ES2716241T3 - Isoformas de BARD1 en cáncer de pulmón y colorrectal y su uso - Google Patents

Isoformas de BARD1 en cáncer de pulmón y colorrectal y su uso Download PDF

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Abstract

Método para detectar la presencia de una isoforma de BARD1 específica de cáncer de pulmón en una muestra biológica que se ha obtenido a partir de un sujeto que comprende el paso de detección, en dicha muestra, de al menos una de las isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón seleccionadas del grupo que comprende la isoforma π que comprende la SEC ID N.º: 1, y una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC ID N.º: 1, donde la presencia de dichas isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón en una muestra de dicho sujeto es una indicación de que dicho sujeto padece cáncer de pulmón, tiene un mayor riesgo 10 de cáncer de pulmón y/o tiene un riesgo de recurrencia después de un tratamiento para el cáncer de pulmón.

Description

Isoformas de BARD1 en cáncer de pulmón y colorrectal y su uso
Campo de la invención
[0001] La presente invención se refiere a nuevas isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón y cáncer colorrectal, un método para su detección y un método para tratar y/o prevenir el cáncer de pulmón y el cáncer colorrectal.
Antecedentes de la invención
[0002] El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer a nivel mundial. Los métodos de tratamiento distintos de la cirugía no son muy eficientes y llevan a la resistencia. Así, se necesitan urgentemente revelaciones sobre la etiología del cáncer de pulmón y su progresión. El cáncer colorrectal es otra causa principal de muerte relacionada con el cáncer y el cuarto cáncer más común a nivel mundial. La supervivencia y el pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal dependen del estadio del tumor en el momento del diagnóstico. Los estadios tempranos de cáncer colorrectal pueden ser curables. Desafortunadamente, más del 57% tienen una extensión regional o distante de la enfermedad en el momento del diagnóstico. A pesar de la inversión y los avances en la gestión del cáncer significativos, la supervivencia a los cinco años solo es de un 15% para los pacientes con cáncer colorrectal en estadio avanzado.
[0003] Recientemente, muchos grupos han abordado los mecanismos que conducen al cáncer de pulmón comparando proteínas, ARN y microARN en tumores con tejido sano. Además del TP53, el gen eliminado o mutado más frecuentemente en el cáncer de pulmón, los componentes de la vía p53-ARF también están eliminados, mutados o modificados epigenéticamente de manera consistente. En cuanto al cáncer colorrectal, los desafíos son entender la base molecular y determinar los factores que inician el desarrollo y potencian la progresión. Los eventos moleculares implicados en el comienzo del cáncer colorrectal y la progresión metastásica se han aclarado solo parcialmente. Estudios recientes han revelado el uso potencial de marcadores moleculares y bioquímicos en el cáncer colorrectal para predecir los resultados y la respuesta a la quimioterapia, como MLH1, MSH2, p-catenina y p53.
[0004] Los perfiles moleculares están emergiendo como parámetros predictivos y pronósticos en el carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM), incluyendo los genes implicados en la reparación de daños en el ADN, tales como ERCC1, RRM1 y BRCA1. La expresión sobrerregulada del gen de predisposición al cáncer de mama, BRCA1, se propuso como marcador pronóstico y predictivo para la respuesta al tratamiento en el CPNM. Con respecto al cáncer colorrectal, los estudios de BRCA1 se limitan principalmente al riesgo de cáncer colorrectal y mutaciones de BRCA1. Varios estudios intentaron correlacionar las mutaciones de BRCA1 y el riesgo de cáncer colorrectal, pero sin ninguna conclusión clara. En base a la limitada evidencia actual disponible, los portadores de una mutación de BRCA deberían considerarse con alto riesgo de cáncer colorrectal. Sin embargo, el papel específico de la expresión de BRCA1 en el cáncer colorrectal no está claro.
[0005] BRCA1 se expresa en muchos tejidos proliferantes y actúa como supresor tumoral en vías de reparación del ADN y control del ciclo celular. La estabilidad y la función de la proteína BRCA1 dependen de su interacción con BARD1 (proteína 1 de dominio de RING asociado a BRCA1). El heterodímero BRCA1-BARD1 tiene actividad ubiquitina ligasa E3, por lo que controla así la estabilidad de proteínas diana clave a través de la ubiquitinación. BARD1 está implicada también en la apoptosis dependiente de p53, que es deficiente en la mayoría de los cánceres de pulmón. BARD1 estabiliza a p53 y promueve su fosforilación, y se requiere la expresión de BARD1 para el funcionamiento apropiado de p53 en la señalización hacia la apoptosis. Así, BARD1 juega un papel doble en la supresión tumoral, como una pareja de unión tanto de BRCA1 como de p53. Varios estudios han mostrado que BARD1 está sobrerregulada durante la mitosis, transcripcionalmente por E2F y postraduccionalmente por fosforilación, y de manera importante, que es esencial para la mitosis. Según otros estudios, se demostró que tanto BRCA1 como BARD1 interactúan con hMSH2, un gen comúnmente asociado al cáncer colorrectal hereditario no asociado a poliposis (CCHNP), y las mutaciones de hMSH2 parecen ser la causa de aproximadamente el 30-40% de los CCHNP. Los defectos en el proceso de señalización BRCA1-hMSH2 llevan a una susceptibilidad aumentada a la tumorigénesis.
identiicados en ensayos de cribado basados en la uni n a la protena de c ncer de mama, BR A1. Uno de estos genes se denomina BARD1, una proteína RING que interactúa con BRCA1 y se concibe para usar en varios métodos diagnósticos y terapéuticos relacionados con el cáncer, particularmente aquellos conectados con cáncer de mama, ovárico y uterino.
[0007] WO 2008/119802 (Université de Genéve) divulga que, en cánceres ginecológicos, se sobreexpresan isoformas de BARD1 que tienen una deleción y se localizan aberrantemente en el citoplasma, y su expresión se correlaciona con un mal pronóstico en cáncer de mama y ovárico. El análisis estructural de estas isoformas mostró que carecen de las regiones que interactúan con BRCA1 o inducen la apoptosis. Estas isoformas son específicas de cánceres ginecológicos y se denominan isoformas a, p, n, Y, £, 9, 5 y 9.
[0008] Irminger-Finger I. et al. : "Identification of oncogenic BARD1 isoforms in lung cancer", Proceedings of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, vol. 50, #3335, 22 abril 2009, página 806, Proceedings of the 100th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; Denver, CA, EE.UU.; abril 18-22, 2009, divulga la identificación de isoformas oncogénicas de BARD1 que carecen de exones y epítopos N-terminales en el cáncer de pulmón por inmunohistoquímica en secciones de carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM) utilizando anticuerpos que reconocen distintos epítopos de BARD1.
[0009] Bianco A. et al.: "Distinct BARD1 isoforms expressed in lung cancer potential targets for treatment", European Respiratory Society Annual Congress October 4-8, 2008, Berlín, Alemania, 7 octubre 2008, divulga que, para determinar si las isoformas oncogénicas de BARD1 juegan un papel en el cáncer de pulmón, se realizaron análisis de la expresión de BARD1 en CPNM utilizando anticuerpos que reconocen distintos epítopos de BARD1 y RT-PCR para determinar la estructura del ARNm de las isoformas de BARD1 en CPNM y revelaron que la pérdida de exones/regiones reguladoras 5' está implicada en la sobreexpresión observada de isoformas truncadas en el extremo N-terminal.
[0010] Debido a la gravedad y la incurabilidad de los cánceres de pulmón y colorrectal, sigue habiendo una necesidad de desarrollar un método de detección eficaz, que permitiría la identificación de estos cánceres y además permitiría el desarrollo de métodos y composiciones eficaces para el tratamiento o la prevención de los mismos. El problema principal es que, hasta la fecha, no se ha desarrollado ningún método o estrategia eficaz para superar este problema.
Resumen de la invención
[0011] La presente invención proporciona un método para detectar la presencia de una isoforma de BARD1 específica de cáncer de pulmón en una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto que comprende el paso de detectar en dicha muestra al menos una de las isoformas de BARD1 específica de cáncer de pulmón seleccionada del grupo que comprende la isoforma n que comprende la SEC ID N.°: 1 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1, donde la presencia de dichas isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón en una muestra de dicho sujeto es una indicación de que dicho sujeto padece cáncer de pulmón, tiene un mayor riesgo de cáncer de pulmón y/o tiene un riesgo de recurrencia después de un tratamiento para el cáncer de pulmón.
La presente invención proporciona además un polipéptido aislado y/o purificado que comprende la SEC ID N.°: 1 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1 para el uso como biomarcador en el método de las reivindicaciones 1 a 4.
[0012] Otro objeto de la presente invención es un péptido seleccionado del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 13 a 80 para usar en un método para detectar la presencia de las isoformas de BARD1 de la presente invención.
[0013] Un objeto adicional de la presente invención es el uso de un kit para detectar la presencia de isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón en una muestra obtenida a partir de un sujeto, que comprende
al menos un cebador o sonda de polinucleótidos donde dicho cebador o sonda de polinucleótidos es específica para un polinucleótido que codifica la isoforma n de BARD1 que comprende la SEC ID N.°: 1 o que tiene al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1 y/o
una combinación de anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a diferentes epítopos de al menos la isoforma n de BARD1 que comprende la secuencia de de al menos una de las isoormas de BARD1 que comprenden las secuencias de amino cidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106, o las secuencias que tienen al menos un 95% de homología con la SEC ID Nros.: 1-7, 105-106, y/o
al menos un péptido seleccionado del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 13 a 80.
La presente invención también se refiere a un método para distinguir el cáncer de pulmón y el cáncer colorrectal de los cánceres ginecológicos, comprendiendo dicho método el paso de detección en una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto de al menos una de las isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón seleccionada del grupo que comprende la isoterma n que comprende la SEC ID N.°: 1 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1, donde la presencia de dichas isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón es una indicación de cáncer de pulmón.
[0014] Adicionalmente, la presente invención se refiere a un anticuerpo, ARNip recombinante de las isoformas de BARD1 de la presente invención para usar en un método para tratar y/o prevenir el cáncer de pulmón.
Breve descripción de las figuras
[0015]
La figura 1 muestra la expresión de BARD1 en CPNM. La inmunohistoquímica se realizó en 100 casos de CPNM con los anticuerpos BARD1 N19, C20, PVC, WFS y BRCA1. (A) Presentación esquemática de los exones de BARD1 (1-11) con los motivos proteicos indicados arriba como dedo RING (RING), repeticiones de anquirina (ANK) y dominios BRCT. Se designan las posiciones aproximadas de los epítopos reconocidos por los varios anticuerpos (N19, PVC, WFS, C20). (B-D) Ejemplos de tinción inmunohistoquímica usando anticuerpos BARD1 y un anticuerpo BRCA1. BARD1 N19 y C20 mostraron tinción granulosa citoplásmica y a veces se colocalizaron en las mismas células o regiones. La tinción de BARD1 PVC y WFS fue citoplásmica o de forma difusa nuclear y citoplásmica. La tinción de BRCA1 se colocalizó con la tinción de BARD1 N19 (B). Se muestran ejemplos de ninguna o poca tinción con PVC y WFS (C) y tinción insignificante con N-19 y C20 (D). Se indican las barras de escala (paneles superiores = 200 pm; paneles inferiores = 100 pm). (E) Tinción observada de 73 de 100 casos de CPNM evaluados con los cuatro N19, PVC, WFS y C20. "+" indica tinción positiva, "-" indica tinción negativa. La tinción positiva con los cuatro anticuerpos fue el patrón de expresión más frecuente. (F) Comparación por parejas de tinciones de BARD1 N19, PVC, WFS y C20. BARD1 N19 y C20 y PVC y WFS estaban fuertemente correlacionados. Se observó una correlación débil o nula entre N19 y PVC, N19 y WFS, C20 y PVC, C20 y WFS.
La figura 2 muestra la comparación de la expresión de BARD1 en tejidos tumorales y peritumorales y la correlación con características clínicas. (A) Comparación de tinciones de BARD1 N19, BARD1 C20 y BRCA1 en tejidos tumorales y peritumorales de 20 (10 mujeres y 10 varones) pacientes con CPNM. La tinción para todos los anticuerpos estaba aumentada en tejidos tumorales en comparación con tejidos "normales". (B) Se evaluaron las tinciones de BARD1 N19, BARD1 C20 y BRCA1 en tejidos tumorales de 10 pacientes con CPNM mujeres y 10 varones. La tinción para todos los anticuerpos estaba aumentada en los tumores de pacientes mujeres en comparación con pacientes varones. (C) Comparación de tinción con anticuerpos BARD y tipos de tumores en 100 casos de CPNM. La tinción positiva fue más frecuente en no adenocarcinomas (AC) (incluyendo carcinoma de células escamosas y carcinoma de células grandes) que en AC. Las tinciones aumentadas de PVC y WFS fueron estadísticamente significativas. (D-E) Correlación de la expresión de BARD1 con la supervivencia del paciente. (D) Análisis de Kaplan-Meyer de la supervivencia libre de enfermedad (SLE) según la combinación de la tinción positiva de 4 anticuerpos y la tinción positiva de menos de 4 de anticuerpos, tal y como se define en la Fig. IE. (E) Análisis de Kaplan-Meyer de la supervivencia global (SG) según la combinación de la tinción positiva de 4 anticuerpos y la tinción positiva de menos de 4 de anticuerpos, tal y como se define en la Fig. IE.
La figura 3 muestra el curso temporal de la expresión de la isoforma de BARD1 en un modelo experimental de ratón de cáncer de pulmón inducido. (A) Expresión de BARD1 en tejido pulmonar morfológicamente normal (normal) en animales tratados con uretano. Los epítopos BARD1 PVC y WFS se detectaron en algún neumocito tipo II, pero no en neumocitos tipo I a las 16 semanas (sem). Todos los epítopos se expresaron en neumocitos tipo II y tipo I a las 24 semanas y las 32 semanas, y la expresión estaba sobrerregulada de 24 semanas a 32 semanas. La tinción C20 fue inversa a las otras: tinción intensa a las 16 semanas, tinción débil a las 24 semanas y casi negativa a las 32 semanas. (B) Expresión de BARD1 en tumores. En regiones tumorales, la expresión de BARD1 PVC y, específicamente, de WFS estaba sobrerregulada de -D e resume el patr n de expresi n de los eptopos de BARD1 en tejido normal y tumoral (D) de tres ratones. Las puntuaciones de tinción, porcentaje de células positivas, se indican (0 indica tinción negativa, de 1 a 4 indican intensidades crecientes y números de células con tinción positiva).
La figura 4 muestra la expresión y la estructura de transcritos de BARD1 en tejidos humanos de tumores de pulmón y peritumorales. (A-D) Se realizó una RT-PCR con cebadores que amplifican toda la región codificante de BARD1 o regiones que comprenden los exones 1- 4 o 1- 6. La GAPDH se amplificó como control de la RT-PCR. Los marcadores del tamaño molecular (M) se muestran a la izquierda. BARD1 FL y las isoformas diferencialmente empalmadas supuestas se indican a la derecha. (A) Expresión de ARN de BARD1 en tejido pulmonar normal. La RT-PCR realizada en biopsias de pulmón de individuos con enfermedades pulmonares benignas (véase la sección de Métodos) muestra la ausencia de expresión de BARD1 en la mayoría de las muestras y la amplificación de isoformas individuales (y, ó, n) en 5 casos de 8. (B) Amplificación de BARD1 FL y/o isoformas truncadas utilizando un cebador directo en el exón 1 y un cebador inverso en el exón 11 o el exón 4. Ejemplos de pares de tejido peritumoral normal (N) y tumoral (T) se muestran para tejidos de pacientes varones y mujeres.
BARD1 FL y las isoformas diferencialmente empalmadas supuestas se indican a la derecha. Los tejidos normales y tumorales expresan el mismo patrón de isoformas. (C) La amplificación de los exones 1 a 6 se realizó para distinguir BARD1 FL, p, y las isoformas nuevas k y n. La isoterma n está específicamente expresada en tumores, pero no o débilmente en tejidos normales. (D) Expresión del receptor de estrógeno a, determinado por RT-PCR, se halló en la mayoría de los casos. Se hallaron niveles de expresión similares en muestras normales y tumorales, de varones y mujeres. (E) Estructura de las isoformas conocidas de BARD1 y las formas nuevas específicas de cáncer de pulmón, la isoforma k y la n. Se indican la estructura exónica (1 a 11) de BARD1 FL y las características de las proteínas (RING, ANK, BRCT) y las señales de localización nuclear (NLS) y las posiciones de los cebadores.
