитіла) інгібувала активацію та/або не активувала або не збільшувала активацію РІЗ-К і/або сигнальні шляхи ЕКК (позаклітинної сигнально-регульованої кінази) і, зокрема, інгібують фосфорилювання та/або не індукують або не збільшують фосфорилювання РІЗ-К й/або ЕКК 1 й/або ЕКК 2. Зокрема, антитіло, його антигензв'язуючий фрагмент або молекулу-міметик антитіла, запропоновані у даному документі, та, зокрема, таке антитіло, його антигензв'язуючий фрагмент або молекулу-міметик антитіла, які є антагоністом відносно взаємодії ІЇІ--7-ІІ -7К, не індукують активацію РІЗ-К іи"або шляхи ЕКК (переважно шляхи

РІЗ-К і шляхи ЕКК), і, зокрема, не індукують фосфорилювання РІЗ-К й/або ЕКК 1 й/або ЕРК 2, більше конкретно, не індукують фосфорилювання РІЗ-К й ЕРК 1 й ЕКК 2. Зокрема, антитіло, його антигензв'язуючий фрагмент або молекула-міметик антитіла, запропоновані у даному документі, і, зокрема, таке антитіло, його антигензв'язуючий фрагмент або молекула-міметик антитіла, які є антагоністом відносно взаємодії ІІ--7-ІІ -7К, інгібують активацію шляхів РІЗ-К й/або

ЕКК і, зокрема, інгібують фосфорилювання РІЗ-К й/або ЕКК 1 й/або ЕКК 2, більше конкретно інгібують фосфорилювання РІЗ-К й ЕКК 1 й ЕКК 2. Активація шляхів і/або фосфорилювання зазначених білків може бути досліджена способами, відомими фахівцю, і, зокрема, за допомогою вестерн-блотингу, як показано на фіг.7 й у прикладі 8.

Антагоніст для зв'язування Т5І Р

Зо Оскільки антитіла, запропоновані у даному документі, зв'язують СО127 в І-7-К, вони можуть також зв'язувати СО127 в Т5І РК і, зокрема, за допомогою стеричного утруднення та/або конкуренції на загальних сайтах зв'язування, вони можуть інгібувати зв'язування Т5І Р з Т5І РЕК.

Інакше кажучи, антитіла, запропоновані у даному документі, можуть проявляти антагоністичну активність відносно зв'язування Т5І Р.

Інгібітор Т5І Р-індукованого продукування ТАНС

У конкретному варіанті реалізації антитіла, запропоновані у даному документі, інгібують індуковане Т5І Р продукування ТАКС СО127-позитивними клітинами. Як згадано вище, Т5І Р- стимульовані дендритні клітини продукують підвищені рівні ТАКС. Це може бути результатом їх зв'язування з Т5І РК й їх потенційної дії як антагоністів зв'язування Т5ІР. У конкретному варіанті реалізації антитіла, запропоновані у даному документі, не збільшують дозрівання дендритних клітин (де дозрівання визначається, наприклад, підвищеною експресією маркера клітинної поверхні СО40 і/або СОВ80).

Рівень індукованої Т5І Р вироблення ТАКС може бути нижче в клітинах, оброблених Т5І Р разом з антитілами проти СО127, запропонованими у даному документі, ніж в клітинах, оброблених одним Т5І Р. Інакше кажучи, антитіла, запропоновані у даному документі, можуть бути інгібіторами Т5І Р-індукованого вироблення ТАКС. У варіанті реалізації винаходу антитіла, запропоновані у даному документі, знижують рівні вироблення ТАКС. У конкретному варіанті реалізації рівень вироблення ТАКС у клітинах, оброблених Т5І Р й антитілом, запропонованим у даному документі, знижується більше ніж на 10 95, переважно більше ніж на 20 95, у порівнянні з рівнем у клітинах, оброблених одним Т5І Р, навіть при низьких концентраціях антитіл 1 мкг/мл.

Вимірювання вироблення ТАС може бути виконане на СО127-позитивних імунних клітинах, зокрема на дендритних клітинах, зі зразка крові з використанням будь-якого стандартного способу, відомого фахівцю, і проілюстрований, наприклад, у УМО 2015/189302 у прикладі 9.

Цитотоксична активність

У конкретному варіанті реалізації антитіла, запропоновані у даному документі, є цитотоксичними відносно клітин людини, особливо людських Т-клітин, експресуючих СО127.

Клітинами людини, експресуючими СО127 у вигляді ланцюга рецептора ІІ 7, що є мішенню для зазначених антитіл, є в основному Т-лімфоцити та, більше точно, субпопуляції ефекторних Т- лімфоцитів, включаючи наївні Т-клітини та Т-клітини пам'яті але не є регуляторними Т- бо клітинами (Тгед), особливо - не є спочиваючими натуральними Тгед. Т-клітини пам'яті генеруються в результаті праймування антигенів і в основному визначаються їхніми функціональними характеристиками, у тому числі здатністю піддаватися проліферації при повторній активації та диференціюванню у вторинні ефекторні клітини та клітини пам'яті.

Аналогічно, цільовий рецептор Т5І Р (як комплекс, що включає альфа-ланцюг 1І-7-К) регулює диференціюванню Т-хелперних лімфоцитів, В-клітин і дендритних клітин.

Зокрема, антитіла, запропоновані у даному документі, що мають "цитотоксичну активність у відношенні Т-клітин" або цитотоксичні властивості (цитотоксичні антитіла), викликають виснаження популяції ефекторних Т-клітин, убиваючи ці клітини, і відповідно зменшують кількість цих клітин при введенні. | навпаки, зазначені антитіла не змінюють субпопуляцію регуляторних Т-клітин або не змінюють її в значній мірі, дозволяючи клітинам Тгед виконувати свою функцію. У цьому контексті у конкретному варіанті реалізації після введення зазначених антитіл співвідношення регуляторних Т (Тгтед) до ефекторних Т (Тей) клітин збільшується.

Зокрема, антитіла, запропоновані у даному документі, дозволяють підвищити зазначене співвідношення приблизно на 10 95 або більше. Зокрема, збільшення співвідношення Тгед у порівнянні з Теї становить близько 20 95.

Зокрема, цитотоксичні антитіла проявляють антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС). В якості альтернативи, антитіла, запропоновані у даному документі, не мають властивостей АОСС. Потенціал АОСС антитіла може вважатися позитивним, коли специфічна цитотоксичність становить, наприклад, вище 10 95. Властивості АОСС можна оцінити в аналізі

АОСС, такому як тест, описаний у Прикладі 10 УМО 2015/189302. Коли антитіло являє собою антитіло пацюка, ефекторними клітинами, використовуваними в аналізі АОСС, переважно є клітини ГАК (лімфокін-активований кілер) пацюка. Коли антитіла є гуманізованими, аналіз АОСС можна проводити, зокрема, на людських МК-клітинах.

Антитіла за винаходом, які мають як цитотоксичні, так й антагоністичні властивості проти

СОр127-позитивних клітин, забезпечують кумулятивний ефект цих властивостей відносно виснаження ефекторних Т-клітин, особливо Т-клітин пам'яті, тим самим забезпечуючи більше сильне виснаження (виснаження пулу СО127-- клітин) і відповідне зменшення кількості Т-клітин- мішеней.

У наведених вище параграфах, а також у Прикладах описано, як досліджувати відповідні

Зо бажані функціональні характеристики антитіл, запропонованих у цьому документі. У наступних розділах будуть докладно описані різні структурні характеристики та можливі модифікації антитіл. У світлі цих вказівок фахівець в даній області зможе одержати антитіла, що мають нижченаведені структурні характеристики, а також бажані функціональні характеристики, зокрема, взявши за початок антитіло М1382-пМІб, яке має бажані функціональні характеристики.

Фахівцю відомо, що при введенні людям, бажано, щоб антитіла представляли як можна більше сильну гомологію з людськими антитілами. Ступінь ідентичності з людським антитілом виміряється як 95 людських залишків у послідовності антитіла, зокрема, у каркасі варіабельного домену легкого або важкого ланцюга антитіла, тобто 96 залишків у послідовності антитіла, зокрема, у каркасі варіабельного домену легкого або важкого ланцюга антитіла, які ідентичні в тому ж функціональному положенні залишку в найбільше гомологічному з відомих людських антитіл, зокрема в каркасі найбільше гомологічного відомого варіабельного домену легкого або важкого ланцюга людського антитіла. Ця особливість як правило виражена у даному документі, як і в літературі, як "антитіло А (або каркасна послідовність його варіабельного домену) має ххУб людських залишків", що означає, що антитіло А (або каркасна послідовність його варіабельного домену) має хх 95 залишків, які ідентичні в тому ж функціональному положенні залишкам найбільше гомологічного з відомих антитіл людини (або каркасної послідовності його варіабельного домену). Такий ступінь ідентичності може бути виміряний за допомогою засобів, відомих фахівцю, та, зокрема, за допомогою інструмента ЮотаіпсСарАїЇдп Міжнародної інформаційної системи з імуногенетики (ІМСТ), як було з'ясовано в ході відкритого засідання групи експертів ІММ ВОЗ (квітень 2015 р.). Переважно, антитіла, запропоновані у даному документі, мають більше ніж 80 95, ще більше переважно щонайменше 84 95, більше ніж 84 95 і навіть більше переважно щонайменше 85 95 ідентичності з антитілом людини, зокрема, на підставі визначення з використанням інструмента ЮотаїіпсСарАЇїїдп. Зазначений ступінь ідентичності може бути визначений тільки для варіабельного домену легкого ланцюга або тільки для легкого ланцюга (у порівнянні з варіабельним доменом легкого ланцюга або легкого ланцюга людського антитіла) або для легкого ланцюга та важкого ланцюга, взятих разом, шляхом порівняння кожного ланцюга з найбільше гомологічно відповідним ланцюгом людського антитіла та реєстрації кумулятивного відсотка ідентичності. Зокрема, варіабельний домен бо легкого ланцюга антитіла або легкий ланцюг антитіла за винаходом становить щонайменше

80 95, більше конкретно, 84 95, і ще більше конкретно щонайменше 85 95 людських залишків.

Варіабельні домени легкого ланцюга конкретного антитіла, запропоновані у даному документі, мають відповідно 84,2 95 (ЗЕО ІЮ Мо: 9); 85,3 95 (ЗЕО ІО Мо: 10 ї ЗЕО ІЮ Мо: 11) і 86,3 95 (ЗЕО ІЮ

Мо: 12) людських залишків. Переважний варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, запропонований у даному документі (З5ЕО ІО Мо: 7), має 90,8 9о людських залишків.

Варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, запропонованого у даному документі, може включати до 135 амінокислот, переважно до 120 амінокислот і ще більше переважно до 110 або 107 амінокислот. Варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, запропонованого у даному документі, може включати щонайменше 80, переважно щонайменше 90 їі навіть більше переважно щонайменше 100 або 106 амінокислот. Варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, запропонованого у даному документі, може містити від 80 до 135, переважно від 90 до 120 ї ще більше переважно від 105 до 110 амінокислот.

Запропонований у даному документі легкий ланцюг антитіла може містити до 250 амінокислот, переважно до 230 амінокислот і ще більше переважно до 214 або 211 амінокислот.

Запропонований у даному документі легкий ланцюг антитіла може містити щонайменше 150, переважно щонайменше 190 і навіть більше переважно щонайменше 200 або 210 амінокислот.

Запропонований у даному документі легкий ланцюг антитіла може включати від 150 до 250, переважно від 190 до 230 і ще більше переважно від 210 до 220 амінокислот.

У даному документі також представлені поліпептиди, які являють собою (ії) антигензв'язуючі фрагменти антитіл, запропонованих у даному документі, зокрема антигензв'язуючі фрагменти, що складаються з або містять фрагмент легкого ланцюга антитіла або варіабельних областей легкого ланцюга антитіла, запропонованих у даному документі, варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, запропонований у даному документі, і/або (ії) молекули-міметики антитіл, запропоновані у даному документі.

Антигензв'язуючий фрагмент являє собою поліпептид, який специфічно зв'язується з білком

СО0127, згідно з визначенням вище у відповідному розділі (параграфи Ц|44| - І47)), і містить щонайменше три СОК із М1382-п3 (що складаються з послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4-6), переважно фрагмент варіабельних доменів легкого ланцюга, запропонований у даному документі (з БЕО ІЮ МО: 9-12), що містить зазначені послідовності СОК. Антигензв'язуючий

Зо фрагмент може містити щонайменше 40, переважно щонайменше 50 і ще більше переважно щонайменше 70 або 74 амінокислоти. Антитілозв'язуючий фрагмент може містити не більше 100, переважно не більше 90 і навіть більше переважно не більше 80 або 74 амінокислот.

Антигензв'язуючий фрагмент може містити від 40 до 100, від 50 до 90 і переважно від 60 до 100 і ще більше переважно від 50 до 70 або від 60 до 80 амінокислот. Антигензв'язуючий фрагмент, запропонований у даному документі, може, зокрема, мати будь-які підходящі функціональні ознаки, розкриті відносно антитіл, запропонованих у цьому документі, зокрема ознаки, розкриті у пунктах І471-І621І.

Відповідно, виділений поліпептид, запропонований у даному документі, може складатися з послідовності до 250 амінокислот, конкретно до 217, до 214, до 211, більше конкретно, до 200, до 175 до 150, до 135, до 120, до 107, ще більше конкретно, до 100, до 90, до 80, до 74, до 70, до 60 амінокислот.

Молекула-міметик антитіла являє собою поліпептид із властивостями, подібними антитілу, зокрема, з подібними властивостями зв'язування з СО127. Міметиками антитіл можуть бути, наприклад, молекули-афітіла, афіліни, афімери, антикаліни, монотіла та т.д. Молекула-міметик антитіла, запропонована у даному документі, може, зокрема, мати будь-які підходящі функціональні ознаки, розкриті відносно антитіл, запропонованих у даному документі, зокрема, ознаки, розкриті у пунктах І471|-(621.

Зокрема, антитіло за винаходом являє собою гуманізоване антитіло, яке містить константні домени, отримані з константних доменів людини. Зокрема, константний домен легкого ланцюга антитіла походить від константного домену легкого ланцюга каппа людини і/або константний домен важкого ланцюга антитіла походить від константної області важкого ланцюга Ідс1, Ідс2 або Ідс4 людини, особливо від константної області важкого ланцюга Ідс4 людини. "Отриманий з" означає деякі точкові мутації шляхом амінокислотних замін, таких як Ідс4 (5228Р) або Ідс1 (ЕЗЗЗА). Ці мутації, добре відомі фахівцю в даній області, зазвичай модифікують деякі властивості батьківського ланцюга. Наприклад, вони призводять до меншої імуногенності у порівнянні з батьківським антитілом або скасовують зв'язування з Есу-рецептором або усувають димеризацію мономірного антитіла або стабілізують димеризацію, роблячи антитіла краще для терапевтичного використання в людини. Антитіло за винаходом, отримане з батьківського константного домену важкого та легкого ланцюга, містить або складається з послідовності, 60 зазначеної в БЕО ІЮО Мо: 26, ЗЕО ІЮ Мо: 27 або в 5ЕО ІО Мо: 28 або їх фрагмента, відповідно.

Більше конкретно, константний домен легкого ланцюга антитіла складається з послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮ Мо: 27. Зокрема, константний домен важкого ланцюга антитіла містить або складається з послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮ Мо: 26, або її фрагмента. Більше конкретно, константний домен важкого ланцюга антитіла складається з послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ

Мо: 26.

У даному документі також представлені виділені молекули нуклеїнової кислоти, що кодують поліпептид за винаходом, або антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, запропоновані у даному документі. Зокрема, зазначені молекули нуклеїнової кислоти кодують варіабельний домен легкого ланцюга або легкий ланцюг антитіла, запропонованого у даному документі, в комбінації з виділеними молекулами нуклеїнової кислоти, що кодують важкий ланцюг антитіла, запропонованими у даному документі, відповідно до будь-якого з наведених у даному документі визначень. Зокрема, у даному документі запропонована виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, що містить або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з БЕО ІО Мо: 9; ЗЕО ІО Мо: 10; 5ЕО ІО Мо: 11; 5ЕО ІЮ Мо: 12. Зокрема, виділена молекула нуклеїнової кислоти за винаходом містить або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 15, 5БО ІЮ МО: 16, 5Е6О ІО МО: 17 або 5ЕО ІО Мо: 18.

Зокрема, зазначена виділена молекула нуклеїнової кислоти представлена в комбінації з виділеною молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг, що включає три СОК, що складаються з послідовностей, які наведені в БЕО ІЮО Мо: 1, ЗЕО ІО Мо: 2 і 5ЕБЕО ІЮО Мо: 3, зокрема, що кодує варіабельний домен важкого ланцюга, що складається з послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮО Мо: 7, більше конкретно, виділену молекулу нуклеїнової кислоти, що складається з послідовності, зазначеної в 5ЕО ІЮ Мо: 13. У переважному варіанті реалізації представлена комбінація виділених молекул нуклеїнової кислоти, що кодують антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, причому зазначена комбінація включає або складається з першої виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що містить або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з БЕО ІЮ Мо: 15, БЕО ІО Мо: 16, 5ЕО ІО Мо: 17 і ЗЕО ІО Мо: 18; і другої виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що містить або складається з послідовності ЗЕО ІЮ

Мо: 13. В іншому переважному варіанті реалізації представлена комбінація виділених молекул нуклеїнової кислоти, що кодують антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, причому

Зо зазначена комбінація включає або складається з першої виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що містить або складається з послідовності 5ЕО ІЮО Мо: 18; і другої виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що містить або складається з послідовності зЗЕО ІЮ Мо: 13.

У даному документі також представлені полінуклеотиди, що кодують поліпептидну послідовність повного легкого ланцюга, що включає як варіабельний, так і константний домен, тобто, зокрема, полінуклеотиди, що кодують одну з послідовностей ЗЕО ІЮО Мо: 9-12 і послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 27 або 28, зокрема полінуклеотиди, що містять або складаються з однієї з послідовностей 5ЕО ІЮ Мо: 15-18, конкатенованих з 5ЕО ІЮ Мо: 30 або 5ЕО ІЮ Мо: 31.

Такі полінуклеотиди представлені, зокрема, в комбінації з полінуклеотидом, що кодують поліпептидну послідовність повного важкого ланцюга, що містить як варіабельний, так і константний домен, тобто, зокрема, полінуклеотиди, що кодують 5ЕО ІЮ Мо: 7 і послідовність

ЗБЕО ІЮ Мо: 26, зокрема, полінуклеотиди, що містять або складаються з 5ЕБО ІЮ Мо: 13, конкатенованої з 5ЕО ІЮО Мо: 29.

Зокрема, виділені молекули нуклеїнової кислоти, запропоновані у даному документі, можуть переважно містити, крім послідовності, що кодує легкий ланцюг і, необов'язково, важкий ланцюг антитіла, запропонованого у даному документі, у зворотному напрямку від послідовності, що кодує зазначені ланцюги антитіла, послідовність, що кодує сигнальний пептид, дозволяючи секретувати зазначені ланцюги при експресії у продукуючій клітині. Вони також можуть містити одну або декілька послідовностей, що кодують один або декілька маркерних пептидів, для виявлення та/або полегшення очищення зазначених ланцюгів.

У даному документі також представлений вектор для клонування й/або експресії молекули нуклеїнової кислоти, запропонованої у даному документі. Зокрема, зазначений запропонований вектор являє собою плазміду, що підходить для клонування й/або експресії в клітинах ссавців, яка містить регуляторні послідовності для транскрипції й експресії. Відповідно, у даному документі запропонований вектор, що містить полінуклеотид, описаний вище, зокрема полінуклеотид, описаний у параграфах 761-781.

Крім того, у даному документі запропоновані клітини або клітинні лінії, рекомбіновані з молекулою нуклеїнової кислоти, як зазначено вище, зокрема вектор, особливо, клітини або клітинні лінії ссавців або птахів, зокрема, як докладно показано на фіг.2. Наприклад, клітини яєчника китайського хом'яка, генетично модифіковані для зменшення глобального бо фукозилювання. Дійсно, антитіла, в яких відсутнє фукозилювання ядра, демонструють значно підвищену антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (АОСС) (моп Ногеїеп еї аІ.,, 2010). Іншим прикладом є клітинна лінія ЕВб6б, яка, за природою, має властивості низького фукозилювання (ОЇімієг еї аї., 2010). Антитіла можуть також продукуватися в клітинах, тимчасово трансфікованих молекулою нуклеїнової кислоти, як зазначено вище, зокрема вектором, зокрема клітинами СО5, зокрема, як докладно описано у прикладі 2.

У даному документі також представлені способи одержання поліпептиду, запропонованого у даному документі, зокрема, легкого ланцюга антитіла та/або моноклонального антитіла, причому зазначені способи включають стадію експресії зазначеного поліпептиду, легкого ланцюга антитіла або моноклонального антитіла (або легкого та, необов'язково, важкого ланцюга моноклонального антитіла) у клітинах, що містять молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує зазначений поліпептид, в умовах, що забезпечують виділення зазначеного поліпептиду та стадію виділення зазначеного поліпептиду. Зокрема, антитіла або їх фрагменти одержують у клітинах, які мають низькі властивості фукозилювання, таких як клітини птахів ЕВб66.

У даному документі також представлена фармацевтична композиція, що містить поліпептид (зокрема, варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або легкий ланцюг антитіла) й/або антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, або відповідну молекулу-міметик антитіла, і/або виділену молекулу нуклеїнової кислоти, згідно з визначенням вище, і фармацевтичний носій.

Зазначена фармацевтична композиція може додатково містити інший активний інгредієнт.

Зазначена композиція представлена, зокрема, у складі, що підходить для системного введення або для місцевого застосування. Зокрема, у даному документі запропоновані композиції, що підходять для місцевого застосування, зокрема для внутрішньом'язової або підшкірної ін'єкції, для ін'єкції з використанням пристрою, такого як автоін'єктор (або ручка-ін'єктор), для трансдермального введення, зокрема з використанням трансдермального пластиру, для трансмукозального введення, зокрема інтраназального або ректального введення. Зокрема, у даному документі запропоновані композиції, що підходять для місцевого введення в шлунково- кишковий тракт (СІ), зокрема за допомогою перорального введення, зокрема для лікування кишкового захворювання, такого як хвороба Крона або ВК, зокрема композиції, що підходять для доставки в товсту кишку. Зокрема, у даному документі запропоновані композиції, що підходять для системного введення, зокрема для парентерального або ентерального введення,

Зо зокрема для внутрішньовенного введення або перорального введення. Як відомо фахівцю, ентеральне введення може бути або місцевим введенням у шлунково-кишковий тракт, або системним введенням. У тих випадках, коли такі фармацевтичні композиції або їх застосування представлені у даному документі, слід розуміти, що також можуть бути представлені носії для введення та їх застосування, наприклад, коли фармацевтична композиція для ін'єкцій представлена явно, слід розуміти, що композиція представлена сама по собі, а також у пристрої або в комбінації з пристроєм, що дозволяють виконувати введення й/або ін'єкцію зазначеної композиції ("пристрій для доставки"). Приклади пристроїв для доставки включають, серед іншого, автоін'єктори, зокрема багатокамерні шприци та трансдермальні пластирі. Відповідно, у даному документі надається пристрій для доставки, зокрема автоіїнжектор, насос або трансдермальний пластир, що містять зазначену композицію, й їх застосування, як представлено нижче відносно фармацевтичних композицій. У даному документі також представлений набір, що включає фармацевтичну композицію та пристрій для локальної доставки, зокрема пристрій для підшкірної, ентеральної або пероральної доставки, зокрема попередньо заповнений шприц або безголюковий пристрій, що містить зазначену композицію та/або підходить для введення зазначеної композиції, і його застосування, як представлено нижче відносно фармацевтичних композицій. Така фармацевтична композиція надається у будь-якій підходящій формі для введення, у тому числі у вигляді розчину, зокрема стерильного водного розчину, у вигляді суспензії, у вигляді твердої речовини, зокрема ліофілізованої твердої речовини, зокрема для адсорбції на (або в адсорбованому вигляді на) пластирі, і/або для ресуспендування та введення у вигляді розчину, у вигляді пігулки, таблетки або іншої твердої форми, що підходить для перорального введення, зокрема з відстроченим або пролонгованим вивільненням, у вигляді наночастинок, наприклад, композиція, що містить наночастинки з поліпептидом, адсорбованим на поверхні або всередині зазначених наночастинок і т.д. Форма фармацевтичної композиції та, необов'язково, характер пристрою для доставки можуть бути підходящими для доставки активного інгредієнта, запропонованого у даному документі, системно або локально, тобто може підходити для активного інгредієнта для досягнення цільових клітин, тканин, органів в активному стані. Зокрема, форма фармацевтичної композиції та, необов'язково, характер пристрою доставки можуть бути підходящими для доставки в шлунково-кишковий тракт, зокрема в товсту кишку. Вважається, що фармацевтична композиція бо містить фармацевтично прийнятний носій; однак фармацевтичні композиції також надаються без носія для аналогічних застосувань та цілей, коли такий носій не потрібен для фармацевтичного застосування, наприклад, якщо продукт вводять у вигляді чистої ліофілізованої твердої речовини. Зокрема, введення здійснюють відповідно до будь-яких підходящих способів, таких, як описані у даному документі для кишкового вивільнення, особливо для кишкового відстроченого вивільнення.

