CN114112867A - 外泌体纯度分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种外泌体纯度分析方法，用分子排阻法联合颗粒计数法，在这个分析方法中，采用SEC柱子对外泌体样本进行分子大小的纯度分析，但是SEC不能特异性的分开和外泌体大小类似的脂质体或者蛋白多聚物，所以联合了纳米流式检测仪对染色后样本的颗粒进行计数，根据其能够对外泌体染色，不能染脂质体和蛋白的原理，来对外泌体和杂质分别统计，增加外泌体纯度的准确性。
Description
技术领域
本发明属于分析技术领域，尤其是涉及一种外泌体纯度分析方法。
背景技术
外泌体的分离是近年来一种新型行业，常用的外泌体纯度分析方法是分子排阻法，由于外泌体形状相似但是大小不一，内容物组分复杂，除了外泌体以外，还可包含其他杂质，例如脂质类物质和蛋白多聚物，导致对外泌体的分离造成了极大的困难。外泌体样本中往往会存在一些杂质，可能是脂质体、也可能是随制备过程产生的一些杂质，如果仅依靠分子排阻法来判断外泌体纯度的话，明显是可以产生不准确的结果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种外泌体纯度分析方法。
本发明采用的技术方案是：外泌体纯度分析方法，分子排阻法测定外泌体样本纯度为A；
通过颗粒计数方法计算得到外泌体样本纯度为B；
外泌体纯度为A×B。
优选地，对外泌体样本染色标记，检测外泌体样本总颗粒数为x，检测具有染色的颗粒数y，则有：
B=y/x。
优选地，通过纳米流式检测仪检测荧光标记后外泌体样本纯度B。
优选地，通过水溶性染料处理外泌体样本。
优选地，所述水溶性染料为荧光素钠。
优选地，荧光素钠加入到外泌体样本中，浓度为8-12μM，37℃孵育24h后清洗。
优选地，先对外泌体进行破膜，再加入水溶性染料。
优选地，加入皂苷对外泌体进行破膜。
优选地，外泌体染色后进行SPE柱脱盐。
优选地，采用SEC柱，通过HPLC对外泌体样本纯度进行测定。
优选地，先通过分子排阻法测定A，再通过颗粒计数法测定B；
或者，先通过颗粒计数法测定B，再通过分子排阻法测定A。
本发明具有的优点和积极效果是：联合HPLC和颗粒计数法对外泌体样本的纯度进行分析，分别从尺寸和种类上进行了考量，充分排除了小分子杂质和与外泌体等径的杂质对分析工作造成的影响，提高了对外泌体纯度分析的准确性。
附图说明
图1是本发明实施例1中外泌体HPLC-SEC纯度；
图2是本发明实施例1中外泌体荧光纯度；
图3是本发明实施例2中外泌体HPLC-SEC纯度；
图4是本发明实施例2中外泌体荧光纯度。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
本发明公开一种外泌体纯度分析方法，分别通过分子排阻法和颗粒计数法对同一外泌体样本进行纯度检测。分子排阻法测定外泌体样本纯度为A；通过颗粒计数方法计算得到外泌体样本纯度为B；则外泌体纯度为A×B。分子排阻法能够通过粒径大小对外泌体样本进行分析，计算得到的纯度值A为外泌体和与外泌体粒径相似杂质的物质在外泌体样本中的占比。本发明颗粒计数法通过纳米流式检测仪计算得到的，但是纳米流式检测仪难以计数小分子杂质，但是能够分辨与外泌体粒径相似的杂质，与分子排阻法结合，进一步确定外泌体在外泌体样本中的占比。这样在分子大小层面就区分了外泌体与一些小分子物质；在与外泌体大小相当的杂质层面，就被颗粒计数法区别开来，所以两种方法联合使用就能够增加对外泌体纯度的准确度。
颗粒计数法中，对外泌体样本染色标记，孵育洗涤后，通过纳米流式检测仪检测外泌体样本总颗粒数为x，具有染色的颗粒数y，则有B=y/x。
其中，采用水溶性染料处理外泌体样本，水溶性染料可以对外泌体进行染色，但是不可以染亲脂性物质，与外泌体粒径相似的多为脂质体，难以被水溶性染料染色。本发明某些实施例中水溶性染料为荧光素钠，染色方法为将荧光素钠加入到外泌体样本中，工作浓度为8-12μM，37℃孵育24h后清洗。外泌体染色后进行SPE柱脱盐，除去多余荧光素钠染料及其他小分子杂质，提高外泌体纯度测定的准确性。
分子排阻法采用SEC柱，通过HPLC对外泌体样本纯度进行测定。在适宜的条件（流速和流动相），对样品进行初步的纯度分析，根据蛋白marker分子量，判断外泌体应该出现的位置，然后根据峰对图谱进行处理，初步判断外泌体的纯度A。
本发明某些实施例中，分子排阻法和颗粒计数法可分别进行，再处理得到最终的外泌体浓度，先通过分子排阻法测定A，再通过颗粒计数法测定B，或者，先通过颗粒计数法测定B，再通过分子排阻法测定A。
下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：
1.HPLC检测
取外泌体样本1，通过高效液相色谱仪，采用SEC柱（Acclaim SEC-1000, 7 µ m，1000 Å，7.8 x 150 mm），以0.3ml/min流速,含有150mMNaCl的20mM磷酸盐（PH=7.2）水溶液为流动相进行等度洗脱，外泌体样本1上样体积为25ul,在紫外吸光值280nm下进行检测。