Las supuestas estructuras proteicas esquemáticas de las isoformas se muestran a continuación en gris, los exones no codificantes en blanco, y los marcos de lectura abiertos alternativos (p, y y n) en puntos (manchas) gris claro.
La isoforma nueva k se muestra con la deleción del exón 3 y el supuesto inicio de la traducción (ATG) dentro del exón 4. La nueva isoforma n está diseñada con la deleción dentro del exón 4, y se indican las mutaciones y los polimorfismos conocidos de BARD1 que se mapean dentro de esta región. Los nombres designados de las isoformas se muestran a la izquierda, el tamaño (aminoácidos) y los pesos moleculares (MW) en el lado derecho.
La figura 5 muestra la comparación de la expresión de BARD1, BRCA1 y Aurora B de tejidos peritumorales morfológicamente normales (izquierda) y en tumorales (derecha) de pacientes con CPNM mujeres y varones.
Se usó la tinción con los anticuerpos BARD1 (N19 y C20) y el anticuerpo específico del extremo C-terminal p8, BRCA1 y Aurora B para la inmunohistoquímica. Denotación n = tinción nuclear. La figura 6 muestra un empalme alternativo y/o la iniciación de la transcripción dentro del exón 4. (A) Diagrama de varios fragmentos de BARD1 amplificados con cebadores directos dentro del exón (Ex) 4, el exón 5 y el exón 6 (a la izquierda), y un cebador inverso en el exón 11 (a la derecha). La posición de los cebadores y el tamaño esperado de la banda amplificada se marca en paréntesis (bp). (B) Se muestra la amplificación de transcritos de BARD1 en tejidos de tumores de pulmón humanos (T) y tejidos peritumorales normales adyacentes (N) de pacientes con CPNM varones (panel izquierdo) y mujeres (panel derecho) con los cebadores indicados en A.
Nótese que la amplificación con cebadores dentro del exón 4 es variable en diferentes muestras, pero todas las muestras se pueden amplificar con los cebadores en el exón 5 o el exón 6. Las variaciones en la expresión de ARNm y proteína de BARD1 se puede deber al empalme alternativo o la iniciación de la transcripción diferencial en esta región.
La figura 7 muestra la comparación y la correlación de la expresión de ARNm de las isoformas de BARD1 en tejidos tumorales (tumor) y peritumorales (normal) de pacientes mujeres y varones. BARD1 FL y las isoformas de BARD1 de 20 pares de muestras de tejido tumoral/morfológicamente normal, incluidos 10 varones y 10 mujeres, se puntuaron y se presentaron. La expresión se cuantificó con el software ImageJ (véase la sección de Métodos). Los resultados se muestran en las figuras como medias ± SE (error estándar) de los valores. (A) Comparación de BARD1 FL y las isoformas en tejidos peritumorales y tumorales. Todas las formas están sobrerreguladas en tumores con significación estadística, con excepción de la isoforma p y k. (B-C) BARD1 FL y las isoformas de BARD1 son más abundantes en tejidos tumorales que en peritumorales, tanto en varones (B) como en mujeres (C). (D/E) Comparación de la expresión de BARD1 entre varón y mujer en tejidos tumorales (D) y en tejidos normales (E). Las isoformas de BARD1 p y k se expresan más en tejidos de varones que de mujeres en tejidos tumorales y peritumorales. Esto es estadísticamente significativo. BARD1 FL y las isoformas de tumorales y peritumorales, pero esto no es estadsticamente signiicativo. F omparaci n de BARD1 FL y las isoformas en grupos de pacientes jóvenes (< 60 años) y mayores (> 60 años). BARD1 FL y la isoforma y están sobrerreguladas en pacientes jóvenes (< 60 años). Esto es estadísticamente significativo.
La figura 8 muestra ejemplos de inmunohistoquímica de la expresión de BARD1 y BRCA1 en el cáncer colorrectal.
La inmunohistoquímica se realizó en muestras de 148 casos de cáncer colorrectal con anticuerpos BARD1 N19, C20, PVC, WFS y BRCA1. Todas las muestras se presentaron como micromatriz de tejido con tetrámeros para cada uno de los casos. Ciento cuarenta y cinco muestras fueron elegibles para el análisis después del ensayo de inmunohistoquímica. (A) Frecuencia de casos de tinción positiva con anticuerpos para BARD1 y BRCA1. Los índices de tinción positiva para cada uno de los cuatro anticuerpos fueron variables. Las tinciones de BARD1 N19 y C20 fueron menos frecuentes, así como la tinción de BRCA1. Se observaron tinciones positivas de BARD1 PVC y WFS en la mayor parte de los casos de cáncer colorrectal. (B) Patrón de expresión de BARD1 en el cáncer colorrectal. Se obtuvieron patrones de expresión con cuatro anticuerpos BARD1 en base a la tinción positiva (+) y negativa (-) para cada uno de los casos. El patrón de expresión más frecuente fue la tinción positiva de PVC y WFS, pero negativa de N19 y C20, la tinción "positiva para los cuatro anticuerpos" fue el segundo, la tinción negativa de N19, pero positiva de PVC, w Fs y C20 fue el tercer patrón de expresión observado con más frecuencia. (C-F) Ejemplos de tinción inmunohistoquímica usando anticuerpos BARD1 y anticuerpo BRCA1. BARD1 N19 y C20 mostraron una tinción granulosa citoplásmica y se colocalizaron en las mismas células o regiones. La tinción de BARD1 PVC y WFS fue citoplásmica de forma difusa. La tinción de BRCA1 fue granulosa tanto en el citoplasma como en el núcleo. Se muestran ejemplos de tinción positiva con anticuerpos BARD1 y anticuerpos BRCA1 (C), tinción insignificante con N-19 y C20 (D), tinción positiva con los cuatro anticuerpos BARD1 (E) y tinción negativa con N19 (F). Se muestran las barras de escala (paneles superiores = 200 pm; paneles inferiores = 50 pm).
La figura 9 muestra la correlación entre las distintas tinciones con anticuerpos para BARD1 y BRCA1 en el cáncer colorrectal. (A) Correlación de las tinciones de BARD1 N19, PVC, WFS y C20. Las tinciones de BARD1 N19 y C20 estaban fuertemente correlacionadas, las tinciones de PVC y WFS, PVC y C20, y WFS y C20 estaban débilmente correlacionadas. No se observó ninguna correlación entre N19 y PVC, y N19 y WFS. (B) Correlación de la tinción con anticuerpos de BRCA1 y BARD1. La tinción de BRCA1 no estaba correlacionada con ninguna tinción de los cuatro anticuerpos BARD1.
La figura 10 muestra la correlación de la expresión de distintos epítopos de BARD1 y BRCA1 con variables clínicas en el cáncer colorrectal. La tinción positiva de BARD1 N19 fue más frecuente en el género femenino (P= 0,014) (A). No se halló ninguna correlación entre los diferentes anticuerpos de BARD1 y la tinción de BRCA1 y el grado histopatológico del tumor (grado) (B), tamaño del tumor o invasión del tejido cercano (tumor) (C), implicación de ganglios linfáticos (ganglio) (D), metástasis distante (metástasis) (E) y estadio tumoral (estadio) (F). El valor de P se obtiene mediante la prueba x2.
La figura 11 muestra la expresión y la estructura de los transcritos de BARD1 en tejido de cáncer colorrectal (T) y tejido peritumoral normal (N). (A) Amplificación de BARD1 FL y/o las isoformas truncadas usando un cebador directo en el exón 1 y un cebador inverso en el exón 11 (Ex 1-11) o el exón 4 (Ex 1- 4). Como ejemplos, se muestran pares de tejidos peritumorales y tumorales de 5 pacientes varones y 5 mujeres. La expresión de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se muestra para las mismas muestras como estándar. El marcador molecular se muestra a la izquierda (M). BARD1 FL y las isoformas truncadas supuestas se indican a la derecha. Los tejidos peritumorales y tumorales expresaron diferentes patrones de las isoformas: expresión menos frecuente en tejidos peritumorales que en tejidos tumorales. Dos isoformas nuevas, k y n, identificadas también en CPNM, estaban expresadas en el cáncer colorrectal. (B) La amplificación del receptor de estrógeno a (ERa) en las mismas muestras, MCF-7 se usó como control positivo (derecha). No se observó expresión de ERa en tejidos colorrectales, ni en muestras peritumorales ni en tumorales de varones y mujeres.
La figura 12 muestra la comparación de la expresión de las isoformas de ARNm de BARD1 en tejidos tumorales (tumor) y peritumorales (normal) de pacientes varones y mujeres con cáncer colorrectal. BARD1 FL y las isoformas de BARD1 de 20 pares de muestras de tejido tumoral/peritumoral de cáncer colorrectal, incluyendo 10 de varones y 10 de mujeres, se puntuaron y se presentan. La expresión se cuantificó en base a la presencia o la ausencia de expresión en cada una de las muestras peritumorales o tumorales (A), y para cada una de las isoformas (B, C, D). (A) Comparación de la expresión de BARD1 en los tejidos peritumorales y tumorales, incluyendo en varones, en mujeres y en muestras combinadas, en base a la ausencia o la presencia de cualquiera de las formas de BARD1. La expresión de BARD1 fue más abundante y más frecuente en tejidos tumorales que peritumorales (P = 0,0003), tanto en FL y las isoormas en tejidos peritumorales y tumorales. Todas las ormas estaban sobrerreguladas en tumores con significación estadística (P < 0,05 para todas). (C/D) Comparación de la expresión de BARD1 FL y las isoformas en tejidos colorrectales de varones y mujeres. La expresión de BARD1 FL y de las isoformas fue similar en tejidos de varones y de mujeres, tanto en tejidos peritumorales (C) como en tumorales (D) (P > 0,05 para todas). El valor de P se obtiene por la prueba x2.
La figura 13 muestra la correlación de la expresión de ARNm de BARD1 FL y de las isoformas con variables clinicopatológicas en el cáncer colorrectal. (A) Comparación de la expresión de BARD1 FL y de las isoformas en pacientes más jóvenes (< 60 años) y mayores (> 60 años). BARD1 FL y todas las isoformas, excepto la isoforma p, estaban más sobrerreguladas en los pacientes mayores que en los más jóvenes. Especialmente, la expresión de las isoformas 9, ó y n estaban significativamente asociadas a pacientes mayores (P < 0,01). (B-E) Comparación de la expresión de BARD1 FL y de las isoformas con el estado de tumor primario y de ganglio linfático, y el estadio y el grado tumoral. La expresión de la isoforma k de BARD1 se asoció significativamente con un tamaño de tumor grande o la invasión de tejido cercano (B), la implicación de ganglios linfáticos (C) y un estadio avanzado (estadio III y IV) (D). No se halló ninguna correlación entre la expresión de las isoformas de BARD1 y el grado histopatológico del tumor (E). El valor de P se obtiene por la prueba x2. No se mostró la comparación para P> 0,05. La figura 14 muestra un ejemplo de prueba ELISA para la detección de anticuerpos específicos de isoformas de BARD1 en sangre o suero.
La figura 15 muestra la amplificación de la isoforma n con cebadores en ATG y sitio de la deleción en n. Se identifica una segunda isoforma, n', derivada de una deleción adicional del exón 2.
La figura 16 muestra una transferencia Western con anticuerpos anti-Bardl en células HeLa, MCF7, RPE1 y NLF. El Ac Bethyl BL518 (BL) reconoce epítopos codificados en el medio del exón 4. Se generó el Ac PGP contra los epítopos codificados por el ORF alternativo específico de p en el exón 1. Reconoce la isoforma p de BARD1 y la isoforma p-d-5 (p') de BARD1 y la isoforma n de BARD1.
La figura 17 muestra la represión por ARNip de las isoformas de BARD1. A) Ubicación de la secuencia diana del ARNip. Se usaron dos ARNip en el exón 4, K401 y K423. K401, situado en la deleción de la isoforma pi, K423 está aguas arriba de la deleción. B-C) K401 tuvo menos efecto en el crecimiento que K423. B) La expresión de ARNip está acoplada a la expresión de GFP. Muchas células positivas están creciendo en células que expresan K401, pocas están creciendo en células que expresan K423. C) Las curvas de crecimiento confirman que K423 reprime el crecimiento celular de manera tan eficaz como el previamente declarado K78, que se dirige a todas las formas de BARD1.
La figura 18 muestra que los microARN afectan a la expresión de BARD1 y de la isoforma de BARD1. La RT-PCR muestra que todas las formas de BARD1 están ligeramente reprimidas por miR-203. La transferencia Western muestra una fuerte represión de FL, p y n por sobreexpresión de miR-203.
Descripción detallada de la invención
[0016] Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí en la práctica o el análisis de la presente invención, se describen abajo métodos y materiales adecuados. Las publicaciones y aplicaciones discutidas aquí se proporcionan solamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada aquí debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder a tal publicación en virtud de invención anterior. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos. En el caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluidas las definiciones.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que entiende comúnmente una persona experta en la técnica a la que pertenece la materia en este caso. Como se utiliza en este caso, las definiciones siguientes se suministran para facilitar la comprensión de la presente invención.
El término "comprender' se usa generalmente en el sentido de incluir, es decir, que permite la presencia de una o más características o componentes.
Como se usa en la especificación y las reivindicaciones, la forma singular "un", "una", "la" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, una isoforma de BARD1 se refiere al menos a una isoforma de BARD1.
Como se utiliza en este caso, el término "isoforma" es cualquiera de las diferentes formas de la misma proteína, tal como la proteína BARD1 en la presente invención. Las diferentes formas de una proteína, tal como BARD1, se pueden producir a partir de genes relacionados o pueden surgir del mismo gen nucle tido o NP, dierencias gen ticas peque as entre alelos del mismo gen. Estos ocurren en posiciones de nucleótidos individuales específicas dentro de un gen.
[0017] Como se utiliza en este caso, los términos "sujeto" o "paciente" están bien aceptados en la técnica y se usan aquí para referirse a un mamífero y, más preferiblemente, un humano. En algunas formas de realización, el sujeto es un sujeto que necesita un tratamiento o un sujeto con cáncer de pulmón y/o colorrectal. Sin embargo, en otras formas de realización, el sujeto puede ser un sujeto normal que no ha desarrollado síntomas de cáncer de pulmón y/o colorrectal o el sujeto que ya se ha sometido a un tratamiento contra el cáncer de pulmón y/o colorrectal. El término no indica una edad o sexo particular. Así, se pretende cubrir sujetos adultos y recién nacidos, ya sean varones o mujeres.
[0018] Como se utiliza en este caso, los términos "péptido", "proteína", "polipéptido", "polipeptídico" y "peptídico" se usan de forma intercambiable para designar una serie de residuos de aminoácidos conectados al otro por enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carboxi de los residuos adyacentes.
[0019] A diferencia de lo que se esperaba, los solicitantes han identificado sorprendentemente, en cada muestra de una cohorte de 100 pacientes con carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM) y una de 165 con cáncer colorrectal, dos isoformas de BARD1 nuevas adicionales además de las isoformas ya conocidas a, p, n, y, £, 9, 5 y 0. Otra característica sorprendente es que la isoforma a estaba ausente en cada muestra de una cohorte de 100 pacientes con CPNM y una de 165 con cáncer colorrectal. Estas nuevas isoformas se denominaron k y n. De hecho, las isoformas de BARD1 expresaron un patrón similar en tejidos tumorales de CPNM y cáncer colorrectal, todos expresaron dos isoformas nuevas k y n, que difieren de las isoformas de BARD1 identificadas en cánceres ginecológicos (WO 2008/119802). Este hallazgo indicó que la expresión anormal de BARD1 puede ser diferente en tejidos tumorales dependientes de hormonas femeninas y dependientes de hormonas no femeninas.