У даному документі також представлена композиція, що містить в якості активного інгредієнта поліпептид (зокрема, варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або легкий ланцюг антитіла) й/або антитіло (зокрема, моноклональне антитіло), відповідний антигензв'язуючий фрагмент або молекулу міметик антитіла, згідно з визначенням вище, або фармацевтична композиція, згідно з визначенням вище, у складі, що підходить для контролю виживання або розмноження СО127-позитивних клітин людини, зокрема СО127-позитивних ефекторних клітин людини, особливо виживання або розмноження Т-клітин пам'яті СО127к, особливо Т-клітин пам'яті, які одночасно є СО127- і СОв8ж, або які одночасно є клітинами

Ср127- і Срахж, при введенні пацієнту-людині. Зокрема, зазначена композиція, що містить антитіло (або інший агент, як зазначено вище) в якості активного інгредієнта, перебуває в складі, що підходить для контролю диференціювання та/або дозрівання дендритних клітин при введенні пацієнту.

Автори винаходу несподівано показали, що однократна ін'єкція антитіла, запропонованого у даному документі, забезпечує стійкий ефект, і запальна відповідь все ще значно знижена у тварин, яких лікували однократною ін'єкцією запропонованих антитіл, аж до 14 місяців і навіть до 18 місяців після зазначеної однократної ін'єкції. Введення та переважно однократне введення поліпептиду, зокрема легкого ланцюга антитіла й, більше конкретно, антитіла, його антигензв'язуючого фрагмента або молекули-міметика антитіла, запропонованого у даному документі, переважно робить швидку та/або тривалу дію на ефекторні Т-клітини пам'яті.

Швидкий ефект спостерігається переважно протягом тижня та більше переважно протягом 48 годин і ще більше переважно протягом дня після введення зазначеного поліпептиду, ланцюга антитіла або антитіла. Тривалий ефект спостерігається переважно щонайменше 12 місяців і більше переважно щонайменше 14 місяців після самого останнього (і, переважно, одноразового) введення зазначеного поліпептиду, ланцюга антитіла або антитіла. Такий ефект

Зо є, зокрема, оборотним (зокрема, відповідь Т-клітин може бути відновлена новою вакцинацією).

Такий ефект переважно є специфічним відносно антигену та/або відповіді та переважно не асоційований з вимірюваною лімфодеплецією (тобто загальна кількість лімфоцитів у суб'єкта не зменшується, згідно з вимірюваннями звичайними способами). В іншому такий ефект можна визначити як клональну делецію Т-клітин пам'яті або як оборотну антигенспецифічну делецію імунної Т-пам'яті. Вплив такого введення на ефекторні Т-клітини пам'яті може бути оцінений шляхом порівняння рівнів секретуючих ІЕМ-у клітин (виміряних, наприклад, за допомогою

ЕГІ5РОТ) у відповідь на антиген, наприклад, туберкулін, у вакцинованих суб'єктів (зокрема, у павіанів), яких пізніше лікували поліпептидом, ланцюгом антитіла або моноклональним антитілом, запропонованим у даному документі, і в неопрацьованих вакцинованих суб'єктів: ефект є спостережуваним, якщо виміряний рівень антигенспецифічних Т-клітин значно нижче (переважно щонайменше на 10 95, більше переважно щонайменше на 40 95 нижче) у суб'єктів, що одержали лікування, у відповідний момент часу після лікування. Такий ефект можна також виміряти, оцінюючи іншим способом запальну реакцію на даний антиген, наприклад, місцеву, зокрема шкірну, запальну реакцію у відповідь на антиген, що місцево вводиться. В якості альтернативи, може бути використаний аналіз тетрамеру МНС. Способи дослідження такого ефекту відомі фахівцю в даній області та проілюстровані у даному документі, зокрема, у прикладі 6.

Крім того, автори винаходу несподівано показали, що антитіло, запропоноване у даному документі, може робити швидку дію, зокрема на активацію Т-клітин, зокрема на вивільнення цитокінів Т-клітинами, зокрема в запальній тканині. Такий ефект, зокрема, спостерігається протягом тижня, переважно протягом 48 і навіть більше переважно протягом 24 годин після введення антитіла, і, зокрема, спостерігається як зменшення вироблення (або вивільнення)

ІРМУу. Такий ефект, зокрема, спостерігається локально, тобто в місці введення антитіла або в місці доставки. Зокрема, антитіло, запропоноване у даному документі, виробляє швидкий ефект, зокрема швидкий локальний ефект, зокрема, на вивільнення цитокінів Т-клітинами, зокрема, виробляє ефект, спостережуваний протягом 24 годин після введення. Коли антитіло вводять для локальної доставки, але не безпосередньо в місці передбачуваної доставки, антитіло може здійснювати швидкий ефект, як описано вище, у місці доставки, протягом тих самих періодів часу після доставки, а не після введення, що може мати на увазі або не мати на бо увазі затримку від моменту введення, як відомо фахівцю.

Композиція, запропонована у даному документі, може додатково містити додаткову сполуку, що має терапевтичну імуномодуляторну дію, зокрема, на клітини, що беруть участь в алергії або аутоїмунітеті. Для ілюстрації, прикладами імуномодуляторів, що представляють інтерес, є інші моноклональні антитіла, націлені на Т-клітини, такі як анти-СО3, анти-ІСО5 або анти-СО28- антитіла, або рекомбінантні білки або антитіла, націлені на допоміжні А-клітини, такі як СТІ А4Ід або анти-СО40-антитіла.

Поліпептид, антитіло, його антигензв'язуючий фрагмент або молекула-міметик антитіла, виділена молекула нуклеїнової кислоти, клітина та/або композиція, запропоновані у даному документі, можуть бути представлені у комбінованому продукті, що включає додаткові продукти, зокрема агент із терапевтичним імуномодуляторним ефектом, як зазначено вище, зокрема, призначені для одночасного, роздільного або послідовного введення. У даному документі запропонований комбінований продукт, що містить поліпептид (зокрема, варіабельний домен легкого ланцюга антитіла або легкий ланцюг антитіла) й/або антитіло, його антигензв'язуючий фрагмент або його молекулу-міметик, і/або виділену молекулу нуклеїнової кислоти, вектор, клітину або клітинну лінію та/або фармацевтичну композицію, згідно з визначенням вище, і необов'язково додатково включає: - агент із терапевтичною імуномодуляторною дією, зокрема, призначений для введення у поєднанні, наприклад, з антитілом за даним винаходом, зокрема, коли зазначене введення є або одночасним, або роздільним за часом, і/або коли зазначене введення здійснюється тим самим або іншим шляхом; і/або - пристрій для введення продукту.

Поліпептид, зокрема легкий ланцюг антитіла й/або антитіло, зокрема моноклональне антитіло й/або антигензв'язуючий фрагмент, або молекула-міметик антитіла та/або нуклеїнова кислота, вектор, клітина або клітинна лінія та/"або фармацевтична композиція або композиція, згідно з визначенням вище, зокрема, представлені для застосування у пацієнта-людини для лікування патологій або патологічних станів, на які впливають імунні відповіді, особливо відповіді Т-клітин пам'яті. Такі стани або патології включають стани або патології, викликані відторгненням трансплантата, аутоімунні захворювання, алергійні захворювання, респіраторні захворювання, хронічні вірусні інфекції, хронічні запальні захворювання, зокрема хронічні

Зо кишкові запальні захворювання, лімфому, лейкоз або інші ракові захворювання, включаючи захворювання, які виникають в результаті солідних пухлин, коли ці патології асоційовані з

Ср127-позитивними клітинами, а також із сигнальним шляхом ІІ--7, зокрема, коли слід уникати збільшення дозрівання дендритних клітин. Відповідно, автори винаходу показують, що використання зазначених агентів може бути розглянуте для лікування конкретних алергійних шкірних захворювань, запальних захворювань кишечнику (33К), зокрема хвороби Крона (СО) або виразкового коліту (ВК), або первинного синдрому Шегрена, або системної червоної вовчанки, або системного склерозу, або розсіяного склерозу, або діабету типу І або гострого лімфобластного лейкозу (наприклад, Т-ГЛЛ) або лімфоми Ходжкіна, або раку молочної залози, асоційованого з клітинами СО127-, раку нирки, раку сечового міхура, раку легенів, раку підшлункової залози або для лікування Т-клітинної лімфоми шкіри, такої як лімфома Сезарі, або для лікування гострого лімфобластного лейкозу з мутацією посилення функції шляху ІІ-7-

Е/5ЗІР або для лікування відторгнення трансплантата та/або пацієнтів, які потребують трансплантації та/або на стадії підготовки до трансплантації та/або перенесли трансплантацію.

У переважних варіантах реалізації розглядається лікування запальних захворювань кишечнику (З33К), зокрема хвороби Крона (СО) або виразкового коліту (ВК), або первинного синдрому

Шегрена, або системної червоної вовчанки, або системного склерозу, або розсіяного склерозу, або діабету типу І. Зокрема, винахід відноситься до поліпептиду або його антитіла або антигензв'язуючого фрагменту або його молекули-міметика антитіла, або до виділеної молекули нуклеїнової кислоти, або до фармацевтичної композиції за винаходом для застосування в якості лікарського засобу, більше конкретно для застосування у профілактиці або лікуванні відторгнення трансплантата органу або тканини або захворювання, вибраного з групи, що складається з аутоїмунних захворювань, зокрема ревматоїдного артриту, системного склерозу, розсіяного склерозу, діабету І типу, аутоїмунного тиреоїдиту, системної червоної вовчанки, первинного синдрому Шегрена та запальних захворювань, зокрема запальних захворювань кишечнику (ЗЗ3К), більше конкретно, хвороби Крона та виразкового коліту, й енцефаломієліту, а також алергійних захворювань та ракових захворювань, і захворювань, пов'язаних із трансплантацією, і респіраторних захворювань, переважно при місцевому застосуванні.

У даному документі запропоновані застосування поліпептиду, легкого ланцюга антитіла або антитіла, відповідного антигензв'язуючого фрагмента або молекули-міметика антитіла при бо лікуванні патологічних станів, що включають зміну імунної відповіді у пацієнта-людини, що призводить до домінантного толерогенного статусу, або, навпаки, відсутності толерантності у випадках, коли необхідний контроль рівня імунної відповіді, а також руйнування злоякісних

Ср127-позитивних клітин.

Під "лікуванням" або "терапевтичним лікуванням" мається на увазі, що проведені етапи введення призводять до поліпшення клінічного стану тварини або людини, що потребує цього, який страждає від розладу (розладів), асоційованих зі шляхом 1-7, тобто включають активацію або проліферацію СО127-позитивних клітин. Таке лікування спрямоване на поліпшення клінічного стану тварини або людини-пацієнта шляхом усунення або полегшення симптомів, асоційованих з розладом(-ами), пов'язаними зі шляхом 1-7, тобто з активацією або проліферацією СО127-позитивних клітин. Переважне лікування, запропоноване у даному документі, дозволяє відновити здоров'я. Переважно, зазначене лікування не має небажаних негативних ефектів, пов'язаних з підвищеним дозріванням імунних клітин, зокрема дендритних клітин.

У приватних аспектах лікування пацієнтів представлені поліпептид, антитіло, антигензв'язуючий фрагмент, молекула-міметик антитіла, полінуклеотид, клітини або клітинна лінія або композиція, призначені та/або підходящі для застосування для виснаження СО127- позитивних клітин при збереженні СО127-негативних клітин.

У приватних аспектах лікування пацієнтів представлене застосування поліпептиду, антитіла, антигензв'язуючого фрагмента, молекули-міметика антитіла, полінуклеотиду, клітин або клітинної лінії або композиції, призначених і/або підходящих для застосування для запобігання диференціювання й/або експансії та/або дозрівання СО127-позитивних клітин, зокрема диференціювання, експансії або дозрівання, індукованих 1-7 і/або Т5І Р, при цьому роблячи незначний вплив або не роблячи прямого впливу на СО127-негативні клітини.

У приватних аспектах лікування пацієнтів представлене застосування поліпептиду, антитіла, антигензв'язуючого фрагмента, молекули-міметика антитіла, полінуклеотиду, клітин або клітинної лінії або композиції, призначених і/або підходящих для застосування для усунення/нейтралізації наївних Т-клітин і Т-клітин пам'яті шляхом втручання у передачу сигналів, індуковану 1І--7, при збереженні Тгед-клітин.

У приватних аспектах лікування пацієнтів представлене застосування поліпептиду, антитіла,

Зо антигензв'язуючого фрагмента, молекули-міметика антитіла, полінуклеотиду, лінії клітин або клітин, призначених і/або підходящих для застосування для виснаження субпопуляцій лімфоцитів або інших популяцій клітин, експресуючих СО127 (включаючи нормальні або патологічні Т- і В-лімфоцити, МК-клітини, дендритні клітини й інші типи клітин, включаючи епітеліальні клітини) в результаті цитотоксичної дії антитіл, можливо, але не винятково, за допомогою АОСС (антитіло-залежна клітинна цитотоксичність) і, необов'язково, за допомогою

СОС (комплемент-залежна цитотоксичність).

Також у даному документі запропонований поліпептид, зокрема, легкий ланцюг антитіла й/або антитіло, антигензв'язуючий фрагмент, молекула-міметик антитіла, полінуклеотид, клітини або клітинна лінія або композиція, визначені вище, для застосування як активного інгредієнта в комбінованій або додатковій терапевтичній схемі у пацієнта, що потребує цього. Також передбачене застосування поліпептиду, зокрема легкого ланцюга антитіла й/або антитіла, антигензв'язуючого фрагмента, молекули-міметика антитіла, полінуклеотиду, клітин або клітинної лінії або композиції, визначених вище, в якості терапевтично активного інгредієнта в комбінованій або додатковій терапевтичній схемі у пацієнта, що потребує цього.

У вищевказаних аспектах передбачуване використання також застосовне до нуклеїнових кислот, векторів, клітин, клітинних ліній, композицій та фармацевтичних композицій, запропонованих вище.

Запропоновані у даному документі засоби та продукти, зазначені вище, призначені й/або є підходящими для застосування при патологіях, таких як викликані відторгненням трансплантата, аутоїмунні захворювання, алергійні захворювання, респіраторні захворювання, хронічні вірусні інфекції, хронічні запальні захворювання, зокрема хронічне запалення кишечнику, лімфома, лейкоз або інші ракові захворювання, включаючи захворювання, що виникають в результаті солідних пухлин, коли ці патології асоційовані з СО127-позитивними клітинами, а також із сигнальним шляхом 1-7, зокрема, коли слід уникати збільшення дозрівання дендритних клітин. Відповідно, зазначені засоби та продукти зокрема призначені й/або є підходящими для лікування певних алергійних шкірних захворювань, запальних захворювань кишечнику (З3З3К), зокрема хвороби Крона (СО) або виразкового коліту (ВК), або гострого лімфобластного лейкозу (наприклад, Т-ГЛЛ) або лімфоми Ходжкіна, або раку молочної залози, асоційованих із клітинами СО127, раку нирки, раку сечового міхура, раку легені, раку бо підшлункової залози або для лікування Т-клітинної шкірної лімфоми, такої як лімфома Сезарі,

або для лікування гострого лімфобластного лейкозу з мутацією посилення функції шляху ЇЇ -7-

Е/Л5ЗІР або для лікування відторгнення трансплантата та/або пацієнтів, які потребують трансплантації та/або на стадії підготовки до трансплантації та/або перенесли трансплантацію.

Зокрема, у даному документі запропоноване застосування поліпептиду, зокрема, легкого ланцюга антитіла й/або антитіла, антигензв'язуючого фрагмента, молекули-міметика антитіла, нуклеїнової кислоти, клітин, клітинної лінії або композиції пацієнту-людині для лікування станів і/або патологій, викликаних відторгненням трансплантата, аутоїмунних захворювань, алергійних захворювань, респіраторних захворювань, хронічних вірусних інфекцій, хронічних запальних захворювань, зокрема хронічних запальних захворювань кишечнику, лімфоми, лейкозу або інших ракових захворювань, включаючи ті, які виникають в результаті солідних пухлин, коли ці патології асоційовані з СО127-позитивними клітинами, а також із сигнальним шляхом 1-7, зокрема, коли слід уникати збільшення дозрівання дендритних клітин. Відповідно, зазначені продукти призначені, зокрема, для лікування певних алергійних шкірних захворювань, запальних захворювань кишечнику (З3З3К), зокрема хвороби Крона (ХК) або виразкового коліту (ВК), або гострого лімфобластного лейкозу (наприклад, Т-ГЛЛ) або лімфоми Ходжкіна або раку молочної залози, асоційованих із клітинами СО127-, раку нирки, раку сечового міхура, раку легені, раку підшлункової залози або для лікування Т-клітинної шкірної лімфоми, так як лімфома

Сезарі, або для лікування гострого лімфобластного лейкозу з мутацією посилення функції шляху І/7-К//5ЗІР або для лікування відторгнення трансплантата та/або пацієнтів, які потребують трансплантації та/(або на стадії підготовки до трансплантації та/або перенесли трансплантацію або для лікування аутоїмунного захворювання або алергійного захворювання, або для лікування лейкозу, такого як гострий лімфобластний лейкоз, або для лікування лімфоми, або для лікування ракового захворювання, або для лікування хронічної вірусної інфекції, або для лікування запальних захворювань, зокрема ЗЗК, особливо ХК або ВК, або для лікування респіраторних захворювань, або для профілактики і/або лікування симптомів, пов'язаних з трансплантацією.

Зокрема, у даному документі запропонований спосіб лікування, який включає введення поліпептиду (зокрема, варіабельного домену легкого ланцюга антитіла або легкого ланцюга антитіла) й/або антитіла, антигензв'язуючого фрагмента, молекули-міметика антитіла, або

Зо виділеної молекули нуклеїнової кислоти, клітин і/або клітинної лінії або композиції та/або фармацевтичної композиції, згідно з визначенням вище, пацієнту-людині для лікування станів і/або патологій, викликаних відторгненням трансплантата, аутоїмунних захворювань, алергійних захворювань, респіраторних захворювань, хронічних вірусних інфекцій, хронічних запальних захворювань, зокрема хронічних кишкових запальних захворювань, лімфоми, лейкозу або інших ракових захворювань, включаючи захворювання, що виникають в результаті солідних пухлин, коли ці патології асоційовані з СО127-позитивними клітинами, а також із сигнальним шляхом І-- 7, особливо коли слід уникати збільшення дозрівання дендритних клітин. Відповідно, зазначені способи призначені, зокрема, для лікування певних алергійних шкірних захворювань, запальних захворювань кишечнику (З3З3К), зокрема хвороби Крона (ХК) або виразкового коліту (ВК), або гострого лімфобластного лейкозу (наприклад, Т-ГЛЛ) або лімфоми Ходжкіна, або раку молочної залози, асоційованого з СО127-- клітинами, раку нирки, раку сечового міхура, раку легені, раку підшлункової залози, або для лікування Т- клітинної шкірної лімфоми, такої як лімфома Сезарі, або для лікування гострого лімфобластного лейкозу з мутацією посилення функції шляху 1І-7-

Е/Л5ЗІР або для лікування відторгнення трансплантата та/або пацієнтів, які потребують трансплантації та/або на стадії підготовки до трансплантації та/або перенесли трансплантацію або для лікування аутоїмунного захворювання або алергійного захворювання, або для лікування лейкозу, такого як гострий лімфобластний лейкоз, або для лікування лімфоми, або для лікування ракового захворювання, або для лікування хронічної вірусної інфекції, або для лікування запальних захворювань, зокрема ЗЗ3К, особливо ХК або ВК, або для лікування респіраторних захворювань, або для профілактики і/або лікування симптомів, пов'язаних з трансплантацією.

Автори винаходу також показали, що у пацієнтів з ВК рівні І-7, СО127 і/або мРНК Т5І РК дозволяють прогнозувати відповідь на звичайне імуносупресивне лікування: ті, що відповіли (тобто пацієнти, у яких спостерігається виражене зниження симптомів у відповідь на лікування) мають більше низькі рівні І--7 Її СО127 і більше високі рівні ТІ ЗРК, ніж ті, що не відповіли.

Відповідно, у даному документі запропоновані способи оцінки іп мімо імовірності відповіді на імуносупресивне лікування у пацієнтів, зокрема у пацієнтів з виразковим колітом (ВК), що включають вимірювання у зразку, отриманому від зазначеного пацієнта, рівня 17, СО127 і/або

МРНАНК ТІ 5РК або білка, і дозволяють зробити висновок про те, що ймовірність відповіді бо збільшена у порівнянні з контрольною групою, коли виміряний рівень 1Ї-7 і/або СО127 нижче, ніж середній рівень у зазначеній групі, і/або коли виміряний рівень Т5І РЕ вище, ніж середній рівень у зазначеній групі. Методи для виконання потрібних вимірювань відомі фахівцю в даній області та можуть включати використання антитіла проти СО127, зокрема, для вимірювання рівнів експресії білеюла СО127. Поліпептид, зокрема, легкий ланцюг антитіла та/"або моноклональне антитіло, запропоновані вище, представлені, зокрема, для застосування в таких способах, і такі способи представлені, зокрема, з використанням такого поліпептиду, легкого ланцюга антитіла та/або моноклонального антитіла.

Зокрема, у даному документі запропонований спосіб вибору сполуки з групи, що складається з антитіла, його антигензв'язуючого фрагмента та молекули-міметика антитіла, причому цей спосіб включає щонайменше одну з наступних стадій: і. дослідження зв'язування даної сполуки з СО127, зокрема з людським СО127, зокрема з послідовністю епітопу з домену 01 і/або з сайту 25 домену 02 з СО127. Епітопна послідовність з домену 01 і/або з сайту 25 домену Ю2 може бути будь-якою з епітопних послідовностей, описаних у даному документі, зокрема, як описано у параграфах |16)Ї, зокрема епітопною послідовністю, вибраною з групи, що складається з ЗЕО ІО Мо. 31, ЗЕО ІЮ Мо: 33, 5ЕО ІЮ Мо: 34, ЗЕО І Мо: 35, 5ЕО ІО Мо: 36 або 5ЕО ІО Мо: 96 і, зокрема, ЗЕО ІЮ Мо: 34, БЕО ІЮ Мо: 35 і

ЗЕО ІО Мо: 96. У конкретному варіанті реалізації винаходу дослідження на зв'язування може включати дослідження на зв'язування сполуки з послідовністю епітопу, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮО Мо: 34, 5ЕО ІО Мо: 35 і 5ЕО ІЮО Мо: 96, і дослідження на зв'язування сполуки з послідовністю епітопу, вибраною з групи, що складається з ЗЕО ІЮ Мо: 42 і 5ЕО ІЮ

Мо: 43. Зв'язуюча здатність сполуки може бути досліджена будь-яким зі способів, відомих в даній області, зокрема методом Вій7, відомим фахівцю в даній області та проілюстрованим, зокрема, на фіг.3, у прикладі З і прикладі 4 у даному документі й у п. 14, фі. 3,416 й у відповідних поясненнях, а також у прикладах 1, 2, 6, 7 із МО 2015/189302, і/або способом із прикладу 10, розкритого у даному документі; і/або і. дослідження інгібування передачі сигналів 1Ї/7-К, індукованої 1-7, зокрема фосфорилювання 5ТАТЬ, у присутності даної сполуки. Інгібування, індуковане ІЇІ-7 у присутності даної сполуки, може бути досліджене способом, розкритим у прикладі 8 і/або прикладі 11 у даному документі; і/або

Зо ії. дослідження активації фосфатидилінозитол-З-кінази у присутності даної сполуки.

