CN103890009A

CN103890009A - 白细胞介素-31单克隆抗体

Info

Publication number: CN103890009A
Application number: CN201280046131.2A
Authority: CN
Inventors: G.F.巴莫特; S.A.敦哈姆
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Zoetis Services LLC
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-07-05
Also published as: MX2014000803A; RS56268B1; CN103890009B; US20190359702A1; DK2734549T3; AU2012285432B2; RS60924B1; NZ620031A; AU2012285432A1; LT3219729T; SI3219729T1; HUE051068T2; US20140286958A1; PL3219729T3; BR112014001407A2; EP3842456A1; AR087281A1; KR101613024B1; EP2734549A1; HRP20201634T1

Abstract

本发明提供了特异性结合到犬白细胞介素-31(IL-31)或猫IL-31中的至少一种上的分离的抗体。此类抗体可以是用于治疗狗和猫体内的瘙痒和/或过敏症的诊断和/或兽用组合物形式。

Description

白细胞介素-31单克隆抗体

技术领域

本发明涉及重组单克隆抗体领域及其在临床与科学程序，包括诊断程序中的用途。本发明还提供了用于治疗狗或猫的瘙痒症或过敏症的兽用组合物形式的分离的抗-IL31抗体。

背景技术

特异性皮炎已经由美国兽医皮肤病学会特别工作组定义为“一种具有特征性临床表现的基因易患性炎症和瘙痒过敏性皮肤疾病(Olivry等人，Veterinary Immunology and Immunopathology2001;81:143-146)。该特别工作组还认识到，犬的此类疾病与变应原-特异性IgE相关(Olivry等人，2001supra;Marsella&Olivry Clinics in Dermatology2003;21:122-133)。严重瘙痒伴随着继发性脱毛与红斑对宠物主人而言是最为明显和关心的症状。

因贫乏和不一致的流行病学数据，特异性皮炎的流行率尚不能精确得知，但是估计为犬类总数的10%(Marsella&Olivry2003supra;Scott等人，Canadian Veterinary Journal2002;43:601-603;HillierVeterinary Immunology and Immunopathology2001;81:147-151)。在全球，大约4.5亿只狗患有这种慢性和终身的疾病。发病率似乎在升高。怀疑品种和性别的偏向，但是随地理区域会发生巨大的变化(Hillier，2001supra;Picco等人，Vet Dermatol.2008;19:150-155)。

过敏性皮炎中涉及的潜在因素很多，但了解甚少。食物成分可能引发特异性皮炎(Picco，2008supra)，以及环境变应原如跳蚤、尘螨、豚草、植物提取物等等。遗传因素也起着重要的作用。尽管并无证实的品种偏向，某些遗传方式被认为提高了对特异性皮炎的易感性(Sousa&Marsella Veterinary Immunology and Immunopathology2001;81:153-157;Schwartzman等人，Clin.Exp.Immunol.1971;9:549-569)。

白细胞介素-31(IL-31)是2004年克隆的细胞因子。其主要由活化的T辅助(Th)2细胞产生(Dillon等人，Nat Immunol2004;5:752-60)，也是也可以在肥大细胞和巨噬细胞中产生。IL-31结合由IL-31受体A(IL-31RA)和制瘤素M受体(OSMR)组成的共同受体(Dillon等人，2004supra和Bilsborough等人，J Allergy Clin Immunol.2006117(2):418-25)。受体激活导致通过JAK受体的STAT磷酸化。该共同受体的表达已经显示在巨噬细胞、角质形成细胞中和在背根神经节中。近来，已经发现IL-31涉及皮炎、瘙痒性皮肤病损、过敏和气道过敏，参见图1。

用抗CD3和抗CD28抗体刺激T细胞立即上调IL-31mRNA表达(Dillon等人，2004supra)。微阵列分析已经表明，IL-31诱导某些趋化基因如CXCL1、CLL17(胸腺和活化调节的趋化因子[TARC])、CCL19(巨噬细胞炎性蛋白[MIP]3β)、CCL22(单核细胞衍生的趋化因子[MDC])、CCL23(MIP3)和CCL4(MIPβ)(Dillon等人，2004supra)。

过度表达IL-31的转基因小鼠表现出皮肤炎症、瘙痒、严重皮炎和脱毛(Dillon等人，2004supra)。对小鼠皮下注射IL-31触发了被炎性细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润，并导致表皮增厚和皮肤黑棘。在患有自然原因导致的特异性皮炎(AD)的NC/Nga小鼠中，IL-31在皮肤损伤中过度表达并与瘙痒有关(Takaoka等人，EurJ.Pharmacol.2005;516，180-181；Takaoka等人，Exp.Dermatol.2006;15，161-167)。同样，在小鼠模型中，IL-31已经显示引发了迅速发作的瘙痒(Raap等人，J Allergy Clin Immunol.2008;122(2):421-3)。

进一步的研究表明，IL-31与特应性皮炎引起的人类的皮肤炎症和瘙痒有关。在人类AD患者中，IL-31mRNA的表达在皮肤损伤中远高于在非皮损皮肤中的表达，并且在非皮损皮肤中的表达远大于在来自健康患者的正常皮肤中的表达(Sonkoly等人，J Allergy Clin Immunol2006;117:411-7)。另一研究已经报道了AD患者皮肤内的CD45RO+(记忆)皮肤淋巴细胞抗原(CLA))阳性T细胞表达IL-31mRNA和蛋白质(Bilsborough等人，2006supra)。还已经报道了患者皮肤中的IL-31mRNA过度表达或变态反应性接触性皮炎与IL-4和IL-13mRNA表达有关，但是与干扰素(IFN)-γmRNA表达无关(Neis等人，J.Allergy Clin.Immunol.2006;118，930-937)。此外，IL-31血清水平已经显示在患有慢性自发性荨麻疹的人类患者体内提高，在AD患者体内甚至更高(Raap等人，Exp Dermatol.2010;19(5):464-6)。同样，在人体内已经观察到了AD的严重程度与血清IL-31水平的相关性(Rapp等人，2008supra)。已经显示了在IgE交联后并在特应性个体中响应于金黄色葡萄球菌超抗原IL-31在肥大细胞中分泌提高。此外，IL-31已经显示了在人结肠肌成纤维细胞中刺激产生几种促炎介质，包括IL-6、IL-8、CXCL1、CC17和多种金属蛋白酶(Yagi等人，International Journal ofMolecular Medicine2007;19(6):941-946)。

针对环境变应原的I型超敏反应被认为是犬AD的主要机制，并且Th2-介导的细胞因子，如IL-4的水平在患有AD的狗的皮肤损伤中提高(Nuttall等人，Vet.Immunol.Immunopathol.2002;87，379-384)。此外，infiltration by炎性细胞、淋巴细胞和中性粒细胞浸润是潜在加重皮肤损伤的重要机制；趋化基因CCL17/TARC、CCR4和CCL28/黏膜相关上皮趋化因子(MEC)的过度表达在患有AD的狗体内导致皮肤损伤加重(参见Maeda等人，Vet.Immunol.Immunopathol.2005;103，83-92；Maeda等人，Vet.Immunol.Immunopathol.2002b;90，145-154；和Maeda等人，J.Vet.Med.Sci.2008;70，51-55)。

最近的证据表明，IL-31可能参与促进变态反应性炎症与变态反应性哮喘的呼吸道上皮响应特性(Chattopadhyay等人，J Biol Chem2007;282:3014-26；和Wai等人，Immunology，2007;122，532-541)。

这些观察结果支持了IL-31在瘙痒与过敏症中起到显著作用的假说。合意的是提供可用于治疗狗或猫的瘙痒症和/或过敏症的针对IL-31的治疗性抗体。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合到犬IL-31或猫IL-31中的至少一种上的分离的抗体。在一些实施方案中，该抗体是一种单克隆抗体。在一个实施方案中，该单克隆抗体是嵌合的。在另一个实施方案中，该抗体是犬源化的或猫源化的。

在一些实施方案中，该抗体减轻、抑制或中和狗或猫体内的IL-31活性。在优选的实施方案中，该抗体减轻、抑制或中和瘙痒症或过敏症。瘙痒症包括例如特异性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒。过敏症包括例如变态反应性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、马喘息病、气道炎症性疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺疾病和自身免疫引起的炎症过程，如肠易激综合征(IBS)。

在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合部分，其包括以下的至少一个：

具有以下氨基酸序列的可变重(V_H)链互补决定区(CDR)1：YYDIN(SEQ ID NO:1;11E12-VH-CDR1)，SYDMS(SEQ ID NO:2;19D07-VH-CDR1)或NYGMS(SEQ ID NO:3;34D03-VH-CDR1)；

具有以下氨基酸序列的可变重链CDR2：WIFPGDGGTKYNETFKG(SEQ ID NO:4;11E12-VH-CDR2)，TITSGGGYTYSADSVKG(SEQ ID NO:5;19D07-VH-CDR2)或TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID NO:6;34D03-VH-CDR2)；

具有以下氨基酸序列的可变重链CDR3：ARGGTSVIRDAMDY(SEQ ID NO:7;11E12-VH-CDR3)，ARQNWVVGLAY(SEQ ID NO:8;19D07-VH-CDR3)或VRGYGYDTMDY(SEQ ID NO:9;34D03-VH-CDR3)；以及

其在CDR1、CDR2或CDR3的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。

在另一个实施方案中，本发明提供包括下列基团的至少一种的分离的抗体或其抗原结合部分：

包含具有以下氨基酸序列的互补决定区(CDR)1的可变轻(V_L)链：RASESVDNYGISFMH(SEQ ID NO:10;11E12-VL-CDR1)，KSSQSLLNSGNQKNYLA(SEQ ID NO:11;19D07-VL-CDR1)或KASQSVSFAGTGLMH(SEQ ID NO:12;34D03-VL-CDR1)；

具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR2：RASNLES(SEQ ID NO:13;11E12-VL-CDR2)，GASTRES(SEQ ID NO:14;19D07-VL-CDR2)或RASNLEA(SEQ ID NO:15;34D03-VL-CDR2)；

具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR3：QQSNKDPLT(SEQ IDNO:16;11E12-VL-CDR3)，QNDYSYPYT(SEQ ID NO:17;19D07-VL-CDR3)或QQSREYPWT(SEQ ID NO:18;34D03-VL-CDR3)；以及

在又一个实施方案中，具有上述可变轻链CDR的至少一种的抗体可以进一步包括下列可变重链CDR的至少一种：

具有以下氨基酸序列的可变重链互补决定区(CDR)1：YYDIN(SEQ ID NO:1;11E12-VH-CDR1)，SYDMS(SEQ ID NO:2;19D07-VH-CDR1)或NYGMS(SEQ ID NO:3;34D03-VH-CDR1)；

在一些实施方案中，该抗体可以包括下列的至少一种：

a)可变轻链，包含：

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNKDPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:19;MU-11E12-VL)，

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK(SEQ ID NO:20;CAN-11E12-VL-cUn-FW2)，DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWFQQKPGQSPQLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK(SEQ ID NO:21;CAN-11E12-VL-cUn-13)，

DIVMSQSPSSLSVSAGDKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPWQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:22;MU-19D07-VL)，

EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYGASTRESGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:23;CAN-19D07-VL-998-1)，DILLTQSPASLAVSLGQRAIISCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLEAGVPTRFSGSGSRTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSREYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:24;MU-34D03-VL)，或

EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQAPKLLIYRASNLEAGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQSREYPWTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:25;CAN-34D03-VL-998-1)；

b)可变重链，包含：

QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFKYYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDGGTKYNETFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARGGTSVIRDAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:26;MU-11E12-VH)，

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFKYYDINWVRQAPGAGLDWMGWIFPGDGGTKYNETFKGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRAGDIAVYYCARGGTSVIRDAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27；CAN-11E12-VH-415-1)，

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQIPEKRLEWVATITSGGGYTYSADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:28；MU-19D07-VH)，

EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLQWVATITSGGGYTYSADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:29；CAN-19D07-VH-400-1)，

EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFSFSNYGMSWVRQTPDKRLEWVATISYGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:30；MU-34D03-VH)，或

EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLQWVATISYGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:31；CAN-34D03-VH-568-1)；和

c)其具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。

在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到SEQ ID NO:32的犬IL-31氨基酸序列的大约氨基酸残基95位至125位之间的区域或猫IL-31中的相应区域上的单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体特异性结合到SEQ ID NO:32的犬IL-31氨基酸序列的大约氨基酸残基102位至122位之间的区域或猫IL-31中的相应区域上。

本发明还提供包括治疗有效量的至少一种上述抗体的兽用组合物。

在其它实施方案中，本发明提供能产生上述抗体的宿主细胞。

在再其它实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，该核酸包括编码以下至少一种的核酸序列：

具有以下氨基酸序列的可变重(V_H)链互补决定区(CDR)1：YYDIN(SEQ ID NO:1；11E12-VH-CDR1)，SYDMS(SEQ ID NO:2；19D07-VH-CDR1)或NYGMS(SEQ ID NO:3；34D03-VH-CDR1)；

具有以下氨基酸序列的可变重链CDR2：WIFPGDGGTKYNETFKG(SEQ ID NO:4；11E12-VH-CDR2)，TITSGGGYTYSADSVKG(SEQ ID NO:5；19D07-VH-CDR2)或TISYGGSYTYYPDNIKG(SEQ ID NO:6；34D03-VH-CDR2)；

具有以下氨基酸序列的可变重链CDR3：ARGGTSVIRDAMDY(SEQ ID NO:7；11E12-VH-CDR3)，ARQNWVVGLAY(SEQ ID NO:8；19D07-VH-CDR3)或VRGYGYDTMDY(SEQ ID NO:9；34D03-VH-CDR3)；以及

在进一步实施方案中，上述分离的核酸可以进一步包括编码下列至少一种的核酸序列：

包含具有以下氨基酸序列的互补决定区(CDR)1的可变轻(V_L)链：RASESVDNYGISFMH(SEQ ID NO:10；11E12-VL-CDR1)，KSSQSLLNSGNQKNYLA(SEQ ID NO:11；19D07-VL-CDR1)或KASQSVSFAGTGLMH(SEQ ID NO:12；34D03-VL-CDR1)；

具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR2：RASNLES(SEQ ID NO:13；11E12-VL-CDR2)，GASTRES(SEQ ID NO:14；19D07-VL-CDR2)或RASNLEA(SEQ ID NO:15；34D03-VL-CDR2)；

具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR3：QQSNKDPLT(SEQ IDNO:16；11E12-VL-CDR3)，QNDYSYPYT(SEQ ID NO:17；19D07-VL-CDR3)或QQSREYPWT(SEQ ID NO:18；34D03-VL-CDR3)；以及

本发明进一步提供包括至少一种上述核酸的载体。

在其它实施方案中，本发明提供了制造抗体的方法，包括在导致产生该抗体的条件下培养上述宿主细胞，并从该宿主细胞或该宿主细胞的培养介质中分离该抗体。

还提供了治疗症状或疾病的方法，所述症状或疾病选自瘙痒症或过敏症，包括施用治疗有效量的上述抗体。在一些实施方案中，该瘙痒症选自特异性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒。在其它实施方案中，待治疗的过敏症至选自变态反应性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、马喘息病、气道炎症性疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺疾病和自身免疫引起的炎症过程，如肠易激综合征(IBS)。

进一步提供了通过施用上述抗体抑制狗或猫体内的IL-31活性的方法。

还提供了检测或定量样品中IL-31的方法，该方法包括在上述抗体的存在下培养含有IL-31的临床或生物样品；并检测结合到样品中的IL-31上的抗体。在一个实施方案中，可检测地标记该抗体。在另一个实施方案中，该抗体是未标记的，并与标记过的第二抗体组合使用。

附图概述

图1是IL-31途径(pathway)的示意图。

图2是突出抗原结合位点的小鼠免疫球蛋白G(IgG)分子的一般结构的示意图。

图3是小鼠:犬嵌合IgG的一般结构的示意图。

图4是显示小鼠IgG的形态或“犬源化”的图解，小鼠CDR接枝到由序列数据库识别的犬框架上。

图5是配对具有完全犬源化重链的嵌合轻链的“杂源嵌合(heterochimeric)”单克隆抗体的图解。

图6相对于预先放血和阳性的对照物小鼠的来自IL-31免疫小鼠(CF-1MU#1–4)的ELISA Titers。

图7是显示对恒定区的引物和指向小鼠可变区的简并引物的抗体可变链的图解。

图8是安慰剂对照、单剂量、SC研究(76A60)中嵌合11E12的药效试验的图。

图9是显示研究76A60中登记的狗的个体瘙痒评分的表。

图10是显示11E12的嵌合的(Blot#1)、犬源化的(Blot#2)和杂源嵌合的(Blots#3和4)版本结合到犬IL-31的Western蛋白质印迹。Blot#3中的杂源嵌合体(heterochimera)具有与嵌合重链配对的犬源化轻链。Blot#4中的杂源嵌合体具有与犬源化重链配对的嵌合轻链。各硝化纤维素印迹含有预染蛋白质标准品(Seeblue plus2,Invitrogen Corp.,Carlsbad，CA)(左泳道)和800ng的犬IL-31(右泳道)。

