KR20200108275A - 면역-종양학 및 항-염증 요법을 위한 엑소좀 - Google Patents

면역-종양학 및 항-염증 요법을 위한 엑소좀 Download PDF

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누루딘 디. 르위스
유 주
스리람 사티야나라야난
존 디. 쿨만
더글라스 이. 윌리엄스
레오니드 에이. 게이듀코브
케 쓔
케 o
셀리 마틴
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코디악 바이오사이언시즈, 인크.
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Abstract

면역조절 성분을 포함하는 세포외 소포가 본원에 개시된다. 세포외 소포의 생성 방법 및 암, GvHD 및 자가면역 질환의 치료를 위해 세포외 소포를 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

면역-종양학 및 항-염증 요법을 위한 엑소좀
연관 출원에 대한 교차 참조
본 출원은2018년 8월 27일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/723,267; 및 2017년 12월 28일자로 출원된 62/611,140의 이점을 주장하며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 통합된다.
본 발명은 인간 면역계와 상호작용하고, 이를 조절하기 위한 조성물, 상기 조성물을 제조하는 방법, 및 상기 조성물을 사용하여 암, GvHD 및 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
면역요법은 면역 반응을 유도, 향상 또는 억제함으로써 질환을 치료하는 것이다. 면역요법은 환자 자신의 면역계를 자극하여 암 세포를 공격할 수 있다. 암 면역요법은 일반적으로 화학요법 및 방사선 요법과 같은 전통적인 암 요법보다 부작용이 적다. 항-염증성 면역요법은 자가면역 질환 및 이식편 대 숙주 질환(GvHD) 치료를 위해 환자의 면역계를 하향-조절할 수 있다. 면역조절 분자를 신체의 세포 및 조직에 전달하기 위한 개선된 방법이 필요하다.
약물 전달 비히클로서, 세포외 소포는 전통적인 약물 전달 방법, 특히 유전자 요법에 비해 많은 이점을 제공한다. 세포외 소포의 전신 전달은 이들 지질 나노입자를 다양한 조직으로 분포시킨다. 연구에 따르면 세포외 소포는 인간 면역계의 조절과 연관된 다양한 세포와 상호작용할 수 있다. 인간 면역계를 활성화, 억제 또는 영향을 주기 위해 치료 분자를 전달하도록 선택된, 풍부한 또는 조작된 세포외 소포는 암 및 다른 면역계 연관 질환에 대한 강력한 치료제일 수 있다.
본원은 인간 면역계를 상향-조절 또는 하향-조절할 수 있고, 암과 싸우기 위해 환자의 면역계를 부스팅하거나 GvHD 및 자가면역 질환의 증상을 경감시키기 위해 환자의 면역계를 억제할 수 있는 면역조절 성분으로 선택된, 풍부한 또는 조작된 세포외 소포를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한 인간 면역계를 조절하기 위해 세포외 소포를 생성하고 이용하는 방법이 제공된다.
따라서, 제1 양태에서, 봉입된 용적에 결합된 세포막을 포함하는 세포외 소포; 내측 표면 및 외측 표면을 갖는 세포막; 및 세포막과 회합되거나 봉입된 용적 내에 봉입된 제1 면역조절 성분을 포함하는 조성물이 제공된다.
다양한 구현예에서, 제1 면역조절 성분은 음성 체크포인트 조절인자에 대한 억제제 또는 음성 체크포인트 조절인자의 결합 파트너에 대한 억제제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 음성 체크포인트 조절인자는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 세포독성 T-림프구-회합된 단백질 4(CTLA-4), 프로그래밍된 세포사 단백질 1(PD-1), 림프구-활성화된 유전자 3(LAG-3), T-세포 면역글로불린 뮤신-함유 단백질 3(TIM-3), B 및 T 림프구 감쇠기(BTLA), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA), 아데노신 A2a 수용체(A2aR), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), CD20, CD39 및 CD73.
다양한 구현예에서, 제1 면역조절 성분은 양성 공통자극 분자에 대한 활성제 또는 양성 공통자극 분자의 결합 파트너에 대한 활성제이다. 일부 구현예에서, 양성 공통자극 분자는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원이다. 이들 구현예들 중 일부에서, TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas 수용체, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK 수용체, TACI, BAFF 수용체, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP, 및 XEDAR. 일부 구현예에서, 양성 공통자극 분자에 대한 활성제는 TNF 슈퍼패밀리 일원이다. 이들 구현예들 중 일부에서, TNF 슈퍼패밀리 일원은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드, 및 EDA-2. 특정 구현예에서, TNF 슈퍼패밀리 일원은 CD40L이다. 특정 구현예에서, TNF 슈퍼패밀리 일원은 CD27L이다. 특정 구현예에서, TNF 슈퍼패밀리 일원은 OX40L이다.
일부 구현예에서, 양성 공통자극 분자는 CD28-슈퍼패밀리 공통자극 분자이다. 이들 구현예들 중 일부에서, CD28-슈퍼패밀리 공통자극 분자는 ICOS 또는 CD28이다. 일부 구현예에서, 양성 공통자극 분자에 대한 활성제는 ICOSL, CD80 또는 CD86이다. 특정 구현예에서, 양성 공통자극 분자에 대한 활성제는 CD80이다.
일부 구현예에서, 제1 면역조절 성분은 사이토카인 또는 사이토카인의 결합 파트너이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 및 IL-15. 특정 구현예에서, 사이토카인은 IL-7이다. 특정 구현예에서, 사이토카인은 IL-12이다. 특정 구현예에서, 사이토카인은 IL-15이다.
일부 구현예에서, 제1 면역조절 성분은 T-세포 수용체(TCR), T-세포 공동-수용체, 주조직 적합성 복합체(MHC), 인간 백혈구 항원(HLA) 또는 이의 유도체이다.
일부 구현예에서, 제1 면역조절 성분은 T-세포 수용체 또는 공동-수용체의 활성제이다. 특정 구현예에서, T-세포 수용체 또는 공동-수용체의 활성제는 CD3의 활성제, 선택적으로 CD3의 효능제 항체이다.
일부 구현예에서, 제1 면역조절 성분은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 알파-태아단백(AFP), 암종배아 항원(CEA), 상피성 종양 항원(ETA), 뮤신 1(MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 티로시나제, 흑색종-연관된 항원(MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1), 프로그래밍된 사멸 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메소텔린, VEGFR, 알파-엽산 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원, MART-1 gp100 및 TNF-연관된 세포자멸사-유도 리간드. 특정 구현예에서, 종양 항원은 참조 게놈 서열로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 대상체의 게놈 서열로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 제1 면역조절 성분은 선택된 표적 또는 활성의 효능제 또는 길항제이다.
일부 구현예에서, 제1 면역조절 성분은 항체 또는 항원-결합 단편이다.
일부 구현예에서, 제1 면역조절 성분은 폴리뉴클레오타이드이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: mRNA, miRNA, siRNA, 안티센스 RNA, shRNA, lncRNA 및 dsDNA.
일부 구현예에서, 제1 면역조절 성분은 단백질, 펩타이드, 당지질 또는 당단백질이다.
일부 구현예에서, 제1 면역조절 성분은 상기 세포외 소포의 외측 표면에 표시된 융합 단백질로서 발현된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 PTGFRN 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 서열은 서열번호:3이다.
일부 구현예에서, 세포외 소포는 엑소좀이다. 일부 다른 구현예에서, 세포외 소포는 나노소포이다.
특정 구현예에서, 본 조성물은 약제학적으로-허용가능한 담체를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포외 소포는 제2 면역조절 성분을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 음성 체크포인트 조절인자에 대한 억제제 또는 음성 체크포인트 조절인자의 결합 파트너에 대한 억제제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 음성 체크포인트 조절인자는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 세포독성 T-림프구-회합된 단백질 4(CTLA-4), 프로그래밍된 세포사 단백질 1(PD-1), 림프구-활성화된 유전자 3(LAG-3), T-세포 면역글로불린 뮤신-함유 단백질 3(TIM-3), B 및 T 림프구 감쇠기(BTLA), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA), 아데노신 A2a 수용체(A2aR), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), CD20, CD39 및 CD73.
다양한 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 양성 공통자극 분자에 대한 활성제 또는 양성 공통자극 분자의 결합 파트너에 대한 활성제이다. 일부 구현예에서, 양성 공통자극 분자는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원이다. 이들 구현예들 중 일부에서, TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas 수용체, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK 수용체, TACI, BAFF 수용체, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP, 및 XEDAR. 일부 구현예에서, 양성 공통자극 분자에 대한 활성제는 TNF 슈퍼패밀리 일원이다. 이들 구현예들 중 일부에서, TNF 슈퍼패밀리 일원은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드, 및 EDA-2. 특정 구현예에서, TNF 슈퍼패밀리 일원은 CD40L이다. 특정 구현예에서, TNF 슈퍼패밀리 일원은 CD27L이다. 특정 구현예에서, TNF 슈퍼패밀리 일원은 OX40L이다.
일부 구현예에서, 양성 공통자극 분자는 CD28-슈퍼패밀리 공통자극 분자이다. 이들 구현예들 중 일부에서, CD28-슈퍼패밀리 공통자극 분자는 ICOS 또는 CD28이다. 일부 구현예에서, 양성 공통자극 분자에 대한 활성제는 ICOSL, CD80 또는 CD86이다. 특정 구현예에서, 양성 공통자극 분자에 대한 활성제는 CD80이다.
일부 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 사이토카인 또는 사이토카인의 결합 파트너이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 및 IL-15. 특정 구현예에서, 사이토카인은 IL-7이다. 특정 구현예에서, 사이토카인은 IL-12이다. 특정 구현예에서, 사이토카인은 IL-15이다.
일부 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 T-세포 수용체(TCR), T-세포 공동-수용체, 주조직 적합성 복합체(MHC), 인간 백혈구 항원(HLA) 또는 이의 유도체이다.
일부 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 T-세포 수용체 또는 공동-수용체의 활성제이다. 특정 구현예에서, T-세포 수용체 또는 공동-수용체의 활성제는 CD3의 활성제, 선택적으로 CD3의 효능제 항체이다.
일부 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 알파-태아단백(AFP), 암종배아 항원(CEA), 상피성 종양 항원(ETA), 뮤신 1(MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 티로시나제, 흑색종-연관된 항원(MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1), 프로그래밍된 사멸 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메소텔린, VEGFR, 알파-엽산 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원, MART-1 gp100 및 TNF-연관된 세포자멸사-유도 리간드. 특정 구현예에서, 종양 항원은 참조 게놈 서열로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 대상체의 게놈 서열로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 선택된 표적 또는 활성의 효능제 또는 길항제이다.
일부 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 항체 또는 항원-결합 단편이다.
일부 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 폴리뉴클레오타이드이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: mRNA, miRNA, siRNA, 안티센스 RNA, shRNA, lncRNA 및 dsDNA.
일부 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 단백질, 펩타이드, 당지질 또는 당단백질이다.
일부 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 상기 세포외 소포의 외측 표면에 표시된 융합 단백질로서 발현된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 PTGFRN 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 융합 단백질의 서열은 서열번호:3이다.
일부 구현예에서, 제2 면역조절 성분은 상기 제1 면역조절 성분과 상이하다.
일부 구현예에서, 세포외 소포는 제3 면역조절 성분을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 면역조절 성분은 상기 제1 및 제2 면역조절 성분과 상이하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 조성물의 제조 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 제1, 제2 및/또는 제3 면역조절 성분으로 생산자 세포를 변형시키는 단계; 상기 생산자 세포로부터 세포외 소포를 수득하는 단계; 및 상기 수득된 세포외 소포를 선택적으로 단리하는 단계를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 상기 방법은 생산자 세포로부터 세포외 소포를 수득하는 단계; 상기 수득된 세포외 소포를 단리하는 단계; 및 단리된 세포외 소포를 제1, 제2 및/또는 제3 면역조절 성분으로 변형시키는 단계. 특정 구현예에서, 본 방법은 단리된 세포외 소포를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체의 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 치료 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 본 조성물은 대상체에서 면역 반응을 상향조절하여, 그것에 의해 대상체 면역계의 종양 표적화를 향상시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 이식편 대 숙주 질환(GvHD)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 치료 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물은 대상체에서 면역 반응을 하향-조절하여, 그것에 의해 GvHD의 증상을 경감시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 대상체의 자가면역 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 치료 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물은 대상체에서 면역 반응을 하향-조절하여, 그것에 의해 대상체의 면역 활성을 억제할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에는 종양 항원을 포함하는 치료 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암을 치료 또는 예방하는 방법 이 본원에 제공되며, 여기서 조성물은 종양 항원에 대한 면역 반응을 강화시켜, 이에 의해 암에 대한 상기 대상체의 면역 반응을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 알파-태아단백(AFP), 암종배아 항원(CEA), 상피성 종양 항원(ETA), 뮤신 1(MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 티로시나제, 흑색종-연관된 항원(MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1), 프로그래밍된 사멸 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메소텔린, VEGFR, 알파-엽산 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원, MART-1 gp100 및 TNF-연관된 세포자멸사-유도 리간드.
특정 구현예에서, 종양 항원은 참조 게놈 서열로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 대상체의 게놈 서열로부터 유래된다.
도 1a 및 1b는 방사선-표지된 엑소좀이 주입된 마우스의 시간 경과를 나타낸다. 도 1a는 정맥내 투여 경로를 나타낸다. 도 1b는 복강내 투여 경로를 나타낸다.
도 2는 방사선표지된 엑소좀의 정맥내 및 복강내 투여 후 상이한 마우스 조직에서의 엑소좀 분포의 정량화이다.
도 3a 및 3b는 CD40L-발현 엑소좀과 함께 인큐베이션한 후 2명의 인간 공여체로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 B-세포 활성화의 효과를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 CD40L-발현 엑소좀과 함께 인큐베이션한 후 2명의 인간 공여체로부터의 정제된 B-세포의 B-세포 활성화 효과를 나타낸다.
도 5a는 CD40 리포터 세포주의 개략도이다. 도 5b는 항-CD40 효능적 항체 또는 재조합 인간 CD40L로 처리된 CD40 리포터 세포주의 농도-의존적 활성화를 나타낸다. 도 5c는 CD40 리포터 세포주에 대한 CD40L-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 CD80-발현 엑소좀을 갖는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 T-세포 활성화의 효과를 나타낸다. 도 6a는 CD8+ T-세포의 수에 대한 CD80-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다. 도 6b는 CD4+ T-세포의 수에 대한 CD80-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 인간 PBMC에서 IFNγ 발현에 대한 CD80-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 8a 및 8b는 2명의 공여체로부터의 인간 PBMC에서 IFNγ 발현에 대한 CD27L-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 9a 및 9b는 2명의 공여체로부터의 인간 PBMC에서 IL-2 발현에 대한 CD27L-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 2명의 공여체로부터의 인간 PBMC에서 IFNγ 발현에 대한 OX40L-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 11a 및 11b는 2명의 공여체로부터의 인간 PBMC에서 IL-2 발현에 대한 OX40L-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 12a는 OX40 리포터 세포주의 개략도이다. 도 12b는 항-OX40 효능제 항체 또는 재조합 인간 OX40L로 처리된 OX40 리포터 세포주의 농도-의존적 활성화를 나타낸다. 도 12c는 OX40 리포터 세포주에 대한 OX40L-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 13a 및 13b는 인간 PBMC에서 IFNγ 발현에 대한 항-CD3 항체와 조합된 IL-7-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 14a는 IL-7 수용체 리포터 세포주의 개략도이다. 도 14b는 재조합 인간 IL-7로 처리된 IL-7 수용체 리포터 세포주의 농도-의존적 활성화를 나타낸다. 도 14c는 IL-7 수용체 리포터 세포주에 대한 IL-7-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 15a 및 15b는 EdU 편입에 의해 측정된 마우스 생체내에서 T-세포 증식에 대한 IL-7-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다. 도 15a는 CD8+ T-세포에 대한 IL-7-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다. 도 15b는 메모리 CD8+ T-세포에 대한 IL-7-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 16a 및 16b는 CD71 양성율에 의해 측정된 마우스 생체내에서 T-세포 증식에 대한 IL-7-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다. 도 16a는 CD8+ T-세포에 대한 IL-7-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다. 도 16b는 메모리 CD8+ T-세포에 대한 IL-7-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 17a는 엑소좀 표면에서 고밀도로 발현된 PTGFRN/IL-7 융합 단백질 및 융합 단백질의 변이체의 개략도를 나타낸다. 도 17b는 최적화된 PTGFRN/IL-7 융합 단백질의 서열이다.
도 18a는 정제된 엑소좀의 표면에서 상이한 IL-7 융합 단백질의 상대적 발현을 나타내는 웨스턴 블랏이다. 도 18b는 IL-7-매개된 T-세포 활성화의 모델로서 IL-7 수용체 하향-조절에 대한 IL-7-발현 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 19a는 PBMC에서 T-세포 활성화에 대한 항-CD3 scFv 엑소좀의 효과를 나타낸다. 도 19b는 PBMC에서 B-세포 활성화에 대한 항-CD3 scFv 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 20a는 PBMC에서 T-세포 활성화에 대한 항-CD3 scFab 엑소좀의 효과를 나타낸다. 도 20b는 PBMC에서 B-세포 활성화에 대한 항-CD3 scFab 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 21a는 항-CD3 scFv 엑소좀으로 처리한 후 T-세포 활성화 정도를 나타내는 히스토그램이다. 도 21b는 항-CD3 scFv 엑소좀으로 처리한 후 B-세포 활성화 정도를 나타내는 히스토그램이다.
도 22a는 가용성 항-CD3 항체 또는 플레이트-코팅된 항-CD3 항체와 비교된 플레이트-코팅된 활성화 분석에서 T-세포 활성화에 대한 항-CD3 scFab 엑소좀의 효과를 나타낸다. 도 22b는 도 22a에서와 같이 수행된 개별 실험의 결과를 정량하는 막대형 차트이다.
도 23a는 전장 PTGFRN/IL-12 융합 단백질의 개략도를 나타낸다. 도 23b는 단축된 PTGFRN/IL-12 융합 단백질의 개략도를 나타낸다.
도 24a는 인간 PBMC에서 IFNγ를 유도하는 짧은 또는 전장 PTGFRN-IL-12를 과발현하는 재조합 인간 IL-12 또는 엑소좀의 효과를 나타낸다. 도 24b는 재조합 IL-12 및 IL-12-함유 엑소좀의 효능을 요약한 표이다.
도 25는 흑색종의 쥣과 모델에서 종양 성장 감소에 대한 재조합 IL-12 및 IL-12-PTGFRN 엑소좀의 효과를 나타낸다.
도 26a는 PBS로 처리된 도 25에 도시된 각각의 종양-보유 마우스에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 26b는 재조합 IL-12로 처리된 도 25에 도시된 각각의 종양-보유 마우스에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 26c는 IL-12-PTGFRN 엑소좀으로 처리된 도 25에 도시된 각각의 종양-보유 마우스에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 27은 도 25에 도시된 효능 연구에서 모든 B16F10 종양-보유 마우스의 이미지를 나타낸다.
도 28은 도 25에 도시된 B16F10 종양-보유 마우스의 생존 곡선을 나타낸다.
도 29a는 PBS, rIL-12 또는 IL-12-PTGFRN 엑소좀으로 처리된 마우스의 종양에서 IFNγ 유전자 발현 수준을 나타낸다. 도 29b는 PBS, rIL-12 또는 IL-12-PTGFRN 엑소좀으로 처리된 마우스의 종양에서 CXCL9 유전자 발현 수준을 나타낸다. 도 29c는 PBS, rIL-12 또는 IL-12-PTGFRN 엑소좀으로 처리된 마우스의 종양에서 CXCL10 유전자 발현 수준을 나타낸다. 도 29d는 PBS, rIL-12 또는 IL-12-PTGFRN 엑소좀으로 처리된 마우스의 종양에서 TGFβ 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 30은 PBS, rIL-12 또는 IL-12-PTGFRN 엑소좀으로 처리된 종양-보유 마우스에서 IFNγ-양성 CD8+ 비장 T-세포의 퍼센트를 나타낸다.
도 31a는 IFNγ 단량체에 융합된 전장 PTGFRN의 개략도를 나타낸다. 도 31b는 IFNγ 탠덤 이량체에 융합된 전장 PTGFRN의 개략도를 나타낸다.
도 32는 정제된 인간 및 마우스 단량체(m) 및 탠덤 이량체 (td) PTGFRN IFNγ 엑소좀의 PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 33은 천연 엑소좀(WT), 단량체 IFNγ PTGFRN 엑소좀(m-IFNγ-PTGFRN), 및 탠덤 이량체 IFNγ PTGFRN 엑소좀 (td-IFNγ- PTGFRN) 첨가 후 단핵구 PD-L1 발현을 나타낸다. LPS-유도 PD-L1 활성화를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 34는 PDGFR의 막관통 도메인에 융합된 15/IL-15Rα 융합 단백질의 개략도를 나타낸다.
도 35는 pDisplay IL-15 엑소좀의 첨가 후 CD69 양성 NK 세포의 백분율에 의해 측정된 NK 세포 활성화를 나타낸다.
도 36a는 전장 PTGFRN에 융합된 IL-15 및 전장 PTGFRN에 융합된 IL-15 N72D 의 도식을 나타낸다. 도 36b는 전장 PTGFRN에 융합된 IL-15 및 전장 PTGFRN에 융합된 IL-15 N72D 의 웨스턴 블랏팅을 나타낸다.
도 37은 전장 PTGFRN에 융합된 IL-15 및 전장 PTGFRN에 융합된 IL-15 N72D의 첨가 후 CD69 양성 NK 세포의 백분율로 측정된 NK 세포 활성화를 나타낸다.
도 38은 PDGFR 막관통 영역(exoCD3-PD), 전장 PTGFRN(exoCD3-긴) 및 PTGFRN 단편(exoCD3-짧은) 각각에 융합된 항-CD3 항체 단편의 도식을 나타낸다.
도 39는 천연 엑소좀(WT), PDGFR 막관통 영역(pDisplay)에 융합된 항-CD3 항체 단편을 갖는 엑소좀, 전장 PTGFRN(FL PTGFRN)에 융합된 항-CD3 항체 단편을 갖는 엑소좀, 및 PTGFRN 단편(짧은 PTGFRN)에 융합된 항-CD3 항체 단편을 갖는 엑소좀을 각각 첨가한 후 바이오-층 간섭법(BLI)의 결과를 나타낸다.
도 40a는 항-CD3 항체 단편의 첨가 후 CD69 양성 CD4+ T 세포의 백분율에 의해 측정된 CD4+ T 세포 활성화를 나타낸다. 도 40b는 천연 엑소좀(exoNative) 및 PTGFRN 단편(exoCD3-짧은)에 융합된 항-CD3 항체 단편을 갖는 엑소좀을 각각 첨가한 후 CD69 양성 CD4+ T 세포의 백분율로 측정된 CD4+ T 세포 활성화를 나타낸다.
도 41은 B-세포에 대한 CD69 양성율에 의해 측정된 B-세포 활성화 검정에서 각각의 작제물에 대한 CD40L-GFP PTGFRN 융합 단백질 및 EC50의 도식을 나타낸다.
도 42a는 천연 엑소좀, 삼량체 CD40L-PTGFRN 작제물 pCB-527을 갖는 엑소좀, 삼량체 CD40L-PTGFRN 작제물 pCB-766을 갖는 엑소좀 각각의 첨가 후 CD69 양성 B 세포의 백분율에 의해 측정된 B 세포 활성화를 나타낸다. 도 42b는 농도-매칭된 CD40L과 비교된 삼량체 CD40L-PTGFRN 작제물 pCB-527 및 pCB-766 각각을 갖는 엑소좀의 첨가후 CD69 양성 B 세포의 백분율에 의해 측정된 B 세포 활성화를 나타낸다.
도 43a는 삼량체 CD40L-PTGFRN 작제물 pCB-527을 갖는 엑소좀을 첨가한 후 CD69 양성 B 세포의 백분율로 측정된 공여체 1에서의 B 세포 활성화를 나타낸다. 도 43b는 삼량체 CD40L-PTGFRN 작제물 pCB-527을 갖는 엑소좀을 첨가한 후 CD69 양성 B 세포의 백분율로 측정된 공여체 2에서의 B 세포 활성화를 나타낸다.
도 44a는 항-CD40L-장식된 비드로 단리되고 IL-12 및 CD40L에 대한 형광 항체로 표지된 천연 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다. 도 44b는 항-CD40L-장식된 비드로 단리되고 및 CD81 및 CD40L에 대해 형광 항체로 표지된 천연 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다.
도 45a는 항-CD40L-장식된 비드로 단리되고 CD81에 대한 형광 항체로 표지된 PTGFRN-CD40L/IL-12 이중 조작된 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다. 도 45b는 항-CD40L-장식된 비드로 단리되고 IL-12 및 CD40L에 대한 형광 항체로 표지된 PTGFRN-CD40L/IL-12 이중 조작된 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다.
도 46a는 항-IL-12-장식된 비드로 단리되고, IL-12 및 CD40L에 대한 형광 항체로 표지된 PTGFRN-CD40L/IL-12 이중 조작된 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다. 도 46b는 항-IL-12-장식된 비드로 단리되고 CD81에 대한 형광 항체로 표지된 PTGFRN-CD40L/IL-12 이중 조작된 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다.
도 47a는 재조합 IL-12, 재조합 CD40L과 혼합된 재조합 IL-12, PTGFRN-IL-12 엑소좀, 이중-양성 PTGFRN-CD40L/IL-12 엑소좀, 및 PTGFRN-IL-12 엑소좀과 PTGFRN-CD40L 엑소좀의 혼합물을 각각 첨가한 후 공여체 1 인간 PBMC에서의 IFNγ 반응을 나타낸다. 도 47b는 재조합 IL-12, 재조합 CD40L과 혼합된 재조합 IL-12, PTGFRN-IL-12 엑소좀, 이중-양성 PTGFRN-CD40L/IL-12 엑소좀, 및 PTGFRN-IL-12 엑소좀과 PTGFRN-CD40L 엑소좀의 혼합물을 각각 첨가한 후 공여체 2 인간 PBMC에서의 IFNγ 반응을 나타낸다.