Активація фосфатидилінозитол-З-кінази у присутності даної сполуки може бути досліджена згідно зі способом, розкритим у прикладі 8 і/або прикладі 11 у даному документі; і/або ім. дослідження активації сигнального шляху ЕКК у присутності даної сполуки. Активація сигнального шляху ЕКК у присутності даної сполуки може бути досліджена згідно зі способом, розкритим у прикладі 8 і/або прикладі 11 у даному документі; м. дослідження здатності зв'язування даної сполуки щонайменше з одним бета-шаром сайту 26 домену 02 із СО127, зокрема щонайменше з третім бета-шаром сайту 20, визначеним як нуклеокислоти ЗЕО ІЮ Мо 34 і/або щонайменше з однією амінокислотною послідовністю, вибраною з групи ЗЕО ІЮО Мо: 35 і 5ЕО ІЮО Мо: 96. Зв'язуюча здатність сполуки може бути досліджена будь-яким зі способів, відомих в даній області, зокрема, методом Вій7, відомим фахівцю та проілюстрованим, зокрема, на фіг.3, прикладі З і прикладі 4 у даному документі та на с. 14, фіг. 3, 4 і 6 і відповідних поясненнях, а також прикладах 1, 2, 6, 7 із МО 2015/189302 і або способом із прикладу 10, розкритого у даному документі.

Спосіб може додатково містити в собі будь-який з наступних необов'язкових етапів або щонайменше один із наступних необов'язкових етапів: мі. дослідження зв'язування СО127, зокрема людського СО127, із загальним ус-ланцюгом цитокінових рецепторів у присутності сполуки. Зв'язування СО127 із загальним ус-ланцюгом цитокінових рецепторів цитокінів у присутності сполуки може бути оцінене, зокрема, за допомогою методів спільної імунопреципітації, добре відомих фахівцю для дослідження взаємодії білків і проїілюстрованих, наприклад, у МО 2015/189302 у прикладі 21. Зокрема, клітини можна інкубувати у присутності або під час відсутності тестованої сполуки, потім солюбілізувати в умовах білкових комплексів, що забезпечують збереження, й отриманий лізат може бути підданий імунопреципітації проти СО127, і присутність ус в СО127-вмісному імунопреципітованому комплексі може бути оцінена вестерн-блотингом з використанням анти- ус-антитіл (і навпаки, імунопреципітацію можна проводити з використанням анти-ус-антитіл, а присутність СО127 оцінювати з використанням анти-СО127-антитіл); і/або мі. дослідження інтерналізації СО127, зокрема людського СО127, й/або ІІ 7-індукованої інтерналізації СО127 у присутності сполуки. Інтерналізація СО127, визначена у даному документі у параграфах 1511-53), може бути додатково визначена та/або досліджена, як бо викладено у УМ02015/189302, зокрема у параграфах 1І591-(63| на сторінках 19-20 і на Фігурі 16 й у прикладі 5; і/або мії. дослідження дозрівання дендритних клітин, індукованих Т5І Р у присутності сполуки.

Дозрівання дендритних клітин, викликане Т5ІР, визначене у параграфах ЦІ47| і (48) даного документа. Засоби для вимірювання такого ефекту відомі фахівцю та розкриті, зокрема, у публікації МЛО 2015/189302 на сторінках 16-17 й у Прикладі 9 звідти. Зокрема, засоби для вимірювання такого ефекту включають вимірювання експресії СО40 між клітинами, стимульованими сполукою, і клітинами, стимульованими тільки ТОЇ Р (без сполуки).

У конкретному варіанті реалізації способу вибирають сполуку, яка специфічно зв'язується з

СОр127, зокрема людським СО127, є антагоністом передачі сигналів 1І7-К, індукованої 1-7, не індукуючим активацію фосфатидилінозитол-З-кінази і/або сигнального шляху ЕКК. У більше конкретному варіанті реалізації способу вибирають сполуку, яка специфічно зв'язується з

СОр127, зокрема з людським СО127, є антагоністом передачі сигналів 1І7-К, індукованої 1І-7, їі не індукуючим активацію фосфатидилінозитол-3З-кінази та не індукуючим активацію сигнального шляху ЕКК.

Зокрема, у даному документі запропонований спосіб одержання антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента за винаходом, індукованого проти СО127, можливо, викликаного імунізацією тварини, що не є людиною, такої як пацюка штаму ГОШ/С ІдКта, доступного в

Університеті м. Лувен, Бельгія). Імунізація може бути проведена з використанням фрагмента амінокислотної послідовності БЕО ІЮ Мо: 22 і, зокрема, фрагмента 5ЕО ІЮ Мо: 22, що містить епітопну послідовність, визначену в даному документі, та, зокрема, 5ЕО ІЮ Мо: 35 і/або 5ЕО ІЮ

Мо: 96, в якості імуногена. Гібридома може бути отримана шляхом злиття одноядерних клітин селезінки з імуноцитомою ІКУ983Е пацюка ГО). Гібридома може бути піддана скринінгу згідно зі здатністю секретованих моноклональних антитіл зв'язуватися з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮО Мо: 22, 5ЕО ІЮ Мо: 35 і 5ЕО ІЮ Мо: 96, особливо

ЗЕО ІЮ Мо: 35 і/або ЗЕО ІО Мо: 96. Таким чином, винахід також охоплює імуногенну сполуку, причому зазначена імуногенна сполука являє собою фрагмент амінокислотної послідовності

ЗБЕО ІЮ Мо. 22, зокрема фрагмент, що містить щонайменше одну вибрану амінокислотну послідовність з групи ЗЕО ІЮ Мо: 32, БЕО ІЮО Мо: 33, 5ЕО ІЮО Мо: 34, 5ЕО ІО Мо: 35 і 5ЕО ІЮО Мо: 96, особливо ЗЕО Мо 34, 5ЕО ІЮ Мо: 35 і 5ЕО ІЮ Мо: 96, більше конкретно ЗЕО ІЮ Мо: 96. У

Зо конкретному варіанті реалізації винаходу імуногенна сполука являє собою лінійний пептид, зокрема лінійний пептид, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 96, більше конкретно, лінійний пептид, який включає або складається з, переважно складається з амінокислотної послідовності 52ЕО ІЮО Мо. 35.

Короткий опис креслень

Фігура 1. Амінокислотні послідовності антитіл, запропоновані у даному документі

Панель А. Послідовність важкого ланцюга (МН). СОК виділені жирним шрифтом.

Панель В. Послідовність гуманізованих легких ланцюгів (ІН), отриманих із МІ38В2. СОК виділені жирним шрифтом. М1382-МІ З містить вихідні каркасні залишки М1382-и3 у положеннях 48 ії 87 (підкреслені); М1382-МІ 4-М48І і М1382-МІ 5-Е87У містять відповідний гуманізований каркасний залишок, а М1382-МІ 6-М48І -Е87У містять обидва гуманізованих каркасних залишки.

Фігура 2. Виробництво антитіл - стабільна трансфекція

Для кожного зі згаданих антитіл у клітинах СНО-М були виконані три різні промислові партії відповідно до загальноприйнятих способів, з використанням комерційно доступних безсироваткових середовищ, й у даному документі наведені титри, отримані в типових експериментах, виміряні за допомогою аналізу ЕГІ5А. Горизонтальна вісь: час культивування в днях, вертикальна вісь: отримані титри антитіл у мкг/мл.

Фігура 3. Зв'язування з СЮО127

Зв'язування зазначених антитіл з рекомбінантним СО127 аналізували методом ЕГІЗА згідно зі способом, докладно описаним у прикладі 3. Горизонтальна вісь: концентрація антитіла в нг/мл, вертикальна вісь: оптичну щільність на 450 нм в довільних одиницях.

Фігура 4. Інгібування фосфорилювання 5ТАТЬ

Інгібування фосфорилювання 5ТАТ5 зазначеними антитілами аналізували за допомогою цитофлуорометрії згідно зі способом, докладно описаним у прикладі 5. Відсоток клітин СОЗ-ь, офарбованих антитілами роТАТ»5, показаний на панелі А (горизонтальна вісь: концентрація антитіл у нг/мл), а середня інтенсивність флуоресценції (в довільних одиницях) сигналу ретТАТ5 для клітин СЮОЗ3-- показана на панелі В.

Фігура 5. Вплив на Т-клітини пам'яті

Панель А. Відповідь ОТН (площа під кривою кривих еритеми) у павіана після ін'єкції М1382.

Гіперчутливість уповільненого типу у відповідь на провокацію туберкуліном проаналізували бо у вакцинованих павіанів після введення М1382 (п-7 павіанів) або допоміжної речовини (п-4 павіана) шляхом вимірювання шкірної реакції згідно зі способом, докладно описаним у прикладі 6. Вертикальна вісь: площа під кривою еритеми в довільних одиницях. Значення наведені для внутрішньошкірних реакцій, проведених у задані моменти часу, зазначені в днях по горизонтальній осі, до або після введення М1382 або допоміжної речовини (що вводиться в день 0). "Після БЦЖ" відповідає результатам шкірної реакції, виконаним після нової вакцинації

БЦЖ (па - не визначено).

Контроль з використанням тільки допоміжної речовини не визначали в дні 150 і 180 і "після

БЦЖ" (па).

Панель В.

Відповідь ОТН (площа під кривою кривих еритеми) у павіана після ін'єкції гуманізованого

Мм1382.

Гіперчутливість уповільненого типу у відповідь на зараження туберкуліном аналізували у вакцинованих павіанів після введення гуманізованого М1382 (АА892В88, 32257, М915650), 33874) або буфера шляхом вимірювання шкірної реакції згідно зі способом, докладно описаним у прикладі 6. Вертикальна вісь: площа під кривою еритеми, в довільних одиницях. Значення наведені для внутрішньошкірних реакцій, вимірюваних перед введенням гуманізованого М1382 або буфера (1ОК1", перший стовпчик ліворуч для кожного павіана), через 4 години після введення гуманізованого М1382 або буфера (1О2", другий стовпчик ліворуч), через один, два та три місяці (7О0К3-5", з третього по п'ятий стовпчик ліворуч) і через чотири місяці ("/ОКб", шостий стовпчик ліворуч, тільки для М9150А) після введення гуманізованого М1382 або буфера та після нової вакцинації БЦЖ ("ОК7", останній стовпчик ліворуч).

Панель С.

Аналіз ІЕМУ ЕГІЗРОТ проводили на РВМС в крові у вакцинованого БЦЖ павіана, після провокації туберкуліном і введення гуманізованого М1382.

Частоту АСб-специфічних Т-клітин після зараження туберкуліном аналізували у вакцинованих павіанів після введення гуманізованого М1382 (АА892В88, 32257, М915650), 33874) або за допомогою аналізу ІЕМу методом ЕГІ5РОТ згідно зі способом, докладно описаним у прикладі 6. Вертикальна вісь: частота плям на 100 000 клітин. Значення наведені для ЕГІЗБРОТ без антигену ("без Ад", ліві стовпчики) або з туберкуліновим антигеном (праві стовпчики),

Зо виконаного до введення гуманізованого М1382 або буфера (перший стовпчик ліворуч для кожної групи стовпчиків), через 4 дня після введення гуманізованого М1І382 або буфера (ТОК2"), через один, два та три місяці (7О0К3-5") ії чотири місяці (7ОКб", тільки для М9150А) після введення гуманізованого М1І3В2 або буфера та після нової вакцинації БЦЖ (останній стовпчик ліворуч, заштрихований).

Фігура 6. Експресія І -7, СО127 і Т5І Р у пацієнтів із ЗЗК

Рівні експресії мРНК 1-7, СО127 (розчинна форма І!/-7Коа) і Т5ІР (повнорозмірні) вимірювали згідно зі способом, докладно описаним у Прикладі 7, у зразках тканин від здорових контрольних суб'єктів (контроль без ЗЗК), здорових і хворих (запалених) зразках біопсії товстої кишки від пацієнтів з активним виразковим колітом (ВК), які не відповіли (або перестали відповідати) на протизапальне лікування, і в зразках від пацієнтів з ВК з неактивним захворюванням -- тобто, які були вилікувані або перебували в стадії ремісії під час відбору проб ("що відповіли"). Вертикальна вісь: відносні одиниці флуоресценції. Точки відображають значення для кожного зразка в окремій групі, горизонтальна смужка представляє середні значення для групи, а "вуса" помилок представляють стандартне відхилення. "" означає р- значення «0,05; "я" - р-значення «0,01; "ие" р-значення «0,0001.

Фігура 7. Інгібування сигнальних шляхів СО127

Вплив різних антитіл проти СЮО127 людини на активацію сигнальних шляхів оцінювали за допомогою вестерн-блотингу, як докладно описано у прикладі 8. На фігурі представлені репрезентативні результати від б різних донорів. "Без ІЇ-7" відповідає зразку, який не був стимульований 1-7. "С" відповідає контрольному зразку, стимульованому 1-7 під час відсутності антитіла проти СО127. Горизонтальні лінії ліворуч від блота представляють міграцію зазначеного маркера молекулярної маси. Стрілки праворуч від блота вказують міграцію тирозин-фосфорильованого ЗТАТЬ5, тирозину 199-фосфорильованого РІЗ-К роб, фосфорильованого АКІ, фосфорильованого ЕКК 1/2 і, в якості еталона завантаження, ЗСАРОН.

Фігура 8. Придушення вивільнення цитокінів Т-клітин із біоптатів ВК

Панель А. Продукування ІЕЄМу зразками біопсії пацієнтів з ВК, вирощеними ех-мімо. Панель

В. Продукування ІЕМу зразками біопсії пацієнтів з СО, вирощеними ех-мімо.

На обох панелях зразки були отримані й оброблені, як докладно описано у Прикладі 9.

Кожний символ представляє один зразок від пацієнта, культивований з дос ("Сі АБ") або з бо антитілом проти СО127 ("а -7Ка"). Зв'язані символи являють собою парні зразки від одного і того самого пацієнта. "р «0,01 з критерієм для зв'язаних пар Уілкоксона. Продукування ІЄМу було значно інгібоване тАб проти І/7Ка. Аналогічні результати спостерігалися для зразків біопсії пацієнтів з СО.

Фігура 9. Антитіла проти І -7Ка людини й агоністичні сигнали

Вплив різних антитіл проти людського СО127 на активацію сигнальних шляхів 5ТАТЬ, РІЗК й

ЕКК оцінювали за допомогою Вестерн-блотингу, як докладно описано у Прикладі 11. На фігурі

ОА показана одна з семи різних донорських клітин під час відсутності екзогенного рекомбінантного людини 1-7. Панель А. "Середовище" відповідає зразку, що не містить ніяких антитіл проти людського СО127. "Без ІЇ7" означає, що чотири зразки не були стимульовані ЇЇ. -7.

Три зразки попередньо обробляли 10 мкг/мл одного тАБ проти ІІ -7Ка (М1382-пМІ 6 або МО707- 13-64 або 1А11-С1).

Панель В. Кількісне визначення різК і рЕКК, скоректоване на експресію САРОН і нормалізоване до контрольних умов середовища (п-7 різних донорів). Вертикальна вісь: експресія, нормалізована до контролю. Точки відображають значення для кожного зразка в окремій групі, горизонтальна смужка представляє середні значення для групи, а "вуса" помилок представляють стандартне відхилення.

Фігура 10. Вплив антитіл проти І 7-Ка людини на активацію шляху І 7

Кількісне визначення сигналу фосфо-ЗТАТ5 було скоректоване з урахуванням експресії

САОРН і нормалізоване до контрольних умов середовища. РВМС попередньо обробляли 10 мкг/мл одного тАб проти 1І7-ВКа (М1382-пМІ 6 або МО707-13-54 або 1А11) та потім інкубували протягом 10 хв при 37 "С з 5 нг/мл ІЇ7 людини. Кількісні оцінки сигналу фосфо-5ТАТ5 були скоректовані на експресію ЗАРОН (п-7 різних донорів). Пунктирна лінія зображує стан середовища без обробки. Точки відображають значення для кожного зразка в окремій групі, горизонтальна смужка представляє середні значення для групи, а "вуса" помилок представляють стандартне відхилення. "" означає р-значення «0,05 між зазначеними групами.

Фігура 11. Подвійні тАб-агоністи/антагоністи проти ІЇ7-Ка індукують модифікації транскрипції

Аналіз послідовностей РНК людських РВМС (п-7), інкубованих протягом 3,5 годин (1) з 5 нг/мл 17 людини, (2) без 1-7, (3,4,5) з 5 нг/мл ІЇ7 людини та з різними анти-тАБ ІІ 7-Ка людини

Зо ((3): 10 мкг/мл М1382-РМІ 6; (4): 10 мкг/мл МО707-13-1Ід4; (5): 10 мкг/мл 1А11).

Панель А. Теплова карта експресії 93 найбільше диференційовано експресованих генів (рівень хибнопозитивних результатів (ОК) 5 95, кратність зміни (ЕО) » 2) між стимуляцією 117 і контрольними умовами.

Панель В. Кількісна оцінка медіанного профілю трьох індукованих ІІ 7 кластерів в умовах стимуляції ІІ-7, контролю й І-7 й анти-людського 1І-7-На.

Панель С. Діаграма Венна для аналізу послідовностей РНК людських РВМС (п-7), інкубованих без 1-7 протягом 3,5 годин з різними тАбБ проти І--7Ка людини (10 мкг/мл М1382-

РПМІ.6, 10 мкг/мл. МО707-13-І94 Мо1 або 10 мкг/мл ТА11). Діаграма Венна для 481 диференційно експресованих генів (БОК 5595, ЕС » 1,5), при порівнянні тАб проти І/-7Коа людини та контрольних умов середовища. Розмір кола пропорційний кількості генів для кожної категорії.

Приклади

Приклад І. Гуманізація легких ланцюгів

Наступний важкий ланцюг використовували у всіх описаних у даному документі експериментах, якщо не зазначено інше

М1382 гуманізована УН, нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ Мо: 13):

САсатасласСстастоаААтТсАаасвсасаацАСтааТСАААсСсСссессавастоАстасатста тТесАТОТаОССОСТСТСАсСастТсСАСАСТадасаАСТАСТАТАТааСАТтТасАтТоСаАСАСасСАССАС вСАдасадстасалатасататсТАСТАТТТСОТаСсСсАСТОСИССсСтТадааАСсСТтТАСТАТОСТадсСАс татСсАдсапААааТСсАСААТСТСАСаааАТтТААСаТсСтТАААААТТОоССТаТатАССтТасСсАцвАТаААСА ссстададасСспААаАСсАсСсастататАСтТАТТаСЯаСстТоаТасссСАСсТатоСасСАСАСТАТОССТТ

СААТТАСТТТаАТТАТТаВСЬОСОССАСсОДатТАСоСтТаатТаАСАС тотТосдас

М1382 гуманізована МН, Амінокислотна послідовність (ЗЕО ІО Мо: 7): див. фіг. ТА

Наступні оптимізовані нуклеотидні послідовності використовували для одержання легких ланцюгів антитіла (амінокислотні послідовності яких представлені на фіг. 18):

М1382-Н3 (5ЕО ІО Мо:14): вАаАтТатсАтТадсаСсАаатоооСасСАлСсастотсатстосссасспаАдАаСсаСасаАсо статсатасдаАсСстоСадааАСАТСТАССААХСсасСстоаСсатааТАТСА,САаАлассосовас

СсАсаассссеса,астатта4датстТАСТСаСаААСАССТТасАСАТСЯЯСАТОСССТОССССЯСаСсТТстТ (510) ссасатсдссаХаСсаасСАСсСаАаТТСАСССТаАСсСАТСТОССЯТСОСстТоСАаАаа,аСсадааАСстТТоСа сса,ататАСТАСТаСсСсАдасСсАатАСТАСЯАСТАСССССТОССЯТТосвасИа7аСсаааАССААсаИТтас

АСПСАТСАдДа

МІЗваАМІ З (5ЕО ІО Мо: 15): вАСАТТСАЧАТаАСССАСсТососСстовА,ассталатасваататавсасаАсСсасатаАСах тТсАсСсСТОаССсСОсаАсСатоСадасАтТАТСТАССАОСВОасСстТИасстаатТАССАасСАаадАаасССсаавиасСА давСССсССАААстТастаатстТАСсдасСсасСоААСАСССТоСАСАТСОСССЯВтТоСсоСсАассааттсА ссасстосаастоаацпААСацпАСтТАСАСССТСАСОАтотТостосСстасаласСаспААаАСТТОС

ССАССТАСТТСТаССАасАСТАТТАСЯАСТАСССОЯСТООССЯТТССИатТааСааСАССААСИаИтоад

САТСААС

МІЗваНМІ 4 (5ЕО ІО Мо: 16): вАСАТТСАЧАТаАСССАСсТососСстовА,ассталатасваататавсасаАсСсасатаАСах тЄсАсСсТасСсОосалсатоСадааАтТАТСТАССАСЬЯССТОССОСтТОатАСсСАаСАадда,аССсавасА аВсССсСсССАААстТастастотТАсАдаСрасСцпААСАСССТоСАСАТССОСССЯтоСсСоСсАассааТттсА ссасстосаастоаацпААСацпАСтТАСАСССТСАСОАтотТостосСстасаласСаспААаАСТТОС

ССАССТАСТТСТаССАасАСТАТТАСЯАСТАСССОЯСТООССЯТТССИатТааСааСАССААСИаИтоад

САТСААС

М1ІЗва2АМІ 5 (ЗЕО ІО Мо: 17): вАСАТТСАЧАТаАСССАСсТососСстовА,ассталатасваататавсасаАсСсасатаАСах тсАсСсТасССсвалсатоСадааАТтТАТСТАССАЧСЬЯССТОСССТаатТАССсАаСАаадАда,аССавасСА давССсСсССАААстТастаатстАСсАдасСсасСоААСАСССТоСАСАТССССОЯТоСОССсАДаССасттсСА ссасстоссастоаацпААСацпАСтТАСАСССТСАСОСАТоТоОсТоССсТасАаасСасААаАСТТСа

ССАССТАСТАСТОССАаСАаТтАТТАССЯАСТАСОСЯСТвОСЯттосатааСсцасСАССАдастоаА

САТСААС

М1Зва2 МІ 6 (ЗЕО ІО Мо: 18): вАСАТТСАЧАТаАСССАСсТососСстовА,ассталатасваататавсасаАсСсасатаАСах тсАсСсТасССсвалсатоСадааАТтТАТСТАССАЧСЬЯССТОСССТаатТАССсАаСАаадАда,аССавасСА ааСсСсСсССАААстТастастоТАСсАдаСрасцпААСАСССТССАСАТосОоСсатосСсСАасСаатТсСА ссасстосаастоаацпААСацпАСтТАСАСССТСАСОАтотТостосСстасаласСаспААаАСТТОС

ССАССТАСТАСТОССАаСАаТтАТТАССЯАСТАСОСЯСТвОСЯттосатааСсцасСАССАдастоаА

Коо) САТСААС

Кожну послідовність МІ. отримували шляхом синтезу генів, вставлених у вектор клонування (рОсС57) з 5-- і 3'-кінцевими В5ІМ/І та додаванням послідовності Козака (ЗССАСС) перед АТО. В якості вектора експресії використовували плазміду експресії рЕизесСі Ід-пк (Іпммодеп), що містить константний домен СІ Карра людського ІдДС1.

Кожну клонуючу плазміду (МІ-рОС57-Сепвзогір) розщеплювали рестриктазою В5іУМІ для екстракції вставки МІ. (400 п.н.). Очищену вставку лігували в експресійну плазміду рЕизесі Ід-нк, лінеаризовану розщепленням В5іуУМІ, ії дефосфорилювали. Позитивні клони, що мають фрагменти МІ, вставлені у правильній орієнтації перед людськими константними доменами, ампліфікували й очищали препаратом Міаіргер без ендотоксинів (Маспегеу-Мадеї) для стадії трансфекції. Важкий ланцюг клонували аналогічним чином з константним доменом, що складається з БЕО ІО Мо: 26.

Приклад 2. Одержання гуманізованих легких ланцюгів

Для досліджених гуманізованих антитіл проти СО127 трансфекцію та відбір стабільних клонів здійснювали відповідно до загальноприйнятих способів. Готували та досліджували три супернатанти для кожного антитіла, що відповідають різному співвідношенню трансфекції важкого ланцюга (НС) та легкого ланцюга (С): 2:11, 1:1,3 ї 1:2 НСС. Отримані титри представлені на фіг.2, отриманої після продукування в клітинах СНО, висіяних в кількості 300000 клітин/мл; без антибіотиків, відповідно до загальноприйнятих способів: титр аналізували за допомогою ЕГІЗА на іммобілізованому анти-людському дО (Ес) відповідного антитіла та виявлення проводили за допомогою мишачих анти-людських каппа-тАб плюс мічені пероксидазою ослині антимишачі антитіла, з виявленням методом колориметрії на 450 нм із використанням субстрату ТМВ.

