JP2004511223A

JP2004511223A - 多重化酵素アッセイ

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Publication number: JP2004511223A
Application number: JP2002517831A
Authority: JP
Inventors: スー，　キフェン; ギボンズ，　イアン
Original assignee: アクララ　バイオサイエンシーズ，　インコーポレイテッド
Priority date: 2000-08-08
Filing date: 2001-08-08
Publication date: 2004-04-15
Also published as: US20020119500A1; CA2417355A1; US20040048328A1; US6846645B2; WO2002012547A1; EP1309717A1; AU2001279222B2; US6630296B2; AU7922201A

Abstract

多重化酵素アッセイ方法およびこの方法を行うための基質セットが開示される。この方法は、複数の酵素反応を、酵素基質を対応する産物へと変換するのに有効な条件下で複数の酵素基質の存在下で実施する工程を包含し、ここで、各基質の産物および基質は、互いに、そして他の基質およびそれらの対応する産物とは異なる分離特徴を有する。この反応（この反応は、別々の反応または合わせた反応で行われ得る）を行った後、この反応物中の基質および産物は、単一の分離媒体中で分離される。各分離された産物および基質について、産物および基質の量に関連する産物および基質ならびにシグナルを同定するのに有効な分離特徴が検出される。これから、反応の各々において対応する産物に変換された基質の量を決定し得る。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明の分野は、酵素アッセイであり、特に、多重化基質および必要に応じて多重化酵素を含むアッセイである。
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【表３】

（発明の背景）
単一の容器において複数の決定を実施することおよび各決定の結果を個々に決定し得ることに興味を有する多数の状況が存在する。個々の結果を達成し得るために、各決定が他の決定とは独立すること、および各決定が、測定され得かつ他の決定の産物とは区別され得る産物を提供することが必要である。
【０００４】
目的の分野の１つは、複数の酵素に対する、環境変化の影響である。化合物を生物学的活性についてスクリーニングする際に、１以上の標的に対するこの化合物の影響、ならびに標的ではない酵素に対するこの化合物の影響に興味を有する。それゆえ、複数の酵素に対する化合物の影響を決定するために同じ条件下で単一の決定を実施し得るならば、目的の標的に関するこの化合物の生物学的活性を決定し得るだけでなく、副作用に関するこの化合物の特異性もまた決定し得る。
【０００５】
生物学的活性について化合物をスクリーニングすること以外に、特定の酵素に関する、細胞活性に対する環境変化の影響を決定することにも興味が存在する。癌細胞に関して、化合物または処置の過程に関する、タンパク質の細胞発現、個々の酵素の活性、または酵素プロフィールの変化を決定する際に興味を有する。
【０００６】
酵素多重化が有利である１つの特別のクラスの酵素は、細胞表面レセプターまたは細胞内レセプターであり、これらは、薬物スクリーニングについての標的の重要なクラスを表す。なぜなら、これらのレセプターは、細胞の増殖および代謝に関与するからである。多くのレセプター（例えば、インスリンレセプター、インスリン様増殖因子レセプター、上皮増殖因子および血小板由来増殖因子）は、酵素ドメインを有する（Ｗｈｉｔｅ）。いくつかのレセプターは、レセプターをアッセイするために酵素にカップリングされ得る（Ｂｕｎｅｍａｎｎ）。リガンドがレセプターの特定の部位に結合する場合、リガンドは代表的に、レセプターの酵素ドメインを活性化する。多くの例では、この酵素は、合成ペプチドのリン酸化速度の決定によって測定され得る、プロテインキナーゼである。多くのレセプターはそれらの特異的リガンドに対して高い親和性を有するので（Ｐｉｋｅ，１９８４，Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ，Ｓａｓａｋｉ）、それらの酵素（キナーゼ）活性をモニタリングすることによってレセプターアッセイを実施するための方法を開発することが可能である。特異的に結合した天然のリガンドのみが酵素ドメインを活性化する可能性を有するので、その酵素活性をモニタリングすることによるレセプターアッセイは、非特異的結合の問題を回避し得る。このアプローチは、多くのレセプター、特にホルモンレセプターおよび増殖因子レセプターについて、リガンド結合アッセイおよび酵素アッセイの両方に用いられ得る。
【０００７】
リガンド／レセプター結合を阻害し得る化合物についてスクリーニングする際に、スクリーニングされなければならない、２つの、いくつかの場合には３つの変動要因が存在する。第１の変動要因は、試験化合物自体（例えば、リガンド／レセプター相互作用の潜在的インヒビターのライブラリーから誘導された非常に多数の試験化合物）である。第２の変動要因は、レセプターリガンドの濃度に対する試験化合物濃度である。第３の変動要因は、他の酵素（例えば、標的細胞上または標的細胞内の他のレセプターキナーゼ）に対する試験化合物の影響である。試験化合物の濃度について試験し、これを最適化すること、ならびに他の細胞酵素に対するそれらの影響をアッセイすることは、多数のアッセイサンプルを最終的に必要とする。多重化アッセイにおける試験変動要因のうちの１以上を合わせることによって、実施することが必要とされるアッセイの数を実質的に低減し得、そして／または複数のアッセイについての内部コントロールを提供し得る。
【０００８】
（発明の要旨）
１つの局面では、本発明は、多重化酵素アッセイ方法を含む。この方法は、基質のセット中の複数の酵素基質の存在下で、酵素基質を対応する産物へと変換するのに有効な条件下で複数の酵素反応を実施する工程を包含し、ここで、各基質の産物および基質は、互いに、そしてこのセット中の他の基質およびそれらの対応する産物とは異なる分離特徴を有する。この反応を実施した後、この産物、そして好ましくは、この反応物中の基質もまた、単一の分離媒体中で分離される。各分離された産物および基質について、この産物および基質を同定するに有効な分離特徴、ならびにこの産物および基質の量に関連するシグナルが検出される。これから、反応の各々において対応する産物へと変換された基質の量が決定され得る。
【０００９】
この基質および産物の分離特徴は好ましくは、電場の影響下にある電気泳動媒体中の電気泳動移動度であるが、他の分離特徴（例えば、排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動または質量分析法によって分離した場合の挙動）もまた意図される。この基質および対応する産物は蛍光標識され得、ここで、検出する工程は、蛍光励起波長を照射した場合に各産物から蛍光シグナルを検出することを含む。
【００１０】
１つの一般的実施形態では、複数の酵素反応は、複数の異なる酵素を含む単一の反応混合物において実施され、ここで、アッセイされる酵素の各々は、反応混合物中の基質のうちの１つを対応する産物へと変換するのに有効である。この実施形態は、例えば、選択された細胞条件下で、細胞中の複数の異なる酵素の各々の活性レベルを決定するために用いられ得、ここで、この反応混合物中の異なる酵素は、このような選択された細胞条件下で細胞から入手される。
【００１１】
コントロール細胞条件および試験細胞条件の両方において、細胞中の一群の酵素の各々の活性レベルの変化を決定する際の使用のために、実施する工程、分離する工程、検出する工程および決定する工程は、コントロール条件および試験条件の両方で細胞から得られた酵素について実施される。例えば、異なる酵素のうちの１以上の活性レベルを阻害または活性化する能力について既知であるかまたは試験される因子に細胞が暴露された場合のこの細胞中の一群の酵素の各々の活性レベルの変化を決定するために、実施する工程、分離する工程、検出する工程および決定する工程は、この因子への暴露の前および後のこの細胞から得られた酵素について実施される。例示的な群の酵素としては、レセプター−キナーゼ酵素および細胞シグナル伝達経路酵素が挙げられる。
【００１２】
別の一般的な実施形態では、選択された酵素の活性を阻害または刺激する際の１以上の因子の影響をアッセイする際に使用するために、酵素反応は、別々の反応混合物中で実施され、ここで、各混合物は、（ｉ）１以上の酵素および（ｉｉ）基質のセット由来の１以上の基質を含む。
【００１３】
より特定の実施形態では、試験化合物が酵素活性に影響を与える能力についてスクリーニングまたは評価する際に使用するために、反応混合物はまた、（ａ）複数の異なる試験因子のうちの１つ、および／または単一の因子の複数の異なる濃度のうちの１つの一方または両方を含む。反応混合物は、異なる反応の基質および産物を分離する前に合わされる。
【００１４】
セット中の異なる基質は、（ｉ）酵素基質部分、（ｉｉ）このセット中の他の基質および対応する産物の分離特徴に関して独特である分離特徴を、このセット中の各基質およびその対応する産物に付与する移動度モディファイヤー、ならびに（ｉｉｉ）このセット中の上記基質および産物からのシグナルの検出を可能にするレポーター部分を含み得る。ここで、セット中のこの基質は、オリゴペプチド基質部分を有し、そしてこの移動度モディファイヤーは、（ｉ）該オリゴペプチドにカップリングされた非ペプチド部分、（ｉｉ）この基質部分を保存するが、このオリゴペプチドの分子量および／または電荷を変更する、上記オリゴペプチド中の１以上のアミノ酸置換、ならびに（ｉｉｉ）異なる電荷および／または分子量を有する異なるレポーター部分であり得る。
【００１５】
レセプター酵素とこのレセプターの酵素活性を刺激することが公知のリガンドとの間の相互作用をアッセイする際に使用するために、この別々の酵素反応混合物は好ましくは、（ｉ）１以上の選択された酵素、（ｉｉ）基質のセットからの１以上の基質、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの反応混合物中に、この酵素の最適な活性化を生じるために充分な濃度のリガンドを含む、１以上の異なる濃度のこのリガンドを含む。反応混合物のうちの１つは好ましくは、リガンドを含まず、非活性化酵素の酵素活性レベルを提供する。
【００１６】
レセプター酵素は例えば、活性化状態で、オリゴペプチド基質をリン酸化するに有効なレセプター−キナーゼ酵素（例えば、リガンドがＥＧＦであるＥＧＦＲ、リガンドがインスリンであるレセプターＩＩキナーゼ、ならびにリガンドがインスリンであるインスリンレセプターキナーゼ）であり得る。このレセプター酵素アッセイでは、セット中の基質は、オリゴペプチド基質、および上記の型の移動度モディファイヤーを含む。
【００１７】
１以上の試験因子がリガンド活性化酵素活性を妨害する能力をアッセイするために、反応混合物の少なくともいくつかは、最適な濃度のリガンドに加えて、複数の異なる試験因子のうちの１つを含む。あるいは、またはさらに、反応混合物のうちの少なくともいくつかは、最適な濃度のリガンドに加えて、１以上の濃度の少なくとも１つの試験因子を含む。
【００１８】
