JP2023133470A - 免疫腫瘍及び抗炎症療法のためのエクソソーム - Google Patents
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Abstract
【課題】免疫腫瘍及び抗炎症療法のためのエクソソームの提供。【解決手段】免疫調節成分を含む細胞外小胞が、本明細書に開示される。細胞外小胞を産生するための方法、ならびにがん、GvHD、及び自己免疫疾患を治療するために細胞外小胞を使用するための方法も、提供される。ヒト免疫系を上方調節または下方調節し、がんと戦うために患者の免疫系を増強するか、またはGvHD及び自己免疫疾患の症状を緩和させるために患者の免疫系を抑制することができる免疫調節成分を有する、選択、濃縮、または操作された細胞外小胞を含む組成物が、本明細書に提供される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2018年8月27日に出願された米国仮出願第62/723,267号、及び2017年12月28日に出願された同第62/611,140号の優先権を主張し、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2018年8月27日に出願された米国仮出願第62/723,267号、及び2017年12月28日に出願された同第62/611,140号の優先権を主張し、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、ヒト免疫系を相互作用させ調節するための組成物、組成物を作成する方法、及び組成物を使用してがん、GvHD、及び自己免疫疾患を治療する方法に関する。
免疫療法とは、免疫応答を誘導、増強、または抑制することによる疾患の治療である。免疫療法は、がん細胞を攻撃するために患者自身の免疫系を刺激することができる。がん免疫療法は、通常、化学療法や放射線療法のような従来のがん療法に比べて少ない副作用を有する。抗炎症免疫療法は、自己免疫疾患及び移植片対宿主疾患(GvHD)を治療するための患者の免疫系を下方調節することができる。必要なのは、免疫調節分子を体の細胞及び組織に送達するための改善された方法である。
薬物送達ビヒクルとして、細胞外小胞は、特に遺伝子治療のために、従来の薬物送達方法よりも多くの利益を提供する。細胞外小胞の全身送達は、様々な組織へのこれらの脂質ナノ粒子の分布を生じさせる。研究は、細胞外小胞がヒト免疫系の調節に関与する様々な細胞と相互作用できることを示している。ヒト免疫系を活性化、抑制、または影響を与えるために治療分子を送達するように選択、濃縮、または操作された細胞外小胞は、がん及び他の免疫系関連疾患に対して強力な治療薬であり得る。
ヒト免疫系を上方調節または下方調節し、がんと戦うために患者の免疫系を増強するか、またはGvHD及び自己免疫疾患の症状を緩和させるために患者の免疫系を抑制することができる免疫調節成分を有する、選択、濃縮、または操作された細胞外小胞を含む組成物が、本明細書に提供される。
ヒト免疫系を調節するために細胞外小胞を産生及び利用する方法も、提供される。
したがって、第1の態様では、封入体積を境界する細胞膜を含む細胞外小胞であって、細胞膜が内面及び外面を有している細胞外小胞と、細胞膜に結合するか、または封入体積内に封入された第1の免疫調節成分と、を含む組成物が、本明細書に提供される。
様々な実施形態では、第1の免疫調節成分は、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である。これらの実施形態のいくつかでは、負のチェックポイント調節因子は、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)、T細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質3(TIM-3)、B及びTリンパ球減衰因子(BTLA)、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、T細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)、アデノシンA2a受容体(A2aR)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、CD20、CD39、ならびにCD73からなる群から選択される。
様々な実施形態では、第1の免疫調節成分は、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子は、TNF受容体スーパーファミリーメンバーである。これらの実施形態のいくつかでは、TNF受容体スーパーファミリーメンバーは、CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受容体、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受容体、TACI、BAFF受容体、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP、及びXEDARからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、TNFスーパーファミリーメンバーである。これらの実施形態のいくつかでは、TNFスーパーファミリーメンバーは、TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BBリガンド、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITRリガンド、及びEDA-2からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、TNFスーパーファミリーメンバーは、CD40Lである。ある特定の実施形態では、TNFスーパーファミリーメンバーは、CD27Lである。ある特定の実施形態では、TNFスーパーファミリーメンバーは、OX40Lである。
いくつかの実施形態では、正の共刺激分子は、CD28-スーパーファミリー共刺激分子である。これらの実施形態のいくつかでは、CD28-スーパーファミリー共刺激分子は、ICOSまたはCD28である。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、ICOSL、CD80、またはCD86である。ある特定の実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、CD80である。
いくつかの実施形態では、第1の免疫調節成分は、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、及びIL-15からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、サイトカインは、IL-7である。ある特定の実施形態では、サイトカインは、IL-12である。ある特定の実施形態では、サイトカインは、IL-15である。
いくつかの実施形態では、第1の免疫調節成分は、T細胞受容体(TCR)、T細胞共受容体、主要組織適合性複合体(MHC)、ヒト白血球抗原(HLA)、またはその誘導体である。
いくつかの実施形態では、第1の免疫調節成分は、T細胞受容体または共受容体の活性化剤である。ある特定の実施形態では、T細胞受容体または共受容体の活性化剤は、CD3の活性化剤、任意選択でCD3のアゴニスト抗体である。
いくつかの実施形態では、第1の免疫調節成分は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ-胎児タンパク質(AFP)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、ムチン1(MUC1)、Tn-MUC1、ムチン16(MUC16)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、腫瘍タンパク質p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、プログラム死リガンド1(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、メソテリン、VEGFR、アルファ-葉酸受容体、CE7R、IL-3、がん-精巣抗原、MART-1 gp100、及びTNF関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、参照ゲノム配列に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、対象のゲノム配列に由来する。
いくつかの実施形態では、第1の免疫調節成分は、選択された標的または活性のアゴニストまたはアンタゴニストである。
いくつかの実施形態では、第1の免疫調節成分は、抗体または抗原結合断片である。
いくつかの実施形態では、第1の免疫調節成分は、ポリヌクレオチドである。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、mRNA、miRNA、siRNA、アンチセンスRNA、shRNA、lncRNA、及びdsDNAからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第1の免疫調節成分は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である。
いくつかの実施形態では、第1の免疫調節成分は、該細胞外小胞の外側表面に表示される融合タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、PTGFRNまたはその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の配列は、配列番号3である。
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、エクソソームである。いくつかの他の実施形態では、細胞外小胞は、ナノベシクルである。
ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、第2の免疫調節成分を追加的に含む。
様々な実施形態では、第2の免疫調節成分は、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である。これらの実施形態のいくつかでは、負のチェックポイント調節因子は、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)、T細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質3(TIM-3)、B及びTリンパ球減衰因子(BTLA)、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、T細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)、アデノシンA2a受容体(A2aR)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、CD20、CD39、ならびにCD73からなる群から選択される。
様々な実施形態では、第2の免疫調節成分は、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子は、TNF受容体スーパーファミリーメンバーである。これらの実施形態のいくつかでは、TNF受容体スーパーファミリーメンバーは、CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受容体、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受容体、TACI、BAFF受容体、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP、及びXEDARからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、TNFスーパーファミリーメンバーである。これらの実施形態のいくつかでは、TNFスーパーファミリーメンバーは、TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BBリガンド、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITRリガンド、及びEDA-2からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、TNFスーパーファミリーメンバーは、CD40Lである。ある特定の実施形態では、TNFスーパーファミリーメンバーは、CD27Lである。ある特定の実施形態では、TNFスーパーファミリーメンバーは、OX40Lである。
いくつかの実施形態では、正の共刺激分子は、CD28-スーパーファミリー共刺激分子である。これらの実施形態のいくつかでは、CD28-スーパーファミリー共刺激分子は、ICOSまたはCD28である。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、ICOSL、CD80、またはCD86である。ある特定の実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、CD80である。
いくつかの実施形態では、第2の免疫調節成分は、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、及びIL-15からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、サイトカインは、IL-7である。ある特定の実施形態では、サイトカインは、IL-12である。ある特定の実施形態では、サイトカインは、IL-15である。
いくつかの実施形態では、第2の免疫調節成分は、T細胞受容体(TCR)、T細胞共受容体、主要組織適合性複合体(MHC)、ヒト白血球抗原(HLA)、またはそれらの誘導体である。
いくつかの実施形態では、第2の免疫調節成分は、T細胞受容体または共受容体の活性化剤である。ある特定の実施形態では、T細胞受容体または共受容体の活性化剤は、CD3の活性化剤、任意選択でCD3のアゴニスト抗体である。
いくつかの実施形態では、第2の免疫調節成分は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ-胎児タンパク質(AFP)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、ムチン1(MUC1)、Tn-MUC1、ムチン16(MUC16)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、腫瘍タンパク質p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、プログラム死リガンド1(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、メソテリン、VEGFR、アルファ-葉酸受容体、CE7R、IL-3、がん-精巣抗原、MART-1 gp100、及びTNF関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、参照ゲノム配列に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、対象のゲノム配列に由来する。
いくつかの実施形態では、第2の免疫調節成分は、選択された標的または活性のアゴニストまたはアンタゴニストである。
いくつかの実施形態では、第2の免疫調節成分は、抗体または抗原結合断片である。
いくつかの実施形態では、第2の免疫調節成分は、ポリヌクレオチドである。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、mRNA、miRNA、siRNA、アンチセンスRNA、shRNA、lncRNA、及びdsDNAからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第2の免疫調節成分は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である。
いくつかの実施形態では、第2の免疫調節成分は、該細胞外小胞の外側表面に表示される融合タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、PTGFRNまたはその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質の配列は、配列番号3である。
いくつかの実施形態では、第2の免疫調節成分は、該第1の免疫調節成分と異なる。
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、第3の免疫調節成分を追加的に含む。いくつかの実施形態では、第3の免疫調節成分は、該第1及び第2の免疫調節成分と異なる。
別の態様では、組成物を製造する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、産生細胞を第1、第2、及び/または第3の免疫調節成分で修飾することと、細胞外小胞を産生細胞から得ることと、任意選択で得られた細胞外小胞を単離することと、を含む。いくつかの他の実施形態では、方法は、産生細胞から細胞外小胞を得ることと、得られた細胞外小胞を単離することと、単離された細胞外小胞を、第1、第2、及び/または第3の免疫調節成分で修飾することと、を含む。ある特定の実施形態では、方法は、単離された細胞外小胞を医薬組成物中に製剤化することをさらに含む。
別の態様では、対象におけるがんを治療する方法が、本明細書に提供される。方法は、治療有効量の組成物を対象に投与することを含み、組成物は、対象における免疫応答を上方調節し、それによって対象の免疫系の腫瘍標的化を増強することができる。
別の態様では、対象における移植片対宿主疾患(GvHD)を治療する方法が、本明細書に提供される。方法は、治療有効量の組成物を対象に投与することを含み、組成物は、対象における免疫応答を下方調節し、それによってGvHDの症状を軽減することができる。
別の態様では、対象の自己免疫疾患を治療する方法が、本明細書に提供される。方法は、治療有効量の組成物を対象に投与することを含み、組成物は、対象における免疫応答を下方調節し、それによって対象の免疫活性を抑制することができる。
別の態様では、腫瘍抗原を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するまたは予防する方法であって、その組成物が、腫瘍抗原に対する免疫応答を増強し、それによって、がんに対する対象の免疫応答を増強することができる方法が、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ-胎児タンパク質(AFP)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、ムチン1(MUC1)、Tn-MUC1、ムチン16(MUC16)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、腫瘍タンパク質p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、プログラム死リガンド1(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、メソテリン、VEGFR、アルファ-葉酸受容体、CE7R、IL-3、がん-精巣抗原、MART-1 gp100、及びTNF関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、参照ゲノム配列に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、対象のゲノム配列に由来する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
封入体積を境界する細胞膜を含む細胞外小胞であって、前記細胞膜が内面及び外面を有する前記細胞外小胞と、
前記細胞膜に結合するか、または前記封入体積内に封入された第1の免疫調節成分とを含む、組成物。
(項目2)
前記第1の免疫調節成分が、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記負のチェックポイント調節因子が、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)、T細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質3(TIM-3)、B及びTリンパ球減衰因子(BTLA)、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、T細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)、アデノシンA2a受容体(A2aR)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、CD20、CD39、ならびにCD73からなる群から選択される、項目2に記載の組成物。
(項目4)
前記第1の免疫調節成分が、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である、項目1に記載の組成物。
(項目5)
前記正の共刺激分子がTNF受容体スーパーファミリーメンバーである、項目4に記載の組成物。
(項目6)
前記TNF受容体スーパーファミリーメンバーが、CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受容体、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受容体、TACI、BAFF受容体、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP、及びXEDARからなる群から選択される、項目5に記載の組成物。
(項目7)
前記正の共刺激分子の活性化剤がTNFスーパーファミリーメンバーである、項目4に記載の組成物。
(項目8)
前記TNFスーパーファミリーメンバーが、TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BBリガンド、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITRリガンド、及びEDA-2からなる群から選択される、項目7に記載の組成物。
(項目9)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがCD40Lである、項目8に記載の組成物。
(項目10)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがCD27Lである、項目8に記載の組成物。
(項目11)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがOX40Lである、項目8に記載の組成物。
(項目12)
前記正の共刺激分子がCD28-スーパーファミリー共刺激分子である、項目4に記載の組成物。
(項目13)
前記CD28-スーパーファミリー共刺激分子が、ICOSまたはCD28である、項目12に記載の組成物。
(項目14)
正の共刺激分子の前記活性化剤が、ICOSL、CD80、またはCD86である、項目4に記載の組成物。
(項目15)
正の共刺激分子の前記活性化剤がCD80である、項目14に記載の組成物。
(項目16)
前記第1の免疫調節成分が、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーである、項目1に記載の組成物。
(項目17)
前記サイトカインが、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、及びIL-15からなる群から選択される、項目16に記載の組成物。
(項目18)
前記サイトカインがIL-7である、項目16に記載の組成物。
(項目19)
前記サイトカインがIL-12である、項目16に記載の組成物。
(項目20)
前記サイトカインがIL-15である、項目16に記載の組成物。
(項目21)
前記第1の免疫調節成分が、T細胞受容体(TCR)、T細胞共受容体、主要組織適合性複合体(MHC)、ヒト白血球抗原(HLA)、またはそれらの誘導体である、項目1に記載の組成物。
(項目22)
前記第1の免疫調節成分が、T細胞受容体または共受容体の活性化剤である、項目1に記載の組成物。
(項目23)
T細胞受容体または共受容体の前記活性化剤が、CD3の活性化剤、任意選択でCD3のアゴニスト抗体である、項目22に記載の組成物。
(項目24)
前記第1の免疫調節成分が腫瘍抗原である、項目1に記載の組成物。
(項目25)
前記腫瘍抗原が、アルファ-胎児タンパク質(AFP)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、ムチン1(MUC1)、Tn-MUC1、ムチン16(MUC16)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、腫瘍タンパク質p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、プログラム死リガンド1(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、メソテリン、VEGFR、アルファ-葉酸受容体、CE7R、IL-3、がん-精巣抗原、MART-1 gp100、及びTNF関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される、項目24に記載の組成物。
(項目26)
前記腫瘍抗原が参照ゲノム配列に由来する、項目24または25に記載の組成物。
(項目27)
前記腫瘍抗原が対象のゲノム配列に由来する、項目24または25に記載の組成物。
(項目28)
前記第1の免疫調節成分が、アゴニストまたはアンタゴニストである、項目1~27のいずれかに記載の組成物。
(項目29)
前記第1の免疫調節成分が、抗体または抗原結合断片である、項目1~27のいずれかに記載の組成物。
(項目30)
前記第1の免疫調節成分がポリヌクレオチドである、項目1~27のいずれかに記載の組成物。
(項目31)
前記ポリヌクレオチドが、mRNA、miRNA、siRNA、アンチセンスRNA、shRNA、lncRNA、及びdsDNAからなる群から選択される、項目30に記載の組成物。
(項目32)
前記第1の免疫調節成分が、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である、項目1~27に記載の組成物。
(項目33)
前記第1の免疫調節成分が、前記細胞外小胞の前記外面に表示される融合タンパク質として発現される、項目1~32のいずれかに記載の組成物。
(項目34)
前記融合タンパク質が、PTGFRNまたはその断片もしくはバリアントを含む、項目33に記載の組成物。
(項目35)
前記融合タンパク質の配列が配列番号3である、項目34に記載の組成物。
(項目36)
前記細胞外小胞がエクソソームである、項目1~35のいずれかに記載の組成物。
(項目37)
前記細胞外小胞がナノベシクルである、項目1~32のいずれかに記載の組成物。
(項目38)
薬学的に許容される担体をさらに含む、項目1~37のいずれかに記載の組成物。
(項目39)
前記細胞外小胞が第2の免疫調節成分を追加的に含む、項目1~38のいずれかに記載の組成物。
(項目40)
前記第2の免疫調節成分が、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である、項目39に記載の組成物。
(項目41)
前記負のチェックポイント調節因子が、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)、T細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質3(TIM-3)、B及びTリンパ球減衰因子(BTLA)、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、T細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)、アデノシンA2a受容体(A2aR)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、CD20、CD39、ならびにCD73からなる群から選択される、項目40に記載の組成物。
(項目42)
前記第2の免疫調節成分が、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である、項目39に記載の組成物。
(項目43)
前記正の共刺激分子がTNF受容体スーパーファミリーメンバーである、項目42に記載の組成物。
(項目44)
前記TNF受容体スーパーファミリーメンバーが、CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受容体、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受容体、TACI、BAFF受容体、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP、及びXEDARからなる群から選択される、項目43に記載の組成物。
(項目45)
正の共刺激分子の前記活性化剤がTNFスーパーファミリーメンバーである、項目42に記載の組成物。
(項目46)
前記TNFスーパーファミリーメンバーが、TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BBリガンド、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITRリガンド、及びEDA-2からなる群から選択される、項目45に記載の組成物。
(項目47)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがCD40Lである、項目46に記載の組成物。
(項目48)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがCD27Lである、項目46に記載の組成物。
(項目49)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがOX40Lである、項目46に記載の組成物。
(項目50)
前記正の共刺激分子がCD28-スーパーファミリー共刺激分子である、項目42に記載の組成物。
(項目51)
前記CD28-スーパーファミリー共刺激分子が、ICOSまたはCD28である、項目50に記載の組成物。
(項目52)
正の共刺激分子の前記活性化剤が、ICOSL、CD80、またはCD86である、項目42に記載の組成物。
(項目53)
正の共刺激分子の前記活性化剤がCD80である、項目52に記載の組成物。
(項目54)
前記第2の免疫調節成分が、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーである、項目39に記載の組成物。
(項目55)
前記サイトカインが、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、及びIL-15からなる群から選択される、項目54に記載の組成物。
(項目56)
前記サイトカインがIL-7である、項目54に記載の組成物。
(項目57)
前記サイトカインがIL-12である、項目54に記載の組成物。
(項目58)
前記サイトカインがIL-15である、項目54に記載の組成物。
(項目59)
前記第2の免疫調節成分が、T細胞受容体(TCR)、T細胞共受容体、主要組織適合性複合体(MHC)、ヒト白血球抗原(HLA)、またはそれらの誘導体である、項目39に記載の組成物。
(項目60)
前記第2の免疫調節成分が、T細胞受容体または共受容体の活性化剤である、項目39に記載の組成物。
(項目61)
T細胞受容体または共受容体の前記活性化剤が、CD3の活性化剤、任意選択でCD3のアゴニスト抗体である、項目60に記載の組成物。
(項目62)
前記第2の免疫調節成分が腫瘍抗原である、項目39に記載の組成物。
(項目63)
前記腫瘍抗原が、アルファ-胎児タンパク質(AFP)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、ムチン1(MUC1)、Tn-MUC1、ムチン16(MUC16)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、腫瘍タンパク質p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、プログラム死リガンド1(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、メソテリン、VEGFR、アルファ-葉酸受容体、CE7R、IL-3、がん-精巣抗原、MART-1 gp100、及びTNF関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される、項目62に記載の組成物。
(項目64)
前記腫瘍抗原が参照ゲノム配列に由来する、項目62または63に記載の組成物。
(項目65)
前記腫瘍抗原が対象のゲノム配列に由来する、項目62または63に記載の組成物。
(項目66)
前記第2の免疫調節成分が、アゴニストまたはアンタゴニストである、項目39~65のいずれかに記載の組成物。
(項目67)
前記第2の免疫調節成分が、抗体または抗原結合断片である、項目39~65のいずれかに記載の組成物。
(項目68)
前記第2の免疫調節成分がポリヌクレオチドである、項目39~65のいずれかに記載の組成物。
(項目69)
前記ポリヌクレオチドが、mRNA、miRNA、siRNA、アンチセンスRNA、shRNA、lncRNA、及びdsDNAからなる群から選択される、項目68に記載の組成物。
(項目70)
前記第2の免疫調節成分が、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である、項目39~65に記載の組成物。
(項目71)
前記第2の免疫調節成分が、前記細胞外小胞の外面に表示される融合タンパク質として発現される、項目39~70のいずれかに記載の組成物。
(項目72)
前記融合タンパク質が、PTGFRNまたはその断片もしくはバリアントを含む、項目71に記載の組成物。
(項目73)
前記融合タンパク質の配列が配列番号3である、項目72に記載の組成物。
(項目74)
前記第2の免疫調節成分が前記第1の免疫調節成分と異なる、項目39~73のいずれかに記載の組成物。
(項目75)
前記細胞外小胞が第3の免疫調節成分を追加的に含む、項目39~74のいずれかに記載の組成物。
(項目76)
前記第3の免疫調節成分が、前記第1及び第2の免疫調節成分と異なる、項目75に記載の組成物。
(項目77)
前記項目1~38のいずれかに記載の組成物を製造する方法であって、
産生細胞を、前記第1、第2、及び/または第3の免疫調節成分で修飾することと、
前記細胞外小胞を前記産生細胞から得ることと、
任意選択で、前記得られた細胞外小胞を単離することと、を含む、前記方法。
(項目78)