[0020] La isoforma nueva k lleva una deleción del exón 3. La traducción del exón 2 al exón 4 no está en el marco de lectura, pero la traducción puede iniciarse dentro del exón 4. El producto proteico resultante sería similar en reactividad de anticuerpos a la isoforma p.
[0021] La nueva isoforma n lleva una deleción de 408 pares de bases, que codifica los aminoácidos 301 a 436 del exón 4. La traducción de la isoforma n resultaría en una proteína que reacciona con los anticuerpos PVC y WFS, pero carente de NLS importantes (Fig. 4C, E y Fig. 6). La isoforma n se deriva a partir de un mecanismo de empalme nuevo que genera una deleción parcial del exón 4, pero retiene los exones 1- 3 y el principio del exón 4, manteniendo así el dominio de dedo RING que se une a BRCA1. La isoforma n retiene los exones 1 a 3 y el principio del exón 4, por tanto, los epítopos reconocidos por PVC y WFS, una combinación de epítopos no encontrada en ninguna otra isoforma. La isoforma n se puede detectar con los anticuerpos PVC y WFS; estos anticuerpos muestran una mayor tinción en los tumores de pulmón avanzados en ratones. Así, la isoforma n puede ser un inductor oncogénico de la progresión tumoral en CPNM. La deleción parcial del exón 4 en la isoforma n puede ser una región importante, ya que alberga varias mutaciones y NLS asociadas al cáncer (Fig. 4E), que pueden explicar la localización citoplásmica de la tinción con PVC y WFS. La localización intracelular aberrante podría afectar a las modificaciones de proteína, por ejemplo, la fosforilación, y a las interacciones proteína-proteína.
[0022] La isoforma n parece particularmente importante para el cáncer de pulmón, ya que es la única isoforma que está sobrerregulada significativamente en tejido tumoral y está ausente o solo expresada débilmente en el tejido peritumoral, mientras que todas las otras isoformas de BARD1 estaban expresadas en tejido tumoral y peritumoral de manera similar (Fig. 4B; Fig. 7). La deleción parcial del exón 4 lleva a la pérdida de una NLS importante en BARD1 que puede explicar la localización citoplásmica.
[0023] Una isoforma adicional n', derivada de la deleción del exón 2, estaba coexpresada con la isoforma n en el cáncer de pulmón y el cáncer colorrectal.
[0024] Los solicitantes mostraron que BARD1 FL (BARD1 de longitud completa) y las isoformas empalmadas se expresan en tejido tumoral y peritumoral normal y pueden contribuir a la iniciación y la progresión del tumor. Sin embargo, la isoforma n se expresa específicamente en tumores y puede estar implicada en la progresión oncogénica. BARD1 FL se expresa a nivel de ARNm, pero no hay FL, est n expresadas en cada muestra de una cohorte de 100 pacientes con PNM y una de 165 con cáncer colorrectal. La expresión y localización de las isoformas no se correlaciona con BRCA1, lo que indica que las funciones de la ubiquitina ligasa E3 del heterodímero BRCA1-BARD1 están en riesgo en ambos tipos de cáncer. La estabilidad y la localización de la proteína BRCA1 dependen en gran medida de BARD1. La ausencia de BARD1 FL, que causa la ausencia de las funciones supresoras de tumores de BRCA1-BARD1, lleva a la inestabilidad genómica y la resistencia a la apoptosis. Además de este efecto de pérdida de BARD1 FL, las isoformas sobreexpresadas de BARD1 empalmadas diferencialmente pueden ser inductores de la tumorigénesis.
[0025] El empalme alternativo es un fenómeno frecuentemente observado en el cáncer de pulmón y ha sido demostrado para varias proteínas reguladoras. Las isoformas de empalme se pueden traducir a isoformas de proteína aberrantes con funciones antagonistas. Esto se ha demostrado para dos variantes de empalme de BARD1, BARD 1p y BARD16, que actúan de manera antagonista a las funciones de BARD 1 FL estabilizando a Aurora B y en ERa, respectivamente. Así, la expresión de la isoforma de BARD1 en CPNM puede no ser meramente un testigo, sino que puede ser un inductor de la tumorigénesis. De hecho, la expresión de epítopos mapeados en los exones 3 y 4, reconocidos por los anticuerpos PVC y WFS, respectivamente, está aumentada en los estadios agresivos de tumores de pulmón en el modelo de ratón de cáncer de pulmón inducido (Fig. 3).
[0026] Todas las muestras de tejido de tumor de pulmón y peritumoral expresan también isoformas encontradas en los cánceres ginecológicos; específicamente la isoforma ó. La isoforma ó de BARD1 se une y estabiliza a ERa, que se opone a la función del heterodímero BRCA1-BARD1. Puesto que ERa también se expresa en todas las muestras, las isoformas de BARD1 pueden estar sobrerreguladas por estrógeno e implicadas en la señalización del estrógeno en el cáncer de pulmón. Así, varias isoformas de BARD1 parecen estar asociadas con la carcinogénesis.
[0027] Ya que las células cancerosas necesitan BARD1 o las isoformas de BARD1 para proliferar, la expresión de las isoformas de BARD1 en el CPNM y el cáncer colorrectal no es meramente un testigo, sino que puede ser un inductor de la tumorigénesis. Especialmente las isoformas que expresan los epítopos mapeados en los exones 3 y 4 parecen estar correlacionadas con la corta supervivencia tanto en el CPNM como en el cáncer colorrectal. Estos epítopos estaban sobrerregulados en tumores invasivos en el modelo de ratón de cáncer de pulmón. Las isoformas de BARD1 expresadas en el CPNM y el cáncer colorrectal están derivadas de un empalme alternativo. Por ejemplo, las isoformas de empalme se pueden traducir a isoformas de proteína aberrantes con funciones antagonistas.
[0028] Todas las muestras de tumor de pulmón y las muestras de tejido peritumoral expresan ERa y la isoforma ó. Sin embargo, no hubo ninguna expresión de ARNm de ERa en la serie de casos de cáncer colorrectal, y no se encontró ninguna diferencia entre la expresión de las isoformas de BARD1 y el género.
[0029] De manera interesante, sin embargo, la alta frecuencia de tinción N19 positiva estaba significativamente asociada al sexo femenino en el cáncer colorrectal (P = 0,014), y este hallazgo está en línea con la expresión del epítopo N-terminal de BARD1 correlacionado con el sexo femenino en el CPNM (la significación estadística fue marginal, P = 0,051). En el CPNM, se observaron altos niveles de expresión de ARNm de las isoformas de BARD1 y, £ y n en mujeres, mientras que las isoformas p y k estaban sobreexpresadas en varones. La expresión de las isoformas y y £ se pudieron detectar mediante BARD1 N19, mientras que las isoformas p, k y n, no. Así, el nivel de proteína y el nivel de ARNm de la expresión de las isoformas de BARD1 fueron compatibles, sugiriendo que las isoformas de BARD1 específicas de género se expresan en estos cánceres.
[0030] Las isoformas de BARD1 mostraron un patrón diferente de expresión en tejidos tumorales frente a los tejidos peritumorales en el CPNM y el cáncer colorrectal. En el CPNM, todas las isoformas, con excepción de la isoforma n, se expresaron en el tejido peritumoral y solo ligeramente aumentada en los tejidos tumorales, pero se observó menos o ninguna expresión de cualquier forma de BARD1 en los tejidos de control obtenidos de enfermedad pulmonar benigna. Por el contrario, en el cáncer colorrectal, las isoformas de BARD1 estaban expresadas con más frecuencia en los tejidos tumorales, pero nada o menos expresadas en los tejidos peritumorales. Este resultado se puede explicar por la diversa modulación del empalme alternativo según el diferente tipo celular, en respuesta a estímulos externos o determinadas condiciones patológicas y/o la diferencia de expresión de ERa entre tejidos pulmonares y colorrectales.
correlaciona con la supervivencia reducida de los pacientes con PNM. in embargo, el patr n de tinción positiva de cuatro anticuerpos estaba significativamente asociado a una supervivencia más larga en el cáncer colorrectal, así como el caso para la tinción positiva N19; mientras que el patrón de tinción positiva de PVC y WFS estaba fuertemente correlacionado con una supervivencia más corta, pero no su tinción positiva individual. De hecho, diferentes patrones de expresión no solo reflejan la expresión de diferentes isoformas de BARD1 sino también la combinación de las isoformas. Según la correlación de la expresión de diferentes epítopos de BARD1, parece observarse varias isoformas de BARD1: forma truncada N-terminal y C-terminalmente y formas con deleciones internas tanto en el CPNM como en el cáncer colorrectal, así como una forma adicional de pérdida del extremo N-terminal en el cáncer colorrectal. El patrón de expresión de tinción positiva para cuatro anticuerpos no indica la expresión de la isoterma n, pero puede reflejar la expresión simultánea de diferentes isoformas de BARD1.
[0032] De hecho, la expresión de la isoforma n de BARD1 es consistente con los epítopos reconocidos por PVC y WFS, una combinación de epítopos no encontrada en cualquier otra isoforma. De hecho, la tinción de PVC y WFS es citoplásmica. La expresión de PVC y WFS está claramente ligada con un pronóstico pobre tanto en el CPNM como en el cáncer colorrectal, la tinción de PVC y WFS también se correlacionó con la progresión del cáncer en el modelo de ratón de cáncer de pulmón.
[0033] La expresión intensa de los epítopos reactivos PVC y WFS, junto a la expresión débil de epítopos N-terminales y C-terminales puede indicar que estos epítopos se bloquean por configuración estérica y/o interacciones proteína-proteína. La regulación postranscripcional o la estabilidad de proteína diferencial de BARD1 FL frente a isoformas de BARD1 puede explicar también la ausencia de BARD1 FL a nivel de proteína, mientras que está presente a nivel de ARNm.
Los solicitantes demostraron que la expresión de las isoformas de BARD1 fue común en el CPNM y el cáncer colorrectal. La expresión de estas isoformas se asoció significativamente al pronóstico en el CPNM y el cáncer colorrectal, ya sea un pronóstico malo o mejor, y sugiere fuertemente que las isoformas de BARD1 están implicadas en la tumorigénesis, la progresión y la mortalidad. Por lo tanto, BARD 1 y sus isoformas podrían ser marcadores diagnósticos y pronósticos prometedores, no solo para identificar individuos con potencial de un mal pronóstico para un tratamiento más agresivo, sino que también señalan hacia una nueva dirección para buscar terapias dirigidas moleculares eficaces. Por ejemplo, las isoformas de BARD1, tal como k y n, podrían ser dianas para nuevas estrategias para el tratamiento del cáncer de pulmón y el colorrectal.
La detección de las isoformas específicas k y n es útil para la identificación de sujetos con el riesgo más alto de morir de CPNM y de cáncer colorrectal antes y/o después de un tratamiento quirúrgico potencialmente curativo, ya que es un paso crítico en la selección de sujetos para el tratamiento posterior con quimioterapia adyuvante.
La presente invención proporciona un método para detectar la presencia de una isoforma de BARD1 específica de cáncer de pulmón en una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto que comprende el paso de detección, en dicha muestra, de al menos una de las isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón seleccionada del grupo que comprende la isoforma n que comprende la SEC ID N.°: 1 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1, donde la presencia de dichas isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón en una muestra de dicho sujeto es una indicación de que dicho sujeto padece cáncer de pulmón, tiene un mayor riesgo de cáncer de pulmón y/o tiene un riesgo de recurrencia después de un tratamiento para el cáncer de pulmón. Preferiblemente, el paso de detección comprende la detección tanto de la isoforma n de BARD1 que comprende la SEC ID N.°: 1 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC iD N.°: 1, como de la isoforma k de BARD1 que comprende la SEC ID N.°: 2 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 2. También preferiblemente, el método de la invención comprende el paso de detección, en dicha muestra biológica, de la isoforma n de BARD1 consistente en la SEC ID N.°: 1 y la isoforma k de BARD1 consistente en la SEC ID N.°:2. El método de la invención comprende además la detección, en dicha muestra biológica, de al menos una de las isoformas de BARD1 seleccionada del grupo que comprende
la isoforma n' que comprende la SEC ID N.°: 105 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC iD N.°: 105,
la isoforma p que comprende la SEC ID N.°: 5 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC iD N.°: 5,
la isoforma ó que comprende la SEC ID N.°: 6 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC iD N.°: 6, y
la isoforma y que comprende la SEC ID N.°: 7 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC iD N.°: 7,
homologa con la E iD N. : 106.
Preferiblemente, el método de la invención comprende además la detección, en dicha muestra biológica, de al menos una de las isoformas de BARD1 seleccionada del grupo que comprende
la isoforma n' que comprende la SEC ID N.°: 105 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC iD N.°: 105,
la isoforma p que comprende la SEC ID N.°: 5 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC iD N.°: 5,
la isoforma p' que comprende la SEC ID N.°: 106 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC iD N.°: 106.
También preferiblemente, el método de la invención comprende el paso de detección, en dicha muestra biológica, de la isoforma n de BARD1 consistente en la SEC ID N.°: 1, la isoforma k de BARD1 consistente en la SEC ID N.°: 2 y la isoforma p de BARD1 consistente en la SEC ID N.°: 5.
[0034] En el contexto de la presente invención "fragmento biológicamente activo" se refiere a regiones de las isoformas de BARD1 de la invención que son necesarias para la función normal, por ejemplo, funciones antagonistas de las isoformas de BARD1. Los fragmentos biológicamente activos incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a o derivadas de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nros.: 1 a 7, 105 a 106, que incluyen menos aminoácidos que las isoformas de BARD1 de longitud completa y presentan al menos una actividad antagonista. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad antagonista. Un fragmento biológicamente activo de las isoformas de BARD1 de la invención puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más residuos de aminoácidos de largo. Además, otros fragmentos biológicamente activos, donde se eliminan otras regiones, se pueden preparar por técnicas recombinantes y evaluarse para una o más de las actividades funcionales de una isoforma nativa de BARD1 de la invención.
[0035] Por ejemplo, un fragmento activo biológicamente de la isoforma n puede consistir en la SEC ID N.°: 3, un fragmento activo biológicamente de la isoforma k puede consistir en la SEC ID N.°: 4 y un fragmento activo biológicamente de la isoforma p puede consistir en la SEC ID N.°: 4.
[0036] En otra forma de realización, la isoforma de BARD1 de la invención es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o 99%, preferiblemente un 95% de homología con la secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID Nros.: 1 a 7, 105 a 106 y retiene la actividad de las isoformas de BARD1 que comprenden las SEC ID Nros.: 1 a 7, 105 a 106.
[0037] Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos, las secuencias se alinean con fines de una comparación óptima (por ejemplo, los espacios se pueden introducir en la secuencia de un primer aminoácido para el alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos). Los residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes se comparan entonces. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El alineamiento y el porcentaje de homología se puede determinar usando cualquier programa de software adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, aquellos descritos en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. (Eds) 1987, suplemento 30, sección 7.7.18). Los programas preferidos incluyen el programa GCG Pileup, FASTA (Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 85: 2444-2448) y BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md., y Altschul et al., (1997) NAR 25: 3389-3402). Otro programa de alineamiento preferido es ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA), usando preferiblemente los parámetros por defecto. Otro programa de software de secuencias que encuentra uso es el programa de búsqueda de datos TFASTA disponible en la versión 6.0 del Sequence Software Package (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.).
[0038] Los fragmentos son secuencias que comparten al menos un 40% de aminoácidos en longitud con la respectiva secuencia de las isoformas de BARD1 de la presente invención. Estas secuencias se pueden usar en tanto que presenten las mismas propiedades biológicas que la secuencia nativa de la que derivan, por ejemplo, actividad antagonista. Preferiblemente, estas secuencias comparten más de de un 95 de amino cidos de longitud con la secuencia respectiva de la que deriva. Estos ragmentos se pueden preparar mediante una variedad de métodos y técnicas conocidos en la técnica tal como, por ejemplo, la síntesis química.
