JP2022519275A - エクソソーム操作のための膜タンパク質足場 - Google Patents

エクソソーム操作のための膜タンパク質足場 Download PDF

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Abstract

本開示は、異種エクソソーム小胞タンパク質（ＨＥＶＰ）、ＨＥＶＰを含む操作されたエクソソーム、ならびに治療適用を含むこれらの組成物を調製及び使用する方法に関する。本開示の態様は、新規のＥＶ（例えば、エクソソーム）組成物、これらの組成物を調製するための方法、及び組成物を使用する治療方法に関する。具体的には、組成物及び方法は、異種細胞外小胞タンパク質（ＨＥＶＰ）またはその断片を含む細胞外小胞に関するものであり、細胞外小胞は、ＨＥＶＰを天然に発現しない産生細胞から産生され、ＨＥＶＰは、ドナー細胞によって天然に産生される。【選択図】なし

Description

１．関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年２月４に出願された米国仮出願第６２／８０１，０６５号、２０１９年２月５日に出願された同第６２／８０１，６３６号、及び２０１９年５月２２日に出願された同第６２／８５１，５８１号の優先権を主張し、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２．ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表への参照
本出願とともに出願されたＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：４０００＿０３１ＰＣ０３＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：２０５，９６４；及び作成日：２０２０年２月４日）で電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
３．開示の分野
本開示は、細胞外小胞（ＥＶ）が産生される細胞（すなわち、異種エクソソーム小胞タンパク質）において天然に発現されない１つ以上の外因性タンパク質を含む、操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）、ならびにかかるＥＶを産生及び使用する方法に関する。
４．開示の背景
細胞外小胞（ＥＶ）（例えば、エクソソーム）は、細胞間情報伝達の重要な媒介物である。これらはまた、がんなどの多くの疾患の診断及び予後における重要なバイオマーカーである。薬剤送達ビヒクルとして、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、多くの治療領域における新しい治療モダリティとして、従来の薬剤送達方法を超える多くの利益を提供する。
治療目的のためのＥＶ（例えば、エクソソーム）の使用は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）が、混入タンパク質、ＤＮＡ、炭水化物、及び脂質を含むがこれらに限定されない不純物を含まないか、またはほとんど含まないことを必要とする。現在の精製方法は、かなりの量のこれらの不純物を除去するのに十分な選択性を提供しないため、純度を改善するための追加のプロセスが望まれる。
さらに、ＥＶ（例えば、エクソソーム）がヒト疾患の治療でより頻繁に使用されるようになると、それらは、分子標的化、免疫回避、及び制御された薬剤放出を付与するそれらの物理化学パラメータにおける不均一性のために、臨床的期待を満たすために苦しみ得る。これは、主に、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の特性（例えば、組成、サイズ、形状、剛性、表面電荷、親水性、安定性、ならびにリガンドの種類及び密度）と、ペイロードの特性（例えば、薬剤の種類、溶解性、負荷、効力、投薬、免疫応答、及び放出動態）と、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の輸送（例えば、免疫監視、粒子外漏出、組織標的化、組織浸透、及び細胞取り込み）に対するインビボでの生理学的障壁と、の不均一性及び複雑性に起因する。かなりの量の努力がなされているが、所望の特性、例えば、治療用ペイロードを含有し、適切な標的化部分を有するＥＶ（例えば、エクソソーム）を有する治療用ＥＶ（例えば、エクソソーム）の別個のサブ集団を得るための有効な方法は、まだ容易には利用可能ではない。
ＥＶ（例えば、エクソソーム）の別個のサブ集団を生成、単離、及び精製するための好適な方法が、ＥＶ（例えば、エクソソーム）ベースの技術の治療的使用及び他の適用をより可能にするために必要とされる。
５．開示の概要
本開示の態様は、新規のＥＶ（例えば、エクソソーム）組成物、これらの組成物を調製するための方法、及び組成物を使用する治療方法に関する。具体的には、組成物及び方法は、異種細胞外小胞タンパク質（ＨＥＶＰ）またはその断片を含む細胞外小胞に関するものであり、細胞外小胞は、ＨＥＶＰを天然に発現しない産生細胞から産生され、ＨＥＶＰは、ドナー細胞によって天然に産生される。加えて、本開示は、ドナーＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面で豊富化されるＨＥＶＰの使用に関する。本明細書に記載されるＨＥＶＰの例には、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１が含まれ、特に、非間葉細胞（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１及び／もしくはＮＲＰ１の場合にＣＨＯ細胞、ならびに／またはＣＤ１３、ＭＭＥ及びＮＲＰ１の場合にＨＥＫ細胞）によって産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面で組換えによって発現される。これらのＨＥＶＰタンパク質は、米国特許第１０，１９５，２９０号（その全体が本明細書に参考により組み込まれる）に記載されるように、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を操作するために使用することができる。
一実施形態において、次いで、本開示は、少なくとも１つの異種細胞外小胞タンパク質（ＨＥＶＰ）またはその断片を含む細胞外小胞を提供し、細胞外小胞は、ＨＥＶＰを天然に発現しない産生細胞から産生され、ＨＥＶＰはドナー細胞によって天然に産生される。ある特定の実施形態において、細胞外小胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の異種細胞外小胞タンパク質（ＨＥＶＰ）またはそれらの断片を含み、細胞外小胞は、ＨＥＶＰを天然に発現しない産生細胞から産生され、ＨＥＶＰは、ドナー細胞によって天然に産生される。一般に、別段の定めがない限り、「少なくとも１つのＨＥＶＰ」及び「２、３、４、５．．．個のＨＥＶＰ」への言及は、異なる種類または多様なＨＥＶＰ（例えば、異なるアミノ酸配列を有するＨＥＶＰ）の存在（１つを超える場合）を示し、ＥＶ（例えば、エクソソーム）上の（任意の種類の）ＨＥＶＰ分子の量ではなく、はるかに大きくなるであろう。
ある特定の実施形態において、ドナー細胞によって産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）中の少なくとも１つのＨＥＶＰのレベルは、タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いた液体クロマトグラフィーを使用して測定される、約２０、約８０、約１２５、または約２００ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である。いくつかの態様において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおけるＨＥＶＰのレベルは、タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いた液体クロマトグラフィーを使用して測定される約２０ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である。いくつかの態様において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおけるＨＥＶＰのレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される約８０ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である。いくつかの態様において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおけるＨＥＶＰのレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約１２５ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である。いくつかの態様において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおけるＨＥＶＰのレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約１７０ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である。いくつかの態様において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおけるＨＥＶＰのレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約２００ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である。いくつかの態様において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおけるＨＥＶＰのレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約７００ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である。いくつかの態様において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおけるＨＥＶＰのレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約１７７ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）である。いくつかの態様において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおけるＨＥＶＰのレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約７４２ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）である。
ある特定の実施形態において、ドナー細胞によって産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）における少なくとも１つのＨＥＶＰのレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される約２０～約８０ＰＳＭ、または約８０～約２００ＰＳＭである。いくつかの態様において、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおける少なくとも１つのＨＥＶＰのレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される２０～８０ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）である。いくつかの態様において、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおける少なくとも１つのＨＥＶＰのレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される８０～２００ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）である。いくつかの態様において、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおける少なくとも１つのＨＥＶＰのレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される約１５０～約７５０ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）である。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、ドナー細胞によって産生されるエクソソームにおける少なくとも１つのＨＥＶＰのレベルは、ドナー細胞によって産生されるエクソソームの総タンパク質含有量の約５％以上である。
追加の実施形態は、上記の概要に記載されるもののような細胞外小胞を含み、少なくとも１つのＨＥＶＰまたはその断片は、融合タンパク質である。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、互いに結合される２つ以上のタンパク質を指す。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＨＥＶＰ及び外因性生物学的活性分子（例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）を含む。いくつかの態様において、２つ以上のタンパク質（例えば、ＨＥＶＰ及び外因性生物学的活性分子）は、互いに融合され得る。いくつかの態様において、２つ以上のタンパク質（例えば、ＨＥＶＰ及び外因性生物学的活性分子）は、リンカーを介して互いに結合され得る。関連する実施形態において、少なくとも１つのＨＥＶＰまたはその断片は、機能的部分の付加によって改変される。関連する実施形態において、機能的部分は、結合剤に親和性を有する。関連する実施形態において、機能的部分は、親和性タグである。ある特定の実施形態において、親和性タグは、ペプチドである。他の関連する実施形態において、機能的部分は、治療用化合物である。さらに他の関連する実施形態において、治療用化合物は、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。さらに他の関連する実施形態において、治療用化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、小分子、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。さらに他の関連する実施形態において、治療用化合物は、抗体またはその断片である。追加の関連する実施形態において、治療用化合物は、酵素、リガンド、受容体、またはそれらの断片である。他の関連する実施形態において、機能的部分は標的化部分であり、それは、いくつかの実施形態において、（例えば、）器官、組織、または細胞に特異的であることができる。関連する実施形態において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、融合タンパク質であり、融合タンパク質は、リンカーを含む。関連する実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、少なくとも１つのＨＥＶＰまたはその断片と、それに結合された機能的部分との間にリンカーをさらに含む。関連する実施形態において、リンカーは、可撓性リンカーまたは剛性リンカーである。他の関連する実施形態において、リンカーは、直鎖炭素リンカー、分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーである。他の関連する実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカーである。
本開示はまた、上記の概要に記載の細胞外小胞を含み、産生細胞は、ＨＥＫ、ＣＨＯ、ＭＢ－２３１、Ｒａｊｉ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＡＰ、ＭＳＣ細胞、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。関連する実施形態において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、肺線維芽細胞ＥＶＰ、大動脈内皮細胞ＥＶＰ、急性骨髄性白血病細胞ＥＶＰ、単球ＥＶＰ、Ｂ細胞リンパ腫ＥＶＰ、マクロファージＥＶＰ、脳内皮細胞ＥＶＰ、間葉系細胞ＥＶＰ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。関連する実施形態において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、ヒトＥＶＰ、マウスＥＶＰ、ラットＶＥＰ、イヌＥＶＰ、またはサルＥＶＰである。さらに他の関連する実施形態において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１、またはそれらの断片からなる群から選択される。さらに他の関連する実施形態において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１、またはそれらの断片からなる群から選択され、産生細胞は、ＣＨＯ細胞である。別の関連する実施形態において、少なくとも１つのＨＥＶＰは、ＣＤ１３、ＭＭＥ、及びＮＲＰ１、またはそれらの断片からなる群から選択され、産生細胞は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞である。
別の関連する実施形態において、上記の細胞外小胞における少なくとも１つのＨＥＶＰは、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様において、産生細胞は、これらのタンパク質を天然に産生しない細胞である。関連する実施形態において、上記の概要に記載される細胞外小胞は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＥＶＰをさらに含む。
関連する実施形態において、本開示は、本明細書に開示される細胞外小胞（例えば、エクソソーム）を提供し、産生細胞は、非ヒト細胞であり、少なくとも１つのＨＥＶＰは、ヒトＨＥＶＰである。代替的に、産生細胞は、ヒト細胞であることができ、少なくとも１つのＨＥＶＰは、非ヒトＨＥＶＰである。
追加の関連する実施形態は、上記の細胞外小胞のいずれかを含む医薬製剤を含む。本開示の別の態様は、上記の概要に記載される細胞外小胞または医薬製剤を含むキットを含み、細胞外小胞または医薬製剤は容器またはパッケージに含有され、キットは細胞外小胞または医薬製剤の推奨される使用を記載する説明書をさらに含む。
本開示はまた、治療を必要とする患者を治療するための方法を含み、有効量の上記の細胞外小胞または医薬製剤のうちのいずれかを患者に投与することを含む。
本開示はさらに、細胞に由来するＥＶに非天然発生タンパク質を発現する方法を提供し、細胞における少なくとも１つの異種細胞外小胞タンパク質（ＨＥＶＰ）またはその断片をコードする核酸をトランスフェクションすることと、ＨＥＶＰまたはその断片を含むＥＶを細胞から単離することと、を含み、ＨＥＶＰは、細胞に由来するＥＶに天然に発生していない。ある特定の態様において、ＥＶは、本開示に開示されるＥＶのいずれかを含む。いくつかの態様において、ＥＶにおいて非天然発生タンパク質を発現させる方法は、ＥＶのＨＥＶＰを特徴付けることをさらに含むことができる。
本明細書に記載のＨＥＶＰは、本開示の様々な実施形態で使用することができる。本開示の一態様は、ＨＥＶＰを機能的化合物（例えば、本明細書に開示される外因性生物学的活性分子）とコンジュゲートし、表面に改変タンパク質を含有する操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生することによって融合タンパク質を生成することに関する。例えば、治療用タンパク質のネイティブな全長または生物学的活性断片は、ＨＥＶＰ豊富化タンパク質またはその断片にコンジュゲートされることによって、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面に輸送することができる。本明細書に記載のＨＥＶＰを使用する方法は、いくつかの場合において、他の関連システム（例えば、Ｌａｍｐ２Ｂ、ＰＤＧＦＲ、ラクトアドヘリンＣＤ９、ＣＤ６３及び／もしくはＣＤ８１、またはそれらの断片）と比較して、ある特定の態様において改善されていると考えられる。
本開示の別の態様は、ＨＥＶＰを使用した細胞培養培地または血漿などの不均一溶液からの親和性精製によるＥＶ（例えば、エクソソーム）の精製に関する。いくつかの実施形態は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）のサブ集団に特異的な表面マーカーを使用することによる、全ＥＶ（例えば、エクソソーム）からのＥＶ（例えば、エクソソーム）のサブ集団の単離に関する。
本開示の別の態様は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）が混入産物であるときに、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を試料から除去する方法に関する。例えば、天然または操作されたウイルスは、混入しているＥＶ（例えば、エクソソーム）から精製することができる。したがって、本明細書に記載のＨＥＶＰは、同様のサイズ、形状、及び／または電荷の他の粒子が望ましい産物である生物学的プロセスから、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を選択的に除去するために使用することができる。
本開示の別の態様は、より効率的な親和性精製のために、または表面で標的化部分もしくは治療的に関連するタンパク質（例えば、本明細書に開示される外因性生物学的活性分子）の提示のために、設計された表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）の生成または使用に関する。例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面は、全長ＨＥＶＰ及び／またはＨＥＶＰの断片もしくは改変タンパク質を、表面により高い密度で含有するように改変され得る。
本開示は、産生細胞、またはそのような表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生するための産生細胞を生成する方法にさらに関する。外因性ポリヌクレオチド（例えば、ＨＥＶＰをコードする）を、産生細胞内に一過性または安定的に導入させて、産生細胞に表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を生成させることができる。
具体的には、本開示の態様は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を単離する方法に関するものであり、（１）ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む試料を提供するステップと、（２）試料を標的タンパク質に親和性を有する結合剤と接触させるステップであって、標的タンパク質は、ＨＥＶＰ（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体）を含む、接触させるステップと、（３）標的タンパク質と結合剤との間の結合に基づいてＥＶ（例えば、エクソソーム）を単離するステップと、を含む。
いくつかの実施形態において、試料は、インビトロで増殖された細胞から得られ、任意選択的に、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。いくつかの実施形態において、試料は、対象の体液から得られる。
いくつかの実施形態において、細胞は、標的タンパク質を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態において、細胞は、標的タンパク質をコードする発現プラスミドを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、結合剤に親和性を有するタグを発現する外因性配列を含むように遺伝子改変され、外因性配列は、細胞のゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、外因性配列は、ＨＥＶＰ（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、またはＮＲＰ１）をコードする内因性配列の３’または５’末端に位置するゲノム部位に挿入される。いくつかの実施形態において、内因性配列は、ＩＧＳＦ８をコードしない。いくつかの実施形態において、外因性配列は、ＨＥＶＰ（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、またはＮＲＰ１）をコードする内因性配列内に位置するゲノム部位に挿入される。
いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、タグ、及びＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体を含む、融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、標的タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片もしくは改変ではない。いくつかの実施形態において、細胞は、ＡＤＡＭ１０の発現低下を有するように遺伝子改変される。
いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、標的タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１から選択される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、またはＮＲＰ１の断片もしくは変異体を含む。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、配列番号３３のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、親和性タグは、結合剤に親和性を有する。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片もしくは改変を含まない。
いくつかの実施形態において、結合剤は、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチドまたは小分子を含む。いくつかの実施形態において、結合剤は固体支持体に結合され、任意選択的に、固体支持体は、多孔性アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁性ビーズ、または膜を含む。
いくつかの実施形態において、固体支持体は、クロマトグラフィーカラムを形成する。いくつかの実施形態において、試料を結合剤と接触させるステップは、試料をクロマトグラフィーカラムに適用することによって実施される。
いくつかの実施形態において、本方法は、（１）試料のサブセットを、異なる標的タンパク質に親和性を有する異なる結合剤と接触させるステップと、（２）異なる標的タンパク質と異なる結合剤との間の結合に基づいて、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を単離するステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態において、異なる標的タンパク質は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＣＤ１３（またはその断片もしくは変異体）を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＭＭＥ（またはその断片もしくは変異体）を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＥＮＰＰ１（またはその断片もしくは変異体）を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＮＲＰ１（またはその断片もしくは変異体）を含む。いくつかの実施形態において、異なる標的タンパク質は、配列番号３３のポリペプチドを含む。
本開示の別の態様は、本明細書に提供される方法によって産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）に関する。
さらに別の態様において、本開示は、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）及び賦形剤を含む、医薬組成物に関する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）源を含む試料よりも低い濃度の巨大分子を含み、巨大分子は、核酸、混入タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、巨大分子を実質的に含まない。
本開示の別の態様は、標的タンパク質を含むＥＶ（例えば、エクソソーム）に関し、標的タンパク質の少なくとも一部は、外因性配列から発現され、標的タンパク質は、ＨＥＶＰ（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体）を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＣＤ１３（またはその断片もしくは変異体）を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＭＭＥ（またはその断片もしくは変異体）を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＥＮＰＰ１（またはその断片もしくは変異体）を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＮＲＰ１（またはその断片もしくは変異体）を含む。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片もしくは変異体を含まない。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、配列番号３３のポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、標的タンパク質と結合剤との間の結合に基づいて単離される。
いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、外因性配列を含むように遺伝子改変された細胞から産生され、任意選択的に、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＡＤＡＭ１０の発現低下を有するように遺伝子改変される。
いくつかの実施形態において、細胞は、外因性配列を含むプラスミドを含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞のゲノムに挿入された外因性配列を含む。いくつかの実施形態において、外因性配列は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、またはＮＲＰ１をコードするゲノム配列の３’もしくは５’末端に位置するゲノム部位に挿入される。いくつかの実施形態において、外因性配列は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、またはＮＲＰ１をコードするゲノム配列に挿入される。いくつかの実施形態において、外因性配列は、ＩＧＳＦ８をコードしない。
いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、親和性タグは、結合剤に親和性を有する。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片を含まない。
いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体、及び治療用化合物を含む、融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片を含まない。
治療用化合物は、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチドからなる群から選択することができる。いくつかの実施形態において、治療用化合物は、リンカーを含む。治療用化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び小分子からなる群から選択することができる。
ＨＥＶＰまたはその断片に結合することができる機能的部分及び関連化合物、例えば、治療用化合物は、抗体またはそれらの断片もしくは変異体を含む。ペプチドである機能的化合物は、酵素、リガンド、受容体、またはそれらの断片もしくは変異体であることができる。治療用ペプチドは、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体であることができる。
いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体、及び標的化部分を含む、融合タンパク質である。標的化部分は、器官、組織、または細胞に特異的であることができる。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片を含まない。
いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、第２の異なる標的タンパク質をさらに含み、異なる標的タンパク質は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体を含む。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、異なる標的タンパク質と異なる結合剤との間の結合に基づいて単離される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片を含まない。
一態様において、本開示は、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）及び賦形剤を含む、医薬組成物に関する。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、巨大分子を実質的に含まず、巨大分子は、核酸、混入タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、及びそれらの組み合わせから選択される。
一態様において、本開示は、本明細書に提示されるＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生するための細胞に関する。
具体的には、いくつかの実施形態は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、またはＮＲＰ１をコードするゲノム配列に挿入された外因性配列を含む、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生するための細胞に関するものであり、外因性配列及びゲノム配列は、融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ゲノム配列は、ＩＧＳＦ８をコードしない。
外因性配列は、親和性タグをコードすることができる。
外因性配列は、治療用ペプチドをコードすることができる。治療用ペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、または治療用化合物に対するリンカーからなる群から選択することができる。治療用化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び小分子からなる群から選択することができる。治療用ペプチドは、抗体またはその断片もしくは変異体であることができる。治療用ペプチドは、酵素、リガンド、受容体、またはそれらの断片もしくは変異体であることができる。治療用ペプチドは、抗微生物ペプチド、またはその断片もしくは変異体であることができる。
外因性配列は、標的化部分をコードすることができる。標的化部分は、器官、組織、または細胞に特異的であることができる。
いくつかの実施形態において、細胞株は、ＡＤＡＭ１０の発現低下を有するように遺伝子改変される。
一態様において、本開示は、本開示の細胞株から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）を提供する。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、異なるＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面の異なる融合タンパク質よりも高い密度で表面に融合タンパク質を含み、異なるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、従来のＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質をコードする異なるゲノム配列に挿入された外因性配列を含む異なる細胞株から産生され、外因性配列及び異なるゲノム配列は、異なる融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、従来のＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、及びそれらの断片からなる群から選択される。