도 48은 재조합 IL-12, 재조합 CD40L과 혼합된 재조합 IL-12, PTGFRN-IL-12 엑소좀, 이중-양성 PTGFRN-CD40L/IL-12 엑소좀, 및 PTGFRN-IL-12 엑소좀과 PTGFRN-CD40L 엑소좀의 혼합물을 각각 첨가한 후 공여체 1 및 공여체 2 인간 PBMC에서의 IFNγ 반응의 EC50을 나타낸다.
도 49a는 재조합 CD40L, 재조합 CD40L과 혼합된 재조합 IL-12, PTGFRN-CD40L 엑소좀, 이중-양성 PTGFRN-CD40L/IL-12 엑소좀, 및 PTGFRN-IL-12 엑소좀과 PTGFRN-CD40L 엑소좀의 혼합물을 각각 첨가한 후 공여체 1 인간 PBMC에서 B 세포 활성화를 나타낸다. 도 49b는 재조합 CD40L, 재조합 CD40L과 혼합된 재조합 IL-12, PTGFRN-CD40L 엑소좀, 이중-양성 PTGFRN-CD40L/IL-12 엑소좀, 및 PTGFRN-IL-12 엑소좀과 PTGFRN-CD40L 엑소좀의 혼합물을 각각 첨가한 후 공여체 2 인간 PBMC에서 B 세포 활성화를 나타낸다.
도 50은 재조합 CD40L, 재조합 CD40L과 혼합된 재조합 IL-12, PTGFRN-CD40L 엑소좀, 이중-양성 PTGFRN-CD40L/IL-12 엑소좀, 및 PTGFRN-IL-12 엑소좀과 PTGFRN-CD40L 엑소좀의 혼합물을 각각 첨가한 후 공여체 1 및 공여체 2 인간 PBMC에서의 IFNγ 반응의 EC50을 나타낸다.
도 51a는 항-IL-12-장식된 비드로 단리되고 IL-12 및 CD40L에 대한 형광 항체로 표지된 PTGFRN-CD40L/IL-12/FLT3L 삼중 조작된 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다. 도 51b는 항-IL-12-장식된 비드로 단리되고 IL-12 및 FLT3L에 대한 형광 항체로 표지된 PTGFRN-CD40L/IL-12/FLT3L 삼중 조작된 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다. 도 51c는 항-IL-12-장식된 비드로 단리되고 CD40L 및 FLT3L에 대한 형광 항체로 표지된 PTGFRN-CD40L/IL-12/FLT3L 삼중 조작된 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다.
도 52a는 항-CD40L-장식된 비드로 단리되고 IL-12 및 CD40L에 대한 형광 항체로 표지된 PTGFRN-CD40L/IL-12/FLT3L 삼중 조작된 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다. 도 52b는 항-CD40L-장식된 비드로 단리되고 IL-12 및 FLT3L에 대한 형광 항체로 표지된 PTGFRN-CD40L/IL-12/FLT3L 삼중 조작된 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다. 도 52c는 항-CD40L-장식된 비드로 단리되고 CD40L 및 FLT3L에 대한 형광 항체로 표지된 PTGFRN-CD40L/IL-12/FLT3L 삼중 조작된 엑소좀의 FACS 분석을 나타낸다.
인간 면역계를 조절할 수 있는 세포외 소포가 본원에 개시된다. 세포외 소포를 생성하는 방법, 및 이들 세포외 소포를 사용하여 암 및 다른 면역계 관련된 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명을 보다 상세하게 기재하기 전에, 본 발명은 비제한적으로 특정 구현예로 기재되며, 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 구현예를 기재하기 위한 목적이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구항들에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명확히 명시하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이 하한 단위의 10 분의 1까지 각 개재 값 및 상기 언급된 범위에서 다른 언급되거나 개재된 값이 본 발명에 포함된다고 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한도에 따라 본 발명에 포괄된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 대표적인 예시적 방법 및 물질이 이제 기재된다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허는 각각의 개별 공보 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 지시되고 본 명세서에 참고로 포함되어 공보가 인용되는 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하는 것처럼 본원에 참고로 편입된다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명확히 지시되지 않는한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의한다. 청구범위는 임의의 선택적인 요소를 배제하도록 작성될 수 있음에 추가로 주목된다. 따라서, 이 진술은 청구항 구성요소의 언급 또는 부정적 제한의 사용과 연관하여 "단독으로", "단독" 등과 같은 배타적 용어의 사용을 위한 선행 기초로서 제공되도록 의도된다.
본 개시내용을 읽었을 때 당해 분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 본 명세서에 기재되고 설명된 각각의 개별 구현예는 본 발명의 범위 또는 사상으로부터 벗어나지 않으면서 다른 몇개의 구현예 중 임의의 특징으로부터 쉽게 분리될 수 없거나, 이와 조합될 수 있다. 모든 인용된 방법은 인용된 사건 순서 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 발명을 추가로 설명함에 있어서, 본 발명의 방법을 실시하는데 사용하기 위한 본 발명의 시스템이 더욱 상세하게 논의되고, 이어서 연관된 방법이 검토될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포외 소포"는 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하는 세포-유래된 소포를 지칭한다. 세포외 소포는 이들이 유래된 세포보다 작은 직경을 갖는 모든 막-결합 소포를 포함한다. 일반적으로 세포외 소포는 직경이 20 nm 내지 1000 nm의 범위이고, 내부 공간 내에서, 세포외 소포의 외측 표면 상에 표시되고/되거나 막에 걸쳐 있는 다양한 거대분자 전달대상물을 포함할 수 있다. 전달대상물은 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 세포외 소포는 세포자멸체, 세포 단편, 직접 또는 간접 조작에 의해 (예를 들어, 연속 압출 또는 알칼리성 용액으로의 처리에 의해) 세포로부터 유래된 소포, 소포형성된 소기관, 및 살아있는 세포에 의해 (예를 들어, 직접적인 원형질막 발아 또는 후기 엔도좀과 원형질막의 융합에 의해) 생성된 소포를 포함한다. 세포외 소포는 살아있는 또는 죽은 유기체, 외식된 조직 또는 기관 및/또는 배양 세포로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "엑소좀"은 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하고, 직접적인 원형질막 발아 또는 후기 엔도좀과 원형질막의 융합에 의해 세포로부터 생성된, 세포-유래된 작은(직경 20~300 nm, 더 바람직하게는 직경 40~200 nm) 소포이다. 엑소좀은 세포외 소포 종이다. 엑소좀은 지질 또는 지방산 및 폴리펩타이드를 포함하고, 선택적으로 페이로드(예를 들어, 치료제), 리시버(예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산, RNA, 또는 DNA), 당(예를 들어, 단당, 다당류, 또는 글리칸) 또는 다른 분자를 포함한다. 엑소좀은 생산자 세포로부터 유래될 수 있고, 그의 크기, 밀도, 생화학적 파라미터 또는 이들의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "나노소포"는 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하고, 조작없이 나노소포가 생산자 세포에 의해 생산되지 않도록, 직접 조작 또는 간접 조작에 의해 세포로부터 생성된, 세포-유래된 작은(직경 20~250 nm, 더 바람직하게는 직경 30~150 nm) 소포이다. 생산자 세포의 적절한 조작은 연속 압출, 알칼리성 용액 처리, 초음파 처리 또는 이들의 조합을 비제한적으로 포함한다. 나노소포의 생산은 일부 사례에서 생산자 세포의 파괴를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 나노소포의 모집단은 원형질막으로부터의 직접적인 발아 또는 후기 엔도좀과 원형질막의 융합에 의해 생산자 세포로부터 유래된 소포가 실질적으로 없다. 나노소포는 세포외 소포의 종이다. 나노소포는 지질 또는 지방산 및 폴리펩타이드를 포함하고, 선택적으로 페이로드(예를 들어, 치료제), 리시버(예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산, RNA, 또는 DNA), 당(예를 들어, 단당, 다당류, 또는 글리칸) 또는 다른 분자를 포함한다. 일단 조작에 따라 생산자 세포로부터 유래된 나노소포는 그의 크기, 밀도, 생화학적 파라미터 또는 이들의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다.
용어 "세포외 소포 전달" 또는 "세포외 소포의 전달"는 대상체의 표적 조직, 세포 및/또는 기관에 대한 세포외 소포의 투여 및 편재화를 지칭한다. 일부 구현예에서, 면역조절 성분은 표적 세포의 세포질로 전달될 수 있다. 다른 구현예에서, 면역조절 성분은 표적 세포의 막으로 전달된다. 일부 구현예에서, 세포외 소포의 막은 표적 세포의 막과 융합된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생산자 세포"는 세포외 소포가 단리될 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 생산자 세포는 세포외 소포의 원천으로서 작용하는 세포이다. 생산자 세포는 세포외 소포와 단백질, 지질, 당 또는 핵산 성분을 공유할 수 있다. 일부 구현예에서, 생산자 세포는 변형된 또는 합성 세포이다. 일부 구현예에서, 생산자 세포는 배양된 또는 단리된 세포이다. 특정 구현예에서, 생산자 세포는 세포주이다. 특정 다른 구현예에서, 생산자 세포는 일차 세포이다. 일부 특정 구현예에서, 생산자 세포는 면역 세포이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "막"은 하나 이상의 생물학적 화합물, 전형적으로 지질 및 선택적으로 폴리펩타이드 및/또는 탄수화물을 포함하는 외측 공간으로부터 내측 공간을 분리하는 경계층이다. 일부 구현예에서, 막은 지질 및 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 막은 인지질, 당지질, 지방산, 스핑고지질, 포스포글리세라이드, 스테롤, 콜레스테롤, 및 포스파티딜세린을 포함한다. 이들 구현예들 중 일부에서, 막은 하나 이상의 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 다당류, 예컨대 글리칸을 추가로 포함한다. 세포외 소포는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 막을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역조절 성분"은 세포외 소포와 접촉하는 표적(예를 들어, 표적 세포)에 작용하고, 면역 체계를 조절하는 치료제를 지칭한다. 세포외 소포 및/또는 생산자 세포에 도입될 수 있는 면역조절 성분은 치료제, 예컨대 관문 억제제의 조절제 또는 관문 억제제의 리간드, 표면 항원 및 이의 유도체, 사이토카인 및 이의 유도체를 포함한다. 면역조절 성분은 또한 효능제, 길항제, 항체 및 항원-결합 단편, 또는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 siRNA, miRNA, lncRNA 및 DNA를 포함할 수 있다.
용어 "리시버"는 세포외 소포를 표적으로 향하게 하고/하거나 대상체에서 세포외 소포와 상기 표적과의 상호작용을 촉진하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 수용체는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 리시버는 대상체의 조직에서 면역조절 성분의 농도를 증가시킬 수 있다. 리시버의 예는 표 3에 열거된 예를 비제한적으로 포함한다.
용어 "표적"은 세포, 병원체, 대사물, 폴리펩타이드 복합체 또는 조직에 존재하거나 대상체의 순환계 또는 림프계에서 순환하는 임의의 분자 또는 구조, 예컨대 면역 세포 또는 암 세포를 지칭한다. 표적의 예는 표 4에 열거된 예를 비제한적으로 포함한다.
"치료제" 또는 "치료적 분자"는 유효량으로 존재하는 경우 원하는 치료를 필요로 하는 대상체에 치료적 효과, 약리적 및/또는 생리적 효과를 생성하는 화합물 또는 분자를 포함한다. 대상체에게 투여될 때 측정가능한 또는 대상체에 전달가능한 효과, 예를 들어 질환, 장애 또는 병태의 증상을 완화시키거나 감소시키는 효과를 갖는 임의의 화합물, 예를 들어, 소분자 약물, 또는 생물학적 제제(예를 들어, 폴리펩타이드 약물 또는 핵산 약물)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 천연적으로 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성적으로 생산된 면역글로불린 및 이의 단편을 포함한다. 상기 용어는 또한 면역글로불린 결합 도메인과 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. "항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편으로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 용어 항체의 사용은 전체의 항체, 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체, 이의 단편을 포함하고, 단일-사슬 항체, 인간화된 항체, 쥣과 항체, 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단클론성 항체, 항-개체특이형 항체, 항체 단편, 예컨대, 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, 및 Fd 단편, 디아바디, 및 항체-관련된 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 항체는 원하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는한 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원-결합 단편"은 온전한 면역글로불린의 단편 및 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 임의의 부분을 지칭한다. 예를 들어, 항원-결합 단편은 F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fab 단편, Fv 단편, 또는 scFv 단편일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. Fab 단편은 하나의 항원 결합 부위를 가지며, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역, 경쇄의 불변 영역, 및 중쇄의 제1 불변 영역 CH1을 함유한다. Fab' 단편은 Fab' 단편이 중쇄 CH1 영역의 C-말단에 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하여, 중쇄의 힌지 영역을 추가로 포함한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. F(ab')2 단편이 생산되어, Fab' 단편의 시스테인 잔기가 힌지 영역에서 디설파이드 결합에 의해 연결된다. Fv 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 갖는 최소 항체 단편이며, Fv 단편을 생산하기 위한 재조합 기술은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 2-사슬 Fv 단편은 중쇄 가변 영역이 비-공유결합에 의해 경쇄 가변 영역에 연결된 구조를 가질 수 있다. 단일-사슬 Fv(scFv) 단편은 일반적으로 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커를 통해 경쇄 가변 영역에 공유결합된, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 이의 C-말단에서 서로 직접 연결된, 2-사슬 Fv 단편에서와 같이 이량체 구조를 가질 수 있다. 항원-결합 단편은 프로테아제를 사용하여 수득될 수 있으며(예를 들어, 전체 항체는 파파인으로 소화되어 Fab 단편을 수득하고, 펩신으로 소화되어 F(ab')2 단편을 수득함), 유전자 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. dAb 단편은 VH 도메인으로 구성된다. 단일-사슬 항체 분자는 다수의 개별 분자, 예를 들어 이량체, 삼량체 또는 다른 중합체를 갖는 중합체를 포함할 수 있다.
어구 "핵산 분자"는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기의 단일 또는 이중-가닥 중합체를 지칭한다. 여기에는 염색체 DNA 및 자가-복제 플라스미드, 벡터, mRNA, tRNA, siRNA, miRNA, 등이 포함된다. 핵산 분자는 재조합될 수 있으며, 핵산이 세포 내로 도입될 때 외인성 폴리펩타이드가 발현될 수 있다.
용어 "효능제"는 수용체에 결합하여 수용체를 활성화시켜, 생물학적 반응을 생성하는 분자를 지칭한다. 수용체는 내인성 또는 외인성 효능제에 의해 활성화될 수 있다. 내인성 효능제의 비-제한적인 예에는 호르몬 및 신경전달물질이 포함된다. 외인성 효능제의 비-제한적인 예에는 약물이 포함된다. 효능제는 전체, 부분적인, 또는 역효능제일 수 있다.
용어 "길항제"는 수용체에 결합할 때 생물학적 반응 자체를 유발하지 않고 효능제 매개 반응을 차단하거나 약화시키는 분자를 지칭한다. 많은 길항제는 수용체상의 구조적으로 정의된 결합 부위에서 내인성 리간드 또는 기질과 경쟁함으로써 이들의 효능을 달성한다. 길항제의 비-제한적인 예는 알파 차단제, 베타-차단제 및 칼슘 채널 차단제를 포함한다. 길항제는 경쟁적, 비-경쟁적 또는 비-경쟁적 길항제일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 단백질의 "단편"은 자연 발생 단백질과 비교하여 N- 및/또는 C-말단 결실된 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, 또는 ATP 수송체의 단편은 엑소좀에 구체적으로 표적화될 수 있는 능력을 보유한다. 이러한 단편은 일명 "기능적 단편"이다. 단편이 그런 의미에서 기능적 단편인지의 여부는 웨스턴 블랏, FACS 분석 및 예를 들면 GFP와 같은 자가 형광 단백질과 단편의 융합을 포함하는, 엑소좀의 단백질 함량을 결정하는 임의의 당 업계에 알려진 방법에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체의 단편은 엑소좀을 구체적으로 표적화하는 자연 발생 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, 또는 ATP 수송체의 능력의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%를 보유한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 단백질의 "변이체"는 당 업계에 알려진 방법에 의해 정렬시 다른 단백질과 특정 아미노산 서열 동일성을 공유하는 단백질을 지칭한다. 단백질의 변이체는 또 다른 단백질에서의 치환, 삽입, 결실, 틀이동 또는 재배열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 변이체는 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, 또는 ATP 수송체의 단편과 적어도 70% 동일성을 갖는 변이체이다. 일부 구현예에서, PTGFRN의 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 1에 따른 PTGFRN 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, BSG 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 9에 따른 BSG 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, IGSF2 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 34에 따른 IGSF2 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, IGSF3 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 20에 따른 IGSF3 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, IGSF8 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 14에 따른 IGSF8 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, ITGB1 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 21에 따른 ITGB1 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, ITGA4 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 22에 따른 ITGA4 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, SLC3A2 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 23에 따른 SLC3A2 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, ATP1A1 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 24에 따른 ATP1A1 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, ATP1A2 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 25에 따른 ATP1A2 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, ATP1A3 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 26에 따른 ATP1A3 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, ATP1A4 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 27에 따른 ATP1A4 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, ATP1B3 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 28에 따른 ATP1B3 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, ATP2B1 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 29에 따른 ATP2B1 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, ATP2B2 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 30에 따른 ATP2B2 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, ATP2B3 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 31에 따른 ATP2B3 또는 이의 기능적 단편. 일부 구현예에서, ATP2B4 변이체 또는 단편의 변이체는 하기와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다:서열번호: 32에 따른 ATP2B4 또는 이의 기능적 단편.상기 각각의 경우에, 바람직하게는, 변이체 또는 단편의 변이체는 엑소좀에 특이적으로 표적화될 수 있는 능력을 보유한다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 당 업계에 널리 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 하기에 기재되어 있다:Smith and Waterman, Adv.Appl.Math.2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio.48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24:307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:15 237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989) Corpet et al., Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988); Huang et al., Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992); and Pearson et al., Meth.Mol. Biol. 24:307-31(1994). NCBI 기본 국소 정렬 검색 툴(BLAST) [Altschul 20 et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990) J는 국립 생물 정보 센터(NBCl, Bethesda, Md.) 및 인터넷을 포함한 여러 공급원에서 입수가능하며, 서열 분석 프로그램 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와의 연결에 사용하기 위해, 인터넷에서 이용가능하다. 프로그램을 사용하여 서열 식별을 결정하는 방법에 대한 BLAST 및 설명은 NIH(National Institute of Health)의 NCBI(국립 생물 정보 센터, National Institute for Biotechnology Information) 공식 웹 사이트에서 액세스할 수 있다.
본원에 제공된 임의의 단백질의 인용은 단백질의 기능적 변이체를 포함한다. 용어 단백질의 "기능적 변이체"는 엑소좀에 구체적으로 표적화될 수 있는 능력을 보유하는 단백질의 변이체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 본원에 기재된 하나 이상의 화합물, 예컨대, 예를 들어, 하나 이상의 다른 화학적 성분, 예컨대 약제학적으로-허용가능한 담체 및 부형제와 혼합되거나, 섞이거나, 현탁된 세포외 소포를 지칭한다. 약제학적 조성물의 하나의 목적은 세포외 소포 제제의 대상체로의 투여를 촉진하는 것이다. 용어 "약제학적으로-허용가능한" 및 이의 문법적 변형은 조성물의 투여를 금지할 정도로 바람직하지 않은 생리적 효과의 생성없이 대상체에게 투여할 수 있는 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 지칭한다. 용어 "부형제" 또는 "담체"는 화합물의 투여를 추가로 촉진하기 위해 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다. 용어 "약제학적으로-허용가능한 담체" 또는 "약제학적으로-허용가능한 부형제"는 인간을 비롯한 동물에게 사용하기 위해 미국 연방 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나 미국 약전에 열거된 모든 제제, 뿐만 아니라 대상체에게 상당한 자극을 유발하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 손상시키지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포함한다약제학적 조성물을 제조하는데 유용하고 일반적으로 안전하고 무독성이며 바람직한 부형제 및 담체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "단리하다," "단리된," 및 "단리하는" 또는 "정제하다," "정제된," 및 "정제하는" 뿐만 아니라 "추출된" 및 "추출하는"은 상호교환적으로 사용되고, 하나 이상의 정제 과정, 예를 들어, 원하는 세포외 소포 제제의 선택 또는 강화를 거친 원하는 세포외 소포의 제조 상태(예를 들어, 복수의 알려지거나 알려지지 않은 양 및/또는 농도)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 사용된 단리 또는 정제하는 단계는 생산자 세포를 함유하는 샘플로부터 세포외 소포의 제거, 부분적으로 제거(예를 들어 분획)하는 과정이다. 일부 구현예에서, 단리된 세포외 소포 조성물은 검출가능한 원하지 않는 활성을 갖지 않거나, 대안적으로 원하지 않는 활성의 수준 또는 양이 허용가능한 수준 또는 양 이하이다. 다른 구현예에서, 단리된 세포외 소포 조성물은 허용가능한 양 및/또는 농도 이상에서 원하는 세포외 소포의 양 및/또는 농도를 갖는다. 다른 구현예에서, 단리된 세포외 소포 조성물은 조성물이 수득되는 개시 물질(예를 들어 생산자 세포 제제)과 비교하여 풍부하다. 이 농축은 개시 물질과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 99.9999%, 또는 99.9999% 초과로 될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 세포외 소포 제제는 실질적으로 잔존 생물학적 생성물이 없다. 일부 구현예에서, 단리된 세포외 소포 제제는 임의의 오염 생물학적 물질이 100% 없는, 99% 없는, 98% 없는, 97% 없는, 96% 없는, 또는 95% 없다. 잔존 생물학적 생성물은 비생물 물질(화학물질 포함) 또는 원치 않는 핵산, 단백질, 지질 또는 대사물을 포함할 수 있다. 실질적으로 잔존 생물학적 생성물이 없는 것은 또한, 세포외 소포 조성물이 검출가능한 생산자 세포를 함유하지 않으며, 세포외 소포 만이 검출될 수 있음을 의미할 수 있다.
용어들 "투여," "투여하는" 및 그의 변형은 대상체에 세포외 소포 또는 제제와 같은 조성물을 도입하는 것을 지칭하며, 조성물 또는 제제의 동반 및 순차적인 도입을 포함한다. 대상체로의 조성물 또는 제제의 도입은 경구로, 폐로, 비강내로, 비경구로(정맥내로, 동맥내로, 근육내로, 복강내로, 또는 피하로), 직장으로, 림프내로, 척추강내로, 종양내로, 눈주위 또는 국소적 경로를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의한 것이다. 투여는 자가-투여 및 또 다른 투여를 포함한다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 제제가 그것의 의도된 기능을 수행할 수 있게 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 본 조성물은 대상체의 정맥에 조성물 또는 제제를 도입함으로써 투여된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "조절하다," "조절하는", "변형하는," 및/또는 "조절제"는 일반적으로 길항제 또는 효능제로서 변형, 증가 또는 감소, 예를 들어, 직접 또는 간접적으로 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 행동을 촉진/자극/상향-조절 또는 방해/억제/하향-조절하는, 예컨대 예를 들어 작용하는 능력을 지칭한다. 일부 사례에서, 조절제는 대조군에 비하여, 또는 일반적으로 예상되는 활성의 평균 수준에 비하여, 또는 대조군 수준의 활성에 비하여, 특정 농도, 수준, 활성 또는 기능을 증가 및/또는 감소시킬 수 있다.
용어 "충분한 양"은 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양, 예를 들어, 대상체의 병태를 조절하기에 충분한 양을 의미한다.
용어 "치료 유효량"은 질환의 증상을 개선시키는데 효과적인 양이다. 예방적으로 치료가 고려될 수 있기 때문에 치료 유효량은 "예방 유효량"일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로" 또는 "실질적인"은 예를 들어, 특정 공간내 한 개체의 존재, 수준 또는 농도, 한 개체가 다른 개체에 미치는 영향, 또는 치료 효과를 지칭한다. 예를 들어, 증가가 기준선을 기준으로, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 50-배, 100-배, 또는 1000-배인 경우, 개체의 활성, 수준 또는 농도가 실질적으로 증가된다. 증가가 기준선을 기준으로, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 또는 500%인 경우, 개체의 활성, 수준 또는 농도도 실질적으로 증가된다.
용어 " 생체내 "는 살아있는 유기체에서 발생하는 과정을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "포유동물"은 인간 및 비-인간 포유동물 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 약어는 하기를 포함한다:"mRNA"는 메신저 RNA를 지칭하고, "miRNA"는 마이크로 RNA를 지칭하고, "siRNA"는 작은 간섭 RNA를 지칭하고, "안티센스 RNA"는 mRNA에 상보적인 단일가닥 RNA를 지칭하고, "shRNA"는 작거나 짧은 헤어핀 RNA를 지칭하고, "lncRNA"는 긴 비-코딩 RNA를 지칭하고, "dsDNA"는 이중가닥 DNA를 지칭한다.
조성물
본 개시내용의 양태는 면역계를 조절할 수 있는 조성물을 포함한다. 본 조성물은 세포막을 포함하는 세포외 소포, 및 세포막과 회합되거나 막-결합된 봉입된 용적 내에 봉입된, 면역조절 성분을 포함한다.
세포외 소포
다양한 구현예에서, 본 조성물은 세포외 소포를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하는 세포-유래된 소포이다.
다양한 구현예에서, 세포외 소포는 이것이 유래된 세포보다 더 작은 직경을 갖는 막-결합 소포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 소포는 약 20~1000 nm, 예컨대 약 20~100 nm, 20~200 nm, 20~300 nm, 20~400 nm, 20~500 nm, 20~600 nm, 20~700 nm, 20~800 nm, 20~900 nm, 30~100 nm, 30~200 nm, 30~300 nm, 30~400 nm, 30~500 nm, 30~600 nm, 30~700 nm, 30~800 nm, 30~900 nm, 40~100 nm, 40~200 nm, 40~300 nm, 40~400 nm, 40~500 nm, 40~600 nm, 40~700 nm, 40~800 nm, 40~900 nm, 50~150 nm, 50~500 nm, 50~750 nm, 100~200 nm, 100~500 nm, 또는 500~1000 nm의 최장 치수를 갖는다.