別の局面では、本発明は、多重化酵素アッセイを実施するための酵素基質のセットを含む。このセットは、複数の酵素基質を含み、複数の酵素基質の各々は、（ｉ）このアッセイ中の酵素がこの基質と反応してこの基質を対応する産物へと変換する、酵素基質部分、（ｉｉ）このセット中の他の基質および対応する産物の分離特徴に関して独特の分離特徴をこのセット中の各基質およびその対応する産物に付与する、移動度モディファイヤー、ならびに（ｉｉｉ）このセット中の上記基質および産物からのシグナルの検出を可能にするレポーター部分を有する。このレポーター部分は例えば、蛍光レポーターであり得る。この酵素は例えば、異なる機能群のキナーゼ（サイクリックヌクレオチド調節プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼＣ、Ｃａ２^＋／ＣａＭによって調節されるキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、ＥＲＫ／ＭＡＰキナーゼ、およびプロテイン−チロシンキナーゼを含む）由来のキナーゼであり得る。このキナーゼは、オリゴペプチド基質をリン酸化するに有効な、シグナル伝達経路中のプロテインキナーゼ酵素（例えば、ＥＲＫキナーゼ、Ｓ６キナーゼ、ＩＲキナーゼ、Ｐ３８キナーゼおよびＡｂＩキナーゼ）であり得る。この酵素アッセイでは、このセット中の基質は、オリゴペプチド基質および上記の型の移動度モディファイヤーを含む。目的の他のキナーゼは、例えば、Ｓｒｃキナーゼ、ＪＮＫ、ＭＡＰキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、Ｐ５３キナーゼ、血小板由来増殖因子レセプター、上皮増殖因子レセプターおよびＭＥＫを含み得る。
【００１９】
オリゴペプチド基質を有する、１以上の酵素をアッセイするための方法において使用するために、セット中のこの基質は、オリゴペプチド基質部分を有し、そしてこの移動度モディファイヤーは、（ｉ）このオリゴペプチドにカップリングされた非ペプチド部分、（ｉｉ）この基質部分の認識を保存するが、このオリゴペプチドの分子量および／または電荷を変更する、このオリゴペプチド中の１以上のアミノ酸置換、ならびに（ｉｉｉ）異なる電荷および／または分子量を有する異なるレポーター部分であり得る。
【００２０】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、本発明の以下の詳細な説明を添付の図面と共に読んだ場合、より充分に明らかになる。
【００２１】
（特定の実施形態の説明）
本発明は、多重化酵素アッセイ（すなわち、複数の異なる酵素アッセイの結果が単一の検出形式でモニタリングまたは検出されるアッセイ）を実施するための方法に関する。２つの一般的型の多重化アッセイが意図される。第一に、第Ａ節に詳述したように、複数の酵素は、複数またはセットの異なる酵素基質の存在下で同じ反応混合物中でアッセイされる。各酵素は、基質のうちの１つを対応する産物へと変換し得、ここで、この基質および対応する産物は、この産物および好ましくは、この基質が単一の分離媒体中で互いに分離されるのを可能にする、異なる、独特の分離特徴をする。
【００２２】
第二の一般的アッセイの型では、第Ｂ節に詳述したように、複数の酵素反応は別々に、例えば、並行して実施される。別々の反応は、同じもしくは異なる酵素の１以上、同じ酵素インヒビターもしくは酵素アクチベーターまたは異なる酵素インヒビターもしくは酵素アクチベーターの１以上、および／または異なる濃度のインヒビター、アクチベーターもしくは基質を含み得る。上記のように、各反応混合物は、関連した産物へと変換され得る１以上の基質を含み、ここで、この基質および対応する産物は、上記のような異なる、独特の分離特徴を有する。１つの例示的な実施形態では、異なる反応混合物は、リガンドによって活性化または阻害されることが公知であるレセプター酵素、複数の選択された濃度の１以上のリガンド自体、ならびにリガンド−レセプター結合を阻害もしくは刺激する能力についてスクリーニングされる異なる試験化合物および／または異なる濃度のこのような試験化合物のいずれかを含む。個々の反応を実施した後、この反応混合物は、産物および基質の分離および検出について合わされる。
【００２３】
両方の型のアッセイでは、この産物および好ましくはこの基質は、単一の分離媒体で分離され、そして各産物の分離特徴およびこの産物の量に関連するシグナルが決定される。これから、反応物中の各酵素によって対応する産物へと変換された基質の量が決定され得る。好ましい分離特徴は電気泳動移動度であり、ここで、この産物および基質は、例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって分離される。分離工程および検出工程は、第Ｃ節において考慮される。別の局面では、本発明は、第Ｄ節において考察したように、多重化反応方法のための基質のセットを提供する。
【００２４】
（Ａ．単一反応形式）
酵素および／または酵素基質の多重化アッセイが実施され、それによって、媒体の酵素活性は、少なくとも１つの酵素に関して決定され、特に、媒体の酵素活性に対する因子の影響が決定される。共通の特徴を保有する酵素のファミリー、または酵素によって作用が及ぼされる共通の機能を共有する基質のファミリーまたはそれらの組合せは、酵素組成物の酵素活性の迅速かつ効率的な評価において用いられる。酵素組成物の酵素は、例えば、副作用に関する薬物の影響などのアッセイの目的に関して目的の機能以外には機能の共通性を有さないことが必要である。
【００２５】
複数の基質および／または産物が分離および検出され、ここで、個々の酵素の存在および量が決定され得るか、または基質および／もしくは産物の量もしくは性質の特定の変化が因子の影響を示す。好都合なことには、この産物は、キャピラリー電気泳動によって個々に決定され得、ここで、この因子の存在下での産物の量または性質は、この因子の非存在下での結果と比較され得る。本方法論は、酵素活性、細胞性酵素活性の変化または目的の媒体の酵素活性に対する化合物の影響について化合物をスクリーニングするための特定の用途を見出す。
【００２６】
このアッセイは、個々の決定され得る基質のセットを有することを必要とする。決定されるべき酵素活性の性質に依存して、基質の各々は、適切な機能性および機能性についてのコンホメーションを有して、酵素の活性部位が結合して酵素改変を受けるのを可能にする。個々の基質は、酵素反応の結果として、標識されるかまたは標識されることになり、それによって、この酵素反応は、反応物と産物との間の分離を可能にする分離特徴の変化をもたらす。通常、変化した特徴は、例えば、電気泳動、クロマトグラフィーおよび質量分析法に関与する、移動時間の変化である。１つの例示的な分離特徴は、電気泳動移動度であり、これは、分子の電荷、質量および形状（すなわち、半径）に主に依存するが、二次的因子（例えば、形状および疎水性）にも依存する。本発明の重要な特徴によって、セット中の基質の酵素的変換によって産生される産物は、互いに異なる、そしてそれらの対応する基質とは異なる、分離特徴を有する。好ましくは、セット中の基質はまた、互いに異なる、そしてセット中の産物の各々とは異なる、分離特徴を有し、その結果、各基質およびその対応する産物は、多重化アッセイにおいて独自に分離および検出され得る。本発明において使用するための基質の例示的なセットを以下に考察する。
【００２７】
酵素は、触媒される反応の性質に基づいて異なる群に分けられ得る。酵素群としては、以下が挙げられる：ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼもしくはシンターゼ。特に興味深いのは、生理学的重要性を有する酵素のクラスである。これらの酵素としては、以下が挙げられる：プロテインキナーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、プロテインホスファターゼ、イソメラーゼ、グリコシラーゼ、シンテターゼ、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼなど、特に、（有機および無機の両方の）エステルを作製または加水分解する際、アミドをグリコシル化する際、ならびにアミドを加水分解する際に関与する酵素。任意のクラスにおいて、キナーゼにおいて（ここで、キナーゼは、ペプチドおよびタンパク質中のセリン残基、トレオニン残基および／またはチロシン残基のリン酸化に特異的であり得る）のように、さらなる細分が存在し得る。
【００２８】
酵素の組合せは、少なくとも２つの酵素、通常少なくとも３つの酵素を含み、そして４以上の酵素を含み得る。任意の最大数の酵素が自由裁量によるが、実際問題として、通常、１２よりも少ない異なる酵素、より通常は９よりも少ない、一般に２〜８の範囲、より通常は３〜６の範囲、便利には４〜６の範囲の異なる酵素が存在する。一群の酵素は一般に、適合可能な反応条件（例えば、ｐＨおよびイオン強度）を有するが、比較的低い質量濃度を有するアッセイ成分（例えば、補因子）を含め、補因子の必要要件、金属イオンの必要要件などは、共通である必要はない。
【００２９】
独立して活性によって、基質の変換の約２０％未満が、意図された酵素以外の酵素に起因することが意図される。共通の条件は、酵素の各々が反応過程の間に測定可能な速度を提供することを必要とし、そして一般に、酵素の各々が、他の酵素について添加された成分から顕著な妨害を受けることなく、特定の基質についての最大代謝回転速度の少なくとも約１０％、通常少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％を有することである。
【００３０】
各アッセイ決定について、成分は、酵素について適切な条件下で、適切な基質と合わされる。酵素およびアッセイの性質に依存して、基質は天然に存在し得るかまたは合成物であり得、頻繁に合成物である。大部分は、分離技術は産物の検出のために用いられるので、産物は、（通常、分光光度測定検出（特に蛍光測定（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）検出）または電気化学的検出を可能にする標識を有し）検出可能である。
【００３１】
本発明の例示は、多重化キナーゼアッセイの例証である。このキナーゼは、ヒドロキシル基をリン酸化する大きな群の酵素であり、その多くは、ヒドロキシル基について特定の環境に関して高い特異性を有し、内部リン酸化（ｉｎｔｒａｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）または外部リン酸化（ｉｎｔｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）（これは、高濃度の競合的基質を用いて内部リン酸化を競合し得る）を提供し得、そして共通の反応物（ＡＴＰ）を用い、そして一般にほぼ同じ媒体必要要件を有する。酵素の濃度は一般に、の範囲である。約１ｐＭ〜１μＭ、より適切には１０^−６〜１ＩＵ／ｍｌ（ＩＵは、最適な条件における１マイクロモル／分の産物形成と定義される）。例示的なアッセイ条件は、実施例１〜８に与えられる。
【００３２】