別の態様において、本開示は、非エクソソーム材料を単離する方法に関し、本方法は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）及び非ＥＶ（例えば、エクソソーム）材料を含む試料を提供するステップと、試料を標的タンパク質に親和性を有する結合剤と接触させるステップであって、標的タンパク質は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体を含み、それによってＥＶ（例えば、エクソソーム）が結合剤に結合することを誘導する、接触させるステップと、非ＥＶ（例えば、エクソソーム）材料を単離するステップと、を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＣＤ１３（またはその断片もしくは変異体）を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＭＭＥ（またはその断片もしくは変異体）を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＥＮＰＰ１（またはその断片もしくは変異体）を含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＮＲＰ１（またはその断片もしくは変異体）を含む。
いくつかの実施形態において、非エクソソーム材料は、ウイルスまたはタンパク質である。いくつかの実施形態において、非エクソソーム材料は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、または他のエンベロープもしくは非エンベロープウイルスである。いくつかの実施形態において、非エクソソーム材料は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態において、単離された非エクソソーム材料は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を実質的含まない。
いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、親和性タグをさらに含み、親和性タグは、結合剤に対する親和性を有する。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、配列番号３３のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、結合剤は、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド、または小分子を含む。いくつかの実施形態において、結合剤は固体支持体に結合され、任意選択的に、固体支持体は、多孔性アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁性ビーズ、または膜を含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、クロマトグラフィーカラムを形成する。いくつかの実施形態において、試料を結合剤と接触させるステップは、試料をクロマトグラフィーカラムに適用することによって実施される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の精製方法は、ナノ小胞の精製のために使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法は、ナノ小胞に関する。本開示の追加の実施形態は、以下により詳細に説明される。
６．図面の簡単な説明
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来（ｙ軸）またはＨＥＫ２９３由来（ｘ軸）ＥＶ（例えば、エクソソーム）のいずれかにおいて特定された個々のタンパク質のペプチドスペクトルマッチを示すドットグラフを提供する。個々のドットは、異なるタンパク質に対応する。ＣＤ１３及びＭＭＥ（矢印を使用して示される）は、両方ともＭＳＣ由来のＥＶで豊富化されているが、ＨＥＫ２９３由来のＥＶでは検出されない。ドットグラフの下の表は、ＣＤ１３及びＭＭＥタンパク質の分子量（ＭＷ）、ならびにＨＥＫ２９３（ＨＥＫ）及びＭＳＣ細胞におけるそれらの相対発現を示す。 ＰＴＧＦＲＮまたはＣＤ１３のいずれかを過剰発現するように改変されているＨＥＫ２９３産生細胞に由来するＥＶ（例えば、エクソソーム）におけるＣＤ１３及びＰＴＧＦＲＮタンパク質の発現を示す。Ａは、野生型（ＷＴ）（すなわち、非改変）、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現、及びＣＤ１３過剰発現ＨＥＫ２９３由来ＥＶのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を提供する。Ｂは、組換えＣＤ１３（ｒＣＤ１３）標準を使用したＥＬＩＳＡによる、操作されたＨＥＫ２９３由来ＥＶでのＣＤ１３タンパク質発現の定量化を提供する。左側に示されるグラフが標準である。右側に示されるグラフは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）についてである。 操作されたＨＥＫ２９３由来ＥＶ（例えば、エクソソーム）で発現されたＣＤ１３タンパク質の生物活性分析を提供する。Ａは、市販のＣＤ１３活性アッセイキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｋ５２３）を使用した組換えＣＤ１３タンパク質（ｒＣＤ１３）の酵素活性を示す。Ｂは、同じＣＤ１３活性アッセイキットを使用して、操作されたＨＥＫ２９３由来ＥＶ（例えば、エクソソーム）で発現されたＣＤ１３タンパク質の生物活性を示す。組換えＣＤ１３タンパク質を、６つの異なる濃度：（ｉ）８８０ｎｇ／ｍＬ、（ｉｉ）４４０ｎｇ／ｍＬ、（ｉｉｉ）２９３ｎｇ／ｍＬ、（ｉｖ）２２０ｎｇ／ｍＬ、（ｖ）１１０ｎｇ／ｍＬ、及び（ｖｉ）５５ｎｇ／ｍＬで試験した。Ｂでは、ＥＶを、３つの異なる濃度：（ｉ）１．６×１０１０ｐ／ｍＬ、（ｉｉ）７．９×１０９ｐ／ｍＬ、及び（ｉｉｉ）４．０×１０９ｐ／ｍＬで試験した。非操作ＥＶ（すなわち、野生型）を、対照として使用した。 操作されたＨＥＫ２９３由来ＥＶ（例えば、エクソソーム）で発現されるＣＤ１３及びＭＭＥタンパク質にコンジュゲートされたＧＦＰの発現分析を提供する。Ａは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を使用して測定されるＧＦＰ発現を示す。ＰＴＧＦＲＮ（ＰＴＧＦＲＮ－ＧＦＰ）にコンジュゲートされたＧＦＰを発現するＥＶを、対照として使用した。Ｂは、以下の足場タンパク質：（ｉ）ＬＡＭＰ２Ｂ、（ｉｉ）ｐＤｉｓｐｌａｙ、（ｉｉｉ）ＰＴＧＦＲＮ、（ｉｖ）ＭＭＥ、及び（ｖ）ＣＤ１３のうちの１つにコンジュゲートされたＧＦＰの発現の比較を示す。ＧＦＰを分光光度によって測定した。生の蛍光測定値が、異なる足場タンパク質の各々について示される。
７．１．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下に帰される意味を有する。
本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」または「ＥＶ」という用語は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有する全ての膜結合小胞（例えば、エクソソーム、ナノ小胞）を含む。一般的に、細胞外小胞は直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、細胞外小胞の外部表面に表示される内部空間（例えば、内腔）内、及び／または膜をまたぐいずれかで、様々な巨大分子カーゴを含むことができる。カーゴは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、１つ以上のカーゴまたは他の外因性生物学的活性分子を含む。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、１つ以上の足場部分を含むことができる。ある特定の態様において、１つ以上の足場部分は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）が産生される細胞において天然に発現されない。例として、限定されないが、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接または間接操作（例えば、連続押出またはアルカリ溶液による処理による）によって細胞に由来する小胞、小胞化オルガネラ、及び生体細胞によって産生される小胞（例えば、原形質膜の直接発芽または後期エンドソームと原形質膜との融合によって）が含まれる。細胞外小胞は、生きているか、もしくは死んだ生物、外植された組織もしくは器官、原核細胞もしくは真核細胞、及び／または培養細胞に由来し得る。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、１つ以上の導入遺伝子産物を発現するように改変されている細胞によって産生される。したがって、本開示のＥＶは、天然発生ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含まない。
本明細書で使用される場合、「エクソソーム」という用語は、内部空間を封入する膜を含み、直接原形質膜出芽によるか、または後期エンドソームの原形質膜との融合により細胞から生成される、細胞由来の小さい（直径２０～３００ｎｍ、より好ましくは直径４０～２００ｎｍ）小胞を指す。ある特定の態様において、本開示のエクソソームは、約２０～２９０ｎｍ、２０～２８０ｎｍ、２０～２７０ｎｍ、２０～２６０ｎｍ、２０～２５０ｎｍ、２０～２４０ｎｍ、２０～２３０ｎｍ、２０～２２０ｎｍ、２０～２１０ｎｍ、２０～２００ｎｍ、２０～１９０ｎｍ、２０～１８０ｎｍ、２０～１７０ｎｍ、２０～１６０ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１４０ｎｍ、２０～１３０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２０～１１０ｎｍ、２０～１００ｎｍ、２０～９０ｎｍ、２０～８０ｎｍ、２０～７０ｎｍ、２０～６０ｎｍ、２０～５０ｎｍ、２０～４０ｎｍ、２０～３０ｎｍ、３０～３００ｎｍ、３０～２９０ｎｍ、３０～２８０ｎｍ、３０～２７０ｎｍ、３０～２６０ｎｍ、３０～２５０ｎｍ、３０～２４０ｎｍ、３０～２３０ｎｍ、３０～２２０ｎｍ、３０～２１０ｎｍ、３０～２００ｎｍ、３０～１９０ｎｍ、３０～１８０ｎｍ、３０～１７０ｎｍ、３０～１６０ｎｍ、３０～１５０ｎｍ、３０～１４０ｎｍ、３０～１３０ｎｍ、３０～１２０ｎｍ、３０～１１０ｎｍ、３０～１００ｎｍ、３０～９０ｎｍ、３０～８０ｎｍ、３０～７０ｎｍ、３０～６０ｎｍ、３０～５０ｎｍ、３０～４０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、４０～２９０ｎｍ、４０～２８０ｎｍ、４０～２７０ｎｍ、４０～２６０ｎｍ、４０～２５０ｎｍ、４０～２４０ｎｍ、４０～２３０ｎｍ、４０～２２０ｎｍ、４０～２１０ｎｍ、４０～２００ｎｍ、４０～１９０ｎｍ、４０～１８０ｎｍ、４０～１７０ｎｍ、４０～１６０ｎｍ、４０～１５０ｎｍ、４０～１４０ｎｍ、４０～１３０ｎｍ、４０～１２０ｎｍ、４０～１１０ｎｍ、４０～１００ｎｍ、４０～９０ｎｍ、４０～８０ｎｍ、４０～７０ｎｍ、４０～６０ｎｍ、４０～５０ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２９０ｎｍ、５０～２８０ｎｍ、５０～２７０ｎｍ、５０～２６０ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、５０～２４０ｎｍ、５０～２３０ｎｍ、５０～２２０ｎｍ、５０～２１０ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１９０ｎｍ、５０～１８０ｎｍ、５０～１７０ｎｍ、５０～１６０ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、５０～１４０ｎｍ、５０～１３０ｎｍ、５０～１２０ｎｍ、５０～１１０ｎｍ、５０～１００ｎｍ、５０～９０ｎｍ、５０～８０ｎｍ、５０～７０ｎｍ、５０～６０ｎｍ、６０～３００ｎｍ、６０～２９０ｎｍ、６０～２８０ｎｍ、６０～２７０ｎｍ、６０～２６０ｎｍ、６０～２５０ｎｍ、６０～２４０ｎｍ、６０～２３０ｎｍ、６０～２２０ｎｍ、６０～２１０ｎｍ、６０～２００ｎｍ、６０～１９０ｎｍ、６０～１８０ｎｍ、６０～１７０ｎｍ、６０～１６０ｎｍ、６０～１５０ｎｍ、６０～１４０ｎｍ、６０～１３０ｎｍ、６０～１２０ｎｍ、６０～１１０ｎｍ、６０～１００ｎｍ、６０～９０ｎｍ、６０～８０ｎｍ、６０～７０ｎｍ、７０～３００ｎｍ、７０～２９０ｎｍ、７０～２８０ｎｍ、７０～２７０ｎｍ、７０～２６０ｎｍ、７０～２５０ｎｍ、７０～２４０ｎｍ、７０～２３０ｎｍ、７０～２２０ｎｍ、７０～２１０ｎｍ、７０～２００ｎｍ、７０～１９０ｎｍ、７０～１８０ｎｍ、７０～１７０ｎｍ、７０～１６０ｎｍ、７０～１５０ｎｍ、７０～１４０ｎｍ、７０～１３０ｎｍ、７０～１２０ｎｍ、７０～１１０ｎｍ、７０～１００ｎｍ、７０～９０ｎｍ、７０～８０ｎｍ、８０～３００ｎｍ、８０～２９０ｎｍ、８０～２８０ｎｍ、８０～２７０ｎｍ、８０～２６０ｎｍ、８０～２５０ｎｍ、８０～２４０ｎｍ、８０～２３０ｎｍ、８０～２２０ｎｍ、８０～２１０ｎｍ、８０～２００ｎｍ、８０～１９０ｎｍ、８０～１８０ｎｍ、８０～１７０ｎｍ、８０～１６０ｎｍ、８０～１５０ｎｍ、８０～１４０ｎｍ、８０～１３０ｎｍ、８０～１２０ｎｍ、８０～１１０ｎｍ、８０～１００ｎｍ、８０～９０ｎｍ、９０～３００ｎｍ、９０～２９０ｎｍ、９０～２８０ｎｍ、９０～２７０ｎｍ、９０～２６０ｎｍ、９０～２５０ｎｍ、９０～２４０ｎｍ、９０～２３０ｎｍ、９０～２２０ｎｍ、９０～２１０ｎｍ、９０～２００ｎｍ、９０～１９０ｎｍ、９０～１８０ｎｍ、９０～１７０ｎｍ、９０～１６０ｎｍ、９０～１５０ｎｍ、９０～１４０ｎｍ、９０～１３０ｎｍ、９０～１２０ｎｍ、９０～１１０ｎｍ、９０～１００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１１０～２９０ｎｍ、１２０～２８０ｎｍ、１３０～２７０ｎｍ、１４０～２６０ｎｍ、１５０～２５０ｎｍ、１６０～２４０ｎｍ、１７０～２３０ｎｍ、１８０～２２０ｎｍ、または１９０～２１０ｎｍの直径を有する。本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）のサイズは、以下に記載される方法に従って測定することができる。
いくつかの態様において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、二脂質膜を含み、内部表面及び外部表面を含む。ある特定の態様において、内部表面は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内側コア（すなわち、内腔）に面する。ある特定の態様において、外部表面は、産生細胞または標的細胞のエンドソーム、多小胞体、または膜／細胞質と接触し得る。
いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）膜は、脂質及び脂肪酸を含む。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。
いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）膜は、内側リーフレット及び外側リーフレットを含む。内側及び外側リーフレットの組成物は、当技術分野で既知の経二重層分布アッセイ（ｔｒａｎｓｂｉｌａｙｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）によって決定することができ、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８５ ８１９：１７０を参照されたい。いくつかの態様において、外側リーフレットの組成物は、およそ７０～９０％のコリンリン脂質、およそ０～１５％の酸性リン脂質、及びおよそ５～３０％のホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの態様において、内側リーフレットの組成物は、およそ１５～４０％のコリンリン脂質、およそ１０～５０％の酸性リン脂質、及びおよそ３０～６０％のホスファチジルエタノールアミンである。
いくつかの態様において、エクソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択的に、ペイロード（例えば、治療剤）、レシーバー（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）、糖（例えば、単純糖、多糖類、もしくはグリカン）、または他の分子を含む。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、本開示のエクソソームは、１つ以上の足場部分を含む。ある特定の態様において、１つ以上の足場部分は、エクソソームが産生される細胞において天然に発現されない。エクソソームは、プロデューサー細胞に由来することができ、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。エクソソームは、細胞外小胞の一種である。一般に、エクソソーム産生／生合成は、産生細胞の破壊を生じない。いくつかの態様において、本開示のエクソソームは、１つ以上の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。本開示のエクソソームは、改変され（例えば、産生細胞内で天然に発現されないタンパク質を過剰発現するように操作される）、したがって、天然に存在するエクソソームを含まない。
本明細書で使用される場合、「異種エクソソーム小胞タンパク質」または「ＨＥＶＰ」という用語は、特定の細胞型によって産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）で異種発現されるタンパク質を指し、その細胞型はタンパク質を天然に発現しないが、タンパク質は異なる細胞型のＥＶ（例えば、エクソソーム）で天然に発現される。後者の細胞型は本明細書で「ドナー細胞」として称され、前者の細胞型は本明細書で「産生細胞」と称される。
本明細書で使用される場合、「ナノ小胞」という用語は、内部空間を封入する膜を含む、細胞由来の小さい（直径２０～２５０ｎｍ、より好ましくは直径３０～１５０ｎｍ）小胞を指し、直接的または間接的操作によって細胞（例えば、産生細胞）から生成され、ナノ小胞は操作なしでは産生細胞によって産生されない。プロデューサー細胞の適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液での処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ナノ小胞の産生は、いくつかの例では、プロデューサー細胞の破壊を生じ得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合による、産生細胞に由来する小胞を実質的に含まない。いくつかの態様において、ナノ小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択的に、ペイロード（例えば、治療剤）、レシーバー（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）、糖（例えば、単純糖、多糖類、もしくはグリカン）、または他の分子を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のナノ小胞は、１つ以上の足場部分を含む。ある特定の態様において、１つ以上の足場部分は、ナノ小胞が産生される細胞において天然に発現されない。ナノ小胞は、ナノ小胞が上記の操作に従って産生細胞に由来すると、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。ナノ小胞は、細胞外小胞の一種である。本明細書で使用される場合、ナノ小胞は、改変されており（例えば、産生細胞内で天然に発現されないタンパク質を過剰発現するように操作されている）、したがって、天然発生ナノ小胞を含まない。
本明細書で使用される場合、「表面改変エクソソーム」という用語は、その組成物に改変された膜または表面を有するエクソソームを指し、それによって、操作されたエクソソームの膜または表面は、改変前のものまたは天然発生エクソソームのものと異なる。操作は、エクソソームの表面で、またはエクソソームの膜内で行うことができ、それによってエクソソームの表面が変化される。例えば、膜は、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などのその組成物において改変される。組成物は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって以前にまたは同時に改変された細胞から産生されることによって、変化され得る。具体的には、組成物は、遺伝子操作によって、または遺伝子操作学によって既に改変されている細胞から産生されることによって、変化され得る。本明細書に開示されるように、いくつかの態様において、本明細書に開示される表面操作されたエクソソームは、エクソソームの表面に露出され得るか、またはエクソソームの表面上に露出される部分のアンカーポイント（結合）であり得る、１つ以上の外因性タンパク質（例えば、足場部分、例えば、本明細書に開示される異種エクソソーム小胞タンパク質）、またはその断片もしくは変異体を含む。特定の態様において、１つ以上の足場部分は、エクソソームが産生される細胞において天然に発現されない。いくつかの態様において、表面操作されたエクソソームは、エクソソームの表面に露出され得るか、またはエクソソームの表面上に露出される部分のアンカーポイント（結合）であり得る、天然エクソソームタンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）、またはその断片もしくは変異体の、より高い発現（例えば、より多い数）を含む。上記の定義は、エクソソームの文脈において提供されるが、他のタイプの細胞外小胞も、同様の手段で表面操作することができる。したがって、別途示されない限り、表面操作されたエクソソームに関する開示は、他の細胞外小胞に同様に適用することができる。
本明細書で使用される場合、「内腔操作されたエクソソーム」という用語は、その組成物において改変されたエクソソームの膜または内腔を有するエクソソームを指し、そのため、操作されたエクソソームの内腔は、改変前または天然発生エクソソームのものとは異なる。操作は、エクソソームの内腔または膜内に直接行うことができ、それによってエクソソームの内腔が変化される。例えば、膜は、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などのその組成物において改変され、それによってエクソソームの内腔が改変される。組成物は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって既に改変された細胞から産生されることによって、変化され得る。具体的には、組成物は、遺伝子操作によって、または遺伝子操作学によって既に改変されている細胞から産生されることによって変化され得る。いくつかの態様において、内腔操作されたエクソソームは、１つ以上の外因性生物学的活性分子（例えば、足場部分、例えば、本明細書に開示される異種エクソソーム小胞タンパク質）を含む。ある特定の態様において、外因性生物学的活性分子は、エクソソームの内腔内に露出され得るか、またはエクソソームの内側層に露出される部分のためのアンカーポイント（結合）であり得る、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ、例えば、エクソソームが天然に発現しないタンパク質）、またはその断片もしくは変異体を含むことができる。ある特定の態様において、１つ以上の足場部分は、エクソソームが産生される細胞において天然に発現されない。いくつかの態様において、内腔操作されたエクソソームは、エクソソームの内腔に露出され得るか、またはエクソソームの内腔に露出された部分のアンカーポイント（結合部）であり得る、天然エクソソームタンパク質、またはその断片もしくは変異体のより高い発現を含む。上記の定義は、エクソソームの文脈において提供されるが、他の種類の細胞外小胞も、同様の手段で内腔操作することができる。したがって、別途示されない限り、内腔操作されたエクソソームに関する開示は、他の細胞外小胞に同様に適用することができる。
本明細書で使用される場合、「改変」という用語は、タンパク質の文脈で使用されるとき、タンパク質の非変異体アミノ酸配列に対して少なくとも約１５％の配列同一性を有するタンパク質を指す。タンパク質の改変は、タンパク質の断片または変異体を含む。タンパク質の改変は、タンパク質の断片または変異体に対する化学的または物理的改変をさらに含むことができる。
「改変された」という用語は、本明細書に記載のＥＶ、例えば、エクソソームの文脈で使用される場合、ＥＶ、例えば、エクソソーム及び／またはその産生細胞の変更または操作を指し、それにより、改変されたＥＶ、例えば、エクソソームは、天然発生ＥＶ、例えば、エクソソームと異なる。いくつかの態様において、本明細書に記載の改変ＥＶ、例えば、エクソソームは、天然発生ＥＶ、例えば、エクソソームの膜と比べて、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成物が異なる膜を含む（例えば、膜は、より高い密度または数の天然のエクソソームタンパク質を含み、及び／または膜は、エクソソーム（例えば、治療用分子（例えば、抗原）、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）に天然に認められない複数の（例えば、少なくとも２つの）生物学的活性分子を含む）。本明細書で使用される場合、エクソソームに天然に認められない生物学的活性分子は、「外因性生物学的活性分子」としても記載される。かかる外因性生物学的活性分子の非限定的な例には、本明細書に開示される異種エクソソーム小胞タンパク質（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、またはＮＲＰ１）、治療用分子（例えば、抗原）、標的化部分、アジュバント、免疫調節物質、またはそれらの組み合わせが含まれる。ある特定の態様において、膜に対するかかる改変は、ＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、表面操作されたＥＶ、例えば、本明細書に記載のエクソソーム）の外部表面を変化させる。
本明細書で使用される場合、「足場部分」及び「足場」という用語は、互換的に使用され得、カーゴまたは任意の他の関心対象の外因性生物学的活性分子（例えば、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）を、ＥＶ、例えば、ＥＶ、例えば、エクソソームの外部表面上に固定するために使用することができる分子を指す。ある特定の態様において、足場部分は、合成分子を含む。いくつかの態様において、足場部分は、非ポリペプチド部分を含む。いくつかの態様において、足場部分は、ＥＶ、例えば、エクソソームに天然に存在する脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。いくつかの態様において、足場部分は、ＥＶ、例えば、エクソソームに天然に存在しない脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。いくつかの態様において、足場部分は、本明細書に開示される異種エクソソーム小胞タンパク質を含む。いくつかの態様において、足場部分は、全タンパク質またはその断片（例えば、機能的断片、例えば、ＥＶ、例えば、エクソソームの外部表面上または内腔表面上に別の部分を固定することができる最小の断片）であることができる。本開示によって使用することができる他の足場部分の非限定的な例には、足場Ｘ、足場Ｙ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂが含まれる。
本明細書で使用される場合、「足場Ｘ」という用語は、エクソソームの表面で最近特定されたエクソソームタンパク質を指す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１９５，２９０号を参照されたい。足場Ｘタンパク質の非限定的な例には、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブ調節因子（「ＰＴＧＦＲＮタンパク質」）；ベイシジン（「ＢＳＧタンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（「ＩＧＳＦ２タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（「ＩＧＳＦ３タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（「ＩＧＳＦ８タンパク質」）；インテグリンβ－１（「ＩＴＧＢ１タンパク質」）；インテグリンα－４（「ＩＴＧＡ４タンパク質」）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（「ＳＬＣ３Ａ２タンパク質」）；及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（「ＡＴＰ１Ａ１タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ２タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ３タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ４タンパク質」、「ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂタンパク質」）が含まれる。
本明細書で使用される場合、「足場Ｙ」という用語は、エクソソームの内腔内で新たに特定されたエクソソームタンパク質を指す。例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６１６７９を参照し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。足場Ｙタンパク質の非限定的な例には、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（「ＭＡＲＣＫＳタンパク質」）、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質１（「ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質」）、及び脳酸可溶性タンパク質１（「ＢＡＳＰ１タンパク質」）が含まれる。
本明細書で使用される場合、タンパク質の「断片」という用語は、天然発生配列よりも短いタンパク質のアミノ酸配列、例えば、天然発生タンパク質と比較して、Ｎ末端及び／またはＣ末端が欠失、及び／またはタンパク質の任意の他の部分が欠失した、タンパク質のアミノ酸配列を指す。好ましくは、本明細書に開示される異種エクソソーム小胞タンパク質の断片（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、またはＮＲＰ１）は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を特異的に標的とする能力を保持する。いくつかの態様において、本明細書に開示される異種エクソソーム小胞タンパク質の断片は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の外部表面または内腔表面に別の部分を固定する能力を保持する。このような断片は、「機能的断片」とも呼ばれる。本明細書で使用される場合、「機能的断片」という用語は、タンパク質機能を保持するタンパク質断片を指すことができる。いくつかの態様において、「機能的断片」という用語は、全長タンパク質を天然に発現しない細胞株で発現することができるタンパク質断片を指す。断片がその意味で機能的断片であるかは、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、及び自己蛍光タンパク質など、例えばＧＦＰを有する断片の融合物を含む、ＥＶ（例えば、エクソソーム）のタンパク質含有量を決定する当技術分野で既知の任意の方法によって評価することができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される異種エクソソーム小胞タンパク質は、天然発生の異種エクソソーム小胞タンパク質の能力、例えば、部分を固定する能力の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％を保持する。具体的な実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、またはＮＲＰ１の断片は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を特異的に標的とし、及び／またはＥＶに（例えば、外部表面に）別の部分を固定する、天然発生のＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、またはＮＲＰ１の能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％を保持する。
本明細書で使用される場合、タンパク質の「変異体」という用語は、当技術分野で既知の方法によるアラインメントで、ある特定のアミノ酸配列同一性を別のタンパク質と共有するタンパク質を指す。タンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフトまたは再配列を含むことができる。特定の実施形態において、変異体は、ＣＤ１３（例えば、膜アラニルアミノペプチダーゼ、アラニルアミノペプチダーゼ（ＡＡＰ）、アミノペプチダーゼＮ（ＡＰ－Ｎ）、アミノペプチダーゼＭ、ＧＰ１５０、ＬＡＰ１、Ｐ１５０、ＰＥＰＮ、ＡＮＰＥＰ、もしくは微小体アミノペプチダーゼとしても当技術分野で知られる）、ＭＭＥ（例えば、膜メタロ－エンドペプチダーゼ、ネプリライシン、神経エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、分化クラスタ１０（ＣＤ１０）、一般的な急性リンパ芽球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ）、皮膚線維芽細胞エラストラーゼ、アトリオペプチダーゼ、もしくはエンケファリナーゼとしても当技術分野で知られる）、ＥＮＰＰ１（例えば、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１、ホスホジエステラーゼ／ヌクレオチドピロホスファターゼ１、原形質細胞膜糖タンパク質ＰＣ－１、膜成分染色体６表面マーカー１、アルカリホスホジエステラーゼ１、Ｌｙ－４１抗原、ＡＲＨＲ２、もしくはＣＯＬＥＤとしても当技術分野で知られている）、またはＮＲＰ１（例えば、ニューロピリン１、血管内皮細胞増殖因子１６５受容体（ＶＥＧＦ１６５Ｒ）、ＣＤ３０４、ＢＤＣＡ４、ＮＰ１、もしくはＮＲＰとしても当技術分野で知られている）に対して少なくとも約７０％の同一性を有する変異体である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３の変異体または断片の変異体は、配列番号４７に従うＣＤ１３またはその機能的断片と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、ＭＭＥの変異体または断片の変異体は、配列番号４８に従うＭＭＥまたはその機能的断片と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、ＥＮＰＰ１の変異体または断片の変異体は、配列番号４９に従うＥＮＰＰ１またはその機能的断片と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、ＮＲＰ１の変異体または断片の変異体は、配列番号５０に従うＮＲＰ１またはその機能的断片と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。上記の場合の各々では、変異体または断片の変異体は、タンパク質の機能（例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を特異的に標的とする能力）を保持することが好ましい。
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、ポリペプチドにおけるアミノ酸が、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸で置き換えられている場合、置換は保存的であると考えられる。別の態様において、アミノ酸の鎖は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成物が異なる構造的に同様の鎖で保存的に置き換えることができる。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」という用語は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入されなければならない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮して、比較幅にわたって配列によって共有される同一のマッチング位置の数を指す。マッチング位置は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が標的配列及び参照配列の両方で提示される任意の位置である。標的配列に提示されるギャップは、ギャップがヌクレオチドまたはアミノ酸ではないため、カウントされない。同様に、参照配列に提示されるギャップは、標的配列ヌクレオチドまたはアミノ酸がカウントされ、参照配列からのヌクレオチドまたはアミノ酸はカウントされないため、参照配列はカウントされない。
