KR20230092978A - 개 및 고양이 온코스타틴 m 수용체 베타에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

개 및 고양이 온코스타틴 m 수용체 베타에 대한 항체 및 이의 용도 Download PDF

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조에티스 서비시즈 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 개 또는 고양이 온코스타틴 M 수용체 베타(OSMR-β) 또는 둘 다에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하되, 항체는 개 및/또는 고양이 세포에서 IL-31-매개성 신호전달 또는 OSM-매개성 신호전달 또는 둘 다를 길항한다.

Description

개 및 고양이 온코스타틴 M 수용체 베타에 대한 항체 및 이의 용도
본 발명은 면역요법의 분야이다. 보다 구체적으로, 이는 온코스타틴 M(Oncostatin M: OSM)에 대한 수용체 및 개 및/또는 고양이 온코스타틴 M 수용체 베타 서브유닛(Oncostatin M receptor Beta subunit: OSMR-β)에 결합하는 단일클론 항체와 같은 이의 조절제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항-OSMR-β 항체를 사용하는 OSM 및 IL-31과 관련된 개 및 고양이에서 질환의 진단 및/또는 치료에 관한 것이다.
사이토카인은 면역 반응의 발달 및 제어에서 중요한 역할을 하는 작은 단백질의 큰 패밀리를 포함한다. 소정의 사이토카인은 신경 및 피부 손상을 포함한 병리학적 통증 행동의 시작 및 지속과 관련이 있다. 보다 최근에 발견된 사이토카인인 인터류킨-31(IL-31)은 만성 피부 염증의 유도와 관련이 있다(Dillon et al. (2004) Nat. Immunol. 5, 752-760). 인간 및 뮤린 데이터는 소양증, 탈모증, 피부 병변 및 아토피성 피부염(atopic dermatitis: AD)을 포함하는 중증의 염증성 피부 장애 및 천식과 같은 다른 조절된 알레르기성 질환과 관련된 IL-31의 고발현을 보여주었다(상기 Dillon et al. (2004); Neis et al. (2006) J. Allergy Clin. Immunol. 118, 930-937; Rabenhorst et al. (2014) Curr. Allergy Asthma Rep. 14, 423; Cornelissen et al. (2012) Eur. J. Cell Biol. 91, 552-566; Takaoka et al. (2006) Exp. Dermatol. 15, 161-167; Sonkoly et al. (2006) J. Allergy Clin. Immunol. 117, 411-417; Lewis et al. (2017) J. Eur. Acad. Dermatology Venereol. 31, 142-150).
인간 AD에 대한 실험적 동물 모델은 NC/Nga 마우스에서의 가려움-관련 긁는 행동과 IL-31 mRNA의 발현 사이에 강한 상관관계가 있음이 보고되었다(상기 Takaoka et al.). 상승된 IL-31 혈청 수준이 건강한 대조군 대상체(Raap et al. (2008) J. Allergy Clin. Immunol. 122, 421-423)와 비교하여 AD가 있는 성인 환자에서 그리고 AD 악화(flare) 및 휴지기(quiescence) 동안 소아 환자에서 발견되었다(Ezzat et al. (2011) J. Eur. Acad. Dermatology Venereol. 25, 334-339).
종합하면, 이들 데이터는 IL-31이 인간의 이러한 피부 염증성 질환에 대한 치료법의 개발을 위한 중요한 표적을 나타냄을 시사한다. 길항제 항-IL-31 단일클론 항체(mAb)가 현재 인간 건강을 위해 개발 중이다(Pantazi et al. (2017) Nat. Rev. Drug Discov. 17, 237-238; Nemoto et al. (2016) Br. J. Dermatol. 174, 296-304). 또한, 항-IL-31 mAb는 이미 동물 건강 분야에서 개발되었다(Bammert 등의 미국 특허 제8,790,651B2; Michels et al. (2016) Vet. Dermatol. 27, 478-e129). 예를 들어, IL-31RA에 결합하는 항-hIL-31RA mAb인 CIM331은 IL-31 신호전달을 저해하고 중증 소양증을 감소시킨다(상기 Nemoto et al. (2016)). 수의학에서, "개화된" 항-IL-31 mAb인 로키베트맙은 개 소양증에 대한 임상 시험에서 효능을 보여 현재 개에 대한 AD 요법으로 승인되었다(상기 Michels et al. (2016)).
IL-31은 T 헬퍼 유형 2 세포에 의해 우선적으로 생산되는 IL-6 사이토카인 슈퍼패밀리의 구성원이다(상기 Dillon et al. (2004)). 성숙 인간 IL-31(hIL-31)은 4개의 역평행 나선의 예측된 토폴로지를 갖는 141개의 아미노산(상기 Dillon et al. (2004))으로 구성된다(Le Saux et al. (2010) J. Biol. Chem. 285, 3470-3477). IL-31 신호전달 경로는 gp130-유사 유형 1 사이토카인 수용체(IL-31RA, GPL로도 알려져 있음) 및 온코스타틴 M 수용체(OSMR)를 통해 매개되는 것으로 생각된다(상기 Dillon et al.; 상기 Le Saux et al. (2010); Diveu et al. (2004) Eur. Cytokine Netw. 15, 291-302; Zhang et al. (2008) Cytokine Growth Factor Rev. 19, 347-356). 두 수용체 모두 2개의 피브로넥틴 유형 III-유사 도메인에 의해 형성된 공통 사이토카인 결합 도메인(cytokine binding domain: CBD)을 공유하는 유형 I 사이토카인 수용체 패밀리에 속한다(Diveu et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 49850-49859).
이전의 연구는 인간 IL-31RA(hIL-31RA)가 hIL-31에 직접 결합한다는 면역침전의 증거를 제공하였다. 이러한 동일한 연구에서, 면역침전 결과는 hIL-31에 대한 직접적인 인간 OSMR(hOSMR) 결합을 검출하지 못하였다((Le Saux et al. (2010) Molecular dissection of human interleukin-31-mediated signal transduction through site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem. 285, 3470-3477; 상기 Diveu et al. (2004)). 그러나, 결합의 증가는 hIL-31RA과 hOSMR이 결합되었을 때 구별되었으며, 이는 hIL-31이 hIL-31RA에 먼저 결합하고 이때 hOSMR이 동원되어 삼원 복합체를 형성함을 시사한다(상기 Le Saux et al. (2010); 상기 Diveu et al. (2004)). 이 모델에서, 삼원 복합체는 수많은 하류 신호전달 경로를 활성화한다(상기 Dillon et al. (2004); 상기 Le Saux et al. (2010), 상기 Diveu et al. (2004); Dambacher et al. (2007) Gut 56, 1257-1265; Dreuw et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 36112-36120).
IL-6/IL-6 α-수용체/gp130 복합체의 구조에 기초하여(Boulanger et al. (2003) Science. 300, 2101-2104), IL-6 사이토카인 슈퍼패밀리는 3개의 상이한 접촉 결합 부위(부위 I, II 및 III)을 통해 이들의 수용체와 상호작용하는 것으로 생각된다. Le Saux 등은 전산학적 분석 및 희소 알라닌 스캐닝을 사용하여 hIL-31과 이의 수용체 사이의 상호작용을 위한 중요한 결합 부위로서만 부위 II 및 III을 기술하였다(상기 Le Saux et al. (2010)). 특히, Glu44, Glu106 및 His110은 결합 부위 II에 대한 중요한 잔기로 확인된 반면 Lys134는 결합 부위 III 내에서 확인되었다.
출원인은 고양이 IL-31(fIL-31)과 이의 고양이 수용체 fOSMR 및 fIL-31RA 사이의 상호작용에 대한 통찰력을 얻고, mAb #1 또는 15H05로 명명된 항-fIL-31 mAb에 대한 구조적 에피토프를 매핑하기 위한 연구를 시작하였다(Medina-Cucurella AV et al; Feline Interleukin-31 Shares Overlapping Epitopes with the Oncostatin M Receptor and IL-31RA. Biochemistry. 2020 Jun 16;59(23):2171-2181); WO2019/177697A2(조에티스 서비시스 엘엘씨(Zoetis Services LLC)). OSMR이 IL-31RA의 부재하에 IL-31과 상호작용할 수 없음을 보여준 인간 상동체에 대해 수행된 이전의 연구와 대조적으로, 출원인은 fOSMR이 fIL-31에 직접 결합하며 fIL-31RA 결합을 부분적으로 방해한다는 것을 여러 생물물리학적 방법을 통해 발견하였다. 출원인은 미세 에피토프 매핑(fine epitope mapping)과 결합된 예측된 구조적 모델(Medina-Cucurella (2019) Methods Mol. Biol. 1764, 101-121), 효모 표면 디스플레이(Chao et al. (2006) Nat. Protoc. 1, 755-768), 닉킹 돌연변이유발(nicking mutagenesis)(Wrenbeck et al. (2016) Nat. Methods 13, 928-930) 및 심층 시퀀싱(deep sequencing)(Araya and Fowler (2011) Trends Biotechnol. 29, 435-442)을 사용하여 fOSMR, fIL31-RA 및 항-fIL-31 mAb에 대한 잠재적인 fIL-31 결합 부위를 확인하였다. 작제된 결합 부위는 이전에 상기 Le Saux 등이 발견한 부위와 일치하였으며, 출원인이 "공유된 부위"라고 명명한 두 수용체 사이의 추가적인 중첩 부위를 보여주었다. 구체적으로, IL31-RA에 대한 결합 부위는 fIL-31 위치 E20 및 K82를 포함하는 반면, OSMR에 대한 결합 부위는 "패드NFERK" 모티프(P103-K110) 및 위치 G39 및 K100을 포함하며, 이는 인간 상동체에 대한 이전의 연구와 일치한다. 그러나, 출원인의 결과는 인간에 대해 이전에 보고되지 않은 두 고양이 수용체 사이의 위치 R69, R72, P73, D76, D81 및 E97로 구성된 새로운 중첩 부위도 밝혀내었다. OSMR과 IL-31RA를 모두 저해하는 항-고양이 IL-31 mAb의 구조적 에피토프가 또한 이 공유된 부위에 대해 매핑되었다. 결합된 출원인의 결과는 fIL-31이 부분적으로 공유된 에피토프를 통해 독립적으로 IL-31RA 및 OSMR에 결합함을 보여준다. 이러한 결과는 고양이와 같은 반려 동물의 IL-31 신호전달에 대한 메커니즘이 인간의 IL-31 신호전달에 대한 메커니즘과 다를 수 있음을 시사한다. 이는 결국 반려 동물에서 IL-31-매개성 신호전달을 길항하는 효율적인 치료적 전략이 고등 동물에서 IL-31-매개성 신호전달을 길항하는 치료적 전략과 다를 수 있음을 의미한다.
개 및/또는 고양이 온코스타틴 M 수용체 베타 서브유닛(OSMR-β)에 결합하며 개 및/또는 고양이에서 OSM-매개성 및/또는 IL-31-매개성 신호전달을 길항하는 치료용 단일클론 항체를 제공하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 항체는 바람직하게는 개 및 고양이에서 알레르기성 피부염 및 아토피성 피부염과 같은 중증 염증성 피부 장애 및 피부 또는 신장 섬유증과 같은 섬유증 병태를 포함하는 OSM 및 IL-31과 관련된 개 및 고양이의 질환의 진단 및/또는 치료에 유용할 것이다.
세포 모델은 지지 구조/대사, 염증/선천성 면역 및 조직 리모델링에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자의 발현에 영향을 미침으로써 인간 각질형성세포 기능을 조절하는 OSM의 역할을 설명한다(Boniface K et al; Oncostatin M secreted by skin infiltrating T lymphocytes is a potent keratinocyte activator involved in skin inflammation. J Immunol. 2007 Apr 1;178(7):4615-22). 이 연구자들은 재구성된 표피에서 일차 각질형성세포를 사용하는 세포 모델에서 각질형성세포 활성화로 인한 피부 염증에서 OSM-매개성 OSMR 활성화의 역할에 대한 강력한 증거를 제공한다. 이러한 각질형성세포 배양에서 OSM-매개성 OSMR 활성화는 피부의 건선 및 아토피성 질환과 일치하는 유전자 발현 패턴을 상향조절한다. 이러한 데이터는 염증성 피부 장애(건선 또는 아토피성 피부염(AD)) 환자에서 OSM 및 OSMR 모두의 발현 증가로 뒷받침된다. 차단 단일클론 항체로 OSMR-β를 표적화함으로써, IL-31 및 OSM 사이토카인 둘 다의 기능이 차단될 것이다. IL-31의 기능을 차단함으로써, 로키베트맙과 유사한 항-소양성 및 항-염증성 특성이 달성될 것으로 예상되지만, OSM의 저해로 인해 로키베트맙 이상의 추가적인 항-염증성 및 항-섬유증 활성이 달성될 수 있다.
본 발명은 개 또는 고양이 온코스타틴 M 수용체 베타(OSMR-β) 또는 둘 다에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하되, 항체는 개 및/또는 고양이 세포에서 IL-31-매개성 신호전달 또는 OSM-매개성 신호전달 또는 둘 다를 길항한다. 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 개 및/또는 고양이 세포에서 IL-31-매개성 신호전달 및 OSM-매개성 신호전달을 모두 길항한다. 일 실시형태에서, IL-31-매개성 신호전달은 pSTAT3 신호전달과 같으나 이에 제한되지 않는 pSTAT 신호전달이다. 또 다른 실시형태에서, OSM-매개성 신호전달은 pSTAT3 신호전달과 같으나 이에 제한되지 않는 pSTAT 신호전달이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 다음으로부터 선택되는 상보성 결정 영역(complementary determining region: CDR) 서열의 조합을 포함한다:
1) 02D09: 서열번호 1의 가변 중쇄(VH)-CDR1(DYGMH), 서열번호 2의 VH-CDR2(YISSGSRAVFFADTVKG), 서열번호 3의 VH-CDR3(DRYDGRGFAY), 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
2) 09E09: 서열번호 7의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 8의 VH-CDR2(YISSGGDYIYYADTVKG), 서열번호 9의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
3) 10F07: 서열번호 13의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 14의 VH-CDR2(YISSGGDYFYYADTVKG), 서열번호 15의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
4) 14C04: 서열번호 19의 VH-CDR1(NYWMN), 서열번호 20의 VH-CDR2(QIYPGHVNTNYNGNFKD), 서열번호 21의 VH-CDR3(SADNSGFVLFAY), 서열번호 22의 VL-CDR1(RASKSVSTSGYSYLH), 서열번호 23의 VL-CDR2(LASNLES) 및 서열번호 24의 VL-CDR3(QHSRELPLT);
5) 19F07: 서열번호 25의 VH-CDR1(DYYMA), 서열번호 26의 VH-CDR2(NINYDGSSTYYLDSLKS), 서열번호 27의 VH-CDR3(GLTWDFDV), 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT); 또는
6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
모 항체의 CDR 변이체의 일부 실시형태에서, 실시예 부문의 표 A에 표시된 돌연변이 위치에서 모 항체 02D09, 09E09, 10F07 및 19F07에 위치한 아미노산 잔기는 각각의 모 항체의 CDR 변이체에서 보존된다.
다른 실시형태에서, 19F07 모 항체의 CDR 변이체는 실시예 부문의 표 B에 제공된다. 구체적으로, 표 B는 19F07 항체의 각 CDR에 대한 일반적인 설명을 제공하고, 19F07의 각 CDR에 허용되는 아미노산 치환을 보여준다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체는 다음 가변 중쇄 및 가변 경쇄 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 가변 중쇄
서열번호 31(MU_02D09_VH)
Figure pct00001
서열번호 35(MU_09E09_VH)
Figure pct00002
서열번호 39(MU_10F07_VH)
Figure pct00003
서열번호 43(MU_14C04_VH)
Figure pct00004
서열번호 47(MU_19F07_VH)
Figure pct00005
서열번호 51(FEL_02D09_VH1)
Figure pct00006
서열번호 53(FEL_02D09_VH2)
Figure pct00007
서열번호 59(CAN_09E09_VH1)
Figure pct00008
서열번호 61(CAN_09E09_VH2)
Figure pct00009
서열번호 67(FEL_09E09_VH1)
Figure pct00010
서열번호 69(FEL_09E09_VH2)
Figure pct00011
서열번호 75(CAN_10F07_VH1)
Figure pct00012
서열번호 79(CAN_10F07_VH2)
Figure pct00013
서열번호 83(FEL_10F07_VH1)
Figure pct00014
서열번호 87(FEL_10F07_VH2)
Figure pct00015
서열번호 91(CAN_19F07_VH1)
Figure pct00016
서열번호 95(CAN_19F07_VH2)
Figure pct00017
서열번호 99(FEL_19F07_VH1)
Figure pct00018
서열번호 103(FEL_19F07_VH2)
Figure pct00019
서열번호 127(CAN_14C04_VH1)
Figure pct00020
또는
서열번호 129(CAN_14C04_VH2)
Figure pct00021
및
(b) 다음을 포함하는 가변 경쇄
서열번호 33(MU_02D09_VL)
Figure pct00022
서열번호 37(MU_09E09_VL)
Figure pct00023
서열번호 41(MU_10F07_VL)
Figure pct00024
서열번호 45(MU_14C04_VL)
Figure pct00025
서열번호 49(MU_19F07_VL)
Figure pct00026
서열번호 55(FEL_02D09_VL1)
Figure pct00027
서열번호 57(FEL_02D09_VL2)
Figure pct00028
서열번호 63(CAN_09E09_VL1)
Figure pct00029
서열번호 65(CAN_09E09_VL2)
Figure pct00030
서열번호 71(FEL_09E09_VL1)
Figure pct00031
서열번호 73(FEL_09E09_VL2)
Figure pct00032
서열번호 77(CAN_10F07_VL1)
Figure pct00033
서열번호 81(CAN_10F07_VL2)
Figure pct00034
서열번호 85(FEL_10F07_VL1)
Figure pct00035
서열번호 89(FEL_10F07_VL2)
Figure pct00036
서열번호 93(CAN_19F07_VL1)
Figure pct00037
서열번호 97(CAN_19F07_VL2)
Figure pct00038
서열번호 101(FEL_19F07_VL1)
Figure pct00039
서열번호 105(FEL_19F07_VL2)
Figure pct00040
서열번호 131(CAN_14C04_VL1)
Figure pct00041
또는
서열번호 133(CAN_14C04_VL2)
Figure pct00042
일 실시형태에서, 항체는 키메라이다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 개화되거나 고양이화된다.
일 실시형태에서, 항체는 개 또는 고양이에서 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 소양성 또는 알레르기성 병태를 저해하거나 중화한다. 일 양태에서, IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 소양성 병태는 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 알레르기성 병태는 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 종창, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐색, 기도 과민반응성, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 자가면역으로 인한 염증성 과정으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 항체는 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 섬유증 또는 염증성 장애를 저해한다. 일 양태에서, IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 섬유증 장애는 신장 섬유증, 폐 섬유증 및 피부 섬유증으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 염증성 장애는 자가면역, 골관절염, 면역-매개성 다발성 관절염, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 화농창상성 피부염, 죽상동맥경화증 및 심혈관 질환에 영향을 받는 동물의 피부 또는 관절의 염증으로 인한 염증성 과정으로부터 선택된다.
추가 실시형태에서, 항체는 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 염증성 통증을 감소시킨다. 일 양태에서, IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 염증성 통증은 골관절염 통증이다.
본 발명은 또한 위에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 항체를 포함하는 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법의 일 실시형태에서, IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 장애는 소양성 병태, 알레르기성 병태, 섬유증 장애, 염증성 장애 또는 염증성 통증으로부터 선택된다.
치료 방법의 또 다른 실시형태에서, IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 소양성 병태는 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방법의 또 다른 실시형태에서, IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 알레르기성 병태는 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 종창, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐색, 기도 과민반응성, 만성 폐쇄성 폐 질환 또는 자가면역으로 인한 염증성 과정으로부터 선택된다.
치료 방법의 추가 실시형태에서, IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 섬유증 장애는 신장 섬유증, 폐 섬유증 또는 피부 섬유증으로부터 선택된다. 방법의 또 다른 실시형태에서, IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 염증성 장애는 자가면역, 골관절염, 면역-매개성 다발성 관절염, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 화농창상성 피부염, 죽상동맥경화증 또는 심혈관 질환에 영향을 받는 동물의 피부 또는 관절의 염증으로 인한 염증성 과정으로부터 선택된다.
치료 방법의 또 다른 추가 실시형태에서, IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 염증성 통증은 골관절염 통증이다.
치료 방법의 일 실시형태에서, 대상체는 개 또는 고양이이다.
본 발명은 위에 기재된 바와 같은 항체를 개 또는 고양이에게 투여하는 단계를 포함하는, 개 또는 고양이에서 IL-31 및/또는 OSM 활성을 저해하는 방법을 추가로 제공한다.
또한, 샘플에서 OSMR 베타를 검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 위에 기재된 바와 같은 항체의 존재하에 OSMR 베타를 포함하는 샘플을 인큐베이션하는 단계; 및 샘플에서 OSMR 베타에 결합한 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 이 방법의 일 실시형태에서, 항체 표지를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 방법은 샘플에서 OSMR 베타를 정량화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 데 사용될 수 있는 숙주 세포 및 핵산을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 다음 조합 중 적어도 하나를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 숙주 세포를 제공한다:
1) 02D09: 서열번호 1의 가변 중쇄(VH)-CDR1(DYGMH), 서열번호 2의 VH-CDR2(YISSGSRAVFFADTVKG), 서열번호 3의 VH-CDR3(DRYDGRGFAY), 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
2) 09E09: 서열번호 7의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 8의 VH-CDR2(YISSGGDYIYYADTVKG), 서열번호 9의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
3) 10F07: 서열번호 13의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 14의 VH-CDR2(YISSGGDYFYYADTVKG), 서열번호 15의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
4) 14C04: 서열번호 19의 VH-CDR1(NYWMN), 서열번호 20의 VH-CDR2(QIYPGHVNTNYNGNFKD), 서열번호 21의 VH-CDR3(SADNSGFVLFAY), 서열번호 22의 VL-CDR1(RASKSVSTSGYSYLH), 서열번호 23의 VL-CDR2(LASNLES) 및 서열번호 24의 VL-CDR3(QHSRELPLT);
5) 19F07: 서열번호 25의 VH-CDR1(DYYMA), 서열번호 26의 VH-CDR2(NINYDGSSTYYLDSLKS), 서열번호 27의 VH-CDR3(GLTWDFDV), 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT); 또는
6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
본 발명은 또한 가변 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 다음 조합 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다:
1) 02D09: 서열번호 1의 가변 중쇄(VH)-CDR1(DYGMH), 서열번호 2의 VH-CDR2(YISSGSRAVFFADTVKG) 및 서열번호 3의 VH-CDR3(DRYDGRGFAY);
2) 09E09: 서열번호 7의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 8의 VH-CDR2(YISSGGDYIYYADTVKG) 및 서열번호 9의 VH-CDR3(DPITGTFAY);
3) 10F07: 서열번호 13의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 14의 VH-CDR2(YISSGGDYFYYADTVKG) 및 서열번호 15의 VH-CDR3(DPITGTFAY);
4) 14C04: 서열번호 19의 VH-CDR1(NYWMN), 서열번호 20의 VH-CDR2(QIYPGHVNTNYNGNFKD) 및 서열번호 21의 VH-CDR3(SADNSGFVLFAY);
5) 19F07: 서열번호 25의 VH-CDR1(DYYMA), 서열번호 26의 VH-CDR2(NINYDGSSTYYLDSLKS) 및 서열번호 27의 VH-CDR3(GLTWDFDV); 또는
6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
일 실시형태에서, 위에 기재된 핵산은 가변 경쇄 CDR 서열의 다음 조합 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다:
1) 02D09: 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
2) 09E09: 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
3) 10F07: 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
4) 14C04: 서열번호 22의 VL-CDR1(RASKSVSTSGYSYLH), 서열번호 23의 VL-CDR2(LASNLES) 및 서열번호 24의 VL-CDR3(QHSRELPLT);
5) 19F07: 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT); 또는
6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 서열은 가변 경쇄 CDR 서열의 다음 조합 중 적어도 하나를 암호화한다:
1) 02D09: 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
2) 09E09: 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
3) 10F07: 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
4) 14C04: 서열번호 22의 VL-CDR1(RASKSVSTSGYSYLH), 서열번호 23의 VL-CDR2(LASNLES) 및 서열번호 24의 VL-CDR3(QHSRELPLT);
5) 19F07: 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT); 또는
6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
본 발명은 위에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 항체의 생산을 초래하는 조건하에 위에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 숙주 세포의 배양 배지로부터 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
도 1은 a) 개 DH82 세포 및 b) 고양이 Fcwf4 세포에서 개 및 고양이 OSM의 처리에 의해 생성된 pSTAT3 용량-반응을 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 출원에 기재된 항-OSMR 항체를 선택하는 데 사용되는 단계를 보여주는 흐름도이다.
도 3은 본 출원에 기재된 항-OSMR 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열의 정렬이다.
도 4는 본 출원에 기재된 5개의 항-OSMR 항체에 대해 생성된 상동성 모델의 구조의 쌍별 비교 후 CDR의 RMSD 값을 보여주는 행렬이다.
도 5의 A)는 개 OSMR 단백질의 이량체에 결합된 개 OSM의 이량체를 보여주는 상동성 모델이다. 검은색 원은 OSM 및 OSMR의 결합 계면을 강조한 것이다. B)는 인간 OSM:OSMR 상호작용에서 중요한 것으로 알려진 아미노산을 강조하는 결합 계면의 확대된 영역을 보여준다.
도 6은 OSM이 OSMR에 결합하는 논리적인 위치 및 인간, 개 및 고양이 OSMR 단백질 사이의 서열 다양성에 기초한 본 명세서에 기재된 항체의 에피토프 결합 부위를 보여준다.
도 7은 RNAscope ISH 프로브를 사용한 고양이 피부에서의 OSMR mRNA의 정량화를 보여준다. 대조군 조직은 정상적인 고양이 피부 생검으로부터 얻은 것이며, 병든 조직은 알레르기성 피부 질환이 있는 고양이의 피부 생검으로부터 얻은 것이다.
도 8은 대조군(비알레르기성) 대 병든(알레르기성) 피부 조직으로부터의 OSMR 단백질의 IHC 염색으로부터의 단일 대표 이미지를 보여준다.
도 9의 A)는 24-시간 동안 개 OSM 단백질의 용량 증가에 반응하는 개 활막세포의 증식을 보여준다. B)는 대조군 항체(또한 24-시간 인큐베이션)와 비교하여 항-OSMR 마우스 항체 10F07(본 명세서에 기재됨)을 사용한 OSM-유도성 개 활막세포 증식의 저해를 보여준다.
도 10의 A)는 24-시간 동안 개 OSM 단백질의 용량 증가에 반응하는 개 활막세포에서의 개 MCP-1 단백질의 유도를 보여준다. B)는 대조군 항체(또한 24-시간 인큐베이션)와 비교하여 항-OSMR 마우스 항체 10F07(본 명세서에 기재됨)을 사용한 OSM-유도성 개 활막세포 MCP-1 생산의 저해를 보여준다.
도 10의 A)는 24-시간 동안 개 OSM 단백질의 용량 증가에 반응하는 개 활막세포에서의 개 MCP-1 단백질의 유도를 보여준다. B)는 대조군 항체(또한 24-시간 인큐베이션)와 비교하여 항-OSMR 마우스 항체 10F07(본 명세서에 기재됨)을 사용한 OSM-유도성 개 활막세포 MCP-1 생산의 저해를 보여준다.
도 11은 72-시간 동안 개 OSM 단백질의 용량 증가에 반응하는 일차 개 신장 섬유아세포에서 개 MCP-1 단백질의 유도를 보여준다.
도 12의 A)는 둘 다 그룹당 6마리의 동물에게 제0일에 12.0 ㎎/㎏의 용량으로 피하 투여된 항-OSMR 마우스:개 키메라 19F07(T01) 및 10F07(T02)을 비교하는 IL-31 유도성 소양증의 개 모델에서 투약 전 및 후의 소양증 점수를 보여준다. B)는 처리 그룹에 의한 투여 후 점수와 평균 및 90% 신뢰 한계를 이용한 대응표본 t-검정에 대한 요약 통계를 보여준다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 본 명세서에서 02D09-VH-CDR1로 지칭되는 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 2는 본 명세서에서 02D09-VH-CDR2로 지칭되는 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 3은 본 명세서에서 02D09-VH-CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 4는 본 명세서에서 02D09-VL-CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 5는 본 명세서에서 02D09-VL-CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 6은 본 명세서에서 02D09-VL-CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 7은 본 명세서에서 09E09-VH-CDR1로 지칭되는 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 8은 본 명세서에서 09E09-VH-CDR2로 지칭되는 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 9는 본 명세서에서 09E09-VH-CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 10은 본 명세서에서 09E09-VL-CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 11은 본 명세서에서 09E09-VL-CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 12는 본 명세서에서 09E09-VL-CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 13은 본 명세서에서 10F07-VH-CDR1로 지칭되는 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 14는 본 명세서에서 10F07-VH-CDR2로 지칭되는 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 15는 본 명세서에서 10F07-VH-CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 16은 본 명세서에서 10F07-VL-CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 17은 본 명세서에서 10F07-VL-CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 18은 본 명세서에서 10F07-VL-CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 19는 본 명세서에서 14C04-VH-CDR1로 지칭되는 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 20은 본 명세서에서 14C04-VH-CDR2로 지칭되는 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 21은 본 명세서에서 14C04-VH-CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 22는 본 명세서에서 14C04-VL-CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 23은 본 명세서에서 14C04-VL-CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 24는 본 명세서에서 14C04-VL-CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 25는 본 명세서에서 19F07-VH-CDR1로 지칭되는 가변 중쇄 CDR1이고;
서열번호 26은 본 명세서에서 19F07-VH-CDR2로 지칭되는 가변 중쇄 CDR2이고;
서열번호 27은 본 명세서에서 19F07-VH-CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3이고;
서열번호 28은 본 명세서에서 19F07-VL-CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1이고;
서열번호 29는 본 명세서에서 19F07-VL-CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2이고;
서열번호 30은 본 명세서에서 19F07-VL-CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3이고;
서열번호 31은 본 명세서에서 MU_02D09_VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 32는 본 명세서에서 MU_02D09_VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 33은 본 명세서에서 MU_02D09_VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 34는 본 명세서에서 MU_02D09_VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 35는 본 명세서에서 MU_09E09_VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 36은 본 명세서에서 MU_09E09_VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 37은 본 명세서에서 MU_09E09_VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 38은 본 명세서에서 MU_09E09_VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 39는 본 명세서에서 MU_10F07_VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 40은 본 명세서에서 MU_10F07_VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 41은 본 명세서에서 MU_10F07_VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 42는 본 명세서에서 MU_10F07_VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 43은 본 명세서에서 MU_14C04_VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 44는 본 명세서에서 MU_14C04_VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 45는 본 명세서에서 MU_14C04_VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 46은 본 명세서에서 MU_14C04_VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 47은 본 명세서에서 MU_19F07_VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 48은 본 명세서에서 MU_19F07_VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 49는 본 명세서에서 MU_19F07_VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 50은 본 명세서에서 MU_19F07_VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 51은 본 명세서에서 FEL_02D09_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 52는 본 명세서에서 FEL_02D09_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 53은 본 명세서에서 FEL_02D09_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 54는 본 명세서에서 FEL_02D09_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 55는 본 명세서에서 FEL_02D09_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 56은 본 명세서에서 FEL_02D09_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 57은 본 명세서에서 FEL_02D09_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 58은 본 명세서에서 FEL_02D09_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 59는 본 명세서에서는 CAN_09E09_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 60은 본 명세서에서는 CAN_09E09_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 61은 본 명세서에서는 CAN_09E09_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 62는 본 명세서에서는 CAN_09E09_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 63은 본 명세서에서는 CAN_09E09_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 64는 본 명세서에서는 CAN_09E09_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 65는 본 명세서에서는 CAN_09E09_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 66은 본 명세서에서는 CAN_09E09_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 67은 본 명세서에서 FEL_09E09_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 68은 본 명세서에서 FEL_09E09_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 69는 본 명세서에서 FEL_09E09_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 70은 본 명세서에서 FEL_09E09_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 71은 본 명세서에서 FEL_09E09_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 72는 본 명세서에서 FEL_09E09_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 73은 본 명세서에서 FEL_09E09_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 74는 본 명세서에서 FEL_09E09_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 75는 본 명세서에서는 CAN_10F07_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 76은 본 명세서에서는 CAN_10F07_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 77은 본 명세서에서는 CAN_10F07_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 78은 본 명세서에서는 CAN_10F07_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 79는 본 명세서에서는 CAN_10F07_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 80은 본 명세서에서는 CAN_10F07_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 81은 본 명세서에서는 CAN_10F07_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 82는 본 명세서에서는 CAN_10F07_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 83은 본 명세서에서 FEL_10F07_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 84는 본 명세서에서 FEL_10F07_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 85는 본 명세서에서 FEL_10F07_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 86은 본 명세서에서 FEL_10F07_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 87은 본 명세서에서 FEL_10F07_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 88은 본 명세서에서 FEL_10F07_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 89는 본 명세서에서 FEL_10F07_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 90은 본 명세서에서 FEL_10F07_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 91은 본 명세서에서는 CAN_19F07_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 92는 본 명세서에서는 CAN_19F07_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 93은 본 명세서에서는 CAN_19F07_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 94는 본 명세서에서는 CAN_19F07_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 95는 본 명세서에서는 CAN_19F07_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 96은 본 명세서에서는 CAN_19F07_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 97은 본 명세서에서는 CAN_19F07_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 98은 본 명세서에서는 CAN_19F07_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 99는 본 명세서에서 FEL_19F07_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 100은 본 명세서에서 FEL_19F07_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 101은 본 명세서에서 FEL_19F07_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 102는 본 명세서에서 FEL_19F07_VL1로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 103은 본 명세서에서 FEL_19F07_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 104는 본 명세서에서 FEL_19F07_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 105는 본 명세서에서 FEL_19F07_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열이고;
서열번호 106은 본 명세서에서 FEL_19F07_VL2로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 107은 본 명세서에서 개_OSMR_hIgG1_Fc로 지정된 개 OSMR-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열이고;
서열번호 108은 본 명세서에서 개_OSMR_hIgG1_Fc로 지정된 개 OSMR-Fc 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 109는 본 명세서에서 개_OSM로 지칭되는 개 OSM에 해당하는 아미노산 서열이고;