標的化されたキナーゼに依存して反応条件を変動させ得る；例示的なキナーゼの活性を支持するインビトロでの条件は、以下に例示されるかおよび／または当該分野で他に公知である。例えば、反応は一般に、有効量のヌクレオシド三リン酸（例えば、ＡＴＰ）の存在を通常、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲の濃度で必要とする。緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｓ）は一般に、約５〜約９の範囲のｐＨで、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度である。個々の酵素は一般に、約１ｐｇ／μｌ〜５ｎｇ／μｌの範囲の量で存在する。頻繁に、カチオン（例えば、Ｍｇ、ＭｎおよびＣａ）が、一般に約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で用いられる。他の添加物は、約０．１ｍＭ〜約２ｍＭの範囲の濃度でＤＴＴを含み得る。いくつかの例では、オルト−バナジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｏｒｔｈｏ−ｖａｎａｄａｔｅ）は、夾雑するホスファターゼを阻害する、約０．５ｍＭ〜２ｍＭの範囲の濃度で用いられ得る。また、不活性なタンパク質（例えば、オボアルブミン、血清アルブミンなど）は、低濃度アッセイ成分の非特異的結合および不活性化を妨害する、特に、表面への酵素結合を妨害する、一般に、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で含まれ得る。多くの哺乳動物キナーゼについて、反応は、室温または高温で、通常、２０℃〜４０℃の範囲で、便利には室温（約２５℃）で実施される。高処理能力適用について、反応時間は最少にされ、そして通常０．０１時間〜４時間であり、より通常は約０．１時間〜１時間である。
【００３３】
一般に、コントロール測定が実施され、ここで、単一の酵素の速度が、特異的基質を用いて決定され、ならびにそれぞれの基質の存在下または非存在下での他の酵素についての基質の組合せを用いてこの酵素の反応が決定される。
【００３４】
候補化合物活性の評価を実施する際に、候補化合物は所望の濃度で添加されるか、または複数のアッセイが、１桁〜５桁の大きさの範囲にわたる異なる濃度で候補化合物を用いて実施され得る。目的の活性範囲に依存して、この候補の濃度は、候補の予想される活性、媒体中の酵素数、候補が調査される指標の性質などに依存して約０．１ｐＭ〜約１ｍＭの範囲であり得る。特に興味深いのは、天然に存在するかまたは合成物かのいずれかの、生物学的活性について調査される、通常５ｋＤａ未満の、候補化合物（例えば、薬物）である。
【００３５】
反応混合物中の全ての成分を合わせた後、代表的に、酵素および候補化合物を最初に添加し、続いて基質を同時に添加して、反応を進行させる。１以上のアリコートを採取して、基質の各々について反応の時間経過を入手し得る。各アリコートについて、反応は、インヒビターを添加することによってクエンチングされ得、（例えば、加熱すること、酵素からの基質の分離の開始による）変性プロセスによって、または他の便利な手段によって停止され得る。
【００３６】
以下の実施例１〜８は、複数の酵素が単一反応混合物においてアッセイされる、アッセイ方法の種々の実施形態を例示する。図１Ａおよび図１Ｂは、分離および検出反応を実施する際に用いられる２つの型の電気泳動デバイスにおけるチャネルネットワークを示す。手短には、図１Ａ中の２０で示されるネットワークは、２つの側方チャネルが交差した分離チャネルを含み、この２つの側方チャネルは、分離チャネルを下流の分離領域２４、中間サンプル容量領域２６および上流のチャネル領域２８へと分ける。サンプルはこのネットワーク中のレザバ３０中に含まれ、そして領域２６へとローディングされる。サンプルローディングの後、電圧が分離チャネルの端にまたがってかけられ、反応の基質成分および産物成分の電気泳動移動が引き起こされて、分離領域２４中に含まれる分離媒体中へ、そして分離媒体を通って移動する。この領域の下流端に隣接して配置された検出器（示さず）（例えば、標準的な共焦点蛍光検出器）を用いて、検出領域を通したサンプルの基質および産物のバンドの移動が慣用的に検出される。分離された産物および基質のバンドのシグナル強度は、例えば、ピーク高さまたはピーク面積によって測定されることに従って決定され得る。例示的な実施条件の詳細を、以下の実施例に示す。
【００３７】
図１Ｂは、２つの側方チャネルが交差した分離チャネルを備える、ミクロな流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）チャネルネットワーク３３を示し、この側方チャネルは、分離チャネルを下流の分離領域３４、中間サンプル容量領域３６および上流のチャネル領域３８へと分ける。ネットワーク中のレザバ４０に含まれるサンプルは、サンプルをレザバからレザバ４２へと引き出すことによって、領域３６中にローディングされる。サンプルローディング後、サンプルの基質成分および産物成分は、上記の通りに分離され、そして検出される。
【００３８】
実施例１は、４つの異なるキナーゼ酵素についての単一混合物の多重化反応を記載し、反応混合物には、１セットの異なる酵素基質を含む。酵素反応性を確認するために、アッセイにおいて１つのみの酵素およびその基質を用いることによって、多重化アッセイについてと同じプロトコルに従って４つの酵素の各々について個々の酵素アッセイをまた行った。ピーク同定を図２Ａに示す。
【００３９】
多重化アッセイの特異性を実証するために、アッセイ容量を一定に維持し、そして１つのみの酵素を他の３つの酵素についての基質と共に添加した（すなわち、このアッセイ混合物中の酵素についての基質は存在しない）こと以外は多重化アッセイについてと同じプロトコルを続けた。図２Ｂにおいて見られ得るように、この実験において用いた４つの酵素および他の酵素の基質の各々の間で交差反応性は存在しない。
【００４０】
実施例２は、３つの酵素（Ｓｒｃキナーゼ、レセプターＩＩキナーゼおよびＰＫＡキナーゼ）を含む類似の方法を記載する。この実験の目的は、この実施例において詳述するように、酵素反応について釣り合いがとれた量の産物を有するために、実験条件を最適化した後の多重化アッセイ性能を実証することであった。この結果を図３Ａに示す。特異性もまた、これらの３つの酵素について研究され、実施例１においてと同様に、１つの酵素を、１つのチューブにおいて他の２つの酵素についての基質と共にインキュベートした。この結果を図３Ｂに示す。
【００４１】
実施例３では、この方法を用いて、それぞれ、以下の３つのクラスのキナーゼがアッセイされる：チロシンをリン酸化するキナーゼ、セリンをリン酸化するキナーゼおよびトレオニンをリン酸化するキナーゼ。基質および反応条件を実施例２に示す。図４に示す結果は再度、単一の反応混合物中の各基質および対応する産物について位置およびシグナル強度を検出する能力を実証する。
【００４２】
単一酵素反応においてと同様に複数酵素アッセイにおいて類似の酵素反応速度が観察されることを実証するために、Ｓｒｃキナーゼ単独または多重化反応物中のＳｒｃキナーゼによって生成された反応産物（図５Ａ）、ならびにＰＫＡ単独および多重化反応物中のＰＫＡによって生成された反応産物（図５Ｂ）についての時間経過を実施した。この２つの図において産物対時間プロットから見られるように、実質的に同じ反応速度が、単一酵素および複数酵素反応混合物の両方において観察された。
【００４３】
実施例５において報告された研究は、複数アッセイ形式中の酵素が、酵素インヒビターに対して、単一酵素と実質的に同じ反応を示すことを示すために設計された。用いられた酵素はＳｒｃキナーゼであり、そして既知のインヒビターであった。この酵素は、単一酵素形式（図６Ａ）または複数酵素形式（図６Ｂ）のいずれにおいても存在した。これらの図から見られるように、複数酵素混合物中のさらなるキナーゼ酵素の存在は、いずれのキナーゼの阻害測定値にも影響を与えない。特に、ＩＣ_５０値は、多重化アッセイ形式および個々のアッセイ形式について同等である。同様の結果もまた、ＰＫＡキナーゼについて得られた。
【００４４】
実施例６において記載されるアッセイ方法は、多重化アッセイが、異なるクラスの酵素に適用可能であることを実証し、ここで、合理的な酵素代謝回転速度を得るために共通の条件が用いられ得る。この実施例では、アッセイにおける２つの酵素はホスホリパーゼおよびＰＫＡであり、実施例６において詳述した条件下でアッセイされる。図７において見られるように、この多重化アッセイは、個々のホスホリパーゼおよびＰＫＡアッセイと実質的に同じアッセイ結果を与える。
【００４５】
実施例７に記載される多重化アッセイ方法は、インスリンレセプター経路におけるいくつかの重要な酵素（すなわち、インスリンレセプターキナーゼ、ＥｒｋキナーゼおよびＳ６キナーゼ）を含み、このアッセイ方法の使用によって、例えば、共役した機能を有する、単一の経路中のいくつかの細胞性酵素の活性が検出されることを実証する。図８は、３つの酵素の活性が多重化アッセイにおいて同時にモニタリングされ得ることを示す。
【００４６】
キナーゼＳ６、キナーゼＰ３８およびキナーゼＡｂ１を用いて細胞のシグナル伝達経路における複数の酵素の活性を同時にアッセイするための同様のアッセイを実施例８に示し、結果を図９Ａに示す。特異性を調べるために、アッセイ条件は、１つのみのキナーゼおよび他の２つのキナーゼについての基質をこのアッセイにおいて用いて交差反応性をチェックしたこと以外は同じであった。図９Ｂに示すように、１％未満の交差反応性が、キナーゼと他のキナーゼについての基質との間に観察された。それゆえ、これらの基質は、この実験においてそれらのそれぞれのキナーゼについて特異的である。
【００４７】
多重化酵素アッセイが実施され得、ここで、個々の酵素の活性が、存在する他の酵素とは独立して決定され得るだけでなく、因子もまた添加され得、そしてこれらの酵素の各々に対するこの因子の影響もまた決定され得ることが上記の結果から明らかである。移動度が酵素反応後にシフトする基質を用い、そして例えば、キャピラリー電気泳動を用いて分離され得る基質を選択することによって、あるクラスの酵素のメンバーの酵素活性に対する因子の影響が迅速に決定され得る。このようにして、候補薬物は、活性、特異性、交差反応性および潜在的副作用について、単一の容器において、および１回の分離において、迅速にスクリーニングされ得る。
【００４８】
（Ｂ．複数反応形式）
本発明のこの一般的実施形態では、個々の酵素アッセイ反応は、別々の反応混合物において実施される。酵素アッセイ後、この混合物（または反応の基質および産物を含むその画分）は合わされ、そして単一の反応媒体中で、例えば、ＣＥによって分離される。各個々の反応混合物は、１以上の酵素および１以上の基質を含み得る。この最も単純な形態において、アッセイされるべき単一の酵素およびその酵素についての単一の基質が、各反応混合物中に予めセットされる。
【００４９】
反応において用いられる基質のセットは、単一の反応多重化アッセイにおいて必要される特性と同じ一般的特性を有する。すなわち、各基質および対応する産物は独特の分離特徴を有し、これらが互いに分離されるのを可能にする。同様に、産物の全ては独特の分離特徴を有し、これらが互いに、そして他の全ての基質から分離されるのを可能にする。上記に示したように、セット中の基質は、異なる反応混合物中に分布し得、１混合物あたり１つまたは１混合物あたり２以上であり得る。
【００５０】
１つの例示的な適用において、このアッセイ方法は、リガンド−レセプター相互作用を妨害することによって酵素活性を妨害または活性化し得る化合物をスクリーニングしそして評価することを目的として、リガンド活性化レセプターまたはリガンド阻害レセプターに適用され得る。レセプターは、薬物スクリーニングについての重要なクラスの標的を表す。なぜなら、これらは、細胞の増殖および代謝に関与するからである。特に重要なもののうち、多くのレセプターは、腫瘍形成プロセスに関与する。多くのレセプター（例えば、インスリンレセプター、インスリン様増殖因子レセプター、上皮増殖因子および血小板由来増殖因子）は、酵素ドメインを有する（Ｗｈｉｔｅ）。いくつかのレセプターは、レセプターをアッセイするために酵素にカップリングされ得る（Ｂｕｎｅｍａｎｎ）。リガンドがレセプターの特異的部位に結合する場合、これは代表的に、レセプターの酵素ドメインを活性化する。多くの場合、この酵素はプロテインキナーゼであり、これは、合成ペプチドのリン酸化速度の決定によって測定され得る。