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムは、以下：Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：１５ ２３７－４４（１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－３（１９８９）、Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．１６：１０８８１－９０（１９８８）、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．８：１５５－６５（１９９２）、及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９９４）に記載されている。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）［Ａｌｔｓｃｈｕｌ ２０ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０（１９９０）］は、いくつかの供給源から入手可能であり、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）及びインターネットが含まれる。ＢＬＡＳＴ、及びプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、ＮＩＨ（国立衛生研究所）のＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）の公式ウェブサイトでアクセスすることができる。
本明細書に提供される任意のタンパク質の列挙は、タンパク質の機能的バリアントを包含する。タンパク質の「機能的変異体」という用語は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を特異的に標的とする能力を保持するタンパク質の変異体を指す。
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変異を含有することができる。一態様において、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、または欠失を生じるが、コードされたポリペプチドの特性または活性を変化させない変異を含有する。別の態様において、ヌクレオチド変異体は、遺伝コードの縮退性に起因するサイレント置換によって産生される。他の態様において、変異体では、５～１０、１～５、または１～２個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加される。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ内のコドンを他のもの、例えばＥ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主に変更させる）ために、産生することができる。
天然発生の変異体は、「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、生物の染色体上の所与の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替形態の１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドレベルのいずれかで変化し得、本開示に含まれる。代替的に、非天然発生の変異体は、突然変異誘発技術によって、または直接合成によって産生することができる。
タンパク質工学及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、変異体を生成して、ポリペプチドの特徴を改善または変更することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に失うことなく、分泌タンパク質のＮ末端またはＣ末端から欠失させることができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４－２９８８（１９９３）は、３、８、または２７個のアミノ酸残基を欠失した後でさえ、ヘパリン結合活性を有する変異体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０個のアミノ酸残基を欠失した後に、最大１０倍高い活性を呈した。（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）
さらに、十分な証拠によって、変異体がしばしば天然発生のタンパク質と同様の生物学的活性を保持することが実証される。例えば、Ｇａｙｌｅ及び同僚（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１（１９９３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの広範囲な変異解析を行った。彼らは、ランダムな突然変異誘発を使用して、分子の全長にわたり変異体当たり平均して２．５個のアミノ酸変化であった３，５００を超える個々のＩＬ－１ａ変異体を生成した。複数の変異を、全ての可能なアミノ酸位置で調べた。研究者らは、「分子のほとんどは、［結合または生物学的活性］にほとんど影響を与えずにできた」ことを認めた。（要約を参照する）実際に、調べられた３，５００ヌクレオチド配列超のうち、２３個の固有のアミノ酸配列のみが、野生型と著しく活性が異なるタンパク質を産生した。
上記のように、ポリペプチド変異体は、例えば、改変ポリペプチドを含む。改変には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０－７９（２０１０）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アミノ酸のアルギニル化などのタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化が含まれる。いくつかの態様において、足場Ｘ及び／または足場Ｙは、任意の好都合な位置で改変される。
本明細書で使用される場合、「に連結された」、「にコンジュゲートされた」、及び「に固定された」という用語は、互換的に使用され、第１の部分（例えば、足場部分、例えば、異種エクソソーム小胞タンパク質）と第２の部分（例えば、ペイロード）との間に形成される共有結合または非共有結合を指す。
本明細書で使用される場合、「産生細胞」という用語は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を生成するために使用される細胞を指す。産生細胞は、インビトロで培養される細胞、またはインビボでの細胞であることができる。産生細胞には、ＥＶ、例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を生成するのに有効であることが知られている細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）ニューロン前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊水細胞、脂肪性間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、産生細胞は、抗原提示細胞ではない。いくつかの態様において、産生細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。本明細書に開示されるように、いくつかの態様において、本開示の産生細胞は、１つ以上の導入遺伝子産物を発現するように改変されている。いくつかの態様において、産生細胞は、産生細胞が天然に発現しないタンパク質（例えば、異種エクソソーム小胞タンパク質）を発現するように改変されている。いくつかの態様において、本開示で有用なＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えばエクソソームの表面に露出されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に抗原を担持しないが、代わりに、足場部分への結合によって、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔内またはＥＶ、例えば、エクソソームの表面（例えばエクソソーム）に抗原を担持することができる。
本明細書で使用される場合、「ＭＨＣクラスＩ分子」は、ＭＨＣクラスＩ分子をコードする野生型または変異体ＨＬＡクラスＩ遺伝子のタンパク質産物を指す。したがって、「ＨＬＡクラスＩ分子」及び「ＭＨＣクラスＩ分子」は、本明細書で互換的に使用される。
ＭＨＣクラスＩ分子は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子の２つの主要クラスのうちの１つであり（他方はＭＨＣクラスＩＩである）、有顎脊椎動物の体内の全ての有核細胞の細胞表面に認められる。それらは、血小板にも生じるが、赤血球では生じない。それらの機能は、細胞内から細胞傷害性Ｔ細胞にタンパク質のペプチド断片を提示することであり、これは、ＭＨＣクラスＩタンパク質の助けによって提示される特定の非自己抗原に対する免疫系からの即時応答を引き起こす。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞質タンパク質に由来するペプチドを提示するため、ＭＨＣクラスＩ提示の経路は、多くの場合、細胞質または内因性経路と呼ばれる。
ヒトにおいて、ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃである。ＭＨＣクラスＩ分子は、２つのタンパク質鎖：α鎖及びβ２－マイクログロブリン（β２ｍ）鎖を含む。ヒトβ２ｍは、Ｂ２Ｍ遺伝子によってコードされる。クラスＩ ＭＨＣ分子は、主にプロテアソームによる細胞質タンパク質の分解から生成されるペプチドに結合する。次いで、ＭＨＣ Ｉ：ペプチド複合体は、細胞の外部形質膜に小胞体を介して挿入される。エピトープペプチドは、クラスＩ ＭＨＣ分子の細胞外部分に結合される。したがって、クラスＩ ＭＨＣの機能は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に細胞内タンパク質を提示することである。しかしながら、クラスＩ ＭＨＣはまた、交差提示として知られるプロセスにおいて、外因性タンパク質から生成されるペプチドも提示することができる。
正常な細胞は、そのクラスＩ ＭＨＣ上に正常な細胞タンパク質転換からのペプチドを提示し、ＣＴＬは、中央及び末梢の耐容メカニズムにより、それらに応答して活性化されない。ウイルス感染後など、細胞が外来タンパク質を発現する場合、クラスＩ ＭＨＣの一部は、これらのペプチドを細胞表面に提示する。その結果、ＭＨＣ：ペプチド複合体に特異的なＣＴＬは、提示細胞を認識して殺すであろう。代替的に、クラスＩ ＭＨＣ自体は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）のための阻害性リガンドとして機能することができる。いくつかのウイルス及びある特定の腫瘍がＣＴＬ応答を回避するために用いるメカニズムである表面クラスＩ ＭＨＣの正常レベルの低下は、ＮＫ細胞死滅を活性化する。
本明細書で使用される場合、「ＭＨＣクラスＩＩ分子」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子をコードする野生型または変異体ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のタンパク質産物を指す。したがって、「ＨＬＡクラスＩＩ分子」及び「ＭＨＣクラスＩＩ分子」は、本明細書で互換的に使用される。
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、通常、樹状細胞、単核食細胞、いくつかの内皮細胞、胸腺上皮細胞、及びＢ細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞にのみ認められる主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子のクラスである。これらの細胞は、免疫応答を開始する際に重要である。クラスＩＩペプチドによって提示される抗原は、細胞外タンパク質に由来する（ＭＨＣクラスＩにおけるような細胞質ではない）。
ＭＨＣクラスＩ分子と同様に、クラスＩＩ分子もヘテロ二量体であるが、この場合、α鎖及びβ鎖という２つの同種のペプチドからなり、いずれもＭＨＣにコードされる。下位命名α１、α２などは、ＨＬＡ遺伝子内の別個のドメインを指し、各ドメインは通常、遺伝子内の異なるエクソンによってコードされ、いくつかの遺伝子は、リーダー配列、膜貫通配列などをコードするさらなるドメインを有する。これらの分子は、膜貫通配列及び細胞質尾部と同様に両方とも細胞外領域を有する。鎖のα１領域及びβ１領域は、一緒に膜遠位ペプチド結合ドメインを作製するようになり、一方、鎖の残りの細胞外部分であるα２及びβ２領域は、膜近位免疫グロブリン様ドメインを形成する。抗原またはペプチドが結合する抗原結合溝は、２つのαヘリックス壁及びβシートからなる。ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原結合溝は両端で開いており、クラスＩ分子での対応する溝は両端で閉じているため、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される抗原は長く、一般的に１５～２４個のアミノ酸残基長である。ＭＨＣクラスＩＩ分子の負荷は、食作用によって生じ、細胞外タンパク質は形質膜陥入され、リソソーム内で消化され、生じたエピトープペプチド断片は、細胞表面へのそれらの移行の前にＭＨＣクラスＩＩ分子に負荷される。ヒトにおいて、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質複合体は、ヒト白血球抗原遺伝子複合体（ＨＬＡ）によってコードされる。ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡは、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲである。ＨＬＡ遺伝子複合体における変異は、ＭＨＣクラスＩＩ欠損症の一種である裸リンパ球症候群（ＢＬＳ）をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「標的タンパク質」という用語は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面に標的化することができるタンパク質を指す。標的タンパク質は、天然にＥＶ（例えば、エクソソーム）膜を標的とする非変異タンパク質、または非変異タンパク質の断片もしくは変異体であることができる。標的タンパク質は、非変異タンパク質または非変異タンパク質の変異体もしくは断片に結合した、フラグタグ、治療用ペプチド、標的化部分、または他のペプチドを含有する融合タンパク質であることができる。標的タンパク質は、リンカーによって膜貫通タンパク質、内在性膜タンパク質、周辺タンパク質、または膜に結合した可溶性タンパク質を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「混入タンパク質」という用語は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）と会合していないタンパク質を指す。例えば、混入タンパク質は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に封入されておらず、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の膜に結合または組み込まれていないタンパク質を含む。
本明細書で使用される場合、「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」、または「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、同様に「抽出された」及び「抽出すること」という用語は、互換的に使用され、精製、例えば、所望のＥＶ（例えば、エクソソーム）調製物の選択または豊富化の１つ以上のプロセスを受けている、所望のＥＶ（例えば、エクソソーム）の調製物（例えば、複数の既知または未知の量及び／または濃度）の状態を指す。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される単離することまたは精製することは、産生細胞を含有する試料からＥＶ（例えば、エクソソーム）（例えば、画分）を除去、部分的に除去するプロセスである。いくつかの実施形態において、単離されたＥＶ（例えば、エクソソーム）組成物は検出可能な望ましくない活性を有しないか、または代替的には、望ましくない活性のレベルもしくは量は、許容されるレベルもしくは量未満である。他の実施形態において、単離されたＥＶ（例えば、エクソソーム）組成物は、許容される量及び／または濃度以上の所望のＥＶ（例えば、エクソソーム）の量及び／または濃度を有する。他の実施形態において、単離されたＥＶ（例えば、エクソソーム）組成物は、組成物が得られる出発材料（例えば、産生細胞調製物）と比較して豊富化される。この豊富化は、出発材料と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、少なくとも約９９．９９９９％、または約９９．９９９９％超であることができる。いくつかの実施形態において、単離されたＥＶ（例えば、エクソソーム）調製物は、残留生物学的産物を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、単離されたＥＶ（例えば、エクソソーム）調製物は、任意の混入した生物学的物質が、約１００％フリー、約９９％フリー、約９８％フリー、約９７％フリー、約９６％フリー、約９５％フリー、約９４％フリー、約９３％フリー、約９２％フリー、約９１％フリー、または約９０％フリーである。残留生物学的産物は、非生物物質（化学物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物を含むことができる。残留生物学的産物を実質的に含まないことはまた、ＥＶ（例えば、エクソソーム）が検出可能な産生細胞を含有しないこと、及びＥＶ（例えば、エクソソーム）のみが検出可能であることを意味することができる。
「賦形剤」または「担体」という用語は、化合物の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ヒトを含む動物での使用について米国連邦政府の規制機関によって承認されたか、または米国薬局方に列挙されている任意の薬剤、同様に、対象に重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を抑止しない任意の担体または希釈剤を包含する。薬学的組成物を調製するのに有用であり、一般に安全で、非毒性であり、望ましい賦形剤及び担体が、含まれる。
本明細書で使用される場合、「ペイロード」という用語は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）と接触した標的（例えば、標的細胞）に作用する治療剤を指す。ＥＶ、例えば、エクソソームに含まれ得るペイロードの非限定的な例は、治療用分子（例えば、抗原または免疫抑制剤）、アジュバント、及び／または免疫調節物質である。ＥＶ（例えば、エクソソーム）及び／または産生細胞に導入することができるペイロードには、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含むか、または転写を中断させるヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素などのポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、もしくはポリペプチドコンジュゲート化ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）などの調節機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含むか、または翻訳を中断させるアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び小分子（例えば、小分子薬剤及び毒素）のような治療剤が含まれる。
本明細書で使用される場合、「生物学的活性分子」という用語は、生物学的システム（例えば、細胞またはヒト対象）において活性を有する薬剤を指し、構造タンパク質、酵素、サイトカイン（インターフェロン及び／またはインターロイキンなど）、抗生物質、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはそれらの有効部分を含むがこれらに限定されないタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド、抗体またはその一部が天然、合成もしくはヒト化され得るＦｖ断片、ペプチドホルモン、受容体、シグナル伝達分子もしくは他のタンパク質；オリゴヌクレオチドもしくは改変オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは修改変アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、人工または天然染色体（例えば、酵母人工染色体）もしくはその一部、以下に定義される核酸、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡもしくはリボザイムを含むＲＮＡ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）；ウイルスまたはウイルス様粒子；改変または非改変であり得る、ヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの合成アナログ；改変または非改変であり得る、アミノ酸もしくはそのアナログ；非ペプチド（例えば、ステロイド）ホルモン；プロテオグリカン：脂質；または炭水化物が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、生物学的活性分子には、治療用分子（例えば、抗原）、標的化部分（例えば、抗体またはその抗原結合断片）、アジュバント、免疫調節物質、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、生物学的活性分子は、巨大分子（例えば、タンパク質、抗体、酵素、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせ）を含む。いくつかの態様において、生物学的活性分子には、小分子（例えば、アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチドコンジュゲート化ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、ｓｉＲＮＡ、ＳＴＩＮＧ、薬学的薬剤、またはそれらの任意の組み合わせ）が含まれる。いくつかの態様において、生物学的活性分子は、ＥＶに対して外因性であり、すなわち、ＥＶにおいて天然に認められない。
本明細書で使用される場合、「治療用化合物」という用語は、対象（例えば、ヒト対象）における疾患もしくは障害を治療及び／または予防することができる任意の分子を指す。
いくつかの態様において、治療用分子は抗原を含む。本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、対象に導入された際に、それ自体に対する免疫応答（細胞性または体液性）を誘発する任意の薬剤を指す。いくつかの態様において、抗原は、主要組織適合複合体Ｉ及び／またはＩＩ分子に発現されない。他の態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームにおける抗原は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ複合体として発現されないが、ＥＶ、例えば、エクソソームは、依然として、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面にＭＨＣクラスＩ／ＩＩ分子を含有することができる。したがって、ある特定の態様において、本明細書に開示されるＥＶ、例えば、エクソソームは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と直接的に相互作用せずに、抗原に対する免疫応答を誘導する。同様に、ある特定の態様において、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、抗原をクロスドレス化によって標的細胞（例えば、樹状細胞）の表面に直接的に移行しない。クロスドレス化は、樹状細胞（ＤＥＸ）に由来するＥＶ、例えば、エクソソームによって一般的に使用され、Ｔ細胞活性化を誘導する機構である。Ｐｉｔｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６（４）：１２２４－３２（２０１６）を参照されたい。他の態様において、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、抗原提示細胞によって貪食され、ＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩ複合体として抗原提示細胞の表面に発現され得る。
いくつかの態様において、治療用分子は、免疫抑制剤を含む。本明細書で使用される場合、「免疫抑制剤」という用語は、対象における免疫応答を遅延または停止させる任意の薬剤（例えば、治療用分子）を指す。免疫抑制剤は、対象の免疫系が臓器移植後に免疫応答を開始することを防止するために、または過活動免疫系によって引き起こされる疾患を治療するために、対象に投与することができる。免疫抑制剤の例には、限定されないがシクロスポリン、ＩＳＡ（ＴＸ）２４７、タクロリムスもしくはカルシニューリンなどのカルシニューリン阻害剤、限定されないがシロリムス、エベロリムス、ＦＫ７７８もしくはＴＡＦＡ－９３などのラパマイシンの標的、限定されないがバシリキシマブ及びダクリズマブなどのインターロイキン－２α鎖遮断剤、限定されないがマイコフェノール酸モフェチルなどのイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、限定されないがメトトレキサートなどのジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害剤、限定されないがプレドニゾロン及びメチルプレドニゾロンなどのコルチコステロイド、または限定されないがアザチオプリンなどの免疫抑制性抗代謝物質が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、免疫抑制剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、抗原及び免疫抑制剤の両方を含むことができる。いずれか１つの理論によっても束縛されることなく、抗原及び免疫抑制剤の両方を含むＥＶ（例えば、エクソソーム）は、抗原に対する耐性を誘導するために使用することができる。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、天然または部分的もしくは全体的に合成的に産生されているかにかかわらず、免疫グロブリン、及びその断片を包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を網羅する。「抗体」は、抗原に特異的に結合し認識する、免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドをさらに含む。抗体という用語の使用は、抗体全体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、それらの断片を含むことを意味し、さらに一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片である、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片など、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ならびに抗体関連ポリペプチドを含む。抗体は、それらが所望の生物学的活性または機能を呈する限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ、ナノボディ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、アゴニスト抗体、遮断抗体、標的化抗体、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、アゴニスト抗体は、ＣＤ４０Ｌアゴニストである。いくつかの態様において、遮断抗体は、プログラム死１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４、及びそれらの任意の組み合わせから選択される標的タンパク質に結合する。
本明細書で使用される場合、「免疫調節物質」という用語は、細胞外小胞と接触した標的（例えば、標的細胞）に作用し、免疫系を調節する薬剤を指す。ＥＶ（例えば、エクソソーム）及び／または産生細胞に導入することができる免疫調節物質の非限定的な例には、チェックポイント阻害物質の調節剤、チェックポイント阻害物質のリガンド、サイトカイン、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせなどの薬剤が含まれる。免疫調節物質にはまた、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチドであるｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチドコンジュゲート化ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡなど、または小分子も含まれる。
本明細書で使用される場合、「哺乳動物対象」は、ヒト、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコなど）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含むがこれらに限定されず、全ての哺乳動物を含む。
「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、治療、または療法が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の方法は、ヒト療法及び獣医学適用の両方に適用可能である。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物であり、他の実施形態において、対象は、ヒトである。
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）パーセンテージ濃度で約１０％未満の巨大分子を含むことを意味する。いくつかの画分は、約０．００１％未満、約０．０１％未満、約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．３％未満、約０．４％未満、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、または約１０％未満（ｍ／ｖ）の巨大分子を含有し得る。
本明細書で使用される場合、「巨大分子」という用語は、核酸、混入タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせを意味する。
本明細書で使用される場合、「従来のエクソソームタンパク質」という用語は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、またはそれらに結合するペプチドを含むが、これらに限定されない、ＥＶ（例えば、エクソソーム）で豊富化されることが既に知られているタンパク質を意味する。
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、ペプチドまたはタンパク質を別の分子（例えば、異なるペプチドまたはタンパク質、小分子など）に結合することができる任意の分子構造を指す。好適なリンカーは当業者に周知であり、直鎖または分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１３，Ｖｏｌ．６５：１０，ｐｐ．１３５７－１３６９を参照されたい）。リンカーは、カルボキシル及びアミノ末端アミノ酸に、それらの末端カルボキシル基もしくはアミノ基を介して、またはそれらの反応性側鎖基を介して、結合することができる。加えて、いくつかの態様において、リンカーは、可撓性または剛性として分類することができ、それらは切断可能（例えば、１つ以上のプロテアーゼ切断可能部位を含み、これは、リンカーの配列内に位置し得るか、またはリンカー配列のいずれかの末端でリンカーに隣接し得る）であることができる。
本明細書で使用される「投与すること」は、本明細書に開示されるＥＶ、例えば、エクソソームを含む組成物を、薬学的に許容される経路を介して対象に与えることを意味する。投与経路は、静脈内、例えば、静脈内注射及び静脈内注入であることができる。追加の投与経路には、例えば、皮下、筋肉内、経口、経鼻、及び肺投与が含まれる。ＥＶ、例えば、エクソソームは、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の一部として投与することができる。
本明細書で使用される「免疫応答」は、外来物質または異常な、例えば、がん性の細胞に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、応答は、これらの物質及びそれらによって引き起こされる疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の１つ以上の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞または好中球）及びこれらの細胞または肝臓のいずれかによって産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用によって媒介され、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん細胞もしくは他の異常細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合、正常なヒト細胞もしくは組織に、選択的な標的化、結合、損傷、破壊、及び／または侵入した病原体の脊椎生物の体からの排除をもたらす。免疫反応には、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、もしくはＴｒｅｇ細胞の活性化もしくは阻害、または免疫系の任意の他の細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性化もしくは阻害が含まれる。したがって、免疫応答は、体液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞によって媒介される）、細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞によって媒介される）、または体液性及び細胞性免疫応答の両方を含むことができる。いくつかの態様において、免疫応答は、「阻害性」免疫応答である。阻害性免疫応答は、刺激（例えば、抗原）の効果を遮断または減少させる免疫応答である。ある特定の態様において、阻害性免疫応答は、刺激に対する阻害性抗体の産生を含む。いくつかの態様において、免疫応答は、「刺激性」免疫応答である。刺激性免疫応答は、標的抗原（例えば、腫瘍抗原またはウイルス）を破壊し、排除することができるエフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）の生成をもたらす免疫応答である。
本明細書で使用される「治療する」、「治療」、または「治療すること」は、例えば、疾患もしくは状態の重症度の低減、疾患経過の持続時間の低減、疾患もしくは状態に関連する１つ以上の症状の改善もしくは除去、疾患もしくは状態を有する対象に、疾患もしくは状態を必ずしも治癒することのない有益な効果の提供を指す。本用語はまた、疾患もしくは状態またはそれらのその症状の予防または防止を含む。一態様において、「治療すること」または「治療」という用語は、抗原に対する対象における免疫応答を誘導することを意味する。
本明細書で使用される「防止する」または「防止すること」は、特定の転帰の発生または重症度を減少または低下させることを指す。いくつかの態様において、転帰を防止することは、予防的治療を通じて達成される。
７．２．他の解釈上の慣例
本明細書に列挙される範囲は、列挙された端点を含め、範囲内の全ての値の簡略表記であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、またはサブ範囲を含むと理解される。
「約」という用語は、指示された値及びその値の上と下の範囲を示し、包含する。ある特定の実施形態において、「約」という用語は、指定値±１０％、±５％、または±１％を示す。ある特定の実施形態において、適用可能な場合、「約」という用語は、指定値（複数可）±その値（複数可）の１標準偏差を示す。
本開示全体を通して、「ａ」または「ａｎ」実体という用語は、その実体のうちの１つ以上を指し、例えば、「抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つ以上の抗体を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で互換的に使用することができる。
さらに、本明細書で使用される場合、「及び／または」は、他の有無にかかわらず、２つの特定の特徴または構成要素の各々の具体的な開示とみなされるべきである。したがって、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、以下の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）、の各々を包含することが意図される。