前記項目1~38のいずれかに記載の組成物を製造する方法であって、
前記細胞外小胞を産生細胞から得ることと、
前記得られた細胞外小胞を単離することと、
前記単離された細胞外小胞を、前記第1、第2、及び/または第3の免疫調節成分で修飾することと、を含む、前記方法。
(項目79)
前記単離された細胞外小胞を医薬組成物中に製剤化することをさらに含む、項目77または78に記載の方法。
(項目80)
対象におけるがんを治療する方法であって、
前記対象に、治療有効量の前記項目1~38のいずれかに記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記対象における免疫応答を上方調節し、それによって前記対象の免疫系の腫瘍標的化を増強することができる、前記方法。
(項目81)
対象における移植片対宿主疾患(GvHD)を治療する方法であって、
前記対象に、治療有効量の項目1~38のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が前記対象における免疫応答を下方調節し、それによってGvHDの症状を軽減することができる、前記方法。
(項目82)
対象における自己免疫疾患を治療する方法であって、
前記対象に、治療有効量の項目1~38のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が前記対象における免疫応答を下方調節し、それによって前記対象の免疫活性を抑制することができる、前記方法。
(項目83)
対象におけるがんを治療するまたは予防する方法であって、
前記対象に、治療有効量の項目24~27のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が前記腫瘍抗原に対する免疫応答を増強し、それによって、がんに対する前記対象の前記免疫応答を増強することができる、前記方法。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
封入体積を境界する細胞膜を含む細胞外小胞であって、前記細胞膜が内面及び外面を有する前記細胞外小胞と、
前記細胞膜に結合するか、または前記封入体積内に封入された第1の免疫調節成分とを含む、組成物。
(項目2)
前記第1の免疫調節成分が、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記負のチェックポイント調節因子が、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)、T細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質3(TIM-3)、B及びTリンパ球減衰因子(BTLA)、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、T細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)、アデノシンA2a受容体(A2aR)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、CD20、CD39、ならびにCD73からなる群から選択される、項目2に記載の組成物。
(項目4)
前記第1の免疫調節成分が、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である、項目1に記載の組成物。
(項目5)
前記正の共刺激分子がTNF受容体スーパーファミリーメンバーである、項目4に記載の組成物。
(項目6)
前記TNF受容体スーパーファミリーメンバーが、CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受容体、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受容体、TACI、BAFF受容体、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP、及びXEDARからなる群から選択される、項目5に記載の組成物。
(項目7)
前記正の共刺激分子の活性化剤がTNFスーパーファミリーメンバーである、項目4に記載の組成物。
(項目8)
前記TNFスーパーファミリーメンバーが、TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BBリガンド、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITRリガンド、及びEDA-2からなる群から選択される、項目7に記載の組成物。
(項目9)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがCD40Lである、項目8に記載の組成物。
(項目10)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがCD27Lである、項目8に記載の組成物。
(項目11)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがOX40Lである、項目8に記載の組成物。
(項目12)
前記正の共刺激分子がCD28-スーパーファミリー共刺激分子である、項目4に記載の組成物。
(項目13)
前記CD28-スーパーファミリー共刺激分子が、ICOSまたはCD28である、項目12に記載の組成物。
(項目14)
正の共刺激分子の前記活性化剤が、ICOSL、CD80、またはCD86である、項目4に記載の組成物。
(項目15)
正の共刺激分子の前記活性化剤がCD80である、項目14に記載の組成物。
(項目16)
前記第1の免疫調節成分が、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーである、項目1に記載の組成物。
(項目17)
前記サイトカインが、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、及びIL-15からなる群から選択される、項目16に記載の組成物。
(項目18)
前記サイトカインがIL-7である、項目16に記載の組成物。
(項目19)
前記サイトカインがIL-12である、項目16に記載の組成物。
(項目20)
前記サイトカインがIL-15である、項目16に記載の組成物。
(項目21)
前記第1の免疫調節成分が、T細胞受容体(TCR)、T細胞共受容体、主要組織適合性複合体(MHC)、ヒト白血球抗原(HLA)、またはそれらの誘導体である、項目1に記載の組成物。
(項目22)
前記第1の免疫調節成分が、T細胞受容体または共受容体の活性化剤である、項目1に記載の組成物。
(項目23)
T細胞受容体または共受容体の前記活性化剤が、CD3の活性化剤、任意選択でCD3のアゴニスト抗体である、項目22に記載の組成物。
(項目24)
前記第1の免疫調節成分が腫瘍抗原である、項目1に記載の組成物。
(項目25)
前記腫瘍抗原が、アルファ-胎児タンパク質(AFP)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、ムチン1(MUC1)、Tn-MUC1、ムチン16(MUC16)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、腫瘍タンパク質p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、プログラム死リガンド1(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、メソテリン、VEGFR、アルファ-葉酸受容体、CE7R、IL-3、がん-精巣抗原、MART-1 gp100、及びTNF関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される、項目24に記載の組成物。
(項目26)
前記腫瘍抗原が参照ゲノム配列に由来する、項目24または25に記載の組成物。
(項目27)
前記腫瘍抗原が対象のゲノム配列に由来する、項目24または25に記載の組成物。
(項目28)
前記第1の免疫調節成分が、アゴニストまたはアンタゴニストである、項目1~27のいずれかに記載の組成物。
(項目29)
前記第1の免疫調節成分が、抗体または抗原結合断片である、項目1~27のいずれかに記載の組成物。
(項目30)
前記第1の免疫調節成分がポリヌクレオチドである、項目1~27のいずれかに記載の組成物。
(項目31)
前記ポリヌクレオチドが、mRNA、miRNA、siRNA、アンチセンスRNA、shRNA、lncRNA、及びdsDNAからなる群から選択される、項目30に記載の組成物。
(項目32)
前記第1の免疫調節成分が、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である、項目1~27に記載の組成物。
(項目33)
前記第1の免疫調節成分が、前記細胞外小胞の前記外面に表示される融合タンパク質として発現される、項目1~32のいずれかに記載の組成物。
(項目34)
前記融合タンパク質が、PTGFRNまたはその断片もしくはバリアントを含む、項目33に記載の組成物。
(項目35)
前記融合タンパク質の配列が配列番号3である、項目34に記載の組成物。
(項目36)
前記細胞外小胞がエクソソームである、項目1~35のいずれかに記載の組成物。
(項目37)
前記細胞外小胞がナノベシクルである、項目1~32のいずれかに記載の組成物。
(項目38)
薬学的に許容される担体をさらに含む、項目1~37のいずれかに記載の組成物。
(項目39)
前記細胞外小胞が第2の免疫調節成分を追加的に含む、項目1~38のいずれかに記載の組成物。
(項目40)
前記第2の免疫調節成分が、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である、項目39に記載の組成物。
(項目41)
前記負のチェックポイント調節因子が、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)、T細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質3(TIM-3)、B及びTリンパ球減衰因子(BTLA)、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、T細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)、アデノシンA2a受容体(A2aR)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、CD20、CD39、ならびにCD73からなる群から選択される、項目40に記載の組成物。
(項目42)
前記第2の免疫調節成分が、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である、項目39に記載の組成物。
(項目43)
前記正の共刺激分子がTNF受容体スーパーファミリーメンバーである、項目42に記載の組成物。
(項目44)
前記TNF受容体スーパーファミリーメンバーが、CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受容体、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受容体、TACI、BAFF受容体、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP、及びXEDARからなる群から選択される、項目43に記載の組成物。
(項目45)
正の共刺激分子の前記活性化剤がTNFスーパーファミリーメンバーである、項目42に記載の組成物。
(項目46)
前記TNFスーパーファミリーメンバーが、TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BBリガンド、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITRリガンド、及びEDA-2からなる群から選択される、項目45に記載の組成物。
(項目47)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがCD40Lである、項目46に記載の組成物。
(項目48)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがCD27Lである、項目46に記載の組成物。
(項目49)
前記TNFスーパーファミリーメンバーがOX40Lである、項目46に記載の組成物。
(項目50)
前記正の共刺激分子がCD28-スーパーファミリー共刺激分子である、項目42に記載の組成物。
(項目51)
前記CD28-スーパーファミリー共刺激分子が、ICOSまたはCD28である、項目50に記載の組成物。
(項目52)
正の共刺激分子の前記活性化剤が、ICOSL、CD80、またはCD86である、項目42に記載の組成物。
(項目53)
正の共刺激分子の前記活性化剤がCD80である、項目52に記載の組成物。
(項目54)
前記第2の免疫調節成分が、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーである、項目39に記載の組成物。
(項目55)
前記サイトカインが、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、及びIL-15からなる群から選択される、項目54に記載の組成物。
(項目56)
前記サイトカインがIL-7である、項目54に記載の組成物。
(項目57)
前記サイトカインがIL-12である、項目54に記載の組成物。
(項目58)
前記サイトカインがIL-15である、項目54に記載の組成物。
(項目59)
前記第2の免疫調節成分が、T細胞受容体(TCR)、T細胞共受容体、主要組織適合性複合体(MHC)、ヒト白血球抗原(HLA)、またはそれらの誘導体である、項目39に記載の組成物。
(項目60)
前記第2の免疫調節成分が、T細胞受容体または共受容体の活性化剤である、項目39に記載の組成物。
(項目61)
T細胞受容体または共受容体の前記活性化剤が、CD3の活性化剤、任意選択でCD3のアゴニスト抗体である、項目60に記載の組成物。
(項目62)
前記第2の免疫調節成分が腫瘍抗原である、項目39に記載の組成物。
(項目63)
前記腫瘍抗原が、アルファ-胎児タンパク質(AFP)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、ムチン1(MUC1)、Tn-MUC1、ムチン16(MUC16)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、腫瘍タンパク質p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、プログラム死リガンド1(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、メソテリン、VEGFR、アルファ-葉酸受容体、CE7R、IL-3、がん-精巣抗原、MART-1 gp100、及びTNF関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される、項目62に記載の組成物。
(項目64)
前記腫瘍抗原が参照ゲノム配列に由来する、項目62または63に記載の組成物。
(項目65)
前記腫瘍抗原が対象のゲノム配列に由来する、項目62または63に記載の組成物。
(項目66)
前記第2の免疫調節成分が、アゴニストまたはアンタゴニストである、項目39~65のいずれかに記載の組成物。
(項目67)
前記第2の免疫調節成分が、抗体または抗原結合断片である、項目39~65のいずれかに記載の組成物。
(項目68)
前記第2の免疫調節成分がポリヌクレオチドである、項目39~65のいずれかに記載の組成物。
(項目69)
前記ポリヌクレオチドが、mRNA、miRNA、siRNA、アンチセンスRNA、shRNA、lncRNA、及びdsDNAからなる群から選択される、項目68に記載の組成物。
(項目70)
前記第2の免疫調節成分が、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である、項目39~65に記載の組成物。
(項目71)
前記第2の免疫調節成分が、前記細胞外小胞の外面に表示される融合タンパク質として発現される、項目39~70のいずれかに記載の組成物。
(項目72)
前記融合タンパク質が、PTGFRNまたはその断片もしくはバリアントを含む、項目71に記載の組成物。
(項目73)
前記融合タンパク質の配列が配列番号3である、項目72に記載の組成物。
(項目74)
前記第2の免疫調節成分が前記第1の免疫調節成分と異なる、項目39~73のいずれかに記載の組成物。
(項目75)
前記細胞外小胞が第3の免疫調節成分を追加的に含む、項目39~74のいずれかに記載の組成物。
(項目76)
前記第3の免疫調節成分が、前記第1及び第2の免疫調節成分と異なる、項目75に記載の組成物。
(項目77)
前記項目1~38のいずれかに記載の組成物を製造する方法であって、
産生細胞を、前記第1、第2、及び/または第3の免疫調節成分で修飾することと、
前記細胞外小胞を前記産生細胞から得ることと、
任意選択で、前記得られた細胞外小胞を単離することと、を含む、前記方法。
(項目78)
前記項目1~38のいずれかに記載の組成物を製造する方法であって、
前記細胞外小胞を産生細胞から得ることと、
前記得られた細胞外小胞を単離することと、
前記単離された細胞外小胞を、前記第1、第2、及び/または第3の免疫調節成分で修飾することと、を含む、前記方法。
(項目79)
前記単離された細胞外小胞を医薬組成物中に製剤化することをさらに含む、項目77または78に記載の方法。
(項目80)
対象におけるがんを治療する方法であって、
前記対象に、治療有効量の前記項目1~38のいずれかに記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記対象における免疫応答を上方調節し、それによって前記対象の免疫系の腫瘍標的化を増強することができる、前記方法。
(項目81)
対象における移植片対宿主疾患(GvHD)を治療する方法であって、
前記対象に、治療有効量の項目1~38のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が前記対象における免疫応答を下方調節し、それによってGvHDの症状を軽減することができる、前記方法。
(項目82)
対象における自己免疫疾患を治療する方法であって、
前記対象に、治療有効量の項目1~38のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が前記対象における免疫応答を下方調節し、それによって前記対象の免疫活性を抑制することができる、前記方法。
(項目83)
対象におけるがんを治療するまたは予防する方法であって、
前記対象に、治療有効量の項目24~27のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が前記腫瘍抗原に対する免疫応答を増強し、それによって、がんに対する前記対象の前記免疫応答を増強することができる、前記方法。
ヒト免疫系を調節することができる細胞外小胞が、本明細書に開示される。細胞外小胞を産生する方法ならびにこれらの細胞外小胞を用いてがん及び他の免疫系関連疾患を治療する方法も、提供される。
本発明がより詳細に説明される前に、本発明は、説明される具体的な実施形態に限定されないことを理解されるべきであり、そのような実施形態は、もちろん変化することができる。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態のみを説明する目的であり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することが意図されるものではないことも、理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り下限の単位の10分の1までの各介在値は、その範囲の上限値と下限値と、その記載範囲内の任意の他の記載値または介在値との間で、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲に独立して含まれることができ、また、記載範囲における任意の具体的に除外された限界値を条件として、本発明内に包含される。記載範囲が限界値の1つまたは両方を含む場合、それらの含まれた限界値のいずれかまたは両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価の任意の方法及び材料は、本発明の実施または試験に使用されることができるが、代表的な例示的な方法及び材料が、説明される。
本明細書中で引用される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される方法及び/または材料を開示及び説明するために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、任意の任意選択的要素を除外するように起草されることができることを、さらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲要素の列挙に関連した「単なる」、「のみ」などのような排他的用語の使用、または負の限定の使用の先行基準として機能することが意図される。
本開示を読むと当業者に明らかになるように、本明細書に説明及び例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかから容易に分離され得るか、またはそれらと組み合わされ得る別個の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序、または論理的に可能な任意の他の順序で行われることができる。
主題発明をさらに説明するにあたって、主題方法を実践する際の使用のための主題システムは、より詳細に議論され、続いて関連する方法の見直しが行われる。
本明細書で使用される際、用語「細胞外小胞」は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有する全ての膜結合小胞を含む。一般に、細胞外小胞は、直径20nm~1000nmの範囲であり、内側空間内に、細胞外小胞の外側表面に表示された、及び/または膜にまたがるいずれかの様々な巨大分子輸送物を含むことができる。輸送物は、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び/またはそれらの組み合わせを含むことができる。例として、限定されないが、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接または間接操作(例えば、連続押出またはアルカリ溶液による処理による)によって細胞に由来する小胞、小胞化オルガネラ、及び生体細胞によって産生される小胞(例えば、原形質膜の直接発芽または後期エンドソームと原形質膜との融合によって)が含まれる。細胞外小胞は、生体または死体、外植された組織もしくは臓器、及び/または培養細胞に由来することができる。
本明細書で使用される際、用語「エクソソーム」は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小さい(直径20~300nm、より好ましくは直径40~200nm)小胞を指し、直接原形質膜発芽によって、または後期エンドソームと原形質膜との融合によって生成される。エクソソームは、細胞外小胞の一種である。エクソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード(例えば、治療剤)、レシーバー(例えば、標的部分)、ポリヌクレオチド(例えば、核酸、RNA、もしくはDNA)、糖(例えば、単純糖、多糖類、もしくはグリカン)、または他の分子を含む。エクソソームは、産生細胞に由来し、そのサイズ、密度、生化学パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。
本明細書で使用される際、用語「ナノベシクル」は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小さい(直径20~250nm、より好ましくは直径30~150nm)小胞を指し、ナノベシクルが操作なしに産生細胞によって産生されないように、直接または間接操作によって細胞から生成される。産生細胞の適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ナノベシクルの産生は、いくつかの事例では、産生細胞の破壊を生じ得る。好ましくは、ナノベシクルの集団は、原形質膜から直接発芽するか、または後期エンドソームと原形質膜との融合による産生細胞に由来する小胞を実質的に含まない。ナノベシクルは、細胞外小胞の一種である。ナノベシクルは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード(例えば、治療剤)、レシーバー(例えば、標的部分)、ポリヌクレオチド(例えば、核酸、RNA、もしくはDNA)、糖(例えば、単純糖、多糖類、もしくはグリカン)、または他の分子を含む。ナノベシクルは、操作に従って産生細胞に由来すると、そのサイズ、密度、生化学パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。
用語「細胞外小胞送達」または「細胞外小胞の送達」は、対象の標的組織、細胞、及び/または臓器への細胞外小胞の投与及び局在化を指す。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、標的細胞の細胞質に送達されることができる。他の実施形態では、免疫調節成分は、標的細胞の膜に送達される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞の膜は、標的細胞の膜と融合する。
本明細書で使用される際、用語「産生細胞」は、細胞外小胞が単離され得る任意の細胞を指す。産生細胞は、細胞外小胞の供給源として機能する細胞である。産生細胞は、タンパク質、脂質、糖、または核酸成分を細胞外小胞と共有することができる。いくつかの実施形態では、産生細胞は、修飾細胞または合成細胞である。いくつかの実施形態では、産生細胞は、培養細胞または単離された細胞である。ある特定の実施形態では、産生細胞は、細胞株である。ある特定の他の実施形態では、産生細胞は、一次細胞である。いくつかの具体的な実施形態では、産生細胞は、免疫細胞である。
本明細書で使用される「膜」は、内部空間を外部空間から分離する境界層であり、1つ以上の生物学的化合物、典型的には脂質、及び任意選択でポリペプチド及び/または炭水化物を含む。いくつかの実施形態では、膜は、脂質及び脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。これらの実施形態のいくつかでは、膜は、グリカンのような1つ以上のポリペプチド及び/または1つ以上の多糖類をさらに含む。細胞外小胞は、本明細書に定義される膜を含む。
本明細書で使用される際、用語「免疫調節成分」は、細胞外小胞と接触した標的(例えば、標的細胞)に作用し、免疫系を調節する治療剤を指す。細胞外小胞及び/または産生細胞へと導入されることができる免疫調節成分は、チェックポイント阻害剤の調節剤もしくはチェックポイント阻害剤のリガンド、表面抗原及びその誘導体、サイトカイン及びその誘導体のような治療剤を含む。免疫調節成分は、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、ならびに抗原結合断片、またはsiRNA、miRNA、lncRNA、及びDNAのようなポリヌクレオチドも含むことができる。
用語「レシーバー」は、細胞外小胞を標的に誘導する、及び/または対象における細胞外小胞と標的との相互作用を促進する分子を指す。いくつかの実施形態では、レシーバーは、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、レシーバーは、対象の組織中の免疫調節成分の濃度を増加させることができる。レシーバーの例は、表3に列挙される例を含むが、これらに限定されない。
用語「標的」は、細胞、病原体、代謝産物、ポリペプチド複合体、または免疫細胞もしくはがん細胞のような、対象の組織中に存在するか循環系もしくはリンパ系中を循環する任意の分子もしくは構造を指す。標的の例は、表4に列挙される例を含むが、これらに限定されない。
「治療剤」または「治療分子」は、有効量で存在する場合、それを必要とする対象に対して所望の治療効果、薬理学的及び/または生理学的効果を生み出す化合物または分子を含む。「治療剤」または「治療分子」は、対象に投与されると、対象に対して測定可能または伝達可能な効果を有し、例えば、疾患、障害または状態の症状を緩和または減少させる任意の化合物、例えば、低分子薬物、または生物製剤(例えば、ポリペプチド薬物もしくは核酸薬物)を含む。
本明細書で使用される際、用語「抗体」は、天然または部分的もしくは完全に合成的に産生される免疫グロブリン、及びその断片を包含する。本用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインと相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。「抗体」は、抗原に特異的に結合し認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドをさらに含む。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、その断片を含むこと、かつ、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス-ヒト、マウス-霊長類、霊長類-ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、例えば、scFv、(scFv)2、Fab、Fab’、及びF(ab’)2、F(ab1)2、Fv、dAb、及びFd断片のような抗体断片、ダイアボディ、ならびに抗体関連ポリペプチドをさらに含むことを意味する。抗体は、所望の生物学的活性または機能を示す限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。
本明細書で使用される用語「抗原結合断片」は、無傷の免疫グロブリンの断片、及び抗原に特異的に結合する能力を有する抗原結合領域を含むポリペプチドの任意の部分を指す。例えば、抗原結合断片は、F(ab’)2断片、Fab’断片、Fab断片、Fv断片、またはscFv断片であり得るが、これらに限定されない。Fab断片は、1つの抗原結合部位を有し、かつ軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、及び重鎖の第1の定常領域CH1を含有する。Fab’断片は、Fab’断片が重鎖CH1領域のC末端に少なくとも1つのシステイン残基を含む重鎖のヒンジ領域を追加的に含む点でFab断片とは異なる。F(ab’)2断片が生成され、それにより、Fab’断片のシステイン残基がヒンジ領域でジスルフィド結合によって結合される。Fv断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有する最小抗体断片であり、Fv断片を産生するための組換え技術は、当該技術分野において周知である。二本鎖Fv断片は、重鎖可変領域が非共有結合によって軽鎖可変領域に連結された構造を有することができる。一本鎖Fv(scFv)断片は、重鎖可変領域がペプチドリンカーを介して軽鎖可変領域に共有結合されるか、または重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がそのC末端で互いに直接連結された、二本鎖Fv断片中のような二量体構造を一般に有することができる。抗原結合断片は、プロテアーゼを使用して得られ(例えば、抗体全体をパパインで消化してFab断片を得、ペプシンで消化してF(ab’)2断片を得る)かつ、遺伝子組換え技術によって調製され得る。dAb断片は、VHドメインからなる。一本鎖抗体分子は、いくつかの個々の分子、例えば、二量体、三量体、または他のポリマーを有するポリマーを含むことができる。
語句「核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。「核酸分子」は、染色体DNA及び自己複製プラスミド、ベクター、mRNA、tRNA、siRNA、miRNA、などを含む。核酸分子は組換え可能であり、核酸が細胞へと導入される際に外因性ポリペプチドが発現され得る。
用語「アゴニスト」は、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を生み出す分子を指す。受容体は、内因性アゴニストまたは外因性アゴニストいずれかによって活性化されることができる。内因性アゴニストの非限定的な例は、ホルモン及び神経伝達物質を含む。外因性アゴニストの非限定的な例は、薬物を含む。アゴニストは、完全アゴニスト、部分アゴニスト、または逆アゴニストであり得る。
用語「アンタゴニスト」は、受容体に結合すると生物学的応答そのものを誘発するよりもむしろ、アゴニスト媒介性応答を遮断または減衰させる分子を指す。多くのアンタゴニストは、受容体上の構造的に定義された結合部位で内因性リガンドまたは基質と競合することによってその効力を達成する。アンタゴニストの非限定的な例は、アルファブロッカー、ベータブロッカー、及びカルシウムチャネルブロッカーを含む。アンタゴニストは、競合的、非競合的(non-competitive)、または競合的でない(uncompetitive)アンタゴニストであり得る。
本明細書で使用される際、タンパク質の「断片」という用語は、天然に存在するタンパク質と比較してN末端及び/またはC末端が欠失したタンパク質を指す。好ましくは、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、またはATPトランスポーターの断片は、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持する。このような断片は、「機能的断片」としても呼ばれる。断片がその意味で機能的断片であるかどうかは、ウエスタンブロット、FACS分析、及び例えばGFPのような自己蛍光タンパク質との断片の融合物を含む、エクソソームのタンパク質含有量を決定する任意の技術分野で既知の方法によって評価されることができる。具体的な実施形態では、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATPトランスポーターの断片は、エクソソームを特異的に標的とする天然に存在するPTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、またはATPトランスポーターの能力の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%を保持する。