서열번호 110은 본 명세서에서 고양이_OSM_hIgG1_Fc로 지칭되는 고양이 OSM-Fc 융합 단백질에 해당하는 아미노산 서열이고;
서열번호 111은 본 명세서에서 고양이_OSM_hIgG1_Fc로 지칭되는 고양이 OSM-Fc 융합 단백질에 해당하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 112는 본 명세서에서 고양이_OSMR_hIgG1_Fc로 지정된 고양이 OSMR-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열이고;
서열번호 113은 본 명세서에서 고양이_OSMR_hIgG1_Fc로 지정된 고양이 OSMR-Fc 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 114는 본 명세서에서 개_HC_65_1로 지칭되는 개 중쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열이고;
서열번호 115는 본 명세서에서 개_HC_65_1로 지칭되는 개 중쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 116은 본 명세서에서 개_LC_카파로 지칭되는 개 경쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열이고;
서열번호 117은 본 명세서에서 개_LC_카파를 지칭하는 개 경쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 118은 본 명세서에서 고양이_HC_대립유전자A_1로 지칭되는 고양이 중쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열이고;
서열번호 119는 본 명세서에서 고양이_HC_대립유전자A_1로 지칭되는 고양이 중쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 120은 본 명세서에서 고양이_LC_카파_G_마이너스로 지칭되는 고양이 경쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열이고;
서열번호 121은 본 명세서에서 고양이_LC_카파_G_마이너스로 지칭되는 고양이 경쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 122는 본 명세서에서 인간_OSMR로 지칭되는 인간 OSMR 단백질에 대한 아미노산 서열이고;
서열번호 123은 본 명세서에서 개_IL31로 지칭되는 개 IL31 단백질에 대한 아미노산 서열이고;
서열번호 124는 본 명세서에서 개_IL31로 지칭되는 개 IL31 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 125는 본 명세서에서 고양이_IL31로 지칭되는 고양이 IL31 단백질에 대한 아미노산 서열이고;
서열번호 126은 본 명세서에서 고양이_IL31로 지칭되는 고양이 IL31 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 127은 본 명세서에서는 CAN_14C04_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 128은 본 명세서에서는 CAN_14C04_VH1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 129는 본 명세서에서는 CAN_14C04_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 130은 본 명세서에서는 CAN_14C04_VH2로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 131은 본 명세서에서는 CAN_14C04_VL1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 132는 본 명세서에서는 CAN_14C04_VL2로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 133은 본 명세서에서는 CAN_14C04_VL1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이고;
서열번호 134는 본 명세서에서는 CAN_14C04_VL2로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고;
서열번호 135는 본 명세서에서 인간_LIFR로 지정된 인간 LIFR 단백질의 아미노산 서열이고;
서열번호 136은 본 명세서에서 인간_LIF로 지정된 인간 LIF 단백질의 아미노산 서열이다.
정의
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명의 맥락에서 사용되는 여러 용어가 정의될 것이다. 이러한 용어에 더하여, 필요에 따라 다른 용어들이 본 명세서의 다른 곳에서 정의된다. 본 명세서에서 달리 명시적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술 용어는 해당 기술 분야에서 인정되는 의미를 가질 것이다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 복수의 이러한 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 에피토프는 항체의 CDR에 의해 인식되는 항원 결정기를 지칭한다. 즉, 에피토프는 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 임의의 분자의 일부를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항-OSMR 베타 작용제가 반응하는 OSMR 베타의 영역을 지칭한다.
"항원"은 추가적으로 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부이다(상응하는 항체 결합 영역은 파라토프로 지칭될 수 있음). 일반적으로, 에피토프는 분자, 예를 들어, 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 그룹화로 이루어지며, 특정 3차원 구조적 특성뿐만 아니라 특정 전하 특성을 갖는다.
항체 결합의 맥락에서 용어 "특이적으로"는 특정 항원, 즉, 폴리펩타이드 또는 에피토프에 대한 항체의 고결합력 및/또는 고친화성 결합을 지칭한다. 많은 실시형태에서, 특정 항원은 항체-생산 세포가 단리되는 동물 숙주를 면역화하는 데 사용되는 항원(또는 항원의 단편 또는 소분획)이다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 동일한 항체가 다른 항원에 결합하는 것보다 더 강하다. 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 약하지만 검출 가능한 수준(예를 들어, 관심 폴리펩타이드에 대해 나타난 결합의 10% 이하)에서 다른 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 이러한 약한 결합 또는 배경 결합은, 예를 들어, 적절한 대조군의 사용에 의해 대상 폴리펩타이드에 결합하는 특정 항체와 쉽게 구별할 수 있다. 일반적으로, 특정 항체는 10-7 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 이하(예를 들어, 10-9 M 이하, 10-10 이하, 10-11 이하, 10-12 이하 또는 10-13 이하 등)의 KD의 결합 친화성으로 항원에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 온전한 면역글로불린을 지칭한다. 따라서, 단일의 단리된 항체 또는 단편은 다중클론 항체, 단일클론 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 헤테로키메라 항체, 개화된 항체 또는 고양이화된 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 바람직하게는 단일클론 항체 및 이의 단편, 및 OSMR 베타 단백질 및 이의 단편에 결합할 수 있는 이의 면역학적 결합 등가물을 지칭한다. 용어 항체는 동종 분자 또는 복수의 상이한 분자 실체로 구성된 혈청 제품과 같은 혼합물을 지칭하기 위해 사용된다.
"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유적 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 이황화 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 사이에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬간 이황화 브리지를 갖는다. 각 중쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VH)과 여러 개의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VL)이 있고 다른 쪽 끝에 불변 도메인이 있으며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인과 정렬되고 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
용어 "항체 단편"은 제한 없이 단리된 단일 항체 사슬, Fv 작제물, Fab 작제물, Fc 작제물, 경쇄 가변 또는 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR) 서열 등을 포함하는 온전한 항체 구조보다 작은 것을 지칭한다.
용어 "가변" 영역은 프레임워크 및 CDR(초가변으로도 알려져 있음)을 포함하고, 가변 도메인의 소정의 부분이 항체 사이에서 서열이 광범위하게 상이하며 이의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 영역이라고 하는 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(framework region: FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 루프 연결을 형성하고, 일부 경우 α-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 β-시트 구성을 크게 채택하는 다중 FR을 포함한다. 각 사슬의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되며, 다른 사슬로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 데 직접 관여하지 않지만, 항체-의존적 세포 독성에 항체가 참여하는 것과 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용될 때 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(상기 Kabat, et al. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편이라고 하는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 이름의 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하고 비공유적으로 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. VH-VL 이량체 표면상의 항원-결합 부위를 정의하는 것은 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하는 이러한 구성이다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다 낮은 친화성으로 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에 몇 개의 잔기가 추가된다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파(κ) 및 람다(λ)라고 하는 2개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 현재 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 클래스가 있으며, 이들 중 일부는 하위클래스(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2(마우스 및 인간 명칭으로 정의됨)로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라고 한다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 여러 종에서 잘 알려져 있다. 이러한 불변 도메인과 관련된 개별적인 아이소타입 및 기능적 활성의 변화(prevalence)는 종-특이적이며 실험적으로 정의되어야 한다.
본 명세서에 정의된 "단일클론 항체"는 세포의 단일 클론(구체적으로, 하이브리도마 세포의 단일 클론)에 의해 생성된 항체이며, 따라서 단일의 순수한 동종 유형의 항체이다. 동일한 클론으로부터 생성된 모든 단일클론 항체는 동일하며 동일한 항원 특이성을 갖는다. 용어 "단일클론"은 세포의 단일 클론, 단일 세포 및 해당 세포의 자손과 관련이 있다.
본 명세서에서 단일클론 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이고, 나머지 사슬(들)은 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 또 다른 종으로부터 유래된 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)뿐만 아니라 이러한 항체의 단편을 포함한다. 전형적으로, 키메라 항체는 경쇄 및 중쇄 유전자가 상이한 종에 속하는 항체 가변 및 불변 영역 유전자로부터 전형적으로 유전 공학에 의해 작제된 항체이다. 예를 들어, 마우스 단일클론 항체 유전자의 가변 분절은 개 불변 분절에 연결될 수 있다. 이 실시형태에서, 항원 결합 부위는 마우스로부터 유래된 반면 FC 부분은 개이다.
비-개(예를 들어, 뮤린) 항체의 "개화된" 형태는 비-개 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 유전자 조작된 항체이다. 개화된 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스와 같은 비-개 종(공여 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기로 대체된 개 면역글로불린 서열(수용 항체)이다. 일부 예에서, 개 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-개 잔기로 대체된다. 또한, 개화된 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 개화된 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-개 면역글로불린 서열의 것에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 개 면역글로불린 서열의 것이다. 개화된 항체는 또한 선택적으로 전형적으로 개 면역글로불린 서열의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 전체 또는 적어도 일부를 포함할 것이다. 일 실시형태에서, 마우스 CDR은 개 프레임워크에 이식된다.
비-고양이(예를 들어, 뮤린) 항체의 "고양이화된" 형태는 비-고양이 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 유전자 조작된 항체이다. 고양이화된 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스와 같은 비-고양이 종(공여 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기로 대체된 고양이 면역글로불린 서열(수용 항체)이다. 일부 예에서, 고양이 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-고양이 잔기로 대체된다. 또한, 고양이화된 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 고양이화된 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-고양이 면역글로불린 서열의 것에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 고양이 면역글로불린 서열의 것이다. 고양이화된 항체는 또한 선택적으로 전형적으로 고양이 면역글로불린 서열의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 전체 또는 적어도 일부를 포함할 것이다.
본 명세서에 정의된 용어 "헤테로키메라"는 항체 사슬(중쇄 또는 경쇄) 중 하나는 개화된 반면 다른 하나는 키메라인 항체를 지칭한다. 일 실시형태에서, 개화된 가변 중쇄(여기서 모든 CDR은 마우스이고, 모든 FR은 개임)는 키메라 가변 경쇄(여기서 모든 CDR은 마우스이고, 모든 FR은 마우스임)와 쌍을 이룬다. 이 실시형태에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 모두 개 불변 영역에 융합된다.
"변이체" 항-OSMR 베타 항체는 모 항체 서열에서 본 명세서에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 추가, 결실 및/또는 치환에 의해 "모" 항-OSMR 베타 항체 아미노산 서열과 아미노산 서열이 다르며 모 항-OSMR 베타-항체의 적어도 하나의 목적하는 활성을 유지하는 분자를 지칭한다. 목적하는 활성은 항원에 특이적으로 결합하는 능력, 동물에서 OSM 활성 및/또는 IL-31 활성을 감소, 저해 또는 중화하는 능력 및 세포-기반 검정에서 OSM-매개성 및/또는 IL-31-매개성 pSTAT 신호전달(STAT 인산화)을 저해하는 능력을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변(CDR) 및/또는 프레임워크 영역(들)에 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변(CDR) 및/또는 프레임워크 영역에 적어도 1개, 예를 들어, 약 1개 내지 약 15개, 바람직하게는 약 2개 내지 약 5개 또는 2개 내지 약 10개의 치환을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 CDR 영역에 적어도 약 다음 수의 아미노산 치환을 포함할 수 있다: 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개. 또 다른 실시형태에서, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 CDR 영역에 약 다음 수까지의 아미노산 치환을 포함할 수 있다: 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개. 변이체 항체와 관련하여, 모 항체의 임의의 주어진 CDR에서 아미노산 치환의 수는 모 항체의 다른 CDR에서의 치환의 수와 상이할 수 있음을 이해하여야 한다. 일 실시형태에서, 변이체는 각각 독립적으로 모 항체의 가변 중쇄 CDR1, 가변 중쇄 CDR2 및 가변 중쇄 CDR3 아미노산 서열과 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있는 가변 중쇄 CDR1, 가변 중쇄 CDR2 및 가변 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 가질 것이다. 또 다른 실시형태에서, 변이체는 각각 독립적으로 모 항체의 가변 경쇄 CDR1, 가변 경쇄 CDR2 및 가변 경쇄 CDR3 아미노산 서열과 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있는 가변 경쇄 CDR1, 가변 경쇄 CDR2 및 가변 경쇄 CDR3 아미노산 서열을 가질 것이다. 일반적으로, 변이체는 모 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 서열과 적어도 50% 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 65%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 이 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 본 명세서에서 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후 모 항체 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. N-말단, C-말단 또는 내부 신장(extension), 결실 또는 항체 서열로의 삽입 중 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않아야 한다. 변이체는 OSMR 베타에 결합하는 능력을 유지하며, 바람직하게는 모 항체의 것보다 우수한 목적하는 활성을 갖는다. 예를 들어, 변이체는 더 강한 결합 친화성, 동물에서 OSM 및/또는 IL-31 활성을 감소, 저해 또는 중화하는 향상된 능력 및/또는 세포-기반 검정에서 OSM 및/또는 IL-31-매개성 pSTAT 신호전달을 저해하는 향상된 능력을 가질 수 있다.
"변이체" 핵산은 본 명세서에서 "모" 핵산과 서열이 다른 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드 서열 분기는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 치환 또는 추가와 같은 돌연변이적 변화로 인해 발생할 수 있다. 이러한 변화는 각각 단독으로 또는 조합하여, 주어진 순서로 1회 이상 발생할 수 있다.
본 명세서에서 "모" 항체는 변이체의 제조에 사용되는 아미노산 서열에 의해 암호화되는 항체이다. 바람직하게는, 모 항체는 개 프레임워크 영역을 갖고, 존재하는 경우, 개 항체 불변 영역(들)을 갖는다. 예를 들어, 모 항체는 개화된 또는 개 항체일 수 있다. 또 다른 예로서, 모 항체는 고양이화된 또는 고양이 항체일 수 있다. 또 다른 예로서, 모 항체는 뮤린 단일클론 항체이다.
용어 "단리된"은 물질(예를 들어, 항체 또는 핵산)이 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리되고/되거나 회수됨을 의미한다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 물질의 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 핵산과 관련하여, 단리된 핵산은 염색체에서 정상적으로 회합되는 5'에서 3'로의 서열로부터 분리된 것을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 물질은 물질의 95중량% 초과, 가장 바람직하게는 99중량% 초과로 정제될 것이다. 단리된 물질은 물질의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 제자리(제자리) 물질을 포함한다. 일반적으로, 그러나, 단리된 물질은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 명세서에서 사용될 때 단어 "표지"는 항체 또는 핵산에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지 자체는 그 자체로 검출 가능할 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는 효소적 표지의 경우 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드", "핵산 분자" 등은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있고, DNA 및 RNA에 있는 일련의 뉴클레오타이드 염기("뉴클레오타이드"라고도 함)를 지칭한다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 및/또는 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은, 예를 들어, 단일-가닥 및 이중-가닥 분자를 포함한다. 핵산은, 예를 들어, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, DNA 분자(예를 들어, cDNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), 재조합 핵산, 플라스미드 및 다른 벡터, 프라이머 및 프로브일 수 있다. 5'에서 3'(센스) 및 3'에서 5'(안티센스) 폴리뉴클레오타이드가 모두 포함된다.
"대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 분자에 의해 영향을 받을 수 있는 치료를 필요로 하는 동물을 지칭한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 동물은 척추동물을 포함하며, 개, 고양이 및 말 동물과 같은 포유동물이 특히 바람직한 예이다.
"치료학적 유효량"(또는 "유효량")은 대상체 또는 환자에게 투여될 때 유익하거나 또는 목적하는 결과를 초래하기에 충분한 활성 성분, 예를 들어, 본 발명에 따른 작용제의 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 치료학적 유효량의 조성물은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "치료학적 유효량"은 증상의 임상적 개선을 포함하는 소양성 병태 또는 알레르기성 병태의 치료와 관련된 하나 이상의 매개변수에서 객관적으로 측정된 변화를 생성하는 양이다. 물론, 치료학적 유효량은 특정 대상체 및 치료될 병태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 병태의 중증도, 선택된 특정 화합물, 따라야 할 투여 양생법, 투여 시기, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이며, 이들 모두는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적"은 질환 또는 장애에 대한 치료의 전 범위를 포함한다. 본 발명의 "치료적" 작용제는 위험한 것으로 확인될 수 있는 동물을 표적으로 하도록 설계된 절차를 포함하는 예방적(prophylactic 또는 preventive) 방식으로(약물유전학); 또는 본질적으로 개선적이거나 또는 치료적인 방식으로 작용할 수 있거나; 또는 치료될 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 진행 속도 또는 정도를 늦추는 작용을 할 수 있다.
"치료", "치료하는" 등은 치료적 치료 및 예방적 조치 모두를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 동물은 이미 장애가 있는 동물뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 동물을 포함한다. 용어 질환 또는 장애의 "치료" 또는 이를 "치료하는"은 질환 또는 장애를 예방하거나 또는 이로부터 보호하는 것(즉, 임상적 증상이 발생하지 않도록 하는 것); 질환 또는 장애를 저해하는 것(즉, 임상적 증상의 발생을 정지시키거나 또는 억제하는 것; 및/또는 질환 또는 장애를 완화시키는 것(즉, 임상적 증상의 퇴행을 유발하는 것)을 포함한다. 알 수 있는 바와 같이, 궁극적인 귀납적 사건 또는 사건들이 알려지지 않았거나 잠재적일 수 있기 때문에 질환 또는 장애를 "예방하는" 것과 "억제하는" 것을 구별하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 따라서, 용어 "예방"은 "예방하는" 및 "억제하는"을 모두 포함하는 "치료"의 유형을 구성하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 용어 "치료"는 "예방"을 포함한다.
용어 "알레르기성 병태"는 본 명세서에서 면역계와 및 신체 외부 물질 사이의 상호작용에 의해 유발되는 장애 또는 질환으로 정의된다. 이 외부 물질은 "알레르겐(allergen)"이라고 한다. 일반적인 알레르겐은 꽃가루, 먼지, 곰팡이, 집먼지진드기 단백질, 벌레 물림에 의해 주입된 타액 등과 같은 공기 알레르겐을 포함한다. 알레르기성 병태의 예는 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 종창, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐색, 기도 과민반응성, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 과민성 대장 증후군(Irritable bowel syndrome: IBS)과 같은 자가면역으로 인한 염증성 과정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "소양성 병태"는 본 명세서에서 완화를 위해 피부를 문지르거나 또는 긁고 싶은 충동을 일으키는 극심한 가려움증을 특징으로 하는 질환 또는 장애로 정의된다. 소양성 병태의 예는 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "섬유증 장애"는 본 명세서에서 기관 또는 조직에 세포외 매트릭스 성분이 축적되어 이들의 구조를 변화시키고 정상적인 기능의 파괴를 초래하는 섬유증을 특징으로 하는 질환 또는 장애로 정의된다. 섬유증은 거의 모든 기관 또는 조직에서 발생할 수 있으며, 매우 다양한 질환과 관련이 있다. 섬유증 장애 유형의 예는 신장 섬유증, 폐 섬유증 및 피부 섬유증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "염증성 장애"는 염증을 특징으로 하는 다양한 장애 및 병태를 포함한다. 예는 자가면역으로 인한 염증성 과정, 골관절염에 의해 영향을 받는 동물의 피부 또는 관절의 염증, 면역-매개성 다발성 관절염, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 화농창상성 피부염, 죽상동맥경화증 및 심혈관 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "염증성 통증"은 조직 손상 및 염증(예를 들어, 수술 후 통증, 외상, 관절염)에 대한 반응으로 발생하는 통증에 대한 자발적인 과민반응이다. 하나의 비제한적인 예에서, 염증성 통증은 골관절염과 관련된 통증이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 모든 용어는 또한 임의의 및 모든 후속 세대인 자손을 포함한다. 고의적이거나 또는 부주의한 돌연변이로 인해 모든 자손이 동일하지 않을 수 있음이 이해된다. 이종 핵산 서열을 발현하는 맥락에서, "숙주 세포"는 시험관내 또는 생체내에 위치하는지에 관계없이 원핵생물 또는 진핵생물 세포(예를 들어, 세균 세포, 효모 세포, 포유동물 세포 및 곤충 세포)를 지칭한다. 예를 들어, 숙주 세포는 트랜스제닉 동물에 위치할 수 있다. 숙주 세포는 벡터에 대한 수용자로서 사용될 수 있고, 벡터를 복제하고/하거나 벡터에 의해 암호화되는 이종 핵산을 발현할 수 있는 임의의 형질전환 가능한 유기체를 포함할 수 있다.
"조성물"은 활성제와 보조제와 같이 비활성(예를 들어, 표지) 또는 활성일 수 있는 또 다른 화합물 또는 조성물의 조합을 의미하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, 본 발명에 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 담체는 제한 없이 물, 식염수, 완충 식염수, 포스페이트 완충액, 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함한다. 다른 통상적으로 사용되는 희석제, 보조제 및 부형제가 통상적인 기법에 따라 첨가될 수 있다. 이러한 담체는 에탄올, 폴리올 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일 및 주사용 유기 에스터를 포함할 수 있다. 완충액 및 pH 조정제가 또한 사용될 수 있다. 완충액은 제한 없이 유기산 또는 염기로부터 제조된 염을 포함한다. 대표적인 완충액은 제한 없이 시트르산, 예를 들어, 시트레이트, 아스코르브산, 글루콘산, 히스티딘-HCl, 탄산, 타타르산, 석신산, 아세트산 또는 프탈산의 염과 같은 유기산염, Tris, 트라이메탄민 하이드로클로라이드 또는 포스페이트 완충액을 포함한다. 비경구 담체는 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스, 트레할로스, 수크로스 및 소듐 클로라이드, 젖산 링거 또는 고정유를 포함할 수 있다. 정맥내 담체는 링거 덱스트로스 등에 기초한 것들과 같은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 비활성 가스 등과 같은 방부제 및 기타 첨가제가 또한 약제학적 담체에 제공될 수 있다. 본 발명은 담체의 선택에 의해 제한되지 않는다. 적절한 pH 등장성, 안정성 및 다른 통상적인 특성을 갖는 위에 기재된 성분으로부터의 이러한 약제학적으로 허용 가능한 조성물의 제조는 당업계의 기술 범위 내에 있다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, publ., 2000; 및 The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th edit., eds. R. C. Rowe et al, APhA Publications, 2003]과 같은 교과서를 참조한다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 주어진 아미노산 잔기에 대한 임의의 아미노산 치환을 나타내며, 여기서 치환 잔기는 주어진 잔기의 것과 화학적으로 유사하여 폴리펩타이드 기능(예를 들어, 효소적 활성)의 실질적인 감소를 초래하지 않는다. 보존적 아미노산 치환은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 이들의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제6,790,639호, 제6,774,107호, 제6,194,167호 또는 제5,350,576호에 기술되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 다음 6개의 그룹 중 하나 내에서 발생하는 임의의 것일 것이다:
Figure pct00043
1. 작은 지방족, 실질적으로 비극성 잔기: Ala, Gly, Pro, Ser 및 Thr;
Figure pct00044
2. 큰 지방족, 비극성 잔기: Ile, Leu 및 Val; Met;
Figure pct00045
3. 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 아마이드: Asp 및 Glu;
Figure pct00046
4. 극성, 음으로 하전된 잔기의 아마이드: Asn 및 Gln; His;
Figure pct00047
5. 극성, 양으로 하전된 잔기: Arg 및 Lys; His; 및
Figure pct00048
6. 큰 방향족 잔기: Trp 및 Tyr; Phe.
바람직한 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 천연 잔기(보존적 치환) 쌍으로 열거된 다음 중 임의의 하나일 것이다: Ala(Ser); Arg(Lys); Asn(Gln; His); Asp(Glu); Gln(Asn); Glu(Asp); Gly(Pro); His (Asn; Gln); Ile(Leu; Val); Leu(Ile; Val); Lys(Arg; Gln; Glu); Met(Leu; Ile); Phe(Met; Leu; Tyr); Ser(Thr); Thr(Ser); Trp(Tyr); Tyr(Trp; Phe); 및 Val(Ile; Leu).
폴리펩타이드가 보존적 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있는 것과 마찬가지로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 보존적 코돈 치환(들)을 포함할 수 있다. 코돈 치환은 발현될 때 위에 기재된 바와 같은 보존적 아미노산 치환을 생성하는 경우 보존적인 것으로 간주된다. 아미노산 치환을 초래하지 않는 축퇴 코돈 치환도 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드에 유용하다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 실시형태에 유용한 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 이로 형질전환될 발현 숙주 세포에 의해 나타나는 코돈 사용 빈도를 근사화하거나 또는 그렇지 않으면 이의 발현을 개선하기 위해 축퇴 코돈 치환에 의해 돌연변이될 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으므로 다양할 수 있음을 이해하여야 한다. 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 이는 청구범위에 의해서만 정의된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 항체와 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며 일반적으로 사용되는 것들이다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조직 배양 및 형질감염(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)에 대해 표준 기법이 사용된다. 효소 반응 및 정제 기법은 제조업체 사양에 따라, 또는 당업계에서 일반적으로 달성되거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행된다. 전술한 기법 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 수행되며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001) 및 Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/Wiley Interscience), 1993]을 참조한다. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 실험실 절차와 기법은 당업계에서 잘 알려져 있으며 일반적으로 사용되는 것들이다. 표준 기법은 화학적 합성, 화학적 분석, 약제 제조, 제형화 및 전달 및 환자의 치료에 사용된다.
작동예 또는 달리 지시된 경우를 제외하고, 본 명세서에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다.
확인된 모든 특허 및 기타 간행물은, 예를 들어, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 설명된 방법론을 설명하고 개시하기 위해 참조에 의해 본 명세서에 명시적으로 포함된다. 이들 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시에 대해서만 제공된다.
본 발명은 재조합 단일클론 항체 및 펩타이드, 및 진단적 절차를 포함하는 임상 및 과학 절차에서의 이들의 용도를 제공한다. 분자 생물학 및 재조합 기술의 방법의 도입으로, 재조합 수단에 의해 항체 및 항체-유사 분자를 생산할 수 있게 되었으며, 이에 따라 항체의 폴리펩타이드 구조에서 발견되는 특정 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열을 생성할 수 있게 되었다. 이러한 항체는 상기 항체의 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 유전자 서열을 클로닝하거나 또는 상기 폴리펩타이드 사슬을 직접 합성하여 합성된 사슬을 조립하여 특정 에피토프 및 항원 결정기에 대해 친화성을 갖는 활성 사량체(H2L2) 구조를 형성함으로써 생성될 수 있다. 이는 상이한 종 및 공급원으로부터 항체를 중화시키는 특징이 있는 서열을 갖는 항체의 즉석 생산(ready production)을 가능하게 하였다.
항체의 출처 또는 재조합적으로 작제되거나 또는 합성되는 방식에 관계없이, 시험관내 또는 생체내에서 트랜스제닉 동물, 실험실 또는 상업적 규모의 거대 세포 배양물을 사용하거나, 트랜스제닉 식물을 사용하거나 또는 공정의 어떤 단계에서도 살아있는 유기체를 사용하지 않는 직접 화학 합성에 의해, 모든 항체는 전체적으로 유사한 3차원 구조를 갖는다. 이 구조는 종종 H 2 L2로 주어지며, 항체가 일반적으로 2개의 경쇄(L) 아미노산 사슬 및 2개의 중쇄(H) 아미노산 사슬을 포함한다는 사실을 지칭한다. 두 사슬은 모두 구조적으로 상보성인 항원 표적과 상호작용할 수 있는 영역을 갖는다. 표적과 상호작용하는 영역은 "가변" 또는 "V" 영역으로 지칭되며, 상이한 항원 특이성의 항체와의 아미노산 서열의 차이를 특징으로 한다. H 또는 L 사슬의 가변 영역은 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원 결합 영역"은 항원과 상호작용하고 항체에 항원에 대한 특이성 및 친화성을 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체 분자의 부분을 지칭한다. 항체 결합 영역은 항원-결합 잔기의 적절한 형태를 유지하는 데 필요한 "프레임워크" 아미노산 잔기를 포함한다.
항원 결합 영역을 제공하는 H 또는 L 사슬의 가변 영역 내에는 특이성이 다른 항체 사이의 극단적인 가변성 때문에 "초가변"이라고 불리는 더 작은 서열이 있다. 이러한 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 영역으로도 지칭된다. 이러한 CDR 영역은 특정 항원 결정기 구조에 대한 항체의 기본 특이성을 설명한다.
CDR은 가변 영역 내 아미노산의 비연속적인 신장부를 나타내지만, 종에 관계없이 가변 중쇄 및 경쇄 영역 내에서 이러한 중요한 아미노산 서열의 위치상 위치는 가변 사슬의 아미노산 서열 내에서 유사한 위치를 갖는 것으로 밝혀졌다. 모든 항체의 가변 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR 영역을 가지며, 각각은 서로 인접하지 않는다.
모든 포유동물 종에서, 항체 펩타이드는 불변(즉, 고도로 보존된) 및 가변 영역을 포함하며, 후자 내에는 CDR 및 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 내에 있지만 CDR 외부에 있는 아미노산 서열로 구성된 소위 "프레임워크 영역"이 있다.
항체의 CDR 영역에 의해 인식되는 항원 결정기에 관하여, 이는 "에피토프"로도 지칭된다. 즉, 에피토프는 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 임의의 분자의 부분 또는 부분들을 지칭한다(상응하는 항체 결합 영역은 파라토프로 지칭될 수 있음).
"항원"은 해당 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하도록 동물을 추가적으로 유도할 수 있는 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 위에 언급된 특정 반응은 항원이 다른 항원에 의해 유발될 수 있는 다수의 다른 항체가 아니라 해당 항체와 매우 선택적인 방식으로 반응할 것임을 나타낸다.
용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라 부분, 단편, 펩타이드 및, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fse, CDR 영역, 파라토프와 같은 이들의 유도체, 또는 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 임의의 부분 또는 펩타이드 서열을 모두 포함하는 것을 의미한다. 항체는 분자와 특이적으로 반응하여 분자를 항체에 결합시킬 수 있는 경우 "결합할 수 있다"고 한다.
항체는 또한 키메라 항체, 헤테로키메라 항체, 개화된 항체 또는 고양이화된 항체뿐만 아니라 효소적 절단, 펩타이드 합성 또는 재조합 기법과 같으나 이에 제한되지 않는 임의의 공지된 기법에 의해 제공되는 단편, 부분, 영역, 펩타이드 또는 이들의 유도체를 포함한다. 본 발명의 이러한 항체는 개 OSMR 베타 또는 고양이 OSMR 베타 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체 단편 또는 일부는 온전한 항체의 Fc 단편이 결여되어 있으며 순환계에서 더 빨리 제거될 수 있고, 온전한 항체보다 비특이적 조직 결합이 적을 수 있다. 항체 단편의 예는 파파인(Fab 단편을 생성하기 위해) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생성하기 위해)과 같은 효소를 사용한 단백질 분해성 절단에 의해 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 온전한 항체로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Wahl et al., 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983)] 참조. 항체의 일부는 임의의 위의 방법에 의해 만들어질 수 있거나 또는 재조합 분자의 일부를 발현시킴으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 재조합 항체의 CDR 영역(들)은 단리되고 적절한 발현 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,680,053호 참조.
클론 02D09, 09E09, 10F07, 14C04 및 19F07 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열
일부 실시형태에서, 본 발명은 개 OSMR 베타 또는 고양이 OSMR 베타 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론 항체를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 단일클론 항체는 개 OSMR 베타 또는 고양이 OSMR 베타에 결합하며, IL-31 수용체 A(IL-31Ra) 및 온코스타틴-M-특이적 수용체(OsmR 또는 OSMR 베타)를 포함하는 IL-31 보조 수용체 복합체의 활성화를 방지하거나 또는 저해한다. 본 발명의 단일클론 항체는 본 명세서에서 이의 하이브리도마 클론에 할당된 번호를 지칭하는 "02D09", "09E09, "10F07", "14C04" 및 "19F07"로 식별된다. 본 명세서에서, "02D09", "09E09", "10F07", "14C04" 및 "19F07"은 또한 각각 02D09, 09E09, 10F07, 14C04 및 19F07 항체에 결합하는 이들의 능력 때문에 02D09, 09E09, 10F07, 14C04 및 19F07로 식별되는 OSMR 베타 에피토프와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 파라토프 또는 CDR의 일부를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 02D09, 09E09, 10F07, 14C04 및 19F07의 여러 재조합, 키메라, 헤테로키메라, 개화된 및/또는 고양이화된 형태는 동일한 이름으로 지칭될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 다음으로부터 선택되는 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 조합을 포함한다:
1) 02D09: 서열번호 1의 가변 중쇄(VH)-CDR1(DYGMH), 서열번호 2의 VH-CDR2(YISSGSRAVFFADTVKG), 서열번호 3의 VH-CDR3(DRYDGRGFAY), 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
2) 09E09: 서열번호 7의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 8의 VH-CDR2(YISSGGDYIYYADTVKG), 서열번호 9의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
3) 10F07: 서열번호 13의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 14의 VH-CDR2(YISSGGDYFYYADTVKG), 서열번호 15의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
4) 14C04: 서열번호 19의 VH-CDR1(NYWMN), 서열번호 20의 VH-CDR2(QIYPGHVNTNYNGNFKD), 서열번호 21의 VH-CDR3(SADNSGFVLFAY), 서열번호 22의 VL-CDR1(RASKSVSTSGYSYLH), 서열번호 23의 VL-CDR2(LASNLES) 및 서열번호 24의 VL-CDR3(QHSRELPLT);
5) 19F07: 서열번호 25의 VH-CDR1(DYYMA), 서열번호 26의 VH-CDR2(NINYDGSSTYYLDSLKS), 서열번호 27의 VH-CDR3(GLTWDFDV), 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT); 또는
6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
일부 실시형태에서, 실시예 부문의 표 A에 표시된 돌연변이 위치에서 모 항체 02D09, 09E09, 10F07 및 19F07에 위치한 아미노산 잔기는 각각의 모 항체의 CDR 변이체에서 보존된다. 예를 들어, 표 A 및 서열 목록의 정보에 기초하여, 일부 실시형태에서 아래에 나타낸 밑줄 친 아미노산 잔기는 모 항체 02D09, 09E09, 10F07 및 19F07의 CDR 변이체에서 보존된다.
02D09: 서열번호 1의 가변 중쇄(VH)-CDR1(DYGMH), 서열번호 2의 VH-CDR2(YISSGSRAVFFADTVKG), 서열번호 3의 VH-CDR3(DRYDGRGFAY), 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
09E09: 서열번호 7의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 8의 VH-CDR2(YISSGGDYIYYADTVKG), 서열번호 9의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
10F07: 서열번호 13의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 14의 VH-CDR2(YISSGGDYFYYADTVKG), 서열번호 15의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
19F07: 서열번호 25의 VH-CDR1(DYYMA), 서열번호 26의 VH-CDR2(NINYDGSSTYYLDSLKS), 서열번호 27의 VH-CDR3(GLTWDFDV), 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT).
실시예 19에 기재된 결과에 기초하여, 밑줄 친 위치에서의 알라닌 대체 돌연변이는 OSMR 표적에 대한 항체의 결합에 부정적인 영향을 미쳤다. 추론에 의해, 밑줄 그어지지 않은 잔기는 CDR 변이체에서 대체될 수 있으며, 이는 이들 위치에서의 알라닌 돌연변이가 OSMR 표적에 대한 항체의 결합에 부정적인 영향을 미치지 않았기 때문이다.
또한, 실시예 부문의 표 B의 정보는 일부 실시형태에서 19F07 모 항체의 CDR 변이체가 아래에 재현된 해당 표의 서열 정의에 명시된 허용되는 치환을 가질 수 있는 것임을 뒷받침한다.
Figure pct00049
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체는 다음 가변 중쇄 및 가변 경쇄 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 가변 중쇄:
서열번호 31(MU_02D09_VH)
Figure pct00050
서열번호 35(MU_09E09_VH)
Figure pct00051
서열번호 39(MU_10F07_VH)
Figure pct00052
서열번호 43(MU_14C04_VH)
Figure pct00053
서열번호 47(MU_19F07_VH)
Figure pct00054
서열번호 51(FEL_02D09_VH1)
Figure pct00055
서열번호 53(FEL_02D09_VH2)
Figure pct00056
서열번호 59(CAN_09E09_VH1)
Figure pct00057
서열번호 61(CAN_09E09_VH2)
Figure pct00058
서열번호 67(FEL_09E09_VH1)
Figure pct00059
서열번호 69(FEL_09E09_VH2)
Figure pct00060
서열번호 75(CAN_10F07_VH1)
Figure pct00061
서열번호 79(CAN_10F07_VH2)
Figure pct00062
서열번호 83(FEL_10F07_VH1)
Figure pct00063
서열번호 87(FEL_10F07_VH2)
Figure pct00064
서열번호 91(CAN_19F07_VH1)
Figure pct00065
서열번호 95(CAN_19F07_VH2)
Figure pct00066
서열번호 99(FEL_19F07_VH1)
Figure pct00067
서열번호 103(FEL_19F07_VH2)
Figure pct00068
서열번호 127(CAN_14C04_VH1)
Figure pct00069
또는
서열번호 129(CAN_14C04_VH2)
Figure pct00070
및
(b) 다음을 포함하는 가변 경쇄:
서열번호 33(MU_02D09_VL)
Figure pct00071
서열번호 37(MU_09E09_VL)
Figure pct00072
서열번호 41(MU_10F07_VL)
Figure pct00073
서열번호 45(MU_14C04_VL)
Figure pct00074
서열번호 49(MU_19F07_VL)
Figure pct00075
서열번호 55(FEL_02D09_VL1)
Figure pct00076
서열번호 57(FEL_02D09_VL2)
Figure pct00077
서열번호 63(CAN_09E09_VL1)
Figure pct00078
서열번호 65(CAN_09E09_VL2)
Figure pct00079
서열번호 71(FEL_09E09_VL1)
Figure pct00080
서열번호 73(FEL_09E09_VL2)
Figure pct00081
서열번호 77(CAN_10F07_VL1)
Figure pct00082
서열번호 81(CAN_10F07_VL2)
Figure pct00083
서열번호 85(FEL_10F07_VL1)
Figure pct00084
서열번호 89(FEL_10F07_VL2)
Figure pct00085
서열번호 93(CAN_19F07_VL1)
Figure pct00086
서열번호 97(CAN_19F07_VL2)
Figure pct00087
서열번호 101(FEL_19F07_VL1)
Figure pct00088
서열번호 105(FEL_19F07_VL2)
Figure pct00089
서열번호 131(CAN_14C04_VL1)
Figure pct00090
또는
서열번호 133(CAN_14C04_VL2)
Figure pct00091
다른 실시형태에서, 본 발명은 위에 기재된 항체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-OSMR 베타 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 발명의 범위 내에 포함한다. 02D09, 09E09, 10F07, 14C04 및 19F07 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 뉴클레오타이드 서열이 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 또한 가변 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 다음 조합 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다:
1) 02D09: 서열번호 1의 가변 중쇄(VH)-CDR1(DYGMH), 서열번호 2의 VH-CDR2(YISSGSRAVFFADTVKG) 및 서열번호 3의 VH-CDR3(DRYDGRGFAY);
2) 09E09: 서열번호 7의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 8의 VH-CDR2(YISSGGDYIYYADTVKG) 및 서열번호 9의 VH-CDR3(DPITGTFAY);
3) 10F07: 서열번호 13의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 14의 VH-CDR2(YISSGGDYFYYADTVKG) 및 서열번호 15의 VH-CDR3(DPITGTFAY);
4) 14C04: 서열번호 19의 VH-CDR1(NYWMN), 서열번호 20의 VH-CDR2(QIYPGHVNTNYNGNFKD) 및 서열번호 21의 VH-CDR3(SADNSGFVLFAY);
5) 19F07: 서열번호 25의 VH-CDR1(DYYMA), 서열번호 26의 VH-CDR2(NINYDGSSTYYLDSLKS) 및 서열번호 27의 VH-CDR3(GLTWDFDV); 또는
6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
일 실시형태에서, 위에 기재된 핵산은 가변 경쇄 CDR 서열의 다음 조합 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다:
1) 02D09: 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
2) 09E09: 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
3) 10F07: 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
4) 14C04: 서열번호 22의 VL-CDR1(RASKSVSTSGYSYLH), 서열번호 23의 VL-CDR2(LASNLES) 및 서열번호 24의 VL-CDR3(QHSRELPLT);
5) 19F07: 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT); 또는
6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 서열은 가변 경쇄 CDR 서열의 다음 조합 중 적어도 하나를 암호화한다:
1) 02D09: 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
2) 09E09: 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
3) 10F07: 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
4) 14C04: 서열번호 22의 VL-CDR1(RASKSVSTSGYSYLH), 서열번호 23의 VL-CDR2(LASNLES) 및 서열번호 24의 VL-CDR3(QHSRELPLT);
5) 19F07: 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT); 또는
6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
본 발명은 위에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 단일 발현 벡터는 가변 경쇄 CDR 서열을 암호화하는 핵산 서열뿐만 아니라 가변 중쇄 CDR 서열을 암호화하는 핵산 서열을 운반할 수 있다. 대안적으로, 가변 경쇄 CDR을 암호화하는 핵산 서열은 하나의 벡터에 의해 운반될 수 있는 반면, 가변 중쇄 CDR을 암호화하는 핵산 서열은 별도의 벡터에 의해 운반될 수 있다.
유전자 코드는 축퇴되기 때문에, 특정 아미노산을 암호화하기 위해 하나 초과의 코돈이 사용될 수 있다. 유전자 코드를 사용하여, 하나 이상의 상이한 뉴클레오타이드 서열이 식별될 수 있으며, 이들 각각은 아미노산을 암호화할 수 있다. 특정 올리고뉴클레오타이드가 실제로 실제 XXX-암호화 서열을 구성할 확률은 비정상적인 염기 페어링 관계 및 특정 코돈이 항-OSMR 베타 항체 또는 이의 일부를 발현하는 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서 (특정 아미노산을 암호화하기 위해) 실제로 사용되는 빈도를 고려하여 추정될 수 있다. 이러한 "코돈 사용 규칙"은 문헌[Lathe, et al., 183 J. Molec. Biol. 1-12 (1985)]에 개시되어 있다. Lathe의 "코돈 사용 규칙"을 사용하여, 항-OSMR 베타 서열을 암호화할 수 있는 이론적인 "가장 가능성이 높은" 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 뉴클레오타이드 서열 또는 뉴클레오타이드 서열의 세트가 확인될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하기 위한 항체 코딩 영역은 본 명세서에 기재된 항체 및 항원-결합 부분의 변이체(효능제)를 생성하는 표준 분자 생물학적 기법을 사용하여 기존의 항체 유전자를 변경시킴으로써 제공될 수 있는 것으로 의도된다. 이러한 변이체는 항-OSMR 베타 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 아미노산 서열에서의 결실, 부가 및 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 치환의 한 부류는 보존적 아미노산 치환이다. 이러한 치환은 항-OSMR 베타 항체 서열에서 주어진 아미노산을 유사한 특성의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 전형적으로 보존적 치환으로 보이는 것은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 중에서 다른 것으로의 대체; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아마이드 잔기 Asn 및 Gln 간의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환, 방향족 잔기 Phe, Tyr 사이의 대체 등이다. 어떤 아미노산 변화가 표현형적으로 침묵할 가능성이 있는지에 관한 지침은 문헌[Bowie et al., 247 Science 1306-10 (1990)]에서 찾을 수 있다.
변이체 또는 효능제 항-OSMR 베타 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 완전히 기능적일 수 있거나 또는 하나 이상의 활성에서 기능이 결여되어 있을 수 있다. 완전히 기능적인 변이체는 전형적으로 중요하지 않은 잔기 또는 중요하지 않은 영역에 보존적 변이 또는 변이만을 포함한다. 기능적 변이체는 또한 기능에 변화가 없거나 또는 미미한 변화를 초래하는 유사한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이러한 치환은 어느 정도 기능에 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 비기능적 변이체는 전형적으로 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환, 결실, 삽입, 역위 또는 절단 또는 중요한 잔기 또는 중요한 영역의 치환, 삽입, 역위 또는 결실을 포함한다.
기능에 필수적인 아미노산은 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다(Cunningham et al., 244 Science 1081-85 (1989)). 후자의 절차는 분자의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그런 다음, 생성된 돌연변이체 분자는 에피토프 결합 또는 시험관내 ADCC 활성과 같은 생물학적 활성에 대해 테스트된다. 리간드-수용체 결합에 중요한 부위는 또한 결정학, 핵 자기 공명 또는 광친화성 표지와 같은 구조적 분석에 의해 결정될 수 있다(Smith et al., 224 J. Mol. Biol. 899-904 (1992); de Vos et al., 255 Science 306-12 (1992)).
더욱이, 폴리펩타이드는 종종 20개의 "자연 발생적" 아미노산 이외의 아미노산을 포함한다. 또한, 말단 아미노산을 포함하는 많은 아미노산이 처리 및 다른 번역 후 변형과 같은 자연적 과정 또는 당업계에 잘 알려진 화학적 변형 기법에 의해 변형될 수 있다. 공지된 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아마이드화, 플라빈의 공유적 부착, 헴 모이어티의 공유적 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유적 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유적 부착, 가교결합, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 폼일화, 감마 카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 아이오다인화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해 처리, 인산화, 프렌일화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화 및 유비퀴틴화와 같은 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개성 첨가를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이러한 변형은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 과학 문헌에 매우 상세하게 기술되어 있다. 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화와 같은 몇 가지 특히 일반적인 변형은 문헌[Proteins--Structure and Molecular Properties (2nd ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman & Co., NY, 1993)]과 같은 가장 기본적인 교과서에 기술되어 있다. 문헌[Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic Press, NY, 1983); Seifter et al. 182 Meth. Enzymol. 626-46 (1990); 및 Rattan et al. 663 Ann. NY Acad. Sci. 48-62 (1992)]과 같이 이러한 주제에 대한 많은 상세한 리뷰가 이용 가능하다.
따라서, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 부분은 또한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 암호화된 것이 아닌 유도체 또는 유사체를 포함한다.
유사하게는, 방금 설명한 아미노산 서열의 추가 및 치환뿐만 아니라 변이 및 변형은 OSM 베타 항원 및/또는 이의 에피토프의 아미노산 서열에 동일하게 적용될 수 있으므로 본 발명에 포함된다. 위에 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 단일클론 항체를 암호화하는 유전자는 OSMR 베타의 인식에 특히 효과적이다.
항체 유도체
항체 유도체가 본 발명의 범위에 포함된다. 항체의 "유도체"은 단백질의 일부가 아닌 추가적인 화학적 모이어티를 포함한다. 단백질의 공유적 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 변형은 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자에 도입될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 이작용성 작용제를 사용한 유도체화는 항체 또는 단편을 수불용성 지지체 매트릭스 또는 다른 거대분자 담체에 가교결합시키는 데 유용하다.
유도체는 또한 표지된 방사성 표지된 단일클론 항체를 포함한다. 예를 들어, 이들은 방사성 아이오다인(125I, 131I), 탄소(14C), 황(35S), 인듐(111In), 트라이튬(3H); 서양고추냉이 과산화수소, 알칼리 포스파테이스, 베타-D-갈락토시데이스, 글루코스 옥시데이스, 글루코아밀레이스, 카복실산 안하이드레이스, 아세틸콜린 에스터레이스, 라이소자임, 말레이트 데하이드로게네이스 또는 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게네이스와 같은 효소를 사용한 단일클론 항체와 바이오틴 또는 아비딘의 접합체; 및 단일클론 항체와 생물발광제(예컨대, 루시퍼레이스), 화학발광제(예컨대, 아크리딘 에스터) 또는 형광제(예컨대, 피코빌리단백질)의 접합체.
본 발명의 또 다른 유도체 이작용성 항체는 2개의 상이한 항원 그룹을 인식하는 2개의 별도의 항체의 일부를 조합함으로써 생성된 이중특이성 항체이다. 이는 가교 또는 재조합 기법에 의해 달성될 수 있다. 추가적으로, 모이어티는 생체내 반감기를 증가(예를 들어, 혈류로부터 제거되는 시간을 연장시킴으로써)시키기 위해 항체 또는 이의 일부에 추가될 수 있다. 이러한 기법은, 예를 들어, PEG 모이어티를 추가하는 것(페길화라고도 함)을 포함하며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 미국 공개 제20030031671호 참조.
항체의 재조합 발현
일부 실시형태에서, 대상 단일클론 항체를 암호화하는 핵산은 숙주 세포에 직접 도입되고, 세포는 암호화된 항체의 발현을 유도하기에 충분한 조건하에서 인큐베이션된다. 대상 핵산이 세포에 도입된 후, 세포는 항체의 발현을 허용하기 위해 약 1시간 내지 24시간 동안 때때로 선택하에 일반적으로 37℃에서 전형적으로 인큐베이션된다. 일 실시형태에서, 항체는 세포가 자라는 배지의 상청액에 분비된다.
전통적으로, 단일클론 항체는 뮤린 하이브리도마 계통에서 천연 분자로 생산되었다. 해당 기술에 더하여, 본 발명은 단일클론 항체의 재조합 DNA 발현을 제공한다. 이는 개화된 항체 및 고양이화된 항체뿐만 아니라 선택한 숙주 종에서 다양한 항체 유도체 및 융합 단백질의 생산을 가능하게 한다.
본 발명의 적어도 하나의 항-OSMR 베타 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 서열은 결찰을 위한 평활 또는 점착 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화, 부착 말단의 적절한 채움(filling), 바람직하지 않은 연결을 피하기 위한 알칼리 포스파테이스 처리 및 적절한 라이게이스를 사용한 결찰을 포함하는 통상적인 기법에 따라 벡터 DNA로 재조합될 수 있다. 이러한 조작을 위한 기법은, 예를 들어, 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989)]에 개시되어 있으며, 상기 문헌[Ausubel et al. 1993]은 단일클론 항체 분자 또는 이의 항원 결합 영역을 암호화하는 핵산 서열을 작제하는 데 사용될 수 있다.
DNA와 같은 핵산 분자는 전사 및 번역 조절 정보를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 이러한 서열이 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 "작동 가능하게 연결"되어 있는 경우 폴리펩타이드를 "발현할 수 있다"고 한다. 작동 가능한 연결은 조절 DNA 서열 및 발현하고자 하는 DNA 서열이 회수 가능한 양의 항-OSMR 베타 폴리펩타이드 또는 항체 부분으로서 유전자 발현을 허용하는 방식으로 연결되는 연결이다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 특성은 유사한 기술 분야에서 잘 알려져 있는 바와 같이 유기체마다 다를 수 있다. 예를 들어, 상기 문헌[Sambrook et al., 2001; 및 Ausubel et al., 1993] 참조.
따라서, 본 발명은 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 항-OSMR 베타 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 발현을 포함한다. 적합한 숙주는 생체내 또는 제자리(in situ)의 세균, 효모, 곤충, 진균, 새 및 포유동물 세포를 포함하는 세균 또는 진핵생물 숙주 또는 포유동물, 곤충, 새 또는 효모 기원의 숙주 세포를 포함한다. 포유동물 세포 또는 조직은 인간, 영장류, 햄스터, 토끼, 설치류, 소, 돼지, 양, 말, 염소, 개 또는 고양이 기원일 수 있지만, 임의의 다른 포유동물 세포도 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 도입된 뉴클레오타이드 서열은 수용 숙주에서 자가 복제가 가능한 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 혼입될 것이다. 임의의 매우 다양한 벡터가 이를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 문헌[Ausubel et al., 1993] 참조. 특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택하는 데 중요한 인자는 다음을 포함한다: 벡터를 포함하는 수용 세포가 벡터를 포함하지 않는 수용 세포로부터 인식되고 선택될 수 있는 용이성; 특정 숙주에서 요구되는 벡터의 카피수; 및 상이한 종의 숙주 세포 사이에서 벡터를 "셔틀"할 수 있는 것이 바람직한지 여부.
당업계에 공지된 원핵생물 벡터의 예는 대장균(예컨대, 예를 들어, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, .pi.VX)에서 복제할 수 있는 것들과 같은 플라스미드를 포함한다. 이러한 플라스미드는, 예를 들어, 상기 문헌[Maniatis et al., 1989; Ausubel et al, 1993]에 개시되어 있다. 바실러스 플라스미드는 pC194, pC221, pT127 등을 포함한다. 이러한 플라스미드는 문헌[Gryczan, in THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI 307-329 (Academic Press, NY, 1982)]에 개시되어 있다. 적합한 스트렙토마이세스 플라스미드는 pIJ101(Kendall et al., 169 J. Bacteriol. 4177-83 (1987)) 및 .phi.C31과 같은 스트렙토마이세스 박테리오파지(Chater et al., in SIXTH INT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 (Akademiai Kaido, Budapest, Hungary 1986)를 포함한다. 슈도모나스 플라스미드는 문헌[John et al., 8 Rev. Infect. Dis. 693-704 (1986); Izaki, 33 Jpn. J. Bacteriol. 729-42 (1978); 및 상기 Ausubel et al., 1993]에 검토되어 있다.
대안적으로, 항-OSMR 베타 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 cDNA의 발현에 유용한 유전자 발현 요소는 (a) 바이러스 전사 프로모터 및 이들의 인핸서 요소, 예컨대, SV40 초기 프로모터(Okayama et al., 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)), 라우스 육종 바이러스 LTR(Gorman et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 6777 (1982)) 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 LTR(Grosschedl et al., 41 Cell 885 (1985)); (b) 스플라이스 영역 및 폴리아데닐화 부위, 예컨대, SV40 후기 영역(Okayarea et al., 1983)으로부터 유래된 것들, 및 (c) SV40에서와 같은 폴리아데닐화 부위(Okayama et al., 1983)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
면역글로불린 cDNA 유전자는 문헌[Weidle et al., 51 Gene 21 (1987)]에 기술되어 있는 바와 같이 발현 요소 SV40 초기 프로모터 및 이의 인핸서, 마우스 면역글로불린 H 사슬 프로모터 인핸서, SV40 후기 영역 mRNA 스플라이싱, 토끼 S-글로빈 개재 서열, 면역글로불린 및 토끼 S-글로빈 폴리아데닐화 부위 및 SV40 폴리아데닐화 요소를 사용하여 발현될 수 있다.
부분 cDNA, 부분 게놈 DNA(Whittle et al., 1 Protein Engin. 499 (1987)), 전사 프로모터로 구성된 면역글로불린 유전자의 경우 인간 사이토메갈로바이러스일 수 있고, 프로모터 인핸서는 사이토메갈로바이러스 및 마우스/인간 면역글로불린일 수 있으며, mRNA 스플라이싱 및 폴리아데닐화 영역은 천연 염색체 면역글로불린 서열일 수 있다.
일 실시형태에서, 설치류 세포에서 cDNA 유전자의 발현을 위해, 전사 프로모터는 바이러스 LTR 서열이고, 전사 프로모터 인핸서는 마우스 면역글로불린 중쇄 인핸서 및 바이러스 LTR 인핸서 중 하나이거나 또는 둘 다이고, 스플라이스 영역은 31bp 초과의 인트론을 포함하고, 폴리아데닐화 및 전사 종결 영역은 합성되는 면역글로불린 사슬에 상응하는 천연 염색체 서열로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 다른 단백질을 암호화하는 cDNA 서열은 포유동물 세포에서 단백질의 발현을 달성하기 위해 위에 인용된 발현 요소와 조합된다.
각각의 융합된 유전자는 발현 벡터에 조립되거나 또는 이에 삽입될 수 있다. 그런 다음, 키메라 면역글로불린 사슬 유전자 산물을 발현할 수 있는 수용 세포는 항-OSMR 베타 면역글로불린 사슬을 암호화하는 유전자 또는 키메라 H 또는 키메라 L 사슬-암호화 유전자로 단독으로 형질감염되거나 또는 키메라 H 및 키메라 L 사슬 유전자로 공동 형질감염된다. 형질감염된 수용 세포는 혼입된 유전자의 발현을 허용하고 발현된 면역글로불린 사슬 또는 온전한 항체 또는 단편이 배양물로부터 회수되는 조건하에서 배양된다.
일 실시형태에서, 항-OSMR 베타 면역글로불린 H 및 L 사슬 또는 키메라 H 및 L 사슬 또는 이의 일부를 암호화하는 융합된 유전자는 이후에 수용 세포를 공동 형질감염시키는 데 사용되는 별도의 발현 벡터에 조립된다. 대안적으로, 키메라 H 및 L 사슬을 암호화하는 융합된 유전자는 동일한 발현 벡터에 조립될 수 있다.
발현 벡터의 형질감염 및 키메라 항체의 생산을 위해, 수용 세포주는 골수종 세포일 수 있다. 골수종 세포는 형질감염된 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 면역글로불린을 합성, 조립 및 분비할 수 있으며, 면역글로불린의 글리코실화 메커니즘을 보유한다. 골수종 세포는 배양물 또는 분비된 면역글로불린이 복수로부터 얻어질 수 있는 마우스의 복막강에서 성장할 수 있다. 다른 적합한 수용 세포는 인간 또는 비인간 기원의 B 림프구와 같은 림프 세포, 인간 또는 비인간 기원의 하이브리도마 세포 또는 종간 헤테로하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명의 키메라, 개화되거나 고양이화된 항체 작제물 또는 항-OSMR 베타 면역글로불린 유전자 작제물을 운반하는 발현 벡터는 형질전환, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트-침전과 같은 생화학적 수단 및 다이에틸아미노에틸(DEAE) 덱스트란과 같은 다가양이온을 사용한 적용 및 전기천공, 직접 미세주입 및 미세입자 투사법(microprojectile bombardment)과 같은 기계적 수단을 포함하는 임의의 다양한 적합한 수단에 의해 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다(Johnston et al., 240 Science 1538 (1988)).
효모는 면역글로불린 H 및 L 사슬의 생산에 있어 세균보다 상당한 이점을 제공할 수 있다. 효모는 글리코실화를 포함하는 번역 후 펩타이드 변형을 수행한다. 효모에서 목적하는 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있는 강력한 프로모터 서열 및 높은 카피수의 플라스미드를 활용하는 수많은 재조합 DNA 전략이 현재 존재한다. 효모는 클로닝된 포유동물 유전자 산물의 리더 서열을 인식하고 리더 서열을 보유하는 펩타이드(즉, 프리-펩타이드)를 분비한다(Hitzman et al., 11th Int'l Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982)).
효모 유전자 발현 시스템은 항-OSMR 베타 항체 서열, 항체 및 조립된 뮤린 및 키메라, 헤테로키메라, 개화되거나 고양이화된 항체, 이들의 단편 및 영역의 생산, 분비 및 안정성의 수준에 대해 일상적으로 평가될 수 있다. 효모가 글루코스가 풍부한 배지에서 성장할 때 대량으로 생산되는 해당 효소를 코딩하는 능동적으로 발현되는 유전자로부터의 프로모터 및 종결 요소를 포함하는 임의의 일련의 효모 유전자 발현 시스템이 사용될 수 있다. 공지된 해당 유전자는 또한 매우 효율적인 전사 제어 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 포스포글리세레이트 카이네이스(phosphoglycerate kinase: PGK) 유전자의 프로모터 및 종결 신호가 사용될 수 있다. 효모에서 클로닝된 면역글로불린 cDNA의 발현을 위한 최적의 발현 플라스미드를 평가하기 위해 다수의 접근 방식을 취할 수 있다. 문헌[Vol. II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK 1985)] 참조.
세균 균주는 또한 본 발명에 기술된 항체 분자 또는 펩타이드의 생산을 위한 숙주로서 사용될 수 있다. 숙주 세포와 양립할 수 있는 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 제어 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 이러한 세균 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 복제 부위뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 특정 유전자를 운반한다. 세균에서 클로닝된 면역글로불린 cDNA에 의해 암호화된 뮤린, 키메라, 헤테로키메라, 개화되거나 고양이화된 항체, 단편 및 영역 또는 항체 사슬의 생산을 위한 발현 플라스미드를 평가하기 위해 다수의 접근 방식을 취할 수 있다(문헌[상기 Glover, 1985; 상기 Ausubel, 1993; 상기 Sambrook, 2001; Colligan et al., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, NY (1994-2001); Colligan et al., eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001)] 참조).
숙주 포유동물 세포는 시험관내 또는 생체내에서 성장시킬 수 있다. 포유동물 세포는 리더 펩타이드 제거, H 및 L 사슬의 접힘 및 조립, 항체 분자의 글리코실화 및 기능적 항체 단백질의 분비를 포함하는 면역글로불린 단백질 분자에 번역 후 변형을 제공한다.
항체 단백질의 생산을 위한 숙주로서 유용할 수 있는 포유동물 세포는 위에 기재된 림프 기원의 세포에 더하여 Vero(ATCC CRL 81) 또는 CHO-K1(ATCC CRL 61) 세포와 같은 섬유아세포 기원의 세포를 포함한다.
포유동물 세포에서 클로닝된 항-OSMR 베타 H 및 L 사슬 유전자의 발현을 위해 많은 벡터 시스템이 이용 가능하다(상기 문헌[Glover, 1985] 참조). 완전한 H2L2 항체를 얻기 위해 다른 접근법을 따를 수 있다. 완전한 사량체 H2L2 항체 및/또는 항-OSMR 베타 단편(예를 들어, 이의 항원-결합 부분)으로의 H 및 L 사슬의 세포내 회합 및 연결을 달성하기 위해 동일한 세포에서 H 및 L 사슬을 공동 발현시키는 것이 가능하다. 공동 발현은 동일한 숙주에서 동일하거나 또는 상이한 플라스미드를 사용함으로써 발생할 수 있다. H 및 L 사슬 모두에 대한 유전자 및/또는 항-OSMR 베타 단편은 동일한 플라스미드에 배치될 수 있으며, 그런 다음 이는 세포에 형질감염되고, 이에 의해 두 사슬을 발현하는 세포를 직접 선택할 수 있다. 대안적으로, 세포는 하나의 사슬, 예를 들어, L 사슬을 암호화하는 플라스미드로 먼저 형질감염된 후, 생성된 세포주가 제2 선별 마커를 포함하는 H 사슬 플라스미드로 형질감염될 수 있다. 두 경로를 통해 항-OSMR 베타 아미노산 서열 및/또는 H2L2 분자를 생산하는 세포주는 추가적인 선별 마커와 함께 펩타이드, H, L 또는 H + L 사슬의 추가적인 카피를 암호화하는 플라스미드로 형질감염되어 조립된 H2L2 항체 분자의 더 높은 생산 또는 형질감염된 세포주의 향상된 안정성과 같은 향상된 특성을 갖는 세포주를 생성할 수 있다.
재조합 항체의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정적인 발현이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주는 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 숙주 세포는 면역글로불린 발현 카세트 및 선별 마커로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1일 내지 2일 동안 성장시킨 다음 선택 배지로 교환된다. 재조합 플라스미드 내 선별 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 염색체에 안정적으로 통합시키고 성장하여 결국 세포주로 클로닝되고 확장될 수 있는 초점(foci)을 형성할 수 있게 한다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물/성분의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
일단 본 발명의 항체가 생산되면, 이는 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화성 및 분류 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 많은 실시형태에서, 항체는 세포에서 배양 배지로 분비되고 배양 배지로부터 수확된다.
약제학적 적용
본 발명의 항-OSMR 베타 항체 또는 이의 항원-결합 부분은, 예를 들어, 개 및 고양이와 같은 반려 동물의 다양한 병태의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 병태는 소양성 병태, 알레르기성 병태, 염증성 병태, 섬유증 병태 및 염증과 관련된 통증을 포함한다. 이러한 유형의 병태에 대한 구체적이지만 비제한적인 예가 본 명세서에 개시되어 있다. 일부 경우에, 특정 장애는 하나 이상의 범주에 속하는 것으로 간주될 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 소정의 알레르기성 병태도 염증성 병태로 간주될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제 및, 활성 성분으로서 본 발명에 따른 항체 또는 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 항체는 본 발명에 따른 키메라, 헤테로키메라, 개화되거나 고양이화된 항체일 수 있다. 온전한 면역글로불린 또는 Fab와 같은 이들의 결합 단편이 또한 구상된다. 본 발명의 항체 및 이의 약제학적 조성물은 비경구 투여, 예를 들어, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여에 유용하다.
본 발명의 항-OSMR 베타 항체 및/또는 이의 항원-결합 부분은 개별 치료제로서 또는 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로 선택된 투여 경로 및 표준 약제학적 관행에 기초하여 선택된 약제학적 담체와 함께 투여된다.
본 명세서에 개시된 항체의 투여는 비경구 주사(예컨대, 복강내, 피하 또는 근육내 주사), 경구를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 또는 기도 표면에 대한 항체(전형적으로 약제학적 제형으로 수행됨)의 국소 투여에 의해 수행될 수 있다. 기도 표면에 대한 국소 투여는 비강내 투여에 의해(예를 들어, 점적기, 면봉 또는 흡입기의 사용에 의해) 수행될 수 있다. 기도 표면에 대한 항체의 국소 투여는 또한 에어로졸 현탁액으로서 항체를 포함하는 약제학적 제형(고체 및 액체 입자를 모두 포함)의 호흡 가능한 입자를 생성한 다음 대상체가 호흡 가능한 입자를 흡입하게 하는 것과 같은 흡입 투여에 의해 수행될 수 있다. 약제학적 제형의 호흡 가능한 입자를 투여하기 위한 방법 및 장치는 잘 알려져 있으며, 임의의 통상적인 기법이 사용될 수 있다. 경구 투여는, 예를 들어, 섭취 가능한 액체 또는 고체 제형의 형태일 수 있다.
일부 목적하는 실시형태에서, 항체는 비경구 주사에 의해 투여된다. 비경구 투여를 위해, 항-OSMR 베타 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 약제학적으로 허용 가능한 비경구 비히클과 함께 용액, 현탁액, 에멀션 또는 동결건조된 분말로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 비히클은 수성 담체와 같은 허용 가능한 담체에 용해된 항체 또는 이의 칵테일의 용액일 수 있다. 이러한 비히클은 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 트레할로스 또는 수크로스 용액 또는 5% 혈청 알부민, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 등이다. 고정유와 같은 리포솜 및 비수성 비히클이 또한 사용될 수 있다. 이러한 용액은 무균이며, 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이러한 조성물은 통상적인 잘 알려진 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 독성 조정제 등과 같은 대략적인 생리학적 조건에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 락테이트 등을 포함할 수 있다. 이러한 제형 내 항체의 농도는, 예를 들어, 약 0.5중량% 미만, 일반적으로 적어도 약 1중량% 내지 많게는 15중량% 또는 20중량%까지 상당히 광범위할 수 있으며, 주로 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등에 기초하여 선택될 것이다. 비히클 또는 동결건조된 분말은 등장성(예를 들어, 소듐 클로라이드, 만니톨) 및 화학적 안정성(예를 들어, 완충액 및 방부제)을 유지하는 첨가제를 포함할 수 있다. 제형은 일반적으로 사용되는 기법에 의해 멸균된다.
비경구로 투여 가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 또는 명백할 것이며, 예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMA. SCI. (15th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980)]에 보다 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 항체는 보관을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체에 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래의 면역 글로불린에 효과적인 것으로 나타났다. 임의의 적합한 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다. 당업자라면 동결건조 및 재구성은 다양 정도의 항체 활성 손실을 초래할 수 있으며, 사용 수준을 보상하기 위해 조정되어야 할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 항체 또는 이의 칵테일을 포함하는 조성물은 기존 질환의 재발 방지 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 이 분야의 표준 참고 교과서인 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES]의 최신판에 기술되어 있다.
치료적 적용에서, 조성물은 질환 및 이의 합병증을 치료하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키거나 또는 완화시키기에 충분한 양으로 이미 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료학적 유효 용량" 또는 "치료학적 유효량"으로 정의된다. 이러한 사용에 효과적인 양은 질환의 중증도 및 대상체 자신의 면역계의 일반적인 상태에 따라 다를 것이지만, 일반적으로 체중 kg당 약 0.1㎎의 항체 내지 체중 kg당 약 10㎎의 항체, 바람직하게는 체중 kg당 약 0.3㎎의 항체 내지 체중 kg당 약 5㎎의 항체 범위일 것이다. 본 발명의 개-유사 및 고양이-유사 항체에 의해 달성되는 외부 물질의 최소화 및 "외래 물질" 거부의 낮은 가능성을 고려하여, 이러한 항체를 실질적으로 과잉으로 투여하는 것이 가능할 수 있다.
물론 투여되는 투여량은 특정 작용제의 약력학적 특성 및 이의 투여 방식 및 경로와 같은 공지된 요인; 수용자의 연령, 건강 및 체중; 증상의 특성 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료의 빈도 및 목적하는 효과에 따라 달라질 것이다.
비제한적인 예로서, 개 또는 고양이에서 IL-31-관련 또는 OSM-관련 병리의 치료는 위에 기재된 투여량 범위에서 본 발명의 항-OSMR 베타 항체의 격주 또는 월간 투여량으로 제공될 수 있다.
개 또는 고양이 치료 용도를 위한 예시적인 항체는 본 발명에 따라 강력한 생체내 항-OSMR 베타 활성을 갖는 고친화성(이들은 또한 고결합력일 수 있음) 항체 및 이의 단편, 영역 및 유도체이다.
조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료하는 수의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 어떤 경우에도, 약제학적 제형은 대상체를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 항체(들)를 제공하여야 한다.
진단적 적용
본 발명은 또한 소양성 병태, 알레르기성 병태, 염증성 병태, 섬유증 병태 또는 염증과 관련된 통증과 같은 OSM 및/또는 IL-31-매개성 병태인 것으로 알려지거나 또는 이로 의심되는 반려 동물에서 OSMR 베타를 검출하기 위한 진단 방법에 사용하기 위한 위의 항-OSMR 베타 항체 및 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
본 발명의 항-OSMR 베타 항체 및/또는 이의 항원-결합 부분은 샘플에서 OSMR 베타 또는 항-OSMR 베타 항체를 검출하거나 또는 정량화하는 면역검정에 유용하다. OSMR 베타에 대한 면역검정은 전형적으로 OSMR 베타에 선택적으로 결합할 수 있는 본 발명의 검출 가능하게 표지된 고친화성(또는 고결합력)의 항-OSMR 베타 항체의 존재하에 임상적 또는 생물학적 샘플을 인큐베이션하는 단계 및 샘플에 결합된 표지된 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 다양한 임상적 검정 절차가 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[IMMUNOASSAYS FOR THE 80'S (Voller et al., eds., Univ. Park, 1981)] 참조. 이러한 샘플은 동물 대상체로부터 수집되고 아래 기재된 바와 같이 ELISA 분석을 거치는 조직 생검, 혈액, 혈청 및 대변 샘플 또는 액체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체에 대한 항원의 결합은 고체 지지체의 사용 없이 검출된다. 예를 들어, 항체에 대한 항원의 결합은 액체 형식으로 검출될 수 있다.
다른 실시형태에서, 항-OSMR 베타 항체는, 예를 들어, 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정화할 수 있는 나이트로셀룰로스 또는 또 다른 고체 지지체에 고정될 수 있다. 그런 다음, 지지체는 적합한 완충액으로 세척된 후 검출 가능하게 표지된 OSMR 베타-특이적 항체로 처리될 수 있다. 그런 다음, 고체상 지지체는 결합되지 않은 표지된 항체를 제거하기 위해 완충액으로 두 번째로 세척될 수 있다. 그런 다음, 고체 지지체 상에 결합된 표지의 양은 공지된 방법 단계에 의해 검출될 수 있다.
"고체상 지지체" 또는 "담체"는 펩타이드, 항원 또는 항체가 결합할 수 있는 임의의 지지체를 지칭한다. 잘 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리바이닐리덴플루오라이드(PVDF), 덱스트란, 나일론, 아밀레이스, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴리아크릴아마이드, 아가로스 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 어느 정도 가용성이거나 또는 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 커플링된 분자가 OSMR 베타 또는 항-OSMR 베타 항체에 결합할 수 있는 한 거의 모든 가능한 구조적 구성을 가질 수 있다. 따라서, 지지체 구성은 비드와 같이 구형이거나 또는 테스트 튜브의 내부 표면 또는 막대의 외부 표면과 같이 원통형일 수 있다. 대안적으로, 표면은 시트, 배양 접시, 테스트 스트립 등과 같이 편평할 수 있다. 예를 들어, 지지체는 폴리스타이렌 비드를 포함할 수 있다. 당업자는 결합 항체, 펩타이드 또는 항원에 결합하기 위한 많은 다른 적합한 담체를 알고 있거나 또는 일상적인 실험에 의해 동일한 것을 확인할 수 있다.
잘 알려진 방법 단계는 주어진 로트의 항-OSMR 베타 항체의 결합 활성을 결정할 수 있다. 당업자는 일상적인 실험에 의해 작동적 및 최적의 검정 조건을 결정할 수 있다.
OSMR 베타-특이적 항체를 검출 가능하게 표지하는 것은 효소 면역검정(enzyme immunoassay: EIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)에 사용하기 위해 효소에 연결함으로써 달성될 수 있다. 연결된 효소는 노출된 기질과 반응하여, 예를 들어, 분광광도, 형광에 의해 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생성한다. 본 발명의 OSMR 베타-특이적 항체를 검출 가능하게 표지하는 데 사용될 수 있는 효소는 말레이트 데하이드로게네이스, 포도상구균 뉴클레이스, 델타-5-스테로이드 아이소머레이스, 효모 알코올 데하이드로게네이스, 알파-글리세로포스페이트 데하이드로게네이스, 트라이오스 포스페이트 아이소머레이스, 서양고추냉이 과산화수소, 알칼리 포스파테이스, 아스파라기네이스, 글루코스 옥시데이스, 베타-갈락토시데이스, 리보뉴클레이스, 우레이스, 카탈레이스, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게네이스, 글루코아밀레이스 및 아세틸콜린에스터레이스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
OSMR 베타-특이적 항체에 방사성 표지를 함으로써, 방사면역검정(radioimmunoassay: RIA)의 사용을 통해 OSMR 베타를 검출할 수 있다. 문헌[Work et al., LAB. TECHNIQUES & BIOCHEM. 1N MOLEC. Bio. (No. Holland Pub. Co., NY, 1978)] 참조. 방사성 동위원소는 감마 계수기 또는 섬광 계수기의 사용과 같은 수단에 의해 또는 방사능 사진 촬영(autoradiography)에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소는 3H, 125I, 131I, 35S, 14C 및 125I를 포함한다.
OSMR 베타-특이적 항체를 형광 화합물로 표지하는 것도 가능하다. 형광 표지된 항체가 적절한 파장의 빛에 노출되면, 이의 존재는 형광으로 인해 이의 존재가 검출될 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 형광 표지 화합물 중에는 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코사이아닌, 알로피코사이아닌, o-프탈알데하이트 및 플루오레스카민이다.
OSMR 베타-특이적 항체는 또한 125Eu 또는 기타 란타나이드 시리즈와 같은 형광-방출 금속을 사용하여 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이러한 금속은 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌다이아민-테트라아세트산(EDTA)과 같은 이러한 금속 킬레이트기를 사용하여 OSMR 베타-특이적 항체에 부착될 수 있다.
OSMR 베타-특이적 항체는 또한 화학발광 화합물에 커플링함으로써 검출 가능하게 표지될 수 있다. 그런 다음, 화학발광 표지된 항체의 존재는 화학적 반응 과정 동안 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 유용한 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 아이소루미놀, 써로마틱 아크리디늄 에스터, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스터이다.
마찬가지로, 생물발광 화합물이 본 발명의 OSMR 베타-특이적 항체, 부분, 단편, 폴리펩타이드 또는 유도체를 표지하는 데 사용될 수 있다. 생물발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 일종의 화학발광이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 표지를 위한 중요한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시퍼레이스 및 에쿼린이다.
OSMR 베타-특이적 항체, 부분, 단편, 폴리펩타이드 또는 유도체의 검출은, 예를 들어, 검출 가능한 표지가 방사성 감마 방사체인 경우 섬광 계수기에 의해 또는, 예를 들어, 표지가 형광 물질인 경우 형광계에 의해 달성될 수 있다. 효소 표지의 경우, 검출은 효소에 대한 기질을 사용하는 비색 방법에 의해 달성될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준과 비교하여 기질의 효소적 반응의 정도를 육안으로 비교함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 위의 검정에 의해 검출되는 OSMR 베타는 생물학적 샘플에 존재할 수 있다. OSMR 베타를 포함하는 임의의 샘플이 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플은, 예를 들어, 혈액, 혈청, 림프, 소변, 대변, 염증성 삼출물, 뇌척수액, 양수, 조직 추출물 또는 균질액 등과 같은 생물학적 유체이다. 본 발명은 이러한 샘플만을 사용하는 검정에 제한되지 않으며, 당업자는 본 명세서에 비추어 다른 샘플을 사용할 수 있는 적합한 조건을 결정하는 것이 가능하다.