７．３．ＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質
本開示の態様は、特定の産生細胞から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）膜で高度に豊富化される異種エクソソーム小胞タンパク質（ＨＥＶＰ）の特定、使用及び改変に関する。本明細書に記載されるように、異なる細胞（例えば、間葉系幹細胞とＨＥＫ２９３）は、異なるタンパク質を天然に発現する。細胞から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、産生細胞内で天然に発現される１つ以上のタンパク質を発現する。したがって、異なる産生細胞から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、異なるタンパク質組成物を有することができる。ＨＥＶＰは、質量分析または当技術分野で既知の他の方法を用いて、高度に精製されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を分析することによって特定することができる。
本開示のＨＥＶＰには、ＥＶ（例えば、エクソソーム）膜で豊富化される、膜貫通タンパク質、内在性膜タンパク質及び周辺タンパク質などの様々な膜タンパク質が含まれる。それらは、様々なＣＤタンパク質、トランスポーター、インテグリン、レクチン、及びカドヘリンを含む。具体的には、タンパク質は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ＨＥＶＰは、ＣＤ１３（またはその断片もしくは変異体）である。いくつかの態様において、ＨＥＶＰは、ＭＭＥ（またはその断片もしくは変異体）である。いくつかの態様において、ＨＥＶＰは、ＥＮＰＰ１（またはその断片もしくは変異体）である。いくつかの態様において、ＨＥＶＰは、ＮＲＰ１（またはその断片もしくは変異体）である。いくつかの態様において、ＨＥＶＰは、ＩＩ型膜貫通タンパク質である。本開示とともに使用され得るＩＩ型膜貫通タンパク質の非限定的な例には、ＣＤ２５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１７８、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１３７、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＴＬ１、ＧＩＴＲＬ、及びそれらの組み合わせが含まれる。
本開示は、ある特定の細胞型（例えば、ＭＳＣからのＥＶ）に由来するＥＶでのみ発現されるエクソソーム小胞タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）が、エクソソーム小胞タンパク質（例えば、ＨＥＫ２９３からのＥＶ）を天然に発現しない他の細胞型に由来するＥＶで発現されるように操作できることを示す。本明細書で特定される１つ以上のＨＥＶＰは、産生細胞、産生条件、精製方法、またはＥＶ（例えば、エクソソーム）の意図された適用に応じて、選択的に使用することができる。例えば、特定のＥＶ（例えば、エクソソーム）の集団で豊富化されたＨＥＶＰは、特定のＥＶ（例えば、エクソソーム）の集団を精製するために使用することができる。特定のサイズ範囲、標的化部分、電荷密度、ペイロードなどを有するある特定のＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面で豊富化されたＨＥＶＰは、本開示のいくつかの実施形態で特定され、使用することができる。いくつかの実施形態において、治療用ＥＶ（例えば、エクソソーム）の生成、精製、及び単離のために、２つ以上のＨＥＶＰを同時に、または続けて使用することができる。
７．４．表面操作及び／または内腔操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）
本開示の別の態様は、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）の生成及び使用に関する。いくつかの態様において、本開示は、内腔操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）の生成及び使用に関する。表面操作及び／または内腔操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、その組成物で改変された膜を有する。例えば、それらの膜組成物は、膜のタンパク質、脂質、またはグリカン含有量を変化させることによって改変することができる。
いくつかの実施形態において、表面操作及び／または内腔操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＰＥＧ誘導性融合及び／または超音波融合などの化学的及び／または物理的方法によって生成される。
他の実施形態において、表面操作ＥＶ及び／または内腔操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、遺伝子操作によって生成される。遺伝子改変産生細胞または遺伝子改変細胞の子孫から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、改変された膜組成物を含有することができる。いくつかの態様において、遺伝子改変産生細胞または遺伝子改変細胞の子孫は、細胞内に天然に認められない１つ以上の外因性タンパク質を含む。ある特定の態様において、１つ以上の外因性タンパク質は、本明細書に開示される異種エクソソーム小胞タンパク質（ＨＥＶＰ）などの足場部分である。いくつかの実施形態において、表面操作及び／または内腔操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、（ＨＥＶＰを自然に発現する細胞におけるＨＥＶＰ発現の密度と比較して）より高いかもしくは低い密度でＨＥＶＰを有するか、またはＨＥＶＰの変異体もしくは断片を含む。
例えば、表面操作及び／または内腔操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＨＥＶＰまたはＨＥＶＰの変異体もしくは断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞から産生することができる。外因性配列から発現されるタンパク質を含むＥＶ（例えば、エクソソーム）は、改変された膜タンパク質組成物を含むことができる。
ＨＥＶＰの様々な改変または断片は、本開示の実施形態のために使用することができる。例えば、結合剤に対する増強された親和性を有するように改変されたタンパク質は、結合剤を使用して精製され得る表面操作及び／または内腔操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を生成するために使用することができる。ＥＶ（例えば、エクソソーム）及び／または膜をより効果的に標的化するように改変されたタンパク質を使用することができる。ＥＶ（例えば、エクソソーム）膜への特異的かつ効果的な標的化に必要とされる最小限の断片を含むように改変されたタンパク質も使用することができる。いくつかの態様において、カーゴまたは任意の他の外因性生物学的活性分子（例えば、本明細書に開示されるもの）を固定することができるＨＥＶＰ（その断片及び変異体を含む）は、表面操作及び／または内腔操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を構築する際に使用することができる。ある特定の態様において、ある特定のクラスのタンパク質を固定することができるＨＥＶＰ（その断片及び変異体を含む）を使用することができる。
例えば、いくつかの態様において、ＨＥＶＰは、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、かかるＨＥＶＰを使用して、Ｉ型タンパク質の細胞外ドメインをＥＶ（例えば、エクソソーム）に固定することができる。ある特定の態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）上のＩ型タンパク質の細胞外ドメインの発現は、タンパク質が異なる種類の足場部分（例えば、非Ｉ型膜貫通ＨＥＶＰ）に固定されている場合の対応する発現と比較して、またはタンパク質を天然に発現するＥＶ（例えば、エクソソーム）産生細胞でタンパク質が過剰発現されている場合の対応する発現と比較して、Ｉ型膜貫通ＨＥＶＰに固定されている場合に増加される。
いくつかの態様において、ＨＥＶＰはＩＩ型膜貫通タンパク質であり、かかるＨＥＶＰを使用して、ＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインをＥＶ（例えば、エクソソーム）に固定することができる。ある特定の態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）上のＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインの発現は、タンパク質が異なる種類の足場部分（例えば、非ＩＩ型膜貫通ＨＥＶＰ）に固定されている場合の対応する発現と比較して、またはタンパク質を天然に発現するＥＶ（例えば、エクソソーム）産生細胞でタンパク質が過剰発現されている場合の対応する発現と比較して、ＩＩ型膜貫通ＨＥＶＰに固定されている場合に増加される。
いくつかの態様において、ＨＥＶＰは、ＩＩＩ型膜貫通タンパク質であり、かかるＨＥＶＰを使用して、ＩＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインをＥＶ（例えば、エクソソーム）に固定することができる。ある特定の態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）上のＩＩＩ型タンパク質の細胞外ドメインの発現は、タンパク質が異なる種類の足場部分（例えば、非ＩＩＩ型膜貫通ＨＥＶＰ）に固定されている場合の対応する発現と比較して、またはタンパク質を天然に発現するＥＶ（例えば、エクソソーム）産生細胞でタンパク質が過剰発現されている場合の対応する発現と比較して、ＩＩＩ型膜貫通ＨＥＶＰに固定されている場合に増加される。
いくつかの態様において、ＨＥＶＰはＩＶ型膜貫通タンパク質であり、かかるＨＥＶＰを使用して、ＩＶ型タンパク質の細胞外ドメインをＥＶ（例えば、エクソソーム）に固定することができる。ある特定の態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）上のＩＶ型タンパク質の細胞外ドメインの発現は、タンパク質が異なる種類の足場部分（例えば、非ＩＶ型膜貫通ＨＥＶＰ）に固定されている場合の対応する発現と比較して、またはタンパク質を天然に発現するＥＶ（例えば、エクソソーム）産生細胞でタンパク質が過剰発現されている場合の対応する発現と比較して、ＩＶ型膜貫通ＨＥＶＰに固定されている場合に増加される。
融合タンパク質も使用することができ、例えば、親和性タグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、Ｓ－ペプチド、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）、ＭＢＰ、ＳＵＭＯ、及びプロテインＡ）に融合されたＨＥＶＰまたはそれらの断片は、親和性タグに特異的な結合剤を用いて、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）の精製または除去のために使用することができる。
治療活性を有する融合タンパク質は、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）の生成のためにも、使用することができる。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、融合タンパク質を発現するように操作または改変されており、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ以上）の治療用分子を標的に送達するために使用することができる。例えば、融合タンパク質は、ＨＥＶＰ（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体）、及び治療用化合物（例えば、ペプチド）を含むことができる。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＣＤ１３（またはその断片もしくは変異体）及び治療用化合物を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、Ｍｍｅ（またはその断片もしくは変異体）及び治療用化合物を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＥＮＰＰ１（またはその断片もしくは変異体）及び治療用化合物を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＮＲＰ１（またはその断片もしくは変異体）及び治療用化合物を含む。いくつかの態様において、治療用化合物は、ＨＥＶＰに直接融合される。いくつかの態様において、治療用化合物は、リンカー（例えば、本明細書に開示されるもの）を介してＨＥＶＰに固定される。
いくつかの態様において、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、少なくとも約６５個、少なくとも約７０個、少なくとも約７５個、少なくとも約８０個、少なくとも約８５個、少なくとも約９０個、少なくとも約９５個、または少なくとも約１００個のアミノ酸を含むことができる。
いくつかの態様において、ペプチドリンカーは合成、すなわち非天然発生である。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直鎖配列を、天然に連結されていないかまたは天然では遺伝的に融合されていないアミノ酸の第２の直鎖配列に、連結または遺伝子的に融合するアミノ酸配列を含む、ペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然発生または非天然発生ペプチド）を含む。例えば、いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、天然発生ポリペプチドの改変形態（例えば、付加、置換、または欠失などの変異を含む）である、非天然発生ポリペプチドを含むことができる。
リンカーは、切断を受け易いものであり得（「切断可能なリンカー」）、それによって、外因性生物学的活性分子（例えば、標的化部分、治療用分子、アジュバント、または免疫調節物質）の放出を促進することができる。
いくつかの態様において、リンカーは、「還元感受性リンカー」である。いくつかの態様において、還元感受性リンカーは、ジスルフィド結合を含有する。いくつかの態様において、リンカーは「酸に不安定なリンカー」である。いくつかの態様において、酸に不安定なリンカーは、ヒドラゾンを含有する。好適な酸に不安定なリンカーにはまた、例えば、シスアコニットリンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはこれらの任意の組み合わせも含まれる。
いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーを含む。
いくつかの態様において、治療用ペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、または治療用化合物に対するリンカーからなる群から選択される。治療用化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、または小分子であることができる。治療用ペプチドは、抗体、酵素、リガンド、受容体、抗微生物ペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体であることができる。いくつかの実施形態において、治療用ペプチドは、核酸結合タンパク質である。核酸結合タンパク質は、ダイサー、アルゴノートタンパク質、ＴＲＢＰ、またはＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質であることができる。いくつかの実施形態において、核酸結合タンパク質は、１つ以上のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を追加的に含む。１つ以上のＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチドコンジュゲート化ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、ガイドＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであることができる。
いくつかの実施形態において、治療用ペプチドは、タンパク質－タンパク質相互作用システムの一部である。いくつかの実施形態において、タンパク質－タンパク質相互作用システムは、ＦＲＢ－ＦＫＢＰ相互作用システム、例えば、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００５ Ａｐｒ ６；１２７（１３）：４７１５－２１に記載されるＦＲＢ－ＦＫＢＰ相互作用システムである。
いくつかの態様において、ＨＥＶＰに固定され、ＥＶ（例えば、エクソソーム）で発現され得る治療用分子は、抗原を含む。ある特定の態様において、抗原は、腫瘍抗原を含む。腫瘍抗原の非限定的な例には、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソセリン、ＶＥＧＦＲ、α葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん精巣抗原（ＣＴＡ）、ＭＡＲＴ－１ ｇｐ１００、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド、ブラキュリ（好ましくは、黒色腫で発現された抗原（ＰＲＡＭＥ））、またはそれらの組み合わせが含まれる。さらなる態様において、抗原は、ネオ抗原を含むことができる。本明細書で使用される場合、「ネオ抗原」という用語は、腫瘍特異的変異遺伝子によってコードされる抗原を指す。いくつかの態様において、抗原は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、またはそれらの任意の組み合わせに由来する。いくつかの態様において、抗原は、発がん性ウイルスに由来する。さらなる態様において、抗原は、ヒトγヘルペスウイルス４（エプスタイン・バーウイルス）、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、サイトメガロウイルス、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、コロナウイルス（例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ ＣｏＶ）、フィロウイルス（例えば、マールブルク及びエボラ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉａ種（例えば、ｖｉｖａｘ及びｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、チクングニヤウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトヘルペスウイルス８、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ２）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｐｒｏｔｅｕｓ種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ種、コアグラーゼ陰性ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（ＣｏＮＳ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ種、またはそれらの組み合わせを含む群に由来する。
いくつかの態様において、治療用分子は、免疫抑制剤を含む。したがって、ある特定の態様において、本明細書に開示されるＥＶは、ＨＥＶＰ及び免疫抑制剤を含む。
他の好適な治療用分子の非限定的な例には、抗腫瘍剤、抗炎症剤、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト、イオンチャネル調節剤、及び神経活性剤を含む、薬理学的に活性な薬剤及び遺伝子的に活性な分子が含まれる。治療剤の好適なペイロードの例には、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，」Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９９６），Ｎｉｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、そのセクション：Ｄｒｕｇｓ Ａｃｔｉｎｇ ａｔ Ｓｙｎａｐｔｉｃ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｉｔｅｓ、Ｄｒｕｇｓ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｕｔａｃｏｉｄｓ、Ｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｗａｔｅｒ，Ｓａｌｔｓ ａｎｄ Ｉｏｎｓ、Ｄｒｕｇｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｒｅｎａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇｓ、Ｄｒｕｇｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｄｒｕｇｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｄｒｕｇｓ Ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｄｒｕｇｓ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ Ｂｌｏｏｄ－Ｆｏｒｍｉｎｇ ｏｒｇａｎｓ、Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ、Ｖｉｔａｍｉｎｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ；ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙに記載されているものが含まれ、全てが参照により本明細書に組み込まれる。好適なペイロードには、毒素、ならびに生物学的及び化学的兵器剤がさらに含まれ、例えば、Ｓｏｍａｎｉ，Ｓ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗａｒｆａｒｅ Ａｇｅｎｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照する。
いくつかの態様において、治療用分子は、自己抗原を含む。本明細書で使用される場合、「自己抗原」という用語は、宿主細胞または組織によって発現される抗原を指す。正常な健康状態下では、かかる抗原は、体によって自己として認識され、免疫応答を誘発しない。しかしながら、特定の疾患条件下では、体自身の免疫系は自己抗原を外来物として認識し、それらに対する免疫応答を開始し得、自己免疫をもたらす。ある特定の態様において、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、自己抗原（すなわち、Ｔ細胞応答が誘導されて、自己免疫をもたらしている自己（生殖細胞系）タンパク質）を含むことができる。かかるＥＶ、例えば、エクソソームは、自己反応性Ｔ細胞を標的とし、それらの活性を抑制するために使用することができる。自己抗原（関連疾患または障害を含む）の非限定的な例には、β細胞タンパク質（Ｉ型糖尿病）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ、多発性硬化症）、滑膜タンパク質（関節リウマチ）、またはそれらの組み合わせが含まれる。
いくつかの態様において、治療用分子は、抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、治療用分子は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ、ナノボディ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、アゴニスト抗体、遮断抗体、標的化抗体、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、アゴニスト抗体は、ＣＤ４０Ｌアゴニストである。いくつかの態様において、遮断抗体は、プログラム死１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４、及びそれらの任意の組み合わせから選択される標的タンパク質に結合する。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、抗ＩＬ１２抗体またはその抗原結合断片、及び抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはその抗原結合断片を含む。
融合タンパク質は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面を標的とし、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に治療活性を提供することができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片もしくは改変を含まない。
いくつかの実施形態において、標的化部分を有する融合タンパク質が使用される。例えば、融合タンパク質は、ＨＥＶＰ（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体）、及び標的化部分を含むことができる。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＣＤ１３及び標的化部分を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＭＭＥ及び標的化部分を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＥＮＰＰ１及び標的化部分を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＮＲＰ１及び標的化部分を含む。標的化部分は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を使用する治療のため、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を特定の器官、組織、または細胞に標的化するために使用することができる。ある特定の態様において、標的化部分は、細胞または細胞集団で発現されるマーカー（または標的分子）に結合する。ある特定の態様において、マーカーは、複数の細胞型、例えば、全ての抗原存在細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、及びＢリンパ球）で発現される。いくつかの態様において、マーカーは、特定の細胞集団（例えば、樹状細胞）でのみ発現される。特定の細胞集団（例えば、樹状細胞）で発現されるマーカーの非限定的な例には、Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（ＣＬＥＣ９Ａ）タンパク質、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－捕捉性非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ２０７、ＣＤ４０、Ｃｌｅｃ６、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＤＥＣ－２０５、レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体－１（ＬＯＸ－１）、ＭＡＲＣＯ、Ｃｌｅｃ１２ａ、ＤＣ－アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ－ＡＳＧＰＲ）、ＤＣ免疫受容体２（ＤＣＩＲ２）、デクチン－１、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、ＢＤＣＡ－１（ＣＤ３０３、Ｃｌｅｃ４ｃ）、デクチン－２、Ｂｓｔ－２（ＣＤ３１７）、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、抗体またはその抗原結合断片である。抗体及びそれらの抗原結合断片は、抗体全体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、それらの断片を含み、さらに、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片である、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、及びＦ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片など、ダイアボディ、ならびに抗体関連ポリペプチドが含まれる。抗体及びそれらの抗原結合断片は、所望の生物学的活性または機能を呈する限り、二重特異性抗体と多重特異性抗体も含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＨＥＶＰ（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体）及び１つ以上の外因性生物学的活性分子を含むことができる。ある特定の態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現され得る外因性生物学的活性分子は、アジュバントである。したがって、いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＣＤ１３（またはその断片もしくは変異体）及びアジュバントを含む。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＭＭＥ（またはその断片もしくは変異体）及びアジュバントを含む。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＮＰＰ１（またはその断片もしくは変異体）及びアジュバントを含む。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＮＲＰ１（またはその断片もしくは変異体）及びアジュバントを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、２、３、４、５つ、またはそれ以上の異なるアジュバントを含む。本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、カーゴの治療効果を増強する（例えば、抗原に対する免疫応答を増加させる）任意の物質を指す。
いくつかの態様において、本開示のために有用なアジュバントは、細胞質パターン認識受容体の活性化を誘導する。細胞質パターン認識受容体の非限定的な例には、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－１）、黒色腫分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン、ロイシンリッチリピート及びピリンドメイン含有（ＮＬＲＰ）、インフラマソーム、またはそれらの組み合わせが含まれる。ある特定の態様において、アジュバントは、ＳＴＩＮＧアゴニストである。インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）は、細菌によって典型的に産生される環状ジヌクレオチドの細胞質センサである。活性化すると、それはＩ型インターフェロンの産生につながり、免疫応答を開始する。ある特定の態様において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む。
いくつかの態様において、アジュバントは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む。ＴＬＲアゴニストの非限定的な例には、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、リポテイコ酸、不定型ＬＰＳ、ＭＡＬＰ－２及びＭＡＬＰ－４０４、ＯｓｐＡ、ポリン、ＬｃｒＶ、リポマンナン、ＧＰＩアンカー、リゾホスファチジルセリン、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、ザイモサン、ｈｓｐ６０、ｇＨ／ｇＬ糖タンパク質、ヘマグルチニン）、ＴＬＲ３アゴニスト（例えば、二本鎖ＲＮＡ、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ））、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポテイコ酸、β－ディフェンシン２、フィブロネクチンＥＤＡ、ＨＭＧＢ１、スナピン、テナシンＣ）、ＴＬＲ５アゴニスト（例えば、フラゲリン）、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト（例えば、一本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ－Ａ、ポリＧ１０、ポリＧ３、レシキモド）、ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ）、及びそれらの組み合わせが含まれる。ＴＬＲアゴニストの非限定的な例は、ＷＯ２００８／１１５３１９Ａ２、ＵＳ２０１３／０２０２７０７Ａ１、ＵＳ２０１２／０２１９６１５Ａ１、ＵＳ２０１０／００２９５８５Ａ１、ＷＯ２００９／０３０９９６Ａ１、ＷＯ２００９／０８８４０１Ａ２、及びＷＯ２０１１／０４４２４６Ａ１に認めることができ、その各々は参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片もしくは改変を含まない。