图11是犬源化11E12轻链框架替换工作的示意图。

图12是显示具有单一回复突变的11E12的犬源化版本结合到小鼠框架2轻链残基上的Western蛋白质印迹。各硝化纤维素印迹含有预染蛋白质标准品(Seeblue plus2,Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)(左泳道)和800ng的犬IL-31(右泳道)。

图13是采用全长和截短的犬IL-31蛋白质的Western蛋白质印迹。个体硝化纤维素印迹用A)抗-His B)34D03和C)11E12抗体探测。印迹的泳道1-9对应如下：泳道1——预染蛋白质标准品(Seeblue plus2,Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)；泳道2——全长犬IL-31；泳道3——N-末端截短-20N；泳道4——N-末端截短-40N；泳道5——N-末端截短-60N；泳道6——C-末端截短-20C；泳道7——C-末端截短-40C；泳道8——C-末端截短-60C；和泳道9——β-半乳糖苷酶(lacZ)。注意：全长IL-31和具有C-末端截短的蛋白质(-20、-40C和-60C)在这些条件下没有显示可检测的表达。

图14是采用截短的犬IL-31蛋白质的Western蛋白质印迹。个体硝化纤维素印迹用A)抗-His、B)11E12和C)34D03抗体探测。印迹的泳道1-5对应如下：泳道1——预染蛋白质标准品(Seeblue plus2,Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)；泳道2——在20-122位置处的C-末端截短；泳道3——在位置20-100处的C-末端截短；泳道4——在位置20-80处的C-末端截短；和泳道5——β-半乳糖苷酶(lacZ)。

图15是采用表达具有替换各氨基酸位置(76-122)的丙氨酸的犬IL-31的大肠杆菌(E.coli)菌株的裂解物的Western蛋白质印迹片段。如图中所示，个体硝化纤维素印迹用抗-His、11E12和34D03抗体探测。

图16是在犬IL-31中具有双重和三重突变的Western蛋白质印迹的片段。-20N蛋白质裂解物作为阳性对照物运行。

图17是显示皮下注射犬源化的34D03抗体(1.0mg/kg)的狗的瘙痒评分的图。在用1.5μg/kg犬IL-31激发的前一天(基线响应)和后一天(2h响应)对每次研究测量瘙痒评分。

图18是含有提纯的犬和猫IL-31蛋白质的4-12%Bis Tris SDSPAGE。板A显示了在还原性条件下运行的蛋白质的考马斯亮蓝染色。板B显示了在非还原性条件下运行的蛋白质的考马斯亮蓝染色。板C和D是分别与A和B相同的凝胶的Western蛋白质印迹，用抗-His抗体探测。泳道1——犬IL-31；泳道2——猫IL-31；泳道3——预染蛋白质标准品(Seeblue plus2,Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)；泳道4——犬IL-31；和泳道5——猫IL-31。

图19是大肠杆菌(E.coli)中制造的犬和猫IL-31诱导的在犬DH-82单核细胞中的pSTAT信令的图。犬IL-31(CHO)是用于所有先前的基于细胞的测定，狗瘙痒模型和作为抗体初步鉴定的免疫原的参比蛋白质。

图20是显示在涉及11E12和34D03抗体(用加号标注)的结合的区域中猫与犬IL-31之间的序列保守性的对比。

图21是采用IL-31蛋白质的Western蛋白质印迹。个体硝化纤维素印迹用A)抗-His、B)11E12和C)34D03抗体探测。注意：犬IL-31(CHO)不含6-His tag。

图22是比较猫源化和犬源化抗体34D03的显示犬DH82单核细胞中pSTAT信令引发的犬IL-31抑制的图。

图23是用猫源化抗体34D03探测的在还原性条件下猫和犬IL-31的Western蛋白质印迹。

序列概述

SEQ ID NO:1是在本文中称为11E12-VH-CDR1的可变重链CDR1；

SEQ ID NO:2是在本文中称为19D07-VH-CDR1的可变重链CDR1；

SEQ ID NO:3是在本文中称为34D03-VH-CDR1的可变重链CDR1；

SEQ ID NO:4是在本文中称为11E12-VH-CDR2的可变重链CDR2；

SEQ ID NO:5是在本文中称为19D07-VH-CDR2的可变重链CDR2；

SEQ ID NO:6是在本文中称为34D03-VH-CDR2的可变重链CDR2；

SEQ ID NO:7是在本文中称为11E12-VH-CDR3的可变重链CDR3；

SEQ ID NO:8是在本文中称为19D07-VH-CDR3的可变重链CDR3；

SEQ ID NO:9是在本文中称为34D03-VH-CDR3的可变重链CDR3；

SEQ ID NO:10是在本文中称为11E12-VL-CDR1的可变轻链CDR1；

SEQ ID NO:11是在本文中称为19D07-VL-CDR1的可变轻链CDR1；

SEQ ID NO:12是在本文中称为34D03-VL-CDR1的可变轻链CDR1；

SEQ ID NO:13是在本文中称为11E12-VL-CDR2的可变轻链CDR2；

SEQ ID NO:14是在本文中称为19D07-VL-CDR2的可变轻链CDR2；

SEQ ID NO:15是在本文中称为34D03-VL-CDR2的可变轻链CDR2；

SEQ ID NO:16是在本文中称为11E12-VL-CDR3的可变轻链CDR2；

SEQ ID NO:17是在本文中称为19D07-VL-CDR3的可变轻链CDR3；

SEQ ID NO:18是在本文中称为34D03-VL-CDR3的可变轻链CDR3；

SEQ ID NO:19是在本文中称为MU-11E12-VL的可变轻链序列；

SEQ ID NO:20是在本文中称为CAN-11E12-VL-cUn-FW2的可变轻链序列；

SEQ ID NO:21是在本文中称为CAN-11E12-VL-cUn-13的可变轻链序列；

SEQ ID NO:22是在本文中称为MU-19D07-VL的可变轻链序列；

SEQ ID NO:23是在本文中称为CAN-19D07-VL-998-1的可变轻链序列；

SEQ ID NO:24是在本文中称为MU-34D03-VL的可变轻链序列；

SEQ ID NO:25是在本文中称为CAN-34D03-VL-998-1的可变轻链序列；

SEQ ID NO:26是在本文中称为MU-11E12-VH的可变重链序列；

SEQ ID NO:27是在本文中称为CAN-11E12-VH-415-1的可变重链序列；

SEQ ID NO:28是在本文中称为MU-19D07-VH的可变重链序列；

SEQ ID NO:29是在本文中称为CAN-19D07-VH-400-1的可变重链序列；

SEQ ID NO:30是在本文中称为MU-34D03-VH的可变重链序列；

SEQ ID NO:31是在本文中称为CAN-34D03-VH-568-1的可变重链序列；

SEQ ID NO:32是对应GenBank登录号C7G0W1的氨基酸序列并相应于犬IL-31全长蛋白质；

SEQ ID NO:33是对应GenBank登录号C7G0W1的核苷酸序列并相应于该核苷酸序列编码的犬IL-31全长蛋白质；

SEQ ID NO:34是编码在本文中称为MU-11E12-VL的可变轻链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:35是编码在本文中称为MU-11E12-VH的可变重链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:36是编码在本文中称为MU-19D07-VL的可变轻链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:37是编码在本文中称为MU-19D07-VH的可变重链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:38是编码在本文中称为MU-34D03-VL的可变轻链序的核苷酸序列；

SEQ ID NO:39是编码在本文中称为MU-34D03-VH的可变重链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:40是在本文中称为HC-64的犬重链恒定区的氨基酸序列(GenBank登录号AF354264)；

SEQ ID NO:41是编码在本文中称为HC-64的犬重链恒定区的核苷酸序列(GenBank登录号AF354264)；

SEQ ID NO:42是在本文中称为HC-65的犬重链恒定区的氨基酸序列(GenBank登录号AF354265)；

SEQ ID NO:43是编码在本文中称为HC-65的犬重链恒定区的核苷酸序列(GenBank登录号AF354265)；

SEQ ID NO:44是在本文中称为kappa的犬轻链恒定区的氨基酸序列(GenBank登录号XP_532962)；

SEQ ID NO:45是编码称为kappa的犬轻链恒定区的核苷酸序列(GenBank登录号XP_532962)；

SEQ ID NO:46是编码在本文中称为CAN-19D07-VL-998-1的可变轻链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:47是编码在本文中称为CAN-19D07-VH-998-1的可变重链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:48是编码在本文中称为CAN-34D03-VL-998-1的可变轻链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:49是编码在本文中称为CAN-34D03-VH-568-1的可变重链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:50是编码在本文中称为CAN-11E12-VL-cUn-FW2的可变轻链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:51是编码在本文中称为CAN-11E12-VH-415-1的可变重链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:52是编码在本文中称为CAN-11E12-VL-cUn-13的可变轻链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:53是在本文中称为CAN-11E12_VL_cUn_1的可变轻链序列；

SEQ ID NO:54是编码在本文中称为CAN-11E12-VL-cUn-1的可变轻链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:55对应用于E.coli表达的本文中所用的犬IL-31全长构造的氨基酸序列；

SEQ ID NO:56是对应用于E.coli表达的本文中所用的犬IL-31全长构造的核苷酸序列；

SEQ ID NO:57是对应用于E.coli表达的犬IL-31-20N构造的氨基酸序列；

SEQ ID NO:58是对应用于E.coli表达的犬IL-31-20N构造的核苷酸序列；

SEQ ID NO:59是对应用于E.coli表达的犬IL-31-40N构造的氨基酸序列；

SEQ ID NO:60是对应用于E.coli表达的犬IL-31-40N构造的核苷酸序列；

SEQ ID NO:61是对应用于E.coli表达的犬IL-31-60N构造的氨基酸序列；

SEQ ID NO:62是对应用于E.coli表达的犬IL-31-60N构造的核苷酸序列；

SEQ ID NO:63是对应用于E.coli表达的犬IL-3120-122构造的氨基酸序列；

SEQ ID NO:64是对应用于E.coli表达的犬IL-3120-122构造的核苷酸序列；

SEQ ID NO:65对应用于E.coli表达的犬IL-3120-100构造的氨基酸序列；

SEQ ID NO:66是对应用于E.coli表达的犬IL-3120-100构造的核苷酸序列；

SEQ ID NO:67是对应用于E.coli表达的犬IL-3120-80构造的氨基酸序列；

SEQ ID NO:68是对应用于E.coli表达的犬IL-3120-80构造的核苷酸序列；

SEQ ID NO:69是对应用于E.coli表达的猫IL-31全长构造的核苷酸序列；

SEQ ID NO:70是对应用于E.coli表达的猫IL-31全长构造的氨基酸序列；

SEQ ID NO:71是在本文中称为FEL-34D03-VL-021-1的可变轻链序列；

SEQ ID NO:72是编码在本文中称为FEL-34D03-VL-021-1的可变轻链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:73是在本文中称为FEL-34D03-VH-035-1的可变重链序列；

SEQ ID NO:74是编码在本文中称为FEL-34D03-VH-035-1的可变重链序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:75是在本文中称为HC-A Feline的猫重链恒定区的氨基酸序列(GenBank登录号AB016710.1)；

SEQ ID NO:76是编码在本文中称为HC-A Feline的猫重链恒定区的核苷酸序列(GenBank登录号AB016710.1)；

SEQ ID NO:77是在本文中称为LC-Kappa Feline的猫轻链恒定区的氨基酸序列(GenBank登录号AF198257.1)；

SEQ ID NO:78是编码在本文中称为LC-Kappa Feline的猫轻链恒定区的核苷酸序列(GenBank登录号AF198257.1)。

定义

在详细描述本发明之前，将定义本发明上下文中使用的几个术语。除了这些术语之外，如果需要的话，其它术语在说明书中其它地方予以定义。除非另行明确定义，本说明书中使用的现有技术的术语具有本领域公认的含义。

说明书与权利要求书中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数，除非上下文另行明确规定。例如，提到“一抗体”包括多个此类抗体。

本文中所用的术语“包含”意在指该组合物和方法包括所列举的元素，但是不排除其它元素。

本文中所用的表位是指抗体的CDR所识别的抗原决定簇。换言之，表位指的是能够被抗体识别并被抗体结合的任何分子的部分。除非另行说明，本文中所用术语“表位”指的是抗IL-31剂对其为反应性的IL-31的区域。

“抗原”是能够被抗体结合的分子或分子的一部分，其附加地能够被抗体识别并被抗体结合(相应的抗体结合区域可以称为互补位)。通常，表位由分子的化学活性表面分组组成，例如氨基酸或糖侧链，并具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。

在抗体结合的上下文中的术语“特异性”是指抗体高抗体亲抗原性和/或高亲和力结合到特定抗原，即多肽，或表位上。在许多实施方案中，特定抗原是用于免疫动物宿主的抗原，由所述宿主分离抗体产生细胞。抗体特异性结合抗原比相同抗体对其它抗原的结合更牢固。特异性结合到多肽的抗体能够以弱但仍可检测的水平结合其它多肽(例如对相关多肽所显示的结合的10%或更低)。此类弱结合，或背景结合例如通过使用适当的对照物可以轻易地与对对象多肽的特异性抗体结合区分开来。通常，特异性抗体以具有10^-7M或更低，例如10^-8M或更低(例如10^-9M或更低、10^-10或更低、10^-11或更低、10^-12或更低，或10^-13或更低等等)的K_D的结合亲和力结合至抗原。

本文中所用的术语“抗体”指的是具有两个轻链和两个重链的完整的免疫球蛋白。由此，单一的分离抗体或片段可以是多克隆抗体、单克隆抗体、合成抗体、重组抗体、嵌合的抗体、杂源嵌合的抗体、犬源化的抗体或猫源化的抗体。术语“抗体”优选指的是单克隆抗体及其片段，以及其能结合到IL-31蛋白及其片段上的免疫结合等效物。术语抗体用于指均质分子或混合物，如由多种不同的分子实体构成的血清产物。

“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。各轻链通过一个共价二硫化物键连接至至重链，而二硫化物连接的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中改变。各重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫键。各重链在一个末端处具有一个可变域(V_H)，接着是多个恒定域。各轻链在一个末端处具有可变域(V_L)，并在另一末端处具有恒定域；该轻链的恒定域与该重链的第一恒定域对齐，并且该轻链可变域与该重链的可变域对齐。人们认为，特定氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。图2是突出抗原结合位点的天然小鼠免疫球蛋白G(IgG)的一般结构的实例。

术语“抗体片段”指的是小于完整抗体结构，包括但不限于单一抗体链、Fv结构、Fab结构、Fc结构、轻链可变或互补性决定区(CDR)序列等等。

术语“可变”区域包括框架和CDR(也称为高变的)，并且指的是以下事实；在抗体之间，可变域的某些部分的序列广泛不同，并用于各特定抗体对其特定抗原的结合与特异性。但是，可变性并非在抗体的可变域中均匀分布。其集中在轻链与重链可变域中的称为高变区的三个片段中。可变域的更为高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含多个FR，其主要采用β-片层构型，通过三个高变区连接，其形成环接，并在一些情况下构成α-片层结构的一部分。各链中的高变区通过FR区紧密地固定在一起并与来自其它链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991),第647-669页)。该恒定域并不直接涉及抗体对抗原的结合，但是表现出各种效应子功能，如该抗体参与抗体依赖性细胞毒性。

术语“高变区”在本文中使用时指的是负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。该高变区含有来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(Kabat等人，(1991)，上文)和/或来自“高变环”的那些残基(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“框架”或“FR”残基是除了本文中定义的高变区残基之外的那些可变域残基。

木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点，和一个残余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了具有两个抗原结合位点并仍能够交联抗原的F(ab′)₂片段。

“Fv”是最小抗体片段，其包含完整的抗原识别和结合位点。该区域由一个重链和一个轻链可变域的紧密、非共价结合的二聚体组成。在这种结构中，各可变域的三个高变区相互作用以确定V_H-V_L二聚体表面上的抗原结合位点。总之，六个高变区赋予该抗体以抗原结合特异性。但是，即使单个可变域(或仅包含三个对该抗原为特异性的高变区的Fv的一半)的高变区也能够识别和结合抗原，尽管在比完整亲合位点更低的亲和力下进行。

