PL203326B1 - Przeciwciało, kompozycja farmaceutyczna, koniugat, izolowany kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza i sposób wytwarzania przeciwciała - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało, kompozycja farmaceutyczna, koniugat, izolowany kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza i sposób wytwarzania przeciwciała.

Rodzina ErbB receptorów o aktywnościach kinaz tyrozynowych obejmuje ważne mediatory wzrostu, różnicowania i przeżywania komórek. Ta rodzina receptorów obejmuje czterech odrębnych przedstawicieli, obejmujących receptor naskórkowego czynnika wzrostowego (EGFR lub ErbB1), HER2 (ErbB2 lub p185^neu), HER3 (ErbB3) i HER4 (ErbB4lub tyro2).

EGFR, kodowany przez gen erbB1, wiąże się przyczynowo z nowotworami złośliwymi u ludzi. W szczególności, zwiększoną ekspresję EGFR obserwowano w raku sutka, pęcherza, płuc, głowy, szyi i żołądka, jak również w glejakach. Zwiększonej ekspresji receptora EGFR często towarzyszy zwiększone wytwarzanie przez te same komórki nowotworowe liganda EGFR, transformującego czynnika wzrostowego alfa (TGF-α), w wyniku czego dochodzi do aktywacji receptora na autokrynnym szlaku stymulacji. Baselga i Mandelsohn, Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994). Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw EGFR lub jego ligandom, TGF-α i EGF, oceniano jako czynniki terapeutyczne w leczeniu takich nowotworów złośliwych. Patrz np. Baselga i Mandelsohn, supra; Masui i in., Cancer Research 44: 1002-1007 (1984) oraz Wu i in., J. Clin. Invest. 95: 1897-1905 (1995).

Drugiego przedstawiciela rodziny ErbB, p185^neu, pierwotnie zidentyfikowano jako produkt transformującego genu nerwiaka niedojrzałego chemicznie traktowanych szczurów. Zaktywowana postać protoonkogenu neu powstaje w wyniku punktowej mutacji (walina do kwasu glutaminowego) w transbłonowym regionie kodowanego białka. Amplifikację ludzkiego homologu neu obserwuje się w rakach sutka i jajników i jest ona skorelowana ze złą prognozą(Slamon i in.,Science,235: 177-182 (1987); Slamon i in., Science 244: 707-712 (1989) oraz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 968 603). Dotąd nie donoszono dla nowotworów ludzkich o mutacji punktowej analogicznej do tej w protoonkogenie neu. Nadekspresję ErbB2 (często, ale nie zawsze z powodu amplifikacji genu) obserwowano również w innych rakach, obejmujących raka żołądka, śluzówki macicy, gruczołu ślinowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki i pęcherza moczowego. Patrz, między innymi, King i in., Science, 229: 974 (1985); Yokota i in., Lancet: 1: 765-767 (1986); Fukushigi i in., Mol. Cell. Biol., 6:955-958(1986); Geurin i in., Oncogene Res. 3: 21-31 (1988); Cohen i in., Oncogene, 4: 81-88 (1989); Yonemura i in., Cancer Res., 51: 1034 (1991); Borst i in., Gynecol. Oncol. 38: 364 (1990); Weiner i in., Cancer Res., 50: 421-425 (1990); Kern i in., Cancer Res. 50: 5184 (1990); Park i in., Cancer Res., 49: 6605 (1989); Zhau i in., Mol. Carcinog., 3: 354-357 (1990); Aasland i in., Br. J. Cancer. 57: 358-363 (1988); Williams i in., Pathiobiology 59: 46-52 (1991) i McCann i in., Cancer 65: 88-92 (1990). ErbB2 może ulegać nadekspresji w raku gruczołu krokowego (Gu i in., Cancer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross i in., Hum. Pathol. 28: 827-33 (1997); Ross i in., Cancer 79: 2162-70 (1997) i Sadasivan i in., J. Urol. 150: 126-31 (1993)).

Opisano przeciwciała skierowane przeciw białkowym produktom p185^neu szczura i ErbB2 człowieka. Drebin i współpracownicy otrzymali przeciwciała skierowane przeciw produktowi genu neu szczura, p185^neu. Patrz, na przykład, Drebin i in., Cell 41: 695-706 (1985); Myers i in., Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991) i międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 94/22478. Drebin i in., Oncogene 2: 273-277 (1988) donoszą, że w wyniku stosowania mieszanin przeciwciał reaktywnych wobec dwóch odrębnych regionów p185^neu uzyskuje się synergistyczne wpływy przeciwnowotworowe wobec stransformowanych neu komórek NIH-3T3 wszczepionych myszom nude. Patrz także opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 824 311, wydany 20 października 1998 r.

Hudziak i in., Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) opisują tworzenie zestawu przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2, które scharakteryzowano stosując linię komórek ludzkiego nowotworu sutka, SK-BR-3. Względną proliferację komórkową komórek SK-BR-3 po ekspozycji na przeciwciała określano przez wybarwianie fioletem krystalicznym monowarstw po 72 godzinach. Stosując to oznaczenie, najwyższe hamowanie otrzymano dla przeciwciała nazwanego 4D5, które hamowało proliferację komórkową o 56%. Inne przeciwciała z zestawu w mniejszym stopniu obniżały proliferację komórkową w tym oznaczeniu. Stwierdzono ponadto, że przeciwciało 4D5 uczula linie komórek nowotworu sutka, w których zachodzi nadekspresja ErbB2, na cytotoksyczne wpływy TNF-α. Patrz także opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 677 171, wydany 14 października 1997 r. Dyskutowane w Hudziak i in. przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 scharakteryzowano dalej w Fendly i in., Cancer Research 50: 1550-1558 (1990); Kotts i in., In Vitro 26(3): 59A (1990); Sarup i in., Growth Regulation 1: 72-82 (1991); Shepard i in., J. Clin. Immunol. 11(3): 117-127 (1991); Kumar i in., Mol. Cell..

PL 203 326 B1

Biol. 11(2): 979-986 (1991); Lewis i in., Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263 (1993); Pietras i in., Oncogene 9: 1829-1838 (1994); Vitetta i in., Cancer Research 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski i in., J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994);Scott i in., J. Biol. Chem. 266: 14300-5 (1991); D'souza i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7202-7206 (1994); Lewis i in., Cancer Research 56: 1457-1465 (1996) oraz Schaefer i in., Oncogene 15: 1385-1394 (1997).

Zrekombinowana, humanizowana wersja mysiego, skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała 4D5 (huMab4D5-8, rhuMAb HER2 lub HERCEPTIN^®, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 821 337) jest klinicznie aktywna u pacjentów z przerzutowymi rakami sutka z nadekspresją ErbB2, którzy uprzednio przeszli intensywną terapię przeciwrakową (Baselga i in., J. Clin. Oncol. 14: 737-744 (1996)). HERCEPTTN^® uzyskał zatwierdzenie do sprzedaży od Food and Drug Administration 25 września 1998 r. do leczenia pacjentów z przerzutowym rakiem sutka, w których to nowotworach zachodzi nadekspresją białka ErbB2.

Inne skierowane przeciw ErbB2 przeciwciała o różnych właściwościach opisano w Tagliabue i in., Int. J. Cancer 47: 933-937 (1991); McKenzie i in., Oncogene 4: 543-548 (1989); Maier i in., Cancer Res. 51: 5361-5369 (1991); Bacus i in., Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990); Stancovski i in., PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991); Bacus i in., Cancer Research 52: 2580-2589 (1992); Xu i in., Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993); międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 94/00136; Kasprzyk i in., Cancer Research 52: 2771-2776 (1992); Hancock i in., Cancer Res. 51: 4575-4580 (1991); Shawver i in., Cancer Res. 54: 1367-1373 (1994); Arteaga i in., Cancer Res. 54: 3758-3765 (1994); Harwerth i in., J. Biol. Chem. 267: 15160-15167 (1992); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 783186 oraz Klapper i in., Oncogene 14: 2099-2109 (1997).

W wyniku przeszukiwania pod kątem homologii zidentyfikowano dwóch innych przedstawicieli rodziny receptorów ErbB, ErbB3 (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 183 884 i 5 480 968, jak również Kraus i in., PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989)) oraz ErbB4 (europejskie zgłoszenie patentowe numer 599 274; Plowman i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1746-1750(1993) i Plowman i in., Nature 366: 473-475 (1993)). Oba te receptory wykazują zwię kszoną ekspresję w co najmniej niektórych liniach komórek raka sutka.

Receptory ErbB generalnie występują w komórkach w różnych kombinacjach i uważa się, że heterodimeryzacja zwiększa różnorodność komórkowych odpowiedzi na szereg różnorodnych ligandów ErbB (Earp i in., Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR wiązany jest przez sześć różnych ligandów: naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF), transformujący czynni wzrostowy alfa (TGF-α), amfiregulinę, wiążący heparynę naskórkowy czynnik wzrostowy, betacelulinę i epiregulinę (Groenen i in., Growth Factors 11: 235-257 (1994)). Ligandami ErbB3 i ErbB4 jest rodzina białek heregulin, powstających w wyniku alternatywnego składania eksonów pojedynczego genu. Rodzina heregulin obejmuje hereguliny alfa, beta i gamma (Holmes i in., Science 256: 1205-1210 (1992); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 641 869 oraz Schaefer i in., Oncogene 15:1385-1394 (1997)); czynniki różnicowania neu (NDF), glejowe czynniki wzrostowe (GGF); aktywność indukującą receptory acetylocholinowe (ARIA) i czynnik neuronów czuciowych i ruchowych (SMDF). W celu zapoznania się z przeglądem, patrz Groenen i in., Growth Factors 11: 235-257 (1994); Lemke, G., Molec. & Cell.. Neurosci. 7: 247-262 (1996) i Lee iin., Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995). Ostatnio zidentyfikowano trzy dodatkowe ligandy ErbB: neuregulinę-2 (NUMERG-2), o której donoszono, że wiąże się albo z ErbB3, alboErbB4 (Chang i in., Nature 387: 509-512 (1997) i Carraway i in. Nature 387:512-516 (1997)); neuregulinę-3, która wiąże ErbB4 (Zhang i in., PNAS (USA) 94 (18): 9562-7 (1997) oraz neuregulinę-4, która wiąże ErbB4 (Hararii in., Oncogene 18:2681-89 (1999); HB-EGF, betacelulina i epiregulina również wiążą się z ErbB4.

O ile EGF i TGF-α nie wiążą się z ErbB2, EGF stymuluje tworzenie heterodimeru EGFR i ErbB2, co aktywuje EGFR i czego wynikiem jest transfosforylacja ErbB2 w heterodimerze. Dimeryzacja i/lub transfosforylacja okazały się aktywować kinazę tyrozynową ErbB2. Patrz Earp i in., supra. Podobnie, gdy ErbB3 ulega koekspresji z ErbB2, tworzony jest aktywny kompleks sygnałowy i przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 są zdolne do niszczenia tego kompleksu (Sliwkowski i in., J. Biol. Chem. 269 (20): 14661-14665 (1994)). Dodatkowo, powinowactwo ErbB3 wobec hereguliny (HRG) zwiększa się do stanu wyższego powinowactwa, gdy ulega on koekspresji z ErbB2. Odnośnie kompleksu białek ErbB2-ErbB3, patrz także Levi i in., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995) i Lewis i in., Cancer Res. 56: 1457-1465 (1996). ErbB4, podobnie jak ErbB3, tworzy aktywny kompleks sygnałowy z ErbB2 (Carraway i Cantley, Cell. 78: 5-8 (1994)).

PL 203 326 B1

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało, które zawiera sekwencję aminokwasową w sekwencji SEQ ID numer: 4 ciężkiej domeny zmiennej (VH) i sekwencję aminokwasową w sekwencji SEQ ID numer:3 lekkiej domeny zmiennej (VL).

W rozwiązaniu korzystnym przeciwciało to jest nienaruszonym przeciwciałem IgG1, lub jest fragmentem przeciwciała, ewentualnie może być fragmentem Fab przeciwciała.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera przeciwciała, które zawierają sekwencję aminokwasową w sekwencji SEQ ID numer: 4 ciężkiej domeny zmiennej (VH) i sekwencję aminokwasową w sekwencji SEQ ID numer: 3 lekkiej domeny zmiennej (VL) oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

W korzystnym wykonaniu, kompozycja farmaceutyczna wedł ug wynalazku stanowi roztwór wodny, lub może być kompozycją zliofilizowaną.

Następnie przedmiotem wynalazku jest koniugat, który zawiera przeciwciała jak zdefiniowano powyżej skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym.

Kolejno, przedmiotem wynalazku jest także izolowany kwas nukleinowy kodujący przeciwciało zdefiniowane powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor zawierający kwas nukleinowy kodyacy przeciwciało według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza zawierająca wektor według wynalazku jak zdefiniowano powyżej.

Komórka gospodarza, korzystnie jest komórką ssaczą, a bardziej korzystnie jest komórką jajnika chomika Chińskiego (CHO).

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania przeciwciała, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza zawierającej kwas nukleinowy kodujący przeciwciało, które zawiera sekwencję aminokwasową w sekwencji SEQ ID numer: 4 ciężkiej domeny zmiennej (VH) i sekwencję aminokwasową w sekwencji SEQ ID numer: 3 lekkiej domeny zmiennej (VL, tak że zachodzi ekspresja kwasu nukleinowego i produkcja przeciwciała. W korzystnym wykonaniu sposobu przeciwciało odzyskuje się z hodowli komórek gospodarza, lub z medium hodowlanego hodowli komórek gospodarza.

W sposobie według wynalazku, komórką gospodarza jest komórka jajnika chomika Chińskiego (CHO).

W najbardziej korzystnym aspekcie sposobu według wynalazku, miesza się odzyskane przeciwciała z farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem, zaróbką lub stabilizatorem do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej zawierającej to przeciwciało.

Jeśli przeciwciało stosowane do terapii blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand i/lub posiada cechy charakterystyczne monoklonalnego przeciwciała 2C4, uzyskuje się dalsze korzyści. Na przykład, o ile leki ukierunkowane na EGFR zakłócają funkcje tylko EGFR, przeciwciała będące przedmiotem szczególnego zainteresowania w niniejszym wynalazku (np. 2C4, włącznie z jego wariantami humanizowanymi i/lub wariantami pod względem dojrzałości powinowactwa) będą zakłócać funkcje heterodimerów EGFR/ErbB2, ErbB3/ErbB4 i ErbB2/ErbB3. Ponadto, przeciwciała według niniejszego wynalazku, które wiążą ErbB2 i blokują aktywację receptora ErbB przez ligand, będą komplementarne do leków ukierunkowanych na EGFR, podczas gdy leki ukierunkowane na EGFR nie są komplementarne do siebie wzajemnie.

Zastrzeżone przeciwciało może służyć do leczenia raka u człowieka, przy czym rak ten charakteryzuje się lub nie nadekspresją receptora ErbB2. Rak, który można leczyć jest rakiem sutka. Może to być też przerzutowy rak sutka. Lek można podawać człowiekowi z czynnikiem chemioterapeutycznym. Takim czynnikiem chemioterapeutyczny mogą być czynniki należące do grupy składającej się z antybiotyków antracyklinowych, cyklofosfomidu, taksanu, newelbiny, kseloda, mitomycyny C, oksaliplatyny, gemcytabiny i związku platyny.

Opisano także zastosowanie (a) pierwszego przeciwciała, które wiąże się z ErbB2 i hamuje wzrost komórek rakowych, w których zachodzi nadekspresją ErbB2; oraz (b) drugiego przeciwciała, które wiąże ErbB2 i blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand, do wytwarzania leku do leczenia raka u człowieka. Korzystnie, pierwsze przeciwciało w zastosowaniu według wynalazku obejmuje przeciwciało monoklonalne 4D5 lub humani-zowane 4D5, a drugie przeciwciało obejmuje przeciwciało mono-klonalne 2C4 lub humanizowane 2C4.

PL 203 326 B1

Przeciwciała, które wiążą się z ErbB2 i blokują aktywację receptora ErbB przez ligand, można też zastosować do wytwarzania leku do leczenia raka u człowieka, przy czym rakiem tym jest okrężnicy, odbytnicy oraz okrężnicy i odbytnicy.

Przeciwciało według wynalazku może być składnikiem wyrobu, który obejmuje pojemnik i zawartą w nim kompozycję, gdzie kompozycja zawiera przeciwciało, które wiąże się z ErbB2 i blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand, i ponadto obejmuje ulotkę informacyjną wskazującą, że kompozycję można stosować do leczenia raka, przy czym raka nie charakteryzuje nadekspresja receptora ErbB2. Może to też być wyrób, który obejmuje (a) pierwszy pojemnik z zawartą w nim kompozycją, gdzie kompozycja zawiera pierwsze przeciwciało, które wiąże się z ErbB2 i hamuje wzrost komórek rakowych, w których zachodzi nadekspresja ErbB2, oraz (b) drugi pojemnik z zawartą w nim kompozycją, gdzie kompozycja zawiera drugie przeciwciało, które wiąże się z ErbB2 i blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand.

W niniejszym opisie rozważa się różne korzyści ze stosowania przeciwciała, które wiąże ErbB2, do leczenia raka, w przeciwieństwie do leków ukierunkowanych na EGFR. W szczególności, EGFR ulega wysokiej ekspresji w wątrobie i skórze, a to stanowi olbrzymi sygnał dla aktywnego leku, jeśli lek wiąże się z EGFR. Ponadto, dla innych leków ukierunkowanych na EGFR, takich jak skierowane przeciw EGFR chimeryczne przeciwciało C225 i niskocząsteczkowy lek ZD1839, który wiąże EGFR, obserwowano toksyczność wobec skóry. Przypuszcza się, że przeciwciała, które wiążą ErbB2, będą posiadać lepszy profil bezpieczeństwa, niż takie leki.

Jeśli przeciwciało stosowane do terapii blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand i/lub posiada cechy charakterystyczne monoklonalnego przeciwciała 2C4, uzyskuje się dalsze korzyści. Na przykład, o ile leki ukierunkowane na EGFR zakłócają funkcje tylko EGFR, przeciwciała będące przedmiotem szczególnego zainteresowania w niniejszym wynalazku (np. 2C4, włącznie z jego wariantami humanizowanymi i/lub wariantami pod względem dojrzałości powinowactwa) będą zakłócać funkcje heterodimerów EGFR/ErbB2, ErbB3/ErbB4 i ErbB2/ErbB3. Ponadto, przeciwciała według niniejszego wynalazku, które wiążą ErbB2 i blokują aktywację receptora ErbB przez ligand, będą komplementarne do leków ukierunkowanych na EGFR, podczas gdy leki ukierunkowane na EGFR nie są komplementarne do siebie wzajemnie.

Krótki opis rysunków

Figury 1A i 1B przedstawiają mapowanie epitopowe reszt 22-645 w obrębie domeny zewnątrzkomórkowej (ECD) ErbB2 (sekwencję aminokwasową, włącznie z sekwencją sygnałową, przedstawiono na fig. 1A; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) jak określono przez analizę skróconych mutantów i ukierunkowaną mutagenezę (Nakamura i in., J. of Virology 67 (10): 6179-6191 (1993) oraz Renz i in., J. Cell. Biol. 125 (6): 1395-1406 (1994)). Różne skrócone wersje lub mutacje punktowe ECD ErbB2 przygotowano z cDNA stosując technikę reakcji łańcuchowej polimerazy. Ekspresję mutantów ErbB2 prowadzono w postacji białek fuzyjnych z gD w ssaczym plazmidzie ekspresyjnym. Plazmid ekspresyjny wykorzystuje promotor/sekwencję wzmacniającą cytomegalowirusa oraz sygnały terminacji i poliadenylacji SV40 położone za wstawioną sekwencją. Plazmidowym DNA transfekowano komórki 293.Jeden dzień po transfekcji komórki znakowano metabolicznie przez noc w wolnym od metioniny i cysteiny podłożu DMEM o niskim stężeniu glukozy, zawierającym 1% dializowaną płodową surowicę bydlęcą i 25 μ Ci każdej z ³⁵S-metioniny i ³⁵S-cysteiny. Supernatanty zbierano i do supernatantu dodawano albo przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw ErbB2, albo przeciwciała kontrolne, i inkubowano w temperaturze 4°C w ciągu 2-4 godzin. Kompleksy wytrącano, nakładano na żel z 10-20% gradientem akryloamidu w Tricine z SDS i elektroforezę prowadzono przy napięciu 100 V. Żel przenoszono na membranę przez elektobloting i analizowano przez autoradiografię. Jak przedstawiono na fig. 1B, skierowane przeciw ErbB2 przeciwciała 7C2, 7F3, 2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 i 3H4 wiążą różne epitopy ECD ErbB2.

Figury 2A i 2B przedstawiają wpływ skierowanych przeciw ErbB2 przeciwciał 2C4 i 7F3 na aktywację rHRGe1 komórek MCF7. Figura 2 przedstawia krzywe dawka-od powiedź dla hamowania przez 2C4 lub 7Fs stymulacji HRG fosforylacji tyrozyny. Figura 2B przedstawia krzywe dawkaodpowiedź dla hamowania przez 2C4 lub 7F3 wiązania wyznakowanego ¹²⁵I rHRGe1 _177-244 z komórkami MCF7.

Figura 3 przedstawia hamowanie wiązania wyznakowanego ¹²⁵I rHRGe1 _177-244 z zestawem ludzkich linii komórek nowotworowych przez skierowane przeciw ErbB2 monoklonalne przeciwciała 2C4 lub 7F3. Kontrolami dla przeciwciał monoklonalnych są mysie przeciwciała monoklonalne o takim samym izotypie, które nie blokują wiązania rHRG. Niespecyficzne wiązanie wyznakowanego

PL 203 326 B1 ¹²⁵I rHRGei 177-244 określano w równoległych inkubacjach prowadzonych w obecności 10 nM rHRGei. Wartości niespecyficznego wiązania wyznakowanej ¹²⁵I rHRGe1 177-244 były niższe niż 1% całości dla wszystkich testowanych linii komórkowych.

Figury 4A i 4B przedstawiają wpływ monoklonalnych przeciwciał 2C4 i 4D5 na proliferację komó-rek MDA-MB-175 (fig. 4A) i SK-BR-3 (fig. 4B). Komórki MDA-MB-175 i SK-BR-3 wysiewano w 96-studzienkowych płytkach i umożliwiano przyleganie w ciągu 2 godzin. Doświadczenie prowadzono w podłożu zawierającym 1% surowicę. Dodawano przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 lub samo podłoże i komórki inkubowano w ciągu w godzin w temperaturze 37°C. Następnie dodawano rHRGe1 (1 nM) lub samo podłoże i komórki inkubowano w ciągu 4 dni. Monowarstwy przemywano i wybarwiano/utrwalano 0,5% fioletem krystalicznym. W celu określenia proliferacji komórek mierzono absorbancję przy długości fali 540 nm.

Figury 5A i 5B przedstawiają wpływ monoklonalnego przeciwciała 2C4, przeciwciała HERCEPTIN® lub przeciwciała skierowanego przeciw EGFR na zależną od hereguliny (HRG) asocjację ErbB2 z ErbB3 w komórkach MCF7, w których występowała ekspresja niskich/normalnych poziomów ErbB2 (fig. 5A), i w komórkach SK-BR-3, w których występowała ekspresja wysokich poziomów ErbB2 (fig. 5B); patrz przykład 2 poniżej.

Figury 6A i 6B porównują aktywności nienaruszonego mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4 (mu 2C4) i chimerycznego fragmentu Fab 2C4. Fig. 6A przedstawia hamowanie wiązania ¹²⁵I-HGR z komórkami MCF7 przez chimeryczny Fab 2C4 lub nienaruszone mysie przeciwciało monoklonalne 2C4. Komórki MCF7 wysiewano w 24-studzienkowych płytkach (1 x 10⁵ komórek/studzienkę) i hodowano do uzyskania w około 85% zwartej warstwy w ciągu dwóch dni. Doświadczenia wiązania prowadzono w sposób opisany w Lewis i in., Cancer Research 56: 1457-1465 (1996). Fig. 6B przedstawia hamowanie aktywacji przez rHRGe1 fosforylacji tyrozyny p180 w komórkach MCF7 przeprowadzone w sposób opisany w Lewis i in., Cancer Research 56: 1457-1465 (1996).

Figury 7A i 7B przedstawiają przyporządkowania sekwencji aminokwasowych domen zmiennej łańcucha lekkiego (VL) (fig 7A) i zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) (fig. 7B) mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4 (odpowiednio sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 1 i 2); domen VL i VH humanizowanej wersji 2C4 (odpowiednio sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 3 i 4) oraz ludzkich sekwencji konsensu zrębów VL i VH (hum κ1, łańcuch lekki kappa podgrupy I, humIII, łańcuch ciężki podgrupy III) (odpowiednio sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 5 i 6). Gwiazdki wskazują różnice pomiędzy humanizowaną wersją 2C4, 574, a mysim przeciwciałem monoklonalnym 2C4 lub pomiędzy humanizowaną wersją 574 2C4 a ludzką sekwencją zrębu. Regiony determionujące komplementarność (CDR) znajdują się w nawiasach.

Figury od 8A do 8C przedstawiają wiązanie chimerycznego Fab 2C4 (Fab.v1) i kilku humanizowanych wariantów 2C4 z zewnątrzkomórkową domeną ErbB2 (ECD) określone techniką ELISA w przykładzie 3.

Figura 9 jest wstęgowym diagramem domen VL i VH monoklinalnego przeciwciała 2C4 z oznaczonym białym szkieletem CDR (LI, L21 L3, HI, H2, H3). Przedstawiono również łańcuchy boczne VH oceniane przez mutagenezę podczas humanizowania (patrz przykład 3, tablica 2).

Figura 10 przedstawia wpływ monoklonalnego przeciwciała^® 2C4 lub HERCEPTIN^® na aktywację aktywowanej mitogenami kinazy białkowej (MAPK) za pośrednictwem EGF, TGF-α lub HRG.

Figura 11 jest wykresem słupkowym przedstawiającym wpływ przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2 (samych lub w kombinacjach) na heteroprzeszczepy gruczolakoraka płuc Calu3 (nadekspresja 3+ ErbB2). Uwaga: leczenie zatrzymano 24 dnia.

Figura 12 przedstawia wpływ zrekombinowanego humanizowanego przeciwciała monoklonalnego 2C4 (rhuMAb 2C4) lub HERCEPTIN^® na wzrost komórek MDA-175, co oceniano w oznaczeniu z zastosowaniem błękitu Almar.

Figura 13 przedstawia skuteczność rhuMAb 2C4 wobec heteroprzeszczepów MCF7.

Szczegółowy opis korzystnych rozwiązań

1. Definicje

Receptor ErbB jest receptorem o aktywności kinazy białkowej, który należy do rodziny receptorów ErbB i obejmuje receptory EGFR, ErbB2, ErbB3 i ErbB4 oraz innych przedstawicieli tej rodziny pozostających do zidentyfikowania w przyszłości. Receptor ErbB będzie generalnie zawierać domenę zewnątrzkomórkową, która może wiązać ligand ErbB; lipofilową domenę transbłonową; konserwatywną wewnątrzkomórkową domenę kinazy tyrozynowej oraz karboksykońcową domenę sygnałową, niosącą kilka reszt tyrozynowych, które mogą ulegać fosforylacji. Receptorem ErbB może być natywna

PL 203 326 B1 sekwencja receptora ErbB lub jego wariant sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, receptorem ErbB jest natywna sekwencja ludzkiego receptora ErbB.

Terminy ErbB1, receptor naskórkowego receptora wzrostowego lub EGFR stosuje się w niniejszym opisie wymiennie i odnoszą się one do EGFR ujawnionego, na przykł ad, w Carpenter i in., Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914 (1987), włącznie z jego naturalnie wystę pującymi postaciami zmutowanymi (np. delecyjnym mutantem EGFR, jak w Humphrey i in., PNAS (USA) 87: 4207-4211 (1990)). erbB1 odnosi się do genu kodującego białkowy produkt EGFR.

Wyrażenia ErbB2 i HER2 stosuje się w niniejszym opisie wymiennie i odnoszą się one do ludzkich białek HER2 opisanych, na przykład, w Semba i in., PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) i Yamamoto i in., Nature 319: 230-234 (1986) (numer dostę pu Genbank X03363). Termin erbB2 odnosi się do genu kodującego ErbB2 człowieka, a neu odnosi się do genu kodującego p185^neu szczura. Korzystnym ErbB2 jest natywna sekwencja ludzkiego ErbB2.

ErbB3 i HER3 odnoszą się do polipeptydu receptora ujawnionego, na przykład, w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryk o numerach 5 183 884 i 5 480 968, jak również w Kraus i in., PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989).

Terminy ErbB4 i HER4 odnoszą się w niniejszym opisie do polipeptydu receptora ujawnionego, na przykład, w europejskim zgłoszeniu patentowym numer 599 274; Plowman i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993) i Plowman i in., Nature, 366: 473-475 (1993), włącznie z jego izoformami, np. ujawnionymi w międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 99/19488, opublikowanym 22 kwietnia 1999 r.

Przez ligand ErbB rozumie się polipeptyd, który wiąże się z i/lub aktywuje receptor ErbB. Ligandem ErbB będącym przedmiotem szczególnego zainteresowania w niniejszym opisie jest natywna sekwencja ludzkiego liganda ErbB, takiego jak naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF) (Savage i in.,

J. Biol. Chem. 247: 7612-7621 (1972), transformujący czynnik wzrostowy alfa (TGF-α) (Marquardt i in., Science 223: 1079-1082 (1984); amfiregulina, znana również jako autokrynny czynnik wzrostowy nerwiaka osłonkowego lub keratynocytów (Shoyab i in., Science 243:1074-1076(1989), Kimura i in., Nature 348: 257-260 (1990) oraz Cook i in., Mol. Cell. Biol. 11: 2547-2557 (1991), betacelulina (Shing i in., Science 259: 1604-1607 (1993) i Sasada i in., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 1173 (1993)), wiążący heparynę naskórkowy czynnik wzrostowy (HB-EGF) (Higashiyama i in., Science 251: 936-939 (1991); epiregulina(Toyoda i in., J. Biol. Chem. 270: 7495-7500 (1995) i Komurasaki i in., Oncogene 15: 2841-2848 (1997)), heregulina (patrz poniżej), neuregulina-2 (NUMERG-2) (Carraway i in., Nature 387: 512-516 (1997)), neuregulina-3 (NUMERG-3) (Zhang i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567 (1997)), neuregulina-4 (NUMERG-4) (Harari i in., Oncogene 18: 2681-89 (1999) lub cripto (CR-1) (Kannani in., J. Biol. Chem. 272 (6): 3330-3335 (1997)). Ligandy ErbB, które wiążą EGFR, obejmują EGF, TGF-α, amfiregulinę, betacelulinę, HB-EGF i epiregulinę. Ligandy ErbB, które wiążą ErbB3, obejmują hereguliny. Ligandy ErbB zdolne do wiązania ErbB4 obejmują betacelulinę, epiregulinę, HB-EGF, NUMERG-2, NUMERG-3, NUMERG-4 i hereguliny.

Heregulina (HRG), gdy stosuje się ją w niniejszym opisie, odnosi się do polipeptydowego produktu kodowanego przez gen heregulin, jak ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 641 869 lub Marchionni i in., Nature, 362: 312-318 (1993). Przykłady heregulin obejmują heregulinę α, heregulinę β1, heregulinę β2 i heregulinę β3 (Holmes i in., Science, 256: 1205-1210 (1992) i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 641 869), czynnik różnicowania neu (NDF) (Peles i in., Cell. 69: 205-216 (1992)); aktywność indukującą receptory acetylocholinowe (ARIA) (Falls i in., Cell. 72: 801-815 (1993)); glejowe czynniki wzrostowe (GGF) (Marchionni i in., Nature, 362: 312-318 (1993); czynnik neuronów czuciowych i ruchowych (SMDF) (Ho i in., J. Biol. Chem. 270: 14523-14532 (1995)); heregulinę γ (Schaefer i in., Oncogene 15: 1385-1394 (1997)). Termin obejmuje biologicznie aktywne fragmenty i/lub warianty sekwencji aminokwasowej natywnej sekwencji polipeptydu HRG, takie jak jego fragment domeny EGF-podobnej (np.HRGe1 _177-244 ).