いくつかの態様において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＨＥＶＰ（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片もしくは変異体）及び１つ以上の外因性生物学的活性分子を含むことができ、１つ以上の外因性生物学的活性分子は、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ以上）の免疫調節物質を含む。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＣＤ１３（またはその断片もしくは変異体）及び免疫調節物質を含む。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＭＭＥ（またはその断片もしくは変異体）及び免疫調節物質を含む。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＮＰＰ１（またはその断片もしくは変異体）及び免疫調節物質を含む。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＮＲＰ１（またはその断片もしくは変異体）及び免疫調節物質を含む。ある特定の態様において、１つ以上の免疫調節物質は、本明細書に開示される他の外因性生物学的活性分子（例えば、標的化部分、治療用分子、及び／またはアジュバント）と組み合わせて発現される。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤を含む。ある特定の態様において、負のチェックポイント調節因子には、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ＣＤ７３、またはそれらの組み合わせが含まれる。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤である。ある特定の態様において、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ＣＴＬＡ－４のモノクローナル抗体（「抗ＣＴＬＡ－４抗体」）である。ある特定の態様において、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の態様において、抗体断片は、ＣＴＬＡ－４のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の態様において、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブである。他の態様において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、トレメリムマブである。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）の阻害剤である。いくつかの態様において、免疫調節物質は、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の阻害剤である。いくつかの態様において、免疫調節物質は、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）の阻害剤である。ある特定の態様において、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２の阻害剤は、ＰＤ－１のモノクローナル抗体（「抗ＰＤ－１抗体」）、ＰＤ－Ｌ１のモノクローナル抗体（「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」）、またはＰＤ－Ｌ２のモノクローナル抗体（「抗ＰＤ－Ｌ２抗体」）である。いくつかの態様において、阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または抗ＰＤ－Ｌ２抗体の断片である。ある特定の態様において、抗体断片は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の態様において、阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブである。いくつかの態様において、抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブである。いくつかの態様において、抗ＰＤ－１抗体は、ピディリズマブである。いくつかの態様において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブである。他の態様において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アベルマブである。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）の阻害剤である。ある特定の態様において、ＬＡＧ３の阻害剤は、ＬＡＧ３のモノクローナル抗体（「抗ＬＡＧ３抗体」）である。いくつかの態様において、阻害剤は、抗ＬＡＧ３抗体の断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の実施形態において、阻害剤は、ＬＡＧ３に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）の阻害剤である。いくつかの態様において、免疫調節物質は、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）の阻害剤である。いくつかの態様において、免疫調節物質は、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）を有するＴ細胞免疫受容体の阻害剤である。いくつかの態様において、免疫調節物質は、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）の阻害剤である。いくつかの態様において、免疫調節物質は、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）の阻害剤である。いくつかの態様において、免疫調節物質は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の阻害剤である。いくつかの態様において、免疫調節物質は、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ因子（ＩＤＯ）の阻害剤である。いくつかの態様において、免疫調節物質は、ＣＤ２０、ＣＤ３９、またはＣＤ７３の阻害剤である。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、正の共刺激分子のための活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーのための活性化剤を含む。ある特定の態様において、正の共刺激分子は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー（例えば、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲ）を含む。いくつかの態様において、正の共刺激分子のための活性化剤は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー（例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦ－Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４－１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ－２）である。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）の活性化剤である。ある特定の態様において、ＯＸ４０の活性化剤は、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体である。さらなる態様において、ＯＸ４０の活性化剤は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）である。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、ＣＤ２７の活性化剤である。ある特定の態様において、ＣＤ２７の活性化剤は、アゴニスト抗ＣＤ２７抗体である。他の態様において、ＣＤ２７の活性化剤は、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）である。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、ＣＤ４０の活性化剤である。ある特定の態様において、ＣＤ４０の活性化剤は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。いくつかの態様において、ＣＤ４０の活性化剤は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。ある特定の態様において、ＣＤ４０Ｌは、単量体ＣＤ４０Ｌである。他の態様において、ＣＤ４０Ｌは、三量体ＣＤ４０Ｌである。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）の活性化剤である。ある特定の態様において、ＧＩＴＲの活性化剤は、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体である。他の態様において、ＧＩＴＲの活性化剤は、ＧＩＴＲの天然リガンドである。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、４－１ＢＢの活性化剤である。具体的な態様において、４－１ＢＢの活性化剤は、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体である。ある特定の態様において、４－１ＢＢの活性化剤は、４－１ＢＢの天然リガンドである。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、Ｆａｓ受容体（Ｆａｓ）である。かかる態様において、Ｆａｓ受容体は、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面に提示される。いくつかの態様において、免疫調節物質は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）である。ある特定の態様において、Ｆａｓリガンドは、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面に提示される。いくつかの態様において、免疫調節物質は、抗Ｆａｓ抗体または抗ＦａｓＬ抗体である。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、ＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子の活性化剤である。ある特定の態様において、ＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子は、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である。ある特定の態様において、免疫調節物質は、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、誘導性Ｔ細胞共刺激物質（ＩＣＯＳ）の活性化剤である。ある特定の態様において、ＩＣＯＳの活性化剤は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体である。他の態様において、ＩＣＯＳの活性化剤は、ＩＣＯＳリガンド（ＩＣＯＳＬ）である。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、ＣＤ２８の活性化剤である。いくつかの態様において、ＣＤ２８の活性化剤は、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体である。他の態様において、ＣＤ２８の活性化剤は、ＣＤ２８の天然リガンドである。ある特定の態様において、ＣＤ２８のリガンドは、ＣＤ８０である。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーを含む。ある特定の態様において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはＩＦＮ－γを含む。いくつかの態様において、免疫調節物質は、ＦＬＴ－３（ＣＤ１３５）を含む。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、胚中心応答に必要とされる細胞内相互作用を支持するタンパク質を含む。ある特定の態様において、かかるタンパク質は、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーメンバーまたはＳＬＡＭ関連タンパク質（ＳＡＰ）を含む。いくつかの態様において、ＳＬＡＭファミリーメンバーは、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９（Ｌｙ９）、Ｌｙ１０８、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ－Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ、ＣＤ２Ｆ－１０、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその誘導体である。ある特定の態様において、免疫調節物質は、ＴＣＲα鎖またはその誘導体である。他の態様において、免疫調節物質は、ＴＣＲβ鎖またはその誘導体である。さらなる態様において、免疫調節物質は、Ｔ細胞の共受容体またはその誘導体である。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはその誘導体である。ある特定の態様において、ＣＡＲは、本明細書に開示される治療用分子（例えば、腫瘍抗原、例えば、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソセリン、ＶＥＧＦＲ、α葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん精巣抗原、ＭＡＲＴ－１ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド）のうちの１つ以上に結合する。
ある特定の態様において、免疫調節物質は、ＣＤ２８の活性化剤である。ある特定の態様において、活性剤は、ＣＤ２８のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の態様において、抗体断片は、ＣＤ２８のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の態様において、活性剤は、ＣＤ２８に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、ＮＦ－κＢ阻害剤を含む。本開示によって使用することができるＮＦ－κＢ阻害剤の非限定的な例は、ＩＫＫ複合体阻害剤（例えば、ＴＰＣＡ－１、ＮＦ－κＢ活性化阻害剤ＶＩ（ＢＯＴ－６４）、ＢＭＳ３４５５４１、アンレキサノクス、ＳＣ－５１４（ＧＫ０１１４０）、ＩＭＤ０３５４、ＩＫＫ－１６）、ＩκＢ分解阻害剤（例えば、ＢＡＹ１１－７０８２、ＭＧ－１１５、ＭＧ－１３２、ラクタシスチン、エポキソミシン、パルテノリド、カルフィルゾミブ、ＭＬＮ－４９２４（ペボネディスタット））、ＮＦ－κＢ核トランスロケーション阻害剤（例えば、ＪＳＨ－２３、ロリプラム）、ｐ６５アセチル化阻害剤（例えば、没食子酸、アナカルジン酸）、ＮＦ－κＢ－ＤＮＡ結合阻害剤（例えば、ＧＹＹ４１３７、ｐ－ＸＳＣ、ＣＶ３９８８、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２））、ＮＦ－κＢトランス活性化阻害剤（例えば、ＬＹ２９４００２、ワートマニン、メサラミン）、またはそれらの組み合わせを含む。Ｇｕｐｔａ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７９９：７７５－７８７（２０１０）を参照し、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。さらなる態様において、免疫調節物質は、ＣＯＸ－２阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン及び誘導体）、プロスタグランジン、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、抗ロイコトリエン、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、アゴニストである。ある特定の態様において、アゴニストは、ホルモンまたは神経伝達物質などの内因性アゴニストである。他の態様において、アゴニストは、薬剤などの外因性アゴニストである。いくつかの態様において、アゴニストは、物理的アゴニストであり、受容体に結合することなくアゴニスト応答を作成することができる。いくつかの実施形態において、アゴニストは、スーパーアゴニストであり、内因性アゴニストよりも大きな最大応答を生じることができる。ある特定の態様において、アゴニストは、受容体で完全な効力を有する完全アゴニストである。他の態様において、アゴニストは、完全アゴニストと比較して、受容体で部分的効力のみを有する部分アゴニストである。いくつかの態様において、アゴニストは、受容体の恒常的活性を阻害することができる逆アゴニストである。いくつかの態様において、アゴニストは、受容体に対する効果を生じるために他のコアゴニストとともに作用するコアゴニストである。ある特定の態様において、アゴニストは、共有結合の形成を通じて受容体に永久的に結合する不可逆的アゴニストである。ある特定の態様において、アゴニストは、特定の種類の受容体に対する選択的アゴニストである。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、アンタゴニストである。具体的な態様において、アンタゴニストは、競合的アンタゴニストであり、受容体を活性化することなく内因性リガンドまたはアゴニストと同じ結合部位で受容体に可逆的に結合する。競合的アンタゴニストは、最大応答を達成するために必要なアゴニストの量に影響できる。他の態様において、アンタゴニストは、非競合的アンタゴニストであり、受容体の活性部位または受容体のアロステリック部位に結合する。非競合的アンタゴニストは、任意の量のアゴニストによって達成され得る最大応答の規模を低下できる。さらなる態様において、アンタゴニストは、不競合的アンタゴニストであり、別個のアロステリック結合部位へのその結合の前に、アゴニストによる受容体活性化を必要とする。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、抗体または抗原結合断片を含む。免疫調節物質は、全長タンパク質またはその断片であることができる。抗体または抗原結合断片は、天然の供給源に由来するか、または部分的もしくは全体的に合成的に産生され得る。いくつかの態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。これらの態様のいくつかにおいて、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ抗体である。ある特定の態様において、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。いくつかの他の態様において、抗体は、ポリクローナル抗体である。ある特定の態様において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片から選択される。ある特定の態様において、抗原結合断片は、ｓｃＦｖまたは（ｓｃＦｖ）２断片である。ある特定の他の態様において、抗体または抗原結合断片は、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）（単一ドメイン抗体）である。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、二重特異性もしくは多重特異性抗体である。
様々な態様において、抗体または抗原結合断片は、完全にヒトである。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、ヒト化される。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、キメラである。これらの態様のいくつかにおいて、キメラ抗体は、非ヒトＶ領域ドメイン及びヒトＣ領域ドメインを有する。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、マウスまたは獣医学などの、非ヒトである。
ある特定の態様において、免疫調節物質は、ポリヌクレオチドである。これらの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドには、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチドコンジュゲート化ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｄｓＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｌｎｃＲＮＡ）である。これらの態様のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、それは所望のポリペプチドに翻訳され得る。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはプレｍｉＲＮＡ分子である。これらの態様のいくつかにおいて、ｍｉＲＮＡは、標的細胞の細胞質に送達され、ｍｉＲＮＡ分子が標的細胞においてネイティブｍＲＮＡを発現停止することができる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、がん遺伝子または他の制御不全ポリペプチドの発現に干渉できる、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。これらの態様のいくつかにおいて、ｓｉＲＮＡは、標的細胞の細胞質に送達され、ｓｉＲＮＡ分子が標的細胞においてネイティブｍＲＮＡを発現停止することができる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡである。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御し、疾患を調節することができる長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡに転写され得るＤＮＡである。これらの態様のいくつかにおいて、転写されたＲＮＡは、所望のポリペプチドに翻訳され得る。
いくつかの態様において、免疫調節物質は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、表面操作されたエクソソーム）は、当技術分野で既知のＥＶ（例えば、表面操作されたエクソソーム）と比較して優れた特徴を実証する。例えば、本明細書で提供されるＨＥＶＰを使用して産生されるＥＶ（例えば、表面操作されたエクソソーム）は、従来技術におけるＥＶ（例えば、エクソソーム）、例えば、従来のエクソソームタンパク質を使用して産生されるものよりも、それらの表面で高度に豊富化される改変タンパク質を含有する。いくつかの態様において、改変タンパク質の発現レベルは、従来のエクソソームタンパク質を使用した対応するタンパク質の発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％以上増加（すなわち、豊富化）される。
さらに、いくつかの態様において、本開示のＥＶ（例えば、表面操作されたエクソソーム）は、当技術分野で既知のＥＶ（例えば、表面操作されたエクソソーム）と比較して、より大きい、より特異的、またはより制御された生物学的活性を有することができる。例えば、本明細書に記載のＨＥＶＰタンパク質またはその断片（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはそれらの断片）に融合された治療用または生物学的に関連する外因性配列を含む表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、当技術分野で既知の足場への融合よりも多くの所望の操作された特性を有することができる。当技術分野で既知の足場タンパク質には、テトラスパニン分子（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９など）、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２及びＬＡＭＰ２Ｂ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン及びそれらの断片、ならびにこれらのタンパク質またはそれらの断片のいずれかに親和性を有するペプチドが含まれる。以前は、外因性タンパク質の過剰発現は、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生するために、ＥＶ（例えば、エクソソーム）上への外因性タンパク質の確率的またはランダムな配置に依存していた。これは、ＥＶに外因性タンパク質（例えば、エクソソーム）の低レベルで予測不可能な密度をもたらした。したがって、本明細書に記載されるＨＥＶＰタンパク質及びそれらの断片は、新規のＥＶ（例えば、エクソソーム）組成物及びその作製方法における重要な進歩を提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書で特定される外因性配列（例えば、外因性生物学的活性分子、例えば、抗原、アジュバント、標的化部分、及び／または免疫調節物質をコードする）及びＨＥＶＰを含有する融合タンパク質を含む表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、当技術分野で既知の従来のＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、またはそれらに結合するペプチド）にコンジュゲートされる外因性配列を含む同様に操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）よりも高い密度の融合タンパク質を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＨＥＶＰを含有する融合タンパク質は、従来のＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質を使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面上の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面上に、約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＨＥＶＰを含有する融合タンパク質は、従来のＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質を使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面上の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に、約２～約４倍、約４～約８倍、約８～約１６倍、約１６～約３２倍、約３２～約６４倍、約６４～約１００倍、約１００～約２００倍、約２００～約４００倍、約４００～約８００倍、約８００～約１０００倍、またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、それらの変異体、断片、断片の変異体、または改変の融合タンパク質は、ＣＤ９を使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、それらの変異体、断片、断片の変異体、または改変の融合タンパク質は、ＣＤ６３を使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、それらの変異体、断片、断片の変異体、または改変の融合タンパク質は、ＣＤ８１を使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、それらの変異体、断片、断片の変異体、または改変の融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲを使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、それらの変異体、断片、断片の変異体、または改変の融合タンパク質は、ＧＰＩアンカータンパク質を使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、それらの変異体、断片、断片の変異体、または改変の融合タンパク質は、ラクトアドヘリンを使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、それらの変異体、断片、断片の変異体、または改変の融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２を使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、それらの変異体、断片、断片の変異体、または改変の融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２Ｂを使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、それらの変異体、断片、断片の変異体、または改変の融合タンパク質は、従来のＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質の断片を使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面上の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、それらの変異体、断片、断片の変異体、または改変の融合タンパク質は、従来のＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質の変異体を使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面上の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。
特定の実施形態において、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、それらの変異体、断片、断片の変異体、または改変の融合タンパク質は、従来のＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質（例えば、ＣＤ６３などのテトラスパニン分子）を使用して同様に改変された他のＥＶ（例えば、エクソソーム）表面上の融合タンパク質よりも、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。
本明細書で提供される融合タンパク質は、ＨＥＶＰ（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはその断片もしくは変異体）、及び追加のペプチド（例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質などの本明細書に開示される外因性生物学的活性分子）を含むことができる。追加のペプチドは、ＨＥＶＰまたはその断片もしくは変異体のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに結合することができる。追加のペプチドは、ＨＥＶＰに結合したＥＶ（例えば、エクソソーム）の内側（内腔側内）または外側に位置することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供する融合タンパク質は、ＨＥＶＰ（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、もしくはＮＲＰ１、またはその断片もしくは変異体）、及び２つの追加のペプチド（例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質などの本明細書に開示される外因性生物学的活性分子）を含む。例えば、いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＣＤ１３（またはその断片もしくは変異体）及び２つの追加のペプチドを含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＭＭＥ（またはその断片もしくは変異体）及び２つの追加のペプチドを含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＥＮＰＰ１（またはその断片もしくは変異体）及び２つの追加のペプチドを含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＮＲＰ１（またはその断片もしくは変異体）及び２つの追加のペプチドを含む。２つの追加のペプチドの両方は、ＨＥＶＰ、またはその断片もしくは変異体のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに結合することができる。いくつかの実施形態において、２つの追加のペプチドの一方は、Ｎ末端に結合され、２つの追加のペプチドの他方は、ＨＥＶＰまたはその断片もしくは変異体のＣ末端に結合される。追加のペプチドは、ＨＥＶＰに結合したＥＶ（例えば、エクソソーム）の内側（内腔側内）もしくは外側、または両方に位置することができる。
７．５．表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）の産生のための産生細胞
本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、インビトロで増殖した細胞または対象の体液から産生することができる。ＥＶ（例えば、エクソソーム）がインビトロ細胞培養から産生される場合、様々な産生細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＨＴ－１０８０細胞、ＭＢ－２３１細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、及びＣＡＰ細胞を本開示のために使用することができる。いくつかの態様において、産生細胞は、ＨＥＫ２９３細胞株である。いくつかの態様において、産生は、ＭＳＣである。
産生細胞は、１つ以上の外因性配列を含むように遺伝子改変して、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生することができる。いくつかの態様において、１つ以上の外因性配列は、本明細書に開示されるＨＥＶＰをコードする。いくつかの態様において、１つ以上の外因性配列は、本明細書に開示される外因性生物学的活性分子（例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）をコードする。いくつかの態様において、１つ以上の外因性配列は、本明細書に開示されるＨＥＶＰ及び外因性生物学的活性分子の両方をコードする。遺伝子改変産生細胞は、一過性または安定的な形質転換によって導入される外因性配列を含むことができる。外因性配列は、プラスミドとして産生細胞に導入することができる。外因性配列は、産生細胞のゲノム配列に、標的化部位で、またはランダムな部位に、安定して組み込むことができる。いくつかの実施形態において、安定な細胞株は、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）の産生のために生成される。
いくつかの態様において、本明細書に開示される遺伝子改変産生細胞は、内因性レベルのＨＥＶＰを発現する。かかる態様において、外因性配列は、産生細胞のゲノム配列に挿入され、ＨＥＶＰをコードする内因性配列の中、上流（５’末端）または下流（３’末端）に配置され得る。当技術分野で既知の様々な方法を、産生細胞への外因性配列の導入のために使用することができる。例えば、様々な遺伝子編集法（例えば、相同組換え、トランスポゾン媒介システム、ｌｏｘＰ－Ｃｒｅシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮを使用する方法）を使用して改変された細胞は、本開示の範囲内である。
外因性配列は、ＨＥＶＰまたはＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質の変異体もしくは断片をコードする配列を含むことができる。ＨＥＶＰをコードする配列の過剰コピーを導入して、ＨＥＶＰをより高い密度で有する表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生することができる。ＨＥＶＰの変異体または断片をコードする外因性配列を導入して、ＨＥＶＰの改変または断片を含有する表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生することができる。親和性タグをコードする外因性配列を導入して、ＨＥＶＰに結合した親和性タグを含む融合タンパク質を含有する表面改変されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生することができる。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、外因性生物学的活性分子（例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）をコードする外因性配列を導入して、ＨＥＶＰに結合された（例えば、直接的またはリンカーを介して）外因性生物学的活性分子を含む融合タンパク質を含有する表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生することができる。
いくつかの実施形態において、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、同じまたは同様の産生細胞型から単離された天然ＥＶ（例えば、エクソソーム）よりも高い密度のＨＥＶＰを有する。いくつかの実施形態において、ＨＥＶＰは、天然ＥＶ（例えば、エクソソーム）よりも、表面改変されたＥＶ（例えば、エクソソーム）に、約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＨＥＶＰは、天然ＥＶ（例えば、エクソソーム）よりも、表面改変されたＥＶ（例えば、エクソソーム）に、約２～約４倍、約４～約８倍、約８～約１６倍、約１６～約３２倍、約３２～約６４倍、約６４～約１００倍、約１００～約２００倍、約２００～約４００倍、約４００～約８００倍、約８００～約１，０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＨＥＶＰを含む融合タンパク質は、天然ＥＶ（例えば、エクソソーム）での非改変ＨＥＶＰよりも、表面改変されたＥＶ（例えば、エクソソーム）に、約２～約４倍、約４～約８倍、約８～約１６倍、約１６～約３２倍、約３２～約６４倍、約６４～約１００倍、約１００～約２００倍、約２００～約４００倍、約４００～約８００倍、約８００～約１０００倍、またはより高い密度で存在する。いくつかの実施形態において、ＨＥＶＰの断片または変異体は、天然ＥＶ（例えば、エクソソーム）での非改変ＨＥＶＰよりも、表面改変されたＥＶ（例えば、エクソソーム）に、約２～約４倍、約４～約８倍、約８～約１６倍、約１６～約３２倍、約３２～約６４倍、約６４～約１００倍、約１００～約２００倍、約２００～約４００倍、約４００～約８００倍、約８００～約１０００倍、またはより高い密度で存在する。
特定の実施形態において、ＣＤ１３、ＣＤ１３の断片もしくは変異体、またはその改変は、天然ＥＶ（例えば、エクソソーム）での非改変ＣＤ１３よりも、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）に、約２～約４倍、約４～約８倍、約８～約１６倍、約１６～約３２倍、約３２～約６４倍、約６４～約１００倍、約１００～約２００倍、約２００～約４００倍、約４００～約８００倍、約８００～約１０００倍、またはより高い密度で存在する。特定の実施形態において、ＭＭＥ、ＭＭＥの断片もしくは変異体、またはその改変は、天然ＥＶ（例えば、エクソソーム）での非改変ＭＭＥよりも、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）に、約２～約４倍、約４～約８倍、約８～約１６倍、約１６～約３２倍、約３２～約６４倍、約６４～約１００倍、約１００～約２００倍、約２００～約４００倍、約４００～約８００倍、約８００～約１０００倍、またはより高い密度で存在する。特定の実施形態において、ＥＮＰＰ１、ＥＮＰＰ１の断片もしくは変異体、またはその改変は、天然ＥＶ（例えば、エクソソーム）での非改変ＥＮＰＰ１よりも、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）に、約２～約４倍、約４～約８倍、約８～約１６倍、約１６～約３２倍、約３２～約６４倍、約６４～約１００倍、約１００～約２００倍、約２００～約４００倍、約４００～約８００倍、約８００～約１０００倍、またはより高い密度で存在する。特定の実施形態において、ＮＲＰ１、ＮＲＰ１の断片もしくは変異体、またはその改変は、天然ＥＶ（例えば、エクソソーム）での非改変ＮＲＰ１よりも、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）に、約２～約４倍、約４～約８倍、約８～約１６倍、約１６～約３２倍、約３２～約６４倍、約６４～約１００倍、約１００～約２００倍、約２００～約４００倍、約４００～約８００倍、約８００～約１０００倍、またはより高い密度で存在する。