本明細書で使用される際、タンパク質の「バリアント」という用語は、当該技術分野で既知の方法によるアラインメント時に、ある特定のアミノ酸配列同一性を別のタンパク質と共有するタンパク質を指す。タンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフトまたは再配列を含むことができる。具体的な実施形態では、バリアントは、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATPトランスポーター、またはPTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、またはATPトランスポーターの断片と少なくとも70%の同一性を有するバリアントである。いくつかの実施形態では、PTGFRNのバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号1に従うPTGFRNまたはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、BSGのバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号9に従うBSGまたはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、IGSF2のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号34に従うIGSF2またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、IGSF3のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号20に従うIGSF3またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、IGSF8のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号14に従うIGSF8またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ITGB1のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号21に従うITGB1またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ITGA4のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号22に従うITGA4またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、SLC3A2のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号23に従うSLC3A2またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ATP1A1のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号24に従うATP1A1またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ATP1A2のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号25に従うATP1A2またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ATP1A3のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号26に従うATP1A3またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ATP1A4のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号27に従うATP1A4またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ATP1B3のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号28に従うATP1B3またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ATP2B1のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号29に従うATP2B1またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ATP2B2のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号30に従うATP2B2またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ATP2B3のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号31に従うATP2B3またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ATP2B4のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号32に従うATP2B4またはその機能的断片と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%の配列同一性を共有する。上記の場合の各々では、バリアントまたは断片のバリアントは、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持することが好ましい。
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムは、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)、Needleman and Wunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970)、Pearson and Lipman,Methods in Mol.Biol.24:307-31(1988)、Higgins and Sharp,Gene 73:15 237-44(1988)、Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)Corpet et al.,Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)、Huang et al.,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)、及びPearson et al.,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)において説明される。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)[Altschul 20 et al.,J.Mol.Biol.215:403-10(1990)Jは、配列解析プログラムblastp、blasm、blastx、tblastn、及びtblastxに関連して使用するために、国立生物情報センター(NBCI,Bethesda,Md.)及びインターネット上を含むいくつかの供給源から入手可能である。BLAST、及びプログラムを使用して配列識別を決定する方法の説明は、NIH(国立衛生研究所)のNCBI(国立バイオテクノロジー情報センター)の公式ウェブサイトでアクセスすることができる。
本明細書に提供される任意のタンパク質の列挙は、タンパク質の機能的バリアントを包含する。タンパク質の「機能的バリアント」という用語は、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持するタンパク質のバリアントを指す。
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、例えば、薬学的に許容される担体及び賦形剤などの1つ以上の他の化学成分と混合もしくは混ぜ合わされ、または懸濁された細胞外小胞のような、本明細書に記載の化合物のうちの1つ以上を指す。医薬組成物の1つの目的は、対象への細胞外小胞の調製物の投与を容易にすることである。用語「薬学的に許容される」及びその文法的変形は、組成物の投与を禁止する程度の望ましくない生理的効果の産生なしに対象に投与することができる組成物、担体、希釈剤及び試薬を指す。用語「賦形剤」または「担体」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加された不活性物質を指す。用語「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、米国連邦政府の規制機関によって承認されたか、もしくはヒトを含む動物に使用するために米国薬局方に列挙された薬剤のいずれか、同様に対象に著しい刺激を与えず、かつ投与される化合物の生物学的活性及び特性を抑制しない任意の担体もしくは希釈剤を包含する。医薬組成物を調製する際に有用であり、かつ一般に安全であり、無毒であり、及び望ましい賦形剤ならびに担体が含まれる。
本明細書で使用される際、用語「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」、または「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、同様に「抽出された」及び「抽出すること」は互換的に使用され、1つ以上の精製のプロセス、例えば所望の細胞外小胞調製物の選択もしくは濃縮を経た、所望の細胞外小胞の調製物の状態(例えば、複数の既知または未知の量及び/または濃度)を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される単離することまたは精製することは、産生細胞を含有する試料から細胞外小胞を除去する、部分的に除去する(例えば、画分)プロセスである。いくつかの実施形態では、単離された細胞外小胞組成物は検出可能な望ましくない活性を有しないか、または代替的に、望ましくない活性のレベルもしくは量は許容可能なレベルもしくは量以下である。他の実施形態では、単離された細胞外小胞組成物は、許容される量及び/または濃度以上の所望の細胞外小胞の量及び/または濃度を有する。他の実施形態では、単離された細胞外小胞組成物は、組成物が得られる出発物質(例えば、産生細胞調製物)と比較して濃縮される。この濃縮は、出発物質と比較して10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、99.999%、99.9999%、または99.9999%超であり得る。いくつかの実施形態では、単離された細胞外小胞調製物は、残留生物学的製剤を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、単離された細胞外小胞調製物は、任意の汚染生体物質を含まない100%遊離、99%遊離、98%遊離、97%遊離、96%または95%である。残留生物学的製剤は、非生物材料(化学物質を含む)、または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物を含むことができる。残留生物学的製剤を実質的に含まないことは、細胞外小胞組成物が検出可能な産生細胞を含有しないこと、及び細胞外小胞のみが検出可能であることも意味し得る。
用語「投与」、「投与すること」ならびにそれらの変異形は、細胞外小胞または薬剤のような組成物を対象へと導入することを指し、かつ組成物または薬剤の同時及び順次導入を含む。組成物または薬剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口(静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、もしくは皮下)、直腸、リンパ内、髄腔内、腫瘍内、眼周または局所を含む任意の好適な経路による。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。好適な投与経路は、組成物または薬剤がその意図された機能を実行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈へと導入することによって投与される。
本明細書で使用される際、用語「調節する」、「調節すること」、「修飾する」、及び/または「調節因子」は、増加または減少、例えば直接または間接的に、促進する/刺激する/上方調節すること、もしくは干渉する/阻害する/下方調節することによって、例えばアンタゴニストもしくはアゴニストとして作用するような特定の濃度、レベル、発現、機能または行動を変化させる能力を一般に指す。いくつかの事例では、調節剤は、対照と比較して、または一般に期待されるであろう活性の平均レベルと比較して、または活性の対照レベルと比較して、ある特定の濃度、レベル、活性もしくは機能を増加及び/または減少させることができる。
用語「十分な量」は、所望の効果を生み出すのに十分な量、例えば、対象における状態を調節するのに十分な量を意味する。
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。治療有効量は、予防が治療であると考えられ得るため、「予防有効量」であり得る。
本明細書で使用される際、用語「実質的に」または「実質的な」は、例えば、具体的な空間における実体の存在、レベル、もしくは濃度、ある実体の別の実体に対する効果、または治療の効果を指す。例えば、実体の活性、レベルまたは濃度は、増加がベースラインと比較して2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、または1000倍である場合、実質的に増加する。実体の活性、レベルまたは濃度は、増加がベースラインと比較して5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、または500%である場合も実質的に増加する。
用語「in vivo」は、生体内で生じるプロセスを指す。
本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒト哺乳動物の両方を含む。
本出願で使用される省略形は以下を含む。「mRNA」はメッセンジャーRNAを指し、「miRNA」はマイクロRNAを指し、「siRNA」は低分子干渉RNAを指し、「アンチセンスRNA」はmRNAに相補的な一本鎖RNAを指し、「shRNA」は小または短ヘアピンRNAを指し、「lncRNA」は長鎖非コードRNAを指し、「dsDNA」は二本鎖DNAを指す。
組成物
本開示の態様は、免疫系を調節することができる組成物を含む。組成物は、細胞膜を含む細胞外小胞と、細胞膜に結合するか、または膜結合封入体積内に封入された免疫調節成分とを含む。
本開示の態様は、免疫系を調節することができる組成物を含む。組成物は、細胞膜を含む細胞外小胞と、細胞膜に結合するか、または膜結合封入体積内に封入された免疫調節成分とを含む。
細胞外小胞
様々な実施形態では、組成物は、細胞外小胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来小胞である。
様々な実施形態では、組成物は、細胞外小胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来小胞である。
様々な実施形態では、細胞外小胞は、それが由来する細胞よりも小さい直径を有する膜結合小胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、約20~100nm、20~200nm、20~300nm、20~400nm、20~500nm、20~600nm、20~700nm、20~800nm、20~900nm、30~100nm、30~200nm、30~300nm、30~400nm、30~500nm、30~600nm、30~700nm、30~800nm、30~900nm、40~100nm、40~200nm、40~300nm、40~400nm、40~500nm、40~600nm、40~700nm、40~800nm、40~900nm、50~150nm、50~500nm、50~750nm、100~200nm、100~500nm、または500~1000nmのような、約20~1000nmの最長寸法を有する。
ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、エクソソームである。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、ナノベシクルである。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、アポトーシス小体である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、細胞の断片である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、直接または間接操作によって細胞に由来する小胞である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、小胞化オルガネラである。様々な実施形態では、細胞外小胞は、生体細胞によって産生される小胞である。
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、生体に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、死体に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、外植された組織に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、外植された臓器に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、培養細胞に由来する。これらの実施形態のいくつかでは、細胞外小胞が細胞培養系で生成される際、細胞外小胞はさらに単離される(例えば、細胞外小胞を培養細胞から分離することによって)。分離は、沈降によって達成されることができる。例えば、細胞外小胞は、0.5~2.0、0.6~1.0、0.7~1.0、0.8~1.0、0.9~1.0、1.0~1.1、1.1~1.2、1.2~1.3、1.4~1.5、1.0~1.5、1.5~2.0、及び1.0~2.0kg/m3の比密度(specific density)を有することができる。分離は、アフィニティ精製によって達成されることもできる。例えば、細胞外小胞は、細胞外小胞を含む集団を樹脂に結合することによって精製されることができ、該樹脂は細胞外小胞の表面上の1つ以上の標的タンパク質に対して特異的親和性を有する複数のリガンドを含む。標的タンパク質は、テトラスパニン(例えば、CD63、CD81、CD9)、EWIタンパク質/免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー(例えば、PTGFRN、IGSF8、IGSF3)、インテグリン(例えば、ITGB1、ITGA4)、ATPトランスポータータンパク質(例えば、ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)、SLC3A2、BSG、またはCD98hcであり得る。標的タンパク質は追加的に、エクソソームの表面上に表示される免疫調節成分であってもよい。
様々な実施形態では、細胞外小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、糖をさらに含む。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、ポリヌクレオチドをさらに含む。
様々な実施形態では、細胞外小胞膜は、内面及び外面を含み、かつ内部空間を封入する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、ペイロードをさらに含む。ある特定の実施形態では、ペイロードは、内部空間内に封入される。ある特定の実施形態では、ペイロードは、細胞外小胞の外側表面上に表示される。ある特定の実施形態では、ペイロードは、細胞外小胞の膜にまたがっている。様々な実施形態では、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び/またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、レシーバーをさらに含む。
エクソソーム
様々な実施形態では、細胞外小胞は、エクソソームである。ある特定の実施形態では、エクソソームは、産生細胞によって分泌される小さい膜結合小胞である。
様々な実施形態では、細胞外小胞は、エクソソームである。ある特定の実施形態では、エクソソームは、産生細胞によって分泌される小さい膜結合小胞である。
いくつかの実施形態では、産生細胞由来のエクソソームは、約20~290nm、20~280nm、20~270nm、20~260nm、20~250nm、20~240nm、20~230nm、20~220nm、20~210nm、20~200nm、20~190nm、20~180nm、20~170nm、20~160nm、20~150nm、20~140nm、20~130nm、20~120nm、20~110nm、20~100nm、20~90nm、20~80nm、20~70nm、20~60nm、20~50nm、20~40nm、20~30nm、30~300nm、30~290nm、30~280nm、30~270nm、30~260nm、30~250nm、30~240nm、30~230nm、30~220nm、30~210nm、30~200nm、30~190nm、30~180nm、30~170nm、30~160nm、30~150nm、30~140nm、30~130nm、30~120nm、30~110nm、30~100nm、30~90nm、30~80nm、30~70nm、30~60nm、30~50nm、30~40nm、40~300nm、40~290nm、40~280nm、40~270nm、40~260nm、40~250nm、40~240nm、40~230nm、40~220nm、40~210nm、40~200nm、40~190nm、40~180nm、40~170nm、40~160nm、40~150nm、40~140nm、40~130nm、40~120nm、40~110nm、40~100nm、40~90nm、40~80nm、40~70nm、40~60nm、40~50nm、50~300nm、50~290nm、50~280nm、50~270nm、50~260nm、50~250nm、50~240nm、50~230nm、50~220nm、50~210nm、50~200nm、50~190nm、50~180nm、50~170nm、50~160nm、50~150nm、50~140nm、50~130nm、50~120nm、50~110nm、50~100nm、50~90nm、50~80nm、50~70nm、50~60nm、60~300nm、60~290nm、60~280nm、60~270nm、60~260nm、60~250nm、60~240nm、60~230nm、60~220nm、60~210nm、60~200nm、60~190nm、60~180nm、60~170nm、60~160nm、60~150nm、60~140nm、60~130nm、60~120nm、60~110nm、60~100nm、60~90nm、60~80nm、60~70nm、70~300nm、70~290nm、70~280nm、70~270nm、70~260nm、70~250nm、70~240nm、70~230nm、70~220nm、70~210nm、70~200nm、70~190nm、70~180nm、70~170nm、70~160nm、70~150nm、70~140nm、70~130nm、70~120nm、70~110nm、70~100nm、70~90nm、70~80nm、80~300nm、80~290nm、80~280nm、80~270nm、80~260nm、80~250nm、80~240nm、80~230nm、80~220nm、80~210nm、80~200nm、80~190nm、80~180nm、80~170nm、80~160nm、80~150nm、80~140nm、80~130nm、80~120nm、80~110nm、80~100nm、80~90nm、90~300nm、90~290nm、90~280nm、90~270nm、90~260nm、90~250nm、90~240nm、90~230nm、90~220nm、90~210nm、90~200nm、90~190nm、90~180nm、90~170nm、90~160nm、90~150nm、90~140nm、90~130nm、90~120nm、90~110nm、90~100nm、100~300nm、110~290nm、120~280nm、130~270nm、140~260nm、150~250nm、160~240nm、170~230nm、180~220nm、または190~210nmのような、約20~300nmの最長寸法を有する。
特に好ましい実施形態では、本明細書に記載の産生細胞由来のエクソソームは、約30~100nmの最長寸法を有する。別の好ましい実施形態では、産生細胞由来のエクソソームは、約20~300nmの最長寸法を有する。別の好ましい実施形態では、産生細胞由来のエクソソームは、約40~200nmの最長寸法を有する。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、90%のエクソソームが最長寸法20~300nmを有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、95%のエクソソームが最長寸法20~300nmを有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、99%のエクソソームが最長寸法20~300nmを有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、90%のエクソソームが最長寸法40~200nmを有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、95%のエクソソームが最長寸法40~200nmを有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、99%のエクソソームが最長寸法40~200nmを有する集団を含む。他の好ましい実施形態では、本明細書に記載のエクソソームまたはエクソソーム集団のサイズは、以下に記載される方法に従って測定される。
いくつかの実施形態では、エクソソームは、産生細胞によって生成される。いくつかの実施形態では、エクソソームの膜は、産生細胞に由来する1つ以上の分子を含む。いくつかの実施形態では、エクソソームは、細胞培養系で生成され、単離される(例えば、エクソソームを産生細胞から分離することによって)。分離は、沈降によって達成されることができる。例えば、エクソソームは、0.5~2.0、0.6~1.0、0.7~1.0、0.8~1.0、0.9~1.0、1.0~1.1、1.1~1.2、1.2~1.3、1.4~1.5、1.0~1.5、1.5~2.0、及び1.0~2.0kg/m3の比密度を有することができる。分離は、アフィニティ精製によって達成されることもできる。例えば、細胞外小胞は、細胞外小胞を含む集団を樹脂に結合することによって精製されることができ、該樹脂は細胞外小胞の表面上の1つ以上の標的タンパク質に対して特異的親和性を有する複数のリガンドを含む。1つ以上の標的タンパク質は、テトラスパニン(例えば、CD63、CD81及び/またはCD9)、EWIタンパク質/免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー(例えば、PTGFRN、IGSF8及び/またはIGSF3)、インテグリン(例えば、ITGB1及び/またはITGA4)、ATPトランスポータータンパク質(例えば、ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3及び/またはATP2B4)、SLC3A2、BSG、またはCD98hcであり得る。標的タンパク質は追加的に、エクソソームの表面上に表示される免疫調節成分であってもよい。
いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、内面及び外面を含む。ある特定の実施形態では、内面は、エクソソームの内側コアに面する。ある特定の実施形態では、外面は、エンドソーム、多胞体、または産生細胞もしくは標的細胞の膜/細胞質と接触し得る。
いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、脂質及び脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。いくつかの実施形態では、脂質及び脂肪酸は、表1に列挙されるもののうちの1つ以上であり得る。
ある特定の実施形態では、エクソソームは、内側リーフレット及び外側リーフレットからなる脂質二重層を含む。内側リーフレット及び外側リーフレットの組成物は、当該技術分野で既知の二重層間分布アッセイによって決定されることができ、例えば、Kuypers et al.Biohim Biophys Acta 1985 819:170を参照されたい。いくつかの実施形態では、外側リーフレットの組成物は、約70~90%のコリンリン脂質、約0~15%の酸性リン脂質、及び約5~30%のホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの実施形態では、内側リーフレットの組成物は、約15~40%のコリンリン脂質、約10~50%の酸性リン脂質、及び約30~60%のホスファチジルエタノールアミンである。
いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、1つ以上のポリペプチドをさらに含む。ある特定の実施形態では、エクソソームは、以下、スペクトリン、ミオシン様ポリペプチド、バンド3、SLC4A1、アクチン、アクチン様ポリペプチド、グリセルアルデヒド3-P脱水素酵素(G3PD)、テトラスパニン(例えば、CD63、CD81及び/またはCD9)、Alix及びTSG101、インテグリン(例えば、ITGB1及び/またはITGA4)、セレクチン、CR1、TNFRI、タンパク質分解酵素、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合型タンパク質もしくはヒストン、EWIタンパク質/免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー(例えば、PTGFRN、IGSF8及び/またはIGSF3)、ATPトランスポータータンパク質(例えば、ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3及び/またはATP2B4)、SLC3A2、BSG、またはCd98hcを含むがこれらに限定されないリストから選択される1つ以上のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、エクソソームは、表2から選択される少なくとも1つのポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、エクソソームは、その表面にポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、エクソソームは、1つ以上のポリペプチドを含有するために修飾される。いくつかの実施形態では、産生細胞は、1つ以上のポリペプチドを含有するために修飾される。いくつかの実施形態では、産生細胞は1つ以上のポリペプチドを天然に含有し、そこに由来するエクソソームもポリペプチドを含有する。任意の所望の表面マーカーのレベルは、エクソソーム上で直接修飾されることができる(例えば、複合体を組み換えて産生されたポリペプチドと接触させて、複合体の膜に挿入またはコンジュゲーションをもたらすことによって)。あるいは、または加えて、任意の所望の表面マーカーのレベルは、産生細胞上で直接修飾されることができる(例えば、複合体を組み換えて産生されたポリペプチドと接触させて、細胞の膜に挿入またはコンジュゲーションをもたらすことによって)。あるいは、産生細胞は、外因性核酸を産生細胞内へと形質導入して所望の表面マーカーを発現させることによって修飾されることができる。表面マーカーは既に産生細胞上に天然に存在することができ、この場合、外因性構築物は産生細胞内または産生細胞上のマーカーの過剰発現及びマーカーの濃度の増加をもたらし得る。あるいは、天然に発現された表面マーカーは、産生細胞から除去されることができる(例えば、産生細胞内で遺伝子サイレンシングを誘導することによって)。ポリペプチドは、異なる機能性をエクソソームに付与することができる(例えば、特異的標的化能力、送達機能(例えば、融合分子)、酵素機能、インビボでの半減期の増加または減少など)。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、CD47、CD55、CD49、CD40、CD133、CD59、グリピカン-1、CD9、CD63、CD81、インテグリン、セレクチン、レクチン、及びカドヘリンを含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、エクソソームは、その表面上に1つ以上のポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、最近エクソソームの表面上で濃縮されることが特定されたタンパク質の群から選択される(その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第62/550,543号で詳細に説明される)。このポリペプチドの群は、プロスタグランジンF2受容体陰性調節因子(PTGFRN)、バシギン(BSG)、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー3(IGSF3)、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー8(IGSF8)、インテグリンベータ-1(ITGB1)、インテグリンアルファ-4(ITGA4)、4F2細胞表面抗原重鎖(SLC3A2)、及びATPトランスポータータンパク質のクラス(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)を含む。
いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、グリカンのような1つ以上の多糖類をさらに含む。
いくつかの実施形態では、エクソソームは、ペイロード(治療剤)を標的に送達する。ペイロードは、エクソソームと接触した標的(例えば、標的細胞)に作用する治療剤である。接触は、インビトロまたは対象において生じ得る。エクソソーム及び/または産生細胞へと導入されることができるペイロードは、ヌクレオチド(例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含むか、または転写を中断させるヌクレオチド)、核酸(例えば、酵素のようなポリペプチドをコードするDNAもしくはmRNA分子、またはmiRNA、dsDNA、lncRNA、もしくはsiRNAのような調節機能を有するRNA分子)、アミノ酸(例えば、検出可能な部分を含むアミノ酸または翻訳を中断させる毒素)、ポリペプチド(例えば、酵素)、脂質、炭水化物、ならびに低分子(例えば、低分子薬物及び毒素)のような治療剤を含む。