[0039] La presente invención abarca también variantes de las isoformas de BARD1. Una variante es un péptido o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere hasta cierto punto de un péptido o polipéptido de la secuencia nativa, que es una secuencia de aminoácidos que varía de la secuencia nativa por sustituciones de aminoácidos conservadoras, por la cual uno o más aminoácidos se sustituyen por otro con las mismas características y funciones conformacionales. Las variantes de la secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, deleciones, modificaciones de las cadenas laterales y/o inserciones en determinadas posiciones en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se definen aquí como intercambios dentro de uno de los siguientes cincos grupos:
I. Residuos pequeños alifáticos, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly II. Residuos polares cargados positivamente: His, Arg, Lys
III. Residuos polares cargados negativamente: y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln
IV. Residuos grandes aromáticos: Phe, Tyr, Trp
V. Residuos grandes alifáticos no polares: Met, Leu, Ile, Val, Cys.
[0040] Debe entenderse que algunos aminoácidos no convencionales también pueden ser reemplazos adecuados para los aminoácidos de origen natural. Por ejemplo, los residuos de Lys se pueden sustituir por ornitina, homoarginina, nor-Lys, N-metil-Lys, N, N-dimetil-Lys y N, N, N- trimetil-Lys. Los residuos de Lys también pueden sustituirse con aminoácidos básicos sintéticos incluyendo, pero sin limitarse a, N-1-(2-pirazolinil)-Arg, 2-(4-piperinil)-Gly, 2-(4-piperinil)-Ala, 2-[3-(2S)pirrolininil]-Gly y 2-[3-(2S)pirolininil]-Ala. Los residuos de Tyr se pueden sustituir con 4-metoxitirosina (MeY), metaTyr, ortoTyr, nor-Tyr, 1251-Tyr, mono-halo-Tyr, di-halo-Tyr, O-sulfo-Tyr, O-fosfo-Tyr y nitro-Tyr.
[0041] Los residuos de Tyr también se pueden sustituir con los isómeros 3-hidroxilo o 2-hidroxilo (meta-Tyr u orto-Tyr, respectivamente) y los derivados O-sulfo- y O-fosfo correspondientes. Los residuos de Tyr también pueden sustituirse con hidroxilo sintético que contiene aminoácidos incluyendo, pero sin limitarse a, 4-hidroximetil-Phe, 4-hidroxifenil-Gly, 2,6-dimetil-Tyr y 5-amino-Tyr. Los aminoácidos alifáticos se pueden sustituir por derivados sintéticos que llevan cadenas laterales alifáticas no naturales ramificadas o lineales CnH2n+2 donde n es un número desde el 1 hasta, e incluyendo, el 8. Se proporcionan ejemplos de sustituciones conservadoras adecuadas por aminoácidos no convencionales en WO 02/064740.
[0042] Las inserciones abarcan la adición de uno o más residuos de aminoácidos de origen natural o no convencionales. La deleción abarca la deleción de uno o más residuos de aminoácidos.
[0043] Además, ya que un problema inherente a los péptidos nativos (en forma L) es la degradación por proteasas naturales, la proteína fisiológica activa de la invención se puede preparar para incluir formas-D y/o "isómeros retro-inversos" del péptido. Preferiblemente, se preparan isómeros retroinversos de partes cortas, variantes o combinaciones de la proteína fisiológica activa de la invención. Se preparan péptidos retro-inversos para péptidos de secuencia conocida como se describe, por ejemplo, en Sela y Zisman, en una revisión publicada en FASEB J. 1997 May; 11(6): 449-56. Por "isómero retro-inverso" se entiende un isómero de un péptido lineal donde la dirección de la secuencia está invertida y la quiralidad de cada residuo de aminoácido está invertida; así, puede no haber ninguna complementariedad de grupo terminal.
[0044] La invención incluye también análogos donde uno o más enlaces peptídicos se han sustituido por un tipo alternativo de enlace covalente (un "péptido mimético") que no es susceptible a la escisión por peptidasas. Cuando la degradación proteolítica de los péptidos tras la inyección en el sujeto es un problema, la sustitución de un enlace peptídico particularmente sensible por un péptido mimético no escindible hará al péptido resultante más estable y, así, más útil como sustancia activa. Tales miméticos y los métodos para incorporarlos en péptidos se conocen bien en la técnica.
[0045] Preferiblemente, la muestra biológica se selecciona del grupo que comprende una muestra de biopsia, una muestra histológica, líquidos pulmonares, una muestra de tejido congelado, una muestra de tejido tumoral, una muestra de heces, líquido cefalorraquídeo (LCR), células tumorales circulantes preerible, la muestra biol gica es suero derivado de una muestra de sangre obtenida de un sujeto.
[0046] La detección de la presencia de las isoformas de BARD1 de la presente invención se puede llevar a cabo por métodos convencionales tales como inmunotinción de proteínas, inmunoprecipitación de proteínas, inmunoelectroforesis, inmunotransferencia, ensayo de proteínas BCA, transferencia Western, espectrofotometría. La presencia de isoformas de BARD1 también puede detectarse a través de la presencia de su ARNm correspondiente por métodos convencionales tales como la transferencia Northern, ensayos de protección de nucleasas (NPA), hibridación in situ y reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Preferiblemente, la expresión del ARN específico de isoformas de BARD1 se detecta en células tumorales circulantes (CTC).
[0047] En una forma de realización de la presente invención, la presencia de isoformas de BARD 1 se detecta usando anticuerpos específicos para las isoformas de BARD1 de la invención. Preferiblemente, dichos anticuerpos son anticuerpos policlonales o monoclonales o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105­ 106, fragmentos biológicamente activos de las mismas o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106. También preferiblemente, dichos anticuerpos son una combinación de anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a diferentes epítopos de al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106, fragmentos biológicamente activos de las mismas o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106. Preferiblemente, dichos epítopos son los exones 3 y 4.
[0048] Preferiblemente, dichos anticuerpos policlonales o monoclonales o dicha combinación de anticuerpos específicamente se unen con al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1 y 2, fragmentos biológicamente activos de las mismas o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-2.
[0049] Por ejemplo, los anticuerpos que permiten la detección de las isoformas de BARD1 de la invención son los siguientes:
- N19, C20 y H300 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA),
- PVC y WSF (inicio del exón 4) se generaron y se aplicaron como se ha descrito previamente (Irminger-Finger I et al., Mol Cell 8:1255-66, 2001; Feki A et al., Oncogene 24:3726-36, 2005; Hayami R et al., Cancer Res 65:6-10, 2005; Li L et al., Int J Biochem Cell Biol 39:1659-72, 2007; Redente EF et al., Anticancer Res 29:5095-101, 2009; Fabbro M et al., J Biol Chem 277:21315-24, 2002),
- BL (Bethy Laboratories),
- JH2 y JH3 (Gautier et al. Cancer Rsearch, 2000),
- PGP (Ryser et al., Cancer Research, 2000),
- ELS y KPD generados por los solicitantes
- MIQ (Irminger-Finger et al., JCB 1998)
[0050] La detección se puede llevar a cabo por inmunohistoquímica y se resume en la tabla 1:
- La isoterma n de BARD1 debe ser positiva para o N19 (o PVC o MIQ) más o BL (o WFS) y negativa para JH2. Para distinguir la isoterma n de la n' (pi-d-2), esto solo puede hacerse por tamaño en transferencias Western.
- La isoforma k de BARD1 debe ser positiva para BL (o WFS) y negativa para N19 (o PVC o MIQ). - La isoforma p de BARD1 debe ser positiva para PGP, y o WFS o BL. Para distinguir la isoforma p de p' (beta-d-5), la isoforma p es positiva para ELS.
- La isoforma 6 de BARD1 debe ser positiva para N19 y negativa para o PVC (o MIQ) y negativa para BL (o WFS).
- La isoforma y de BARD1 debe ser positiva para N19 y o PVC (o MIQ), pero negativa para C20 (o KPD).
Figure imgf000014_0001
Beta D-5 es el nombre alternativo de la isoforma p' y pi-D-5 es el nombre alternativo para la ¡soforma n'
[0051] En otra forma de realización de la presente invención, la presencia de dichas isoformas de BARD1 se detecta mediante la detección del nivel (la expresión) de ARNm que codifica al menos una de las isoformas de BARD 1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106, fragmentos biológicamente activos de las mismas o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106. Preferiblemente, dicho ARNm codifica al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1 y 2, fragmentos biológicamente activos de las mismas, o una secuencia con al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-2. La expresión de dicho ARNm se realiza preferiblemente in vitro en las células tumorales circulantes (CTC) obtenidas de un sujeto.
[0052] En otra forma de realización de la presente invención, la presencia de dichas isoformas de BARD1 se detecta mediante la detección de la presencia de anticuerpos autoinmunitarios específicos para las isoformas de BARD1 de la presente invención en la muestra de sangre obtenida del sujeto, preferiblemente en suero. Preferiblemente, los anticuerpos autoinmunitarios son anticuerpos específicos para las isoformas n y k de BARD1.
[0053] En el contexto de la presente invención, "anticuerpo autoinmunitario" o "autoanticuerpo" se refiere a un anticuerpo de origen natural dirigido a las isoformas de BARD1 de la invención, que el sistema inmunitario de un sujeto reconoce como proteínas extrañas, aunque estas isoformas de BARD1 se originan en realidad en dicho sujeto. Así, estas isoformas de BARD1 provocan una respuesta inmunitaria. Preferiblemente, dichas isoformas de BARD1 son las isoformas n y k.
bien conocidos en la t cnica, por ejemplo, dierentes t cnicas ELI A ya sea con anticuerpo ijado en la superficie de una placa o con el antígeno fijado en la superficie de una placa para capturar los anticuerpos), radioinmunoensayos y similares (véase Immunoassay, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996). Los inmunoensayos para la detección de anticuerpos que tienen una especificidad inmunológica particular requieren generalmente el uso de un reactivo (antígeno) que presenta una reactividad inmunológica específica con el anticuerpo que se está evaluando. Dependiendo del formato del ensayo, este antígeno se puede inmovilizar en un soporte sólido. Se pone en contacto una muestra en la que se va a evaluar la presencia del anticuerpo (por ejemplo, una muestra de sangre) con el antígeno y, si los anticuerpos con la especificidad inmunológica requerida están presentes en la muestra, reaccionarán inmunológicamente con el antígeno, para formar complejos anticuerpo-antígeno que pueden entonces detectarse o medirse de forma cuantitativa.
[0055] Así, según una forma de realización de la presente invención, la presencia de las isoformas de BARD1 se detecta mediante la detección de la presencia de anticuerpos autoinmunitarios específicos para dichas isoformas de BARD1 en la muestra de sangre obtenida del sujeto, donde al menos un antígeno (péptido), preferiblemente al menos cuatro antígenos (péptidos), seleccionados del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 13 - 80 se usan para detectar dichos anticuerpos autoinmunitarios específicos para dichas isoformas de BARD1. Dichas isoformas de BARD1 se seleccionan del grupo que comprende las isoformas a, p, p', n, y , £, 9, 6, 0, n, n' y k. Preferiblemente, dichas isoformas de BARD1 se seleccionan del grupo que comprende las isoformas p, p', 6, y , n, n' y k. Más preferiblemente, dichas isoformas de BARD1 se seleccionan del grupo que comprende las isoformas p, n y k. De la forma más preferible, dichas isoformas de BARD1 se seleccionan del grupo que comprende las isoformas n y k. La detección de anticuerpos autoinmunitarios se realiza preferiblemente in vitro en una muestra de sangre obtenida de un sujeto, preferiblemente en suero.
[0056] Más preferiblemente, las isoformas de BARD1 son las isoformas n y k específicas de cáncer de pulmón y el cáncer colorrectal y los antígenos se seleccionan del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 16, 17, 18, 23, 59-67, 68, 69, 74, 75, 76-80. De la forma más preferible, los antígenos se seleccionan del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 16, 17, 18, 23, 68, 69, 74 y 75.
[0057] En una forma de realización, la presente invención proporciona un péptido seleccionado del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 13 a 80 para usar en un método para detectar la presencia de las isoformas de BARD1 de la invención.
[0058] Los solicitantes también han descubierto que los antígenos seleccionados del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 13 - 80 también se pueden usar para detectar otros cánceres seleccionados entre cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de próstata, neuroblastoma y leucemia, a través de la detección de la presencia de anticuerpos autoinmunitarios específicos para isoformas de BARD1 seleccionadas del grupo que comprende las isoformas a, p, p', n, Y, £, 9, 6, 0, n, n' y k. Por ejemplo, los antígenos seleccionados del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 13, 14, 15, 23, 59­ 67, 69, 70, 75-80 pueden ser útiles para detectar el cáncer de mama, el cáncer ovárico y el cáncer de próstata.
[0059] Así, en otra forma de realización, la presente invención proporciona un péptido seleccionado del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 13 a 80 para el uso como antígeno en un método para detectar la presencia de las isoformas de BARD1 en una muestra biológica obtenida de un sujeto, donde la presencia de dichas isoformas de BARD1 se detecta mediante la detección de la presencia de anticuerpos autoinmunitarios específicos para dichas isoformas de BARD1 y donde la presencia de dichas isoformas de BARD1 en dicha muestra es una indicación de que dicho sujeto padece cáncer. Dichas isoformas de BARD1 se seleccionan del grupo que comprende las isoformas a, p, p', n, Y, £, 9, 6, 0, n, n' y k.
[0060] Al menos un antígeno debería usarse para detectar la presencia de anticuerpos autoinmunitarios específicos para las isoformas de BARD1. Preferiblemente, se usan al menos cuatro antígenos; más preferiblemente se usan de cuatro a diez antígenos; de la forma más preferible, se usan de cuatro a seis antígenos.
[0061] Los antígenos de la presente invención también se pueden poner en contacto con muestras de control negativo (muestras de sangre de controles sanos) para obtener una línea de base, que facilita la discriminación entre sujetos con cáncer y sujetos sanos (véase Ejemplos - Detección de anticuerpos autoinmunitarios anti-BARD1 en sangre de pacientes con cáncer de pulmón). Opcionalmente, los positivas muestras de sangre con c ncer conirmado para obtener resultados positivos claros.
En otra forma de realización, una muestra de sangre de un sujeto se puede poner en contacto con las isoformas de BARD1 de la invención, preferiblemente las isotermas n y k o fragmentos de las mismas. Luego, el enlace específico entre el anticuerpo autoinmunitario y dichas isoformas de BARD1 se pueden detectar, lo que permite la determinación de la presencia o la ausencia de cáncer de pulmón en base a la cantidad de unión específica entre anticuerpo autoinmunitario y dichas isoformas de BARD1. La detección de anticuerpos autoinmunitarios se realiza preferiblemente in vitro en una muestra de sangre obtenida de un sujeto, preferiblemente en suero.
Alternativamente, según una forma de realización de la presente invención, la presencia de isoformas de BARD 1 de la invención se detecta mediante
la detección del nivel de ARNm que codifica al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106 o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1­ 7, 105-106, y
la detección de la presencia de anticuerpos autoinmunitarios específicos para dichas isoformas de BARD1 en la muestra de sangre obtenida del sujeto, y donde al menos cuatro antígenos seleccionados del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 13 - 80 se usan para la detección de dichos anticuerpos autoinmunitarios específicos para dichas isoformas de BARD1.
La presente invención proporciona además un polipéptido aislado y/o purificado que comprende la SEC ID N.°: 1 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1 para el uso como un biomarcador en el método de la presente invención.
[0062] La presente invención proporciona también un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un epítopo como se expone en la SEC ID N.°: 143 (DTKSRNEVVTPIKGDIPSVEYLLQNGS) en la isoterma n de BARD1. Preferiblemente, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un epítopo como se expone en la SEC ID N.°: 144 (NEVVTPIKGDIPSVEY). La presente invención proporciona además un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un epítopo como se expone en la SEC ID N.°: 143 para usar en un método para tratar y/o prevenir el cáncer de pulmón. Preferiblemente, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un epítopo como se expone en la SEC iD N.°: 144 para usar en un método para tratar y/o prevenir el cáncer de pulmón.
La presente invención abarca también un anticuerpo policlonal o monoclonal o un fragmento del mismo que se une específicamente a al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106 o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106, para usar en un método para tratar y/o prevenir el cáncer de pulmón, y donde se excluyen los anticuerpos siguientes N19, C20, H300, PVC, WSF, BL, JH2, JH3, PGP, ELS, KPD, MIQ.