Продукування М1382-п3 ії М13В2-пМІ 6 також досліджували в експериментах із транзиторною трансфекцією. За один день до трансфекції клітини СО5 висіювали в кількості 100 000 клітин/ямку в планшет Р12 з повним середовищем (МЕМ ЗМЕ10 95 (Нусіопе) 4 Р 1 95 - Си 1 95) й інкубували при 37 "С, 595 СО». В день трансфекції клітини СО5 використовували при злитті величиною від 50 до 90 95. їх промивали РВЗ5 і зберігали з 500 мкл у повному середовищі.

Змішували 0,6 мкг варіанта МН-0,4 мкг варіанта Мі. в 200 мкл середовища ОріїМЕМ і додавали 1 мкл реагенту Різ (Іпмігодеп) (інкубація 15 хв при кімнатній температурі). У суміш додавали бо 3,5 мкл ліпофектаміну І. ТХ (Іпмігодеп) ж 100 мкл й інкубували 25 хв при кімнатній температурі.

Всю суміш наносили по краплях на клітини СО5 й інкубували протягом 48 годин при 37 95, 5 90

СО». Через 48 годин супернатанти збирали та центрифугували (1500 об/хв, 10 хв, 4 С).

Супернатанти кількісно оцінювали за допомогою ЕГІЗА Ме ТН-МО-43. Кількісний аналіз активності виконували за допомогою ЕГІ5А ТН-МО-44.

Приклад 3. Зв'язування з СО127 - Ева

Для сендвіч-ЕГІЗА ослине антитіло проти людського ІдбсС (Рсо-специфічне) наносили в концентрації 1,2 мкг/мл на планшет РОб і додавали очищені антитіла для вимірювання концентрації як функції від стандартного діапазону. Після інкубації та промивання додавали мишачі антитіла проти людського легкого ланцюга, каппа-специфічні, (Енітипе, клон Мам76-

БЕЗ) плюс мічені пероксидазою ослині антимишачі антитіла (даскзоп Іттипогезеагсі, номер 715-036-151) і проявляли звичайними способами.

Для аналізу активності ЕГІ5А рекомбінантний пНСО127 (5іпо ВіоІодіса!І5, Пекін, Китай; номер 10975-НОВН) іммобілізували на пластику при концентрації 1 мкг/мл і додавали розведення анти-

СОр127-антитіла для вимірювання зв'язування. Після інкубації та промивання додавали мишачі антитіла проти людського легкого ланцюга (каппа-специфічні) плюс мічені пероксидазою ослині антимишачі антитіла та проявляли колориметрією на 450 нм із використанням субстрату ТМВ звичайними способами.

Були отримані наступні значення ЕЮ5О (концентрація, необхідна для досягнення 50 95 максимального сигналу):

Таблиця 1

Значення ЕО5БО (у нг/мл) для зв'язування антитіл з СЮО127 нІн"'Н:ІОВОИ ОАІШІТТИІІІВВВЛОВОВОВОВЛОЛВОВЛООЛЛОЛЛОЛОЛООИ УСТ СТ Я

Стабільність антитіл вивчали за допомогою інкубації антитіл протягом 7, 14 або 30 днів при 4, 25 і 42 "С. Зв'язування антитіл з СО127 залишалося чудовим навіть після З30-денної інкубації.

Значення ЕО5БО, визначені за допомогою ІФА після 30 днів інкубації, наведені в таблиці 2.

Таблиця 2

Значення ЕО5О (у нг/мл) для зв'язування антитіл з СО127 після 30- денної інкубації при зазначеній температурі. нн""'НЖИИЕИХХЗВОТЛМІТИОИЛИЛВОООЛОЛОЛОЛОЛОВОЛВЛВЛВЛВЛВЛТЛВТЛВОТЛОТЛВОТЛВОТЛОТЛОТЛОЛОЛОЛОМОО ШИ У ТОСТИ Я

Приклад 4. Зв'язування з СО127 - Вій?

Цей спосіб виконували за допомогою технології Вій» (Єогіе Віо, С22-2 Мо 61010-1).

Рекомбінантний пНСО127 (5біпо ВіоіодісаіІ5, Пекін, Китай; номер 10975-НОВН)/рекомбінантний

Зо білок (Зіпо Віоіодіса! Саї: 11612-НОВН) іммобілізували при концентрації 50 мкг/мл за допомогою фрагмента Ес у біосенсор Ес анти-ІЩО людини (АНС) (Рогіє) Віо, 18-5063) протягом 30 секунд.

Потім додавали анти-СО127-антитіла в концентрації 20 мкг/мл (насичуюча концентрація) протягом періоду асоціації 120 секунд, з наступним періодом дисоціації анти-СО0127-антитіла у буфері кінетики протягом 120 секунд. Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення Вій Рго 1.2, яке обчислювало константу асоціації (Ка) та константу дисоціації (Ка)

і визначало постійну афінності КО (Ка/ка). Результати представлені в таблиці 3.

Таблиця З

Аналіз афінності для анти-СО127 антитіл на людському рекомбінантному білці СО127 методикою

ВІЙ: 001 Асоціація (Ка) (1/мс) | Дисоціація (ка) (1/с) Афінність (КО) (М)

Приклад 5. Інгібування фосфорилювання 5ТАТ5

Щоб перевірити інгібування ІЇ7К у функціональному аналізі, антитіло інкубували з РВМС людини протягом 30 хвилин при 37 "С, а потім стимулювали 17 (АБО 5егоїес, номер РНРО46) в концентрації 0,1 нг/мл протягом 15 хвилин при 37 "С. Реакцію зупиняли при 4 "С і промивали буфером Репт У/азп перед фіксацією за допомогою набору Суюїйх/Суїорепт (ВО Віоз5сіепсе, номер 554722) протягом 15 хвилин при 4 "С. Клітини промивали й офарблювали РІТС-міченим анти-«СОЗ (ВО Віозсієпсе, номер 557694) протягом 30 хвилин при 4 "С. Потім клітини пермеабілізували при інкубації з Регт Вийег ШІ (ВО Віозсіепсе, номер 558050) протягом 30 хвилин при 4 "С. Після промивання РВ5 ВЗА! 95 азид 0,1 95, клітини офарблювали міченим

АІеха-647 антитілом проти реїаї5 (ВО Віозсієпсе, номер 612599) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Зразки аналізували на цитофлуорометрі ВО Сапо!. яИРВМО-СОЗ-- з 1/7 індукували фосфорилювання реа, тоді як без ІЇ7 фосфорилювання не спостерігалося.

Результати представлені на фіг. 4 і в таблиці нижче, де наведена ЕЮ5БО, тобто концентрація зазначеного антитіла для досягнення 50 95 сигналу в цьому аналізі.

Таблиця 4

Інгібування фосфорилювання 5ТАТ»5 антитілами проти СО127 шо 8 (2 0 Ол о 2 о (нг/мл)

Цей експеримент підтвердив, що модифікація зародкової лінії та модифікація структурних залишків гуманізованою амінокислотою не змінює біологічну активність антитіла проти СО127.

Всі досліджені варіанти (М1382-п3, М13В2-пМІ 3, М1382-НМІ 4, М1З3В2-НМІ 5, М138В2-пПМІ 6) можуть інгібувати фосфорилювання 5іаї5 після стимуляції 7 на ПРВМС, подібно раніше отриманим еталонним партіям М1382. Зосередившись на М1382-пМІ 6 (найбільше гуманізованому та найбільше оптимізованому), ми помітили, що воно здатне підтримувати свою біологічну активність в інгібуванні фосфорилювання 5іаї5 тією самою мірою, що й еталонне М1382-Н3.

Більше того, цей варіант був дуже стабільним після 14 днів інкубації при 42, 25 або 4 "С, не викликав утворення агрегатів і зберігав свою зв'язуючу активність.

Приклад 6. Вплив на Т-клітини пам'яті

Зо Туберкулінова модель гіперчутливості вповільненого типу

Павіанів двічі імунізували внутрішньошкірно вакциною бацили Кальмета-Герена (0,1 мл; 2-8 105 КОЕ; Запоїї Разівеиг М50О, Ліон, Франція) у верхній частині гомілки, за 4 і 2 тижні до шкірного тесту гіперчутливості вповільненого типу (ОТН). Внутрішньошкірні реакції (ІК) досліджували за допомогою внутрішньошкірних ін'єкцій 2000 або 1000 І очищеного білкового деривату туберкуліну, очищеного від білків середовища (РРО; Буптріоїс5 Согрогайоп, Сан-Дієго,

Каліфорнія). Сольовий розчин (0,1 мл) використовували в якості негативного контролю. Шкірні реакції в місцях ін'єкцій вимірювали з використанням штангенциркуля як мінімум двома спостерігачами та вважали позитивними при діаметрі » 4 мм. Другий ІК виконували після тритижневого періоду вимивання, і тварини отримували одну внутрішньовенну ін'єкцію 10 мг/кг

М1382 (п-7) або 10 мг/кг (МО1505А, АА89288, 32257, 33874) (п-4) гуманізованої М1І382 або еквівалентного об'єму допоміжної речовини (п-4). Додаткові ІОК виконували щомісяця після ін'єкції. Після періоду вимивання деяких павіанів (які раніше одержали М13В2) знову імунізували двічі внутрішньошкірно вакциною БЦЖ із наступним новим ІК. Середнє значення записували та наносили на графік для кожної часової точки. Щоб порівняти множинні експериментальні умови, відповіді на еритему визначали кількісно як площа під кривою (АС) з використанням для розрахунків програмного забезпечення Сгарі! Рай Ргізт (фіг. 5А і В).

ЕПЗРОТ

Ад-специфічну частоту Т-клітин відслідковували за допомогою аналізу ЕГІЗРОТ ІЕМ-9 (набір

ІРІ5-д ЕГІЗРОТ для приматів, що не є людиною; КО бузієт»5, Міннеаполіс, Міннесота) на свіжовиділених РВМС, повторно стимульованих туберкуліном, відповідно до інструкцій виробника.

Стисло, захоплююче антитіло (КО 5зу«їетв5, каталожний номер 5ЕЇГ 961) додавали в кожну ямку фільтрувальних пластин ЕГІБРОТ МийізЗсгеєпФ НТ РГійег Ріаїезх (Мегок Мійіроге) й інкубували одну ніч при 4 "С. Після трьох промивань додавали блокувальний буфер і планшет інкубували 2 години при температурі навколишнього середовища. РВМС павіанів були недавно витягнені з крові павіанів за допомогою центрифугування в градієнті фіколу (СЕ Неайсаге Пе зсіепсе, Париж, Франція). Потім еритроцити лізували та клітини промивали перед відновленням у відповідній концентрації в культуральному середовищі (середовище ТехМас5, доповнена пеніцилін-стрептоміцином (сібсо)) з очищеним білковим дериватом туберкуліну або без нього.

Планшет інкубували при 37 "С і 5 95 СО» протягом 18-24 годин. Після трьох промивань буфером для промивання додавали детектуюче антитіло (КО зузіет5, каталожний номер 5ЕЇ 961) й інкубували при 4 "С протягом 24 годин. Стрептавідин-АР (КУО 5узіет5, каталожний номер

ЗЕ 002) додавали після трьох промивань й інкубували дві години при температурі навколишнього середовища протягом 2 годин. Виконували три промивання. Потім додавали

ВСІР/МВТ (КО 5узіет5, каталожний номер ЗЕ 002) і витримували в темряві 30 хвилин. Було потрібно декілька промивань буфером для промивання й одне - деіонізованою водою (фіг. 5С).

Тварини

Павіани (Раріо апибіє; 7-14 кг) були отримані з Національного наукового центру

Приматології (Руссе, Франція). Тварин тримали у великому віварії блоку ІМ5ЕКМ 1064.

Дослідження на тваринах були схвалені Національним комітетом з етики Франції.

Зо Результати

У першому експерименті перший тест ІК з туберкуліном виконували на павіанах, вакцинованих БЦЖ, які не отримували лікування в цей час (день -30). Після періоду вимивання довжиною один місяць другий тест ІК виконували через 4 години та потім раз на місяць після в/в ін'єкції 10 мг/кг М1382 (білі стовпчики). Останній тест на ОК виконували після нової вакцинації БЦЖ (через 14 місяців після введення антитіла). Контрольні тварини (чорні стовпчики) отримували аналогічний об'єм допоміжної речовини, тобто отримували провокацію за тим же протоколом. Отримані результати показали, що химерне антитіло проти ІІ/7кКа викликає дуже тривалий захист (до 14 місяців) після одноразового введення. Відповідь на провокацію відновилася тільки після нової вакцинації.

В іншому експерименті перший тест ІК з туберкуліном виконували на павіанах, вакцинованих БЦЖ (заштриховані стовпчики - наприклад, ІОКІ для М9150А). Після періоду вимивання довжиною в один місяць тест ІК виконували через 4 години та потім раз на місяць після в/в ін'єкції 10 мг/кг гуманізованого М13В2 (суцільні стовпчики - наприклад, ІОК2-6 для

М915СА). Останній тест на ІК виконували після нової вакцинації БЦЖ і туберкуліном (заштриховані стовпчики - наприклад, ІОК7 для М9150А). Контрольні тварини (чорні стовпчики) отримували аналогічний об'єм допоміжної речовини, тобто отримували провокацію за тим же протоколом. Отримані результати показали, що гуманізоване М13В82 індукує тривалий захист після одноразового введення в З із 4 оцінених павіанів. Тварина "33874" спочатку відповідала відразу після введення антитіла, але відповідь відновилася мимовільно через місяць.

РВМС у крові повторно стимулювали ех мімо туберкуліном. Перший аналіз ЕГІ5РОТ ІЕМУ з туберкуліном або без нього виконували на павіанах, вакцинованих БЦЖ (заштриховані стовпчики). Другий аналіз ЕГІБРОТ ІБМУу проводили через 4 дня після ін'єкції 10 мг/кг гуманізованого М13В82 (суцільні стовпчики). Потім новий аналіз ЕГІЗРОТ проводили щомісяця при кожному новому тесті ОК туберкуліном іп мімо. Останній аналіз ЕГІ5РОТ ІЄМу проводили після нової вакцинації БЦЖ (заштриховані стовпчики). Отримані результати показали, що введення гуманізованого М1382 індукувало антигенспецифічну делецію Т-клітин пам'яті у тварин із тривалою відповіддю. Павіан "33874" не показав значного скорочення туберкулін- специфічних Т-клітин пам'яті паралельно з відсутністю довгострокового захисту в моделі ОТН.

Після нової вакцинації БЦЖ тварини з тривалою відповіддю показали підвищену частоту бо антиген-специфічних Т-клітин пам'яті, які відновлюються до базального рівня (до ін'єкції тА), і це асоційоване з відновленням відповіді ОТН іп мімо. В цілому, ці результати продемонстрували, що довготривалий захист, індукований гуманізованим М1382, асоційований з делецією антиген- специфічних Т-клітин пам'яті, що пояснює довгостроковий ефект препарату.

Приклад 7. Експресія 1-7, СО127 і Т5І Р у пацієнтів із ЗЗК

Необроблені дані з експресії мРНК, отримані, як докладно описано у РіапеїЇ єї аІ. Си 2013 аналізували як докладно викладено в описі на Фігурі 6.

Приклад 8. Сигнальний шлях людських РВМС, стимульованих анти-СО127 антитілами плюс

І 7

Сигнальні шляхи 1ІЇ7 вивчали з використанням лізатів РВМС людини, інкубованих 30 хв при 37 "С з 10 мкг/мл розчинних антитіл проти СО127 людини та стимульованих 1/7 (АБО 5Зегоїес, номер РНРО46) в концентрації 5 нг/мл протягом 10 хв. при 37 "С. Вестерн-блоттинг проводили у відновлюючих умовах з 20 мкг білка клітинних лізатів у 7,5 96 поліакриламідних гелях і наносили блотингом на нітроцелюлозні мембрани (СеНеанйпсаге). Блоти насичували 595 В5А-трис- буферним сольовим розчином (ТВ5) і проявляли або за допомогою антитіла Рпозрпо-51аї5,

Ріозрпо-РІЗ-кінази рв5, фосфо-АКЕі фосфо-ЕВКТ/2 (Сеї! Зідпаїпоа Тесппоіоду) при концентрації 11000 в 195 В5А-ТВ5 (протягом ночі при 4 "С) з наступним додаванням поліклонального міченого пероксидазою хрону козячого анти-кролячого антитіла, (технологія Сеї!І 5ідпаїїпо), при концентрації 1/2000 протягом 1 години при кімнатній температурі або з антитілом САРОН (Запіа

Сти?) при концентрації 1/1000 в 1 95 ВБА-ТВ5 (протягом ночі при 4 "С) з наступним додаванням поліклонального міченого пероксидазою хрону козячого анти-мишачого антитіла (Часкзоп

Іпптипогезеагсйй) при концентрації 1/2000 протягом 1 години при кімнатній температурі.

Мембрани проявляли хемілюмінесценцією з використанням системи візуалізації ГАЗ-3000 (Еціййт). Таким чином, були проаналізовані наступні анти-людські антитіла проти СО127:

М1382-п3 ї М1382-НМІ 6 (обидва антитіла проти сайту 1/2Б, описані у даному документі); МО707- 13-04 ("антитіло проти сайту 1", розкрите в заявці на патент УМО2013/056984) і 1А11 (розкрите у патенті ЗК МУМО2011/094259).

Приклад 9. Вплив на вивільнення цитокінів Т-клітинами в тканині ЗЗ3К

Біоптати пацієнтів із З3ЗК можна використовувати в якості моделі запалення ех-мімо, і було показано, що вони спонтанно вивільняють високі рівні прозапальних цитокінів після 24 годин

Зо культивування (ВК: ІЄМу, 130-419 пг/мл; І--6 40425529 пг/мл; І--8 25626:-1640 пг/мл - СО: ІЄМу 180238 пг/мл; І/-6 36532734 пг/мл; І/-8 15540252452 пг/мл Ісередні ї- стандартна помилка середнього для ВК і ХК відповідно).

Застосовували анти-СО127 тАБ в концентрації 10 мкг/мл в цьому аналізі культури органів з використанням хірургічних зразків, взятих зі запаленої слизуватої оболонки товстої кишки 20 пацієнтів із ЗЗК (10 пацієнтів із хворобою Крона та 10 пацієнтів з виразковим колітом), і культивування проводили при 37 "С протягом 24 годин в середовищі з 10 мкг/мл контрольного тАб їдсС або блокувального тАб проти людського ІЇ-7Ка (подробиці відбору проб й умов культивування див. нижче). Для кожного пацієнта відбирали парний контрольний зразок і культивували в тих самих умовах, з контролем до замість антитіла проти СО127. Концентрацію цитокінів вимірювали за допомогою ЕГІЗБА (як докладно описано нижче) в супернатанті культивованих ех-мімо зразків.

Вироблення ІЄМу зразками біопсії ВК, вирощеними ех мімо, була значно інгібована тАр проти І-7Ка. Аналогічні результати спостерігали для деяких зразків біопсії ХК секретуючих велику кількість ІЄМУу.

Взяття зразків і культивування органів ех-мімо

У випадку використання резекційної тканини слизуватої оболонки, невеликі фрагменти розміром з біоптат розрізали ножицями. Потім біоптати або фрагменти розміром з біоптат поміщали в 300 мкл безсироваткового середовища Ні-1 (Гопла, Сатбргіддє Віобсієпсе,

Великобританія) з додаванням І -глутаміну, 100 од/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину та 50 мкг/мл гентаміцину. Експланти слизуватої оболонки інкубували протягом 24 год. при 37 "С і 595 СО». Відповідне тестоване антитіло (М1382) або контроль ІдсС, використовувані в концентрації 10 мкг/мл, додавали в середовище на початку періоду інкубації. Нарешті, супернатант і матеріал для біопсії швидко заморожували та зберігали при -70 "С для наступного аналізу.

Твердофазний імуноферментний аналіз (ІФА)

Вироблення цитокінів у супернатанті біоптатів вимірювали за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). Людський рекомбінантний ІРМ-у від виробника ІттипоТооі5 (Ме 31673539,

Епезсоуїне, Німеччина) використовували відповідно до інструкції виробника.

Приклад 10. Порівняння антитіл проти ІЇ7-Ка людини, пов'язане з їх характеристизацією бо епітопів:

Зо

Мас-спектрометричний аналіз: профілювання антитіл з використанням пептидного мікрочипа

Пептидні мікрочипи РереїагтМ компанії Рерії ТесппоЇодіеє містять очищені синтетичні пептиди, отримані з антигенів або інших джерел, які хемоселективно та ковалентно іммобілізовані на поверхні скла. Оптимізований гідрофільний лінкерний фрагмент вставляють між поверхнею скла та пептидною послідовністю, яка отримана з антигену, щоб уникнути помилково негативних результатів, викликаних стеричним утрудненням. З технічних причин всі пептиди містять С-кінцевий гліцин. Експерименти з профілювання зразків проводили на пептидній бібліотеці, що складається з 52 пептидів. Повний список пептидів наведений нижче:

Таблиця 5

Список пептидів, використовуваних в аналізах пептидних мікрочипів 44 ЕЗСУАОМОСІЕОАБІ 62 РІЕТККРІШОКОМІ | 80 | НОМАУВОЕКОЕМКМ/ 48 РУБЗЕЗСУБОГЕММО5 66 УКУСЕКБІТСОККІР )/|84| УМІ55ТКІТНОНКІ. 50 ОСЕММОЗОНБІТСАР 68 ТСККІСІТТУКРЕА |86| ТІ ОВКГОРААМУЕ! 51 МОБОНБІТСАРЕОРО 69 І0ІТТУКРЕАРЕОІ |87| ВКІОРААМУБІКУВЗ5 53 САРЕОРОУМТТМІЕР 71 РЕАРЕСІЗМІУВЕСА )|89)| УБЇКУВБІРОНУРКО 54 ОРОММТТМІЕРЕІСС (72 ЕРІЗМІУВЕСАМОРМ 90 | УВБІРОНУРКОРМУЗЕ 60 ЕВКІОБІМРІЕТККЕ 078 ККУУКМІМНОМАУВО (61 | ОБІМРІЕТККЕШО |79| КМУІМНОУАУВОЕКОЕ | | /

В цілому 4 зразка інкубували на предметних стеклах з мікрочипами у форматі МийімеїЇ. Для антитіла М1382-п3МІ 6 й іншого зразка (МО707-13, НАЇ і ТА11) застосовували 6 різних концентрацій (10 мкг/мл; 2 мкг/мл; 1 мкг/мл; 0,1 мкг/мл; 0,01 мкг/мл; 0,001 мкг/мл). Серійні розведення зразків інкубували протягом 1 години при 30 "С на багатоямковому мікропланшеті, що містить 21 окремий мінічип (1 мінічип на кожне розведення зразка). Після інкубації зразка додавали вторинне антитіло проти (До людини в концентрації 1 мкг/мл і залишали реагувати протягом 1 години. Паралельно проводили додаткову контрольну інкубацію із застосуванням тільки вторинного антитіла на тому самому предметному склі мікрочипа для оцінки хибнопозитивного зв'язування з пептидами. Після промивання та сушіння предметне скло сканували за допомогою лазерного сканера з високою роздільною здатністю на 635 нм для одержання профілів інтенсивності флуоресценції. Отримані зображення кількісно оцінювали для одержання середнього значення пікселів для кожного пептиду. Зображення кількісно оцінювали для одержання середнього значення пікселів для кожного пептиду. Вторинне антитіло проти (До людського, мічене Су5 в концентрації 1 мкг/мл.

Буфери та розчини. Використовували ТВ5-буфер, що включає 0,05 95 Тмееп20 (ОРТ) і буфер для аналізу 120 (Ріегсе, ЗирегВіоск ТВ5 Т20, Мо37536). Збір й аналіз проводили з використанням пептидних мікрочипів (РТ Реріїде ТесппоІодіезє ЗтрнН, Берлін, Німеччина; партія Мо 2668, багатоямкова інкубаційна камера, сканер Ахоп Сеперіх бсаппег 4200АЇ).

Зо Мікрочипи сканували з використанням флуоресцентного сканера з високою роздільною здатністю. Параметри лазера та застосовувана роздільна здатність були ідентичними для всіх виконаних вимірювань. Отримані зображення аналізували та кількісно оцінювали з використанням програмного забезпечення для розпізнавання плям СеперРіх (Моїесціаг Оемісев5).

Для кожної плями була витягнута середня інтенсивність сигналу (від 0 до 65535 довільних одиниць).