특정 구현예에서, 세포외 소포는 엑소좀이다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 나노소포이다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 세포자멸체이다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 세포의 단편이다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 직접 또는 간접적 조작에 의해 세포로부터 유래된 소포이다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 소포형성된 소기관이다. 다양한 구현예에서, 세포외 소포는 살아있는 세포에 의해 생성된 소포이다.
일부 구현예에서, 세포외 소포는 살아있는 유기체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포외 소포는 죽은 유기체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포외 소포는 외식편 조직으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포외 소포는 외식편 기관으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포외 소포는 배양된 세포로부터 유래된다. 이들 구현예들 중 일부에서, 세포외 소포가 세포 배양 시스템에서 생성될 때, 세포외 소포는 (예를 들어, 배양된 세포로부터 세포외 소포를 단리함으로써) 추가로 단리된다. 분리는 침강에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 세포외 소포는 0.5-2.0, 0.6-1.0, 0.7-1.0, 0.8-1.0, 0.9-1.0, 1.0-1.1, 1.1-1.2, 1.2-1.3, 1.4-1.5, 1.0-1.5, 1.5-2.0, 및 1.0-2.0 kg/m3의 비밀도를 가질 수 있다. 분리는 또한, 친화도 정제에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 세포외 소포는 세포외 소포를 포함하는 모집단을 수지에 결합시킴으로써 정제될 수 있으며, 상기 수지는 세포외 소포의 표면상의 하나 이상의 표적 단백질에 대해 특이적인 친화도를 갖는 복수의 리간드를 포함한다. 표적 단백질은 테트라스파닌(예를 들어, CD63, CD81, CD9), EWI 단백질/면역글로불린 슈퍼패밀리 일원(예를 들어, PTGFRN, IGSF8, IGSF3), 인테그린(예를 들어, ITGB1, ITGA4), ATP 수송체 단백질(예를 들어, ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), SLC3A2, BSG, 또는 CD98hc일 수 있다. 표적 단백질은 추가로 엑소좀의 표면에 표시되는 면역조절 성분일 수 있다.
다양한 구현예에서, 세포외 소포는 지질 또는 지방산 및 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 당을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 세포외 소포 막은 내측 표면 및 외측 표면을 포함하고, 내부 공간을 둘러싼다. 일부 구현예에서, 세포외 소포는 페이로드를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 페이로드는 내부 공간 내에 봉입된다. 특정 구현예에서, 페이로드는 세포외 소포의 외측 표면에 표시된다. 특정 구현예에서, 페이로드는 세포외 소포의 막에 걸쳐 있다. 다양한 구현예에서, 페이로드는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자 및/또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 소포는 리시버를 추가로 포함한다.
엑소좀
다양한 구현예에서, 세포외 소포는 엑소좀이다. 특정 구현예에서, 엑소좀은 생산자 세포에 의해 분비된 작은 막-결합 소포이다.
일부 구현예에서, 생산자 세포로부터의 엑소좀은 약 20~300 nm, 예컨대 약 20~290 nm, 20~280 nm, 20~270 nm, 20~260 nm, 20~250 nm, 20~240 nm, 20~230 nm, 20~220 nm, 20~210 nm, 20~200 nm, 20~190 nm, 20~180 nm, 20~170 nm, 20~160 nm, 20~150 nm, 20~140 nm, 20~130 nm, 20~120 nm, 20~110 nm, 20~100 nm, 20~90 nm, 20~80 nm, 20~70 nm, 20~60 nm, 20~50 nm, 20~40 nm, 20~30 nm, 30~300 nm, 30~290 nm, 30~280 nm, 30~270 nm, 30~260 nm, 30~250 nm, 30~240 nm, 30~230 nm, 30~220 nm, 30~210 nm, 30~200 nm, 30~190 nm, 30~180 nm, 30~170 nm, 30~160 nm, 30~150 nm, 30~140 nm, 30~130 nm, 30~120 nm, 30~110 nm, 30~100 nm, 30~90 nm, 30~80 nm, 30~70 nm, 30~60 nm, 30~50 nm, 30~40 nm, 40~300 nm, 40~290 nm, 40~280 nm, 40~270 nm, 40~260 nm, 40~250 nm, 40~240 nm, 40~230 nm, 40~220 nm, 40~210 nm, 40~200 nm, 40~190 nm, 40~180 nm, 40~170 nm, 40~160 nm, 40~150 nm, 40~140 nm, 40~130 nm, 40~120 nm, 40~110 nm, 40~100 nm, 40~90 nm, 40~80 nm, 40~70 nm, 40~60 nm, 40~50 nm, 50~300 nm, 50~290 nm, 50~280 nm, 50~270 nm, 50~260 nm, 50~250 nm, 50~240 nm, 50~230 nm, 50~220 nm, 50~210 nm, 50~200 nm, 50~190 nm, 50~180 nm, 50~170 nm, 50~160 nm, 50~150 nm, 50~140 nm, 50~130 nm, 50~120 nm, 50~110 nm, 50~100 nm, 50~90 nm, 50~80 nm, 50~70 nm, 50~60 nm, 60~300 nm, 60~290 nm, 60~280 nm, 60~270 nm, 60~260 nm, 60~250 nm, 60~240 nm, 60~230 nm, 60~220 nm, 60~210 nm, 60~200 nm, 60~190 nm, 60~180 nm, 60~170 nm, 60~160 nm, 60~150 nm, 60~140 nm, 60~130 nm, 60~120 nm, 60~110 nm, 60~100 nm, 60~90 nm, 60~80 nm, 60~70 nm, 70~300 nm, 70~290 nm, 70~280 nm, 70~270 nm, 70~260 nm, 70~250 nm, 70~240 nm, 70~230 nm, 70~220 nm, 70~210 nm, 70~200 nm, 70~190 nm, 70~180 nm, 70~170 nm, 70~160 nm, 70~150 nm, 70~140 nm, 70~130 nm, 70~120 nm, 70~110 nm, 70~100 nm, 70~90 nm, 70~80 nm, 80~300 nm, 80~290 nm, 80~280 nm, 80~270 nm, 80~260 nm, 80~250 nm, 80~240 nm, 80~230 nm, 80~220 nm, 80~210 nm, 80~200 nm, 80~190 nm, 80~180 nm, 80~170 nm, 80~160 nm, 80~150 nm, 80~140 nm, 80~130 nm, 80~120 nm, 80~110 nm, 80~100 nm, 80~90 nm, 90~300 nm, 90~290 nm, 90~280 nm, 90~270 nm, 90~260 nm, 90~250 nm, 90~240 nm, 90~230 nm, 90~220 nm, 90~210 nm, 90~200 nm, 90~190 nm, 90~180 nm, 90~170 nm, 90~160 nm, 90~150 nm, 90~140 nm, 90~130 nm, 90~120 nm, 90~110 nm, 90~100 nm, 100~300 nm, 110~290 nm, 120~280 nm, 130~270 nm, 140~260 nm, 150~250 nm, 160~240 nm, 170~230 nm, 180~220 nm, 또는 190~210 nm의 최장 치수를 갖는다.
특히 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 생산자 세포로부터의 엑소좀은 약 30~100 nm의 최장 치수를 갖는다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 생산자 세포로부터의 엑소좀은 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 생산자 세포로부터의 엑소좀은 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 엑소좀의 모집단은 엑소좀의 90%가 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 엑소좀의 모집단은 엑소좀의 95%가 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 엑소좀의 모집단은 엑소좀의 99%가 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 엑소좀의 모집단은 엑소좀의 90%가 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 엑소좀의 모집단은 엑소좀의 95%가 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 엑소좀의 모집단은 엑소좀의 99%가 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 엑소좀 또는 엑소좀 모집단의 크기는 하기에 기재된 방법에 따라 측정된다.
일부 구현예에서, 엑소좀은 생산자 세포에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 엑소좀의 막은 생산자 세포로부터 유래된 하나 이상의 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 세포 배양 시스템에서 생성되고, (예를 들어, 엑소좀을 생산자 세포로부터 분리함으로써) 단리된다. 분리는 침강에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 엑소좀은 0.5~2.0, 0.6~1.0, 0.7~1.0, 0.8~1.0, 0.9~1.0, 1.0~1.1, 1.1~1.2, 1.2~1.3, 1.4~1.5, 1.0~1.5, 1.5~2.0, 및 1.0~2.0 kg/m3의 비밀도를 가질 수 있다. 분리는 또한, 친화도 정제에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 세포외 소포는 세포외 소포를 포함하는 모집단을 수지에 결합시킴으로써 정제될 수 있으며, 상기 수지는 세포외 소포의 표면상의 하나 이상의 표적 단백질에 대해 특이적인 친화도를 갖는 복수의 리간드를 포함한다. 하나 이상의 표적 단백질은 테트라스파닌(예를 들어, CD63, CD81 및/또는 CD9), EWI 단백질/면역글로불린 슈퍼패밀리 일원(예를 들어, PTGFRN, IGSF8 및/또는 IGSF3), 인테그린(예를 들어, ITGB1 및/또는 ITGA4), ATP 수송체 단백질(예를 들어, ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3 및/또는 ATP2B4), SLC3A2, BSG, 또는 CD98hc일 수 있다. 표적 단백질은 추가로 엑소좀의 표면에 표시되는 면역조절 성분일 수 있다.
일부 구현예에서, 엑소좀 막은 내측 표면 및 외측 표면을 포함한다. 특정 구현예에서, 내측 표면은 엑소좀의 내부 코어를 향한다. 특정 구현예에서, 외측 표면은 엔도좀, 다중소포체, 또는 생산자 세포 또는 표적 세포의 막/세포질과 접촉할 수 있다.
일부 구현예에서, 엑소좀 막은 지질 및 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 엑소좀 막은 인지질, 당지질, 지방산, 스핑고지질, 포스포글리세라이드, 스테롤, 콜레스테롤, 및 포스파티딜세린을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 및 지방산은 표 1에 열거된 것들 중 하나 이상일 수 있다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 내부 전단지 및 외부 전단지로 구성된 지질 이중층을 포함한다. 내부 및 외부 전단지의 조성은 당해 분야에 알려진 트랜스바이어층 분포 분석에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어, Kuypers et al. Biohim Biophys Acta 1985 819:170을 참고한다. 일부 구현예에서, 외부 전단지의 조성물은 대략 70~90% 콜린 인지질, 대략 0~15% 산성 인지질, 및 대략 5~30% 포스파티딜에탄올아민이다. 일부 구현예에서, 내부 전단지의 조성물은 대략 15~40% 콜린 인지질, 대략 10~50% 산성 인지질, 및 대략 30~60% 포스파티딜에탄올아민이다.
일부 구현예에서, 엑소좀 막은 하나 이상의 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 스펙트린, 미오신-유사 폴리펩타이드, 밴드 3, SLC4A1, 액틴, 액틴-유사 폴리펩타이드, 글리세르알데하이드 3-P 탈수소효소(G3PD), 테트라스파닌(예를 들어, CD63, CD81 및/또는 CD9), Alix 및 TSG101, 인테그린(예를 들어, ITGB1 및/또는 ITGA4), 셀렉틴, CR1, TNFRI, 단백질분해 효소, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-연결된 단백질 또는 히스톤, EWI 단백질/면역글로불린 슈퍼패밀리 일원(예를 들어, PTGFRN, IGSF8 및/또는 IGSF3), ATP 수송체 단백질(예를 들어, ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3 및/또는 ATP2B4), SLC3A2, BSG, 또는 CD98hc를 비제한적으로 포함하는 하기 목록으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 표 2로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 엑소좀은 그의 표면에 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 하나 이상의 폴리펩타이드를 함유하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 생산자 세포는 하나 이상의 폴리펩타이드를 함유하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 생산자 세포는 자연적으로 하나 이상의 폴리펩타이드를 함유하고 이로부터 유래된 엑소좀은 또한 폴리펩타이드를 함유한다. 임의의 원하는 표면 마커의 수준은 (예를 들어, 복합체를 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드와 접촉시켜 복합체의 막에 삽입 또는 콘주게이션을 형성함으로써) 엑소좀 상에서 직접 변형될 수 있다. 대안적으로 또는 또한, 임의의 원하는 표면 마커의 수준은 (예를 들어, 복합체를 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드와 접촉시켜 복합체의 막에 삽입 또는 콘주게이션을 형성함으로써) 생산자 세포 상에서 직접 변형될 수 있다. 대안적으로, 외인성 핵산을 생산자 세포 내로 형질도입함으로써 생산자 세포를 변형시켜 원하는 표면 마커를 발현시킬 수 있다. 표면 마커는 이미 생산자 세포 상에 자연적으로 존재할 수 있으며, 이 경우 외인성 작제물은 생산자 세포 내에서 또는 상에서 마커 및 증가된 농도의 마커의 과발현을 초래할 수 있다. 대안적으로, 자연적으로 발현된 표면 마커는 (예를 들어, 생산자 세포에서 유전자 사일런싱을 유도함으로써) 생산자 세포로부터 제거될 수 있다. 폴리펩타이드는 엑소좀(예를 들어, 특정 표적화 능력, 전달 기능(예를 들어, 융합 분자), 효소적 기능, 생체내 반감기 증가 또는 감소 등에 상이한 기능성을 부여할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 CD47, CD55, CD49, CD40, CD133, CD59, 글리피칸-1, CD9, CD63, CD81, 인테그린, 셀렉틴, 렉틴, 및 카드헤린을 비제한적으로 포함한다.
특정 구현예에서, 엑소좀은 그들의 표면 상에 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 최근 엑소좀의 표면에서 풍부한 것으로 확인된 단백질 그룹으로부터 선택된다(하기에 상세히 기재됨:미국 특허 출원 62/550,543, 이는 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입됨). 이 폴리펩타이드 그룹은 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자(PTGFRN); 바시긴(BSG); 면역글로불린 슈퍼패밀리 일원 3(IGSF3); 면역글로불린 슈퍼패밀리 일원 8(IGSF8); 인테그린 베타-1(ITGB1); 인테그린 알파-4(ITGA4); 4F2 세포-표면 항원 중쇄(SLC3A2); 및 ATP 수송체 단백질의 부류(ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4))를 포함한다.
일부 구현예에서, 엑소좀 막은 글리칸과 같은 하나 이상의 다당류를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 엑소좀은 페이로드(치료제)를 표적에 전달한다. 페이로드는 엑소좀과 접촉하는 표적(예를 들어, 표적 세포)에 작용하는 치료제이다. 접촉은 시험관내에서 또는 대상체에서 발생할 수 있다. 엑소좀 및/또는 생산자 세포 내로 도입될 수 있는 페이로드는 치료제, 예컨대 뉴클레오타이드(예를 들어, 전사를 방해하는 검출가능한 분체 또는 독소를 포함하는 뉴클레오타이드), 핵산(예를 들어, 효소와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 mRNA 분자, 또는 조절 기능을 갖는 RNA 분자, 예컨대 miRNA, dsDNA, lncRNA 또는 siRNA), 아미노산(예를 들어, 번역을 방해하는 검출가능한 분체 또는 독소를 포함하는 아미노산), 폴리펩타이드(예를 들어, 효소), 지질, 탄수화물 및 소분자(예를 들어, 소분자 약물 및 독소)를 포함한다.
엑소좀은 막 융합을 통해 표적 세포와 상호작용하고, 표적 세포의 표면 또는 세포질에 엑소좀 조성물 중 페이로드(예를 들어, 치료제)를 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 막 융합은 표적 세포의 엑소좀과 원형질막 사이에서 일어난다. 다른 구현예에서, 막 융합은 표적 세포의 엑소좀과 엔도좀 막 사이에서 일어난다.
일부 구현예에서, 엑소좀은 리시버 폴리펩타이드를 포함한다. 리시버 폴리펩타이드는 합성일 수 있다. 일부 구현예에서, 리시버 폴리펩타이드는 생산자 세포(예를 들어, 리시버 폴리펩타이드를 암호화하는 외인성 핵산이 생산자 세포에 도입됨) 또는 생산자 세포 외부에서 제조된 재조합 리시버 폴리펩타이드(예를 들어,, 단백질 발현 시스템에 의해 합성됨)로 도입된다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 엑소좀이 생산자 세포로부터 단리된 후), 리시버 폴리펩타이드(예를 들어,, 재조합적으로 생산된 폴리펩타이드)는 엑소좀에 직접 도입된다. 일부 구현예에서, 리시버 폴리펩타이드는 엑소좀의 표면에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 리시버 폴리펩타이드는 엑소좀을 대상체의 순환계, 예컨대 혈액에서 순환하는 특정 표적(예를 들어, 표적, 예컨대 병원체, 대사물, 폴리펩타이드 복합체 또는 비-기능성 세포 또는 암 세포와 같은 세포) 또는 조직(예컨대, 이환 조직)내에 거주하는 표적을 표적화할 수 있다.
일부 구현예에서, 엑소좀은 합성이다. 예를 들어, 엑소좀은 페이로드, 예컨대 예를 들어, 치료적 폴리펩타이드, 핵산(예컨대, DNA 또는 RNA) 또는 다른 폴리뉴클레오타이드, 다당류 또는 글리칸, 지질 또는 지방산, 큰 생물학적 제제, 소분자 또는 독소를 포함하여, 엑소좀이 자연적으로 발생하지 않는다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 (예를 들어, 페이로드를 도입하거나 다른 방식으로, 예컨대 막의 단백질, 지질 또는 글리칸 함량을 변화시킴으로써 복합체의 함량을 변형시킴으로써) 변형된다. 예를 들어, 엑소좀은 먼저 생산자 세포로부터 단리된 다음 원하는대로 변형되어 합성 엑소좀을 생성한다. 일부 구현예에서, 생산자 세포는 변형된다. 예를 들어, 외인성 핵산, 외인성 폴리펩타이드 또는 소분자 또는 독소가 생산자 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 또한, 생산자 세포는 (예를 들어, 세포 또는 막 함량을 변형시킴으로써, 예컨대 세포막의 지질 또는 글리칸 함량을 변화시킴으로써) 달리 변형될 수 있다. 변형된 생산자 세포로부터 생성된 엑소좀은 하나 이상의 생산자 세포의 변형 중 하나 이상을 포함한다. 이 과정에서 합성 엑소좀이 생성된다. 일부 구현예에서, 생산자 세포 및 생산자 세포로부터 단리된 엑소좀 둘 모두는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다.
나노소포
다양한 구현예에서, 세포외 소포는 나노소포이다. 특정 구현예에서, 나노소포는 내부 공간을 둘러싸고, 조작없이 세포에 의해 나노소포가 생산되지 않도록 직접 또는 간접 조작에 의해 세포로부터 생성되는 막을 포함하는 세포-유래된 작은 소포이다. 세포의 적절한 조작은 연속 압출, 알칼리 용액으로의 처리, 초음파처리 또는 이들의 조합을 비제한적으로 포함하며, 일부 사례에서 생산자 세포의 파괴를 초래할 수 있다.
다양한 구현예에서, 나노소포는 약 20~250 nm, 예컨대 약 20~100 nm, 20~150 nm, 20~200 nm, 30~100 nm, 30~150 nm, 30~200 nm, 30~250 nm, 40~100 nm, 40~150 nm, 40~200 nm, 40~250 nm, 50~100 nm, 50~150 nm, 50~200 nm, 50~250 nm, 100~200 nm, 또는 150~250 nm의 최장 치수를 갖는다.
다양한 구현예에서, 나노소포는 생산자 세포로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 나노소포는 직접 또는 간접 조작에 의해 생산자 세포로부터 생성된다. 적절한 조작은 연속 압출, 알칼리 용액으로의 처리, 초음파처리 또는 이들의 조합을 비제한적으로 포함한다. 이들 구현예들 중 일부에서, 조작은 생산자 세포의 파괴를 초래할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 나노소포의 모집단은 원형질막으로부터의 직접적인 발아 또는 후기 엔도좀과 원형질막의 융합에 의해 생산자 세포로부터 유래된 소포가 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 나노소포는 그의 크기, 밀도, 생화학적 파라미터 또는 이들의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리된다. 특정 구현예에서, 단리는 침강에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 나노소포는 0.5~2.0, 0.6~1.0, 0.7~1.0, 0.8~1.0, 0.9~1.0, 1.0~1.1, 1.1~1.2, 1.2~1.3, 1.4~1.5, 1.0~1.5, 1.5~2.0, 및 1.0~2.0 kg/m3의 비밀도를 가질 수 있다.
다양한 구현예에서, 나노소포는 지질 또는 지방산 및 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 나노소포는 당을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 나노소포는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 나노소포는 리시버를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 나노소포는 페이로드를 추가로 포함한다. 이들 구현예들 중 일부에서, 페이로드는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자 및/또는 이들의 조합을 포함한다.
면역조절 성분
다양한 구현예에서, 본 조성물은 면역조절 성분을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 면역조절 화합물은 엑소좀 표면 단백질에 대한 번역 융합 단백질로서 발현되어, 상기 단백질이 엑소좀의 표면에 보유되는 단백질이다. 특정 구현예에서, 면역조절 화합물은 막 단백질이다. 특정 구현예에서, 면역조절 화합물은 가용성 단백질이다. 일부 구현예에서, 엑소좀 표면 단백질은 테트라스파닌(예를 들어, CD63, CD81, CD9), EWI 단백질/면역글로불린 슈퍼패밀리 일원(예를 들어, PTGFRN, IGSF8, IGSF3), 인테그린(예를 들어, ITGB1, ITGA4), ATP 수송체 단백질(예를 들어, ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), SLC3A2, BSG, 또는 CD98hc 또는 이의 단편 또는 변이체이다.
일부 구현예에서, 면역조절 화합물은 엑소좀 표면 단백질에 대한 번역 융합 단백질로서 발현되어 가용성 단백질이 엑소좀의 표면에 보유되는 가용성 단백질이다. 일부 구현예에서, 엑소좀 표면 단백질은 테트라스파닌(예를 들어, CD63, CD81, CD9), EWI 단백질/면역글로불린 슈퍼패밀리 일원(예를 들어, PTGFRN, IGSF8, IGSF3), 인테그린 (예를 들어, ITGB1, ITGA4), ATP 수송체 단백질(예를 들어, ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), SLC3A2, BSG, 또는 CD98hc 또는 이의 단편 또는 변이체이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 항종양 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 면역조절 성분은 선천적 면역 반응을 조절한다. 이들 구현예들 중 일부에서, 면역조절 성분은 자연 살해 세포를 표적으로 한다. 일부 다른 구현예에서, 면역조절 성분은 적응성 면역 반응을 조절한다. 이들 구현예들 중 일부에서, 면역조절 성분은 세포독성 T 세포를 표적으로 한다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 전장 형태로 생산자 세포에서 발현된다. 다른 구현예에서, 면역조절 성분은 엑소좀 표면 단백질에 대한 번역 융합 단백질로서 발현되며, 이는 엑소좀 표면에서 면역조절 화합물의 생물학적 활성 부분의 더 높은 수준의 발현을 초래한다. 일부 구현예에서, 면역조절 화합물은 엑소좀 표면 단백질에 대한 번역 융합 단백질로서 발현되어 가용성 단백질이 엑소좀의 표면에 보유되는 가용성 단백질이다. 일부 구현예에서, 엑소좀 표면 단백질은 테트라스파닌(예를 들어, CD63, CD81, CD9), EWI 단백질/면역글로불린 슈퍼패밀리 일원(예를 들어, PTGFRN, IGSF8, IGSF3), 인테그린(예를 들어, ITGB1, ITGA4), ATP 수송체 단백질(예를 들어, ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), SLC3A2, BSG, 또는 CD98hc 또는 이의 단편 또는 변이체이다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 음성 체크포인트 조절인자에 대한 억제제이다. 일부 구현예에서, 면역조절 성분은 음성 체크포인트 조절인자의 결합 파트너에 대한 억제제이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 세포독성 T-림프구-회합 단백질 4(CTLA-4)의 억제제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, CTLA-4 억제제는 CTLA-4의 단클론성 항체이다. 특정 구현예에서, 억제제는 CTLA-4의 단클론성 항체의 단편이다. 특정 구현예에서, 항체 단편은 CTLA-4의 단클론성 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, 또는 Fd이다. 특정 구현예에서, 억제제는 CTLA-4에 대한 나노바디, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체이다. 일부 특정 구현예에서, 단클론성 항체는 이필리무맙이다. 일부 특정 구현예에서, 단클론성 항체는 트레멜리무맙이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 프로그래밍된 세포사 단백질 1(PD-1)의 억제제이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 프로그래밍된 사멸-리간드 1(PD-L1)의 억제제이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 프로그래밍된 사멸-리간드 2(PD-L2)의 억제제이다. 일부 구현예에서, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2의 억제제는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2의 단클론성 항체이다. 특정 구현예에서, 억제제는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2의 단클론성 항체의 단편이다. 특정 구현예에서, 항체 단편은 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2의 단클론성 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, 또는 Fd이다. 특정 구현예에서, 억제제는 나노바디, 이중특이적 항체, 또는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2에 대한 다중특이적 항체이다. 일부 특정 구현예에서, 단클론성 항체는 니볼루맙이다. 일부 특정 구현예에서, 단클론성 항체는 펨브롤리주맙이다. 일부 특정 구현예에서, 단클론성 항체는 피딜리주맙이다. 일부 특정 구현예에서, 단클론성 항체는 아테졸리주맙이다. 일부 특정 구현예에서, 단클론성 항체는 아벨루맙이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 림프구-활성화 유전자 3(LAG3)의 억제제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, LAG3의 억제제는 LAG3의 단클론성 항체이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 T-세포 면역글로불린 뮤신-함유 단백질 3(TIM-3)의 억제제이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 B 및 T 림프구 감쇠기(BTLA)의 억제제이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT)의 억제제이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA)의 억제제이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 아데노신 A2a 수용체(A2aR)의 억제제이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR)의 억제제이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO)의 억제제이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 CD20, CD39 또는 CD73의 억제제이다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 양성 공통자극 분자에 대한 활성제이다. 일부 구현예에서, 면역조절 성분은 양성 공통자극 분자의 결합 파트너에 대한 활성제이다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원의 활성제이다. 특정 구현예에서, TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas 수용체, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK 수용체, TACI, BAFF 수용체, ATAR, CD271, CD269, GITR, TROY, CD358, TRAMP, 및 XEDAR. 일부 구현예에서, 면역조절 성분은 TNF 슈퍼패밀리 일원이다. 특정 구현예에서, TNF 슈퍼패밀리 일원은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드, 및 EDA-2.