【００５１】
本発明のこの実施形態において標的化されるレセプターは、酵素ドメインを有するかまたはアッセイのために酵素へとカップリングされ得るかのいずれかであるので、このアッセイ方法は、リガンド−レセプター結合での競合についてライブラリーの化合物をスクリーニングするために適用可能であり、そして酵素ドメインの阻害を導く。この方法を例示するために、図１０は、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の固有の活性レベルおよびリガンド活性の活性レベルを示す。見られるように、このレセプター酵素は、固有の酵素活性（低いリガンド／レセプター濃度）を有し、これは、リガンドによって増強されるレセプター酵素活性よりもずっと低い。第１に、化合物がこのレセプターに対する結合についてこのリガンドと競合する場合、レセプター酵素活性は、第２段階と第１段階との間であり、この化合物は、完全な競合を示さないとみなされる。第２のシナリオでは、この化合物が強力な競合物であり、そして非常に高い濃度になる場合、結合の平衡は化合物レセプターへと傾き、そしてこのレセプター酵素は、固有の酵素活性を示すのみである。第３の状況では、ライブラリーの化合物がこの酵素ドメインに対するインヒビターである場合、このレセプター酵素活性は、０と段階２との間である。強力なインヒビターは、全体としてこの酵素を打ち消す。上記の考察に基づいて、ライブラリーの化合物をリガンド結合競合および酵素阻害についてスクリーニングすることが可能である。レセプターの酵素活性を変化させる機構を解明するために、高濃度のこの化合物が用いられ得る。この酵素活性がその固有の活性よりも低くは決して低下しない場合、この化合物はおそらく、このリガンドに対する競合物である。一方、過剰量のライブラリー化合物を添加した後のこの酵素活性が固有の活性よりも低く、または０まで低下した場合、この化合物は、酵素ドメインに対するインヒビターの可能性が最も高い。しかし、こうすることは必要でないかもしれない。なぜなら、リガンドと競合するかまたは酵素ドメインを阻害するかのいずれかの化合物を見出す目的は、細胞の増殖または代謝（例えば、癌遺伝子プロセス）に関与する有害なシグナル伝達を停止させるからである。
【００５２】
リガンド／レセプター結合を阻害し得る化合物についてスクリーニングする際に、上記のように、スクリーニングしなければならない、２つ、そして時々は３つの変動要因が存在する。第１の変動要因は、試験化合物自体、例えば、リガンド／レセプター相互作用の潜在的インヒビターのライブラリーから誘導された非常に多数の試験化合物である。本発明の方法において、非常に多数の試験化合物は、別々のアッセイ混合物においてスクリーニングされ得、アッセイ混合物の各々は、この酵素および最適な濃度のリガンドを含み、ここで、各反応混合物は、以下の第Ｄ節において詳述するように、同じ基質部分を有するが異なる分離特徴を有する基質のセットからの基質を含む。
【００５３】
次いで、反応混合物または産物および基質を含むその一部は合わされ、単一の分離媒体において分離され、そして分離特徴（例えば、電気泳動移動度）に関して分析されて、各産物および基質が同定される。産物レベルにおいて測定可能な変化を生じる試験化合物は、リガンド／レセプター相互作用を妨害し得る薬物についての潜在的候補として同定される。
【００５４】
第２の変動要因は、レセプターリガンドの濃度に対する、試験化合物濃度である。上記のように、いくつかの異なるリガンド／試験化合物比で酵素活性レベルを調べて、この化合物がリガンド−レセプター結合の競合インヒビターであるかまたは酵素活性を単純に阻害するかを決定し、そして試験化合物が有効であり得る濃度を決定することが必要であり得る。これは、本発明に従って、複数の別々の反応を実施することによって行われ得、各々の反応は、目的の酵素、最適な濃度のリガンド、複数の異なる試験化合物濃度の各々、および基質セット中の複数の別々の基質の各々を含む。
【００５５】
次いで、この反応混合物は合わされ、そして上記の通りに処理されて、各産物および基質が同定される。この情報、ならびにこのセット中の各基質についての産物および基質の相対レベルから、濃度活性曲線は、単一の多重化アッセイ結果から構築され得る。
【００５６】
第３の変動要因は、標的細胞上または標的細胞中の他の酵素（例えば、他のレセプターキナーゼ）に対するこの試験化合物の影響である。上記の第Ａ節から認識され得るように、この相の化合物試験は、複数酵素形式において効率的に行われ得、この形式において、酵素−リガンド相互作用に対する化合物の影響は、複数の他の酵素（関連したリガンドを含む）の存在下でアッセイされ得る。
【００５７】
以下の実施例９〜１２は、単一アッセイ形式について上記で考察した一般的原理を実証する。実施例９における研究は、２つの異なる基質を用いて、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ対について最適なリガンド／レセプター比を決定するために設計される（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。図１１Ａおよび図１１Ｂから測定されたキナーゼ活性は、両方の基質についてＥＧＦ／ＥＧＦＲ比の関数としてプロットされた。図１２Ａにおけるプロットは、この酵素が、基質１に対して作用する場合に、最適なＥＧＦ／ＥＧＦＲ比を用いて、キナーゼにおける６．３倍の増強を示す。最大レベルの増強は、図１２Ｂにおいて見られるように、基質２を用いて約１１倍であった。
【００５８】
本発明に従って、多重化形式においてどのようにして同じ情報が入手され得るかが認識され得る。ここで、各異なる反応混合物は、選択されたＥＧＦ／ＥＧＦＲ比のうちの１つおよび基質セット由来の基質のうちの１つを含む。次いで、個々の反応混合物が合わされ、産物および基質は単一の分離媒体中で分離され、そして基質および産物の相対レベルが各反応について測定される。このことから、図１２Ａおよび図１２Ｂに示す用量応答曲線のような用量応答曲線が構築される。
【００５９】
実施例１０は、キナーゼレセプター酵素のリガンド活性化を妨害し得る競合についてスクリーニングする（アンタゴニストについてスクリーニングする）アッセイの使用を実証する。この実施例において、２つのＥＧＦＲフラグメントは、結合部位を飽和し、そしてＥＧＦが添加された場合にＥＧＦの結合をブロックし、続いてキナーゼ活性の増大をブロックする能力について研究された。実施例１０における表１から見られるように、高濃度のフラグメントは、ＥＧＦＲの増強された活性を抑制し得たが、基底酵素レベル（リガンドの非存在下における活性）を抑制し得なかった。
【００６０】
多重化形式におけるこの研究を実施するために、固定した比でのこの酵素およびリガンドは、複数の異なる濃度の各々の選択された試験インヒビターおよび基質セット由来の基質の１つと混合される。各分離反応を実施した後、この反応混合物は合わされ、そして上記の通りに単一分離媒体において分析され、化合物の阻害活性についての用量応答曲線が得られる。
【００６１】
別の例として、レセプターＩＩ（インスリン関連レセプター）は、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）に関連して研究された。レセプターＩＩキナーゼ活性において顕著な増強（＞４倍）が観察された。試験された他のリガンドとしては、インスリン、インスリンα鎖およびインスリンβ鎖が挙げられる。インスリンおよびインスリンβ鎖は両方とも、高濃度を用いた場合、２０倍という高さでこのレセプターキナーゼ活性を刺激した（実施例１１中の表２）。このレセプターについての１つのインスリンβ鎖の用量応答研究を図１３に示す。いくつかのリガンドによるこのレセプターキナーゼ活性についての増強の顕著な相違（ＩＧＦについて４倍、インスリンおよびインスリンβ鎖について＞２０倍、インスリンα鎖についてほんの約３倍）に基づいて、インスリンβ鎖は、レセプターキナーゼ活性をモニタリングすることによってレセプター−リガンド結合アッセイを実証するために選択された。
【００６２】
レセプターＩＩレセプターについての、インスリンβ鎖と上皮増殖因子（ＥＧＦ）との間の競合を実施して、レセプターキナーゼ活性をモニタリングすることによって、活性化リガンドと推定競合物との間の競合において使用するためのアッセイ方法が実証された。図１４Ａは、高濃度の活性化リガンドで、非活性化リガンドによるリガンド誘導性レセプターＩＩキナーゼ活性化の阻害を示す。図１４Ｂに示すように、３μＭという、より低いインスリンβ鎖濃度を用いた場合、ＥＧＦについてほぼ完全な競合を示すこともまた可能である。
【００６３】
上記のリガンド阻害アッセイが、本発明に従って多重化アッセイにおいてどのようにして実施されるかが上記から認識される。各反応混合物は、この酵素、最適に活性化する（または阻害する）量のリガンド、複数の異なる濃度の各々の試験化合物、および基質セットからの選択された基質を含む。各個々の酵素反応を実施した後に、アッセイ混合物が合わされ、そしてこの基質および産物が上記の通りに分離され、そして定量される。この情報から、この酵素に対するその競合結合における、この試験化合物の用量応答曲線が構築される。
【００６４】
（Ｃ．分離および検出）
アッセイ反応由来の産物、そして好ましくは関連の基質は、単一の分離媒体または形式で分離される。このことは、反応物由来の合わせた産物（そして好ましくは、基質の全て）を含むサンプル混合物が、単一の分離媒体（例えば、電気泳動分離媒体、クロマトグラフィー媒体または質量分析法媒体に適用され、そしてサンプル産物／基質成分の全てがその媒体で分離されることを意味する。
【００６５】
好ましい分離媒体は電気泳動媒体であり、そして適切な分離デバイスは、周知の方法に従って分離チャネルを横切って荷電成分を分離するための上記の型のミクロ流体デバイスである。図のいくつかにおいて例示したように、複数のプローブおよび基質の電気泳動分離およびバンドの分解能は、この方法によって容易に達成される。
【００６６】
便利には、アリコート（一般に、約５μｌ以下）は、統合型システムへの電気泳動注入もしくは圧気注入を介して、またはシリンジ、キャピラリーなどのいずれかによって直接、ミクロ流体デバイスまたはキャピラリー電気泳動デバイスのサンプルレザバへと移される。ミクロ流体デバイスは、国内および外国の多数の特許および公開特許出願に記載される。例えば、米国特許第５，７５０，０１５号；同第５，９００，１３０号；同第６，００７，６９０号；ならびにＷＯ　９８／４５６９３；ＷＯ　９９／１９７１７およびＷＯ　９９／１５８７６を参照のこと。
【００６７】
図１Ａおよび図１Ｂは、上記の通り、ＣＥ分離および蛍光検出における使用のために適切な２つの型のミクロ流体デバイスを例示する。分離が実施される条件は、従来の条件であり、そして産物の性質に伴って変動する。電気泳動の条件下で同様の移動度を有する産物については、より長い時間が必要とされる。条件は、キャピラリー電気泳動について従来の電圧を用いて、オリゴペプチドまたは他の基質に適用可能である。
【００６８】