エクソソームは、膜融合を介して標的細胞と相互作用し、エクソソーム組成物中のペイロード(例えば、治療剤)を標的細胞の表面または細胞質に送達することができる。いくつかの実施形態では、膜融合は、エクソソームと標的細胞の原形質膜との間で生じる。他の実施形態では、膜融合は、エクソソームと標的細胞のエンドソーム膜との間で生じる。
いくつかの実施形態では、エクソソームは、レシーバーポリペプチドを含む。レシーバーポリペプチドは、合成されることができる。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチドは、産生細胞(例えば、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸が、産生細胞内へと導入される)内、または産生細胞外で作成された組換えレシーバーポリペプチド(例えば、タンパク質発現系によって合成される)内へと導入される。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチド(例えば、組換え産生ポリペプチド)は、直接(例えば、エクソソームが産生細胞から単離された後)エクソソームへと導入される。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチドは、エクソソームの表面上にあり得る。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチドは、血液のような対象の循環系内で循環する特定の標的(例えば、病原体、代謝産物、ポリペプチド複合体、または非機能的細胞もしくはがん細胞のような細胞のような標的)、または(疾患組織のような)組織内に存在する標的にエクソソームを標的化することができる。
いくつかの実施形態では、エクソソームは、合成される。例えば、エクソソームは、例えば、治療用ポリペプチドのようなペイロード、(DNAもしくはRNAのような)核酸または他のポリヌクレオチド、多糖類またはグリカン、脂質または脂肪酸、大きな生物製剤、エクソソームが天然に存在しないような低分子または毒素を含むことができる。いくつかの実施形態では、エクソソームは、修飾される(例えば、ペイロードを導入するか、または膜のタンパク質、脂質もしくはグリカン含有量を変更させることによるように、それ以外の方法で複合体の含有量を修飾することによって)。例えば、エクソソームは、最初に産生細胞から単離され、次いで所望に応じて修飾され、それによって合成エクソソームを生成する。いくつかの実施形態では、産生細胞は、修飾される。例えば、外因性核酸、外因性ポリペプチドまたは低分子または毒素は、産生細胞へと導入されることができる。あるいは、または加えて、産生細胞は、それ以外の方法で(例えば、細胞膜の脂質またはグリカン含有量を変更することによるように、細胞または膜含有量を修飾することによって)修飾されることができる。修飾産生細胞から生成されたエクソソームは、産生細胞の修飾のうちの1つ以上を含む。プロセスは、合成エクソソームを産生する。いくつかの実施形態では、産生細胞及び産生細胞から単離されたエクソソームの両方は、本明細書に記載のように修飾される。
ナノベシクル
様々な実施形態では、細胞外小胞は、ナノベシクルである。ある特定の実施形態では、ナノベシクルは、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小さな小胞であり、ナノベシクルが操作なしで細胞によって産生されないように、直接または間接操作によって細胞から生成される。細胞の適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されず、いくつかの事例では、産生細胞の破壊を生じ得る。
様々な実施形態では、細胞外小胞は、ナノベシクルである。ある特定の実施形態では、ナノベシクルは、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小さな小胞であり、ナノベシクルが操作なしで細胞によって産生されないように、直接または間接操作によって細胞から生成される。細胞の適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されず、いくつかの事例では、産生細胞の破壊を生じ得る。
様々な実施形態では、ナノベシクルは、約20~100nm、20~150nm、20~200nm、30~100nm、30~150nm、30~200nm、30~250nm、40~100nm、40~150nm、40~200nm、40~250nm、50~100nm、50~150nm、50~200nm、50~250nm、100~200nm、または150~250nmのような、約20~250nmの最長寸法を有する。
様々な実施形態では、ナノベシクルは、産生細胞に由来する。ある特定の実施形態では、ナノベシクルは、直接または間接操作によって産生細胞から生成される。適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。これらの実施形態のいくつかでは、操作は、産生細胞の破壊を生じ得る。いくつかの好ましい実施形態では、ナノベシクルの集団は、原形質膜から直接発芽するか、または後期エンドソームと原形質膜との融合による産生細胞に由来する小胞を実質的に含まない。
いくつかの実施形態では、ナノベシクルは、そのサイズ、密度、生化学パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離される。ある特定の実施形態では、単離は、沈降によって達成されることができる。例えば、ナノベシクルは、0.5~2.0、0.6~1.0、0.7~1.0、0.8~1.0、0.9~1.0、1.0~1.1、1.1~1.2、1.2~1.3、1.4~1.5、1.0~1.5、1.5~2.0、及び1.0~2.0kg/m3の比密度を有することができる。
様々な実施形態では、ナノベシクルは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ナノベシクルは、糖をさらに含む。ある特定の実施形態では、ナノベシクルは、ポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ナノベシクルは、レシーバーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ナノベシクルは、ペイロードをさらに含む。これらの実施形態のいくつかでは、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び/またはそれらの組み合わせを含む。
免疫調節成分
様々な実施形態では、組成物は、免疫調節成分をさらに含む。
様々な実施形態では、組成物は、免疫調節成分をさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫調節化合物は、該タンパク質がエクソソームの表面上に保持されるように、エクソソーム表面タンパク質への翻訳融合タンパク質として発現されるタンパク質である。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、膜タンパク質である。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態では、エクソソーム表面タンパク質は、テトラスパニン(例えば、CD63、CD81、CD9)、EWIタンパク質/免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー(例えば、PTGFRN、IGSF8、IGSF3)、インテグリン(例えば、ITGB1、ITGA4)、ATPトランスポータータンパク質(例えば、ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)、SLC3A2、BSG、またはCD98hcまたはその断片もしくはバリアントである。
いくつかの実施形態では、免疫調節化合物は、該可溶性タンパク質がエクソソームの表面上に保持されるように、エクソソーム表面タンパク質への翻訳融合タンパク質として発現される可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態では、エクソソーム表面タンパク質は、テトラスパニン(例えば、CD63、CD81、CD9)、EWIタンパク質/免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー(例えば、PTGFRN、IGSF8、IGSF3)、インテグリン(例えば、ITGB1、ITGA4)、ATPトランスポータータンパク質(例えば、ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)、SLC3A2、BSG、またはCD98hcまたはその断片もしくはバリアントである。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、抗腫瘍活性を有する。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、先天性免疫応答を調節する。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、ナチュラルキラー細胞を標的とする。いくつかの他の実施形態では、免疫調節成分は、適応性免疫応答を調節する。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、細胞傷害性T細胞を標的とする。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、その全長形態で産生細胞内で発現される。他の実施形態では、免疫調節成分は、エクソソーム表面タンパク質への翻訳融合タンパク質として発現され、エクソソームの表面上の免疫調節化合物の生体活性部分のより高いレベルの発現を生じる。いくつかの実施形態では、免疫調節化合物は、該可溶性タンパク質がエクソソームの表面上に保持されるように、エクソソーム表面タンパク質への翻訳融合タンパク質として発現される可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態では、エクソソーム表面タンパク質は、テトラスパニン(例えば、CD63、CD81、CD9)、EWIタンパク質/免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー(例えば、PTGFRN、IGSF8、IGSF3)、インテグリン(例えば、ITGB1、ITGA4)、ATPトランスポータータンパク質(例えば、ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)、SLC3A2、BSG、またはCD98hcまたはその断片もしくはバリアントである。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、負のチェックポイント調節因子の阻害剤である。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)の阻害剤である。これらの実施形態のいくつかでは、CTLA-4阻害剤は、CTLA-4のモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、阻害剤は、CTLA-4のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、CTLA-4のモノクローナル抗体のscFv、(scFv)2、Fab、Fab’、及びF(ab’)2、F(ab1)2、Fv、dAb、またはFdである。ある特定の実施形態では、阻害剤は、CTLA-4に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、イピリムマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、トレメリムマブである。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、プログラム死リガンド1(PD-L1)の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、プログラム死リガンド2(PD-L2)の阻害剤である。いくつかの実施形態では、PD-1、PD-L1、またはPD-L2の阻害剤は、PD-1、PD-L1、またはPD-L2のモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、阻害剤は、PD-1、PD-L1、またはPD-L2のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、PD-1、PD-L1、またはPD-L2のモノクローナル抗体のscFv、(scFv)2、Fab、Fab’、及びF(ab’)2、F(ab1)2、Fv、dAb、またはFdである。ある特定の実施形態では、阻害剤は、PD-1、PD-L1、またはPD-L2に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ニボルマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ペンブロリズマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ピジリズマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、アテゾリズマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、アベルマブである。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)の阻害剤である。これらの実施形態のいくつかでは、LAG3の阻害剤は、LAG3のモノクローナル抗体である。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、T細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質3(TIM-3)の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、B及びTリンパ球減衰因子(BTLA)の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、Ig及びITIMドメイン(TIGIT)を有するT細胞免疫受容体の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、T細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、アデノシンA2a受容体(A2aR)の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、CD20、CD39、またはCD73の阻害剤である。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、正の共刺激分子の活性化剤である。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、TNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性化剤である。ある特定の実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーメンバーは、CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受容体、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受容体、TACI、BAFF受容体、ATAR、CD271、CD269、GITR、TROY、CD358、TRAMP、及びXEDARからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、TNFスーパーファミリーメンバーである。ある特定の実施形態では、TNFスーパーファミリーメンバーは、TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BBリガンド、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITRリガンド、及びEDA-2からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性化剤は、単量体タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性化剤は、三量体タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーメンバーは、単量体タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーメンバーは、三量体タンパク質として発現される。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、TNF受容体スーパーファミリーメンバー4(OX40)の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、OX40の活性化剤は、OX40のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、OX40の活性化剤は、OX40リガンド(OX40L)である。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、CD27の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、CD27の活性化剤は、CD27のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、CD27の活性化剤は、CD27リガンド(CD27L)である。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、CD40の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、CD40の活性化剤は、CD40のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、CD40の活性化剤は、CD40リガンド(CD40L)である。いくつかの実施形態では、CD40Lは、単量体CD40Lである。いくつかの実施形態では、CD40Lは、三量体CD40Lである。
いくつかの実施形態では、三量体CD40Lは、PTGFRNまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、三量体CD40Lは、PTGFRNまたはその断片のN末端に融合される。いくつかの実施形態では、三量体CD40Lは、PTGFRNへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号19または配列番号20の配列を有する。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質(GITR)の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、GITRの活性化剤は、GITRのアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、GITRの活性化剤は、GITRの天然リガンドである。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、4-1BBの活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、4-1BBの活性化剤は、4-1BBのアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、4-1BBの活性化剤は、4-1BBの天然リガンドである。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、Fas受容体(Fas)である。これらの実施形態のいくつかでは、Fas受容体は、細胞外小胞の表面上に表示される。いくつかの他の実施形態では、免疫調節成分は、Fasリガンド(FasL)である。これらの実施形態のいくつかでは、Fasリガンドは、細胞外小胞の表面上に表示される。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、Fas受容体の抗体である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、Fasリガンドの抗体である。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、CD28-スーパーファミリー共刺激分子の活性化剤である。ある特定の実施形態では、CD28-スーパーファミリー共刺激分子は、ICOSまたはCD28である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ICOSL、CD80、またはCD86である。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、誘導性T細胞共刺激剤(ICOS)の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ICOSの活性化剤は、ICOSのアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、ICOSの活性化剤は、ICOSリガンド(ICOSL)である。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、CD28の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、CD28の活性化剤は、CD28のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、CD28の活性化剤は、CD28の天然リガンドである。ある特定の実施形態では、CD28のリガンドは、CD80である。
ある特定の実施形態では、組成物は、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤、及び正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤を含む。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、サイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、エクソソーム表面タンパク質またはその断片に翻訳融合された可溶性サイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターロイキン2(IL-2)である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターロイキン7(IL-7)である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターロイキン12(IL-12)である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターロイキン15(IL-15)である。
ある特定の実施形態では、サイトカインは、PTGFRNまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、IL-7は、PTGFRNまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、IL-7は、PTGFRNのN末端またはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、IL-7は、PTGFRNへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号1または配列番号2の配列を有する。
ある特定の実施形態では、サイトカインは、PTGFRNまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、IL-12は、PTGFRNまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、IL-12は、PTGFRNのN末端またはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、IL-12は、PTGFRNへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6の配列を有する。
ある特定の実施形態では、サイトカインは、PTGFRNまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、IL-15は、PTGFRNまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、IL-15は、PTGFRNのN末端またはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、IL-15は、PTGFRNへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号15または配列番号16の配列を有する。
いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターフェロン(IFN)である。ある特定の実施形態では、インターフェロンは、PTGFRNまたはその断片に融合される。ある特定の実施形態では、インターフェロンは、インターフェロンγ(IFNγ)である。いくつかの実施形態では、IFNγは、PTGFRNまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、IFNγは、PTGFRNのN末端またはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、IFNγは、PTGFRNへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号7または配列番号8の配列を有する。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、T細胞受容体(TCR)またはその誘導体である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、TCRα鎖またはその誘導体である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、TCRβ鎖またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、T細胞の共受容体またはその誘導体である。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ-胎児タンパク質(AFP)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、ムチン1(MUC1)、Tn-MUC1、ムチン16(MUC16)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、腫瘍タンパク質p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、プログラム死リガンド(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、メソテリン、VEGFR、アルファ-葉酸受容体、CE7R、IL-3、がん-精巣抗原、MART-1 gp100、及びTNF関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、がん胎児性抗原(CEA)である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、上皮腫瘍抗原(ETA)である。
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ムチンである。これらの実施形態のいくつかでは、ムチンは、分泌ムチンである。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、ムチンは、膜貫通ムチンである。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ムチン1(MUC1)である。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、Tn-MUC1である。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ムチン16(MUC16)である。
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、メラノーマ関連抗原(MAGE)である。これらの実施形態のいくつかでは、MAGEは、I型MAGEである。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、MAGEは、II型MAGEである。特定の実施形態では、I型MAGEは、MAGEーA2である。特定の実施形態では、I型MAGEは、MAGE-A4である。
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ-胎児タンパク質(AFP)である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍タンパク質p53(p53)である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、チロシナーゼである。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質(TRP)である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、プログラム死リガンド1(PD-L1)またはプログラム死リガンド2(PD-L2)である。様々な実施形態では、腫瘍抗原は、CD4、CD8、CD45、CD80、及びCD86からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、キメラ抗原受容体(CAR)またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、CARは、アルファ-胎児タンパク質(AFP)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、ムチン1(MUC1)、Tn-MUC1、ムチン16(MUC16)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、腫瘍タンパク質p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、プログラム死リガンド1(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、メソテリン、VEGFR、アルファ-葉酸受容体、CE7R、IL-3、がん-精巣抗原、MART-1 gp100、及びTNF関連アポトーシス誘導リガンドのうちの1つ以上に結合する。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、T細胞受容体または共受容体の活性化剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、CD3の活性化剤である。ある特定の実施形態では、活性化剤は、CD3のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、CD3に対するモノクローナル抗体のscFv、(scFv)2、Fab、Fab’、及びF(ab’)2、F(ab1)2、Fv、dAb、またはFdである。ある特定の実施形態では、活性化剤は、CD3に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、抗CD3抗体断片は、PTGFRNまたはその断片に融合する。いくつかの実施形態では、抗CD3抗体断片は、PTGFRNのN末端またはその断片に融合する。いくつかの実施形態では、抗CD3抗体断片は、PTGFRNへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号18または配列番号21の配列を有する。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、CD28の活性化剤である。ある特定の実施形態では、阻害剤は、CD28のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、CD28のモノクローナル抗体のscFv、(scFv)2、Fab、Fab’、及びF(ab’)2、F(ab1)2、Fv、dAb、またはFdである。ある特定の実施形態では、阻害剤は、CD28に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、主要組織適合性複合体(MHC)またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、MHCクラスIまたはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、MHCクラスIIまたはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、MHCクラスIIIまたはその誘導体である。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、ヒト白血球抗原(HLA)またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、HLA-E、HLA-F、HLA-G、またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、またはその誘導体である。