该Fab片段还含有该轻链的恒定域和该重链的第一恒定域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于，前者在包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链CH1域的羧基末端增加了几个残基。Fab′-SH在本文中是对其中恒定域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初作为一对其间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段制得。其它抗体片段的化学耦合也是已知的。

来自任何脊椎动物物类的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以根据其恒定域的氨基酸序列分配为称作kappa(κ)和lambda(λ)两种截然不同的类型中的一种。

取决于它们的重链的恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配至不同类别。目前存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可以进一步分为小类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2(如通过小鼠和人类designation定义)。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别是所谓的α、Δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型在多种物类中是公知的。个别同种型的发病率和与这些恒定域相关的官能活性是种属特异性的，并必须通过实验来确定。

本文中定义的“单克隆抗体”是通过细胞的单一克隆产生的抗体(特别地，杂交瘤细胞的单一克隆)并因此是单一纯净的均质型抗体。由相同克隆产生的所有单克隆抗体是相同的，并具有相同的抗原特异性。术语“单克隆”涉及细胞、单细胞和该细胞的后代的单一克隆。

本文中的单克隆抗体具体包括其中一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种的抗体中的相应序列相同或同源而该链的其余部分与衍生自另一物种的抗体中的相应序列相同或同源的“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，以及此类抗体的片段，只要它们表现出所需的生物学活性。通常，嵌合的抗体是通常通过基因工程由属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因构建其轻链和重链基因的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变节段可以连接到犬恒定节段上。图3是小鼠:犬IgG的一个实施方案的一般结构的示意图。在该实施方案中，该抗原结合位点衍生自小鼠，而F_c部分是犬的。

非犬(例如鼠类)抗体的“犬源化”形式是含有衍生自非犬免疫球蛋白的最小序列的基因工程抗体。犬源化抗体是犬免疫球蛋白序列(受体抗体)，其中该受体的高变区残基被来自非犬物种如具有所需特异性、亲合力和能力的小鼠的高变区残基(给体抗体)替代。在一些例子中，犬免疫球蛋白序列的框架区(FR)残基被相应的非犬残基替代。此外，犬源化抗体可以包括在受体抗体中或在给体抗体中并未发现的残基。进行这些修饰以便进一步改善抗体性能。通常，该犬源化抗体基本包括所有的至少一个、通常两个的可变域，其中所有或基本所有的高变区对应于非犬免疫球蛋白序列的那些，并且所有或基本所有的FR是犬免疫球蛋白序列的那些。该犬源化抗体任选还将包含完整的、或至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为犬免疫球蛋白序列的恒定区。图4是显示小鼠IgG的形态或“犬歯化”的一个实施方案的图解。在该实施方案中，小鼠CDR接枝到犬框架上。

非猫(例如鼠类)抗体的“猫源化”形式是含有衍生自非猫免疫球蛋白的最小序列的基因工程抗体。猫源化抗体是猫免疫球蛋白序列(受体抗体)，其中该受体的高变区残基被来自非猫物种如具有所需特异性、亲合力和能力的小鼠的高变区残基(给体抗体)替代。在一些例子中，猫免疫球蛋白序列的框架区(FR)残基被相应的非猫残基替代。此外，猫源化抗体可以包括在受体抗体中或在给体抗体中并未发现的残基。进行这些修饰以便进一步改善抗体性能。通常，该猫源化抗体基本包括所有的至少一个、通常两个的可变域，其中所有或基本所有的高变区对应于非猫免疫球蛋白序列的那些，并且所有或基本所有的FR是猫免疫球蛋白序列的那些。该猫源化抗体任选还将包含完整的、或至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为猫免疫球蛋白序列的恒定区。

本文中所定义的术语“杂源嵌合”指的是其中抗体链之一(重链或轻链)是犬源化的而其它链是嵌合的一种抗体。图5描述了杂源嵌合的分子的一个实施方案。在该实施方案中，犬源化的可变重链(其中所有的CDR是小鼠的，并且所有FR是犬的)与嵌合的可变轻链(其中所有的CDR是小鼠的，并且所有FR是小鼠)配对。在该实施方案中，可变重链和可变轻链均稠合至犬恒定区。

“变体“抗IL-31抗体在本文中指的是通过添加、缺失和/或替换亲本抗体序列中的一个或多个氨基酸残基并保持亲本抗IL-31抗体的至少一种所需活性而使该氨基酸序列不同于“亲本”抗IL-31抗体氨基酸序列的分子。所需活性可以包括特异性结合该抗原的能力，减轻、抑制或中和动物体内IL-31活性的能力，以及在基于细胞的测定中抑制IL-31介导的pSTATD信号传导的能力。在一个实施方案中，该变体在亲本抗体的一个或多个高变和/或框架区中包含一个或多个氨基酸替换。例如，该变体可以在亲本抗体的一个或多个高变和/或框架区中包含至少一个、例如大约一个至大约十个、优选大约两个至大约五个替换。通常，该变体将具有一氨基酸序列，该氨基酸序列具有与亲本抗体重链或轻链可变域序列的至少50%的氨基酸序列同一性，更优选至少65%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%和最优选至少95%的序列同一性。相对于该序列的同一性或同源性在本文中定义为在对齐序列并在需要时引入缺口染色体以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与亲本抗体残基相同的氨基酸残基的百分比。N-封端、C-封端或内部延长、缺失或插入抗体序列均不应理解为影响序列同一性或同源性。该变体保持结合IL-31的能力并优选具有优异于亲本抗体的那些的所需活性。例如，该变体可以具有更牢固的结合亲合力、增强的减轻、抑制或中和动物体内IL-31活性的能力和/或在基于细胞的测定中增强的抑制IL-31介导pSTAT信号传导的能力。

“变体”核酸在本文中指的是序列形式不同于“亲本”核酸的分子。多核苷酸序列趋异可能是由于突变变化如缺失、替换或添加一个或多个核苷酸。这些变化各自可以在给定序列中单独或组合地、一次或多次地发生。

本文中的“亲本”抗体是用于制备该变体的氨基酸序列编码的抗体。优选地，该亲本抗体具有犬框架区域，并且如果存在的话，具有犬抗体恒定区。例如，该亲本抗体可以是犬源化抗体或犬抗体。作为另一实例，该亲本抗体可以是猫源化抗体或猫抗体。作为再一个实例，该亲本抗体是鼠单克隆抗体。

术语“分离的”指的是将该材料(例如抗体或核酸)从其天然环境的组分中分离和/或回收。其天然环境的污染物组分是干扰该材料的诊断或治疗用途的材料，并可能包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。关于核酸，分离的核酸可以包括从通常在染色体中与之相关的5′至3′序列中分离的核酸。在优选的实施方案中，该材料将被提纯至大于该材料的95重量%，最优选大于99重量%。分离的材料包括原位位于重组细胞中的材料，因为该材料的天然环境的至少一种组分将不存在。但是，通常分离的材料将通过至少一个提纯步骤来制备。

词语“标记”在本文中使用时指的是直接或间接结合到该抗体或核酸上的可检测化合物或组合物。该标记本身可以是自身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。

术语“核酸”、“多核苷酸”、“核酸分子”等等可以在本文中互换使用，并指的是在DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)。该核酸可以含有脱氧核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。术语“核酸”包括例如单链和双链分子。核酸可以是例如基因或基因片段、外显子、内含子、DNA分子(例如cDNA)、RNA分子(例如mRNA)、重组核酸、质粒和其它载体、引物和探针。包括5′至3′(有义)和3′至5′(反义)多核苷酸。

“对象”或“患者”指的是可以被本发明的分子影响的需要治疗的动物。根据本发明可以治疗的动物包括脊椎动物，哺乳动物如犬、猫和马科动物是特别优选的实例。

“治疗有效量”(或“有效量”)指的是当施用于对象或患者时足以产生有益或所需结果的活性成分(例如本发明的药剂)的量。有效量可以以一次或多次给药、应用或剂量来施用。本发明的组合物的治疗有效量可以容易地由本领域普通技术人员来确定。在本发明的上下文中，“治疗有效量”是在与瘙痒症或过敏性疾病的治疗(包括症状的临床改善)相关的一个或多个参数方面产生客观测得的变化的量。当然，取决于待治疗的特定对象和疾病、对象的体重和年龄、疾病症状的严重程度、所选择的特定化合物、要遵循的给药方案、给药时间、给药方式等等，该治疗有效量将变化，所有这些可以由本领域普通技术人员容易地确定。

本文中所用的术语“治疗(therapeutic)”涵盖了对疾病或病症的全方位治疗。本发明的“治疗”剂可以以预防性或防范性的方式起作用，包括包含设计针对可以识别为有风险(遗传药理学)的动物的程序；或以改良性或实质上治疗性的方式起作用；或者可以起作用以减缓要治疗的疾病或病症的至少一种症状进展的速率或程度。

“治疗(treatment)”、“治(treating)”等等指的是治疗性处理和预防性或防范性措施。需要治疗的动物包括已经患有该病症的那些以及其中要预防该病症的那些。术语“治疗”或“治“疾病或病症包括针对该疾病或病症的预防或防护(即，使临床症状不会发展)；抑制疾病或病症(即，阻止或抑制临床症状的发展)；和/或缓解疾病或病症(即，使临床症状消退)。如要理解的那样，并非总是能够区分“预防”和“抑制”疾病或病症，因为最终的诱发事件可能是未知的或潜在的。因此，术语“预防”应理解为构成一类治疗，其涵盖“防止”和“抑制”。术语“治疗”由此包括“预防”。

术语“过敏性疾病”在本文中定义为免疫系统与体外物质之间相互作用所引起的病症或疾病。这种外来物质称为“变应原”。常见变应原包括气源性变应原如花粉、尘埃、霉菌、尘螨蛋白、由昆虫叮咬注入的唾液等等。过敏性疾病的实例包括但不限于以下：变态反应性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、马喘息病、气道炎症性疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺疾病和自身免疫引起的炎症过程，如肠易激综合征(IBS)。

术语“瘙痒症”在本文中定义为特征在于产生要摩擦或搔抓皮肤以获得缓解的冲动的强烈痒觉的疾病或病症。瘙痒症的实例包括但不限于以下：特异性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒。

本文中所用术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语可以包括它们的后代，其为任意或所有后代。要理解的是由于有意或无意的突变，所有后代可能不同。在表达异源核酸序列的上下文中，“宿主细胞”指的是无论在体外还是体内的原核或真核细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞)。例如，宿主细胞可以位于转基因动物体内。宿主细胞可以用作载体的受体，并可以包括任何能够复制载体和/或表达由载体编码的异源核酸的可转化生物体。

“组合物”意在指活性剂与可以是惰性(例如标签)或活性的另一化合物或组合物(如佐剂)的组合。

如本文中定义，适用于本发明的药物可接受载体是本领域技术人员公知的。此类载体包括但不限于水、盐水、缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、醇/水溶液、乳液或悬浮液。其它常规使用的稀释剂、佐剂和赋形剂可以根据常规技术添加。此类载体可以包括乙醇、多元醇及其合适的混合物、植物油和可注射的有机酯。缓冲剂和pH调节剂也可以使用。缓冲剂包括但不限于由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括但不限于有机酸盐，如以下酸的盐：柠檬酸(例如柠檬酸盐)、抗坏血酸、葡糖酸、组氨酸-盐酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸、Tris、盐酸氨基丁三醇(trimethanmine hydrochloride)或磷酸盐缓冲剂。肠胃外载体可以包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖、海藻糖、蔗糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内载体可以包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些，等等。防腐剂和其它添加剂如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂(例如EDTA)、多情气体等等也可以在药物载体中提供。本发明不受载体选择的限制。由上述组分制备具有合适的pH等渗性、稳定性和其它常规特征的这些药物可接受组合物在本领域技术范围内。例如参见文本如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott Williams&Wilkins，2000年出版；和The Handbook of Pharmaceutical Excipients，4.sup.th edit.,eds.R.C.Rowe等人，APhA Publications,2003。

术语“保守氨基酸替换”表示对给定氨基酸残基的任何氨基酸替换，其中替换残基在化学上如此类似于给定残基以至于多肽功能(例如酶促活性)基本未降低。保守氨基酸替换是本领域公知的，其实例描述在例如美国专利号6,790,639、6,774,107、6,194,167或5,350,576中。在一个优选实施方案中，保守氨基酸替换可以是发生在下列六组之一中的任意一种：

1.小的脂族、基本非极性的残基：Ala、Gly、Pro、Ser和Thr；

2.大的脂族、非极性残基：Ile、Leu和Val；Met；

3.极性带负电荷残基及其酰胺：Asp和Glu；

4.极性带负电荷残基的酰胺：Asn和Gln；His；

5.极性带正电荷残基：Arg和Lys；His；以及

6.大的芳族残基：Trp和Tyr；Phe。

在一个优选实施方案中，保守氨基酸替换将是下列的任意一种，其作为天然残基(保守替换)对列举：Ala(Ser)；Arg(Lys)；Asn(Gln；His)；Asp(Glu)；Gln(Asn)；Glu(Asp)；Gly(Pro)；His(Asn；Gln)；Ile(Leu；Val)；Leu(Ile；Val)；Lys(Arg；Gln；Glu)；Met(Leu；Ile)；Phe(Met；Leu；Tyr)；Ser(Thr)；Thr(Ser)；Trp(Tyr)；Tyr(Trp；Phe)和Val(Ile；Leu)。

由于多肽可以含有保守氨基酸替换，聚核苷酸于此可以含有保守密码子替换。如果在表达时其产生如上所述的保守氨基酸替换，密码子替换被认为是保守的。简并密码子替换，其导致无氨基酸替换，也可用于本发明的多核苷酸。由此，例如，编码可用于本发明的实施方案的所选多肽的多核苷酸可以通过简并密码子替换发生突变以接近要用其转化的表达宿主细胞所表现出来的该密码子使用频率，或以其它方式改善其表达。

发明详述

要理解的是，本发明不限于本文中描述的特定方法、方案和试剂等，因此可能发生变化。本文中所用的术语仅用于描述特定实施方案。并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。

除非另行规定，与本文中所述抗体结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文中灵性要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，与本文中所述的细胞核组织培养、分子生物学和蛋白质与寡-或多核苷酸化学以及杂交技术结合使用的术语以及其技术是本领域中公知且常用的那些。

标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养与转染(例如电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商说明书或如本领域中通常完成的那样或如本文中所述进行。前述技术与程序通常根据本领域公知的常规方法并如本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体参考文献中所述那样进行。参见例如Sambrook等人，MOLECULARCLONING:LAB.MANUAL(第3版，Cold Spring Harbor Lab.Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,2001)和Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology(New York:Greene Publishing Association/WileyInterscience,1993)。与本文中所述的分析化学、合成有机化学和医药化学结合使用的术语以及其实验室程序和技术是本领域公知且常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和输送，以及患者的治疗。

除了在操作实施例中，或另行说明，本文中所用的所有表示成分的量或反应条件的数值应理解为在所有情况下用术语“大约”来修饰。

确定的所有专利与其它出版物出于描述和公开例如可能与本发明结合使用的此类出版物中所述方法的目的明确地经此引用并入本文。仅为其在本申请提交日前的公开内容而提供这些出版物。

本发明提供重组单克隆抗体和肽及其在临床与科研程序(包括诊断程序)中的用途。

随着分子生物学方法和重组技术的到来，有可能通过重组手段产生抗体和抗体样分子，并由此生成编码该抗体的多肽结构中发现的特定氨基酸序列的基因序列。此类抗体可通过克隆编码所述抗体的多肽链的基因序列或通过直接合成所述多肽链并组装合成的链以形成对特定表位和抗原决定簇具有亲合力的活性四聚体(H₂L₂)结构来制造。这使得易于制造具有来自不同物种和来源的中和抗体的序列特性的抗体。

不考虑该抗体的来源，或者它们如何重组构建，或者如何使用转基因动物、实验室或商业规模的大量细胞培养物、使用转基因植物、或通过直接化学合成(在该方法任何阶段均不使用活的有机体)在体外或体内合成它们，所有抗体均具有类似的整体三维结构。这种结构常常以H₂L₂形式给出，并指的是抗体通常包含两条轻(L)氨基酸链和两条重(H)氨基酸链的事实。这两种链均具有能够与结构上互补的抗原性靶标相互作用的区域。与该靶标相互作用的区域称为“可变区”或“V”区，并通过来自具有不同抗原特异性的抗体的氨基酸序列中的差异来表征。H或L链的可变区含有能够特异性结合到抗原靶标上的氨基酸序列。