各産物および基質を同定するために、各基質およびその対応するレポーターは、その産物／基質に独特である検出可能なレポーターを有さなければならないか、またはより通常は、選択された分離条件下での各産物および基質の相対的分離特徴を知っているかのいずれかである。例えば、サンプルがＣＺＥによって分離される場合、各産物および基質は、他の産物および基質に対する、または検出可能な内部標準に対する、その既知の移動位置または相対的移動位置から同定され得る。これは、上記のいくつかの特徴において例示され、ここで、産物および基質の特定のバンドは、電気泳動ゲルに単一の産物／基質対として適用された場合に、それらの既知の移動挙動に従って同定される。
【００６９】
分離後、成分は検出され、最初に上記の通りに分離特徴が決定され、そして二番目に、サンプル中の基質および各異なる基質についての産物の相対量の尺度としてシグナル強度（例えば、ピーク高さまたはピーク面積）が測定される。所定の基質およびその産物が両方とも同じ検出特徴（例えば、蛍光吸光度および発光スペクトル）を有すると仮定して、その基質および産物の相対量は、他の基質−産物対が異なる検出特徴を有したとしても、それらの相対ピーク高さまたはピーク面積から決定され得る。産物シグナル単独が測定される場合、種々の産物の相対検出特徴を知って、それらの異なる測定レベルを比較するための標準を有することが必要である。
【００７０】
産物および基質のシグナルを測定するための方法は周知である。１つの好ましい方法では、この産物および基質は、蛍光標識される。標準的な蛍光発光源は、分離媒体の下流部分における検出域へと向けられ、そしてこの域の蛍光発光は、標準的な光検出器によって測定される。記録されるシグナルの高さまたは面積は、サンプル中の産物および基質の濃度の尺度を提供する。
【００７１】
上記の検出情報を用いて、検出された各産物または基質−産物対を基質セット中の特定の基質へと割当て、そして多重酵素アッセイにおける各異なる酵素または多重反応アッセイにおける各異なる反応に対応する、各基質についての基質から産物への変換のレベルを比較することが現在可能である。
【００７２】
（Ｄ．基質セット）
本発明によって提供される基質セットは、複数の酵素基質を含み、酵素基質の各々は、以下を有する：（ｉ）そのアッセイにおいて酵素がその基質と反応して、その基質を対応する産物へと変換する、酵素基質部分、（ｉｉ）そのセット中の各基質およびその対応する産物に、そのセット中の他の基質および対応する産物の分離特徴に関して独特の分離特徴を付与する、移動度モディファイヤー、ならびに（ｉｉｉ）このセット中の上記基質および産物からのシグナルの検出を可能にする、レポーター部分。
【００７３】
レポーター部分は、分離媒体における分離後に、産物および基質が（好ましくは、定量的に）検出されるのを可能にする、任意の部分である。分光光度的検出について、発蛍光団または色素が用いられ得る。放射標識レポーターは、別のクラスの適切なレポーターである。あるいは、このレポーターは、例えば、共有に係る米国特許出願第６０／２９３，８２１号（２００１年５月２６日出願）に記載されるような、適切な反応成分の存在下で検出可能な反応を触媒するに有効である、触媒部分であり得る。
【００７４】
多数の異なる蛍光剤は、上記で言及した論文；すなわち、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１６２，５２６（１９６８）およびＢｒａｎｄら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１，８４３（１９７２）に記載される。１つの蛍光剤群は、キサンテン色素であり、これには、３，６−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロール（３，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｐｈｅｎｙｌｘａｎｔｈｈｙｄｒｏｌ）から誘導されたフルオレセイン、ならびに３，６−ジアミノ−９−フェニルキサントヒドロールから誘導されたロサミン（ｒｏｓａｍｉｎｅ）およびローダミンが含まれる。ローダミンおよびフルオレセインは、９−ｏ−カルボキシフェニル基を有し、そして９−ｏ−カルボキシフェニルキサントヒドロールの誘導体である。これらの化合物は、フェニル基に置換基を伴って市販され、フェニル基は、結合のための部位として、または結合官能基として、用いられ得る。例えば、アミノおよびイソチオシアネート置換フルオレセイン化合物が入手可能である。
【００７５】
別の群の蛍光化合物は、ナフチルアミンであり、α位またはβ位（通常、α位）にアミノ基を有する。ナフチルアミノ化合物の中に含まれるのは、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートである。いくつかのナフタレン化合物は、タンパク質に対する非特異的結合を有することが見出されており、それゆえ、これらの使用は、タンパク質の量が最少にされるアッセイ媒体を用いることを必要とする。他の蛍光剤は、窒素含有大環状分子を含む多座配位子リガンドであり、この大環状分子は、π電子を有する共役環構造を有する。これらの大環状分子は、架橋している炭素または窒素での置換を含め、必要に応じて置換され得る。適切な大環状分子としては、極めて非局在している電子を含む、ポルフィリン、アザポルフィリン、コリン、サフィリン（ｓａｐｐｈｙｒｉｎ）およびポルフィセン（ｐｏｒｐｈｙｃｅｎｅ）ならびに他の同様の大環状分子の誘導体が挙げられる。アザポルフィリン誘導体としては、フタロシアン、ベンゾトリアザポルフィリンおよびナフタロシアンならびにそれらの誘導体が挙げられる。
【００７６】
いくつかの例では、ポリペプチド基質へと融合されたグリーン蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質を用いる、蛍光融合タンパク質が用いられ得る。
【００７７】
電気化学発光（ＥＣＬ）を含め、電気化学的標識について、ＥＣＬ部分は、本発明に従った電気化学的刺激の結果として、電磁放射（例えば、可視光）を放出する有機金属化合物を包含する。例は、４，４’，５’，５テトラメチルビピリジンＲｅ（Ｉ）（４−エチルピリジン）（ＣＯ_３．^＋ＣＦ_３ＳＯ_３ ⁻；およびＰｔ（２−（２−チエニル）ピリジン）_２である。
【００７８】
基質における移動度モディファイヤーは、互いに関して、ならびにそのセット中の全ての他の基質および対応する産物に関して独特の分離特徴をその基質およびその対応する産物に付与するように選択される。分離特徴が電気泳動移動度である場合、移動度モディファイヤーは好ましくは、独特の電荷／質量比および／または形状を各基質および産物に付与するように選択される。分離特徴がクロマトグラフィー分離である場合、この異なる移動度モディファイヤーは、異なる疎水性、電荷、分子量、および／またはサイズを有する。質量分析法による分析については、この異なる移動度モディファイヤーは、異なる質量を有する。
【００７９】
１つの一般的実施形態では、この移動度モディファイヤーは、この基質には関連せず、そしてこの基質に対して共有結合する。異なる電気泳動分離特徴を付与するために適切なこの型のモディファイヤーは、共有に係るＰＣＴ特許出願ＷＯ　００／６６６０７（２０００年１１月９日公開、そして本明細書中に参考として援用される）に詳述されている。このようなモディファイヤーは代表的に、独特の電荷／質量比を各異なるモディファイヤーに付与する反復サブユニット基を有する。
【００８０】
基質部分が生体高分子（例えば、オリゴペプチド）である場合、この部分自体を変動させて、分離特徴における相違を提供し得る、すなわち、移動度モディファイヤーとして作用し得る。例えば、酵素との基質相互作用に関連しない、オリゴペプチド中のアミノ酸を置換して、このオリゴペプチドの分子量もしくはサイズを増大もしくは低減し得るか、またはこのオリゴペプチドの電荷を変動させ得る。この型の基質を構築する際に、酵素特異性に必要なアミノ酸を最初に同定し、次いで電気泳動移動度を変更するように設計されたアミノ酸の置換、欠失または付加を行う。新たな基質を構築した後、この基質は、基質反応速度が変化していないことを確認するために試験されなければならないか、または変化していた場合、反応速度が既知の基質に対して標準化されなければならない。基質の改変および別々の移動度モディファイヤーの組合せもまた用いられ得る。
【００８１】
最後に、分離特徴における変化は、検出基の質量、電荷および／またはサイズにおける変化によって達成され得る。異なる数の荷電塩基性基もしくは荷電酸性基、または異なる分子量を有する蛍光基は公知である。
【００８２】
以下の実施例は、本発明に従う種々の組み合わせた酵素アッセイ形式および単一酵素アッセイ形式を例示する。実施例は、本発明を例示するが、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【００８３】
（実施例１〜８についての実験）
用いた機器は、Ａｒ^＋レーザー光学システムを備えた共焦点顕微鏡システムを備えていた。４つの独立して制御される電圧を有する電源を用いて、分離プロセスを制御した。２種類のＬａｂＣａｒｄ^ＴＭミクロ流体デバイスを、多重化アッセイ混合物の分離について棒状の図に以下に示すように用いた（図１）。チャネルの寸法は、深さ３５μｍ×幅８０μｍであり、種々の長さを有していた。このレザバは、直径が２．５ｍｍであった。
【００８４】
全ての試薬およびアッセイ緩衝液を以下に列挙する：
・酵素および基質：
−Ｓｒｃ−キナーゼ（Ｔｙｒ）：最適な基質：ＦＩＴＣ^１−ＡＥＥＥＩＹＧＥＦＥＡＫＫＫＫ；
−ＣＤＣ−２基質：ＦＩＴＣ−ＬＣＫＶＥＫＩＧＥＧＴＴＧＶＹＫ；
−カゼインキナーゼ（Ｓｅｒ）：ＦＩＴＣ−ＲＲＲＤＤＤＳＤＤＤＫ；
−ＭＡＰ−キナーゼ（Ｔｈｒ）：ＦＩＴＣ−ＰＫＴＰ；
−ＰＫＡ−キナーゼ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）：ＦＩＴＣ−ＧＲＴＧＲＲＮＳＩ；
−レセプターＩＩ−キナーゼ（Ｔｙｒ）：ＦＩＴＣ−ＫＫＫＳＰＧＥＹＶＮＩＥＦＧ。
^１フルオレセインイソチオシアネートを、フルオレセインを末端アミノ基に結合させるために用いた。
【００８５】
この基質ストック溶液を、Ｄ．Ｉ．Ｈ_２Ｏ中に１ｍＭで調製した。各アッセイにおける基質濃度を、アッセイプロトコルに記載する。レセプターＩＩ−キナーゼが好意による贈与物であったこと以外は、全ての酵素を、Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
・反応緩衝液およびストック溶液：
１．２ｍｇ／ｍＬオボアルブミンを含む、１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ　７．４）、
２．５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、
３．５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ中の１０μＭフルオレセイン、
４．５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ中の１００μＭフルオレセイン、
５．５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ中の５０ｍＭ　ＤＴＴ、
６．５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ中の５０ｍＭ　Ｎａ_３ＶＯ_４、
７．５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ中の１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２＋５ｍＭ　ＭｎＣｌ_２、