일부 구현예에서, TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원의 활성제는 단량체성 단백질로서 발현된다. 일부 구현예에서, TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원의 활성제는 삼량체성 단백질로 발현된다. 일부 구현예에서, TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원은 단량체성 단백질로서 발현된다. 일부 구현예에서, TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원은 삼량체성 단백질로 발현된다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원 4(OX40)의 활성제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, OX40의 활성제는 OX40의 효능제 항체이다. 이들 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, OX40의 활성제는 OX40 리간드(OX40L)이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 CD27의 활성제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, CD27의 활성제는 CD27의 효능제 항체이다. 이들 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, CD27의 활성제는 CD27 리간드(CD27L)이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 CD40의 활성제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, CD40의 활성제는 CD40의 효능제 항체이다. 이들 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, CD40의 활성제는 CD40 리간드(CD40L)이다. 일부 구현예에서, CD40L은 단량체성 CD40L이다. 일부 구현예에서, CD40L은 삼량체성 CD40L이다.
일부 구현예에서, 삼량체 CD40L은 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, 삼량체 CD40L은 PTGFRN의 N-말단 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, 삼량체 CD40L은 PTGFRN에 대한 융합 단백질로서 발현되며, 여기서 폴리펩타이드는 서열번호:19 또는 서열번호:20의 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련된 단백질(GITR)의 활성제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, GITR의 활성제는 GITR의 효능제 항체이다. 이들 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, GITR의 활성제는 GITR의 천연 리간드이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 4-1BB의 활성제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 4-1BB의 활성제는 4-1BB의 효능제 항체이다. 이들 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, 4-1BB의 활성제는 4-1BB의 천연 리간드이다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 Fas 수용체(Fas)이다. 이들 구현예들 중 일부에서, Fas 수용체는 세포외 소포의 표면에 표시된다. 일부 다른 구현예에서, 면역조절 성분은 Fas 리간드(FasL)이다. 이들 구현예들 중 일부에서, Fas 리간드는 세포외 소포의 표면에 표시된다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 Fas 수용체의 항체이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 Fas 리간드의 항체이다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 CD28-슈퍼패밀리 공통자극 분자의 활성제이다. 특정 구현예에서, CD28-슈퍼패밀리 공통자극 분자는 ICOS 또는 CD28이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 ICOSL, CD80 또는 CD86이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 유도성 T 세포 공통자극인자(ICOS)의 활성제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, ICOS의 활성제는 ICOS의 효능제 항체이다. 이들 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, ICOS의 활성제는 ICOS 리간드(ICOSL)이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 CD28의 활성제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, CD28의 활성제는 CD28의 효능제 항체이다. 이들 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, CD28의 활성제는 CD28의 천연 리간드이다. 특정 구현예에서, CD28의 리간드는 CD80이다.
특정 구현예에서, 본 조성물은 음성 체크포인트 조절인자에 대한 억제제 또는 음성 체크포인트 조절인자의 결합 파트너에 대한 억제제 및 양성 공통자극 분자에 대한 활성제 또는 양성 공통자극 분자의 결합 파트너에 대한 활성제를 포함한다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 엑소좀 표면 단백질 또는 이의 단편에 번역적으로 융합된 가용성 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 인터류킨 2(IL-2)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 인터류킨 7(IL-7)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 인터류킨 12(IL-12)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 인터류킨 15(IL-15)이다.
특정 구현예에서, 사이토카인은 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-7은 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-7은 PTGFRN의 N-말단 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-7은 PTGFRN에 대한 융합 단백질로서 발현되며, 여기서 폴리펩타이드는 서열번호:1 또는 서열번호:2의 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 사이토카인은 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-12는 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-12는 PTGFRN의 N-말단 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-12는 PTGFRN에 대한 융합 단백질로서 발현되며, 여기서 폴리펩타이드는 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5 또는 서열번호:6의 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 사이토카인은 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 PTGFRN의 N-말단 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 PTGFRN에 대한 융합 단백질로서 발현되며, 여기서 폴리펩타이드는 서열번호:15 또는 서열번호:16의 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 사이토카인은 인터페론(IFN)이다. 특정 구현예에서, 인터페론은 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 특정 구현예에서, 인터페론은 인터페론 γ(IFNγ)이다. 일부 구현예에서, IFNγ는 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, IFNγ는 PTGFRN의 N-말단 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, IFNγ는 PTGFRN에 대한 융합 단백질로서 발현되며, 여기서 폴리펩타이드는 서열번호:7 또는 서열번호:8의 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 T-세포 수용체(TCR) 또는 이의 유도체이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 TCR α-사슬 또는 이의 유도체이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 TCR β-사슬 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 면역조절 성분은 T-세포의 공동-수용체 또는 이의 유도체이다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 종양 항원이다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 알파-태아단백(AFP), 암종배아 항원(CEA), 상피성 종양 항원(ETA), 뮤신 1(MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 티로시나제, 흑색종-관련된 항원(MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1), 프로그래밍된 사멸 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메소텔린, VEGFR, 알파-엽산 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원, MART-1 gp100, 및 TNF-관련된 세포자멸사-유도 리간드.
특정 구현예에서, 종양 항원은 암종배아 항원(CEA)이다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 상피성 종양 항원(ETA)이다.
특정 구현예에서, 종양 항원은 뮤신이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 뮤신은 분비된 뮤신이다. 이들 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, 뮤신은 막관통 뮤신이다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 뮤신 1(MUC1)이다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 Tn-MUC1이다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 뮤신 16(MUC16)이다.
특정 구현예에서, 종양 항원은 흑색종-연관된 항원(MAGE)이다. 이들 구현예들 중 일부에서, MAGE는 유형-I MAGE이다. 이들 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, MAGE는 유형-II MAGE이다. 특정 구현예에서, 유형-I MAGE는 MAGE-A2이다. 특정 구현예에서, 유형-I MAGE는 MAGE-A4이다.
특정 구현예에서, 종양 항원은 알파-태아단백(AFP)이다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 종양 단백질 p53(p53)이다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 티로시나제이다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 티로시나제-관련된 단백질(TRP)이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1) 또는 프로그래밍된 사멸 리간드 2(PD-L2)이다. 다양한 구현예에서, 종양 항원은 CD4, CD8, CD45, CD80, 및 CD86으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, CAR은 알파-태아단백(AFP), 암종배아 항원(CEA), 상피성 종양 항원(ETA), 뮤신 1(MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 티로시나제, 흑색종-연관된 항원(MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1), 프로그래밍된 사멸 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메소텔린, VEGFR, 알파-엽산 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원, MART-1 gp100, 및 TNF-관련된 세포자멸사-유도 리간드 중 하나 이상과 결합한다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 T-세포 수용체 또는 공동-수용체의 활성제이다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 CD3의 활성제이다. 특정 구현예에서, 활성제는 CD3의 단클론성 항체의 단편이다. 특정 구현예에서, 항체 단편은 CD3에 대한 단클론성 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, 또는 Fd이다. 특정 구현예에서, 활성제는 CD3에 대한 나노바디, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체 단편은 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체 단편은 PTGFRN의 N-말단 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체 단편은 PTGFRN에 대한 융합 단백질로서 발현되며, 여기서 폴리펩타이드는 서열번호:18 또는 서열번호:21의 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 면역조절 성분은 CD28의 활성제이다. 특정 구현예에서, 억제제는 CD28의 단클론성 항체의 단편이다. 특정 구현예에서, 항체 단편은 CD28의 단클론성 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, 또는 Fd이다. 특정 구현예에서, 억제제는 CD28에 대한 나노바디, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체이다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 주조직 적합성 복합체(MHC) 또는 이의 유도체이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 면역조절 성분은 MHC 부류 I 또는 이의 유도체이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 면역조절 성분은 MHC 부류 II 또는 이의 유도체이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 면역조절 성분은 MHC 부류 III 또는 이의 유도체이다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 인간 백혈구 항원(HLA) 또는 이의 유도체이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 면역조절 성분은 HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 이의 유도체이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 면역조절 성분은 HLA-E, HLA-F, HLA-G 또는 이의 유도체이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 면역조절 성분은 HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR 또는 이의 유도체이다.
다양한 구현예에서, 면역조절 성분은 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 다당류, 지질, 소분자 또는 독소일 수 있다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 단백질, 펩타이드, 당지질 또는 당단백질일 수 있다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 효능제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 효능제는 내인성 효능제, 예컨대 호르몬, 또는 신경전달물질이다. 이들 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, 효능제는 외인성 효능제, 예컨대 약물이다. 일부 구현예에서, 효능제는 물리적 효능제이며, 이는 수용체에 결합하지 않고 효능제 반응을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 효능제는 내인성 효능제보다 더 큰 최대 반응을 생성할 수 있는 슈퍼 효능제이다. 특정 구현예에서, 효능제는 수용체에서 전체 효능을 갖는 전체 효능제이다. 특정 다른 구현예에서, 효능제는 완전 효능제에 비해 수용체에서 부분적인 효능만을 갖는 부분적인 효능제이다. 일부 구현예에서, 효능제는 수용체의 구성적 활성을 억제할 수 있는 역효능제이다. 일부 구현예에서, 효능제는 수용체에 대한 효과를 생성하기 위해 다른 공동-효능제와 함께 작용하는 공동-효능제이다. 특정 구현예에서, 효능제는 공유 결합의 형성을 통해 수용체에 영구적으로 결합하는 비가역적 효능제이다. 특정 구현예에서, 효능제는 특정 유형의 수용체에 대한 선택적 효능제이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 길항제이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 길항제는 경쟁적 길항제이며, 이는 수용체를 활성화시키지 않고 내인성 리간드 또는 효능제와 동일한 결합 부위에서 수용체에 가역적으로 결합한다. 경쟁적 길항제는 최대 반응을 달성하는 데 필요한 효능제의 양에 영향을 줄 수 있다. 이들 구현예들 중 일부 다른 구현예에서, 길항제는 비-경쟁적 길항제이며, 이는 수용체의 활성 부위 또는 수용체의 알로스테릭 부위에 결합한다. 비-경쟁적 길항제는 임의의 양의 효능제에 의해 달성될 수 있는 최대 반응의 규모를 감소시킬 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 길항제는 비-경쟁적 길항제이며, 이는 별도의 알로스테릭 결합 부위에 결합하기 전에 효능제에 의한 수용체 활성화를 필요로 한다.
다양한 구현예에서, 면역조절 성분은 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다. 면역조절 성분은 전장 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은 천연 공급원으로부터 유래되거나, 부분적으로 또는 전체적으로 합성으로 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 단클론성 항체는 IgG 항체이다. 특정 구현예에서, 단클론성 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 일부 다른 구현예에서, 항체는 다클론성 항체이다. 특정 구현예에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, 및 Fd 단편으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 항원-결합 단편은 scFv 또는 (scFv)2 단편이다. 특정 다른 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 나노바디®(단일-도메인 항체)이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다.
다양한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 완전 인간이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 키메라 항체는 비-인간 V 영역 도메인 및 인간 C 영역 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 비-인간, 예컨대 쥣과 또는 수의과이다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 폴리뉴클레오타이드이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 mRNA, miRNA, siRNA, 안티센스 RNA, shRNA, lncRNA, 및 dsDNA를 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA(예를 들어, mRNA, miRNA, siRNA, 안티센스 RNA, shRNA, 또는 lncRNA)이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 폴리뉴클레오타이드가 mRNA인 경우, 이는 원하는 폴리펩타이드로 번역될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 마이크로RNA(miRNA) 또는 프리-miRNA 분자이다. 이들 구현예들 중 일부에서, miRNA는 표적 세포의 세포질로 전달되어, miRNA 분자는 표적 세포에서 천연 mRNA를 침묵시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 종양 유전자 또는 다른 조절곤란 폴리펩타이드의 발현을 방해할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)이다. 이들 구현예들 중 일부에서, siRNA는 표적 세포의 세포질로 전달되어, siRNA 분자는 표적 세포에서 천연 mRNA를 침묵시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 유전자 발현을 조절하고 질환을 제어할 수 있는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA로 전사될 수 있는 DNA이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 전사된 RNA는 원하는 폴리펩타이드로 번역될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 단백질, 펩타이드, 당지질 또는 당단백질이다.
다양한 구현예에서, 본 조성물은 원자, 분자 등의 혼합물, 융합, 조합 및 콘주게이트를 포함하는 상기 언급된 둘 이상의 면역조절 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 막과 연관되거나, 봉입된 용적의 상기 세포외 소포내에 봉입된, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 상이한 면역조절 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 조성물은 폴리펩타이드와 조합된 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 조성물은 서로 접합된 둘 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 조성물은 생물학적 활성 분자에 접합된 단백질을 포함한다. 이들 구현예들 중 일부에서, 생물학적 활성 분자는 전구약물이다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 막과 연관되거나, 봉입된 용적의 상기 세포외 소포내에 봉입된, 2개의 상이한 면역조절 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 2개의 상이한 면역조절 성분은 IL-12 및 CD40L이다. 일부 구현예에서, CD40L 및 IL-12는 각각 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, CD40L 및 IL-12는 각각 PTGFRN의 N-말단 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, CD40L 및 IL-12는 PTGFRN에 대한 융합 단백질로서 발현되며, 여기서 폴리펩타이드는 각각 서열번호:20 및 서열번호:3의 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 막과 연관되거나 봉입된 용적의 상기 세포외 소포내에 봉입된 3개의 상이한 면역조절 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 2개의 상이한 면역조절 성분은 IL-12, CD40L 및 FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L)이다. 일부 구현예에서, CD40L, IL-12 및 FLT3L 은 각각 PTGFRN 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, CD40L, IL-12 및 FLT3L은 각각 PTGFRN의 N-말단 또는 이의 단편에 융합된다. 일부 구현예에서, CD40L, IL-12 및 FLT3L은 PTGFRN에 대한 융합 단백질로서 발현되고, 여기서 폴리펩타이드는 각각 서열번호:20, 서열번호:3, 및 서열번호:22의 서열을 갖는다.
약제학적 조성물
약제학적 조성물은 일반적으로 대상체에게 투여하기에 적합한 형태의 복수의 세포외 소포 및 약제학적으로-허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다. 약제학적으로-허용가능한 부형제 또는 담체는 투여되는 특정 조성물 뿐만 아니라 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 복수의 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물의 다양한 적합한 제형이 존재한다. (하기 참고, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.21st ed(2005)). 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균 제형화되고, 미국 식품의약품국의 모든 우수의약품 제조 및 품질 관리 기준(GMP) 규정을 완전히 준수한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기재된 하나 이상의 치료제 및 세포외 소포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 소포는 하나 이상의 개별 치료제와 공동-투여되며, 여기서 공동-투여는 세포외 소포의 투여 전, 후에 또는 동시에 별도의 치료제의 투여를 포함한다.
약제학적으로-허용가능한 부형제는 수의적 용도뿐만 아니라 인간의 약제학적 용도로 허용가능한 부형제를 포함하여, 일반적으로 안전한, 무독성, 및 바람직한 부형제를 포함한다.
담체 또는 희석제의 예는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 비제한적으로 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 화합물의 사용은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 배지 또는 화합물이 본원에 기재된 세포외 소포와 양립할 수 없는 한, 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충 치료제가 또한 조성물에 포함될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 세포외 소포는 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 진피내, 경피, 직장, 두개내, 복강내, 비강내, 종양내, 근육내 경로 또는 흡입제로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물은 정맥내로, 예를 들어 주사로 투여된다. 세포외 소포는 임의로 세포외 소포가 의도되는 질환, 장애 또는 병태의 치료에 적어도 부분적으로 효과적인 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다.
용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 물, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균 화합물 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 산화방지제 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트 화합물 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충액 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성 조정을 위한 화합물, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 조성물은 일반적으로 용이한 주사능이 존재하는 정도로 멸균되고 유동적이다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 용매 또는 분산매, 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 분산물의 경우 필요한 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용하여 적절한 유체성을 유지할 수 있다. 미생물의 작용 예방은 다양한 항균 및 항진균성 화합물, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등으로 달성될 수 있다. 요망하는 경우, 등장성 화합물, 예를 들어, 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨이 조성물에 첨가될 수 있다. 주입가능한 조성물의 장기적인 흡수는 흡수를 지연시키는 화합물, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 초래될 수 있다.
멸균 주입가능 용액은 세포외 소포를 유효량으로 및 필요에 따라 본원에 열거된 성분의 하나 또는 조합으로 적절한 용매에 혼입함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 세포외 소포를 염기성 분산매 및 임의의 원하는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주입가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이는 활성 성분의 분말 및 이전에 이의 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 생성한다. 세포외 소포는 세포외 소포의 지속성 또는 맥동성 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다.
세포외 소포를 포함하는 조성물의 전신 투여는 또한 경점막 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 투여의 경우, 침투될 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 당 업계에 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어, 경점막 투여를 위한, 세제, 담즙산염, 및 후시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 예를 들어, 비강 스프레이를 사용하여 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적 조성물로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체에게 정맥내 투여된다. 특정 다른 구현예에서, 본 조성물은 림프계로, 예를 들어, 림프내 주사에 의해 또는 결절내 주사에 의해(참고, 예를 들어, Senti et al., PNAS 105(46):17908(2008)), 또는 근육내 주사에 의해, 피하 투여에 의해, 종양내 주사에 의해, 흉선 또는 간으로의 직접 주사에 의해, 투여된다.
특정 구현예에서, 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물은 액체 현탁액으로 투여된다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 투여 후 데포를 형성할 수 있는 제형으로서 투여된다. 특정 바람직한 구현예에서, 데포는 세포외 소포를 느리게 순환시키거나, 데포 형태로 남아있다.
전형적으로, 약제학적으로-허용가능한 조성물은 오염 물질이 없도록 고순도이며, 생체적합성이며, 독성이 없으며, 대상체에게 투여하기에 적합하다. 물이 담체의 구성성분인 경우, 물은 고순도이고, 예를 들어, 내독소가 없도록 처리된다.
약제학적으로-허용가능한 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 마이크로-결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘, 및/또는 광유일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 풍미 증강제, 유화제, 현탁화제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 본원에 기재된 세포외 소포 및 선택적으로 약제학적 활성제 또는 치료제를 포함한다. 치료제는 생물 제제, 소분자 제제 또는 핵산 제제일 수 있다.
본원에 기재된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 투약 형태가 제공된다. 일부 구현예에서, 투약 형태는 정맥내 주사를 위한 액체 현탁액으로서 제형화된다. 일부 구현예에서, 투약 형태는 종양내 주사를 위한 액체 현탁액으로서 제형화된다.
특정 구현예에서, 세포외 소포의 제조는 잔존 복제 가능 핵산을 손상시키기 위해 방사선, 예를 들어, X 선, 감마선, 베타 입자, 알파 입자, 중성자, 양성자, 원소 핵, 자외선에 노출된다.
특정 구현예에서, 세포외 소포의 제조는 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 초과 또는 100 kGy 초과의 조사량을 사용하여 감마 조사된다.
특정 구현예에서, 세포외 소포의 제조는 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 초과, 또는 10000 mSv 초과의 조사량을 사용하여 X-선 조사된다.
방법
본 개시내용의 양태는 또한 세포외 소포 및 면역조절 성분을 포함하는 조성물의 제조 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생산자 세포로부터 세포외 소포를 수득하는 단계로서, 생산자 세포가 면역조절 성분을 자연적으로 함유하는 단계; 및 수득된 세포외 소포를 선택적으로 단리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 면역조절 성분으로 생산자 세포를 변형시키는 단계; 상기 변형된 생산자 세포로부터 세포외 소포를 수득하는 단계; 및 상기 수득된 세포외 소포를 선택적으로 단리하는 단계를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 상기 방법은 생산자 세포로부터 세포외 소포를 수득하는 단계; 상기 수득된 세포외 소포를 단리하는 단계; 및 상기 단리된 세포외 소포를 면역조절 성분으로 변형시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 단리된 세포외 소포를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
세포외 소포 제조 방법
면역조절 성분으로 생산자 세포를 변형시키는 방법
다양한 구현예에서, 상기 방법은 생산자 세포를 면역조절 성분으로 변형시키는 단계를 포함한다.
생산자 세포는 포유동물 세포주, 식물 세포주, 곤충 세포주, 진균 세포주 또는 원핵 세포주일 수 있다. 특정 구현예에서, 생산자 세포는 포유동물 세포주이다. 포유동물 세포주는 인간 배아 신장(HEK) 세포주, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주, HT-1080 세포주, HeLa 세포주, PERC-6 세포주, CEVEC 세포주, 섬유아세포 세포주, 양수세포 세포주, 상피 세포주, 및 중간엽 줄기 세포(MSC) 세포주를 비제한적으로 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 포유동물 세포주는 HEK-293 세포, BJ 인간 포피 섬유아세포, fHDF 섬유아세포, AGE.HN® 뉴런 전구체 세포, CAP® 양수세포, 지방질 간엽 줄기 세포 또는 RPTEC/TERT1 세포일 수 있다. 생산자 세포는 또한 일차 세포일 수 있다. 다양한 구현예에서, 일차 세포는 일차 포유동물 세포, 일차 식물 세포, 일차 곤충 세포, 일차 진균 세포 또는 일차 원핵 세포일 수 있다.
특정 바람직한 구현예에서, 생산자 세포는 면역 세포, 예컨대 수지상 세포, T 세포, B 세포, 천연 살해 세포(NK 세포), 항원 제시 세포, 대식세포, T 헬퍼 세포, 또는 조절 T 세포(Treg 세포)이다.
다양한 구현예에서, 면역조절 성분은 형질감염, 바이러스 형질도입, 전기천공, 압출, 초음파처리, 세포 융합, 또는 당업계에서 숙련된 자에게 알려진 다른 방법에 의해 생산자 세포로 도입된 이식유전자 또는 mRNA로부터 생산자 세포에서 발현될 수 있다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 형질감염에 의해 생산자 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 면역조절 성분은 양이온성 지질 및 중합체와 같은 합성 거대분자를 사용하여 적합한 생산자 세포로 도입될 수 있다(Papapetrou et al., 유전자 요법 12:S118-S130(2005)). 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 전하 상호작용을 통해 면역조절 성분과 복합체를 형성한다. 이들 구현예들 중 일부에서, 양으로 하전된 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 결합하고, 세포내 이입에 의해 세포에 의해 흡수된다. 일부 다른 구현예에서, 양이온성 중합체를 사용하여 생산자 세포를 형질감염시킬 수 있다. 이들 구현예들 중 일부에서, 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)이다. 특정 구현예에서, 화학물질 예컨대 인산칼슘, 사이클로덱스트린, 또는 폴리브렌을 사용하여 면역조절 성분을 생산자 세포에 도입할 수 있다. 면역조절 성분은 또한 물리적 방법 예컨대 입자-매개된 형질감염, "유전자 건", 바이오리스틱, 또는 입자 폭격을 사용하여 생산자 세포에 도입될 수 있다(Papapetrou et al., 유전자 요법 12:S118-S130(2005)). 리포터 유전자 예컨대, 예를 들어, 베타-갈락토시다아제, 클로르암페니콜 아세틸전달효소, 루시퍼라제, 또는 녹색 형광 단백질을 사용하여 생산자 세포의 형질감염 효율을 평가할 수 있다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 바이러스 형질도입에 의해 생산자 세포에 도입된다. 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MMLV), 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스(AAV), 단순 포진 바이러스(HSV), 렌티바이러스, 및 스퓨마바이러스를 포함하는 다수의 바이러스가 유전자 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 바이러스 매개된 유전자 전달 비히클은 DNA 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스 및 헤르페스 바이러스에 기초한 벡터, 뿐만 아니라 레트로바이러스 기초 벡터를 포함한다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 전기천공에 의해 생산자 세포에 도입된다. 전기천공법은 세포막에 일시적인 기공을 형성하여, 다양한 분자가 세포로 도입되도록 한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 치료제뿐만 아니라 DNA 및 RNA는 전기천공에 의해 생산자 세포 내로 도입될 수 있다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 미세주입에 의해 생산자 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 유리 마이크로피펫을 사용하여 면역조절 성분을 현미경적 수준에서 생산자 세포 내로 주입할 수 있다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 압출에 의해 생산자 세포에 도입된다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 초음파처리에 의해 생산자 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 생산자 세포는 고강도 음파에 노출되어, 면역조절 성분의 장입을 허용하는 세포막의 일시적인 파괴를 유발한다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 세포 융합에 의해 생산자 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 면역조절 성분은 전기 세포 융합에 의해 도입된다. 일부 다른 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 생산자 세포를 융합시키기 위해 사용된다. 일부 다른 구현예에서, 센다이 바이러스는 생산자 세포를 융합시키기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 저삼투압 분해에 의해 생산자 세포로 도입된다. 이들 구현예들 중 일부에서, 생산자 세포는 낮은 이온 강도 완충액에 노출되어, 면역조절 성분의 장입을 허용하는 파열을 유발한다. 일부 대안적인 구현예에서, 저삼투압 용액에 대한 제어된 투석을 사용하여 생산자 세포를 팽윤시키고, 생산자 세포막에 기공을 생성시킨다. 생산자 세포는 후속으로 막의 재밀봉을 허용하는 조건에 노출된다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 세제 처리에 의해 생산자 세포에 도입된다. 특정 구현예에서, 생산자 세포는 면역조절 성분의 장입을 허용하는 기공을 생성함으로써 생산자 세포막을 일시적으로 손상시키는 중성 세제로 처리된다. 생산자 세포가 장입된 후, 세제는 세정되어 막을 재밀봉한다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 수용체 매개된 세포내이입에 의해 생산자 세포에 도입된다. 특정 구현예에서, 생산자 세포는 면역조절 성분의 결합시 수용체 및 연관된 면역조절 성분의 내재화를 유도하는 표면 수용체를 갖는다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 여과에 의해 생산자 세포에 도입된다. 특정 구현예에서, 생산자 세포 및 면역조절 성분은 생산자 세포 막의 일시적인 파괴를 유발하고 면역조절 성분이 생산자 세포로 들어가게 하는 생산자 세포보다 작은 기공 크기의 필터를 통해 강제될 수 있다.
일부 구현예에서, 생산자 세포는 여러 동결 해동 사이클에 적용되어, 면역조절 성분의 장입을 허용하는 세포막 파괴를 초래한다.