本文中所用的术语“抗原结合区”指的是含有与抗原相互作用并赋予抗体其对抗原的特异性与亲合力的氨基酸残基的抗体分子部分。所述抗体结合区包括保持抗原结合残基的适当构象所必需的“框架”氨基酸残基。

在提供抗原结合区的H或L链的可变区内是由于其在具有不同特异性的抗体之间的极端可变性而称为“高变”的较小序列。此类高变区也称为“互补性决定区”或“CDR”区。这些CDR区决定了对特定抗原决定簇结构的抗体的基本特异性。

该CDR代表在可变区中非连续的氨基酸区段，但是已发现，不考虑物种，可变重链和轻链区中的这些关键性氨基酸序列的位置定位具有在可变链的氨基酸序列中的类似位置。所有抗体的可变重链和轻链均具有三个CDR区，各自彼此是不连续的。

在所有哺乳动物物种中，抗体肽含有恒定(即高度保守的)区和可变区，并且在后者中存在CDR和所谓的“框架区”，该“框架区”由重链或轻链的可变区内但是在CDR之外的氨基酸序列构成。

关于抗体的CDR区所识别的抗原决定簇，其也称为“表位”。换言之，表位指的是能够被抗体(相应的抗体结合区域可以称为互补位)识别并结合的任何分子的部分。

“抗原“是能够被抗体结合的分子或分子的一部分，其还能够诱导动物产生能够结合到该抗原表位上的抗体。抗原可以具有一个或超过一个的表位。上文所述的特定反应指的是该抗原与其相应抗体以高度选择性的方式反应，并且不与可以被其它抗原引发的大量其它抗体反应。

术语“抗体”指的是包括完整的免疫球蛋白分子以及其部分、片段、肽和衍生物，如Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv、Fse、CDR区、互补位或者能够结合抗原或表位的抗体的任意部分或肽序列。如果抗体能够特异性地与分子反应，由此将该分子结合到抗体上，则认为该抗体“能够结合”分子。

抗体还包括通过任何已知技术(例如但不限于酶切、肽合成或重组技术)提供的嵌合抗体、杂源嵌合抗体、犬源化抗体或猫源化抗体，以及其片段、部分、区域、肽或衍生物。本发明的此类抗体能够特异性结合犬IL-31或猫IL-31的至少一种。抗体片段或部分可缺少完整抗体的Fc片段，从循环中更快地清除，并可以具有比完整抗体更低的非特异性组织结合。采用本领域公知的方法，可以由完整抗体制造抗体片段的实例，例如通过采用酶如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)的蛋白裂解。参见例如Wahl等人，24J.Nucl.Med.316-25(1983)。抗体的部分可以通过任何上述方法制得，或者可通过表达重组分子的一部分来制得。例如，可以分离重组抗体的CDR区并亚克隆到合适的表达载体中。参见例如美国专利号6,680,053。

克隆11E12、34D03和19D07核苷酸与氨基酸序列

在一些实施方案中，本发明提供了特异性结合到犬IL-31或猫IL-31的至少一种上的新型单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的单克隆抗体结合到犬IL-31或猫IL-31上，并防止其结合到其包含IL-31受体A和制瘤素-M-特异性受体(OsmR或IL-31Rb)的共同受体复合物上并将其激活。本发明的单克隆抗体在本文中被标为“11E12”、“34D03”和“19D07”，其指的是其杂交瘤克隆指定的编号。在全文中，“11E12”、“34D03”和“19D07”还指的是与因其结合11E12、34D03或19D07抗体的能力而分别标识为11E12、34D03或19D07的IL-31表位特异性结合的该单克隆抗体部分、该互补位或CDR。本文中所述的11E12、34D03和19D07的几种重组、嵌合、杂源嵌合、犬源化和/或猫源化形式可以具有相同的名称。

在一个实施方案中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合部分，包括下列至少一种：

在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合部分，包括下列至少一种：

在一些实施方案中，该抗体可以包括以下的至少一个：

a)可变轻链，包含：

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK(SEQ ID NO:20;CAN-11E12-VL-cUn-FW2)，

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWFQQKPGQSPQLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK(SEQ ID NO:21;CAN-11E12-VL-cUn-13)，

EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYGASTRESGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:23;CAN-19D07-VL-998-1)，

DILLTQSPASLAVSLGQRAIISCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLEAGVPTRFSGSGSRTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSREYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:24;MU-34D03-VL)，或

b)可变重链，包含：

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFKYYDINWVRQAPGAGLDWMGWIFPGDGGTKYNETFKGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRAGDIAVYYCARGGTSVIRDAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27;CAN-11E12-VH-415-1)，

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQIPEKRLEWVATITSGGGYTYSADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:28;MU-19D07-VH)，

EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLQWVATITSGGGYTYSADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:29;CAN-19D07-VH-400-1)，

EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFSFSNYGMSWVRQTPDKRLEWVATISYGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:30;MU-34D03-VH)，或

EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLQWVATISYGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:31;CAN-34D03-VH-568-1)；和

c)其具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。

在其它实施方案中，本发明提供制造上述抗体的宿主细胞。

本发明在其范围内还包括编码本发明的抗IL-31抗体的轻链和重链的可变区的核苷酸序列。还包括在本发明范围内的是编码11E12、34D03或19D07的氨基酸序列或其肽的任何核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供包含编码下列至少一种的核酸序列的分离的核酸：

本发明进一步提供包括上述核酸的至少一种的载体。

由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个的密码子来编码特定的氨基酸。使用遗传密码，可以识别一种或多种不同的核苷酸序列，其各自能够编码该氨基酸。可通过考虑异常碱基配对关系以及特定密码子在表达抗IL-31抗体或部分的真核或原核细胞中实际使用(以编码特定氨基酸)的频率来估计特定寡核苷酸事实上构成实际XXX编码序列的可能性。Lathe等人，183J.Molec.Biol.1-12(1985)中公开了此类“密码子使用规则”。使用Lathe的“密码子使用规则”，可以识别含有能够编码抗IL-31序列的理论上“最有可能”的核苷酸序列的单一核苷酸序列或一组核苷酸序列。

还意欲通过使用标准分子生物学技术改变现有抗体基因来提供用于本发明的抗体编码区，获得本文中所述的抗体和肽的变体(激动剂)。此类变体包括但不限于抗IL-31抗体或肽的氨基酸序列中的缺失、添加和替换。

例如，一类替换是保守氨基酸替换。此类替换是用另一种性质相似的氨基酸替换抗IL-31抗体中的给定氨基酸。通常视为保守替换的是：脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间彼此的替代；羟基残基Ser和Thr的互换；酸性残基Asp和Glu的互换；酰胺残基Asn和Gln之间的交换；碱性残基Lys和Arg的交换；芳族残基Phe、Tyr之间的替代，等等。在Bowie等人，247Science1306-10(1990)中可以找到关于哪种氨基酸变化有可能导致表型沉默的指南。

抗IL-31抗体的变体或激动剂或肽可以是功能完全的，或者可以缺少一种或多种活性方面的功能。功能完全的变体通常仅含有保守变异或者在非关键残基中或在非关键区域中的变异。功能性变体还可以含有类似氨基酸的替换，其不会导致功能上的变化或者导致不显著的变化。或者，此类替换可以在一定程度上正向或负向影响功能。非功能性变体通常含有一种或多种非保守氨基酸替换、缺失、插入、倒位或截短，或在关键残基或关键区域中的替换、插人、倒位或缺失。

可以通过本领域已知的方法识别对功能而言必不可少的氨基酸，所述方法例如定点突变或丙氨酸扫描突变(Alanine scanningmutagenesis)。Cunningham等人，244Science1081-85(1989)。后一种方法在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变。然后测试所获得的突变分子的生物活性，如表位结合或体外ADCC活性。还可通过结构分析(如晶体学、核磁共振或光亲和性标记)确定对配体-受体结合而言至关重要的位点。Smith等人，224J.Mol.Biol.899-904(1992)；de Vos等人，255Science306-12(1992)。

此外，多肽常含有除了二十种“天然存在的”氨基酸之外的氨基酸。此外，许多氨基酸(包括末端氨基酸)可以通过天然方法(例如加工或其它翻译后修饰)或通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。已知的修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、原血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键的形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚定的形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、水解加工、磷酸化、异戊二烯化、消旋、硒化、硫化、t-RNA介导的向蛋白质中加入氨基酸(如精氨酸化和泛素化)。

此类修饰是本领域那些技术人员公知的，并且已经详细描述在科学文献中。例如，几种特别常见的修饰(例如糖基化、脂质附着、硫化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化)描述在大多数基础教科书中，如Proteins--Structure and Molecular Properties(第2版，T.E.Creighton,W.H.Freeman&Co.,NY,1993)。在这一主题方面可以获得许多详细的综述，如Wold,Posttranslational Covalent Modification ofproteins,1-12(Johnson,ed.,Academic Press,NY,1983)；Seifter等人，182Meth.Enzymol.626-46(1990)；和Rattan等人，663Ann.NY Acad.Sci.48-62(1992)。

因此，本发明的抗体和肽还包括衍生物或类似物，其中替换的氨基酸残基并不是由遗传密码编码的残基。

类似地，该氨基酸序列中的添加和替换以及上述变异和修饰可等同地适用于IL-31抗原和/或其表位或肽的氨基酸序列，并由此被本发明涵盖。如上所述，编码本发明的单克隆抗体的基因能够特异性地有效识别IL-31。

抗体衍生物

本发明的范围内包括抗体衍生物。抗体的“衍生物”含有通常并非蛋白质一部分的附加的化学部分。本发明的范围内包括蛋白质的共价修饰。可以通过使抗体的靶向氨基酸残基与能够和所选侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂反应，由此将此类修饰引入到分子中。例如，本领域公知的使用双功能试剂进行衍生化可用于将抗体或片段交联到不溶于水的支持基质上或交联到其它大分子载体上。

衍生物还包括放射性标记的单克隆抗体，例如其标记有放射性碘(¹²⁵I、¹³¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、铟(¹¹¹In)、氚(³H)等；带有生物素或亲和素的单克隆抗体缀合物，带有酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖淀粉酶、羧酸酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)的缀合物；以及带有生物发光剂(如萤光素酶)、化学发光剂(如吖啶酯)或荧光剂(如藻胆蛋白)的单克隆抗体缀合物。

本发明的另一种衍生双功能抗体是双特异性抗体，通过将识别两种不同抗原基团的两个单独抗体的部分结合而产生。这可以通过交联或重组技术来实现。此外，可以向抗体或其部分中加入部分以延长在体内的半衰期(例如通过延长从血流中清除的时间来实现)。此类技术包括例如添加PEG部分(也称为聚乙二醇化)，并且是本领域公知的。参见美国专利申请公开号20030031671。

抗体的重组表达

在一些实施方案中，将编码对象单克隆抗体的核酸直接引入到宿主细胞中，并在足以诱导编码抗体表达的条件下培养该细胞。在对象核酸已经引入细胞后，通常培养该细胞(通常在37℃下，有时经过筛选)大约1至24小时以便令抗体表达。在一个实施方案中，抗体被分泌到该细胞生长的介质的上清液中。

传统上，单克隆抗体作为鼠杂交瘤细胞系的天然分子而产生。除此技术之外，本发明提供了单克隆抗体的重组DNA表达。这允许在选定的宿主物种中产生犬源化和猫源化的抗体以及一系列抗体衍生物和融合蛋白。

根据常规技术(包括平末端或粘末端连接、限制性酶切以提供合适的末端、在适当情况下填补粘性末端、碱性磷酸酶处理以避免不合意的结合以及用合适的连接酶连接)，可以用载体DNA重组编码至少一种本发明的抗IL-31抗体、部分或多肽的核酸序列。用于此类操作的技术公开在例如Maniatis等人，MOLECULAR CLONING,LAB.MANUAL(Cold Spring Harbor Lab.Press,NY,1982和1989)以及Ausubel等人，1993supra中，所述技术可用于构建编码单克隆抗体分子或其抗原结合区的核酸序列。

如果核酸分子(如DNA)含有这样的核苷酸序列，即所述核苷酸序列包含转录和翻译调控信息且此类序列“有效连接”到编码该多肽的核苷酸序列上，则认为所述核酸分子“能够表达”所述多肽。有效连接是指这样一种连接，其中调控性DNA序列与所要表达的DNA序列以如下方式连接，所述方式允许基因以可回收的量表达抗IL-31肽或抗体部分。基因表达所需的调控区的精确性质由于生物体的不同而不同，这在类似领域中是公知的。参见例如Sambrook等人，2001supra；Ausubel等人，1993supra。

本发明因此包括在原核或真核细胞中表达抗IL-31抗体或肽。合适的宿主包括细菌宿主或真核宿主(包括体内或原位的细菌、酵母、昆虫、真菌、鸟和哺乳动物细胞)，或哺乳动物、昆虫、鸟或酵母来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可以是人、灵长类、仓鼠、兔、啮齿类、牛、猪、绵羊、马、山羊，狗或猫来源的，但也可以使用任何其它哺乳动物细胞。

在一个实施方案中，所引入的核苷酸序列将并入能够在受体宿主中自主复制的质粒或病毒载体中。为此目的可使用任意的多种载体。参见例如Ausubel等人，1993supra。在选择特定质粒或病毒载体时的重要因素包括：含有该载体的受体细胞被识别并从不含有该载体的受体细胞中选择出来的难易程度；载体在特定宿主中期望的拷贝数；以及是否期望载体能够在不同物种的宿主细胞间“穿梭”。

本领域已知的原核载体的实例包括能够在大肠杆菌(例如，pBR322、ColEl、pSC101、pACYC184、πVX)中复制的质粒。此类质粒例如由Maniatis等人，1989supra；Ausubel等人，1993supra公开。Bacillus质粒包括pC194、pC221、pT127等。此类质粒由Gryczan在THE MOLEC.BIO.OF THE BACILLI307-329(Academic Press,NY,1982)中公开。合适的链霉菌(Streptomyces)质粒包括pIJ101(Kendall等人，169J.Bacteriol.4177-83(1987))，以及链霉菌噬菌体如.phi.C31(Chater等人，SIXTH INT′L SYMPOSIUM ON ACTIN0MYCETALESΒΙO.45-54(Akademiai Kaido,Budapest,Hungary1986))。假单胞菌(Pseudomonas)质粒综述在John等人，8Rev.Infect.Dis.693-704(1986)；Izaki，33Jpn.J.Bacteriol.729-42(1978)以及Ausubel等人，1993supra中。

或者，可用于表达编码抗IL-31抗体或肽的cDNA的基因表达元件包括但不限于(a)病毒转录启动子及其增强子元件，例如SV40早期启动子(Okayama等人，3Mol.Cell.Biol.280(1983))、劳斯肉瘤病毒LTR(Gorman等人，79Proc.Natl.Acad.Sci.,USA6777(1982))以及Moloney鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等人，41Cell885(1985))；(b)剪接区域和多聚腺苷酸化位点，如源自SV40晚期区域的那些(Okayarea等人，1983)；以及(c)多聚腺苷酸化位点，如SV40中的位点(Okayama等人，1983)。

可以如Weidle等人，51Gene21(1987)所述表达免疫球蛋白cDNA基因，作为表达元件使用SV40早期启动子及其增强子、小鼠免疫球蛋白H链启动子增强子、SV40晚期区域mRNA剪接、兔S-球蛋白间隔序列、免疫球蛋白和兔S-球蛋白多聚腺苷酸化位点以及SV40多聚腺苷酸化元件。

对于由部分cDNA和部分基因组DNA组成的免疫球蛋白基因(Whittle等人，1Protein Engin.499(1987))，转录启动子可以是人巨细胞病毒，启动子增强子可以是巨细胞病毒和鼠/人免疫球蛋白，mRNA剪接和多聚腺苷酸化区域可以是天然染色体免疫球蛋白序列。

在一个实施方案中，为了在啮齿类细胞中表达cDNA基因，转录启动子是病毒LTR序列，转录启动子增强子是小鼠免疫球蛋白重链增强子和/或病毒LTR增强子，剪接区域含有大于31bp的内含子，多聚腺苷酸化和转录终止区域源自对应于所合成免疫球蛋白链的天然染色体序列。在另一些实施方案中，编码其它蛋白质的cDNA序列与上述表达元件组合以实现蛋白质在哺乳动物细胞中的表达。