８．５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ中の１００ｍＭ　Ｍｇ−ＡＴＰ。
上記の溶液を調製するための全ての化学物質を、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。
【００８６】
実施例１〜９における多重化アッセイを、１つのチューブ中でいくつか（代表的に２〜４）の酵素を用いて実施した。アッセイ混合物は、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）ならびに１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ　Ｍｇ−ＡＴＰ、４ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ　ＭｎＣｌ_２およびアッセイにおいて用いられる各酵素について各５０μＭのペプチド基質を含む。種々の量の酵素を、実施例において記載されるとおり、異なる実験のために用いた。
【００８７】
２種類のＬａｂＣａｒｄミクロ流体デバイスを、基質および産物の電気泳動分離のために用いた。これらを、上記の通りに、図１Ａおよび図１Ｂに示す。チャネル寸法は、深さ３５μｍ×幅８０μｍであり、種々の長さを有した。レザバは、直径が２．５ｍｍであった。４つの独立して制御される電圧を有する電源（ｐｏｗｅｒｆｕｌ　ｓｕｐｐｌｙ）を用いて、分離プロセスを制御した。検出のために用いた機器は、Ａｒ^＋レーザー光学システムを備えた共焦点顕微鏡システムであった。全ての試薬およびアッセイ緩衝液を以下に列挙する：
（実施例１：４つのキナーゼを用いた多重化酵素アッセイおよびアッセイ特異性（図２））
アッセイプロトコルは一般的プロトコルに記載したのと同じである。本実験において用いた酵素は、各々３μＬのカゼインキナーゼ、ｓｒｃ−キナーゼ、レセプターＩＩ−キナーゼおよびＰＫＡキナーゼであった。ｓｒｃ−キナーゼについての基質はｃｄｃ−２であり、そして他のキナーゼについての基質は、対応するキナーゼについて上記に列挙した通りであった。総アッセイ容量は６０μＬであり、そして室温で４５分間インキュベートされる。反応を停止させるために、１０μＬの１００ｍＭ　ＥＤＴＡをアッセイ混合物に添加した。分析を実施する前に、７０μＬのＤ．Ｉ．Ｈ_２Ｏを、分析物および塩の希釈のためにアッセイ溶液に添加した。酵素反応性を確認するために、個々の酵素アッセイをまた、アッセイにおいて１つのみの酵素およびその基質を用いることによって、多重化アッセイについてと同じプロトコルに従って４つの酵素の各々について実施した。ピーク同定を図２ａに示す。
【００８８】
多重化アッセイの特異性を実証するために、アッセイ容量を６０μＬに維持し、そして１つのみの酵素を他の３つの酵素についての基質と一緒に添加した（すなわち、このアッセイ混合物中にこの酵素についての基質は存在しない）こと以外は、多重化アッセイについてと同じプロトコルを続けた。図２ｂにおいて見られ得るように、本実験で用いた４つの酵素および他の酵素の基質の各々の間で交差反応性は存在しない。
【００８９】
アッセイ産物の分離を、以下の注入条件および分離条件を用いて、改変ＬａｂＣａｒｄミクロ流体デバイスで実施した（サンプルは常にウェル４に存在する）：
注入：ウェル２に４５０Ｖ、そして他の３つの電極について３０秒間アースした。
分離：ウェル１で０Ｖ；ウェル２および４で４００Ｖ；ウェル３で７００Ｖ。
検出スポット：５ｍｍ。
Ｅｘ．／Ｅｍ．：４８８ｎｍ／５２０ｎｍ。
分離媒体：２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ＋１％　ＰＥＯ、ｐＨ７．４。
【００９０】
（実施例２：３つのキナーゼを用いた多重化酵素アッセイおよびそれらの特異性（図３））
アッセイプロトコルは、実施例１においてと同じである。用いた３つの酵素は、Ｓｒｃ−キナーゼ、レセプターＩＩ−キナーゼおよびＰＫＡキナーゼである。本実験の目的は、酵素反応について釣り合いのとれた量の産物が得られるように、実験条件を最適化した後の多重化アッセイの性能を示すことである。ｓｒｃ−キナーゼについて、最適なペプチドは、迅速な反応のために用いられる。本実験において用いられる酵素量は、１μＬのｓｒｃ−キナーゼならびに各々５μＬのＰＫＡキナーゼおよびレセプターＩＩキナーゼであった。このアッセイを、６０分間インキュベートし、その後、１０μＬの１００ｍＭ　ＥＤＴＡを添加することによって反応を停止した。改変したＬａｂＣａｒｄミクロ流体デバイスでの分析前に、アッセイサンプルを、７０μＬのＤ．Ｉ．Ｈ_２Ｏで希釈した。特異性をまた、これらの３つの酵素について研究し、１つの酵素を、１つのチューブにおいて他の２つの酵素についての基質とともにインキュベートした。同じ手順および前処理を用いて反応を停止させ、そしてアッセイサンプルを希釈した。分析条件は、実施例１について用いたのと同じである。
【００９１】
（実施例３：３つのクラスのキナーゼを用いた多重化酵素アッセイ（図４））
アッセイプロトコルは、実施例１において用いたのと同じである。多重化アッセイは、３つのクラスのキナーゼについてであり、これらのキナーゼは、それぞれ、チロシン、セリンおよびトレオニンをリン酸化する。このアッセイを、各々５μＬのＰＫＡキナーゼおよびレセプターＩＩキナーゼ、ならびに３μＬのＭＡＰ（Ｅｒｋ−２）キナーゼとともに１時間にわたってインキュベートした。実施例１と同じ手順を用いて反応を停止させ、そして分析のためにアッセイサンプルを希釈した。標準どおりのＬａｂＣａｒｄミクロ流体デバイスを、分析を実施するために用いた。注入を、ウェル番号２に８００Ｖを６０秒間印加し、一方他の３つのウェルはアースすることによって行った。サンプルは、ウェル番号４中にある。分離条件は、ウェル番号１について０Ｖであり、ウェル番号２および４について８００Ｖであり、そしてウェル番号３について１５００Ｖである。分離距離は３ｃｍである。類似の移動度を有する成分を分離するために、比較的長い分離距離が必要とされた。
【００９２】
（実施例４：時間経過研究（図５））
酵素量および２μＭフルオレセインを内部標準として用いたこと以外は、実施例１について用いたのと同じプロトコルを本実験のために用いた。Ｓｒｃ−キナーゼおよびＰＫＡキナーゼを、時間経過研究のために用いた。１ｍｇ／ｍＬオボアルブミンを用いてＨＥＰＥＳ中に新たに事前希釈したｓｒｃ−キナーゼ（５×）およびＰＫＡキナーゼ（４×）を用いて、最終量のｓｒｃ−キナーゼを０．４μＬの商業的ｓｒｃ−キナーゼに等価であるように、そして最終量のＰＫＡキナーゼを０．５μＬの商業的ＰＫＡキナーゼに等価であるように調整した。これらの酵素をアッセイチューブに添加した後、反応を反復ＣＥ分析によってモニタリングした。両方の酵素を用いるアッセイまたは１つのみの酵素を用いる２つの別々のアッセイのいずれについても、酵素の存在または非存在以外は等しい条件を用いた。しかし、これは、反応容量における何の顕著な相違も引き起こさなかった。なぜなら、酵素の容量は、総アッセイ容量の１％未満であるからである。多重化アッセイについて、両方の酵素についての基質が存在した。特定の基質のみが、個々のアッセイについて存在した。改変されたＬａｂＣａｒｄミクロ流体デバイスを、実施例１においてと同じ条件で分析のために用いた。内部標準（フルオレセイン）に対して正規化した産物ピーク面積を用いて、反応程度をモニタリングした。図５に示すように、ｓｒｃ−キナーゼおよびＰＫＡキナーゼは両方とも、多重化アッセイまたは個々のアッセイのいずれにおいても、約１時間にわたって非常に良好な線形性を示した。また、両方の酵素は、多重化アッセイ対個々のアッセイにおいてほぼ同じ反応性を示した。このことは、この２つの酵素が、個々のアッセイにおける速度と等しい速度で多重化アッセイにおいて独立して作動することを示す。
【００９３】
（実施例５：阻害研究（図６））
本実験は、多重化アッセイ形式および個々のアッセイ形式の両方において測定されたＩＣ_５０または阻害が、類似の結果を示すことを実証する。アッセイ条件は、酵素の数および内部標準としての１μＭフルオレセインの使用以外は、実施例１において用いたのと同じであった。寛大な贈与物として提供された既知のキナーゼインヒビターであるｓｒｃ−キナーゼを、阻害研究のために用いた。市販のインヒビターＰＫＩ−［６−２２］を、ＰＫＡキナーゼ研究のために用いた。インヒビターの濃度範囲は、ｓｒｃ−キナーゼについて０μＭ〜５０μＭ、そしてＰＫＡキナーゼについて０μＭ〜１５０μＭである。反応物を、新たに希釈した酵素溶液由来の各々０．４μＬのｓｒｃ−キナーゼおよびＰＫＡキナーゼと共に４０分間インキュベートした（実施例４においてと同様のアプローチ）。阻害を定量するための反応を停止させるために、アッセイチューブを、＞８０℃で１分間加熱した（これは、この酵素を変性させる）。アッセイサンプルを直ちに分析しない場合、これらを酵素変性の直後に−２０℃で貯蔵した。分析条件は、改変ＬａｂＣａｒｄミクロ流体デバイスについて実施例１において用いたのと正確に同じである。この結果（図６）は、他のキナーゼの存在が、いずれのキナーゼの阻害測定値にも影響を与えないことを示す。ＩＣ_５０値は、多重化アッセイ形式と個々のアッセイ形式とで同等であった。
【００９４】
（実施例６：ＰＫＡキナーゼおよびホスホリパーゼを用いた多重化酵素アッセイ（図７））
本実験は、異なるクラスの酵素を用いて多重化酵素アッセイを実施することが実行可能であることを実証し、ここで、共通の条件を用いて、合理的な酵素代謝回転速度を獲得し得る。多重化アッセイ溶液は、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ　Ｃａ（Ａｃ）_２、２ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＭｎＣｌ_２、２ｍＭ　Ｍｇ−ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、内部標準としての３μＭフルオレセイン、両方の酵素についての各々３０μＭの基質、１μＬのホスホリパーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｐ７１４７）および０．５μＬのＰＫＡキナーゼを含む。個々のアッセイについて、１つのみの酵素およびその基質をアッセイ混合物中に添加したこと以外は、多重化アッセイについてと同じ条件を用いた。このアッセイを２０分間インキュベートし、そしてこの酵素を、１００℃まで２分間加熱することによって変性させた。
【００９５】
分析条件は、改変したＬａｂＣａｒｄミクロ流体デバイスについて用いたのと同じであり、そして分離媒体は、１％　ＰＥＯを有する２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳであった。図７は、これらの２つの酵素についてのアッセイが多重化され得ることを示す。
【００９６】
（実施例７：インスリン刺激シグナル伝達経路のモニタリング（図８））
この経路に関与する重要な酵素（生化学的サンプル）を多重化するための実験条件：５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ　ＡＴＰ、３０μＭの基質（Ｓ６キナーゼ：ＦＩＴＣ−ＬＣ−ＬＲＲＡＳＬＧ；ＩＲキナーゼ：（５−ＦＡＭ）−ＫＫＫＳＰＧＥＹＶＮＩＥＦＧ；Ｅｒｋキナーゼ：ＦＩＴＣ−ＬＣ−ＰＫＴＰ）、３μＬのＳ６キナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１μＬ　Ｅｒｋ−２キナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および１μＬインスリンレセプターキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）。このアッセイを、室温で１．４時間インキュベートし、その後、分析を行った（図８）。