면역조절 성분으로 세포외 소포를 변형시키는 방법
다양한 대안적인 구현예에서, 면역조절 성분은 세포외 소포의 단리 후에 세포외 소포에 직접 도입된다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 형질감염에 의해 세포외 소포에 도입된다. 일부 구현예에서, 면역조절 성분은 양이온성 지질 및 중합체와 같은 합성 거대 분자를 사용하여 세포외 소포 내로 도입될 수 있다(Papapetrou et al., 유전자 요법 12:S118-S130(2005)). 특정 구현예에서, 화학물질 예컨대 인산칼슘, 사이클로덱스트린, 또는 폴리브렌을 사용하여 면역조절 성분을 세포외 소포에 도입할 수 있다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 전기천공에 의해 세포외 소포에 도입된다. 일부 구현예에서, 세포외 소포는 전기장에 노출되어 세포외 소포 막에 일시적인 홀을 유발하여 면역조절 성분의 장입을 허용한다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 미세주입에 의해 세포외 소포에 도입된다. 일부 구현예에서, 유리 마이크로피펫은 현미경적 수준에서 면역조절 성분을 세포외 소포에 직접 주사하는데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 압출에 의해 세포외 소포에 도입된다.
특정 구현예에서, 면역조절 성분은 초음파처리에 의해 세포외 소포에 도입된다. 일부 구현예에서, 세포외 소포는 고강도 음파에 노출되어, 세포외 소포 막의 일시적인 파괴를 일으켜 면역조절 성분의 장입을 허용한다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 세포외 소포의 표면에 접합될 수 있다. 콘주게이션은 당해 분야에 알려진 방법에 의해 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포외 소포는 화학적으로 접합된 면역조절 성분을 포함한다. 화학적 콘주게이션은 링커를 사용하거나 사용하지 않고 면역조절 성분을 또 다른 분자에 공유결합시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 콘주게이트의 형성은 당해 분야의 숙련가의 기술 내에 있으며, 콘주게이션을 달성하기 위한 다양한 기술이 공지되어 있으며, 특정 기술의 선택은 콘주게이트될 물질에 의해 유도된다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 세포외 소포에 콘주게이트된다. 특정 다른 구현예에서, 지질, 탄수화물, 핵산 및 소분자와 같은 비-폴리펩타이드가 세포외 소포에 콘주게이트된다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 저삼투압 분해에 의해 세포외 소포에 도입된다. 이들 구현예들 중 일부에서, 세포외 소포는 낮은 이온 강도 완충액에 노출되어 면역조절 성분의 장입을 허용하는 파괴를 초래한다. 일부 대안적인 구현예에서, 저삼투압 용액에 대한 제어된 투석을 사용하여 세포외 소포를 팽윤시키고, 세포외 소포 막에 기공을 생성시킨다. 세포외 소포는 후속으로 막의 재밀봉을 허용하는 조건에 노출된다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 세제 처리에 의해 세포외 소포에 도입된다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 면역조절 성분의 장입을 허용하는 기공을 생성함으로써 세포외 소포막을 일시적으로 손상시키는 중성 세제로 처리된다. 세포외 소포가 장입된 후, 세제는 세정되어 막을 재밀봉한다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 수용체 매개된 세포내이입에 의해 세포외 소포에 도입된다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 면역조절 성분의 결합시 수용체 및 연관된 면역조절 성분의 내재화를 유도하는 표면 수용체를 갖는다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 기계적 소성에 의해 세포외 소포에 도입된다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 금 미세담체와 같은 무거운 또는 하전된 입자에 부착된 면역조절 성분으로 충격을 받을 수 있다. 이들 구현예들 중 일부에서, 입자는 세포외 소포 막을 가로지르도록 기계적으로 또는 전기적으로 가속화될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역조절 성분은 여과에 의해 세포외 소포에 도입된다. 특정 구현예에서, 세포외 소포 및 면역조절 성분은 세포외 소포 막의 일시적인 파괴를 유발하고 면역조절 성분이 세포외 소포로 들어가게 하는, 세포외 소포보다 작은 기공 크기의 필터를 통해 강제될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포외 소포는 여러 동결 해동 사이클에 적용되어, 면역조절 성분의 장입을 허용하는 세포외 소포 막 파괴를 초래한다.
세포외 소포를 단리하는 방법
세포외 소포는 생산자 세포로부터 단리될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포외 소포는 생산자 세포에 의해 세포 배양 배지로 방출된다. 세포외 소포의 모든 공지된 단리 방법이 본원에서 사용하기에 적합한 것으로 고려된다. 예를 들어, 세포외 소포의 물리적 특성은 전하에 기초한 분리(예를 들어, 전기영동 분리), 크기에 기초한 분리(예를 들어, 여과, 분자 체질, 등), 밀도에 기초한 분리(예를 들어, 규칙적 또는 구배 원심분리), Svedberg 상수에 기초한 분리(예를 들어, 외부 힘에 의한 또는 외부힘 없는 침강, 등)를 포함하는, 배지 또는 다른 원료 물질로부터 분리하는데 이용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 단리는 하나 이상의 생물학적 특성에 기초할 수 있고, 표면 마커를 사용할 수 있는 방법을 포함한다(예를 들어, 침전을 위해, 고상에 대한 가역적 결합, FACS 분리, 특이적 리간드 결합, 비-특이적 리간드 결합, 친화도 정제 등).
단리 및 농축은 전형적으로 연속 원심분리를 포함하는, 일반적인 및 비-선택적인 방식으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 단리 및 농축은 세포외 소포 또는 생산자 세포-특이적 표면 마커를 사용하는 것과 같이 보다 구체적이고 선택적인 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 특정 표면 마커는 면역침강, FACS 분류, 친화도 정제 및 비드-결합된 리간드에 의한 자기 분리에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 세포외 소포를 단리하는데 이용될 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 기술은 당해 기술에 공지되어 있다. 예시적인 비제한적인 기술이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 공동 용적 분율은 단리되고 관심 세포외 소포를 포함한다. 또한, 일부 구현예에서, 세포외 소포는 당 업계에 일반적으로 알려진 바와 같이(하나 이상의 크로마토그래피 분획의) 원심분리 기술에 의해 크로마토그래피 분리 후 추가로 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 밀도 구배 원심분리는 세포외 소포를 추가로 단리하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 생산자 세포-유래된 세포외 소포를 다른 기원의 세포외 소포로부터 추가로 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 생산자 세포-유래된 세포외 소포는 생산자 세포에 특이적인 항원 항체를 사용하여 면역흡착 포획에 의해 비-생산자 세포-유래된 세포외 소포로부터 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포외 소포의 단리는 차별적인 원심분리, 크기-기반 막 여과, 면역침강, FACS 분류 및 자기 분리를 비제한적으로 포함하는 방법의 조합을 포함할 수 있다.
세포외 소포의 크기를 측정하는 방법
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 세포외 소포 및/또는 세포외 소포의 모집단의 크기를 측정하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 세포외 소포 크기는 가장 긴 측정가능한 치수로 측정된다. 일반적으로, 세포외 소포의 가장 긴 측정가능한 치수는 또한 그의 직경으로 지칭된다.
세포외 소포 크기는 동적 광 산란(DLS) 및/또는 다중각 광 산란(MALS)을 사용하여 측정될 수 있다. 세포외 소포의 크기를 측정하기 위해 DLS 및/또는 MALS를 사용하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있으며, 나노입자 추적 검정(NTA, 예를 들어, Malvern NanoSight NS300 나노입자 추적 디바이스를 사용함)을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 소포 크기는 Malvern NanoSight NS300을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포는 (예를 들어, Malvern NanoSight NS300을 사용하여) NTA에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포는 (예를 들어, Malvern NanoSight NS300을 사용하여) NTA에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 90%가 (예를 들어, Malvern NanoSight NS300을 사용하여) NTA에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 95%가 (예를 들어, Malvern NanoSight NS300을 사용하여) NTA에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 99%가 (예를 들어, Malvern NanoSight NS300을 사용하여) NTA에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 90%가 (예를 들어, Malvern NanoSight NS300을 사용하여) NTA에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 95%가 (예를 들어, Malvern NanoSight NS300을 사용하여) NTA에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 99%가 (예를 들어, Malvern NanoSight NS300을 사용하여) NTA에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다.
세포외 소포 크기는 조절가능한 저항성 펄스 감지(TRPS)를 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, TRPS에 의해 측정된 세포외 소포 크기는 iZON qNANO Gold를 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포는 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포는 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 90%가 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 95%가 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 99%가 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 90%가 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 95%가 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 99%가 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다.
세포외 소포 크기는 전자현미경검사를 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 소포 크기를 측정하는데 사용되는 전자현미경검사는 투과 전자현미경검사이다. 특정 구현예에서, 세포외 소포 크기를 측정하기 위해 사용된 투과 전자현미경은 Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN이다. 전자현미경을 사용하여 세포외 소포 크기를 측정하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 이러한 임의의 방법은 세포외 소포 크기를 측정하는데 적합할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포는 스캐닝 전자현미경(예를 들어, Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN 스캐닝 전자현미경)에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포는 스캐닝 전자현미경(예를 들어, Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN 스캐닝 전자현미경)에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 90%가 스캐닝 전자현미경(예를 들어, Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN 스캐닝 전자현미경)에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 95%가 스캐닝 전자현미경(예를 들어, Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN 스캐닝 전자현미경)에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 99%가 스캐닝 전자현미경(예를 들어, Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN 스캐닝 전자현미경)에 의해 측정된 바와 같이 약 20~300 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 90%가 스캐닝 전자현미경(예를 들어, Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN 스캐닝 전자현미경)에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 95%가 스캐닝 전자현미경(예를 들어, Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN 스캐닝 전자현미경)에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포외 소포 모집단은 세포외 소포의 99%가 스캐닝 전자현미경(예를 들어, Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN 스캐닝 전자현미경)에 의해 측정된 바와 같이 약 40~200 nm의 최장 치수를 갖는 모집단을 포함한다.
암, GvHD 및 자가면역 질환 치료 방법
또한, 대상체에서 암, 이식편 대 숙주-질환(GvHD) 및 자가면역 질환의 치료 방법이 본원에 제공된다.
다양한 구현예에서, 본 조성물은 암을 가진 대상체에게 투여된다. 이들 구현예들 중 일부에서, 본 조성물은 면역 반응을 상향-조절하고 대상체의 면역계의 종양 표적화를 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 치료되는 암은 백혈구(T-세포, B-세포, 대식세포, 수지상 세포, 단핵구)를 종양 미세환경 또는 소위 "고온 종양" 또는 "염증성 종양"으로 침윤시키는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 치료되는 암은 종양 미세환경 또는 소위 "차가운 종양" 또는 "비-염증성 종양"으로의 낮은 수준 또는 검출불가능한 수준의 백혈구 침윤을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 "차가운 종양"을 "고온 종양"으로 전환시키기에 충분한 양으로 및시간 동안 투여되며, 즉, 상기 투여는 백혈구(예컨대, T-세포)의 종양 미세환경으로의 침윤을 초래한다.
일부 구현예에서, 세포외 소포 및 면역조절 성분을 포함하는 조성물은 암 백신으로서 대상체에게 투여된다. 이들 구현예들 중 일부에서, 본 조성물은 개인화된 암 백신으로서 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 면역조절 성분은 종양 항원 또는 종양 항원으로부터 유래된 펩타이드이다. 적합한 종양 항원의 예는 하기를 포함한다: 알파-태아단백(AFP), 암종배아 항원(CEA), 상피성 종양 항원(ETA), 뮤신 1(MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 티로시나제, 흑색종-연관된 항원(MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1), 프로그래밍된 사멸 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메소텔린, VEGFR, 알파-엽산 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원, MART-1 gp100 및 TNF-관련된 세포자멸사-유도 리간드. 특정 구현예에서, 종양 항원은 참조 게놈 서열로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 종양 항원은 조성물을 받는 상기 대상체의 게놈 서열에서 유래된다.
조성물로 치료될 수 있는 암은 표 5에 열거된 암을 비제한적으로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 조성물은 이식편 대 숙주 질환(GvHD)을 갖는 대상체에게 투여된다. 이들 구현예들 중 일부에서, 조성물은 면역 반응을 하향-조절하고 GvHD의 증상을 경감시킬 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 본 조성물은 세포자멸적 신호전달의 활성화를 통해 GvHD의 증상을 완화시킨다. 특정 구현예에서, GvHD 치료용 조성물은 Fas 리간드(FasL)를 포함한다. 이들 구현예들 중 일부에서, FasL은 세포외 소포의 표면에서 발현된다.
다양한 구현예에서, 본 조성물은 자가면역 질환이 있는 대상체에게 투여된다. 이들 구현예들 중 일부에서, 조성물은 면역 반응을 하향-조절하고 대상체의 면역 활성을 억제할 수 있다.
자가면역 질환은 다발성 경화증, 말초 신경염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 관절염, 탈모증, 자가면역 췌장염, 베체트병, 수포성 유천포창, 소아지방변증, 데빅병(시신경척수염), 사구체신염, IgA 신병증, 여러 가지의 혈관염, 경피증, 당뇨병, 동맥염, 백반증, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군, 건선, 포도막염, 및 전신 홍반성 루푸스를 비제한적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 대상체의 순환계에 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 적합한 액체에 주입되고 대상체의 정맥에 투여된다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 대상체의 순환계에 동맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 적합한 액체에 주입되고 대상체의 동맥에 투여된다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 척추강내 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 뇌척수액(CSF)에 도달하도록 척추관 또는 지주막 하 공간으로의 주사를 통해 투여된다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 대상체의 하나 이상의 종양으로 종양내 투여된다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 비강내 투여에 의해 상기 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 국소 투여 또는 전신 투여 형태로 코를 통해 주입될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 조성물은 비강 스프레이로서 투여된다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 복강내 투여에 의해 상기 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 적합한 액체에 주입되고 대상체의 복막 내로 주사된다. 일부 구현예에서, 상기 복강내 투여는 림프에 조성물(예를 들어, 조성물 중의 세포외 소포)의 분포를 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 복강내 투여는 흉선, 비장 및/또는 골수에 조성물(예를 들어, 조성물 중의 세포외 소포)의 분포를 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 복강내 투여는 하나 이상의 림프절에 조성물(예를 들어, 조성물 중의 세포외 소포)의 분포를 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 복강내 투여는 자궁경부 림프절, 서혜 림프절, 종격 림프절, 또는 흉골 림프절 중 하나 이상에 조성물(예를 들어, 조성물 중의 세포외 소포)의 분포를 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 복강내 투여는 췌장에 조성물(예를 들어, 조성물 중의 세포외 소포)의 분포를 초래한다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 눈주위 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 눈 주위 조직으로 주입된다. 눈주위 약물 투여에는 결막하 경로, 전측 하위-테논(Tenon), 후측 하위-테논, 및 안구뒤 투여가 포함된다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 다중 투여 경로에 의해 동일한 대상체로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 다중 투여 경로는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 척추강내 투여, 비강내 투여, 종양내 투여, 복강내 투여 및/또는 눈주위 투여를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 다중 투여 경로는 정맥내 투여 및 복강내 투여를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포외 소포의 투약량은 1ng 내지 10 ng, 10 ng 내지 100 ng, 100 ng 내지 1 μg, 1 μg 내지 5 μg, 5 μg 내지 10 μg, 10 μg 내지 50 μg, 50 μg 내지 75 μg, 75 μg 내지 100 μg, 100 μg 내지 150 μg, 150 μg 내지 200 μg, 200 μg 내지 300 μg, 300 μg 내지 500 μg, 500 μg 내지 1 mg, 또는 1mg 내지 10 mg이다.
조성물은 상기 대상체에게 1회 투여될 수 있다. 대안적으로, 일정 기간에 걸쳐 다중 투여가 수행될 수 있다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 투여가 상기 대상체에게 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 필요에 따라, 예를 들어, 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상이 지속되는 한, 투여가 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 반복된 투여는 대상체의 나머지 생애 동안 지시될 수 있다. 치료 기간은 다양할 수 있으며 예를 들어, 1년, 6개월, 3개월, 2개월, 1개월, 2주, 1주, 3일, 2일 또는 1일 이하일 수 있다.
특정 구현예에서, 세포외 소포의 용량은 1일 1회, 격일로, 매주 1회, 매주 2회, 매월 1회 또는 매월 2회와 같은 간격으로 투여된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 표적 세포 또는 조직에서 면역조절 성분의 농도를 질환, 장애 또는 병태의 증상과 연관된 수준 이상으로 효과적으로 증가시키기에 충분한 빈도로 투여된다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 질환, 장애 또는 병태가 치료되거나 이의 증상이 개선되도록 치료 기간에 걸쳐 적어도 2회 투여된다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 질환, 장애 또는 병태가 치료되거나 이의 증상이 예방되도록 치료 기간에 걸쳐 적어도 2회 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 치료 기간 동안 충분한 양의 면역조절 성분이 표적 세포 또는 조직으로 전달되도록 치료 기간 동안 충분한 횟수로 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 치료 기간 동안 충분한 양의 면역조절 성분이 치료 기간 동안 표적 세포 또는 조직으로 전달되어 질환, 장애 또는 병태가 예방, 감소, 개선 또는 지연되도록 치료 기간 동안 충분한 횟수로 투여된다. 일부 구현예에서, 표적 세포 또는 조직에서 면역조절 성분 농도를 증가시키는 것은 피크 농도를 증가시키는 것을 포함하고, 다른 경우에는 평균 농도를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 기간 동안의 실질적인 증가는 대상체의 전처리 또는 후-치료 기간을 비교하거나, 치료를 받는 모집단에서 이루어진 측정치를 매칭되고 처리되지 않은 대조군 모집단과 비교함으로써 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 치료 기간 당 충분한 횟수로 투여되어 표적 세포 또는 조직에서 면역조절 성분의 농도가 적어도 약 1주일, 2주일, 3주일, 4주일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 6개월 이상 동안 증가된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 치료 기간마다 충분한 횟수로 투여되어 표적 세포 또는 조직에서 면역조절 성분의 농도가 적어도 치료 기간 동안 지속되는시간 동안 증가된다.
일부 구현예에서, 치료 기간 내의 반복 투여 사이의 시간 간격은 순환하는 세포외 소포의 수가 투여된 약제학적 조성물 내에 존재하는 세포외 소포 수의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 미만으로 감소되는 기간보다 길지 않다.
일부 구현예에서, 방법은 치료제를 보유한 적합한 치료 용량의 세포외 소포의 주사 전에 단일 용량 또는 다중 용량의 비-치료적 세포외 소포를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 비-치료적 세포외 소포는 치료적 세포외 소포와 별도로 및 상이한 투약량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 비-치료적 세포외 소포의 투약량은 치료적 세포외 소포의 투약량보다 많다. 특정 다른 구현예에서, 비-치료적 세포외 소포의 투약량은 치료적 세포외 소포의 투약량보다 더 적다. 특정 구현예에서, 비-치료적 세포외 소포의 투약량은 치료적 세포외 소포와 동일하다. 다양한 구현예에서, 적합한 용량의 치료 세포외 소포의 주사 전에 비-치료적 세포외 소포의 방법은 간, 폐 및/또는 비장에서 치료 세포외 소포의 업데이트를 감소시킨다.
유효량의 조성물은 표적 조직, 표적 세포 유형, 투여 수단, 세포외 소포의 물리적 특성(예를 들어, 크기 및 일부 경우에 전달되는 분자의 범위) 및 기타 결정인자에 적어도 부분적으로 기초하여 제공된다. 일반적으로, 유효량의 조성물은 표적 세포의 효율적인 세포 반응을 제공한다. 상승된 효율은 증가된 세포 형질감염(즉, 세포외 소포 구성성분으로 형질감염된 세포의 백분율), 숙주 대상체의 증가된 세포 반응 또는 감소된 선천적 면역 반응에 의해 입증될 수 있다.
세포외 소포 및 이의 약제학적 조성물의 투약량 및 투여 빈도는 예를 들어, 질환의 중증도, 환자의 연령, 성별 및 식이, 염증의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상 인자와 같은 다양한 인자에 기초하여 주치의에 의해 결정될 수 있다. 한 예에서, 정맥내 투여는 최소로 효과적인 용량으로 개시되고, 긍정적 효과가 관측될 때까지 미리-선택된 시간 경과에 따라 용량이 증가된다. 결과적으로, 투약량의 증분적 증가는 나타날 수 있는 임의의 부작용을 고려하면서 상응하는 효과 증가를 생성하는 수준으로 제한된다.
실시예
하기 실시예는 당해 분야의 숙련가에게 본 발명을 제조 및 사용하는 방법에 대한 완전한 개시내용 및 설명을 제공하기 위해 제공되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 한정하고자 하는 것도, 아래 실험이 모두 또는 유일한 실험이 수행됨을 나타내고자 하는 것이 아니다. 사용된 수(예를 들어, 양, 온도, 등)와 연관하여 정확도를 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오차 및 편차를 고려해야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부분은 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 부근이다. 표준 약어, 예를 들어, bp, 염기쌍(s); kb, 킬로베이스(들); pl, 피코리터(s); s 또는 sec, 초(s); min, 분(들); h 또는 hr, 시간(s); aa, 아미노산(들); nt, 뉴클레오타이드(들); 등이 사용될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 당해 분야의 기술내에서 통상적인 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학적 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어 하기를 참고한다: T.E.Creighton, 단백질:구조 및 분자 특성들(W.H.Freeman and Company, 1993); A.L.Lehninger, 생화학(Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., 분자 클로닝:A Laboratory Manual(2nd Edition, 1989); 효소학에서의 방법(S.Colowick and N.Kaplan eds., Academic Press, Inc.);Remington's Pharmaceutical Sciences, 21th Edition(Easton, Pennsylvania:Mack Publishing Company, 2005); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed.(Plenum Press) Vols A and B(1992).
방법
엑소좀 정제
조건화된 배양 배지를 수집하고 실온에서 5분 동안 300 ~ 800 x g에서 원심분리하여 세포와 큰 잔해를 제거했다. 이어서, 배지 상청액에 1000 U/L 벤조나제®를 보충하고 수조에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 상청액을 수집하고 4 ℃에서 30분 동안 16,000 x g에서 원심분리하여 잔존 세포 잔해 및 다른 큰 오염물질을 제거하였다. 이어서, 상청액을 133,900 x g에서 3시간 동안 4 ℃에서 초원심분리하여 엑소좀을 펠릿화하였다. 상청액을 버리고, 튜브의 최하부로부터 임의의 잔존 매질을 흡인했다. 펠릿을 200 ~ 1000 μL PBS(-Ca-Mg)에 재현탁시켰다.
엑소좀 집단을 추가로 풍부하게 하기 위해, 펠릿을 밀도 구배 정제(수크로스 또는 Optiprep™)를 통해 처리하였다. 자당 구배 정제를 위해, 엑소좀 펠릿을 하기 표 6에 정의된 바와 같이 자당 구배의 상부에 층을 이루었다:
Figure pct00001
SW 41 Ti 로터에 배치된 12 mL 울트라-클리어(344059) 튜브에서 4 ℃에서 16시간 동안 200,000 x g로 구배를 회전시켜 엑소좀 분획을 분리하였다.
엑소좀 층을 최상 층으로부터 조심스럽게 제거하고 38.5 mL 울트라-클리어(344058) 튜브에서 약 32.5 mL PBS로 희석하고 4 ℃에서 3시간 동안 133,900 x g에서 다시 한번 초원심분리하여 정제된 엑소좀을 펠릿화하였다. 생성된 펠릿을 최소 용적의 PBS(약 200 μL)에 재현탁시키고 4 ℃에서 저장하였다.
Optiprep™ 구배의 경우, SW 41 Ti 로터용 12 mL 울트라-클리어(344059) 튜브에서 동일한 용적의 10%, 30% 및 45% Optiprep로 3-tier 멸균 구배를 제조하였다. 펠릿을 Optiprep™ 구배에 첨가하고, 4 ℃에서 16시간 동안 200,000 x g에서 초원심분리하여 엑소좀 분획을 분리하였다. 이어서, 엑소좀 층을 튜브의 최상부 약 3 mL로부터 조심스럽게 수집하였다.
엑소좀 분획을 38.5mL 울트라-클리어(344058) 튜브에서 약 32 mL PBS로 희석하고, 4 ℃에서 3시간 동안 133,900 xg에서 초원심분리하여 정제된 엑소좀을 펠릿화하였다. 펠릿화된 엑소좀을 이어서 최소 용적의 PBS(약 200 μL)에 재현탁시키고, 4 ℃에서 저장하였다.
실시예 1:면역 관문 조절인자 항체를 표시하기 위한 엑소좀 조작
인간 배아 신장(HEK) 세포주는 고밀도로 성장하고, 생성된 엑소좀은 당해 분야의 숙련가에게 알려진 방법(예를 들어, 본원에 기재된 방법)에 따라 배양 배지로부터 단리된다. 세포독성 T-림프구-회합된 단백질 4(CTLA-4) 항체로 조작된 엑소좀은 당해 분야에 알려진 기술에 따라 화학적 콘주게이션에 의해 제조된다. CTLA4 항체로 변형된 엑소좀은 유세포측정에 의해 선택된다. 동시에, 변형되지 않은 엑소좀은 동일한 표준 방법에 따라 단리된다.
2개의 엑소좀 모집단은 방사성 추적자로 표지되고, 150 μg의 각 제제가 생 마우스(예를 들어 흑색종의 마우스 모델)에 주입된다. CTLA-4 항체를 표시하는 엑소좀 또는 변형되지 않은 엑소좀을 수용하는 마우스는 30분 동안 연속적으로, 그리고 다시 전체 동물 PET/CT에 의해 4시간 간격으로 모니터링된다. 전체-동물 이미지형성을 통해 다양한 조직에 대한 표지된 엑소좀의 실시간 고해상도 추적이 가능하다.
각각의 엑소좀 모집단의 150 μg을 방사성 추적자로 먼저 표지하지 않고 2개의 마우스 코호트에 정맥 내로 주입한다. 투여 후 5주 후에 마우스를 안락사시킨다. 면역조직화학 및 실시간 PCR에 의해 종양 샘플을 수집하고 분석하였다.