将各融合基因组装到或插入到表达载体中。随后将能够表达嵌合免疫球蛋白链基因产物的受体细胞与抗IL-31肽或嵌合的H链或嵌合的L链编码基因单独转染，或与嵌合的H链和嵌合的L链基因共转染。经转染的受体细胞在允许所并入基因表达的条件下进行培养，并从培养物中回收表达的免疫球蛋白链或者完整抗体或片段。

在一个实施方案中，将编码抗IL-31肽或嵌合的H和L链或其部分的融合基因组装到单独的表达载体中，随后用所述表达载体共转染受体细胞。或者可以将编码嵌合的H和L链的融合基因组装在相同的表达载体上。

为了转染表达载体并产生嵌合抗体，受体细胞系可以是骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可以合成、组装或分泌由转染的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白，并具有糖基化该免疫球蛋白的机制。骨髓瘤细胞可以在培养物或者在小鼠腹腔中培养，其中分泌的免疫球蛋白可以从腹水中获得。其它合适的受体细胞包括淋巴细胞，如人源或非人源的B淋巴细胞、人源或非人源的杂交瘤细胞或者种间杂源杂交瘤细胞。

携带本发明的嵌合的、犬源化或猫源化的抗体构建物或抗IL-31多肽的表达载体可以通过任意多种合适的手段引入到合适的宿主细胞中，所述手段包括生化手段，如转化、转染、接合、原生质体融合、磷酸钙沉淀以及使用聚阳离子如二乙氨基乙基(DEAE)葡聚糖，以及机械手段，如电穿孔、直接显微注射和微弹轰击。Johnston等人，240Science1538(1988)。

就产生免疫球蛋白H链和L链而言，酵母可以提供超越细菌的显著优势。酵母进行翻译后肽修饰(包括糖基化)。目前存在多种使用强启动子序列和高拷贝数质粒的重组DNA策略，可用于在酵母中生产所需蛋白质。酵母识别所克隆的哺乳动物基因产物的前导序列，并分泌带有前导序列的肽(即前肽)。Hitzman等人，11th Int′l Conference on Yeast,Genetics&Molec.Biol.(Montpelier,France,1982)。

可以常规地评估酵母基因表达系统针对抗IL-31肽、抗体和组装的鼠以及嵌合的、杂源嵌合的、犬源化的或猫源化的抗体、其片段和区域的产生、分泌和稳定性水平。可使用一系列酵母基因表达系统中的任何一种，其中包含来自活跃表达基因(当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时，其编码大量产生的糖酵解酶)的启动子和终止元件。已知的糖酵解基因还可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可使用磷酸甘油酸激酶(PGK)的启动子和终止子信号。可采用多种方法来评价在酵母中表达克隆的免疫球蛋白cDNA的最佳表达质粒。参见卷11DNACloning,45-66(Glover编辑，IRLPress,Oxford,UK1985)。

也可使用菌株作为产生本发明所述抗体分子或肽的宿主，源自与宿主细胞相容的物种的含有复制子和调控序列的质粒载体与这些细菌宿主联合使用。该载体带有复制位点以及能够在转化细胞中提供表型选择的特定基因。可以采用多种方法来评价表达质粒在细菌产生所克隆免疫球蛋白cDNA编码的鼠、嵌合的、杂源嵌合的、犬源化的或猫源化的抗体、片段和区域或抗体链(参见Glover,1985supra；Ausubel,1993supra；Sambrook,2001supra；Colligan等人编辑,Current Protocolsin Immunology,John Wiley&Sons,NY,NY(1994-2001)；Colligan等人编辑，Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,NY(1997-2001)。

宿主哺乳动物细胞可以在体外或体内培养。哺乳动物细胞提供了对免疫球蛋白分子的翻译后修饰，包括去除前导肽、H链和L链的折叠与组装、抗体分子的糖基化以及功能性抗体蛋白质的分泌。

除了上述淋巴来源的细胞以外，可用作产生抗体蛋白质之宿主的哺乳动物细胞还包括成纤维细胞来源的细胞，如Vero(ATCC CRL81)或CHO-K1(ATCC CRL61)细胞。

许多载体系统可用于在哺乳动物细胞中表达所克隆的抗IL-31肽H和L链基因(参见Glover,1985supra)。可根据不同的方法来获得完整的H₂L₂抗体。有可能在同一细胞中共表达H和L链，以实现H链和L链在细胞内结合并连接成完整的四聚体H₂L₂抗体和/或抗IL-31肽。可通过在同一宿主中使用相同或不同的质粒进行共表达。可以将H链和L链和/或抗IL-31肽的基因置于同一质粒中，然后转染至细胞中，由此直接选择表达两种链的细胞。或者，可以先用编码一条链例如L链的质粒转染细胞，随后用含有第二选择标记的H链质粒转染所得到的细胞系。可以用编码额外肽拷贝、H链、L链、或H加L链连同额外的选择标记的质粒通过各自的途径转染产生抗IL-31肽和/或H₂L₂分子的细胞系，以获得增强特性的细胞系，例如更多地产生经组装H₂L₂抗体分子或者经转染细胞系的稳定性增强。

为了长期高产率地生产重组抗体，可以使用稳定的表达。例如，可以将稳定表达该抗体分子的细胞系工程化。而不是使用含有病毒复制来源的表达载体，宿主细胞可以用免疫球蛋白表达盒和可选标记转化。在引入外来DNA后，可以令工程化细胞在加富培养基中生长1-2天，随后转移至选择培养基中。重组质粒中的可选标记提供对该选择的抗性并允许细胞稳定地将该质粒整合到染色体中并生长以形成病灶，其随后可以克隆并扩展为细胞系。此类工程化细胞系特别可用于筛选和评估与该抗体分子直接或间接相互作用的化合物/组分。

一旦已经制得本发明的抗体，可以通过纯化免疫球蛋白分子领域中已知的任何方法对其进行纯化，例如通过色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法特别是在蛋白质A后的特定抗原的亲和色谱法，以及尺寸排阻色谱法)、离心、不同溶解度或通过用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。在许多实施方案中，抗体由细胞分泌到培养介质中，并从培养介质中收获。

药物应用

本发明的抗IL-31抗体或肽可用于治疗伴侣动物如狗和猫的瘙痒和/或过敏性疾病。更具体地，本发明进一步提供了包含药物可接受载体或稀释剂以及作为活性成分的本发明的抗体或肽的药物组合物。该抗体可以是本发明的嵌合的、杂源嵌合的、犬源化的或猫源化的抗体。还涵盖了完整的免疫球蛋白或其结合片段，如Fab。该抗体及其药物组合物可用于肠胃外施用，例如皮下，肌内或静脉内施用。

本发明的抗IL-31抗体和/或肽可作为单独的治疗剂施用或者与其它治疗剂组合施用。它们可以单独施用，但通常与根据所选施用途径和标准制药实践所选择的药物载体一起施用。

施用本文中公开的抗体可以通过任何合适的手段进行，包括胃肠外注射(如腹膜内、皮下或肌肉内注射)、口服或通过抗体的局部给药(通常在药物制剂中进行)至气道表面。局部给药至气道表面可以通过鼻内给药进行(例如通过使用滴管、棉签或吸入剂)。抗体到气道表面的局部给药还可以通过吸入给药进行，如通过产生气溶胶悬浮体形式的含有该抗体的药物制剂的可吸入粒子(包括固体和液体粒子)，并随后令受试者吸入该可吸入粒子。用于药物制剂的可吸入粒子的给药的方法与装置是公知的，并且可以使用任何常规技术。口服给药可以是例如为可摄取的液体或固体制剂形式。

在一些所需实施方案中，该抗体通过胃肠外注射施用。对于胃肠外施用而言，抗IL-31抗体或肽可与药物可接受的胃肠外载体一起配置成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。例如，所述载体可以是抗体或其混合物溶解在可接受载体(如水性载体，此类载体是水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液，或5%人血清白蛋白、0.4%盐水、0.3%甘氨酸等等)中的溶液。也可使用脂质体和非水性载体(如固定油)。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒状物质。可通过常规的公知灭菌技术对这些组合物灭菌。该组合物可包含接近生理条件所需的药物可接受辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的抗体浓度可以有很大的不同，例如由低于大约0.5重量%、通常为或至少为大约1重量%直至高达15重量%或20重量%，主要基于液体体积、粘度等等，根据所选的特定施用模式来选择。该载体或冻干粉末可包含维持等渗性(例如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如缓冲剂和防腐剂)的添加剂。通过常用的技术对制剂进行灭菌。

制备胃肠外可施用组合物的实际方法是已知的或者对本领域技术人员而言显而易见，并更详细地描述在例如REMINGTON′SPHARMA.SCI.(第15版，Mack Pub.Co.,Easton,Pa,1980)中。

本发明的抗体可以冻干用于储存，并在使用前用合适的载体重溶(reconstituted)。该技术已显示出对常规免疫球蛋白有效。可采用任何合适的冻干和重溶技术。本领域技术人员应当理解，冻干和重溶可导致不同程度的抗体活性损失，并且使用水平可能需要进行调整以得到补偿。

可施用含有本发明的抗体或其混合物的组合物用于预防现有疾病的复发和/或治疗。在最新版本的REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES(本领域的标准参考教科书)中描述了合适的药物载体。

在治疗应用中，以足以治愈或至少部分阻抑或减轻疾病及其并发症的量，向已患有疾病的患者施用组合物。足以实现此目的的量定义为“治疗有效剂量”或“治疗有效量”。该用途的有效量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但通常从每千克体重大约0.1毫克抗体至每千克体重大约10毫克抗体，优选每千克体重大约0.3毫克抗体至每千克体重大约5毫克抗体。考虑到由本发明的犬样抗体和猫样抗体实现无关物质最小化以及降低“外源物质”排斥的可能性，有可能施用显著过量的这些抗体。

取决于已知的因素，如特定试剂的药代动力学特性以及其施用模式和途径；接受者的年龄、健康状况和重量；症状的性质和程度、并行治疗的种类、治疗频率和预期效果，施用的剂量当然不同。

作为非限制性实例，治疗狗或猫的IL-31相关病症可以以每双周或每月计剂量提供上述剂量范围内的本发明的抗IL-31抗体。

根据本发明，用于犬或猫治疗用途的抗体实例是具有强的体内抗IL-31活性的高亲和性(抑或高亲合力)抗体以及其片段、区域和衍生物。

可采用治疗医师选择的剂量水平和模式进行组合物的单次或多次施用。在任何情况下，药物制剂应提供足以有效治疗患者的量的本发明的抗体。

诊断应用

本发明还提供了上述抗IL-31抗体和肽用于在已知或疑似患有瘙痒和/或过敏性疾病的伴侣动物中检测IL-31的诊断方法。

本发明的抗IL-31抗体和/或肽可用于在样品中检测或定量IL-31或抗IL-31抗体的免疫测定。IL-31的免疫测定通常包括在经可检测标记的高亲和性(或高亲合力)的本发明的抗IL-31抗体或多肽(能够选择性结合IL-31)存在下培养临床样品或生物样品，并检测样品中结合的标记过的肽或抗体。各种临床测定方法是本领域公知的。参见例如IMMUNOASSAYS FOR THE80’S(Voller等人编辑，Univ.Park,1981)。此类样品包括组织活检样品、血液、血清和粪便样品，或从动物对象收集并施以如下所述的ELISA分析的液体。

在一些实施方案中，在不使用固体支持物的情况下检测抗原对抗体的结合。例如，可以以液体形式检测抗原对抗体的结合。

在其它实施方案中，抗IL-31抗体或多肽可以例如固定到硝化纤维素或另一能够固定细胞、细胞粒子或可溶性蛋白质的固体支持物上。随后可以用合适的缓冲液清洗所述支持物，接着用可检测标记过的IL-31特异性肽或抗体进行处理。随后可以用缓冲液再清洗固相支持物一次，以除去未结合的肽或抗体。然后，可通过已知方法步骤检测固体支持物上所结合标记的量。

“固相支持物”或“载体”指的是任何能够结合肽、抗原或抗体的支持物。公知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。为了本发明的目的，该载体的性质可以是在一定程度上可溶的或者不溶性的。支持材料可以具有实际上任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合到IL-31或抗IL-31抗体。由此，支持物构型可以是球形(如在珠粒中)或圆柱形(如在试管的内表面或柱的外表面中)。或者，该表面可以是平坦的，如薄片、培养皿、测试条等。例如，支持物可包括聚苯乙烯珠粒。本领域技术人员将知道适于结合抗体、肽或抗原的许多其它载体，或者可通过常规实验进行确定。

公知的方法步骤可以确定给定量的抗IL-31肽和/或抗体的结合活性。本领域那些技术人员可通过常规实验来确定可操作的和最佳的测定条件。

通过与用于酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的酶连接，可实现对IL-31特异性肽和/或抗体的可检测标记。连接的酶与暴露的底物反应，生成可被检测到的化学部分，所述检测可通过例如分光光度法、荧光光度法或可视手段来实现。可用于对本发明IL-31特异性抗体进行可检测标记的酶包括但不限于：苹果酸脱氢酶、金黄色葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。

通过放射性标记IL-31特异性抗体，有可能通过使用放射免疫测定(RIA)来检测IL-31。参见Work等人，LAB.TECHNIQUES&BIOCHEM.1N MOLEC.Bio.(No.Holland Pub.Co.，NY,1978)。可通过例如使用伽玛计数器或闪烁计数器等手段或者通过放射自显影来检测放射性同位素。特别适用于本发明目的的同位素包括³H、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、¹⁴C和¹²⁵I。

还可能用荧光化合物来标记IL-31特异性抗体。当荧光标记过的抗体暴露在适当波长的光下时，由于荧光，因此可检测其存在。最常用的荧光标记化合物包括异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。

还可使用发荧光的金属(例如¹²⁵Eu或镧系的其它金属)来可检测标记IL-31特异性抗体。可使用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属螯合基团将这些金属连接到IL-31特异性抗体上。

还可通过与化学发光化合物偶联来对IL-31特异性抗体进行可检测标记。然后，通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来测定经化学发光标记的抗体的存在。可用的化学发光标记化合物的实例有鲁米诺、异鲁米诺、染色性(theromatic)吖啶酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。

同样地，可使用生物发光化合物来标记本发明的IL-31特异性抗体、部分、片段、多肽或衍生物。生物发光是在生物体系中发现的一类化学发光，其中催化性蛋白质提高化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来测定生物发光蛋白质的存在。用于标记的重要生物发光化合物有萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。

可通过闪烁计数器(例如，如果可检测标记是放射性伽马发射体)或通过荧光光度计(例如，如果标记是荧光材料)实现对IL-31特异性抗体、部分、片段、多肽或衍生物的检测。在酶标记的情况下，可通过采用酶的底物的比色法来实现检测。也可通过对底物的酶促反应程度与类似制备的标准品进行肉眼比较来实现检测。

对本发明的目的而言，通过上述测定检测的IL-31可存在于生物样品中。可以使用含有IL-31的任何样品。例如，所述样品为生物液体，如血液、血清、淋巴液、尿、粪便、炎性渗出物、脑脊液、羊水、组织提取物或匀浆等等。然而，本发明不仅限于使用这些样品的测定，本领域普通技术人员根据本说明书可以确定允许使用其它样品的适当条件。

通过从患者取出组织样本，并提供针对该样本的本发明经标记抗体的组合，可实现原位检测。可通过向生物样品施用或覆盖标记过的抗体(或部分)来提供所述抗体(或其部分)。通过使用这样的方法，不仅可以测定IL-31的存在，还能测定IL-31在所检测组织中的分布。使用本发明，本领域普通技术人员会容易地想到，可对多种组织学方法(如染色方法)中的任意一种进行改造从而实现这样的原位检测。

可以对本发明的抗体、片段或衍生物进行调整以用于免疫测定，也称为“双位点”或“夹心”测定。在一种典型的免疫测定中，将一定量的未标记抗体(或抗体片段)结合到不溶于被测试液体的固体支持物，并添加一定量的可检测标记过的可溶性抗体以允许检测和/或定量在固相抗体、抗原和标记的抗体之间形成的三元复合物。

该抗体可用于定量或定性地检测样品中的IL-31或检测表达IL-31的细胞的存在。这可以通过免疫荧光技术来实现，所述技术使用荧光标记的抗体(见下文)连同荧光显微镜、流式细胞检测或荧光检测。出于诊断的目的，该抗体可以是标记过的或未标记的。未标记的抗体可以与其它标记抗体(第二抗体)组合使用，所述标记的抗体与该抗体是反应性的，例如对犬或猫免疫球蛋白恒定区为特异性的抗体。或者，可以直接标记该抗体。可使用各种标记，如放射性核素、氟、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等等。多种类型的免疫分析(如前文讨论的那些)是可获得的并且是本领域技术人员公知的。