La presente invención también abarca una combinación de anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a diferentes epítopos de al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106 o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1­ 7, 105-106 para usar en un método para tratar y/o prevenir el cáncer de pulmón, y donde se excluyen los anticuerpos siguientes: N19, C20, H300, PVC, WSF, BL, JH2, JH3, PGP, ELS, KPD, MIQ.
El anticuerpo de la presente invención también se puede usar para detectar las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106 o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1­ 7, 105-106 en muestras de tejido de un sujeto, líquidos biológicos de un sujeto o células circulantes en la sangre de un sujeto.
Preferiblemente, dichos anticuerpos policlonales o monoclonales o dicha combinación de anticuerpos se unen específicamente a la isoterma n de BARD1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID N.°: 1 o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1. Como se utiliza en este caso, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que tiene una estructura específica, que interactúa (es decir, se une) solo con el antígeno que se usó para sintetizar el anticuerpo (por ejemplo, las isoformas de BARD1 de la invención) o con un antígeno estrechamente relacionado con el mismo. Además, un anticuerpo puede ser un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo modificado, siempre que se una a una o más de las proteínas codificadas por los genes marcadores. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser Fab, F(ab')2, Fv o Fv (scFv) monocatenario, donde los fragmentos Fv de las cadenas H y L están ligados por un conector apropiado (Huston J. S. Et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 5879-83). Más específicamente, un fragmento de un anticuerpo se puede generar tratando un anticuerpo con una enzima, incluidas papaína o pepsina. Alternativamente, un gen que codifica el fragmento del anticuerpo se puede construir, insertar en un vector de expresión y expresar en una célula huésped apropiada (véase, por ejemplo, Co M. S. et al., (1994) J. Immunol. 152: 2968-76; Better M. y Horwitz A. H. (1989) Methods Enzymol. 178: 476-96; Pluckthun A. y Skerra A. (1989) Methods Enzymol.
Enzymol. 121: 663-9; Bird R. E. y Walker B. W. 1991 Trends Biotechnol. 9:132-7.
Un anticuerpo se puede modificar por conjugación con una variedad de moléculas, por ejemplo, polietilenglicol (PEG). El anticuerpo modificado se puede obtener modificando químicamente un anticuerpo. Tales métodos de modificación son convencionales en el campo.
Alternativamente, un anticuerpo puede comprender un anticuerpo quimérico que tiene una región variable de un anticuerpo no humano y una región constante de un anticuerpo humano, o un anticuerpo humanizado, que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo no humano, una región marco (FR) y una región constante de un anticuerpo humano. Tales anticuerpos se pueden preparar usando tecnologías conocidas. La humanización se puede realizar sustituyendo CDR o secuencias CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Verhoeyen et al, (1988) Science 239: 1534-6). Por consiguiente, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos, donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. También se pueden usar anticuerpos completamente humanos que comprenden regiones variables humanas además de regiones marco y constantes humanas. Tales anticuerpos se pueden producir usando varias técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los métodos in vitro implican el uso de bibliotecas recombinantes de fragmentos de anticuerpos humanos presentados en bacteriófagos (por ejemplo, Hoogenboom & Winter, (1992) J. Mol. Biol. 227: 381-8). De forma similar, se pueden hacer anticuerpos humanos introduciendo locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que se han inactivado parcial o completamente los genes de inmunoglobulina endógenos. Este método se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nros. 6,150,584; 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425, 5,661,016. Tales anticuerpos se pueden preparar usando tecnologías conocidas.
La presente invención proporciona también una molécula de ARNip recombinante que se une a una molécula de ARN monocatenaria o bicatenaria, donde dicha molécula de ARN monocatenaria o bicatenaria comprende un ARNm que codifica al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106 o secuencias que tienen al menos el 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1­ 7, 105-106 y por la cual se inhibe la expresión de dichas isoformas de BARD1, para usar en un método para tratar y/o prevenir el cáncer de pulmón.
[0063] Preferiblemente, dicho ARNm codifica la isoterma n de BARD1 que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID N.°: 1 o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1.
[0064] En el contexto de la presente invención, el ARNip (ARN interferente o ARN interferente pequeño) inhibe o reduce la expresión de las isoformas de BARD1. Preferiblemente, dichas isoformas son n, n', k, p, p', 6, y y; más preferiblemente n, k, p y de la forma más preferible n y k. Aquí, el término "ARNip" se refiere a una molécula de ARN bicatenaria que evita la traducción de un ARNm diana. Normalmente, el ARNip comprende una secuencia de ácido nucleico sentido y una secuencia de ácido nucleico antisentido contra la expresión de una o más de las isoformas de BARD1 que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106 o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-7, 105­ 106. En general, se puede aislar el ARNip. Un ARNip "aislado" es uno que se elimina de su entorno original. Por ejemplo, un ARNip se considera que está aislado si se clona en un vector que no es una parte del entorno natural.
[0065] El ARNip se puede construir completamente de forma sintética y consistente en dos ARN monocatenarios complementarios o de manera biosintética. El ARNip se construye de modo que un único transcrito tenga tanto la secuencia sentido como la complementaria antisentido del gen diana (por ejemplo, un único ARN horquillado o shRNA). Se pueden usar técnicas estándar para introducir ARNip en la célula, incluidas aquellas en las que el ADN es una plantilla a partir de la cual se transcribe el ARN.
Normalmente, un ARNip que se une a una molécula de ARN monocatenaria, donde dicha molécula de ARN monocatenaria comprende un ARNm que codifica al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106 o secuencias que tienen al menos el 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-7, 105­ 106, asociándose con el transcrito de ARNm normalmente monocatenario, interfiriendo así con la traducción y así, la expresión de las isoformas de BARD1. Así, las moléculas de ARNip de la invención se pueden definir por su capacidad para hibridar específicamente con ARNm o ADNc que codifica al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106 o secuencias que tienen al menos el 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106.
preeriblemente menos de 200, m s preeriblemente menos de 100, a n m s preeriblemente menos de 50 o más preferiblemente menos de 25 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, un ARNip tiene de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. Para mejorar la actividad de inhibición del ARNip, se pueden añadir uno o más nucleótidos de uridina ("u") al extremo 3' de la cadena antisentido de la secuencia diana. El número de "u" que se va a añadir es al menos 2, generalmente de 2 a 10, preferiblemente de 2 a 5. Las "u" añadidas forman una cadena única en el extremo 3' de la cadena antisentido del ARNip.
Un ARNip de la presente invención se puede introducir directamente en las células de una forma que es capaz de unirse a los transcritos de ARNm. En estas formas de realización, las moléculas de ARNip de la invención están típicamente modificadas como se conoce en la técnica. Otras modificaciones también son posibles, por ejemplo, los ARNip conjugados con colesterol han mostrado propiedades farmacológicas mejoradas. Song, et al, Nature Med. 9: 347-51 (2003). Alternativamente, un ADN que codifica el ARNip se puede introducir en un vector.
[0066] Se han identificado varios ARNip útiles. Por ejemplo, un ARNip en el exón 9 (por favor refiérase a la Fig. 1A y la Fig. 4E) es eficiente y lleva a la detención de la proliferación. En otro ejemplo, el uso de un ARNip en el exón 4 es importante para la isoforma n de BARD1 (véase la Fig. 17). Algunos ARNip útiles son:
K34: CATTCTGAGAGAGCCTGTG (SEC ID N.° 107)
K423: GTGCTCAGCAAGACTCATA (SEC ID N.° 108)
K401: AAGTCTCTTTACCATTGGCTG (SEC ID N.° 109)
K78: AAGTGTATGCTTGGGATTCTC (SEC ID N.° 110)
[0067] La presente divulgación describe además un modulador de la actividad biológica de las isoformas de BARD1 que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106, fragmentos biológicamente activos de las mismas o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106, para usar en un método para tratar y/o prevenir el cáncer de pulmón y el cáncer colorrectal. Preferiblemente, dichas isoformas de BARD1 comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1 y 2, fragmentos biológicamente activos de las mismas o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-2.
El modulador de la actividad biológica de las isoformas de BARD1 puede ser un competidor. Preferiblemente, dicho competidor es un compuesto capaz de interrumpir la interacción entre dichas isoformas de BARD1 y un receptor de las mismas. Por ejemplo, el competidor puede ser también un inhibidor o un antagonista. El término "inhibidor" o "antagonista" se refiere a moléculas que inhiben la función de la proteína o el polipéptido uniéndose a él. El competidor, tal como el inhibidor o el antagonista, puede inhibir directamente la interacción entre las isoformas de BARD1 de la invención y su ligando y/o receptor natural dando como resultado una función bioquímica o biológica alterada del receptor. La inhibición competitiva es una forma de inhibición donde la unión del inhibidor evita la unión del ligando y viceversa. En la inhibición competitiva, el inhibidor se une al mismo sitio activo que el ligando natural, sin experimentar una reacción. La molécula de ligando no puede introducirse en el sitio activo mientras el inhibidor está allí, y el inhibidor no puede introducirse en el sitio cuando el ligando está allí. La "actividad o función biológica" de una proteína se refiere a la capacidad para efectuar funciones celulares diversas y para unirse a otras moléculas de manera específica y estrecha.
[0068] También en el contexto de la presente divulgación, un modulador de la actividad biológica de las isoformas de BARD1 de la invención puede ser preferiblemente un microARN (miARN) que modula la expresión génica. Los solicitantes descubrieron que BARD1 puede ser la diana de muchos microARN. La expresión exógena de microARN específico reprime la expresión de BARD1 (véase la Fig. 18). Más preferiblemente en el contexto de la presente invención, los microARN se seleccionan del grupo que comprende: hsa-mir-10a MI0000266: (SEC ID N.° 111); hsa-mir-10b MI0000267 (SEC ID N.° 112); hsa-mir-130a MI0000448 (SEC ID N.° 113); hsa-mir-130b MI0000748 (SEC ID N.° 114); hsa-mir-134 MI0000474 (SEC ID N.° 115); hsa-mir-144 MI0000460 (SEC ID N.° 116); hsa-mir-148a MI0000253 (SEC ID N.° 117); hsa-mir-148b MI0000811 (SEC ID N.° 118); hsa-mir-152 MI0000462 (SEC ID N.° 119); hsa-mir-181a-2 MI0000269 (SEC ID N.° 120); hsa-mir-181a-1 MI0000289 (SEC ID N.° 121); hsa-mir-181b-1 MI0000270 (SEC ID N.° 122); hsa-mir-181b-2 MI0000683 (SEC ID N.° 123); hsa-mir-19a MI0000073 (SEC ID N.° 124); hsa-mir-19b-1 MI0000074 (SEC ID N.° 125); hsa-mir-19b-2 MI0000075 (SEC ID N.° 126); hsa-mir-203 MI0000283 (SEC ID N.° 127); hsa-mir-301a MI0000745 (SEC ID N.° 128); hsa-mir-301b MI0005568 (SEC ID N.° 129); hsa-mir-452 MI0001733 (SEC ID N.° 130); hsa-mir-454 MI0003820 (SEC ID N.° 131); hsa-mir-517a MI0003161 (SEC ID N.° 132); hsa-mir-517c MI0003174 (SEC ID N.° 133); hsa-mir-553 MI0003558 (SEC ID N.° 134); hsa-mir-570 MI0003577 (SEC ID N.° 135); hsa-mir-576 MI0003583 (SEC ID N.° 136); hsa-mir-579 MI0003586 (SEC ID N.° 618 MI0003632 E ID N. 140.
Normalmente, los microARN son moléculas cortas de ácido ribonucleico (ARN), que tienen al menos aproximadamente 22 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nucleótidos, que pueden unirse a secuencias complementarias en un transcrito diana de ARN mensajero (ARNm), que normalmente da como resultado la represión de la traducción o la degradación de la diana y el silenciamiento de gen.
[0069] La presente invención incluye también un método para distinguir el cáncer de pulmón de los cánceres ginecológicos, comprendiendo dicho método el paso de detección, en una muestra biológica obtenida de un sujeto, de al menos una de las isoformas de BARD1 específica para el cáncer de pulmón seleccionada del grupo que comprende la isoterma n que comprende la s Ec ID N.°: 1 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1, donde la presencia de dichas isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón es una indicación de cáncer de pulmón.
[0070] Otra característica útil para distinguir el cáncer de pulmón de los cánceres ginecológicos, es que la isoforma a de BARD1 está ausente en el cáncer de pulmón. La secuencia de aminoácidos de la isoforma a de BARD1 se conoce de WO 2008/119802. Así, opcionalmente, dicho método comprende además la detección, en dicha muestra, de la isoforma a de BARD1 o una secuencia con al menos un 95% de homología con la isoforma a de BARD1, donde la ausencia de dicha isoforma a de BARD1 es una indicación de que dicho sujeto no padece cáncer de pulmón y/o cáncer colorrectal.
Preferiblemente, los cánceres ginecológicos son un grupo de diferentes neoplasias del sistema reproductivo femenino. Los tipos más comunes de neoplasias ginecológicas son cáncer cervical, cáncer ovárico y cáncer de endometrio (útero). Hay otras neoplasias ginecológicas menos comunes, incluyendo el cáncer de vagina, el cáncer de vulva, los tumores trofoblásticos gestacionales y el cáncer de las trompas de Falopio. En el contexto de la presente invención, el cáncer de mama se incluye también en los cánceres ginecológicos.
[0071] La presente invención proporciona además el uso de un kit para detectar la presencia de isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón en una muestra obtenida de un sujeto, que comprende
al menos un cebador o sonda de polinucleótidos donde dicho cebador o sonda de polinucleótidos es específico para un polinucleótido que codifica la isoforma n de BARD1 que comprende la SEC ID N.°: 1 o que tiene al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1 y/o
una combinación de anticuerpos o fragmentos de los mismos que se une específicamente a diferentes epítopos de al menos la isoforma n de BARD1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.°: 1 o que tiene al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1, y de al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende la SEC ID Nros.: 2-7, 105-106, y/o al menos un péptido seleccionado del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 13 a 80.
[0072] Preferiblemente, dichas isoformas de BARD1 comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-22 o secuencias que tienen al menos un 95% de homología con la SEC ID N.°: 1-2.
El polinucleótido que codifica al menos una de las isoformas de BARD1 es un polinucleótido que comprende las secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas del grupo que comprende la SEC ID N.°: 8 (isoforma n), la SEC ID N.°: 9 (isoforma k), la SEC ID N.°: 10 (isoforma P), la SEC ID N.°: 11 (isoforma 6), la SEC ID N.°: 12 (isoforma y), la SEC ID N.°: 141 (isoforma n'), la SEC ID N.°: 142 (isoforma p'); preferiblemente secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID N.°: 8 y 9. Los cebadores, las sondas y/o los anticuerpos se pueden empaquetar juntos junto con otros reactivos de detección necesarios en forma de kit. Por ejemplo, se pueden empaquetar en recipientes separados, por ejemplo, un ácido nucleico o anticuerpo (unido a una matriz sólida o empaquetado separadamente con reactivos para unirlos a la matriz), un reactivo de control (positivo y/o negativo) y/o una etiqueta detectable. También pueden incluirse en el kit instrucciones (por ejemplo, escritas, en cinta, en videocasete, en CD-ROM, etc.) para realizar la detección.
[0073] La presente divulgación describe también vacunas y métodos de vacunación. Por ejemplo, los métodos para tratar o prevenir el cáncer de pulmón y/o el cáncer colorrectal en un sujeto que padece dicho cáncer pueden implicar la administración al sujeto de una composición de vacuna que comprende
una o más de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105-106, una secuencia con al menos de las mismas,
o uno o más péptidos (antígenos) seleccionados del grupo que comprende las SEC ID N.°: 13 a 80. Preferiblemente, dichas isoformas de BARD1 comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-2, una secuencia con al menos un 95% de homología con las SEC ID Nros.: 1-2 y dichos péptidos se seleccionan del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 16, 17, 18, 23, 59-67, 68, 69, 74, 75, 76-80.