様々な実施形態では、免疫調節成分は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、脂質、低分子、または毒素であり得る。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質であり得る。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、アゴニストである。これらの実施形態のいくつかでは、アゴニストは、ホルモンのような内因性アゴニスト、または神経伝達物質である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、アゴニストは、薬物のような外因性アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、受容体に結合することなくアゴニスト応答を作製することができる物理的アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、内因性アゴニストよりも大きな最大応答を生み出すことができるスーパーアゴニストである。ある特定の実施形態では、アゴニストは、受容体で完全な有効性を有する完全アゴニストである。ある特定の他の実施形態では、アゴニストは、完全アゴニストと比較して受容体において部分的な有効性のみを有する部分アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、受容体の構成活性を阻害することができる逆アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、他のコアゴニストと連携して受容体に対する効果を生み出すコアゴニストである。ある特定の実施形態では、アゴニストは、共有結合の形成を通じて受容体に永続的に結合する不可逆性アゴニストである。ある特定の実施形態では、アゴニストは、特定の型の受容体に対する選択的アゴニストである。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、アンタゴニストである。これらの実施形態のいくつかでは、アンタゴニストは、受容体を活性化することなく、内因性リガンドまたはアゴニストと同じ結合部位で受容体に可逆的に結合する競合的アンタゴニストである。競合的アンタゴニストは、最大応答を達成するために必要なアゴニストの量に影響することができる。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、アンタゴニストは、受容体の活性部位または受容体のアロステリック部位に結合する非競合的アンタゴニストである。非競合的アンタゴニストは、任意の量のアゴニストによって得られる最大応答の大きさを低減させることができる。いくつかの他の実施形態では、アンタゴニストは、別個のアロステリック結合部位への結合前にアゴニストによる受容体活性化を必要とする、競合的でないアンタゴニストである。
様々な実施形態では、免疫調節成分は、抗体または抗原結合断片を含む。免疫調節成分は、全長タンパク質またはその断片であり得る。抗体または抗原結合断片は、天然源に由来し得るか、部分的または完全に合成的に産生され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。これらの実施形態のいくつかでは、モノクローナル抗体は、IgG抗体である。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である。いくつかの他の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、Fab、Fab’、及びF(ab’)2、F(ab1)2、Fv、dAb、ならびにFd断片から選択される。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、scFvまたは(scFv)2断片である。ある特定の他の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ナノボディ(登録商標)(単一ドメイン抗体)である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、二重特異性または多重特異性抗体である。
様々な実施形態では、抗体または抗原結合断片は、完全にヒトである。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ヒト化される。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、キメラである。これらの実施形態のいくつかでは、キメラ抗体は、非ヒトV領域ドメイン及びヒトC領域ドメインを有する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、マウスまたは獣医学のような非ヒトである。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ポリヌクレオチドである。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、mRNA、miRNA、siRNA、アンチセンスRNA、shRNA、lncRNA、及びdsDNAを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、RNA(例えば、mRNA、miRNA、siRNA、アンチセンスRNA、shRNA、またはlncRNA)である。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドがmRNAであるとき、ポリヌクレオチドは所望のポリペプチドへと翻訳されることができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、マイクロRNA(miRNA)またはプレmiRNA分子である。これらの実施形態のいくつかでは、miRNAは、miRNA分子が標的細胞内の天然mRNAを沈黙させる(silence)ことができるように、標的細胞の細胞質に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、がん遺伝子または他の調節不全ポリペプチドの発現に干渉することができる低分子干渉RNA(siRNA)または短ヘアピンRNA(shRNA)である。これらの実施形態のいくつかでは、siRNAは、siRNA分子が標的細胞内の天然mRNAを沈黙させることができるように、標的細胞の細胞質に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、mRNAに相補的であるアンチセンスRNAである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を調節し、疾患を調節することができる長鎖非コードRNA(lncRNA)である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、RNAへと転写されることができるDNAである。これらの実施形態のいくつかでは、転写RNAは、所望のポリペプチドへと翻訳されることができる。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である。
様々な実施形態では、組成物は、原子、分子などの混合物、融合物、組み合わせ及びコンジュゲートを含む、2つ以上の上記の免疫調節成分を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、膜に結合するか、または該細胞外小胞の封入体積内に封入された1、2、3,4、5、6、7、8、9、10、11、または12個の異なる免疫調節成分を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、ポリペプチドと組み合わされた核酸を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、互いにコンジュゲートされた2つ以上のポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、生体活性分子にコンジュゲートされたタンパク質を含む。これらの実施形態のいくつかでは、生体活性分子は、プロドラッグである。
いくつかの実施形態では、組成物は、膜に結合するか、または該細胞外小胞の封入体積内に封入された2つの異なる免疫調節成分を含む。ある特定の実施形態では、2つの異なる免疫調節成分は、IL-12及びCD40Lである。いくつかの実施形態では、CD40L及びIL-12は、それぞれPTGFRNまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、CD40L及びIL-12は、PTGFRNのN末端またはその断片にそれぞれ融合される。いくつかの実施形態では、CD40L及びIL-12は、PTGFRNへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、それぞれ配列番号20及び配列番号3の配列を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、膜に結合するか、または該細胞外小胞の封入体積内に封入された3つの異なる免疫調節成分を含む。ある特定の実施形態では、2つの異なる免疫調節成分は、IL-12、CD40L、及びFMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3L)である。いくつかの実施形態では、CD40L、IL-12、及びFLT3Lは、PTGFRNまたはその断片にそれぞれ融合される。いくつかの実施形態では、CD40L、IL-12、及びFLT3Lは、PTGFRNのN末端またはその断片にそれぞれ融合される。いくつかの実施形態では、CD40L、IL-12、及びFLT3Lは、PTGFRNへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、それぞれ配列番号20、配列番号3、及び配列番号22の配列を有する。
医薬組成物
医薬組成物は、対象への投与に適した形態で、複数の細胞外小胞及び薬学的に許容される賦形剤または担体を一般に含む。薬学的に許容される賦形剤または担体は、投与される特定の組成物、同様に組成物を投与するために使用される具体的な方法によって部分的に決定される。したがって、複数の細胞外小胞を含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.21st
ed.(2005)を参照されたい)。医薬組成物は、一般に滅菌されて製剤化され、かつ米国食品医薬品局の全ての適正製造基準(GMP)規制に完全に準拠する。
医薬組成物は、対象への投与に適した形態で、複数の細胞外小胞及び薬学的に許容される賦形剤または担体を一般に含む。薬学的に許容される賦形剤または担体は、投与される特定の組成物、同様に組成物を投与するために使用される具体的な方法によって部分的に決定される。したがって、複数の細胞外小胞を含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.21st
ed.(2005)を参照されたい)。医薬組成物は、一般に滅菌されて製剤化され、かつ米国食品医薬品局の全ての適正製造基準(GMP)規制に完全に準拠する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の1つ以上の治療剤及び細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、1つ以上の別個の治療剤と共投与され、共投与は、細胞外小胞の投与の前、後、またはそれと同時の別個の治療剤の投与を含む。
薬学的に許容される賦形剤は、ヒトの薬学的使用と同様の獣医学的使用に許容される賦形剤を含む、一般に安全であり、無毒であり、及び望ましい賦形剤を含む。
担体または希釈剤の例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び5%ヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。かかる媒質及び化合物の薬学的活性物質への使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒質または化合物が本明細書に記載の細胞外小胞と互換性がない場合を除き、その組成物中における使用が企図される。補体治療剤は、組成物中へと組み込まれることもできる。典型的には、医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性があるように製剤化される。細胞外小胞は、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮膚内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、筋肉内経路、または吸入剤として投与されることができる。ある特定の実施形態では、細胞外小胞を含む医薬組成物は、例えば、注射によって静脈内投与される。細胞外小胞は、任意選択で、細胞外小胞が意図された疾患、障害または状態を治療することに少なくとも部分的に有効である他の治療剤と組み合わせて投与されることができる。
溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる。水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌化合物;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤;エチレンジアミン四酢酸(EDTA)のようなキレート化合物;酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度調整用化合物。PHは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整されることができる。調製物は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数の用量バイアルに封入することができる。
注射可能な使用に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与のために、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL(商標)(BASF,Parsippany,N.J.)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む。組成物は、一般に滅菌され、容易な注射可能性が存在する程度の流体である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなどのような)、ならびにそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成されることができる。所望の場合、等張化合物、例えば、糖、マニトール(manitol)、ソルビトールのようなポリアルコール、及び塩化ナトリウムは、組成物に添加されることができる。注射可能組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含ませることによってもたらされ得る。
滅菌注射可能溶液は、所望に応じて、適切な溶媒中に、本明細書に列挙された成分の1つまたは組み合わせと有効量の細胞外小胞を組み込むことによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒及び任意の所望の他の成分を含む滅菌ビヒクルへと細胞外小胞を組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分と、前もって滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分との粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥である。細胞外小胞は、細胞外小胞の持続的もしくは拍動的放出を可能にするような様式で製剤化され、デポ注射またはインプラント調製物の形態で投与することができる。
細胞外小胞を含む組成物の全身投与は、経粘膜手段によっても行われることができる。経粘膜投与のために、浸透するバリアに適した浸透剤が、製剤に使用される。かかる浸透剤は、当該技術分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与用の、界面活性剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、鼻腔スプレーの使用を通じて達成されることができる。
ある特定の実施形態では、細胞外小胞を含む医薬組成物は、医薬組成物から利益を得るであろう対象へと静脈内投与される。特定の他の実施形態では、組成物は、例えば、リンパ内注射もしくはリンパ節内注射(例えば、Senti et al.,PNAS 105(46):17908(2008)を参照されたい)、または筋肉内注射、皮下注射、腫瘍内注射、胸腺もしくは肝臓への直接注射によってリンパ系に投与される。
ある特定の実施形態では、細胞外小胞を含む医薬組成物は、液体懸濁液として投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、投与後にデポを形成することができる製剤として投与される。ある特定の好ましい実施形態では、デポは、細胞外小胞を徐々に循環へと放出するか、またはデポ形態であり続ける。
典型的には、薬学的に許容される組成物は、汚染物質を含まないように高度に精製され、生体適合性があり毒性がなく、かつ対象への投与に適している。水が担体の構成成分である場合、水は、汚染物質、例えば、エンドトキシンを含まないように高度に精製及び処理される。
薬学的に許容される担体は、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び/または鉱物油であり得るが、これらに限定されない。医薬組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香料増強剤、乳化剤、懸濁剤、及び/または防腐剤をさらに含むことができる。
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載の細胞外小胞、及び任意選択で薬学的活性薬剤または治療剤を含む。治療剤は、生物剤、低分子剤、または核酸剤であり得る。
本明細書に記載の細胞外小胞を含む医薬組成物を含む剤形が、提供される。いくつかの実施形態では、剤形は、静脈内注射用の液体懸濁液として製剤化される。いくつかの実施形態では、剤形は、腫瘍内注射用の液体懸濁液として製剤化される。
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の調製は、残留複製能力のある核酸を破壊するために、例えば、X線、ガンマ線、ベータ粒子、アルファ粒子、中性子、陽子、元素核、UV線のような放射線を受ける。
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の調製物は、1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、または100kGy超の照射線量を使用してガンマ照射を受ける。
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の調製物は、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、または10000mSv超の照射線量を使用してX線照射を受ける。
方法
本開示の態様は、細胞外小胞及び免疫調節成分を含む組成物を製造する方法も含む。いくつかの実施形態では、方法は、産生細胞から細胞外小胞を得ることであって、産生細胞が免疫調節成分を天然に含有する、得ることと、任意選択で、得られた細胞外小胞を単離することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、産生細胞を免疫調節成分で修飾することと、細胞外小胞を修飾産生細胞から得ることと、任意選択で、得られた細胞外小胞を単離することと、を含む。いくつかの他の実施形態では、方法は、産生細胞から細胞外小胞を得ることと、得られた細胞外小胞を単離することと、単離された細胞外小胞を免疫調節成分で修飾することと、を含む。ある特定の実施形態では、方法は、単離された細胞外小胞を医薬組成物中に製剤化することをさらに含む。
本開示の態様は、細胞外小胞及び免疫調節成分を含む組成物を製造する方法も含む。いくつかの実施形態では、方法は、産生細胞から細胞外小胞を得ることであって、産生細胞が免疫調節成分を天然に含有する、得ることと、任意選択で、得られた細胞外小胞を単離することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、産生細胞を免疫調節成分で修飾することと、細胞外小胞を修飾産生細胞から得ることと、任意選択で、得られた細胞外小胞を単離することと、を含む。いくつかの他の実施形態では、方法は、産生細胞から細胞外小胞を得ることと、得られた細胞外小胞を単離することと、単離された細胞外小胞を免疫調節成分で修飾することと、を含む。ある特定の実施形態では、方法は、単離された細胞外小胞を医薬組成物中に製剤化することをさらに含む。
細胞外小胞を産生する方法
産生細胞を免疫調節成分で修飾する方法
様々な実施形態では、方法は、免疫調節成分で産生細胞を修飾することを含む。
産生細胞を免疫調節成分で修飾する方法
様々な実施形態では、方法は、免疫調節成分で産生細胞を修飾することを含む。
産生細胞は、哺乳動物細胞株、植物細胞株、昆虫細胞株、真菌細胞株、または原核細胞株であり得る。ある特定の実施形態では、産生細胞は、哺乳動物細胞株である。哺乳動物細胞株は、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞株、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、HT-1080細胞株、HeLa細胞株、PERC-6細胞株、CEVEC細胞株、線維芽細胞株、羊水細胞株、上皮細胞株、及び間葉系幹細胞(MSC)細胞株を含むが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、哺乳動物細胞株は、HEK-293細胞、BJヒト包皮線維芽細胞、fHDF線維芽細胞、AGE.HN(登録商標)ニューロン前駆細胞、CAP(登録商標)羊水細胞、脂肪間葉系幹細胞、またはRPTEC/TERT1細胞であり得る。産生細胞は、一次細胞でもあり得る。様々な実施形態では、一次細胞は、一次哺乳動物細胞、一次植物細胞、一次昆虫細胞、一次真菌細胞、または一次原核細胞であり得る。
ある特定の好ましい実施形態では、産生細胞は、樹状細胞、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)、抗原提示細胞、マクロファージ、Tヘルパー細胞、または制御性T細胞(Treg細胞)のような免疫細胞である。
様々な実施形態では、免疫調節成分は、トランスフェクション、ウイルス導入、電気穿孔、押出、超音波処理、細胞融合、もしくは当業者に既知の他の方法によって、産生細胞へと導入された導入遺伝子またはmRNAからの産生細胞内で発現させることができる。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、トランスフェクションによって産生細胞に導入される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、カチオン性脂質及びポリマーのような合成高分子を使用して好適な産生細胞に導入され得る(Papapetrou et al.,Gene Therapy 12:S118-S130(2005))。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、電荷相互作用を通じて免疫調節成分と複合体を形成する。これらの実施形態のいくつかでは、正荷電複合体は負荷電細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞によって取り込まれる。いくつかの他の実施形態では、カチオン性ポリマーは、産生細胞をトランスフェクトするために使用することができる。これらの実施形態のいくつかでは、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン(PEI)である。ある特定の実施形態では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質は、免疫調節成分を産生細胞に導入するために使用することができる。免疫調節成分は、粒子媒介性トランスフェクション、「遺伝子銃」、バイオリスティック、または粒子撃ち込み技術のような物理的方法を使用して産生細胞に導入することもできる(Papapetrou et al.,Gene Therapy 12:S118-S130(2005))。例えば、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子は、産生細胞のトランスフェクション効率を評価するために使用することができる。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ウイルス導入によって産生細胞に導入される。モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、レンチウイルス、及びスプマウイルスを含む、いくつかのウイルスは、遺伝子導入ビヒクルとして使用されることができる。ウイルス媒介性遺伝子導入ビヒクルは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びヘルペスウイルスのようなDNAウイルスに基づくベクター、同様にレトロウイルスに基づくベクターを含む。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、電気穿孔によって産生細胞に導入される。電気穿孔は細胞膜に一過性の細孔を作製し、細胞へと様々な分子を導入することを可能にする。いくつかの実施形態では、DNA及びRNA、同様にポリペプチド及び非ポリペプチド治療剤を、電気穿孔によって産生細胞へと導入することができる。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、マイクロ注射によって産生細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ガラスマイクロピペットを、免疫調節成分を顕微鏡レベルで産生細胞へと注入するために使用することができる。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、押出によって産生細胞に導入される。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、超音波処理によって産生細胞に導入される。いくつかの実施形態では、産生細胞は、高強度の音波に曝露され、免疫調節成分の付加を可能にする細胞膜の一過性破壊を引き起こす。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、細胞融合によって産生細胞に導入される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、電気細胞融合によって導入される。いくつかの他の実施形態では、ポリエチレングリコール(PEG)は、産生細胞を融合させるために使用される。いくつかの他の実施形態では、センダイウイルスは、産生細胞を融合させるために使用される。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、低張溶解によって産生細胞に導入される。これらの実施形態のいくつかでは、産生細胞は、免疫調節成分の付加を可能にする破裂をそれらに引き起こす低イオン強度緩衝液に曝露される。いくつかの代替実施形態では、低張液に対する制御透析は、産生細胞を膨らませ、産生細胞膜内に細孔を作製するために使用される。産生細胞は、その後、膜の再密封を可能にする条件に曝露される。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、界面活性剤処理によって産生細胞に導入される。ある特定の実施形態では、産生細胞は、免疫調節成分の付加を可能にする細孔を作製することによって産生細胞膜を一時的に損なうように軽度の界面活性剤で処理される。産生細胞が付加された後、界面活性剤は洗い流され、それによって膜を再密封する。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、受容体媒介性エンドサイトーシスによって産生細胞に導入される。ある特定の実施形態では、産生細胞は、免疫調節成分の結合時に受容体及び結合した免疫調節成分の内在化を誘導する表面受容体を有する。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、濾過によって産生細胞に導入される。ある特定の実施形態では、産生細胞及び免疫調節成分を産生細胞よりも小さい孔径のフィルタに強制的に通し、産生細胞膜の一過性破壊を引き起こすことによって、免疫調節成分が産生細胞に入ることを可能にすることができる。
いくつかの実施形態では、産生細胞はいくつかの凍結解凍サイクルに曝され、免疫調節成分の付加を可能にする細胞膜破壊を生じる。
細胞外小胞を免疫調節成分で修飾する方法
様々な代替実施形態では、免疫調節成分は、細胞外小胞の単離後に細胞外小胞に直接導入される。
様々な代替実施形態では、免疫調節成分は、細胞外小胞の単離後に細胞外小胞に直接導入される。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、トランスフェクションによって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、カチオン性脂質及びポリマーのような合成高分子を使用して細胞外小胞に導入することができる(Papapetrou et al.,Gene Therapy 12:S118-S130(2005))。ある特定の実施形態では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質を、免疫調節成分を細胞外小胞に導入するために使用することができる。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、電気穿孔によって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、細胞外小胞膜に一過性の孔を引き起こす電界に曝露され、免疫調節成分の付加を可能にする。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、マイクロ注射によって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、ガラスマイクロピペットは、免疫調節成分を顕微鏡レベルで細胞外小胞へと直接注入するために使用されることができる。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、押出によって細胞外小胞に導入される。
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、超音波処理によって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、高強度の音波に曝露され、免疫調節成分の付加を可能にする細胞外小胞膜の一過性破壊を引き起こす。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、細胞外小胞の表面にコンジュゲートされることができる。コンジュゲーションは、当該技術分野で既知の方法によって化学的または酵素的に達成されることができる。
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、化学的にコンジュゲートされた免疫調節成分を含む。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用の有無にかかわらず、免疫調節成分の別の分子への共有結合によって達成することができる。かかるコンジュゲートの形成は当業者の技術範囲内であり、様々な技術はコンジュゲートを達成するために既知であり、具体的な技術の選択は、コンジュゲートされる材料によって誘導される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドが、細胞外小胞にコンジュゲートされる。ある特定の他の実施形態では、脂質、炭水化物、核酸、及び低分子のような非ポリペプチドは、細胞外小胞にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、低張溶解によって細胞外小胞に導入される。これらの実施形態のいくつかでは、細胞外小胞は、免疫調節成分の付加を可能にする破裂をそれらに引き起こす低イオン強度緩衝液に曝露される。いくつかの代替実施形態では、低張液に対する制御透析は、細胞外小胞を膨らませ、細胞外小胞膜内に細孔を作製するために使用される。細胞外小胞は、その後、膜の再密封を可能にする条件に曝露される。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、界面活性剤処理によって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、免疫調節成分の付加を可能にするため、細孔を作製することによって細胞外小胞膜を一時的に損なうように軽度の界面活性剤で処理される。細胞外小胞が付加された後、界面活性剤は洗い流され、それによって膜を再密封する。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、免疫調節成分の結合時に受容体及び結合した免疫調節成分の内在化を誘導する表面受容体を有する。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、機械的発射によって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、金マイクロキャリアのような重粒子または荷電粒子に結合された免疫調節成分を撃ち込むことができる。これらの実施形態のいくつかでは、粒子を、細胞外小胞膜を横断するように機械的または電気的に加速されることができる。
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、濾過によって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞及び免疫調節成分は、細胞外小胞よりも小さい孔径のフィルタに強制的に通し、細胞外小胞膜の一過性破壊を引き起こすことによって、免疫調節成分が細胞外小胞に入ることを可能にする。
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、いくつかの凍結解凍サイクルに曝され、免疫調節成分の付加を可能にする細胞外小胞膜破壊を生じる。
細胞外小胞を単離する方法
細胞外小胞は、産生細胞から単離することができる。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、産生細胞によって細胞培養培地へと放出される。細胞外小胞の単離の全ての既知の様式は、本明細書での使用に好適であると見なされることが、企図される。例えば、細胞外小胞の物理的特性は、それらを培地または他の供給源材料から分離するために採用されることができ、電荷(例えば、電気泳動分離)、サイズ(例えば、濾過、分子篩など)、密度(例えば、規則的または勾配遠心分離)、スベドベリ定数(例えば、外力の有無を伴う沈降など)に基づく分離を含む。あるいは、または加えて、単離は、1つ以上の生物学的特性に基づくことができ、表面マーカー(例えば、沈殿、固相への可逆結合、FACS分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合、アフィニティ精製など)を採用することができる方法を含む。
細胞外小胞は、産生細胞から単離することができる。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、産生細胞によって細胞培養培地へと放出される。細胞外小胞の単離の全ての既知の様式は、本明細書での使用に好適であると見なされることが、企図される。例えば、細胞外小胞の物理的特性は、それらを培地または他の供給源材料から分離するために採用されることができ、電荷(例えば、電気泳動分離)、サイズ(例えば、濾過、分子篩など)、密度(例えば、規則的または勾配遠心分離)、スベドベリ定数(例えば、外力の有無を伴う沈降など)に基づく分離を含む。あるいは、または加えて、単離は、1つ以上の生物学的特性に基づくことができ、表面マーカー(例えば、沈殿、固相への可逆結合、FACS分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合、アフィニティ精製など)を採用することができる方法を含む。