在一个实施方案中，用于检测IL-31的诊断方法是测流免疫试验。这种方法也称为免疫层析测定、快速免疫迁移(RIM^TM)或试纸检验。测流免疫法基本上是适于沿单一轴操作以贴合试纸条格式的免疫测定法。该技术的许多变体已经开发成上皮，但是都根据相同的基本原理操作。典型的测试条由下列组件组成：(1)样品垫——测试样品施加于其上的吸收剂垫；(2)缀合物或反应剂垫——其含有对缀合至有色粒子(通常为胶体金粒子或胶乳微球)的靶分析物为特异性的抗体；(3)反应膜——通常是疏水性的硝化纤维素或乙酸纤维素膜，抗靶分析物抗体以横穿该膜的线固定在其上作为捕获区或测试线(可以存在对照区，含有对缀合物抗体特异性的抗体)；和(4)芯给或废液贮器——设计为通过毛细管作用汲取样品穿过反应膜并收集样品的另一吸收剂垫。该带的组件通常固定到惰性背衬材料上，并呈现简单的浸渍片形式，或存在于具有样品端口和显示捕获区与对照区的反应窗的塑料外壳中。

存在两种类型的用于微生物测试的测流免疫法：双抗体夹心阵列和竞争阵列。在双抗体夹心形式中，样品从样品垫迁移穿过缀合物垫，在缀合物垫中任何存在的靶分析物将结合到该缀合物上。样品随后连续迁移穿过该膜直到到达捕获区，在捕获区中靶/缀合物复合物将结合到固定的抗体上，在该膜上产生可见的线。样品随后进一步沿该带迁移直到其到达对照区，在对照区中过量缀合物将结合并在膜上产生第二可见线。对照物线表明样品已经如预期那样迁移穿过该膜。在膜上的两条清晰的线为阳性结果。对照区中的单一线是阴性结果。竞争阵列不同于双抗体夹心形式，在于缀合物垫含有已经结合到靶分析付的抗体或结合到其类似物的。如果靶分析物存在与样品中，其因此不会与缀合物结合，并将保持未标记。当样品沿着该膜迁移并达到捕获区时，过量的未标记分析物将结合到固定的抗体上并阻断捕获缀合物，以至于不产生可见线。未结合的缀合物随后在对照区中结合到抗体，产生可见的对照线。在膜上的单一对照线为阳性结果。捕获区和对照区中的两条可见线为阴性结果。但是，如果不存在过量的未标记靶分析物，在捕获区会产生弱的线，表明不确定的结果。在测流技术方面存在许多改变。膜上的捕获区可以含有固定的抗原或酶——取决于靶分析木——而不是抗体。还有可能施加多个捕获区以产生多重测试。例如，已经开发了能够单独地检测同一样品中EHEC Shiga毒素ST1和ST2的商品试纸。

重要的是，本发明的抗体有助于诊断狗或猫的瘙痒和/或变态反应性。更具体而言，本发明的抗体可以识别伴侣动物体内IL-31的过度表达。由此，本发明的抗体可提供重要的免疫组化工具。

本发明的抗体可用于抗体阵列，高度适合测量包括基因表达谱。

试剂盒

还包括在本发明范围内的是用于实施该方法的试剂盒。该试剂盒至少包括一种或多种本发明的抗体、编码该抗体的核酸或含有该抗体的细胞。在一个实施方案中，通常以容器中的冻干形式提供本发明的抗体。该抗体，其可以缀合至标记物或毒素或不缀合，通常与缓冲剂(如Tris、磷酸盐、碳酸盐等)、稳定剂、杀生物剂、惰性蛋白质(例如血清白蛋白)或类似物一起包含在试剂盒中。通常，这些材料以活性抗体量的小于5重量%的量存在，基于抗体浓度，其通常以至少大约0.001重量%的总量存在。通常，合意的是包含惰性补充剂或赋形剂以稀释活性成分，其中赋形剂可以以全部组合物的大约1重量%至99重量%的量存在。当在测定中使用能够与第一抗体结合的第二抗体时，这种抗体通常将存在于单独的容器。第二抗体通常缀合至标记物，并以类似于上述抗体制剂的方式进行配制。该试剂盒通常还包含一套使用说明。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒是可用于检测样品中犬或猫IL-31蛋白质的试纸试剂盒(测流免疫法试剂盒)。此类试纸通常包括样品垫，测试样品施加到样品垫上；含有对犬或猫IL-31特异性的抗体的缀合物或试剂垫，其中抗体缀合到有色粒子上(通常为胶体金粒子)；反应膜，抗IL-31抗体以横穿该膜的线固定在其上作为捕获区或测试线(还可以存在对照区，含有对缀合物抗体特异性的抗体)；和设计为通过毛细管作用汲取样品穿过反应膜并收集样品的另一吸收剂垫。该试纸试剂盒通常还包括使用说明。

现在将通过下列非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1识别犬白细胞介素31(IL-31)的小鼠单克隆抗体的鉴别

使用CHROMOS ACE(Artificial Chromosome Expression)系统(Chromos Molecular Systems,Inc.,Burnaby,British Columbia)在CHO细胞中生成重组犬IL-31以产生分泌的具有SEQ ID NO:32序列的犬IL-31蛋白质。该蛋白质通过SEQ ID NO:33的核苷酸序列编码。获得来自400毫升细胞培养(CHO细胞系)的条件培养基并对10体积的QA缓冲剂(20mM Tris，pH8.0，20mM NaCl)透析4.5小时。透析介质经0.2μm过滤并以1毫升/分钟装载到用QA缓冲剂预平衡的SOURCE^TMQ柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上。用多步线性梯度洗脱蛋白质。大部分IL-31保留在穿柱(FT)级分中，少量IL-31早期在梯度中洗脱。蛋白质鉴别事先通过Western免疫印迹和胰蛋白酶消化的质谱(MS)分析证实。将FT级分中的蛋白质浓缩4-5倍并在4℃下对磷酸盐缓冲的盐水(PBS)透析整夜。在透析到PBS中后检查蛋白质的稳定性。没有观察到沉淀，并在4℃下数天后没有观察到蛋白质水解。使用N-糖苷酶F的去糖基化试验导致蛋白质浓缩向下至SDS-PAGE上的～15kDa的单一带中。蛋白质浓度采用二喹啉甲酸测定(BCA测定)用牛血清白蛋白(BSA)作为标准物(ThermoFisher Scientific,Inc.,Rockford,IL)测定。蛋白质溶液分成等份，快速冷冻(液氮)并在-80℃下储存。

使用在CHO细胞中制得的雌性CF-1小鼠与重组犬IL-31的标准免疫接种鉴别小鼠单克隆抗体。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定来自免疫小鼠的滴度。犬IL-31(50纳克/孔)固定到聚苯乙烯微孔板中并用做捕获抗原。来自免疫小鼠的血清在含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)中稀释。用辣根过氧化物酶(HRP)缀合山羊抗小鼠二次抗体(Kirkegard&Perry Laboratories,Inc.(KPL,Inc.),Gaithersburg,MD)检测小鼠抗犬IL-31抗体的存在。在添加显色底物(SureBlue Reserve TMB1-Component Microwell Peroxidase Substrate,KPL,Inc.,Gaithersburg,MD)并在室温(RT)下培育十分钟后，添加100微升0.1N HCl停止反应。在450nm的光密度(OD)下测定各孔的吸光度。图6总结了用犬IL-31免疫的个体小鼠的抗体反应。来自小鼠3和4的供体脾细胞池用于融合。在融合并经直接ELISA筛选抗IL-31结合后，选择100个孔用于扩张和抗IL-31活性的二次筛选。二次筛选证实，81个融合保留产生抗IL-31抗体的能力。保存细胞冻存和这81个备选者的上清液用于进一步评估。

为了鉴别具有抑制活性的备选者，评估所有81个上清液在基于细胞的测定中影响IL-31介导pSTAT信号传导的能力。这种基于细胞的测定测量了用10ng/mL的犬γ干扰素(R&D Systems,Minneapolis,MN)预先处理24小时并在IL-31处理前血清饥饿2小时以提高IL-31受体表达的犬DH-82单核细胞中的pSTAT信号传导。在预处理后，以1μg/mL添加重组犬IL-31五分钟，并使用Alpha Screen技术(PerkinElmer,Waltham,MA)评价STAT磷酸化。由于在杂交瘤上清液中抗体浓度和纯度未知，使用该上清液的1:2或1:20稀释与1μg/ml的IL-31共同培育1小时后定性测量这些上清液的抑制STAT磷酸化的能力。该试验鉴别了31种上清液，其相对于未处理的孔抑制>50%的STAT磷酸化，由此证明提纯和进一步表征。

在各单克隆抗体(mAb)的提纯和定性后，在DH-82细胞测定中评价所有31个抗体的IC50值。基于所得的IC50值和竞争性ELISA确定基于表位仓(bins)的抗体类，发展表1中描述的三种抗体用于进一步表征，11E12，19D07和34D03。

表1

实施例2编码11E12、19D07和34D03抗体的DNA序列

使用Rneasy-mini试剂盒(Qiagen,Inc.,Germantown,M)如制造商所述从杂交瘤细胞11E12、19D07和34D03中分离核糖核酸(RNA)。通过离心收获来自各杂交瘤的一百万冷冻细胞，并根据规程中所述方法使用Rneasy旋转柱由细胞裂解液提纯RNA。将RNA从各柱中洗脱并立即用于定量和cDNA制备。通过使用GeneQuant pro分光光度计(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)测量RNA在260nm和280nm下的吸光度来分析RNA的产率和纯度。在分离后，剩余RNA在-80℃下储存用于进一步使用。

根据制造商的说明书(EMD Chemicals,Inc.,Gibbstown,NJ)使用设计用于小鼠免疫球蛋白(Ig)可变域的扩增的寡核苷酸引物。根据制造商的说明书使用耐热RT试剂盒(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)通过逆转录(RT)由全部杂交瘤RNA制备cDNA。将200-400ng来自各杂交瘤的RNA添加到含有3’Ig恒定区引物的单个反应管中。该3’恒定Ig引物靠近可变Ig区定位并将转录代表小鼠抗体可变区的第一链cDNA。对各杂交瘤RNA，使用3’恒定重链和3’恒定kappa轻链引物进行个别RT反应。

将来自各杂交瘤的cDNA用作聚合酶链反应(PCR)中的模板以扩增可变IgG重链和kappa轻链cDNA用于序列测定目的。使用设计以对合至小鼠Ig可变域的信号序列编码区的简并5’引物或引物池对各PCR进行多重反应。采用用于小鼠可变重链和可变轻链区扩增的简并引物或引物池进行单独的PCR反应(图7)。使用Expand High FidelityDNA聚合酶试剂盒(Roche Diagnostics Corp.,Indianapolis,IN)根据制造商规程用1微升的cDNA反应进行PCR。PCR的热循环参数如下：94℃2分钟，35个循环(94℃15秒，55℃30秒，72℃1分钟)，72℃7分钟。通过在1%琼脂糖凝胶上的凝胶电泳法分离由PCR扩增的片段，并使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen,Inc.,Germantown,MD)提纯。用于重链和轻链可变区的正向引物结合EcoRI或SalI(New England Biolabs(NEB),Inc.,Ipswich,MA)位点与反向重链和轻链可变,HindIII(NEBInc.,Ipswich,MA)以促进克隆到pUC19质粒中。纯化的PCR片段和pUC19质粒用上述限制性内切酶在37℃下消化1-2小时。消化后，使用Qiaquick PCR清理试剂盒(Qiagen,Inc.,Germantown,MD)纯化PCR片段。消化的质粒通过在1%琼脂糖凝胶上的凝胶电泳法分离并使用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化。使用T4DNA连接酶和连接缓冲剂(NEB,Inc.,Ipswich,MA)将代表可变IgG重链和kappa轻链DNA的纯化PCR片段在4℃下连接到pUC19质粒中整夜。3微升各连接反应用于转化E.coli TOP10细胞(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。

使用Qiagen微型制备试剂盒(Qiagen27106)根据制造商规程将质粒从代表各杂交瘤的可变区的阳性克隆中分离。使用BigDye测序反应仪(Applied Biosystems by Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)根据制造商规程，M13正向和反向引物用于扩增各克隆插入物的DNA序列。测序反应用96孔纯化试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA)根据制造商规程纯化。将样品装载到ABI-3730毛细管测序仪上，并使用Sequencher(GeneCodes v.4.2)对所得序列痕迹分析存在完全开放的阅读框架。对各抗体测定的小鼠抗犬IL-31可变序列如下：11E12可变轻链(SEQ ID NO:19MU-11E12-VL，其相应的核苷酸序列为SEQ IDNO:34)，11E12可变重链(SEQ ID NO:26MU-11E12-VH，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:35)，19D07可变轻链(SEQ ID NO:22MU-19D07-VL，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:36)，19D07可变重链(SEQ ID NO:28MU-19D07-VH，其相应的核苷酸序列为SEQ IDNO:37)，34D03可变轻链(SEQ ID NO:24MU-34D03-VL，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:38)和34D03可变重链(SEQ ID NO:30MU-34D03-VH，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:39)。

为确认衍生自各抗体可变重链和轻链的cDNA序列的有效性，在Applied Biosystems型号494气相蛋白质测序仪上使用Edman降解法对纯化的mAb蛋白质进行N-末端序列分析。下表2描述了抗体11E12和34D03的可变轻链序列和34D03的可变重链序列的确认。通过cDNA序列翻译衍生的抗体11E12的可变重链的N-末端氨基酸被确定为谷氨酰胺。谷氨酰胺，作为蛋白质的氨基末端残基，可以通过Edman降解自发地环化为阻止序列测定的焦谷氨酸(Chelius等人，Anal Chem.200678(7):2370-6)。

表2*

*在表2中，“DIVLT”对应于SEQ ID NO:19的残基1-5，“DIVMS”对应于SEQ ID NO:22的残基1-5，“DILLT”对应于SEQ ID NO:24的残基1-5，“QVQLQ”对应于SEQ ID NO:26的残基1-5，“EVKLV”对应于SEQ ID NO:28的残基1-5，和“EVQLV”对应于SEQ ID NO:30的残基1-5。

实施例3构建11E12、19D07和34D03嵌合抗体

如上所述，抗体由两种杂源嵌合蛋白质的异源二聚体配对组成。该异源二聚体的各蛋白质链(一条重链和一条轻链)由可变域和恒定域组成。各可变域含有三个致力于抗原结合的互补决定区(CDR)。CDR通过框架区在可变域中分离，框架区提供了显露抗体上结合位点的适当空间的支架。合在一起，该CDR和框架区有助于抗体结合其同源抗原的能力(图2)。

如上文进一步描述的那样，嵌合的抗体由接枝到犬IgG分子的各个重链与轻链恒定区上的来自小鼠抗体(如上面的序列分析所确定的那样)的可见序列(CDR与框架)组成(图3)。由于可变域负责抗原结合，完全小鼠可变域接枝到犬恒定区上预计对抗体结合IL-31免疫原的能力几乎没有或没有影响。

为了同时证实鉴别重链和轻链可变区的正确序列和为了制造重组的均质材料，生成了在哺乳动物表达体系中产生嵌合抗体的表达载体。正向和反向引物设计为扩增衍生自杂交瘤11E12、19D07和34D03的抗体序列的小鼠重链和轻链可见区、将独特的限制性内切酶位点，Kozak共有序列和分泌引导序列并入各正向引物中以促进来自哺乳动物细胞系的重组抗体的表达与分泌。各反向引物设计为扩增各可见重链和轻链并包括独特的限制性位点以促进克隆。使用克隆的杂交瘤可变链抗体DNA作为各反应的模板，进行PCR以扩增各重链和轻链。将各PCR产物克隆到含有犬IgG重链(在本文中称为HC-64或HC-65)或轻链(在本文中称为kappa)恒定区的哺乳动物表达质粒，所述犬IgG重链或轻链恒定区分别基于来自GenBank登录号AF354264或AF354265和XP_532962的序列。HC-64的氨基酸与核苷酸序列分别表示为SEQ ID NO:40和41。HC-65的氨基酸与核苷酸序列氨基酸分别表示为SEQ ID NO:42和43。Kappa的氨基酸与核苷酸序列氨基酸分别表示为SEQ ID NO:44和45。在CMV启动子控制下编码各重链和轻链的质粒使用标准脂质体转染方法共同转染到HEK293细胞中。在表达六天后，根据蛋白质纯化的标准方法，使用MabSelect SuRe蛋白质A树脂(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)将嵌合的mAbs由30毫升瞬时转染的HEK293FS细胞上清液中纯化。将洗脱的级分收集，并用10,000标称MW截断Nanosep Omega离心设备(Pall Corp.,PortWashington,NY)浓缩至～500微升，在1×PBS,pH7.2中在4℃下透析整夜并在4℃下储存用于进一步用途。