Heterooligomer ErbB według niniejszego wynalazku jest niekowalencyjnie związany z oligomerem obejmującym co najmniej dwa różne receptory ErbB. Takie kompleksy mogą się tworzyć, gdy komórka, w której zachodzi ekspresja dwóch lub więcej receptorów, eksponowana jest na ligand ErbB, i można je izolować przez immunoprecypitację i analizować przez SDS-PAGE, jak opisano na przykład w Sliwkowski i in., J. Biol. Chem., 269 (20): 14661-14665 (1994). Przykłady takich heterooligomerów ErbB obejmują kompleksy EGFR-ErbB2, ErbB2-ErbB3 i ErbB3-ErbB4. Ponadto, heterooligomer ErbB może zawierać dwa lub więcej receptory ErbB2 połączone z innym receptorem ErbB,

PL 203 326 B1 takim jak ErbB3, ErbB4 lub EGFR. Heterooligomer może obejmować inne białka, takie jak podjednostka receptora cytokin (np. gp130).

Przez aktywację receptora ErbB przez ligand rozumie się przekazywanie sygnału (np. tego powodowanego przez wewnątrzkomórkową domenę o aktywności kinazy receptora ErbB, fosforylującą reszty tyrozynowe receptora ErbB lub polipeptydowego substratu), w którym pośredniczy wiązanie liganda ErbB z heterooligomerem ErbB zawierającym będący przedmiotem zainteresowania receptor ErbB. Generalnie, będzie ona obejmować wiązanie liganda ErbB z heterooligomerem ErbB, które aktywuje domenę o aktywności kinazy jednego lub więcej z receptorów ErbB w heterooligomerze i w ten sposób powoduje fosforylację reszt tyrozynowych w jednym lub więcej z receptorów ErbB i/lub fosforylacji reszt tyrozynowych w dodatkowym(ych) substracie polipeptydowym. Aktywację receptora ErbB można określać ilościowo stosując różne oznaczenia fosforylacji tyrozyny.

Polipeptydem onatywnej sekwencji jest polipeptyd, który posiada taką samą sekwencję aminokwasową, jak polipeptyd pochodzenia naturalnego (np. receptor ErbB lub ligand ErbB). Takie polipeptydy o natywnej sekwencji można izolować z ich naturalnego źródła lub można wytwarzać sposobami rekombinacyjnymi lub syntetycznymi. A zatem, polipeptyd o natywnej sekwencji może posiadać sekwencję aminokwasową naturalnie występującego polipeptydu ludzkiego, polipeptydu mysiego lub polipeptydu jakiegokolwiek innego gatunku ssaka.

Termin wariant sekwencji aminokwasowej odnosi się do polipeptydów posiadających sekwencje aminokwasowe, które w pewnym stopniu różnią się od polipeptydu o sekwencji natywnej. Zazwyczaj, warianty sekwencji aminokwasowej posiadać będą co najmniej około 70% homologii do co najmniej jednej domeny wiążącej receptor natywnego liganda ErbB lub co najmniej jednej domeny wiążącej ligand natywnego receptora ErbB, a korzystnie będą one w co najmniej około 80%, korzystniej co najmniej około 90% homologiczne do takich domen wiążących receptor lub ligand. Warianty sekwencji aminokwasowych posiadają podstawienia, delecje i/lub insercje w niektórych pozycjach sekwencji aminokwasowej w stosunku do natywnej sekwencji aminokwasowej.

Homologię definiuje się jako procent reszt w wariancie sekwencji aminokwasowej, które są identyczne po przyporządkowaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli jest to konieczne, z uzyskaniem maksymalnego procentu homologii. Metody i programy komputerowe do przyporządkowywania są dobrze znane w tej dziedzinie. Jednym z takich programów komputerowych jest Align 2, autorstwa Genentech, Inc., który złożono wraz z dokumentacją dla użytkownika w United States Copyright Office, Waszyngton, DC 20559, 10 grudnia 1991 r.

Termin przeciwciało w niniejszym opisie stosuje się w najszerszym znaczeniu i w szczególności obejmuje on nienaruszone przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała multispecyficzne (np. przeciwciała bispecyficzne), utworzone z co najmniej dwóch nienaruszonych przeciwciał, oraz fragmenty przeciwciał, dotąd jak wykazują one pożądaną aktywność biologiczną.

Termin przeciwciało monoklonalne wznaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała tworzące populację są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w nieznacznych ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne, skierowane przeciw pojedynczym miejscom antygenowym. Ponadto, w przeciwieństwie do preparatów przeciwciał poliklonalnych, które obejmują różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne skierowane jest przeciw pojedynczej determinancie na antygenie. Poza ich specyficznością, przeciwciała monoklonalne są korzystne pod tym względem, że można je syntetyzować nie zanieczyszczone innymi przeciwciałami. Określenie monoklonalne wskazuje na charakter przeciwciała otrzymanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał, i nie oznacza ono wymagania wytwarzania przeciwciała jakąkolwiek określoną metodą. Na przykład, przeciwciała monoklonalne przeznaczone do stosowania według niniejszego wynalazku można tworzyć metodą hybrydom, po raz pierwszy opisaną przez Kohlera i in., Nature, 256: 495 (1975), lub można tworzyć metodami rekombinacji DNA (patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 567). Przeciwciała monoklonalne można również izolować z bibliotek prezentowanych przez fagi, stosując techniki opisane na przykład w Clackson i in., Nature, 352: 624-628 (1991) oraz Marks i in., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Przeciwciała monoklonalne w niniejszym opisie, w szczególności, obejmują przeciwciała chimeryczne, w których część łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego jest identyczna z lub homologiczna do odpowiadających sekwencji w przeciwciałach pochodzących od określonego gatunku lub należących do określonej klasy lub podklasy przeciwciał, podczas gdy pozostała część łańcucha(ów) jest idenPL 203 326 B1 tyczna z lub homologiczna do odpowiadających sekwencji w przeciwciałach pochodzących od innego gatunku lub należących do innej klasy lub podklasy przeciwciał, jak również fragmenty takich przeciwciał, dotąd jak wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 567 oraz Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Przeciwciała chimeryczne będące w niniejszym opisie przedmiotem zainteresowania obejmują przeciwciała upodobnione do przeciwciał Naczelnych, zawierające wiążące antygen sekwencje domeny zmiennej pochodzące od Naczelnych innych niż człowiek (np. małp Starego Świata, małp człekokształtnych itp.) i ludzkie sekwencje regionów stałych.

Fragmenty przeciwciał obejmują część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie obejmują jego region wiążący antygen czyli zmienny. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 i Fv; diaciała; przeciwciała liniowe; cząsteczki przeciwciał jednołańcuchowych oraz multispecyficzne przeciwciała tworzone z fragmentu(ów) przeciwciał.

Nienaruszonym przeciwciałem jest przeciwciało, które zawiera wiążący antygen region zmienny, jak również domenę stałą łańcucha lekkiego (CL) i domeny stałe łańcucha ciężkiego, CH1, CH2 i CH3. Domeny stał e mogą być domenami stał ymi o natywnych sekwencjach (ludzkimi domenami stałymi o natywnych sekwencjach) lub ich wariantem sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, nienaruszone przeciwciało posiada jedną lub więcej funkcji efektorowych.

Funkcje efektorowe przeciwciała odnoszą się do tych aktywności biologicznych, które można przypisać regionowi Fc (regionu Fc o natywnej sekwencji lub regionowi Fc o wariancie sekwencji aminokwasowej) przeciwciała. Przykłady funkcji efektorowych przeciwciał obejmują wiązanie C1q, cytotoksyczność zależną od dopełniacza, wiązanie receptora Fc, zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC), fagocytozę, zmniejszanie ilości powierzchniowych receptorów komórkowych (np.receptora komórek B, BCR) itp.

Zależnie od sekwencji aminokwasowej domeny stałej swoich łańcuchów ciężkich, nienaruszone przeciwciała można przypisać do różnych klas. Istnieje pięć głównych klas nienaruszonych przeciwciał: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich można dalej podzielić na podklasy (izotypy), np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Domeny stałe łańcuchów ciężkich, które odpowiadają różnym klasom przeciwciał, nazwano odpowiednio α, δ, ε. γ i μ. Struktury podjednostek i przestrzenne konfiguracje różnych klas immunoglobulin są dobrze znane.

Zależna od przeciwciał cytotoksyczność komórkowa i ADCC odnoszą się do reakcji zachodzącej za pośrednictwem komórek, w której niespecyficzne komórki cytotoksyczne, w których zachodzi ekspresja receptorów Fc (FcR) (na przykład komórki NK, granulocyty obojętnochłonne i makrofagi) rozpoznają przeciwciało związane na komórce docelowej i następnie powodują lizę komórki docelowej. W głównych komórkach zaangażowanych w ADCC, komórkach NK, zachodzi ekspresja tylko FcyIII, podczas gdy w monocytach zachodzi ekspresja FcyRI, FcyII i FcyIII. Ekspresję FcR na komórkach hematopoetycznych podsumowano w tablicy 3 na str. 464 w Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). W celu oszacowania aktywności ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić oznaczenie ADCC in vitro, takie jak to opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 500 362 lub 5 821 337. Użyteczne do takich oznaczeń komórki efektorowe obejmują komórki monojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i komórki NK. Alternatywnie, bądź dodatkowo, aktywność ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania można oceniać in vivo, np. w modelu zwierzęcym, taki jak ujawniony w Clynes i in., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

Ludzkimi komórkami efektorowymi są leukocyty, w których zachodzi ekspresja jednego lub więcej FcR i które pełnią funkcje efektorowe. Korzystnie, w komórkach zachodzi ekspresja co najmniej FyRIII i pełnią one funkcję efektorową ADCC. Przykłady ludzkich leukocytów, które zaangażowane są w ADCC, obejmują monojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), komórki NK, monocyty, cytotoksyczne komórki T i granulocyty obojętno-chłonne, przy czym szczególnie korzystne są PBMC i komórki NK. Komórki efektorowe można izolować z ich naturalnego źródła, np. z krwi lub PBMC, jak opisano w niniejszym opisie.

Terminy receptor Fc lub FcR stosuje się do opisu rceptora, który wiąże region Fc przeciwciała. Korzystnym FcR jest ludzki FcR o sekwencji natywnej. Ponadto, korzystnym FcR jest taki, który wiąże przeciwciało IgG (receptor gamma) i posiada receptory podklas FcyRI, FcyRII i FcyRIII, włącznie z wariantami allelicznymi i postaciami tych receptorów powstającymi w wyniku alternatywnego składania eksonów. Receptory FcyRII obejmują FcyRIIA (receptor aktywujący) i FcyRIIB (receptor hamujący), które posiadają podobne sekwencje aminokwasowe i różnią się głównie swoimi domenami

PL 203 326 B1 cytoplazmatycznymi. Aktywujący receptor FcyRIIA zawiera w swojej domenie cytoplazmatycznej motyw opartej na tyrozynie aktywacji immunoreceptora (ITAM). Hamujący receptor FcyRIIB w swojej domenie cytoplazmatycznej motyw opartego na tyrozynie hamowania immunoreceptora (patrz przegląd w M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Przeglądu FcR dokonano w Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel i in., Immunomethods 4: 25-34 (1994) oraz de Haas i in., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Termin FcR w niniejszym opisie obejmuje inne FcR, włącznie z tymi, które zostaną zidentyfikowane w przyszłości. Termin obejmuje również noworodkowy receptor, FcRn, który jest odpowiedzialny za przenoszenie matczynych IgG do płodu ( (Guyer i in., J. Immunol. 117: 587 (1976) i Kim i in., J. Immunol 24:249 (1994)).

Cytotoksyczność zależna od dopełniacza lub CDC odnosi się do zdolności cząsteczki do lizowania celu w obecności dopełniacza. Drogę aktywacji dopełniacza inicjalizuje wiązanie pierwszego składnika układu dopełniacza (C1q) z cząsteczką (np. przeciwciałem) skompleksowaną z odpowiednim antygenem. W celu ocenienia aktywacji dopełniacza można przeprowadzić oznaczenie CDC, np. w sposób opisany w Gazzano-Santoro i in., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

Natywne przeciwciała są zazwyczaj heterotetramerycznymi glikoproteinami o masach cząsteczkowych około 150 000 daltonów, złożonymi z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki połączony jest z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem disiarczkowym, podczas gdy liczba wiązań disiarczkowych występujących pomiędzy łańcuchami ciężkimi różnych izotypów immunoglobulin jest różna. Każdy łańcuch ciężki i lekki posiada również, w regularnych odstępach, wewnątrzłańcuchowe mostki disiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki posiada na jednym końcu domenę zmienną (VH), po której następują domeny stałe. Każdy łańcuch lekki posiada na jednym końcu domenę zmienną (VL), a na drugim końcu domenę stałą. Domena stała łańcucha lekkiego jest położona równolegle do pierwszej domeny stałej łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego jest położona równolegle do domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Uważa się, że określone reszty aminokwasowe tworzą granicę pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego.

Termin zmienna odnosi się do faktu, że pewne części domeny zmiennej znacząco różnią się sekwencją pomiędzy przeciwciałami i są wykorzystywane w wiązaniu i specyficzności każdego określonego przeciwciała z jego określonym antygenem. Jednakże, zmienność nie jest równo rozłożona w całych domenach zmiennych przeciwciał. Koncentruje się ona w trzech odcinkach, nazywanych regionami hiperzmiennymi, zarówno w domenach zmiennych łańcuchów lekkich, jak i łańcuchów ciężkich. Bardziej konserwatywne części domen zmiennych nazywane są regionami zrębu (FR). Każda z domen zmiennych natywnych łańcuchów ciężkich i lekkich zawiera cztery FR, w większości przyjmujące konfigurację struktury β, połączone przez trzy regiony hiperzmienne, tworzące pętle łączące, a w niektórych przypadkach tworzące część struktury β. Regiony hiperzmienne w każdym łańcuchu są utrzymywane w bliskim sąsiedztwie przez FR i, z regionami hiperzmiennymi drugiego łańcucha, biorą udział w tworzeniu wiążącego antygen miejsca przeciwciał (patrz Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interst, wyd. 5, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Domeny stałe nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu przeciwciała z antygenem, ale posiadają różne funkcjeefektorowe, takiejakudział przeciw ciała w zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC).

Termin region hiperzmienny w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do reszt aminokwasowych przeciwciała, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny generalnie obejmuje reszty aminokwasowe z regionu determinującego komplementarność lub CDR (np. reszty 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interst, wyd. 5, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/lub reszty zhiperzmiennej pętli (np. reszty 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Resztami regionu zrębu lub FR są te reszty domeny zmiennej, które są różne od reszt regionu hiperzmiennego, jak zdefiniowano w niniejszym opisie.

Trawienie przeciwciał papaina daje dwa identyczne fragmenty wiążące antygen, nazwane fragmentami :Fab, z których każdy posiada pojedyncze miejsce wiążące antygen, oraz pozostający fragment Fc, którego nazwa odzwierciedla jego zdolność do łatwego krystalizowania. Traktowanie

PL 203 326 B1 pepsyną daje fragment F(ab')2, który posiada dwa miejsca wiążące antygen i jest nadal zdolny do sieciowania antygenu.

Fv jest minimalnym fragmentem przeciwciała, który zawiera pełne miejsce rozpoznawania antygenu i wiązania antygenu. Region ten składa się z dimeru domeny zmiennej jednego łańcucha ciężkiego i jednego łańcucha lekkiego, połączonych silnym, niekowalencyjnym wiązaniem. Ma on taką konfigurację, że trzy regiony hiperzmienne każdej domeny zmiennej oddziałują dla zdefiniowania miejsca wiążącego antygen na powierzchni dimeru VH-VL. Łącznie, sześć regionów hiperzmiennych nadaje przeciwciału specyficzność wiązania antygenu. Jednakże, nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv, zawierająca tylko trzy hiperzmienne regiony specyficzne wobec antygenu) posiada zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, chociaż z niższym powinowactwem niż cale miejsce wiążące.

Fragment Fab zawiera również domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab dodatkiem kilku reszt na karboksylowym końcu domeny CH1 łańcucha ciężkiego, obejmujących jedną lub więcej cystein z regionu zawiasowego przeciwciała. Fab'-SH jest oznaczeniem w niniejszym opisie dla Fab', w którym reszta(ty) cysteiny domen stałych posiadają co najmniej jedną wolną grupę tiolową. Fragmenty F(ab')2 przeciwciał pierwotnie tworzono jako pary fragmentów Fab', pomiędzy którymi występowały cysteiny zawiasowe. Znane są również inne chemiczne sposoby sprzęgania fragmentów przeciwciał.

Łańcuchy lekkie przeciwciał z jakiegokolwiek gatunku kręgowca można, w oparciu o sekwencje aminokwasowe ich domen stałych, zakwalifikować do jednego z dwóch wyraźnie odrębnych typów, nazwanych kappa (κ) i lambda (λ).

Jednołańcuchowe Fv lub scFv fragmenty przeciwciał zawierają domeny VH i VL przeciwciała, przy czym domeny te występują w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Korzystnie, polipeptyd Fv zawiera ponadto polipeptydowy łącznik pomiędzy domenami VH i VL, który umożliwia tworzenie przez scFv struktury pożądanej do wiązania antygenu. Dla zapoznania się z przeglądem dotyczącym scFv patrz Pliickthun, w: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg i Moore, red., Springer-Verlag, Nowy Jork, str. 269-315 (1994). Skierowane przeciw ErbB2 fragmenty scFv przeciwciał opisano w międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 93/16185, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 571 894 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5587 458.

Termin diaciała odnosi się do małych fragmentów przeciwciał o dwóch miejscach wiążących antygen, które to fragmenty zawierają zmienną domenę łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (VH-VL). Przez zastosowanie łącznika, który jest zbyt krótki, aby umożliwiał parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, wymusza się parowanie z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzenie dwóch miejsc wiążących antygen. Diaciała opisano dokładniej w, na przykład, europejskim opisie patentowym numer 404 097, międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 93/11161 oraz w Hollinger i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Humanizowane postacie przeciwciał gatunków innych niż człowiek (np. gryzoni) są chimerycznymi przeciwciałami, które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z immunoglobuliny gatunku innego niż człowiek. W większej części, przeciwciała humanizowane są immunoglobulinami ludzkimi (przeciwciało-biorca), w których reszty z regionu hiperzmiennego biorcy zastąpiono resztami z regionu hiperzmiennego przeciwciała gatunku innego niż człowiek (przeciwciało-dawca), takiego jak przeciwciała myszy, szczura, królika lub Naczelnego innego niż człowiek, posiadającego pożądaną specyficzność, powinowactwo i zdolność wiązania. W niektórych przypadkach reszty regionu zrębu immunoglobuliny ludzkiej zastępuje się odpowiadającymi resztami gatunku innego niż człowiek. Ponadto, przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty, które nie występują ani w przeciwcielebiorcy, ani w przeciwciele-dawcy. Modyfikacji tych dokonuje się w celu dalszego udoskonalenia wydajności przeciwciała. Generalnie, przeciwciało humanizowane zawierać będzie co najmniej jedną, a zazwyczaj dwie domeny zmienne, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie hiperzmienne pętle odpowiadają tym z immunoglobuliny gatunku innego niż człowiek, a wszystkie lub zasadniczo wszystkie z FR są tymi o sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Humanizowane przeciwciało ewentualnie będzie również zawierać co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj tego immunoglobuliny ludzkiej. Dla zapoznania się z dalszymi szczegółami patrz Jones i in., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann i in., Nature 332: 323-327 (1988) oraz Presta, Curr. Op. Struci. Biol. 2:593-596 (1992).

PL 203 326 B1

Humanizowane przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 obejmująhuMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 i huMAb4D5-8 (HERCEPTIN^®), jak opisano w tablicy 3 opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 821 337, humanizowane przeciwciało 520C9 (międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 93/21319) oraz humanizowane przeciwciała opisane poniżej w niniejszym opisie.

Przeciwciałem wyizolowanym jest przeciwciało, które zidentyfikowano i wydzielono i/lub odzyskano ze składnika jego naturalnego otoczenia. Zanieczyszczającymi składnikami jego naturalnego otoczenia są materiały, które mogłyby zakłócać diagnostyczne lub terapeutyczne stosowanie przeciwciała, i mogą obejmować enzymy, hormony i inne białkowe i niebiałkowe substancje rozpuszczone. W korzystnych rozwiązaniach, przeciwciało będzie oczyszczone (1) do stopnia wyższego niż 95% wagowych przeciwciała, jak określono metodą Lowry'ego, a najkorzystniej wyższego niż 99% wagowych, (2) do stopnia wystarczającego do otrzymania sekwencji co najmniej 15 reszt N-końcowych i wewnę trznych przy zastosowaniu sekwenatora wirowego, lub (3) do homogennoś ci w SDS-PAGE w warunkach redukujących lub nieredukujących, przy zastosowaniu wybarwiania błękitem Coomassie'go lub, korzystnie, srebrem. Wyizolowane przeciwciało obejmuje przeciwciało in situ w zrekombinowanych komórkach, ponieważ co najmniej jeden składnik naturalnego otoczenia przeciwciała nie będzie obecny. Zazwyczaj, jednakże, wyizolowane przeciwciało będzie przygotowane przez co najmniej jeden etap oczyszczania.

Przeciwciałem które wiąże antygen będący przedmiotem zainteresowania, np. antygen ErbB2, jest przeciwciało zdolne do wiązania antygenu z wystarczającym powinowactwem, tak że przeciwciało jest użyteczne jako ukierunkowany czynnik terapeutyczny wobec komórek, w których zachodzi ekspresja antygenu. Jeśli przeciwciałem jest przeciwciało, które wiąże ErbB2, będzie ono zazwyczaj preferencyjnie wiązać ErbB2 w przeciwieństwie do innych receptorów ErbB, i może nim być takie, które znacząco nie reaguje krzyżowo z innymi białkami, takimi jak EGFR, ErbB3 lub ErbB4. W takich rozwiązaniach stopień wiązania z tymi białkami nie będącymi ErbB2 (np. wiązanie z endogennymi receptorami na powierzchni komórek) będzie niższy niż 10%, co określa się przez analizę sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) lub radioimmunoprecypitację (RIA). Niekiedy, przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 nie będzie znacząco reagowało z białkiem neu szczura, np. jak opisano w Schecter i in., Nature 312: 513 (1984) oraz Drebin i in., Nature 312: 545-548 (1984).

Przeciwciałem, które blokuje aktywację przez ligand receptora ErbB, jest przeciwciało, które obniża lub zapobiega takiej aktywacji jak zdefiniowano powyżej w niniejszym opisie, przy czym przeciwciało jest zdolne do blokowania aktywacji receptora ErbB przez ligand znacząco skuteczniej niż monoklonalne przeciwciało 4D5, np. w przybliżeniu tak skuteczne, jak monoklonalne przeciwciała 7F3 lub 2C4 bądź ich fragmenty Fab, a korzystnie w przybliżeniu tak skuteczne, jak monoklonalne przeciwciało 2C4 lub jego fragment Fab. Na przykład, przeciwciałem, które blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand, może być przeciwciało, które jest o około 50-100% bardziej skuteczne niż 4D5 pod względem blokowania tworzenia heterooligomeru ErbB. Blokowanie aktywacji receptora ErbB przez ligand może zachodzić w inny sposób, np. przez zakłócanie wiązania liganda z receptorem ErbB, tworzenia kompleksu ErbB, aktywności kinazy tyrozynowej receptora w kompleksie ErbB i/lub fosforylacji reszt(y) kinazy tyrozynowej w lub przez receptor ErbB. Przykłady przeciwciał, które blokują aktywację receptora ErbB przez ligand, obejmują monoklonalne przeciwciała 2C4 i 7F3 (które blokują aktywację heterooligomerów ErbB2/ErbB3 i ErbB2/ErbB4 przez HRG oraz aktywację heterooligomeru EGFR/ErbB2 przez EGF, TGF -α, amfiregulinę, HB-EGF i/lub epiregulinę) oraz przeciwciała L26, L96 i L288 (Klapper i in., Oncogene 14: 2099-2109 (1977)), które blokują wią zanie EGF i NDF z komórkami T47D, w których zachodzi ekspresja EGFR, ErbB2, ErbB3 i ErbB4.

Przeciwciałem posiadającym właściwość biologiczną określonego przeciwciała, takiego jak monoklonalne przeciwciało oznaczone 2C4, jest przeciwciało, które posiada jedną lub więcej z właściwości biologicznych tego przeciwciała, które odróżniają je od innych przeciwciał wiążących się z tym samym antygenem (np. ErbB2). Na przykł ad, przeciwciał o o wł a ś ciwoś ci biologicznej 2C4 moż e blokować aktywację heterooli-gomeru ErbB obejmującego ErbB2 i ErbB3 lub ErbB4 przez HRG; blokować aktywację receptora ErbB obejmującego EGFR i ErbB2 przez EGF, TGF-α, HB-EGF, epiregulinę i/lub amfiregulinę; blokować zachodzącą za pośrednictwem TGF-α i/lub HRG aktywację MAPK i/lub wiązać się z tym samym epitopem w zewnątrzkomórkowej domenie ErbB2, który jest wiązany przez 2C4 (np. tym samym blokując wiązanie monoklonalnego przeciwciała 2C4 z ErbB2).

O ile nie wskazano inaczej, wyrażenie monoklonalne przeciwciało 2C4 odnosi się do przeciwciała, które posiada reszty wiążące antygen mysiego przeciwciała 2C4 opisane poniżej w przykładach,

PL 203 326 B1 lub pochodzące od niego. Na przykład, monoklonalnym przeciwciałem 2C4 może być mysie przeciwciało monoklonalne 2C4 lub jego wariant, taki jak humanizowane przeciwciało 2C4, posiadające wiążące antygen reszty aminokwasowe mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4. Przykłady humanizowanych przeciwciał 2C4 podano w przykładzie 3 poniżej. O ile nie wskazano inaczej, wyrażenie rhuMAb 2C4 w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do przeciwciała posiadającego sekwencje zmienną lekkiego łańcucha (VL) i zmienną ciężkiego łańcucha (VH) o, odpowiednio, sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 3 i 4, poddane fuzji z sekwencjami regionów stałych ludzkich łańcuchów lekkich i ciężkich IgG1 (allo-typu nie-A), ewentualnie ulegających ekspresji w komórce jajnika chomika chińskiego(CHO).

ile nie wskazano inaczej, termin monoklonalne przeciwciało 4D5 odnosi się do przeciwciała, które posiada reszty wiążące antygen mysiego przeciwciała 4D5 (ATCC CRL 10463) lub pochodzące od niego. Na przykład, monoklonalnym przeciwciałem 4D5 może być mysie przeciwciało monoklonalne 4D5 lub jego wariant, taki jak humanizowane przeciwciało 4D5, posiadające wiążące antygen reszty mysiego przeciwciała monoklonalnego 4D5. Przykładowe humanizowane przeciwciała 4D5 obejmująhuMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 i huMAb4D5-8 (HERCEPTIN^®), jak w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 821 337, przy czym huMAb4D5-8 (HERCEPTIN^®) jest korzystnym humanizowanym przeciwciałem 4D5.

Czynnik hamujący wzrost w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do związku lub kompozycji, które hamują wzrost komórki, zwłaszcza komórki rakowej, w której zachodzi ekspresja ErbB, albo in vitro, albo in vivo. A zatem, czynnikiem hamującym wzrost może być czynnik, który znacząco zmniejsza procent komórek, w których zachodzi ekspresja ErbB, w fazie S. Przykłady czynników hamujących wzrost obejmują czynniki, które blokują postęp cyklu komórkowego (w fazie innej niż faza S), takie jak czynniki, które indukują zatrzymanie w fazie G1 i zatrzymanie w fazie M. Klasyczne czynniki blokujące fazę M obejmują alkaloidy barwinka (winkrystyna i winblastyna), taksany i inhibitory topoizomerazy II, takie jak doksorubicyna, epirubicyna, etopozyd i bleomycyna. Działanie tych czynników, które powodują zatrzymanie w fazie G1, na przykład czynniki alkilujące DNA, takie jak tamoksyfen, prednizon, dakarbazyna, chlormetyna, cisplatyna, metotreksat, 5-fluorouracyl i ara-C, rozciąga się również na zatrzymywanie w fazy S. Dalsze informacje można znaleźć w The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn i Israel, red., rozdział 1 zatytułowany Cell. cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs autorstwa Murakami'ego i in. (WB Saunders, Filadelfia, 1995), zwłaszcza na str. 13.

Przykładami przeciwciał hamujących wzrost są te, które wiążą się z ErbB2 i hamują wzrost komórek rakowych, w których zachodzi nadekspresją ErbB2. Korzystne skierowane przeciw ErbB2 przeciwciała hamujące wzrost hamują wzrost komórek nowotworu sutka SK-BR-3 w hodowli komórkowej o więcej niż 20%, a korzystnie więcej niż 50% (np. od około 50% do około 100%) przy stężeniu przeciwciała wynoszącym około od 0,5 do 30 μg/ml, gdy hamowanie wzrostu określa się po sześciu dniach ekspozycji komórek SK-BR-3 na przeciwciało (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 677 171, wydany 14 października 1997 r.). Oznaczenie hamowania wzrostu komórek SK-BR-3 opisano bardziej szczegółowo w tym opisie patentowym oraz w niniejszym opisie poniżej. Korzystnym przeciwciałem hamującym wzrost jest monoklonalne przeciwciało 4D5, np. humanizowane 4D5.

Przeciwciałem, które indukuje śmierć komórkową, jest przeciwciało, które powoduje, że zdolna do życia komórka staje się niezdolna do życia. Komórką jest ogólnie komórka, w której zachodzi ekspresja receptora ErbB2, szczególnie jeśli w komórce zachodzi nadekspresja receptora ErbB2. Korzystnie, komórką jest komórka rakowa, np. komórka sutka, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, gruczołu ślinowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki lub pęcherza moczowego. In vitro komórką może być komórka SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 lub SK0V3. Śmierć komórkową in vitro można określać w nieobecności dopełniacza i odpornościowych komórek efektorowych w celu rozróżnienia śmierci komórkowej indukowanej przez zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC) lub cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC). A zatem, oznaczenie śmierci komórkowej można przeprowadzić stosując surowicę inaktywowaną termicznie (tj. w nieobecności dopełniacza) i w nieobecności odpornościowych komórek efektorowych. W celu określenia, czy przeciwciało jest zdolne do indukowania śmierci komórkowej, utratę integralności błony komórkowej ocenianą przez pobieranie jodku propidionowego (PI), błękitu tryptanu (patrz Moore i in., Cytotechnology 17: 1-11 (1995)) 7AAD można oceniać w stosunku do komórek nie-traktowanych. Korzystnymi przeciwciałami indukującymi śmierć komórkową są te, które indukują pobieranie PI przez komórki BT474 w oznaczeniu pobierania PI (patrz poniżej).

PL 203 326 B1

Przeciwciałem, które indukuje apoptozę jest przeciwciało, które indukuje programową śmierć komórkową, co określa się przez wiązanie aneksyny V, fragmentację DNA, obkurczanie się, powiększanie się retikulum endoplazmatycznego, fragmentację komórek i/lub tworzenie pęcherzyków błonowych (nazywanych ciałkami apoptycznymi). Komórką jest zazwyczaj komórka, w której zachodzi nadekspresją receptora ErbB2. Korzystnie, komórką jest komórka rakowa, np. komórka sutka, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, gruczołu ślinowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki lub pęcherza moczowego. In vitro komórką może być komórka SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB361 lub SKOV3. Dostępne są różne metody oceniania zachodzących w komórkach zdarzeń związanych z apoptozą. Na przykład, można mierzyć translokację fosfatydyloseryny (PS) przez wiązanie aneksyny; fragmentację DNA można oceniać przez obserwację fragmentów DNA w żelu elektroforetycznym, a kondensację jąder/chromatyny wraz z fragmentacją DNA można oceniać przez wzrost ilości komórek hipodiploidalnych. Korzystnie, przeciwciałem indukującym apoptozę jest przeciwciało, które powoduje indukcję wiązania aneksyny silniejszą o około od 2- do 50-krotnie, korzystnie o około od 5- do 50-krotnie, a najkorzystniej o około od 10- do 50-krotnie w stosunku do komórek nietraktowanych w oznaczeniu wiązania aneksyny z zastosowaniem komórek BT474 (patrz poniżej). Niekiedy, przeciwciałem proapoptycznym będzie przeciwciało, które ponadto blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand ErbB (np. przeciwciało 7F3); tj. przeciwciało posiada taką samą właściwość biologiczną jak monoklonalne przeciwciało 2C4. W innych sytuacjach, przeciwciałem jest przeciwciało, które nie blokuje znacząco aktywacji receptora ErbB przez ligand ErbB (np. 7C2). Przeciwciałem może być przeciwciało podobne do 7C2, które, chociaż indukuje apoptozę, nie indukuje dużego obniżenia procentu komórek w fazie S (np. przeciwciało, które indukuje tylko około 0-10% obniżenie procentu tych komórek w stosunku do kontroli.