실시예 2:Fas 리간드를 표시하기 위한 엑소좀 조작
인간 항원-제시 세포는 퓨로마이신-내성 선별 마커 및 Fas 리간드를 암호화하는 플라스미드로 형질감염된다. 형질감염된 세포를 퓨로마이신으로 처리하고, 내성 콜로니를 선택하고 유세포측정에 의해 Fas 리간드의 표면 발현에 대해 분석한다. 안정한 Fas 리간드-발현 세포는 고농도로 성장하고, 생성된 엑소좀은 당해 분야의 숙련가에게 알려진 방법(예를 들어, 본원에 기재된 방법)에 따라 배양 배지로부터 단리된다. 동시에, 형질감염되지 않은 생산자 세포가 배양되고, 생성된 엑소좀은 동일한 표준 방법에 따라 단리된다.
2개의 엑소좀 모집단은 방사성 추적자로 표지되고, 150 μg의 각각의 제제가 생 마우스(예를 들어, GvHD의 마우스 모델)에 주입된다. 비변형된 세포로부터 유래된 엑소좀 또는 Fas 리간드-발현 세포로부터 유래된 엑소좀을 수용하는 마우스는 30분 동안 계속해서, 그리고 다시 전체-동물 PET/CT에 의해 4시간 간격으로 모니터링된다. 전체-동물 이미지형성을 통해 다양한 조직에 대한 표지된 엑소좀의 실시간 고해상도 추적이 가능하다.
비변형된 생산자 세포 및 Fas 리간드를 발현하도록 조작된 생산자 세포로부터의 정제된 엑소좀 모집단은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 정제된다. 각각의 엑소좀 모집단 150 μg을 먼저 방사성 추적자로 표지하지 않고 2개의 마우스 집단에 주입한다. 면역조직화학 분석 및 실시간 PCR을 위해 투여 후 3 내지 5주에 두 집단의 동물을 안락사시킨다.
실시예 3:복강내 투여 후 엑소좀의 림프 흡수
생체내에서 정제된 엑소좀의 체내분포를 확인하기 위해, 하기 실험을 수행했다:
293T 세포의 컨디셔닝된 배양 배지를 수집하고, 실온에서 5분 동안 300 ~ 800 x g에서 원심분리하여 세포와 큰 잔해를 제거했다. 이어서, 배지 상청액에 1000 U/L 벤조나제®를 보충하고 수조에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 상청액을 수집하고 4℃에서 30분 동안 16,000 x g에서 원심분리하여 잔존 세포 잔해 및 다른 큰 오염물질을 제거하였다. 이어서, 상청액을 133,900 x g에서 3시간 동안 4℃에서 초원심분리하여 엑소좀을 펠릿화하였다. 상청액을 버리고 잔존 매질을 튜브의 최하부로부터 흡입시켰다. 그런 다음 펠릿을 200 ~ 1000 μL PBS(-Ca-Mg)에 재현탁했다.
엑소좀 모집단을 추가로 풍부하게 하기 위해, 펠릿을 표 6에 정의된 바와 같이 수크로스 밀도 구배 정제를 통해 처리하였다.
SW 41 Ti 로터에 배치된 12 mL 울트라-클리어(344059) 튜브에서 4℃에서 16시간 동안 200,000 x g로 구배를 회전시켜 엑소좀 분획을 분리하였다.
엑소좀 층을 최상 층으로부터 조심스럽게 제거하고 38.5 mL 울트라-클리어(344058) 튜브에서 약 32.5 mL PBS로 희석하고 4℃에서 3시간 동안 133,900 x g에서 다시한번 초원심분리하여 정제된 엑소좀을 펠릿화하였다. 생성된 펠릿을 최소 용적의 PBS(약 200 μL)에 재현탁시키고 4℃에서 저장하였다.
생체내 이미지형성을 위한 정제된 엑소좀을 방사성 표지하기 위해, 100 μL의 1x1011 정제된 엑소좀을 HEPES(200 μL, 0.1M, pH 8.5)로 희석하고 p-SCN-Bn-DFO(5 μg)에 37℃에서 1시간 동안 콘주게이팅하고, 이어서 4℃에서 별도로 밤새 인큐베이션하였다. DFO-엑소좀을 HEPES(100 μL, 1M, pH 7.3)에 희석된 89Zr(7.5mCi)과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, qEv 칼럼에서 정제하였다. 이는 100 μCi/1x1010 엑소좀에서 총 수율(최대 0.8 mL PBS 중 0.4 mCi의 89Zr-DFO-엑소좀)을 초래하였다. > 95% RCP를 보장하기 위해 방출 전에 품질관리(HPLC)를 수행하였다.
시험관내 안정성
엑소좀(20 μCi/2x1010)을 실온에서 하기에서 인큐베이션하였다:
a. 제형 완충액
b. 마우스 혈청(가능한 경우 혈청내 10% v/v 엑소좀 용액)
인큐베이션 개시 2시간 후 HPLC에 용액을 주입하여 추적자의 안정성을 결정하였다.
생체내 이미지형성
마우스(SKH-1, n=8, 5~8주령)를 2개의 그룹으로 무작위 추출하고, 1x1010/g 엑소좀으로 칭량하고 주입하여(첫 번째 그룹의 동적 스캔이 끝난 직후에 두 번째 그룹을 주입함) 100 μCi/마우스의 최소 방사성 용량을 제공한다. 그룹 1은 정맥내로(IV) 주입하고 그룹 2는 복강내로(IP) 주입하였다.
마우스는 하기 스케줄을 사용하여 4-마우스 호텔에서 전신 PET/CT 스캔을 받는다. 1시간 동적(5x60, 5x180, 8x300초) 및 4시간(20분), 24시간(목요일, 20분) 및 48시간(금요일, 30분)에 정적 이미지형성.해부학적 참조를 위해 각각의 이미지형성 시점에 CT가 이어졌다.
마지막 이미지형성 시점 후, 마우스를 안락사시키고, 하기 기관을 수집하고, 칭량하고 감마 계수기에서 카운트하였다:혈액, 폐(1), 간(엽), 비장, 췌장, 신장(1), 간, 결장 및 추가의 고흡수 기관.
계수가 극도로 높고 다시 카운트되면 기관은 2~3일 동안 붕괴될 수 있었다.
Figure pct00002
결과
처리된 마우스의 2개의 집단을 처리 후 4시간, 24시간 및 48시간에 이미지화하였다. 전신 PET/CT 이미지형성은 그룹 1 처리 IV에서 모든 마우스의 간으로의 강력한 전달(도 1a) 및 그룹 2 처리 IP에서 마우스에 대한 뚜렷한 비-중첩 분포를 나타냈다(도 1b). 기관을 해부하고 방사선사진 감마 계수기로 분석하여, IV로 처리된 마우스에서 상당한 간 및 비장 흡수를 나타냈다(도 2). 대조적으로, IP로 처리된 마우스의 경우, 간 및 난소에서 추가의 흡수와 함께 췌장, 비장, 흉선 및 림프절에서 주로 흡수가 관찰되었다. 이들 결과는 상이한 투여 경로가 실질적으로 상이한 체내분포 프로파일을 초래한다는 것을 입증한다. 중요하게는, IP 투여는 림프구에서 상당한 흡수를 유도하여, IP 투여가 면역 세포에 도달하기에 적합한 투여 경로일 수 있음을 시사한다.
실시예 4:조작된 CD40L 엑소좀에 의한 B-세포 활성화
CD40L은 주로 T-세포상에서 발현되는 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리의 구성원이다. CD40L 수용체, CD40은 대식세포, 수지상 세포 및 B-세포를 포함하는 항원 제시 세포에서 발현된다. CD40을 통한 신호전달은 B-세포를 활성화시키고 항원-특이적 반응을 유도한다. CD40 경로를 활성화시키는 것은 광범위한 종양 유형에서 항종양 면역의 발달에 영향을 미친다. 특이적 면역 효과를 유도하기 위해, 조작된 엑소좀이 생성될 수 있는지를 결정하기 위해, 전장 인간 CD40L을 함유하는 플라스미드로 형질감염된 HEK293SF 세포로부터 엑소좀을 생성하였다. 형질감염된 세포를 퓨로마이신 선택하에두고 내성 세포 모집단을 고밀도로 성장시켰다. 생성된 엑소좀을 컨디셔닝된 배양 배지로부터 수집하고 상기한 바와 같이 Optiprep™ 구배로 정제하였다. 비변형된 HEK293SF 세포로부터의 엑소좀을 또한 단리하여 대조군으로서 사용하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 96-웰 플레이트의 웰당 150,000 세포로 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 정제된 CD40L 엑소좀 또는 천연 엑소좀과 함께 인큐베이션하였다. PBMC의 하나의 샘플을 양성 대조군으로서 1 μg/mL의 가용성 재조합 CD40L-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 도 3a 및 3b에 도시된 바와 같이, CD40L 엑소좀은 2개의 상이한 공여체 샘플에서 CD69 발현에 의해 측정된 바와 같이, 용량-의존적 방식으로 B-세포를 활성화시켰다. 천연 엑소좀은 B-세포 활성화를 유도하지 못했다. 중요하게는, CD40L 엑소좀에 의한 B-세포 활성화 수준은 CD40L-Fc에 의해 야기된 활성화와 유사하였다.
관측된 엑소좀-매개된 B-세포 활성화가 B-세포의 직접적인 활성화에 의한 것인지 또는 트랜스-작용 면역 세포를 통한 것인지의 여부를 결정하기 위해, 정제된 인간 B-세포를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 50,000개의 정제된 인간 B-세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 CD40L 엑소좀, 천연 엑소좀 또는 CD40L-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 고농도 CD40L 엑소좀의 하나의 샘플을 냉동-해동 사이클(CD40L-EVs [F/T])을 통해 놓고, B-세포 활성화에 대해서도 시험하였다. 도 4a 및 4b에 도시된 바와 같이, CD40L 엑소좀은 CD40L-Fc와 유사한 정도로 2개의 공여체로부터 정제된 B-세포를 활성화시켰다. 천연 엑소좀은 B-세포를 활성화시키는데 실패한 반면, CD40L 엑소좀 냉동-해동 샘플은 B-세포를 성공적으로 활성화시켰으며, 이는 CD40L 엑소좀의 효과가 B-세포를 통해 직접 매개되고, CD40L의 존재가 B-세포 활성화에 충분하다는 것을 나타낸다. 또한, 조작된 엑소좀은 적어도 하나의 냉동-해동 사이클 동안 안정하고 활성을 유지한다.
CD40L 엑소좀을 추가로 검증하기 위해, 리포터 시스템을 사용하여 조작된 엑소좀의 활성을 측정하였다. CD40 경로의 활성화는 NF-κB의 활성화를 초래한다. 표면에 CD40을 과발현하도록 조작되고 NF-κB 프로모터(Promega Corporation)의 다운스트림에 루시퍼라제 리포터를 함유하도록 조작된 변형된 U2OS 세포주를 사용하여, 항-Fc 항체(Jackson ImmunoResearch, Inc.)와 가교결합된 효능적 항-CD40 항체(BioLegend, Inc.) 또는 항-IgG 항체(Jackson ImmunoResearch, Inc.)와 가교결합된 재조합 인간 CD40L(ACROBiosystems)의 존재 하에서 세포를 인큐베이션함으로써 CD40 활성화를 확인하였다(도 5a 및 5b). CD40L 조작된 엑소좀을 조작된 세포와 함께 인큐베이션하여 항-CD40+ 항-Fc의 효과와 유사한 루시퍼라제 활성의 강력한 증가를 초래하였다. 중요하게도, 조작된 엑소좀은 가교결합 항체를 필요로 하지 않았으며, 엑소좀 표면상의 CD40L이 CD40을 활성화시키기에 충분한 기능성 CD40L 삼량체를 형성할 수 있음을 입증하였다.
실시예 5:조작된 CD80 엑소좀에 의한 T-세포 활성화
CD80은 항원 제시 세포에서 발현되고, T-세포 표면의 CD28 및 CTLA-4에 결합한다. CD28 및 CTLA-4를 통한 CD80(및 CD86)에 의한 자극은 면역 반응의 개시 동안 T-세포를 활성화시킨다. 엑소좀이 T-세포를 활성화하도록 조작될 수 있는지를 결정하기 위해, 실시예 4에 기재된 바와 같이 HEK293SF 세포의 형질감염 및 선택에 의해 CD80-함유 엑소좀을 생성하였다. CD80 엑소좀의 활성을 검증하기 위해, 인간 PBMC를 96-웰 플레이트의 웰당 150,000 세포에 플레이팅하고, (i) 정제된 CD80 엑소좀 및 항-CD3 항체, (ii) 천연 엑소좀 및 항-CD3 항체, (iii) 항-CD3 항체 단독, 또는 (iv) 항-CD28 및 항-CD3 항체의 조합과 인큐베이션하였다. 샘플을 3일 동안 37℃에서 인큐베이션하고, CD4+ T-세포(도 6a) 및 CD8+ T-세포(도 6b) 모두에 대한 T-세포 수에 대해 분석하였다. CD80 엑소좀은 용량-의존적 방식으로, 그리고 CD3 및 CD28 항체의 양성 대조군과 비슷한 정도로 T-세포를 활성화시켰다. 대조적으로, 천연 엑소좀은 T-세포 증식에 영향을 미치지 않았다.
CD80 엑소좀이 T-세포의 기능적 활성화를 유도함을 확인하기 위해, 천연 엑소좀 및 추가의 항-CD3 항체를 갖는 CD80 엑소좀과 함께 인큐베이션된 PBMC에서의 AlphaLISA에 의해 IFNγ 수준을 측정하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, CD80 엑소좀에 대해서는 IFNγ 수준이 용량-의존적 증가가 있었지만, 천연 엑소좀에 대해서는 그렇지 않았다. 도 7b에 도시된 바와 같이, CD80 엑소좀의 최고 농도는 양성 대조군(항-CD28/항-CD3)을 포함하는 임의의 다른 조건보다 더 큰 IFNγ 수준을 초래하였다. 이들 결과는 엑소좀이 면역 세포 활성화를 초래하는 특정 활성으로 조작될 수 있음을 입증한다.
실시예 6:조작된 CD27L 및 OX40L 엑소좀에 의한 전-염증 사이토카인 생산
CD27L(CD70) 및 OX40L은 TNF 슈퍼-패밀리의 구성원이며, T-세포의 동족 수용체(각각 CD27 및 OX40)에 결합한다. CD27L은 T- 및 B-세포의 특정 모집단에 의해 발현되는 반면, OX40L은 항원 제시 세포의 특정 모집단에 의해 발현된다. CD27 또는 OX40을 통한 신호전달은 특히 아네르기성 T-세포를 활성화시키는 방법에서와 같이, 따라서 면역-종양학에 영향을 미친다. PBMC에서 전-염증성 사이토카인 생성을 유도하도록 엑소좀이 조작될 수 있는지를 결정하기 위해, CD27L- 및 OX40L-함유 엑소좀은 실시예 4에 기재된 바와 같이 HEK293SF 세포의 형질감염 및 선택에 의해 생성되었다. CD27L 엑소좀의 활성을 검증하기 위해, 인간 PBMC를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 정제된 CD27L 엑소좀 및 항-CD3 항체, 천연 엑소좀 및 항-CD3 항체, 항-CD3 항체 단독, 또는 항-CD28 및 항-CD3 항체의 조합과 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 2일 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 2개의 상이한 공여체에서 인터페론 감마(IFNγ) 생산(도 8a 및 8b) 및 IL-2 생성(도 9a 및 9b)에 대해 분석하였다. CD27L 엑소좀은 용량-의존적 방식으로, 그리고 CD3 및 CD28 항체의 양성 대조군과 비슷한 정도(공여체 1) 또는 상당히 큰 정도(공여체 2)로 IFNγ 및 IL-2 생산을 유도하였다. 대조적으로, 천연 엑소좀은 IFNγ 또는 IL-2 생산에 영향을 미치지 않았다. 유사하게, OX40L 엑소좀은 2개의 상이한 공여체에서 IFNγ 및 IL-2 생성을 유사하거나 더 큰 정도로 유도하기에 충분하였다(도 10a 및 10b 및 도 11a 및 11b).
OX40L 엑소좀을 추가로 검증하기 위해, 조작된 엑소좀의 활성을 측정하기 위해 보고서 시스템을 사용하였다. OX40 경로의 활성화는 NF-κB의 활성화를 초래한다. 표면에 OX40을 과발현하도록 조작되고 NF-κB 프로모터(Promega Corporation)의 다운스트림에 루시퍼라제 리포터를 함유하도록 조작된 변형된 Jurkat T-세포주를 사용하여, 항-Fc 항체(Jackson ImmunoResearch, Inc.)와 가교결합된 효능적 항-OX40 항체(BioLegend) 또는 항-IgG 항체(Jackson ImmunoResearch, Inc.)와 가교결합된 재조합 인간 OX40L(ACROBiosystems)의 존재 하에서 세포를 인큐베이션함으로써 OX40 활성화를 확인하였다(도 12a 및 12b). 항-IgG와 가교결합된 항-OX40L 항체는 리포터 세포를 활성화시키는데 실패한 반면, 항-Fc와 가교결합된 재조합 OX40L은 리포터 유전자의 강력한 활성화를 유도하였다(도 12b). 놀랍게도, 조작된 OX40L 엑소좀은 항-OX40 항체 또는 재조합 OX40L보다 더 큰 정도로 리포터 유전자 발현을 유도하였다(도 12c). 중요하게도, 조작된 엑소좀은 가교결합 항체를 필요로 하지 않았으며, 엑소좀 표면상의 OX40L이 OX40을 활성화시키기에 충분한 기능성 OX40L 삼량체를 형성할 수 있음을 입증하였다.
실시예 7:IL-7 조작된 엑소좀에 의한 T-세포 활성화
IL-7은 B-세포 및 T-세포 증식에 관여하는 사이토카인이며, 면역요법에 영향을 미친다. 구체적으로, IL-7은 T-세포를 활성화시키고, 백혈구에 의해 잘 침윤되지 않은 종양 또는 T-세포 아네르기를 유발한 종양 미세환경에서 종양 항원 반응을 유도할 수 있다. 헤테로이량체성 IL-7 수용체를 통한 IL-7 신호전달은 인터페론 감마(IFNγ) 신호전달을 유도하며, 이는 T-세포에 의한 종양-특이적 항원 반응을 향상시킬 수 있다. 엑소좀이 T-세포 활성화를 유도하도록 조작될 수 있는지를 결정하기 위해, IL-7-함유 엑소좀은 IL-7 및 PDGF 수용체의 융합을 암호화하는 pDisplay™ 플라스미드(ThermoFisher)에 의한 HEK293SF 세포의 형질감염 및 선택에 의해 생성되었다. 조작된 엑소좀을 방법에 기재된 바와 같이 정제하였다. IL-7 엑소좀의 활성을 검증하기 위해, 인간 PBMC를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 정제된 IL-7 엑소좀 및 항-CD3 항체, 천연 엑소좀 및 항-CD3 항체, 항-CD3 항체 단독 또는 항-CD28 및 항-CD3 항체의 조합과 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 2일 동안 37℃에서 인큐베이션하고 IFNγ에 대해 분석하였다(도 13a 및 13b). 항-CD3 항체와 조합된 IL-7 엑소좀은 항-CD3 단독보다 피크 IFNγ 생산을 더 크게 유도하였다(도 13a). 추가로, IL-7 엑소좀은 용량-의존적 방식으로, 그리고 CD3 및 CD28 항체의 양성 대조군과 유사한 정도로 IFNγ를 유도하였다. 대조적으로, 천연 엑소좀은 IFNγ 생산에 영향을 미치지 않았다(도 13b).
IL-7 수용체는 IL-7R 및 IL-2RG로 구성된 헤테로이량체성 복합체이며, IL-7의 존재하에 3원 복합체를 형성하고 JAK/STAT 경로를 통한 다운스트림 신호전달을 유도하여 세포 증식을 초래한다. 합성 세포-기반 검정을 사용하여 조작된 IL-7 엑소좀의 기능적 활성을 평가하기 위해 IL-7 수용체를 통한 IL-7 신호전달을 측정하였다(DiscoverX Corporation)(도 14a). 재조합 인간 IL-7(rhIL-7)은 IL-7 수용체를 통한 신호전달을 증가시키기에 충분했으며(도 14b), 조작된 IL-7 엑소좀은 IL-7 수용체를 통한 신호전달을 유도할 수 있었지만, 천연 엑소좀은 그렇지 않았다(도 14c). 이들 데이터는 IL-7-발현 엑소좀이 시험관내 IL-7 수용체를 통한 신호전달을 유도하기에 충분하다는 것을 입증한다.
시험관내에서 관측된 IL-7 엑소좀의 효과가 생체내 모델에서 재현될 수 있는지를 결정하기 위해, IL-7 엑소좀을 C57BL/6 마우스에 투여하였다. 20마리 마우스의 집단을 하기 그룹으로 분리하였다:(1) PBS, (2) 재조합 인간 IL-7(rhIL-7), (3) IL-7 조작된 엑소좀 및 (4) 변형되지 않은 천연 엑소좀. 각각의 그룹에서 5마리의 마우스에 1mg의 EdU 및 PBS, 1x1011 천연 또는 IL-7 엑소좀, 또는 10μg의 rhIL-7을 3일 동안 매일 1회 복강내(IP) 주입하였다. 마우스를 희생시키고, 비장을 단리하고, 유세포측정에 의해 비장 세포에서 EdU 수준을 측정하였다. 도 15a에 도시된 바와 같이, 퍼센트-양성 CD8+ T-세포는 대조군 집단과 비교하여 IL-7 엑소좀 마우스 및 rhIL-7 마우스에서 상당히 증가하였다. IL-7 엑소좀 마우스에서의 T-세포 수는 rhIL-7 집단보다 적었지만, IL-7 엑소좀 집단에 투여된 IL-7 분자보다 5배가 적은 것으로 추정된다(데이터는 도시되지 않음). 메모리 마커 CD45RO의 수준을 측정함으로써 메모리 CD8+ T-세포에 대해 유사한 추세가 관측되었다(도 15b).
직교 접근법으로서, 엑소좀-처리된 마우스로부터 단리된 비장 세포에서 CD71(트랜스페린 수용체)의 수준을 측정하였다. CD71은 증식에 필요하고, CD71 수준은 T-세포 수와 상관 관계가 있다. 도 15a 및 15b에 도시된 바와 같이, CD8+ T-세포 및 메모리 CD-8 + T-세포 수는 도 16a 및 16b에서 관측된 것과 동일한 추세를 따랐다. 함께, 이들 데이터는 조작된 엑소좀이 생체내에서 특이적 면역 세포 효과를 유도할 수 있고, 이 활성화는 재조합 효능제에 비해 분자 단위로 더 강력할 수 있음을 입증한다.
실시예 8:전매 스캐폴드로의 IL-7 융합은 특이 활성을 강화시킴
IL-7 조작된 엑소좀의 활성을 향상시키기 위해, IL-7 서열을 HEK293SF 엑소좀의 표면에서 고도로 발현되는 신규 엑소좀 막관통 단백질인 PTGFRN의 절단된 부분에 융합시켰다. IL-7은 FLAG 태그뿐만 아니라 PTGFRN의 C-최말단 IgV 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인 앞 영역을 포괄하는 PTGFRN의 짧은 단편의 번역 융합 상류로 표현되었다. IL-7과 PTGFRN 사이에 일련의 4개의 아미노산 결실을 도입함으로써 일련의 발현 작제물이 생성되었다(도 17a). 생성된 작제물은 pX-1 내지 pX-4로 넘버링하였다(도 17b에 도시된 pX-4 완전한 서열). 항-IL-7 항체를 사용한 웨스턴 블랏 분석에 의해 나타낸 바와 같이, 작제물 pX-3 및 pX-4는 최고 수준의 발현을 나타냈다. PTGFRN 백본에서 IL-7 발현의 수준은 실시예 7에서 사용된 pDisplay-IL-7보다 극적으로 높았다(도 18a). IL-7의 증가된 발현은 이들 신규한 융합 단백질이 훨씬 더 큰 수준의 IL-7-매개된 T-세포 활성화를 유도할 수 있음을 시사하였다. PTGFRN-IL-7 융합의 효능을 결정하기 위해, T-세포 활성화의 시험관내 모델을 수행하였다. T-세포의 IL-7-매개된 활성화시, IL-7 수용체(IL-7R) 수준은 24시간 내에 용량-의존적 방식으로 감소한다(Ghawazi et al., Immunol Cell Biol. 2013 Feb;91(2):149-58). 따라서, PBMC를 다양한 IL-7 조작된 엑소좀과 함께 인큐베이션한 후 IL-7R 수준을 모니터링하였다. 도 18b에 도시된 바와 같이, 천연 엑소좀은 IL-7R 수준을 감소시키는데 실패한 반면, pDisplay-IL-7 엑소좀(IL-7-pD)은 고용량에서만 IL-7R 수준을 감소시켰다. 대조적으로, PTGFRN-IL-7 엑소좀(IL-7-pX3 내지 pX4)은 훨씬 더 낮은 용량에서 IL-7R 수준을 완전히 감소시켰고, 이들 조작된 엑소좀의 효능이 증가함을 나타낸다. IC50의 척도로서, PTGFRN-IL-7 엑소좀은 IL-7-pD 엑소좀보다 20배 내지 76배 더 강력하였고(표 2), 리간드 밀도의 증가는 생물학적 효능을 증가시키기에 충분하다는 것을 입증한다. 게다가, 이들 결과는 PTGFRN의 특이적 절단이 치료적 엑소좀을 조작하는데 사용하기 위한 이상적인 스캐폴드일 수 있음을 입증한다.
Figure pct00003
실시예 9:항-CD3 항체 단편으로 조작된 엑소좀
이전 실시예에 나타낸 바와 같이, 엑소좀은 면역조절 단백질의 기능적 내인성 서열을 과발현하도록 조작될 수 있다. 합성 효능제가 엑소좀의 표면에서 조작될 수 있는지를 결정하기 위해, 항-CD-3 항체를 실시예 4에 기재된 바와 같이 pDisplay 또는 CD80의 막관통 도메인에 대한 융합체로서 발현시켰다. 인간 PBMC를 웰당 100,000 세포로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 항-CD3 단일 사슬 Fv(scFv)(도 19a 및 19b) 또는 단일 사슬 Fab(scFab)(도 20a 및 20b)를 발현하도록 조작된 엑소좀과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, PBMC를 제조사의 프로토콜에 따라 ImmunoCult™ CD3/CD28 활성제 (Stem Cell Technologies)와 함께 인큐베이션하였다. 항-CD28 공통-자극의 존재하에, 모든 조작된 엑소좀은 양성 대조군과 유사한 T-세포(도 19a 및 20a) 및 B-세포(도 19b 및 20b) 활성화를 유도하는 반면, 조작되지 않은 엑소좀 대조군은 그렇지 않았다. 면역 세포 모집단에 대한 항-CD3 엑소좀의 효과를 측정하기 위해, T-세포 및 B-세포를 유세포측정에 의해 CD69 양성율에 대해 분석하였다. 도 21a에 도시된 바와 같이, CD80 막관통 도메인에 융합된 항-CD3 scFv를 발현하는 엑소좀과 인큐베이션된 PBMC는 T-세포의 약 40%의 활성화를 유도하였다. B-세포의 활성화에 대해 유사한 효과가 관측되었다(도 21b).