在天然和变性条件下使用SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS PAGE)对嵌合犬IgG的表达进行了评估。使用SDS MES运行缓冲剂根据制造商规程(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)在4-12%的Bis Tris凝胶上将来自各转染的单克隆抗体(mAbs)分离。电泳后，用Simply Blue CoomassieStain(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)使蛋白质可视化以确保发生适当的配对，并提供蛋白质同质化的粗略评估。为了评价重组mAbs是否保持了结合犬IL-31的能力，经Western蛋白质印迹法对mAbs结合犬IL-31的能力进行了评估。使用Invitrogen iBlot装置(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)将蛋白质标样和重组犬IL-31(800纳克)溶解在转移到硝化纤维素膜的SDS PAGE上。在转移后，用蒸馏的去离子水洗涤膜，并用含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)中的5%脱脂奶粉(NFDM)在室温(RT)下阻断1小时。在阻断后，膜在PBST中洗涤并用来自瞬时表达或纯化的嵌合抗体的稀释上清液培育。使用在RT下以1:5000在PBST中稀释1小时的山羊抗犬IgG抗体-缀合过氧化物酶(Bethyl Laboratories Inc.,Montgomery,TX或Rockland,Immunochemicals,Inc.,Gilbertsville,PA)评价该嵌合抗体的结合。在向印迹(KPL,Inc.,Gaithersburg,MD)中添加TMB底物后，通过对应于犬IL-31糖基化形式的比色带的存在来测定IL-31结合的确认。

进一步分析通过Western蛋白质印迹法显示来自HEK293细胞的表达与结合到重组犬IL-31免疫原的嵌合的亲和力和功能。为了表征与备选mAbs结合IL-31的亲和力，使用Biacore系统(Biocore Life Sciences(GE Healthcare),Uppsala,Sweden)评估表面等离子体共振(SPR)。为了避免与不同的表面处理(在将抗体固定到表面上时出现)相关的亲和力差异；采用其中IL-31直接缀合到表面上的策略。使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)化学法通过胺偶联5微克/毫升IL-31获得固定。芯片用乙醇胺骤冷并评价与所有结合到固定IL-31的备选mAbs的亲和力。所有曲线拟合为1:1模型。亲和力<E-11低于仪器的检测定量的下限。

还以两种独立的方式对所有备选mAbs在基于细胞的测定中抑制IL-31信号传导的能力进行了评价。在共同培育方式中，mAb:IL-31复合物预先培育一小时以确保在细胞加入前形成复合物。为了提高mAbs之间差异化的可能性，进行缺少共同培育并将mAbs直接添加到细胞中5分钟并随后加入IL-31的第二组试验。在两种情况下，进行IL-31刺激5分钟。如下表3中所示，小鼠单克隆11E12、19D07和34D03转化为犬嵌合形式对它们结合IL-31或抑制细胞介导信号传导的能力几乎没有影响。该结果也炎症了衍生自各小鼠杂交瘤的正确可变重链与可变轻链序列。

表3

^·嵌合的11E12——对于重链，MU-11E12-VH与HC-64配对，对于轻链，MU-11E12-VL与kappa配对。

^*嵌合的19D07——对于重链，MU-19D07-VH与HC-64配对，对于轻链，MU-19D07-VL与kappa配对。

嵌合的34D03——对于重链，MU-34D03-VH与HC-64配对，对于轻链，MU-34D03-VL与kappa配对。

实施例4嵌合的mAbs的体内评价

为了证实在DH-82测定中观察到的IL-31介导的细胞信号传导的抑制，与抑制狗体内IL-31介导的瘙痒关联，对上表3中所述嵌合的11E12单克隆抗体（嵌合的11E12-64）在IL-31犬瘙痒模型中进行评价。在该模型中，犬IL-31，当以1至1.5μg/kg的剂量静脉内给药（IV）时，产生可以在两小时观察期内量化以评估瘙痒反应的快速起效一致瘙痒反应，狗放置在单间围栏中，使用视频监控进行瘙痒活性测量。在≥1小时的适应期后，采用分类评分系统，使用实时视频监控对每只狗测定瘙痒极限分数。具体而言，在连续的1分钟间隔时，对于每只狗是否显示瘙痒行为作出“是/否”的判断。瘙痒行为的显示，如舔/咀嚼爪子、侧腹和/或肛门区域，搔抓侧腹、颈部和/或地板，摇头和在笼子地板上蹭它们的臀部（scooting of their bottom across the cage flooring）足以在指定时间间隔中得出“是”的应答。在该时期结束时，将结论为“是”的数目加在一起得出累计瘙痒评分指数（PSI）。对每只动物测定两次瘙痒评分，第一次测量是恰好在试验品治疗期开始前测得的30分钟基线得分。在每个计划的观察期结束时，将狗送回它们正常的居住地。

为了评价皮下（SC）施用嵌合的11E12-64是否能够抑制IL-31介导的瘙痒，进行包括治疗组和安慰剂组（N=4/组）的先导研究（76A03）。在该研究中，对所有8条狗进行基线响应，将狗随即分组并根据它们的PSI安置。重要的是，每组由两个高反应者（PSI>55）和两个中度反应者（PSI=30至55）组成。这些狗随后在第7天施用嵌合的11E12-64，并在第8、14和22天施以IL-31攻击。图8中给出了该研究的结果。这些结果证实，对于嵌合的11E12-64治疗的动物，施用嵌合的11E12-64在第8和14天导致相对于第1天平均PSI降低超过75%。这与未治疗动物的PSI得分提高37-51%相反。在mAb治疗两周后PSI回到基线，表明对于0.3mg/kg的施用剂量，效力持续期为一到两周之间。

当评估PSI时一项特殊挑战是与狗瘙痒行为相关的每日变化。为了帮助控制这种变化，在IL-31攻击前的每一天对每只狗测定30分钟基线PSI。图9显示纳入该研究的狗的个体瘙痒得分（76A60）。图9中的数据表明第8天和第14天基线PSI在嵌合的11E12-64治疗组中为IL-31攻击后的大约25%。这一观察结果与IL-31相关瘙痒的完全小时一致，因为基线观察时期（0.5小时）是IL-31后观察时期（2小时）的25%。两者合计，这些体内数据提供了非常有力的证据；1）嵌合的11E12单克隆可以中和IL-31在狗体内诱发瘙痒的能力；2）在基于细胞的测定中抑制IL-31介导的信号传导与体内疗效相关；和3）建立利用该IL-31模型用于mAb评价所必需的参数用于评价其它备选抗体。

实施例5犬源化策略

抗药抗体（ADA）的产生可以与包括单克隆抗体的任何生物治疗蛋白质的功效丧失相关。文献中的总和评价已经表明，单克隆抗体的物种形成可以降低mAbs为免疫原性的倾向，尽管可以找到免疫原形完全人类mAbs和非免疫原性嵌合mAbs的实例。为了帮助减轻与形成对本文中提供的小鼠抗IL-31单克隆抗体的ADA相关的风险，采用犬源化策略。该犬源化策略基于找出最适于CDR接枝的犬种系抗体序列（图4）。在广泛分析对重链和链的所有可用的犬种系序列后，根据他们对该小鼠mAbs的同源性选择备选种系，并使用来自小鼠先祖mAbs的CDR取代天然的犬CDR。目的是使用完全犬框架保留高亲和力和细胞基活性以最小化体内免疫原性的可能。表达犬源化mAbs，并经Western蛋白质印迹法表征其结合IL-31的能力。结果在下面的实施例8中描述。在犬源化后仅有保持了结合IL-31的能力的mAbs用于进一步表征。对丧失了结合IL-31的能力的mAbs进行系统剖析以鉴别：1）导致功能丧失的链，2）导致功能丧失的框架和3）导致功能丧失的氨基酸。

实施例611E12、19D07和34D03抗体的犬源化

进行代表mAbs11E12、19D07和34D03的犬源化可变重链和轻链的合成核苷酸构建。在将各可变链亚克隆到含有各犬重链或kappa恒定区的质粒中之后，将质粒共转移以便在HEK293细胞中表达抗体。综上所述，19D07和34D03在犬源化时保留了IL-31结合。对各抗体测定的该犬源化抗犬IL-31可变序列如下：19D07可变轻链（SEQ IDNO:23CAN-19D07-VL-998-1，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:46），19D07可变重链（SEQ ID NO:29CAN-19D07-VH-400-1，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:47），34D03可变轻链（SEQ ID NO:25CAN-34D03-VL-998-1，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:48）和34D03可变重链（SEQ ID NO:31CAN-34D03-VH-568-1，其相应的核苷酸序列为SEQ ID No:49）。

相反，用于11E12犬源化尝试的种系序列导致某些非功能性mAbs。参照图10，对mAb11E12的嵌合、杂源嵌合和犬源化版本进行表达，并经Western蛋白质印迹法表征了它们结合犬IL-31的能力。这些结果证实，犬源化的11E12抗体不能结合犬IL-31（Blot#2）。同样，相对于杂源嵌合体，与犬源化轻链配对的嵌合重链丧失了IL-31结合（Blot#3），而与嵌合轻链配对的犬源化重链保留了IL-31结合活性（Blot#4）。基于由杂源嵌合体获得的结果，可以推断，犬源化轻链导致活性的丧失。

在尝试恢复11E12的犬源化版本对犬IL-31的结合时，通过交换框架序列修饰犬源化轻链。图11提供了11E12轻链框架取代工作的概览。该工作识别了用小鼠框架II替代犬框架II（FWII）并恢复了对犬IL-31的结合的抗体（11E12可变轻链(SEQ ID NO:20CAN-11E12-VL-cUn-FW2，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:50)，11E12可变重链(SEQ ID NO:27CAN-11E12-VH-415-1，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:51)）。

这些回复突变的进一步细化确定，在框架II中具有单个精氨酸至亮氨酸的回复突变（R50L）的抗体可以经Western蛋白质印迹分析恢复IL-31结合（11E12可变轻链(SEQ ID NO:21CAN-11E12-VL-cUn-13，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:52)，11E12可变重链(SEQ ID NO:27CAN-11E12-VH-415-1)）（图12）。一旦各潜在备选的“犬源化”版本被确定，对mAbs进行纯化并透析到PBS中用于进一步评估。

表4概括了亲和力测量与细胞基抑制数据的结果。这些数据证明，如通过Biacore测得的那样，11E12and34D3的犬源化衍生物均在基于细胞的测定中保留了优异的抑制活性和对IL-31的亲和力。另外值得注意的是观察到如通过Biacore测得的那样，原始的犬源化19D7分子保留了优异的效力，抑制细胞基IL-31信号传导的能力相对于其小鼠原始粒子降低。当mAbs由它们的小鼠同种型转化为犬衍生物时，遭受的亲和力丧失从几乎没有到没有。

表4

重链：11E12的所有犬源化的和杂源嵌合的形式包括CAN-11E12-VH-415-1的V_H序列（SEQ ID NO:27）和称为HC-64的恒定区（SEQ ID NO:40）；犬源化的19D07包括CAN-19D07-VH-400-1的V_H序列（SEQ ID NO:29）和HC-64；犬源化的34D03包括CAN-34D03-VH-568-1的V_H序列（SEQ ID NO:31）和HC-64。

轻链：犬源化的11E12包括CAN-11E12-VL-cUn-1的V_L序列（SEQID NO:53）和称为kappa的恒定区（SEQ ID NO:44）；杂源嵌合的11E12包括MU-11E12-VL的V_L序列（SEQ ID NO:19）和kappa；犬源化的11E12FW2包括CAN-11E12-VL-cUn-FW2的V_L序列（SEQ ID NO:20）和kappa；犬源化的11E1213包括CAN-11E12-VL-cUn-13的V_L序列（SEQ ID NO:21）和kappa；犬源化的19D07包括CAN-19D07-VL-998-1的V_L序列（SEQ ID NO:23）和kappa；犬源化的34D03包括CAN-34D03-VL-998-1的V_L序列（SEQ ID NO:25）和kappa。

实施例7表征犬IL-31向抗体11E12和34D03的结合

为了确定参与犬IL-31对抗体11E12和34D03的结合的氨基酸残基，采用突变策略，其包括1）从N端和C端截断IL-31蛋白；2）用丙氨酸替代单个氨基酸（ala扫描）以确定对mAb结合的影响。PCR引物设计为扩增犬IL-31基因（其为为了在E.coli宿主中表达而优化的密码子）。为E.coli表达的密码子优化的犬IL-31全长的序列表示为SEQ ID NO:55，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:56。引物设计为扩增该全长基因并产生由N端和C端内向内移动的蛋白质的20处氨基酸截断。出于这些N-末端截短的目的，位置1对应于紧随该密码子优化结构中N-端6-His标志后的甘氨酸残基。根据制造商规程将PCR扩增产品克隆到pET101D中（Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA）。该pET101D质粒允许重组蛋白质融合到N-端6-His表位标志以确认表达。序列确认的质粒用于改造BL21Star TOP10E.coli细胞（Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA），并使用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）在标准培养条件下诱导重组蛋白质的表达。在诱导后，细胞沉淀，并用细菌蛋白质提取试剂（简称B-PER,ThermoFisher Scientific Inc.,Rockford,IL）裂解。对粗裂解液施以SDS-PAGE并如前所述进行Western蛋白质印迹法。由于所需纯化抗体与试剂的可得性，使用11E12和34D03的小鼠版本进行所有用于突变分析的Western蛋白质印迹法。对各抗体进行测试，测试其结合代表全长和截断的IL-31的粗蛋白裂解液的能力。也用抗His mAb探测对照物印以证实各蛋白的表达。具有N端截断（-20N、-40N和-60N）的蛋白质均表现出在E.coli中的强健表达，并能够结合到11E12和34D03上（图13）。对应于-20N结构的氨基酸和核苷酸序列分别是SEQ ID NO:57和58。对应于-40N结构的氨基酸和核苷酸序列分别是SEQ ID NO:59和60。对应于-60N结构的氨基酸和核苷酸序列分别是SEQ ID NO:61和62。但是，全长IL-31和具有C端截断（-20C、-40C和-60C）的蛋白质在这些条件下未能表达。

据观察，全长IL-31蛋白质表达非常差。但是，具有从N端去除前20个氨基酸（-20N）的结构表现出强健的表达。抗体11E12和34D03均结合到该-20N蛋白质。因此，使用该-20N结构进行进一步的工作。对代表在位置20-122（MW15.3，具有his标志）、20-100（MW12.9，具有his标志）和20-80（MW10.4，具有his标志）的C端截断的结构进行试验以评估mAb对IL-31蛋白质上的这些区域的结合。对应于20-122结构的氨基酸与核苷酸序列分别是SEQ ID NOs:63和64。对应于20-100结构的氨基酸与核苷酸序列分别是SEQ ID NOs:65和66。对应于20-80结构的氨基酸与核苷酸序列分别是SEQ ID NOs:67和68。图14显示了用mAbs11E12（Blot B）和34D03（Blot C）探测的这些截断蛋白质的粗蛋白裂解液的Western蛋白质印迹。如图中所示，mAbs11E12和34D03结合到IL-31截断蛋白质20-122和20-100，但是未能结合到20-80。这些结果表明，SEQ ID NO:55的犬IL-31全长结构的位置80和100之间的氨基酸（使用“SSHMA”作为N端）涉及这些抗体的结合。该区域对应于SEQ ID NO:32的犬IL-31全长蛋白质序列的氨基酸残基102至122之间的氨基酸编号。使用抗His mAb的对照印迹（Blot A）显示，所有截断的蛋白质均被表达。此外，pET101D-lacZ蛋白质用作对照物以证实缺乏mAbs对宿主蛋白质的非特异性结合。

为了进一步鉴别涉及向mAbs11E12和34D03的结合的犬IL-31中的氨基酸，根据已知方法进行丙氨酸扫描诱变。由氨基酸76至122对犬IL-31上的各个位置进行个别结构的丙氨酸取代（在-20N质粒中）。在序列确认后，进行蛋白质表达，并对粗蛋白裂解液施以Western蛋白质印迹分析。图15显示了结果的总结，显示了在犬IL-31上在突变为丙氨酸时影响mAbs11E12和34D03的结合的位置。如图中所示，全长IL-31结构的位置77、78、81和85均影响11E12或34D03抗体的结合。这些分别对应于SEQ ID NO:32的犬IL-31全长蛋白质序列的氨基酸残基99、100、103和107。