Epitop 2C4 jest regionem w zewnątrzkomórkowej domenie ErbB2, z którym wiąże się przeciwciało 2C4. W celu przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z epitopem 2C4, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego, takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopu w celu oszacowania, czy przeciwciało wiąże się z epitopem 2C4 ErbB2 (np. którąkolwiek lub więcej resztami w regionie od około reszty 22 do około reszty 584ErbB2 włącznie; patrz fig. 1A-B).

Epitop 4D5 jest regionem w zewnątrzkomórkowej domenie ErbB2, z którym wiąże się przeciwciało 4D5 (ATCC CRL 10463). Epitop ten występuje blisko domeny transbłonowej ErbB2. W celu przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z epitopem 4D5, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego, takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopu w celu oszacowania, czy przeciwciało wiąże się z epitopem 4D5 ErbB2 (np. którąkolwiek lub więcej resztami w regionie od około reszty 529 do około reszty 625 ErbB2 włącznie; patrz fig. 1A-B).

Epitop 3H4 jest regionem w zewnątrzkomórkowej domenie ErbB2, z którym wiąże się przeciwciało 3H4. Epitop ten obejmuje reszty od około 541 do około 599 włącznie w sekwencji aminokwasowej zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2; patrz fig. 1A-B.

Epitop 72C/7F3 jest regionem na końcu N zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2, z którym wiążą się przeciwciała 7C2 i/lub 7F3 (każde z nich zdeponowano w ATCC, patrz poniżej). W celu przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z epitopem 72C/7F3, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego, takie jak to opisane w Anibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopu w celu oszacowania, czy przeciwciało wiąże się z epitopem 72C/7F3 ErbB2 (np. którąkolwiek lub więcej z reszt w regionie od około reszty 22 do około reszty 53 ErbB2 włącznie; patrz fig. 1A-B).

Traktowanie odnosi się do zarówno traktowania terapeutycznego, jak i profilaktycznego lub pomiarów dla celów zapobiegawczych. Osobnicy potrzebujący traktowania obejmują tych, u których zaburzenie już występuje, jak również tych, u których zapobiega się zaburzeniu. Dlatego też ssak, który będzie poddawany traktowaniu według niniejszego wynalazku może być już zdiagnozowany jako posiadający zaburzenie lub może być predysponowany lub podatny na zaburzenie.

Ssak dla celów traktowania odnosi się do jakiegokolwiek zwierzęcia sklasyfikowanego jako ssak, włącznie z człowiekiem, zwierzętami domowymi i hodowlanymi oraz zwierzętami z zoo, zwierzęPL 203 326 B1 tami wykorzystywanymi w sportach lub ulubieńcami domowymi, takimi jak psy, konie, koty, krowy itp. Korzystnie, ssakiem jest człowiek.

Zaburzeniem jest jakikolwiek stan, który może się poprawić w wyniku traktowania przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2. Obejmuje on przewlekłe lub ostre zaburzenia lub choroby, włącznie z tymi stanami patologicznymi, które predysponują ssaka do zaburzenia będącego przedmiotem zainteresowania. Nieograniczające przykłady zaburzeń, które będą traktowane według niniejszego wynalazku obejmują nowotwory łagodne i złośliwe, białaczki i nowotwory złośliwe tkanki limfatycznej; zaburzenia neuronalne, astrocytarne, podwzgórzowe lub inne gruczołowe, makrofagowe, nabłonkowe, zrębowe i blastoceliczne oraz zaburzenia zapalne, angiogenne i immunologiczne.

Termin ilość skuteczna terapeutycznie odnosi się do ilości leku skutecznej w traktowaniu choroby lub zaburzenia u ssaka. W przypadku raka, skuteczna terapeutycznie ilość leku może zmniejszać liczbę komórek rakowych, zmniejszać wielkość nowotworu, hamować (tj. w pewnym stopniu spowalniać, a korzystnie zatrzymywać) naciekanie komórek rakowych do narządów obwodowych, hamować (tj. w pewnym stopniu spowalniać, a korzystnie zatrzymywać) przerzuty nowotworu, hamować, w pewnym stopniu, wzrost nowotworu i/lub łagodzić w pewnym stopniu jednego lub więcej z objawów związanych z rakiem. W pewnym stopniu lek może zapobiegać wzrostowi i/lub zabijać istniejące komórki nowotworowe, może on być cytostatyczny i/lub cytotoksyczny. W terapii raka, skuteczność można mierzyć na przykład przez ocenianie czasu rozwoju choroby (TTP) i/lub określanie szybkości odpowiedzi (RR).

Terminy rak i rakowy odnoszą się do lub opisują fizjologiczny stan u ssaków, który zazwyczaj charakteryzuje się nieregulowanym wzrostem komórkowym. Przykłady raka obejmują, ale nie ograniczają się do raka, chłoniaka, blastomy, mięsaka i białaczki lub nowotworu złośliwego tkanki limfatycznej. Bardziej szczegółowe przykłady takich raków obejmują raka płaskokomórkowego (np. raka płaskonabłonkowego), raka płuc, włącznie z rakiem drobnokomórkowym, rakiem niedrobnokomórkowym płuc, gruczolakorakiem płuc i rakiem płaskokomórkowym płuc, raka otrzewnej, raka wątrobowokomórkowego, raka żołądka, włącznie z rakiem żołądkowo-jelitowym, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajników, raka wątroby, raka pęcherza moczowego, wątrobiaka, raka sutka, raka okrężnicy, raka odbytnicy, raka okrężnicy i odbytnicy, raka śluzówki macicy lub macicy, raka gruczołów ślinowych, raka nerek, raka gruczołu krokowego, raka sromu, raka tarczycy, raka wątroby, raka odbytu, raka prącia, jak również raka głowy i szyi.

Rakiem, w którym zachodzi ekspresja ErbB jest rak zawierający komórki, które posiadają białko ErbB na swoich powierzchniach komórkowych. Rakiem, w którym zachodzi ekspresja ErbB2 jest rak, który wytwarza dostateczne poziomy ErbB2 na powierzchni swoich komórek, tak że przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 może się z nimi wiązać i wywierać wpływ terapeutyczny w odniesieniu do raka.

Rakiem charakteryzującym się nadmierną aktywacją receptora ErbB jest rak, w którym stopień aktywacji receptora ErbB w komórkach rakowych znacząco przewyższa poziom aktywacji tego receptora w komórkach nie-rakowych tkanki tego samego typu. Taka nadmierna aktywacja może być wynikiem nadekspresji receptora ErbB i/lub wyższych od normalnych poziomów liganda ErbB dostępnego dla aktywacji receptora ErbB na komórkach rakowych. Taka nadmierna aktywacja może powodować i/lub być powodowana przez złośliwy stan komórek rakowych. W niektórych rozwiązaniach, raka poddawać się będzie oznaczeniu diagnostycznemu lub prognostycznemu w celu określenia, czy występuje zwiększanie ilości lub nadekspresją receptora ErbB, której wynikiem jest taka nadmierna aktywacja receptora ErbB. Alternatywnie, lub dodatkowo, raka można poddać oznaczeniu diagnostycznemu lub prognostycznemu w celu określenia, czy w raku występuje zwiększanie ilości i/lub nadekspresja liganda ErbB, które przypisuje się nadmiernej aktywacji receptora. W podgrupie takich raków, nadmierna aktywacja receptora może być wynikiem autokrynnego szlaku stymulacji.

W autokrynnym szlaku stymulacji występuje samostymulacja komórek rakowych wytwarzających zarówno ligand ErbB, jak i odpowiadający mu receptor ErbB. Na przykład, w raku może zachodzić ekspresja bądź nadekspresją liganda EGFR (np. EGF, TGF-α lub HB-EGF). W innym rozwiązaniu, w raku może zachodzić ekspresja lub nadekspresją hereguliny(np. γ-HRG).

Rakiem, w którym zachodzi nadekspresja receptora ErbB, jest rak, który posiada znacząco wyższe poziomy receptora ErbB, takiego jak ErbB2, na powierzchniach swoich komórek w porównaniu z nie-rakową komórką tkanki tego samego typu. Taka nadekspresją może być spowodowana amplifikacją genu lub zwiększoną transkrypcją bądź translacją. Nadekspresję receptora ErbB można określić w oznaczeniu diagnostycznym lub prognostycznym przez stwierdzenie zwiększonych pozio16

PL 203 326 B1 mów białka ErbB obecnego na powierzchni komórek (np. w oznaczeniu immunohistochemicznym, IHC). Alternatywnie, lub dodatkowo, można mierzyć poziomy kodującego ErbB kwasu nukleinowego w komórce, np. technikami hybrydyzacji sondy fluorescencyjnej in situ (FISH; patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 98/45479, opublikowany w październiku 1998 r.), blottingu Southerna lub reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), takimi jak ilościowa PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Nadekspresję receptora ErbB można również badać przez pomiar złuszczonego antygenu (np. zewnątrzkomórkowej domeny ErbB) w płynie biologicznym, takim jak surowica (patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 933 294, wydany 12 czerwca 1990 r., międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 91/05264, opublikowany 18 kwietnia 1991 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 401 638, wydany 28 marca 1995 r., oraz Sias i in., J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). Oprócz powyższych oznaczeń, dla doświadczonych praktyków w tej dziedzinie dostępne są liczne oznaczenia in vivo. Na przykład, komórki w organizmie pacjenta można eksponować na przeciwciało, które ewentualnie wyznakowano wykrywalnym znacznikiem, np. izotopem promieniotwórczym, i można oceniać wiązanie przeciwciała z komórkami u pacjenta, np. przez zewnętrzne badanie promieniotwórczości lub przez analizowanie bioptatu pobranego od pacjenta wcześniej eksponowanego na przeciwciało.

W przeciwieństwie, rakiem, który nie charakteryzuje się nadekspresją receptora ErbB2 jest rak, w którym w oznaczeniu diagnostycznym nie zachodzi ekspresja wyższych niż normalne poziomów receptora ErbB2 w porównaniu z nie-rakowymi komórkami tkanki tego samego typu.

Rakiem, w którym zachodzi nadekspresja liganda ErbB, jest rak, który wytwarza znacząco wyższe poziomy tego liganda w porównaniu z nie-rakową komórką tkanki tego samego typu. Taka nadekspresja może być spowodowana amplifikacją genu lub zwiększoną transkrypcją bądź translacją. Nadekspresję liganda ErbB można określać dla celów diagnostycznych dzięki stwierdzeniu zwiększonych poziomów liganda (lub kodującego go kwasu nukleinowego) u pacjenta, np. w bioptacie nowotworu lub w różnych oznaczeniach diagnostycznych, takich jak IHC, FISH, PCR bądź opisane powyżej oznaczenia in vivo.

Rakiem niezależnym od hormonu jest rak, w którym proliferacja komórek nie jest zależna od obecności hormonu, który wiąże się z receptorem ulegającym ekspresji w komórkach raka. W przypadku takich raków nie stwierdza się regresji klinicznej po zastosowaniu strategii farmakologicznych lub chirurgicznych, które obniżają stężenie hormonu w nowotworze lub w jego pobliżu. Przykłady raków niezależnych od hormonów obejmują niezależnego od androgenu raka gruczołu krokowego, niezależnego od estrogenu raka sutka, raka śluzówki macicy i raka jajników. Takie raki mogą początkowo rozwijać się jako raki zależne od hormonów i przechodzić od stadium wrażliwego na hormony do nowotworu niewrażliwego na hormon po terapii antyhormonalnej.

Termin czynnik cytotoksyczny w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do substancji, która hamuje lub zapobiega funkcji komórek i/lub powoduje zniszczenie komórek.

211 131 125 90 186 188

Termin wzamierzeniuobejmuje izotopy promieniotwórcze (np. At²¹¹, I¹³¹ I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸,

Sm¹⁵³, Bi²¹², p³² i promieniotwórcze izotopy Lu), czynniki chemioterapeutyczne i toksyny, takie jak toksyny niskocząsteczkowe lub toksyny aktywne enzymatycznie pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, włącznie z ich fragmentami i/lub wariantami.

Czynnikiem chemioterapeutycznym jest związek chemiczny użyteczny w leczeniu raka. Przykłady czynników chemioterapeutycznych obejmują czynniki alkilujące, takie jak tiotepa i cyklofosfamid (CYTOXAN™); sulfoniany alkilowe, takie jak busulfan, improsulfan i piposulfan; azyrydyny, takie jak benzodopa, karbokwon, meturedopa i uredopa; etylenoiminy i metylomelaminy, obejmujące altretaminę, trietylenomelaminę, trietylenofosforoamid, trietylenotiofosforoamid i trimetylolomelaminę; pochodne iperytu azotowego, takie jak chlorambucyl, chlornafazyna, cholofosfamid, estramustyna, ifosfamid, mechloroetamina, chlorowodorek tlenku mechloroetaminy, melfalan, nowembichina, fenesteryna, prednimustyna, trofosfamid, iperyt uracylowy; nitrozomoczniki, takie jak karmustyna, chlorozotocyna, fotemustyna, lomustyna, nimustyna, ranimustyna; antybiotyki, takie jak aklacynomycyny, aktynomycyna, autramycyna, azaseryna, bleomycyny, kaktynomycyna, kalicheamicyna, karabicyna, karminomycyna, karzinofilina, chromomycyny, daktynomycyna, daunorubicyna, detorubicyna, 6-diazo-5-okso-L-norleucyna, doksorubicyna, epirubicyna, ezorubicyna, idarubicyna, marcelomycyna, mitomycyny, kwas mykofenolowy, nogalamycyna, oliwomycyny, peplomycyna, potfiromycyna, puromycyna, kwelamycyna, rodorubicyna, streptonigryna, streptozocyna, tubercydyna, ubenimeks, zinostatyna, zorubicyna; antymetabolity, takie jak metotreksat i 5-fluorouracyl (5-FU); analogi kwasu foliowego, takie jak denopteryna, metotreksat, pteropteryna, trimetreksat; analogi purynowe, takie jak fludarabina, 6-merkaptoPL 203 326 B1 puryna, tiamipryna, tioguanina; analogi pirymidynowe, takie jak ancytabina, azacytydyna, 6-azaurydyna, karmofur, cytarabina, dideoksyurydyna, doksyflurydyna, enocytabina, floksourydyna, 5-FU; androgeny, takie jak kalusteron, propioniandromostanolonu, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; przeciwnadnerczowe, takie jak aminoglutetymid, mitotan, trilostan; środek uzupełniający działanie kwasu foliowego, taki jak kwas frolinowy; aceglaton,; glikozyd aldofosfamidowy; kwas aminolewulinowy; amsakryna; bestrabucyl; bizantren; edatraksat; defofamina; demekolcyna; diazykwon; elfornityna; octan eliptynium; etoglucyd; azotan gallium; hydroksymocznik; lentinan; lonidamina; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakryna; pentostatyna; fenarmet; pirarubicyna; kwas podofilinowy; 2-etylohydrazyd; prokarbazyna; PSK^®; razoksan; sizofiran; spirogermanium; kwas tenuazonowy; triazykwon; 2,2',2-trichlorotrietyloamina; uretan; windezyna; dakarbazyna; mannomustyna; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacytozyna; arabinozyd (Ara-C); cyklofosfamid; tiotepa; taksany, np. paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) i docetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francja); chlorambucyl; gemcytabina; 6-tioguanina; merkaptopuryna; metotreksat; analogi platyny, takie jak cisplatyna i karboplatyna; winblastyna; platyna; etopozyd (VP-16); ifosfamid; mitomycyna C; mitoksantron; winkrystyna; winorelbina; nawelbina; nowantron, tenipozyd; daunomycyna; aminopteryna; kseloda; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomerazy RFS 2000; difluorometyloornityna (DMFO); kwas retinowy; esperamicyny; kapecytabina; oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy i pochodne któregokolwiek z powyższych. Definicja ta obejmuje również czynniki antyhormonalne, które działają regulując lub hamując działanie hormonów na nowotwory, takie jak antyestrogeny, obejmujące na przykład tamoksyfen, raloksyfen, aromataza hamująca 4(5)-imidazole, 4-hydroksytamoksyfen, trioksyfen, keoksyfen, LY 117018, onapriston i toremifen (Fareston); oraz antyandrogeny, takie jak flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelina oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy i pochodne któregokolwiek z powyższych.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin lek ukierunkowany na EGFR odnosi się do czynnika terapeutycznego, który wiąże się z EGFR i, ewentualnie, hamuje aktywację EGFR. Przykłady takich czynników obejmują przeciwciała i małe cząsteczki, które wiążą się z EGFR. Przykłady przeciwciał, które wiążą się z EGFR, obejmują przeciwciało monoklonalne 579 (ATCC CRL HB 8506), przeciwciało monoklonalne 455 (ATCC CRL HB8507), przeciwciało monoklonalne 225 (ATCC CRL 8508), przeciwciało monoklonalne 528 (ATCC CRL 8509) (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 4 943 533, Mandelsohn i in.) oraz ich warianty, takie jak chimeryczne 225 (C225) i przekształcone ludzkie 225 (H225) (patrz zgłoszenie międzynarodowe 96/40210, Imclone Systems Inc.), przeciwciała, które wiążą mutanta typu II EGFR (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 212 2 90), humanizowane i chimeryczne przeciwciała, które wiążą EGFR, jak opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 891 996, oraz ludzkie przeciwciała, które wiążą EGFR (zgłoszenie międzynarodowe numer 98/50433, Abgenix). Przeciwciało skierowane przeciw EGFR można skoniugować z czynnikiem cytotoksycznym, tworząc w ten sposób immunokoniugat (patrz np. europejski opis patentowy numer 659 439A2, Merck Patent GmbH). Przykłady małych cząsteczek, które wiążą się z EGFR, obejmują ZD1839 (Astra Zeneca),CP-358774 (OSl/Pfizer) i AG1478.

Czynnik przeciwangiogenny odnosi się do związku, który blokuje, lub w pewnym stopniu zakłóca, rozwój naczyń krwionośnych. Czynnikiem przeciwangiogennym może być, na przykład, mała cząsteczka lub przeciwciało, które wiążą się z czynnikiem wzrostowym lub receptorem czynnika wzrostowego, uczestniczącymi w pobudzaniu angiogenezy. Korzystnym czynnikiem przeciwangiogennym według niniejszego opisu jest przeciwciało, które wiąże się z naczyniowym śródbłonkowym czynnikiem wzrostowym(VEGF).

Termin cytokina jest ogólnym terminem dla białek uwalnianych przez jedną populację komórek, które działają na inną komórkę jako mediatory międzykomórkowe. Przykładami takich cytokin są limfokiny, monokiny i tradycyjne hormony polipeptydowe. Cytokiny obejmują hormon wzrostu, taki jak ludzki hormon wzrostu, N-metionylo- ludzki hormon wzrostu i bydlęcy hormon wzrostu; hormon przytarczyc; tyroksynę; insulinę; proinsulinę; relaksynę; prorelaksynę; hormony glikoproteinowe, takie jak hormon folikulotropowy (FSH), hormon tyrotropowy (TSH) i hormon luteinizujący (LH); wątrobowy czynnik wzrostowy; fibroblastowy czynnik wzrostowy; prolaktynę; laktogen łożyskowy; czynnik martwicy nowotworów α i β; substancja hamująca rozwój przewodów Milera; mysi peptyd związany z gonado-tropiną; inhibinę; aktywinę; naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostowy; integrynę; trombopoetynę (TPO); czynnik wzrostu nerwów, taki jak NGF-β; płytkowy czynnik wzrostowy; transformujące czynniki wzrostowe (TGF), takie jak TGF-α i TGF-β; insulinopodobny czynnik wzrostowy I i II; erytropoetynę (EPO); czynniki indukcyjne kości; interferony, takie jak interferon α, β i γ; czynniki stymulujące two18

PL 203 326 B1 rzenie kolonii (CSF), takie jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) i czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF); interleukiny, takie jak IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; czynnik martwicy nowotworów, taki jak TNF-α lub TNF-β, oraz inne czynniki polipeptydowe, włącznie z LIF i ligandem receptora Kit (KL). W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin cytokina obejmuje białka ze źródeł naturalnych lub z hodowli komórek zrekombinowanych oraz aktywne biologicznie równoważniki cytokin o natywnych sekwencjach.

Termin prolek w znaczeniu stosowanym w tym zgłoszeniu odnosi się do prekursorowej lub pochodnej postaci substancji aktywnej farmaceutycznie, która jest mniej cytotoksyczna dla komórek nowotworowych w porównaniu do leku macierzystego i jest zdolna do ulegania enzymatycznej aktywacji lub przekształcania w bardziej aktywną postać macierzystą. Patrz np., Wilman, Prodrugs in Cancer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, str. 375-382, 615^th Meeting, Belfast (1986) oraz Stella i in., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt i in. (red.), str. 247-267, Humana Press (1985). Proleki według tego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do proleków zawierających grupę fosforanową, proleków zawierających grupę tiofosforanową, proleków zawierających grupę siarczanową, proleków zawierających grupę peptydową, proleków zmodyfikowanych D-aminokwasów, proleków glikozylowanych, proleków zawierających pierścień β-laktamowy, dowolnie podstawionych proleków zawierających grupę fenoksyacetamidową lub dowolnie podstawionych proleków zawierających grupę fenyloacetamidową,

5-fluorocytozyny i innych proleków 5-fluorourydynowych, które mogą być przekształcane w bardziej aktywne cytotoksyczne wolne leki. Przykłady leków cytotoksycznych, które można przeprowadzać w pochodne do postaci proleku do stosowania w tym wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do opisanych powyżej czynników chemioterapeutycznych.

Liposom jest małym pęcherzykiem złożonym z różnego rodzaju lipidów, fosfolipidów i/lub środka powierzchniowo czynnego, użytecznym do dostarczania ssakowi leku (takiego jak skierowane przeciw ErbB2 przeciwciała ujawnione w niniejszym opisie i, ewentualnie, czynnik chemioterapeutyczny). Składniki liposomu są zazwyczaj ułożone dwuwarstwowo, podobnie do ułożenia lipidów w błonach biologicznych.

Termin ulotka informacyjna stosuje się jako odnoszący się do instrukcji zazwyczaj włączanych do komercjalnych opakowań produktów terapeutycznych, które zawierają informacje o wskazaniach, stosowaniu, dawkowaniu, podawaniu, przeciwwskazaniach i/lub ostrzeżeniach dotyczących stosowania takich produktów terapeutycznych.

Czynnikiem chroniącym serce jest związek lub kompozycja, które zapobiegają lub zmniejszają dysfunkcje mięśnia sercowego (tj. kardiomiopatię i/lub zastoinową niewydolność serca) związaną z podawaniem pacjentowi leku, takiego jak antybiotyk antracyklinowy i/lub przeciwciało skierowane przeciw ErbB2. Czynnik chroniący serce może, na przykład, blokować lub zmniejszać zachodzący pod wpływem wolnych rodników wpływ cytotoksyczny i/lub zapobiegać lub zmniejszać uszkodzenia pod wpływem stresu oksydacyjnego. Przykłady czynników chroniących serce objętych niniejszą definicją obejmują chelatujący żelazo czynnik deksrazoksan (ICRF-187 (Seifert i in., The Annals of Pharmacotherapy 28: 1063-1072 (1994)); czynnik obniżający poziom lipidów i/lub przeciwutleniacz, taki jak probukol (Singal i in., J. Mol. Cell. Cardiol. 27: 1055-1063 (1995)); amifostyna (ester aminotiolowy kwasu 2-[(3-aminopropylo)amino]etanotiolodiwodorofosforanowego, nazywany również WR-2721, i jego zdefosforylowana pobierana przez komórkę postać nazwana WR-1065) oraz kwas 5-3-(3-metyloaminopropyloamino)propylofosforotioinowy (WR-151327); patrz Green i in., Cancer Research 54: 738-741 (1994); digoksyna (Bristow, M. R., w: Bristow, M. R., red., Drug-Induced Heart Disease Nowy Jork: Elsevier, 191-215 (1980)); betablokery, takie jak metoprolol (Hjalmarson i in., Drugs 47: Suppl. 4: 31-9 (1994) oraz Shaddy i in., Am. Heart J. 129: 197-9 (1995)); witamina E; kwas askorbinowy (witamina C); akceptory wolnych rodników, takie jak kwas oleanowy, kwas ursolinowy i N-acetylocysteina (NAC); związki pułapkujące spin, takie jak alfa-fenylo-tert-butylonitron (PBN); (Paracchini i in., Anticancer Res. 13: 1607-1612 (1993)); związki selenoorganiczne, takie jak P251 (Elbesen) i podobne.

Wyizolowaną cząsteczką kwasu nukleinowego jest cząsteczka kwasu nukleinowego, którą zidentyfikowano i oddzielono od co najmniej jednej zanieczyszczającej cząsteczki kwasu nukleinowego, z którą jest ona zazwyczaj związana w naturalnym źródle kwasu nukleinowego przeciwciała. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest w innej postaci lub ułożeniu, w jakim występuje w przyrodzie. Dlatego też, wyizolowane cząsteczki kwasów nukleinowych odróżniają się od cząsteczki kwasu nukleinowego jaka istnieje w naturalnych komórkach. Jednakże, wyizolowana cząsteczka kwasu

PL 203 326 B1 nukleinowego obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawartą w komórkach, w których zazwyczaj zachodzi ekspresja przeciwciała, gdzie, na przykład, cząsteczka kwasu nukleinowego znajduje się w położeniu chromosomalnym innym od tego w komórkach naturalnych.

Wyrażenie sekwencje kontrolujące odnosi się do sekwencji DNA koniecznych do ekspresji połączonej w sposób umożliwiający działanie sekwencji kodującej w organizmie określonego gospodarza. Sekwencje kontrolujące, które są odpowiednie dla organizmów prokariotycznych, obejmują na przykład promotor, ewentualnie sekwencję operatora, oraz miejsce wiązania rybosomów. Wiadomo, że komórki eukariotyczne wykorzystują promotory, sygnały poliadenylacji i sekwencje wzmacniające.

Kwas nukleinowy jest połączony w sposób umożliwiający działanie, jeśli umieszczony jest w funkcjonalnej współzależności z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Na przykład, DNA dla presekwencji lub lidera sekrecyjnego jest połączony w sposób umożliwiający działanie z DNA dla polipeptydu, jeśli ulega ekspresji jako prebiałko, które uczestniczy w wydzielaniu polipeptydu, promotor lub sekwencja wzmacniająca są połączone w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą, jeśli zachodzi transkrypcja sekwencji, bądź miejsce wiązania rybosomów jest połączone w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą, jeśli jest położone w sposób ułatwiający translację. Generalnie, połączone w sposób umożliwiające działanie oznacza, że połączone sekwencje DNA są ciągłe oraz, w przypadku lidera sekrecyjnego, są ciągłe i w tej samej fazie odczytu. Jednakże, sekwencje wzmacniające nie muszą być ciągłe. Połączenie uzyskuje się przez ligację w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Jeśli takie miejsca nie występują, zgodnie z konwencjonalną praktyką stosuje się syntetyczne adaptory lub łączniki oligonukleotydowe.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, wyrażenia komórka, linia komórkowa i hodowla komórkowa stosuje się wymiennie i wszystkie takie określenia oznaczają potomstwo. A zatem, słowa transformanty i stransformowane komórki obejmują pierwotną, będącą przedmiotem zainteresowania, komórkę i otrzymane z niej hodowle, bez względu na liczbę pasaży. Jest również zrozumiałe, że całe potomstwo może nie być dokładnie identyczne pod względem zawartego DNA z powodu przemyślanych lub mimowolnych mutacji. Termin obejmuje zmutowane potomstwo, które posiada taką samą funkcję lub aktywność biologiczną, jak poszukiwano w pierwotnie transformowanej komórce. Jeśli zamierzone są inne znaczenia, będą one wynikać z kontekstu.

II. Wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2

Poniżej opisanoprzykładowe techniki wytwarzania przeciwciał stosowanych według niniejszego wynalazku. Antygenem ErbB2 przeznaczonym do stosowania w wytwarzaniu przeciwciał może być np. rozpuszczalną postacią zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2 lub jej części, zawierającą pożądany epitop. Alternatywnie, do tworzenia przeciwciał można stosować komórki, w których zachodzi ekspresja ErbB2 na powierzchniach komórkowych (np. komórki NIH-3T3 stransformowane dla nadekspresji ErbB2 lub linię komórek raka, taką jak komórki SK-BR-3, patrz Stancovsky i in., PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991)). Inne postacie ErbB2 użyteczne do tworzenia przeciwciał będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie.

(i) Przeciwciała poliklonalne

Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych u zwierząt korzystnie pobudza się przez kilkakrotne podskórne (sc) lub dootrzewnowe (ip) iniekcje odpowiedniego antygenu i adiuwanta. Użyteczne może być skoniugowanie odpowiedniego antygenu z białkiem, które jest immunogenne u gatunku przeznaczonego do immunizacji, np. hemocyjaniną skrzypłocza, albuminą surowicy, tyroglobuliną bydlęcą lub sojowym inhibitorem, stosując czynnik bifunkcjonalny lub zmodyfikowany przez utworzenie pochodnej, na przykład ester maleimidobenzoilowy sulfosukcynimidu (koniugacja poprzez reszty cysteiny), N-hydroksysukcynimid (poprzez reszty lizyny), glutaraldehyd, bezwodnik bursztynowy, SOCl2 lub R¹N=C=NUMER, gdzie R i R¹ są różnymi grupami alkilowymi.

Zwierzęta immunizuje się antygenem, immunogennymi koniugatami lub pochodnymi przez połączenie np. 100 μg lub 5 μg białka lub koniugatu (odpowiednio dla królików lub myszy) z 3 objętościami kompletnego adiuwanta Freunda i wstrzykiwanie roztworu śródskórnie w kilku miejscach. Po jednym miesiącu stosuje się u zwierząt dawkę przypominającą od 1/5 do 1/10 początkowej ilości peptydu lub koniugatu w kompletnym adiuwancie Freunda przez podskórne iniekcje w kilku miejscach. Po upływie od 7 do 14 dni od zwierząt pobiera się krew i oznacza miano przeciwciał w surowicy. Zwierzętom podaje się dawki przypominające do osiągnięcia stałego poziomu przeciwciał. Korzystnie, zwierzętom podaje się dawki przypominające koniugatu tego samego antygenu, ale skoniugowanego z innym białkiem i/lub poprzez inny odczynnik sieciujący. Koniugaty można sporządzać w hodowli

PL 203 326 B1 zrekombinowanych komórek jako białka fuzyjne. Do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej można również odpowiednio stosować czynniki agregujące, takie jak ałun.

(ii) Przeciwciała monoklonalne

Przeciwciała monoklonalne otrzymuje się z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. pojedyncze przeciwciała stanowiące populację są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. A zatem, określenie monoklonalne wskazuje, że przeciwciało nie jest mieszaniną różnych przeciwciał.

Na przykład, przeciwciała monoklonalne można otrzymywać stosując metodę hybrydom, po raz pierwszy opisaną przez Kohlera i in., Nature, 256: 495 (1975), lub można je otrzymywać metodami rekombinacji DNA (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 567).

W metodzie hybrydom mysz lub inne odpowiednie, będące gospodarzem zwierzę, takie jak chomik, immunizuje się w opisany powyżej sposób w celu pobudzenia limfocytów, które wytwarzają lub są zdolne do wytwarzania przeciwciał, które będą specyficznie wiązać się z białkiem zastosowanym do immunizacji. Alternatywnie, limfocyty można immunizować in vitro. Następnie limfocyty poddaje się fuzji z komórkami szpiczaka, stosując odpowiedni czynnik indukujący fuzję, taki jak glikol polietylenowy, z utworzeniem komórki hybrydomy (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Tak przygotowane komórki hybrydom wysiewa się i hoduje w odpowiednim podłożu hodowlanym, które korzystnie zawiera jedną lub więcej substancji, które hamują wzrost lub przeżywanie macierzystych komórek szpiczaka, które nie uległy fuzji. Na przykład, jeśli macierzyste komórki szpiczaka pozbawione są enzymu fosforybozylotransferazy guanino-hipoksantynowej (HGPRT lub HPRT), podłoże hodowlane hybrydom zazwyczaj zawierać będzie hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę (podłoże HAT), które to substancje zapobiegają wzrostowi komórek pozbawionych HGPPRT.