En el contexto de la presente invención, un fragmento inmunológicamente activo es un polipéptido que es más corto en longitud que la proteína natural de longitud completa, por ejemplo, una de las isoformas de BARD1, pero que induce una respuesta inmunitaria análoga a la inducida por la proteína de longitud completa. Por ejemplo, un fragmento inmunológicamente activo debería tener al menos 8 residuos en longitud y ser capaz de estimular a una célula inmunitaria, por ejemplo, una célula T o una célula B. La estimulación celular inmunitaria se puede medir detectando la proliferación celular, la elaboración de citocinas (por ejemplo, IL-2) o la producción de un anticuerpo. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press; y Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, 1991-2006, John Wiley & Sons.
[0074] La presente divulgación incluye también una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer de pulmón y/o el cáncer colorrectal en un sujeto que padece dicho cáncer, donde dicha composición comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo de la presente invención.
[0075] La presente divulgación incluye además una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer de pulmón y/o el cáncer colorrectal en un sujeto que padece dicho cáncer, donde dicha composición comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un ARNip de la presente invención.
[0076] La presente divulgación abarca además una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer de pulmón y/o el cáncer colorrectal en un sujeto que padece dicho cáncer, donde dicha composición comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un modulador según la presente invención. Preferiblemente dicho modulador es un microARN, que modula la expresión génica.
"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno, tal como cáncer de pulmón y/o colorrectal, así como aquellos donde el trastorno debe evitarse. Por lo tanto, el mamífero, preferiblemente humano, que se va a tratar en este caso puede haber sido diagnosticado con el trastorno o puede estar predispuesto o ser susceptible al trastorno, tal como cáncer de pulmón y/o colorrectal.
"Prevención" como se utiliza en este caso significa que la administración del modulador o los moduladores, el ARNip y/o los anticuerpos como se describe en la presente invención resulta en una reducción de la posibilidad o probabilidad de que un sujeto con alto riesgo de cáncer de pulmón y/o colorrectal desarrolle de hecho dicho cáncer.
[0077] "Una cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a una sustancia activa (por ejemplo, material químico o biológico) que, cuando se administra a un organismo humano o animal induce un efecto farmacológico y/o fisiológico detectable.
[0078] La respectiva cantidad farmacéuticamente eficaz puede depender del sujeto específico que se va a tratar, de la enfermedad que se va a tratar y del método de administración. El tratamiento comprende normalmente una administración múltiple de la composición farmacéutica, normalmente en intervalos de varias horas, días o semanas. La cantidad farmacéuticamente eficaz de una unidad de dosificación de la sustancia activa, tal como un anticuerpo, un ARNip o un modulador de la presente invención, normalmente está en el intervalo de 0,001 ng a 100 mg por kg de peso corporal del sujeto que se va a tratar. Se entiende que la dosificación adecuada de una sustancia activa de la presente invención dependerá de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, y la naturaleza del efecto deseado.
[0079] Para la administración sistémica, una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, una dosis se puede formular en modelos animales para obtener un intervalo de concentración circulante que incluye el IC50 como se determina en cultivo celular. Tal información se puede usar para determinar con más precisión dosis útiles en seres humanos.
animales, usando t cnicas que se conocen en la t cnica. Una persona normalmente experta en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos en base a datos de animales y, por supuesto, dependerá del sujeto que se esté tratando, del peso del sujeto, la gravedad del trastorno, la forma de administración y el juicio del médico prescriptor.
[0081] "Administración", como se aplica en la presente invención, se refiere al contacto de las composiciones farmacéuticas con el sujeto, preferiblemente un humano.
[0082] La composición farmacéutica puede disolverse o dispersarse en un soporte farmacéuticamente aceptable bien conocido por las personas expertas en la técnica, para la administración parenteral mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular o mediante infusión por goteo intravenoso.
[0083] En cuanto a una composición farmacéutica para la administración parenteral, se puede usar cualquier aditivo convencional tal como excipientes, adyuvantes, ligantes, desintegrantes, agentes de dispersión, lubricantes, diluyentes, potenciadores de absorción, tampones, tensioactivos, solubilizantes, conservantes, emulsionantes, isotonizadores, estabilizadores, solubilizantes para la inyección, ajustadores de pH, etc.
[0084] Los soportes, diluyentes y adyuvantes aceptables que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en la preparación que se pueden usar farmacéuticamente son no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y las concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG).
[0085] La forma de administración de la composición farmacéutica puede ser sistémica o tópica. Por ejemplo, la administración de tal composición farmacéutica pueden ser varias vías parenterales tales como, vías subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdérmica, bucal o mediante un dispositivo implantado, y también se puede administrar por medios peristálticos.
[0086] La composición farmacéutica que incluye una sustancia activa de la presente invención también se puede incorporar o impregnar en una matriz bioabsorbible, donde la matriz se administra en forma de una suspensión de matriz, un gel o un soporte sólido. Además, la matriz puede estar compuesta de un biopolímero.
Se pueden preparar preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas (la patente de EE.UU. n.° 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y [gamma] etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT(TM) (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido lácticoácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Las formulaciones para usar en la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Las personas expertas en la técnica apreciarán que la invención descrita aquí es susceptible a variaciones y modificaciones distintas a aquellas específicamente descritas. La invención incluye también todos los pasos, características, composiciones y compuestos referidos o indicados en esta especificación, individualmente o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones o cualesquiera dos o más de dichos pasos o características. La presente divulgación, por lo tanto, debe considerarse como se ilustra en todos los aspectos y no restrictiva, estando el alcance de la invención de equivalencia pretenden incluirse en las mismas.
La descripción precedente se entenderá más completamente con referencia a los ejemplos siguientes. Tales ejemplos, son, sin embargo, ilustrativos de métodos para poner en práctica la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplos
I - Pacientes - cáncer de pulmón
[0087] Los tejidos tumorales de 100 pacientes con CPNM se recogieron en dos centros diferentes (tabla 1). Todos los pacientes fueron informados y se obtuvo la aprobación de los comités de ética locales. Ocho casos con enfermedades pulmonares benignas (cinco varones y tres mujeres, con edades que varían de 24 a 66 años (edad media, 38 años); cinco casos de enfisema pulmonar, el resto tuberculosis pulmonar y displasia carcinoide) se usaron como muestras de control para la expresión de BARD1.
[0088] Los registros de seguimiento estaban disponibles para 48 de 60 pacientes de Nápoles; el seguimiento fue de uno a 69 meses; dos pacientes murieron durante el periodo perioperatorio, y los datos de 10 pacientes no estaban disponibles. De 48 pacientes con registros de seguimiento, 17 fueron tratados solo con cirugía, cuatro con quimioterapia posoperatoria, uno con quimioterapia y radioterapia posoperatoria, siete pacientes fueron tratados con quimioterapia y radioterapia, cuatro con quimioterapia y uno con radioterapia solo, y los 14 restantes estuvieron sin tratamiento hasta el último seguimiento o la muerte. De estos 48 pacientes, 35 murieron y 13 seguían vivos durante el último periodo de seguimiento.
[0089] Diecisiete de 40 pacientes de Cagliari tenían registros de seguimiento; el seguimiento fue de cinco a 95 meses; 11 pacientes seguían todavía vivos en el último periodo de seguimiento (marzo 2010), y 6 pacientes murieron. La supervivencia global se calculó desde la fecha de cirugía, principio de quimioterapia o radioterapia, o la fecha del diagnóstico para los pacientes sin tratamiento, hasta el último seguimiento o la muerte.
Tabla 1. Características de los pacientes - cáncer de pulmón
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Características de los pacientes - cáncer colorrectal
[0090] Los diagnósticos patológicos fueron hechos por patólogos experimentados en base a criterios de la OMS y estadificados según la clasificación del American Joint Committee on Cancer. Todos los pacientes fueron informados y se obtuvo la conformidad, así como la aprobación de los comités éticos locales.
[0091] Se examinaron un total de 168 casos con cáncer colorrectal que contenían 20 casos de Cagliari y 148 casos de Alemania (tabla 2). Veinte casos de Cagliari que incluyen tanto muestras de tejido tumoral como su tejido adyacente morfológicamente normal (peritumoral) se usaron para la detección mediante PCR con transcriptasa inversa. Se usaron 148 casos con cáncer colorrectal de Alemania para inmunohistoquímica en matrices de tejido. Estos 168 casos estaban compuestos de 106 cánceres de colon y 62 cánceres rectales, todos eran adenocarcinomas. Los pacientes eran 93 varones y 75 mujeres, con edades en el momento del diagnóstico que variaban de 33 a 78 años (edad media, 61 años). 21 pacientes tenían una enfermedad en estadio I, 34 en estadio II, 50 en estadio III y 23 en estadio IV; los 40 pacientes restantes tenían un estadio desconocido, ya que no pudo evaluarse el tumor primario y/o los ganglios linfáticos regionales y/o la metástasis distante. Diez pacientes tenían tumores bien diferenciados (G1), 116 moderadamente diferenciados (G2) y 38 poco diferenciados (G3); los 2 pacientes restantes no se especificaron (GX).
[0092] Las secciones usadas para la tinción inmunoquímica fueron micromatrices de tejido con tetrámeros para cada caso. 75 de 148 casos tuvieron registros de seguimiento, el seguimiento fue de uno a 72 meses, y los 73 pacientes restantes no tenían datos de supervivencia. De estos 75 pacientes con registros de seguimiento, 22 murieron, 48 fueron se perdieron y cinco seguían vivos durante el último periodo de seguimiento.
Tabla 2. Características de los pacientes - cáncer colorrectal
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Inmunohistoquímica
[0093] La inmunohistoquímica se realizó en secciones adyacentes con anticuerpos contra diferentes regiones de BARD1 y contra BRCA1.
Los anticuerpos usados contra diferentes regiones de BARD1, específicamente, N19 (exón 1) (sc-7373) y C20 (exón 11) (sc-7372), se compraron en Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), PVC (exón 3) y WSF (inicio del exón 4) se generaron y se aplicaron como se ha descrito previamente (Irminger-Finger I et al., Mol Cell 8: 1255-66, 2001; Feki A et al., Oncogene 24: 3726-36, 2005; Hayami R et al., Cancer Res 65: 6-10, 2005; Li L et al., Int J Biochem Cell Biol 39: 1659-72, 2007; Redente EF et al., Anticancer Res 29: 5095-101, 2009; Fabbro M et al., J Biol Chem 277: 21315-24, 2002). Los anticuerpos contra BRCA1 eran de Santa Cruz (D16; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). La tinción se visualizó con anticuerpos secundarios (anticonejo de cabra o anticabra de conejo) conjugados con HRP que se aplicaron en diluciones 1:100 a temperatura ambiente durante 1 hora. La tinción de DAB estuvo durante 2 a 15 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina antes de la deshidratación y la fijación. Para determinar la sensibilidad y la especificidad, se realizó la inmunohistoquímica omitiendo los anticuerpos primarios en secciones de control. Para cuantificar la expresión de BARD1 o BRCA1, se eligieron 4 regiones diferentes para cada sección tumoral; el porcentaje de células positivas y la intensidad de tinción se combinaron para calcular una puntuación media de cada muestra. Tres personas realizaron esta cuantificación independientemente y sin ningún conocimiento de los datos clínicos.
Para la inmunohistoquímica realizada en ratones con cáncer de pulmón inducido, se sacrificaron ratones tratados y no tratados emparejados por edad después de 16, 24 y 32 semanas, y los tumores se seccionaron y analizaron por inmunohistoquímica usando anticuerpos PVC, WFS y C20 en dos ratones control y tres que tenían tumores. El análisis y la cuantificación fueron como se ha descrito para muestras humanas.
[0094] Las secciones de tejido de 5 pm fijadas en formalina e incluidas en parafina se desparafinaron en xileno y se rehidrataron a través de concentraciones descendientes de etanol (alcohol al 100%, alcohol al 95%, alcohol al 70%, dH2O). Las secciones se hirvieron durante 5 min en un microondas para la recuperación de antígenos, y se bloquearon las peroxidasas endógenas. Los portaobjetos se incubaron durante toda la noche a 4°C en una cámara de humidificación con el primer anticuerpo después del bloqueo de los epítopos no específicos con BSA (albúmina de suero bovino). Los anticuerpos primarios usados para la detección de BARD1 fueron N19 (sc-7373, Santa Cruz A diluido 1:20, que reconocen eptopos en los exones 1, 3, 4 y 11, respectivamente; el anticuerpo para BRCA1 fue C20 (sc-642, Santa Cruz Biotechnology) (diluido 1:100), que reconoce epítopos C-terminales de BRCA1. Los anticuerpos secundarios (anticonejo de cabra o anticabra de conejo) conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) se aplicaron en diluciones 1:100 a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se permitió la tinción con diaminobencidina (DAB) durante máximo 15 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina antes de la deshidratación y la fijación. Para determinar la sensibilidad y la especificidad, se realizó una inmunohistoquímica omitiendo los anticuerpos primarios en secciones de control. Se midieron los niveles de expresión de BARD1 y BRCA1 de forma semicuantitativa. La tinción se puntuó usando la intensidad y el porcentaje de las células tumorales teñidas. El valor de la intensidad de tinción y el porcentaje de células positivas se multiplicaron para obtener la puntuación final de tinción. La puntuación total de tinción de cada anticuerpo es de 0 a 100, una puntuación de tinción de 25 o menos se define como tinción negativa ("-"), más de 25 se define como tinción positiva ("+"), y se distinguió "+", "++" y "+++" según la puntuación total de tinción fuera de más de 25 a 50, más de 50 a 75, y más de 75. Para el análisis estadístico, solo se consideraron casos positivos frente a negativos, excepto la correlación de la tinción con diferentes anticuerpos usando la puntuación de tinción. Se eligieron cuatro regiones diferentes para cada sección tumoral y fueron puntuadas independientemente por tres observadores (Y, Z; L, L y J, W) sin conocimiento de los datos clínicos.
Análisis de ARN/RT-PCR
[0095] Se realizó una RT-PCR para determinar cualitativamente la expresión de diferentes isoformas y para investigar su estructura. El ARN se aisló de secciones de tejido congelado usando el reactivo Trizol. Se añadió cloroformo (0,1 ml) y se centrifugaron las muestras a 14.000 g durante 15 min a 4 °C para separar las fases. La fase acuosa se transfirió a un tubo Eppendorf sin ribonucleasas, y se añadió un volumen igual de isopropanol para la precipitación de a RN. El sedimento de ARN se lavó con etanol al 75 por ciento y se disolvió en 20 pl de agua sin ribonucleasas. Se midieron las concentraciones para determinar que las proporciones D260/D280 fueran al menos 1,8.
[0096] Para la transcripción inversa, se usó 1 pg de ARN en 21 pl de tampón de transcriptasa inversa que contenía 1 pl de dNTPs (10 mM), 1 pl de oligonucleótidos dT, 2 pl de DTT (0,1 M), 4 pl de tampón de primera cadena y 1 pl de Superscript II. Las reacciones se realizaron a 65 °C durante 5 min, seguido de 42 °C durante 2 min, 42 °C durante 50 min, y 70 °C durante 15 min. Se usaron dos pl de ADNc como plantilla para la PCR con diferentes cebadores.
[0097] El receptor de estrógeno a (ERa) se amplificó usando una temperatura de hibridación de 56 °C y tiempos de extensión de 1 min con los cebadores 5'-ACAAGCGCcAgAGAGATGAT-3' (SEC ID N.°: 81) y 5'-GATGTGGGAGAGGATGAGGA-3' (SEC ID N.°: 82). La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se amplificó como control interno con los cebadores 5'-AGCCACATCGCTCAGACACC-3' (SEC ID N.°: 83) y 5'-GTATCTAGCGCCAGCATCG-3' (SEC ID N.°: 84). El mismo volumen de producto de PCR se usó en geles de agarosa/TBE (al 0,8% para FL, al 1% para las otras) que contenían 0,1 pg/ml de bromuro de etidio (EtBr) para el análisis del mismo tamaño de fragmento de BARD1 (20 pl para los exones 1-11, 10 pl para los exones 1-4, 5 pl para los otros) y visualización bajo luz UV.
[0098] Los productos de la PCR (10 pl) se analizaron en geles de agarosa/TAE al 1% suplementados con bromuro de etidio y visualizados bajo luz UV. Por favor refiérase a la tabla 3 para una lista completa de cebadores y condiciones.