【００９７】
（実施例８：細胞のシグナル伝達経路をモニタリングするための多重化キナーゼアッセイ（図９Ａおよび図９Ｂ））
多重化アッセイについての実験条件：５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　Ｎａ_３ＶＯ_４、２ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ　ＡＴＰ、各キナーゼについて６０μＭの基質（ＡｂＩキナーゼ：ＦＩＴＣ−ＬＣ−ＥＡＩＹＡＡＰＦＡＫ；ｐ３８キナーゼ：ＦＩＴＣ−ＬＣ−ＫＲＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＥＰＮＱＡＬＬＲ；Ｓ６キナーゼ：ＦＩＴＣ−ＬＣ−ＬＲＲＡＳＬＧ）、３μＬのＳ６キナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、０．５μＬのｐ３８キナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および０．５μＬのＡｂＩキナーゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）。室温で３時間にわたってインキュベートした。反応を停止させるために、アッセイ混合物を８０℃で１分間加熱してこれらのキナーゼを変性させた。
【００９８】
１つのみのキナーゼおよび他の２つのキナーゼについての基質をアッセイにおいて用いて交差反応性をチェックしたこと以外は、特異性研究：実験条件は、同じであった。図に示すように、キナーゼと他のキナーゼについての基質との間に１％未満の交差反応性が観察された。それゆえ、これらの基質は、本実験においてそれらのキナーゼについて特異的である。
【００９９】
【表４】

ＥＧＦＲアッセイについてのプロトコル：２５μＬの１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ：７．４）、１０μＬの１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２＋５ｍＭ　ＭｎＣｌ_２、３μＬの１Ｍ　ＮａＣｌ、１μＬ　５０ｍＭ　ＤＴＴ、１μＬ　５０ｍＭ　Ｎａ_３ＶＯ_４、３μＬグリセロール、２μＬ　１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２μＬ　１００ｍＭ　Ｎａ−ＡＴＰ、３μＬ　ＥＧＦＲキナーゼ、種々の量のＥＧＦ、および３μＬ基質（５０μＭ最終濃度）を添加して、反応を開始する。基質を添加する前に、混合物を５分間インキュベートして、ＥＧＦへの結合によってＥＧＦＲを活性化する。このインキュベーションを、３０℃にて３０分間〜１時間行った。１０μＬの２００ｍＭ　ＥＤＴＡを添加したかまたはこのサンプルを凍結するかのいずれかによってキナーゼ反応を停止させた後に分析をする。凍結したサンプルについて、分析を解凍直後に行った。
【０１００】
分析を、２．５ｃｍの有効分離距離を有するＬａｂＣａｒｄで行った（例えば、図１Ｂを参照のこと）。注入を、ウェル番号２で３０秒間にわたって１０００Ｖを印加し、一方、他のウェルをアースすることによって行った。分離条件は、ウェル番号１について０Ｖ、ウェル番号２および４について７００Ｖ、ウェル番号３について１５００Ｖである。
【０１０１】
レセプターＩＩアッセイについてのプロトコル：３０μＬの１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ：７．４）、１０μＬの１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２＋５ｍＭ　ＭｎＣｌ_２、１μＬの５０ｍＭ　ＤＴＴ、１μＬの５０ｍＭ　Ｎａ_３ＶＯ_４、２μＬの１００ｍＭ　Ｎａ−ＡＴＰ、１μＬのレセプターＩＩキナーゼ、種々の量のインスリンβまたは他のインスリンリガンド［活性化リガンド］および／またはＥＧＦ［活性化リガンド結合の競合インヒビター］、そして最終工程は、３μＬのレセプターＩＩキナーゼ基質（５０μＭの最終濃度）を添加して反応を開始することである。キナーゼ基質を添加する前に、混合物を５分間インキュベートして、インスリンβへの結合によってレセプターＩＩキナーゼを活性化する。インキュベーションを、室温にて３０分間行った。１０μＬの２００ｍＭ　ＥＤＴＡを添加するかまたはこのサンプルを凍結するかのいずれかによって反応を停止させた後に分析する。凍結したサンプルについて、サンプルを解凍した直後に分析を行った。
【０１０２】
分析を、５ｍｍの有効分離長を有する改変Ｈｅｎｒｙチップで行った。注入を、ウェル番号２に４５秒間にわたって４００Ｖを印加し、一方、他のウェルをアースすることによって実施した。分離条件は、ウェル番号１について０Ｖ、ウェル番号２および４について４００Ｖ、ウェル番号３について７００Ｖである。
【０１０３】
（実施例９：ＥＧＦＲキナーゼ活性のＥＧＦ増強）
図１０は、ＥＧＦＲキナーゼ活性のＥＧＦ増強を示す。ＥＧＦは、基質１を用いて測定した場合、ＥＧＦＲキナーゼ活性を４倍も増強し得る。文献によれば、ＥＧＦがＥＧＦＲに結合する場合、このことは、このレセプターの二量体化またはインターナリゼーションを引き起こす。しかし、この機構は、充分には理解されていない。膜貫通タンパク質のように、ＥＧＦＲは、そのキナーゼドメインを細胞内に有する。ＥＧＦＲの細胞外レセプタードメインへのＥＧＦ結合がそのキナーゼ活性を顕著に増大させることが報告されている。このプロセスは、癌腫の発達の多くの局面において見出される。本研究において観察される増強の程度は、文献において報告された程度と一貫している。
【０１０４】
ＥＧＦ量に対するＥＧＦＲキナーゼ活性の用量応答を、両方の基質を用いて研究した（図１２Ａの基質１、図１２Ｂの基質２）。用量応答研究について、基質濃度はいずれの基質についても５０μＭであり、そしてＥＧＦＲ濃度は５０ｎＭであった。他の条件を、実験の節に列挙する。予想されるように、ＥＧＦはＥＧＦに強固に結合するので、キナーゼ活性の増強は、化学量論量のＥＧＦを添加した場合、プラトーに達する。これは、０．５：１に等しい、ＥＧＦ：ＥＧＦＲのモル比において到達する。おそらく、ＥＧＦがＥＧＦＲの二量体化を引き起こし、その結果、１分子のＥＧＦが二分子のＥＧＦＲを活性化し得るからである。
【０１０５】
図１１Ａおよび図１１Ｂから測定されたキナーゼ活性を、両方の基質についてＥＧＦ／ＥＧＦＲ比の関数としてプロットした。図１２Ａにおけるプロットは、この酵素が基質１に作用する場合、最適なＥＧＦ／ＥＧＦＲ比を用いて、キナーゼにおける６．３倍の増強を示す。最大レベルの増強は、図１２Ｂにおいて見られるように、基質２を用いて約１１倍であった。
【０１０６】
（実施例１０：スクリーニングアッセイ）
本実施例は、キナーゼレセプター酵素のリガンド活性化を妨害し得る競合（スクリーニングアンタゴニスト）についてスクリーニングするアッセイの使用を実証する。本実施例では、２つのＥＧＦＲフラグメントを、ＥＧＦの結合部位を飽和して結合をブロックし、続いてＥＧＦが添加された場合にキナーゼ活性を増大させる能力について研究した。本実験では、５０μＭのＥＧＦＲ基質２を用いた。ＥＧＦＲおよびＥＧＦの濃度をそれぞれ、５０ｎＭおよび５５ｎＭで用いた。表１に列挙するように、フラグメントの濃度をＥＧＦ濃度よりも約１０倍高くした場合、より少ない増強が観察される。しかし、これは、ＥＧＦによって促進される増強を完全には抑制しない。競合現象は、以下に考察されるように、レセプターＩＩキナーゼアッセイを用いて、より明確に実証される。
【０１０７】
【表１】

（実施例１１：レセプターＩＩ活性をモニタリングすることによるレセプターＩＩアッセイ）
別の実施例として、レセプターＩＩ（インスリン関連レセプター）を、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）に関連して研究した。レセプターＩＩキナーゼ活性における顕著な増強（＞４倍）が観察された。試験した他のリガンドには、インスリン、インスリンα鎖およびインスリンβ鎖が含まれていた。インスリンおよびインスリンβ鎖の両方は、高濃度を用いた場合、このレセプターキナーゼ活性を２０倍も刺激した（表２）。このレセプターについての１つのインスリンβ鎖用量応答研究を、図１３に示す。いくつかのリガンドによるこのレセプターキナーゼ活性についての増強の顕著な相違（ＩＧＦについて４倍、インスリンおよびインスリンβ鎖について＞２０倍、インスリンα鎖についてほんの約３倍）に基づいて、インスリンβ鎖を、レセプターキナーゼ活性をモニタリングすることによってレセプター−リガンド結合アッセイを実証するために選択した。本実験のために、２５μＭの基質を、固定量のレセプターＩＩおよび種々の量のリガンドと共に用いて、レセプターとリガンドとの間の飽和した結合を確認した。
【０１０８】
【表２】

図１３は、インスリンβによるレセプターＩＩキナーゼについての活性化曲線を示す。
【０１０９】
（実施例１２：競合インヒビターについてのスクリーニングアッセイ）
このレセプターを用いた、インスリンβ鎖と上皮増殖因子（ＥＧＦ）との間の競合を実施し、レセプターキナーゼ活性をモニタリングすることによって、活性化リガンドと推定競合物との間の競合における使用のためのアッセイ方法を実証した。固定したレセプター濃度で、２つの濃度（３μＭおよび１５μＭ）のインスリンβ鎖（活性化リガンド）を用い、種々の量のＥＧＦ（競合する非活性化リガンド）を用いた競合実験を実施し、このことは、０．２μＭ〜０．３μＭという同等のＩＣ５０を導いた。競合する非活性化リガンドはより高いインスリンβ濃度で完全な競合を示さなかったが、レセプターキナーゼ活性の変化に基づいて結合競合を測定することは簡単である。
【０１１０】
図１４Ａは、高濃度の活性化リガンドでの非活性化リガンドによる、リガンド誘導性レセプターＩＩキナーゼ活性化の阻害を示す。図１４Ｂに示すように、３μＭというより低いインスリンβ鎖濃度を用いた場合、ＥＧＦを用いてほぼ完全な競合を示すこともまた可能である。
【０１１１】
本明細書に引用した全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物または特許出願が参考として援用されると具体的かつ個々に示されたかのように、本明細書中に参考として援用される。
【０１１２】
上記の発明は、理解を明確にする目的で例示および例によっていくらか詳細に記載されたが、本発明の教示を考慮すれば、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明に特定の変更および改変が行われ得ることが当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、本発明に従って多重化反応産物の電気泳動分離を実施するためのミクロ流体デバイス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ　ｄｅｖｉｃｅ）の、単純化した平面図である。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、本発明に従って多重化反応産物の電気泳動分離を実施するためのミクロ流体デバイスの、単純化した平面図である。
【図２Ａ】