항-CD-3 엑소좀-매개된 T-세포 활성화가 직접적인 T-세포 활성화에 의한 것인지 또는 트랜스-작용 면역 세포를 통한 것인지를 결정하기 위해, 정제된 T-세포의 활성화를 측정하였다. 항-CD28 항체의 존재 또는 부재하에 비-표적화 항체 또는 항-CD3 엑소좀으로 사전-코팅된 웰들에서, 또는 항-CD28 항체의 존재 또는 부재하에 가용성 항-CD3 엑소좀과 함께 인큐베이션된 웰들에서, 100,000개의 정제된 인간 T-세포를 96-웰 형식으로 플레이팅하였다. 도 22a에 도시된 바와 같이, 가용성 및 플레이트-코팅된 항-CD3 scFv 엑소좀 둘 모두는 CD69 발현에 의해 측정된 바와 같이 항-CD28 항체의 존재 하에서 T-세포를 활성화시켰다. 도 22b에 도시된 바와 같이, 항-CD28 항체의 존재하에 플레이트-코팅된 항-CD3 항체는 항-CD28 항체의 존재하에 플레이트-코팅된 항-CD3 scFv와 동일한 정도로 T-세포를 활성화시켰다. 놀랍게도, 항-CD28 항체의 존재하에 가용성 항-CD3 항체는 T-세포의 약 30%를 활성화시키기에 충분했지만, 항-CD28 항체의 존재 하의 가용성 항-CD3 scFv 엑소좀은 상당히 높은 비율의 T-세포를 활성화시켰으며, 항체 단편을 과발현하도록 조작된 엑소좀이 가용성 항체와 비교하여 더 높은 수준의 T-세포 활성화를 유도할 수 있음을 입증한다. 함께, 이들 결과는 엑소좀이 특이적 세포 유형에 대하여 기능적 활성을 갖는 항체 단편을 과발현하도록 조작될 수 있음을 입증한다.
실시예 10:IL-12-PTGFRN 엑소좀은 시험관내 및 생체내 에서 강력한 면역조절 활성을 갖는다.
IL-12는 감염 및 다른 항원성 자극에 반응하여 항원 제시 세포에 의해 생산된 강력한 면역자극성 사이토카인이다. 활성화된 수지상 세포, 대식세포 및 중성구에 의한 IL-12 생산은 CD8+ 및 CD4+ T-세포 둘 다에 의한 IFNγ 생산을 유도하고, 자연 살해(NK) 세포의 세포독성 효과를 유도한다. 종양 미세환경에서 IL-12 분비의 조합된 영향은 IFNγ를 포함하는 Th1 사이토카인의 분비를 초래하여, 종양 세포 사멸, 골수-유래 억제 세포(MDSC)의 재프로그래밍 및 항-혈관신생 효과로 이어진다. IL-12-매개된 항종양 효과는 수많은 동물 모델에서 내구성있는 T-세포 반응 및 항종양 면역을 초래한다. IL-12는 이전에 인간에서 면역요법제로 테스트되었지만, 강력한 IFNγ 반응의 검출가능한 유도에도 불구하고 신장 세포 암종 환자에서 상당한 독성을 초래하였다(Leonard et al. , Blood.1997 Oct 1;90(7):2541-8). 따라서, 엑소좀은 사이토카인의 높은 국소 농도 및 추정되는 종양-유지된 약리로 인해 IL-12에 대한 이상적인 전달 양식을 나타낼 수 있다.
IL-12는 p35와 p40의 두 도메인으로 구성된다. 인간 IL-12 이량체는 전장 PTGFRN(도 23a, 작제물 871, 서열번호:3) 또는 고밀도 표면 디스플레이를 가능하게 하는 PTGFRN의 단축 단편(도 23b, 작제물 873, 서열번호:5)에 융합 단백질로서 암호화되었으며, 상기 작제물은 HEK293SF 세포에서 안정적으로 발현되었다. 안정한 세포주를 화학적으로 정의된 배지에서 성장시키고, 배양 상청액으로부터의 엑소좀을 방법에 기재된 바와 같이 Optiprep™ 구배에 걸쳐 정제하였다. 엑소좀 표면상의 IL-12 단백질의 양을 ELISA로 측정하고, 모든 기능성 연구를 위해 rIL-12에 농도-매칭시켰다. 정제된 전장 및 짧은 hIL-12-PTGFRN 엑소좀 또는 재조합 hIL-12(rhIL-12; BioLegend, 카탈로그 번호 573004)를 준최적 농도의 항-CD3 항체의 존재하에 인간 PBMC에서 적정하여, IFNγ 발현을 유도하였다. rhIL-12는 0.029 ng/ml의 EC50으로 강력한 IFNγ 발현을 수득하였으며, 이는 전장 IL12-PTGFRN과 유사하였으며, 둘 모두 IL12-단-PTGFRN보다 약 10배 더 강력하였다(도 24a~b). 이들 결과는 전장 PTGFRN 스캐폴드에 표시된 IL-12가 짧은 PTGFRN 작제물보다 더 강력한 면역조절 시약일 수 있음을 시사한다.
마우스 및 인간 IL-12 단백질은 교차-반응하지 않으며, 도 24에 나타낸 시험관내 데이터는 전장 PTGFRN에 융합된 mIL-12가 PTGFRN의 스캐폴드를 사용하는 것보다 더 강력할 것임을 시사한다. 암의 생체내 모델에서 mIL-12-PTGFRN 엑소좀의 효능을 결정하기 위해, C57BL/6 마우스에 1x106 B16F10 쥣과 흑색종 세포를 피하 이식하였다(그룹당 n=5 마우스). 종양 접종 후 5일, 6일 및 7일에, 동물에게 PBS, 재조합 쥣과 IL-12 0.2μg(mIL12; BioLegend, 카탈로그 번호 577004) 또는 전장 IL-12-PTGFRN을 나타내는 1x1011 엑소좀(mIL12-엑소좀; 서열번호: 4)을 종양내로 주입하였다. 종양 부피가 2,000mm3에 도달하면 동물을 희생시켰다. 도 25~27에 도시된 바와 같이, PBS 그룹의 종양은 빠르게 성장하는 반면, rmIL12 및 mIL12-엑소 그룹의 종양은 극적으로 감소되었다(약 65~80% 용적 감소). 중요하게는, 16일까지, mIL12-엑소 그룹의 종양은 rmIL12 그룹의 종양보다 더 작았으며, 가용성 사이토카인과 비교하여 엑소좀의 표면에 표시될 때 IL-12의 우수한 효능을 나타냈다. PBS 처리된 그룹과 비교하여 IL-12 처리된 그룹의 생존 이점도 있었다(도 28).
rmIL12에 비해 IL-12-PTGFRN-엑소좀의 기계론적인 이점을 이해하기 위해, Th1 유전자 발현을 대조군 및 처리된 그룹의 종양에서 프로파일링하였다. IFNγ(도 29a), T-세포 화학유인물질 CXCL9(도 29b) 및 CXCL10(도 29c), 및 TGFβ(도 29d)는 대조군과 비교하여 IL-12 처리된 그룹에서 모두 증가하였다. 대부분의 경우, 사이토카인 신호는 rmIL-12에 비해 mIL12-Exo로 처리된 동물에서 더 높았다. 비장 CD8+ T-세포의 IFNγ 수준을 유세포측정에 의해 측정하였고, Exo-mIL-12-처리된 마우스는 PBS 그룹 또는 rmIL-12 그룹보다 상당히 더 큰 신호를 나타냈다(도 30). 함께, 이들 데이터는 엑소좀의 표면에 표시된 IL-12가 시험관내 강력한 T-세포 활성화를 촉진하고 생체내에서 쥣과 흑색종의 공격적인 모델에서 강력한 항종양 효과를 유도하는 데 사용될 수 있는 신규한 및 강력한 면역조절 전략을 나타낸다. 기계론적으로, IL-12 엑소좀은 rIL-12보다 우수성을 나타내므로, 암 면역요법에서 신규하고 차별화된 치료 방식을 나타낸다.
실시예 11:인터페론 감마-표시 엑소좀은 강력한 면역 세포 활성제이다
인터페론 감마(IFNγ)는 선천적 및 적응성 면역 반응을 프라이밍하는 데 관여하는 사이토카인이다. IL-12를 포함한 수많은 신호에 반응하여 다양한 세포 유형에서 발현되며, NK 세포를 활성화시키고, 항원 제시 세포에서 항원 전달을 유도하고, 백혈구 활성화 및 침습을 촉진하기에 충분하다. IFNγ는 자연적으로 동종이량체로 발현되고, 가용성 인자로서 분비된다. IFNγ 발현 엑소좀은 단량체성 또는 이량체성 인간 및 마우스 IFNγ에 융합된 전장 PTGFRN으로 HEK293SF 세포를 안정적으로 형질감염시켜 생성되었다(각각 도 31a 및 31b). 현탁액 세포 배양물로부터의 엑소좀을 상기 기재된 바와 같이 정제하고, PAGE로 분석하였다. 단량체(m) 및 탠덤 이량체(td) PTGFRN IFNγ 엑소좀은 유사한 수준으로 예측된 분자량(화살표)으로 발현되었다(도 32). 정제된 엑소좀을 ELISA로 분석하고, 재조합 IFNγ(Biolegend, 카탈로그 번호 570206)를 사용하여 표준 곡선과 비교하여, 엑소좀당 IFNγ 분자의 수를 계산하였다. 표 9의 결과는 4가지 유형의 정제된 엑소좀 각각에서 IFNγ 분자의 수를 나타낸다. 특히, 탠덤 이량체 IFNγ PTGFRN 엑소좀은 단량체성 IFNγ PTGFRN 엑소좀보다 적어도 2배 많은 IFNγ 분자를 함유하며, 탠덤 이량체 엑소좀이 이량체성 IFNγ 작제물을 적절하게 발현하고 있음을 시사한다.
Figure pct00004
인간 단량체 및 탠덤 이량체 PTGFRN-IFNγ 엑소좀을 증가하는 농도에서 24시간 동안 인간 PBMC와 함께 인큐베이션하였다. 단핵구 활성화는 IFNγ 신호전달에 의해 유도된 다운스트림 표면 단백질인 PD-L1 발현에 의해 측정되었다. 도 33에 도시된 바와 같이, 천연 HEK293SF 엑소좀(WT)은 PD-L1 발현을 유도하는 데 실패한 반면, 단량체 및 탠덤 이량체 IFNγ PTGFRN 엑소좀은 PD-L1을 용량-의존적 방식으로, 탠덤 이량체 IFNγ PTGFRN 엑소좀에 의해 더 큰 활성화로 PD-L1을 유도하였다. 엑소좀-매개된 PD-L1 활성화는 LPS-유도된 활성화와 유사하였다(도 33). 이들 데이터는 단량체 또는 이량체 형태의 가용성 사이토카인이 엑소좀의 표면에서 기능적으로 발현될 수 있고 면역 세포 활성화를 유도할 수 있음을 입증한다. 면역 종양학에서 IFNγ 발현 엑소좀의 사용은 종양 세포에 대한 NK 및 T-세포 반응의 유도에 유용할 수 있다.
실시예 12:IL-15 발현 엑소좀은 NK 세포 활성화를 유도한다
인터류킨 15(IL-15)는 병원성 감염 후 단핵 세포에 의해 생산된 사이토카인이다. IL-15는 가용성 단백질로서 분비되거나 IL-15Rα에 결합된 이량체 막-고정된 단백질로서 제시될 수 있다. IL-15는 NK 세포 및 T-세포를 활성화시키고, 면역-종양 및 다른 면역 개입 요법에서 잠재적 치료 분자로서 연루된다. IL-15-발현 엑소좀은 IL-15/IL-15Rα 융합 단백질에 융합된 PDGFR(pDisplay)의 막관통 도메인을 암호화하는 발현 플라스미드로 HEK293SF 세포를 안정적으로 형질감염시킴으로써 생산되었다(도 34). 엑소좀을 상기 방법에 기재된 바와 같이 Optiprep™ 밀도-구배 초원심분리에 의해 정제하였다. 정제된 엑소좀을 인간 PBMC와 24시간 동안 인큐베이션하고, NK 세포 활성화를 유세포측정에 의해 CD69에 대해 양성 퍼센트로 측정하였다. pDisplay IL-15 엑소좀 중 어느 것도 PBMC 배양의 세포 당 최대 105 엑소좀 용량에서 NK 세포 활성화를 유도하지 않았다(도 35; 도 34에서와 같은 엑소좀 작제물 번호). NK 세포 활성화를 유도하는데 고밀도 IL-15 디스플레이가 필요한지 여부를 조사하기 위해, HEK293SF 세포를 전장 PTGFRN 에 융합된 IL-15를 암호화하는 발현 플라스미드로 안정적으로 형질감염시켰다. 또한, HEK293SF 세포는 전장 PTGFRN에 융합된 보다 강력한 IL-15를 암호화하는 발현 플라스미드로 안정적으로 형질감염되었다(IL-15 N72D, J Immunol.　2009 Sep 15;183(6):3598-607에 기재된 바와 같음; 도 36a). 항-PTGFRN 웨스턴 블랏팅에 의해 발현을 확인하였다(도 36b). IL-15 수준을 ELISA(R & D Systems, 카탈로그 번호 D1500)에 의해 정량화하고, 재조합 IL-15(Biolegend, 카탈로그 번호 570302)로 정규화하였다. IL-15 PTGFGN 엑소좀을 밤새 2개의 독립적인 PBMC 배양물에 첨가하고, 농도-매칭된 재조합 IL-15와 비교하였다. 3개의 IL-15 공급원 모두 CD69에 대해 양성인 NK 세포의 백분율에 의해 측정된 바와 같이 용량-의존적 방식으로 PBMC에서 NK 세포 활성화를 유도하였다. 또한, 모든 작제물은 유의미한 비교 효능을 나타내는 두 공여체에 걸쳐 서로 비교가능하였다(도 37; 도 36에서와 같은 엑소좀 작제물 번호). 이들 데이터는 IL-15가 엑소좀의 표면에 적극적으로 그리고 강력하게 표시될 수 있음을 입증하지만, 이것은 PTGFRN에 의해 부여된 것과 같은 높은 발현 수준을 요구한다.
실시예 13:PTGFRN 스캐폴드 상의 항-CD-3 항체 단편을 표시하는 엑소좀이 T-세포를 활성화시킨다
실시예 9의 결과는 항-CD3 항체 단편을 표시하는 엑소좀이 T-세포를 활성화시킬 수 있음을 입증한다. PTGFRN 스캐폴드가 이 활성을 지지하는지 여부를 결정하기 위해, 항-CD3 항체 단편(OKT3 변이체)을 PDGFR 막관통 영역(exoCD3-PD), 전장 PTGFRN(exoCD3-장) 또는 PTGFRN 단편(exoCD3-단)에 융합시키고, HEK293SF 세포에서 안정적으로 발현하였다(도 38). 엑소좀 결합은 Octet® RED96(Pall)을 사용하여 바이오-층 간섭법(BLI)에 의해 확인되었다. CD3 단편을 BLI 프로브에 결합시키고(도 39, ii), 세정하고(도 39, iii), 엑소좀 작제물을 첨가하였다(도 39, iv). WT HEK293SF 세포로부터의 엑소좀은 BLI 프로브에 결합하지 않았지만, 모든 조작된 작제물은 결합하였다. 두 PTGFRN 단편은 더 큰 친화도로 프로브에 결합하고 안정적으로 결합된 상태를 유지한다(도 39, v). 항-CD3 디스플레이 엑소좀을 시험관내 활성에 대해 시험하였다. 유세포측정에 의해 측정된 바와 같이 CD4+ T-세포상에서 CD69 양성율에 의해 T-세포 활성화를 측정하였다. 변형되지 않은 천연 엑소좀(exoNative)과 대조적으로, PTGFRN 단편 (exoCD3-단)에 융합된 항-CD3을 가진 엑소좀은 시험관내 에서 CD4+ T-세포를 활성화시키는 데 효과적이었다(도 40).
실시예 14:CD40L을 표시하는 엑소좀은 B-세포의 강력한 활성제이다
CD40 리간드(CD40L)는 공통자극 수용체 CD40에 결합하는 종양 괴사 슈퍼패밀리(TNFSF)의 리간드이며, 이는 B-세포 및 다른 항원 제시 세포에서 높게 발현된다. TNFSF 리간드-매개된 세포 활성화는 세포 표면 상에 형성되고 동족 수용체에 결합하는 삼량체 리간드 복합체의 형성을 요구한다. 표면에 CD40L의 상이한 형태를 나타내는 엑소좀이 B-세포를 활성화시키기에 충분한지 여부를 조사하기 위해, 40개 이상의 상이한 CD40L 발현 작제물을 HEK293SF 세포에서 설계하고 개별적으로 형질감염시켰다. CD40L은 PDGFR의 막관통 도메인, 전장 PTGFRN, 및 PTGFRN의 짧은 단일-도메인 단편에 대한 융합으로서 표현되었다(도 41a, 하단부). CD40L-GFP PTGFRN 융합은 단량체(pCB-518 내지 pCB-526)로 또는 강제된 삼량체(pCB-607 및 pCB-527)(도 41a, 하단부)로 표현되었다. 단량체성 CD40L의 삼량체화를 촉진하기 위해, TRAF2(pCB-521 내지 pCB-523) 또는 콜라겐 XV(pCB-524 내지 pCB-526)로부터의 다량체화 도메인에 대한 융합을 표현하는 작제물을 설계하였다. 단량체성 CD40L 작제물 중에서, pCB-518/521/524는 내인성 CD40L로부터의 전장 N-말단 줄기 서열을 함유하고; pCB-519/522/525는 내인성 CD40L로부터의 절단된 N-말단 줄기 서열을 함유하고; pCB-520/523/526은 CD40L의 가용성 부분만을 함유하였다. 각각의 조작된 엑소좀 모집단을 RosetteSep™ 인간 B 세포 농축 칵테일(Stemcell Technologies # 15064)을 사용하여 인간 말초 혈액으로부터 단리된, 정제된 B-세포와 인큐베이션하고, B-세포 활성화를 유세포측정에 의한 B-세포 상의 CD69 양성율에 의해 측정하였다. 각각의 작제물에 대한 EC50을 세포 배양의 입자 농도의 함수로서 계산하였고, 도 41의 상단에 도시된 그래프에 플롯팅하였다. 흥미롭게도, 모든 단량체 CD40L 작제물은 중간 정도의 효능을 갖는 반면, 삼량체 작제물은 단량체보다 적어도 10배 더 강력하였다(도 41, 상단). 이들 결과는 단량체 CD40L이 엑소좀의 표면 상에 제시될 때 B-세포의 불량한 활성제이지만, 강제된 삼량체 CD40L이 강력한 B-세포 활성화를 유도할 수 있음을 입증한다. 게다가, PTGFRN은 이량체 구조(PCT/US2018/048026)를 형성하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 표적 결합 및 면역 세포 활성화를 추가로 촉진하기 위해 더 높은 차수의 다량체 구조가 엑소좀 표면 상에 형성될 수 있음을 시사한다.
도 41에 도시된 결과는 모두 PTGFRN의 C-말단에 융합된 내강 GFP를 함유하는 엑소좀을 이용하였다. 태그-없는 CD40L 엑소좀을 생성할 목적으로, 리드 작제물 pCB-527과 동일하지만 C-말단 GFP가 없는 삼량체 CD40L-PTGFRN 작제물이 HEK293SF 세포(pCB-766)에서 안정적으로 발현되었다. 조작된 엑소좀 표면상의 CD40L의 절대 농도는 하기 표 10에 나타낸 바와 같이 ELISA(R & D Systems, 카탈로그 번호, DCDL40)를 사용하여 정량화하였다.
Figure pct00005
정제된 CD40L-PTGFRN 엑소좀을 농도-매칭된 재조합 인간 CD40L과 비교하여 상기 기재된 바와 같이 B-세포 활성화 검정에서 시험하였다(Biolegend, 카탈로그 번호 591702). GFP-함유 및 태그-없는 CD40L 엑소좀은 입자 수 또는 CD40L 농도의 함수로서 측정될 때 유사한 B-세포 활성제였으며(도 42a), 두 엑소좀 제제는 농도-매칭된 CD40L보다 더 강력하였다(도 42b). HEK293SF 세포로부터의 천연의 비-조작된 엑소좀은 B-세포를 활성화시키는데 실패하였고, 이는 엑소좀 표면상의 조작된 CD40L 삼량체 작제물이 B-세포를 강력하게 활성화시키기에 충분하다는 것을 입증한다.
CD40을 작동시키고 B-세포를 활성화시키는 대안적인 방식은 이차 항체와 가교결합된 효능적 항체를 사용하는 것이다. 삼량체 CD40L-발현 엑소좀의 효능을 효능적 CD40L 항체와 비교하기 위해, PBMC 배양물을 2μg/ml 항-CD40L 항체(Biolegend®; 클론 5C3)와 이차 가교결합 항체(JacksonImmuno Research, 카탈로그 번호 115-006-071)와 함께 인큐베이션하였다. 최대 B-세포 활성화는 도 43a 및 43b에서 점선으로 도시되어 있다. pCB-527 엑소좀(PTGFRN-삼량체 CD40L-GFP)은 면역 세포 활성화에서 삼량체 CD40L 엑소좀의 우수성을 입증하는 2개의 독립적인 공여체 PBMC 풀(도 43a 및 43b)에서 가교결합된 효능적 항체보다 더 큰 최대 B-세포 활성화를 유도하였다.
실시예 15:개별 엑소좀에 다중 면역-종양학 분자의 동시 표시
상기 실시예는 개별 면역-조절 단백질이 엑소좀의 표면에 표시될 수 있고, 하나 이상의 면역 세포 유형에서 기능적 변화를 유도할 수 있음을 입증한다. 특정 적용에서, 조합 조작된 엑소좀의 용도는, 즉 엑소좀 표면 상에 2개 이상의 분자를 함유하는 엑소좀을 요구할 수 있으며, 이들 각각은 뚜렷한 면역 세포 경로를 신호전달할 수 있다. HEK293SF 세포는 PTGFRN-IL-12 및 PTGFRN-CD40L 융합 단백질 둘 모두를 발현하는 플라스미드로 안정적으로 형질감염되었다. 상기 기재된 바와 같이 엑소좀을 단리 및 정제하였다. 비변형된 HEK293SF 세포로부터의 엑소좀을 음성 대조군으로 사용하였다.
상이한 리간드의 동시 장입을 입증하기 위해, 풀-다운 코스테인 분석법을 개발하였다:
시약:
다이나비드(Dynabeads)(Thermofisher 엑소좀-스트렙타비딘 단리/검출 시약, 카탈로그 번호 10608D):1x107비드/mL, 50% 슬러리
단리 완충액:0.5% BSA/PBS(2% BSA로부터 1:4)
블록 완충액:2% BSA/PBS(1gr/50mL, 필터)
· 0.5ml 비드를 0.5ml 단리 완충액으로 세척하고 0.5mL 단리 완충액에 재현탁
· 1μg 바이오티닐화된 포획 항체(2.2 ul의 0.5 ug/ul 스톡) 첨가
· 1시간 회전, RT
· 500μl 단리 완충액 세척
· 500μl 블록 완충액에 재현탁, 10분 회전 RT
· 500μl 단리 완충액(1x107비드/mL, 50% 슬러리)에서 배양
· 4C로 저장
A. 엑소좀 포획 및 흐름
샘플 당 1x105 비드(10 μl 비드, 20 μl 슬러리)
비드 당 50,000개의 엑소좀; 샘플 당 5x109 엑소좀(1.2x109 엑소좀/μL 스톡)
흐름을 위해 각 형광 표지된 검출 항체 5μl
5x109 엑소좀 + 20μl Dynabeads 슬러리 + 0.7 ml 0.1% BSA/PBS 혼합
순서:
1. 120 μl 슬러리 비드, sup 제거, 0.7 ml 블록 완충액 첨가, 혼합, 10분 RT 회전, sup 제거
2. 0.7ml 단리 완충액 + 25.2 μl 엑소좀에서 비드를 현탁시키고, ON@4C 회전
3. 다음날: 빠른 스핀 엑소좀 및 비드, 5초
4. 자석에 튜브를 놓고 sup를 제거한다
5. 700μl에서 차단, 10분 회전 RT
6. 자석에 튜브를 놓고 sup를 제거한다
7. 600μl 단리 완충액에 재현탁:튜브 당 6 x 100μl
8. 1μl 표지된 검출 항체 첨가, 혼합, 암실에서 4C에서 30분 배양
9. 500g에서 2분 회전, sup 제거
10. 2배 단리 완충액 세척
11. 200μl 단리 완충액에 재현탁하고 유량을 흐름.
천연 엑소좀을 항-CD40L-장식된 비드로 단리하고 IL-12 및 CD40L (도 44a) 또는 CD81, 천연 및 조작된 엑소좀에 존재하는 엑소좀 마커 및 CD40L(도 44b)에 대해 형광 항체로 표지하였다. IL-12, CD40L 또는 CD81에 대해 형광 신호가 검출되지 않았기 때문에 CD40L 비드는 어떠한 천연 엑소좀도 파괴하지 않았다. 대조적으로, PTGFRN-CD40L/IL-12 이중 조작된 엑소좀은 항-CD40L 비드와 함께 인큐베이션하고 상기와 같이 단리하였다. CD81(도 45a), IL-12 또는 CD40L(도 45b)에 대한 염색은 모두 조작된 엑소좀으로 검출되었으며(카운트된 비드의 97% 초과), 이는 CD40L-매개된 단리가 IL-12 엑소좀을 단리할 수 있음을 나타낸다. 유사하게, 항-IL-12-장식된 비드는 IL-12/CD40L 조작된 엑소좀과 함께 인큐베이션되었고, IL-12, CD40L 및 CD81에 대해 염색되었다. 모든 비드의 98% 이상이 CD40L 및 IL-12 둘 다 또는 CD81에 대해 양성이었고(도 46a 및 46b), 엑소좀은 그의 표면에 IL-12 및 CD40L을 모두 함유하고 있음을 입증하였다.