[0099] El kit QIAEX II (Qiagen, Hombrechtikon, Suiza) se usó para la purificación de ADN. Se realizó la secuenciación con cebadores internos de BARD1.
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Análisis de imagen para la PCR en Java National Institutes o Health, http: rsbweb.nih.govii . Los productos de la P R se sometieron a un gel de agarosa, se visualizaron con tinción de bromuro de etidio y se fotografiaron. Las imágenes se guardaron como ficheros JPG antes de ser convertidas a escala de grises para el análisis. La imagen se abrió en ImageJ, la función de calibración se estableció en OD sin calibrar para cada imagen antes de medir. La herramienta de rectángulo se usó para dibujar el área para medir el mismo tamaño de las bandas de PCR. El mismo tamaño de banda en la escalera de ADN que se aproxima al tamaño de las bandas de interés en las muestras se usaron para obtener los valores precisos relativos en diferentes geles en base al ajuste del área del rectángulo. Se perfiló el área del valor máximo. Se usó la proporción del área de valor máximo como un porcentaje del área total bajo la curva para el análisis estadístico.
Extracción de ARN total, transcripción inversa y PCR
[0101] La RT-PCR se realizó para mostrar cualitativamente la expresión de diferentes isoformas y para determinar su estructura. El aislamiento de ARN de secciones de tejido congelado se obtuvo utilizando el reactivo Trizol según el protocolo de aislamiento de ARN. Se añadió cloroformo (0,1 ml) y las muestras se centrifugaron a 14.000 g durante 15 min a 4 °C para separar las fases. La fase acuosa se transfirió a un tubo Eppendorf sin ribonucleasas, y se añadió un volumen igual de isopropanol para la precipitación de ARN. El sedimento de ARN se lavó con etanol al 75 por ciento y se disolvió en 20 pl de agua sin ribonucleasas. Se midieron las concentraciones para determinar que las proporciones D260/D280 fueran al menos 1,8.
[0102] Para la transcripción inversa, se usaron 1,5 pg de ARN en un volumen final de 25 pl, que contenía 5 pl de tampón de reacción M-MLV RT 5x, 2 pl de oligonucleótidos dT (500 pg/ml), 1,5 pl de 10 mM de dNTP, 1 pl de inhibidor de ribonucleasa RNasin recombinante (25 u/pl) y 1 pl de transcriptasa inversa de M-MLV (200 u/pl). La reacción se incubó 5 minutos a 70 °C seguido de 60 minutos a 42 °C y 10 minutos a 70°C. Se usaron tres pl de ADNc como plantilla para la amplificación de BARD1 FL, y se usaron 2 pl de ADNc para la amplificación de varios fragmentos de BARD1. La PCR se realizó con Taq polimerasa en un volumen final de 50 pl. La desnaturalización primaria (94 °C, 2 min) y la extensión final (72 °C, 10 min) fueron las mismas para todas las reacciones de PCR. Las temperaturas de hibridación y los tiempos de extensión fueron variables según los diferentes cebadores y la longitud del producto esperado para BARD1 (tabla 3).
[0103] El receptor de estrógeno a (ERa) se amplificó usando una temperatura de hibridación de 56 °C y tiempos de extensión de 1 min con los cebadores 5'-ACAAGCGCcAgAGAGATGAT-3' (SEC ID N.°: 81) y 5'-GAT GTGGGAGAGGAT GAGGA-3' (SEC ID N.°: 82). La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se amplificó como control interno con los cebadores 5'-AGCCACATCGCTCAGACACC-3' (SEC ID N.°: 83) y 5'-GTATCTAGCGCCAGCATCG-3' (SEC ID N.°: 84). El mismo volumen de producto de la PCR se cargó en geles de agarosa/TBE (al 0,8% para FL, al 1% para las otras) que contenían 0,1 pg/ml de bromuro de etidio (EtBr) para la visualización del fragmento de BARD1 (20 pl para los exones 1-11, 10 pl para los exones 1-4, 5 pl para los otros) bajo luz UV.
[0104] El kit QIAEX II (Qiagen, Hombrechtikon, Suiza) se usó para la purificación de ADN de productos de la RT-PCR según las instrucciones del fabricante seguido de la secuenciación con los cebadores directos e inversos usados para la PCR, o cebadores adicionales dentro de los fragmentos si no se produjo ninguna secuencia superpuesta.
Modelo de ratón
[0105] Los tumores de pulmón se indujeron químicamente en ratones BALB/c como se describe en Redente EF, Dwyer-Nield LD, Barrett bS, et al: Lung tumor growth is stimulated in IFN-gamma-/- mice and inhibited in IL-4Ralpha-/- mice. Anticancer Res 29: 5095-101, 2009. Se inyectaron intraperitonealmente ratones machos, de 6 - 8 semanas de edad, con un mg de uretano por g de peso corporal una vez por semana durante siete semanas. Los ratones se sacrificaron 16, 24 y 32 semanas después del tratamiento. El tejido pulmonar y los tumores se diseccionaron y se procesaron para el análisis inmunoquímico. Se analizaron tejidos de tres ratones para cada punto temporal.
Análisis estadístico
de expresi n de los eptopos de BARD1 y BR A1. e us la prueba x2 para comparar el porcentaje de casos positivos en tejidos tumorales frente a peritumorales, y la correlación de casos positivos de la expresión de BARD1 con variables clínicas. La prueba T se usó para medir la correlación del nivel de expresión de BARD 1 con variables clínicas. Para asociaciones con la supervivencia, los pacientes se colocaron además en dos grupos según sus niveles de expresión de BARD1. Las diferencias de supervivencia se estimaron usando el método de Kaplan-Meier y se compararon con la prueba de rango logarítmico. Para todos los cálculos, las pruebas fueron bilaterales, y se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05. Los análisis se realizaron usando la versión 13 de Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) para Windows (SPSS Inc, Chicago, IL).
II - Resultados
[0107] Se realizó una inmunohistoquímica en secciones tumorales, que comprendían diferentes tipos, grados y estadios de 100 pacientes (tabla 1). Se usaron anticuerpos que reconocen cuatro epítopos diferentes de BARD1 (mapeados en los exones 1, 3, 4 y 11), que podrían resultar teóricamente en 16 patrones de tinción diferentes. Sorprendentemente, solo se observaron pocos patrones distintos, y se observó tinción para los cuatro anticuerpos en la mayoría de los tumores (Fig. 1A-E). La tinción de secciones adyacentes mostró que diferentes epítopos estaban expresados en diferentes regiones de las secciones tumorales y en diferentes compartimentos subcelulares (Fig. 1B-D), lo que sugiere que diferentes isoformas de BARD1 estaban expresadas en un único tumor. Típicamente, BARD1-N19 (exón 1) y C20 (exón 11) mostraron una tinción granulosa citoplásmica y estaban colocalizados en las mismas regiones de un tumor. Las inmunotinciones con BARD1 PVC (exón 3) y WFS (exón 4) fueron difusas y en el citoplasma. Estas diferencias en intensidad y localización intracelular de las tinciones sugirieron que la expresión de los cuatro epítopos no reflejó la expresión de tipo salvaje de BARD1, sino la expresión simultánea de diferentes isoformas.
[0108] Los niveles de expresión de N19 y C20 estaban correlacionados fuertemente entre sí, como fue el caso para PVC y WFS (Fig. IF), pero otros patrones de tinción con anticuerpos no estaban correlacionados. Así, podría concluirse que las formas truncadas N-terminal y C-terminalmente, así como las formas con deleciones internas, se expresan en el CPNM. Particularmente, la tinción con WFS (extremo 5' del exón 4) estaba sobrerregulada en muchos cánceres de pulmón, a diferencia del patrón de expresión de epítopos observado para cánceres ováricos, donde la tinción con WFS fue poco frecuente.
[0109] Se investigó la coexpresión de BRCA1 y BARD1 en las secciones de tejido adyacente (Fig. 1B-D). BRCA1 se expresó en el 66,7% de las muestras de CPNM, pero no se correlacionó con la expresión de ninguno de los epítopos de BARD1. Como BRCA1 no está coexpresado con BARD1, estos datos sugieren que las funciones del heterodímero BRCA1-BARD1 se pierden en el CPNM.
[0110] Se observó expresión de BARD1 en tejido tumoral y peritumoral normal, aunque más elevada en tumores (Fig. 2A; Fig. 5). La expresión fue mayor generalmente en tumores de pacientes mujeres que varones (Fig. 2B).
[0111] La expresión de epítopos específicos de BARD1 fue menos frecuente en adenocarcinomas que en no adenocarcinomas (incluyendo carcinoma de células escamosas y carcinoma de células grandes) (Fig. 2C). Sin embargo, no se halló ninguna correlación de la tinción con anticuerpos con el grado y el estadio tumoral (datos no mostrados).
[0112] También se evaluaron los epítopos individuales de la expresión de BARD1 y el patrón de expresión con la supervivencia libre de enfermedad (SLE) y la supervivencia global (SG) en 65 pacientes con datos de seguimiento. Los pacientes con tinción positiva individual de PVC y WFS tenían una SLE significativamente más corta y una SG más corta que aquellos con una tinción negativa. Lo más importante es que los pacientes con un patrón de tinción positiva simultánea con PVC y WFS mostraron una supervivencia mucho más corta comparada con aquellos que tenían combinaciones diferentes. No se observó ninguna correlación entre N19, C20 y otros patrones de tinción y SLE o SG.
[0113] Los análisis univariante y multivariante usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox se realizaron para evaluar si los marcadores analizados tienen una importancia pronóstica independiente. En el análisis univariante, el estadio patológico mostró también predicción de la SLE y la SG (tabla 5). El estadio patológico y otros dos posibles factores pronósticos, el tipo histológico y el género del individual de PV y WF , el patr n de tinci n positiva simult nea de PV y WF , y el estadio patológico conservan una importancia pronóstica independiente tanto para SLE como para SG (tabla 5).
Tabla 4. Análisis univariante de supervivencia en 65 pacientes con CPNM con datos de seguimiento
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Tabla 5. Análisis multivariante de supervivencia en 65 pacientes con CPNM con datos de seguimiento
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predictores del modelo (enfermedad, estadio y sexo)
[0114] En otro ejemplo de la presente invención, se mostró una correlación de las isoformas de BARD 1 con la iniciación y la progresión del cáncer de pulmón, donde se monitorizó la expresión de BARD1 en el cáncer de pulmón inducido experimentalmente. Las inyecciones múltiples de uretano en ratones BALB/c inducen la progresión de tumores de pulmón primarios a adenocarcinomas. Este tratamiento conduce a tumores macroscópicos en 16 semanas; se hacen más grandes en 24 semanas e invaden el tejido adyacente normal después de 32 semanas. Se seleccionaron los tejidos normales y las regiones tumorales en todos los estadios y se puntuó la tinción con anticuerpos (Fig. 3). Consistentemente, la expresión de PVC y WFS fue débil, y la de C20 fue intensa en los animales de control. Este patrón fue similar en tumores de 16 semanas. Sin embargo, en tumores de 24 semanas, las expresiones de PVC y WFS aumentaron en comparación con C20 y estaban altamente sobrerregulados en tumores de 32 semanas. Estos experimentos demuestran que el patrón de expresión de BARD1 cambia durante los diferentes estadios de la tumorigénesis y sugieren que los epítopos de BARD1 que se mapean en los exones 3 y 4 pueden estar implicados en la promoción tumoral y la progresión hacia un estadio invasivo.
[0115] La estructura de diferentes isoformas expresadas en el CPNM se determinó por RT-PCR con cebadores que amplifican toda la región codificante de BARD1 a partir de muestras de 10 pacientes mujeres y 10 varones. Se extrajo ARN de tejido tumoral y de tejido peritumoral normal. El tejido pulmonar normal de control se obtuvo de los pacientes con enfermedades respiratorias benignas. La expresión de BARD1 en pulmón normal fue ausente o muy baja; solo se halló una expresión débil de BARD1 en los controles por RT-PCR (Fig. 4A) y por inmunohistoquímica (datos no mostrados). La RT-PCR de los pacientes con CPNM mostró una expresión de BARD1 FL y varias de sus isoformas diferentes en la mayoría de las muestras tumorales y peritumorales. En la mayoría de los casos, los patrones de expresión específicos de BARD1 FL y de las isoformas fueron idénticos en tejidos peritumorales normales y tumorales (Fig. 4B).
Para distinguir las isoformas de peso molecular similar, la RT-PCR se realizó con cebadores que amplifican los exones 1 y 4, o 1 y 6. Se halló, además de BARD1 FL, la expresión de la isoforma p ya conocida, pero no la a (Wo 2008/119802) y además dos isoformas nuevas k y n (Fig. 4B, C, E, Fig. 6 y Fig. 7).
[0116] Se cuantificó la expresión de las isoformas obtenidas por RT-PCR en casos de mujeres y varones. FL y las isoformas se expresaron de forma similar en tejido tumoral y peritumoral, a diferencia de la sobrerregulación significativa de las isoformas de BARD1 a nivel de proteína (Fig. 1A y Fig. 5). La expresión de las isoformas de BARD1 p y k estaba significativamente sobrerregulada en varones en comparación con mujeres (P < 0,05), mientras que la expresión de las isoformas BARD1 n, BARD1y y BARD1s estaba sobrerregulada en mujeres en comparación con varones (Fig. 7).
[0117] En otro ejemplo de la presente invención, se halló expresión de ERa en todos los tejidos pulmonares de mujeres y varones, tanto en tejidos normales como peritumorales (Fig. 4D), lo que sugiere que las isoformas de BARD1 pueden estar relacionadas con la señalización de estrógenos en el CPNM.
III - Resultados
[0118] La expresión de BARD1 en el cáncer colorrectal se investigó realizando una inmunohistoquímica en secciones tumorales de 148 muestras de tejido incluido en parafina de cáncer colorrectal presentado como micromatriz tisular con tetrámeros para cada uno de los casos (tabla 2). Ciento cuarenta y cinco casos fueron elegibles para el análisis después del ensayo inmunohistoquímico, y se analizaron en este estudio. Cuatro anticuerpos (N19, PVC, WFS y C20) contra diferentes regiones de BARD1 (exón 1, exón 3, exón 4 y exón 11, respectivamente) se usaron para distinguir diferentes epítopos de BARD1 en secciones de tejido adyacente (Fig. 1A). La expresión de BRCA1 también se investigó usando el anticuerpo BRCA1 C20 contra el epítopo C-terminal de BRCA1.
[0119] La tinción positiva para cada uno de los cuatro anticuerpos fue variable en el cáncer colorrectal (Fig. 9A). Las tinciones de BARD1 N19, PVC, WFS y C20 se clasificaron como positivas en 36 (24,8%), 122 (84,1%), 129 (89%) y 61 (42,1%) casos de cáncer colorrectal, respectivamente. Se observaron 142 casos con al menos una tinción positiva con anticuerpos, y solo en tres casos no se c ncer colorrectal expresaron al menos un eptopo de BARD1.
[0120] Aunque en principio son posibles 16 combinaciones diferentes para la expresión de los 4 epítopos, solo se hallaron tres combinaciones principales (Fig. 9B). Estos 3 patrones de expresión de BARD1 en cáncer colorrectal incluyeron: la expresión de solo los epítopos medios fue el más frecuente (38,6%) (Fig. 2B, D), la tinción para los cuatro anticuerpos fue el segundo (18,6%) (Fig. 8B, C, E), la pérdida del epítopo N-terminal fue el tercer (17,9%) (Fig. 8B, F) patrón de expresión más frecuentemente observado.
[0121] Como la expresión de BARD1 en tejidos de CPNM, se ha observado que las tinciones con los cuatro anticuerpos fueron citoplásmicas, pero en regiones diferentes. BARD1 N19 y C20 mostraron una tinción granulosa, mientras que PVC y WFS mostraron una tinción difusa, y se colocalizaron en las mismas células o las mismas regiones, respectivamente (Fig. 8C-F). Para seguir investigando esto, el patrón de expresión obtenido con cada anticuerpo se cuantificó y se compararon los resultados. Se observó una fuerte correlación entre los niveles de expresión de N19 y C20 (p = 0,71; P = 0,000). Otras comparaciones tales como PVC y WFS (p = 0,39; P = 0,000), Pv C y C20 (p = 0,36; P = 0,000), y WFS y C20 (p = 0,27; P = 0,001) mostraron correlaciones débiles. No se halló ninguna correlación entre las tinciones de N19 y PVC, y N19 y WFS (Fig. 10A).