単離及び濃縮は、典型的には連続遠心分離を含む一般的かつ非選択的な様式で行われることができる。あるいは、単離及び濃縮は、細胞外小胞または産生細胞特異的表面マーカーを使用するような、より特異的かつ選択的な様式で行われることができる。例えば、特定の表面マーカーは、免疫沈降、FACS選別、アフィニティ精製、及びビーズ結合リガンドを用いた磁気分離に使用されることができる。
いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、細胞外小胞を単離するために使用することができる。サイズ排除クロマトグラフィー技術は、当該技術分野で既知である。例示的な非限定的技術が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ボイド体積画分は、単離されて対象の細胞外小胞を含む。さらに、いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、当該技術分野で一般に知られているように、(1つ以上のクロマトグラフィー画分の)遠心分離技術によってクロマトグラフィー分離後にさらに単離されることができる。いくつかの実施形態では、例えば、密度勾配遠心分離を利用は、細胞外小胞をさらに単離するために使用されることができる。ある特定の実施形態では、産生細胞由来の細胞外小胞を他の起源の細胞外小胞からさらに分離することが望ましい場合がある。例えば、産生細胞由来の細胞外小胞は、産生細胞に特異的な抗原抗体を使用する免疫吸着捕捉によって、非産生細胞由来の細胞外小胞から分離されることができる。
いくつかの実施形態では、細胞外小胞の単離は、分画遠心分離、サイズベースの膜濾過、免疫沈降、FACS選別、及び磁気分離を含むがこれらに限定されない方法の組み合わせを含むことができる。
細胞外小胞のサイズを測定する方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞外小胞のサイズ及び/または細胞外小胞の集団を測定することを含む。一般に、細胞外小胞サイズは、最長測定可能寸法として測定される。一般に、細胞外小胞の最長測定可能寸法は、その直径としても呼ばれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞外小胞のサイズ及び/または細胞外小胞の集団を測定することを含む。一般に、細胞外小胞サイズは、最長測定可能寸法として測定される。一般に、細胞外小胞の最長測定可能寸法は、その直径としても呼ばれる。
細胞外小胞サイズは、動的光散乱(DLS)及び/または多角度光散乱(MALS)を使用して測定することができる。細胞外小胞のサイズを測定するためにDLS及び/またはMALSを使用する方法は、当業者に既知であり、ナノ粒子追跡アッセイ(NTA、例えば、Malvern NanoSight NS300ナノ粒子追跡デバイスを使用する)を含む。特定の実施形態では、細胞外小胞サイズは、Malvern NanoSight NS300を使用して決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、NTAによって測定された場合(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用して)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、NTAによって測定された場合(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用して)、約40~200nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の90%は、NTAによって測定された場合(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用して)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の95%は、NTAによって測定された場合(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用して)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の99%は、NTAによって測定された場合(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用して)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の90%は、NTAによって測定された場合(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用して)、約40~200nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の95%は、NTAによって測定された場合、(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用して)、約40~200nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の99%は、NTAによって測定された場合(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用して)、約40~200nmの最長寸法を有する。
細胞外小胞サイズは、調節可能な抵抗パルス検知(TRPS)を使用して測定されることができる。特定の実施形態では、TRPSによって測定された細胞外小胞サイズは、iZON qNANO Goldを使用して決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、TRPSによって測定された場合(例えば、iZON qNano Goldを使用して)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、TRPS(例えば、iZON qNano Gold)によって測定された場合、約40~200nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の90%は、TRPSによって測定された場合(例えば、iZON qNano Goldを使用して)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の95%は、TRPSによって測定された場合(例えば、iZON qNano Goldを使用して)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の99%は、TRPSによって測定された場合(例えば、iZON qNano Goldを使用して)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の90%は、TRPSによって測定された場合(例えば、iZON qNano Goldを使用して)、約40~200nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の95%は、TRPSによって測定された場合(例えば、iZON qNano Goldを使用して)、約40~200nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の99%は、TRPSによって測定された場合(例えば、iZON qNano Goldを使用して)、約40~200nmの最長寸法を有する。
細胞外小胞サイズは、電子顕微鏡法を用いて測定されることができる。いくつかの実施形態では、細胞外小胞サイズを測定するために使用される電子顕微鏡法は、透過型電子顕微鏡法である。特定の実施形態では、細胞外小胞サイズを測定するために使用される透過型電子顕微鏡は、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWINである。電子顕微鏡を使用して細胞外小胞サイズを測定する方法は当業者に周知であり、任意のかかる方法は細胞外小胞サイズを測定するのに適切であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、走査型電子顕微鏡で測定された場合(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査型電子顕微鏡)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、走査型電子顕微鏡で測定された場合(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査型電子顕微鏡)、約40~200nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の90%は、走査型電子顕微鏡で測定された場合(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査型電子顕微鏡)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の95%は、走査型電子顕微鏡で測定された場合(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査型電子顕微鏡)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の99%は、走査型電子顕微鏡で測定された場合(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査型電子顕微鏡)、約20~300nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の90%は、走査型電子顕微鏡で測定された場合(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査型電子顕微鏡)、約40~200nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の95%は、走査型電子顕微鏡で測定された場合(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査型電子顕微鏡)、約40~200nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の99%は、走査型電子顕微鏡で測定された場合(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査型電子顕微鏡)、約40~200nmの最長寸法を有する。
がん、GvHD、及び自己免疫疾患を治療する方法
また、対象におけるがん、移植片対宿主疾患(GvHD)及び自己免疫疾患を治療する方法が、本明細書に提供される。
また、対象におけるがん、移植片対宿主疾患(GvHD)及び自己免疫疾患を治療する方法が、本明細書に提供される。
様々な実施形態では、組成物は、がんを有する対象に投与される。これらの実施形態のいくつかでは、組成物は、免疫応答を上方調節し、対象の免疫系の腫瘍標的化を増強することができる。いくつかの実施形態では、治療されるがんは、腫瘍微小環境、またはいわゆる「熱い腫瘍」もしくは「炎症性腫瘍」への白血球(T細胞、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球)の浸潤により特徴付けられる。いくつかの実施形態では、治療されるがんは、腫瘍微小環境、またはいわゆる「冷たい腫瘍」もしくは「非炎症性腫瘍」への低レベルまたは検出不可能なレベルの白血球浸潤により特徴付けられる。いくつかの実施形態では、組成物は、「冷たい腫瘍」を「熱い腫瘍」へと変換するのに十分な量及び時間投与され、すなわち、該投与は腫瘍微小環境への白血球(例えばT細胞)の浸潤を生じる。
いくつかの実施形態では、細胞外小胞及び免疫調節成分を含む組成物は、がんワクチンとして対象に投与される。これらの実施形態のいくつかでは、組成物は、個別化がんワクチンとして対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、腫瘍抗原または腫瘍抗原に由来するペプチドである。好適な腫瘍抗原の例は、アルファ-胎児タンパク質(AFP)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮腫瘍抗原(ETA)、ムチン1(MUC1)、Tn-MUC1、ムチン16(MUC16)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、腫瘍タンパク質p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、プログラム死リガンド1(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、メソテリン、VEGFR、アルファ-葉酸受容体、CE7R、IL-3、がん-精巣抗原、MART-1 gp100、及びTNF関連アポトーシス誘導リガンドを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、参照ゲノム配列に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、組成物を受容する対象のゲノム配列に由来する。
組成物で治療されることができるがんは、表5に列挙されるがんを含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、組成物は、移植片対宿主疾患(GvHD)を有する対象に投与される。これらの実施形態のいくつかでは、組成物は、免疫応答を下方調節し、GvHDの症状を緩和させることができる。いくつかの特定の実施形態では、組成物は、アポトーシスシグナル伝達の活性化を通じてGvHDの症状を緩和させる。ある特定の実施形態では、GvHDを治療するための組成物は、Fasリガンド(FasL)を含む。これらの実施形態のいくつかでは、FasLは、細胞外小胞の表面上に発現される。
様々な実施形態では、組成物は、自己免疫疾患を有する対象に投与される。これらの実施形態のいくつかでは、組成物は、免疫応答を下方調節し、対象の免疫活性を抑制することができる。
自己免疫疾患は、多発性硬化症、末梢神経炎、シェーグレン症候群、関節リウマチ、脱毛症、自己免疫性膵炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、デビック病(視神経脊髄炎)、糸球体腎炎、IgA腎症、各種血管炎、強皮症、糖尿病、動脈炎、白斑、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、乾癬、ぶどう膜炎、及び全身性エリテマトーデスを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の循環系に静脈内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、好適な液体中に注入され、対象の静脈へと投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の循環系に動脈内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、好適な液体中に注入され、対象の動脈へと投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、髄腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物が脳脊髄液(CSF)に到達するように、脊柱管またはくも膜下腔への注射を介して投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の1つ以上の腫瘍へと腫瘍内投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、鼻腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、局所投与または全身投与のいずれかの形態で鼻を通して吸送されることができる。ある特定の実施形態では、組成物は、鼻腔スプレーとして投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、腹腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、好適な液体中に注入され、対象の腹膜へと注射される。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、組成物(例えば、組成物中の細胞外小胞)のリンパ管への分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、組成物(例えば、組成物中の細胞外小胞)の胸腺、脾臓、及び/または骨髄への分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、組成物(例えば、組成物中の細胞外小胞)の1つ以上のリンパ節への分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、組成物(例えば、組成物中の細胞外小胞)の、頸部リンパ節、鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節、または胸骨リンパ節のうちの1つ以上への分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、組成物(例えば、組成物中の細胞外小胞)の、膵臓への分布を生じる。
いくつかの実施形態では、組成物は、眼周投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、眼周組織へと注射される。眼周薬物投与は、結膜下投与、前側テノン嚢下投与、後側テノン嚢下投与、及び球後投与の経路が含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の投与経路によって同じ対象へと投与される。いくつかの実施形態では、該複数の投与経路は、静脈内投与、動脈内投与、髄腔内投与、鼻腔内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、及び/または眼周投与を含む。好ましい実施形態では、該複数の投与経路は、静脈内投与及び腹腔内投与を含む。
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の用量は、1ng~10ng、10ng~100ng、100ng~1μg、1μg~5μg、5μg~10μg、10μg~50μg、50μg~75μg、75μg~100μg、100μg~150μg、150μg~200μg、200μg~300μg、300μg~500μg、500μg~1mg、または1mg~10mgである。
組成物は、対象に1回投与されることができる。あるいは、複数の投与は、一定期間にわたって実行されることができる。例えば、2回、3回、4回、5回、またはそれ以上の投与は、対象に行われることができる。いくつかの実施形態では、投与は、例えば、疾患、障害または状態に関連する症状が持続する限り、必要に応じて行われることができる。いくつかの実施形態では、反復投与は、対象の寿命の残りの期間で示され得る。治療期間は様々であり得、例えば、1年、6ヶ月、3ヶ月、2ヶ月、1ヶ月、2週間、1週間、3日、2日、または1日以下であり得る。
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の用量は、1日1回、隔日1回、週1回、週2回、月1回または月2回のような間隔で投与される。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、標的細胞または組織中の免疫調節成分の濃度を疾患、障害または状態の症状に関連するレベルよりも高く効果的に増加させるのに十分な頻度で投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、疾患、障害または状態が治療されるか、またはその症状が改善されるように、治療期間にわたって少なくとも2回投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、疾患、障害または状態が治療されるか、またはその症状が予防されるように、治療期間にわたって少なくとも2回投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療期間中に十分な量の免疫調節成分が標的細胞または組織に送達されるように、治療期間にわたって十分な回数投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、疾患、障害または状態の1つ以上の症状が予防、減少、改善もしくは遅延されるように、治療期間中に十分な量の免疫調節成分が標的細胞もしくは組織に送達されるように、治療期間にわたって十分な回数投与される。いくつかの実施形態では、標的細胞または組織中の免疫調節成分濃度を増加させることは、ピーク濃度を増加させることを含むが、他の実施形態では、平均濃度を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、治療期間中の実質的な増加は、対象における治療前もしくは治療後の期間を比較することによって、または治療を受ける集団で行われた測定値を、一致した未治療の対照集団と比較することによって決定されることができる。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、標的細胞または組織中の免疫調節成分の濃度が、少なくとも約1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月もしくは6ヶ月以上増加するように、治療期間当たり十分な回数投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、標的細胞または組織中の免疫調節成分の濃度が、少なくとも治療期間と同じくらいの期間増加するように、治療期間当たり十分な回数投与される。
いくつかの実施形態では、治療期間内の反復投与間の時間間隔は、循環中の細胞外小胞の数が、投与された薬学的組成物中に存在する細胞外小胞の数の約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%未満に低減する期間以下である。
いくつかの実施形態では、方法は、治療剤を保有する細胞外小胞の適切な治療用量の注射の前に、1つ以上の非治療用細胞外小胞の用量をさらに含む。ある特定の実施形態では、非治療用細胞外小胞は、治療用細胞外小胞に別々に投与され、かつ治療用細胞外小胞とは異なる用量で投与される。ある特定の実施形態では、非治療用細胞外小胞の用量は、治療用細胞外小胞の用量よりも多い。ある特定の他の実施形態では、非治療用細胞外小胞の用量は、治療用細胞外小胞の用量よりも少ない。ある特定の実施形態では、非治療用細胞外小胞の用量は、治療用細胞外小胞と同じである。様々な実施形態では、適切な用量の治療用細胞外小胞の注射前の非治療用細胞外小胞の方法は、肝臓、肺、及び/または脾臓における治療用細胞外小胞の更新を低減させる。
有効量の組成物は、標的組織、標的細胞型、投与手段、細胞外小胞の物理的特徴(例えば、サイズ、及びいくつかの場合では、送達される分子の程度)ならびに他の決定要因に少なくとも部分的に基づいて提供される。一般に、有効量の組成物は、標的細胞の効率的な細胞応答を提供する。増加した効率は、宿主対象の細胞トランスフェクション(すなわち、細胞外小胞成分でトランスフェクトされた細胞の百分率)の増加、細胞応答の増加、または先天性免疫応答の低減によって実証されることができる。
細胞外小胞及びその医薬組成物の投与量ならびに投与頻度は、例えば、疾患の重症度、患者の年齢、性別及び食事、任意の炎症の重症度、投与時間、及び他の臨床的要因のような様々な要因に基づいて主治医によって決定され得る。一例では、静脈内投与は最小限で有効な用量で開始され、用量は予め選択された時間経過にわたって正の効果が観察されるまで増加する。その後、用量の増分的増加は、現れ得る任意の悪影響を考慮しながら、対応する効果の増加を生み出すレベルに限定される。
以下の実施例は、当業者に本発明を作成する及び使用する方法の完全な開示ならびに説明を提供するように提案され、かつ発明者がその発明と見なす範囲を限定することが意図されるものではなく、または、以下の実験が実行された全てもしくは唯一の実験であることを表すことが意図されるものではない。努力は使用された数(例えば、量、温度など)についての正確性を確実にするためになされてきたが、いくつかの実験誤差や偏差は説明されるべきである。別途示されない限り、部品は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気中または大気近傍である。標準的な略称は、例えば、bp、塩基対(複数可);kb、キロ塩基(複数可);pl、ピコリッター(複数可);sまたはsec、秒(複数可);min、分(複数可);hまたはhr、時間(複数可);aa、アミノ酸(複数可);nt、ヌクレオチド(複数可)などが使用されることができる。
本発明の実施は、別途示されない限り、当技術分野の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技術、及び薬理学の従来の方法を採用する。かかる技術は、文献で十分に説明されている。例えば、T.E.Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993)、A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,current addition)、Sambrook,et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)、Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)、Remington’s Pharmaceutical Sciences,21th Edition(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,2005)、Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed.(Plenum Press)Vols A and B(1992)を参照されたい。
方法
エクソソーム精製
調整培養培地を回収し、室温で5分間300~800×gで遠心分離して、細胞及び大きな破片を除去した。次いで、培地上清を1000U/Lベンゾナーゼ(登録商標)で補充し、水浴中で1時間37℃でインキュベートした。上清を回収し、4℃で30分間16,000×gで遠心分離して、残留細胞破片及び他の大きな汚染物質を除去した。次いで、上清を4℃で3時間133,900×gで超遠心分離して、エクソソームをペレット化した。上清を廃棄し、残留培地をチューブの底部から吸引した。ペレットを200~1000μLのPBS(-Ca-Mg)中に再懸濁した。
エクソソーム精製
調整培養培地を回収し、室温で5分間300~800×gで遠心分離して、細胞及び大きな破片を除去した。次いで、培地上清を1000U/Lベンゾナーゼ(登録商標)で補充し、水浴中で1時間37℃でインキュベートした。上清を回収し、4℃で30分間16,000×gで遠心分離して、残留細胞破片及び他の大きな汚染物質を除去した。次いで、上清を4℃で3時間133,900×gで超遠心分離して、エクソソームをペレット化した。上清を廃棄し、残留培地をチューブの底部から吸引した。ペレットを200~1000μLのPBS(-Ca-Mg)中に再懸濁した。
エクソソーム集団をさらに濃縮するために、密度勾配精製(ショ糖またはOptiprep(商標))を介してペレットを処理した。ショ糖勾配精製のために、以下の表6に定義されるように、エクソソームペレットをショ糖勾配の上部に重ねた。
勾配を、SW41 Ti回転子に配置された12mLの超クリア(344059)チューブ中で4℃で16時間200,000×gで回して、エクソソーム画分を分離した。
エクソソーム層を上層から穏やかに除去し、38.5mLの超クリア(344058)チューブ中の約32.5mLのPBS中で希釈し、再び4℃で3時間133,900×gで超遠心分離して、精製されたエクソソームをペレット化した。生じたペレットを最小体積のPBS(約200μL)中に再懸濁し、4℃で保存した。
Optiprep(商標)勾配のために、SW 41 Ti回転子用12mLのUltra-Clear(344059)チューブ内で、等体積の10%、30%、及び45%のOptiprepにより3層滅菌勾配を調製した。ペレットをOptiprep(商標)勾配に添加し、4℃で16時間200,000×gで超遠心分離して、エクソソーム画分を分離した。次いで、エクソソーム層を、チューブの上部約3mLから穏やかに回収した。
エクソソーム画分を、38.5mLの超クリア(344058)チューブ中の約32mLのPBS中で希釈し、4℃で3時間133,900×gで超遠心分離して、精製されたエクソソームをペレット化した。次いで、ペレット化されたエクソソームを最小体積のPBS(約200μL)中に再懸濁し、4℃で保存した。
実施例1:エクソソームを操作して、免疫チェックポイント調節因子抗体を表示する
ヒト胚性腎臓(HEK)細胞株は高密度に増殖され、生じたエクソソームは当業者に既知の方法(例えば、本明細書に記載の方法)に従って培養培地から単離される。細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)抗体で操作されたエクソソームは、当該技術分野で既知の技術に従って化学的コンジュゲーションによって調製される。CTLA4抗体で修飾されたエクソソームは、フローサイトメトリーによって選択される。同時に、未修飾エクソソームは、同じ標準的な方法に従って単離される。
ヒト胚性腎臓(HEK)細胞株は高密度に増殖され、生じたエクソソームは当業者に既知の方法(例えば、本明細書に記載の方法)に従って培養培地から単離される。細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)抗体で操作されたエクソソームは、当該技術分野で既知の技術に従って化学的コンジュゲーションによって調製される。CTLA4抗体で修飾されたエクソソームは、フローサイトメトリーによって選択される。同時に、未修飾エクソソームは、同じ標準的な方法に従って単離される。
2つのエクソソーム集団は放射性トレーサーで標識され、各調製物の150μgは生きたマウス(例えば、メラノーマのマウスモデル)へと注射される。CTLA-4抗体を示すエクソソームまたは未修飾エクソソームのいずれかを受容するマウスは30分間連続で監視され、全動物PET/CTによって4時間間隔で再び監視される。全動物撮像は、標識されたエクソソームを様々な組織にリアルタイムで高解像度で追跡することを可能にする。
各エクソソーム集団の150μgは、放射性トレーサーで最初に標識することなく2つのマウスコホートへと静脈内注射される。マウスは、投与後5週間で安楽死させられる。腫瘍試料は、回収され、免疫組織化学及びリアルタイムPCRによって分析される。
実施例2:エクソソームを操作してFasリガンドを表示する
ヒト抗原提示細胞は、ピューロマイシン耐性選択マーカー及びFasリガンドをコードするプラスミドでトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞はピューロマイシンで処理され、耐性コロニーは選択され、フローサイトメトリーによってFasリガンドの表面発現についてアッセイされる。安定したFasリガンド発現細胞は高濃度に成長させられ、生じたエクソソームは当業者に既知の方法(例えば、本明細書に記載の方法)に従って培養培地から単離される。同時に、トランスフェクトされていない産生細胞は培養され、生じたエクソソームは同じ標準的な方法に従って単離される。
ヒト抗原提示細胞は、ピューロマイシン耐性選択マーカー及びFasリガンドをコードするプラスミドでトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞はピューロマイシンで処理され、耐性コロニーは選択され、フローサイトメトリーによってFasリガンドの表面発現についてアッセイされる。安定したFasリガンド発現細胞は高濃度に成長させられ、生じたエクソソームは当業者に既知の方法(例えば、本明細書に記載の方法)に従って培養培地から単離される。同時に、トランスフェクトされていない産生細胞は培養され、生じたエクソソームは同じ標準的な方法に従って単離される。
2つのエクソソーム集団は放射性トレーサーで標識され、各調製物の150μgは生きたマウス(例えば、GvHDのマウスモデル)へと注射される。未修飾細胞に由来するエクソソームまたはFasリガンド発現細胞に由来するエクソソームのいずれかを受容するマウスは、30分間連続で監視され、全動物PET/CTによって4時間間隔で再び監視される。全動物撮像は、標識されたエクソソームを様々な組織にリアルタイムで高解像度で追跡することを可能にする。
未修飾産生細胞及びFasリガンドを発現するように操作された産生細胞からの精製されたエクソソーム集団は、本明細書に記載の方法に従って精製される。各エクソソーム集団の150μgは、放射性トレーサーで最初に標識することなく2つのマウスコホートへと注射される。両方のコホートの動物は、免疫組織化学分析及びリアルタイムPCRのために投与後3~5週間安楽死させられる。
実施例3:腹腔内投与後のエクソソームのリンパ取り込み
精製されたエクソソームのインビボでの生体内分布を決定するために、以下の実験を実行した。
精製されたエクソソームのインビボでの生体内分布を決定するために、以下の実験を実行した。
293T細胞から調整培養培地を回収し、室温で5分間300~800×gで遠心分離して、細胞及び大きな破片を除去した。次いで、培地上清を1000U/Lベンゾナーゼ(登録商標)で補充し、水浴中で1時間37℃でインキュベートした。上清を回収し、4℃で30分間16,000×gで遠心分離して、残留細胞破片及び他の大きな汚染物質を除去した。次いで、上清を4℃で3時間133,900×gで超遠心分離して、エクソソームをペレット化した。上清を廃棄し、チューブの底から残留培地を吸引した。次いで、ペレットを200~1000μLのPBS(-Ca-Mg)中に再懸濁した。
エクソソーム集団をさらに濃縮するために、表6に定義されるようにショ糖密度勾配精製を介してペレットを処理した。
勾配を、SW41 Ti回転子に配置された12mLの超クリア(344059)チューブ中で4℃で16時間200,000×gで回して、エクソソーム画分を分離した。
エクソソーム層を上層から穏やかに除去し、38.5mLの超クリア(344058)チューブ中の約32.5mLのPBS中で希釈し、再び4℃で3時間133,900×gで超遠心分離して、精製されたエクソソームをペレット化した。生じたペレットを最小体積のPBS(約200μL)中に再懸濁し、4℃で保存した。