Korzystnymi komórkami szpiczaka są te, które wydajnie ulegają fuzji, podtrzymują stabilne wytarzanie przeciwciała na wysokim poziomie przez wyselekcjonowane komórki wytwarzające przeciwciała i są wrażliwe na podłoże, takie jak podłoże HAT. Wśród nich korzystnymi liniami komórek szpiczaka są linie komórek szpiczaka mysiego, takie jak te pochodzące z mysich nowotworów MOPC-21 i MPC-11, dostępne w Salk Institute Cell. Distribution Center, Kalifornia, USA, oraz komórki SP-2 lub X63-Ag8-653, dostępne w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Opisano również linie komórek szpiczaka ludzkiego i heteroszpiczaka mysio-ludzkiego do wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Kozbor, J.Immunol., 133: 3001 (1984) i Brodeur i in., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, 1987)).

W podłożu hodowlanym, w którym hodowano komórki hybrydom, oznacza się wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw antygenowi. Korzystnie, specyficzność wiązania wytwarzanych przez komórki hybrydom przeciwciał monoklonalnych określa się przez immunoprecypitację lub przez oznaczenie wiązania in vitro, takie jak oznaczenie radioimmunologiczne (RIA) lub enzymatyczne oznaczenie immunosorpcyjne (ELISA).

Powinowactwo wiązania przeciwciała monoklonalnego można określić na przykład przez analizę Scatcharda, zgodnie z Munson i in., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Po zidentyfikowaniu komórek hybrydom, które wytwarzają przeciwciała o pożądanej specyficzności, powinowactwie i/lub aktywności, klony można subklonować zgodnie z procedurą kolejnych rozcieńczeń i hodować standardowymi metodami (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986)). Podłoża hodowlane odpowiednie do tego celu obejmują, na przykład, podłoże D-DMEM lub RPMI-1640. Ponadto, komórki hybrydom można hodować in vivo jako nowotwory wysiękowe w zwierzętach.

Przeciwciała monoklonalne wydzielane przez subklony odpowiednio wyodrębnia się z podłoża hodowlanego, płynu wysiękowego lub surowicy zgodnie z konwencjonalnymi procedurami oczyszczania przeciwciał, takimi jak na przykład, stosowanie białka A-Sepharose, chromatografia na hydroksyapatycie, elektroforeza żelowa, dializa i chromatografia powinowactwa.

DNA kodujące przeciwciała monoklonalne łatwo izoluje się i sekwencjonuje stosując konwencjonalne procedury (np. przez zastosowanie sond oligonukleotydowych, które są zdolne do specyficznego wiązania z genami kodującymi łańcuchy ciężki i lekki przeciwciał mysich). Jako korzystne źródło takiego DNA służą komórki hybrydom. Po wyizolowaniu, DNA można umieszczać w wektorach ekspresyjnych, którymi następnie transfekuje się komórki gospodarza, takie jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórki szpiczaka, które inaczej nie wytwarzają białka przeciwciał, w celu uzyskania syntezy przeciwciał monoklonalnych w zrekombiPL 203 326 B1 nowanych komórkach gospodarza. Artykuły przeglądowe dotyczące rekombinacyjnej ekspresji DNA kodującego przeciwciało w bakteriach obejmują Skerra i in., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) oraz Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151-188 (1992) .

W dalszym rozwiązaniu, przeciwciała monoklonalne lub fragmenty przeciwciał można izolować z fagowych bibliotek przeciwciał, utworzonych z zastosowaniem technik opisanych w McCafferty i in., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson i in., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks i in., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) opisują odpowiednio izolowanie przeciwciał mysich i ludzkich z zastosowaniem bibliotek fagowych. W późniejszych publikacjach opisano wytwarzanie ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (zakres nM) przez przetasowywanie łańcuchów (Marks i in., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)), jak również kombinatoryczne infekowanie i rekombinację in vivo jako strategię konstruowania bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse i in., Nuc. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993)). A zatem, techniki te stanowią dobre alternatywy tradycyjnych technik przeciwciał monoklonalnych hybrydom do izolowania przeciwciał monoklonalnych.

DNA można również modyfikować, na przykład przez podstawienie sekwencji kodujących domeny stałe łańcuchów ciężkiego i lekkiego w miejsce homologicznych sekwencji mysich (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 567 oraz Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)) lub przez kowalencyjne połączenie z sekwencją kodującą immunoglobulinę całej lub części sekwencji kodującej polipeptyd nie będący immunoglobuliną.

Zazwyczaj takie polipeptydy nie będące immunoglobulinami podstawia się za stałe domeny przeciwciała, bądź podstawia się je za domeny zmienne jednego miejsca wiążącego antygen, tworząc chimeryczne przeciwciało biwalentne, zawierające jedno miejsce wiążące antygen wykazujące specyficzność wobec antygenu i drugie miejsce wiążące antygen wykazujące specyficzność wobec innego antygenu.

(iii) Przeciwciała humanizowane

Metody humanizowania przeciwciał gatunków innych niż człowiek opisano w tej dziedzinie. Korzystnie, humanizowane przeciwciało posiada jedną lub więcej reszt aminokwasowych wprowadzonych do niego ze źródła innego niż człowiek. Te reszty aminokwasowe nie pochodzące od człowieka często określa się jako reszty importowane, które zazwyczaj uzyskuje się z importowej domeny zmiennej. Humanizację można zasadniczo prowadzić zgodnie z metodą Wintera i współpracowników (Jones i in., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann i in., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen i in., Science, 239: 1534-1536 (1988)), przez podstawianie sekwencjami regionów hiperzmiennych odpowiadających sekwencji przeciwciała ludzkiego. Zgodnie z tym, takie humanizowane przeciwciała są przeciwciałami chimerycznymi (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 567), w których zasadniczo mniej niż nienaruszoną ludzką domenę zmienną podstawiono odpowiadającą sekwencją z gatunku innego niż człowiek. W praktyce, przeciwciałami humanizowanymi są zazwyczaj ludzkie przeciwciała, w których niektóre reszty regionu hiperzmiennego i ewentualnie niektóre reszty FR podstawiono resztami z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni.

Wybór ludzkich domen zmiennych, zarówno łańcucha lekkiego, jak i ciężkiego, przeznaczonych do stosowania w przygotowywaniu przeciwciał humanizowanych, jest bardzo ważny dla obniżania antygenowości. Zgodnie z tak zwaną metodą najlepszego dopasowania, sekwencję domeny zmiennej przeciwciała gryzonia stosuje się do przeszukiwania całej biblioteki znanych ludzkich sekwencji domen zmiennych. Ludzką sekwencję, która jest najbardziej podobna do tej gryzonia, akceptuje się następnie jako ludzki region zrębu (FR) przeciwciała humanizowanego (Sims i in., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia i in., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). W innych metodach wykorzystuje się określony region zrębu pochodzący z sekwencji konsensu wszystkich ludzkich przeciwciał z określonej podgrupy łańcuchów lekkich lub ciężkich. Ten sam zrąb można stosować dla kilku różnych przeciwciał humanizowanych (Carter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta i in., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Ważne jest ponadto, aby przeciwciała poddawane humanizacji zachowywały wysokie powinowactwo wobec antygenu i inne korzystne właściwości biologiczne. Dla osiągnięcia tego celu, według korzystnego sposobu, przeciwciała humanizowane przygotowuje się dokonując analizy sekwencji macierzystych i różnych teoretycznych produktów humanizowanych z zastosowaniem przestrzennych modeli sekwencji macierzystej i humanizowanych. Przestrzenne modele immunoglobulin są powsze-chnie dostępne i znane dla specjalistów w tej dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe, które ilustrują i prezentują prawdopodobne przestrzenne struktury konformacyjne wybranych potencjalnych sekwencji immunoglobulin. Analiza tych struktur umożliwia analizę prawdopodobnej

PL 203 326 B1 roli reszt w działaniu potencjalnej sekwencji immunoglobuliny, tj. analizę reszt, które wpływają na zdolność potencjalnej immunoglobuliny do wiązania jej antygenu. W ten sposób można wybrać reszty FR oraz połączyć z sekwencjami biorcy i importowanymi, tak że uzyskuje się cechy charakterystyczne pożądanego przeciwciała, takie jak zwiększone powinowactwo do antygenu(ów) docelowego(wych). Generalnie, reszty regionu hiperzmiennego bezpośrednio i w największym stopniu uczestniczą we wpływaniu na wiązanie antygenu.

W przykładzie 3 poniżej opisano wytwarzanie przykładowych humanizowanych przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2, które wiążą ErbB2 i blokują aktywację receptora ErbB przez ligand. Humanizowane przeciwciała będące przedmiotem szczególnego zainteresowania w niniejszym opisie blokują zachodzącą za pośrednictwem EGF, TGF-α i/lub HRG aktywację MAPK zasadniczo równie skutecznie, jak mysie przeciwciało monoklonalne 2C4 (lub jego fragment Fab) i/lub wiążą ErbB2 zasadniczo równie skutecznie, jak mysie przeciwciało monoklonalne 2C4 (lub jego fragment Fab). Humanizowane przeciwciało według niniejszego wynalazku może, na przykład, zawierać reszty innego niż ludzki regionu hiperzmiennego wprowadzone do ludzkiej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i może ponadto posiadać podstawienie w regionie zrębu (FR) w pozycji wybranej z grupy składającej się z 69H, 71H i 73H, stosując system numeracji domeny zmiennej podany w Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest., wyd. 5, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). W jednym rozwiązaniu, humanizowane przeciwciało zawiera podstawienia w FR w dwóch lub wszystkich spośród pozycji 69H, 71H i 73H.

Przykładowe przeciwciało humanizowane będące przedmiotem zainteresowania w niniejszym opisie zawiera reszty determinujące komplementarność domeny zmiennej łańcucha ciężkiego GFTFTDYTMX, gdzie X korzystnie jest D lub S (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8) i/lub NLGPSFYFDY (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9), ewentualnie zawierające modyfikacje aminokwasowe tych reszt CDR, np. jeśli modyfikacje zasadniczo utrzymują lub poprawiają powinowactwo przeciwciała. Na przykład, będący przedmiotem zainteresowania wariant przeciwciała może posiadać od około jednego do około siedmiu lub około pięciu podstawień aminokwasowych w powyższych sekwencjach CDR łańcuchów ciężkich. Takie warianty przeciwciał można przygotowywać dzięki dojrzewaniu powinowactwa, np. w sposób opisany poniżej. Najbardziej korzystne przeciwciało monoklonalne zawiera sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4.

Przeciwciało humanizowane może zawierać reszty determinujące komplementarność domeny zmiennej łańcucha lekkiego KASQDVSIGVA (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10); SASYX¹X²X³, gdzie X¹ korzystnie jest R lub L, X² korzystnie jest Y lub E, a X³ korzystnie jest T lub S (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11) i/lub QQYYIYPYT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12), poza tymi resztami CDR domeny zmiennej łańcucha ciężkiego, które podano w poprzednim akapicie. Takie przeciwciała humanizowane ewentualnie zawierają modyfikacje aminokwasowe powyższych reszt CDR, np. jeśli modyfikacje zasadniczo utrzymują lub poprawiają powinowactwo przeciwciała. Na przykład, będący przedmiotem zainteresowania wariant przeciwciała może posiadać od około jednego do około siedmiu lub około pięciu podstawień aminokwasowych w powyższych sekwencjach CDR łańcuchów lekkich. Takie warianty przeciwciał można przygotowywać dzięki dojrzewaniu powinowactwa, np. w sposób opisany poniżej. Najbardziej korzystne przeciwciało monoklonalne zawiera sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3.

Niniejsze zgłoszenie rozważa również otrzymane dzięki dojrzewaniu powinowactwa przeciwciała, które wiążą ErbB2 i blokują aktywację receptora ErbB przez ligand. Przeciwciałem macierzystym może być przeciwciało ludzkie lub przeciwciało humanizowane, np. przeciwciało zawierające sekwencje zmienne łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego odpowiednio przedstawione w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3 i 4 (tj. wariant 574). Otrzymane dzięki dojrzewaniu powinowactwa przeciwciało korzystnie wiąże się z receptorem ErbB2 z powinowactwem wyższym od tego mysiego 2C4 lub wariantu 574 (np. powinowactwem poprawionym od około dwukrotnie lub około czterokrotnie do około stukrotnie lub około tysiąckrotnie, np. co ocenia się stosując ELISA z wykorzystaniem domeny zewnątrzkomórkowej ErbB2 (ECD). Przykładowe reszty CDR domeny zmiennej łańcucha ciężkiego do podstawiania obejmują H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 lub kombinacje dwóch lub więcej (np. od dwóch do trzech, czterech, pięciu lub do około dziesięciu z tych reszt).

Rozważa się różne postacie przeciwciała humanizowanego lub przeciwciała otrzymanego dzięki dojrzewaniu powinowactwa. Na przykład, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem otrzyPL 203 326 B1 manym dzięki dojrzewaniu powinowactwa może być fragment przeciwciała, taki jak Fab, który ewentualnie skoniugowano z jednym lub więcej czynnikami cytotoksycznymi w celu utworzenia immunokoniugatu. Alternatywnie, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem otrzymanym dzięki dojrzewaniu powinowactwa może być nienaruszone przeciwciało, takie jak nienaruszone przeciwciało IgG1.

(iv) Przeciwciała ludzkie

Jako alternatywę dla humanizacji, można tworzyć przeciwciała ludzkie. Na przykład, obecnie jest możliwe tworzenie zwierząt transgenicznych (np. myszy), które są zdolne, po immunizacji, do wytwarzania pełnego repertuaru przeciwciał ludzkich, przy braku wytwarzania immunoglobulin endogennych. Na przykład, opisano, że wynikiem homozygotycznej delecji genu regionu łączącego łańcucha ciężkiego (JH) przeciwciała u chimerycznych myszy ze zmutowaną linią płciową jest całkowite zahamowanie wytwarzania przeciwciał endogennych. Wynikiem przeniesienia ludzkiego układu genów immunoglobulin linii płciowej do takich myszy o zmutowanej linii płciowej będzie wytwarzanie przeciwciał ludzkich po stymulacji antygenem. Patrz np. Jakobovits i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits i in., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann i in., Year in Immuno., 7: 33 (1993) oraz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 591 669, 5 589 369 i 5 545 807.

Alternatywnie, do tworzenia ludzkich przeciwciał lub fragmentów przeciwciał z zestawu genów domeny zmiennej (V) immunoglobulin od nieimmunizowanych dawców można stosować technikę prezentacji przez fagi (McCafferty i in., Nature 348: 552-553 (1990)). Zgodnie z tą techniką, geny domen V przeciwciał klonuje się w jednej ramce odczytu z genem albo głównego, albo drugorzędnego białka otoczki bakteriofaga włókienkowatego, takiego jak M13 lub fd, i prezentuje jako funkcjonalne fragmenty przeciwciał na powierzchni cząstki fagowej. Ponieważ włókienkowata cząstka zawiera jednoniciową kopię DNA genomu faga, wynikiem selekcji opartej na funkcjonalnych właściwościach przeciwciała będzie również selekcja genu kodującego przeciwciało wykazujące te właściwości. A zatem, fag naśladuje pewne właściwości komórki B. Prezentację przez fagi można prowadzić w różnych układach: dla zapoznania się z nimi patrz np. Johnson, Kevin S. i Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Do prezentacji przez fagi można stosować kilka źródeł odcinków genów V. Clackson i in., Nature, 352: 624-628 (1991) wyizolowali różne przeciwciała skierowane przeciw oksazolonowi z małej losowej kombinatorycznej biblioteki genów V otrzymanych ze śledziony immunizowanych myszy. Można skonstruować zestaw genów V od nieimmunizowanych dawców ludzkich i przeciwciała skierowane wobec szeregu rozmaitych antygenów (włącznie z autoantygenami) można wyizolować zasadniczo zgodnie z technikami opisanymi w Marks i in., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) lub Griffith i in., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Patrz także opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 565 332 i 5 573 905.

Jak dyskutowano powyżej, przeciwciała ludzkie mogą być również wytwarzane przez aktywowane in vitro komórki B (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 567610 i 5 229 275).

Ludzkie przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 772 997, wydanym 30 czerwca 1998 r., oraz międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer 97/00271, opublikowanym 3 stycznia 1997 r.

(v) Fragmenty przeciwciał

Opracowano różne techniki tworzenia fragmentów przeciwciał. Tradycyjnie fragmenty te otrzymywano przez proteolityczne trawienie nienaruszonych przeciwciał (patrz np. Morimoto i in., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) oraz Brennan i in., Science, 229: 81 (1985)). Jednakże, obecnie fragmenty te mogą być bezpośrednio wytwarzane przez zrekombinowane komórki gospodarza. Na przykład, fragmenty przeciwciał można izolować z dyskutowanych powyżej fagowych bibliotek przeciwciał. Alternatywnie, fragmenty Fab'-SH można bezpośrednio odzyskiwać z E. coli i chemicznie sprzęgać z utworzeniem fragmentów F(ab')2 (Carter i in., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Zgodnie z innym podejściem, fragmenty F(ab)2 można izolować bezpośrednio z hodowli zrekombinowanych komórek gospodarza. Dla osób pracujących w tej dziedzinie oczywiste będą inne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał. W innych rozwiązaniach, przeciwciałem z wyboru jest jednołańcuchowy fragment Fv (scFv). Patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 93/16185 i opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 571 894 i 5 587 458. Fragmentem przeciwciała może być również przeciwciało liniowe, na przykład jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 641 870. Takie fragmenty liniowych przeciwciał mogą być monospecyficzne lub bispecyficzne.

PL 203 326 B1 (vi) Przeciwciała bispecyficzne

Przeciwciałami bispecyficznymi są przeciwciała, które posiadają specyficzności wiązania wobec co najmniej dwóch różnych epitopów. Przykładowe przeciwciała bispecyficzne mogą wiązać się z dwoma różnymi epitopami białka ErbB2. Inne takie przeciwciała mogą łączyć miejsce wiązania ErbB2 z miejscem(ami) wiązania EGFR, ErbB3 i/lub ErbB4. Alternatywnie, ramię skierowane przeciw ErbB2 może być połączone z ramieniem, które wiąże się z pobudzającą cząsteczką na leukocycie, taką jak cząsteczka receptora komórek T (np. CD2 lub CD3) lub receptorami IgG (FcyR), takimi jak FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) i FcyRIII (CD16), tak aby skoncentrować mechanizmy obrony komórkowej na komórkach, w których zachodzi ekspresja ErbB2. Przeciwciała bispecyficzne można również stosować do dostarczania czynników cytotoksycznych do komórek, w których zachodzi ekspresja ErbB2. Przeciwciała te posiadają ramię wiążąceErbB2 oraz ramię, które wiąże czynnik cytotoksyczny (np. saporynę, antyinterferon-a, alkaloid barwinka, łańcuch A rycyny, metotreksat lub hapten z izotopem promieniotwórczym. Przeciwciała bispecyficzne można przygotowywać jako przeciwciała o pełnej długości lub fragmenty przeciwciał (np. bispecyficzne przeciwciała F(ab')2).

W międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 96/16673 opisano bispecyficzne przeciwciało skierowane przeciw ErbB2/FcYRIII, a opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 837 234 ujawnia bispecyficzne przeciwciało skierowane przeciw ErbB2/FcYRI. Bispecyficzne przeciwciało skierowane przeciw ErbB2/Fca przedstawiono w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer 98/02463. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 821 337 opisuje bispecyficzne przeciwciało skierowane przeciw ErbB2/CD3.

Sposoby przygotowywania przeciwciał bispecyficznych są znane w nauce. Tradycyjne wytwarzanie bispecyficznych przeciwciał o pełnej długości opiera się na koekspresji dwóch par łańcuch ciężki/łańcuch lekki immunoglobuliny, gdzie oba łańcuchy posiadają różne specyficzności (Millstein i in., Nature, 305: 537-539 (1983)). Z powodu losowego doboru łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin, te hybrydomy (kwadromy) wytwarzają potencjalną mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których tylko jedna posiada właściwą bispecyficzną strukturę. Oczyszczanie właściwej cząsteczki, którego zazwyczaj dokonuje się dzięki etapom chromatografii powinowactwa, jest raczej niewygodne, a wydajności produktu są niskie. Podobne procedury ujawniono w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer 93/08829 i w Traunecker i in., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Według innego podejścia, domeny zmienne przeciwciał o pożądanych specyficznościach (miejscach wiązania przeciwciało-antygen) poddaje się fuzji z sekwencjami domen stałych immunoglobulin. Fuzję korzystnie prowadzi się z domeną stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, zawierającą co najmniej część regionów zawiasowego, CH2 i CH3. Korzystne jest, aby pierwszy region stały łańcucha ciężkiego (CHI) zawierający miejsce konieczne do wiązania łańcucha lekkiego, był obecny co najmniej jednej z fuzji. DNA kodujące fuzje łańcuchów ciężkich immunoglobulin i, jeśli jest to pożądane, łańcuchów lekkich, wstawia się do oddzielnych wektorów i kotransfekuje odpowiedni organizm gospodarza. Zapewnia to dużą elastyczność pod względem doprowadzania wzajemnych proporcji trzech łańcuchów polipeptydowych w rozwiązaniach, w których nierówne stosunki trzech łańcuchów polipeptydowych stosowanych w konstruowaniu zapewniają optymalną wydajność. Możliwe jest jednak wstawienie sekwencji kodujących dwa lub trzy łańcuchy polipeptydowe do jednego wektora ekspresyjnego, jeśli wynikiem ekspresji co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych stosunkach jest wysoka wydajność lub jeśli stosunki nie mają większego znaczenia.

W korzystnym rozwiązaniu tego podejścia, przeciwciała bispecyficzne składają się z hybrydowego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny o pierwszej specyficzności wiązania w jednym ramieniu i pary hybrydowy łańcuch ciężki-łańcuch lekki immunoglobuliny (zapewniającej drugą specyficzność wiązania) w drugim ramieniu. Stwierdzono, że ta asymetryczna struktura ułatwia oddzielanie pożądanego związku bispecyficznego od niepożądanych kombinacji łańcuchów immunoglobulin, ponieważ obecność lekkiego łańcucha immunoglobuliny tylko w jednej połowie bispecyficznej cząsteczki zapewnia łatwy sposób oddzielania. Podejście to ujawniono w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer 94/04690. Dla dalszych szczegółów tworzenia przeciwciał bispecyficznych patrz, na przykład, Suresh i in., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Według innego podejścia, opisanego w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 731 168, region kontaktu pary cząsteczek przeciwciał można konstruować zapewniając maksymalizację procentu heterodimerów, które odzyskuje się z hodowli zrekombinowanych komórek. Korzystny region kontaktu zawiera co najmniej część domeny CH3 domeny stałej przeciwciała. W sposobie tym łańcuchy boczne jednego lub więcej małych aminokwasów z regionu kontaktu pierwPL 203 326 B1 szej cząsteczki przeciwciała zastępuje się większymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyny lub tryptofanu). W regionie kontaktu drugiej cząsteczki przeciwciała tworzy się odpowiadające wgłębienia o identycznej lub podobnej wielkości przez zastąpienie łańcuchów bocznych dużych aminokwasów mniejszymi (np. alaniny lub treoniny). Zapewnia to mechanizm zwiększania wydajności heterodimeru w stosunku do niepożądanych produktów końcowych, takich jak homodimery.

Przeciwciała bispecyficzne obejmują przeciwciała usieciowane, czyli heterokoniugaty. Na przykład, jedno z przeciwciał heterokoniugatu można sprzęgać z awidyną, a drugie z biotyną. Takie przeciwciała proponowano na przykład do kierowania komórek układu odpornościowego do niepożądanych komórek (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 676 980) i do leczenia infekcji HIV (światowe opisy patentowe o numerach 91/00360 i 92/200373 oraz europejski opis patentowy numer 03089). Przeciwciała będące heterokoniugatami można przygotować stosując jakąkolwiek odpowiednią metodę sieciowania. Odpowiednie czynniki sieciujące są dobrze znane w nauce i zostały ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 676 980,wraz z licznymi technikami sieciowania.

Techniki tworzenia przeciwciał bispecyficznych z fragmentów przeciwciał również opisano w literaturze. Na przykład, przeciwciała bispecyficzne można przygotowywać stosując wiązanie chemiczne. Brennan i in., Science, 229: 81 (1985) opisują procedurę, w której nienaruszone przeciwciała rozszczepia się proteolitycznie z utworzeniem fragmentów F(ab')2. Fragmenty te redukuje się w obecności czynnika kompleksującego ditiole, arseninu sodowego, w celu stabilizacji sąsiednich ditioli i zapobiegania tworzenia międzycząsteczkowych wiązań disiarczkowych. Utworzone fragmenty Fab' przekształca się w pochodne tionitrobenzoesanu (TNB). Jedną z pochodnych Fab'-TNB następnie ponownie przekształca się w Fab'-tiol przez redukcję merkaptoetyloaminą i miesza z równomolową ilością drugiej pochodnej Fab'-TNB z utworzeniem przeciwciała bispecyficznego. Utworzone przeciwciała bispecyficzne można stosować jako czynniki do selektywnejimmobilizacji enzymów.

Ostatnie postępy ułatwiły bezpośrednie odzyskiwanie fragmentów Fab'-SH z E. coli, które można chemicznie sprzęgać z utworzeniem przeciwciał bispecyficznych. Shalaby i in., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) opisują wytwarzanie w pełni humanizowanej cząsteczki F(ab') przeciwciała bispecyficznego. Każdy z fragmentów Fab' jest oddzielnie wydzielany z E. coli i poddawany bezpośredniemu sprzęganiu chemicznemu in vitro z utworzeniem bispecyficznego przeciwciała. Tak utworzone przeciwciało bispecyficzne było zdolne do wiązania z komórkami, w których zachodziła nadekspresją receptora ErbB2 i normalnymi ludzkimi komórkami T, jak również wyzwalania litycznej aktywności ludzkich limfocytów cytotoksycznych wobec stanowiących cel ludzkich nowotworów sutka.

Opisano również różne techniki przygotowywania i izolowania fragmentów przeciwciał bispecyficznych bezpośrednio z hodowli zrekombinowanych komórek. Na przykład, przeciwciała bispecyficzne przeciwciała tworzono stosując leucynowe zamki błyskawiczne. Kostelny i in., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Peptydy leucynowego zamka błyskawicznego z białek Fos i Jun połączono z częściami Fab' dwóch różnych przeciwciał przez fuzje genów. Homodimery przeciwciał redukowano w regionie zawiasowym z utworzeniem monomerów, a następnie ponownie utleniano tworząc heterodimery przeciwciał. Metodę tę można również wykorzystywać do tworzenia homodimerów przeciwciał. Technika diaciał, opisana w Hollinger i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), zapewniła alternatywny mechanizm przygotowywania fragmentów przeciwciał bispecyficznych. Fragmenty zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) poprzez łącznik, który jest zbyt krótki do umożliwienia parowania pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha. Zgodnie z tym, domeny VH i VL jednego fragmentu zmuszone są do parowania z komplementarnymi domenami VL i VH drugiego fragmentu, w ten sposób tworząc dwa miejsca wiążące antygeny. Doniesiono również o innej strategii przygotowywania fragmentów przeciwciał bispecyficznych dzięki zastosowaniu dimerów jednołańcuchowych Fv (sFv). Patrz Gruber i in., J. Immunol., 152: 5368 (1994).

Bierze się również pod uwagę przeciwciała o więcej niż dwóch wartościowościach. Można na przykład przygotowywać przeciwciała trispecyficzne. Tutt i in., J. Immunol. 147: 60 (1991).

(vii) Inne modyfikacje sekwencji aminokwasowej

Rozważa się modyfikację(e) sekwencji aminokwasowej opisanych w niniejszym opisie przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2. Na przykład, może być pożądana poprawa powinowactwa wiązania i/lub innych właściwości biologicznych przeciwciała. Warianty sekwencji aminokwasowej przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 przygotowuje się przez wprowadzanie odpowiednich zmian nukleotydowych do kwasu nukleinowego przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, lub przez syntezę peptydów.

PL 203 326 B1

Takie modyfikacje obejmują, na przykład, delecje i/lub insercje i/lub podstawienia reszt w sekwencji aminokwasowej przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2. Do uzyskania produktu końcowego można stosoować jakąkolwiek kombinację delecji, insercji i podstawień, pod warunkiem, że produkt końcowy posiada pożądane właściwości. Zmiany aminokwasów mogą również zmieniać potranslacyjne modyfikacje przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, takie jak zmiany liczby lub pozycji miejsc glikozylacji.

Użyteczną metodę identyfikowania pewnych reszt lub regionów przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, które są korzystnymi miejscami dla mutagenezy, nazwano mutagenezą przez przeszukiwanie alaninami, jak opisano w Cunningham i Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989). W metodzie tej identyfikuje się resztę lub grupę reszt docelowych (np. reszty naładowane, takie jak arg, asp, his, lys i glu) i zastępuje aminokwasami obojętnymi lub naładowanymi ujemnie (najkorzystniej alaniną lub fenyloalaniną) w celu zmiany oddziaływań aminokwasów z antygenem ErbB2. Te pozycje aminokwasowe, które wykazują funkcjonalną wrażliwość na podstawienia, analizuje się następnie bardziej szczegółowo przez wprowadzanie dalszych lub innych wariantów w, bądź za, miejsca podstawienia. A zatem, o ile wstępnie określa się miejsce wprowadzania różnicy w sekwencji aminokwasowej, charakter mutacji per se nie musi zostać wstępnie określony. Na przykład, dla analizy roli mutacji w danym miejscu, przeprowadza się przeszukiwanie alaninami lub mutagenezę losową docelowego kodonu lub regionu i ulegające ekspresji warianty przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 przeszukuje się pod kątem pożądanej aktywności.

Insercje w sekwencjach aminokwasowych obejmują fuzje amino- i/lub karboksylokońcowe, o długości pozostającej w zakresie od jednej reszty do polipeptydów zawierających setki lub więcej reszt, jak również insercje wewnątrzsekwencyjne pojedynczych lub licznych reszt aminokwasowych. Przykłady insercji na końcach obejmują przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 z N-końcową resztą metionylową lub przeciwciało poddane fuzji z polipeptydem cytotoksycznym. Inne insercyjne warianty cząsteczki przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 obejmują fuzję z końcem N lub C przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 enzymu (np. do techniki ADEPT) lub polipeptydu, który zwiększa okres półtrwania przeciwciała w surowicy.

Innym rodzajem wariantu jest wariant z podstawieniem aminokwasowym. Warianty te posiadają co najmniej jedną resztę aminokwasową w cząsteczce przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 zastąpioną inną resztą. Miejsca najbardziej pożądane dla mutagenezy przez podstawienie obejmują regiony hiperzmienne, ale bierze się również pod uwagę zmiany w FR. Konserwatywne podstawienia przedstawiono w tablicy 1 pod nagłówkiem Korzystne podstawienia. Jeśli wynikiem takich podstawień jest zmiana aktywności biologicznej, to następnie można wprowadzać bardziej zasadnicze zmiany, określone w tablicy 1 Przykładowe podstawienia i przeszukiwać produkty.