図２Ａは、アッセイ産物および基質（２Ａ）を示す、４つの異なるキナーゼを用いる多重化酵素アッセイの電気泳動図である。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、基質特異性（２Ｂ）を示す、４つの異なるキナーゼを用いる多重化酵素アッセイの電気泳動図である。
【図３Ａ】
図３Ａは、アッセイ産物および基質（３Ａ）を示す、４つの異なるキナーゼを用いる多重化酵素アッセイの電気泳動図である。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、基質特異性（３Ｂ）を示す、４つの異なるキナーゼを用いる多重化酵素アッセイの電気泳動図である。
【図４】
図４は、３つのクラスのキナーゼを用いる多重化酵素アッセイについての電気泳動図である。
【図５Ａ】
図５Ａは、個々のアッセイ形式（５Ａ）における酵素についての時間経過研究を示す。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、多重化アッセイ形式（５Ｂ）における酵素についての時間経過研究を示す。
【図６Ａ】
図６Ａは、個々のアッセイ形式（６Ａ）における阻害測定値である。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、多重化アッセイ形式（６Ｂ）における阻害測定値である。
【図７】
図７は、ホスホリパーゼおよびＰＫＡキナーゼを用いた多重化酵素アッセイの電気泳動図を示す。
【図８】
図８は、インスリンレセプター経路における酵素についての多重化アッセイの電気泳動図を示す。
【図９Ａ】
図９Ａは、細胞シグナル伝達経路をモニタリングするために用いられる多重化キナーゼアッセイの電気泳動図を示す。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、細胞シグナル伝達経路をモニタリングするために用いられる多重化キナーゼアッセイの電気泳動図を示す。
【図１０】
図１０は、レセプターキナーゼ活性のリガンド増強のレベルを示すプロットである。
【図１１Ａ】
図１１Ａは、第一の基質（１１Ａ）を用いた、ＥＧＦＲ活性で測定したレベルに対する種々のＥＧＦ／ＥＧＦＲ比の影響を示す。
【図１１Ｂ】
図１１Ｂは、第二の基質（１１Ｂ）を用いた、ＥＧＦＲ活性で測定したレベルに対する種々のＥＧＦ／ＥＧＦＲ比の影響を示す。
【図１２Ａ】
図１２Ａは、第一の基質（１２Ａ）を用いた、ＥＧＦＲキナーゼのＥＧＦ増強を示すプロットである。
【図１２Ｂ】
図１２Ｂは、第二の基質（１２Ｂ）を用いた、ＥＧＦＲキナーゼのＥＧＦ増強を示すプロットである。
【図１３】
図１３は、レセプターＩＩキナーゼアッセイにおけるインスリンＢ用量応答を示す。
【図１４Ａ】
図１４Ａは、ＥＧＦを競合物として用いた、高い活性化リガンド濃度（１４Ａ）でのレセプターＩＩキナーゼ活性の変化を示すプロットである。
【図１４Ｂ】
図１４Ｂは、ＥＧＦを競合物として用いた、低い活性化リガンド濃度（１４Ｂ）でのレセプターＩＩキナーゼ活性の変化を示すプロットである。

Claims

多重化酵素アッセイ方法であって、以下の工程：
酵素基質のセットの存在下で、該基質についての酵素の存在下で、該セット中の酵素基質を対応する産物へと変換するに有効な条件下で、複数の酵素反応を実施する工程であって、ここで、（ｉ）各基質および該基質の該産物が、互いに、かつ該セット中の他の基質およびそれらの対応する産物とは異なる分離特徴を有し、そして（ｉｉ）各基質およびその対応する産物は、検出可能なシグナルを生じ得る検出部分を有する、工程、
反応物中の該基質および産物を単一の分離媒体で分離する工程、
各分離された産物について、該産物を同定するに有効な分離特徴および該産物の量に関連するシグナルを検出する工程、ならびに
各産物について検出された、該検出された分離特徴およびシグナルから、該反応の各々で該対応する産物へと変換された基質の量を決定する工程
を包含する、方法。
前記基質および産物の前記分離特徴が電気泳動移動度であり、そして前記分離する工程が、該基質および対応する産物を電気泳動媒体内で、印加された電場の影響下で分離することを包含する、請求項１に記載の方法。
前記基質および対応する産物が、キャピラリー電気泳動によって分離される、請求項２に記載の方法。
前記検出する工程が、前記基質の各々について、該基質を同定するに有効な分離特徴および該基質の量に関連するシグナルを検出することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
前記基質および対応する産物が蛍光標識され、そして前記検出する工程が、蛍光励起波長が照射されたときに各産物から蛍光シグナルを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
前記複数の酵素反応が、複数の異なる酵素を含む単一の反応混合物において実施され、そして該酵素の各々が、該反応混合物中の前記基質の１つを前記対応する産物へと変換するに有効である、請求項１に記載の方法。
選択された細胞条件下で、細胞中の複数の異なる酵素の各々の活性のレベルを決定する際における使用のための、請求項６に記載の方法であって、ここで、前記反応混合物中の該異なる酵素が、このような選択された細胞条件下で該細胞から得られる、方法。
コントロール細胞条件および試験細胞条件における、細胞中の一群の酵素の各々の活性レベルの変化を決定するための、請求項７に記載の方法であって、ここで、前記実施する工程、分離する工程、検出する工程および決定する工程が、コントロール条件および試験条件で該細胞から得られた酵素について実施される、方法。
前記異なる酵素のうちの１以上の活性レベルを阻害または活性化する能力について既知であるかまたは試験される因子に細胞が暴露された場合の該細胞中の一群の酵素の各々の活性レベルの変化を決定するための、請求項７に記載の方法であって、ここで、前記実施する工程、分離する工程、検出する工程および決定する工程が、該因子への暴露の前および後の該細胞から得られた酵素について実施される、方法。
前記一群の酵素が、レセプターキナーゼ酵素および細胞シグナル伝達経路酵素からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
選択された酵素の活性を阻害または刺激する際の１以上の因子の影響をアッセイするための、請求項１に記載の方法であって、ここで、前記実施する工程が、複数の別々の酵素反応を別々の反応混合物中で実施することを包含し、ここで、各混合物が、（ｉ）１以上の酵素および（ｉｉ）前記セット由来の前記基質の１以上を含み、そしてここで、前記実施する工程が、該基質および前記複数の反応の産物を分離する前に前記反応混合物を合わせることをさらに包含する、方法。
酵素活性に影響を与え得る試験化合物についてスクリーニングまたは評価する際に使用するための、請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記別々の反応混合物がまた、（ａ）該酵素の活性を活性化または阻害する能力について試験される複数の異なる試験因子のうちの１つ、および（ｂ）単一の因子の複数の異なる濃度のうちの１つの一方または両方を含む、方法。
請求項１１に記載の方法であって、セット中の前記異なる基質が、（ｉ）酵素基質部分、（ｉｉ）該セット中の他の基質および対応する産物の分離特徴に関して独特である、該セット中の各基質およびその対応する産物に分離特徴を付与する移動度モディファイヤー、ならびに（ｉｉｉ）該基質およびそれらの対応する産物からのシグナルの検出を可能にする検出部分を含む、方法。
セット中の前記異なる基質が、オリゴペプチド基質部分を有し、そして前記移動度モディファイヤーが、（ｉ）該オリゴペプチドにカップリングされた非ペプチド部分、（ｉｉ）該酵素による該基質部分の認識を保存するが、該オリゴペプチドの分離特徴を変更する、該オリゴペプチド中の１以上のアミノ酸置換、および（ｉｉｉ）異なる分離特徴を有する異なるレポーター部分からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
レセプター酵素と該レセプター酵素の活性に影響を与えることが公知のリガンドとの間の相互作用をアッセイするための、請求項１１に記載の方法であって、ここで前記別々の酵素反応混合物が、（ｉ）該酵素、（ｉｉ）前記セットからの前記基質の１つ、（ｉｉｉ）少なくとも１つの反応混合物中に、該酵素の最適な活性化を生じるために充分な濃度のリガンドを含む、１以上の異なる濃度の前記リガンドを含む、方法。
前記反応混合物の少なくとも１つが、リガンドを実質的に含まず、非活性化酵素の酵素活性レベルを提供する、請求項１５に記載の方法。
１以上の試験因子がリガンド活性化酵素活性を妨害する能力をアッセイするための、請求項１５に記載の方法であって、前記反応混合物の少なくともいくつかが、最適な濃度のリガンドに加えて、複数の異なる試験因子のうちの１つを含む、方法。
１以上の試験因子がリガンド活性化酵素活性を妨害する影響をアッセイするための、請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記反応混合物の少なくともいくつかが、最適な濃度のリガンドおよび１以上の異なる濃度の少なくとも１つの試験因子を含む、方法。
前記レセプター酵素が、活性化状態で、オリゴペプチド基質をリン酸化するに有効なレセプター−キナーゼ酵素であり、そして前記セット中の前記基質が、このようなオリゴペプチド基質を含み、移動度モディファイヤーが、（ｉ）該オリゴペプチドにカップリングされた非ペプチド部分、（ｉｉ）該酵素による該基質部分の認識を保存するが、該オリゴペプチドの該分離特徴を変更する、該オリゴペプチド中の１以上のアミノ酸置換、および（ｉｉｉ）異なる分離特徴を有する異なる検出部分からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
前記レセプター酵素が、前記リガンドがＥＧＦであるＥＧＦＲ、前記リガンドがインスリンであるレセプターＩＩキナーゼ、ならびに前記リガンドがインスリンであるＥＲＫおよびインスリンレセプターキナーゼからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
前記酵素がキナーゼである、請求項１１に記載の方法。
前記酵素が、ＥＲＫキナーゼ、Ｓ６キナーゼ、Ｐ３８キナーゼおよびＡｂＩキナーゼからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
複数の酵素基質を含む、多重化酵素アッセイを実施するための酵素基質のセットであって、該複数の酵素基質の各々が、（ｉ）該アッセイ中の酵素が該基質と反応して該基質を対応する産物へと変換する、酵素基質部分、（ｉｉ）該セット中の他の基質および対応する産物の分離特徴に関して独特の分離特徴を該セット中の各基質およびその対応する産物に付与する、移動度モディファイヤー、ならびに（ｉｉｉ）該セット中の該基質および産物からのシグナルの検出を可能にする検出部分を有する、セット。
前記検出部分が、蛍光レポーターである、請求項２３に記載のセット。
オリゴペプチド基質を有する、１以上の酵素をアッセイするための方法における使用のための、請求項２３に記載のセットであって、ここで、セット中の該基質は、オリゴペプチド基質部分を有し、そして前記移動度モディファイヤーは、（ｉ）該オリゴペプチドにカップリングされた非ペプチド部分、（ｉｉ）該酵素による該基質部分の認識を保存するが、該オリゴペプチドの分離特徴を変更する、該オリゴペプチド中の１以上のアミノ酸置換、ならびに（ｉｉｉ）異なる分離特徴を有する異なる検出部分からなる群より選択される、セット。