インビボ撮像用の精製されたエクソソームを放射標識するために、100μL中の1×1011個の精製されたエクソソームをHEPES(200μL、0.1M、pH8.5)で希釈し、p-SCN-Bn-DFO(5μg)に37℃で1時間コンジュゲートし、続いて4℃で単独で一晩インキュベートした。DFO-エクソソームを、HEPES(100μL、1M、pH7.3)中で希釈した89Zr(7.5mCi)と共に37℃で1時間インキュベートし、qEvカラム上で精製した。このことは、100μCi/1×1010エクソソームでの総収率(最大0.8mLのPBS中で0.4mCiの89Zr-DFO-エクソソーム)を生じた。放出前に品質管理(HPLC)を実行し、95%超のRCPを確実にした。
インビトロ安定性
エクソソーム(20μCi/2×1010)を、室温で以下の中でインキュベートした。
a.製剤緩衝液
b.マウス血清(できれば血清中10% v/vのエクソソーム溶液)
エクソソーム(20μCi/2×1010)を、室温で以下の中でインキュベートした。
a.製剤緩衝液
b.マウス血清(できれば血清中10% v/vのエクソソーム溶液)
インキュベーション開始2時間後に溶液をHPLCへと注入し、トレーサーの安定性を決定した。
インビボ撮像
マウス(SKH-1、n=8、5~8週齢)を2つの群にランダムに分け、体重を測定し、1×1010/gのエクソソームで注射して(第1の群の動的スキャンが終了した直後に第2の群を注射して)、100μCi/マウスの最小放射線量を得た。群1を静脈内注射(IV)し、群2を腹腔内注射(IP)した。
マウス(SKH-1、n=8、5~8週齢)を2つの群にランダムに分け、体重を測定し、1×1010/gのエクソソームで注射して(第1の群の動的スキャンが終了した直後に第2の群を注射して)、100μCi/マウスの最小放射線量を得た。群1を静脈内注射(IV)し、群2を腹腔内注射(IP)した。
マウスは、以下のスケジュールを使用して、4匹のマウスのホテルで全身PET/CTスキャンを受ける。1時間の動的(5×60、5×180、8x300秒)ならびに4時間(20分)、24時間(木曜、20分)、及び48時間(金曜、30分)の静的撮像。各撮像時点に続いて、解剖学的参照のためにCTを行った。
最後の撮像時点の後、マウスを安楽死させ、以下の臓器を回収、計量し、ガンマカウンタ内で計数した。血液、肺(1つ)、肝臓(葉)、脾臓、膵臓、腎臓(1つ)、肝臓、結腸、及び高取り込みの追加の臓器。
計数が極端に高かった場合、臓器を2~3日間崩壊させ、再び計数した。
結果
処理されたマウスの2つのコホートを、処理の4時間後、24時間後、及び48時間後に撮像した。全身PET/CT撮像は、IV処理された群1における全てのマウスの肝臓への頑強な送達(図1A)、及びIP処理された群2におけるマウスの異なる非重複分布を明らかにした(図1B)。臓器を解剖し、放射線撮影ガンマカウンタによって分析したところ、IV処理したマウスにおける有意な肝臓及び脾臓の取り込みが明らかになった(図2)。対照的に、IP処理されたマウスについて、取り込みは、主に脾臓、膵臓、胸腺、及びリンパ節において観察され、肝臓及び卵巣において追加の取り込みが観察された。これらの結果は、異なる投与経路が実質的に異なる生体内分布プロファイルを生じることを実証する。重要なことに、IP投与は、リンパ系の著しい取り込みをもたらし、IP投与が免疫細胞に到達するための好適な投与経路であり得ることを示唆した。
処理されたマウスの2つのコホートを、処理の4時間後、24時間後、及び48時間後に撮像した。全身PET/CT撮像は、IV処理された群1における全てのマウスの肝臓への頑強な送達(図1A)、及びIP処理された群2におけるマウスの異なる非重複分布を明らかにした(図1B)。臓器を解剖し、放射線撮影ガンマカウンタによって分析したところ、IV処理したマウスにおける有意な肝臓及び脾臓の取り込みが明らかになった(図2)。対照的に、IP処理されたマウスについて、取り込みは、主に脾臓、膵臓、胸腺、及びリンパ節において観察され、肝臓及び卵巣において追加の取り込みが観察された。これらの結果は、異なる投与経路が実質的に異なる生体内分布プロファイルを生じることを実証する。重要なことに、IP投与は、リンパ系の著しい取り込みをもたらし、IP投与が免疫細胞に到達するための好適な投与経路であり得ることを示唆した。
実施例4:操作されたCD40LエクソソームによるB細胞活性化
CD40Lは、主にT細胞上で発現される腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリーのメンバーである。CD40L受容体CD40は、マクロファージ、樹状細胞、及びB細胞を含む抗原提示細胞上で発現される。CD40を通じたシグナル伝達は、B細胞を活性化し、抗原特異的応答を誘導する。したがって、CD40経路を活性化することは、広範囲の腫瘍型における抗腫瘍免疫の発達に影響を及ぼす。操作されたエクソソームが特定の免疫学的効果を誘導するために生成されることができるかどうかを決定するために、エクソソームを、全長ヒトCD40Lを含有するプラスミドでトランスフェクトされたHEK293SF細胞から生成した。トランスフェクトされた細胞をピューロマイシン選択下に置き、耐性細胞集団を高密度に増殖させた。生じたエクソソームを調整培養培地から回収し、上述のOptiprep(商標)勾配上で精製した。未修飾HEK293SF細胞由来からのエクソソームも単離して、対照として使用した。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、96ウェルプレートのウェル当たり150,000細胞で蒔き、精製されたCD40Lエクソソームまたは天然エクソソームと共に37℃で一晩インキュベートした。PBMCの1つの試料を、陽性対照として1μg/mLの可溶性組換えCD40L-Fcと共にインキュベートした。図3A及び図3Bに示されるように、CD40Lエクソソームは、2人の異なるドナー試料におけるCD69発現によって測定されたように、用量依存的様式でB細胞を活性化した。天然エクソソームは、B細胞活性化を誘導することができなかった。重要なことに、CD40LエクソソームによるB細胞活性化のレベルは、CD40L-Fcによって引き起こされた活性化に匹敵した。
CD40Lは、主にT細胞上で発現される腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリーのメンバーである。CD40L受容体CD40は、マクロファージ、樹状細胞、及びB細胞を含む抗原提示細胞上で発現される。CD40を通じたシグナル伝達は、B細胞を活性化し、抗原特異的応答を誘導する。したがって、CD40経路を活性化することは、広範囲の腫瘍型における抗腫瘍免疫の発達に影響を及ぼす。操作されたエクソソームが特定の免疫学的効果を誘導するために生成されることができるかどうかを決定するために、エクソソームを、全長ヒトCD40Lを含有するプラスミドでトランスフェクトされたHEK293SF細胞から生成した。トランスフェクトされた細胞をピューロマイシン選択下に置き、耐性細胞集団を高密度に増殖させた。生じたエクソソームを調整培養培地から回収し、上述のOptiprep(商標)勾配上で精製した。未修飾HEK293SF細胞由来からのエクソソームも単離して、対照として使用した。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、96ウェルプレートのウェル当たり150,000細胞で蒔き、精製されたCD40Lエクソソームまたは天然エクソソームと共に37℃で一晩インキュベートした。PBMCの1つの試料を、陽性対照として1μg/mLの可溶性組換えCD40L-Fcと共にインキュベートした。図3A及び図3Bに示されるように、CD40Lエクソソームは、2人の異なるドナー試料におけるCD69発現によって測定されたように、用量依存的様式でB細胞を活性化した。天然エクソソームは、B細胞活性化を誘導することができなかった。重要なことに、CD40LエクソソームによるB細胞活性化のレベルは、CD40L-Fcによって引き起こされた活性化に匹敵した。
観察されたエクソソーム媒介性B細胞活性化が、B細胞の直接活性化に起因するのか、またはトランス作用性免疫細胞を通じたものかどうかを決定するために、精製されたヒトB細胞を使用して同様の実験を行った。50,000個の精製されたヒトB細胞を、96ウェルプレートに蒔き、CD40Lエクソソーム、天然エクソソーム、またはCD40L-Fcのいずれかと共にインキュベートした。高濃度CD40Lエクソソームの1つの試料を凍結解凍サイクル(CD40L-EV[F/T])に通し、B細胞活性化についても試験した。図4A及び4Bに示されるように、CD40Lエクソソームは、CD40L-Fcと同様の程度で、2人のドナーからの精製されたB細胞を活性化した。天然エクソソームはB細胞を活性化することができなかったが、CD40Lエクソソーム凍結解凍試料はB細胞を活性化することに成功し、CD40Lエクソソームの効果がB細胞を通じて直接媒介されることと、CD40Lの存在がB細胞活性化に十分であることとを示した。加えて、操作されたエクソソームは、少なくとも1つの凍結解凍サイクルの間安定し活性であり続ける。
CD40Lエクソソームをさらに検証するために、レポーター系を使用して、操作されたエクソソームの活性を測定した。CD40経路の活性化は、NF-κBの活性化を生じる。その表面上でCD40を過剰発現させ、NF-κBプロモーター(Promega Corporation)の下流にルシフェラーゼレポーターを含有するように操作された修飾U2OS細胞株を使用して、抗Fc抗体(Jackson ImmunoResearch,Inc.)と架橋されたアゴニスト抗CD40抗体(BioLegend,Inc.)または抗IgG抗体(Jackson ImmunoResearch,Inc.)と架橋された組換えヒトCD40L(ACROBiosystems)の存在下で細胞をインキュベートすることによってCD40活性化を確認した(図5A及び5B)。CD40L操作エクソソームを操作された細胞と共にインキュベートし、抗CD40+抗Fcの効果に匹敵するルシフェラーゼ活性の頑強な増加を生じた。重要なことに、操作されたエクソソームは、架橋抗体を必要とせず、エクソソームの表面上のCD40LがCD40を活性化するのに十分な機能的CD40L三量体を形成できることを実証した。
実施例5:操作されたCD80エクソソームによるT細胞活性化
CD80は、抗原提示細胞上で発現され、T細胞の表面上のCD28及びCTLA-4に結合する。CD80(ならびにCD86)によるCD28及びCTLA-4を通じた刺激は、免疫応答の開始中にT細胞を活性化する。エクソソームを操作してT細胞を活性化することができるかどうかを決定するために、実施例4に記載のHEK293SF細胞のトランスフェクション及び選択によって、CD80含有エクソソームを生成した。CD80エクソソームの活性を検証するために、ヒトPBMCを、96ウェルプレートのウェル当たり150,000個の細胞で蒔き、(i)精製されたCD80エクソソーム及び抗CD3抗体、(ii)天然エクソソーム及び抗CD3抗体、(iii)抗CD3抗体単独、または(iv)抗CD28及び抗CD3抗体の組み合わせ、と共にインキュベートした。試料を、37℃で3日間インキュベートし、CD4+T細胞(図6A)及びCD8+T細胞(図6B)の両方についてT細胞計数についてアッセイした。CD80エクソソームは、用量依存的様式で、かつCD3及びCD28抗体の陽性対照に匹敵する程度でT細胞を活性化した。対照的に、天然エクソソームは、T細胞増殖に効果がなかった。
CD80は、抗原提示細胞上で発現され、T細胞の表面上のCD28及びCTLA-4に結合する。CD80(ならびにCD86)によるCD28及びCTLA-4を通じた刺激は、免疫応答の開始中にT細胞を活性化する。エクソソームを操作してT細胞を活性化することができるかどうかを決定するために、実施例4に記載のHEK293SF細胞のトランスフェクション及び選択によって、CD80含有エクソソームを生成した。CD80エクソソームの活性を検証するために、ヒトPBMCを、96ウェルプレートのウェル当たり150,000個の細胞で蒔き、(i)精製されたCD80エクソソーム及び抗CD3抗体、(ii)天然エクソソーム及び抗CD3抗体、(iii)抗CD3抗体単独、または(iv)抗CD28及び抗CD3抗体の組み合わせ、と共にインキュベートした。試料を、37℃で3日間インキュベートし、CD4+T細胞(図6A)及びCD8+T細胞(図6B)の両方についてT細胞計数についてアッセイした。CD80エクソソームは、用量依存的様式で、かつCD3及びCD28抗体の陽性対照に匹敵する程度でT細胞を活性化した。対照的に、天然エクソソームは、T細胞増殖に効果がなかった。
CD80エクソソームがT細胞の機能的活性化を誘導することを確認するために、天然エクソソームと追加の抗CD3抗体、及びCD80エクソソームと追加の抗CD3抗体と共にインキュベートしたPBMCにおいて、IFNγレベルをAlphaLISAによって測定した。図7Aに示されるように、IFNγレベルの用量依存的な増加は、CD80エクソソームについてはあったが、天然エクソソームについてはなかった。図7Bに示されるように、最高濃度のCD80エクソソームは、陽性対照(抗CD28/抗CD3)を含む任意の他の条件よりも大きなIFNγレベルを生じた。これらの結果は、エクソソームが免疫細胞活性化を生じる特異的活性で操作されることができることを実証する。
実施例6:操作されたCD27L及びOX40Lエクソソームによる炎症性サイトカイン産生
CD27L(CD70)及びOX40Lは、TNFスーパーファミリーのメンバーであり、かつT細胞上の同族受容体(それぞれ、CD27及びOX40)に結合する。CD27LはT細胞及びB細胞のある特定の集団によって発現されるが、OX40Lは抗原提示細胞のある特定の集団によって発現される。したがって、CD27またはOX40を通じたシグナル伝達は、具体的にアネルギーT細胞を活性化する方法として、免疫腫瘍学に影響を及ぼす。エクソソームを操作してPBMCにおける炎症性サイトカイン産生を誘導することができるかどうかを決定するために、実施例4に記載のHEK293SF細胞のトランスフェクション及び選択によって、CD27LならびにOX40L含有エクソソームを生成した。CD27Lエクソソームの活性を検証するために、ヒトPBMCを、96ウェルプレートに蒔き、精製されたCD27Lエクソソーム及び抗CD3抗体、天然エクソソーム及び抗CD3抗体、抗CD3抗体単独、または抗CD28及び抗CD3抗体の組み合わせ、と共にインキュベートした。試料を、37℃で2日間インキュベートし、2人の異なるドナーにおけるインターフェロンガンマ(IFNγ)産生(図8A及び8B)及びIL-2産生(図9A及び9B)についてアッセイした。CD27Lエクソソームは、用量依存的様式で、かつCD3及びCD28抗体の陽性対照に匹敵する(ドナー1)または有意に超える(ドナー2)程度で、IFNγ及びIL-2産生を誘導した。対照的に、天然エクソソームは、IFNγまたはIL-2産生に効果がなかった。同様に、OX40Lエクソソームは、2人の異なるドナーにおけるIFNγ及びIL-2産生を同様またはそれ以上の程度で誘導するのに十分であった(図10A及び10Bならびに図11A及び11B)。
CD27L(CD70)及びOX40Lは、TNFスーパーファミリーのメンバーであり、かつT細胞上の同族受容体(それぞれ、CD27及びOX40)に結合する。CD27LはT細胞及びB細胞のある特定の集団によって発現されるが、OX40Lは抗原提示細胞のある特定の集団によって発現される。したがって、CD27またはOX40を通じたシグナル伝達は、具体的にアネルギーT細胞を活性化する方法として、免疫腫瘍学に影響を及ぼす。エクソソームを操作してPBMCにおける炎症性サイトカイン産生を誘導することができるかどうかを決定するために、実施例4に記載のHEK293SF細胞のトランスフェクション及び選択によって、CD27LならびにOX40L含有エクソソームを生成した。CD27Lエクソソームの活性を検証するために、ヒトPBMCを、96ウェルプレートに蒔き、精製されたCD27Lエクソソーム及び抗CD3抗体、天然エクソソーム及び抗CD3抗体、抗CD3抗体単独、または抗CD28及び抗CD3抗体の組み合わせ、と共にインキュベートした。試料を、37℃で2日間インキュベートし、2人の異なるドナーにおけるインターフェロンガンマ(IFNγ)産生(図8A及び8B)及びIL-2産生(図9A及び9B)についてアッセイした。CD27Lエクソソームは、用量依存的様式で、かつCD3及びCD28抗体の陽性対照に匹敵する(ドナー1)または有意に超える(ドナー2)程度で、IFNγ及びIL-2産生を誘導した。対照的に、天然エクソソームは、IFNγまたはIL-2産生に効果がなかった。同様に、OX40Lエクソソームは、2人の異なるドナーにおけるIFNγ及びIL-2産生を同様またはそれ以上の程度で誘導するのに十分であった(図10A及び10Bならびに図11A及び11B)。
OX40Lエクソソームをさらに検証するために、レポート系を使用して、操作されたエクソソームの活性を測定した。OX40経路の活性化は、NF-κBの活性化を生じる。その表面上でOX40を過剰発現させ、NF-κBプロモーター(Promega Corporation)の下流にルシフェラーゼレポーターを含有するように操作された修飾JurkatT細胞株を使用して、抗Fc抗体(Jackson ImmunoResearch,Inc.)と架橋されたアゴニスト抗OX40抗体(Biolegend)または抗IgG抗体(Jackson Immunoresearch)と架橋された組換えヒトOX40L(ACROBiosystems)の存在下で細胞をインキュベートすることによってOX40活性化を確認した(図12A及び12B)。抗IgGと架橋した抗OX40L抗体はレポーター細胞を活性化することができなかったが、抗Fcと架橋した組換えOX40Lはレポーター遺伝子の頑強な活性化をもたらした(図12B)。際立ったことに、操作されたOX40Lエクソソームは、抗OX40抗体または組換えOX40Lのいずれかよりも大きな程度でレポーター遺伝子発現を誘導した(図12C)。重要なことに、操作されたエクソソームは、架橋抗体を必要とせず、エクソソームの表面上のOX40LがOX40を活性化するのに十分な機能的OX40L三量体を形成できることを実証した。
実施例7:IL-7操作エクソソームによるT細胞活性化
IL-7は、B細胞及びT細胞増殖に関与するサイトカインであり、免疫療法に影響を及ぼす。具体的には、IL-7は、白血球により不十分に浸潤される腫瘍またはT細胞アネルギーを誘導した腫瘍微小環境において、T細胞を活性化し、腫瘍抗原応答を誘導することができる。ヘテロ二量体IL-7受容体を通じたIL-7シグナル伝達は、T細胞による腫瘍特異的抗原応答を増強することができるインターフェロンガンマ(IFNγ)シグナル伝達を誘導する。エクソソームを操作してT細胞活性化を誘導することができるかどうかを決定するために、IL-7含有エクソソームを、IL-7とPDGF受容体との融合物をコードするpDisplay(商標)プラスミド(ThermoFisher)でのHEK293SF細胞のトランスフェクション及び選択によって生成した。操作されたエクソソームを、方法に記載されているように精製した。IL-7エクソソームの活性を検証するために、ヒトPBMCを、96ウェルプレートに蒔き、精製されたIL-7エクソソーム及び抗CD3抗体、天然エクソソーム及び抗CD3抗体、抗CD3抗体単独、または抗CD28及び抗CD3抗体の組み合わせ、と共にインキュベートした。試料を、37℃で2日間インキュベートし、IFNγについてアッセイした(図13A及び13B)。抗CD3抗体と組み合わせたIL-7エクソソームは、抗CD3単独よりも大きな程度でピークIFNγ産生を誘導した(図13A)。加えて、IL-7エクソソームは、用量依存的様式で、かつCD3及びCD28抗体の陽性対照に匹敵する程度で、IFNγを誘導した。対照的に、天然エクソソームは、IFNγ産生に効果がなかった(図13B)。
IL-7は、B細胞及びT細胞増殖に関与するサイトカインであり、免疫療法に影響を及ぼす。具体的には、IL-7は、白血球により不十分に浸潤される腫瘍またはT細胞アネルギーを誘導した腫瘍微小環境において、T細胞を活性化し、腫瘍抗原応答を誘導することができる。ヘテロ二量体IL-7受容体を通じたIL-7シグナル伝達は、T細胞による腫瘍特異的抗原応答を増強することができるインターフェロンガンマ(IFNγ)シグナル伝達を誘導する。エクソソームを操作してT細胞活性化を誘導することができるかどうかを決定するために、IL-7含有エクソソームを、IL-7とPDGF受容体との融合物をコードするpDisplay(商標)プラスミド(ThermoFisher)でのHEK293SF細胞のトランスフェクション及び選択によって生成した。操作されたエクソソームを、方法に記載されているように精製した。IL-7エクソソームの活性を検証するために、ヒトPBMCを、96ウェルプレートに蒔き、精製されたIL-7エクソソーム及び抗CD3抗体、天然エクソソーム及び抗CD3抗体、抗CD3抗体単独、または抗CD28及び抗CD3抗体の組み合わせ、と共にインキュベートした。試料を、37℃で2日間インキュベートし、IFNγについてアッセイした(図13A及び13B)。抗CD3抗体と組み合わせたIL-7エクソソームは、抗CD3単独よりも大きな程度でピークIFNγ産生を誘導した(図13A)。加えて、IL-7エクソソームは、用量依存的様式で、かつCD3及びCD28抗体の陽性対照に匹敵する程度で、IFNγを誘導した。対照的に、天然エクソソームは、IFNγ産生に効果がなかった(図13B)。
IL-7受容体は、IL-7R及びIL-2RGからなるヘテロ二量体複合体であり、IL-7の存在下で三元複合体を形成し、JAK/STAT経路を通じた下流シグナル伝達を誘導し、細胞増殖を生じる。合成細胞ベースのアッセイを使用して、IL-7受容体を通じたIL-7シグナル伝達を測定して、操作されたIL-7エクソソームの機能的活性を評価した(DiscoverX Corporation)(図14A)。組換えヒトIL-7(rhIL-7)はIL-7受容体を通じたシグナル伝達を増加させるのに十分であり(図14B)、操作されたIL-7エクソソームはIL-7受容体を通じたシグナル伝達を誘導することができたが天然エクソソームはできなかった(図14C)。これらのデータは、IL-7発現エクソソームがインビトロでIL-7受容体を通じたシグナル伝達を誘導するのに十分であることを実証する。
インビトロで観察されたIL-7エクソソームの効果がインビボモデルで再現されることができるかどうかを決定するために、IL-7エクソソームをC57BL/6マウスに投与した。20匹のマウスのコホートを、以下の群に分離した。(1)PBS、(2)組換えヒトIL-7(rhIL-7)、(3)IL-7操作エクソソーム、及び(4)未修飾天然エクソソーム。各群の5匹のマウスに、1mgのEdU及びPBS、1×1011天然もしくはIL-7エクソソーム、または10μgのrhIL-7のいずれかを腹腔内(IP)に1日1回3日間注射した。マウスを犠牲にし、脾臓を単離し、フローサイトメトリーによって脾臓細胞内でEdUレベルを測定した。図15Aに示されるように、パーセント陽性CD8+T細胞は、対照コホートと比較して、IL-7エクソソームマウス及びrhIL-7マウスにおいて有意に増加した。IL-7エクソソームマウスにおけるT細胞計数はrhIL-7コホートよりも低かったが、IL-7エクソソームコホートに投与されたIL-7分子は5倍少なかったと推定される(データは示さず)。同様の傾向は、メモリマーカーCD45ROのレベルを測定することによって、メモリCD8+T細胞について観察された(図15b)。
直交アプローチとして、エクソソーム処理マウスから単離された脾臓細胞においてCD71(トランスフェリン受容体)のレベルを測定した。CD71は、増殖のために必要であり、CD71レベルはT細胞数と相関する。図15A及び15Bに示されるように、CD8+T細胞及びメモリCD-8+T細胞数は、図16A及び16Bで観察されるのと同じ傾向に従った。合わせて、これらのデータは、操作されたエクソソームがインビボで特異的免疫細胞効果を誘導することができ、この活性化が組換えアゴニストと比較して分子当たりに基づきより強力であり得ることを実証する。
実施例8:IL-7専有の足場への融合は特定の活性を増強する
IL-7操作エクソソームの活性を増強するために、IL-7配列を、HEK293SFエクソソームの表面上で高度に発現される新規のエクソソーム膜貫通タンパク質であるPTGFRNの切断部分に融合した。IL-7を、最C末端側のIgVドメイン、膜貫通ドメイン、及びPTGFRNの細胞内ドメイン、同様にFLAGタグの前の領域を包含するPTGFRNの短い断片の上流の翻訳融合として発現させた。一連の発現構築物を、IL-7とPTGFRNとの間に一連の4つのアミノ酸欠失を導入することによって生成した(図17a)。生じた構築物を、pX-1~pX-4(図17Bに示されるpX-4完全配列)に番号付けした。抗IL-7抗体を用いたウエスタンブロット分析によって示されるように、構築物pX-3及びpX-4は、最高レベルの発現を示した。PTGFRN骨格におけるIL-7発現のレベルは、実施例7(図18A)で使用されたpDisplay-IL-7よりも劇的に高かった。IL-7の増加した発現は、これらの新規融合タンパク質がはるかに高いレベルのIL-7媒介性T細胞活性化を誘導できることを示唆した。PTGFRN-IL-7融合物の効力を決定するために、T細胞活性化のインビトロモデルを行った。T細胞のIL-7媒介性活性化時に、IL-7受容体(IL-7R)レベルは、24時間以内に用量依存的に減少する(Ghawazi et al.,Immunol Cell Biol.2013 Feb;91(2):149-58)。したがって、様々なIL-7操作エクソソームでPBMCをインキュベートした後、IL-7Rレベルをモニタリングした。図18Bに示されるように、天然エクソソームはIL-7Rレベルを低減させることができなかったが、pDisplay-IL-7エクソソーム(IL-7-pD)は、高用量でのみIL-7Rレベルを低減させた。対照的に、PTGFRN-IL-7エクソソーム(IL-7-pX3~pX4)は、はるかに低い用量でIL-7Rレベルを完全に低減させ、これらの操作されたエクソソームの効力の増加を実証した。IC50の尺度として、PTGFRN-IL-7エクソソームは、IL-7-pDエクソソームよりも20~76倍強力であり(表2)、増加したリガンド密度が生物学的効力を増加させるのに十分であることを実証した。さらに、これらの結果は、PTGFRNの特異的切断が、エンジニアリング治療用エクソソームでの使用のための理想的な足場であり得ることを実証する。
IL-7操作エクソソームの活性を増強するために、IL-7配列を、HEK293SFエクソソームの表面上で高度に発現される新規のエクソソーム膜貫通タンパク質であるPTGFRNの切断部分に融合した。IL-7を、最C末端側のIgVドメイン、膜貫通ドメイン、及びPTGFRNの細胞内ドメイン、同様にFLAGタグの前の領域を包含するPTGFRNの短い断片の上流の翻訳融合として発現させた。一連の発現構築物を、IL-7とPTGFRNとの間に一連の4つのアミノ酸欠失を導入することによって生成した(図17a)。生じた構築物を、pX-1~pX-4(図17Bに示されるpX-4完全配列)に番号付けした。抗IL-7抗体を用いたウエスタンブロット分析によって示されるように、構築物pX-3及びpX-4は、最高レベルの発現を示した。PTGFRN骨格におけるIL-7発現のレベルは、実施例7(図18A)で使用されたpDisplay-IL-7よりも劇的に高かった。IL-7の増加した発現は、これらの新規融合タンパク質がはるかに高いレベルのIL-7媒介性T細胞活性化を誘導できることを示唆した。PTGFRN-IL-7融合物の効力を決定するために、T細胞活性化のインビトロモデルを行った。T細胞のIL-7媒介性活性化時に、IL-7受容体(IL-7R)レベルは、24時間以内に用量依存的に減少する(Ghawazi et al.,Immunol Cell Biol.2013 Feb;91(2):149-58)。したがって、様々なIL-7操作エクソソームでPBMCをインキュベートした後、IL-7Rレベルをモニタリングした。図18Bに示されるように、天然エクソソームはIL-7Rレベルを低減させることができなかったが、pDisplay-IL-7エクソソーム(IL-7-pD)は、高用量でのみIL-7Rレベルを低減させた。対照的に、PTGFRN-IL-7エクソソーム(IL-7-pX3~pX4)は、はるかに低い用量でIL-7Rレベルを完全に低減させ、これらの操作されたエクソソームの効力の増加を実証した。IC50の尺度として、PTGFRN-IL-7エクソソームは、IL-7-pDエクソソームよりも20~76倍強力であり(表2)、増加したリガンド密度が生物学的効力を増加させるのに十分であることを実証した。さらに、これらの結果は、PTGFRNの特異的切断が、エンジニアリング治療用エクソソームでの使用のための理想的な足場であり得ることを実証する。
実施例9:抗CD3抗体断片で操作されたエクソソーム
前述の実施例に示されるように、エクソソームは、免疫調節タンパク質の機能的内因性配列を過剰発現するように操作されることができる。合成アゴニストをエクソソームの表面上で操作することができるかどうかを決定するために、抗CD-3抗体を、実施例4に記載のpDisplay、またはCD80の膜貫通ドメインいずれかへの融合物として発現した。ヒトPBMCをウェル当たり100,000個の細胞で96ウェルプレートに蒔き、抗CD3一本鎖Fv(scFv)(図19A及び19B)または一本鎖Fab(scFab)(図20A及び20B)を発現するように操作されたエクソソームと共に一晩インキュベートした。陽性対照として、PBMCを、製造業者のプロトコルに従ってImmunoCult(商標)CD3/CD28 Activator(Stem Cell Technologies)と共にインキュベートした。抗CD28共刺激の存在下で、全ての操作されたエクソソームは陽性対照に匹敵するT細胞(図19A及び20A)及びB細胞(図19B及び20B)の活性化を誘導したが、操作されていないエクソソーム対照は誘導しなかった。抗CD3エクソソームの免疫細胞集団への効果を測定するために、フローサイトメトリーによってCD69陽性についてT細胞及びB細胞をアッセイした。図21Aに示されるように、CD80膜貫通ドメインに融合した抗CD3scFvを発現するエクソソームと共にインキュベートしたPBMCは、T細胞の約40%の活性化をもたらした。B細胞の活性化について同様の効果を観察した(図21B)。
前述の実施例に示されるように、エクソソームは、免疫調節タンパク質の機能的内因性配列を過剰発現するように操作されることができる。合成アゴニストをエクソソームの表面上で操作することができるかどうかを決定するために、抗CD-3抗体を、実施例4に記載のpDisplay、またはCD80の膜貫通ドメインいずれかへの融合物として発現した。ヒトPBMCをウェル当たり100,000個の細胞で96ウェルプレートに蒔き、抗CD3一本鎖Fv(scFv)(図19A及び19B)または一本鎖Fab(scFab)(図20A及び20B)を発現するように操作されたエクソソームと共に一晩インキュベートした。陽性対照として、PBMCを、製造業者のプロトコルに従ってImmunoCult(商標)CD3/CD28 Activator(Stem Cell Technologies)と共にインキュベートした。抗CD28共刺激の存在下で、全ての操作されたエクソソームは陽性対照に匹敵するT細胞(図19A及び20A)及びB細胞(図19B及び20B)の活性化を誘導したが、操作されていないエクソソーム対照は誘導しなかった。抗CD3エクソソームの免疫細胞集団への効果を測定するために、フローサイトメトリーによってCD69陽性についてT細胞及びB細胞をアッセイした。図21Aに示されるように、CD80膜貫通ドメインに融合した抗CD3scFvを発現するエクソソームと共にインキュベートしたPBMCは、T細胞の約40%の活性化をもたらした。B細胞の活性化について同様の効果を観察した(図21B)。
抗CD-3エクソソーム媒介性T細胞活性化が直接T細胞活性化に起因するのか、またはトランス作用性免疫細胞を通じたものかどうかを決定するために、精製されたT細胞の活性化を測定した。100,000個の精製されたヒトT細胞を、抗CD28抗体の存在下または非存在下で非標的抗体もしくは抗CD3エクソソームでプレコーティングしたウェル、または抗CD28抗体の存在下もしくは非存在下で可溶性抗CD3エクソソームと共にインキュベートしたウェルに、96ウェル形式で蒔いた。図22Aに示されるように、可溶性及びプレートコーティングされた抗CD3scFvエクソソームの両方は、CD69発現によって測定された抗CD28抗体の存在下でT細胞を活性化した。図22Bに示されるように、抗CD28抗体の存在下でのプレートコーティング抗CD3抗体は、抗CD28抗体の存在下でのプレートコーティング抗CD3scFvと同じ程度に活性化T細胞を活性化した。際立ったことに、抗CD28抗体の存在下で可溶性抗CD3抗体はT細胞の約30%を活性化するのに十分であったが、抗CD28抗体の存在下で可溶性抗CD3scFvエクソソームはT細胞の有意により高い割合を活性化し、抗体断片を過剰発現するように操作されたエクソソームが可溶性抗体と比較してより高いレベルのT細胞活性化を誘導できることを実証した。合わせて、これらの結果は、エクソソームが特定の細胞型に対して機能的活性を有する抗体断片を過剰発現するよう操作されることができることを実証する。
実施例10:IL-12-PTGFRNエクソソームはインビトロ及びインビボで強力な免疫調節活性を有する。
IL-12は、感染及び他の抗原刺激に応答して抗原提示細胞によって産生される強力な免疫刺激サイトカインである。活性化された樹状細胞、マクロファージ、及び好中球によるIL-12産生は、CD8+及びCD4+T細胞の両方によるIFNγ産生を誘導し、ナチュラルキラー(NK)細胞の細胞障害性効果を誘導する。腫瘍微小環境におけるIL-12分泌の複合的な影響は、IFNγを含むTh1サイトカインの分泌を生じ、腫瘍細胞殺傷、骨髄由来抑制細胞(MDSC)のリプログラミング及び抗血管新生効果をもたらす。IL-12媒介性抗腫瘍効果は、多数の動物モデルにおいて耐久性T細胞応答及び抗腫瘍免疫を生じる。IL-12は、以前にヒトにおいて免疫療法剤として試験されたが、頑強なIFNγ応答の検出可能な誘導にもかかわらず、腎細胞癌患者において有意な毒性を生じた(Leonard et al.,Blood.1997 Oct 1;90(7):2541-8)。したがって、エクソソームは、サイトカインの高い局所濃度及び推定された腫瘍保持薬理学に起因して、IL-12にとって理想的な送達モダリティを表すことができる。
IL-12は、感染及び他の抗原刺激に応答して抗原提示細胞によって産生される強力な免疫刺激サイトカインである。活性化された樹状細胞、マクロファージ、及び好中球によるIL-12産生は、CD8+及びCD4+T細胞の両方によるIFNγ産生を誘導し、ナチュラルキラー(NK)細胞の細胞障害性効果を誘導する。腫瘍微小環境におけるIL-12分泌の複合的な影響は、IFNγを含むTh1サイトカインの分泌を生じ、腫瘍細胞殺傷、骨髄由来抑制細胞(MDSC)のリプログラミング及び抗血管新生効果をもたらす。IL-12媒介性抗腫瘍効果は、多数の動物モデルにおいて耐久性T細胞応答及び抗腫瘍免疫を生じる。IL-12は、以前にヒトにおいて免疫療法剤として試験されたが、頑強なIFNγ応答の検出可能な誘導にもかかわらず、腎細胞癌患者において有意な毒性を生じた(Leonard et al.,Blood.1997 Oct 1;90(7):2541-8)。したがって、エクソソームは、サイトカインの高い局所濃度及び推定された腫瘍保持薬理学に起因して、IL-12にとって理想的な送達モダリティを表すことができる。