T a b l i c a 1

Reszta oryginalna	Przykładowe podstawienia	Korzystne podstawienia
1	2	3
Ala (A)	val, leu, ile	val
Arg (R)	lys, gln, asn	lys
Asn(N)	gln, his, asp, lys, arg	gln
Asp(D)	glu, asn	glu
Cys(C)	ser, ala	ser
Gln (Q)	asn, glu	asn
Glu (E)	asp, gln	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn, gln, lys, arg	arg
Ile (I)	leu, val, met, ala, phe, norleucyna
Leu (L)	norleucyna, ile, val, met, ala, phe	ile
Lys (K)	arg, gln, asn	arg
Met (M)	leu, phe, ile	leu

PL 203 326 B1 cd. tablicy 1

1	2	3
Phe (F)	leu, val, ile, ala, tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr, phe	tyr
Tyr (Y)	trp, phe, thr, ser	phe
Val (V)	ile, leu, met, phe, ala, norleucyna	leu

Zasadnicze modyfikacje pod względem właściwości biologicznych przeciwciała prowadzi się przez wybór podstawień, które znacząco różnią się swoim wpływem na utrzymywanie (a) struktury szkieletu polipeptydowego w regionie podstawienia, na przykład konformacji struktury β lub helikalnej, (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w miejscu docelowym lub (c) wielkości łańcucha bocznego. Naturalnie występujące reszty podzielono na grupy w oparciu o wspólne właściwości łańcuchów bocznych:

(1) hydrofobowe: norleucyna, met, ala, val, leu, ile;

(2) obojętne hydrofilowe: cys, ser, thr;

(3) kwaśne: asp, glu;

(4) zasadowe: asn, gln, his, lys, arg;

(5) reszty, które wpływają na orientację łańcucha: gly, pro; oraz (6) aromatyczne: trp, tyr, phe.

Podstawienia niekonserwatywne wymagają wymiany przedstawiciela jednejz tych klas na przedstawiciela innej.

Każdą resztę cysteiny nie biorącą udziału w utrzymywaniu właściwej konformacji przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 również można podstawiać, na ogół seryną, dla poprawy oksydacyjnej stabilności cząsteczki i zapobiegania niewłaściwemu sieciowaniu. W przeciwieństwie, wiązanie (a) cysteinowe można dodatkowo wprowadzać do przeciwciała dla poprawy jego stabilności (szczególnie jeśli przeciwciałem jest fragment przeciwciała, taki jak fragment Fv).

Szczególnie korzystny rodzaj wariantu podstawieniowego obejmuje podstawianie jednej lub więcej reszt regionu hiperzmiennego przeciwciała macierzystego (np. przeciwciała humanizowanego lub ludzkiego). Generalnie, otrzymany(e) wariant(y) wybrany(e) do dalszego opracowywania będzie posiadał poprawione właściwości biologiczne w stosunku do przeciwciała macierzystego, z którego go utworzono. Dogodny sposób tworzenia takich wariantów podstawieniowych obejmuje dojrzewanie powinowactwa z zastosowaniem prezentacji przez fagi. W skrócie, kilka miejsc regionu hiperzmiennego (np. 6-7 miejsc) poddaje się mutacjom w celu utworzenia wszystkich możliwych podstawień aminokwasowych w każdym z miejsc. Tak utworzone warianty przeciwciała prezentowane są w w sposób monowalentny na cząstkach fagów włókienkowatych w postaci białek fuzyjnych z produktem genu III M13, upakowanych w każdej cząstce. Prezentowane przez fagi warianty przeszukuje się następnie pod kątem ich aktywności biologicznej (np. powinowactwa wiązania), jak ujawniono w niniejszym opisie. W celu zidentyfikowania potencjalnych miejsc regionu hiperzmiennego do modyfikacji, można przeprowadzić mutagenezę przeszukiwania alaninami dla identyfikacjiresztregionu hiperzmiennegoznacząco przyczyniających się do wiązania antygenu. Alternatywnie, lub dodatkowo, korzystne może być analizowanie struktury krystalicznej kompleksu antygen-przeciwciało dla identyfikacji punktów kontaktu pomiędzy przeciwciałem i ludzkim ErbB2. Takie reszty kontaktu i reszty sąsiadujące są potencjalnymi resztami do podstawiania zgodnie z technikami opracowanymi w niniejszym opisie. Po utworzeniu takich wariantów, zestaw wariantów poddaje się przeszukiwaniu w sposób opisany w niniejszym opisie i przeciwciała o ulepszonych właściwościach w jednym lub więcej odpowiednich oznaczeń można wybrać do dalszego opracowywania.

Inny rodzaj wariantu aminokwasowego powoduje zmianę pierwotnego wzoru glikozylacji przeciwciała. Przez zmianę rozumie się delecję jednej lub więcej grup węglowodanowych występujących w przeciwciele i/lub dodanie jednego lub więcej miejsc glikozylacji, które nie są obecne w przeciwciele.

PL 203 326 B1

Glikozylacja przeciwciał jest zazwyczaj N-glikozylacją lub O-glikozylacją. N-glikozylacja odnosi się do połączenia grupy węglowodanowej z łańcuchem bocznym reszty asparaginy. Sekwencjami rozpoznawanymi do enzymatycznego przyłączania grupy węglowodanowej do łańcucha bocznego asparaginy są tri-peptydowe sekwencje asparagina-X-seryna i asparagina-X-treonina, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem poza proliną. A zatem, obecność którejkolwiek z tych sekwencji tripeptydowych w polipeptydzie tworzy potencjalne miejsce glikozylacji. O-glikozylacja odnosi się do połączenia jednego z cukrów N-acetylogalaktozoaminy, galaktozy lub ksylozy z hydroksyaminokwasem, najczęściej seryną lub treoniną, chociaż może również być wykorzystywana 5-hydroksyprolina lub 5-hydroksylizyna.

Wprowadzanie dodatkowych miejsc glikozylacji do przeciwciała dogodnie przeprowadza się przez zmianę sekwencji aminokwasowej, tak że zawiera ona jedną lub więcej z opisanych powyżej sekwencji tripeptydowych (miejsc N-glikozylacji). Zmiany można również dokonać przez dodanie, bądź podstawienie, jednej lub więcej reszt seryny lub treoniny do sekwencji oryginalnego przeciwciała (dla miejsc O-glikozylacji).

Cząsteczki kwasównukleinowych kodującychwarianty sekwencji aminokwasowej przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 przygotowuje się różnymi metodami znanymi w tej dziedzinie, metody te obejmują, ale nie ograniczają się do izolowania ze źródła naturalnego (w przypadku naturalnie występujących wariantów sekwencji aminokwasowych) oraz przygotowywania przez mutagenezę za pośrednictwem oligonukleotydów (czyli ukierunkowaną), mutagenezę przez PCR i mutagenezę kasetkową wcześniej przygotowanej wariantowej lub niewariantowej wersji przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2.

Może być pożądane modyfikowanie przeciwciała według wynalazku pod względem funkcji efektorowej, np. tak jak pod względem wzmocnienia zależnej od antygenu cytotoksyczności komórkowej (ADCC) i/lub cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) przeciwciała. Można to uzyskać przez wprowadzenie jednego lub więcej podstawień aminokwasowych do w regionie Fc przeciwciała. Alternatywnie, lub dodatkowo, do regionu Fc można wprowadzić resztę(y) cysteiny, w ten sposób umożliwiając tworzenie międzyłańcuchowego wiązania disiarczkowego w tym regionie. Tak utworzone przeciwciało homodimeryczne może wykazywać poprawioną zdolność do ulegania internalizacji i/lub zwiększone zależne od dopełniacza zabijanie komórek oraz zależną od przeciwciała cytotoksyczność komórkową (ADCC). Patrz Caron i in., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) i Shopes, B., J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Homodimeryczne przeciwciała o wzmocnionej aktywności przeciwnowotworowej można również przygotowywać stosując heterobifunkcjonalne czynniki sieciujące, jak opisano w Wolff i in., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternatywnie, można skonstruować przeciwciało, które posiada podwójne regiony Fc i dlatego może posiadać wzmocnione możliwości zależnej od dopełniacza lizy i ADCC. Patrz Stevanson i in., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).

W celu zwiększenia okresu półtrwania przeciwciała w surowicy, do przeciwciała (azwłaszczafragmentu przeciwciała) można wprowadzić epitop wiążący receptor ratunkowy, jak opisano na przykład w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 73 9 277. Wznaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin epitop wiążący receptor ratunkowy odnosi się do epitopu regionu Fc cząsteczki IgG (np. IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4), który jest odpowiedzialny za zwiększanie okresu półtrwania cząsteczki IgG w surowicy in vivo.

(viii) Przeszukanie pod kątem przeciwciało pożądanych właściwościach

Powyżej opisano techniki tworzenia przeciwciał. Przeciwciała można dalej selekcjonować pod kątem pewnych pożądanych właściwości biologicznych.

W celu identyfikacji przeciwciała, które blokuje aktywację receptora ErbB2 przez ligand, można określić zdolność przeciwciała do blokowania wiązania liganda ErbB z komórkami, w których zachodzi ekspresja receptora ErbB (np. w połączeniu z innym receptorem ErbB, z którym receptor ErbB będący przedmiotem zainteresowania tworzy heterooligomer ErbB). Na przykład, komórki, w których zachodzi naturalna ekspresja, bądź stransfekowane tak, aby zachodziła w nich ekspresja receptorów ErbB heterooligomeru ErbB, można inkubować z przeciwciałem, a następnie eksponować na wyznakowany ligand ErbB. Następnie można ocenić zdolność przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 do blokowania wiązania liganda z receptorem ErbB w heterooligomerze ErbB.

Na przykład, hamowanie wiązania HRG z linią komórek nowotworu sutka MCF7 przez przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 można przeprowadzić stosując monowarstwowe hodowle MCF7 na lodzie w 24-studzienkowej płytce zasadniczo w sposób opisany w przykładzie 1 poniżej. Do każdej studzienki można dodawać skierowane przeciw ErbB2 przeciwciała monoklonalne i inkubować w ciągu

PL 203 326 B1 minut. Następne można dodawać wyznakowaną ¹²⁵I rHRGe1_177-224 (25 pm) i inkubację można kontynuować w ciągu od 4 do 16 godzin. Można przygotowywać krzywe dawka-odpowiedź i obliczać wartość IC50 dla przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. W jednym rozwiązaniu, przeciwciało, które blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand, będzie posiadało w tym oznaczeniu IC50 dla hamowania wiązania HRG z komórkami MCF7 wynoszące około 50 nM lub mniej, korzystniej 10 nM lub mniej. Jeśli przeciwciałem jest fragment przeciwciała, taki jak fragment Fab, IC50 dla hamowania wiązania HRG z komórkami MCF7 w tym oznaczeniu może wynosić około 100 nM lub mniej, korzystniej 50 nM lub mniej.

Alternatywnie, lub dodatkowo, można oceniać zdolność przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 do blokowania stymulowanej ligandem ErbB fosforylacji tyrozyny receptora ErbB obecnego w heterooligomerze ErbB. Na przykład, komórki, w których zachodzi endogenna ekspresja receptorów ErbB, bądź stransfekowane tak, aby zachodziła w nich taka ekspresja, można inkubować z przeciwciałem, a następnie oznaczać zależną od liganda ErbB aktywność fosforylacji tyrozyny stosując przeciwciało skierowane przeciw fosfotyrozynie (które ewentualnie skoniugowano z wykrywalnym znacznikiem). Do określania aktywacji receptora ErbB i blokowania tej aktywności przez przeciwciało dostępne jest również oznaczenie aktywacji receptora o aktywności kinazy opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 766 863.

W jednym rozwiązaniu, można dokonywać przeszukiwania pod kątem przeciwciała, które hamuje stymulację przez HRG fosforylacji tyrozyny p180 w komórkach MCF7 zasadniczo w sposób opisany w przykładzie 1 poniżej. Na przykład, komórki MCF7 można wysiewać w 24-studzienkowych płytkach i do każdej studzienki dodawać skierowane przeciw ErbB2 przeciwciała monoklonalne oraz inkubować w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut; następnie do każdej studzienki można dodawać rHRGe1 ₁₇₇=₂₄₄ do 0,2 nM stężenia końcowego i inkubację można kontynuować w ciągu 8 minut. Z każdej studzienki można odciągnąć podłoże i reakcje można zatrzymywać przez dodanie 100 μl buforu do próbek z SDS (5% SDS, 25 mM DTT i 25 mM Tris-HCl, pH 6,8). Każdą próbkę (25 μθ można poddawać elektroforezie w żelach o gradiencie 4-12% poliakryloamidu (Novex), a następnie elektroforetycznie przenosić na membranę z polifluorku winylidenu.Można wywoływać immunobloty stosując przeciwciało skierowane przeciw fosfotyrozynie (o stężeniu 1 μg/ml) i intensywność głównego reaktywnego prążka o Mr około 180 000 można ilościowooceniaćprzezdensytometrięwświetle odbitym. Wyselekcjonowane przeciwciało będzie korzystnie hamować w tym oznaczeniu stymulację fosforylację tyrozyny p180 przez HRG do około 0-35% wartości kontrolnej. Można przygotować krzywą dawkaodpowiedź dla hamowania stymulacji fosforylacji tyrozyny p180 przez HRG, określanego przez densytometrię w świetle odbitym i można obliczyć IC50 dla przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. W jednym rozwiązaniu, przeciwciało, które blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand będzie posiadać w tym oznaczeniu IC50 dla hamowania stymulacji tyrozyny p180 przez HRG wynoszące około 50 nM lub lub mniej, korzystniej 10 nM lub mniej. Jeśli przeciwciałem jest fragment przeciwciała, taki jak fragment Fab, IC50 dla hamowania stymulacji fosforylacji tyrozyny p180 przez HRG w tym oznaczeniu może wynosić na przykład około 100 nM lub mniej, korzystniej 50 nM lub mniej.

Można również oceniać wpływ hamowania wzrostu przez przeciwciało wobec komórek MDA-MB175, np. zasadniczo w sposób opisany w Schaefer i in., Oncogene 15: 1385-1394 (1997). Według tego oznaczenia, komórki MDA-MB-175 można traktować monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2 (10 μg/ml) w ciągu 4 dni i wybarwiać fioletem krystalicznym. Inkubacja z przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2 może wywierać wpływ hamowania wzrostu na tę linię komórkową, podobny do tego wykazywanego przez monoklonalne przeciwciało 2C4. W dalszym rozwiązaniu, egzogenna HRG nie będzie znacząco odwracała tego hamowania. Korzystnie, przeciwciało będzie zdolne do hamowania proliferacji komórkowej komórek MDA-MB-175 w większym stopniu niż monoklonalne przeciwciało 4D5 (a ewentualnie w większym stopniu niż monoklonalne przeciwciało 7F3), zarówno w obecności,jak i nieobecności egzogennej HRG.

W jednym rozwiązaniu, będące przedmiotem zainteresowania przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 może blokować zależną od hereguliny asocjację ErbB2 z ErbB3 zarówno w komórkach MCF7, jak i SK-BR-3, określaną w doświadczeniu koimmunoprecypitacji, takim jak to opisane w przykładzie 2, znacznie skuteczniej niż monoklonalne przeciwciało 4D5, a korzystnie znacznie skuteczniej niż monoklonalne przeciwciało 7F3.

W celu identyfikacji hamujących wzrost przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2, przeciwciała można przeszukiwać pod kątem tych, które hamują wzrost komórek nowotworowych, w których zachodzi nadekspresją ErbB2. W jednym rozwiązaniu, wybrane przeciwciało hamujące wzrost jest zdolne

PL 203 326 B1 do hamowania wzrostu komórek SK-BR-3 w hodowli komórkowej o około 20-100%, a korzystnie o około 50-100%, przy stężeniu przeciwciała wynoszącym około od 0,5 do 30 μg/ml. W celu identyfikacji takich przeciwciał można przeprowadzić opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 677 171 oznaczenie na komórkach SK-BR-3. Według tego oznaczenia, komórki SK-BR-3 hoduje się w mieszaninie podłuż F12 i DMEM w stosunku 1:1, wzbogaconej o 10% płodową surowicę bydlęcą, glutaminę i penicylinę/streptomycynę. Komórki SK-BR-3 wysiewa się w ilości 20 000 komórek w szalkach do hodowli komórek o średnicy 35 mm (2 ml/szalkę o średnicy 35 mm). Dodaje się od 0,5 do 30 μg/ml przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 na szalkę. Po sześciu dniach zlicza się liczbę komórek, w porównaniu z komórkami nietraktowanymi, stosując elektroniczne urządzenie do zliczania komórek COULTER™. Te przeciwciała, które hamują wzrost komórek SK-BR-3 o około 20-100% lub o około 50-100%, można wybierać jako przeciwciała hamujące wzrost.

W celu wyselekcjonowania przeciwciał, które indukują śmierć komórkową, w porównaniu z kontrolą można oceniać utratę integralności błony komórkowej, wskazywaną przez pobieranie PI, błękitu tryptanu lub 7AAD. Korzystnym oznaczeniem jest oznaczenie pobierania PI z zastosowaniem komórek BT474. Według tego oznaczenia, komórki BT474 (które można otrzymać z American Type Culture Collection (Rockville, MD)), hoduje się w Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) : Ham's F-12 (50:50), wzbogaconym o 10% inaktywowaną termicznie FBS (Hyclone) i 2 mM L-glutaminę. (A zatem, oznaczenie prowadzi się w nieobecności dopełniacza i efektorowych komórek odpornościowych). Komórki BT474 wysiewa się z gęstością 3 x 10⁶ komórek na szalkę w szalkach o wymiarach 100 x 20 mm i umożliwia przyłączanie przez noc. Następnie podłoże usuwasię i zastępuje samym świeżym podłożem lub podłożem zawierającym 10 μg/ml odpowiedniego przeciwciała monoklonalnego. Komórki inkubuje się w ciągu okresu 3 dni. Po każdym traktowaniu mono-warstwy przemywa się PBS i odłącza stosując trypsynę. Następnie komórki wiruje się przy 1200 obrotach na minutę w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C, osad ponownie zawiesza w 3 ml schłodzonego lodem buforu do wiązania z Ca²⁺ (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) i rozdziela do probówek 12 x 75 zamkniętych 35 mm filtrem (1 ml na probówkę, 3 probówki na traktowaną grupę) w celu usunięcia agregatów komórkowych. Do probówek dodaje się następnie PI (10 μg/ml). Próbki można analizować stosując cytometr przepływowy FACSCAN™ i oprogramowanie FACSCONVERT™ Cell. Quest (Becton Dickinson). Te przeciwciała, które indukują istotne statystycznie poziomy śmierci komórek określone dzięki pobieraniu PI, można wybierać jako przeciwciała indukujące śmierć komórkową.

Do selekcji pod kątem przeciwciał, które indukują apoptozę, dostępne jest oznaczenie wiązania aneksyny z zastosowaniem komórek BT474. Komórki BT474 hoduje się i wysiewa w szalkach, jak dyskutowano w poprzednim akapicie. Następnie podłoże usuwa się i zastępuje samym świeżym podłożem lub podłożem zawierającym 10 μg/ml przeciwciała monoklonalnego. Komórki inkubuje się w ciągu okresu 3 dni, monowarstwy przemywa się PBS i odłącza stosując trypsynę. Następnie komórki wiruje się, ponownie zawiesza w buforze do wiązania z Ca²⁺ i rozmieszcza do probówek, jak dyskutowano powyżej dla oznaczenia śmierci komórkowej. Do probówek dodaje się następnie wyznakowaną aneksynę (np. aneksynę V-FITC) (1 μg/ml). Próbki można analizować stosując cytometr przepływowy FACSCAN™ i oprogramowanie FACSCONVERT™ Cell. Cjuest (Becton Dickinson). Te przeciwciała, które indukują istotne statystycznie poziomy wiązania aneksyny w stosunku do kontroli wybiera się jako przeciwciała indukujące apoptozę.

Poza oznaczeniem wiązania aneksyny, dostępne jest oznaczenie wybarwiania DNA z zastosowaniem komórek BT474. W celu przeprowadzenia tego oznaczenia, komórki BT474, które traktowano przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania w sposób opisany w poprzednich dwóch akapitach, inkubuje się z 9 μg/ml HOECHST 33342™ w ciągu dwóch godzin w temperaturze 37°C, a następnie analizuje w cytometrze przepływowym EPICS ELITE™ (Coulter Corporation) stosując oprogramowanie MODFIT LT™ (Verity Software House). Stosując oznaczenie, przeciwciała, które indukują zmianę procentu komórek apoptycznych, który jest 2-krotny lub wyższy (a korzystnie 3-krotny lub wyższy) niż w przypadku komórek nietraktowanych (do 100% komórek apoptycznych), można wybrać jako przeciwciała proapoptyczne.

Do przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z epitopem związanym przez przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego, takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, lub dodatkowo, metodami znanymi w tej dziedzinie można prowadzić mapowanie epitopowe (patrz np. fig. 1A i 1B w niniejszym opisie).

PL 203 326 B1 (ix) Immunokoniugaty

Wynalazek dotyczy również immunokoniugatów zawierających przeciwciało skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym, takim jak czynnik chemioterapeutyczny, toksyna (np. toksyna niskocząsteczkowa lub toksyna aktywna enzymatycznie pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, włącznie z ich fragmentami i/lub wariantami) lub izotopem promieniotwórczym (tj. radiokoniugat).

Czynniki chemioterapeutyczne użyteczne w tworzeniu takich immunokoniugatów opisano powyżej. W niniejszym opisie rozważa się również koniugaty przeciwciała z jedną lub więcej toksynami niskocząsteczkowymi, takimi jak kalicheamicyna, maytanzyna (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 208 020), trichoten i CC1065.

W jednym korzystnym rozwiązaniu wynalazku, przeciwciało koniuguje się z jedną lub więcej cząsteczkami maytanzyny (np. od około 1 do około 10 cząsteczkami maytanzyny na cząsteczkę przeciwciała). Maytanzynę można, na przykład, przekształcić w May-SS-Me, którą można zredukować do May-SH3 i poddać reakcji ze zmodyfikowanym przeciwciałem (Chari i in., Cancer Research 52: 127-131 (1992)) z utworzeniem immunokoniugatu maytanzynoid-przeciwciało.

Inny immunokoniugat będący przedmiotem zainteresowania zawiera skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało skoniugowane z jedną lub więcej cząsteczkami kalichamicyny. Rodzina antybiotyków kalicheamicynowych charakteryzuje się zdolnością do rozrywania dwuniciowego DNA przy stężeniach subpikomolowych. Strukturalne analogi kalicheamicyny, które można stosować, obejmują, ale nie ograniczają się do γ₁ ¹, α2¹, as¹, N-acetylo-γ-ι¹, PSAG i θ1¹ (Hinman i in., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) i Lode i in., Cancer Research 58: 2928 (1998)). Patrz także opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5,714,586; 5,712,74; 5,264,586; i 5,773,001; formalnie włączone do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

Enzymatycznie aktywne toksyny i ich fragmenty, które można stosować, obejmują łańcuch A toksyny błoniczej, niewiążące aktywne fragmenty toksyny błoniczej, łańcuch A endotoksyny (z Pseudomonas aeruginosa), łańcuch A rycyny, łańcuch A abryny, łańcuch A moddecyny, alfa-sakrynę, białka Aleurites fordii, białka diantyn, białek Phytolaca americana (PAPI, PAPU i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcynę, krotynę, inhibitor Saponaria officinalis, geloninę, mitożelinę, restryktocynę, fenomycynę, enomycynę i trikoteceny. Patrz, na przykład, zgłoszenie międzynarodowe numer 93/21232, opublikowany 28 października 1993 r.

Niniejszy wynalazek rozważa ponadto immunokoniugat utworzony pomiędzy przeciwciałem a związkiem o aktywności nukleolitycznej (np. rybonukleazą lub endonukleazą DNA, taką jak deoksyrybonukleaza, DNAza).

Do wytwarzania skierowanych przeciw ErbB2 przeciwciał skoniugowanych z izotopami promieniotwórczymi dostępnych jest szereg izotopów. Przykłady obejmują At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² i promieniotwórcze izotopy Lu.

Koniugaty przeciwciała i czynnika cytotoksycznego można przygotować stosując szereg bifunkcjonalnych czynników sprzęgających z białkami, takich jak N-sukcynimidylo-3-(2-pirydylotio)-propionian, sukcynimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan, iminotiolan (IT), bifunkcjonalne pochodne imidoestrów (takie jak chlorowodorek adypimidynianu dimetylowego), aktywne estry (takie jak suberynian disukcynimidylowy), aldehydy (takie jak glutaraldehyd), związki bis-azydowe (takie jak bis (p-azydobenzoilo)heksanodiamina), pochodne bis-diazoniowe (takie jak bis-(p-diazoniobenzoilo)-etylenodiamina), diizocyjaniany (takie jak 2,6-diizocyjanian tolienu) i dwuaktywne związki fluorowe (takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na przykład, immunotoksynę rycynową można przygotować w sposób opisany w Vitetta i in., Science 238: 1098 (1987). Wyznakowany C¹⁴ kwas 1-izotiocyjanatobenzylo-3-metylodietylenotriaminopentaoctowy (MX-DPTA) jest przykładowym czynnikiem chelatującym do koniugowania rybonukleotydu z przeciwciałem. Patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 94/11026. Łącznikiem może być łącznik rozszczepialny, ułatwiający uwalnianie leku cytotoksycznego w komórce. Na przykład można stosować łącznik labilny w kwasach, łącznik wrażliwy na peptydazy, łącznik dimetylowy lub łącznik zawierający wiązanie disiarczkowe (Chari in., Cancer Research 52: 127-131 (1992)).

Alternatywnie, można przygotować białko fuzyjne, zawierające przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 i czynnik cytotoksyczny,np.technikami rekombinacji lub syntezy peptydów.

W jeszcze innym rozwiązaniu, przeciwciało można skoniugować z receptorem (takim jak streptawidyna) do wykorzystywania we wstępnym kierowaniu do nowotworu, podczas którego pacjentowi podaje się koniugat przeciwciało-receptor, a następnie usuwa się niezwiązany koniugat z krążenia

PL 203 326 B1 stosując czynnik usuwający, po czym podaje się ligand (np. awidynę), który skoniugowano z czynnikiem cytotoksycznym (np. nuklidem promieniotwórczym).

(x) Zależnaod przeciwciałterapia prolekiem z udziałem enzymu (ADEPT)

Przeciwciała według niniejszego wynalazku można również stosować w ADEPT, dzięki koniugowaniu przeciwciała z enzymem aktywującym prolek, który przekształca prolek (np. peptydylowy czynnik chemioterapeutyczny, patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 81/01145) w aktywny lek przeciwrakowy. Patrz, na przykład, międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 88/07378 i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,975,278.

Enzymatyczna składowa immunokoniugatu użytecznego w ADEPT obejmuje jakikolwiek enzym zdolny do działania na prolek w taki sposób, że przekształca go w bardziej aktywną, cytotoksyczną postać.

Enzymy, które są użyteczne w sposobie według tego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do alkalicznej fosfatazy użytecznej do przekształcania proleków zawierających grupę fosforanową w wolne leki, arylosulfatazy użytecznej do przekształcania leków zawierających grupę siarczanową w wolne leki, deamianzy cytozynowej użytecznej do przekształcania nietoksycznej 5-fluorocytozyny w lek przeciwrakowy, 5-fluorouracyl, proteaz, takich jak proteaza Serratia, termolizyna, subtylizyna, karboksypeptydazy i katepsyny (takie jak katepsyny B i L), które są użyteczne w przekształcaniu proleków zawierających peptydy w wolne leki, D-alanylokarboksypeptydaz użytecznych w przekształcaniu proleków, które zawierają podstawniki D-aminokwasowe, enzymów rozszczepiających węglowodany, takich jak β-galaktozydaza i neuraminidaza, użytecznych w do przekształcania proleków glikozylowanych w wolne leki, β-laktamazy użytecznej do przekształcania leków zmodyfikowanych β-laktamami w wolne leki oraz amidaz penicylinowych, takich jak amidaza penicyliny V lub amidaza penicyliny G, użytecznych do przekształcania leków zmodyfikowanych przy atomach azotu grup aminowych, odpowiednio, grupami fenoksyacetylowymi lub fenyloacetylowymi w wolne leki. Alternatywnie, do przekształcania proleków według wynalazku w wolne aktywne leki można stosować przeciwciała o aktywności enzymatycznej, znane również w nauce jako abzymy (patrz np. Massey, Nature, 328: 457-458 (1987)). Koniugaty przeciwciało-abzym można przygotowywać w sposób opisany w niniejszym opisie w celu dostarczania abzymu do populacji komórek nowotworowych.

Enzymy według tego wynalazku można kowalencyjnie wiązać z przeciwciałami skierowanymi przeciw ErbB2 stosując techniki dobrze znane w tej dziedzinie, takie jak stosowanie dyskutowanych powyżej heterobifunkcjonalnych odczynników sieciujących. Alternatywnie, stosując dobrze znane w tej dziedzinie techniki rekombinacji DNA, można konstruować białka fuzyjne zawierające co najmniej wiążący antygen region przeciwciała według wynalazku połączony z co najmniej funkcjonalnie aktywną częścią enzymu według wynalazku (patrz np. Neuberger i in., Nature, 312: 604-608 (1984).

(xi) Inne modyfikacje przeciwciał

W niniejszym opisie rozważa się inne modyfikacje przeciwciał. Na przykład, przeciwciało można łączyć z jednym z szeregu polimerów niebiałkowych, np. glikolem polietylenowy, glikolem polipropylenowym, polioksyalkilenami lub kopolimerami glikolu polietylenowego i glikolu polipropylenowego. Przeciwciało można również zamykać w mikrokapsułkach przygotowanych, na przykład, technikami koacerwacji lub przez polimeryzację międzyfazową (na przykład odpowiednio w mikrokapsułkach hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych i mikrokapsułkach poli-(metylometacylanowych)), w koloidalnych układach dostarczania leków (na przykład liposomach, mikrokuleczkach albuminowych, mikroemulsjach, nanocząstkach i nanokapsułkach) bądź makroemulsjach. Takie techniki ujawniono w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 16, Oslo, A. red. (1980).

Ujawnione w niniejszym opisie przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 można również tworzyć w postaci immunoliposomów. Liposomy zawierające przeciwciało przygotowuje się metodami znanymi w tej dziedzinie, takimi jak opisane w Epstein i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985), Hwang i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 485 045 i 4 544 545 oraz międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer 97/38731, opublikowanym 23 października 1997 r. Liposomy o wydłużonym czasie trwania w krążeniu ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 013 556.

Szczególnie użyteczne liposomy można tworzyć metodą odparowywania o odwróconych fazach z kompozycji lipidów zawierającej fosfatydylocholinę, cholesterol i zmodyfikowaną PEG fosfatydyloetanoloaminę (PEG-PE). Liposomy przepuszczane przez sączki o określonej wielkości porów dla uzyskania liposomów o pożądanej średnicy. Fragmenty Fab' przeciwciał według niniejszego wynalazku można koniugować z liposomami w sposób opisany w Martin i in., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)

PL 203 326 B1 dzięki reakcji wymiany disiarczkowej. Liposomy ewentualnie zawierają czynnik chemioterapeutyczny. Patrz Gabizon i in., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).

III. Wektory,komórki gospodarza i metody rekombinacji

Wynalazek zapewnia także wyizolowany kwas nukleinowy kodujący humanizowane przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, wektory i komórki gospodarza zawierające kwas nukleinowy i techniki rekombinacji do wytwarzania przeciwciała.

W celu rekombinacyjnego wytwarzania przeciwciała, kodujący je kwas nukleinowy izoluje się i wstawia do zdolnego do replikacji wektora do dalszego klonowania (amplifikacji DNA) lub do ekspresji. DNA kodujący przeciwciało monoklonalne łatwo izoluje się i sekwencjonuje stosując konwencjonalne procedury (np. stosując sondy oligonukleotydowe, które są zdolne do specyficznego wiązania z genami kodującymi łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała). Dostępnych jest wiele wektorów. Składniki wektora generalnie obejmują, ale nie ograniczają się do jednego lub więcej z następujących elementów: sekwencji sygnałowej, miejsca początku replikacji, jednego lub więcej genów markerowych, sekwencji wzmacniającej, promotora i sekwencji terminacji transkrypcji.

(i) Sekwencja sygnałowa

Skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało według tego wynalazku można wytwarzać rekombinacyjnie nie tylko bezpośrednio, ale również wpostaci polipeptydu fuzyjnego z polipeptydem heterologicznym, którym jest korzystnie sekwencja sygnałowa lub inny polipeptyd posiadający miejsce specyficznego odszczepiania na końcu N dojrzałego białka lub polipeptydu. Wybraną heterologiczną sekwencją sygnałową jest sekwencja, która jest rozpoznawana i modyfikowana (tj. rozszczepiana przez peptydazę sygnałową) w komórce gospodarza. Dla prokariotycznych komórek gospodarza, które nie rozpoznają i nie modyfikują natywnej sekwencji sygnałowej przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, sekwencję sygnałową podstawia się prokariotyczną sekwencją sygnałową wybraną, na przykład, z grupy liderów alkalicznej fosfatazy, penicylinazy, lpp lub stabilnej termicznie enterotoksyny II. Dla wydzielania z drożdży, natywna sekwencję sygnałową można podstawić np. liderem drożdżowej inwertazy, liderem czynnika α (włącznie z liderami czynników α Saccharomyces i Kluyveromyces) lub liderem kwaśnej fosfatazy, liderem glukoamylazy C. albicans bądź sygnałem opisanym w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym patentowym numer 90/13646. Dla ekspresji w komórkach ssaczych dostępne są ssacze sekwencje sygnałowe, jak również wirusowe lidery sekrecyjne, na przykład sygnał gD wirusa opryszczki.