Для подальшої оцінки даних визначали так звані значення ММСОС2. ММС2 дорівнює середньому значенню всіх трьох екземплярів на мікрочипі, крім випадків, коли коефіцієнт варіації (СМ) - стандартне відхилення, ділене на середнє значення - більше 0,5. У цьому випадку ММС2 присвоюється середнє з двох найближчих значень (МС2).

Аналіз за допомогою дейтерію

Використовуючи систему НОХ-2 (Умаїег5 ЗА/ММ; Зелік, Бельгія) рекомбінантний людський

СО0127 і 0- або 1-молярний еквівалент тАр змішували та розбавляли в 99,9 95 020, 10 мМ фосфату натрію, 100 мм Масі, рН 6,8 до кінцевого вмісту О2О 90 95 і концентрація комплексу с0р127 або СО127/пАБЬ 27,5 мкМ. Воднево-дейтерієвий обмін проводили при 20,0 "С протягом 30 хвилин. Обмін гасили шляхом розведення 1:1 (об./об.) зразків 100 мМ фосфатом натрію, 4 М гуанідин-НСІ, 0,4 М ТСЕР, рН 2,3, при 1,0 "С, з одержанням кінцевого рН 2,5. Через 2 хвилини погашені зразки завантажували у пристрій НОХ для оперативного розщеплення пепсином при 20,0 "С (Ензимат ВЕН пепсин, 2,1 х 30 мм; 5 мкм) з наступним знесоленням (Асдийу ВЕН С18

Мапдиага 2,1 мм х 5 мм; 1,7 м) і поділом звернених фаз (Асдийу ВЕН С18 1,0 мм х 100 мм; 1,7

МКМ) з використанням градієнта від 5 9о до 40 95 0,2 9о мурашиної кислоти в ацетонітрилі (рн 2,5) протягом 10 хвилин при витраті 40 мкл/хв при 0,0 "С. Мас-спектрометричний аналіз виконували на мас-спектрометрі УМмаїег5 Хемо 52-Х5 ЕБІ-О-ТОЕ у режимі позитивних іонів з корекцією методом ГосКЗргау. Використовували м'які умови джерела (температура: 90 с, капілярна напруга: 2,5 кВ, конус для відбору проб: 30 В, витрата десольваційного газу: 800 л/год., температура десольватації: 250 "С) для мінімізації зворотного обміну при забезпеченні належної десольватації (73). Ідентифікації пептидів сприяла викликана зіткненням дисоціація, зареєстрована в режимі М5Е з використанням РІ 5 3.0.2 й ОМІРІ 1.8. Включення дейтерію визначали в ЮупатхХ 3.0. Зображення структури готували з використанням РУМОЇ 1.8.2.3 (Зспгодіпдег Г.С, Кембридж, Массачусетсе, США) із РОВ ІО З0ІЗ (19). Одноосновний та двохосновний фосфат натрію, хлорид натрію, гідрохлорид гуанідину, трис (2-карбоксіетил) фосфін гідрохлорид (ТСЕР), 50 95 гідроксид натрію та мурашину кислоту здобували в бідта

Аїдгісп (ЗсппеїІдогі, Німеччина) з найвищою доступною чистотою. Розчинники класу І! С-М5 отримували від Віобзоїме Сіті (Дьєз, Франція), оксид дейтерію (99,995 0) і 20 95 хлорид дейтерію в оксиді дейтерію (99,96 95 Ю) отримували з Сатрбгідде Ізоїоре І абогайогіе5 (Андовер,

Массачусетс, США), 37 95 соляну кислоту - від ММУК Іпіегпайопаї (Фонтене-су-Буа, Франція) та

Зо бичачий цитохром С - від Тпегто Різпег Зсіепіййс (Гермерінг, Німеччина). Ультравідцентрові фільтри Атісоп (0,5 мл; відсічення 10 кДа) отримували від МегокК МіПіроге (Мольсем, Франція).

Результати

Характеризація епітопів за допомогою лінійного пептидного масиву різних тАбр проти І-7Ка дозволила ідентифікувати два типи тАб-антагоністів: (1) тАб, що зв'язуються з областю (сайт- 1) взаємодії з ІІ -7, як раніше описано двома іншими групами дослідників (клон 1А11, описаний у

УМО/2011/094259, і клон НАГ, описаний у УУО/2011/104687), і включають МО707-13, і (2) тАбБ, тобто М1382-ПЗМІ 6 за даним винаходом, що зв'язують як сайт-1, так й епітоп, що перекриває передбачений домен (сайт-2р) гетеродимеризації між ІІ -7Ка та субодиницями у-ланцюга (Умаївй 2012).

М138в2-п3МІ 6 і МО707-13 з високою та подібною афінністю (зв'язування з сайтом-1/25 з КО 2 х 1079 М і зв'язування з сайтом-1 з аналогічним КО 5 х 1079 М) рекомбінантно експресували з ізотипом Ес людського Ід4 (що містить шарнірну мутацію 5228Р для запобігання обміну Рар- плече) і порівнювали з раніше описаним ІтАБб з іншим сайтом-1 з аналогічною афінністю, клон 1А11, описаним у М/О/2011/094259 (КО 6 х 10-99 М) і рекомбінантно експресували з ізотипом Ес людського ІДС1, який у даний час розробляється у клінічних випробуваннях (клінічні випробування МСТ02293161). Аналіз конформаційного епітопу з використанням воднево- дейтерієвого обміну з мас-спектрометрією (НОХ-М5) підтвердив попередні спостереження та продемонстрував, що антитіло за винаходом, тобто М1382-пЗМІ 6 (сайт-1/25 тАБбБ), захищене від включення дейтерію в декілька пептидів сайту-1, але також у пептид, що перекриває сайт-2Б, у той час як два інших тАб (МО707-13 і 1А11) значно запобігають включенню дейтерію тільки в пептиди з сайту-1 (дані не показані).

Антитіло за винаходом було єдиним, яке розпізнало конформаційний епітоп, локалізований на сайті 1 із домену 1, і конформаційний епітоп, локалізований на сайті 26 людського СЮО127.

Приклад 11. Порівняння антитіл проти І -7Ка людини за їх здатністю бути агоністом й/або антагоністом шляху ЇЇ -7.

Вестерн-блотинг

Свіжовиділені РВМС людини інкубували протягом 30 хвилин при 37 "С з 10 мкг/мл тА проти І--7Ка людини, а потім культивували окремо або з 5 нг/мл рекомбінантного людського ІЇ-- 7 (АрОЗегоїес) протягом 10 хвилин при 37 "С. Після зупинки реакцій на льоді готували лізати бо клітин з використанням буфера РІРА (з коктейлем інгібітора протеази). Білки (15 мкг) розчиняли у відновлюючих умовах на 7,5 95-поліакриламідних гелях й іммобілізували на нітроцелюлозних мембранах (СеНеайсаге) з використанням стандартних способів. Блоти промивали 5 95 В5А- трис-буферним сольовим розчином й інкубували з Рпозрпо-5ТАТ 5, Ріпозрпо-РІЗК р55 або

Ріпозрпо-ЕВК-специфічними антитілами в 195 ВБА-ТВ5 (протягом ночі при 4 "С), а потім поліклональними анти-козячими антитілами кролика, міченими пероксидазою хрону (технологія

Сеїї бідпаїїпо), протягом 1 години при кімнатній температурі. В якості альтернативи, блоти офарблювали з використанням антитіла ЗСАРОН (Запіа Сги) в 1 925 ВБА-ТВ5 (протягом ночі при 4 "С), а потім поліклонального козячого анти-мишачого антитіла, міченого пероксидазою хрону (Часкзоп Іттипогезеагсі)), протягом 1 години при кімнатній температурі. Мембрани детектували хемілюмінесценцією з використанням системи візуалізації ГАБ-3000 (Еціїтт).

РНК-секвенування

Свіжовиділені людські РВМС інкубували з 10 мкг/мл моноклональних антитіл проти людського І-7Ка (30 хв при 37 "С), а потім культивували окремо або з 5 нг/мл рекомбінантного людського 1-7 (АрО5егоїес) протягом З годин при 37 "С. Реакції зупиняли на льоді й осад клітин ресуспендували у буфері КІТ (Оіадеп), що містить 1 95 Р-меркаптоетанол, в очищеній від

РНКази/ДНКази воді та зберігали при -80 "С. РНК екстрагували з використанням набору для міні-екстракції РНК відповідно до інструкцій виробника (Оіадеп). Якість та кількість РНК оцінювали за допомогою інфрачервоної спектрометрії (Мапоадгор) та біоаналізатора Адіїєепі (Адіепі КМА 6000 Рісо Кі). Бібліотеки Зтап-5Зед2 готували у Вгоай Тесппоіоду Габрзх і секвенували за допомогою Вгоай Сепотіс5 Ріацйогт відповідно до протоколу 5тагзед2 з деякими змінами. Стисло, повну РНК очищали з використанням мікросфер РНК-5РАЇ, мРНК роїуА хз піддавали зворотній транскрипції в КДНК, й ампліфіковану кКДНК піддавали фрагментації на основі транспозону, використовуючи подвійне індексування для штрих-кодування кожного фрагмента кожного перетвореного транскрипту комбінацією специфічних штрих-кодів для кожного зразка. Секвенування проводили у форматі спарених кінців 2 х 25 п.н. з додатковими 8 циклами для кожного індексу. Дані розділяли за штрих-кодом і вирівняні з використанням Торпаї версії 2.0.10 з настроюваннями за замовчуванням. Транскрипти кількісно оцінювали за допомогою обчислювального конвеєра Вгоай ТесппоЇоду І арх з використанням Сийднпапі версії 2.2.1. Стисло, дані обробляли за допомогою СийМогт, якщо 50 95 зчитувань були вирівняні, і

Зо якщо принаймні 100 000 пар були вирівняні на кожний зразок. При нормалізації використовували настроювання за замовчуванням, включаючи "геометричну" нормалізацію, й інформацію про рівень експресії, у вигляді перетворені в І0д2 значень ЕРКМ (число фрагментів на т.п.н. транскрипта на мільйон картованих фрагментів), використовували для наступного аналізу. Для виявлення диференціальних генів виконували лінійне моделювання з оцінкою відношення середнє-дисперсія (підхід Ійтта-їйгепа) за допомогою емпіричної байєсівської статистичної процедури з використанням пакета ІІММА в КК. Гени з р-значенням, відкоректованим за Бенджаміні та Хохбергу, «595 і кратністю зміни (ЕС)» 1,5 вважалися диференційно експресованими. Для представлення експресії генів виконували аналіз основних компонентів (РСА) і кластеризацію в К м3.3.2 з використанням пакетів аде4/адедгарпісзв і рпеайтар відповідно. Біологічну значимість відібраних генів оцінювали з використанням пакета

ЕК сіизіегРгойег. Відбирали категорії генної онтології (50), збагачені показником помилкового виявлення (РОК) «5 95 і щонайменше з п'ятьма представленими генами. Доступ до даних ЕМА- зед можна одержати використовуючи номер доступу ОБО О5Е

Результати

Сигнальні шляхи 5ТАТ5, РІКЗ й ЕКК

Потім тАБ проти І/-7Ка людини (М1382-Н3МІ 6, МО707-13, 1А11 їі НАЇГЇ) порівнювали за їхньою здатністю активувати або блокувати сигнальні шляхи 5ТАТ5, РІЗК й ЕРКК, раніше асоційовані з передачею сигналів 1-7 (фіг.9 і 10). Як показано раніше (див., наприклад, фіг.7),

І/-7 індукує сильне фосфорилювання ЗТАТ5О5 на людських РВМС, і всі досліджені тАб є потужними інгібіторами цього фосфорилювання 5ТАТ5 (див. Фіг.7). На відміну від цього, як показано на фіг. 9 і 10, автори винаходу виявили, що хоча 1І/-7 індукує варіабельне фосфорилювання РІЗК і не викликає фосфорилювання ЕКК, антитіла попереднього рівня техніки (а саме МО707-13, 1А11 ї НАЇ) значно індукують фосфорилювання ЕКК і меншою мірою сигнал РІЗК навіть під час відсутності екзогенного ІІ -7, на відміну від антитіла за винаходом. Ці результати показують, що антитіла проти І/-7Ка людини попереднього рівня техніки мають часткові властивості агоніста і тому розглядаються як подвійні агоністичні/антагоністичні тАб у відношенні людського ІІ-7К. Навпроти, антитіло за винаходом, і зокрема М1382-п3МІ6, має властивість тільки антагоніста людського 1І--7В.

Автори винаходу оцінили, чи можуть антитіла з властивостями агоніста/антагоніста 60 доставляти ефективний агоністичний сигнал, здатній модифікувати Т-клітини людини.

Транскриптоми людських РВМС, інкубовані протягом 3,5 годин без екзогенного людського ЇЇ -7, З людським 1-7 і з І--7 й антитілом (МО707-13, 1А11 сайт-1 (1904 Мо 1 або Їдс1 Мо 2 відповідно) або М1382-пМІ 6 сайт-1/26 (9404)), проаналізували за допомогою РНК-секвенування наступного покоління (КМА-ЗЕО). В цілому 481 ген був диференційно експресований в людських РВМС, інкубованих з тАБ проти ІІ -7Ка людини, у порівнянні з контрольними умовами, у той час як в цілому 334 гена були диференційно експресовані тільки стимуляцією ІІ -7 людини у порівнянні з контрольними умовами.

Таблиця 6

Список генів, достовірно (РОК 5 95) та диференційно (кратність зміни » 1,5), експресованих після інкубації людських РВМС (п--7) з тАб проти ІІ 7Ка у порівнянні з нестимульованими клітинами. толк окр роко |сюркь тон сюрев нестимул. значення нестимул. значення нестимул. значення

АРРВР2 | 081 | 0001 | юю. БШУО | 0000 1 081 | 0000

СуРІВІ | -0,66 | 0029. | 7 -0.75 | 0003 | -069 | 0006

ЕХОСВ 17711069 | 0043 | 062 | 0033 | 063 | 0026

РЕМІВ | 099 | 0005 | 109 0000 | 087 | 0005 аМмАТ5 77 17710.99,7 | 0011 | 14 | 0001 | 725 | 0000 с-ОРС | 083 | 0015 | 064 | 0029 | 069 | 0015 анг! | 065 | 0015 | 081 | 0000 1 069 | 0002

НРКЗ3 | 067 | 0025 | 079 | 0002 | 069 | 0006 2 77777771 060 | 0031 | -86 | 00001076 | 0001

11. | МВА йЗМі6 | МО707л13іюс4Мї | ЛАТТюсі Ме

ВАЗБЗЕ5 | 063 | 0004 | 067 | 0000 | 060 / 0002

АРІ | 069 | 0019 | 062 | 0013 | 080 / 0002 ттсі3 77777 076 | 0034 | 090 | 0003 | 068 / 0022 вРОХ | 0890 | 0000 | 092 | 0000 | 085 / 0,000

АСТМА | 055 | 0005 | 060 | 0000 | 065 / 0000

АМ5ОА | 066 | 0028 | 093 | 0000 | 054 / 0031 л-еет | 043 | 0034 | 060 | 0000 | 077 / 0000 кУМмо 7 -060 | 0018 | 084 | 0000 | -056 / 0,007 вАр5ям2 | 061 | 0037 | 066 | 0008 | 053 / 0,033 вІсЗА2 | -079 | 0004 | 060 | 0012 | 017 | 0577 шт 7777717 -01 | 0028 | 066 | олої | -080 у 0039

1111. | . МзванЗМі6 | МО707л13іюсаМмї | ЛАТТюсі Ме сркіє | 064 | 018 | 096 | 0004 | 080 / бота свЕСТ | 070 | 0095 | 086 | 0013 | 099 / 0004

РОСАТ | -035 | 0234 | 059 | 0011 | 066 / 0004

НМАМРАО | 058 | 065 | 074 | 0028 | 090 / 0006

КАТЯ | 063 | 016 | 081 | 0013 | 066 / 042 мова | 069 | Бо | 05 | 0007 | 0890 0017

ВЕВ | 022 | 0633 | 063 | 0046 | 069 / 0022 мето | 056 | 0095 | 067 | 0016 | 066 / бота вмет49 | 060 | 0077 | 069 | 0016 | 069 / 002

11. | МВА йЗМі6 | МО707л13іюсаМмї | ЛАТТюсі Ме

ЗЕМР6 | 044 | 0204 | 069 | 0012 | 072 | 0007

ЗІСЗВАТО | 024 | 0595 | 076 | 0014 | 066 / 0030

ЗіСазА2 | 066 | 0068 | 063 | 0040 | 099 / 0001

ЗРАТСТ. | 096 | ово | 117 | 0044 | 1722 | 0031

Мк | 066 | 0052 | 078 | 0006 | 067 / 0016 зРАВ | 064 | 045 | 090 | 0012 | 072 | 0044 тяг | 042 | 0044 | 060 | 0001 | -035 / 0048

АСТВАР | -052 | 0040 | 066 | 0002 | 042 | 0051 схсіл6 | -055 | 0034 | 060 | 0006 | -038 / 0091

РаВХЯ. | 048 | 0034 | 060 | 0002 | -006 / 0,846

ТМЕАІРЄ | -0955 | 0029 | 090 | 0000 | 03 0,637

11111... | МВА йЗМі6 | МО707л13іюс4Ммї | ЛАТТюсі Ме таєВІ | -089 | 0007 | 027 | 0477 | 0036 | 0310

ОВЕЗО | -096 | 0046 | 035 | 0477 | -033 | 0497

АВСАТ | -043 | 0068 | 060 | 0002 | -039,. / 044

АМХА5 | -040 | 0089 | 066 | 0001 | -0,39. / 0,046

МЕР2О | 053 | олоз | 060 | 0028 | 057 / 0,035

МООРАБ | -025 | 0247 | 060 | 0000 | -036 / 0,037

ЗЕВРІМАТ | -046 | 0067 | 069 | 0001 | 047 0021

ТАТА | 034 | 0лв6 | 066 | 0001 | 049 002

1111. | МзванЗМі6 | МО707л13іюса4Мї | ЛАТТюсі Ме хУстаг | 027 | 0329 | 060 | 0005 | 057 / 0006

СЗоїтбв | 046 | ог | 060 | 0032 | 043 | 044 ссі7 711 048 | 022 | 080 | 0010 | 096 у 0955 ссв2 | 042 | 0263 | 076 | 0011 | 009 0848 ср | 035 | 084 | 066 | 0002 | 2 -036 / 0093 срсагЕР2 | 030 | 0490 | 066 | 0037 | 008 / 0,864

ЕХОВСЯ | -051 | зо | 069 | 0013 | -023 | 0491

11111117 мі3Ваамівє | МО707-13ю64Мо1ї | ЛАТ1іюс1Ме2

СІМАР1

ПА 109 ою | ме г оиови бРНІЗ7В | -0051 | 0376 | -090 | 0044 | -031 | 0566

НЕСТОЗ | 061 | 0107 | 066 | 0038 | 038 | 0267

МЕТ | -0396 | 0419 | 067 | 0049 | -006 | 0816

МЕМЕ | 090 | 0068 | 097 | 0018 | 51 | бе

11. | МзванЗМі6 | МО707л13іюсаМмї | ЛАТТюсі Ме

ВАВ2А | 045 | 098 | 060 | 0033 | 053 / 0,059

ВАСІ | 090 | 0065 | 13 | 0005 | 076 / 0063

ВАГУ 77777 | 039 | 0234 | 060 | 0023 | 044 | 007

ВАБАЗ | 038 | 0го | 066 | 0001 | 054 / оо2

ЗЕМАДА | -053 | 0057 | 069 | 0003 | -0004. | 0911

ТАТА | 023 | 0588 | 060 | 0043 | -003 | 0,954

ШВЕЗА | 006 | 0924 | 065 | 0042 | 054 / 0096 умма | 047 | 0086 | 060 | 0008 | 041 0,074

АВНОТА | -024 | 0527 | 000 | 7000 | -062 0018

АВНОАРЗІ | 022 | 0582 | 028 | 0,364 | 060 / 0026

А

11111117 мі3Ваамівє | МО707-13ю64Мо1ї | ЛАТ1юс1Ме?

ЕРБТИ | 009 | 0874 | 016 | 0728 | 075 | 00

АБІС | 005 | 0933 | 006 | 0881 | 076 | 0,007 свРА | 000 | 0997 | 008 | 0823 | 074 | 0,002 свР5 | 000 | 1000 | 006 | 0921 | 114 | 0,002

НАМСВ2 | 007 | 0858 | 019 | 0435 | 066 | 0001

НІМЕРІ | 036 | біз | 009 | 0783 | 065 | 0,005

. МзванЗМі6 | МО707л13юсаМї | ЛАТТюсі Ме пеггя | 05 | 0664 | 037 | 019 | 066 / 0003

ІвЕ8 777771 -009 | 0790 | 001 | 0982 | 5 щ 071 щу 0000

Ум | 006 | 880 | 023 | 0400 | 076 / 0002 ксмкє | 037 | 05оз | 060 | 0144 | 080 0040 комев | -005 | бе | 09 | 0527 | 066 / 0,006 еле! | 042 | 078 | -049 | 0052 | -069 | 0,005

ОМАРЗКІЗ | -009 | 0837 | -098 | 0125 | -064 | 0006 мватр! | 000 | 7000 | 05 | 001 | 076 1 0009

МРКВІВ | 008 | 881 | 021 | 0576 | 060 / 0043

МАдАТ | 02 | 0777 | 006 | 0871 | 095 / 0000

МАдАг | -009 | 841 | -025 | 0373 | 075 | 0002

РРРІНІБВ | 027 | 0302 | 032 | 043 | 060 / 0003

11111111 .| МІзВа3МІі6 | МО70713іюс4Ме1ї | ЛАТюсіМе2

РУСАНО | -0иб 1 0703 | 021 | 05БО | -0,60 | 0032 вРЗ2О | 0,02 | 0975 | 0006 | 0878 | -0,60. | 0024 вН2РІВ | 01 1 0749 | 0009 | 0742 | 094 | 0000

НЗвВавіЗ | 0,28 | 0207 | 0026 | ло | -066 | 0000 8ІСТА5 | 0033 | 0355 | 0е1 | 05ЗО | 060 | 0024

ТЕЗКІ | 0,06 | 0921 | ов | 0645 | 063 | 0038 тлмЕв5РУ | 002 | 0976 | 0009 | 0807 | 1.08 | 0000 2МЕЗа6 | 0,37 | 0544 | 053 | 0088 | -060 | 0,044

Аналіз діаграми Венна (фіг. 113) виявив 61 загальний диференційно експресований ген із трьома тАБр без якого-небудь особливого збагачення генної онтології за даними СоМіпег.

Незважаючи на 61 спільний ген, антитіло за винаходом індукує тільки 31 значну модифікацію гена без збагачення генної онтології. Навпроти, два антитіла попереднього рівня техніки індукують важливу транскрипційну модифікацію транскриптома РВМС людини з 245 диференційно експресованими генами, індукованими тАбБ /дс4 Мо 1 сайту-1ї, і 237 диференційно експресованими генами, індукованими тАбБ Ідс1 Мо 2 сайту-1. 78 диференційно експресованих генів були загальними для цих двох тАБ сайту-1, але ці гени не експресуються диференційно, коли РВМС стимульовані антитілом М1382-НМІ 6.

Аналіз основних компонентів (РСА) сигнатури 1І--7 показує, що диференційно експресовані гени, індуковані антитілами попереднього рівня техніки, сильно відрізняються від диференційно експресованих генів, індукованих 1-7. Збагачення генної онтології соМіпег показує, що обидва антитіла попереднього рівня техніки модифікують біологічні функції РВМС, такі як активація, проліферація, міграція, хемотаксис лейкоцитів, секреція цитокінів і запальні реакції, асоційовані зі шляхом МАРК/ЕКК.

Серед 334 генів, диференційно експресованих з ІІ 7 у порівнянні з контрольною умовою, 93 гена були диференційно експресовані з високою кратною зміною (» 2) та були розділені на З окремих кластера за допомогою аналізу з використанням теплової карти (фіг. 11А). Перший кластер генів зі зниженою регуляцією, оцінюваний за збагаченням онтології генів, в основному був залучений у диференціювання й апоптоз лейкоцитів, другий кластер генів з високим рівнем регуляції асоційований з адгезією, диференціюванням й активацією лейкоцитів, а третій кластер генів з підвищеним рівнем регуляції мав змішану онтологію генів. Цікаво, що всі досліджені тАб (як сайт-1, так і сайт-1/25) демонстрували подібні ефекти, запобігаючи модифікацію кластера-1 і кластера-2, але без впливу на кластер-3 (Фігура 118).