제자리 검출은 동물 대상체로부터 조직학적 표본을 제거하고 이러한 표본에 대한 표지된 본 발명의 항체의 결합을 제공함으로써 달성될 수 있다. 항체(또는 이의 일부)는 표지된 항체(또는 부분)를 생물학적 샘플에 적용하거나 또는 오버레이함으로써 제공될 수 있다. 이러한 절차의 사용을 통해, 검사된 조직에서 OSMR 베타의 존재뿐만 아니라 OSMR 베타의 분포를 결정할 수 있다. 본 발명을 사용하여, 당업자는 임의의 매우 다양한 조직학적 방법(예컨대, 염색 절차)이 이러한 제자리 검출을 달성하기 위해 수정될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다.
본 발명의 항체, 단편 또는 유도체는 "두 부위" 또는 "샌드위치" 검정으로도 알려져 있는 면역측정 검정에 사용하기 위해 적합화될 수 있다. 전형적인 면역측정 검정에서, 표지되지 않은 항체(또는 항체의 단편)의 양은 테스트 중인 유체에 불용성인 고체 지지체에 결합되고, 고체-상 항체, 항원 및 표지된 항체 사이에 형성된 삼원 복합체의 검출 및/또는 정량화를 위해 검출 가능하게 표지된 가용성 항체의 양이 첨가된다.
항체는 샘플에서 OSMR 베타를 정량적으로 또는 정성적으로 검출하거나 또는 OSMR 베타를 발현하는 세포의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이는 형광 현미경, 유세포 측정법 또는 형광 검출과 결합된 형광 표지된 항체(아래 참조)를 사용하는 면역형광 기법에 의해 달성될 수 있다. 진단적 목적을 위해, 항체는 표지되거나 또는 표지되지 않을 수 있다. 표지되지 않은 항체는 개 또는 고양이 면역글로불린 불변 영역에 특이적인 항체와 같이 항체와 반응하는 다른 표지된 항체(2차 항체)와 조합하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체는 직접 표지될 수 있다. 방사성 핵종, 플루오르, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 저해제, 리간드(특히 합텐) 등과 같은 다양한 표지가 사용될 수 있다. 이전에 논의된 바와 같은 다양한 유형의 면역검정이 이용 가능하며 당업자에게 잘 알려져 있다.
일 실시형태에서, OSMR 베타를 검출하기 위한 진단 방법은 측방 유동 면역검정(lateral flow immunoassay) 테스트이다. 이는 면역크로마토그래피 검정, 신속 면역이동(Rapid ImmunoMigration: RIM™) 또는 스트립 테스트로도 알려져 있다. 측방 유동 면역검정은 본질적으로 테스트 스트립 형식에 맞게 단일 축을 따라 작동하도록 적합화된 면역검정이다. 기술의 다양한 변형이 상용 제품으로 개발되었지만, 모두 동일한 기본 원리에 따라 작동한다. 전형적인 테스트 스트립은 다음 구성요소로 이루어진다: (1) 샘플 패드 - 테스트 샘플이 적용되는 흡수성 패드; (2) 접합체 또는 시약 패드 - 이는 유색 입자(일반적으로 콜로이드성 금 입자 또는 라텍스 마이크로스피어)에 접합된 표적 분석물에 특이적인 항체를 포함함; (3) 반응막 - 전형적으로 항-표적 분석 항체가 포획 구역 또는 테스트 선으로서 막을 가로지르는 선에 고정화되는 소수성 나이트로셀룰로스 또는 셀룰로스 아세테이트 막(접합체 항체에 특이적인 항체를 포함하는 대조군 구역도 존재함); 및 (4) 심지(wick) 또는 폐기물 저장소 - 모세관 작용에 의해 반응막을 가로질러 샘플을 끌어당겨 이를 수집하도록 설계된 추가 흡수성 패드. 스트립의 구성요소는 일반적으로 비활성 배킹 물질에 고정되며, 간단한 딥스틱(dipstick) 형식으로 제공되거나 또는 샘플 포트와 포획 및 대조군 구역을 보여주는 반응 창이 있는 플라스틱 케이스 내에 제공될 수 있다.
미생물 테스트에 사용되는 측방 유동 면역검정에는 두 가지 주요 유형이 있다: 이중 항체 샌드위치 검정 및 경쟁적 검정. 이중 항체 샌드위치 형식에서, 샘플은 샘플 패드에서 접합체 패드를 통해 이동하며, 여기서 존재하는 임의의 표적 분석물은 접합체에 결합할 것이다. 그런 다음, 샘플은 표적/접합체 복합체가 고정된 항체에 결합하여 막에 눈에 보이는 선을 생성하는 포획 구역에 도달할 때까지 막을 가로질러 계속 이동한다. 그런 다음, 샘플은 대조군 구역에 도달할 때까지 스트립을 따라 더 이동하며, 여기서 과잉의 접합체가 결합하여 막에 두 번째 눈에 보이는 선을 생성한다. 이 대조군 선은 샘플이 의도한 대로 막을 가로질러 이동하였음을 나타낸다. 막에 2개의 명확한 선이 있으면 양성 결과이다. 대조군 구역의 단일 선은 음성 결과이다. 경쟁적 검정은 접합체 패드가 표적 분석물 또는 이의 유사체에 이미 결합된 항체를 포함한다는 점에서 이중 항체 샌드위치 형식과 다르다. 따라서, 표적 분석물이 샘플에 존재하는 경우, 이는 접합체와 결합하지 않고 표지되지 않은 상태로 남아있게 될 것이다. 샘플이 막을 따라 이동하고 포획 구역에 도달하면, 과잉의 표지되지 않은 분석물이 고정된 항체에 결합하고 접합체의 포획을 차단하여 눈에 보이는 선이 생성되지 않을 것이다. 그런 다음, 결합되지 않은 접합체는 대조군 구역의 항체에 결합하여 눈에 보이는 대조군 선을 생성할 것이다. 막 상의 단일 대조군 선은 양성 결과이다. 포획 및 대조군 구역의 2개의 눈에 보이는 선은 음성 결과이다. 그러나, 과잉의 표지되지 않은 표적 분석물이 존재하지 않는 경우, 약한 선이 포획 구역에 생성될 수 있으며, 이는 결정적이 아닌 결과를 나타낼 수 있다. 측방 유동 기술에는 다양한 변형이 있다. 막의 포획 구역은 항체가 아닌 표적 분석물에 따라 고정된 항원 또는 효소를 포함할 수 있다. 다중 테스트를 만들기 위해 여러 포획 구역을 적용하는 것도 가능하다. 예를 들어, 동일한 샘플에서 EHEC Shiga 독소 ST1 및 ST2를 개별적으로 검출할 수 있는 상업용 테스트 스트립이 개발되었다.
중요하게는, 본 발명의 항체는 개 또는 고양이에서 소양성 병태, 알레르기성 병태, 염증성 장애, 섬유증 장애, 염증과 관련된 통증 또는 이들의 조합을 진단하는 데 도움이 될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 항체는 반려 동물에서 OSMR 베타의 과발현을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 중요한 면역조직화학 도구를 제공할 수 있다.
본 발명의 항체는 유전자 발현 프로파일을 측정하는 데 매우 적합한 항체 어레이에 사용될 수 있다.
키트
또한, 대상 방법을 실시하기 위한 키트가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 키트는 적어도 본 발명의 항체, 이를 암호화하는 핵산 또는 이를 포함하는 세포 중 하나 이상을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 일반적으로 용기에 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 표지 또는 독소에 접합되거나 또는 접합되지 않을 수 있는 항체는 전형적으로 Tris, 포스페이트, 카보네이트 등과 같은 완충액, 안정화제, 살생물제, 비활성 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민 등과 함께 키트에 포함된다. 일반적으로, 이러한 물질은 활성 항체의 양을 기준으로 5중량% 미만으로 존재하고, 일반적으로 다시 항체 농도를 기준으로 적어도 약 0.001중량%의 총량으로 존재할 것이다. 자주, 활성 성분을 희석하기 위해 비활성 증량제 또는 부형제를 포함하는 것이 바람직할 것이며, 여기서 부형제는 총 조성물의 약 1중량% 내지 99중량%로 존재할 수 있다. 1차 항체에 결합할 수 있는 2차 항체가 검정에 사용되는 경우, 이는 일반적으로 별도의 바이알에 존재할 것이다. 2차 항체는 전형적으로 표지에 접합되며, 위에 기재된 항체 제형과 유사한 방식으로 제형화된다. 키트는 일반적으로 사용 지침 세트도 포함할 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 키트는 샘플에서 개 또는 고양이 OSMR 베타 단백질을 검출하는 데 유용한 테스트 스트립 키트(측방 유동 면역검정 키트)이다. 이러한 테스트 스트립은 전형적으로 테스트 샘플이 적용되는 샘플 패드; 개 또는 고양이 OSMR 베타에 특이적인 항체를 포함하는 접합체 또는 시약 패드(항체는 유색 입자(일반적으로 콜로이드성 금 입자)에 접합됨); 항-OSMR 베타 항체가 포획 구역 또는 테스트 선으로서 막을 가로지르는 선에 고정화되는 반응막(접합체 항체에 특이적인 항체를 포함하는 대조군 구역도 존재할 수 있음); 및 모세관 작용에 의해 반응막을 가로질러 샘플을 끌어당겨 이를 수집하도록 설계된 추가 흡수성 패드를 포함할 것이다. 테스트 스트립 키트는 일반적으로 사용 지침도 포함할 것이다.
개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보의 기능적 활성을 평가하기 위한 세포-기반 검정
본 발명은 또한 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보의 기능적 활성을 평가하기 위한 세포-기반 검정을 제공한다. 이 방법은 다음을 포함한다: 개 또는 고양이 OSM에 대한 수용체를 내인성으로 발현하고 이에 반응하는 세포를 제공하는 단계; OSMR 베타 저해제 후보 또는 비히클 대조군을 포함하는 조성물의 존재하에 개 또는 고양이 OSM을 인큐베이션하는 단계; 인큐베이션된 개 또는 고양이 OSM으로 세포를 처리하는 단계; 개 또는 고양이 OSM 처리에 의해 유도된 단백질의 직접적인 인산화를 측정하는 단계; 및 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보를 포함하는 조성물이 비히클 대조군에 비해 개 또는 고양이 OSM에 의해 유도된 직접적인 단백질 인산화를 저해하는지 여부를 결정하는 단계.
일 실시형태에서, 측정 단계는 STAT 단백질의 직접적인 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 한 특정 실시형태에서, STAT 단백질은 STAT3이다.
세포-기반 검정의 또 다른 실시형태에서, 세포는 단핵구 및/또는 대식세포이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 세포는 개 DH82 세포이다. DH82 세포는 악성 조직구증이 있는 개로부터의 대식세포-단핵구 세포주이다.
일 실시형태에서, 개 또는 고양이 OSM 처리에 의해 유도된 직접적인 단백질 인산화는 신호의 증가를 초래한다. 또 다른 실시형태에서, 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보에 의해 유도된 직접적인 단백질 인산화의 저해는 신호의 감소를 초래한다.
일 실시형태에서, 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보는 재조합 개 또는 고양이 항-OSMR 베타 항체이다. 한 특정 실시형태에서, 재조합 개 또는 고양이 항-OSMR 베타 항체는 하이브리도마 배양 상청액에 포함되어 있다. 다른 실시형태에서, 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보는 소분자 약제학적 화합물이다.
일 실시형태에서, 개 또는 고양이 OSM은 개 또는 고양이 OSM으로 세포를 처리하기 전에 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보와 함께 공동 인큐베이션된다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 개 또는 고양이 OSM 처리 전에 OSM 베타 수용체 발현을 증가시키기에 충분한 시간 동안 감마 인터페론과 사전 인큐베이션된다. 일 실시형태에서, 세포는 개 감마 인터페론과 함께 사전 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 개 감마 인터페론과의 사전 인큐베이션 후, 세포는 이후에 개 또는 고양이 OSM 처리 전에 혈청이 고갈된다.
일부 실시형태에서, 비히클 대조군에 비해 직접적인 단백질 인산화를 50% 초과하여 저해하는 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보가 추가 정제 및/또는 특성화를 위해 선택된다. 일 실시형태에서, 방법은, 예를 들어, 비히클 대조군에 비해 직접적인 단백질 인산화를 50% 초과하여 저해한 임의의 해당 후보에 대한 세포-기반 검정을 통해 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보의 IC50 값을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 검정에서 관찰된 개 또는 고양이 OSM으로 유도된 직접적인 단백질 인산화의 저해는 개 또는 고양이에서 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 병태의 저해와 상관관계가 있다. 이러한 장애는 본 명세서에 기재된 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 소양성, 알레르기성, 염증성 및 섬유증 장애뿐만 아니라 골관절염 통증과 같은 OSM-매개성 염증성 통증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
한 특정 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 개 또는 고양이 IL-31 저해제 후보의 기능적 활성을 평가하기 위한 세포-기반 검정을 제공한다: 개 또는 고양이 OSM에 대한 수용체를 내인성으로 발현하고 이에 반응하는 개 DH82 세포를 제공하는 단계; OSMR 베타 저해제 후보 또는 비히클 대조군을 포함하는 조성물의 존재하에 개 또는 고양이 OSM을 인큐베이션하는 단계; DH82 세포를 인큐베이션된 개 또는 고양이 OSM으로 처리하는 단계; 개 또는 고양이 OSM 처리에 의해 유도된 DH82 세포에서의 생물학적 활성을 측정하는 단계; 및 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보를 포함하는 조성물이 비히클 대조군에 비해 개 또는 고양이 OSM으로 유도된 생물학적 활성을 저해하는지 여부를 결정하는 단계. 이 세포-기반 검정은 아래에서 DH82 검정으로 지칭된다.
DH82 검정의 일 실시형태에서, 생물학적 활성은 개 또는 고양이 OSM 처리에 의해 유도된 단백질의 직접적인 인산화이다. DH82 검정의 일 실시형태에서, 단백질은 STAT3과 같은 STAT 단백질이다. DH82 검정의 또 다른 실시형태에서, 개 또는 고양이 OSM 처리에 의해 유도된 직접적인 단백질 인산화는 신호의 증가를 초래한다. DH82 검정의 또 다른 실시형태에서, 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보에 의해 유도된 직접적인 단백질 인산화의 저해는 신호의 감소를 초래한다.
DH82 검정의 추가 실시형태에서, 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보는 재조합 개 또는 고양이 항-OSMR 베타 항체이다. 이러한 재조합 개 또는 고양이 항-OSMR 베타 항체는, 예를 들어, 하이브리도마 배양 상청액에 포함될 수 있다. DH82 검정의 다른 실시형태에서, 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보는 소분자 약제학적 화합물이다.
DH82 검정의 또 다른 실시형태에서, 개 또는 고양이 OSM은 개 또는 고양이 OSM으로 DH82 세포를 처리하기 전에 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보와 함께 공동 인큐베이션된다. DH82 검정의 추가 실시형태에서, DH82 세포는 개 또는 고양이 OSM 처리 전에 개 감마 인터페론과 같으나 이에 제한되지 않는 감마 인터페론과 함께 OSMR 베타 수용체 발현을 증가시키기에 충분한 시간 동안 사전 인큐베이션된다. 일 실시형태에서, DH82 세포는 이후에 개 또는 고양이 OSM 처리 전에 혈청이 고갈된다.
DH82 검정의 한 특정 실시형태에서, 비히클 대조군에 비해 직접적인 단백질 인산화를 50% 초과하여 저해하는 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보가 추가 정제 및/또는 특성화를 위해 선택된다. 일 실시형태에서, 예를 들어, 방법은 DH82 세포-기반 검정을 통해 개 또는 고양이 OSMR 베타 저해제 후보의 IC50 값을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
DH82 검정의 일 실시형태에서, 검정에서 관찰된 개 또는 고양이 OSM으로 유도된 직접적인 단백질 인산화의 저해는 개 또는 고양이에서 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 병태의 저해와 상관관계가 있다. 이러한 장애는 본 명세서에 기재된 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 소양성, 알레르기성, 염증성 및 섬유증 장애뿐만 아니라 골관절염 통증과 같은 OSM-매개성 염증성 통증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이제 본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예
실시예 1. 본 작업에 사용된 재조합 단백질의 생성
항체를 생성하고 항체 후보의 친화성 및 효능을 평가하기 위해 재조합 단백질을 생성하였다. 인간 상동체에 대한 상동성에 의해, 사이토카인 결합, Ig-유사 및 피브로넥틴 III 도메인을 개 및 고양이 OSMR에 대해 확인하였다. 인간 IgG1 Fc 융합체로써 개(서열번호 107; 개_OSMR_hIgG1_Fc) OSMR 단백질(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 108; 개_OSMR_hIgG1_Fc)임) 및 고양이(서열번호 112; 고양이_OSMR_hIgG1_Fc) OSMR 단백질(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 113; 고양이_OSMR_hIgG1_Fc)임)의 최적의 발현을 위해 합성 DNA 작제물을 설계하였다. 고양이 OSM 유전자(서열번호 110; 고양이_OSM_hIgG1_Fc)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 111; 고양이_OSM_hIgG1_Fc)임)의 최적의 발현을 위해 합성 DNA 작제물을 또한 설계하였다. 개 OSM은 킹피셔 바이오테크, 인크.(Kingfisher Biotech, Inc.)(미네소타주 세인트폴 소재)로부터 구입하였고, 단백질 서열은 (서열번호 109; 개_OSM)이다. 모든 합성 카세트를 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 pcDNA3.1에 클로닝하고, 2개의 포유동물 현탁액 세포 시스템인 Freestyle 293F(인간 배아 신장) 세포 또는 EXPICHO-S(차이니즈 햄스터 난소) 세포 중 하나에서 발현시켰다.
0.15 내지 대략적으로 2.5×10e6 세포/㎖의 현탁액 세포를 Freestyle 293 발현 배지(깁코(Gibco))에 유지하였다. 형질감염 당일에, 세포를 1.0×10e6 세포/㎖로 희석하고, 조건 C에 따라 FectoPro 프로토콜에 기재된 플라스미드 DNA와 FectoPRO(폴리플러스 트랜스펙션(Polyplus Transfection)) 시약의 혼합물로 형질감염시켰다. 대략적으로 24시간 후, FectoPro 프로토콜에서 벗어나, Freestyle 293 배지에 희석된 20% w/v 트립톤으로 이루어진 공급물을 각 배양물에 첨가하였다. 인큐베이션 7일 후, 배양물을 수확하고 정화하였다. 현탁액 EXPICHO-S의 경우, 세포를 EXPICHO 발현 배지(깁코)에서 0.14 내지 8.0×10e6 세포/㎖로 유지하였다. 세포를 -1일 및 형질감염일에 ExpiCHO 프로토콜 사용자 매뉴얼에 따라 희석하였다. 희석된 세포를 Max 역가 조건에 따라 ExpiFectamine CHO 형질감염 키트(깁코)로부터의 시약을 사용하여 프로토콜에 기재된 바와 같이 형질감염시켰다. 인큐베이션 12일 내지 14일 후, 배양물을 수집하고 정화하였다.
헥사히스티딘 태깅된 단백질의 정제를 위해, 조건 배지를 500mM 소듐 클로라이드, 5mM 이미다졸 및 pH 7.4로 조정하고, 완충액 A(5mM 이미다졸, 20mM 소듐 포스페이트, 500mM 소듐 클로라이드, pH 7.4)로 사전 평형화시킨 IMAC 수지(Ni Sepharose Excel(지이 헬스케어(GE Healthcare)) 또는 HisPur Cobalt(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))에 로딩하였다. 로딩 후, IMAC 수지를 완충액 A로 광범위하게 세척한 다음, 동일한 완충액에서 이미다졸의 농도를 5mM에서 500mM로 증가시켜 용리하였다. 분획을 SDS-PAGE에 의해 평가하였다. 풀을 만들고, 이미다졸에서 최종 완충액으로 투석하였다. Fc 융합 단백질 및 항체를 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 조건 배지를 PBS로 사전 평형화시킨 MabSelect Sure LX(지이 헬스케어) 또는 AmMag 단백질 A 자성 비드(Genscript)에 로딩하였다. 샘플 로딩 후, 수지를 PBS로 세척한 다음 20mM 소듐 아세테이트(pH 5.5)로 세척하였다. 자성 비드를 사용하는 경우에는, 0.05% tween-20을 평형화 및 세척 완충액에 첨가하였다. 두 방법 중 하나를 사용하여, 샘플을 20mM 아세트산(pH 3.5)으로 칼럼으로부터 용리하였다. 용리 후, 풀을 만들고, 1M 소듐 아세테이트를 4%로 첨가하여 중화하였다. 사용 가능한 부피와 의도된 용도에 따라, 샘플을 때때로 최종 완충액(예를 들어, PBS 등)으로 교환하였다. 최종 단백질 농도를 280㎚에서의 흡광도 또는 BCA 단백질 검정에 의해 측정하였다.
개 IL-31 단백질(서열번호 123; 개_IL31)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 124; 개_IL31)임)의 합성 및 특성화는 이전에 기술된 바 있다(Bammert 등의 미국 특허 제8,790,651호). 고양이 IL-31 단백질(서열번호 125; 고양이_IL31)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 126; 고양이_IL31)임)의 합성 및 특성화는 이전에 기술된 바 있다(Bammert 등의 미국 출원 제20190284272호).
실시예 2. 개 및/또는 고양이 OSMR을 인식하는 마우스 단일클론 항체의 확인
각각 (서열번호 107; 개_OSMR_hIgG1_Fc)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 108; 개_OSMR_hIgG1_Fc)임) 및 (서열번호 112; 고양이_OSMR_hIgG1_Fc)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 113; 고양이_OSMR_hIgG1_Fc)임)로 표시되는 재조합 개 및 고양이 OSMR 단백질의 혼합물을 단일클론 항체를 생산할 목적으로 암컷 AJ 및 CD1 마우스를 면역화하기 위해 사용하였다. 마우스를 2-주의 기간에 걸쳐 일련의 저용량 면역화를 포함하는 28일 신속 면역화 프로토콜(Rapid Immunization Protocol: RIMMS)을 사용하여 면역화하였다. 면역화된 마우스의 혈청 항체 역가를 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 결정하였다. 개 또는 고양이 OSMR(50 ng/웰)을 폴리스타이렌 마이크로플레이트에 고정하고, 포획 항원으로 사용하였다. 별도의 ELISA를 수행하여 관련되지 않은 인간 IgG Fc 융합 단백질에 대한 항체 반응을 결정하였다. 검정 전, 각 플레이트를 카세인을 사용하여 차단하고, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 0.05% tween-20(PBST)이 포함된 인산 완충 식염수에 희석하였다. 항-OSMR(또는 항인간 IgG Fc) 항체의 존재를 항-마우스 HRP 표지된 2차 항체로 검출하였다. 발색 기질(SureBlue Reserve TMB 1-성분 마이크로웰 퍼옥시데이스 기질, 케이피엘, 인크.(KPL, Inc.), 메릴랜드주 게이더스버그 소재)을 첨가한 후, 실온(RT)에서 10분간 인큐베이션한 후, 100㎕의 0.1N HCl을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 각 웰의 흡광도를 450㎚의 광학 밀도(optical density: OD)에서 결정하였다.
테스트 채혈을 제20일에 채취하고, 항혈청 샘플을 평가하여 1:31K 혈청 희석에서 배경보다 높은 OD > 0.1로 정의된 융합-준비 역가(fusion-판독y titer)에 도달하였는지 여부를 결정하였다. 또한, 인간 IgG 흡수 검정을 사용하여 항-OSMR 특이성을 평가하였다. 혈청 샘플을 ELISA 플레이트에 적용하기 전에 풀링/정제된 인간 IgG로 스파이킹하였다. 융합 단백질의 "관계없는(irrelevant)" 인간 IgG Fc 성분을 인식하는 항체가 시스템으로부터 흡수되었으며; 항체는 ELISA 플레이트에서 OSMR에 특이적으로 결합된 OSMR인 항체이다. 흡수 후, 항-OSMR 신호는 표적-특이적 반응을 나타낸다. 단일 반응성 CD-1 마우스는 항-인간 IgG의 흡수 후 개 및 고양이 OSMR 모두에 대해 높은 특이적 역가를 갖는 것으로 선택하였다. 이 마우스는 사전-융합 부스트를 투여받았으며, 공여자의 비장세포를 제28일에 융합에 사용하였다.
하이브리도마 상청액을 ELISA에 의해 개 및/또는 고양이 OSMR 단백질에 결합하지만 관계 없는 인간 IgG Fc에는 결합하지 않는 항체에 대해 스크리닝하였다. 개 및/또는 고양이 OSMR에 선택적으로 결합된 후보 마우스 항 OSMR 하이브리도마를 추가로 서브클로닝하여 동종 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하고, 가변 중쇄 및 경쇄의 시퀀싱을 수행하였다. 이러한 목적하는 특성을 갖는 항체를 생산하는 세포를 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) IgG 사슬의 RNA 전사체의 서열 분석을 위해 선택하였다.
실시예 3. 표면 플라스몬 공명을 사용하여 OMSR에 대한 항-OSMR 항체의 친화성을 결정하는 방법
후보 mAb가 개, 고양이 및 인간(서열번호 122; 인간_OSMR)(알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미니애폴리스 소재) OSMR에 결합하는 친화성을 Biacore 시스템(비아코어 라이프 사이언시스(Biacore Life Sciences)(지이 헬스케어), 스웨덴 웁살라 소재)에서 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 결정하였다. 항체를 표면에 고정화할 때 발생할 수 있는 차별적인 표면 준비와 관련된 친화성 차이를 피하기 위해; 각 종으로부터의 OSMR을 개별 표면에 직접 접합하였다. N-하이드록시석신이미드(NHS)/1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드(EDC) 화학을 사용하여 아민 커플링 5 ㎍/㎖ OSMR에 의해 고정화하였다. 칩을 에탄올아민으로 담금질하고, 고정된 OSMR에 결합된 모든 후보 mAb의 친화성을 평가하였다. 모든 곡선을 1:1 모델에 피팅하였다. 1×10-11 M(1E-11 M) 미만의 친화성 상수(Affinity constant: KD)는 기기의 검출 정량 하한보다 낮다. 친화성 측정에 대한 결과는 본 명세서에 기재되어 있다.
실시예 4. 개 및 고양이 대식세포에서 개 및 고양이 IL-31 유도성 pSTAT3 신호전달의 저해에 의해 평가된 항-OSMR 항체의 효능을 결정하는 방법
저해 활성을 갖는 후보를 확인하기 위해, 항체를 개 또는 고양이 세포-기반 검정에서 IL-31-매개성 STAT3 인산화에 영향을 미치는 능력에 대해 평가하였다. 개 DH-82(ATCC® CRL-10389™) 또는 고양이 Fcwf-4 대식세포-유사 세포(ATCC CRL-2787)에서 STAT3 인산화를 결정하였다. DH82 및 Fcwf-4 세포를 각각 24시간 동안 10 ng/㎖의 개 인터페론 감마(알앤디 시스템즈, 미네소타주 미니애폴리스 소재)로 또는 96시간 동안 125 ng/㎖의 고양이 인터페론 감마(알앤디 시스템즈, 미네소타주 미니애폴리스 소재)로 프라이밍하여 수용체 발현을 증가시켰다. 두 세포 유형을 모두 2시간 동안 혈청 고갈시킨 후 IL-31 및 mAb 처리하였다. 2개의 독립적인 방법을 사용하여, 모든 후보 mAb를 1 ㎍/㎖ 개 또는 42 ng/㎖ 고양이 IL-31 유도성 STAT3 인산화를 저해하는 능력에 대해 평가하였다. 또한, 개 및 고양이 사이토카인의 교차-반응성과 두 종 모두에서 신호전달을 저해하는 항체 능력의 교차-기능을 결정하기 위해 검정을 수행하였다. 복합체 형성을 보장하기 위해, 세포 자극 전에 mAb 및 IL-31 사이토카인의 1시간의 공동 인큐베이션을 완료하였다. IL-31 세포 자극을 5분 동안 수행하였다. STAT3 인산화를 AlphaLISA SureFire ULTRA™ 기술(퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 매사추세츠주 월섬 소재)을 사용하여 측정하였다. 항체 농도 및 순도가 알려져 있지 않은 경우에, 하이브리도마 상청액을 1 ㎍/㎖ 개 또는 42 ng/㎖ 고양이 IL-31과 함께 1시간 동안 공동 인큐베이션 후, STAT3 인산화를 저해하는 능력에 대해 정성적으로 측정하였다. 이러한 검정에서 IL-31 매개성 STAT3 인산화를 저해하는 능력으로 정의된 개별 단일클론 항체의 효능은 선택한 항체의 추가 발전을 위한 주요 선택 기준으로 간주하였다. 효능(potency)이라는 용어는 이러한 검정으로부터 계산된 IC50 값을 지칭하며, IL-31에 의해 유도된 신호전달이 이의 최대 값의 절반으로 감소되는 항체의 농도이다. 본 명세서에 기재된 증가된 효능은 더 낮은 IC50 값과 상관관계가 있다.
실시예 5. 개 및 고양이 대식세포에서 개 및 고양이 OSM으로 유도된 pSTAT3 신호전달의 저해에 의해 평가된 항-OSMR 항체의 효능을 결정하는 방법
저해 활성을 갖는 후보를 확인하기 위해, 항체를 개 또는 고양이 세포-기반 검정에서 OSM-매개성 STAT3 인산화에 영향을 미치는 능력에 대해 평가하였다. 개 DH-82(ATCC CRL-10389™) 또는 고양이 Fcwf-4 대식세포-유사 세포(ATCC CRL-2787)에서 STAT3 인산화를 결정하였다. 이러한 검정의 동적 범위를 평가하기 위해, 개 및 고양이 OSM을 사용한 용량 반응 곡선을 두 세포 유형에서 평가하였다. 세포를 2시간 동안 혈청 고갈시킨 후, 1 ㎍/㎖에서 0.0001 ㎍/㎖까지의 개 또는 고양이 OSM의 9점, 반 로그 곡선(half 로그 curve)으로 10분 동안 처리하여 STAT3 인산화를 유도하였다. 용해 완충액으로 반응을 중지시키고, AlphaLISA SureFire ULTRA™ 기술(퍼킨 엘머, 매사추세츠주 월섬 소재)을 사용하여 STAT3 인산화를 측정하였다. 최대 신호의 50 퍼센트를 유도하는 OSM 단백질의 농도로서 EC50 값을 결정하였다. 도 1A 및 도 1B는 각각 개 DH-82 및 고양이 Fcwf-4 세포에서 개 및 고양이 OSM에 대한 용량-반응 곡선 및 EC50 값을 보여준다.
OSM-매개성 STAT3 인산화를 저해하는 능력을 검정함으로써 후보 항체의 효능을 결정하기 위해, 개 및 고양이 검정을 모두 수행하였다. 세포를 2시간 동안 혈청 고갈시킨 후 세포를 OSM 및 mAb 처리하였다. 2개의 독립적인 방법을 사용하여, 모든 후보 mAb를 0.02 ㎍/㎖ 개 OSM으로 유도된 STAT3 인산화를 저해하는 능력에 대해 평가하였다. 혈청 고갈된 세포와 항-OSMR mAb에 대해 DH-82의 경우 30-분 인큐베이션 또는 Fcwf-4 세포의 경우 20-분 인큐베이션을 허용하는 검정을 수행하였다. 이때 상청액을 제거하고, 세포 자극을 위해 0.02 ㎍/㎖ 개 OSM을 포함하는 배지를 10분 동안 첨가하였다. 용해 완충액으로 반응을 중지시키고, STAT3 인산화를 측정하였다. 항체 농도 및 순도가 알려져 있지 않은 경우에, 하이브리도마 상청액을 상기와 같이 세포 상에서 30분 또는 20-분 인큐베이션한 다음 0.02 ㎍/㎖ 개 OSM으로 자극한 후 STAT3 인산화를 저해하는 능력에 대해 정성적으로 측정하였다. 이러한 검정에서 OSM 매개성 STAT3 인산화를 저해하는 능력으로 정의된 개별 단일클론 항체의 효능은 선택한 항체의 추가 발전을 위한 주요 선택 기준으로 간주하였다. 효능이라는 용어는 이러한 검정으로부터 계산된 IC50 값을 지칭하며, OSM에 의해 유도된 신호전달이 이의 최대 값의 절반으로 감소되는 항체의 농도이다. 본 명세서에 기재된 증가된 효능은 더 낮은 IC50 값과 상관관계가 있다.
실시예 6. 개 및 고양이 세포에서 IL-31 및 OSM 매개성 STAT 인산화를 중화할 수 있는 항-OSMR 단일클론 항체의 선택
도 2의 기준 개요에 기초하여 마우스 항-OSMR 항체를 선택하였다. 마우스를 발현 및 정제를 용이하게 하기 위해 인간 IgG1 Fc에 융합된 3개의 사이토카인 결합 도메인과 단일 피브로넥틴 III 도메인을 포함하는 개 및 고양이 OSMR 단백질의 조합으로 면역화하였다. 하이브리도마로부터 생산된 항체를 ELISA에 의해 개 및 고양이 OSMR에 대한 결합에 대해 스크리닝하고, 관련되지 않은 인간 IgG에 대해 카운터 스크리닝하였다. 개 및/또는 고양이 OSMR에 결합하지만 인간 IgG에는 결합하지 않는 항체를 생산하는 하이브리도마를 추가 분석을 위해 선택하였다. 고갈된 하이브리도마 상청액을 이러한 초기 히트(hit)로부터 생성하고, 항체를 추가 분석을 위해 정제하였다. ELISA 스크리닝으로부터의 결과를 확인하기 위해, 이러한 비클론 하이브리도마로부터의 항체를 Biacore를 사용하여 개 및 고양이 OSMR에 대한 결합에 대해 초기에 검정하였다. 이러한 하이브리도마 후보를 개 DH82 및 고양이 Fcwf-4 세포에서 IL-31 및 OSM 매개성 STAT 인산화를 저해하는 능력에 대해 추가로 테스트하였다. 개 및/또는 고양이 OSMR에 결합하며 IL-31 및 OSM 세포에 기반하여 검정된 것들 중 하나에서 약간의 저해 활성을 갖는 하이브리도마 후보를 서브클로닝을 위해 선택하였다. 세포의 희석을 제한하여 하이브리도마 후보의 서브클로닝을 수행하고, 단일클론성을 확인하였다. 단일클론 항체를 생산하는 이러한 세포의 상청액을 ELISA에 의해 개 및/또는 고양이 OSMR 단백질에 대한 결합에 대해 확인하고, 이러한 항체를 생산하는 세포를 가변 중쇄 및 가변 경쇄 IgG 사슬의 서열 분석을 위한 단리된 RNA에 사용하였다. 또한, 이들 배양물로부터 정제된 단일클론 항체를 인간 OSMR에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 본 명세서에 기재된 항체 후보 중 어느 것도 인간 OSMR에 결합하지 않았다.
이 하이브리도마 캠페인은 초기에 고유한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 갖는 5개의 단일클론 항체를 생산하였다. 이들 마우스 항-OSMR 항체는 가변 중쇄 서열(서열번호 31; MU_02D09_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 32; MU_02D09_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 33; MU_02D09_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 34; MU_02D09_VL)임)을 갖는 02D09; 가변 중쇄 서열(서열번호 35; MU_09E09_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 36; MU_09E09_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 37; MU_09E09_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 38; MU_09E09_VL)임)을 갖는 09E09; 가변 중쇄 서열(서열번호 39; MU_10F07_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 40; MU_10F07_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 41; MU_10F07_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 42; MU_10F07_VL)임)을 갖는 10F07; 가변 중쇄 서열(서열번호 43; MU_14C04_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 44; MU_14C04_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 45; MU_14C04_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 46; MU_14C04_VL)임)을 갖는 14C04; 및 가변 중쇄 서열(서열번호 47; MU_19F07_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 48; MU_19F07_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 49; MU_19F07_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 50; MU_19F07_VL)임)을 갖는 19F07이다. 도 3은 이러한 가변 중쇄 및 경쇄와 검은색 박스로 강조된 CDR의 clustalW 정렬을 보여준다.
Figure pct00092
Figure pct00093
실시예 7. 키메라 항체의 생성
항체 가변 도메인은 항원 결합을 담당한다. 각각의 불변 영역에 대한 전체 가변 도메인의 이식은 OSMR 면역원에 결합하는 항체의 능력에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 정확한 서열이 확인되었음을 동시에 확인하고 균질한 물질을 생산하기 위해, 포유동물 발현 시스템에서 재조합 키메라 항체를 생산하도록 발현 벡터를 설계하였다. 여기에 기재된 키메라 항체는 개 또는 고양이 IgG 분자의 각각의 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 이식된 숙주 종 항체의 가변 서열(CDR 및 프레임워크 모두)로 이루어진다(예를 들어; 마우스 가변:개 불변은 마우스:개 키메라로 지칭됨). 선택된 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 서열에 대해 합성 DNA 서열을 작제하였다.
마우스:개 키메라의 경우, 각각의 마우스 가변 영역을 개 IgG 중쇄(서열번호 114; 개_HC_65_1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 115; 개_HC_65_1)임) 또는 경쇄(서열번호 116; 개_LC_카파)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 117; 개_LC_카파)임) 불변 영역을 포함하는 포유동물 발현 플라스미드에 클로닝하였다. 마우스:고양이 키메라의 경우, 각각의 가변 영역을 고양이 IgG 중쇄(서열번호 118; 고양이_HC_대립유전자A_1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 119; 고양이_HC_대립유전자A_1)임) 또는 경쇄(서열번호 120; 고양이_LC_카파_G_마이너스)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 121; 고양이_LC_카파_G_마이너스)임) 불변 영역을 포함하는 포유동물 발현 플라스미드에 클로닝하였다. 이러한 항체는 가변 중쇄 서열(서열번호 31; MU_02D09_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 32; MU_02D09_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 33; MU_02D09_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 34; MU_02D09_VL)임)을 갖는 마우스:개 02D09 키메라; 가변 중쇄 서열(서열번호 35; MU_09E09_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 36; MU_09E09_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 37; MU_09E09_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 38; MU_09E09_VL)임)을 갖는 마우스:개 09E09 키메라; 가변 중쇄 서열(서열번호 39; MU_10F07_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 40; MU_10F07_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 41; MU_10F07_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 42; MU_10F07_VL)임)을 갖는 마우스:개 10F07 키메라; 가변 중쇄 서열(서열번호 43; MU_14C04_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 44; MU_14C04_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 45; MU_10F07_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 46; MU_10F07_VL)임)을 갖는 마우스:개 14C04 키메라; 가변 중쇄 서열(서열번호 47; MU_19F07_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 48; MU_19F07_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 49; MU_19F07_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 50; MU_19F07_VL)임)을 갖는 마우스:개 19F07 키메라; 가변 중쇄 서열(서열번호 31; MU_02D09_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 32; MU_02D09_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 33; MU_02D09_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 34; MU_02D09_VL)임)을 갖는 마우스:고양이 02D09 키메라; 가변 중쇄 서열(서열번호 35; MU_09E09_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 36; MU_09E09_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 37; MU_09E09_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 38; MU_09E09_VL)임)을 갖는 마우스:고양이 09E09 키메라; 가변 중쇄 서열(서열번호 39; MU_10F07_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 40; MU_10F07_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 41; MU_10F07_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 42; MU_10F07_VL)임)을 갖는 마우스:고양이 10F07 키메라; 가변 중쇄 서열(서열번호 43; MU_14C04_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 44; MU_14C04_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 45; MU_14C04_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 46; MU_14C04_VL)임)을 갖는 마우스:고양이 14C04 키메라; 및 가변 중쇄 서열(서열번호 47; MU_19F07_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 48; MU_19F07_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 49; MU_19F07_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 50; MU_19F07_VL)임)을 갖는 마우스:고양이 19F07 키메라이다. 이들 서열은 포유동물 세포주로부터 키메라 재조합 항체의 발현 및 분비를 용이하게 하는 고유한 제한 엔도뉴클레이스 부위, 코작(Kozak) 컨센서스 서열 및 N-말단 분비 리더를 포함한다. CMV 프로모터의 제어하에 각각의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 플라스미드를 숙주 세포에 공동 형질감염시키고, 본 명세서에 기재된 바와 같이 정제하였다.
Figure pct00094
Figure pct00095
실시예 8. 종분화된(speciated) 항 OSMR 항체의 설계 및 발현
항-약물 항체(anti-drug antibody: ADA)의 생성은 단일클론 항체를 포함한 임의의 바이오치료 단백질의 효능의 상실과 관련이 있을 수 있다. 문헌의 포괄적인 평가는 단일클론 항체의 종분화가 mAb가 면역원성이 되는 경향을 감소시킬 수 있음을 보여주었지만, 면역원성 완전 인간 mAb 및 비-면역원성 키메라 mAb의 예를 찾을 수 있다. 본 발명자들은 본 명세서에서 다음 종분화의 두 가지 방법을 설명한다; 개화는 갯과 종(예를 들어, 카니스 루푸스 파밀리아리스(Canis lupus familiaris) 또는 개)의 프레임워크에 마우스 CDR을 이식하는 것을 의미하고, 고양이화는 고양이 종(예를 들어, 펠리스 카투스(Felis catus) 또는 고양이)의 프레임워크에 마우스 CDR을 이식하는 것을 의미한다. 본 명세서에 제공된 항-OSMR 단일클론 항체에 대한 ADA 형성과 관련된 위험을 완화하기 위해, 개화 및 고양이화 전략을 사용하였다. 개화 및 고양이화 전략은 CDR 이식을 위한 가장 적절한 개 또는 고양이 생식계열 항체 서열을 확인하는 것을 기반으로 하였다. 두 가변 중쇄 및 경쇄에 대한 모든 이용 가능한 생식계열 서열의 광범위한 분석 후, 마우스 항-OSMR mAb에 대한 상동성을 기반으로 생식계열 후보를 선택하였고, 이러한 마우스 선조(progenitor) mAb로부터의 CDR을 사용하여 천연 개 또는 고양이 CDR을 대체하였다. 목표는 생체내 면역원성의 가능성을 최소화하기 위해 개 또는 고양이 항체 프레임워크를 사용하여 고친화성 및 세포-기반 활성을 유지하는 것이었다.
개화 및 고양이화된 mAb를 발현시키고, 세포-기반 검정에서 개 및 고양이 OSMR에 대한 친화성 및 이들의 효능에 대해 특성화하였다. 개화되거나 고양이화된 항체가 개 또는 고양이 OSMR에 결합하는 능력을 상실하는 경우, 1) 기능 상실의 원인이 되는 사슬, 2) 기능 상실의 원인이 되는 프레임워크 및 3) 기능 상실의 원인이 되는 아미노산(들)을 확인하기 위해 체계적인 분석을 수행하였다. 본 명세서에 기재된 종분화된 항체는 개 또는 고양이 IgG 분자의 각각의 중쇄 및 경쇄 불변 영역과 함께 발현된 가변 서열(CDR 및 프레임워크 모두)로 이루어진다. 선택된 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 서열에 대해 합성 DNA 서열을 작제하였다. 이들 서열은 포유동물 세포주로부터 재조합 항체의 발현 및 분비를 용이하게 하는 고유한 제한 엔도뉴클레이스 부위, 코작 컨센서스 서열 및 N-말단 분비 리더를 포함한다. 개화된 항체의 경우, 각각의 개화된 가변 영역을 개 IgG 중쇄(서열번호 114; 개_HC_65_1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 115; 개_HC_65_1)임) 또는 경쇄(서열번호 116; 개_LC_카파)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 117; 개_LC_카파)임) 불변 영역을 포함하는 포유동물 발현 플라스미드에 클로닝하였다. 고양이화된 항체의 경우, 각각의 가변 영역을 고양이 IgG 중쇄(서열번호 118; 고양이_HC_대립유전자A_1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 119; 고양이_HC_대립유전자A_1)임) 또는 경쇄(서열번호 120; 고양이_LC_카파_G_마이너스)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 121; 고양이_LC_카파_G_마이너스)임) 불변 영역을 포함하는 포유동물 발현 플라스미드에 클로닝하였다. CMV 프로모터의 제어하에 각각의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 플라스미드를 숙주 세포에 공동 형질감염시키고, 본 명세서에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다.
고양이 02D09 1.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 51; FEL_02D09_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 52; FEL_02D09_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 55; FEL_02D09_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 56; FEL_02D09_VL1)임)이고; 고양이 02D09 2.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 53; FEL_02D09_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 54; FEL_02D09_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 55; FEL_02D09_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 56; FEL_02D09_VL1)임)이고; 고양이 02D09 1.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 51; FEL_02D09_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 52; FEL_02D09_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 57; FEL_02D09_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 58; FEL_02D09_VL2)임)이고; 고양이 02D09 2.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 53; FEL_02D09_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 54; FEL_02D09_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 57; FEL_02D09_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 58; FEL_02D09_VL2)임)이다.