IL-12 및 CD40L 농도는 시험관내 효능에 대해 조작된 엑소좀을 시험하기 위해 ELISA(Abcam 카탈로그 번호 ab119517)에 의해 정량화되었다. 동등한 농도의 재조합 IL-12, 재조합 CD40L과 혼합된 재조합 IL-12, PTGFRN-IL-12 엑소좀, 이중-양성 PTGFRN-CD40L/IL-12 엑소좀, 또는 PTGFRN-IL-12 엑소좀과 PTGFRN-CD40L 엑소좀의 혼합물을 증가하는 농도의 인간 PBMC(rhIL-12-BioLegend, 카탈로그 번호 573004; rhCD40L - Biolegend, 카탈로그 번호 591702)에 첨가하였다. 세포는 항-CD3 항체와 공통자극되었고, IFNγ 생산은 (PerkinElmer, 카탈로그 번호 AL217C)에 의해 측정되었다. 도 47a 및 47b에 도시된 바와 같이, 모든 IL-12-함유 엑소좀 제제는 재조합 사이토카인과 유사한 IFNγ 반응을 유발했다. 다양한 조건에 대한 EC50의 계산은 엑소좀-연관된 IL-12가 엑소좀 표면상에서 단독으로 또는 조합적으로 발현되든, 농도-매칭된 IL-12보다 더 강력함을 나타내었다(도 48). B-세포 활성화의 맥락에서 재조합 CD40L 및 단독으로 또는 이중으로 조작된 CD40L 엑소좀으로 유사한 결과를 달성하였다(도 49a 및 b). 다시, CD40L 조작된 엑소좀은 가용성 재조합 사이토카인보다 더 강력하였고, 이 경우 이중으로 조작된 엑소좀은 검정에서 시험된 가장 강력한 작제물이었다(도 50).
조합 표면 디스플레이 엑소좀의 가능성을 추가로 탐색하기 위해, HEK293SF 세포를 PTGFRN-IL-12, PTGFRN-CD40L 또는 PTGFRN-FLT3L 융합 단백질을 발현하는 3개의 독립적인 작제물로 안정적으로 형질감염시켰다. 엑소좀은 상기 기재된 바와 같은 친화도 비드 방법에 의해 정제 및 단리되었지만, 항-FLT3L-PE 접합된 항체를 사용하여 표면 FLT3L의 존재에 대해 조사되었다. 항-IL-12 비드로 단리된 엑소좀은 IL-12 및 CD40L(도 51a), IL-12 및 FLT3L(도 51b), 및 CD40L 및 FLT3L(도 51c)에 대해 이중으로 양성이었다. 항-CD40L 비드로 단리된 엑소좀은 IL-12 및 CD40L(도 52a), IL-12 및 FLT3L(도 52b) 및 CD40L 및 FLT3L(도 52c)에 대해 이중으로 양성이었으며, 개별 엑소좀이 각각의 3개의 면역조절 리간드를 발현함을 확인하였다. 이들 결과는 다중 조작된 면역-조절 엑소좀이 실행가능한 치료 방식이며, 면역 세포 활성화에서 가용성 사이토카인보다 유사하거나 더 강력함을 입증한다.
***
전술한 발명이 이해의 명확성을 위해 예시 및 예로써 일부 상세하게 기재되었지만, 본 개시내용의 교시에 비추어 당해 분야의 숙련가에게는 특정 변경 및 변형이 첨부된 특허청구범위의 정신 또는 범위를 벗어나지 않으면서 가능하다는 것이 명백하다.
따라서, 전술한 것은 단지 본 발명의 원리를 설명한다. 당해 분야의 숙련가는 본 명세서에서 명백하게 기재 또는 도시되지는 않았지만 본 발명의 원리를 구현하고 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 배열을 고안할 수 있음을 이해할 것이다. 게다가, 본 명세서에 인용된 모든 예 및 조건적 언어는 판독자가 이러한 구체적으로 인용된 예 및 조건에 제한되지 않는 본 발명의 원리를 이해하는 것을 돕기 위해 주로 의도된다. 또한, 본 발명의 원리, 양태 및 구현예 및 그의 특정 예를 언급하는 본 명세서의 모든 서술은 그의 구조적 및 기능적 등가물을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 그러한 등가물은 현재 알려진 등가물과 미래에 개발될 등가물, 즉, 구조에 관계없이 동일한 기능을 수행하는 임의의 요소를 포함하도록 의도되었다. 그러므로, 본 발명의 범위는 본원에 도시되고 기재된 예시적인 구현예로 제한되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구범위에 의해 구현된다.
서열목록
>서열번호:1
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHSAGGGGSDYKDDDDKGGGGSGPIFNASVHSDTPSVIRGDLIKLFCIITVEGAALDPDDMAFDVSWFAVHSFGLDKAPVLLSSLDRKGIVTTSRRDWKSDLSLERVSVLEFLLQVHGSEDQDFGNYYCSVTPWVKSPTGSWQKEAEIHSKPVFITVKMDVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGLLSCLIGYCSSHWCCKKEVQETRRERRRLMSMEMD
>서열번호:2
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHSAGGGGSGGGGSGPIFNASVHSDTPSVIRGDLIKLFCIITVEGAALDPDDMAFDVSWFAVHSFGLDKAPVLLSSLDRKGIVTTSRRDWKSDLSLERVSVLEFLLQVHGSEDQDFGNYYCSVTPWVKSPTGSWQKEAEIHSKPVFITVKMDVLNAFKYPLLIGVGLSTVIGLLSCLIGYCSSHWCCKKEVQETRRERRRLMSMEMD
>hIL-12-PTGFRN; 871(서열번호:3)
MCHQQLVISW FSLVFLASPL VAIWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC
DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS
LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST
DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP
AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR
QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC
RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCSGG SGGGSGGGGS GGGGSGGGSG
GRNLPVATPD PGMFPCLHHS QNLLRAVSNM LQKARQTLEF YPCTSEEIDH
EDITKDKTST VEACLPLELT KNESCLNSRE TSFITNGSCL ASRKTSFMMA
LCLSSIYEDL KMYQVEFKTM NAKLLMDPKR QIFLDQNMLA VIDELMQALN
FNSETVPQKS SLEEPDFYKT KIKLCILLHA FRIRAVTIDR VMSYLNASSA
GGGGSGGGGS RVVRVPTATL VRVVGTELVI PCNVSDYDGP SEQNFDWSFS
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EVQETRRERR RLMSMEMD*
>mIL-12-PTGFRN; 872(서열번호:4)
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HLLLHKKENG IWSTEILKNF KNKTFLKCEA PNYSGRFTCS WLVQRNMDLK
FNIKSSSSSP DSRAVTCGMA SLSAEKVTLD QRDYEKYSVS CQEDVTCPTA
EETLPIELAL EARQQNKYEN YSTSFFIRDI IKPDPPKNLQ MKPLKNSQVE
VSWEYPDSWS TPHSYFSLKF FVRIQRKKEK MKETEEGCNQ KGAFLVEKTS
TEVQCKGGNV CVQAQDRYYN SSCSKWACVP CRVRSGGSGG GSGGGGSGGG
GSGGGSGGRV IPVSGPARCL SQSRNLLKTT DDMVKTAREK LKHYSCTAED
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MMTLCLGSIY EDLKMYQTEF QAINAALQNH NHQQIILDKG MLVAIDELMQ
SLNHNGETLR QKPPVGEADP YRVKMKLCIL LHAFSTRVVT INRVMGYLSS
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>hIL-12-short PTGFRN; 873(서열번호:5)
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>mIL-12-단 PTGFRN; 874(서열번호:6)
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MSMEMD*
서열번호:7 PTGFRN_IFN_감마 단량체
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서열번호:8 PTGFRN_IFN_감마 이량체
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서열번호:9 PTGFRN_IFN_감마 마우스 단량체
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서열번호:10 PTGFRN_IFN_감마 마우스 이량체
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서열번호:18 PTGFRN-항-CD3
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서열번호:20 PTGFRN_CD40L 삼량체 인간
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서열번호:21 PTGFRN_단-항-CD3
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서열번호:22 FLT3L-PTGFRN
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<110> CODIAK BIOSCIENCES, INC. <120> EXOSOMES FOR IMMUNO-ONCOLOGY AND ANTI-INFLAMMATORY THERAPY <130> 32724-41775/WO <140> PCT/US2018/068062 <141> 2018-12-28 <150> 62/723,267 <151> 2018-08-27 <150> 62/611,140 <151> 2017-12-28 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 390 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe 50 55 60 Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe 65 70 75 80 Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser 85 90 95 Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr 100 105 110 Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala 115 120 125 Leu Gly Glu 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Gly Asp Thr Leu 850 855 860 Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn 865 870 875 880 Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr 885 890 895 Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile 900 905 910 Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 915 920 925 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 930 935 940 Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg 945 950 955 960 Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu 965 970 975 Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 980 985 990 <210> 22 <211> 1055 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe 20 25 30 Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu 35 40 45 Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu 50 55 60 Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln 65 70 75 80 Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly 85 90 95 Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala 100 105 110 Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser 115 120 125 Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp 130 135 140 Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro 145 150 155 160 Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala 165 170 175 Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser 180 185 190 Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Val Arg Val Pro Thr Ala Thr Leu Val 195 200 205 Arg Val Val Gly Thr Glu Leu Val Ile Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr 210 215 220 Asp Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly 225 230 235 240 Ser Ser Phe Val Glu Leu Ala Ser Thr Trp Glu Val Gly Phe Pro Ala 245 250 255 Gln Leu Tyr Gln Glu Arg Leu Gln Arg Gly Glu Ile Leu Leu Arg Arg 260 265 270 Thr Ala Asn Asp Ala Val Glu Leu His Ile Lys Asn Val Gln Pro Ser 275 280 285 Asp Gln Gly His Tyr Lys Cys Ser Thr Pro Ser Thr Asp Ala Thr Val 290 295 300 Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Val Gln Val Lys Val Leu Ala Asp Ser 305 310 315 320 Leu His Val Gly Pro Ser Ala Arg Pro Pro Pro Ser Leu Ser Leu Arg 325 330 335 Glu Gly Glu Pro Phe Glu Leu Arg Cys Thr Ala Ala Ser Ala Ser Pro 340 345 350 Leu His Thr His Leu Ala Leu Leu Trp Glu Val His Arg Gly Pro Ala 355 360 365 Arg Arg Ser Val Leu Ala Leu Thr His Glu Gly Arg Phe His Pro Gly 370 375 380 Leu Gly Tyr Glu Gln Arg Tyr His Ser Gly Asp Val Arg Leu Asp Thr 385 390 395 400 Val Gly Ser Asp Ala Tyr Arg Leu Ser Val Ser Arg Ala Leu Ser Ala 405 410 415 Asp Gln Gly Ser Tyr Arg Cys Ile Val Ser Glu Trp Ile Ala Glu Gln 420 425 430 Gly Asn Trp Gln Glu Ile Gln Glu Lys Ala Val Glu Val Ala Thr Val 435 440 445 Val Ile Gln Pro Ser Val Leu Arg Ala Ala Val Pro Lys Asn Val Ser 450 455 460 Val Ala Glu Gly Lys Glu Leu Asp Leu Thr Cys Asn Ile Thr Thr Asp 465 470 475 480 Arg Ala Asp Asp Val Arg Pro Glu Val Thr Trp Ser Phe Ser Arg Met 485 490 495 Pro Asp Ser Thr Leu Pro Gly Ser Arg Val Leu Ala Arg Leu Asp Arg 500 505 510 Asp Ser Leu Val His Ser Ser Pro His Val Ala Leu Ser His Val Asp 515 520 525 Ala Arg Ser Tyr His Leu Leu Val Arg Asp Val Ser Lys Glu Asn Ser 530 535 540 Gly Tyr Tyr Tyr Cys His Val Ser Leu Trp Ala Pro Gly His Asn Arg 545 550 555 560 Ser Trp His Lys Val Ala Glu Ala Val Ser Ser Pro Ala Gly Val Gly 565 570 575 Val Thr Trp Leu Glu Pro Asp Tyr Gln Val Tyr Leu Asn Ala Ser Lys 580 585 590 Val Pro Gly Phe Ala Asp Asp Pro Thr Glu Leu Ala Cys Arg Val Val 595 600 605 Asp Thr Lys Ser Gly Glu Ala Asn Val Arg Phe Thr Val Ser Trp Tyr 610 615 620 Tyr Arg Met Asn Arg Arg Ser Asp Asn Val Val Thr Ser Glu Leu Leu 625 630 635 640 Ala Val Met Asp Gly Asp Trp Thr Leu Lys Tyr Gly Glu Arg Ser Lys 645 650 655 Gln Arg Ala Gln Asp Gly Asp Phe Ile Phe Ser Lys Glu His Thr Asp 660 665 670 Thr Phe Asn Phe Arg Ile Gln Arg Thr Thr Glu Glu Asp Arg Gly Asn 675 680 685 Tyr Tyr Cys Val Val Ser Ala Trp Thr Lys Gln Arg Asn Asn Ser Trp 690 695 700 Val Lys Ser Lys Asp Val Phe Ser Lys Pro Val Asn Ile Phe Trp Ala 705 710 715 720 Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val Lys Ala Arg Gln Pro Lys Pro Phe 725 730 735 Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu Met Thr Cys Lys Val Ser Ser Lys 740 745 750 Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser Val Leu Ile Met Ala Glu Lys Pro 755 760 765 Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn Glu Thr Lys Tyr Ile Ile Ser Leu 770 775 780 Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu Glu Asn Trp Thr Asp Ala Ser Arg 785 790 795 800 Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys Val Gln Glu Asp Glu Phe Arg Tyr 805 810 815 Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Met 820 825 830 Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala 835 840 845 Thr Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro 850 855 860 Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly 865 870 875 880 Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu 885 890 895 Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser 900 905 910 Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys 915 920 925 Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu 930 935 940 Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu 945 950 955 960 Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys 965 970 975 Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro 980 985 990 Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro 995 1000 1005 Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys 1010 1015 1020 Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln 1025 1030 1035 1040 Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met Asp 1045 1050 1055 <210> 23 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 23 Glu His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln 20 25 30 Thr Ser Gly Pro Ile Phe 35 <210> 24 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Glu His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro 20 25 30 Ile Phe <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Glu His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Gln Thr Ser Gly Pro Ile Phe 20 25 30 <210> 26 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Glu His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ile Phe 20 25

Claims (83)

  1. 조성물로서,
    봉입된 용적에 결합하는 세포막을 포함하는 세포외 소포로서, 상기 세포막이 내측 표면 및 외측 표면을 갖는, 상기 세포외 소포; 및
    상기 세포막과 회합되거나 또는 상기 봉입된 용적내에 봉입된 제1 면역조절 성분을 포함하는 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 면역조절 성분이 음성 체크포인트 조절인자에 대한 억제제 또는 음성 체크포인트 조절인자의 결합 파트너에 대한 억제제인, 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 음성 체크포인트 조절인자가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물: 세포독성 T-림프구-회합된 단백질 4(CTLA-4), 프로그래밍된 세포사 단백질 1(PD-1), 림프구-활성화된 유전자 3(LAG-3), T-세포 면역글로불린 뮤신-함유 단백질 3(TIM-3), B 및 T 림프구 감쇠기(BTLA), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA), 아데노신 A2a 수용체(A2aR), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), CD20, CD39 및 CD73.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 면역조절 성분이 양성 공통자극 분자에 대한 활성제 또는 양성 공통자극 분자의 결합 파트너에 대한 활성제인, 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 양성 공통자극 분자가 TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원인, 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물:CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas 수용체, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK 수용체, TACI, BAFF 수용체, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP, 및 XEDAR.
  7. 청구항 4에 있어서, 양성 공통자극 분자에 대한 상기 활성제가 TNF 슈퍼패밀리 일원인, 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물:TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드, 및 EDA-2.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 TNF 슈퍼패밀리 일원이 CD40L인, 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 TNF 슈퍼패밀리 일원이 CD27L인, 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 TNF 슈퍼패밀리 일원이 OX40L인, 조성물.
  12. 청구항 4에 있어서, 상기 양성 공통자극 분자가 CD28-슈퍼패밀리 공통자극 분자인, 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 CD28-슈퍼패밀리 공통자극 분자가 ICOS 또는 CD28인, 조성물.
  14. 청구항 4에 있어서, 양성 공통자극 분자에 대한 상기 활성제가 ICOSL, CD80 또는 CD86인, 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 양성 공통자극 분자에 대한 상기 활성제가 CD80인, 조성물.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 면역조절 성분이 사이토카인 또는 사이토카인의 결합 파트너인, 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 사이토카인은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물: IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 및 IL-15.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-7인, 조성물.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-12인, 조성물.
  20. 청구항 16에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-15인, 조성물.
  21. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 면역조절 성분이 T-세포 수용체(TCR), T-세포 공동-수용체, 주조직 적합성 복합체(MHC), 인간 백혈구 항원(HLA), 또는 이의 유도체인, 조성물.
  22. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 면역조절 성분이 T-세포 수용체 또는 공동-수용체의 활성제인, 조성물.
  23. 청구항 22에 있어서, T-세포 수용체 또는 공동-수용체의 상기 활성제가 CD3의 활성제, 선택적으로 CD3의 효능제 항체인, 조성물.
  24. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 면역조절 성분이 종양 항원인, 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 종양 항원이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물: 알파-태아단백(AFP), 암종배아 항원(CEA), 상피성 종양 항원(ETA), 뮤신 1(MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 티로시나제, 흑색종-관련된 항원(MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1), 프로그래밍된 사멸 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메소텔린, VEGFR, 알파-엽산 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원, MART-1 gp100, 및 TNF-관련된 세포자멸사-유도 리간드.
  26. 청구항 24 또는 25에 있어서, 상기 종양 항원이 참조 게놈 서열로부터 유래된, 조성물.
  27. 청구항 24 또는 25에 있어서, 상기 종양 항원은 대상체의 게놈 서열로부터 유래된, 조성물.
  28. 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 면역조절 성분이 효능제 또는 길항제인, 조성물.
  29. 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 면역조절 성분이 항체 또는 항원-결합 단편인, 조성물.
  30. 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 면역조절 성분이 폴리뉴클레오타이드인, 조성물.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물: mRNA, miRNA, siRNA, 안티센스 RNA, shRNA, lncRNA 및 dsDNA.
  32. 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 면역조절 성분이 단백질, 펩타이드, 당지질 또는 당단백질인, 조성물.
  33. 청구항 1 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 면역조절 성분이 상기 세포외 소포의 외측 표면 상에 표시된 융합 단백질로서 발현되는, 조성물.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 융합 단백질이 PTGFRN 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 융합 단백질의 서열이 서열번호:3인, 조성물.
  36. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소포가 엑소좀인, 조성물.
  37. 청구항 1 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소포가 나노소포인, 조성물.
  38. 청구항 1 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  39. 청구항 1 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 소포가 제2 면역조절 성분을 추가로 포함하는, 조성물.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분이 음성 체크포인트 조절인자에 대한 억제제 또는 음성 체크포인트 조절인자의 결합 파트너에 대한 억제제인, 조성물.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 음성 체크포인트 조절인자가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물: 세포독성 T-림프구-회합된 단백질 4(CTLA-4), 프로그래밍된 세포사 단백질 1(PD-1), 림프구-활성화된 유전자 3(LAG-3), T-세포 면역글로불린 뮤신-함유 단백질 3(TIM-3), B 및 T 림프구 감쇠기(BTLA), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA), 아데노신 A2a 수용체(A2aR), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), CD20, CD39 및 CD73.
  42. 청구항 39에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분이 양성 공통자극 분자에 대한 활성제 또는 양성 공통자극 분자의 결합 파트너에 대한 활성제인, 조성물.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 양성 공통자극 분자가 TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원인, 조성물.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 TNF 수용체 슈퍼패밀리 일원이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물:CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas 수용체, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK 수용체, TACI, BAFF 수용체, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP, 및 XEDAR.
  45. 청구항 42에 있어서, 양성 공통자극 분자에 대한 상기 활성제가 TNF 슈퍼패밀리 일원인, 조성물.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 TNF 슈퍼패밀리 일원은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물:TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드, 및 EDA-2.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 TNF 슈퍼패밀리 일원이 CD40L인, 조성물.
  48. 청구항 46에 있어서, 상기 TNF 슈퍼패밀리 일원이 CD27L인, 조성물.
  49. 청구항 46에 있어서, 상기 TNF 슈퍼패밀리 일원이 OX40L인, 조성물.
  50. 청구항 42에 있어서, 상기 양성 공통자극 분자가 CD28-슈퍼패밀리 공통자극 분자인, 조성물.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 CD28-슈퍼패밀리 공통자극 분자가 ICOS 또는 CD28인, 조성물.
  52. 청구항 42에 있어서, 양성 공통자극 분자에 대한 상기 활성제가 ICOSL, CD80 또는 CD86인, 조성물.
  53. 청구항 52에 있어서, 양성 공통자극 분자에 대한 상기 활성제가 CD80인, 조성물.
  54. 청구항 39에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분이 사이토카인 또는 사이토카인의 결합 파트너인, 조성물.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 사이토카인은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물:IL-2, IL-7, IL-10, IL-12 및 IL-15.
  56. 청구항 54에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-7인, 조성물.
  57. 청구항 54에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-12인, 조성물.
  58. 청구항 54에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-15인, 조성물.
  59. 청구항 39에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분이 T-세포 수용체(TCR), T-세포 공동-수용체, 주조직 적합성 복합체(MHC), 인간 백혈구 항원(HLA), 또는 이의 유도체인, 조성물.
  60. 청구항 39에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분이 T-세포 수용체 또는 공동-수용체의 활성제인, 조성물.
  61. 청구항 60에 있어서, T-세포 수용체 또는 공동-수용체의 활성제가 CD3의 활성제, 선택적으로 CD3의 효능제 항체인, 조성물.
  62. 청구항 39에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분이 종양 항원인, 조성물.
  63. 청구항 62에 있어서, 상기 종양 항원이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물: 알파-태아단백(AFP), 암종배아 항원(CEA), 상피성 종양 항원(ETA), 뮤신 1(MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 티로시나제, 흑색종-관련된 항원(MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1), 프로그래밍된 사멸 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메소텔린, VEGFR, 알파-엽산 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원, MART-1 gp100, 및 TNF-관련된 세포자멸사-유도 리간드.
  64. 청구항 62 또는 63에 있어서, 상기 종양 항원이 참조 게놈 서열로부터 유래된, 조성물.
  65. 청구항 62 또는 63에 있어서, 상기 종양 항원은 대상체의 게놈 서열로부터 유래된, 조성물.
  66. 청구항 39 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분이 효능제 또는 길항제인, 조성물.
  67. 청구항 39 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분이 항체 또는 항원-결합 단편인, 조성물.
  68. 청구항 39 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분이 폴리뉴클레오타이드인, 조성물.
  69. 청구항 68에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물: mRNA, miRNA, siRNA, 안티센스 RNA, shRNA, lncRNA 및 dsDNA.
  70. 청구항 39 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분은 단백질, 펩타이드, 당지질 또는 당단백질인, 조성물.
  71. 청구항 39 내지 70 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분이 상기 세포외 소포의 외측 표면 상에 표시된 융합 단백질로서 발현되는, 조성물.
  72. 청구항 71에 있어서, 상기 융합 단백질이 PTGFRN 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 조성물.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 융합 단백질의 서열이 서열번호:3인, 조성물.
  74. 청구항 39 내지 73 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 면역조절 성분이 상기 제1 면역조절 성분과 상이한, 조성물.
  75. 청구항 39 내지 74 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포가 제3 면역조절 성분을 추가로 포함하는, 조성물.
  76. 청구항 75에 있어서, 상기 제3 면역조절 성분이 상기 제1 및 제2 면역조절 성분과 상이한, 조성물.
  77. 청구항 1 내지 38 중 어느 한 항의 상기 조성물을 제조하는 방법으로서,
    상기 제1, 제2 및/또는 제3 면역조절 성분으로 생산자 세포를 변형시키는 단계;
    상기 생산자 세포로부터 상기 세포외 소포를 수득하는 단계; 및
    상기 수득된 세포외 소포를 선택적으로 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  78. 청구항 1 내지 38 중 어느 한 항의 상기 조성물을 제조하는 방법으로서,
    생산자 세포로부터 상기 세포외 소포를 수득하는 단계;
    상기 수득된 세포외 소포를 단리하는 단계; 및
    상기 단리된 세포외 소포를 상기 제1, 제2 및/또는 제3 면역조절 성분으로 변형시키는 단계를 포함하는 방법.
  79. 청구항 77 또는 78에 있어서, 상기 단리된 세포외 소포를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  80. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    치료 유효량의 청구항 1 내지 38 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 조성물은 상기 대상체에서 면역 반응을 상향조절할 수 있고, 그에 의해 상기 대상체의 면역계의 종양 표적화를 향상시키는 상기 단계를 포함하는, 방법.
  81. 대상체에서 이식편 대 숙주 질환(GvHD)을 치료하는 방법으로서,
    치료 유효량의 청구항 1 내지 38 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 조성물은 상기 대상체에서 면역 반응을 하향 조절할 수 있고, 그에 의해 GvHD의 증상을 경감시키는 상기 단계를 포함하는, 방법.
  82. 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법으로서,
    치료 유효량의 청구항 1 내지 38 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 조성물은 상기 대상체에서 면역 반응을 하향조절할 수 있고, 그에 의해 상기 대상체의 면역 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 방법.
  83. 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    치료 유효량의 청구항 24 내지 27 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 조성물은 상기 종양 항원에 대한 면역 반응을 강화시킬 수 있고, 그에 의해 상기 대상체의 암에 대한 면역 반응을 향상시키는 단계를 포함하는, 방법
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