В цілому, транскрипційний аналіз підтвердив, що незважаючи на те, що тАр проти людського І -7Ка сайту-1/2-5 мали подібні антагоністичні властивості, два тАБб сайту-1, раніше описані в даній області техніки, індукують значні транскрипційні модифікації людських РВМС, сумісні з активацією Т-клітин і запальними реакціями, індукованими шляхом МАРК/ЕКК.

МАБ сайту-1/26 проти І--7Ка людини за винаходом, тобто М1382-пМІ 6, індукувало меншу транскрипційну модифікацію людських РВМС у порівнянні з двома тАр сайту-1, раніше описаними в рівні техніки.

Відсутність специфічних і "тільки антагоністичних" тАбБ проти І--7Ка для більше великих біологічних видів не дозволило перевірити цей ефект у приматів або людей. Автори винаходу виявили, що агоністичні/антагоністичні властивості тАБ проти 1/-7/Коа залежать від специфічного цільового епітопу, оскільки антитіла існуючого рівня техніки, що зв'язують домен взаємодії ІЇ-7 сайту-1, очевидно, мають як агоністичні, так й антагоністичні властивості, тоді як антитіло за винаходом, що зв'язує домен димеризації ІІ -7Ка/ус (сайт 26), проявляє сувору антагоністичну активність. Автори винаходу припускають, що антитіло за винаходом може порушувати димеризацію І -7Ка/ус, необхідну для інтерналізації та передачі сигналу рецептора. "Тільки антагоністичні" антитіла проти І--7 запобігали довгочасному запаленню шкіри у приматів, опосередковане Т-клітинами пам'яті, навіть після хронічної антигенної стимуляції, не індукуючи лімфопенії або поліклональних Т-клітинних функціональних або метаболічних порушень.

Було показано, що 1-7 індукує проліферативні й антиапоптотичні сигнали за допомогою передачі сигналів І--7К, головним чином, шляхом активації шляху ЗАК/5ТАТ. Також вважається, що передача сигналів І-7К включає шлях РІЗК/АКТ, але це спостерігалося в трансформованих імморталізованних клітинних лініях або первинних тимоцитах, і ці сигнали не були виявлені у периферичних наївних або людських Т-лімфоцитах пам'яті (Умаїапаре, У. Ехр. Меай., 1998). У

Зо декількох повідомленнях також було висловлене припущення, що передача сигналів ІЇ-7Е може підсилювати фосфорилювання ЕКК або в Т-лімфоцитах, або в субпопуляціях про-В-клітин (Оезпрапае Р. І. Іттипої, 2013; Ріетіпуд НЕ їі Раїде Су, Іттипйу, 2001). Роль цих шляхів у передачі сигналів ІЇ-7К в зрілих і людських Т-клітинах менше ясна. Використовуючи первинні свіжовиділені людські РВМС (в основному, що складаються з Т і В-лімфоцитів, моноцитів і МК- клітин) від здорових добровольців, стимульовані високою концентрацією рекомбінантного людського ІЇ/-7 (5000 пг/мл, у той час як концентрація в сироватці становить -5 пг/мл в лімфопенічних умовах, Ууопд НІ, Сапсег Ерідетіо! ВіотагКег5 Ргем, 2008), автори винаходу підтвердили, що 1-7 індукував відтворене фосфорилювання ЗТАТ5. Активація сигналу РІЗК була більше варіабельною, й автори винаходу не спостерігали фосфорилювання ЕКК. Хоча всі тАр проти І Ка, використані в цьому дослідженні, були сильними інгібіторами 1 -7- індукованого ро5ТАТ?5 і проявляли подібні властивості транскрипційних антагоністів, ми виявили, що два тАБ сайту-ї рівня техніки індукували агоністичні сигнали РІЗК/ЕКК і важливі транскрипційні модифікації, асоційовані з активацією Т-клітин і запальними реакціями, індукованими шляхом МАРК/ЕКК. Ці протилежні властивості подвійного агоніста/антагоніста деяких тА не є унікальними, оскільки інші мішені, такі як 1І--4, І -6А, 11-15, С028, СО38, С040 або НЕК2, продемонстрували подібні види активності після ендоцитозу/інтерналізації рецепторів.

Також дослідники недавно підтвердили гетеродимеризацію цього сайту 26 з Т5ІРК і продемонстрували її готовність до передачі сигналів рецептора, як уже передбачалося для ЇЇ - 7Ка і у-ланцюга (Мег5ігаєеїе К., Маїшге Соттипісайоп5, 2017). Цікаво, що передбачений сайт гетеродимеризації між І -7Ка/у-ланцюгом і І/-7Ка//5ІРК перекривається, що вказує на загальний механізм передачі сигналів, опосередкований гетеродимеризацією, між обома рецепторами.

Ми виявили, що аналіз інгібування роТАТ»5 іп міго не дозволяє передбачити ефективність анти-ІЇ-7 В-антитіл іп мімо. У попередньому повідомленні інше анти-ІЇ 7Ба-тАБ запобігало іп міго й ех мімо І--7-індукований реТАТ»5 у приматів, але не захищало від запалення головного мозку на експериментальній моделі мавп з аутоїмунним енцефалітом (ЕАЕ) (Оцппат .., 9.

Меигоїттипе.РПаптасої, 2016).

І/-7 вже добре описаний у плані підтримання пулу периферичних наївних Т-лімфоцитів і Т- бо лімфоцитів пам'яті в мишей. Однак у приматів важливість 1-7 у підтриманні периферичного Т-

клітинного гомеостазу може бути менше очевидною, і/або дублюючі механізми можуть пояснити цю різницю між біологічними видами.

Ці дані показали, що антагоністичні властивості тАб проти ІЇ-7Ка й ефективність іп мімо зв'язані не тільки із запобіганням зв'язування 1-7 й інгібування роТАТ»5. Ці дані показали, що антитіло за винаходом, також націлене на сайт гетеродимеризації рецептора (сайт 25), є "тільки антагоністичним" і забезпечує більше високу ефективність інгібуючих Т-клітинних відповідей іп мімо.

Націлювання на ІІ 7К антитіл з "тільки антагоністичними властивостями" потенційно здатне регулювати виживання та накопичення антиген-специфічних Т-клітин пам'яті та, отже, може сприяти запобіганню довгострокового рецидиву при аутоімунних і запальних захворюваннях.

Посилання

Аргапат, С. б Спо, у. Н. Іпїаттаїйюгу Воме! Оізеазе. Мем Епдіапа уоштпаї ої Медісіпе 361, 2066-2078 (2009).

Адатв5, 0. Н. а ЕКвбієєп, В. АБреїтапі Ппотіпуд ої тисовза! ТТ сеїв ап ехіга-іпіевііпа! тапіїевіайопз5 ої іпїаттацогу ромеї адізеазе. Маї. Нехм. Іттипої. 6, 244-251 (2006).

Адасе, МУ. МУ. Тіввие-Шпоріс еПесіог Т сеї: депегайоп апа їагдеїйпуд орропипіев. Маї. Нем.

Іттипої!. 6, 682-692 (2006).

АІридиегдцне АБ, Согіезао С5, Еохаї! ВВ, 5оагез Н5, Місіогіпо ВМ, 5о!йза АЕ. Ваївеє ої іпстєавзе іп сіксціайпу 1-7 апа о55 ої ІП -7Наїрна ехргезвіоп ашег іп НІМ-1 апа НІМ-2 іпесійопв5: їмо

Іутрпорепіс адізеазе5 м/п вітіїаг пурегіттипе асіїмайоп риї аівіпсі ошісотев. у) Іттипої. 2007

Маг 1;178(5):3252-9. РибМеа РМІО: 17312174.

Вайтоаан, 0. С. 5 запарогп, МУ. у). СтоНп'в дізеавзе. І апсеї 380, 1590-1605 (2012).

Вгоих, В., Неїпо5, М., Мепкеп, К., Ниттепв, ..-Г., Непзеп, К., Мап М/і|)теегїзси, В., апа

Зііпізвеп, Р. (2010). Наріоїуре 4 "РЕ Ше тиКіріеє з5сіего5із-аззосіаїейд іпепеийкКіп-7 гесеріог аІрна депе іпппепсез Ійе ПГедиепсу ої гесепі Іпутіс етідгапів. Сепев Іттип. 11, 326-333.

Споїніа, С., апа ГевзкК, А.М. (1987). Сапопіса! вігисійгез їТог Ше Пурегуагпаріє гедіоп5 ої іттиподіобиїїпв5. ). Мої. Вісі. 196, 901-917.

Споїтіа С, Ге5зК АМ, СпПегагаї Е, Тотіїпзоп ІМ, УУапег С, Магк5 УО, Пемеїуп МВ, УМіпієг С. зЗігисіига! герепоїге ої Те питап МН з5едтепів. / Мої Віої. 1992 Осі 55227(3):799-817.

Ко) Сіак ГА, Оеєтагеві 5У, ЕІдгедде У, Уагре МВ, Її М, бітоп К, мап Мії)теп НМУ. Іпйїмепсе ої сапопіса! вігисійге деїептіпіпд гезідцевз оп апібоду айіпйу апа віарійу. 9 5ігписі ВіоІ. 2014

Еер;185(2):223-7. дої: 10.1016/).)505.2013.08.009. РибМеа РМІЮ: 23994046

Ррапезе, 5. б Ріосспі, С. ОІсегаїїме соїйів. М. Епо!. У. Меа. 365, 1713-1725 (2011).

Оеписсі, С.б., МіїснеїІї, 9У.5., апа Зпітіги, М. (2009). Іпієедгіп їмпсіп іп Т-сеіЇ потіпд їо

Іутрпоїа апа попіутрноїа 5ітев: деніпод ІНеге апа віауіпду ІШеге. Стії. Веу. Іттипої. 29, 87-109.

Еєадап, В. а. єї а. Медоїїгитаь аз Іпдисіоп апа Маїпіеєпапсе Тнегару ог ОіІсегаїйме Соїйів.

Мем Епдіапа доишгпаї ої Медісіпе 369, 699-710 (2013).

Оезпрапає, Р., Самапади, М.М., Ге Зах, 5., Зіпдй, К., Меуапа, С.М., ап4а Согопгу, «.). (2013). 1/-7-апа І/-15-тедіатед ТСВА вепзійігайоп епарієх Т сеїЇ гезропб5е5 Ю зеїГ-апіїдепв. 9.

Ітітипої. Вайіт. Ма 1950 190, 1416-1423.

Оипнат, «., І ее, І.-Е., Огієї, М. мап, Гатанп, 9.О., Мі, І., 7Наї, МУ/., Ти, С.-Н., Пп, 9.С., Вашег, х.,

На! В.А. "ї, єї а. (2016). Віоскаде ої СО127 Ехепзв а Ріспототоив Сіїпіса! Емесі іп Магтозеї

Ехрептепаї! Ашоїттипе Епсерпаіотуєеійїів5. У. Меигоїттипе РНагптасої. 11, 73-83.

Ріетіпа, Н.Е., апі Раїде, С.У. (2001). Ргте-В Се! Весеріог Бідпаїту Меадіаїевз Зе!їесіїме

Везропзве іо 1-7 ай Ше Рго-В о Рге-В Сеї! Тгтапейоп міа ап ЕВК/МАР Кіпазе-Оерепаеєпі Райжмау.

Ітітипійу 15, 521-531.

Сопи, с, Вімега-Міемев, у., апа І еу, К. (2009). Воїє ої Беїа?7 іпіедгіпзв іп іпіезііпа! ІЇмтрпосуїе потіпад апа гегепійоп. Ситт. Мої. Меа. 9, 836-850.

Наав, 9., Когрогаї, М., Зспмаг2, А., Ваїїпі, В., апа У/Пдетапп, В. (2011). ТнНе іпепеикКіп-7 гесеріог а спаіп сопігіршевз 0 апегей потеозіавів ої гедшіаюгу Т сеї іп тийіріє зсіеговів. ЕЄиг. 5.

Іттипої. 41, 845-853.

Нацдероиго, Т., Роїгпег, М., апа Маппоме, В. (2009). Оерієїїпа Т-сеї! зирроршіайоп5 іп огдап тмапзріапіайоп. Тгапеврі. Іпі. ОМ. У. Єшг. ос. Огдап Тгапзріапі. 22, 509-518.

Не, В., апа Сена, В.5. (2010). Тнутіс віготаї! ІМтрпороїіеїіп. Апп. М. У. Асай. 5сі. 1183, 13-24.

Непгіднез, С.М., Віпо, у., Міррв, В.)., Сстанат, Са.)., апа Вагаїа, 9.Т. (2010). 11 -7 іпдисез гарій сіаїйгіп-теаіатей іпіегпаїї2айоп апа ЧАКЗ-дерепадепі дедгадайноп ої ІІ -7Ваїрна іп Т сеїв. Віоса 115, 3269-3277.

Кабаї, Е.А., Ми, Т.Т., Веїд-МіПетг, М., Регту, Н.М. апа Сонезтап, К.5. (1992) бБедиєпсев5 ої

Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї! Іптегевзі (ОІАМЕ рибіїєпіпо, 1992). (510) Кет, В., Ктаупом, Е., І ее, І..-Р., Вау, В. (2013). Ресеріог оссирапсу апа іпіегпаіі2айоп ої ап апіі-ІЇ -7 гесеріог апіїроду. Суїокіпе 63, 276-277.

Кет В, Гі МУ, Вопо С, ГІ еє І Е, Ктаупом Е. Весеріог оссирапсу апа ріосКіпу ої ЗТАТ»5 5ідпаїїпа

Бу ап апі--7 гесеріог ап апіїоду іп супотоЇдиє топКеуз. Суїотеїйу В Сіїп Суїт. 2016

Маг99(2):191-8.

Кног, В., Сагавєї, А. 4. Хамієг, В. У. Сепеїййс5 апа раШйодепевів ої іпПаттаїйогу ромуєї! адізвазе.

Маїшге 474, 307-317 (2011).

І ві, С., 7Ннапа, У., Мао, МУ., Каріап, М.Н., апа 27Нои, В. (2011). Тнутіс Зіотаї І утрпороїіеїїп

Іптепегез м/ййп Аіпглау ТоІегапсе Бу Зирргезвзіпд Ше Сепегаїййоп ої Апіїдеп-Зресіїїс Ведшаюгу Т

СеїІв. У. Іттипої!. 186, 2254-2261.

Маг2исснНеїйї, В., Ніхоп, У.А., 5рої5Кі, А., Спеп, Х., Її, МУ.О., НаїІ, М.Г., УМШеце-ВгоУл, ».,

Нигміа, А.А., І еопага, М/.у., апа Оигит, 5.К. (2008). ОемеІортепі ої гедшціайогу Т сеїЇІв гедцігев І - 7Ваїрна 5іїтиїайоп бу 1-7 ог Т5І Р. Віоса 112, 3283-3292.

МеЕїгоу СА, Юопт ЧА, Маієпй ЗТ. 5ігисіига! апа Біорпувзіса! війдіез ої Ше питап 1 -7/І- 7Ваїрна сотрієх. Зігисіште. 2009 дап 14;17(1):54-65. дої: 10.1016/).51г.2008.10.019.

МеЕїгоу СА, Ноїїапа Ру, 2нао Р, іт УМ, УМеїє |, Еівепвівіп Е, Ман 5Т. 5ігисішгаї геогдапігайоп ої Ше іпіепецйКіп-7 відпайпо сотріех. Ргос Май Асай сі ОО 5 А. 2012 Рер 14;109(7):2503-8. дої: 10.1073/рпаз.1116582109

Міснеї, І., Вепеїої, Ї., Рейге, 5., ММіепіємузКі, 5., І еїтеге, Е., Вгацаєацй, С., Вгоцага, 5., зошШои, У.-Р., апа ІГаріаца, 0.- А. (2008). Райепів м/йп геІарзіпд-тгетіціпуд тийіріє зсіеговзів Наме поптаї! Тгед Топсіп мпеп сеїї5 ехргезвіпа 1-7 гесеріог аірпа-снаїп аге ехсіцдей їот пе апаїувів.

У. Сііп. Іпмеві. 118, 3411-3419.

Ріапеї! М, Гогапо 9), Мога-Висп А, Мазатипі МС, дітепо М, Огааз І, ЕвівїІег М, Вісапй Е,

Рідие УМ, Рапез .), Заїіаз А. Тгапвсгіріюпа! апаїузів ої Ше іпівзіїпаї тисоза ої раїєпів м/йй цІсегаїїме соїйів іп тетівзвіоп гемеаї5 Іазіїіпу еріїпеїіа! сеїЇ айегайоп5. Си. 2013 УиІ;62(7):967-76. дої: 10.1136/д0п1-2012-303333

Касаре, М., Мапноме, В., БоцПои, 9.-Р., апа Вгоцага, 5. (2009). Іпіепецшкіп 7 гесеріог аІрна а а роїепіда! егарешійс їагдеї іп ігапзріапіайоп. Агоп. Іттипої. Тег. Ехр. (УМагв52.) 57, 253-261.

Веспє РА, боштвіїв М, Соптап ОМ, Сіїнога Т, іш Му, Тгаміз М, 7игамвКкі ЗМ, Уоппвіоп У, Гі

МУ, Зріїв Н, де УМ/аа! Маїегуї А, Кавієївіп ВА, Вагап ОР. Нитап Шутіс зіотаї! Іутрпороіеїїп

Зо ргеїегепійавну війтиіасез туе!оїа сеїІв. У Іттипої. 2001 ди! 1;167(1):336-43

Воап, РЕ., Веїї, В.О., ЄоКіазек, Т.А., Кіаіїта, М., Нап, Н., апа 7ієдієг, 5.Е. (2012). Тпе тийПіріє

Тасеїв ої Шутіс віготаї! ІутрПороїеїйп (Т5І Р) ашгіпд аПегдіс іпїаттаїйіоп апа реуопа. У. І еикос.

Віо!. 91, 877-886.

Восптап, У., Казпуар, М., Вобіпзоп, Сі1.МУ., Закатоїо, К., ботег-Ноагіднег, у., Мадпег, К.-О., апа Іеопага, М/.9У. (2010). Тнутіс вігота! Іутрпороїеїіп-теадіатед З5ТАТ5 рпозрпогуїайнйоп міа

Кіпазез ЧАК апа УАК2 геуєаї5 а Кеу аінйегепсе їот ІІ -7-іпдисеа відпаїїпд. Ргос. Маї!. Асай. 5сі. 0.

З. А. 107, 19455-19460. запарот, МУ. У. еї аІ. Медоїїгитаь аз Іпдисіїоп апа Маїіпієпапсе Тнегару ог СтоНп'в ОРізеазе.

Мем Епдіапа дошгпаї ої Медісіпе 369, 711-721 (2013). зЗпоснаї С, Та! М, Вапаараїї ОВ, Раїті С, Саптоге І, ї6є Ктоппіє С, Сагпо С, Са7апіда С,

Кшиогік АЕ, еїапийа М, 5спгарре М, Віопаї А, Ваз5о С, Вегсомісп О, МисКепіпаіег МИ, Іггавїї 5.

Саїіп-ої-Типсіоп о тиїайопе іп іпіепеиКіп-7 гесеріог-а (І 7) іп сНійаноой асшіе Іутрпобіавіїс

ІенКкетіав. У Ехр Мед. 2011 Мау 9:208(5):901-8. дої: 10.1084Лет.20110580. Еташт іп: ) Ехр Меа. 2011 Мау 9:208(5): ргеседіпод 901. ) Ехр Мей. 2011 дип 6;208(6):1333

Тауїог, В.С., 7арн, С., Ттоу, А.Е., Би, М., сзца, К.У., Сотеаицй, М.НВ., апа Апів, О. (2009). ТІ Р гедшіантез іпіевіїпа! іттипйу апа іпїтаттаїйоп іп тоибе тоае!5 ої Пеїтіпій іп'есіоп апа соїйів. у.

Ехр. Меа. 206, 655-667.

Мап Водедот, 0., 7попа, 9., Корр, М., Оийна, С., Кіт, М.-5., Віга, І., МУеїдей, О., Тупег, х.,

Рапавєу, А., Мода, А., єї аї. (2012). ОШегепсев іп 5ідпаїїпа Шгоцдни Ше В-сеї!| ІєиКетіа опсоргоївїп

САГЕ2 іп гезропзе Юю Т5І Р апа Шгоцай тиїапі ЧАК2. Віоса 120, 2853-2863.

Мегзігаєїє, К., Реєїтап, Е., Вгацп, Н., Горе, уУ.,, Мап Ротраву, 0., Бапзегсоег, А.,

Мапаєпрегапе, !., Раймуєї5, К., Тамегпієї, уУ., Іатрбгесні, В.М., еї аїЇ. (2017). Бігисішге апа апіадопівт ої Ше гесеріог сотрієх тедіаїєд Бу питап ТОЇ Р іп аПегау апа азіпта. Маї. Соттип. 8. муаівн ЗТ. Зінисіигаї іпвіднів іпіо Ше соттоп у-сНаїп Татіїу ої суїокКіпез5 апа гесеріого їот Ше іптепецкіп-7 раїпугау. Іттипої Неу. 2012 Мом:/250(1):303-16

МУазапаре, М., Оєпо, У., Марта, Т., ОКатоїй, 5., Науавзпї, Т., Маталакі, М., Імаос, У., Івпії, Н.,

Нари, 5., Оепіга, М., еї аї. (1998). ІпіепеиКіп 7 ігапвдепіс тісе демеіор сНгопіс соїйів мій дестеазей іпіепецшкКіп 7 ргоївіп асситшайноп іп Те соЇопіс тисоза. У. Ехр. Мед. 187, 389-402. 60 МУаїапаре, М., Мапа, М.-Н., Геє, Н.К., Ію, Т., ММапо, М.-Н., Сао, МУ., апа іш, М.-У. (2005а).

Наззаї!5 согризсіез іпвігисі депатйіс сеїїв о іпдисе СО4-С025--гтедшйіайогу Т сеї іп питап Шутив.

Маїишге 436, 1181-1185.

МУопа, Н.-І., Рієїнег, В.М., ЕРеаг5, Т.А8., Мептешеп, Н., і, 5., апа ВабКіп, 0.5. (2008).

Вергодисірі пу

Уіпо, 5., О'Соппог, В., Васі, 9У., Мепа, О., Рапо, С., Соцвіпв, О., 7Напо, с, Си, 5., Сао, 7.,

Зпатії, В., єї аї. (2008). Ехргеззіоп апа сеїшіаг ргомепапсе ої Ійутіс зтотаї! Іутрпороїіеїйп апа спетокіпез іп райепів м/ййп земеге азійта апа спгопіс обзіписіїме риїтопагу адізеазе. у). Іттипо).