DNA dla takiego regionu prekursora liguje się w jednej ramce odczytu z DNA kodującym przeciwciało skierowane przeciw ErbB2.

(ii) Miejsce początku replikacji

Zarówno wektory ekspresyjne, jak i klonujące, zawierają sekwencję kwasu nukleinowego, która umożliwia replikację wektora w jednej lub więcej wybranych komórek gospodarza. Generalnie, w wektorach klonujących sekwencją tą jest sekwencja, która umożliwia replikację wirusa niezależną od chromosomalnego DNA gospodarza, i obejmuje ona miejsca początku replikacji lub sekwencje ulegające autonomicznej replikacji. Sekwencje takie są dobrze znane dla wielu różnorodnych bakterii, drożdży i wirusów. Miejsce początku replikacji z plazmidu pBR322 jest odpowiednie dla większości bakterii Gram-ujemnych, miejsce początku replikacji z plazmidu 2μ jest odpowiednie dla drożdży, a różne wirusowe miejsca początku replikacji (SV40, wirusa polyoma, adenowirusa, VSV lub BPV) są użyteczne do wektorów klonujących w komórkach ssaczych. Generalnie, miejsce początku replikacji nie jest potrzebne w ssaczych wektorach ekspresyjnych (zazwyczaj może być stosowane miejsce początku replikacji SV40, ale tylko dlatego, że zawiera ono wczesny promotor).

(iii) Gen selekcji

Wektory ekspresyjne i klonujące mogą zawierać gen selekcji, nazywany również markerem selekcyjnym. Typowe geny selekcji kodują białka, które (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, np. ampicylinę, neomycynę, metotreksat lub tetracyklinę), (b) uzupełniają niedobory auksotroficzne lub (c) dostarczają składników odżywczych o zasadniczym znaczeniu, niedostępnych w podłożach złożonych, np. gen kodujący racemazę D-alaninową w przypadku Bacilli.

W jednym z przykładów schematów selekcji wykorzystuje się lek do zatrzymywania wzrostu komórki gospodarza. Te komórki, które zostały z powodzeniem stransformowane genem heterologicznym, wytwarzają biało nadające oporność na lek, a zatem przeżywają reżim selekcji. W przykładach takich często stosowanych selekcji wykorzystuje się takie leki, jak neomycyna,kwas mykofenolowy i hygromycyna.

PL 203 326 B1

Innymi przykładami odpowiednich markerów selekcyjnych dla komórek ssaczych są te, które umożliwiają identyfikację komórek kompetentnych pod względem pobierania kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, takie jak geny DHFR, kinazy tymidynowej, metalotioneiny I i II, korzystnie metalotionein Naczelnych, deaminazy adenozynowej, dekarboksylazy ornitynowej itp.

Na przykład, komórki stransformowane genem selekcji DHFR, najpierw identyfikuje się przez hodowlę wszystkich transformantów w podłożu hodowlanym, które zawiera metotreksat (Mtx), współ zawodniczego antagonistę DHFR. Gdy wykorzystuje się DHFR typu dzikiego, odpowiednią komórką gospodarza jest linia komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) pozbawiona aktywności DHFR.

Alternatywnie, komórkigospodarza (szczególnie gospodarzy typu dzikiego, którzy zawierają endogenną DHFR) transformowane lub kotransformowane sekwencjami DNA kodującymi przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, białko DHFR typu dzikiego lub inne markery selekcyjne, takie jak 3'-fosfotransferaza aminoglikozydowa (APH) można selekcjonować poprzez wzrost komórek w podłożu zawierającym czynnik selekcyjny dla markera selekcyjnego, taki jak antybiotyk aminoglikozydowy, np. kanamycynę, neomycynę lub G418. Patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 965 199.

Odpowiednim genem selekcji do stosowania w drożdżach jest gen trp1, obecny w drożdżowym plazmidzie YRp7 (Stinchcomb i in., Nature, 282: 39 (1979). Gen trp1 zapewnia marker selekcyjny dla zmutowanego szczepu drożdży, pozbawionego zdolności wzrostu w obecności tryptofanu, na przykład ATCC numer 44076 lub PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). Obecność uszkodzenia trp1 w genomie komórki gospodarza drożdżowego zapewnia zatem skuteczne środowisko genetyczne do wykrywania transformacji poprzez wzrost w nieobecności tryptofanu. Podobnie, zmutowane szczepy drożdżowe pozbawione Leu2 (ATCC 20 622 lub 38 626) podlegają komplementacji przez znane plazmidy niosące gen Leu2.

Ponadto, do transformacji drożdży Kluyveromyces można stosować wektory pochodzące od kolistego plazmidu o średnicy 1,6 μm, pKD1. Alternatywnie, dla K. lactis doniesiono o układzie ekspresyjnym do wytwarzania na dużą skalę zrekombinowanej podpuszczki cielęcej. Van der Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). Ujawniono również stabilne wektory ekspresyjne występujące w dużej liczbie kopii do wydzielania dojrzałej, zrekombinowanej albuminy surowicy ludzkiej przez przemysłowe szczepy Kluyveromyces. Fleer i in., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).

(iv) Promotor

Wektory ekspresyjne i klonujące zazwyczaj zawierają promotor, który jest rozpoznawany przez organizm gospodarza i jest połączony w sposób umożliwiający działanie z kwasem nukleinowym kodującym przeciwciało skierowane przeciw ErbB2.

Promotory odpowiednie do stosowania z gospodarzami prokariotycznymi obejmują promotor phoA, układy promotorowe β-laktamazowy i laktozowy, promotor alkalicznej fosfatazy, tryptofanowy układ promotorowy (trp) oraz promotory hybrydowe, takie jak promotor tac. Jednakże, odpowiednie są inne znane promotory bakteryjne. Promotory do stosowania w układach bakteryjnych będą zawierać również sekwencję Shine-Dalgarno (S.D.) połączoną w sposób umożliwiający działanie z DNA kodującym przeciwciało skierowane przeciw ErbB2.

Znane są sekwencje promotorowe dla organizmów eukariotycznych. Właściwie wszystkie geny eukariotyczne posiadają region bogaty w AT położony około od 25 do 30 zasad przed miejscem, w którym rozpoczynana jest transkrypcja. Inną sekwencją, występującą od 70 do 80 zasad przed miejscem początku transkrypcji wielu genów, jest region CNCAAT, gdzie N może być dowolnym nukleotydem. Na końcu 3' większości genów eukariotycznych znajduje się sekwencja AATAAA, która może być sygnałem do dołączania odcinka poliA do końca 3' sekwencji kodującej. Wszystkie z tych sekwencji są odpowiednie do wstawiania do eukariotycznych wektorów ekspresyjnych.

Przykłady odpowiednich sekwencji promotorowych do stosowania w gospodarzach drożdżowych obejmują promotory kinazy 3-fosfoglicerynianowej i innych enzymów glikolitycznych, takich jak enolaza, dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza glukozo-6-fosforanowa, mutaza 3-fosfoglicerynianowa, kinaza pirogronianowa, izomeraza triozofosforanowa, izomeraza fosfoglukozowa i glukokinaza.

Innymi promotory drożdżowe, które są promotorami indukowalnymi, posiadającymi dodatkową zaletę kontrolowania transkrypcji przez warunki wzrostu, są regiony promotorowe dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwaśnej fosfatazy, enzymów katabolicznych związanych z metabolizmem azotowym, metalotioneiny, dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowej oraz enzymów odpowiedzialnych za wykorzystywanie maltozy i galaktozy. Wektory i promotory odpowiednie do

PL 203 326 B1 stosowania w ekspresji w drożdżach opisano dalej w europejskim opisie patentowym numer 73 657. Korzystne jest również stosowanie drożdżowych sekwencji wzmacniających z promotorami drożdżowymi.

Transkrypcję przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 z wektorów w komórkach drożdżowych kontrolują, na przykład, promotory otrzymane z genomów wirusów, takich jak wirus poly-oma, wirus ospy ptasiej, adenowirus (taki jak adenowirus 2), wirus brodawczaka bydlęcego, wirus mięsaka ptasiego, cytomegalowirus, retrowirus, wirus zapalenia wątroby typu B, a najkorzystniej wirus małpi 40 (SV40), heterologiczne promotory ssacze, np. promotor aktyny lub promotor immunoglobuliny, promotory białek szoku cieplnego, pod warunkiem, że takie promotory są kompatybilne z układami komórek gospodarza.

Wczesny i późny promotory wirusa SV40 otrzymuje się dogodnie w postaci fragmentu restrykcyjnego SV40, który zawiera również wirusowe miejsce początku replikacji SV40. Natychmiastowy wczesny promotor ludzkiego cytomegalowirusa otrzymuje się dogodnie w postaci fragmentu restrykcyjnego Hindlll E. Układ do ekspresji DNA w gospodarzach ssaczych z zastosowaniem wirusa brodawczaka bydlęcego jako wektora opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 419 446. Modyfikację tego układu opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 601 987. Patrz również Reyes i in., Nature, 297: 598-601 (1982) odnośnie ekspresji cDNA ludzkiego interferonu β w komórkach mysich pod kontrolą promotora kinazy tymidynowej z wirusa opryszczki. Alternatywnie, jako promotor można zastosować długie powtórzenia terminalne wirusa mięsaka Rousa.

(v) Element wzmacniający

Transkrypcję DNA kodującego skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało według tego wynalazku przez wyższe organizmy eukariotyczne często zwiększa wstawienie do wektora sekwencji wzmacniającej. Znanych jest wiele sekwencji wzmacniających z genów ssaków (globiny, elastazy, albuminy, α-fetoproteiny i insuliny). Zazwyczaj jednak stosować się będzie sekwencję wzmacniającą z wirusa komórek eukariotycznych. Przykłady obejmują sekwencję wzmacniającą SV40 po późnej stronie miejsca początku replikacji (pary zasad 100-270), sekwencję wzmacniającą wczesnego promotora cytomegalowirusa, sekwencję wzmacniającą wirusa polyoma po późnej stronie miejsca początku replikacji oraz sekwencje wzmacniające adenowirusów. Patrz także Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982) odnośnie elementów wzmacniających do aktywacji promotorów eukariotycznych. Sekwencję wzmacniającą można włączyć do wektora w pozycji po stronie 5' lub 3' sekwencji kodującej przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, ale korzystnie położona jest ona po stronie 5' promotora.

(vi) Sygnał terminacji transkrypcji

Wektory ekspresyjne stosowane w eukariotycznych komórkach gospodarza (komórkach drożdżowych, grzybowych, owadzich, zwierzęcych, ludzkich lub posiadających jądra komórkach z innych organizmów wielokomórkowych) będą również zawierały sekwencje konieczne do terminacji transkrypcji i do stabilizacji mRNA. Takie sekwencje są powszechnie dostępne z 5'-końcowych i, czasami, 3'-końcowych nie ulegających translacji regionów DNA lub cDNA eukariotycznych lub wirusowych. Regiony te zawierają odcinki nukleotydowe ulegające transkrypcji jako fragment poliadenylowane w nie ulegającej translacji części mRNA kodującego przeciwciało skierowane przeciw ErbB2. Jednym z użytecznych składników terminacji transkrypcji jest region poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu. Patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 94/11026 i ujawniony w nim wektor ekspresyjny.

(vii) Wybór i transformacja komórek gospodarza

Komórkami gospodarza odpowiednimi do klonowania lub ekspresji DNA w wektorach przedstawionych w niniejszym opisie są opisane powyżej komórki organizmów prokariotycznych, drożdży lub wyższych organizmów eukariotycznych. Odpowiednie do tego celu organizmy prokariotyczne obejmują bakterie właściwe, takie jak organizmy Gram-ujemne lub Gram-dodatnie, na przykład Enterobacteriaceae, takie jak Escherichia, np. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, np. Salmonella typhimurium, Serratia, np. Serratia marcescans, oraz Shigella, jak również Bacilli, takie jak B. subtilis i B. licheniformis (np. B. licheniformis 41P, ujawniony w opisie patentowym numer DD 266 710, opublikowanym 12 kwietnia 1989), Pseudomonas, taki jak P. aeruginosa, i Streptomyces. Jednym z korzystnych gospodarzy E. coli do klonowania jest E. coli 294 (ATCC 31 446), chociaż odpowiednie są inne szczepy, takie jak E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537) i E. coli W3110). Przykłady te są raczej ilustrujące, niż ograniczające.

PL 203 326 B1

Poza organizmami prokariotycznymi, odpowiednimi gospodarzami do klonowania lub ekspresji dla wektorów przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 są organizmy eukariotyczne, takie jak grzyby strzępkowe lub drożdże. Spośród mikroorganizmów gospodarzy będących niższymi organizmami prokariotycznymi najpowszechniej stosuje się Saccharomyces cerevisiae, czyli zwykłe drożdże piekarskie. Jednakże, powszechnie dostępne i użyteczne w niniejszym opisie są liczne inne rodzaje, gatunki i szczepy, takie jak Saccharomyces pombe; gospodarze Kluyveromyces, tacy jak K. lactis,

K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus, (ATCC 16 045), K. wickermanii (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906), K. thermotolerans i K. marxianus; yarrowia (europejski opis patentowy numer 402 226); Pichia pastoris (europejski opis patentowy numer 183 070); Candida; Trichoderma reesia (europejski opis patentowy numer 244 234), Neurospora crassa; Schwanniomyces, takie jak Schwanniomyces occidentalis oraz grzyby strzępkowe, takie jak Neurospora, Penicillium, Tolypocladium i gospodarze Aspergillus, tacy jak A. nidulans i A. niger.

Odpowiednie komórki gospodarza do ekspresji glikozylowanego przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 pochodzą z organizmów wielokomórkowych. Przykłady komórek bezkręgowców obejmują komórki roślin i owadów. Zidentyfikowano liczne szczepy i warianty bakulowirusowe i odpowiadające im zalecane owadzie komórki gospodarza z takich gospodarzy, jak Spodoptera frugiperda (gąsienica), Aedes aegypki (komar), Aedes albopictus (komar), Drosphila melanogaster (wywilżna karłówka) i Bombyx mori. Powszechnie dostępne są różne szczepy wirusowe do transfekcji, np. wariant L-l NPV Autographa californica i szczep Bm-5 NPV Bombyx mori, i warianty takie można stosować jako wirusa według niniejszego wynalazku, szczególnie do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda.

Jako gospodarzy można również wykorzystywać hodowle komórek roślinnych bawełny, kukurydzy, ziemniaka, soi, petunii, pomidora, i tytoniu.

Jednakże, komórki kręgowców cieszą się większym zainteresowaniem i namnażanie komórek kręgowców w hodowli (hodowli tkankowej) stało się procedurą rutynową. Przykładami użytecznych ssaczych linii komórek gospodarza są linia komórek nerki małpy CVI stransformowanych SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), linia zarodkowej nerki ludzkiej (293 lub komórki 293 subklonowane do wzrostu w hodowli zawiesinowej, Graham i in., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977); komórki nerki noworodka chomika (BHK, ATCC CCL 10), komórki jajnika chomika chińskiego (CHO, Urlaub i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1989)), komórki Sertoli'ego myszy (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1989)); komórki nerki małpiej (CVI, ATCC CCL 70); komórki nerki koczkodana zielonego (VERO-76, ATCC CRL-1587); komórki ludzkiego raka szyjki macicy (HELA, ATCC CCL 2); komórki nerki psa (MDCK, ATCC CCL 34); komórki wątroby szczura rasy Bufallo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ludzkie komórki płuc (W138, ATCC CCL 75); ludzkie komórki wątroby (Hep G2, HB 8065); mysiego raka sutka (MMT 060562, ATCC CCL51); komórki TRI (Mather i in., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); komórki MRC 5; komórki FS4 oraz linia wątrobiaka ludzkiego (Hep G2).

Komórki gospodarza transformuje się opisanymi powyżej wektorami ekspresyjnymi lub klonującymi w celu wytwarzania przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 i hoduje w konwencjonalnych podłożach odżywczych odpowiednio zmodyfikowanych dla indukcji promotorów, selekcji transformantów lub amplifikacji genów kodujących pożądane sekwencje.

(viii) Hodowanie komórek gospodarza

Komórki gospodarza stosowane do wytwarzania skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała według tego wynalazku można hodować w szeregu podłóż. Do hodowli komórek gospodarza odpowiednie są komercjalnie dostępne podłoża, takie jak Ham's F10 (Sigma), Minimal Essentail Medium (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma). Ponadto, jako podłoża hodowlane dla komórek gospodarza można stosować którekolwiek z podłóż opisanych w Ham i in., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes i in., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 lub 5 122 469, międzynarodowych zgłoszeniach patentowych o numerach 90/03430 i 87/00195 lub ponownym wydaniu opisu Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 30 985. Każde z tych podłóż można uzupełniać, jak jest to konieczne, o hormony i czynniki wzrostowe (takie jak insulina, transferyna lub naskórkowy czynnik wzrostowy), sole (takie jak chlorek sodowy, wapń, magnez i fosforan), bufory (takie jak HEPES), nukleotydy (takie jak adenozyna i tymidyna), antybiotyki (takie jak GENTAMYCIN™), pierwiastki śladowe (zdefiniowane jako związki nieorganiczne zazwyczaj obecne w stężeniach końcowych w zakresie mikromolowym) i glukozę bądź równoważne źródło energii. Można również włączyć jakiekolwiek inne konieczne czynniki uzupełniające w odpowiednich stężeniach, które powinny być znane

PL 203 326 B1 specjalistom w tej dziedzinie. Warunki hodowli, takie jak temperatura, pH i podobne, są takie, jak te uprzednio stosowane dla wybranych do ekspresji komórek gospodarza i będą znane specjaliście w tej dziedzinie.

(ix) Oczyszczanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2

Przy stosowaniu technik rekombinacyjnych, przeciwciało może być wytwarzane wewnątrzkomórkowo, w przestrzeni periplazmatycznej lub może być bezpośrednio wydzielane do podłoża. Jeśli przeciwciało jest wytwarzane wewnątrzkomórkowo, na pierwszym etapie usuwa się cząstkowe pozostałości, albo komórki gospodarza albo zlizowane fragmenty, na przykład przez wirowanie lub ultrafiltrację. Carter i in., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisują procedurę izolowania przeciwciał, które są wydzielane do przestrzeni periplazmatycznej E. coli.

Krótko, masę komórkową rozmraża się w obecności octanu sodowego (pH 3,5), EDTA i fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) w ciągu około 30 minut. Pozostałości komórkowe można usunąć przez wirowanie. Jeśli przeciwciało jest wydzielane do podłoża, supernatanty z takich układów ekspresyjnych generalnie najpierw zatęża się stosując komercjalnie dostępny sączek do zatężania białek, na przykład jednostkę do ultrafiltracji Amicon lub Millipore Pellicon. Na każdym z powyższych etapów można włączyć inhibitor proteaz, taki jak PMSF, w celu zahamowania proteolizy oraz antybiotyki w celu zapobiegnięcia wzrostu przypadkowych zanieczyszczeń.

Kompozycję przeciwciała przygotowaną z komórek można oczyszczać stosując, na przykład, chromatografię na hydroksy-apatycie, elektroforezę żelową, dializę i chromatografię powinowactwa, przy czym korzystną techniką jest chromatografia powinowactwa. To, czy białko A jest odpowiednie jako ligand powinowactwa zależy od gatunku i izotypu domeny Fc immunoglobuliny, która jest obecna w przeciwciele. Białko A można stosować do oczyszczania przeciwciał, które oparte są na ludzkich łańcuchach γ1, γ2 lub γ4 (Lindmark i in. , J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Białko G jest zalecane dla wszystkich izotypów mysich oraz ludzkiego γ3 (Guss i in., EMBO J. 5: 1567-1576 (1986)). Złożem, do którego przyłącza się ligand powinowactwa, najczęściej jest agaroza, ale dostępne są inne złoża. Złoża stabilne mechanicznie, takie jak szkło lub poli(styrenodiwinylo)benzen o kontrolowanej wielkości porów, pozwalają na wyższe szybkości przepływu i krótsze czasy obróbki niż możliwe do uzyskania w przypadku agarozy. Jeśli przeciwciało zawiera domenę CH3, do oczyszczania użyteczna jest żywica Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ). Dostępne są również inne techniki oczyszczania białek, takie jak frakcjonowanie na kolumnie jonowymiennej, wytrącanie etanolem, HPL.C z odwróconymi fazami, chromatografia na krzemionce, chromatografia na heparyna-SEPHAROSE™, chromatografia na żywicy aniono- lub kationowymiennej (takiej jak kolumna z kwasem poliaspartylowym), chromatoogniskowanie, SDS-PAGE i wytrącanie siarczanem amonowym, zależnie od odzyskiwanego przeciwciała.

Po jakimkolwiek etapie(ach) oczyszczania, mieszaninę zawierającą przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania i zanieczyszczenia można poddać chromatografii oddziaływań hydrofobowych w niskim pH z zastosowaniem buforu do elucji o pH pomiędzy około 2,5-4,5, korzystnie prowadzonej przy niskim stężeniu soli (np. od około 0 do 0,25 M soli).

IV. Postacie farmaceutyczne

Terapeutyczne postacie przeciwciał stosowanych zgodnie z niniejszym wynalazkiem przygotowuje się do przechowywania przezmieszanie przeciwciałaposiadającego pożądany stopień czystości z ewentualnymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, zaróbkami lub czynnikami stabilizującymi (Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 16, Osol, A., red. (1980)) do uzyskania postaci zliofilizowanych lub roztworów wodnych. Dopuszczalne nośniki, zaróbki lub czynniki stabilizujące są nietoksyczne dla biorców w stosowanych dawkach i stężeniach, i obejmują bufory, takie jak fosforan, cytrynian iinnekwasy organiczne; środki przeciwutleniające, włącznie z kwasem askorbinowym i metionina; środki konserwujące (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamonowy, chlorek heksametoniowy, chlorek benzalkoniowy, chlorek benzotoniowy, fenol, alkochol butylowy lub benzylowy, parabeny alkilowe, takie jak paraben metylowy lub paraben propylowy, katechol, rezorcinol, cykloheksanol, 3-pentanol i m-krezol); niskocząsteczkowe (o długości mniejszej niż 10 reszt) polipeptydy; białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny, polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina lub lizyna, monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany, włącznie z glukozą, mannozą i dekstrynami, czynniki chelatujące, takie jak EDTA, cukry, takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol, przeciwjony tworzące sole, takie jak sodowy; kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko) i/lub niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak TWEEN™, PLURONICS™ lub glikol polietylenowy (PEG).

PL 203 326 B1

Korzystne liofilizowane postacie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym.

Postać według niniejszego wynalazku może również zawierać więcej niż jeden związek aktywny, jak jest to konieczne dla określonego leczonego wskazania, korzystnie związki o uzupełniających się aktywnościach, które nie wpływają niekorzystnie wzajemnie na siebie. Na przykład, może być pożądane dalsze dostarczenie przeciwciał, które wiążą się z EGFR, ErbB2 (np. przeciwciała, które wiąże się z innym epitopem na ErbB2), ErbB3, ErbB4 lub naczyniowym czynnikiem śródbłonkowym (VEGF) w jednym preparacie. Alternatywnie, lub dodatkowo, kompozycja może ponadto zawierać czynnik chemioterapeutyczny, czynnik cytotoksyczny, cytokinę, czynnik hamujący wzrost, czynnik antyhormonalny, lek ukierunkowany na EGFR, czynnik przeciwangiogenny i/lub czynnik chroniący serce. Takie cząsteczki są odpowiednio obecne w kombinacji w ilościach, które są skuteczne pod względem zamierzonego celu.

Składniki aktywne mogą być również uwięzione w mikrokapsułkach, przygotowanych na przykład technikami koacerwacji lub przez polimeryzację międzyfazową, na przykład odpowiednio mikrokapsułkach hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych oraz mikrokapsułkach poli(metylometacylanowych)), w koloidalnych układach dostarczania leków (na przykład liposomach, mikrokuleczkach albuminowych, mikroemulsjach, nanocząstkach i nanokapsułkach) bądź w makroemulsjach. Takie techniki ujawniono w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 16, Osol, A., red. (1980).

Można przygotowywać preparaty o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują zawierające przeciwciało półprzepuszczalne macierze stałych polimerów hydrofobowych, mające postać ukształtowanych artykułów, np. błon, bądź mikrokapsułek. Przykłady macierzy o przedłużonym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele (na przykład poli(2-hydroksyetylometakrylan) lub polialkohol winylowy, polilaktydy (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 3 773 919), kopolimery kwasu L-glutaminowegoi γ-etylo-L-glutaminy, niedegradowalny octan etyleno-winylowy, degradowalne kopolimery kwas mlekowy-kwas glikolowy, takie jak LUPRON DEPOT™ (mikrokuleczki do iniekcji złożone z kopolimeru kwas mlekowy-kwas glikolowy i octanu leuprolidu) oraz kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy.

Postacie przeznaczone do podawania in vivo muszą być jałowe. Osiąga się to w prosty sposób przez sączenie przez membrany do wyjaławiania przez sączenie.

V. Leczenie przeciwciałami skierowanymi przeciw ErbB2

Uważa się, że zgodnie z niniejszym wynalazkiem, przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 można stosować do leczenia różnych chorób lub zaburzeń. Przykładowe stany lub zaburzenia obejmują nowotwory łagodne i złośliwe, białaczki i nowotwory złośliwe tkanki limfatycznej, inne zaburzenia, takie jak zaburzenia neuronalne, neuroglejowe, astrocytarne, podwzgórzowe, gruczołowe, makrofagowe, nabłonkowe, zrębowe, blastoceliczne, zapalne,angiogenne i immunologiczne.

Generalnie, chorobą lub zaburzeniem, które będzie leczone jest rak. Przykłady raka, który będzie leczony według niniejszego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do raka, chłoniaka, blastomy, mięsaka i białaczki lub nowotworu złośliwego tkanki limfatycznej. Bardziej szczegółowo przykłady takich raków obejmują raka płaskokomórkowego (np. raka płaskonabłonkowego), raka płuc, włącznie z drobnokomórkowym rakiem płuc, rakiem nie-drobnokomórkowym płuc, gruczolakorakiem płuc i rakiem płaskokomórkowym płuc, raka otrzewnej, raka wątrobowo-komórkowego, raka żołądka, włącznie z rakiem żołądkowo-jelitowym, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajników, raka wątroby, raka pęcherza moczowego, wątrobiaka, raka sutka, raka okrężnicy, raka odbytnicy, raka okrężnicy i odbytnicy, raka śluzówki macicy lub macicy, raka gruczołów ślinowych, raka nerek, raka gruczołu krokowego, raka sromu, raka tarczycy, raka wątroby, raka odbytu, raka prącia, jak również raka głowy i szyi.

Rak będzie generalnie zawierał komórki, w których zachodzi ekspresja ErbB2, tak że skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało według niniejszego wynalazku jest zdolne do wiązania się z rakiem.

O ile rak może charakteryzować się nadekspresją receptora ErbB2, niniejsze zgłoszenie zapewnia ponadto sposób leczenia raka, którego nie uważa się za raka, w którym zachodzi nadekspresją ErbB2. Do określania ekspresji ErbB2 w raku dostępne są różne oznaczenia diagnostyczne/pro-gnostyczne. W jednym rozwiązaniu nadekspresję ErbB2 można analizować przez IHC, np. stosując HERCEPTEST^® (Dako). Zatopione w parafinie skrawki tkankowe z bioptatu nowotworu można poddawać oznaczeniu IHC i przyjęto następujące kryteria intensywności wybarwiania białka ErbB2:

PL 203 326 B1

Ocena 0

Nie obserwuje się wybarwiania lub obserwuje się wybarwianie błon w mniej niż 10% komórek nowotworowych.

Ocena 1+ wykrywa sięsłabe/ledwo dostrzegalne wybarwianie błon w więcejniż 10% komórek nowotworowych. Wybarwiana jest tylko część błony komórek.

Ocena 2+ obserwujesięsłabe do umiarkowanego wybarwianie całych błon w więcej niż 10% komórek nowotworowych.

Ocena 3+ obserwuje się umiarkowane do silnego wybarwianie całych błon w więcej niż 10% komórek nowotworowych.

Nowotwory o ocenie od 0 do 1+ pod względem nadekspresji ErbB2 można charakteryzować jako nie wykazujące nadekspresji ErbB2, podczas gdy nowotwory o ocenie od 2+ do 3+ można charakteryzować jako wykazujące nadekspresję ErbB2.

Alternatywnie, lub dodatkowo, można przeprowadzić oznaczenia FISH, takie jak INFORM™ (sprzedawane przez Ventana, Arizona) lub PATHVISION™ (Vysis, Illinois) na utrwalonej formaliną, zatopionej w parafinie tkance nowotworu w celu określenia stopnia (jeśli w ogóle jest) nadekspresji ErbB2 w nowotworze.

W jednym rozwiązaniu, rakiem będzie rak, w którym zachodzi ekspresja (a może zachodzić nadekspresją) EGFR. Przykłady raków, w których może zachodzić ekspresja/nadekspresja EGFR obejmują raka płaskokomórkowego (np. raka płaskonabłonkowego), raka płuc, włącznie z rakiemdrobnokomórkowym, rakiem nie-drobnokomórkowym płuc, gruczolakorakiem płuc i rakiem płaskokomórkowym płuc, raka otrzewnej, raka wątrobowo-komórkowego, raka żołądka, włącznie z rakiem żołądkowo-jelitowym, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajników, raka wątroby, raka pęcherza moczowego, wątrobiaka, raka sutka, raka okrężnicy, raka odbytnicy, raka okrężnicy i odbytnicy, raka śluzówki macicy lub macicy, raka gruczołów ślinowych, raka nerek, raka gruczołu krokowego, raka sromu, raka tarczycy, raka wątroby, raka odbytu, raka prącia, jak również raka głowy i szyi.

Rakiem leczonym według niniejszego wynalazku może być rak charakteryzujący się nadmierną aktywacją receptora ErbB, np. EGFR. Taka nadmierna aktywacja może być spowodowana nadekspresją lub zwiększonym wytwarzaniem receptora ErbB lub liganda ErbB. W jednym rozwiązaniu wynalazku, można przeprowadzić oznaczenie diagnostyczne lub prognostyczne w celu określenia, czy rak pacjenta charakteryzuje się nadmierną aktywacją receptora ErbB. Na przykład, można określić amplifikację genu ErbB i/lub nadekspresję receptora ErbB. W nauce dostępne są różne oznaczenia do określania takiej amplifikacji/nadekspresji i obejmują one opisane powyżej oznaczenia IHC, FISH i złuszczania antygenu. Alternatywnie, lub dodatkowo, zgodnie ze znanymi procedurami można określać poziomy liganda ErbB, takiego jak TGF-α, w lub związanego z nowotworem. Takie oznaczenia mogą wykrywać białko lub kodujący je kwas nukleinowy w testowanej próbce. W jednym rozwiązaniu, poziomy liganda ErbB w nowotworze można określać stosując immunohistochemię (IHC); patrz, na przykład, Scher i in., Clin. Cancer Research 1: 545-550 (1995). Alternatywnie, lub dodatkowo, można oceniać poziomy kodującego ligand ErbB kwasu nukleinowego w testowanej próbce, np. technikami FISH, blottingu Southerna lub PCR.

Ponadto, ponadto, nadekspresję lub amplifikację receptora ErbB lub liganda ErbB można oceniać stosując oznaczenie diagnostyczne in vivo, np. przez podawanie cząsteczki (takiej jak przeciwciało), która wiąże się z cząsteczką mającą być wykrywaną i jest wyznakowana wykrywalnym znacznikiem (np. izotopem promieniotwórczym) oraz przez zewnętrzne badanie pacjenta pod względem lokalizacji znacznika.