IL-12は、p35及びp40の2つのドメインからなる。ヒトIL-12二量体を、全長PTGFRN(図23A、構築物871、配列番号3)または高密度表面表示を可能にするPTGFRNの短縮断片(図23B、構築物873、配列番号5)いずれかへの融合タンパク質としてコードさせ、構築物をHEK293SF細胞内で安定して発現させた。安定した細胞株を化学的に定義された培地で成長させ、培養上清からのエクソソームを方法に記載されているようなOptiprep(商標)勾配上で精製した。エクソソームの表面上のIL-12タンパク質の量を、ELISAによって測定し、全ての機能的研究のためにrIL-12に濃度一致させた。精製された全長及び短いhIL-12-PTGFRNエクソソームまたは組換えhIL-12(rhIL-12;BioLegend,カタログ番号573004)を、IFNγ発現を誘導するために準最適濃度抗CD3抗体の存在下でヒトPBMC中で滴定した。rhIL-12は、全長IL12-PTGFRNに匹敵する0.029ng/mLのEC50で頑強なIFNγ発現を生じ、いずれもIL12-短-PTGFRNよりも約10倍強力であった(図24A~B)。これらの結果は、全長PTGFRN骨格上に表示されたIL-12が短いPTGFRN構築物よりも強力な免疫調節試薬であり得ることを示唆する。
マウス及びヒトIL-12タンパク質は交差反応せず、図24に示されるインビトロデータは、全長PTGFRNに融合したmIL-12がPTGFRNの短い足場を使用するよりもより強力であることを示唆する。がんのインビボモデルにおけるmIL-12-PTGFRNエクソソームの効力を決定するために、C57BL/6マウスに、1×106B16F10マウスメラノーマ細胞(群当たりn=5マウス)を皮下移植した。腫瘍接種後5日目、6日目、及び7日目に、PBS、0.2μgの組換えマウスIL-12(mIL12;BioLegend,カタログ番号577004)、または全長IL-12-PTGFRNを表示する1×1011のエクソソーム(mIL12-エクソソーム、配列番号4)を動物に腫瘍内注射した。腫瘍体積が2,000mm3に達すると、動物を犠牲にした。図25~27に示されるように、PBS群の腫瘍は急速に成長したが、rmIL12及びmIL12-Exo群の腫瘍は激減した(体積の約65~80%低減)。重要なことに、16日目までに、mIL12-Exo群の腫瘍はrmIL12群の腫瘍よりも小さく、可溶性サイトカインと比較してエクソソームの表面上に表示される際のIL-12の優れた有効性を実証した。PBS処理群と比較して、IL-12処理群にとっても生存利益があった(図28)。
rmIL12よりもIL-12-PTGFRN-エクソソームの機構的効果を理解するために、対照群及び処理群の腫瘍においてTh1遺伝子発現をプロファイリングした。IFNγ(図29A)、T細胞化学誘引剤CXCL9(図29B)及びCXCL10(図29C)、ならびにTGFβ(図29D)は、対照群と比較してIL-12処理群において全て増加した。ほとんどの場合において、サイトカインシグナルは、rmIL-12と比較してmIL12-Exoで処理された動物において高かった。脾臓CD8+T細胞におけるIFNγレベルをフローサイトメトリーによって測定し、Exo-mIL-12処理マウスは、PBS群またはrmIL-12群のいずれかよりも有意に大きなシグナルを示した(図30)。合わせて、これらのデータは、エクソソームの表面上に表示されるIL-12が、インビトロで頑強なT細胞活性化を促進する新規かつ強力な免疫調節戦略を表し、インビボでマウスメラノーマの侵襲的モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を誘発するために使用されることができることを実証する。機構的には、IL-12エクソソームは、rIL-12よりも優位性を示し、したがって、がん免疫療法における新規の差別化された治療モダリティを表す。
実施例11:インターフェロンガンマ表示エクソソームは有力な免疫細胞活性化剤である
インターフェロンガンマ(IFNγ)は、先天性及び適応性免疫応答のプライミングに関与するサイトカインである。インターフェロンガンマ(IFNγ)は、IL-12を含む多数のシグナルに応答して多様な細胞型から発現され、かつNK細胞を活性化し、抗原提示細胞における抗原提示を促進し、白血球活性化及び浸潤を促進するのに十分である。IFNγは、ホモ二量体として天然に発現され、可溶性因子として分泌される。IFNγ発現エクソソームを、単量体または二量体のヒト及びマウスIFNγに融合した全長PTGFRNでHEK293SF細胞を安定してトランスフェクトすることによって生成した(それぞれ、図31A及び31B)。上述のように懸濁細胞培養物由来のエクソソームを精製し、PAGEによって分析した。単量体(m)及びタンデム二量体(td)PTGFRN IFNγエクソソームを、同等レベルで予測分子量(矢印)で発現させた(図32)。精製されたエクソソームをELISAによって分析し、組換えIFNγ(Biolegend,カタログ番号570206)を使用する標準曲線と比較して、エクソソーム当たりのIFNγ分子の数を計算した。表9の結果は、精製されたエクソソームの4つの型の各々におけるIFNγ分子の数を示す。特に、タンデム二量体IFNγ PTGFRNエクソソームは、単量体IFNγ PTGFRNエクソソームの少なくとも2倍のIFNγ分子を含有し、タンデム二量体エクソソームが二量体IFNγ構築物を適切に発現していることを示唆する。
インターフェロンガンマ(IFNγ)は、先天性及び適応性免疫応答のプライミングに関与するサイトカインである。インターフェロンガンマ(IFNγ)は、IL-12を含む多数のシグナルに応答して多様な細胞型から発現され、かつNK細胞を活性化し、抗原提示細胞における抗原提示を促進し、白血球活性化及び浸潤を促進するのに十分である。IFNγは、ホモ二量体として天然に発現され、可溶性因子として分泌される。IFNγ発現エクソソームを、単量体または二量体のヒト及びマウスIFNγに融合した全長PTGFRNでHEK293SF細胞を安定してトランスフェクトすることによって生成した(それぞれ、図31A及び31B)。上述のように懸濁細胞培養物由来のエクソソームを精製し、PAGEによって分析した。単量体(m)及びタンデム二量体(td)PTGFRN IFNγエクソソームを、同等レベルで予測分子量(矢印)で発現させた(図32)。精製されたエクソソームをELISAによって分析し、組換えIFNγ(Biolegend,カタログ番号570206)を使用する標準曲線と比較して、エクソソーム当たりのIFNγ分子の数を計算した。表9の結果は、精製されたエクソソームの4つの型の各々におけるIFNγ分子の数を示す。特に、タンデム二量体IFNγ PTGFRNエクソソームは、単量体IFNγ PTGFRNエクソソームの少なくとも2倍のIFNγ分子を含有し、タンデム二量体エクソソームが二量体IFNγ構築物を適切に発現していることを示唆する。
ヒト単量体及びタンデム二量体PTGFRN-IFNγエクソソームを、増加する濃度でヒトPBMCと共に24時間インキュベートした。IFNγシグナル伝達によって誘導された下流表面タンパク質であるPD-L1発現によって単球活性化を測定した。図33に示されるように、天然HEK293SFエクソソーム(WT)は、PD-L1発現を誘導することができなかったが、単量体及びタンデム二量体の両方のIFNγ PTGFRNエクソソームは、タンデム二量体IFNγ PTGFRNエクソソームによるより大きな活性化と共に、用量依存的様式でPD-L1を誘導した。エクソソーム媒介性PD-L1活性化は、LPS誘導活性化に匹敵した(図33)。これらのデータは、単量体または二量体形式のいずれかの可溶性サイトカインが、エクソソームの表面上で機能的に発現され、免疫細胞活性化を誘導することができることを実証する。免疫腫瘍学におけるIFNγ発現エクソソームの使用は、腫瘍細胞に対するNK及びT細胞応答の誘導に有用であり得る。
実施例12:IL-15発現エクソソームはNK細胞活性化を誘導する
インターロイキン15(IL-15)は、病原性感染後に単核細胞によって産生されるサイトカインである。IL-15は、可溶性タンパク質として分泌されることができるか、またはIL-15Rαに結合した二量体膜固定タンパク質として提示されることができる。IL-15は、NK細胞及びT細胞を活性化し、免疫腫瘍学及び他の免疫介入療法において潜在的な治療分子として関与する。IL-15発現エクソソームを、IL-15/IL-15Rα融合タンパク質に融合したPDGFR(pDisplay)の膜貫通ドメインをコードする発現プラスミドでHEK293SF細胞を安定してトランスフェクトすることによって産生した(図34)。上記の方法に記載されているように、Optiprep(商標)密度勾配超遠心分離によってエクソソームを精製した。精製されたエクソソームをヒトPBMCと共に24時間インキュベートし、フローサイトメトリーによってCD69に対する陽性パーセントとしてNK細胞活性化を測定した。pDisplay IL-15エクソソームのいずれも、PBMC培養物の細胞当たり最大105個のエクソソームの用量でNK細胞活性化を誘導しなかった(図35、エクソソーム構築物番号は図34通り)。より高密度のIL-15表示がNK細胞活性化を誘導するために必要であったかどうかを調査するために、HEK293SF細胞を全長PTGFRNに融合したIL-15をコードする発現プラスミドで安定してトランスフェクトした。加えて、HEK293SF細胞を、全長PTGFRNに融合したより強力なIL-15をコードする発現プラスミドで安定してトランスフェクトした(J Immunol.2009 Sep 15;183(6):3598-607に記載されるようなIL-15N72D、図36A)。抗PTGFRNウエスタンブロッティングによって発現を確認した(図36B)。組換えIL-15に正規化して(Biolegend,カタログ番号570302)、IL-15レベルをELISA(R&D Systems,カタログ番号D1500)によって数量化した。IL-15PTGFGNエクソソームを2つの独立したPBMC培養物に一晩添加し、濃度一致組換えIL-15と比較した。3つ全てのIL-15供給源は、CD69に対して陽性であるNK細胞の百分率によって測定されたように、用量依存的様式でPBMCにおけるNK細胞活性化を誘導した。さらに、全ての構築物は、意味のある比較有効性を実証する両方のドナーにわたって互いに比較可能であった(図37、エクソソーム構築物番号は図36通り)。これらのデータは、IL-15がエクソソームの表面上に能動的かつ強力に表示されることができることを実証するが、このことは、PTGFRNによって与えられるもののような高い発現レベルを必要とする。
インターロイキン15(IL-15)は、病原性感染後に単核細胞によって産生されるサイトカインである。IL-15は、可溶性タンパク質として分泌されることができるか、またはIL-15Rαに結合した二量体膜固定タンパク質として提示されることができる。IL-15は、NK細胞及びT細胞を活性化し、免疫腫瘍学及び他の免疫介入療法において潜在的な治療分子として関与する。IL-15発現エクソソームを、IL-15/IL-15Rα融合タンパク質に融合したPDGFR(pDisplay)の膜貫通ドメインをコードする発現プラスミドでHEK293SF細胞を安定してトランスフェクトすることによって産生した(図34)。上記の方法に記載されているように、Optiprep(商標)密度勾配超遠心分離によってエクソソームを精製した。精製されたエクソソームをヒトPBMCと共に24時間インキュベートし、フローサイトメトリーによってCD69に対する陽性パーセントとしてNK細胞活性化を測定した。pDisplay IL-15エクソソームのいずれも、PBMC培養物の細胞当たり最大105個のエクソソームの用量でNK細胞活性化を誘導しなかった(図35、エクソソーム構築物番号は図34通り)。より高密度のIL-15表示がNK細胞活性化を誘導するために必要であったかどうかを調査するために、HEK293SF細胞を全長PTGFRNに融合したIL-15をコードする発現プラスミドで安定してトランスフェクトした。加えて、HEK293SF細胞を、全長PTGFRNに融合したより強力なIL-15をコードする発現プラスミドで安定してトランスフェクトした(J Immunol.2009 Sep 15;183(6):3598-607に記載されるようなIL-15N72D、図36A)。抗PTGFRNウエスタンブロッティングによって発現を確認した(図36B)。組換えIL-15に正規化して(Biolegend,カタログ番号570302)、IL-15レベルをELISA(R&D Systems,カタログ番号D1500)によって数量化した。IL-15PTGFGNエクソソームを2つの独立したPBMC培養物に一晩添加し、濃度一致組換えIL-15と比較した。3つ全てのIL-15供給源は、CD69に対して陽性であるNK細胞の百分率によって測定されたように、用量依存的様式でPBMCにおけるNK細胞活性化を誘導した。さらに、全ての構築物は、意味のある比較有効性を実証する両方のドナーにわたって互いに比較可能であった(図37、エクソソーム構築物番号は図36通り)。これらのデータは、IL-15がエクソソームの表面上に能動的かつ強力に表示されることができることを実証するが、このことは、PTGFRNによって与えられるもののような高い発現レベルを必要とする。
実施例13:PTGFRN足場上に抗CD-3抗体断片を表示するエクソソームはT細胞を活性化する
実施例9における結果は、抗CD3抗体断片を表示するエクソソームがT細胞を活性化できることを実証する。PTGFRN足場がこの活性を支持するかどうかを決定するために、抗CD3抗体断片(OKT3バリアント)をPDGFR膜貫通領域(exoCD3-PD)、全長PTGFRN(exoCD3-長)、またはPTGFRN断片(exoCD3-短)に融合し、HEK293SF細胞内で安定して発現させた(図38)。Octet(登録商標)RED96(Pall)を使用して、バイオレイヤー干渉法(BLI)によってエクソソーム結合を確認した。CD3断片をBLIプローブに結合させ(図39、ii)、洗浄し(図39、iii)、エクソソーム構築物を添加した(図39、iv)。WT HEK293SF細胞からのエクソソームはBLIプローブに結合しなかったが、全ての操作された構築物は結合した。両方のPTGFRN断片は、より大きな親和性でプローブに結合し、安定して結合し続けた(図39、v)。抗CD3表示エクソソームをインビトロ活性について試験した。フローサイトメトリーによって測定されたように、CD4+T細胞上のCD69陽性によってT細胞活性化を測定した。未修飾天然エクソソーム(exoNative)とは対照的に、PTGFRN断片に融合した抗CD3を有するエクソソーム(exoCD3-短)は、インビトロでCD4+T細胞を活性化するのに有効であった(図40)。
実施例9における結果は、抗CD3抗体断片を表示するエクソソームがT細胞を活性化できることを実証する。PTGFRN足場がこの活性を支持するかどうかを決定するために、抗CD3抗体断片(OKT3バリアント)をPDGFR膜貫通領域(exoCD3-PD)、全長PTGFRN(exoCD3-長)、またはPTGFRN断片(exoCD3-短)に融合し、HEK293SF細胞内で安定して発現させた(図38)。Octet(登録商標)RED96(Pall)を使用して、バイオレイヤー干渉法(BLI)によってエクソソーム結合を確認した。CD3断片をBLIプローブに結合させ(図39、ii)、洗浄し(図39、iii)、エクソソーム構築物を添加した(図39、iv)。WT HEK293SF細胞からのエクソソームはBLIプローブに結合しなかったが、全ての操作された構築物は結合した。両方のPTGFRN断片は、より大きな親和性でプローブに結合し、安定して結合し続けた(図39、v)。抗CD3表示エクソソームをインビトロ活性について試験した。フローサイトメトリーによって測定されたように、CD4+T細胞上のCD69陽性によってT細胞活性化を測定した。未修飾天然エクソソーム(exoNative)とは対照的に、PTGFRN断片に融合した抗CD3を有するエクソソーム(exoCD3-短)は、インビトロでCD4+T細胞を活性化するのに有効であった(図40)。
実施例14:CD40Lを表示するエクソソームはB細胞の強力な活性化剤である
CD40リガンド(CD40L)は、B細胞及び他の抗原提示細胞上で高度に発現される共刺激受容体CD40に結合する腫瘍壊死スーパーファミリー(TNFSF)のリガンドである。TNFSFリガンド媒介性細胞活性化は、細胞表面上に形成し、同族受容体に結合する三量体リガンド複合体の形成を必要とする。CD40Lの異なる立体構造をそれらの表面に表示するエクソソームがB細胞を活性化するのに十分であったかどうかを調査するために、40超の異なるCD40L発現構築物を設計し、HEK293SF細胞において個別にトランスフェクトした。PDGFRの膜貫通ドメイン、全長PTGFRN、及びPTGFRNの短い単一ドメイン断片との融合物として、CD40Lを発現させた(図41A、下)。単量体(pCB-518~pCB-526)または強制三量体(pCB-607及びpCB-527)としてCD40L-GFP PTGFRN融合物を発現させた(図41A、下)。単量体CD40Lの三量体形成を促進するために、TRAF2(pCB-521~pCB-523)またはコラーゲンXV(pCB-524~pCB-526)からの多量体化ドメインへの融合物を発現する構築物を設計した。単量体CD40L構築物のうち、pCB-518/521/524は内因性CD40Lからの全長N末端幹配列を含有し、pCB-519/522/525は内因性CD40Lからの切断N末端幹配列を含有し、pCB-520/523/526はCD40Lの可溶性部分のみを含有した。操作されたエクソソーム集団の各々を、RosetteSep(商標)ヒトB細胞濃縮カクテル(Stemcell Technologies#15064)を使用してヒト末梢血から単離した精製されたB細胞と共にインキュベートし、B細胞活性化をフローサイトメトリーによってB細胞に対するCD69陽性によって測定した。構築物の各々のEC50は、細胞培養物の粒子濃度の関数として計算され、図41(上)に示されるグラフにプロットされる。興味深いことに、単量体CD40L構築物の全ては適度な効力を有したが、三量体構築物は単量体より少なくとも10倍強力であった(図41、上)。これらの結果は、単量体CD40Lがエクソソーム表面上に提示された際にB細胞の不十分な活性化剤であることと、しかし強制三量体CD40Lが頑強なB細胞活性化を誘導できることとを実証する。さらに、PTGFRNは二量体構造を形成することが示されており(PCT/US2018/048026)、標的結合及び免疫細胞活性化をさらに促進するために高次多量体構造がエクソソーム表面上に形成されることができることを示唆している。
CD40リガンド(CD40L)は、B細胞及び他の抗原提示細胞上で高度に発現される共刺激受容体CD40に結合する腫瘍壊死スーパーファミリー(TNFSF)のリガンドである。TNFSFリガンド媒介性細胞活性化は、細胞表面上に形成し、同族受容体に結合する三量体リガンド複合体の形成を必要とする。CD40Lの異なる立体構造をそれらの表面に表示するエクソソームがB細胞を活性化するのに十分であったかどうかを調査するために、40超の異なるCD40L発現構築物を設計し、HEK293SF細胞において個別にトランスフェクトした。PDGFRの膜貫通ドメイン、全長PTGFRN、及びPTGFRNの短い単一ドメイン断片との融合物として、CD40Lを発現させた(図41A、下)。単量体(pCB-518~pCB-526)または強制三量体(pCB-607及びpCB-527)としてCD40L-GFP PTGFRN融合物を発現させた(図41A、下)。単量体CD40Lの三量体形成を促進するために、TRAF2(pCB-521~pCB-523)またはコラーゲンXV(pCB-524~pCB-526)からの多量体化ドメインへの融合物を発現する構築物を設計した。単量体CD40L構築物のうち、pCB-518/521/524は内因性CD40Lからの全長N末端幹配列を含有し、pCB-519/522/525は内因性CD40Lからの切断N末端幹配列を含有し、pCB-520/523/526はCD40Lの可溶性部分のみを含有した。操作されたエクソソーム集団の各々を、RosetteSep(商標)ヒトB細胞濃縮カクテル(Stemcell Technologies#15064)を使用してヒト末梢血から単離した精製されたB細胞と共にインキュベートし、B細胞活性化をフローサイトメトリーによってB細胞に対するCD69陽性によって測定した。構築物の各々のEC50は、細胞培養物の粒子濃度の関数として計算され、図41(上)に示されるグラフにプロットされる。興味深いことに、単量体CD40L構築物の全ては適度な効力を有したが、三量体構築物は単量体より少なくとも10倍強力であった(図41、上)。これらの結果は、単量体CD40Lがエクソソーム表面上に提示された際にB細胞の不十分な活性化剤であることと、しかし強制三量体CD40Lが頑強なB細胞活性化を誘導できることとを実証する。さらに、PTGFRNは二量体構造を形成することが示されており(PCT/US2018/048026)、標的結合及び免疫細胞活性化をさらに促進するために高次多量体構造がエクソソーム表面上に形成されることができることを示唆している。
図41に示される結果は、PTGFRNのC末端に融合した管腔GFPを含有するエクソソームを全て採用した。タグなしCD40Lエクソソームを生成することを目標に、リード構築物pCB-527と同じ三量体CD40L-PTGFRN構築物を、HEK293SF細胞(pCB-766)において安定して発現させたが、C末端GFPを欠いた。ELISA(R&D Systems,カタログ番号,DCDL40)を使用して、以下の表10に示されるように、操作されたエクソソームの表面上のCD40Lの絶対濃度を数量化した。
精製されたCD40L-PTGFRNエクソソームを、濃度一致組換えヒトCD40L(Biolegend,カタログ番号591702)と比較して、上述のB細胞活性化アッセイにおいて試験した。GFP含有及びタグなしCD40Lエクソソームは、粒子数またはCD40L濃度の関数として測定された場合、同等のB細胞活性化剤であり(図42A)、両方のエクソソーム調製物は濃度一致CD40Lよりも強力であった(図42B)。HEK293SF細胞からの天然の操作されていないエクソソームはB細胞を活性化することができず、エクソソーム表面上の操作されたCD40L三量体構築物がB細胞を強力に活性化するのに十分であったことを実証した。
CD40を作動させ、かつB細胞を活性化する代替的なモダリティは、二次抗体と架橋したアゴニスト抗体を使用することである。三量体CD40L発現エクソソームの効力をアゴニストCD40L抗体と比較するために、2μg/mlの抗CD40L抗体(Biolegend(登録商標);Clone 5C3)と二次架橋抗体(JacksonImmuno Research,カタログ番号115-006-071)と共にPBMC培養物をインキュベートした。最大B細胞活性化は、図43A及び43Bにおいて点線として示される。pCB-527エクソソーム(PTGFRN三量体CD40L-GFP)は、2人の独立したドナーのPBMCプールにおいて架橋アゴニスト抗体よりも大きな最大B細胞活性化を誘導し(図43A及び43B)、免疫細胞を活性化させることにおける三量体CD40Lエクソソームの優位性を実証した。
実施例15:個々のエクソソーム上の複数の免疫腫瘍学分子の同時表示
前述の実施例は、個々の免疫調節タンパク質がエクソソームの表面上に表示されることができ、1つ以上の免疫細胞型における機能的変化を誘導することを実証する。ある特定の用途において、組み合わせて操作されたエクソソーム、すなわち、エクソソーム表面上に2つ以上の分子を含有するエクソソームの使用が必要とされることができ、各々は異なる免疫細胞経路をシグナル伝達することが可能である。PTGFRN-IL-12及びPTGFRN-CD40L融合タンパク質の両方を発現するプラスミドでHEK293SF細胞を安定してトランスフェクトした。エクソソームを単離し、上述のように精製した。未修飾HEK293SF細胞由来のエクソソームを、陰性対照として使用した。
前述の実施例は、個々の免疫調節タンパク質がエクソソームの表面上に表示されることができ、1つ以上の免疫細胞型における機能的変化を誘導することを実証する。ある特定の用途において、組み合わせて操作されたエクソソーム、すなわち、エクソソーム表面上に2つ以上の分子を含有するエクソソームの使用が必要とされることができ、各々は異なる免疫細胞経路をシグナル伝達することが可能である。PTGFRN-IL-12及びPTGFRN-CD40L融合タンパク質の両方を発現するプラスミドでHEK293SF細胞を安定してトランスフェクトした。エクソソームを単離し、上述のように精製した。未修飾HEK293SF細胞由来のエクソソームを、陰性対照として使用した。
異なるリガンドの同時付加を実証するために、プルダウン共染色アッセイを開発した:
試薬:
Dynabeads(Thermofisher Exosome-Streptavidin Isolation/Detection Reagent,カタログ番号10608D):1x107ビーズ/mL、50%スラリー
単離緩衝液:0.5%BSA/PBS(2%BSAから1:4)
ブロック緩衝液:2%BSA/PBS(1gr/50mL、濾過)
●0.5mlのビーズを0.5mlの単離緩衝液で洗浄し、0.5mL単離緩衝液に再懸濁させる
●1μgのビオチン化捕捉抗体(0.5ug/ul原液の2.2ul)を添加する
●1時間回転、室温
●500μl分離緩衝液で洗浄する
●500μLブロック緩衝液に再懸濁させる、10分間の回転、室温
●500μl単離緩衝液(1×107ビーズ/mL、50%スラリー)中でインキュベートする
●4℃で保管する
A.エクソソーム捕捉及びフロー
試料当たり1×105(10μlビーズ、20μlスラリー)
ビーズ当たり50,000個のエクソソーム、試料当たり5×109個のエクソソーム(1.2×109エクソソーム/μL原液)
フローのための5μLの各蛍光標識検出抗体
5×109エクソソーム+20μlのDynabeadsスラリー+0.7mlの0.1%BSA/PBSを混合する
手順:
1.120μLスラリービーズ、上清(sup)を取り除き、0.7mlのブロック緩衝液を添加し、混合し、10分間室温で回転させ、上清を除去する
2.0.7ml単離緩衝液+25.2μlエクソソーム中にビーズを懸濁させ、4℃でONを回転させる
3.翌日:エクソソーム及びビーズを素早く回す、5秒
4.マグネットにチューブを配置し、上清を除去する
5.700μlでブロックし、室温で10分間回転させる
6.マグネットにチューブを配置し、上清を除去する
7.600μl単離緩衝液に再懸濁させる:チューブ当たり6×100μl
8.1μl標識検出抗体を添加し、混合し、30分間4℃で暗所でインキュベートする
9.2分間500gで回し、上清を除去する
10.単離緩衝液で2回洗浄する
11.200μl単離緩衝液に再懸濁し、フローを実行。
試薬:
Dynabeads(Thermofisher Exosome-Streptavidin Isolation/Detection Reagent,カタログ番号10608D):1x107ビーズ/mL、50%スラリー
単離緩衝液:0.5%BSA/PBS(2%BSAから1:4)
ブロック緩衝液:2%BSA/PBS(1gr/50mL、濾過)
●0.5mlのビーズを0.5mlの単離緩衝液で洗浄し、0.5mL単離緩衝液に再懸濁させる
●1μgのビオチン化捕捉抗体(0.5ug/ul原液の2.2ul)を添加する
●1時間回転、室温
●500μl分離緩衝液で洗浄する
●500μLブロック緩衝液に再懸濁させる、10分間の回転、室温
●500μl単離緩衝液(1×107ビーズ/mL、50%スラリー)中でインキュベートする
●4℃で保管する
A.エクソソーム捕捉及びフロー
試料当たり1×105(10μlビーズ、20μlスラリー)
ビーズ当たり50,000個のエクソソーム、試料当たり5×109個のエクソソーム(1.2×109エクソソーム/μL原液)
フローのための5μLの各蛍光標識検出抗体
5×109エクソソーム+20μlのDynabeadsスラリー+0.7mlの0.1%BSA/PBSを混合する
手順:
1.120μLスラリービーズ、上清(sup)を取り除き、0.7mlのブロック緩衝液を添加し、混合し、10分間室温で回転させ、上清を除去する
2.0.7ml単離緩衝液+25.2μlエクソソーム中にビーズを懸濁させ、4℃でONを回転させる
3.翌日:エクソソーム及びビーズを素早く回す、5秒
4.マグネットにチューブを配置し、上清を除去する
5.700μlでブロックし、室温で10分間回転させる
6.マグネットにチューブを配置し、上清を除去する
7.600μl単離緩衝液に再懸濁させる:チューブ当たり6×100μl
8.1μl標識検出抗体を添加し、混合し、30分間4℃で暗所でインキュベートする
9.2分間500gで回し、上清を除去する
10.単離緩衝液で2回洗浄する
11.200μl単離緩衝液に再懸濁し、フローを実行。
天然エクソソームを、抗CD40L装飾ビーズで単離し、IL-12及びCD40L(図44A)、または天然及び操作されたエクソソーム上に存在するエクソソームマーカーであるCD81及びCD40L(図44B)に対する蛍光抗体で標識した。IL-12、CD40L、またはCD81について蛍光シグナルが検出されなかったため、CD40Lビーズは、天然エクソソームのいずれもプルダウンしなかった。対照的に、PTGFRN-CD40L/IL-12二重操作エクソソームを、抗CD40Lビーズと共にインキュベートし、上記のように単離した。CD81(図45A)、IL-12またはCD40L(図45B)についての染色は全て、操作されたエクソソーム(計数されたビーズの97%超)で検出され、CD40L媒介性単離がIL-12エクソソームを単離できることも示した。同様に、抗IL-12装飾ビーズをIL-12/CD40L操作エクソソームと共にインキュベートし、IL-12、CD40L、及びCD81について染色した。全てのビーズの98%超は、CD40L及びIL-12、またはCD81の両方について陽性であり(図46A及び46B)、エクソソームがそれらの表面上にIL-12及びCD40Lの両方を含有することを実証した。
インビトロでの効力について操作されたエクソソームを試験するために、ELISA(Abcamカタログ番号ab119517)によってIL-12及びCD40L濃度を数量化した。等濃度の組換えIL-12、組換えCD40Lと混合した組換えIL-12、PTGFRN-IL-12エクソソーム、二重陽性PTGFRN-CD40L/IL-12エクソソーム、またはPTGFRN-IL-12エクソソームとPTGFRN-CD40Lエクソソームとの混合物を、増加濃度でヒトPBMCに添加した(rhIL-12-BioLegend,カタログ番号573004、rhCD40L-Biolegend,カタログ番号591702)。細胞を抗CD3抗体で共刺激し、IFNγ産生を(PerkinElmer,カタログ番号AL217C)によって測定した。図47A及び47Bに示されるように、全てのIL-12含有エクソソーム調製物は、組換えサイトカインに匹敵するIFNγ応答を誘発した。様々な条件のEC50の計算は、エクソソーム関連IL-12が、エクソソーム表面上で単独で発現されても組み合わせて発現されても、濃度一致IL-12よりも強力であることが明らかにした(図48)。B細胞活性化の文脈において、組換えCD40L及び単一または二重操作CD40Lエクソソームで同様の結果を達成した(図49A及びB)。再び、CD40L操作エクソソームは可溶性組換えサイトカインよりも強力であり、この場合、二重操作エクソソームはアッセイで試験された最も強力な構築物であった(図50)。
組み合わせ表面表示エクソソームの可能性をさらに探索するために、PTGFRN-IL-12、PTGFRN-CD40L、またはPTGFRN-FLT3L融合タンパク質のいずれかを発現する3つの独立した構築物でHEK293SF細胞を安定してトランスフェクトした。エクソソームを、精製し、上述のアフィニティビーズ法により単離したが、抗FLT3L-PE共役抗体を用いて表面FLT3Lの存在についても調べた。抗IL-12ビーズで単離されたエクソソームは、IL-12及びCD40L(図51A)、IL-12及びFLT3L(図51B)、ならびにCD40L及びFLT3L(図51C)に対して二重陽性であった。抗CD40Lビーズで単離されたエクソソームは、IL-12及びCD40L(図52A)、IL-12及びFLT3L(図52B)、ならびにCD40L及びFLT3L(図52C)に対して二重陽性であり、個々のエクソソームが3つの免疫調節リガンドの各々を発現することを確認した。これらの結果は、多重操作された免疫調節エクソソームが実現可能な治療モダリティであることと、それらが免疫細胞活性化において可溶性サイトカインよりも同等またはより強力であることとを実証する。
***
***
前述の発明は、明確な理解のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されてきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更及び修正がそこになされ得ることは、本開示の教示に照らして当業者には容易に明らかである。
したがって、前述は、本発明の原理を例示するにすぎない。当業者は、本明細書に明示的に説明されるかまたは示されることはないが、本発明の原理を具現化し、その精神及び範囲内に含まれる様々な配置を考案できることが理解されるであろう。さらに、本明細書に列挙される全ての実施例及び条件付き言語は、本発明の原理がかかる具体的に列挙される実施例及び条件に限定されないことを、読者が理解するのを支援するように、主に意図する。さらに、本発明の原理、態様、ならびに実施形態、同様にその具体例を列挙する本明細書の全ての記述は、その構造的及び機能的均等物の両方を包含することが意図される。加えて、かかる均等物は、構造に関係なく、現在既知の均等物及び将来開発される均等物、すなわち、同じ機能を実行するように開発された任意の要素の両方を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示されかつ記載される例示的な実施形態に限定されることが意図されない。むしろ、本発明の範囲及び精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化されている。
配列リスト
>配列番号1
>配列番号2
>hIL-12-PTGFRN、871(配列番号3)
>mIL-12-PTGFRN、872(配列番号4)
>hIL-12-短PTGFRN、873(配列番号5)
>mIL-12-短PTGFRN、874(配列番号6)
配列番号7 PTGFRN_IFN_ガンマ単量体
配列番号8 PTGFRN_IFN_ガンマ二量体
配列番号9 PTGFRN_IFN_ガンママウス単量体
配列番号10 PTGFRN_IFN_ガンママウス二量体
配列番号11 IL-15 441
配列番号12 IL-15 442
配列番号13 IL-15 443
配列番号14 IL-15 444
配列番号15 IL-15 1009
配列番号16 IL-15 1010
配列番号17 pDisplay-抗CD3
配列番号18 PTGFRN-抗CD3
配列番号19 PTGFRN_CD40L三量体マウス
配列番号20 PTGFRN_CD40L三量体ヒト
配列番号21 PTGFRN_短-抗CD3
配列番号22 FLT3L-PTGFRN
表
配列リスト
>配列番号1
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- 明細書に記載の発明。
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