Вайціт. ма 1950 181, 2790-2798. «пі, К., І, М., 2папо, Х., Сабо, 7., Ваї, 9., Ми, У., 2пои, 95., Ії, М., апа Ои, Г. (2014). а4р7

Іпїедгіп (ГРАМ-1) іє иргедшіаїтєа аї ашШегозсієгоїїс Іебзіоп5 апа і5 іпмоїмей іп аШегозсіего5і5 ргодгезвіоп. СеїЇ. Рпувзіо!. Віоспет. Іпі. у. Ехр. Сеї). Рпузіої. Віоспет. Рпагтасої. 33, 1876-1887 7попо, у., ЗНапта, ., Ва)ц, В., Раіарена, 5.М., Ргазайд, Т.5.К., Ниапа, Т.-0., Мода, А., Тупег,

УМ., мап Водедот, 0., М/еіпвіоск, О.М., еї аї. (2014). Т5І Р відпаїпу раїймжау тар: а ріаногт ог апаїувів ої ТОЇ Р-теадіаїеа зідпаїїпо. Оаїабазе . Віо!. Оаїаразез Сигайоп 2014, раий007.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105. О5Е ІММОМОТНЕВАРЕШОТІС5 «120» Антитіла та поліпептиди, спрямовані проти СО127 -1305 ВІ2201А -1505 ЕР 16306655.8 «1515» 2016-12-09 -160» 96 170» РаїепіНп версія 3.5

Зо -2105 1 «2115» 9 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність -4005 1

Рпе Тнг Геи 5ег Авр Туг Туг Меї Аа 1 5 -2105 2 «2115 17 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 2

ТА Пе 5ег Аа бег Спу І еи Ага ТАг Туг Туг Рго Авр Зег Маї ГГ ув 1 5 10 15 спіу (516)

«2105» З «-2115 13 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» З

Рго І єи 5ег Аа Ні Туг Сіу Ре Авп Туг Рпе Авр Туг 1 5 10 «-210» 4 «2115 11 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 4

Агу Тниг Зег Сім Авр Пе Туг Сп СПу І еи Аа 1 5 10

Зо «2105» 5 «-2115 7 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005 5 5ег АІа Азп ТНг І єи Нів Пе 1 5 «-2105» 6 «-2115» 9 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 6 ап ап Туг Туг Авр Туг Рго І еи Аа 1 5 «-2105 7 бо «2115 122

«212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 7

Сп Маї Сій І єи Маї Спи Зег Сіу Спу СПУ І єи Маї Гуз Рго Спіу СПУ 101 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аїа Маї 5ег Спу Ре ТНг ГГ еи Зег Азр Туг 20 25 0)

Туг Меї Аа Ттр Іе Аг Сіп Айїа Рго Спу Гуз Спу Геи Сім Тер Маї 35 40 45 зег ТП Пе Зег Аіа 5ег Стпу Геи Агу Тиг Туг Туг Рго Авр 5ег Маї 50 55 бо

Гуз Спіу Ага Рпе Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 65 70 75 80

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 0) 85 90 95

Аа Аг Рго Геи 5ег Аїа Ні Туг Сіу Ріє Авп Туг Рне Азр Туг Тр 100 105 110

З5

Спу Сп Спу ТАг Гей Маї Тнг Ма! бег 5ег 115 120 «210» 8 «2115 107 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «-4005» 8

Сі Пе Маї Меї Тиг Сіп 5ег Рго Ага ТНг Геи Зег Ма! Зег Рго Спу 1 5 10 15

Сім Аг Аа ТНг І єи 5ег Сувз Агу Тпг Зег СП Авр Пе Туг СіІп СПУ 20 25 0)

Ї еи Ага Тр Туг СіІп Сп Гув Рго Стпу Сп Айа Рго Аго І єи Геи Іе бо 35 40 45

Туг Зег Аа Авзп ТНг Геи Нів Пе Спу Пе Рго Аа Агу РНе 5ег Спу 50 55 60

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Спи Рне ТНг І єи Тит Пе бег 5ег І єи Сіп Бег 65 70 75 80

Сім Авр РНе Аїа Маї Туг Туг Суз Суп Сп Туг Туг Авр Туг Рго І єи 85 90 95

Аа Рпе Сіу Спу Спу Тнг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «210» 9 «2115 107 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» 9

Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу з30 1 5 10 15

Азр Аг Маї Тпг Пе Тнг Суз Агу Тиг Зег СП Авр Пе Туг Сіп Спу 20 25 зо

Ї еи Ага Тр Туг Сп Сп Гуз Рго Сту Гуз Аїа Рго Гуз І єи Г еи Маї 35 40 45

Туг Зег Аа Азп ТНг Геи Нів Пе Спу Маї Рго 5ег Агу РНе 5ег Спу 50 55 60

Зег Сіу Зег Спіу Тиг Азр Тут ТНг Гей ТНг Пе 5ег 5ег І еи Сп Рго 65 70 75 80

Сім А5р РНе Аа Тниг Туг Рне Суз Сіп Сп Туг Туг Авр Туг Рго І ви 85 90 95

Аа Ре Спіу Спу Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 10 «2115 107 «212» БІЛОК 60 -213» Штвтучна послідовність

223» Синтетична послідовність «4005» 10

Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15

Азр Аг Маї Тпг Пе Тнг Суз Агу Тиг Зег СП Авр Пе Туг Сіп Спу 20 25 0)

Ї еи Ага Тр Туг СіІп Сп Гуз Рго СтПу Гуз Аїйа Рго Гуз І єи Геи І єи 35 40 45

Туг Зег Аа Азп ТНг Геи Нів Пе Спу Маї Рго 5ег Агу РНе 5ег Спу 50 55 60

Зег Сіу Зег Спіу Тиг Азр Тут ТНг Гей ТНг Пе 5ег 5ег І еи Сп Рго 65 70 75 80

Сім А5р РНе Аа Тниг Туг Рне Суз Сіп Сп Туг Туг Авр Туг Рго І ви 85 90 95

Зо

Аа Ре Спіу Спу Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 11 «2115 107 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 11

Авр Пе Сіп Меї Тнг Сп Зег Рго Зег Зег І єи 5ег Аа Зег Ма! Спу 1 5 10 15

Азр Аг Маї Тпг Пе Тнг Суз Агу Тиг Зег СП Авр Пе Туг Сіп Спу 20 25 Зо

Ї еи Ага Тр Туг СіІп Сп Гуз Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз І єи І еи Маї 35 40 45

Туг Зег Аа Азп ТНг Геи Нів Пе Спу Маї Рго 5ег Агу РНе 5ег Спу 50 55 60 60

Зег Сіу Зег Спу Тиг Азр Тут ТНг Гей ТНг Пе 5ег Зег І еи Сп Рго 65 70 75 80 ам А5р Ре Аа Тиг Туг Туг Сув Сп Сіп Туг Туг Азр Туг Рго І єи 85 90 95

Аа Ре Спіу Спу Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105 12 «2115 107 15. «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «-4005 12

Азр Пе Сип Меї Тиг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа Зег Ма! СПУ 1 5 10 15

Азр Аг Маї Тпг Пе Тнг Суз Агу Тиг Зег СП Авр Пе Туг Сіп Спу 20 25 Зо

Зо

Ї еи Ага Тр Туг СіІп Сп Гуз Рго Су Гуз Аа Рго Гуз Г еи ГГ еи І єи 35 ТугЗег Аіа Азп ТНг ГГ еи Ні Пе Спу Маї Рго 5ег Агу РНе 5ег Спу 60

Зег Сіу Зег Спіу Тиг Азр Тут ТНг І єи Тит Пе бег Зег І ви Сп Рго 40 (65 70 75 80 сій Авр РНе Аа Тнг Туг Туг Сув Сип Сп Туг Туг Авр Туг Рго Гей 85 90 95 45

Аа Ре Спіу Спу Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 50 «2105 13 «2115» 366 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність 55 «220» 223» Синтетична послідовність -4005 13 бо саддідсадс ддісдааїс адддаадддда сіддісааас ссдддоадсіс асідсдісід (610)

їсащідсса ісісаддсії сасасідадс дасіасіаїа ддсаддаї ссдасадаса 120 ссададсаадо дасіддадчю адідістасі ашсідсса аідодссідад дассіасіаї 180 ссідасадід ісаадддааяд айсасааїс Ісасдддаїа асосіааааа Псссідіас 240 сідсадаїда асадссідад адссдаадас ассдсідіді астайдсосісодссосасія /-зо00

Іссдсасасі аїдасіїсаа Пасшода! їайддддас аддаїасссі ддідасадіє 360 їссадс 366 «2105» 14 «2115 321 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 14 дадаїсдіса Юасодсадіс ссссдсаасо сісіссдісї ссссдддоада асдсдсдасс (610) сідісоюса ддассіссда ддасаїсіас саадодссісо саїддіаїса дсадаадссс 120 дассаддссс сдсодсідії даїсіасісс дсдаасассі Юдсасаїсда саїсссддса 180

Зо соснеїс9д9 даїсадддад сддсассдад йсасссіда ссаїсісдіс дсіссададс 240 даддасійсд ссдідіасіа сідссадсад їіасіасдасі асссссідос дпсододоас 300 дддассаадд ддадаїсаа 9 321 «-2105 15 «2115 321 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 15 дасайсада Юасссадіс ссссісдадс січадіясда дчдідадсда ссдсоащдаса (610) аїсассідсс ддасдіссда ддаїаїсіас садддссісу ссіддіасса дсадаадссд 120 ддсааддссс ссааасідсі ддісіасадс дсдаасассс Іссасаїсдо сдіссссадс 180 сдоансадсо асіссоддсіс дддаасддас їасасссіса сдаїсісдіс ссідсадсся 240 даадасійсд ссассіасії сідссадсад їайасдасі асссдсіддс діпсоддіддс 300 додсассааду ісдадаїсаа 39 321 «2105 16 бо «2115 321

«212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 16 дасайсада Юасссадіс ссссісдадс січадіясда дчдідадсда ссдсоащдаса (610) аїсассідсс ддасдіссда ддаїаїсіас садддссісу ссіддіасса дсадаадссд 120 ддсааддссс ссааасідсі дсісїасадс дсдаасассс Іссасаїсду сдіссссадс 180 сдоансадсо асіссоддсіс дддаасддас їасасссіса сдаїсісдіс ссідсадсся 240 даадасійсд ссассіасії сідссадсад їайасдасі асссдсіддс діпсоддіддс 300 додсассааду ісдадаїсаа 39 321 «2105» 17 «2115 321 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 17

Зо дасайсада Юасссадіс ссссісдадс січадіясда дчдідадсда ссдсоащдаса (610) аїсассідсс ддасдіссда ддаїаїсіас садддссісу ссіддіасса дсадаадссд 120 ддсааддссс ссааасідсі ддісіасадс дсдаасассс Іссасаїсдо сдіссссадс 180 сдоансадсо асіссоддсіс дддаасддас їасасссіса сдаїсісдіс ссідсадсся 240 даадасійсд ссассіасіа сідссадсад їайасдасі асссосідоас дісоддідас 300 ддсассаада ісдадаїсаа а 321 «2105» 18 «2115 321 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність -4005» 18 дасайсада Юасссадіс ссссісдадс січадіясда дчдідадсда ссдсоащдаса (610) аїсассідсс ддасдіссда ддаїаїсіас садддссісу ссіддіасса дсадаадссд 120 ддсааддссс ссааасідсі дсісїасадс дсдаасассс Іссасаїсду сдіссссадс 180 сдоансадсо асіссоддсіс дддаасддас їасасссіса сдаїсісдіс ссідсадсся 240 бо даадасійсд ссассіасіа сідссадсад їайасдасі асссосідоас дісоддідас 300 додсассааду ісдадаїсаа 39 321 «2105» 19 «2115 31 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 19

Гуз Сувз І еи Азп Рнє Ага Гуз І ви Сіп Сіи Пе Тук Рне Пе Спи ТНг 1 5 10 15

Гуз Гуз Рнє І єи І єи Пе Сту І уз бег Азп Пе Суз Маї І уз Маї 20 25 Зо «2105» 20 «2115 31 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність

Зо «4005» 20

Туг см Пе Гуз Маї Агу Зег Пе Рго Авр Ні Туг РНе Гуз Спу Рпе 1 5 10 15

Тр Зег Сім Тгр 5ег Рго 5ег Туг Туг Рпє Агу ТНг Рго Спи Пе 20 25 Зо «2105 21 «211» 459 «212» БІЛОК «213» Ното зарієп5 «4005 21

Меї Тит Пе Геи Спу ТНг Тнг Ріе Стпу Меї Маї Ре 5ег І єи Гей Сп 1 5 10 15 маї Маї Зег Сіу Сім Зег Сіу Туг Аіа Сп Азп Сіу А5р Гей Си Авр 20 25 Зо

Аа Спи Геи Авр Авр Туг Зег Рпе Зег Суз Туг Зег Сп І еи СПи Маї 35 40 45 60 Авп сапу бег Сп Нів 5ег І еи ТНг Суз Аа РНе Си Авр Рго Азвр Маї

50 55 60

Авп ТНиг ТНг Авп ГГ еи Спи Рне Сіи Пе Сувз Сіпу Аа І еи Маї Спи Маї 65 70 75 80

Гуз Суз І єи Авп Рнє Ага ГГ уз І єи Сп СП Пе Туг Ре Пе Спи ТАг 85 90 95

Гуз Гуз Ре Геи І єи Пе Спу Гуз 5ег Авп Пе Суз Маї Гуз Ма! Су 100 105 110 сій Гуз зег Гей ТНг Суз Гуз Гуз Пе Авр Геи Тит Тнг Пе Маї Гуз 115 120 125

Рго Сіи Аїа Рго РНе Авр ГІ єи Зег Ма! Пе Туг Агу Сіи Спу Аа Ап 130 135 140

Ар Ре Маї Маї Тнг Рне Авзп Тнг 5ег Ніз І еи Сп ГГ уз І ув Туг Маї (145 150 155 160

Гуз Ма! Геи Меї Ні Авр Маї Ага Туг Ага Сіп См Гув Ав5р Сім Авп 165 170 175

Зо

Гуз Тр ТАг Ні Маї Авп І єи Зег Зег Тпг Гуз Геи ТНг І ви Геи Сп 180 185 190

З5

Ага Гуз І ви Сп Рго Аа Аїа Меї Туг Сіи Пе Гуз Маї Ага 5ег Пе 195 200 205

Рго Авр Ні Туг РНе Гуз Спу Рпеє Ттр 5ег Спи Тгр Зег Рго Зег Туг 210 215 220

Туг Рне Аго Тнг Рго Сім Пе Авп Авп 5Зег Зег Сіу Спи Меї Авр Рго 225 230 235 240

Пе Геи Гей Тнг Пе 5ег Пе Геи Зег Рпє Рне 5ег Маї Аа Г еи І єи 245 250 255 ма! Іе І еи Аа Суз Ма! І еи Тр Гуз Гуз Ага Іе Гуз Рго Іе Маї 260 265 270

Тер Рго 5ег І єи Рго Авр Ніз І уз Гуз ТНг І еи Си Нів І єи Суз І уз 275 280 285 (510) Гуз Рго Аго Гуз Авп ГГ еи Авзп Маї Зег Рне Авп Рго Спи 5ег РНє І єи

290 295 00

Азр Суз ап Пе Ні Аг Маї Ар Ар Іе Сп Аїа Агу Ар Си Маї 305 з10 315 з20

Сі Сіу Ре Геи Сп Авр ТНг Ре Рго Сіп Сіп Гей Спи Сі Зег Си 325 330 335

Гуз Сп Аго Геи Спу Спу Авр Маї Сіп 5ег Рго Авп Сув Рго Зег Си 340 345 350

Азр Маї Ма! Пе Тнк Рго Сім Зег РНе Сіпу Агу Авр Зег 5ег Геи ТНг 355 360 365

Сув І ви Аіа Су Авп Маї Зег Аа Суз Авр Аїа Рго Іе І єи Зег Бег 370 375 380

Зег Агу 5ег І еи Азр Суз Агу Сім бег СПУ Гуз Азп Сіу Рго Ні Маї 385 390 395 400

Тугаїп Авр Гей ГГ еи ГГ еи Зег І ви Спу ТАг Тит Авп Зег ТНг Геи Рго 405 до 415

Зо

Рго Рго РНе 5ег І ви Сп Зег СпПу Пе Гей Тпг ГГ еи Авп Рго Маї Аа 420 425 430

З5

Сіп Спу Сп Рго Пе І єи Тиг Зег Геи Спу Зег Авп Сп Спи См Аа 435 440 445

ТугМаї Тнг Меї 5ег Зег Ре Туг Сп Авп Сп 450 455 «2105 22 «2115 219 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» 22 сій Зег СпПу Туг АІа Сп Авп сту Азвр І єи Сім Авр Аа Сім І еи Авр 1 5 10 15

Ар Туг Зег Рне 5ег Суз Туг Зег Сп Ї єи Спи Ма! Азп Спу бег Сп 20 25 0) 60

Ні Зег І єи Тниг Суз Аа РНе Си Авр Рго Авр Маї Авзп ТНг Тиг Авп 35 40 45

Ї ви Спи РНе Сііи Пе Суз Спу Аа ГІ єи Маї Сім Ма! Гуз Сув І еи Авп 50 55 60

Рпє Аг Гуз Г еи Сп См Пе Туг Рпе Пе Сти Тк Гуз Гуз Рне І єи 65 70 75 80

Ї еи Пе Слу Гу5 Зег Азп Іе Суз Маї Гуз Маї Спу Сім Гуз Зег І ви 85 90 95

Тпиг Суз Гуз Гуз Пе Ар І еи Тнг ТНг Пе Маї Гуз Рго Спи Аа Рго 100 105 110

Рпе Авр Геи 5ег Ма! Пе Туг Агу Спи С1пу Аа Азп Авр РНе Маї Маї 115 120 125

ТАг Рне Авп Тнг 5ег Нів І еи Сп Гуз І уз Туг Ма! Гуз Маї І єи Меї 130 135 140

Коо) Ні5 Азр Маї Аа Туг Агу Сп Спи Гуз Авр Сім Авп Гуз Тр ТАг Нів 145 150 155 160 маї Авп І єи бег 5ег ТНг Гуз І єи ТНг І єи І ви Сп Агу Гуз І еи Сп 165 170 175

Рго Аїа Аа Меї Туг Сім Пе Гуз Маї Агу Зег Пе Рго Авр Ні Туг 180 185 190

Рпе Гуз Спу Ріє Ттр 5ег Сім Тр Зег Рго Зег Туг Туг РНе Аг Тиг 195 200 205

Рго Сіш Пе Авп Авп 5ег бег Спу Си Меї Ар 210 215 «210» 23 «2115 7 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 23 (510) Рпеє Пе Спи Тнг Гу Гув Рпе

1 5 «2105» 24 «-2115 6 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» 24

Азр Гей Зег Ма! Пе Туг 1 5 «2105» 25 «2115» 4 20. «2125» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність 25 «4005 25

Рпе Гуз Спіу Рпе 4

Зо «2105» 26 «2115 327 «212» БІЛОК 35 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність 40 «4005» 26

Аа 5ег Тпг Гуз СПУ Рго 5ег Ма! Рне Рго Г єи Аа Рго Суз 5ег Ага 1 5 10 15 45 зег Тиг Зег Си Зег ТАг Аа Аа І єи Стпу Суз І еи Маї Гуз Авр Туг

Зо 50 Рпє Рго Си Рго Маї Тнг Маї Зег Тгтр Авзп Зег Спу Аа Геи Тнг Зег

Стпу Маї Ні5 Тнг РНе Рго Аїа Маї І єи Сп бег бег СПУ І єи Туг Зег 50 55 60

Ї еи Зег Зег Маї Ма! Тниг Маї Рго Зег Зег Зег І еи Спу ТНг Гуз ТНг 65 70 75 80 (516) бо

Туг Тиг Суз Авп Маї Авр Ніз Гуз Рго 5ег Азп ТНг Гуз Маї Авр ГГ ув 85 90 95

Аго Маї Сім Зег Гуз Туг Спу Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго 100 105 110

Сім Рне І єи Спу Сіу Рго 5ег Маї РНе І єи Рне Рго Рго Гуз Рго ГІ уз 115 120 125

Азр ТНг І єи Меї Пе 5Зег Агу Тнг Рго Сіши Ма! Тнг Суз Маї Ма! Маї 130 135 140

Ар Маї бЗег Сп Си Авр Рго Спи Маї Сіп Рне Азп Тр Туг Ма! Азр 145 150 155 160

Сіу Ма! Спи Маї Ні Авп Аїа Гуз ТНг Гуз Рго Агу Спи Сім СІп Рпе 165 170 175

Авп 5ег ТНиг Туг Агу Маї Маї 5ег Маї І єи Тнг Ма! І еи Ні Сіп Ар 180 185 190

Те є Авзп су Гуз Спи Туг Гуз Суз І уз Ма! бег Авп І уз СпПу І ей 195 200 205

Рго Зег Зег Пе Спи Гуз ТАг Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Сп Рго Агд 210 215 220

Сім Рго Сіп Маї Тут Тиг Геи Рго Рго Зег Сип Спи Спи Меї Тнг Гув 225 230 235 240

Авп Сп Маї 5ег І єи Тнг Суз І еи Маї! Гуз Сіу Рне Туг Рго 5ег Ар 245 250 255

Пе Аа Маї Спи Тгтр Спи Зег Азп Стпу Сп Рго Спи Авп Авп Туг ГГ ув 260 265 270

ТА ТАг Ріо Рго Маї І єи Авр 5ег Авр Су Зег Рпе Рне І єи Туг Зег 275 280 285

Аго ГІ еи Тнг Маї Азр Гуз 5ег Ага Ттр Сп Спи СПу Авп Маї Рпє 5ег 290 295 00

Сув Зег Ма! Меї Ніз Сі Аїа ГГ еи Нів Авп Ні Туг Тиг Сіп Гув 5ег 305 310 315 з20 (516)

Ї еи Зег І єи Зег Рго Спу Гув «2105» 27 «2115 107 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 27

Агу Тнг Маї Аа Аа Рго 5ег Ма! Рне Пе Рне Рго Рго 5ег Авр Си 1 5 10 15

Сіп Гей Гуз бег Спу Тнг Айва 5ег Маї Ма! Суз Гей Гей Авп Азп Рпе 20 25 Зо

Туг Рго Ага Сти Аїа Гуз Маї Сіп Тгр Гуз Маї Авр Авп Аа ГГ еи Сп

Зег Сіу Азп бег Сп Спи бег Ма! Тиг Спи Сп Авр 5ег І уз Авр 5ег 60

Зо

ТАг Туг ЗегІ еи бег бег ТНг І єи ТНг І єи 5ег Гуз Аіа Авр Туг См 65 70 75 80 35

Гуз Ні Гуз Маї Туг Аіа Суз Спи Маї ТНиг Ні Сіп Сіу Геи 5ег Зег 85 90 95 40 Рго Ма! Тиг Гуз бег Рпе Авп Агу Сіу Спи Суб 100 105 «2105» 28 45 «2115» 106 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «220» 50 «223» Синтетична послідовність «4005» 28

ТНг Маї Ага Аа Рго 5ег Маї Рне Пе Рне Рго Рго 5ег Авр Сім Сп 55 1 5 10 15

Ї еи Гуз Зег Спу Тнг Аа 5ег Маї Маї Суз ГІ еи І єи Авп Авп Ре Туг 20 25 Зо (516)

Рго Аго Сім Аїа Гуз Маї Сіп Ттр Гуз Маї Авр Авзп Аа І єи Сп Бег 35 40 45

Сіу Авзп бег Сп Сім Зег Ма! Тиг Спи Спп Авр 5ег Гуз Авр 5ег ТНг 50 55 бо

Тугзегі єи Зег Зег Ти еи ТАг І єи Зег Гуз Аа Азвр Туг Спи Гув 65 70 75 80

Ні Гуз Маї Туг Аіа Суз Спи Маї Тиг Ні Сип Спу Геи Зег 5ег Рго 85 90 95 маї Тниг Гуз Зег Рне Азп Ага Сіу Спи Сув 100 105 «2105» 29 «2115» 984 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність

Зо «4005 29 дсіадсасса адддсссаїс ддісіїсссс сіддсосссі дсіссаддад сассіссдад (610) адсасадссд сссіддасід ссіддісаад дасіаснсос ссдаассодді дасддідісад 120

З5 тддааасісад дсдсссідас садсддсдід сасасснсос сдосідіссіасадіссіса 180 ддасісіасі сссісадсад соїддщдасс адїдсссісса дсадсід99 сасдаадасс 240 їТасассюса асаїадаїса саадсссадс аасассаадд ддасаадададндадієс /З00 ааагацдцдіс ссссаїдссс ассаїдссса дсассідаді іссідда99д99 ассаїсадіє 360 пссіднНеос ссссаааасс сааддасасі сісаїдаїйсі сссддасссс щдаддісасуд 420 тдсащаїщ9а ддасаїщдад ссаддаадас сссдаддісс аднсаасід діасдіддаї 480 ддсдддадао юсаїаадс саадасааад ссдсдддадо аодсадіїсаа садсасдуіас 540 сущідаїса дсдіссісас сдіссідсас саддасіддс даасддсаа ддадіасаад (610)0) тюдвсааддісї ссаасааада ссісссдісс Іссаїсдада ааассаїсіссааадссааа 660 ддасадсссс дададссаса ддідіасасс сідсссссаї сссаддадда дчадассаад 720 аассаддіса дссюдассід ссіддісааа досіїсіасс ссадсдасаї сдссодіддад 780 щадададса аддддсадсс ддадаасаас іасаадасса сдсосісссдідсіддасісс 840 дасддсіссі Ісцссіста садсаддсіа ассдіддаса ададсада дсаддачада 900 бо аащісйнсі саїдсіссоді даїдсадад осісіюсаса ассасіасас асадаададс 960 сісісссіді сіссдддіаа аа 984 «2105» 30 «2115 325 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «-4005 30 сдсасддіда ссосдссдіс ддщїсаїа Нсссдссда дсдасдадса сндаацдісс бо дасассдссі ссдісдщіа ссідсісаас аасісіасс сссдсдаддс даадаідсад 120 ддаадоща асаасдсссі ссадісдддс аасадісада ададсдісас ддадсаддас 180 іссааддасі сдасаїасіс ссідіссісуд асдсідассі адсааадс сдайасдад 240 аадсасаада ідіасдсдід сдаддідасс саїсадддсс ідіссісссс ддідассаая 300