개 09E09 1.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 59; CAN_09E09_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 60; CAN_09E09_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 63; CAN_09E09_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 64; CAN_09E09_VL1)임)이고; 개 09E09 2.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 61; CAN_09E09_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 62; CAN_09E09_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 63; CAN_09E09_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 64; CAN_09E09_VL1)임)이고; 개 09E09 1.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 59; CAN_09E09_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 60; CAN_09E09_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 65; CAN_09E09_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 66; CAN_09E09_VL2)임)이고; 개 09E09 2.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 61; CAN_09E09_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 62; CAN_09E09_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 65; CAN_09E09_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 66; CAN_09E09_VL2)임)이다. 고양이 09E09 1.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 67; FEL_09E09_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 68; FEL_09E09_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 71; FEL_09E09_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 72; FEL_09E09_VL1)임)이고; 고양이 09E09 2.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 69; FEL_09E09_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 70; FEL_09E09_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 71; FEL_09E09_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 72; FEL_09E09_VL1)임)이고; 고양이 09E09 1.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 67; FEL_09E09_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 68; FEL_09E09_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 73; FEL_09E09_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 74; FEL_09E09_VL2)임)이고; 고양이 09E09 2.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 69; FEL_09E09_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 70; FEL_09E09_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 73; FEL_09E09_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 74; FEL_09E09_VL2)임)이다.
개 10F07 1.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 75; CAN_10F07_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 76; CAN_10F07_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 77; CAN_10F07_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 78; CAN_10F07_VL1)임)이고; 개 10F07 2.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 79; CAN_10F07_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 80; CAN_10F07_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 77; CAN_10F07_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 78; CAN_10F07_VL1)임)이고; 개 10F07 1.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 75; CAN_10F07_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 76; CAN_10F07_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 81; CAN_10F07_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 82; CAN_10F07_VL2)임)이고; 개 10F07 2.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 79; CAN_10F07_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 80; CAN_10F07_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 81; CAN_10F07_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 82; CAN_10F07_VL2)임)이다. 고양이 10F07 1.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 83; FEL_10F07_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 84; FEL_10F07_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 85; FEL_10F07_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 86; FEL_10F07_VL1)임)이고; 고양이 10F07 2.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 87; FEL_10F07_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 88; FEL_10F07_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 85; FEL_10F07_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 86; FEL_10F07_VL1)임)이고; 고양이 10F07 1.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 83; FEL_10F07_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 84; FEL_10F07_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 89; FEL_10F07_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 90; FEL_10F07_VL2)임)이고; 고양이 10F07 2.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 87; FEL_10F07_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 88; FEL_10F07_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 89; FEL_10F07_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 90; FEL_10F07_VL2)임)이다.
개 19F07 1.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 91; CAN_19F07_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 92; CAN_19F07_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 93; CAN_19F07_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 94; CAN_19F07_VL1)임)이고; 개 19F07 2.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 95; CAN_19F07_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 96; CAN_19F07_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 93; CAN_19F07_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 94; CAN_19F07_VL1)임)이고; 개 19F07 1.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 91; CAN_19F07_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 92; CAN_19F07_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 97; CAN_19F07_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 98; CAN_19F07_VL2)임)이고; 개 19F07 2.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 95; CAN_19F07_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 96; CAN_19F07_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 97; CAN_19F07_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 98; CAN_19F07_VL2)임)이다. 고양이 19F07 1.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 99; FEL_19F07_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 100; FEL_19F07_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 101; FEL_19F07_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 102; FEL_19F07_VL1)임)이고; 고양이 19F07 2.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 103; FEL_19F07_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 104; FEL_19F07_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 101; FEL_19F07_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 102; FEL_19F07_VL1)임)이고; 고양이 19F07 1.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 99; FEL_19F07_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 100; FEL_19F07_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 105; FEL_19F07_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 106; FEL_19F07_VL2)임)이고; 고양이 19F07 2.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 103; FEL_19F07_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 104; FEL_19F07_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 105; FEL_19F07_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 106; FEL_19F07_VL2)임)이다.
개 14C04 1.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 127; CAN_14C04_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 128; CAN_14C04_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 131; CAN_14C04_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 132; CAN_14C04_VL1)임)이고; 개 14C04 2.1은 가변 중쇄 서열(서열번호 129; CAN_14C04_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 130; CAN_14C04_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 131; CAN_14C04_VL1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 132; CAN_14C04_VL1)임)이고; 개 14C04 1.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 127; CAN_14C04_VH1)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 128; CAN_14C04_VH1)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 133; CAN_14C04_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 134; CAN_14C04_VL2)임)이고; 개 14C04 2.2는 가변 중쇄 서열(서열번호 129; CAN_14C04_VH2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 130; CAN_14C04_VH2)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 133; CAN_14C04_VL2)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 134; CAN_14C04_VL2)임)이다.
실시예 9. 후보 항-OSMR 항체의 상동성 모델링 및 CDR 사이의 구조적 변화의 비교
공지된 단백질 구조를 기반으로 한 상동성 모델의 생성은 항체의 3차원 구조를 이해하는 데 유용하다. 중첩(superposition)을 통해 이러한 단백질 모델을 오버레이하면 항체가 3차원 공간에서 서로 유사하고 상이한 영역을 직접 비교할 수 있다. 이러한 방법은 단백질을 주변 환경에 대한 각 아미노산의 물리화학적 특성의 집합적 표현을 설명하지 않는 아미노산 서열의 문자열로 비교하는 한계를 극복한다. 본 명세서에 기재된 5개의 마우스 항-OSMR 항체에 대한 항체 모델을 이용 가능한 다른 소프트웨어와 유사한 모델을 생성할 수 있는 Molecular Operating Environment(MOE™) 소프트웨어(케미칼 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group), 캐나다 몬트리얼 소재)를 사용하여 생성하였다. 예를 들어, 기록상 문헌[Almagro　et al.; Antibody Modeling Assessment; Proteins: Struct. Func. Bioinf. 79 (2011) 3050-3066] 참조.
5개의 마우스 항-OSMR 항체 모델의 구조를 비교하기 위해, 항원 결합에 가장 중요한 것으로 간주되는 각 항체 CDR 사이의 쌍별 비교로부터 평균 제곱근 편차(root-mean-square deviation: RMSD) 값을 결정하였다. RMSD 값은 단백질의 백본 스캐폴드로서 작용하는 이들의 알파 탄소 원자의 좌표를 비교함으로써 3차원 공간에서 구조의 유사성을 결정하는 데 사용되는 알려진 메트릭이다. RMSD를 계산할 때, MOE 소프트웨어는 각 알파 탄소를 다른 구조의 각각 정렬된 알파 탄소와 비교하여 선택된 관심 영역에 대한 구조의 전체 차이를 나타내는 평균 제곱근 편차를 생성한다. 본 발명자들은 본 명세서에서 전체 가변 도메인이 아닌 각 항체 사이의 CDR 영역만의 비교를 설명한다. 3개의 항체 구조 사이의 RMSD 값을 계산할 때, 구조적 중첩 및 정렬을 최적화하기 위해 갭이 도입된 영역을 고려하여 서열 정렬을 수행한다. 어떤 상황에서는, 고려되지 않은 루프 길이의 변동으로 인해 RMSD 유사성이 과대평가된다(더 낮은 RMSD 값). 이는 CDR 길이가 상이한 5개의 마우스 항-OSMR 항체 후보로부터의 CDRH3 및 CDRL1을 고려할 때의 경우이다(도 3). 2옹스트롬 이상의 RMSD는 3차원 공간에서 상당한 분리를 나타낸다.
도 4는 본 명세서에 기재된 5개의 마우스 항-OSMR 항체로부터의 각 CDR의 쌍별 비교로부터 생성된 RMSD를 갖는 6개의 행렬을 보여준다. 이러한 구조적 모델로부터의 CDRH1의 비교는 이들 항체가 2옹스트롬을 초과하는 RMSD 값이 없는 서로에 대한 이 루프에서 일반적인 구조적 유사성을 가짐을 나타낸다. 가변 중쇄 서열(서열번호 43; MU_14C04_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 44; MU_14C04_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 45; MU_14C04_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 46; MU_14C04_VL)임)을 갖는 마우스 항체 14C04는 가장 다른 CDRH1 구조(다른 항체와 비교하여 가장 큰 RMSD)를 가지며, 이 항체가 개 OSMR에만 특이적인 유일한 항체라는 점에 유의하는 것이 중요하다. 뮤린 항-OSMR 항체 14C04와 다른 것들 사이의 RMSD 차이는 CDRH2를 각 비교에 대해 2를 초과하는 RMSD 값과 비교할 때 더욱 두드러진다.
5개의 마우스 항-OSMR 항체로부터의 CDRH3 구조를 비교한 RMSD 결과는 항체 및 이들의 표적인 OSMR과의 구조 기능 관계에 대한 또 다른 중요한 고려사항을 강조한다. 마우스 항-OSMR 항체 14C04는 4개의 비교 중 3개에서 2옹스트롬을 초과하는 RMSD 값을 갖는 이 CDR의 다른 것들과 구조적으로 매우 구별되며, 이전에 언급한 바와 같이 14C04는 개 OSMR 특이적이다(친화성 데이터에 대해 표 1을 참조). 다른 항체는 가변 중쇄 서열(서열번호 31; MU_02D09_VH)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 32; MU_02D09_VH)임) 및 가변 경쇄 서열(서열번호 33; MU_02D09_VL)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 34; MU_02D09_VL)임)을 갖는 마우스 항-OSMR 02D09에서 다른 4개의 항체와 높은 구조적 차이를 갖는다. 마우스 항-OSMR 02D09는 이 항체가 고양이 OSMR에 대한 결합 특이성을 나타낸다는 점에서 흥미롭다(표 1 및 표 3 참조, 표 3은 고양이 OSMR에 대한 키메라 02D09 항체의 더 높은 친화성(개 OSMR에 비해)뿐만 아니라 고양이 OSMR 단백질에 대한 이의 우선적 특이성을 뒷받침하는 더 느린 오프 레이트(off rate)를 뒷받침함). 이전에 만든 점을 반복하자면, 항체 02D09 및 14C04는 또한 더 긴 CDRH3을 가지며, 이러한 추가적인 아미노산은 직접적인 구조 비교에서는 고려되지 않지만, 이들은 개 및 고양이 OSMR 모두에 결합하는[강조 추가됨] 다른 3개의 항체와 비교할 때 이 2개의 CDRH3 루프의 독특한 구조에 큰 영향을 미친다.
경쇄 CDR 구조의 비교를 계속하면, 도 4의 CDRL1 행렬은 5개의 항 OSMR 항체의 RMSD 비교가 2-옹스트롬 차이를 초과하지 않음을 보여준다. 다시, 개 OSMR 항체 14C04는 이 CDR에서 4개의 추가적인 아미노산을 고려하지 않고 구조적 구별에 대한 경향을 나타내는 더 높은 RMSD 값을 갖는다. 이 CDR 루프의 추가적인 4개의 아미노산은 다른 4개의 항체와 비교하여 상당한 구조적 차이를 나타내며, 추가로 이 항체에 대한 결합 파라토프의 고유한 구조적 조성을 뒷받침한다. 항체 02D09 및 14C04는 이들 사이의 비교에서 존재하는 가장 상당한(2옹스트롬 초과의 RMSD) CDRL2 루프에서의 가장 큰 구조적 변화를 갖는다.
항체 09E09 및 10F07로부터의 CDRL2의 아미노산 서열은 동일하지만 이들 사이의 RMSD 비교가 0이 아니라는 점(값은 0.31임)을 나타내는 것이 흥미롭다. 0.31의 RMSD 값은 서로 매우 유사한 구조를 나타낸다. 차이점은 항체 09E09 및 10F07이 동일한 가변 경쇄를 갖지 않으므로 서로 동일하지 않다는 사실에서 발생한다. 단백질 사슬의 다른 영역에 도입된 구조적 변화는 말단에서 발생하는 차이의 원인이 될 수 있으며, RMSD 값의 미묘한 차이에 반영된다.
경쇄 CDRL3의 비교는 항체 02D09와 09E09 사이에 상당한 구조적 차이가 있으며, 개 및 고양이 OSMR에 대한 이중 특이성을 갖는 것들과 비교할 때 더 큰 구조적 변이를 나타내는 이들 2종 특이적 항-OSMR에 대한 경향이 있음을 다시 보여준다. 하나의 특정 가설에 얽매이지 않고, 본 발명자는 이러한 항-OSMR 항체의 CDR 루프의 구조와 개 및/또는 고양이 OSMR에 특이적으로 결합하고 이를 차단하는 기능 사이의 연결을 뒷받침하는 증거를 제시하며, 여기서 이 결합은 IL-31 또는 OSM 단백질에 의해 유도되는 pSTAT3 신호전달 능력을 저해한다.
실시예 10. 개 및 고양이 OSM:OSMR 수용체의 상동성 모델링
결합하여 세포 신호전달 반응을 일으키는 사이토카인의 맥락에서 OSMR 수용체를 특성화하였다. 이러한 사이토카인(OSM 포함)은 세포 분화, 증식, 조혈, 면역학적 및 염증성 반응을 포함하는 다양한 세포 및 조직 분포의 맥락에서 다면 발현성(pleiotropic) 반응을 이끌어내는 사이토카인의 gp130 패밀리 구성원이다(Richards CD.; The Enigmatic Cytokine Oncostatin M and Roles in Disease; ISRN Inflammation. 2013:512103 (2013)). OSMR 단백질은 인간에서 LIF와 OSM 모두에 대한 반응으로 신호를 보내기 위해 헤테로이량체 수용체 복합체를 형성하는 LIFR과 유사한 구조적 구조를 공유한다. 이러한 기능적 특성의 중첩은 종 내 및 종 간 이러한 수용체 구조의 비교를 가능하게 한다. OSMR에 대한 단백질 구조는 현재 이용 가능하지 않지만, LIF 수용체(Leukemia inhibitory factor receptor: LIFR)와 복합체화된 백혈병 저해 인자(Leukemia inhibitory factor: LIF)의 결정 구조(PDB ID: 2Q7N, 4옹스트롬)는 이용 가능하다(Huyton T et al.; An unusual cytokine: Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jul 31;104(31):12737-42). 하나의 가설에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 본 명세서에 IL-31, OSM 및 OSMR 사이의 상호작용의 이해를 안내하기 위한 본보기로서 이 LIF: LIFR 공-결정 구조를 사용하는 구조적 상동성 데이터를 제시한다. 인간 OSM과 인간 OSMR의 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기의 기능적 매핑 보고서와 결합된 이러한 구조적 데이터는 개 및 고양이 OSMR의 상동성 영역에 대한 추론을 가능하게 하며 저해성 항-OSMR 항체가 결합하는 에피토프의 이해를 뒷받침한다.
도 5A는 인간 LIFR(서열번호 135; 인간_LIFR)의 주형 구조 2Q7N에서 (서열번호 107; 개_OSMR_hIgG1_Fc)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 108; 개_OSMR_hIgG1_Fc)임)(개 OSMR의 세포외 도메인)의 28번 내지 329번 아미노산을 사용하여 생성된 대표적인 상동성 모델을 보여준다. 유사한 상동성 모델을 인간 LIFR(서열번호 135; 인간_LIFR)의 주형 구조 2Q7N에서 (서열번호 112; 고양이_OSMR_hIgG1_Fc)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 113; 고양이_OSMR_hIgG1_Fc)임)(고양이 OSMR의 세포외 도메인)의 28번 내지 329번 아미노산을 사용하여 생성하였다. 도 5는 인간 LIF(서열번호 136; 인간_LIF)의 주형 구조 2Q7N에서 개 OSM(서열번호 109; 개_OSM)을 사용하여 생성된 상동성 모델을 보여준다. 유사한 상동성 모델을 인간 LIF(서열번호 136; 인간_LIF)의 주형 구조 2Q7N에서 고양이 OSM(서열번호 110; 고양이_OSM_hIgG1_Fc)(이에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 111; 고양이_OSM_hIgG1_Fc)임)의 23번 내지 234번 아미노산을 사용하여 생성하였다.
도 5A는 LIF:LIFR 공-결정 주형을 기반으로 한 개 OSMR 단백질 근처의 개 OSM 상동성 모델의 결합 계면을 보여준다. 도 5B는 강조 표시된 원 안에 포함된 영역의 확대 사진을 보여준다. 이 확대된 표시에는 인간 OSM:OSMR 상호작용과 관련된 관련 아미노산을 정의하는 이전 연구로부터 확인된 아미노산 표시가 있다(Adrian-Segarra JM et al.; The AB loop of Oncostatin M (OSM) determines species-specific signaling in humans and mice. J Biol Chem. 2018 Dec 28;293(52):20181-20199). 이 간행물은 OSMR에 대한 OSM 결합과 관련된 중요한 아미노산 잔기의 기능을 평가하기 위해 인간 단백질을 사용하였지만, 이 개 OSM:OSMR 상동성 모델에 표시된 상동 아미노산은 실제로 이 결합 계면에 위치하므로 인간 단백질 구조에 대한 추론이 개 및 고양이 수용체 시스템을 지지한다는 증거를 뒷받침한다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
실시예 11. 공지된 OSM 결합 도메인에 대한 상동성 및 종 간 아미노산 서열 변이에 기초한 개 및 고양이 OSMR 상의 항-OSMR 결합 영역의 결정
도 6은 개 및/또는 고양이 OSMR 상의 5개의 마우스 항-OSMR 항체의 결합 영역(들)을 논리적으로 정의하기 위한 도면을 보여준다. 즉, OSMR에서 OSM(및 아마도 IL-31) 결합 부위를 정의하는 아미노산 잔기의 수가 적으며 인간 OSMR 단백질의 서열 차이 및 개와 고양이 OSMR 사이의 제한된 차이로 인해, 이들 항체가 특이적으로 결합하여 본 명세서에 기재된 기능적 활성을 이끌어낼 수 있는 영역이 거의 없다. 도 6에서, 인간 OSMR의 세포외 도메인은 검은색으로 채워진 타원으로 표시하고, 사이토카인 결합 도메인은 빗금 친 사각형으로 표시하고, 피브로넥틴 III 도메인은 속이 빈 원으로 표시하였다. 본 명세서에 기재된 것과 같은 매핑 연구는 인간 OSMR에 대한 OSM의 결합을 담당하는 특정 영역(주요 개별 아미노산 접촉)을 정의한다. 항-OSMR 항체를 생성하기 위해 마우스를 면역화하는 데 사용된 상동성 개 및 고양이 OSMR 단백질 영역도 또한 도시되어 있다. 본 명세서에 기재된 개 및/또는 고양이 OSMR에 결합하기 위해 선택된 항체 중 어느 것도 인간 OSMR에 결합하지 않았으며, 이는 결합이 인간과 다른 개 및/또는 고양이 OSMR 상의 영역에서 발생함을 나타낸다. 즉, 개 및 고양이 OSMR의 이러한 영역에 있는 아미노산은 인간과 다르다. 이들 항체가 개 및/또는 고양이 OSMR에 결합하고 개 및/또는 고양이 OSM(및/또는 IL-31)에 의해 유도된 pSTAT3 매개성 신호전달을 저해한다는 것을 아는 것은, 이들이 OSM 및/또는 IL-31이 수용체를 활성화하기 위해 OSMR에 결합하는 개별 영역에 결합하며, 이 영역은 개와 고양이 대 인간 OSMR에서 상이한 아미노산 서열임을 의미한다.
본 명세서에 기재된 마우스 항-OSMR 항체에는 다음 3가지 유형이 있다: 1) 고양이 OSMR에 우선적으로 결합하는 항체, 2) 개 OSMR에 특이적으로 결합하는 항체 및 3) 개 및 고양이 OSMR에 결합하는 3가지 항체. 이러한 3가지 결합 표현형에 기초하여, 개 OSMR에 특이적으로 결합하는 항체는 아미노산 서열이 개 대 고양이 OSMR에 고유한 OSM(및 IL-31)의 결합 부위 근처의 OSMR 영역에 결합하여야 한다. 개 OSMR보다 고양이 OSMR에 우선적으로 결합하는 항체는 고양이 OSMR에 고유한 영역과 OSM(및 IL-31)의 결합 부위 근처에 결합할 것이다. 개 및 고양이 OSMR 모두에 결합하고 OSM(및/또는) IL-31 매개성 신호전달을 저해하는 항체는 아미노산 서열이 개와 고양이 OSMR 사이에 보존된 OSMR의 영역에 결합할 것이다. 본 명세서에 기재된 모델링 및 이러한 항체에 대해 결정된 기능적 데이터에 기초하여, 이들 데이터는 본 명세서에 기재된 항-OSMR 항체의 에피토프를 정의한다.
실시예 12. OSMR 수용체 모델에 대한 항-OSMR 항체의 도킹(docking)
개 및/또는 고양이 OSMR에 결합하는 선택된 5개의 후보 마우스 항-OSMR 항체에 대해 생성된 상동성 모델이 본 명세서에 기재되어 있다. 또한, CDR 구조에 대한 이들 항체 사이의 기능 관계, 및 개 및/또는 고양이 세포에서 차별적 결합 및 개 및/또는 고양이 IL-31 및/또는 OSM pSTAT3 신호전달의 중화에 대한 효능에 대한 구조의 변화를 설명한다. 추가적으로, 수용체 활성화에 중요한 OSM 사이토카인 및 수용체 상의 영역을 정의하는 OSM:OSMR 결합 계면의 상동성 모델이 설명되어 있다. 이러한 모델의 사용과 이러한 상호작용에 관련된 특정 아미노산 잔기에 대한 지식은 개 및 고양이 OSM 및 OSMR 단백질의 상동성 영역을 인식할(translated to) 수 있게 한다.
또 다른 단백질(또는 단백질 복합체)에 대한 단백질의 도킹은 MOE 또는 현재 이용 가능한 관련 소프트웨어와 같은 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 항체 상동성 모델(또는 항체의 규명된(solved) 구조)은 소프트웨어를 안내하기 위해 단백질 상의 영역(예를 들어, 특정 아미노산 잔기)을 정의하기 위한 사용자의 입력을 사용하여 수용체에 도킹된다. 이러한 영역은 사이토카인과 이것이 결합하는 수용체 사이의 접촉에 중요한 잔기를 정의하는 실험적 데이터의 지식으로부터 정의된다. 이러한 데이터는 상동성 단백질 구조 및/또는 유사한 기능적 특성과 유사한 구조(및 반드시 유사한 아미노산 서열일 필요는 없음)를 갖는 단백질의 구조로부터 유도될 수 있다. OSMR 구조에 대한 항-OSMR 항체의 도킹은 마우스 항 개 및/또는 고양이 CDR이 종 특이성에 중요한지에 대한 지식과 결합된 인간 OSM:OSMR 상호작용에 대한 지식을 사용하여 MOE 소프트웨어에서 수행하였다. 또한, OSM:OSMR 상호작용의 관련 영역에 대한 항체 모델의 배치는 a) 본 명세서에 기재된 마우스 항-OSMR 항체가 개 및/또는 고양이 OSMR에 결합하고, b) 이러한 항체가 IL-31 및/또는 OSM의 능력을 차단하여 개 및/또는 고양이 세포에서 pSTAT3 신호전달을 유도한다는 사실에 의해 뒷받침된다. 이러한 사실은 이러한 항체가 논리적으로 결합할 수 있는 OSMR 단백질의 개별 영역을 정의하고, CDR의 도킹이 발생하여야 하는 위치를 정의하는 영역을 제한한다.
실시예 13. 제자리 혼성화(in situ hybridization: ISH)를 사용한 알레르기성 피부염이 있는 고양이의 피부 조직 생검에서의 OSMR 유전자 발현의 분석
알레르기성 피부 질환이 있는 고양이로부터의 20개의 피부 생검을 포르말린-고정 및 파라핀-포매(formalin-fixed and paraffin-embedded: FFPE)한 후 ISH 분석을 위해 절단하였다. 알레르기성 질환의 징후가 없는 정상적인 고양이 피부로부터의 19개의 생검을 FFPE에 적용하고, 비교 분석을 위해 절단하였다. 어드밴스트 셀 다이아그노스틱스 RNAscope 2.5 LS 시약 키트-레드(ACD, 322750-USM)의 자동화된 단일 발색 ISH 프로토콜을 Leica Bond-RX 시스템을 사용하여 수행하였다. 프로브 혼성화 전에, 조직 샘플에 ACD 독점 프로테이스 시약을 사용하여 열 및 효소적 에피토프 복구(enzymatic epitope retrieval)를 적용하였다. 각 샘플에 대해 양성 대조군 염색을 수행하여 사이클로필린 B(PPIB) 유전자에 대한 프로브(어드밴스트 셀 다이아그노스틱스, 인크.(Advanced Cell Diagnostics, Inc.), 캘리포니아주 뉴어크 소재)를 사용하여 RNA 무결성을 결정하였다. 고양이 OSMR 유전자(어드밴스트 셀 다이아그노스틱스, 인크., 캘리포니아주 뉴어크 소재)의 발현을 검출하기 위해 맞춤형 프로브를 설계하였다. 각 슬라이드를 시각화하고, Leica Aperio ImageScope 12.3.2.8013에서 정량화하였다. 각 이미지에 주석을 달고, ImageScope 소프트웨어에 내장된 매크로 알고리즘 Leica RNA ISH v2로 RNA 발현을 분석하였다. ImageScope 소프트웨어에서 데이터를 추출하고, RNA 신호 대 분석된 조직 영역의 비로 보고하였다. 신호 유의성을 결정하기 위해 스튜던트의 단측 검정을 사용하였다.
도 7은 정상 및 알레르기성 고양이 피부 생검으로부터의 ISH를 사용한 OSMR mRNA의 영상화 후 정량적 결과를 보여준다. RNAScope를 사용한 mRNA의 ISH는 표적화된 전사체(이 경우 고양이 OSMR mRNA)의 검출에 매우 특이적이다. 알레르기성 질환이 있는 고양이의 피부에서 OSMR mRNA의 명백하고 현저한 과발현이 있다. 이러한 결과는 고양이에서 알레르기성 피부 질환의 임상적으로 관련된 진단과 OSMR 및 질환 병태생리 사이의 연결을 나타내는 OSMR 유전자의 과발현 사이의 상관관계를 나타낸다. 이러한 결과는 OSMR이 고양이 피부 장애에 관여하며, 수용체를 통한 사이토카인-매개성 신호전달을 차단할 수 있는 항체로 OSMR을 표적화하는 것이 알레르기성 및 아토피성 피부염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이러한 장애를 치료하는 데 유용할 수 있다는 가설을 뒷받침한다.
실시예 14. 면역조직화학(IHC)을 사용한 알레르기성 피부염이 있는 고양이의 피부 조직 생검에서의 OSMR 단백질의 분석
알레르기성 피부 질환이 있는 고양이로부터의 5개의 피부 생검을 포르말린-고정 및 파라핀-포매(FFPE)한 후 IHC 분석을 위해 절단하였다. 알레르기성 질환의 징후가 없는 정상적인 고양이 피부로부터의 5개의 생검을 FFPE에 적용하고 비교 분석을 위해 절단하였다. Leica Bond-RX 시스템(레이카 바이오시스템즈(Leica Biosystems), 일리노이주 버팔로 그로브 소재)을 사용하여 자동화된 단일 발색 IHC 정제 레드 프로토콜을 수행하였다. 항체 염색 전에, 샘플 에피토프를 EDTA 완충액에서 열 유도 에피토프 회수에 노출시켰다. 다중클론 토끼 항-OSMR 항체(엘에스바이오(LSBio) LS-B11477, 워싱턴주 시애틀 소재)를 사용하여 고양이 OSMR 단백질의 발현을 수행하고, Leica Bond 정제 레드 AP 연결 중합체 및 신속 레드 크로모겐(fast red chromogen)(레이카 바이오시스템즈, 일리노이주 버팔로 그로브 소재)으로 검출하였다. OSMR 단백질의 발현을 나타내는 적색 염색에 대해 각각의 이미지를 검사함으로써 정성적 분석을 수행하였다.
도 8은 정상적인 고양이 피부 박편(section)과 알레르기성 질환이 있는 고양이로부터의 피부 박편을 비교한 대표적인 이미지를 보여준다. 피부의 컬러 슬라이드 이미지는 밝은 갈색의 표피 영역, 핵의 다피(Dapi) 염색인 작은 반점이 있는 진보라색 반점 및 알칼리 포스파테이스(AP) 표지된 2차 항체의 발색에 따른 OSMR 단백질의 비색 염색인 적색을 포함한다. 도 8은 컬러 이미지를 그레이스케일 형식으로 변환한 후 대조군 피부 조직 이미지 및 알레르기성 피부 조직 이미지에서 고양이 OSMR 단백질의 염색을 보여준다. 대조군(비알레르기성) 피부 샘플에서는 표피하 공간에서 OSMR 단백질의 발현이 미미하며 표피층 근처에 세포가 일반적으로 분포되어 있다. 알레르기성 피부 샘플로부터의 이미지는 표피와 표피하 공간 사이의 구별이 최소화된 세포의 큰 침윤과 함께 표피하 공간 전체에 걸쳐 OSMR 단백질의 상승된 발현을 명확하게 보여준다. OSMR 단백질은 이러한 이미지에서 검은색으로 정의된 핵 염색의 외부 공간의 회색에서 검은색의 음영으로 보인다. 흥미로운 점은 이러한 이미지에서 세포 경계에 주석이 표시되어 있지는 않지만 세포에서 떨어져 있는 것으로 추정되는 사이질(interstitial) 영역에 염색이 나타나 있으며, 이는 분비된 가용성 형태의 OSMR 수용체가 존재할 수 있음을 나타낸다는 것이다. 하나의 가설에 얽매이지 않고, 이러한 분비된 수용체는 OSMR이 상호작용하는 단백질에 대한 길항제 또는 운반 단백질로 작용함으로써 조절 역할을 할 수 있는 것으로 생각할 수 있다. 이러한 가용성 형태가 수용체의 세포-관련 형태와 동일한 아미노산 서열 및 구조를 갖는다면, 본 명세서에 기재된 것과 같은 항-OSMR 항체도 가용성 형태에 결합할 것이다. 5개의 대조군 고양이 피부 슬라이드 및 5개의 알레르기성 피부 슬라이드의 육안 검사는 2개의 대표 이미지에 대해 본 명세서에 설명된 것과 유사한 OSMR 염색 패턴을 나타낸다. 결과는 알레르기성 질환이 없는 고양이 피부 샘플과 비교할 때 알레르기성 질환이 있는 고양이의 피부에서 OSMR의 과발현을 보여주는 본 명세서에 기재된 정량적 결과를 뒷받침한다. 이러한 결과는 알레르기성 및 아토피성 피부염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 피부 장애가 있는 고양이의 피부에서 OSMR 단백질의 역할에 대한 증거를 제공한다.
실시예 15. 항 OSMR 항체의 생체내 효능을 결정하기 위한 개 및 고양이의 IL-31 유도성 가려움 모델
하나의 특정 가설에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 IL-31 및/또는 OSM에 의한 pSTAT3 유도성 신호전달의 생물학적 활성을 차단(또는 중화)할 수 있는 개 및/또는 고양이 OSMR에 대한 선택된 항체의 결합 및 OSMR 수용체의 수준에서 이러한 IL-31 및/또는 OSM 저해가 개 및 고양이에 대해 본 명세서에 기재된 아토피성, 알레르기성, 염증성 및 다른 장애에 대한 치료제로서 유익할 수 있다는 증거를 제시한다. 표적을 효과적으로 중화시키는 항체의 능력은 숙주 종에서의 효능에 대한 적절한 모델을 사용하여 생체내에서 평가될 수 있다. 생체내 효능을 결정하기 위한 이러한 모델이 기술된다.
개에서 생체내 효능을 결정하기 위해, 실험실 개에게 항-개 OSMR 항체를 피하(SC) 투여하였다. 모든 개를 대상으로 기준선 반응을 수행하고, 개를 소양증 점수 지수(pruritic score index: PSI)에 기초하여 무작위로 그룹화하고 수용하였다. 그런 다음, 제7일에 개에게 항-개 OSMR 항체를 투여하고, IL-31 시험 투여(challenge)를 제8일, 제14일 및 제22일에 수행하였다. 항체 처리한 동물에서 제1일에 비해 제8일 및 제14일 동안 평균 PSI의 감소는 처리하지 않은 동물에 대한 PSI 점수와 비교할 때 효능 종점에 대해 고려하였다. 개의 소양성 행동과 관련된 PSI의 일일 변화를 평가하는 것은 IL-31 시험 투여 전 매일 각 개에 대해 결정된 30-분 기준선 PSI로 변화에 대해 제어된다. 이러한 생체내 모델 데이터는 1) 항-개 OSMR 단일클론 항체가 개에서 소양증을 유도하는 IL-31의 능력을 중화할 수 있고, 2) 세포 기반 검정에서 OMSR의 차단에 의한 IL-31 매개성 신호전달의 저해가 생체내 효능과 상관관계가 있으며, 3) 항체 평가를 위한 IL-31 모델을 사용하는 데 필요한 매개변수가 다른 후보 항체의 평가를 위해 확립된다는 증거를 제공할 수 있다.
항-고양이 OSMR의 효능을 IL-31 유도성 생체내 고양이 모델에서 평가하였다. 비히클 위약 및 항체 그룹에 대한 시험 투여 전 소양성 행동을 -7일에서 28일까지 평가하였으며, 0일은 항체 투여일이다. 첫 번째 고양이 IL-31 시험 투여 7일 전인 제0일에 고양이에게 항-OSMR 항체를 피하 투여하였다. IL-31 단백질의 정맥내 시험 투여 후 1시간 동안 제7일, 제21일 및 제28일에 소양성 행동을 평가하였다. 비히클 위약 대조군과 비교할 때, IL-31 시험 투여 후 제7일, 제21일 또는 제28일에 관찰된 소양증의 감소를 효능에 대해 고려하였다. 이러한 데이터 생체내에서 고양이 IL-31에 의해 유도된 소양증을 중화하는 항-OSMR 항체의 능력을 뒷받침하며, 항체가 아토피성 피부염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고양이의 IL-31 매개성 질환의 치료에 치료제로 작용할 수 있음을 시사한다.
실시예 16. 마우스 및 마우스:개 키메라 항-OSMR 항체를 사용한 추가적인 세포-기반 데이터
IL-31 및 OSM-매개성 pSTAT3 신호전달에 대한 세포 시험 물질 검정에서 항-OSMR 항체의 효능을 평가하기 위해 추가적인 세포-기반 실험을 수행하였다. 이러한 데이터는 실시예 6 및 실시예 7에 설명된 이전의 작업을 뒷받침하기 위해 생성하였다. 마우스 및 마우스:개 키메라 항체의 서열은 각각 실시예 6 및 실시예 7에 기재되어 있다. 이러한 데이터는 두 항체 10F07 및 19F07이 개 및 고양이 세포 모두에서 개 및 고양이 IL-31 및 OSM 매개성 pSTAT3 신호전달을 저해하는 데 우수한 효능을 가짐을 보여준다. 또한, 흥미로운 것은 개 매개성 신호전달의 저해에 대한 항체 14C04 및 고양이에 대한 02D09의 선택적 효능이며, 이는 이러한 두 항체에 의해 인식되는 에피토프에 대한 차별적 특이성을 초래하는 OSMR 수용체에 대한 구조적 변화에 대한 가능성을 나타낸다.
Figure pct00096
실시예 17. 개화 및 고양이화된 항-OSMR 항체에 대한 결합 데이터
개화(개) 및 고양이화된(고양이) 항-OSMR 항체를 클로닝하고, 발현시키고 정제하였다. 표 6의 각 종분화된 항체의 서열은 실시예 8에 기재되어 있다. 개 및 고양이 OSMR에 대한 이러한 종분화된 항체의 친화성을 Biacore를 사용하여 측정하였다. 표 5는 개 및/또는 고양이 OSMR을 발현하고 이에 결합하는 종분화된 항체에 대한 이러한 Biacore 실험의 결과를 설명한다. 표에 나타낸 바와 같이, 이 첫 라운드의 종분화는 19F07, 09E09 및 10F07 계통으로부터 이들의 단백질 표적을 발현하고 이에 결합하는 항체를 생산하였다. 이러한 종분화된 버전과 동일한 CDR을 갖는 마우스 및 마우스:개 키메라와의 비교를 위해, 각각 표 1 및 표 3을 참조한다. 이러한 3개의 시리즈 항체 각각에 대한 가장 높은 친화성 종분화는 7.73E-9 M의 KD로 고양이 OSMR에 결합하는 Fel_09E09_1.1, 1.21E-9 M의 KD로 고양이 OSMR에 결합하는 Fel_10F07_2.2, 8.30E-9M의 KD로 개 OSMR에 결합하는 Can_19F07_2.1 및 3.32E-12 M의 KD로 고양이 OSMR에 결합하는 Fel_19F07_2.2이다. 종분화 과정 동안의 목적은 종분화된 항체 형태가 각각의 표적 단백질(이 경우 개 및/또는 고양이 OSMR)에 대한 친화성을 유지하는 것이다. 이 목표를 예시하는 항체에 대한 결합 동역학이 여기에 자세히 설명되어 있다.
Figure pct00097
실험 대조군은 인간 OSMR에 대한 항-인간 OSMR 항체의 결합만을 보여준다. 이러한 CDR을 갖는 마우스 선조 mAb 중 어느 것도 인간 OSMR에 대한 결합을 나타내지 않았다(표 1 참조). 형질감염되지 않은 대조군을 기능적 항체를 발현시키기 위한 플라스미드 없이 이러한 종분화된 재조합 mAb와 동일하게 성장시키고 정제하였다. cOSM 결합은 이러한 3가지 OSMR 수용체 형태가 개 형태의 OSM 단백질에 결합할 수 있음을 보여준다. Ctrl-HBS-EP는 Biacore 기기용 완충액 대조군이다.
실시예 18. 알라닌 치환을 사용한 항-OSMR CDR의 돌연변이 분석
항체 CDR 상의 각 아미노산 잔기와 표적 단백질에 대한 항체의 결합에서 해당 잔기의 관여 사이의 기능적 관계를 확립하기 위해, 알라닌 대체 돌연변이 분석을 수행하였다. 표 1에 기재된 5개의 항-OSMR 항체 중 4개에 대해 중쇄 및 경쇄 마우스 가변 서열을 포함하는 개별적인 포유동물 발현 플라스미드를 합성하였다(항체 Mu_14C04에 대한 알라닌 대체는 수행하지 않았음). 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 키메라 항체의 생성을 위해 본 명세서에 기재된 바와 같이 각각 중쇄 및 경쇄 개 불변 영역으로 클로닝하였다(실시예 7). 이러한 키메라 항체의 발현 및 정제는 본 명세서에 기재된 절차에 따라 수행하였다(실시예 1). 비교 분석을 위해, 초기 마우스 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열(야생형)로부터 어떠한 변화도 없이 각각의 키메라를 만들었다. 각각의 돌연변이체에 대해, 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬 CDR 위치의 각각의 비알라닌 잔기를 알라닌으로 대체하여 개별 플라스미드를 생성하였다. 각 CDR의 단일 위치에 단일 알라닌 치환을 포함하는 각 플라스미드를 상응하는 중쇄 또는 경쇄의 야생형 플라스미드와 쌍을 이루게 하고, 일시적인 CHO 세포 시스템을 사용하여 발현시켰다.
실시예 19. 항-OSMR 항체의 알라닌 돌연변이체에 대한 ELISA 및 Biacore 결합 결과
알라닌 대체 돌연변이 분석의 목적은 OSMR 표적 단백질에 대한 결합에서 개별 CDR 아미노산 잔기의 관여를 더 깊게 이해하기 위한 것이다. CDR 아미노산 잔기에서 알라닌으로의 단일 치환은 기능적 변화를 초래할 수 있으며, 이에 따라 항체의 표적에 대한 결합이 부정적인 영향을 받는다(이는 CDR 치환을 포함하지 않는 야생형 항체와 비교하여 항체 단백질 표적에 대한 결합이 적거나, 또는 결합 친화도가 낮거나 또는 ELISA 신호가 낮음을 의미함). 각 알라닌 돌연변이체에 대한 결합의 평가를 고양이 OSMR 단백질(서열번호 112)이 폴리스타이렌 ELISA 플레이트에 수동적으로 고정된 간접 ELISA를 사용하여 수행하였다. ELISA는 단계 사이에 1시간의 인큐베이션 시간을 갖는 차단 및 세척의 표준 절차에 따라 수행하였다. 결합을 결정하기 위해, 표시된 곳에 정제된 항체(순수한 항체) 또는 세포 배양 상청액(상청액)으로서 각각의 야생형 또는 돌연변이체 항체를 ELISA 플레이트의 개별 웰에 첨가하였다. 이러한 항체는 마우스:개 키메라로 작제하였기 때문에, HRP 기질을 사용하여 발색시킨 후 고양이 OSMR 단백질에 결합된 항체의 양을 검출하기 위해 염소 항-개 HRP 표지된 2차 항체를 사용하였다. 일시적인 CHO 배양물로부터 항체가 생산되었는지 여부를 결정하기 위해, ELISA 플레이트 상의 포획 시약으로서 마우스 항-개 항체를 사용하여 별도의 ELISA를 수행하였다. 각 상청액 또는 순수한 항체 프렙을 개별 웰에 첨가하고 결합시켰다. HRP 표지된 염소 항-개 검출 mAb(항체 발현 대조군)를 사용하여 항체의 존재를 결정하였다. 각 ELISA 플레이트에 의해 생성된 비색 신호를 분석물이 없는 배경 대조군으로 정규화하였다. 데이터는 고양이 OSMR에 대한 결합에 대한 ELISA로부터의 광학 밀도(OD)(ELISA 신호) 대 항체 대조군 플레이트(항체 발현 대조군)로부터의 OD의 비로 나타내었다. 1.3 이하의 OD 비(ELISA 신호/mAb 대조군)로 생성된 알라닌 돌연변이는 결합에 부정적인 영향을 미치는 것으로 간주하였다. 각 야생형 발현 대조군에 대한 OD 비는 1.6보다 컸다. 일반적으로, 결합에 부정적인 영향을 미치는 대부분의 돌연변이는 0.5 미만의 OD 비를 초래하였다(표 A).
Figure pct00098
표 A는 기재된 4개의 항-OSMR 키메라 항체에 대한 각각의 CDR 위치에서 알라닌 대체 돌연변이를 이용한 ELISA 및 Biacore로부터의 결과를 요약한 것이다. 설명 열에 표시된 알라닌 대체 돌연변이는 인용된 CDR(CDR 열) 내에 속하는 전체 가변 영역의 위치를 기준으로 넘버링되었다.
ELISA 데이터는 고양이 OSMR에 대한 알라닌 대체 돌연변이체의 결합에 의해 생성된 신호의 비이다. 이 비는 고양이 OSMR에 결합하여 생성된 신호를 항체 발현 대조군으로부터의 신호로 나눈 것이다(이는 재조합 항체가 존재함을 나타냄). 또한, 발현 대조군으로부터의 상응하는 신호와 함께 개 및 고양이 OSMR에 대한 Biacore 결합 동역학이 여기에 나타나 있다. 이 표에 표시된 데이터는 동일한 항체 제제(상청액 또는 순수한 항체)를 사용한 실험으로부터 얻은 것이며, 결합이 ELISA 검정에서 부정적인 영향을 받은 결합인 알라닌 대체 돌연변이체로부터만 얻은 것이다.