Jeśli rakiem, który ma być leczony, jest rak niezależny od hormonów, ekspresję hormonu (np. androgenu) i/lub jego odpowiedniego receptora w nowotworze można oceniać stosując którekolwiek z różnych dostępnych oznaczeń, np. jak opisano powyżej. Alternatywnie, lub dodatkowo, pacjenta można diagnozować jako posiadającego raka niezależnego od hormonów dzięki temu, że nie odpowiada on dłużej na terapię antyandrogenami.

W niektórych rozwiązaniach, pacjentowi podaje się immunokoniugat zawierający przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym. Korzystnie, immunokoniugat i/lub białko ErbB2, z którym się on wiążę, ulega/ulegają internalizacji do komórki, czego wynikiem jest zwiększona skuteczność terapeutyczna immunokoniugatu pod względem zabijania komórek rako40

PL 203 326 B1 wych, z którymi się on wiąże. W korzystnym rozwiązaniu, czynnik cytotoksyczny ukierunkowany jest wobec kwasu nukleinowego w komórce rakowej lub zakłóca jego działanie. Przykłady takich czynników cytotoksycznych obejmują maytanzynoidy, kalicheamicyny, rybonukleazy i endonukleazy DNA.

Skierowane przeciw ErbB2 przeciwciała lub immunokoniugaty podaje się pacjentowi będącemu człowiekiem zgodnie ze znanymi metodami, takimi jak podawanie dożylne, np. jako szybkie wstrzyknięcie lub przez ciągłą infuzję w ciągu dłuższego czasu lub drogą domięśniową, dootrzewnową, domózgowo-rdzeniową, podskórną, dostawową, domaziówkową, doosłonkową, doustną, miejscową lub inhalacyjną. Korzystne jest podawanie dożylne lub podskórne.

Z podawaniem przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 można łączyć inne reżimy terapeutyczne. Łączone podawanie obejmuje jednoczesne podawanie z zastosowaniem oddzielnych postaci lub pojedynczej postaci farmaceutycznej, oraz kolejne podawanie w dowolnej kolejności, przy czym korzystnie występuje okres, podczas którego oba (lub wszystkie) czynniki aktywne jednocześnie wywierają swoje aktywności biologiczne.

W korzystnym rozwiązaniu, pacjentaleczy się dwoma różnymi przeciwciałami skierowanymi przeciw ErbB2. Na przykład, pacjenta można leczyć pierwszym przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2, które blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand lub przeciwciałem posiadającym biologiczne właściwości monoklonalnego przeciwciała 2C4, jak również drugim przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2, które jest przeciwciałem hamującym wzrost (np. HERCEPTIN^®), lub skierowanym przeciw ErbB2 przeciwciałem, które indukuje apoptozę komórek, w których zachodzi nadekspresja ErbB2 (np. 7C2, 7F3 lub ich humanizowanymi wariantami). Korzystnie, wynikiem takiej terapii kombinowanej jest synergistyczny wpływ terapeutyczny. Można, na przykład, leczyć pacjenta HERCEPTIN^®, a następnie leczyć rhuMAb 2C4, np. jeśli pacjent nie odpowiada na terapię HERCEPTIN^®. W innym rozwiązaniu, pacjenta można najpierw leczyć rhuMAb 2C4, a następnie stosować terapię HERCEPTIN^®. W jeszcze dalszym rozwiązaniu, pacjenta można leczyć jednocześnie rhuMAb 2C4 i HERCEPTIN^®.

Może być również pożądane łączne podawanie przeciwciała lub przeciwciał skierowanego(nych) ErbB2, z podawaniem przeciwciała skierowanego przeciw innemu antygenowi związanemu z nowotworem. Inne przeciwciało w tym przypadku może wiązać się, na przykład, z EGFR, ErbB3, ErbB4 lub naczyniowym śród-błonkowym czynnikiem wzrostowym (VEGF).

W jednym rozwiązaniu, leczenie według niniejszego wynalazku obejmuje łączne podawanie przeciwciała (lub przeciwciał) skierowanego przeciw ErbB2 i jednego lub więcej czynników chemioterapeutycznych lub czynników hamujących wzrost, włącznie z jednoczesnym podawaniem koktajli różnych czynników chemioterapeutycznych. Korzystne czynniki chemioterapeu-tyczne obejmują taksany (takie jak paklitaksel i docetaksel) i/lub antybiotyki antracyklinowe. Preparaty i schematy dawkowania takich czynników chemioterapeutycznych można stosować zgodnie z instrukcjami producentów lub jak określi empirycznie praktyk w tej dziedzinie. Preparaty i schematy dawkowania takiej chemioterapii opisano również w Chemotherapy Service, red. M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1992).

Przeciwciało można łączyć ze związkiem antyhormonalnym, np. związkiem antyestrogennym, takim jak tamoksyfen, antyprogesteronem, takim jak onapriston (patrz europejski opis patentowy numer 616 812) lub antyandrogenem, takim jak flutamid, w dawkach znanych dla takich cząsteczek. Jeśli rakiem, który ma być leczony, jest rak niezależny od hormonów, pacjenta można wcześniej poddawać terapii antyhormonalnej, a po tym, jak rak stanie się niezależny od hormonu, pacjentowi można podawać przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 (i ewentualnie inne czynniki,jak opisano w niniejszym opisie).

Niekiedy korzystne może być również jednoczesne podawanie pacjentowi czynnika chroniącego serce (dla zapobiegania lub zmniejszania dysfunkcji mięśnia sercowego związanej z terapią, bądź jednej lub więcej cytokin. Można również jednocześnie podawać lek ukierunkowany na EGFR lub czynnik przeciwangiogenny. Poza powyższymi reżimami terapeutycznymi, pacjenta można również poddać chirurgicznemu usunięciu komórek rakowych i/lub radioterapii.

Skierowane przeciw ErbB2 przeciwciała według niniejszego wynalazku można również łączyć z lekiem ukierunkowanym na EGFR, takim jak te dyskutowane powyżej w części Definicje, uzyskując uzupełniający, a potencjalnie synergistyczny, wpływ terapeutyczny.

Odpowiednie dawkowanie dla każdego z powyższych jednocześnie podawanych czynników jest takie jak obecnie stosowane, a można je zmniejszać z powodu łącznego działania (synergii) czynnika i przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2.

PL 203 326 B1

Odpowiednie dawkowanie przeciwciała do zapobiegania lub leczenia choroby zależeć będzie od rodzaju leczonej choroby, jak zdefiniowano powyżej, ciężkości i przebiegu choroby, tego, czy przeciwciało podaje się w celach zapobiegawczych, czy leczniczych, wcześniejszego leczenia, historii klinicznej pacjenta i odpowiedzi na przeciwciało oraz od uznania lekarza prowadzącego. Przeciwciało odpowiednio podaje się pacjentowi w toku leczenia raz lub w seriach. Zależnie od rodzaju i ciężkości choroby, początkową proponowaną dawką do podawania pacjentowi jest około od 1 μg/kg do 15 mg/kg (np. 0,1 mg/kg 20 mg/kg) przeciwciała, zależnie od tego, na przykład, czy będzie to jedno czy więcej oddzielnych podań, czy też podawanie przez ciągłą infuzję. Typowa dawka dzienna może pozostawać w zakresie od około 1 μg/kg do 100 mg/kg lub więcej, zależnie od wymienionych powyżej czynników. Dla podawań powtarzanych w ciągu kilku dni lub dłużej, zależnie od stanu, leczenie kontynuuje się do wystąpienia pożądanego zahamowania objawów choroby. Korzystne dawkowanie przeciwciała pozostawać będzie w zakresie od około 0,05 mg/kg do około 10 mg/kg. A zatem, pacjentowi można podawać jedną lub więcej dawek wynoszących około 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg lub 10 mg/kg (lub jakąkolwiek ich kombinację). Takie dawki można podawać w sposób przerywany, np. co tydzień lub co trzy tygodnie (np. tak, że pacjent otrzymuje od około dwóch do około dwudziestu, np. około sześciu dawek przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2). Można podawać początkowo wyższą dawkę uderzeniową, a następnie jedną lub więcej niższych dawek. Przykładowy schemat dawkowania obejmuje podawanie początkowo dawki uderzeniowej około 4 mg/kg, a następnie co tydzień dawki podtrzymującej około 2 mg/kg przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2. Jednakże, użyteczne mogą być inne schematy dawkowania. Postęp tej terapii łatwo monitoruje się stosując konwencjonalne techniki i oznaczenia.

Poza podawaniem białka przeciwciała pacjentowi, w niniejszym zgłoszeniu rozważa się podawanie przeciwciała przez terapię genową. Takie podawanie kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało jest objęte wyrażeniem podawanie skutecznej terapeutycznie ilości przeciwciała. Patrz, na przykład, międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 96/07321, opublikowany 14 marca 1996 r., dotyczący stosowania terapii genowej do tworzenia wewnątrzkomórkowych przeciwciał.

Istnieją dwa główne podejścia do podawania kwasu nukleinowego (ewentualnie zawartego w wektorze) do komórek pacjenta: in vivo i ex vivo. Dla dostarczenia in vivo, kwas nukleinowy wstrzykuje się bezpośrednio pacjentowi, zazwyczaj w miejscu, w którym wymagane jest przeciwciało. Dla traktowania ex vivo, usuwa się komórki pacjenta, do tych wyizolowanych komórek wprowadza się kwas nukleinowy i zmodyfikowane komórki podaje się pacjentowi albo bezpośrednio, albo, na przykład, zakapsułkowane w porowatych membranach, które wszczepia się pacjentowi (patrz np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 892 538 i 5 283 187). Istnieją różne dostępne techniki wprowadzania kwasów nukleinowych do zdolnych do życia komórek. Techniki różnią się zależnie od tego, czy kwas nukleinowy przenosi się do hodowanych komórek in vitro, czy in vivo w komórkach zamierzonego gospodarza. Techniki odpowiednie do przenoszenia kwasu nukleinowego do komórek ssaków in vitro obejmują stosowanie liposomów, elektroporacji, mikroiniekcji, fuzji komórkowej, DEAE-dekstranu, metody wytrącania fosforanem wapniowym itd. Wektorem powszechnie stosowanym do dostarczania genów ex vivo jest retrowirus.

Obecnie korzystne techniki przenoszenia kwasów nukleinowych in vivo obejmują transfekcję wektorami wirusowymi (takimi jak adenowirus, wirus opryszczki I lub wirus towarzyszący adenowirusom) i układy oparte na lipidach (użytecznymi lipidami do przenoszenia genu za pośrednictwem lipidów są na przykład DOTMA, DOPE i DC-Chol). W niektórych sytuacjach pożądane jest dostarczenie źródła kwasu nukleinowego z czynnikiem, który kieruje do komórek docelowych, takim jak przeciwciało specyficzne wobec białka błony powierzchniowej komórek docelowych, ligand receptora na komórkach docelowych itd. Jeśli wykorzystuje się liposomy, do kierowania i/lub ułatwiania pobierania można stosować białka, które wiążą się z białkiem błony powierzchniowej komórek związanym z endocytozą, np. białka kapsydu lub ich fragmenty wykazujące tropizm wobec określonego rodzaju komórek, przeciwciała skierowane przeciw białkom, które ulegają internalizacji w cyklu działania oraz białka, które kierują do położenia wewnątrzkomórkowego i wydłużają wewnątrzkomórkowy okres półtrwania. Technikę endocytozy zależnej od receptora opisali, na przykład, Wu i in., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987) i Wagner i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990). Dla zapoznania się z przeglądem znanych obecnie protokołów znakowania genów i terapii genowej patrz Anderson i in., Science 256: 808-813 (1992). Patrz także międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer 93/25673 i cytowane w nim odnośniki.

PL 203 326 B1

VI. Wyroby

Wynalazek pozwala na utworzenie wyrobu zawierającego materiały użyteczne do leczenia opisanych zaburzeń. Wyrób obejmuje pojemnik i etykietę lub ulotkę informacyjną na lub dołączoną do pojemnika. Odpowiednie pojemniki obejmują, na przykład, butelki, fiolki, strzykawki itp. Pojemniki mogą być utworzone z różnych materiałów, takich jak szkło lub plastik. Pojemnik zawiera kompozycję, która jest skuteczna w leczeniu stanu chorobowego i może posiadać jałowe miejsce dostępu (na przykład pojemnikiem może być worek z roztworem do podawania dożylnego lub fiolka z korkiem, który można przebić igłę do iniekcji podskórnej). Co najmniej jednym czynnikiem aktywnym w kompozycji jest przeciwciało skierowane przeciw ErbB2. Etykieta lub ulotka informacyjna wskazuje, że kompozycję stosuje się do leczenia wybranego stanu, takiego jak rak. W jednym rozwiązaniu, etykieta lub ulotka informacyjna wskazuje, że kompozycję zawierającą przeciwciało wiążące się z ErbB2 można stosować do leczenia raka, w którym zachodzi ekspresja receptora ErbB wybranego z grupy składającej się z receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGFR), ErbB3 i ErbB4, korzystnie EGFR. Ponadto, etykieta lub ulotka informacyjna może wskazywać, że pacjentem, który może być leczony jest pacjent posiadający raka charakteryzującego się nadmierną aktywacją receptora ErbB wybranego spośród EGFR, ErbB3 lub ErbB4. Na przykład, rakiem może być rak, w którym zachodzi nadekspresją tych receptorów i/lub w którym zachodzi nadekspresją liganda ErbB (takiego jak TGF-α). Etykieta lub ulotka informacyjna może również wskazywać, że kompozycję można stosować do leczenia raka, który nie charakteryzuje się nadekspresją receptora ErbB2. Na przykład, podczas gdy ulotka informacyjna dla HERCEPTIN^® wskazuje, że przeciwciało stosuje się do leczenia pacjentów z przerzutowym rakiem sutka, w nowotworach których zachodzi nadekspresją białka ErbB2, ulotka informacyjna według niniejszego wynalazku może wskazywać, że przeciwciało lub kompozycję stosuje się do leczenia raka bez względu na stopień nadekspresji ErbB2. W innych rozwiązaniach, ulotka informacyjna może wskazywać, że przeciwciało lub kompozycję można stosować do leczenia raka sutka (na przykład przerzutowego raka sutka), raka niezależnego od hormonu, raka gruczołu krokowego (np. niezależnego od androgenów raka gruczołu krokowego), raka płuc (np. nie-drobnokomórkowego raka płuc), raka okrężnicy, raka odbytnicy lub raka okrężnicy i odbytnicy, bądź którejkolwiek z innych chorób lub zaburzeń ujawnionych w niniejszym opisie. Ponadto, wyrób może zawierać (a) pierwszy pojemnik z zawartą w nim kompozycją, gdzie kompozycja zawiera pierwsze przeciwciało, które wiąże się z ErbB2 i hamuje wzrost komórek rakowych, w których zachodzi nadekspresją ErbB2, oraz (b) drugi pojemnik z zawartą w nim kompozycją, gdzie kompozycja zawiera drugie przeciwciało, które wiąże się z ErbB2 i blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand. Wyrób w tym rozwiązaniu wynalazku może ponadto zawierać ulotkę informacyjną wskazującą, że kompozycje pierwszego i drugiego przeciwciała można stosować do leczenia raka. Ponadto, ulotka informacyjna może zawierać instrukcję dla użytkownika kompozycji (zawierającej przeciwciało, które wiąże ErbB2 i blokuje aktywację receptora ErbB przez ligand) dotyczącą terapii kombinowanej z przeciwciałem i którąkolwiek z terapii pomocniczych opisanych w poprzednich częściach (np. czynnikiem chemioterapeutycznym, lekiem ukierunkowanym na EGFR, czynnikiem przeciwangiogennym, związkiem antyhormonalnym, czynnikiem chroniącym serce i/lub cytokiną). Alternatywnie, lub dodatkowo, wyrób może ponadto zawierać drugi (lub trzeci) pojemnik, zawierający farmaceutycznie dopuszczalny bufor, taki jak bakteriostatyczną wodę do iniekcji (BWFI), sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanami, roztwór Ringera i roztwór dekstrozy. Może on ponadto obejmować inne materiały pożądane z punktu widzenia komercjalnego lub użytkownika, obejmujące inne bufory, rozcieńczalniki, sączki, igły i strzykawki.

VII. Nieterapeutyczne zastosowania przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2

Przeciwciała (np. humanizowane przeciwciała skierowane przeciw ErbB2) posiadają ponadto zastosowania nieterapeutyczne.

Na przykład, przeciwciała można stosować jako czynniki do oczyszczania na zasadzie powinowactwa. W tym sposobie, przeciwciała immobilizuje się na fazie stałej, takiej jak żywica Sephadex lub bibuła filtracyjna, stosując metody znane w tej dziedzinie. Immobilizowane przeciwciało kontaktuje się z próbką zawierającą przeznaczone do oczyszczania białko przeciw ErbB2 (lub jego fragment), a następnie nośnik przemywa się odpowiednim rozpuszczalnikiem, który będzie usuwać zasadniczo cały materiał z próbki, z wyjątkiem białka ErbB2, które jest związane z immobilizowanym przeciwciałem. Wreszcie, nośnik przemywa się innym odpowiednim rozpuszczalnikiem, takim jak bufor glicynowy o pH 5,0, który będzie uwalniał białko ErbB2 z przeciwciała.

Przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 mogą również być użyteczne w diagnostycznych oznaczeniach białka ErbB2, np. wykrywaniu jego ekspresji w określonych komórkach, tkankach lub surowicy.

PL 203 326 B1

Do zastosowań diagnostycznych, przeciwciało zazwyczaj wyznakowane będzie wykrywalną grupą. Dostępne są liczne znaczniki, które można generalnie podzielić na następujące kategorie:

(a) Izotopy promieniotwórcze, takie jak ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H i ¹³¹I. Przeciwciało można znakować izotopem promieniotwórczym stosując techniki opisane na przykład w Current Protocols in Immunology, tomy 1 i 2, Coligen i in., red., Wiley-Interscience, Nowy Jork, Nowy Jork (1991), a promieniotwórczość można mierzyć stosując licznik scyntylacyjny.

(b) Znaczniki fluorescencyjne, takie jak chelaty metali ziem rzadkich (chelaty europu) lub fluoresceinę i jej pochodne, rodaminę i jej pochodne, dansyl, Lissamine, fikoerytrynę i Texas Red. Znaczniki fluorescencyjne można koniugować z przeciwciałem stosując na techniki ujawnione na przykład w Current Protocols in Immunology, supra. Fluorescencję można ilościowo mierzyć stosując fluorymetr.

(c) Dostępne są różne znaczniki enzym-substrat i przegląd niektórych z nich zapewnia opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amerykinumer 4 275 149. Enzym generalnie katalizuje chemiczną zmianę substratu chromogennego, którą można mierzyć stosując różne techniki. Na przykład, enzym może katalizować zmianę barwy substratu, którą można mierzyć spektrofotometrycznie. Alternatywnie, enzym może zmieniać fluorescencję lub chemiluminescencję substratu. Techniki ilościowego pomiaru zmiany fluorescencji opisano powyżej. Substrat chemiluminescencyjny staje się elektronowo wzbudzony przez reakcję chemiczną, a następnie może emitować światło, które można mierzyć (stosując na przykład chemiluminometr) lub dostarcza energię akceptorowi fluorescencyjnemu. Przykłady znaczników enzymatycznych obejmują lucyferazy (np. lucyferazę świetlika lub lucyferazę bakteryjną; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 737 456), lucyferynę, 2,3-dihydroftalazynodiony, dehydrogenazę jabłczanową, ureazę, peroksydazę, taką jak peroksydaza chrzanu (HRPO), fosfatazę alkaliczną, β-galaktozydazę, glukoamylazę, lizozym, oksydazy sacharydów (np. oksydazę glukozową, oksydazę galaktozową i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanowa), oksydazy związków heterocyklicznych (takie jak urikaza i oksydaza ksantynowa), laktoperoksydazę, mikroperoksydazę i podobne. Techniki koniugowania enzymów z przeciwciałami opisano w O'Sullivan i in. , Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, w: Methods in Enzym. (red. J. Langone i H. Van Vunakis), Academic Press, Nowy Jork, 73: 147-166 (1981).

Przykłady kombinacji enzym-substrat obejmują na przykład:

(i) peroksydazę chrzanu (HRPO) z nadtlenkiem wodoru jako substratem, gdzie nadtlenek wodoru utlenia prekursor barwnika (np. diaminę ortofenylenową (OPD) lub chlorowodorek 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny(TMB);

(ii) alkaliczną fosfatazę (AP) z paranitrofenylofosforanem jako substratem chromogennym oraz (iii) β-D-galaktozydazę (β-D-Gal) z chromogennym substratem (np. p-nitrofenylo-e-D-galaktozydem lub fluorogennym substratem 4-metyloumbeliferylo-e-D-galaktozydem.

Dla specjalistów w tej dziedzinie dostępne są liczne inne kombinacje enzym-substrat. Dla zapoznania się z ogólnym przeglądem patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 275149 i 4 318 980.

Niekiedy znacznik koniuguje się pośrednio z przeciwciałem. Specjalista w tej dziedzinie będzie świadomy różnych technik, jakimi można to uzyskać. Na przykład, przeciwciało można koniugować z biotyną, a z awidyną można skoniugować którykolwiek ze znaczników z trzech wymienionych powyżej szerokich kategorii, bądź vice versa. Biotyna selektywnie wiąże się z awidyną, a zatem znacznik może być skoniugowany z przeciwciałem w ten pośredni sposób. Alternatywnie, dla uzyskania pośredniej koniugacji znacznika z przeciwciałem, przeciwciało koniuguje się z małym haptenem (np. digoksyną) a jeden z wymienionych powyżej znaczników różnego typu koniugować z przeciwciałem skierowanym przeciw haptenowi (np. przeciwciałem skierowanym przeciw digoksynie). A zatem, można uzyskać pośrednią koniugację znacznika z przeciwciałem.

W innym rozwiązaniu wynalazku, skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało nie musi być wyznakowane, a jego obecność można wykrywać stosując wyznakowane przeciwciało, które wiąże się z przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku można wykorzystywać w jakiejkolwiek znanej metodzie oznaczenia, takiej jak oznaczenia wiązania współzawodniczego, bezpośredniego i pośredniego oznaczenia typu sandwich i oznaczenia immunoprecypitacji. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, str. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Próbka nowotworu do immunocytochemii może być próbką świeżą lub mrożoną lub może być zatopiona w parafinie i utrwalona środkiem konserwującym, takim jak na przykład formalina.

PL 203 326 B1

Przeciwciała można również stosować w oznaczeniach diagnostycznych in vivo. Generalnie, przeciwciało znakuje się nuklidem promieniotwórczym (takim jak ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³H, ³²P lub ³⁵S), tak że nowotwór można zlokalizować stosując immunoscyntygrafię. Dla ułatwienia, przeciwciała według niniejszego wynalazku można dostarczać w zestawie, tj. opakowanym zestawie odczynników w uprzednio określonych ilościach z instrukcjami przeprowadzania oznaczenia diagnostycznego. Jeśli przeciwciało zostało wyznakowane enzymem, zestaw będzie zawierał substraty i kofaktory wymagane przez enzym (np. prekursor substratu, który zapewnia wykrywalny chromofor lub fluorofor). Ponadto, można włączyć inne dodatki, takie jak czynniki stabilizujące, bufory (np. bufor blokujący lub bufor lizujący) i podobne. Względna ilość różnych odczynników może być szeroko zróżnicowana dla zapewnienia stężeń odczynników w roztworze, które zasadniczo optymalizują czułość oznaczenia. W szczególności, odczynniki można dostarczać jako suche proszki, zazwyczaj liofilizowane, włącznie z zaróbkami, które po rozpuszczeniu zapewniać będą posiadający właściwe stężenie roztwór odczynników.

VIII. Depozyt materiałów poniższe linie komórek hybrydom zdeponowano w American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas,VA 20110--2209,Stany Zjednoczone Ameryki (ATCC):

Oznaczenie	Numer ATCC	Data depozytu
Przeciwciała
7C2	ATCC HB-12215	17 października 1996 r.
7F3	ATCC HB-12216	17 października 1996 r.
4D5	ATCC CRL 10464	24 maja 1990 r.
2C4	ATCC HB-12697	8 kwietnia 1999 r.

Dalsze szczegóły wynalazku zilustrowano poniższymi nie-ograniczającymi Przykładami. Ujawnienia wszystkich cytowań w opisie formalnie włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie i charakteryzowanie monoklonalnego przeciwciała 2C4

Mysie przeciwciała monoklonalne 2C4, 7F3 i 4D5, które specyficznie wiążą się z zewnątrzkomórkową domeną ErbB2, utworzono w sposób opisany w Fendly i in., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990). Krótko, komórki NIH 3T3/HER2-3400 (w których zachodzi ekspresja około 1 x 10⁵ cząsteczek ErbB2/komórkę) otrzymane jak opisano w Hudziak i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 7158-7163 (1987) zebrano stosując sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 25 mM EDTA i zastosowano do immunizacji myszy BALB/c. Myszy otrzymywały dootrzewnowe iniekcje 10⁷ komórek w 0,5 ml PBS w tygodniach 0, 2, 5 i 7. Myszy o antysurowicach, które immunoprecypitowały wyznakowane ³²P ErbB2, otrzymywały dootrzewnowe iniekcje ekstraktu błonowego ErbB2 oczyszczanego na Sepharose z immobiliozowaną aglutyniną kiełków pszenicy (WBA) w tygodniach 9 i 13. Następnie stosowano dożylne iniekcje 0,1 ml preparatu ErbB2 i limfocyty śledzionowe poddawano fuzji z linią X63-Ag8.633 szpiczaka mysiego.

Supernatanty hybrydom przeszukiwano pod kątem wiązania ErbB2 przez ELISA i radioimmunoprecypitację.

Epitopy ErbB2 wiązane przez monoklonalne przeciwciała 4D5, 7F3 i 2C4 określono przez analizę współzawodniczego wiązania (Fendly i in., Cancer Research 50: 1550-1558 (1990)). Badania krzyżowego blokowania przeprowadzono na przeciwciałach przez bezpośrednią fluorescencję nienaruszonych komórek stosując PANDEX™ Screen Malachite do ilościowej oceny fluorescencji. Każde z przeciwciał monoklonalnych skoniugowano z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) stosując ustalone procedury (Wofsy i in., Selected Methods in Cellular Immunology, str. 287, Mishel i Schiigi (red.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)). Spójne monowarstwy komórek NIH 3T3/HER2-3400 traktowano trypsyną, raz przemywano i ponownie zawieszano z gęstością 1,75 x 10⁶ komórek/ml w zimnej PBS zawierającej 0,5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% NaN3. Dla zmniejszenia się zatykania membran płytek PANDEX™ dodawano cząstki lateksowe (IDC, Portland, OR) do 1% stężenia końcowego. Komórki w zawiesinie, 20 μ], oraz 20 μl oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych (od 100 μg/ml do 0,1 μg/ml) dodawano do studzienek płytki PANDEX™ i inkubowano na lodzie w ciągu 30 minut. Do każdej studzienki dodawano wstępnie określone rozcieńczenie wyznakowanych FITC przeciwciał monoklonalnych o objętości 20 μ!, inkubowano w ciągu 30 minut, przemywano i fluorescencję określano ilościowo stosując PANDEX™. Przeciwciała monoklonalne uważano za dzielące wspólny epitop, jeśli blokowały swoje wzajemne wiązanie o 50% lub więcej w porównaniu z monoklonalnym przePL 203 326 B1 ciwciałem kontrolnym. W doświadczeniu tym monoklonalne przeciwciała 4D5, 7F3 i 2C4 przypisano odpowiednio epitopom I,G/F i F.

Hamujące wzrost właściwości monoklonalnych przeciwciał 2C4, 7F3 i 4D5 oceniano stosując linię komórek nowotworu sutka, SK-BR-3 (patrz Hudziak i in., Molec. Cell.. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989)). Krótko, komórki SK-BR-3 odłączano od podłoża stosując 0,25% (v/v) trypsynę i zawieszano w kompletnym podłożu z gęstością 4 x 10⁵ komórek na ml. Objętości 100 μl (4 x 10⁴ komórek) wysiewano w 96-studzienkowych płytkach do mikrorozcieńczeń, umożliwiano adhezję komórek, a następnie dodawano 100 μl samego podłoża lub podłoża zawierającego przeciwciało monoklonalne (stężenie końcowe 5 μg/ml). Po 72 godzinach płytki dwukrotnie przemywano PBS (pH 7,5), wybarwiano fioletem krystalicznym (0,5% w metanolu) i analizowano pod względem względnej proliferacji komórek w sposób opisany w Sugarman i in., Science, 230: 943-945 (1985). Przeciwciała monoklonalne 2C4 i 7F3 hamowały względną proliferację komórek SK-BR-3 o odpowiednio około 20% i około 30% w porównaniu z około 56% hamowaniem uzyskanym dla monoklonalnego przeciwciała 4D5.

Monoklonalne przeciwciała 2C4, 4D5 i 7F3 oceniano pod kątem ich zdolności do hamowania stymulowanej HRG fosforylacji tyrozyny białek o Mr w zakresie 180 000 z pełnokomórkowych lizatów komórek MCF7 (Lewis i in., Cancer Research 56: 1457-1465 (1996)). Donoszono, że w komórkach MCF7 zachodzi ekspresja wszystkich znanych receptorów ErbB, ale na stosunkowo niskich poziomach, ponieważ ErbB2, ErbB3 i ErbB4 posiadają prawie identyczne wielkości cząsteczek, nie jest możliwe rozróżnienie, którego białka tyrozyny ulegały fosforylacji, gdy pełnokomórkowe lizaty oceniano stosując analizę przez blotting typu Western.

Jednakże, komórki te są idealne do oznaczeń stymulowanej HRG fosforylacji tyrozyn, ponieważ w stosowanych warunkach oznaczenia, w nieobecności egzogennie dodawanej HRG, wykazują one tylko niskie lub niewykrywalne poziomy fosforylacji tyrozyn białek o Mr w zakresie 180 000.

Komórki MCF7 wysiewano w 24-studzienkowych płytkach, do każdej studzienki dodawano skierowane przeciw ErbB2 przeciwciała monoklonalne i inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturzepokojowej. Następniedokażdejstudzienki dodawano rHRGe1 _177-244 do 0,2 nM stężenia końcowego i inkubację kontynuowano w ciągu 8 minut. Z każdej studzienki ostrożnie odsysano podłoże i reakcję zatrzymywano przez dodanie 100 μl buforu do próbek z SDS (5% SDS, 25 mM DTT i 25 mM Tris-HCl, pH 6,8). Każdą próbkę (25 μl poddawano elektroforezie w żelu o gradiencie 4-12% (Novex), a następnie elektroforetycznie przenoszono na membranę z polifluorku winylidenu. Immunobloty wywoływano stosując przeciwciało skierowane przeciw fosfotyrozynie (4G10, z UBI, stosowane w stężeniu 1 (jig/ml) i intensywność głównego reaktywnego prążka o Mr około 180 000 ilościowo oceniano przez densytometrię w świetle odbitym, jak opisano uprzednio (Holmes i in., Science, 256: 1205-1210 (1992); Sliwkowski i in., J. Biol. Chem., 269: 14661-14665 (1994)).

Monoklonalne przeciwciała 2C4, 7F3 i 4D5 znacząco hamowały tworzenie sygnału indukowanej HRG fosforylacji tyrozyny przy Mr 180 000. W nieobecności HRG żadne z tych przeciwciał nie było zdolne do stymulacji fosforylacji tyrozyn białek o Mr w zakresie 180 000. Przeciwciała te także nie reagowały krzyżowo z EGFR (Fendly i in., Cancer Research 50: 1550-1558 (1990)), ErbB3 lub ErbB4. Przeciwciała 2C4 i 7F3 znacząco hamowały stymulację przez HRG fosforylację tyrozyn p180 do <25% kontroli. Monoklonalne przeciwciało 4D5 było zdolne do blokowania stymulacji fosforylacji tyrozyn przez HRG o około 50%. Figura 2A przedstawia krzywe dawka-odpowiedź dla hamowania przez 2C4 i 7F3 stymulowanej HRG fosforylacji tyrozyn p180, określone przez densytometrię w świetle odbitym.

Analiza tych krzywych hamowaniazzastosowaniem 4-parametrycznego fitowania dała IC⁵⁰ wynoszące 2,8 ± 0,7 nM i 29,0 ± 4,1 dla odpowiednio 2C4 i 7F3.