Іссісаасс дадосдааю сюаї 325 «2105 31 «2115 322

Зо «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 31 асддудссд сдссдісдді дісаїанс ссдссдадсу асдадсадії даадіссддс (610) ассдссіссу іІсдщідссі дсісаасаас Цсіассссс дсдаддсдаа дадсадща 120 ааддюдаса асдсссісса дісдддсаас адісаддада дсдісасодда дсаддасісс 180 ааддасісда саїасісссі діссісдаса сдассіїда дсааадссда Пасдадаая 240 сасаадаці асдсдідсда додщдасссаї саддассіді ссіссссдаї дассаадієс 300

Нсаассоддо дсдаадсію аї 322 «2105 32 «2115» 9 «2125» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «-4005 32 (510) Рпе Авр Геи 5ег Ма! Пе Туг Агу Си

1 5 «2105 З3 «-2115 10 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність -4005 33

Азп Ар Ре Маї Маї Тиг Рне Авп ТАг Зег 1 5 10 «-2105» 34 «-2115» 8 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 34

Тиг Гуз Геи ТНг І еи Геи Сп Аг9 1 5

Зо «2105 35 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «-4005 35

Тиг Ге І ви Сп Аго Гуз ГГ еи Сп Рго Аа Аїіа Меї Туг Спи Пе 1 5 10 15 «2105 36 «-2115 10 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність -4005 36

Ї еи Маї Спи Маї Гуз Суз І ви Азп Ре Ага 1 5 10 бо «-2105 37

«-2115» 14 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 37

Пе Суз Слу Ага Г єи Маї Сіи Маї Гуз Сув Геи Азп Рпе Ага 1 5 10 «2105» 38 «2115 11 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність -4005» 38

Ї еи Маї Спи Маї Гуз Суз І єи Азп РНе Ага ГГ ув 1 5 10 «2105» 39 «-2115 7

Зо «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «-4005 39

Гуз Гуз РНе ГІ еи ГГ еи Пе Спу 1 5 «-210» 40 «2115 11 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 40

Гуз Гуз РНе Г еи І еи Пе Спу Гуз Зег Азп Пе 1 5 10 «2105» 41 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність

Гс10)

«020» 223» Синтетична послідовність «400» 41

РНе Пе Сім ТНг ГГ ув Гуз Рне І єи І єи Пе Спу 1 5 10 «-2105» 42 «-2115 5 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 42

Суві еи Авп Ріє Ага 1 5 «-2105» 43 «-2115 7 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 43

РНе Пе Сім ТНг І ув Гуз Рне 1 5 «-210» 44 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 44 сій Зег Спу Туг Аа Сіп Авп Спу Авр І еи Сім Авр Аїа Сім І еи 1 5 10 15 «-210» 45 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність бо «4005» 45

Аа Сп Авп Су Авр І єи Спи Авр Аа Спи І ей Ар Авр Туг 5ег 1 5 10 15 «-210» 46 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 46

Азр І єи Спи Ар Аа Сім І єи Авр Ар Туг Зег Рпе бЗег Суз Туг 1 5 10 15 «-2105» 47 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 47

Аа Сі Ї єи Авр Авр Туг б5ег Рпе 5ег Суз Туг Зег Сп І еи Спи 1 5 10 15 «-210» 48 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 48

Азр Туг Зег Рпе Зег Суз Туг Зег Сп І єи СП Маї Авп Спу Зег 1 5 10 15 «-210» 49 «-2115 15

БО «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 49

Зег Суз Туг Зег Сп Ї еи Спи Ма! Азп Стпу бег Сп Ніб 5ег і єи 1 5 10 15

Гс10)

«2105» 50 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 50

Сіп Геи Спи Маї Авп сту Зег Сп Нів Зег І еи ТАиг Суз Аа Рпе 1 5 10 15 «-2105 51 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 51

Авп Сіпу бег Сп Ні 5ег І єи Тнг Суз Аіа Рне Спи Авр Рго Азр 1 5 10 15 «2105» 52 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005» 52

Ні Зег І єи Тиг Суз Аа Ре Сіи Авр Рго Азвр Маї Авп ТНг ТНг 1 5 10 15 «210» 53 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005» 53

Суз Аа Рпє Сіи Авр Рго Азвр Маї Авп Тниг Тнг Авп І еи Си Ре 1 5 10 15 «-2105» 54 «-2115 15 60 «212» БІЛОК

213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005» 54

Азр Рго Азвр Маї Авп ТНг Тиг Авп ГГ еи Спи Рпе Сіи Пе Сув Спу 1 5 10 15 «2105 55 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «-4005 55

Авп ТНиг ТНг Авп ГГ еи Спи Рне Спи Пе Сувз Сіу Аа І ей Маї СПи 1 5 10 15 «2105 56 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «-4005 56

Ї еи Си Рне Сі Пе Суз Сіу Аа І єм Маї Спи Ма! І уз Суз І еи 1 5 10 15 «-2105 57 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 57

Пе Суз Су Аа І єи Маї Спи Маї Гуз Сув Геи Азп РНе Ага Гуз 1 5 10 15 «2105 58 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штгтучна послідовність «020» 60 «223» Синтетична послідовність

«400» 58

Ї еи Ма! Спи Маї Гуз Суз І вєи Азп РНе Ага Гуз ГГ еи Сп Спи Пе 1 5 10 15 «210» 59 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 59

Гуз Суз І еи Авп Ріє Ага Гуз І єи Сп Спи Пе Туг Рне Пе Спи 1 5 10 15 «210» 60 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність

Ко) «400» 60

Рпє Аг Гуз І еи Сп Сім Пе Туг Рпе Пе Сіи ТАг Гуз Гуз Рпе 1 5 10 15 «-2105 61 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 61

Сіп Си Пе Туг Рпе Пе Сім ТНиг Гуз Гув Ре Г еи ГГ еи Пе Спу 1 5 10 15

БО «210» 62 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 62 (510) Рпеє Пе Спи Тнг Гуз Гуз РНе І еи Гей Пе Спу Гу5 Зег Авп Пе

1 5 10 15 «2105 63 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність -4005 63

Гуз Гуз Рнє І єи І єи Пе Стпу І ув бег Азп Пе Суз Маї І уз Маї 1 5 10 15 «-2105» 64 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 64

Ї еи Пе Стпу Гуз бег Авп Пе Суз Маї Гуз Ма! Спу Спи Гуз Зег 1 5 10 15 «2105» 65 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «-4005» 65 зЗег Авп Пе Суз Маї Гуз Ма! Спу Сім Гуз Зег І еи ТНиг Суз Гув 1 5 10 15 «2105» 66 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «-4005» 66 ма! Гуз Маї Спу Спи Гуз Бег І єи ТНг Суз І уз І уз Пе Авр І єи 1 5 10 15 бо «2105» 67

«-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 67 спи Гуз БегІ еи Тиг Суз Гуз Гуз Пе Авр І єи Тиг ТАг Пе Маї 1 5 10 15 «-2105» 68 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність -4005» 68

Тпиг Суз Гуз Гуз Пе Авр І еи Тниг Тпг Пе Маї! Гуз Рго Сім Аа 1 5 10 15 «2105» 69 «-2115 15

Зо 212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «-4005» 69

Пе А5р Гей Тиг Тнг Те Маї Гуз Рго Сіи Аа Рго РНе Азр І єи 1 5 10 15 «-2105 70 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «-4005 70

Тит Пе Маї Гуз Рго Сім Аїа Рго Рне Азр Геи 5ег Ма! Пе Туг 1 5 10 15 «-2105 71 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність 60

«020» 223» Синтетична послідовність «4005 71

Рго Сіи Аїа Рго РНе Авр ГІ єи 5ег Ма! Пе Туг Агу Сім Сіу Аіа 1 5 10 15 «-2105 72 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005 72

Рпе Авр Геи 5ег Ма! Пе Туг Агу Спи Спіу Аіа Азп Ар Ре Маї 1 5 10 15 «-2105 73 «-2115 15 «212» БІЛОК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005» 73 ма! Ме Туг Агу Спи Спіу Аа Авп Авр РнНе Маї Маї Тиг Ре Авп 1 5 10 15 «-2105» 74 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005» 74

Сім Спу Аа Азп Авр Рнє Маї Ма! Тнг Рне Авзп ТнНг 5ег Нів І ви 1 5 10 15 «-2105 75 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність 60 «4005» 75

Азр Ре Маї Маї Тнг Ре Авп Тнг з5ег Ніз І ви Сп Гуз Гув Туг 1 5 10 15 «-2105 76 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 76

ТАг Рне Авп Тнг 5ег Нів І еи Сп Гуз І уз Туг Ма! Гуз Ма! І еи 1 5 10 15 «-2105 77 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005» 77

Беї Нів І єи Сп І уз Гуз Туг Ма! Гуз Ма! І єи Меї Ніз Авр Маї 1 5 10 15 «-2105 78 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 78

Гуз Гуз Туг Ма! Гуз Маї І єи Меї Ні Авр Маї Аа Туг Агу Сп 1 5 10 15 «-2105» 79 «-2115 15

БО «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 79

Гуз Ма! І єи Меї Ніз Азр Маї Аа Туг Ага Сіп Спи Гуз А5р Си 1 5 10 15 60

«210» 80 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 80

Ні5 Азр Маї Аа Туг Агд Сп Спи Гуз Авр Сім Авп Гуз Тр ТАг 1 5 10 15 «-2105» 81 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 81

Туг Агу Сп Спи Гуз Авр Си Авп Гуз Тр ТНг Нів Маї Авп І єи 1 5 10 15 «210» 82 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 82

Гуз Азр Си Авп Гуз Тр Тнг Ні Маї Авп І еи 5ег Зег ТНг І ув 1 5 10 15 «210» 83 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 83

Гуз Тр ТАг Ні Маї Авп І єи Зег 5ег Тпиг Гуз Геи ТНг І єи Гей 1 5 10 15 «-2105» 84 «-2115 15 60 «212» БІЛОК

213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 84 маї Авп І єи бег 5ег ТНг Гуз І єи ТНг І єи І ви Сп Агу Гуз ей 1 5 10 15 «2105» 85 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «-4005» 85 зЗег Ти Гуз І еи Тиг Гени І еи Сп Аго Гуз ГГ еи Сп Рго Аа Аа 1 5 10 15 «2105» 86 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність

Зо «020» «223» Синтетична послідовність -4005» 86

Тиг Ге І ви Сп Аго Гуз ГГ еи Сп Рго Аа Аїіа Меї Туг Спи Пе 1 5 10 15 «-210» 87 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 87

Аго Гуз єи Сп Рго Аа Аа Меї Туг Сім Пе Гуз Маї Агу 5ег 1 5 10 15 «-2105» 88 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» 60 «223» Синтетична послідовність

«400» 88

Рго Аїа Аа Меї Туг Спи Пе Гуз Маї Агоу Зег Пе Рго Авр Ніб 1 5 10 15 «210» 89 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 89

Туг см Пе Гуз Маї Агу Зег Пе Рго Авр Ні Тут Рне Гуз Спу 1 5 10 15 «210» 90 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність

Ко) «400» 90

Ммаї Ага зе" Пе Рго Ар Ні Туг Рпе Гуз Сіу Ре Тр 5ег Сі 1 5 10 15 «2105» 91 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 91

Рго Авр Ні Туг Рпє Гуз Спу Рпеє Тгр Зег Сім Тгр Зег Рго Зег 1 5 10 15

БО «210» 92 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «400» 92 60 Рне Гуз Сіу РНе Тр 5ег Си Тр 5ег Рго 5ег Туг Туг Рне Ага

1 5 10 15 «2105 93 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність -4005 93

Тр Зег Сім Тгр 5ег Рго 5ег Туг Туг Рпє Агу ТНг Рго Спи Пе 1 5 10 15 «-2105» 94 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 94 зЗег Рго 5бег Туг Туг Рне Агу Тнг Рго Сім Пе Авзп Авп 5ег 5ег 1 5 10 15 «2105» 95 «-2115 15 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «-4005» 95

Туг Рне Ага Тнг Рго Сім Пе Авп Авп 5Зег Зег Сіу Сім Меї Азр 1 5 10 15 «2105» 96 «-2115» 8 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність -4005» 96

Ага Гуз І ви Сіп Рго Аа Аа Меї 1 5

Claims (8)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, яке специфічно зв'язується з СО127, зокрема з людським СО127, що містить: - легкий ланцюг антитіла, що містить або варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, що складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 9; 5ЕО ІЮ МО: 10; ЗЕО ІЮ МО: 11; ЗЕО ІО МО: 12; зокрема ЗЕО ІЮ МО: 12; і - варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що складається з послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮО МО: 7.

2. Антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, за п. 1, де зазначене антитіло являє собою гуманізоване моноклональне антитіло, зокрема, де константний домен легкого ланцюга антитіла походить від константного домену легкого ланцюга каппа людини, зокрема, де константний домен легкого ланцюга складається з послідовності ЗЕО ІЮО МО: 27 або 281 де константний домен важкого ланцюга антитіла походить від константного домену важкого ланцюга Ідс1, Ідс2, ІдОЗ або Ідс4 людини, зокрема від константного домену важкого ланцюга 354 людини, зокрема, де константний домен важкого ланцюга антитіла складається з послідовності з БЕО ІЮ МО: 26.

3. Антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, за п. 1 або 2, де легкий ланцюг антитіла включає або варіабельний домен легкого ланцюга антитіла складається з ЗЕО ІЮО МО: 12.

4. Антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким із пп. 1-3, яке є антагоністом передачі сигналів ІГ-7К, індукованої ІЇ/-7, й яке не індукує активацію фосфатидилінозитол-3- кінази та/або сигнального шляху ЕКК.

5. Антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким із пп. 1-4, яке розпізнає епітоп, що містить послідовність, взяту з сайта 25 із СО127, і/або порушує зв'язування СО127 із загальним ланцюгом ус цитокінових рецепторів, зокрема, яке розпізнає щонайменше третій бета-шар сайта 25 С0127.

6. Антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким із пп. 1-5, яке не індукує інтерналізацію СО127 й/або інгібує індуковану 1-7 інтерналізацію СО127. Зо

7. Антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким із пп. 1-6, яке не збільшує дозрівання дендритних клітин, індуковане Т5І Р.

8. Антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким із пп. 1-7, яке робить тривалий ефект і/або швидкий ефект, зокрема, яке робить швидкий локальний ефект.

9. Антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким із пп. 1-8, яке специфічно зв'язується з СО127 людини з константою афінності КО нижче 5х109 М, що може бути визначено біосенсорним аналізом.

10. Комбінація виділених молекул нуклеїнової кислоти, що кодують антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, за будь-яким із пп. 1-9, зокрема першої виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що містить або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 15, БЕО ІЮО МО: 16, 5ЕО ІЮО МО: 17 і 5ЕО ІЮО МО: 18; і другої виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що містить або складається з послідовності 5ЕО ІЮ МО: 13.

11. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким із пп. 1-9 (або комбінацію виділених молекул нуклеїнової кислоти за п. 10 і фармацевтичний носій.

12. Фармацевтична композиція за п. 11, яка придатна для місцевого застосування, зокрема для місцевого підшкірного, ентерального або перорального застосування, більше конкретно - для доставки в товсту кишку.

13. Набір, який містить фармацевтичну композицію за п. 11 або 12 і пристрій для доставки, що придатна для місцевого введення, зокрема пристрій для підшкірної, ентеральної або пероральної доставки, більше конкретно - зазначений пристрій містить попередньо заповнений шприц або безголковий пристрій.

14. Застосування антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким із пп. 1-9 або комбінації виділених молекул нуклеїнової кислоти за п. 10, або фармацевтичної композиції за п. 11 або 12 як лікарського засобу.

15. Застосування антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким із пп. 1-9 або комбінації виділених молекул нуклеїнової кислоти за п. 10, або фармацевтичної композиції за п. 11 або 12 як лікарського засобу за п. 14 для профілактики або лікування відторгнення трансплантата органа або тканини або захворювання, вибраного з групи, що складається з аутоїмунних захворювань, зокрема ревматоїдного артриту, системного склерозу, розсіяного 60 склерозу, діабету І типу, аутоїмунного тиреоїдиту, системного червоного вовчака, первинного синдрому Шегрена та запальних захворювань, зокрема запальних захворювань кишечнику (З3З3К), більше конкретно хвороби Крона та виразкового коліту, й енцефаломієліту, а також алергійних захворювань та ракових захворювань, і захворювань, пов'язаних із трансплантацією, та респіраторних захворювань. А МІЗВБАУН ЕВ ОО Ме: 7) ОУСІ УКВ С УКОЛ САУ ПІДУ УМА ЧУТОК БУМ ТОАОСЦАТУТРОЗУКОЕКПОВОНАККВО У ОМ КАКОТАЬ УРУСАВВЛАНУЦЕМУ ВУ АСИСТ УР» В МІУ ІЕС ОО Ме: ПСИ ТОБ ЗАБУВ ОВУ ПТС ЕН СА УУ ТО ОКРОКАРКІ, ГУТАВТНІСУВВ БОТОКС ОРОС ОСИ У РАгООСТКУКІХ МІВ ВУ УЯВІ ОВО ОО Ме: 30 ПІТТОМ ХАУС ОВУ ПТС ОТО С АУУУ М ОКРОКАВК, АВ ТНІСУВОВЕ ОЗ ВИ Па ОР СОгАТУ СОЦ УВ АОС кУК МІЗВОНАЗАКВУУ ЕС ЦО Мех 1 ОК Т ОБР ЗАБУСОКУ ПОВ БЕН ОСА У КС ОКРОКАРКІ ЦУУБАКТІНІСУРЗНЕ ОВ ИТО ТП ОРЕ ОАЕ МАгСООТЕУЕК МОЗ ВО УуЦ АН ВХ ЗО І СД ОБВБ БАБУВОВ УТ ТВ НУМО АКА ВОКАРКЬ ГЕБАМТН УВО ОП СПАМ ОРЕСТА У СОСЯ Оу ідкаосТ кує

Фіг. 1

КАКАО в Юлю мі3вІ-Я З Ка дя че МІЗВО-пЯ щ 100 сп квк і лов хх ій й я ВВЕ Ж ї - ВО Я че ОВУ ХУ ї г ї М Її сх і С: Ж

ЕЕ. й й

800. ГА ни Ж а оту ві 3 Кк ож Е о і й она й:

з. ! і Е ой з т що Й й Ши 1 ж вої и 3 4567 85 Час обробки ЩО

Фіг. 2

4 з оо МІЗВОАЗ 00ееМІЗВОНМОЯ 0 ее РИЗВОвМЯ а оон че МміЗВеАМ В Кеш : ї ДК зв В уник

Єв. Й нення КУ 1 нї я Я З ве. : я й о Н БК . | я, Кі С ! У й кенцентовція (неЯмМл тріг. З

А Ба» Ну зав ВИНЕН З а зе ВІЗВО-НУА ши адал о «ее ВА ЗВІ-НУ ЄВ езазвм В як міЗВОнЯ ж за та Ме ча З 18 13080 ноо в антязінеа ними 7" 200ач --- МІЗВО-НЗ З щ че МІНА Я ко чен МИЗВО-НМі5 а 1500 вах че Міаво НУ, 7 та ню тю вититіпс іму «ріг. 4 зак ВО звативкінно зве дя Ж КН ВЕ ві я Е В я 5 я я я: Як Ж ОВ ОКО -х ї Х ше Ж ох Як ТЗ Як яоХ ї

8 . іш 5 5 8 5 За : ка я її В В :КШЕЕ хх ЩЕ 5 5 5 щі Ж Оз 5 А х щі 5. З Ж Ж 3 КЕ ій я її х Я ве «ВАК я хро КУ їй шен ни ШОН КО в : ЗВ вірне век ж х ГЯ ; чКЬ ЩЕ оосесесссссеєї ЗКАКЕЯ дкоковвкннкі ТЕН : і Я її ЗУ Го Вк В 5 В В. КЕ Ж ЗВ Зак : я ЗХ ж ІВ кВ ЗК С . ВІВ УЖ Е: - З МОУ й що 5 | х Б ІВ щі З і 5 В Ми ШЕ | 5 о З 5 5 5 о

Кк... | ЕЕ ші ншшшяш: ї ІБ я х : ЗВО І ЕВ В Х Х ях о КК К Я 18 КК З ВХ ОК па Хе М у КК КЕН з ниж й ВН. ВАЖОМВЕ ЗА)? ЖеБОА 33 00 Буфер

Фіг. 5

КЕ ААНВОНВ: О мУке ЗУБ ВО Ву Я явка ця я Тв веж: ; і ші ї і БІ, З ян х і.

ше. В. . с 3 щ І У» Ї КЗ сх 1 МК В КВК. іх . Е що го ! КЕ Ка Н - . З - МКК р Ї вк В. як х У НОХ З ВК 3. З Е Ж ях що я віл ще ВК . ї ни й ска о о. Без ща Туберкути кава зусцннх у и А я Й же В КЕ Ма: о мене авта п м ки во МІ Ва В викденех ет зо 85 КУ: ЕЕ Е : ВХ Урихе ВКА, КЗ З В і ; Бі з

«ДЩ. ї У у ів Щек Е Її х Е КОСУ С, і. ши т і: г . В Б

Ж і. | Як . їх Я ї СХ Ж ЯХ В. А І хОЯ КЗ ї БО Ко в Н ОН : Н ВЕ ВВ хх 5 х І БІВ хе Ж ї ВУХ ВЕК ЯКЕ що Хе 7 війбжвлоне і ВИНО. ооо ВК ЩехАб Туйеркути Б ТуМеюеуМВ:

Фіг. 5 (продовження)

ЕТ НАУ т ! я а | Ше І: К. т ше ні г І. І В са: и ше ШЕ Ж б ви жа і ! ее ни ши ан кан п й Ж Ж те з о х ее Ку й Ку й К КІ

У . х Щ х й ве ведкеніни КО ща зідлечінк з як іа ще нення зЕКОк ваними В дна 8 данним М фіг. 6 ЖЕ ЗО вич фіг й ЗВО в г шк КУ ;-Щ гі в в із ї зх вира х В дню С АВ ТК В Ко й Я «сені ; х ах -Е Н х. яке ; вон щ Бе як М к - В ї ее ме о ки хй аа Канн з СТАВ ЗНАТВ

Фіг. 8 ше. с щі Б п ЇЇ -»:

Щ. вк ВЕНК я 8 Е : жо» ї Є | і хм о -Щ В 2 | | - я ся ї ок бе є ДЕ С о я

Фіг. З аТАТ тих папатттввввтт Кк сю х Ко нон Ж дюн ро 3 - ч 7 і. ія Х У я : я 5 ву хх Ех гЯ КК ооще З шин себнюя як р г з ї Х Ж їх що Е 8 ох, я ярок и -АК.. ї в Ше 5 - ж «е ви К я і ЩА ж м я Ко : з є й щ

Фіг. о й. : х у гЗ х вен нн нон їх - ,ІО55.55.55555,5,,5 Я Й ПО М я Ух Казки Б ДКАААААКАКААААЯ 5 х: ї пив ВК хх ун. Же Н БО І ж» Н п : : реко ніна Ж ин мн нон нама КосЯ ї ПЕКИ ОО х ї й с у Е АХ о в о вв з п З г Ваз он З

КО. о ї т с З ї і шо Сс : Н : 5 ОО ОО ; : : С х ї |: І ОО х ї ї ДАХ ОУМХОООООООО В Е Н у ї : 555 хх і он я 5 Я Мне пк М В ВВ щ п вана Ка у 5 55 с с Я ,кММММ А м Го я СТУ пед ння : шк ще а Бжо к шої шт ша Іжа РО й Н ЩЕ оду що їй що КВ Е з Ж м: ї » 1 ОБЖ що : В сх. щі 1 шо: В В «УК У ех В: М НЕННЯ Кей іі ах і Мч Бі і БАД Ви С ШЕ и Н ЖІ с В МУ - - 14 ж ї Я ї КН с ЕЕ ОРОЕ1ЖКЕ Во: У ВХ, ку Н ї хх КЕ: і Яку о НЕ ДІД Я рокі ОА Її і : М Р ок В І ВН Не нен НЕ о ; Зх В т ШИНИ, кор ОМ рот ОО І В ту М. шк х х: -і В Н ї ї КЕ і МВ є ЕЕ З УНН ННЯ : тхжи Н Божою ІУ ї кох ж вх : -к і Шк С; пеки нн КН жо т Хиастев Е панни по ен на Кен я мн МУвВечеЕ З Кнеетав я Кущ Я

Фіг. 11 е не МОТО т-13-а6 Е КО мівьиля З о. Що и

Фіг. 1 (продовження)