いくつかの実施形態において、産生細胞は、追加の外因性配列を含むようにさらに改変される。例えば、追加の外因性配列を導入して、内因性遺伝子発現を調節するか、またはペイロードとしてある特定のポリペプチドを含むＥＶ（例えば、エクソソーム）を産生することができる。いくつかの実施形態において、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変され、１つは、ＨＥＶＰまたはＨＥＶＰの変異体もしくは断片をコードし、他は、ペイロードをコードする。いくつかの実施形態において、産生細胞は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に追加の機能性、例えば、特異的標的化能力、送達機能、酵素機能、インビボでの半減期の増加または減少などを付与する追加の外因性配列を含むようにさらに改変され得る。いくつかの実施形態において、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変され、１つは、ＨＥＶＰまたはＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質の変異体もしくは断片をコードし他方は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に追加の機能性を付与するタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態において、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変され、２つの外因性配列の各々は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面に融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、産生細胞からの表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、同じまたは同様の細胞型の非改変細胞から単離された天然ＥＶ（例えば、エクソソーム）と比較して、ＨＥＶＰのより高い密度を有する。いくつかの実施形態において、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、同じまたは同様の細胞型の非改変細胞から単離された天然ＥＶ（例えば、エクソソーム）の約２倍、約４倍、約８倍、約１６倍、約３２倍、約６４倍、約１００倍、約２００倍、約４００倍、約８００倍、約１，０００倍、またはより高い密度でＨＥＶＰを含有する。いくつかの実施形態において、産生細胞は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個またはそれ以上の追加の外因性配列を含むようにさらに改変される。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、外因性配列は、本明細書に開示される１つ以上のＨＥＶＰをコードする。いくつかの態様において、外因性配列は、本明細書に開示される１つ以上の外因性生物学的活性分子（例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）をコードする。いくつかの態様において、外因性配列は、本明細書に開示されるＨＥＶＰ及び外因性生物学的活性分子の両方をコードする。
より具体的には、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１を含むが、これらに限定されない１つ以上のＨＥＶＰまたはそれらの変異体をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。本明細書に記載される１つ以上のＨＥＶＰのいずれかは、プラスミド、ゲノムに挿入された外因性配列、または合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの他の外因性核酸から産生細胞内で発現され得る。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＨＥＶＰは、その全長、内因性形態をコードする外因性配列で形質転換された細胞で発現される。いくつかの実施形態において、かかる外因性配列は、配列番号４７のＣＤ１３タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、かかる外因性配列は、配列番号４８のＭＭＥタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、かかる外因性配列は、配列番号４９のＥＮＰＰ１タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、かかる外因性配列は、配列番号５０のＮＲＰ１タンパク質をコードする。
表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１を含むがこれらに限定されない１つ以上のＨＥＶＰの断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生され得る。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＣＤ１３の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生される。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＭＭＥの断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生される。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＮＰＰ１の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生される。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＮＲＰ１の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生される。いくつかの実施形態において、配列は、天然タンパク質のＮ末端から少なくとも約５、約１０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、または約８００個のアミノ酸を欠く、ＨＥＶＰの断片をコードする。いくつかの実施形態において、配列は、天然タンパク質のＣ末端から少なくとも約５、約１０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、または約８００個のアミノ酸を欠く、ＨＥＶＰの断片をコードする。いくつかの実施形態において、配列は、天然タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方から少なくとも約５、約１０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、または約８００個のアミノ酸を欠く、ＨＥＶＰの断片をコードする。いくつかの実施形態において、配列は、天然タンパク質の１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠く、ＨＥＶＰの断片をコードする。
いくつかの実施形態において、ＨＥＶＰの断片は、１つ以上の異種タンパク質（例えば、外因性生物学的活性分子、例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、断片のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、断片のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、断片のＮ末端及びＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。
表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＣＤ１３の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３の断片は、１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠く。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３の断片は、１つ以上の異種タンパク質（例えば、外因性生物学的活性分子、例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）に融合される。１つ以上の異種タンパク質は、ＣＤ１３断片のＮ末端に融合させることができる。１つ以上の異種タンパク質は、ＣＤ１３断片のＣ末端に融合させることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＣＤ１３断片のＮ末端及びＣ末端の両方に融合させることができる。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３断片に融合した異種タンパク質は、追加的に、シグナル配列ペプチドを含有する。
表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＭＭＥの断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態において、ＭＭＥの断片は、１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠く。いくつかの実施形態において、ＭＭＥの断片は、１つ以上の異種タンパク質（例えば、外因性生物学的活性分子、例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＭＭＥ断片のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＭＭＥ断片のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＭＭＥ断片のＮ末端及びＣ末端の両方に融合される。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＭＭＥ断片に融合した異種タンパク質は、追加的に、シグナル配列ペプチドを含有する。
表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＮＰＰ１の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生され得る。いくつかの実施形態において、ＥＮＰＰ１の断片は、１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠く。いくつかの実施形態において、ＥＮＰＰ１の断片は、１つ以上の異種タンパク質（例えば、外因性生物学的活性分子、例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＥＮＰＰ１断片のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＥＮＰＰ１断片のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＥＮＰＰ１断片のＮ末端及びＣ末端の両方に融合される。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＥＮＰＰ１断片に融合した異種タンパク質は、追加的に、シグナル配列ペプチドを含有する。
表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＮＲＰ１の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生され得る。いくつかの実施形態において、ＮＲＰ１の断片は、１つ以上の異種タンパク質（例えば、外因性生物学的活性分子、例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＮＲＰ１断片のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＮＲＰ１断片のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の異種タンパク質は、ＮＲＰ１断片のＮ末端及びＣ末端の両方に融合される。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＮＲＰ１断片に融合した異種タンパク質は、追加的に、シグナル配列ペプチドを含有する。
いくつかの実施形態において、表面操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１を含むがこれらに限定されない、ＨＥＶＰタンパク質の全長または断片と同一または同様の配列のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＨＥＶＰの全長または断片と少なくとも約５０％同一であり、例えば、配列番号４７～５０（すなわち、配列番号４７、４８、４９、または５０）と少なくとも約５０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＨＥＶＰの全長または断片と少なくとも約６０％同一であり、例えば、配列番号４７～５０と少なくとも約６０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＨＥＶＰの全長または断片と少なくとも約７０％同一であり、例えば、配列番号４７～５０と少なくとも約７０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＨＥＶＰの全長または断片と少なくとも約８０％同一であり、例えば、配列番号４７～５０と少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＨＥＶＰの全長または断片と少なくとも約９０％同一であり、例えば、配列番号４７～５０と少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＨＥＶＰの全長または断片と少なくとも約９５％同一であり、例えば、配列番号４７～５０と少なくとも約９５％同一である。いくつかの態様において、ポリペプチドは、ＨＥＶＰの全長または断片と少なくとも約９６％同一であり、例えば、配列番号４７～５０と少なくとも約９６％同一である。いくつかの態様において、ポリペプチドは、ＨＥＶＰの全長または断片と少なくとも約９７％同一であり、例えば、配列番号４７～５０と少なくとも約９７％同一である。いくつかの態様において、ポリペプチドは、ＨＥＶＰの全長または断片と少なくとも約９８％同一であり、例えば、配列番号４７～５０と少なくとも約９８％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＨＥＶＰの全長または断片と少なくとも約９９％同一であり、例えば、配列番号４７～５０と少なくとも約９９％同一である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＨＥＶＰの全長または断片と少なくとも約９９．９％同一であり、例えば、配列番号４７～５０と少なくとも約９９．９％同一である。
７．６．親和性精製
本開示のいくつかの実施形態は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）膜で豊富化されたタンパク質と固定化結合剤との間の特異的結合相互作用を使用する、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の単離、精製、及びサブ画分化に関する。これらの方法は、一般的に、（１）ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む試料を適用またはロードするステップと、（２）任意選択的に、ＥＶの標的タンパク質（例えば、エクソソーム）と結合剤との間の結合相互作用を維持する適切な緩衝液を使用して、未結合試料成分を洗い流すステップと、（３）結合相互作用がもはや発生しないように、緩衝液条件を変更することによって、固定化結合剤からＥＶ（例えば、エクソソーム）を溶離（解離及び回収）するステップと、を含む。
いくつかの実施形態は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）膜で豊富化されたタンパク質と固定化結合剤との間の特異的結合相互作用を使用して、試料からＥＶ（例えば、エクソソーム）を除去する方法に関する。この場合、結合剤に結合したＥＶ（例えばエクソソーム）は結合剤から溶離されず、結合剤に結合しない画分を収集することができる。本方法を使用して、ＥＶ（例えば、エクソソーム）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、または任意の他のエンベロープもしくは非エンベロープウイルス）または組換えタンパク質（例えば、抗体、酵素または他のポリペプチド）などの非ＥＶ（例えば、エクソソーム）材料を含む試料を精製することができ、この場合、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、混入粒子である。結合したＥＶ（例えば、エクソソーム）は、結合剤に結合したままにすることができ、非ＥＶ（例えば、エクソソーム）材料が収集され、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を実質的含まない。
この単離、精製、サブ画分化または除去プロセスに使用される標的タンパク質は、産生細胞のゲノムから産生される内因性タンパク質、遺伝子改変によって産生細胞に導入されるタンパク質、または化学的、物理的もしくは他の生物学的方法によって改変されるタンパク質であることができる。いくつかの場合において、タンパク質は、非変異体タンパク質または変異体タンパク質、例えば、内因性タンパク質の変異体もしくは断片である。いくつかの場合において、タンパク質は、融合タンパク質（例えば、本明細書に記載されるものなど）である。
標的タンパク質に親和性を有する様々な結合剤は、本開示の実施形態のために使用することができる。例えば、標的タンパク質に特異的な親和性を有するタンパク質、ペプチド、及び小分子は、結合剤として使用することができる。いくつかの実施形態において、結合剤は、有機または無機源から得られる。有機源からの結合剤の例には、血清タンパク質、レクチン、または抗体が含まれる。無機源からの結合剤の例には、ボロン酸、金属キレート、及びトリアジン色素が含まれる。
結合剤は、固体支持体に化学的に固定または結合させることができ、それによって結合剤に特異的な親和性を有するＥＶ（例えば、エクソソーム）が結合するようになる。様々な形態の固体支持体、例えば、多孔性アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁性ビーズ、または膜を使用することができる。いくつかの実施形態において、固体支持体は、クロマトグラフィーカラムを形成し、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の親和性クロマトグラフィーのために使用することができる。
いくつかの場合において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の単離、精製、サブ画分化及び除去は、結合剤及び固体支持体が充填されるカラムを使用したカラムクロマトグラフィーによって行われる。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含有する試料がカラムを通って流れて設定され、洗浄緩衝液がカラムを通って流れ、それに続いて溶離緩衝液がカラムに適用されて収集される。これらのステップは、周囲圧力で、または追加の圧力を加えて行うことができる。
いくつかの場合において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の単離、精製、サブ画分化、及び除去は、バッチ処理を使用して行われる。例えば、試料は、容器内の固体支持体に結合した結合剤に添加され、混合し、固体支持体を分離し、液相を除去し、洗浄し、遠心分離し、溶離緩衝液を添加し、再遠心分離し、溶離液を除去する。
いくつかの場合において、ハイブリッド法を用いることができる。例えば、試料は、容器内の固体支持体に結合した結合剤に添加され、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に結合した固体支持体を引き続きカラムに充填し、洗浄及び溶離はカラムで行われる。
いくつかの場合において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の単離、精製、サブ画分化、及び除去は、マイクロタイタープレート、磁性ビーズ、または膜に結合した結合剤を使用して行われる。この場合、試料を固体支持体に結合させた結合剤に添加し、次いで、混合するステップ、固体支持体を分離するステップ、液相を除去するステップ、洗浄するステップ、洗浄緩衝液を除去するステップ、溶離緩衝液を添加するステップ、及び溶離液を除去するステップが続く。
結合剤とＥＶ上の標的タンパク質（例えば、エクソソーム）との間の結合は、結合剤とＥＶ上の標的タンパク質（例えば、エクソソーム）との間の特異的相互作用に最適な様々な生理学的条件で行われる。結合物（例えば、エクソソーム）の溶離は、塩濃度、ｐＨ、ｐＩ、電荷、及びイオン強度を直接的にまたは勾配を通して変化させることによって達成することができる。
いくつかの実施形態において、１つの結合剤で単離、精製、またはサブ画分化された試料は、続いて、異なる結合剤で処理される。
いくつかの実施形態において、２つ以上のカラムが連続して使用され、複数のカラムの各々は、異なる標的タンパク質に特異的である異なる結合剤を含有する。
いくつかの実施形態において、単一のカラムは、異なる標的タンパク質に各々特異的である複数の結合剤を含有する。
いくつかの場合において、結合剤及び固体支持体は、定期的な除菌ステップの導入によって再利用される。例えば、それらは、プロピレングリコール、イソプロパノール、高イオン強度、及び／または水酸化ナトリウムの組み合わせによって消毒することができる。
７．６．１．サンプルの調製
本明細書に記載の方法を使用して、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む様々な試料からＥＶ（例えば、エクソソーム）を精製、単離、サブ画分化、または除去することができる。いくつかの実施形態において、試料は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含有する澄明化収集材料である。いくつかの場合において、試料は、当技術分野で周知の精製方法によって部分的に精製されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む。例えば、親和性精製のための結合剤に適用する前に、限外濾過／透析濾過、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、深層濾過、またはイオン交換結合／溶離クロマトグラフィーを使用して、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を部分的に精製することができる。
いくつかの場合において、部分的に精製された材料は、結合剤との所望の相互作用のための特定の生理学的条件（例えば、ｐＨ、温度、塩濃度、塩の種類、極性）を有するようにさらに処理される。試料は、特定のＥＶ（例えば、エクソソーム）濃度を得るために希釈もしくは濃縮によって、またはＥＶ（例えば、エクソソーム）の構造を変化させるために賦形剤を添加することによって、調製することができる。いくつかの場合において、部分的に精製された材料は、いかなる操作も伴わずに結合剤に適用される。
７．６．２．結合
本明細書に記載の方法は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の標的タンパク質と結合剤との間の特異的相互作用を必要とする。ハイスループットスクリーニングを、塩濃度、ｐＨ、及び／または有機修飾剤、エチレングリコール、プロピレングリコール、もしくは尿素による極性の低減を変化させることによって実施して、特異的結合に理想的な緩衝液条件を特定することができる。標的タンパク質と結合剤との間の相互作用はまた、試料条件（例えば、クロマトグラフィー樹脂の体積当たりにロードされる試料量、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の濃度、不純物の濃度）、ロード用緩衝液（例えば、ｐＨ、塩濃度、塩の種類、極性）、及び他の物理的条件（例えば、温度）に応じて変化し得る。さらに、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の構造を変化させる賦形剤を添加することも、それらの相互作用を変化させることができる。加えて、滞留時間は、不純物とＥＶ（例えば、エクソソーム）との間の示差的吸着速度に基づいて調整することができる。したがって、本明細書に記載される様々な精製条件を試験して、ステップのための理想的な条件を特定することができる。
同様のアプローチを使用して、純度及び収率を改善し、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の亜集団を豊富化、枯渇化、または単離するのに役立てることができる。これらの特性は、ロード負荷を最大化することと、よりストリンジェントな溶離条件を適用することとともに、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の濃度をさらに向上させるために用いられ得る。
７．６．２．１．溶離
ＥＶ（例えば、エクソソーム）の溶離は、塩濃度、ｐＨ、及び／または有機修飾剤、エチレングリコール、プロピレングリコール、もしくは尿素を用いた極性を、変化させることによって達成することができる。
ＥＶ（例えばエクソソーム）の選択的溶離は、溶離緩衝液において、一価のカチオン性ハロゲン化物塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、塩化リチウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、及びヨウ化カリウム）、二価または三価の塩（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、リン酸カリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、及び塩化第二鉄）、またはそれらの組み合わせの濃度を、一価カチオン性ハロゲン塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、塩化リチウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、及びヨウ化カリウム）、二価または三価の塩（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、リン酸カリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、及び塩化第二鉄）、またはそれらの組み合わせの増加させる勾配（段階的または直線的）の使用を通して、固定されたｐＨで増加させることによって達成される。
実質的なＥＶ（例えば、エクソソーム）純度は、カラムロード段階の際に不純物を通過して流すことと、選択的賦形剤洗浄の際に不純物を溶離させることと、カラムに結合された追加の不純物を残しながら、溶離の際に産物を選択的に溶離させることと、によって達成され得る。カラム溶離液から測定される吸光度は、本方法によって得られるＥＶ（例えば、エクソソーム）の純度を示すことができる。
溶離は、ｐＨ範囲、塩、有機溶媒、小分子、界面活性剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、温度、及び上記の任意の組み合わせを調節することによっても達成することができる。同様の溶離剤を使用して、純度を改善、収率を改善、及び／またはＥＶ（例えば、エクソソーム）のサブ集団を単離することができる。
溶離は、ｐＨ、塩、有機溶媒、小分子、界面活性剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、温度、及び上記の任意の組み合わせなどの異なる特性を有する複数の溶離緩衝液を用いて行うこともできる。複数の溶離画分を収集することができ、各画分で収集されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、異なる特性を有する。例えば、１つの画分において収集されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、他の画分におけるＥＶ（例えば、エクソソーム）よりも、高い純度、小さいかまたは大きい平均サイズ、好ましい組成物などを有する。
異なる特性を有する溶離緩衝液は、連続流として適用することができ、複数の溶離画分が収集される。溶離画分は、定組成溶離または勾配溶離の際に収集することができる。少なくとも１つの溶離画分が収集されると、溶離画分の組成物を分析することができる。例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）、宿主細胞タンパク質、混入タンパク質、ＤＮＡ、炭水化物、または脂質の濃度は、各溶離画分において測定することができる。各溶離画分におけるＥＶ（例えば、エクソソーム）の他の特性も測定することができる。これらの特性は、平均サイズ、平均電荷密度、及び生体分布、細胞取り込み、半減期、薬力学、効力、投薬、免疫応答、負荷効率、安定性、または他の化合物に対する反応性に関連する他の生理学的特性を含む。
７．６．２．２．洗浄
任意選択的に、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の純度は、溶離前に試料を洗浄することによってさらに改善することができる。いくつかの実施形態において、賦形剤は、洗浄緩衝液であることができる。賦形剤は、特定のｐＨ範囲、塩、有機溶媒、小分子、界面活性剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、及び上記の任意の組み合わせを有する溶液であることができる。
より具体的には、賦形剤は、アルギニン、リジン、グリシン、ヒスチジン、カルシウム、ナトリウム、リチウム、カリウム、ヨウ化物、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、尿素、プロピレングリコール、アルミニウム、アンモニウム、グアニジニウム、ポリエチレングリコール、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、界面活性剤、塩化物、硫酸塩、カルボン酸、シアル酸、リン酸塩、酢酸塩、グリシン、ホウ酸塩、ギ酸塩、過塩素酸塩、臭素酸塩、硝酸塩、ジチオスレイトール、βメルカプトエタノール、またはトリ－ｎ－ブチルリン酸塩を含むことができる。
賦形剤はまた、界面活性剤を含むこともでき、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能であるセチルトリメチルアンモニウムクロリド、オクトキシノール－９、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００（すなわち、ポリエチレングリコールｐ－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）－フェニルエーテル）及びＴＲＩＴＯＮ（登録商標）ＣＧ－１１０；ドデシル硫酸ナトリウム；ラウリル硫酸ナトリウム；デオキシコール酸；ポリソルベート８０（すなわち、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）；ポリソルベート２０（すなわち、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）；アルコールエトキシレート；アルキルポリエチレングリコールエーテル；デシルグルコシド；オクトグルコシド；ＳａｆｅＣａｒｅ；ＤＯＷ Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手可であるＥＣＯＳＵＲＦ（商標）ＥＨ９、ＥＣＯＳＵＲＦ（商標）ＥＨ６、ＥＣＯＳＵＲＦ（商標）ＥＨ３、ＥＣＯＳＵＲＦ（商標）ＳＡ７、及びＥＣＯＳＵＲＦ（商標）ＳＡ９；ＢＡＳＦから入手可能であるＬＵＴＥＮＳＯＬ（商標）Ｍ５、ＬＵＴＥＮＳＯＬ（商標）ＸＬ、ＬＵＴＥＮＳＯＬ（商標）ＸＰ及びＡＰＧ（商標）３２５Ｎ；ＡＩＲ ＰＲＯＤＵＣＴＳから入手可能であるＴＯＭＡＤＯＬ（商標）９００；ＣＲＯＤＡから入手可能であるＮＡＴＳＵＲＦ（商標）２６５；Ｂｅｓｔｃｈｅｍから入手可能であるＳＡＦＥＣＡＲＥ（商標）１０００；ＤＯＷから入手可能であるＴＥＲＧＩＴＯＬ（商標）Ｌ６４；カプリル酸；Ｌｕｂｒｉｚｏｌから入手可能であるＣＨＥＭＢＥＴＡＩＮＥ（商標）ＬＥＣ；ならびにＭａｃｋｏｌ ＤＧからなる群から選択される。
７．６．３．結果を改善するための他の方法
クロマトグラフィー樹脂の体積当たりにロードされ得るＥＶ（例えば、エクソソーム）の量は、供給材料を調節することによって、例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の濃度を増加させること、不純物の濃度を減少させること、ｐＨを変化させること、塩濃度を減少させること、イオン強度を減少させること、またはＥＶ（例えば、エクソソーム）の特定のサブ集団を変化させること、によって改善することができる。質量移動の制約及び樹脂でのＥＶ（例えば、エクソソーム）のゆっくりとした吸着及び脱着に起因して、クロマトグラフィー樹脂の体積当たりにロードすることができるＥＶ（例えば、エクソソーム）の量は、カラムロード中の流速を遅くすることによって、より長いカラムを使用することによって、滞留時間を増加させることができる。
７．７．適用
７．７．１．ＥＶ（例えば、エクソソーム）の精製
医療目的のためのＥＶ（例えば、エクソソーム）の使用では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、核酸、混入タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、小分子、金属、またはそれらの組み合わせなどの巨大分子に限定されない不純物を、含まないまたはほとんど含まないことを必要とする。本開示は、混入している巨大分子からＥＶ（例えば、エクソソーム）を精製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、精製ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、混入している巨大分子を実質的に含まなない。
７．７．２．ＥＶ（例えば、エクソソーム）のサブ画分化
本開示の実施形態は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の集団を、それらの膜タンパク質、サイズ、電荷密度、リガンドタイプ（例えば、テトラスパニン）及びヘパリンまたは他の硫酸化炭水化物結合部位に基づいて、サブ画分化するための方法をさらに提供する。親和性タグ、ロード及び溶離緩衝液組成物ならびにプロトコルの選択は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の異なるサブ集団の溶離をもたらすことができる。
例えば、本開示の実施形態は、より小さいかまたはより大きいサイズを有するＥＶ（例えば、エクソソーム）の集団を精製する方法を提供する。ＥＶ（例えば、エクソソーム）のサイズは、当分野で利用可能な方法によって決定することができる。例えば、サイズは、ナノ粒子追跡分析、多角度光散乱、単角度光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、分析的超遠心分離、フィールドフロー画分化、レーザー回折、調整可能な抵抗パルスセンシング、または動的光散乱によって測定することができる。
本開示の実施形態はさらに、それらの電荷密度に基づいてＥＶ（例えば、エクソソーム）をサブ画分化する方法に関する。ＥＶ（例えば、エクソソーム）の電荷密度は、電位差滴定、陰イオン交換、陽イオン交換、等電点電気泳動、ゼータ電位、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動、またはそれらの任意の組み合わせによって決定することができる。
本開示の実施形態はまた、生体分布、細胞取り込み、半減期、薬力学、効力、投薬、免疫応答、負荷効率、安定性、または他の化合物に対する反応性などの他の生理学的特性に基づいて、ＥＶ（例えば、エクソソーム）をサブ画分化することに関する。本方法は、特定の適用に好適であるＥＶ（例えば、エクソソーム）の集団の単離を可能にする。
７．７．３．使用
いくつかの態様において、本開示は、疾患もしくは障害を予防及び／または治療する方法を、それを必要とする対象において提供し、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エクソソーム）を投与することを含む。