[0122] A partir de los niveles de expresión de epítopos diferentes, la localización intracelular, la intensidad de tinción con anticuerpos diferentes, la expresión correlacionada o no correlacionada de diferentes epítopos de BARD1, y los patrones de expresión con cuatro anticuerpos contra los diferentes epítopos de BARD1, fue posible concluir que las formas truncadas N-terminal y C-terminalmente, la pérdida de las formas del extremo N-terminal, así como las formas que contienen los cuatro epítopos reactivos con los anticuerpos usados en este estudio, estaban expresadas en el cáncer colorrectal.
IV - Expresión no coordenada de BARD1 y BRCA1
[0123] A diferencia de BARD1, la tinción de BRCA1 mostró tanto tinción granulosa citoplásmica como nuclear en la misma célula (Fig. 8C). Se observó una tinción positiva de BRCA1 en el 22,1% (32 de 145) de los casos de cáncer colorrectal, mientras que la tinción positiva de N19 se observó en el 24,8% (36 de 145) de los casos. De manera interesante, solo 7 de 61 casos (11,5%) que fueron N19 positivos fueron también BRCA1 positivos. Además, no se halló ninguna correlación entre la expresión de BRCA1 y la expresión de distintos epítopos de BARD1 (Fig. 10B). Estos resultados demostraron que la expresión de BRCA1 no estaba coordinada con BARD1 en el cáncer colorrectal.
V - Correlación de la expresión de la proteína BARD1 con características clinicopatológicas y el pronóstico de los pacientes
[0124] La frecuencia de tinción positiva de N19 estaba significativamente asociada con el sexo femenino (P = 0,014) (Fig. 11A), esto es consistente con los resultados en los que BARD1 N19 se sobreexpresó en mujeres más que en varones en el CPNM (Fig. 2a-B). La expresión de diferentes epítopos de BARD1 y la expresión de BRCA1 no estaban correlacionados con ninguna de las otras variables clinicopatológicas, por ejemplo, grado tumoral, tumor primario, ganglio linfático y estado de metástasis distante, y estadio tumoral (Fig. 4B-F). Además, no se obtuvo ninguna correlación significativa entre diferentes patrones de expresión y variables clinicopatológicas (datos no mostrados).
[0125] La correlación de la expresión de BARD1 y de BRCA1 con la supervivencia se evaluó también comparando diferentes patrones de expresión de BARD1 (Fig. 9B) y la expresión individual de cuatro epítopos de BARD1 y BRCA1 con la supervivencia en 75 casos de cáncer colorrectal con datos de seguimiento. Se observó (tabla 6) que los pacientes con tinción positiva de BARD1 N19 tenían mayores índices de supervivencia a 1 año, a los 2 años y a los 3 años, pacientes con tinción positiva de C20 tenían mayores tasas de supervivencia a 1 año y a los 3 años, en comparación con su tinción negativa. No se obtuvo ninguna diferencia de la comparación de BARD1 PVC y WFS (los casos de tinción negativa no fueron suficientes para un análisis adicional), y la tinción positiva y negativa de BRCA1 con la supervivencia.
[0126] Cuando se usó el patrón de expresión como comparación (tabla 7), se observó que el patrón de expresión de la tinción positiva con los cuatro anticuerpos se correlacionaba con tasas de expresi n de solo la expresi n de los eptopos medios y otros patrones de expresi n en grupo. in embargo, el patrón de expresión de solo la expresión de los epítopos medios (detectada con PVC y WFS) estaba correlacionado con tasas de supervivencia a 1 año, a los 2 años y a los 3 años inferiores en comparación con otros patrones de expresión en grupo, así como en comparación con el patrón de tinción positiva con los cuatro anticuerpos. No se halló ninguna correlación entre el patrón de expresión de pérdida del epítopo del extremo N-terminal y otros patrones de expresión, incluyendo el patrón de expresión de tinción positiva con los cuatro anticuerpos (con la excepción de la tasa de supervivencia a 1 año), solo el patrón de expresión de los epítopos medios y todos los otros patrones de expresión en grupo.
[0127] En conjunto fue posible concluir que el patrón de expresión de BARD1 de la tinción positiva con los cuatro anticuerpos es un factor pronóstico positivo, así como la expresión del epítopo N-terminal de BARD1; a la inversa, solo la expresión simultánea de los dos epítopos medios es un factor pronóstico negativo, pero no su expresión individual de los epítopos en el cáncer colorrectal.
Tabla 6. Correlación de la expresión de distintos epítopos de BARD1 y BRCA1 con la supervivencia en 75 pacientes con cáncer colorrectal
Figure imgf000032_0001
Tabla 7. Correlación de patrones de expresión de BARD1 con la supervivencia en 75 pacientes con cáncer colorrectal
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000033_0001
VI - Estructura de las isoformas de BARD1 expresadas en el cáncer colorrectal
[0128] La expresión de BARD1 a nivel de ARNm se evaluó mediante RT-PCR en 20 tejidos tumorales y tejidos peritumorales, incluyendo 10 casos de varones y 10 de mujeres. Se extrajo ARN de secciones de tejido congelado. La RT-PCR se realizó utilizando el cebador directo en el exón 1 y los cebadores inversos en el exón 11 y el exón 4 para amplificar las regiones codificantes de BARD1 (del exón 1 al exón 11, y del exón 1 al exón 4), la GAPDH se amplificó como control. Conjuntamente, ERa se amplificó también a partir de esta serie de muestras, como se hizo en el CPNM (Fig. 11A).
[0129] A diferencia del CPNM, los patrones de expresión de ARNm de BARD1 fueron bastantes diferentes en tejidos tumorales y tejidos peritumorales del colon y el recto. BARD1 FL y las isoformas se expresaron frecuentemente en la mayor parte de las muestras tumorales (90%, 18 de 20 casos); pero, en tejidos peritumorales, no fue frecuente ninguna expresión de BARD1 (65%, 13 de 20 casos), 7 casos (35%) expresaron solo BARD1 FL y/o menos isoformas. Esto fue estadísticamente significativo (P = 0,0003). Se observaron también resultados similares en varones (8/10 vs 4/10, respectivamente) (P = 0,0679) y en mujeres (10/10 vs 3/10, respectivamente) (P = 0,0010) (Fig. 12A). Todas las isoformas de BARD1, que estaban expresadas en tejidos de CPNM incluyendo la isoforma nueva k, con una deleción del exón 3, y la isoforma nueva n con una deleción de 408 bp en el extremo 3' del exón 4, estaban expresadas también en los tejidos de cáncer colorrectal. Para acentuar, BARD1 FL y todas las isoformas de BARD1 estaban expresadas frecuentemente en tejidos tumorales, pero menos o sin expresión en los tejidos peritumorales (P < 0,05 para todos). (Fig. 12B).
VII - Patrón de expresión de BARD1 similar observado en tejido de varones y mujeres
[0130] Las isoformas de BARD1 p y k estaban sobrerreguladas significativamente en el tejido pulmonar de los varones y las isoformas n, y y £ estaban altamente expresadas en el tejido pulmonar de mujeres. A diferencia del tejido pulmonar, la frecuencia de la expresión de BARD1 FL y las isoformas fue similar en el tejido colorrectal de varones y mujeres, incluyendo en tejidos peritumorales (P > 0,05 para todos) (Fig. 12c ) y en tejidos tumorales (P > 0,05 para todos) (Fig. 12d ).
[0131] No se observó ninguna expresión de ERa en tejidos colorrectales en las muestras de la serie, incluyendo en tejidos peritumorales y tejidos tumorales, en varones y mujeres (Fig. 11B). Este resultado podría, al menos parcialmente, explicar que no hubiera ninguna correlación de la expresión de BARD 1 con varones y mujeres en tejidos colorrectales, en comparación con la expresión de BARD1 en tejidos pulmonares.
VIII - Correlación de la expresión de las isoformas de BARD1 con variables clínicas
[0132] Se ha observado que BARD1 FL y las isoformas de BARD1 estaban expresadas más frecuentemente en pacientes con edades de más de 60 años que iguales o menores de 60 años. Especialmente, la frecuencia de la expresión de las isoformas de BARD1 9, ó y n estaba significativamente asociada con los pacientes de mayor edad (P < 0,01) (figura 13A). Además, la expresión de la isoforma k de BARD1 en frecuencia estaba asociada significativamente con un tamaño de tumor grande o cercano a la invasión tisular (T3 y T4) (P = 0,0098), implicación de ganglios linfáticos (N1 y N2) (P = 0,0422) y estadios avanzados (estadio III y IV) (P = 0,0422) (Fig. 6B-D). No se observó ninguna correlación entre la expresión de BARD1 y el grado histopatológico del tumor (Fig. 13E).
IX - Detección de anticuerpos autoinmunitarios anti-BARD1 en sangre de pacientes con cáncer de pulmón Método

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1.Método para detectarlapresencia de una isoforma de BARD1 específica de cáncerde pulmón en una muestra biológicaque se ha obtenido a partirde un sujetoque comprende elpaso de detección, en dicha muestra, de al menos una de las isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón seleccionadasdelgrupoque comprende
    laisoforman que comprende laSEC ID N.°: 1,y una secuencia con almenos un 95% de homología con laSEC IDN.°:1,
    donde lapresencia de dichas isoformas de BARD1 específicas de cáncerde pulmón en una muestra de dichosujetoes una indicaciónde que dichosujetopadece cáncerde pulmón,tieneun mayor riesgo de cáncer de pulmón y/otiene un riesgode recurrencia después de un tratamiento paraelcáncerde pulmón.
    2.Método según lareivindicación 1,que comprende además elpaso de detección, en dichamuestra, de almenos una de lasisoformas de BARD1 seleccionadas delgrupo que comprende: laisoforma k que comprende laSEC ID N.°:2 o una secuencia con almenos un 95% de homología con laSEC ID N.°:2.
    3. Método de las reivindicaciones 1 a 2, donde dicho método comprende además ladetección, en dicha muestra biológica, de almenos una de las isoformas de BARD1 seleccionadas del grupo que comprende
    laisoforma n' que comprende laSEC ID N.°: 105 o una secuencia con al menos un 95% de homologíacon laSEC iDN.°:105,
    la isoforma p que comprende la SEC ID N.°: 5 o una secuencia con al menos un 95% de homologíacon laSEC iD N.°:5,
    la isoforma ó que comprende la SEC ID N.°: 6 o una secuencia con al menos un 95% de homologíacon laSEC iD N.°:6,
    la isoforma y que comprende la SEC ID N.°: 7 o una secuencia con al menos un 95% de homologíacon laSEC iD N.°:7,y
    laisoforma p' que comprende laSEC ID N.°: 106, o una secuencia con al menos un 95% de homologíacon laSEC IDN.°:106.
    4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha muestra biológica se selecciona del grupo que comprende una muestra de biopsia, una muestra histológica, líquidos pulmonares, una muestra de tejido congelado, una muestra de tejidotumoral, una muestra de heces, líquido cefalorraquídeo (LCR),célulastumoralescirculantes(CTC)yuna muestrade sangre.
    5.Método de lasreivindicaciones1a4,donde lapresenciade dichasisoformasde BARD1 se detecta usando anticuerposespecíficosparadichasisoformasde BARD1.
    6.Método según lareivindicación5,donde dichos anticuerposson una combinación de anticuerposo fragmentos de losmismos que se unen específicamenteadiferentesepítoposde almenos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende lasSEC ID Nros.: 1-7, 105-106 o lassecuencias con almenos un 95% de homología con lasSEC IDNros.: 1-7,105-106.
    7.Método de lasreivindicaciones1a4,donde lapresenciade dichas isoformasde BARD1 sedetecta mediante ladetección del nivelde ARNm que codificaalmenos una de lasisoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7,105-106osecuenciascon almenos un 95% de homologíacon lasSEC IDNros.: 1-7, 105­ 106.
    8.Método de lasreivindicaciones1a4,donde lapresenciade dichasisoformas de BARD1 sedetecta mediante la detección de la presencia de anticuerpos autoinmunitarios específicos de dichas isoformas de BARD1 en lamuestrade sangre obtenidadelsujeto,ydonde almenos cuatroantígenos seleccionados del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 13 -80 se usan para ladetección de dichosanticuerposautoinmunitariosespecíficosde dichas isoformasde BARD1.
    mediante
    la detección del nivel de ARNm que codifica al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 1-7, 105- 106 o lassecuencias con almenos un 95% de homología con lasSEC ID Nros.: 1-7, 105-106,y
    ladetección de la presencia de anticuerpos autoinmunitarios específicos para dichas isoformas de BARD1 en la muestra de sangre obtenida del sujeto, y donde al menos cuatro antígenos seleccionados del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 13 -80 se usan para ladetección de dichosanticuerposautoinmunitariosespecíficos paradichasisoformasde BARD1.
    10.Polipéptidoaisladoy/opurificadoque comprende laSEC IDN.°:1oquetienealmenos un 95% de homología con laSEC IDN.°: 1paraeluso como biomarcadoren elmétodo de lasreivindicaciones 1 a4.
    11. Uso de un kitpara detectar lapresencia de las isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón en una muestraobtenidaapartirde unsujetoque comprende:
    almenos un cebadorosonda de polinucleótidosdonde dichocebadorosonda de polinucleótidos esespecíficapara un polinucleótidoque codificalaisoterman de BARD1 que comprende laSEC IDN.°:1oquetienealmenos un95% de homologíacon laSEC IDN.°:1,y/o
    una combinación de anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a diferentes epítopos de al menos la isoterma n de BARD1 que comprende la secuencia de aminoácidos de laSEC IDN.°: 1,oque tienealmenos un 95% de homología con laSEC IDN.°: 1, y de al menos una de las isoformas de BARD1 que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEC ID Nros.: 2-7, 105-106, y/o al menos un péptidoseleccionadodelgrupo que comprende lasSEC IDNros.: 13a80.
    12.Uso según lareivindicación11,donde dichacombinación de anticuerposincluye:
    -uno oambos de losanticuerposseleccionadosdelgrupoque consisteen:WFS yBL;y, -el anticuerpo JH2, o anticuerpos que se unen a los mismos epítopos correspondientes que WFS, BL y/oJH2,
    donde elhallazgode launiónde losanticuerposWFS y/oBL,y,almismo tiempo, laausenciade unión aJH2, esuna indicaciónde lapresenciade laisoterman de BARD1.
    13.Uso según lareivindicación11,donde dichacombinación deanticuerposincluyeun anticuerpoque se une específicamente a la región eliminada del exón 4 de la isoterma n de BARD y donde la ausenciade uniónpordichoanticuerpoesuna indicaciónde lapresenciade laisoterman de BARD1.
    14. Método para distinguirelcáncer de pulmón de loscánceres ginecológicos, comprendiendo dicho método elpaso de detección, en una muestra biológica obtenida a partirde un sujeto, de almenos una de las isoformas de BARD1 específicas de cáncer de pulmón seleccionadas del grupo que comprende:
    laisoterman que comprende laSEC IDN.°:1oque tienealmenos un 95% de homología con laSEC IDN.°:1,
    donde lapresenciade dichaisoformade BARD1 específicade cáncerde pulmón es una indicaciónde cáncerde pulmón.
    15.Anticuerpoofragmentodelmismo que se une específicamentea laisoforman (SEC IDN.°:1). 16.Anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un epítopo como se expone en laSEC ID N.°: 144.
    17. Molécula de ARNip recombinante que se une a una molécula de ARN monocatenario o bicatenario, donde dicha molécula de ARN monocatenario o bicatenario comprende un ARNm que codifica laisoforma n de BARD1 que comprende laSEC ID N.°: 1 o que tiene almenos un 95% de homología con laSEC IDN.°:1yporlacualse inhibelaexpresión de dichaisoformade BARD1, para usar en un método para tratar y/o prevenir el cáncer de pulmón.
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