표 A의 Biacore 데이터는 고양이 OSMR ELISA 실험에서 결합이 부정적인 영향을 받은 각각의 알라닌 대체 돌연변이에 대한 동역학 결합 데이터를 보여준다. ELISA로부터의 데이터는 항체가 1시간에 걸쳐 결합 및 해리되어 정상-상태 결합을 일으키는 평형 상태를 나타낸다. Biacore를 사용하여, 표적 단백질을 표면에 고정하고, 항체를 이동 액체상으로 이 표면 위로 통과시켰다. 결합(ka), 해리(kd) 및 친화성 상수(KD)의 계산할 수 있게 하는 표면 공명의 변화로부터 단백질-단백질 상호작용을 결정하였다. 하나의 가설에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 동일한 항체 제제를 사용한 ELISA 및 Biacore 실험으로부터의 데이터를 제시하며, 이는 결합과 관련하여 두 방법 간에 일치할 수 있지만 결합 동역학 및 상이한 검정 역학의 특성으로 인해 모순된 결과를 나타낼 수 있다. 표 A에 제시된 데이터(실시예 21의 효모 디스플레이 돌연변이 분석으로부터의 실험 결과와 함께)는 본 명세서에 기재된 항-OSMR 항체와 OSMR 수용체를 통해 IL-31 및 OSM-매개성 신호전달에 결합하고 이를 차단하는 능력 사이에서 정의되는 구조:기능 관계의 정의를 가능하게 한다.
실시예 20. 항-OSMR CDR 잔기의 구조-기능 관계를 결정하기 위해 돌연변이 스캐닝에 결합된 효모 표면 디스플레이(yeast surface display: YSD)를 사용하는 방법
OSMR 단백질 표적과의 상호작용에 중요한 항-OSMR 항체 19F07의 아미노산 잔기를 추가로 정의하기 위해, 효모 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)의 표면 상에 항체 가변 도메인을 디스플레이하는 것을 사용하는 독립적인 실험 방법을 사용하였다. 문헌[Klesmith et al. (2019) Biochemistry 58, 4869-4881]에 정의된 접근법을 사용하여 항체 Mu_19F07에 대해 돌연변이 내성 에피토프 매핑을 수행하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 gBlocks(IDT)로 구입하였으며, (G4S)4 링커를 통해 연결하여 19F07 단일 사슬 가변 결합 단편(scFv)을 작제하였다. HiFi 어셈블리를 사용하여 유전자를 BbvCI 닉킹 제한 부위(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))를 포함하는 최소 세균 플라스미드에 클로닝하였다. 닉킹 돌연변이유발을 사용하여, 2개의 단일-부위 포화 라이브러리를 VH 및 VL 도메인 내의 각 코돈 위치에 대한 NNK 코돈을 별도로 암호화하는 2개의 상이한 올리고 풀(IDT)을 갖는 이 벡터를 사용하여 생성하였다(Wrenbeck et al. (2016) Nature Methods 13, 928-930). 모든 클로닝 단계에 대해, 설계된 라이브러리를 오버샘플링하기에 충분한 수(VH 및 VL 라이브러리에 대해 각각 3744개 및 3424개 변이체의 이론적인 라이브러리 크기)의 형질전환체가 존재하였다. 돌연변이되지 않은 모 scFv gBlock(야생형)과 VH 및 VL 돌연변이체 라이브러리를 PCR 증폭시키고, 상동 재조합을 사용하여 선형화된 효모 표면 디스플레이 벡터로 EBY100 효모에 전기천공하였다. 선형화된 효모 디스플레이 벡터는 유전자 삽입체의 (PAS)40-HA 태그-(G4S)3 링커 5' 및 유전자 삽입체의 myc 태그 3'를 특징으로 하는 c-말단 디스플레이 벡터이다. 효모 배양물을 글루코스 및 카사미노산(SDCAA)이 포함된 50㎖ 합성 정의 배지에서 30℃에서 하루 동안 성장시키고, 성장 2일 동안 SDCAA에서 계대하였다. 그런 다음, 세포 펠릿을 2일 내지 3일 동안 18℃에서 50㎖ SGCAA(갈락토스) 배양으로 옮겼다.
모 서열을 디스플레이하는 효모 상의 재조합 개 OSMR-hFc1을 적정하고 유세포 분석기(비디 아큐리(BD Accuri))를 사용하여 결합된 분획을 판독함으로써 분류 가능한 조건을 발견하였다. 모 scFv 작제물을 디스플레이하는 효모 세포를 예상 표지 분율이 0.9가 될 때까지 충분한 표지 일수 동안 리간드 접근 방식을 디스플레이하기 위해 가변 체적 - 불변 단백질을 사용하여 적정하였다. 모든 농도에 대해 단백질 대 디스플레이 리간드 비는 적어도 10:1이었고, 조건 간에 일정하게 유지되었다. 세포를 닭 항-myc FITC 항체(아이씨엘랩(ICLlab)) 및 단백질 A - AlexaFlour 647로 염색하여 전장 디스플레이 및 재조합 단백질 결합을 각각 시각화하였다. FlowJo를 통해 계산된 전장 디스플레이 세포의 중앙값 647 형광을 사용하여 리간드 대 농도의 결합 프로파일을 계산하였다. 두 가지 라이브러리 분류를 위해 재조합 개 및 고양이 OSMR 모두에 100nM 리간드의 표지 농도를 사용하였다. 100㎛ 칩이 있는 순도 모드의 SH800(소니 바이오테크놀로지(Sony Biotechnology))에서 라이브러리의 분류를 수행하였다. 요컨대, 세포를 산란, 단일 세포, 전장 디스플레이에 게이팅한 다음 결합 대 디스플레이에 게이팅하였다. 결합 대 디스플레이 대각선 아래의 세포(즉, 디스플레이를 위해 정규화된 벌크 집단에 비해 감소된 결합을 갖는 변이체)를 수집하였다. 모든 종류에 대해 수집된 세포의 수는 이들 각각의 이론적인 라이브러리 크기의 67-배 범위보다 컸다.
Illumina 시퀀싱을 위해 분류 및 참조 라이브러리를 준비하고, 비동의성(non-synonymous) 변이체의 적어도 75-배 오버샘플링의 판독 깊이로 시퀀싱하였다(Kowalsky et al. (2015) PLOS ONE 10, e0118193). 분류 대 참조 라이브러리의 돌연변이 적합성 z-점수를 12의 참조 라이브러리 판독 수 임계값(read count threshold)을 사용하고 총 판독 수에서 설계되지 않은 변이체를 제외하는 PACT를 사용하여 계산하였다(Klesmith et al. (2019) Bioinformatics 35, 2707-2712). Z-점수는 야생형 동의성 코돈 농축의 분산으로 정규화된 야생형 로그2 농축에 비해 개별 돌연변이의 로그2 농축 비로 정의하였다([εi - εwt]/σwt,synon). 2.0의 z-점수 임계값을 사용하여 용인된(tolerated) 돌연변이로부터 결합을 감소시킨 분류를 통해 수집된 농축된 돌연변이를 분리하였다. 따라서, 용인된 돌연변이는 z-점수가 2.0 미만인 돌연변이로 정의하였다.
실시예 21. 개 및 고양이 OSMR에 대한 결합에 중요한 항 OSMR 항체 상의 아미노산 잔기를 결정하기 위한 YSD로부터의 결과
이러한 효모 디스플레이 실험으로부터의 결과는 항체 19F07의 CDR 결합 도메인에서 관련된 아미노산 잔기를 결정하기 위한 추가적인 접근법을 설명한다. 실시예 19에 기재된 바와 같이, 항체의 친화성 변화를 분석하는 각각의 독립적인 방법은 결합 및 해리 이벤트 동안 발생하는 실험적인 역학의 영향을 받는다. 항체 파라토프의 효모 디스플레이 돌연변이 분석은 항체의 결합 부분(ScFv)이 효모 세포의 표면에 디스플레이되어 표적 항원 단백질에 대한 접근을 허용하면서 세포 내 돌연변이를 암호화하는 유전자형 정보를 연결하는 유체상 환경에서 이루어진다. 이는 디스플레이되는 결합 단편의 물리적 특성과 가변 중쇄 및 경쇄 단편을 암호화하는 DNA 사이의 연결을 가능하게 한다. 이 방법은 CDR의 개별 위치에서 개별 돌연변이와 표적 단백질에 대한 결합의 커플링을 가능하게 할 뿐만 아니라 각 CDR의 개별 위치에서 모든 아미노산 돌연변이의 분석을 가능하게 한다. 이러한 데이터는 허용 가능한(결합 가능), 허용 불가능한(결합에 부정적인 영향) 또는 일부 상황에서 결합에 유리한(기능 돌연변이의 획득) 돌연변이를 결정할 수 있게 한다.
표 B는 효모 표면 디스플레이 실험의 결과에 따라 허용되는 항체 Mu_19F07의 CDR의 돌연변이를 설명한다. 각 위치에서의 모든 아미노산의 치환에 대한 데이터가 이 실험에서 도출되었지만, 이 표는 야생형 아미노산 대신 아미노산의 더 작은 서브세트가 허용되는 기재된 위치에서의 돌연변이만을 보여준다. 아미노산 치환이 거의(또는 전혀) 허용되지 않는 이러한 아미노산 위치는 (표적 OSMR 단백질에 결합하는 이 방법에 의해) 이러한 위치가 항체 CDR의 구조를 기능적 결과(OSMR에 대한 결합)에 연결하는 데 더 관련이 있음을 나타낸다. 알라닌 치환 ELISA 및 Biacore 실험으로부터의 결과와 함께, 이러한 항-OSMR 항체에 필요한 구조적 요소에 대한 보다 완전한 그림이 관찰된다.
Figure pct00099
표 B. 효모로부터의 결과는 각각의 표시된 위치에서 허용 가능한(결합을 허용하는) 치환을 나타내는 항체 19F07 상의 각 CDR의 돌연변이 분석을 나타낸다. 여기에 기재된 결과는 많은 허용 가능한 치환이 발생하는 위치가 아니라 결합에 영향을 미치는 제한된 수의 허용된 치환이 발생한 아미노산 위치에서의 돌연변이로부터 나온 것이다.
실시예 22. 항-OSMR 항체 결합과 관련된 OSMR 상의 아미노산 잔기를 결정하기 위한 YSD로부터의 결과
실시예 20은 개 및 고양이 OSMR과의 상호작용에 중요한 항체 19F07의 결합 파라토프 상의 아미노산 잔기를 결정하는 데 사용되는 방법을 설명한다. 유사한 방법을 사용하여 고양이 IL-31과 상호작용하는 고양이 OSMR 상의 아미노산 잔기를 결정하였다. 고양이 OSMR(서열번호 112(고양이_OSMR_hIgG1_Fc))을 이의 야생형 형태로 효모의 표면에 디스플레이하고, 고양이 IL-31(서열번호 125)에 대한 결합 조건을 최적화하였다. 기재된 바와 같이 고양이 OSMR의 돌연변이 라이브러리를 생성하고, 심층 시퀀싱과 결합된 유세포 분류를 수행하여 고양이 IL-31로 만들어진 관련 아미노산 접촉을 정의하는 고양이 OSMR 상의 돌연변이를 결정하였다. 이러한 데이터는 고양이 OSMR에 대한 고양이 IL-31의 결합에 대한 에피토프가 서열번호 112(데이터 미제시)의 류신 157(L157)과 페닐알라닌 229(F229) 사이에 위치한 고양이 OSMR 상의 영역임을 나타내었다. 이러한 데이터가 본 출원의 실시예 10에 제시된 상동성 모델을 뒷받침한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 이 상동성 모델은 개 및 고양이 OSM이 OSMR과 상호작용하는 영역을 설명한다. 본 명세서에 기재된 세포-기반 검정으로부터의 기능적 데이터는 이러한 선택한 항-OSMR 항체가 IL-31 및 OSM-매개성 pSTAT3 신호전달 둘 다에 저해 특성을 가짐을 나타내며, 이는 OSMR 단백질 상의 IL-31과 OSM의 결합 부위가 매우 근접함을 나타낸다. 이러한 매핑 데이터는 각각의 OSMR 단백질에 대한 개 및 고양이 OSM의 상동성 모델에 의해 제안된 바와 같은 고양이 OSMR에 대한 고양이 IL-31의 유사한 결합 부위를 실제로 뒷받침한다. 종합하면, 이러한 결과는 생체내에서 OSMR의 신호전달 기능을 저해하기 위해 항체의 결합에 필요한 개 및 고양이 OSMR 상의 관련 에피토프 공간에 대한 지식을 뒷받침한다.
실시예 23. 개 활막세포에서 개 OSM의 전염증성 역할
OSMR 신호전달에 대한 길항작용은 개 연골세포 및 개 관절-유래 활막세포에서 단핵구 화학유인물질 단백질-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1: MCP-1)의 하류 활성화를 저해하는 데 효과적이며, 시험관내 관절-유래 활막세포의 온코스타틴 M(OSM) 유도성 세포 증식을 현저하게 감소시켜 생체내 통증 및 염증의 감소를 위한 잠재적인 신규한 치료법을 나타내는 것으로 입증되었다. 항-OSMR 단일클론 항체는 개 및 고양이 골관절염(OA)과 관련된 통증 및 염증을 완화시키기 위해 OSM 신호전달을 차단하는 새로운 종류의 신규한 치료법을 나타낸다. 시험관내 효능을 결정하기 위해, 항-OSMR 항체를 증식 및 저해 세포-기반 검정에서 관절-유래 활막세포의 기능적 활성에 대해 평가하였다. CellTiter-GLO 발광 세포 생존능 검정 키트를 사용하여 개 OSM으로 유도된 세포 증식에 대한 항-OSMR mAb의 효과를 평가하였다. 일차 개 관절-유래 활막세포를 단리하고, STAT-3 경로를 활성화하고 STAT-5 및 STAT-1은 덜 활성화하여 OSM 자극에 대한 반응을 결정하였다. 개 관절-유래 활막세포는 콜라겐 유형-1 코팅된 플레이트에 도말하였을 때 24시간 및 72시간 내에 급속한 증식으로 OSM 자극에 반응한다(도 9a). 항-OSMR 항체 Mu_10F07은 개 관절-유래 활막세포에서 OSM-유도성 세포 증식을 강력하게 저해하였다(도 9b). 개 활막세포는 또한 활성 염증 부위에 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 및 T 세포를 동원하는 MCP-1을 빠르게 합성함으로써 OSM 자극에 반응한다(도 10a). 항-OSMR 항체 10F07은 개 OSM-유도성 MCP-1 합성을 용량-의존적으로 감소시켰다. 전반적으로, 이러한 시험관내 연구 결과는 신규한 항-OSMR 항체를 사용하여 OSMR 신호전달을 차단하는 항-염증성 역할과 관련된 기능적 활성을 확인하였다.
실시예 24. OSM의 섬유화 촉진 역할
개 및 고양이의 만성 신장 질환과 관련된 신장 섬유증에서 OSM의 역할을 조사하기 위해 개의 일차 개 신장 섬유아세포에서 MCP-1의 활성화를 결정하였다. 개 OSM(서열번호 109)은 72시간에 걸쳐 MCP-1 수준의 용량 의존적 증가를 보여주었다(도 11). 신장 섬유아세포에서 항-OSMR 항체를 사용한 이 화학유인물질 단백질의 차단은 섬유증 질환의 진행을 변경하는 데 유익할 수 있다.
실시예 25. IL-31-유도성 소양증의 개 모델에서 항-개 OSMR mAb의 평가
기준선 소양증 점수를 확립하기 위해 -7일 및 7일에 IL-31 시험 물질 투여 절차를 수행하였다. 개 재조합 IL-31의 스톡 농도로부터 정맥내 용액을 제조하였다. 연구 -7일 및 7일에 마지막 개에게 시험 투여를 한 후 모든 개에 대한 소양성 활동의 기록을 시작하였다. 치료 할당(treatment allocation)을 눈가림한 IL-31 시험 물질을 투여한 개체도 소양성 활동을 기록할 수 있었다.
다음 범주형 득점 시스템(categorical scoring system)을 사용하여 각 개에 대한 (시험 투여 기간 후) 소양증 점수를 결정하였다. 구체적으로, 연속적인 1-분 간격으로, 각 개가 소양성 행동을 나타내는지 여부에 관해 "예"/"아니오"를 결정하였다. 다음과 같은 소양성 행동의 표시는 관찰 기간 내에서 각각의 개별 1-분 시간 간격에 대해 "예" 응답을 이끌어내기에 충분하였다. 이러한 행동은 핥기 또는 씹기(예를 들어, 발, 옆구리, 꼬리, 항문 부위), 긁기(예를 들어, 옆구리 또는 목), 머리 흔들기 또는 몸 흔들기 및 신체의 일부를 문지르기(예를 들어, 케이지의 바닥/벽에)를 포함한다. 특정 1-분 간격으로 제공된 공간에 "예" 응답은 "1"로 표시하고, "아니오" 응답은 "0"으로 표시하였다. 예 응답의 누적 수를 소양증 점수로 결정하였다. 감시실의 각 펜 바로 위에 위치한 라이브 피드 카메라를 통해 채점자는 별도의 방에서 개를 관찰할 수 있었다. 각 채점자는 단일 모니터에 표시된 각 개에 대한 실시간 영상으로 4마리의 개를 동시에 관찰하였다. 120-분 동안 동물에 대한 시험 투여 후 소양증의 최대 가능 점수는 120이었다. 관찰 기간의 완료 후, 개는 정상적인 수용 장소로 돌려보냈다.
각 동물에 대한 소양증 점수는 분절 소양증 행동이 각 시점(-7일 및 7일)에 대해 관찰된 1-분 시간 세그먼트의 총 수로 계산하였다. 대응표본 t-검정을 사용하여 -7일과 7일 소양증 점수 사이의 평균 차이를 테스트하였다. 마우스:개 키메라 항-OSMR 항체 19F07(T01) 및 10F07(T02)을 12.0 ㎎/㎏의 단일 SC 주사로 투여하였으며, 소양성 반응을 투여 후 제7일에 관찰하였다. 도 12는 연구 -7일 및 연구 7일에 총 2-시간의 관찰 기간 동안 시험 투여 후 점수를 보여준다. 이들 결과는 키메라 19F07 및 10F07의 단일 피하 12 ㎎/㎏ 투여가 연구 -7일에 기록된 소양증 점수와 비교하여 IL-31 유도성 소양증의 개 모델에서 연구 7일에 상당히 더 낮은 총 소양증 점수를 나타냄을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Zoetis Services LLC <120> ANTIBODIES TO CANINE AND FELINE ONCOSTATIN M RECEPTOR BETA AND USES THEREOF <130> ZP000355A <140> PCT/US2021/055366 <141> 2021-10-18 <150> US 63/093,607 <151> 2020-10-19 <160> 136 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Tyr Gly Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Arg Ala Val Phe Phe Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asp Arg Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Tyr Ile Ser Ser Gly 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Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Ile Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 62 <211> 354 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 62 gaagtacaac ttgtggagag cgggggcgac ttggttaagc ctgcgggatc tttgaccttg 60 tcctgtctgg cttcaggctt tacctttagt agttacgcca tgagttgggt ccggcaaacc 120 ccggaaaagg ggctgcagtg ggtagcttat ataagttccg ggggggatta tatctactat 180 gctgacaccg tcaagggacg cttcacaata agccgagata atgcaaaaaa tacactgtac 240 ctccagatga atagcctgcg agacgaggac actgccgtct attattgtgc tcgagaccca 300 ataacgggaa cttttgcgta ttggggtcaa ggcacactgg ttactgtctc gagc 354 <210> 63 <211> 102 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 63 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 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Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Leu Thr Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 92 <211> 351 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 92 gaggtacagc ttgtggaatc tgggggggat ttggtaaagc ctggcggttc cctgcgcctc 60 tcctgtgtgg cctcaggttt caccttttca gactactaca tggcgtgggt gcgccaggca 120 cccggaaaag gtctccaatg ggttgcaaat atcaattatg acggttcttc aacatactac 180 ttggactcac ttaagtctcg gtttactatt agtcgggaca atgctaaaaa taccttgtat 240 ttgcagatga actcactccg ggcggaggac acggcgatgt attactgtgt tcgcggtctt 300 acatgggact tcgatgtttg ggggcagggt acactcgtta cagtctcgag c 351 <210> 93 <211> 102 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 93 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 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catus <400> 101 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 102 <211> 306 <212> DNA <213> Felis catus <400> 102 gaaattcaaa tgactcaatc accgtcatcc ttgtccgcca gccccggcga cagggtaaca 60 ataacttgta aggccagcca agatgtagat acggcggtag cgtggtatca acagaagccg 120 ggtaaggttc caaagctgct gatctatctc gcatccacca gacatacagg tgttccatcc 180 cgctttagcg ggtccggttc cggcactgat ttcaccctta ccatttccag tctggagccg 240 gaggacgctg ctacctatta ttgtcaacag tattcccgct tcccccttac ctttggacag 300 ggtacc 306 <210> 103 <211> 117 <212> PRT <213> Felis catus <400> 103 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 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Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Val Gln 35 40 45 Asn Lys Gly Ile Gln Glu Ser Thr Thr Glu Gln Asn Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Gln 65 70 75 80 Ser His Glu Lys Phe Ser Cys Glu Val Thr His Lys Ser Leu Ala Ser 85 90 95 Thr Leu Val Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Glu 100 105 110 <210> 121 <211> 330 <212> DNA <213> Felis catus <400> 121 cggagtgatg ctcagccatc tgtctttctc ttccaaccat ctctggacga gttacataca 60 ggaagtgcct ctatcgtgtg catattgaat gacttctacc ccaaagaggt caatgtcaag 120 tggaaagtgg atggcgtagt ccaaaacaaa ggcatccagg agagcaccac agagcagaac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacga tgtccagtac ggagtaccaa 240 agtcatgaaa agttctcctg cgaggtcact cacaagagcc tggcctccac cctcgtcaag 300 agcttccaga ggagcgagtg tcagagagag 330 <210> 122 <211> 739 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Met Ala Leu Phe Ala Val Phe Gln Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu 20 25 30 Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gln Ser Leu 35 40 45 His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln Glu Leu Lys 50 55 60 Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile 65 70 75 80 Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln Val Leu His 85 90 95 Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val 100 105 110 Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe 115 120 125 Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln Asp Ser Thr 130 135 140 Gly Gln Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu 145 150 155 160 Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile Gln Asn Asn 165 170 175 Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gln Ile His Gly Glu Gln Leu Asp 180 185 190 Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe Ile Arg Asn 195 200 205 Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gln Gly Asn Val Ser Glu 210 215 220 Gly Met Lys Gly Ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro 225 230 235 240 Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu His Cys Thr 245 250 255 Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gln Pro Ser 260 265 270 Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys Lys Leu Cys 275 280 285 Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gln Ile Thr Gln Asp Ser Gln Glu 290 295 300 Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser 305 310 315 320 Val Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu Met Asn Pro 325 330 335 Phe Ser Val Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala Ile Met Thr 340 345 350 Trp Lys Val His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu Cys Gln Ile 355 360 365 Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gln Tyr Asn Val Ser Ile Lys 370 375 380 Val Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr 385 390 395 400 Met Ala Arg Val Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp Lys Trp Ser 405 410 415 Glu Trp Ser Gly Gln Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu 420 425 430 Ala Pro Asp Val Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly Asn His Thr 435 440 445 Val Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala Asn Gly Lys 450 455 460 Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys Pro Ser Ser 465 470 475 480 Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr Lys Leu Ile 485 490 495 Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gln Ile Cys Val Ile Ala Asn Asn Ser Val 500 505 510 Gly Ala Ser Pro Ala Ser Val Ile Val Ile Ser Ala Asp Pro Glu Asn 515 520 525 Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phe Ser 530 535 540 Leu Ser Trp Lys Pro Gln Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp 545 550 555 560 Trp Cys Asp His Thr Gln Asp Val Leu Gly Asp Phe Gln Trp Lys Asn 565 570 575 Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg 580 585 590 Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg 595 600 605 Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gln Glu Leu Ala 610 615 620 Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr Ser His Ser 625 630 635 640 Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gln Pro Gly Phe 645 650 655 Ile Gln Gly Tyr His Val Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gln Cys His 660 665 670 Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys 675 680 685 Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val Asp Asn Leu 690 695 700 Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe Thr Ser Ala 705 710 715 720 Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu 725 730 735 His Ser Ser <210> 123 <211> 159 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 123 Met Leu Ser His Thr Gly Pro Ser Arg Phe Ala Leu Phe Leu Leu Cys 1 5 10 15 Ser Met Glu Thr Leu Leu Ser Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu 20 25 30 Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser 35 40 45 Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu 50 55 60 Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro 65 70 75 80 Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro 85 90 95 Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp 115 120 125 Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser 130 135 140 Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln 145 150 155 <210> 124 <211> 477 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 124 atgctctccc acacaggacc atccaggttt gccctgttcc tgctctgctc tatggaaacc 60 ttgctgtcct cccatatggc acccacccat cagctaccac caagtgatgt acgaaaaatc 120 atcttggaat tacagccctt gtcgagggga cttttggaag actatcagaa gaaagagaca 180 ggggtgccag aatccaaccg taccttgctg ctgtgtctca cctctgattc ccaaccacca 240 cgcctcaaca gctcagccat cttgccttat ttcagggcaa tcagaccatt atcagataag 300 aacattattg ataaaatcat agaacagctt gacaaactca aatttcaaca tgaaccagaa 360 acagaaattt ctgtgcctgc agatactttt gaatgtaaaa gcttcatctt gacgatttta 420 cagcagttct cggcgtgcct ggaaagtgtg tttaagtcac taaactctgg acctcag 477 <210> 125 <211> 165 <212> PRT <213> Felis catus <400> 125 Met Leu Ser His Ala Gly Pro Ala Arg Phe Ala Leu Phe Leu Leu Cys 1 5 10 15 Cys Met Glu Thr Leu Leu Pro Ser His Met Ala Pro Ala His Arg Leu 20 25 30 Gln Pro Ser Asp Ile Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Arg Pro Met Ser 35 40 45 Lys Gly Leu Leu Gln Asp Tyr Leu Lys Lys Glu Ile Gly Leu Pro Glu 50 55 60 Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser Ser Asp Ser Gln Leu Pro 65 70 75 80 His Ile Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro 85 90 95 Leu Ser Asp Lys Asn Thr Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Leu Lys Phe Gln Arg Glu Pro Glu Ala Lys Val Ser Met Pro Ala Asp 115 120 125 Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe Ile Leu Ala Val Leu Gln Gln Phe Ser 130 135 140 Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gln Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln His 145 150 155 160 His His His His His 165 <210> 126 <211> 495 <212> DNA <213> Felis catus <400> 126 atgctttcac acgctggacc agcccgattc gccctcttcc tcctctgctg tatggagact 60 ctgttgccgt cccacatggc cccggcacat aggctgcagc cgtctgacat ccggaagatc 120 attctcgaac ttcgccccat gtcgaagggg ttgctgcaag actacctgaa gaaggagatc 180 ggcctgcccg aaagcaacca ctcctcgctg ccttgcctgt caagcgattc ccagctgccc 240 cacattaacg gttccgccat cctcccgtac ttccgggcca tcagaccact gtcggacaag 300 aacaccatcg acaagatcat tgaacagctg gacaagctga agtttcagcg cgagcctgaa 360 gccaaagtgt ccatgcccgc cgataacttc gagcggaaga atttcattct cgcggtgctg 420 cagcagttct ccgcgtgcct ggagcacgtc ctgcaatccc tgaacagcgg acctcagcac 480 caccatcacc accat 495 <210> 127 <211> 121 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 127 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Tyr Pro Gly His Val Asn Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ala Asp Asn Ser Gly Phe Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 128 <211> 363 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 128 gaggtgcagc ttgtagagag tgggggcgac ttggttaagc caggcgggag tttgcgcttg 60 agctgcgtag cgagcggctt cacctttagt aattattgga tgaactgggt gaggcaggcc 120 ccaggaaaag gtctgcagtg ggtcgcccaa atatacccag gccatgtgaa cacaaattat 180 aacggtaatt tcaaagatag gtttacaata tctcgggaca atgcccgcaa cacggtttat 240 ctgcaaatga atagcctgag ggccgaagac acggcggttt attattgtgc taggagcgct 300 gacaacagcg gcttcgtgct gtttgcctac tggggacaag gcactctcgt gaccgtctcg 360 agc 363 <210> 129 <211> 121 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 129 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Tyr Pro Gly His Val Asn Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ala Asp Asn Ser Gly Phe Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 130 <211> 363 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 130 gaagtccagt tggtcgaatc aggcggggac cttgtcaaac caggtggtag cttgcgcctc 60 tcatgcgtgg cgtccggttt tactttttcc aattactgga tgaactgggt ccgacagtcc 120 cccggcaaag ggttgcaatg ggtagcacaa atatatccag ggcacgtaaa caccaactat 180 aatggcaact tcaaggatag gtttactatt agcagggaca acgccaaaaa cacactgtat 240 ctgcaaatga actctcttcg cgctgaagac accgccgttt atttttgtgc gcggagcgcc 300 gacaattccg gctttgtcct tttcgcttat tggggtcagg gtacattggt gacagtctcg 360 agc 363 <210> 131 <211> 106 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 131 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 105 <210> 132 <211> 318 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 132 gaaatagtga tgactcagag ccctgctagt ctctctttgt cacaagagga aaaggtaact 60 attacgtgtc gggcaagtaa gagtgtttcc acaagcggtt actcttattt gcattggtat 120 caacaaaaac ctggacaggc acctaagctg cttatctatc tggccagcaa cttggagtca 180 ggcgtcccgt cccgcttctc aggaagcggc agtggcactg acttttcctt caccatctct 240 tcccttgaac ctgaggacgt ggcggtgtac tactgtcagc attcacggga gctgccactg 300 acattcggcc aaggtacc 318 <210> 133 <211> 106 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 133 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Ser Lys 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Asp Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 105 <210> 134 <211> 318 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 134 gatatagtta tgacacagac tccgctctcc ctcagtgtga gccctgggga aaccgccagt 60 atatcatgcc gggcatccaa aagtgtcagc acttcaggct acagttattt gcattggtat 120 cttcagaaac cgggacagag cccgcagctc ttgatctatt tggcttccaa cctggaaagc 180 ggagtttcta agcgcttttc aggttccggg agcgggacgg atttcacact tcggatctct 240 agagtggaag ccgatgatac tggaatctat tactgtcagc acagtagaga actccctctc 300 acattcgggc agggtacc 318 <210> 135 <211> 789 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Gln Lys Lys Gly Ala Pro His Asp Leu Lys Cys Val Thr Asn Asn Leu 1 5 10 15 Gln Val Trp Asn Cys Ser Trp Lys Ala Pro Ser Gly Thr Gly Arg Gly 20 25 30 Thr Asp Tyr Glu Val Cys Ile Glu Asn Arg Ser Arg Ser Cys Tyr Gln 35 40 45 Leu Glu Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ala Leu Ser His Gly Asp Tyr 50 55 60 Glu Ile Thr Ile Asn Ser Leu His Asp Phe Gly Ser Ser Thr Ser Lys 65 70 75 80 Phe Thr Leu Asn Glu Gln Asn Val Ser Leu Ile Pro Asp Thr Pro Glu 85 90 95 Ile Leu Asn Leu Ser Ala Asp Phe Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Leu Lys 100 105 110 Trp Asn Asp Arg Gly Ser Val Phe Pro His Arg Ser Asn Val Ile Trp 115 120 125 Glu Ile Lys Val Leu Arg Lys Glu Ser Met Glu Leu Val Lys Leu Val 130 135 140 Thr His Asn Thr Thr Leu Asn Gly Lys Asp Thr Leu His His Trp Ser 145 150 155 160 Trp Ala Ser Asp Met Pro Leu Glu Cys Ala Ile His Phe Val Glu Ile 165 170 175 Arg Cys Tyr Ile Asp Asn Leu His Phe Ser Gly Leu Glu Glu Trp Ser 180 185 190 Asp Trp Ser Pro Val Lys Asn Ile Ser Trp Ile Pro Asp Ser Gln Thr 195 200 205 Lys Val Phe Pro Gln Asp Lys Val Ile Leu Val Gly Ser Asp Ile Thr 210 215 220 Phe Cys Cys Val Ser Gln Glu Lys Val Leu Ser Ala Leu Ile Gly His 225 230 235 240 Thr Asn Cys Pro Leu Ile His Leu Asp Gly Glu Asn Val Ala Ile Lys 245 250 255 Ile Arg Asn Ile Ser Val Ser Ala Ser Ser Gly Thr Asn Val Val Phe 260 265 270 Thr Thr Glu Asp Asn Ile Phe Gly Thr Val Ile Phe Ala Gly Tyr Pro 275 280 285 Pro Asp Thr Pro Gln Gln Leu Asn Cys Glu Thr His Asp Leu Lys Glu 290 295 300 Ile Ile Cys Ser Trp Asn Pro Gly Arg Val Thr Ala Leu Val Gly Pro 305 310 315 320 Arg Ala Thr Ser Tyr Thr Leu Val Glu Ser Phe Ser Gly Lys Tyr Val 325 330 335 Arg Leu Lys Arg Ala Glu Ala Pro Thr Asn Glu Ser Tyr Gln Leu Leu 340 345 350 Phe Gln Met Leu Pro Asn Gln Glu Ile Tyr Asn Phe Thr Leu Asn Ala 355 360 365 His Asn Pro Leu Gly Arg Ser Gln Ser Thr Ile Leu Val Asn Ile Thr 370 375 380 Glu Lys Val Tyr Pro His Thr Pro Thr Ser Phe Lys Val Lys Asp Ile 385 390 395 400 Asn Ser Thr Ala Val Lys Leu Ser Trp His Leu Pro Gly Asn Phe Ala 405 410 415 Lys Ile Asn Phe Leu Cys Glu Ile Glu Ile Lys Lys Ser Asn Ser Val 420 425 430 Gln Glu Gln Arg Asn Val Thr Ile Lys Gly Val Glu Asn Ser Ser Tyr 435 440 445 Leu Val Ala Leu Asp Lys Leu Asn Pro Tyr Thr Leu Tyr Thr Phe Arg 450 455 460 Ile Arg Cys Ser Thr Glu Thr Phe Trp Lys Trp Ser Lys Trp Ser Asn 465 470 475 480 Lys Lys Gln His Leu Thr Thr Glu Ala Ser Pro Ser Lys Gly Pro Asp 485 490 495 Thr Trp Arg Glu Trp Ser Ser Asp Gly Lys Asn Leu Ile Ile Tyr Trp 500 505 510 Lys Pro Leu Pro Ile Asn Glu Ala Asn Gly Lys Ile Leu Ser Tyr Asn 515 520 525 Val Ser Cys Ser Ser Asp Glu Glu Thr Gln Ser Leu Ser Glu Ile Pro 530 535 540 Asp Pro Gln His Lys Ala Glu Ile Arg Leu Asp Lys Asn Asp Tyr Ile 545 550 555 560 Ile Ser Val Val Ala Lys Asn Ser Val Gly Ser Ser Pro Pro Ser Lys 565 570 575 Ile Ala Ser Met Glu Ile Pro Asn Asp Asp Leu Lys Ile Glu Gln Val 580 585 590 Val Gly Met Gly Lys Gly Ile Leu Leu Thr Trp His Tyr Asp Pro Asn 595 600 605 Met Thr Cys Asp Tyr Val Ile Lys Trp Cys Asn Ser Ser Arg Ser Glu 610 615 620 Pro Cys Leu Met Asp Trp Arg Lys Val Pro Ser Asn Ser Thr Glu Thr 625 630 635 640 Val Ile Glu Ser Asp Glu Phe Arg Pro Gly Ile Arg Tyr Asn Phe Phe 645 650 655 Leu Tyr Gly Cys Arg Asn Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Arg Ser Met Ile 660 665 670 Gly Tyr Ile Glu Glu Leu Ala Pro Ile Val Ala Pro Asn Phe Thr Val 675 680 685 Glu Asp Thr Ser Ala Asp Ser Ile Leu Val Lys Trp Glu Asp Ile Pro 690 695 700 Val Glu Glu Leu Arg Gly Phe Leu Arg Gly Tyr Leu Phe Tyr Phe Gly 705 710 715 720 Lys Gly Glu Arg Asp Thr Ser Lys Met Arg Val Leu Glu Ser Gly Arg 725 730 735 Ser Asp Ile Lys Val Lys Asn Ile Thr Asp Ile Ser Gln Lys Thr Leu 740 745 750 Arg Ile Ala Asp Leu Gln Gly Lys Thr Ser Tyr His Leu Val Leu Arg 755 760 765 Ala Tyr Thr Asp Gly Gly Val Gly Pro Glu Lys Ser Met Tyr Val Val 770 775 780 Thr Lys Glu Asn Ser 785 <210> 136 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala Thr Cys Ala Ile Arg His 1 5 10 15 Pro Cys His Asn Asn Leu Met Asn Gln Ile Arg Ser Gln Leu Ala Gln 20 25 30 Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln 35 40 45 Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys Leu Cys Gly Pro Asn Val 50 55 60 Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly Thr Glu Lys Ala Lys Leu 65 70 75 80 Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Val Tyr Leu Gly Thr Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Thr Arg Asp Gln Lys Ile Leu Asn Pro Ser Ala Leu Ser Leu His 100 105 110 Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Ile Leu Arg Gly Leu Leu Ser Asn 115 120 125 Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His Val Gly His Val Asp Val 130 135 140 Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp Val Phe Gln Lys Lys Lys 145 150 155 160 Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Gln Ile Ile Ala Val Leu 165 170 175 Ala Gln Ala Phe 180