いくつかの態様において、本方法で治療することができる疾患または障害は、がん、血友病、糖尿病、成長因子欠損、眼疾患、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、胃腸疾患、心臓血管疾患、呼吸器疾患、アレルギー疾患、変性疾患、感染性疾患、線維性疾患、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の態様において、治療することができる疾患または障害は、慢性炎症と関連付けられる。いくつかの態様において、治療は予防的である。いくつかの態様において、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）を使用して、免疫応答を誘導する。いくつかの態様において、本開示のＥＶを使用して、対象にワクチンを接種する。
いくつかの態様において、疾患または障害は、がんである。いくつかの態様において、疾患または障害は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。いくつかの態様において、疾患または障害は、感染性疾患である。
本明細書に記載されるように、細胞（例えば、産生細胞）は、細胞内で天然に発現されないタンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）（すなわち、異種タンパク質）を発現するように改変することができる。いくつかの態様において、かかる改変は、異種タンパク質を発現するために改変細胞から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）をもたらす。したがって、いくつかの態様において、本開示は、非天然発生タンパク質（すなわち、異種タンパク質）を細胞に由来するＥＶ（例えば、エクソソーム）に発現させる方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、細胞を、少なくとも１つの異種タンパク質（例えば、本明細書に開示されるＨＥＶＰ）（またはその断片もしくは変異体）をコードする核酸によってトランスフェクトすることと、細胞から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）を単離することと、を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、少なくとも１つの異種タンパク質を含み、異種タンパク質は、細胞に由来するＥＶにおいて天然に発現されない。
いくつかの態様において、上記細胞から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）（すなわち、少なくとも１つの異種タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされる）は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の異種タンパク質を含む。ある特定の態様において、異種タンパク質は、異なる（例えば、エクソソームは、ＣＤ１３及びＭＭＥタンパク質の両方を発現するように操作され、エクソソームは、ＣＤ１３及びＭＭＥタンパク質を天然に発現しない細胞から産生される）。いくつかの態様において、異種タンパク質は同じであり、ＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現される異種タンパク質の総量は、異種タンパク質を自然に発現する細胞から産生されるＥＶよりも多い。
ＥＶ（例えば、エクソソーム）で発現される異種タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）の量またはレベルを定量化するために、当技術分野で既知の任意の好適な方法を使用することができる。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）で発現されるタンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）の量は、タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を有する液体クロマトグラフィーを使用して、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む所与の試料中のペプチドスペクトルマッチの数を測定することによって評価することができる。実施例１及び実施例３を参照されたい。本明細書で使用される場合、「ペプチドスペクトルマッチ」（ＰＳＭ）は、配列Ｐを有するペプチドの断片化が実験質量スペクトルに記録される可能性を表すペプチドスペクトルペア（Ｐ，Ｓ）に、数値を割り当てるシステムを指すＳ．Ｆｒａｎｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ，８（５）：２２４１－２２５２（Ｍａｙ ２００９）。ＰＳＭは、所与の試料中のタンパク質存在量と相関する。
いくつかの態様において、本明細書に開示される細胞（例えば、少なくとも１つの異種タンパク質をコードする核酸によってトランスフェクトされた）から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現される異種タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）のレベル（または量）は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される場合、少なくとも約１０ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）、少なくとも約２０ＰＳＭ、少なくとも約３０ＰＳＭ、少なくとも約４０ＰＳＭ、少なくとも約５０ＰＳＭ、少なくとも約６０ＰＳＭ、少なくとも約７０ＰＳＭ、少なくとも約８０ＰＳＭ、少なくとも約９０ＰＳＭ、少なくとも約１００ＰＳＭ、少なくとも約１１０ＰＳＭ、少なくとも約１２０ＰＳＭ、少なくとも約１３０ＰＳＭ、少なくとも約１４０ＰＳＭ、少なくとも約１５０ＰＳＭ、少なくとも約１６０ＰＳＭ、少なくとも約１７０ＰＳＭ、少なくとも約１８０ＰＳＭ、少なくとも約１９０ＰＳＭ、少なくとも約２００ＰＳＭ、少なくとも約２１０ＰＳＭ、少なくとも約２２０ＰＳＭ、少なくとも約２３０ＰＳＭ、少なくとも約２４０ＰＳＭ、少なくとも約２５０ＰＳＭ、少なくとも約２６０ＰＳＭ、少なくとも約２７０ＰＳＭ、少なくとも約２８０ＰＳＭ、少なくとも約２９０ＰＳＭ、少なくとも約３００ＰＳＭ、少なくとも約３５０ＰＳＭ、少なくとも約４００ＰＳＭ、少なくとも約４５０ＰＳＭ、少なくとも約５００ＰＳＭ、少なくとも約５５０ＰＳＭ、少なくとも約６００ＰＳＭ、少なくとも約６５０ＰＳＭ、少なくとも約７００ＰＳＭ、少なくとも約７５０ＰＳＭ、少なくとも約８００ＰＳＭ、少なくとも約８５０ＰＳＭ、少なくとも約９００ＰＳＭ、少なくとも約９５０ＰＳＭ、または少なくとも約１，０００ＰＳＭ以上である。
ある特定の態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現される異種タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）のレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される場合、約１２５ＰＳＭ以上である。ある特定の態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現される異種タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）のレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される場合、約１５０ＰＳＭ以上である。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現される異種タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）のレベルは、約２００ＰＳＭ以上である。ある特定の態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現される異種タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）のレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される場合、約７００ＰＳＭ以上である。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現される異種タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ、例えば、ＭＭＥ）のレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される場合、約１７７ＰＳＭである。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現される異種タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ、例えば、ＣＤ１３）のレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される場合、約７４２ＰＳＭである。
いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現される異種タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）のレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される場合、約２０～約８０ＰＳＭである。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現される異種タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）のレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される場合、約８０～約２００ＰＳＭである。いくつかの態様において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）において発現される異種タンパク質（例えば、ＨＥＶＰ）のレベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される場合、約１５０ＰＳＭ～約７５０ＰＳＭである。
７．８．ＥＶ（例えば、エクソソーム）の特徴付け
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、収集された各画分に含まれるＥＶ（例えば、エクソソーム）を特徴付けるステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内容物は、試験及び特徴付けのために抽出することができる。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、単離され、サイズ、形状、形態、または核酸、タンパク質、代謝産物、及び脂質などの分子組成を含むがこれらに限定されない測定基準によって、特徴付けられる。
７．８．１．ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内容物の測定
ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び脂質を含むことができる。全ＲＮＡは、酸－フェノール：クロロホルム抽出を使用して抽出することができる。次いで、小ＲＮＡ含有全ＲＮＡを回収する条件下で、またはｍＲＮＡなどのより長いＲＮＡ種から長さが２００ヌクレオチド未満の小ＲＮＡ種を分離する条件下で、ガラス繊維フィルタを使用してＲＮＡを精製することができる。ＲＮＡは少量で溶離されるため、いくつかの態様において、アルコール沈殿ステップはＲＮＡの単離のために必要とされない。
ＥＶ（例えば、エクソーム）組成物は、トランスクリプトミクス、配列決定、プロテオミクス、質量分析、またはＨＰ－ＬＣを含むがこれらに限定されない、当技術分野で既知の方法によって評価することができる。
単離されたＥＶ（例えば、エクソソーム）に関連するヌクレオチドの組成（ＲＮＡ及びＤＮＡを含む）は、当業者に周知の様々な技術（例えば、定量的または半定量的ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーション検出）を使用して測定することができる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡのレベルは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）組成物からＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供することと、標的オリゴデオキシヌクレオチドを１つ以上のＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ）にハイブリダイゼーションして、ＥＶ（例えば、エクソソーム）組成物のハイブリダイゼーションプロファイルを提供することと、ＥＶ（例えば、エクソソーム）組成物のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成されるハイブリダイゼーションプロファイルと比較することと、によって測定される。対照試料に対する試験試料における少なくとも１つのＲＮＡのシグナルの変化は、ＲＮＡ組成物を示す。
また、マイクロアレイは、既知のＲＮＡ配列から生成される遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。アレイは、各ＲＮＡについて２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを含有することができ、１つは、活性で成熟した配列を含有し、他は、ＲＮＡの前駆体（例えば、ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）に特異的である。アレイはまた、ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件における対照として機能することができる、わずかな塩基でのみヒトオルトログと異なる１つ以上のマウス配列などの対照を含有することができる。両方の種に由来するｔＲＮＡ及び他のＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）は、マイクロチップにプリントすることもでき、特異的ハイブリダイゼーションのための内部の比較的安定した陽性対照を提供する。非特異的ハイブリダイゼーションのための１つ以上の好適な対照も、マイクロチップ上に含むことができる。この目的のために、配列は、いずれの既知のＲＮＡとのいかなる相同性も存在しないことに基づいて選択される。
マイクロアレイは、当技術分野で既知の技術を使用して組み立てることができる。例えば、好適な長さ、例えば、４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドは、位置Ｃ６で５’－アミン修飾され、市販のマイクロアレイシステム、例えば、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ ＯｍｎｉＧｒｉｄ（商標）１００マイクロアレイ及びＡｍｅｒｓｈａｍ ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）を使用して活性化スライドにプリントされる。標的ＲＮＡに対応する標識ｃＤＮＡオリゴマーは、標識プライマーで標的ＲＮＡを逆転写することによって調製される。第１の鎖合成後、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させて、ＲＮＡ鋳型を分解させる。このようにして調製した標的ｃＤＮＡは、次いで、ハイブリダイゼーション条件下、例えば、６倍ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミドで２５℃、１８時間、続いて０．７５倍ＴＮＴで３７℃、４０分間で、マイクロアレイチップにハイブリダイゼーションさせる。固定化プローブＤＮＡが試料中の相補的標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置で、ハイブリダイゼーションが生じる。標識された標的ｃＤＮＡは、結合が生じるアレイ上の正確な位置を示し、自動検出及び定量化を可能にする。出力は、ハイブリダイゼーション事象のリストからなり、ＥＶ（例えば、エクソソーム）調製物における、特異的ｃＤＮＡ配列の相対的存在量、したがって、対応する相補的ＲＮＡの相対的存在量を示す。一実施形態により、標識ｃＤＮＡオリゴマーは、ビオチン標識ｃＤＮＡであり、ビオチン標識プライマーから調製される。次いで、マイクロアレイは、例えば、ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートを使用して、ビオチン含有転写物の直接的な検出によって処理され、従来の走査方法を利用してスキャンされる。アレイ上の各スポットの画像強度は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）における対応するＲＮＡの存在量に比例する。
データマイニング作業は、スキャンチップ、信号取得、画像処理、基準化、統計処理及びデータ比較、ならびに経路分析を含むバイオインフォマティクスによって完了する。したがって、マイクロアレイは、ハイスループット性能によって、数百及び数千のポリヌクレオチドを同時にプロファイリングすることができる。ｍＲＮＡ発現のマイクロアレイプロファイリング分析は、基礎研究における遺伝子発現試験のために貴重なデータを提供することに成功している。及び、この技術は製薬業及び臨床診断でさらに実用化されている。増大する量のｍｉＲＮＡデータが利用可能になり、遺伝子調節におけるｍｉＲＮＡの重要性の証拠が蓄積されるのに伴い、マイクロアレイは、ハイスループットｍｉＲＮＡ試験のための有用な技術となる。ポリヌクレオチドプローブを利用するｍｉＲＮＡレベルの分析は、様々な物理的方式でも行うことができる。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動化を使用して、多数の試験試料の処理を容易にすることができる。
７．８．２．ＥＶ（例えば、エクソソーム）のサイズの測定
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、精製画分に含まれるＥＶ（例えば、エクソソーム）及び／またはＥＶ（例えば、エクソソーム）の集団のサイズを測定することを含む。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）サイズは、最も長い測定可能な寸法として測定される。一般に、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の最も長い一般的な寸法はまた、その直径としても言及される。
ＥＶ（例えば、エクソソーム）サイズは、当技術分野で既知の様々な方法、例えば、ナノ粒子追跡分析、多角度光散乱、単角度光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、分析的超遠心分離、フィールドフロー画分化、レーザー回折、調節可能な抵抗パルスセンシング、または動的光散乱を使用して測定することができる、
ＥＶ（例えば、エクソソーム）サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）及び／または多角度光散乱（ＭＡＬＳ）を使用して測定することができる。ＥＶ（例えば、エクソソーム）のサイズを測定するためにＤＬＳ及び／またはＭＡＬＳを使用する方法は、当業者に既知であり、ナノ粒子追跡アッセイ（ＮＴＡ、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００ナノ粒子追跡デバイスを使用する）を含む。具体的な実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００を使用して決定される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＮＴＡによって（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００を使用して）測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＮＴＡによって（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏｓｉｇｈｔＮＳ３００を使用して）測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９０％は、ＮＴＡによって（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏｓｉｇｈｔＮＳ３００を使用して）測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９５％は、ＮＴＡによって（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００を使用して）測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９９％は、ＮＴＡによって（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００を使用して）測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９０％は、ＮＴＡによって（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００を使用して）測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９５％は、ＮＴＡによって（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００を使用して）測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９９％は、ＮＴＡによって（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００を使用して）測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。
ＥＶ（例えば、エクソソーム）サイズは、調整可能な抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）を使用して測定することができる。具体的な実施形態において、ＴＲＰＳによって測定されるＥＶ（例えば、エクソソーム）サイズは、ｉＺＯＮ ｑＮＡＮＯ Ｇｏｌｄを使用して決定される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＴＲＰＳによって（例えば、ｉＺＯＮ ｑＮａｎｏ Ｇｏｌｄを使用して）測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＴＲＰＳによって（例えば、ｉＺＯＮ ｑＮａｎｏ Ｇｏｌｄ）測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９０％は、ＴＲＰＳによって（例えば、ｉＺＯＮ ｑＮａｎｏ Ｇｏｌｄを使用して）測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９５％は、ＴＲＰＳによって（例えば、ｉＺＯＮ ｑＮａｎｏ Ｇｏｌｄを使用して）測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９９％は、ＴＲＰＳによって（例えば、ｉＺＯＮ ｑＮａｎｏ Ｇｏｌｄを使用して）測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９０％は、ＴＲＰＳによって（例えば、ｉＺＯＮ ｑＮａｎｏ Ｇｏｌｄを使用して）測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９５％は、ＴＲＰＳによって（例えば、ｉＺＯＮ ｑＮａｎｏ Ｇｏｌｄを使用して）測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９９％は、ＴＲＰＳによって（例えば、ｉＺＯＮ ｑＮａｎｏ Ｇｏｌｄを使用して）測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。
ＥＶ（例えば、エクソソーム）サイズは、電子顕微鏡法を使用して測定することができる。いくつかの実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）サイズを測定するために使用される電子顕微鏡法は、透過型電子顕微鏡法である。具体的な実施形態において、ＥＶ（例えば、エクソソーム）サイズを測定するために使用される透過型電子顕微鏡は、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮである。電子顕微鏡を使用してＥＶ（例えば、エクソソーム）サイズを測定する方法は当業者に周知であり、任意のかかる方法は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）サイズを測定するために好適であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）集団は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９０％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）集団は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９５％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）集団は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９９％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約２０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）集団は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９０％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）集団は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９５％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態において、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エクソソーム）集団は、集団を含み、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の９９％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約４０～１０００ｎｍの最長寸法を有する。
７．８．３．ＥＶ（例えば、エクソソーム）の電荷密度の測定
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、精製画分に含まれるＥＶ（例えば、エクソソーム）及び／またはＥＶ（例えば、エクソソーム）の集団の電荷密度を測定することを含む。いくつかの実施形態において、電荷密度は、電位差滴定、陰イオン交換、陽イオン交換、等電点電気泳動、ゼータ電位、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、またはゲル電気泳動によって測定される。
７．８．４．ＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質またはＨＥＶＰの密度の測定
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面のＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質またはＨＥＶＰの密度を測定することを含む。表面密度は、単位面積当たりの質量、面積当たりのタンパク質数、ＥＶ（例えば、エクソソーム）当たりの分子の数または分子シグナルの強度、タンパク質のモル量などとして計算または表示することができる。表面密度は、当技術分野で既知の方法によって、例えば、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロッティング、蛍光（例えば、ＧＦＰ融合タンパク質）検出、ナノフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、αＬＩＳＡ、及び／またはタンパク質ゲル上のバンドを測定することによるデンシトメトリーによって、実験的に測定することができる。
７．９．医薬組成物
明細書で提供されるのは、対象への投与に好適な形態で、所望の純度を有する本開示のＥＶ、例えば、エクソソーム、及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物である。薬学的に許容される賦形剤または担体は、部分的には、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、決定される。したがって、複数の細胞外小胞を含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．２１ｓｔ ｅｄ．（２００５）を参照されたい）医薬組成物は、一般に滅菌されて製剤化され、かつ米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠する。
いくつかの態様において、医薬組成物は、本明細書に記載される１つ以上の治療剤及びＥＶ、例えば、エクソソームを含む。ある特定の態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームは、１つ以上の追加の治療剤と、薬学的に許容される担体中で、同時投与される。いくつかの態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームを含む医薬組成物は、追加の治療剤の投与前に投与される。他の態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームを含む医薬組成物は、追加の治療薬の投与後に投与される。さらなる態様において、ＥＶ、例えば、エクソソームを含む医薬組成物は、追加の治療薬と同時に投与される。
７．１０．キット
また本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の１つ以上のエクソソームを含むキットである。いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に提供される１つ以上のエクソソームなどの本明細書に記載の医薬組成物の成分のうちの１つ以上によって充填される１つ以上の容器、任意選択的に使用説明書を含む、医薬パックまたはキットである。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載される医薬組成物、及び本明細書に記載されるものなどの任意の予防用または治療用薬剤を含む。
７．１１．実施例
以下の実施例は、当業者に本開示をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を提供するように提示され、本発明者が自身の本開示とみなすものの範囲を限定することは意図されておらず、以下の実験が全てまたは唯一の実実施される実験であると表すことも意図されていない。努力は使用された数（例えば、量、温度など）についての正確性を確実にするためになされてきたが、いくつかの実験誤差や偏差は説明されるべきである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。標準的な略称は、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロ塩基（複数可）；ｐｌ、ピコリッター（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）などが使用されることができる。
本発明の実践は、別途示されない限り、当技術分野の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を用いる。かかる技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、ＡＬ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，２００５）、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（ｌ９９２）を参照されたい。
７．１１．１．実施例１：ＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質の特定
７．１１．１．１．ＥＶ（例えば、エクソソーム）の収集
ＥＶ（例えば、エクソソーム）を、４日後に骨髄由来ＭＳＣ細胞の高密度懸濁培養の上清から回収した。上清を濾過し、１，０００ｋＤａのＭＷＣＯ膜（ＰＸＣ０１ＭＣ５０）を使用した接線流濾過によって濃縮した。濃縮した細胞培養上清を、１００ｍＬのＱｕｉｃｋ－Ｓｅａｌ Ｕｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒチューブ（３４５７７８）を使用した超遠心分離によってペレット化した。粗ＥＶ（例えば、エクソソーム）ペレットを、超遠心分離によるＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）（６０％イオジキサノールｗ／ｖ）密度勾配でさらに画分化した。
ペレット化した材料を、１ｍＬのＰＢＳ及び３ｍＬのＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）に再懸濁させ、最終イオジキサノール濃度を４５％にした。ＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配のために、４層滅菌勾配を、ＳＷ ４１ Ｔｉローター用の１２ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブで、再懸濁した材料を含有する４ｍＬの４５％イオジキサノール、３ｍＬの３０％イオジキサノール、２ｍＬの２２．５％イオジキサノール、２ｍＬの１７．５％イオジキサノール、及び１ｍＬのＰＢＳによって調製した。ＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）を、４℃で１６時間、１５０，０００×ｇで超遠心分離して、ＥＶ（例えば、エクソソーム）画分を分離した。次いで、ＥＶ（例えば、エクソソーム）層を、チューブの最上部約３ｍＬから穏やかに収集した。
ＥＶ（例えば、エクソソーム）画分を、３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブ中で約３２ｍＬのＰＢＳに希釈し、４℃で３時間、１３３，９００×ｇで超遠心分離して、精製されたＥＶ（例えば、エクソソーム）をペレット化した。次いで、ペレット化ＥＶ（例えば、エクソソーム）を最小体積のＰＢＳ（約２００μＬ）中に再懸濁させて４℃で保存した。
７．１１．１．２．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のための試料調製
ＥＶ（例えば、エクソソーム）に特異的なタンパク質を決定するために、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配の最上部画分及び底部画分を、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析によって分析した。全ての試料に、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液またはＰＢＳ及び５％スクロースのいずれかを加えた。分析前に、各試料の総タンパク質濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって決定し、その後、各試料をＰＢＳ緩衝液で１２５μｇ／ｍＬに適切に希釈した。次に、５０．０μＬの各試料を、等体積のＥＶ（例えば、エクソソーム）溶解緩衝液（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ ＧｄｍＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＴＣＥＰ、１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）を含有する別個の１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに添加し、続いて２．０μＬの１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００溶液を移した。次いで、全ての試料を５５℃で６０分間インキュベートした。
タンパク質沈殿を、１２５０μＬのエタノールを－２０℃で添加することによって実施した。効率を改善するために、試料を約１０分間激しくボルテックスし、次いで－２０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を水浴中で５分間超音波処理した。沈殿した材料を、１５，０００ｇで４℃、５分間遠心分離することによってペレット化した。上清をデカントし、ペレット化材料を窒素ガスを使用して完全に乾燥させた。ペレットを３０．０μＬの消化緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１．０Ｍ ＧｄｍＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ８．５）中に再懸濁させ、またジスルフィド結合を還元させた。遊離システイン残基を、５．０μＬのアルキル化溶液（３７５ｍＭヨードアセトアミド、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５）を添加し、結果として得られた溶液を暗所において室温で少なくとも３０分間インキュベートすることによってアルキル化した。