为了检验在IL-31区域中多重突变对于结合11E12和34D03抗体而言重要的影响，用双重（D82A，I85A）和三重（I81A，D82A，I85A）丙氨酸置换结构表达质粒。表达除-20N对照物外具有该双重和三重突变的犬IL-31的E.coli裂解液用11E12和34D03抗体点样（图16）。显而易见的是，在犬IL-31上的这三个氨基酸涉及11E12和34D03的识别，因为当这些位点变为丙氨酸时观察到结合的完全消失。这三个氨基酸对应于SEQ ID NO:32的犬IL-31全长蛋白质序列的氨基酸残基103、104和107。

总之，犬IL-31的截断分析表明，氨基酸残基（注释在图15中在位置80与122之间）参与结合11E12和34D03抗体。此外，采用丙氨酸扫描的精细突变分析表明，全长IL-31结构的ASP77、LYS78、ILE81、ASP82和ILE85均影响11E12或34D03的结合，表明该区域最有可能限定了导致被这些抗体识别的表位。有趣的是，人IL-31蛋白质的这个区域显示涉及结合到其共同受体的GPL亚基（Le Saux S等人，BiolChem.2010Jan29;285(5):3470-7.Epub2009年11月17日）。这些观察结果与mAbs11E12和34D03中和单核细胞中IL-31介导的pSTAT活性的能力一起支持了以下假说：这些mAbs结合到对该细胞因子结合到其受体上而言至关重要的犬IL-31上的残基，由此抑制了其诱导信号传导的能力。

实施例8由谷氨酰胺合成酶（GS）质粒制造犬源化的34D03抗体

将编码该犬源化34D03mAb（重链和轻链，上表4）的基因分别克隆到GS质粒pEE6.4和pEE12.4中（Lonza,Basel,Switzerland）。根据制造商规程将所得质粒消化并合并在一起以形成单一哺乳动物表达质粒。各质粒用于转染HEK293细胞并在20升培养介质中进行表达。根据标准蛋白质纯化方法使用Protein A亲和色谱法从调节HEK介质中分离蛋白质。将介质装载到色谱树脂上并通过pH移动洗脱。在使用前，将洗脱的蛋白质进行pH调节、透析和灭菌过滤。通过分析尺寸排阻色谱法，所得抗体大于99%为单体，没有观察到高分子量聚集体。该抗体随后用于在狗瘙痒模型中的评估以评价体内效力。

实施例9在犬瘙痒模型中评估犬源化34D03抗体

使用IL-31-诱发的瘙痒的犬模型评估犬源化34D03（SEQ ID NO31代表的CAN-34D03-65与SEQ ID NO42(HC-65)和SEQ ID NO44(LC-Kappa)上的SEQ ID NO25(VL)配对）的止痒活性。借助这种模型，在1.0mg/kg SC单剂的CAN34D03-65之前和之后最多63天，向动物重复给药已知诱发比格犬的瘙痒行为瞬态期（transient period）的1.5μg/kg静脉攻击剂量的重组犬IL-31。在每一IL-31攻击期，使用实时视频监控获得细胞因子给药前0.5小时内（IL-31前基线期）的瘙痒行为测量，接着在细胞因子注射后20分钟开始类似的2小时测量（2小时IL-31后攻击期）。在各评估时期通过测定经连续的1分钟时间间隔“是/否”出现瘙痒行为而生成瘙痒分数（对于各基线期，最大瘙痒分数=30；对于IL-31后攻击期，最大瘙痒分数=120）。图17概括在CAN34D03-65（其在研究的第0天实施）治疗之前和之后获得的瘙痒分数，在mAb治疗前7天，犬的平均IL-31后攻击瘙痒分数为68±13(S.E.,n=4)。通过比较，在研究日7、14、21，平均IL-31后攻击瘙痒分数分别降至5±2，8±4和9±5。在第-7天和第7-21天之间瘙痒分数的这些变化表明对IL-31的总瘙痒反应性降低≥85%。

如果考虑到在第0和21天之间，IL-31前0.5小时基线分数平均为1.6±0.6—该水平经2小时外推至6-7的瘙痒分数，IL-31-诱发的瘙痒的抑制度经这一时限实际上已接近100%。治疗犬只对外源性IL-31的瘙痒反应性随时间逐渐恢复。到CAN D03-65治疗后63天，平均的2小时IL-31后攻击瘙痒分数提高至57±8或第-7天观察到的mAb IL-31前攻击响应的大致84%。因此，在IL-31-诱发的瘙痒模型中，单次SC推注CAN34D03-65确实为治疗犬只提供数周的抗瘙痒保护。

实施例10猫IL-31的表征

通过使用NCBIs基因组资源(www.ncbi.nlm.nih.gov)的猫基因组与犬IL-31的相似性检索，识别猫IL-31的序列。合成代表猫IL-31的基因以在大肠杆菌中最佳表达。用含有检测和提纯用的N-末端6-His标签的全长犬和猫IL-31基因制造表达构造。用于在大肠杆菌中表达的猫全长构造以SEQ ID NO:69的核苷酸序列和SEQ ID NO:70的蛋白质序列为代表。使用序列证实的质粒转化大肠杆菌BL21Star^TM(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)并在30C进行表达5小时。在细胞丸粒裂解后，发现免疫反应性蛋白高度富集在不可溶裂解物中。将这些细胞丸粒溶解在6M脲中并在变性条件下使用镍钴树脂（Thermo Fisher ScientificInc.,Rockford,IL）进行重组蛋白的提纯。对His标签的存在呈阳性的汇集洗脱馏分用0.8M脲PBS，接着PBS逐步透析，并通过SDS PAGE分析（图18）。如之前观察到，由大肠杆菌诱发产生的重组犬IL-31低。但是，在提纯后回收蛋白质，其根据预期分子质量经SDS-PAGE迁移。

为了检查由大肠杆菌产生的犬和猫IL-31的生物活性，分析各蛋白质在DH82细胞检测中诱发pSTAT信号发送的能力。由于来自哺乳动物细胞的重组IL-31（犬IL-31(CHO)）高度糖基化，不清楚未糖基化的形式是否保持生物活性。图19表明猫IL-31具有与CHO细胞中产生的参照物IL-31相当的生物活性。

犬IL-31的丙氨酸扫描诱变确定该蛋白质内的结合到11E12和34D03抗体上所必需的区域。据推测，由于这一区域中的序列保守性（图20），这些mAbs与猫IL-31交叉反应。

图21表明，mAbs11E12和34D03能够结合到犬IL-31（大肠杆菌）上并也能与猫IL-31蛋白交叉反应。基于这些数据，追踪34D03抗体物种猫源化。

实施例11抗体34D03上的猫源化

类似于所述犬源化策略，由来自mAb34D03的用于CDR接枝的所有可得的猫序列识别适当的种系抗体序列。基于与犬源化34D03中它们各自的犬框架的最高同源性选择可变轻链（SEQ ID NO:71FEL-34D03-VL-021-1，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:72）和可变重链（SEQ ID NO:73FEL-34D03-VH-035-1，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:74）。使用连接到它们各自的恒定重IgG1链序列（SEQ IDNO:75HC-A Feline，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:76GenBank登录号AB016710.1）和kappa恒定轻链序列（SEQ ID NO:77LC-KappaFeline，其相应的核苷酸序列为SEQ ID NO:78GenBank登录号AF198257.1）上的所选可变区制造重组猫源化34D03。由HEK细胞产生抗体并如上所述提纯。图22显示猫34D03中和pSTAT信号发送的能力，具有与犬版本相当的IC50。

评估猫源化34D03的结合猫和犬IL-31的能力。图23显示使用由哺乳动物和大肠杆菌来源提纯的蛋白质，用猫源化34D03进行的蛋白质印迹法。观察到确实结合到犬和猫蛋白上，表明34D03的猫源化形式的完全交叉反应性和证实结合到猫蛋白上。总之，这些结果表明猫IL-31上的保守表位可能是适用于抑制猫中的这种细胞因子的靶。

实施例12具有天然存在的特异性皮炎的犬中的IL-31细胞因子的检测

在本实施例中，使用定量免疫检测技术评估收集自犬群（包括具有特异性皮炎的那些）的血清中的IL-31蛋白水平。

血清收集自下列犬群并在IL-31血清测量之前冷冻。

1)在对屋尘螨变应原（Dermatophagoides farina,Greer Labs）过敏之前和之后的24只purpose bred比格犬（Marshall BioResources,NorthRose,NY）。所有动物为大约9月龄。两个性别大致相等存在。

2)在跳蚤侵扰之前或在成猫跳蚤（Ctenocephalides felis）侵扰后大约1周的30只过敏犬（Youngs Veterinary Research Services,Turlock,CA）。这一群体中的大部分犬是混种的。平均年龄为大约10.5年。两个性别大致相等存在。

3)具有亚临床牙周病但在其它方面被确定为健康的87只client-owned犬。在18个US兽医诊所收集样品。动物在性别和品种方面是美国犬群的代表并且在2年和5年龄之间。

4)被兽医诊断为患有慢性非季节性特异性皮炎（基于修改的Willemse’s标准和Prelaud（Willemse T.J small Anim Pract1986;27:771-778和Prelaud等人，Revue de Medecine Veterinaire1998;149:1057-1064，被饲主评估为最少“中度瘙痒”和基于CADESI-02的25分的最低皮肤病损分数）至少1年期的224只client-owned犬。样品收集自对兽医皮肤科有经验的14个US兽医诊所。大约75%的犬只是纯种的，总群体的～25%是寻回犬（拉布拉多（17.3%）和金毛（8.2%））。犬大多为中年（～6年龄）。两个性别大致相等存在。

夹心免疫法用于量化犬血清中的cIL-31水平。血清样品在Rexxip缓冲液（Gyrolab,Warren,NJ）中1:2稀释并在Bioaffy1000nL CDs(Gyrolab)上使用Gyrolab xP工作站运行。cIL-31用根据本发明的生物素标记的抗-IL-31单克隆抗体捕获和用根据本发明的Alexaflour647标记的抗-IL-31单克隆抗体检测。使用带有Gyrolab Evaluator软件的5参数拟合模型，由具有0.013-250ng/mL动态范围的8点标准曲线外推cIL-31的样品浓度。

cIL-31水平在57%的具有天然存在的特异性皮炎的犬只的血清样品中可检测（≥13pg/mL），但在来自有目的杂交的（purpose-bred）比格犬+/-对HDM敏感、混种犬+/-跳蚤侵扰或具有牙周病但在其它方面被认为健康的有主（client-owned）犬的血清中不可检出（<13pg/mL），无论品种如何。在具有天然存在的特异性皮炎的犬只中，53%的分析样品表现出13-1000pg/mL的血清IL-31水平，4%表现出高于1000pg/mL的血清水平（表5）。

表5各个犬群中的血清IL-31水平

^a小于13pg/mL低于定量限。

本实施例的结果证明在大量患有犬特异性皮炎的狗中IL-31蛋白质升高。不希望被任何理论束缚，人们相信，IL-31途径在瘙痒变态反应性皮肤病症（例如但不限于犬特异性皮炎）的病理学中起作用，并代表了一种采用IL-31拮抗剂进行治疗性干预的新途径，所述IL-31拮抗剂包括但不限于特异性结合到犬IL-31的olacitnib和/或抗IL-31抗体。

Claims

1.特异性结合到犬IL-31或猫IL-31中的至少一种上的分离的抗体。

2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

3.权利要求2的抗体，其中所述抗体是嵌合的。

4.权利要求2的抗体，其中所述抗体是犬源化的或猫源化的。

5.权利要求1至4中任一项的抗体，其中所述抗体减轻、抑制或中和狗或猫体内的IL-31活性。

6.权利要求5的抗体，其中所述抗体减轻、抑制或中和瘙痒症或过敏症。

7.如权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其包含以下的至少一个：

具有以下氨基酸序列的可变重(V_H)链互补决定区(CDR)1：YYDIN(SEQID NO:1；11E12-VH-CDR1)，SYDMS(SEQ ID NO:2；19D07-VH-CDR1)或NYGMS(SEQ ID NO:3；34D03-VH-CDR1)；

具有以下氨基酸序列的可变重链CDR3：ARGGTSVIRDAMDY(SEQ IDNO:7；11E12-VH-CDR3)，ARQNWVVGLAY(SEQ ID NO:8；19D07-VH-CDR3)或VRGYGYDTMDY(SEQ ID NO:9；34D03-VH-CDR3)；以及

8.如权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，包含以下的至少一个：

具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR3：QQSNKDPLT(SEQ ID NO:16；11E12-VL-CDR3)，QNDYSYPYT(SEQ ID NO:17;19D07-VL-CDR3)或QQSREYPWT(SEQ ID NO:18；34D03-VL-CDR3)；以及

9.权利要求8的抗体，进一步包括以下的至少一个：

具有以下氨基酸序列的可变重链互补决定区(CDR)1：YYDIN(SEQ IDNO:1；11E12-VH-CDR1)，SYDMS(SEQ ID NO:2；19D07-VH-CDR1)或NYGMS(SEQ ID NO:3；34D03-VH-CDR1)；

10.权利要求9的抗体，包含以下的至少一个：

a)可变轻链，包含：

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATYYCQQSNKDPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:19；MU-11E12-VL)，

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK(SEQ ID NO:20；CAN-11E12-VL-cUn-FW2)，

DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASESVDNYGISFMHWFQQKPGQSPQLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSNKDPLTFGAGTKLEIK(SEQ ID NO:21；CAN-11E12-VL-cUn-13)，

DIVMSQSPSSLSVSAGDKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPWQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:22；MU-19D07-VL)，

EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYGASTRESGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:23；CAN-19D07-VL-998-1)，DILLTQSPASLAVSLGQRAIISCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLEAGVPTRFSGSGSRTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSREYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:24；MU-34D03-VL)，或

EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQAPKLLIYRASNLEAGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQSREYPWTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:25；CAN-34D03-VL-998-1)；

b)可变重链，包含：

QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFKYYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDGGTKYNETFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARGGTSVIRDAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:26；MU-11E12-VH)，

EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLQWVATITSGGGYTYSADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARQNWVVGLAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:29；CAN-19D07-VH-400-1)，EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFSFSNYGMSWVRQTPDKRLEWVATISYGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:30；MU-34D03-VH)，或

c)其具有一个或多个保守氨基酸替换的变体。

11.包含治疗有效量的如权利要求1至10中任一项所述的抗体的兽用组合物。

12.制造如权利要求1至10中任一项所述的抗体的宿主细胞。

13.包含编码下列至少一种的核酸序列的分离的核酸：

14.权利要求13的核酸，进一步包含编码下列至少一种的核酸序列：

具有以下氨基酸序列的可变轻链CDR3：QQSNKDPLT(SEQ ID NO:16；11E12-VL-CDR3)，QNDYSYPYT(SEQ ID NO:17；19D07-VL-CDR3)或QQSREYPWT(SEQ ID NO:18；34D03-VL-CDR3)；以及

15.包含权利要求13或权利要求14的核酸的载体。

16.制造抗体的方法，包括在导致产生该抗体的条件下培养权利要求12的宿主细胞，并从该宿主细胞或该宿主细胞的培养介质中分离该抗体。

17.治疗症状或疾病的方法，所述症状或疾病选自瘙痒症或过敏症，包括施用治疗有效量的如权利要求1至10中任一项所述的抗体。

18.权利要求17的方法，其中所述瘙痒症选自特异性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病和瘙痒。

19.权利要求17的方法，其中所述过敏症选自变态反应性皮炎、夏季湿疹、荨麻疹、马喘息病、气道炎症性疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺疾病和自身免疫引起的炎症过程。

20.通过使用如权利要求1至10中任一项所述的抗体抑制狗或猫体内的IL-31活性的方法。

21.检测或定量样品中IL-31的方法，该方法包括：

(a)在如权利要求1至10中任一项所述的抗体的存在下培养含有IL-31的临床或生物样品；并

(b)检测结合到该样品中的IL-31上的抗体。

22.权利要求21的方法，其中可检测地标记所述抗体。

23.权利要求21的方法，其中所述抗体是未标记的，并与标记过的第二抗体组合使用。

24.如权利要求1至10中任一项所述的抗体，其特异性结合到SEQ IDNO:32的犬IL-31氨基酸序列的大约氨基酸残基95位至125位之间的区域或猫IL-31中的相应区域上。

25.权利要求24的抗体，其中该抗体特异性结合到SEQ ID NO:32的犬IL-31氨基酸序列的大约氨基酸残基102位至122位之间的区域或猫IL-31中的相应区域上。