Claims (33)

  1. 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 개 또는 고양이 온코스타틴 M 수용체 베타(OSMR-β) 또는 둘 다에 특이적으로 결합하되, 상기 항체는 개 및/또는 고양이 세포에서 IL-31-매개성 신호전달 또는 OSM-매개성 신호전달 또는 둘 다를 길항하는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 개 및/또는 고양이 세포에서 IL-31-매개성 신호전달 및 OSM-매개성 신호전달 둘 다를 길항하는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역(complementary determining region: CDR) 서열의 조합을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
    1) 02D09: 서열번호 1의 가변 중쇄(VH)-CDR1(DYGMH), 서열번호 2의 VH-CDR2(YISSGSRAVFFADTVKG), 서열번호 3의 VH-CDR3(DRYDGRGFAY), 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
    2) 09E09: 서열번호 7의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 8의 VH-CDR2(YISSGGDYIYYADTVKG), 서열번호 9의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
    3) 10F07: 서열번호 13의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 14의 VH-CDR2(YISSGGDYFYYADTVKG), 서열번호 15의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
    4) 14C04: 서열번호 19의 VH-CDR1(NYWMN), 서열번호 20의 VH-CDR2(QIYPGHVNTNYNGNFKD), 서열번호 21의 VH-CDR3(SADNSGFVLFAY), 서열번호 22의 VL-CDR1(RASKSVSTSGYSYLH), 서열번호 23의 VL-CDR2(LASNLES) 및 서열번호 24의 VL-CDR3(QHSRELPLT);
    5) 19F07: 서열번호 25의 VH-CDR1(DYYMA), 서열번호 26의 VH-CDR2(NINYDGSSTYYLDSLKS), 서열번호 27의 VH-CDR3(GLTWDFDV), 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT); 또는
    6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 적어도 하나를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분:
    (c) 다음을 포함하는 가변 중쇄
    서열번호 31(MU_02D09_VH)
    Figure pct00100