インキュベーション後、各試料を、３０．０μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５を使用して希釈し、タンパク質分解消化を、２．０μｇのトリプシンを添加することによって開始した。全ての試料を混合し、次いで３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、トリプシン活性を、５．０μＬの１０％ギ酸を添加することによって停止した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析前に、各試料を、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃ１８スピンカラムを使用して脱塩した。このプロセスの最後に、各試料を乾燥させ、０．１％ギ酸を含む５０．０μＬの水で再構成させ、分析のためにＨＰＬＣバイアルに移した。
７．１１．１．３．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
試料を、ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ ＲＳＣＬｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）低流量クロマトグラフィーシステムに注入し、トリプシンペプチドをＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８トラッピングカラム（７５μｍ×２ｃｍ、３μｍ粒子サイズ、１００Å孔サイズ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、ロード移動相（ＭＰＬ：水、０．１％ギ酸）を１．０００μＬ／分の流量で使用してロードした。ペプチドを溶離させ、移動相Ａ（ＭＰＡ：水、０．１％ギ酸）及び移動相Ｂ（ＭＰＢ：アセトニトリル、０．１％ギ酸）の勾配で、ＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙ Ｃ１８分析カラム（７５μｍ×２５ｃｍ、２μｍ粒子サイズ、１００Å孔サイズ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にかけて３００ｎＬ／分の流量で分離した。溶離に使用した段階的勾配は、２％ＭＰＢで開始し、ロード中に８分間保持した。次いで、ＭＰＢの割合は、３５分間にわたって２～１７％に増加させ、４５分間にわたって再び１７～２５％に増加させ、最後に１０分間にわたって２５～４０％に増加させた。ほとんどの疎水性種は、９８％ＭＰＢに５分間にわって増加させ、その後１０分間保持することによって除去された。方法の合計実行時間は１３５分であり、カラム再平衡化させるために十分な時間であった。洗浄サイクルを、非同一分析の注入との間に実施して、キャリーオーバーを最小限にした。
質量分析は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｂａｓｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計を用いて実施した。前駆イオン質量スペクトルを、４００～１６００Ｄａのｍ／ｚ範囲にわたって７０，０００の分解能で測定した。最も強度の高い１０前駆イオンを、２７の衝突エネルギーを使用してＨＣＤ細胞内で選択及び断片化し、ＭＳ／ＭＳスペクトルを、２００～２０００Ｄａのｍ／ｚ範囲にわたって３５，０００の分解能で測定した。２～４の電荷状態を有するイオンを断片化のために選択し、動的排除時間を３０秒に設定した。１４種の一般的なポリシロキサンを含有する除外リストを利用して、既知の混入物質の誤特定を最小限に抑えた。
７．１１．１．４．データ処理
タンパク質は最初に、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（バージョン２．１．１．２１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＴａｒｇｅｔ Ｄｅｃｏｙ ＰＳＭ Ｖａｌｉｄａｔｏｒと組み合わせたＳｅｑｕｅｓｔ ＨＴアルゴリズムを使用して特定し、定量化した（標識なし）。検索は、完全なＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ｔａｘｏｎｏｍｙ ９６０６ ｖｅｒｓｉｏｎ ２０１７－０５－１０：４２，１５３項目）参照データベース、ならびにＥ１ａタンパク質を含有するカスタムＵｎｉｐｒｏｔデータベース（７項目）に対して実施した。以下の検索パラメータを使用した：酵素、トリプシン、最大２つの欠損した切断、６残基の最小ペプチド長、１０ｐｐｍの前駆体質量許容差、及び０．０２Ｄａ断片質量許容差。検索には、特異的な動的改変（Ｍの酸化、ＮまたはＱの脱アミド化、Ｓ、Ｔ、またはＹのリン酸化、ペプチド末端Ｅのパイログルタミン化、ならびにタンパク質Ｎ末端のアセチル化）及び静的改変（Ｃのカルバミドメチル化）も含まれた。
Ｔａｒｇｅｔ Ｄｅｃｏｙ ＰＳＭ Ｖａｌｉｄａｔｏｒでは、Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェア（バージョン４．８．２，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．．）を使用してデータを再度検索したため、最大デルタＣｎならびに厳密及び緩和された標的偽発見率（ＦＤＲ）の両方を１に設定した。Ｓｃａｆｆｏｌｄでは、データは、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍオープンソースアルゴリズムも使用して検索し、タンパク質閾値９９．０％、最低２つのペプチド、及びのペプチド閾値９５％を使用してタンパク質を特定した。
ＥＶ（例えば、エクソソーム）特異的タンパク質の同一性を決定するために、全ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）を、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配の最上部ＥＶ（例えば、エクソソーム）画分に認められるタンパク質と、下部画分に認められるタンパク質について比較した。結果は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）画分に高度に豊富化された多数の膜関連タンパク質が存在することを示した。ＥＶ（例えば、エクソソーム）タンパク質には、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１が含まれた。
７．１１．２．実施例２：表面タンパク質発現の検証
質量分析試験で特定されたＥＶ（例えば、エクソソーム）特異的タンパク質が、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面で高度に豊富化されることを確認するために、タンパク質ブロッティングを、骨髄由来ＭＳＣからの全細胞溶解物及び精製ＥＶ（例えば、エクソソーム）集団で実行する。総タンパク質パターンは、全細胞溶解物とＥＶ（例えば、エクソソーム）溶解物との間で実質的に異なる。具体的には、ＥＶ（例えば、エクソソーム）溶解物には、全細胞溶解物に存在しない強力なバンドが存在する。ＣＤ１３のウエスタンブロッティングは、強力なバンドがＣＤ１３に対応することを明らかにし、ＣＤ１３が、骨髄由来ＭＳＣから産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）で高度に豊富化され、全ＥＶ（例えば、エクソソーム）溶解物において視覚的に検出可能であり得ることを示す。
７．１１．３．実施例３：エクソソームタンパク質の特異的発現
エクソソームタンパク質の特異性を決定するために、質量分析試験及びウエスタンブロット分析を（実施例１に記載されるように）実施して、精製されたエクソソームに発現される潜在的な足場タンパク質を特定し（例えば、図１を参照されたい）、様々な細胞型から産生されるエクソソームでのいくつかの新規のエクソソーム関連膜タンパク質の発現を分析した。具体的には、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びＨＥＫ２９３細胞に由来するエクソソームを分析した。これらの細胞型からのＥＶ（例えば、エクソソーム）画分をＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配で精製し、ウエスタンブロッティングによって分析した。
異なるエクソソームタンパク質の同一性を決定するために、ＭＳＣに由来するエクソソームに認められるタンパク質とＨＥＫ２９３細胞からのエクソソームに認められるタンパク質について、全ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）を比較した。図１に示されるように、骨髄由来ＭＳＣからのエクソソーム試料を分析したとき、ＣＤ１３は、エクソソーム画分で高度に豊富化されていることが観察された。しかしながら、ＨＥＫ２９３細胞からの試料を分析したところ、ＣＤ１３は、エクソソーム画分または任意の他の画分において検出されなかった。同様の結果は、ＭＭＥについて観察された（図１を参照されたい）。
新規の表面マーカータンパク質の各々を、同様に分析した。データは、特定のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ１３及びＭＭＥ）は、特定の細胞型（例えば、ＭＳＣ）からのエクソソーム上で豊富化されているが、異なる細胞型（例えば、ＨＥＫ２９３）から産生されるエクソソームには存在しないことを示す。
７．１１．４．実施例４：産生細胞からのＣＤ１３の過剰発現
実施例３における結果は、ＣＤ１３及び他のエクソソームタンパク質（例えば、ＭＭＥ）が、様々な細胞型から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）に普遍的には存在しないことを実証した。例えば、ＣＤ１３は、骨髄由来ＭＳＣから産生されたエクソソームで高度に豊富化されたが、ＨＥＫ２９３細胞から産生されたエクソソームでは存在しなかった。
ＣＤ１３が、天然ではＣＤ１３を有するエクソソームを産生しない産生細胞で、エクソソーム足場タンパク質として使用できるか決定するために、ＨＥＫ２９３細胞を、ＦＬＡＧタグに融合した全長ＣＤ１３を発現するプラスミド（「ＣＤ１３－ＦＬＡＧプラスミド」）によって安定的にトランスフェクトした。エクソソームを、野生型ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞及びＣＤ１３－ＦＬＡＧプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＳＦ細胞から精製した。対照として、エクソソームを、ＰＴＧＦＲＮ足場タンパク質を過剰発現するように操作されたＨＥＫ２９３ＳＦ細胞から精製した。
図２Ａに提供されるＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析結果は、ＣＤ１３－ＦＬＡＧが、ＣＤ１３－ＦＬＡＧプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＳＦ細胞において良好に過剰発現されたことを示す。ＣＤ１３の過剰発現は、ＰＴＧＦＲＮと比較して、ＨＥＫ２９３由来エクソソームで同様の豊富化をもたらした。そして、図２Ｂ（右のグラフ）に示されるように、ＣＤ１３－ＦＬＡＧプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＳＦ細胞から産生されたエクソソームも、それらの表面で高レベルのＣＤ１３を発現した。ＥＶで発現されたＣＤ１３は、組換えＣＤ１３タンパク質に匹敵する活性レベルで生物学的に活性であった（図３Ａ及び図３Ｂを参照されたい）。これらの結果は、エクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ１３）を天然に発現しない産生細胞（例えば、ＨＥＫ２９３ＳＦ）が、エクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ１３）を過剰発現するエクソソームを産生するように改変され得ることを実証する。これらの結果は、ＣＤ１３などのエクソソームタンパク質が、異種エクソソームタンパク質、すなわち、ＣＤ１３を含む操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）を生成するために使用することができることを示す。さらに、本明細書に開示される改変細胞（例えば、ＣＤ１３－ＦＬＡＧプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＳＦ細胞）から精製されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、異種エクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ１３）の天然の触媒活性を示す。
同様な処理は、様々な細胞型を使用して、本明細書に記載されるＣＤ１３及び他のＨＥＶＰに対して実行することができ、例えば、ＣＤ１３は、ＣＨＯ細胞に導入することができ（それが天然に発現されない場合）、ＭＭＥは、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ細胞に導入することができ（それが天然に発現されない場合）、ＥＮＰＰ１は、ＣＨＯ細胞に導入することができ（それが天然に発現されない場合）、ＮＲＰ１は、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ細胞に導入することができる（それが天然に発現されない場合）。
７．１１．５．実施例５：改変エクソソームタンパク質の生成
本明細書に記載されるように、本明細書に開示されるエクソソームタンパク質は、改変されて（例えば、切断されるか、または別の部分に結合される）、特定の特性（例えば、特定の細胞型に対する標的化の増加）を示すよう改変されたエクソソームタンパク質を発現するＥＶ（例えば、エクソソーム）を提供することができる。改変エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、全エクソソームタンパク質または切断エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して生成される。特異的な切断されたエクソソームタンパク質は、様々な切断されたエクソソームタンパク質をスクリーニングして、エクソソーム膜に組み込んで結合剤と相互作用する最適な能力を有する切断されたタンパク質を選択することによって、選択される。切断されたタンパク質のエクソソーム膜への標的化は、ナノフローサイトメトリーによって試験される。
改変エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、親和性タグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、Ｓ－ペプチド、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど）をコードするポリヌクレオチドを、完全なまたは切断されたエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１）をコードするポリヌクレオチドに付加することによって生成される。改変ポリヌクレオチドは、融合タンパク質を発現する。ポリヌクレオチドは、エクソソーム膜へのそれらの標的化及び／または結合剤へのそれらの親和性を改善するようにさらに改変される。
改変エクソソームタンパク質をコードする異なるタイプのポリヌクレオチドは、治療用ペプチド（例えば、抗体、酵素、リガンド、受容体、抗微生物ペプチド、それらの変異体、または断片）をコードするポリヌクレオチドを、完全なまたは切断されたエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１）をコードするポリヌクレオチドに付加することによって生成される。改変ポリヌクレオチドは、エクソソームの表面に提示される融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、治療用ペプチドの治療活性を維持する。
改変エクソソームタンパク質をコードする異なるタイプのポリヌクレオチドは、標的化部分（例えば、特定の器官、組織、または細胞に特異的な標的化部分）をコードするポリヌクレオチドを、完全なまたは切断されたエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１）をコードするポリヌクレオチドに付加することによって生成される。改変ポリヌクレオチドは、エクソソームの表面に提示される融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、エクソソームが特定の器官、組織、または細胞に標的化されることを可能にする。
エクソソーム表面での改変エクソソームタンパク質の局在化もまた、ナノフローサイトメトリーによって試験される。
７．１１．６．実施例６：表面操作されたエクソソームの生成
表面操作されたエクソソームを生成する産生細胞は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードする外因性配列を導入することによって作製される。エクソソームタンパク質をコードするプラスミドを一過性にトランスフェクトして、エクソソーム表面でエクソソームタンパク質の高レベル発現を誘導する。改変エクソソームタンパク質をコードするプラスミドを一過性にトランスフェクトして、表面に改変エクソソームタンパク質を有するエクソソームを産生する。
エクソソームタンパク質、エクソソームタンパク質の変異体もしくは断片、または親和性タグ、治療用ペプチドもしくは標的化部分をコードする外因性配列をコードするポリヌクレオチドで、安定的に産生細胞を形質転換して、表面操作されたエクソソームを産生する。親和性タグ、治療用ペプチドまたは標的化部分をコードする外因性配列を、エクソソームタンパク質をコードするゲノム部位に挿入し、エクソソームタンパク質に結合した親和性タグを含む融合タンパク質を生成する。改変エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、エクソソームタンパク質をコードするゲノム部位にノックインされる。
産生細胞株は、少なくとも２つのポリヌクレオチドを安定的にトランスフェクトすることによって生成され、各々は、エクソソームタンパク質、エクソソームタンパク質の変異体もしくは断片、または外因性ペプチド（例えば、親和性タグ、標的化部分、治療用ペプチド）をコードする。異なる産生細胞株はまた、２つ以上の外因性配列（例えば、親和性タグ、マーカー、標的化ペプチド、治療用ペプチドなどをコードする外因性配列）を、複数のゲノム部位に、エクソソームタンパク質をコードするゲノム配列の中またはそれに近接して挿入することによって生成され、複数の改変エクソソームタンパク質を含む表面操作されたエクソソームを生成する。複数の改変エクソソームタンパク質の各々は、エクソソームの表面を標的とする。エクソソームは、２つの異なる結合剤に対する親和性を有し、結合剤のいずれかまたは両方によって精製される。
７．１１．７．実施例７：親和性精製によるエクソソームの単離、精製、及びサブ画分化
エクソソームの親和性精製のための結合剤は、穏やかな条件下で溶離するバイオパニング／指向性展開によって開発される。
結合剤は固体支持体（例えば、多孔性アガロースビーズ）に結合させ、従来のクロマトグラフィーシステム（例えば、ＧＥ ＡＫＴＡ）を形成させる。エクソソームを含有する試料を、親和性精製のためにカラムに適用する。
７．１１．８．実施例８：エクソソームを標的にする異なる足場部分の分析
上記の実施例６に加えて、ＣＤ１３及びＭＭＥタンパク質の能力を、ＨＥＫ２９３細胞に由来するエクソソームの表面にタンパク質を標的化するそれらの能力について試験した。簡単に説明すると、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合した全長ＣＤ１３またはＧＦＰに融合した全長ＭＭＥを発現するプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞に安定的にトランスフェクトした。比較目的のために、ＧＦＰに融合したＰＴＧＦＲＮを過剰発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞も生成した。
図４Ａに示されるように、ＣＤ１３－ＧＦＰまたはＭＭＥ－ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、関心対象の特定のエクソソームタンパク質を発現した。全体的な発現は、ＰＴＧＦＲＮを過剰発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞において観察されたＰＴＧＦＲＮ－ＧＦＰの発現と同様であった。そして図４Ｂに示されるように、ＣＤ１３－ＧＦＰ及びＭＭＥ－ＧＦＰ融合タンパク質の両方は、それぞれのＨＥＫ２９３産生細胞から産生されたＥＶにおいて適切に折り畳まれ、発現された。
まとめると、上記の結果は、ある特定のエクソソームタンパク質（例えば、本明細書に開示される異種エクソソーム小胞タンパク質、例えば、ＣＤ１３及びＭＭＥ）が、異種タンパク質を天然に発現しない産生細胞に外因的に導入され得ることを実証する。結果は、かかる改変産生細胞から産生されるＥＶ（例えば、エクソソーム）が異種エクソソームタンパク質を発現することができ、これを使用して様々な分子（例えば、抗原、標的化部分、アジュバント、及び／または免疫調節物質）をＥＶ（例えば、エクソソーム）に固定することができることをさらに実証する。
８．参照により組み込まれる
本出願で引用された全ての刊行物、特許、特許出願及び他の文書は、各個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、全ての目的のために参照により組み込まれることが個々に示されているのと同じ範囲まで、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
９．均等物
本開示は、とりわけ、カンナビノイドの組成物及び随伴組成物を提供する。本開示はまた、カンナビノイド及び随伴組成物を投与することによって神経変性疾患を治療する方法を提供する。様々な具体的な実施形態が例示され、説明されているが、上記の明細書は限定されるものではない。本開示（複数可）の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。多くの変更は、本明細書の見直しにより当業者に明らかになるであろう。
非公式配列リスト
配列番号４７
ＣＤ１３
＞ｓｐ｜Ｐ１５１４４｜ＡＭＰＮ＿ＨＵＭＡＮ アミノペプチダーゼ Ｎ ＯＳ＝Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＡＮＰＥＰ ＰＥ＝１ ＳＶ＝４
Figure 2022519275000001
 配列番号４８
ＭＭＥ
＞ｓｐ｜Ｐ０８４７３｜ＮＥＰ＿ＨＵＭＡＮ ネプリライシン ＯＳ＝Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＭＭＥ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２
Figure 2022519275000002
 配列番号４９
ＥＮＰＰ１
＞ｓｐ｜Ｐ２２４１３｜ＥＮＰＰ１＿ＨＵＭＡＮ エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１ＯＳ＝Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＥＮＰＰ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２
Figure 2022519275000003
Figure 2022519275000004
 配列番号５０
ＮＲＰ１
＞ｓｐ｜Ｏ１４７８６｜ＮＲＰ１＿ＨＵＭＡＮ ニューロピリン－１ ＯＳ＝Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＮＲＰ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝３
Figure 2022519275000005

Claims (47)

  1. 少なくとも１つの異種細胞外小胞タンパク質（ＨＥＶＰ）またはその断片を含む細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記ＥＶが、前記ＨＥＶＰを天然に発現しない産生細胞から産生され、前記ＨＥＶＰが、ドナー細胞によって天然に産生される、前記細胞外小胞（ＥＶ）。
  2. 前記ＥＶが、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の異種細胞外小胞タンパク質（ＨＥＶＰ）またはその断片を含み、前記ＥＶが、前記ＨＥＶＰを天然に発現しない産生細胞から産生され、前記ＨＥＶＰが、ドナー細胞によって天然に産生される、請求項１に記載のＥＶ。
  3. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記ＨＥＶＰのレベルが、タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による液体クロマトグラフィーを使用して測定される約２０ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  4. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記ＨＥＶＰのレベルが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される約８０ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  5. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記ＨＥＶＰのレベルが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約１２５ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  6. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記ＨＥＶＰのレベルが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約１７０ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  7. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記ＨＥＶＰのレベルが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約２００ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  8. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記ＨＥＶＰのレベルが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約７００ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）以上である、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  9. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記ＨＥＶＰのレベルが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約１７７ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＥＶ。
  10. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記ＨＥＶＰのレベルが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定する約７４２ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）である、請求項１～８のいずれか一項に記載のＥＶ。
  11. 前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記少なくとも１つのＨＥＶＰのレベルが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される約２０～約８０ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載のＥＶ。
  12. 前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記少なくとも１つのＨＥＶＰのレベルが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される約８０～約２００ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）である、請求項１～５のいずれか一項に記載のＥＶ。
  13. 前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記少なくとも１つのＨＥＶＰのレベルが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して測定される約１５０～約７５０ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）である、請求項１～８のいずれか一項に記載のＥＶ。
  14. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、エクソソームを産生するドナー細胞によって天然に産生され、前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームにおける前記少なくとも１つのＨＥＶＰのレベルが、前記ドナー細胞によって産生される前記エクソソームの総タンパク質含有量の約５％以上である、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  15. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰまたはその断片が、融合タンパク質である、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  16. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰまたはその断片が、機能的部分の付加によって改変される、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  17. 前記機能的部分が、結合剤に対する親和性を有する、請求項１６に記載のＥＶ。
  18. 前記機能的部分が、親和性タグである、請求項１７に記載のＥＶ。
  19. 前記親和性タグが、ペプチドである、請求項１８に記載のＥＶ。
  20. 前記機能的部分が、治療用化合物である、請求項１６に記載のＥＶ。
  21. 前記治療用化合物が、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載のＥＶ。
  22. 前記治療用化合物が、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、小分子、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載のＥＶ。
  23. 前記治療用化合物が、抗体またはその断片である、請求項２０に記載のＥＶ。
  24. 前記治療用化合物が、酵素、リガンド、受容体、またはその断片である、請求項２０に記載のＥＶ。
  25. 前記機能的部分が、標的化部分である、請求項１６に記載のＥＶ。
  26. 前記標的化部分が、器官、組織、または細胞に特異的である、請求項２５に記載のＥＶ。
  27. 前記融合タンパク質が、リンカーを含む、請求項１５～２６のいずれか一項に記載のＥＶ。
  28. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰまたはその断片と、前記機能的部分との間のリンカーをさらに含む、請求項１６～２７のいずれか一項に記載のＥＶ。
  29. 前記リンカーが、可撓性リンカーまたは剛性リンカーである、請求項２７または２８に記載のＥＶ。
  30. 前記リンカーが、直鎖炭素リンカー、分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーである、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のＥＶ。
  31. 前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項２７～３０のいずれか一項に記載のＥＶ。
  32. 前記産生細胞が、ＨＥＫ、ＣＨＯ、ＭＢ－２３１、Ｒａｊｉ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＡＰ、ＭＳＣ細胞、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  33. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、肺線維芽細胞ＥＶＰ、大動脈内皮細胞ＥＶＰ、急性骨髄性白血病細胞ＥＶＰ、単球ＥＶＰ、Ｂ細胞リンパ腫ＥＶＰ、マクロファージＥＶＰ、脳内皮細胞ＥＶＰ、間葉系細胞ＥＶＰ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  34. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、ヒトＥＶＰ、マウスＥＶＰ、ラットＶＥＰ、イヌＥＶＰ、またはサルＥＶＰである、請求項３３に記載のＥＶ。
  35. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１、またはそれらの断片からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  36. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、ＣＤ１３、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、及びＮＲＰ１、またはそれらの断片からなる群から選択され、前記産生細胞が、ＣＨＯ細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  37. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、ＣＤ１３、ＭＭＥ、及びＮＲＰ１、またはそれらの断片からなる群から選択され、前記産生細胞が、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  38. 前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  39. 前記細胞外小胞が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＥＶＰをさらに含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＥＶ。
  40. 前記産生細胞が、非ヒト細胞であり、前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、ヒトＨＥＶＰである、先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶ。
  41. 前記産生細胞が、ヒト細胞であり、前記少なくとも１つのＨＥＶＰが、非ヒトＨＥＶＰである、請求項１～３９のいずれか一項に記載のＥＶ。
  42. 先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶを含む、医薬製剤。
  43. 先行請求項のいずれか一項に記載のＥＶまたは医薬製剤を含むキットであって、前記ＥＶまたは医薬製剤が、容器またはパッケージ内に含有され、前記キットが、前記ＥＶまたは医薬製剤の推奨される使用を記載する説明書をさらに含む、前記キット。
  44. 治療を必要とする患者を治療するための方法であって、前記患者に有効量の請求項１～４２のいずれか一項に記載のＥＶまたは医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
  45. 細胞に由来するＥＶにおいて非天然発生タンパク質を発現させる方法であって、少なくとも１つの異種細胞外小胞タンパク質（ＨＥＶＰ）またはその断片をコードする核酸を前記細胞においてトランスフェクションすることと、前記ＨＥＶＰまたはその断片を含むＥＶを前記細胞から単離することと、を含み、前記ＨＥＶＰが、前記細胞に由来する前記ＥＶにおいて天然に発生していない、前記方法。
  46. 前記ＥＶが、請求項１～４１のいずれか一項に記載のＥＶを含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ＥＶの前記ＨＥＶＰをさらに特徴付ける、請求項４５または４６に記載の方法。
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