根据蛋白marker分子量，已知外泌体出峰位置为9min并对图谱进行处理，初步确定外泌体纯度，如图1所示，纯度为100%。
2.荧光素钠染色颗粒计数检测
取外泌体样本1(与HPLC检测为相同样本）,取50ul至2ml离心管中；加入200ul浓度为10mg/ml的皂苷溶液并将其充分混匀，对外泌体进行破膜以便于荧光素钠染色；
向混匀后的样本中加入20ul浓度为1mM的荧光素钠染料，充分混匀；补充PBS溶液，使皂苷最终工作浓度为1mg/ml,荧光素钠染料最终工作浓度为10uM；在37℃的水浴锅中孵育24h，确保染色完全；
对孵育后染色样本进行SPE柱脱盐，除去多余荧光素钠染料及其他小分子杂质，确保不会对纳米流式检测造成干扰：准备一个规格为3ml的SPE脱盐柱空柱，选择以1:1比例保存在20%乙醇中的7FF作为填料。将7FF填料与乙醇充分混匀移取2ml至SPE空柱中，过夜静置确保填料与乙醇完全分离，此时柱子中7FF填料体积为1ml。
将前一天静置SPE柱以1000gx2min离心除去上层乙醇，并以相同条件用PBS清洗两个柱体积。加入200ul染色样本，500gx1min离心收集洗脱样本用于纳米流式检测仪检测。通过纳米流式检测仪检测样本中荧光颗粒占比，即为样本中外泌体的占比，如图2所示，占比率为95.9%。
3.计算：最终该外泌体纯度为:95.9%(95.9%=100%×95.9%）
实施例2：
1.HPLC检测
取外泌体样本2，通过高效液相色谱仪，采用SEC柱（Acclaim SEC-1000, 7 µ m，1000 Å，7.8 x 150 mm），以0.3ml/min流速,含有150mMNaCl的20mM磷酸盐（PH=7.2）水溶液为流动相进行等度洗脱，外泌体样本2上样体积为25ul,在紫外吸光值280nm下进行检测。根据蛋白marker分子量，已知外泌体出峰位置为9min并对图谱进行处理，初步确定外泌体纯度，如图3所示，纯度为54.0799%。
2.荧光素钠染色颗粒计数检测
取外泌体样本2 (与HPLC检测为相同样本）,取50ul至2ml离心管中；加入200ul浓度为10mg/ml的皂苷溶液并将其充分混匀，对外泌体进行破膜以便于荧光素钠染色；
向混匀后的样本中加入20ul浓度为1mM的荧光素钠染料，充分混匀；加入PBS溶液，使皂苷最终工作浓度为1mg/ml,荧光素钠染料最终工作浓度为10uM；在37℃的水浴锅中孵育24h，确保染色完全；
对孵育后染色样本进行SPE柱脱盐，除去多余荧光素钠染料及其他小分子杂质，确保不会对纳米流式检测造成干扰：准备一个规格为3ml的SPE脱盐柱空柱，选择以1:1比例保存在20%乙醇中的7FF作为填料。将7FF填料与乙醇充分混匀移取2ml至SPE空柱中，过夜静置确保填料与乙醇完全分离，此时柱子中7FF填料体积为1ml。
将前一天静置SPE柱以1000gx2min离心除去上层乙醇，并以相同条件用PBS清洗两个柱体积，加入200ul染色样本，500gx1min离心收集洗脱样本用于检测。通过纳米流式检测仪检测样本中荧光颗粒占比，即为样本中外泌体的占比，如图4所示占比率为96.9%。
3.计算：最终该外泌体纯度为:52.4%(52.4%=54.0799%×96.9%）
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (11)
1.外泌体纯度分析方法，其特征在于：分子排阻法测定外泌体样本纯度为A；
通过颗粒计数方法计算得到外泌体样本纯度为B；
外泌体纯度为A×B。
2.根据权利要求1所述的外泌体纯度分析方法，其特征在于：对外泌体样本染色标记，检测外泌体样本总颗粒数为x，检测具有染色的颗粒数y，则有：
B=y/x。
3.根据权利要求2所述的外泌体纯度分析方法，其特征在于：通过纳米流式检测仪检测荧光标记后外泌体样本纯度B。
4.根据权利要求2所述的外泌体纯度分析方法，其特征在于：通过水溶性染料处理外泌体样本。
5.根据权利要求4所述的外泌体纯度分析方法，其特征在于：所述水溶性染料为荧光素钠。
6.根据权利要求5所述的外泌体纯度分析方法，其特征在于：荧光素钠加入到外泌体样本中，浓度为8-12μM，37℃孵育24h后清洗。
7.根据权利要求4-6中任一所述的外泌体纯度分析方法，其特征在于：先对外泌体进行破膜，再加入水溶性染料。
8.根据权利要求7所述的外泌体纯度分析方法，其特征在于：加入皂苷对外泌体进行破膜。
9.根据权利要求2-6中任一所述的外泌体纯度分析方法，其特征在于：外泌体染色后进行SPE柱脱盐。
10.根据权利要求1-6中任一所述的外泌体纯度分析方法，其特征在于：采用SEC柱，通过HPLC对外泌体样本纯度进行测定。
11.根据权利要求1-6中任一所述的外泌体纯度分析方法，其特征在于：先通过分子排阻法测定A，再通过颗粒计数法测定B；
或者，先通过颗粒计数法测定B，再通过分子排阻法测定A。
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