    서열번호 35(MU_09E09_VH)
    Figure pct00101

    서열번호 39(MU_10F07_VH)
    Figure pct00102

    서열번호 43(MU_14C04_VH)
    Figure pct00103

    서열번호 47(MU_19F07_VH)
    Figure pct00104

    서열번호 51(FEL_02D09_VH1)
    Figure pct00105

    서열번호 53(FEL_02D09_VH2)
    Figure pct00106

    서열번호 59(CAN_09E09_VH1)
    Figure pct00107

    서열번호 61(CAN_09E09_VH2)
    Figure pct00108

    서열번호 67(FEL_09E09_VH1)
    Figure pct00109

    서열번호 69(FEL_09E09_VH2)
    Figure pct00110

    서열번호 75(CAN_10F07_VH1)
    Figure pct00111

    서열번호 79(CAN_10F07_VH2)
    Figure pct00112

    서열번호 83(FEL_10F07_VH1)
    Figure pct00113

    서열번호 87(FEL_10F07_VH2)
    Figure pct00114

    서열번호 91(CAN_19F07_VH1)
    Figure pct00115

    서열번호 95(CAN_19F07_VH2)
    Figure pct00116

    서열번호 99(FEL_19F07_VH1)
    Figure pct00117

    서열번호 103(FEL_19F07_VH2)
    Figure pct00118

    서열번호 127(CAN_14C04_VH1)
    Figure pct00119
    또는
    서열번호 129(CAN_14C04_VH2)
    Figure pct00120
    및
    (d) 다음을 포함하는 가변 경쇄
    서열번호 33(MU_02D09_VL)
    Figure pct00121

    서열번호 37(MU_09E09_VL)
    Figure pct00122

    서열번호 41(MU_10F07_VL)
    Figure pct00123

    서열번호 45(MU_14C04_VL)
    Figure pct00124

    서열번호 49(MU_19F07_VL)
    Figure pct00125

    서열번호 55(FEL_02D09_VL1)
    Figure pct00126

    서열번호 57(FEL_02D09_VL2)
    Figure pct00127

    서열번호 63(CAN_09E09_VL1)
    Figure pct00128

    서열번호 65(CAN_09E09_VL2)
    Figure pct00129

    서열번호 71(FEL_09E09_VL1)
    Figure pct00130

    서열번호 73(FEL_09E09_VL2)
    Figure pct00131

    서열번호 77(CAN_10F07_VL1)
    Figure pct00132

    서열번호 81(CAN_10F07_VL2)
    Figure pct00133

    서열번호 85(FEL_10F07_VL1)
    Figure pct00134

    서열번호 89(FEL_10F07_VL2)
    Figure pct00135

    서열번호 93(CAN_19F07_VL1)
    Figure pct00136

    서열번호 97(CAN_19F07_VL2)
    Figure pct00137

    서열번호 101(FEL_19F07_VL1)
    Figure pct00138

    서열번호 105(FEL_19F07_VL2)
    Figure pct00139

    서열번호 131(CAN_14C04_VL1)
    Figure pct00140
    또는
    서열번호 133(CAN_14C04_VL2)
    Figure pct00141
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라인, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 개화되거나 고양이화된, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 개 또는 고양이에서 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 소양성 또는 알레르기성 병태를 저해하거나 중화하는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  8. 제7항에 있어서, 상기 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 소양성 병태는 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  9. 제8항에 있어서, 상기 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 알레르기성 병태는 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 종창, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐색, 기도 과민반응성, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 자가면역으로 인한 염증성 과정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 섬유증 또는 염증성 장애를 저해하는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  11. 제10항에 있어서, 상기 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 섬유증 장애는 신장 섬유증, 폐 섬유증 및 피부 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  12. 제10항에 있어서, 상기 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 염증성 장애는 자가면역으로 인한 염증성 과정, 골관절염에 의해 영향을 받는 동물의 피부 또는 관절의 염증, 면역-매개성 다발성 관절염, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 화농창상성 피부염, 죽상동맥경화증 및 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 염증성 통증을 감소시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  14. 제13항에 있어서, 상기 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 염증성 통증은 골관절염 통증인, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  15. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 수의학적 조성물.
  16. 대상체에서 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 장애를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 장애는 소양성 병태, 알레르기성 병태, 섬유증 장애, 염증성 장애 및 염증성 통증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 소양성 병태는 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 알레르기성 병태는 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 종창, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐색, 기도 과민반응성, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 자가면역으로 인한 염증성 과정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 섬유증 장애는 신장 섬유증, 폐 섬유증 및 피부 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 염증성 장애는 자가면역으로 인한 염증성 과정, 골관절염에 의해 영향을 받는 동물의 피부 또는 관절의 염증, 면역-매개성 다발성 관절염, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 화농창상성 피부염, 죽상동맥경화증 및 심혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 IL-31-매개성 또는 OSM-매개성 염증성 통증은 골관절염 통증인, 방법.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 개 또는 고양이인, 방법.
  24. 개 또는 고양이에서 IL-31 및/또는 OSM 활성을 저해하는 방법으로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 상기 개 또는 고양이에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 샘플에서 OSMR 베타를 검출하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체의 존재하에 OSMR 베타를 포함하는 샘플을 인큐베이션하는 단계; 및
    b) 상기 샘플에서 OSMR 베타에 결합한 상기 항체를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 항체는 표지를 포함하는, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 샘플에서 OSMR 베타를 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 다음 조합 중 적어도 하나를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하는 숙주 세포:
    1) 02D09: 서열번호 1의 가변 중쇄(VH)-CDR1(DYGMH), 서열번호 2의 VH-CDR2(YISSGSRAVFFADTVKG), 서열번호 3의 VH-CDR3(DRYDGRGFAY), 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
    2) 09E09: 서열번호 7의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 8의 VH-CDR2(YISSGGDYIYYADTVKG), 서열번호 9의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
    3) 10F07: 서열번호 13의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 14의 VH-CDR2(YISSGGDYFYYADTVKG), 서열번호 15의 VH-CDR3(DPITGTFAY), 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
    4) 14C04: 서열번호 19의 VH-CDR1(NYWMN), 서열번호 20의 VH-CDR2(QIYPGHVNTNYNGNFKD), 서열번호 21의 VH-CDR3(SADNSGFVLFAY), 서열번호 22의 VL-CDR1(RASKSVSTSGYSYLH), 서열번호 23의 VL-CDR2(LASNLES) 및 서열번호 24의 VL-CDR3(QHSRELPLT);
    5) 19F07: 서열번호 25의 VH-CDR1(DYYMA), 서열번호 26의 VH-CDR2(NINYDGSSTYYLDSLKS), 서열번호 27의 VH-CDR3(GLTWDFDV), 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT); 또는
    6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
  29. 상보성 결정 영역(CDR) 서열의 다음 조합 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산:
    1) 02D09: 서열번호 1의 가변 중쇄(VH)-CDR1(DYGMH), 서열번호 2의 VH-CDR2(YISSGSRAVFFADTVKG) 및 서열번호 3의 VH-CDR3(DRYDGRGFAY);
    2) 09E09: 서열번호 7의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 8의 VH-CDR2(YISSGGDYIYYADTVKG) 및 서열번호 9의 VH-CDR3(DPITGTFAY);
    3) 10F07: 서열번호 13의 VH-CDR1(SYAMS), 서열번호 14의 VH-CDR2(YISSGGDYFYYADTVKG) 및 서열번호 15의 VH-CDR3(DPITGTFAY);
    4) 14C04: 서열번호 19의 VH-CDR1(NYWMN), 서열번호 20의 VH-CDR2(QIYPGHVNTNYNGNFKD) 및 서열번호 21의 VH-CDR3(SADNSGFVLFAY);
    5) 19F07: 서열번호 25의 VH-CDR1(DYYMA), 서열번호 26의 VH-CDR2(NINYDGSSTYYLDSLKS) 및 서열번호 27의 VH-CDR3(GLTWDFDV); 또는
    6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
  30. 제29항에 있어서, CDR 서열의 다음 조합 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 핵산:
    1) 02D09: 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
    2) 09E09: 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
    3) 10F07: 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
    4) 14C04: 서열번호 22의 VL-CDR1(RASKSVSTSGYSYLH), 서열번호 23의 VL-CDR2(LASNLES) 및 서열번호 24의 VL-CDR3(QHSRELPLT);
    5) 19F07: 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT); 또는
    6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
  31. CDR 서열의 다음 조합 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산 서열:
    1) 02D09: 서열번호 4의 가변 경쇄(VL)-CDR1(RASQSISNNLH), 서열번호 5의 VL-CDR2(YASQSIS) 및 서열번호 6의 VL-CDR3(QQSNSWPLT);
    2) 09E09: 서열번호 10의 VL-CDR1(RASQDINNYLN), 서열번호 11의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 12의 VL-CDR3(QQGNTLPWT);
    3) 10F07: 서열번호 16의 VL-CDR1(RASQDITNYLN), 서열번호 17의 VL-CDR2(YTSTLHS) 및 서열번호 18의 VL-CDR3(QQGHMLPWT);
    4) 14C04: 서열번호 22의 VL-CDR1(RASKSVSTSGYSYLH), 서열번호 23의 VL-CDR2(LASNLES) 및 서열번호 24의 VL-CDR3(QHSRELPLT);
    5) 19F07: 서열번호 28의 VL-CDR1(KASQDVDTAVA), 서열번호 29의 VL-CDR2(LASTRHT) 및 서열번호 30의 VL-CDR3(QQYSRFPLT); 또는
    6) 1), 2), 3), 4) 또는 5)의 CDR 변이체.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  33. 항체의 생산을 초래하는 조건하에 제28항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포의 배양 배지로부터 상기 항체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
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