Badania hamowania przez przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 wiązania HRG z liniami komórek nowotworu sutka MCF7 przeprowadzono z monowarstwowymi hodowlami na lodzie w 24-studzienkowej płytce (Lewis i in., Cancer Research, 56: 1457-1465 (1996)). Do każdej studzienki dodawano skierowane przeciw ErbB2 przeciwciała monoklinalne i inkubowano w ciągu 30 minut. Dodawano wyznakowaną ¹²⁵I rHRGe1177-244 (25 pm) i inkubację kontynuowano w ciągu od 4 do 16 godzin. Figura 2B przedstawia krzywe dawka-odpowiedź dla hamowania przez 2C4 lub 7F3 wiązania HRG z komórkami MCF7. Różne stężenia 2c4 lub 7F3 inkubowano z komórkami MCF7 w obecności wyznakowanej ¹²⁵I rHRGe1 i krzywe hamowania przedstawiono na fig. 2B. Analiza tych danych dała IC50 wynoszące 2,4 ± 0,3 nM i 19,0 ± 7,3 nM odpowiednio dla 2C4 i 7F3. Maksymalne hamowanie wynoszące około 74% dla 2C4 i 7F3 było zgodne z danymi dla hamowania fosforylacji tyrozyn.

W celu określenia, czy obserwowany na komórki MCF7 wpływ przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2 był zjawiskiem ogólnym, linie komórek nowotworów ludzkich inkubowano z 2C4 i 7F3 iokre46

PL 203 326 B1 ślano stopień specyficznego wiązania wyznakowanej ¹²⁵I rHRGe1 (Lewis i in., Cancer Research 56: 1457-1465 (1996)). Wyniki tych badań przedstawiono na fig. 3. Wiązanie wyznakowanej ¹²⁵I rHRGe1 może być znacząco hamowane przez albo 2C4, albo 7F3 w przypadku wszystkich linii komórkowych, z wyjątkiem linii komórek raka sutka MDA-MB-468, o której donoszono, że za chodzi w niej ekspresja niewielkich ilości ErbB2 lub nie zachodzi ona w ogóle. Dla pozostałych linii komórkowych donoszono o ekspresji ErbB2, ze szerokim stopniem zróżnicowaniem poziomu ekspresji. Rzeczywiście, zakres ekspresji ErbB2 w testowanych liniach komórkowych różni się o ponad dwa rzędy wielkości. Na przykład, w liniach BT-20, MCF7 i Caov zachodzi ekspresja około 10⁴ receptorów ErbB2/komórkę, podczas gdy w BT-474 i SK-BR-3 około 10⁶ receptorów ErbB2/komórkę. Biorąc pod uwagęszerokizakres ekspresji ErbB2 w tych komórkach i powyższe dane, wywnioskowano, że oddziaływanie pomiędzy ErbB2 i ErbB3 lub ErbB4 było samo oddziaływaniem o wysokim powinowactwie, które zachodzi na powierzchni błony plazmatycznej.

Oceniono wpływ hamowania wzrostu monoklonalnych przeciwciał 2C4 i 4D5 na komórkiMDAMB-175 i SK-BR-3 w obecności lub nieobecności egzogennej rHRGe1 (Schaefer i in., Oncogene 15: 1385-1394 (19997)). Poziomy ErbB2 w komórkach MDA-MB-175 są 4-6 razy wyższe niż poziom stwierdzany w normalnych komórkach nabłonkowych sutka, a tyrozyny receptora ErbB2-ErbB4 są konstytutywnie ufosforylowane w komórkach MDA-MB-175. Komórki MDA-MB-175 traktowano skierowanymi przeciw ErbB2 przeciwciałami monoklonalnymi 2C4 i 4D5 (10 μg/ml) w ciągu 4 dni. W oznaczaniu wybarwiania fioletem krystalicznym inkubacja z 2C4 wykazywała silny wpływ hamujący wzrost na tę linię komórkową (fig. 4A). Egzogenna HRG nie odwracała znacząco tego hamowania. Z drugiej strony, 2C4 nie wykazywało hamującego wpływu na linię komórkową SK-BR-3, w której zachodzi nadekspresją ErbB2 (fig. 4B). Monoklonalne przeciwciało 2C4 było zdolne do hamowania proliferacji komórek MDA-MB-175 w większym stopniu niż monoklonalne przeciwciało 4D5, zarówno w obecności, jak i nieobecności egzogennej HRG. Hamowanie proliferacji komórek przez 4D5 jest zależne od poziomu ekspresji ErbB2 (Lewis i in., Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263 (1993)). Można było wykryć maksymalne 66% hamowanie w komórkach SK-BR-3 (fig. 4B) Jednakże, wpływ ten może zostać przezwyciężony przez endogenną HRG.

P r z y k ł a d 2

Monoklonalne przeciwciało 2C4 blokuje zależne od HRG łączenie się ErbB2 z ErbB3

Zdolność ErbB3 do łączenia się z ErbB2 testowano w doświadczeniu koimmunoprecypitacji. 1,0 x 10⁶ komórek MCF7 lub SK-BR-3 wysiewano w sześciostudzienkowych płytkach do hodowli komórkowych w podłożu DMEM/Ham's F12 w stosunku 50:50 zawierającym 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS) i 10 mM HEPES, pH 7,2 (podłoże wzrostowe) i umożliwiano przyłączanie do podłoża w ciągu nocy. Przed rozpoczęciem doświadczenia komórki głodzono w ciągu dwóch godzin w podłożu wzrostowym bez surowicy.

Komórki krótko przemywano solą fizjologiczną zbuforowaną fosforanami (PBS), a następnie inkubowano z albo 100 nM wskazanym przeciwciałem rozcieńczonym w 0,2% w/v albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w podłożu RPMI z 10 mM HEPES, pH 7,2 (bufor do wiązania), lub z samym buforem do wiązania (kontrola). Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej do połowy studzienek (+) dodawano HRG do 5 nM stężenia końcowego. Do innych studzienek (-) dodawano podobną objętość buforu do wiązania. Inkubację kontynuowano w ciągu 10 minut.

Supernatanty usuwano przez odessanie i komórki lizowano w RPMI, 10 mM HEPES, pH 7,2, 1,0% v/v TRITON-X100™, 1,0% w/v CHAPS (bufor lizujący), zawierającym 0,2 mM PMSF, 10 μg/ml leupeptyny i 10 TU/ml aprotyniny. Lizaty oczyszczano z nierozpuszczalnego materiału przez wirowanie.

ErbB2 poddawano immunoprecypitacji stosując przeciwciało monoklonalne kowalencyjnie sprzęgnięte z żelem powinowactwa (Affi-Prep 10, Bio-Rad).Przeciwciało to (Ab-3, Oncogene Sciences) rozpoznaje epitop domeny cytoplazmatycznej. Immunoprecypitację prowadzono przez dodanie do każdego lizatu 10 μl zawiesiny żelu, zawierającej około 8,5 μg immobilizowanego przeciwciała, i umożliwiano mieszanie próbek w temperaturze pokojowej w ciągu dwóch godzin. Żele zbierano następnie przez wirowanie. Żele trzy razy okresowo przemywano buforem lizującym w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Następnie dodawano bufor do próbek z SDS i próbki krótko ogrzewano we wrzącej łaźni wodnej.

Supernatanty poddawano elektroforezie w 4-12% żelach poliakrylkoamidowych i elektroblottingowi na membrany nitrocelulozowe. Obecność ErbB3 oceniano jako sondę blotów stosując poliklonalne przeciwciało skierowane przeciw epitopom jego domeny cytoplazmatycznej (C-17, Santa Cruz Botech). Bioty wizualizowano stosując substrat chemiluminescencyjny (ECL, Amersham).

PL 203 326 B1

Jak przedstawiono na kontrolnych ścieżkach na fig. 5A i 5B dla odpowiednio komórek MCF-7 i SK-BR-3, ErbB3 obecny był w immunoprecypitatach ErbB2 tylko jeśli komórki stymulowano HRG. Jeśli komórki najpierw inkubowano z monoklonalnym przeciwciałem 2C4, w komórkach MCF7 sygnał ErbB3 był zniesiony (fig. 5A, ścieżka 2C4+) lub znacznie obniżony w komórkach SK-BR-3 (fig. 5B, ścieżka 2C4+). Jak przedstawiono na fig. 5A-B, monoklonalne przeciwciało 2C4 blokuje zależne od hereguliny łączenie się ErbB3 z ErbB2 zarówno w komórkach MCF7, jak i SK-BR-3 znacznie skuteczniej niż HERCEPTIN^®. Preinkubacja z HERCEPTIN^® zmniejszała sygnał ErbB3 w lizatach MCF7, ale wywierała niewielki wpływ, bądź go nie wywierała, na ilość ErbB3 koprecypitującego z lizatów SK-BR-3. Preinkubacja z przeciwciałem skierowanym przeciw receptorowi EGF (Ab-1, Oncogene Sciences) nie wywiera żadnego wpływu na zdolność ErbB3 do koimmunoprecypitacji z ErbB2 dla żadnej z linii komórkowych.

P r z y k ł a d 3

Humanizowane przeciwciała 2C4

Zmienne domeny mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4 najpierw sklonowano w wektorze, który umożliwia wytwarzanie chimerycznego, mysz/człowiek, fragmentu Fab. Całkowity RNA wyizolowano z komórek hybrydomy stosując zestaw do ekstrakcji Stratagene zgodnie z protokołami producenta. Domeny zmienne zamplifikowano przez RT-PCR, oczyszczono w żelu i wstawiono do pochodnego plazmidu opartego na pUC119 zawierającego ludzką domenę stałą kappa i ludzką domenę CH1, jak opisano uprzednio (Carter i in., PNAS (USA) 89: 4285 (1992) i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 821 337). Otrzymanym w wyniku plazmidem stransformowano szczep E. coli 16C9 dla uzyskania ekspresji fragmentu Fab. Prowadzenie hodowli, indukcja ekspresji białka i oczyszczanie fragmentu Fab przeprowadzono tak, jak opisano uprzednio (Werther i in., I. Immunol. 157: 4986-4995 (1996), Presta i in., Cancer Research 57: 4593-4599 (1997)).

Oczyszczone chimeryczne fragmenty Fab 2C4 porównano z mysim macierzystym przeciwciałem 2C4 pod względem jego zdolności do hamowania wiązania ¹²⁵I-HRG z komórkami MCF7 oraz hamowania aktywacji przez HRG fosforylacji tyrozyn p180w komórkach MCF7. Jak przedstawiono na fig. 6A, chimeryczny fragment Fab 2C4 jest bardzo skuteczny pod względem zaburzania tworzenia miejsca wiązania ErbB2-ErbB3 o wysokim powinowactwie na linii komórek ludzkiego raka sutka, MCF7. Względna wartość IC50 obliczona dla nienaruszonego mysiego 2C4 wynosi 4,0 ± 0,4 nM, podczas gdy wartość dla fragmentu Fab wynosi 1,7 ± 1,1 nM. Jak zilustrowano na fig. 6B, monowalentny chimeryczny fragment Fab 2C4 jest bardzo skuteczny pod względem zaburzania zależnej od HRG aktywacji ErbB2-ErbB3. Wartość IC50 obliczona dla nienaruszonego mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4 wynosi 6,0 ± 2 nM, podczas gdy wartość dla fragmentu Fab wynosi 15,0 ± 2 nM.

Zsekwencjonowanie DNA chimerycznego klonu umożliwiło identyfikację reszt CDR (Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) (fig. 7A i B). Stosując mutagenezę ukierunkowaną oligonukleotydami, wszystkie sześć tych regionów CDR wprowadzono do pełnego zrębu ludzkiego (podgrupa I VL kappa i podgrupa III VH) zawartego w plazmidzie VX4, jak opisano uprzednio (Presta i in., Cancer Research, 57: 4593-4599 (1997)). Przeprowadzono ekspresję białka z uzyskanej w wyniku sekwencji z wymienionymi CDR i oczyszczono je jak powyżej. Przeprowadzono badania wiązania w celu porównania obu wersji. Krótko, płytkę NUNC MAXISORP™ opłaszczano 1 mikrogramem na ml domeny zewnątrzko-mórkowej ErbB2 (ECD; wytwarzana w sposób opisany w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer 90/14357) w 50 mM buforze węglanowym, pH 9,6, przez noc w temperaturze 4°C, a następnie blokowano rozcieńczalnikiem do ELISA (0,5% BSA, 0,05% polisorbat 20, PBS) w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny. Kolejne rozcieńczenia próbek w rozcieńczalniku do ELISA inkubowano w płytkach w ciągu 2 godzin. Po przemyciu, związany fragment Fab wykrywano stosując biotynylowane mysie przeciwciało skierowane przeciw ludzkiemu łańcuchowi kappa (ICN 634771), a następnie skoniugowaną ze streptawidyną peroksydazę chrzanową (Sigma) i 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) jako substrat. Absorbancję odczytywano przy długości fali 450 nm. Jak przedstawiono na fig. 8A, w wyniku skonstruowania ludzkiego fragmentu Fab z wymienionymi CDR utracono całą zdolność wiązania.

W celu przywrócenia wiązania humanizowanego Fab, skonstruowano mutanty stosując DNA z wymienionymi CDR jako matrycę. Stosując model utworzony komputerowo (fig. 9), mutacje te zaprojektowano w celu zmiany reszt ludzkiego regionu zrębu na ich mysie odpowiedniki w pozycjach, w których zmiana mogłaby wpływać na konformacje CDR lub region kontaktu przeciwciało-antygen. Mutanty przedstawiono w tablicy 2.

PL 203 326 B1

T a b l i c a 2

Projektowanie mutacji humanizowanego FR 2C4

Numer mutanta	Podstawienia regionu zrębu (FR)
560	ArgH71Val
561	As pH 73 Arg
562	ArgH71Val, AspH73Arg
568	ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly
569	ArgH71Val, AspH73Arg, PheH67Ala
570	ArgH71Val, AspH73Arg, AsnH76Arg
571	ArgH71Val, AspH7 3Arg, LeuH7 8Val
574	ArgH71Val, AspH73Arg, IleH69Leu
56869	ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly, PheH67Ala

Krzywe wiązania dla różnych mutantów przedstawiono na fig. 8A-C. Wersja 574 humanizowanego Fab, ze zmianami Ar-gH71Val, AspH73Arg i IleH69Leu okazała się posiadać przywrócone wiązanie do tego oryginalnego chimerycznego fragmentu Fab 2C4. Dla bardziej szczegółowej analizy lub wzmocnienia wiązania humanizowanego przeciwciała można modyfikować dodatkowe reszty FR i/lub CDR, takie jak L2, L54, L55, L56, H35 i/lub H48 (np. podstawiać w następujący sposób - IleL2Thr, ArgL54Leu, TyrL55-Glu, ThrL56Ser, AspH35Ser i ValH48Ile). Alternatywnie, lub dodatkowo, humanizowane przeciwciało można poddawać dojrzewaniu powinowactwa (patrz powyżej) w celu dalszej poprawy jego powinowactwa i/lub innych aktywności biologicznych.

Wersję 574 humanizowanego 2C4 poddawano dojrzewaniu powinowactwa stosując metodę prezentacji przez fagi. Krótko, Humanizowany Fab 2C4.574 sklonowano w wektorze do prezentacji przez fagi w postaci fuzji z genem III. Gdy cząstki fagowe indukuje się przez infekcję fagiem wspomagającym M13K07, fuzja ta umożliwia prezentację Fab na końcu N białka włókna ogona, produktu genu III (Baca i in., J. Biol. Chem., 272: 10678-10678 (1997)).

Dla każdego z 6 CDR określonych powyżej skonstruowano indywidualne biblioteki. W bibliotekach tych aminokwasy w CDR, które zidentyfikowano stosując model komputerowy (fig. 9) jako będące potencjalnie istotne w wiązaniu z ErbB2, poddano losowym mutacjom stosując oligonukleotydy zawierające NNS jako kodony. Następnie biblioteki selekcjonowano wobec opłaszczonych ECD ErbB2 płytek NUNC MAXIS0RP™ z 3% mlekiem w proszku w PBS z 0,2% TWEEN 20^® (MPBST) stosowanym zamiast wszystkich roztworów blokujących. W celu selekcji fagów o powinowactwach wyższych od tego 2C4.574, w 3, 4 i 5 turach selekcji podczas etapów przemywania jako czynnik współzawodniczący dodawano rozpuszczalną ECD ErbB2 lub rozpuszczalny Fab 2C4.574. Czas przemywania wydłużono do 1 godziny w temperaturze pokojowej.

Po 5 turach selekcji, pojedyncze klony ponownie analizowano przez ELISA fagów. Pojedyncze klony namnażano w 96-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowych o studzienkach z dnem w kształcie litery U, Costar, i fagi indukowano przez dodanie faga wspomagającego. Po wzroście w ciągu nocy, komórki E. coli osadzano i zawierające fagi supernatanty przenoszono do 96-studzienkowych płytek, gdzie faga blokowano MPBST w ciągu jednej godziny w temperaturze pokojowej. Płytki NUNC MAXISORP™ opłaszczone EDC ErbB2 również blokowano MPBST, jak powyżej. Blokowanego faga inkubowano na płytkach w ciągu 2 godzin. Po przemywaniu, związane fagi wykrywano stosując skoniugowane z peroksydazą chrzanu przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw M13 (Amersham Pharmacia Biotech,Inc., 27-9421-01) rozcieńczone 1:5000 w MPBST, a następnie 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę jako substrat. Absorbancję odczytywano przy długości fali 450 nm.

Sekwencjonowaniu DNA poddano 48 klonów z każdej biblioteki, które dawały najwyższe sygnały. Te klony, których sekwencje występowały najczęściej zsubklonowano w opisanym powyżej wektorze, który umożliwia ekspresję rozpuszczalnych Fab. Indukowano te Fab, oczyszczono białka i oczyszczone Fab analizowano pod względem wiązania w opisanym powyżej oznaczeniu ELISA i wiązanie porównano z tym wyjściowej humanizowanej wersji 2C4.574.

PL 203 326 B1

Po zidentyfikowaniu interesujących mutacji w poszczególnych CDR, skonstruowano i testowano w opisany powyżej sposób dodatkowe mutanty, które posiadają różne kombinacje tych mutacji. Mutanty, które wykazywały ulepszone powinowactwo w stosunku do 574 opisano w tablicy 3.

T a b l i c a 3

Projektowanie mutantów otrzymanych przez dojrzewanie powinowactwa 2C4.574

Nazwa mutanta	Zmiana w stosunku do 574	Mutant/574*
H3.A1	serH99trp, metH34leu	0,380
L2.F5	serL50trp, tyrL53gly, metH34leu	0,087
HI.3.B3	thrH28gln, thrH30ser, metH34leu	0,572
L3.G6	tyrL92pro, ileL931ys, metH34leu	0,569
L3.G11	tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly, metH34leu	0,561
L3.29	tyrL92phe, tyr96asn, metH34leu	0,552
L3.36	tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro, metH34leu	0,215
654	serL50trp, metH34leu	0,176
655	metH34ser	0,542
659	serL50trp, metH34ser	0,076
L2.F5.H3.A1	serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, serH99trp	0,175
L3G6.H3.A1	tyrL92pro, ile931ys, metH34leu, serH99trp	0,218
H1.3.B3.H3.A1	thrH28gln, thrH30ser, metH34leu, serH99trp	0,306
L3.G11.H3.A1	tyrL92ser, ile93arg, tyrL94gly, metH34leu, serH99trp	0,248
654.H3.A1	serL50trp, metH34leu, serH99trp	0,133
654.L3.G6	serL50trp, metH34leu, tyrL92pro, ileL93lys	0,213
654.L3.29	serL50trp, metH34leu, tyrL92phe, tyrL96asn	0,236
654.L3.36	serL50trp, metH351eu, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro	0,141

Stosunek ilości mutanta potrzebnej do otrzymania średniej OD krzywej standardowej do ilości 574 potrzebnej do otrzymania średniej OD krzywej standardowej w ELISA ECD Erb2. Liczba niższa od 1,0 wskazuje, że mutant wiąże Erb2 lepiej niż 574.

Skonstruowano również poniższe mutanty i są one obecnie poddawane ocenie:

659.L3.G6

659.L3.11

659.L3.29

659.L3.36

L2F5.L3G6

L2F5.L3G11

L2F5.L29

L2F5.L36

L2F5.L3G6.655

L2F5.L3G11.655

L2F5.L29.655 serL50trp, metH34ser, tyrL92pro, ileL93lys serL50trp, metH34ser, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL96asn serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92pro, ile93lys serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92ser, ile93arg, tyrL94gly serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe, tyrL96asn serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro serL50trp, tyrL53gly, metH35ser, tyrL92pro, ile93lys serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92phe, tyrL96asn L2F5.L36.655 serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro

PL 203 326 B1

Obecnie konstruowane są następujące mutanty, sugerowane przeszukiwanie pod względem homologii:

678

679

680

681

682

683

684

685

686

687

688

689 thrH30ala thrH30ser lysH64arg leuH96val thrL97ala thrL97ser tyrL96phe tyrL91ala tyrL91phe thrL56ala glnL28ala glnL28glu

Korzystnym aminokwasem w pozycji H34 mogłaby być metionina. Można dokonać zmiany na leucynę, jeśli w tej pozycji miałoby być prowadzone utlenianie.

Stwierdzono, że bardzo korzystne dla wiązania są AsnH52 i asnH53. Zmiana tych reszt na alaninę lub kwas asparaginowy dramatycznie zmniejszała wiązanie.

Przygotowano nienaruszone przeciwciało zawierające domeny zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego humanizowanej wersji 574 z regionem stałym łańcucha ciężkiego ludzkiej IgGl (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 821 337). Nienaruszone przeciwciało wytwarzają komórki jajnika chomika chińskiego (CHO). Cząsteczkę tę oznaczono w niniejszym opisie rhuMAb 2C4.

P r z y k ł a d 4

Monoklonalne przeciwciało 2C4 blokuje aktywację MAPK przez EGF, TGF-α lub HRG

Wiele receptorów czynników wzrostowych przekazuje sygnały poprzez szlak aktywowanej mitogenem kinazy białkowej (MAPK). Te kinazy o podwójnej specyficzności są jednym z kluczowych celów szlaków przekazywania sygnałów, które ostatecznie wyzwalają podział komórek rakowych. Zdolność przeciwciała monoklonalnego 2C4 lub HERCEPTIN® do hamowania aktywacji MAPK przez EGFJGF-α lub HRG oceniano w poniższy sposób.

Komórki MCF7 (10⁵ komórek/studzienkę) wysiewano w podłożach zawierających surowicę w 12-studzienkowych płytkach do hodowli komórkowych. Następnego dnia usuwano podłoża i do każdej studzienki dodawano świeże podłoża zawierające 0,1% surowicę. Następnie procedurę tę powtarzano kolejnego dnia i przed oznaczeniem podłoża zastępowano wolnym od surowicy buforem do wiązania (Jonesiin., J. Biol. Chem. 273: 11667-74 (1998) oraz Schaefer i in., J. Biol. Chem. 273: 859-66 (1999)). Umożliwiano zrównoważenie temperatury komórek do temperatury pokojowej, a następnie inkubowano w ciągu 30 minut z 0,5 ml 2 00 nM HERCEPTIN* lub monoklonalnego przeciwciała 2C4. Następnie komórki traktowano 1 nM EGF, 1 nM TGF-α lub 0,2 nM HRG w ciągu 15 minut. Reakcję zatrzymywano przez odessanie podłoża, a następnie dodawano 0,2 ml buforu do próbek SDS-PAGE zawierającego 1% DTT. Aktywację MAPK oceniano przez blotting typu Western stosując przeciwciało skierowane przeciw aktywnej MAPK (Promega), jak opisano uprzednio (Jones i in., J. Biol. Chem., 273: 11667-74 (1998)).

Jak przedstawiono na fig. 10, monoklonalne przeciwciało 2C4 znacząco blokuje aktywację MAPK przez EGF, TGF-α i HRG, w stopniu wyższym niż HERCEPTIN®. Dane te sugerują, że monoklonalne przeciwciało 2C4 wiąże się z powierzchnią ErbB2, która jest wykorzystywana do jego łączenia albo z EGFR, albo z ErbB3, a zatem zapobiega tworzeniu przekazującego sygnały kompleksu receptorowego.

Wykazano również, że monoklonalne przeciwciało 2C4 hamuje zależną od HRG aktywację Akt. Aktywacja szlaku przekazywania sygnałów kinazy PI3 jest ważna dla przeżywania komórek (Carraway

PL 203 326 B1 i in., J. Biol. Chem., 270: 7111-6 (1995)). W komórkach rakowych aktywacja kinazy PI3 może odgrywać rolę w fenotypie inwazyjnym (Tan i in., Cancer Research, 59: 1620-1625 (1999)). Szlak zapewniający przeżywanie zachodzi głównie za pośrednictwem kinazy serynowo/treoninowej AKT (Bos i in., Trends Blochem. Sci., 20: 441-442 (1995)). Kompleksy tworzone pomiędzy ErbB2 a albo ErbB3, albo EGFR mogą inicjować te szlaki w odpowiedzi odpowiednio na heregulinę lub EGF (Olayioye i in., Mol. & Cell.. Biol., 18: 5042-51 (1998); Karunagaran i in., EMBO Journal, 15: 254-264 (1996) oraz Krymskaya i in., Am. J. Physiol., 276: L246-55 (1999)). Inkubacja komórek raka sutka MCF7 z 2C4 hamuje zachodzącą za pośrednictwem hereguliny aktywację ATK. Ponadto, podstawowy poziom aktywacji ATK występujący przy braku dodawania hereguliny jest dalej obniżany przez dodanie 2C4. Dane te sugerują, że 2C4 może hamować aktywację kinazy PI3 przez ligand ErbB i że hamowanie to może prowadzić do apoptozy. Zwiększona wrażliwość na apoptozę może przejawiać się zwiększoną wrażliwości komórek nowotworowych na toksyczny wpływ chemioterapii.

A zatem, monoklonalne przeciwciało 2C4 hamuje inicjowane ligandem przekazywanie sygnałów ErbB przez dwa główne szlaki - kinazy MAP (główny szlak proliferacji) i kinazy PI3 (główny szlak zapewniający przeżywanie/antyapoptyczny).

P r z y k ł a d 5

Kombinacja przeciwciała monoklonalnego 2C4 i HERCEPTIN in vivo

Do oceny skuteczności przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw HER2, albo samych, albo w kombinacji, pod względem hamowania wzrostu nowotworów zastosowano model heteroprzeszczepu z zastosowaniem linii komórkowej gruczolakoraka płuc, Calu-3. Samice myszy rasy NCR nude zainokulowano podskórnie 20 x 10⁶ komórek w 0,1 ml. Pomiary nowotworów prowadzono dwa razy na tydzień i po osiągnięciu przez guzki nowotworów objętości 100 mm³ zwierzęta losowo podzielono na 7 grup traktowania. Grupy traktowania były następujące:

(a) kontrolne przeciwciało monoklonalne, MAb 1766;

(b) HERCEPTIN^®, 10 mg/kg;

(c) przeciwciało monoklonalne 7C2, 10 mg/kg;

(d) przeciwciało monoklonalne 2C4, 10 mg/kg;

(e) HERCEPTIN^® i 7C2, każde 10 mg/kg (f) HERCEPTIN^® i 2C4, każde 10 mg/kg, oraz (g) przeciwciała monoklonalne 2C4 i 7C2, każde 10 mg/kg.

Zwierzęta traktowano dwa razy w tygodniu do dnia 24. Objętości nowotworów mierzono dwa razy w tygodniu do dnia 38.

Jak przedstawiono na wykresie słupkowym na fig. 11, leczenie 2C4 lub HERCEPTIN^® myszy posiadającej nowotwór Calu-3 znacząco hamowało wzrost nowotworów. Kombinacja HERCEPTIN^® i 2C4 lub HERCEPTIN^® i 7C2 przewyższała każde z przeciwciał monoklonalnych podawanych osobno.

P r z y k ł a d 6

Leczenie raka okrężnicy i odbytnicy monoklonalnym przeciwciałem 2C4

Ludzkie linie komórek raka okrężnicy i odbytnicy, takie jak HCA-7, LS174T lub CaCo-2, wszczepia się podskórnie pozbawionym grasicy myszom rasy nude w sposób opisany w Sheng i in., J. Clin. Invest., 99: 2254-2259 (1997). Po osiągnięciu przez nowotwory objętości około 100 mm³, grupy zwierząt leczy się 10-50 mg/kg przeciwciała monoklonalnego 2C4 podawanego dwa razy na tydzień przez iniekcję do jamy otrzewnej. Monoklonalne przeciwciało 2C4 hamuje wzrost heteroprzeszczepów raka okrężnicy i odbytnicy in vivo.

P r z y k ł a d 7

Leczenie raka sutka humanizowanym 2C4

Wpływ rhuMAb 2C4 lub HERCEPTIN® na komórki ludzkiego raka sutka, w których nie zachodzi nadekspresja ErbB2, oceniano w 3-dniowym oznaczeniu z zastosowaniem Alamar Blue (Ahmed, S. A., Immunol Methods, 170: 211-224 (1994) oraz Page i in., Int. J. Oncol. 3: 473-476 (1994)). Komórkami stosowanymi w tym oznaczeniu były komórki ludzkiego raka sutka MDA-175, w których ekspresja ErbB2 zachodzi na poziomie 1+. Jak przedstawiono na fig. 12, wzrost linii komórkowej raka sutka MDA-175 jest znacząco hamowany, w sposób zależny od dawki, przez dodanie rhuMAb 2C4 w porównaniu z leczenia HERCEPTIN^®.

Oceniano skuteczność rhuMAb 2C4 wobec heteroprzeszczepów MCF7, które są dodatnie pod względem receptora estrogenów (ER+) i w których ekspresja ErbB2 zachodzi na niskim poziomie. Stosowano samice myszy poddawane suplementacji estrogenami. rhuMAb 2C4 podawano w dawce

PL 203 326 B1 mg/kg co tydzień. Jak przedstawiono na fig. 13, rhuMAb 2C4 było skuteczne pod względem hamowania wzrostu raka sutka in vivo, gdzie raka sutka nie charakteryzowała nadekspresją ErbB2.

P r z y k ł a d 8

Farmakokinetyka, metabolizm i toksykologia 2C4 rhuMAb 2C4 było stabilne w surowicy ludzkiej. Nie obserwowano żadnych dowodów agregacji lub tworzenia kompleksów w macierzach biologicznych. U myszy rhuMAb 2C4 było usuwane z organizmu szybciej niż HERCEPTIN^®. Badania farmakokinetyczne wskazują, że wynikiem cotygodniowego podawania około 2-6 mg/kg rhuMAb 2C4 powinno być uzyskiwanie stężeń w surowicy podobnych do HERCEPTIN^® przy obecnie stosowanych dawkach. Uzyskiwane w surowicy stężenie 2C4 powinno znacznie przekraczać IC50 określane in vitro.

Badania toksykologiczne przeprowadzono na makakach jawajskich (2 samce i dwie samice na grupę). rhuMAb 2C4 podawano dożylnie w dawkach 0, 10, 50 lub 100 mg/kg dwa razy na tydzień w ciągu 4 tygodni. Badania toksykologiczne obejmowały pomiary wagi ciała (tygodnie -2, -1 i następnie co tydzień); badania spożycia pokarmów (jakościowe, dzienne); badania lekarskie z oceną ciśnienia krwi, elektrokardiogramu (ECG) i temperatury ciała (tygodnie -2, -1 oraz tygodnie 2 i 4, 4 godziny po podaniu drugiej dawki w danym tygodniu); badania ultrasonograficzne serca (po pierwszym podaniu dawki w tygodniu 1 oraz na końcu badania, tydzień 4); diagnostykę laboratoryjną (wyjściowo i koniec tygodnia 2 i 4); analizę moczu (wyjściowo i koniec tygodnia 2 i 4); pobieranie próbek do analizy przeciwciał (wyjściowo i koniec tygodnia 2 i 4), jak również sekcję i analizę histopatologiczną.

Wszystkie zwierzęta ze wszystkich grup przeżyły do końca badania. Nie zanotowano żadnych znaczących obserwacji klinicznych ani różnic pomiędzy grupami. Wyniki sekcji nie wykazały znaczących dużych nieprawidłowości w narządach żadnego ze zwierząt. Nie obserwowano żadnych znaczących mikroskopowych nieprawidłowości w tkankach żadnego ze zwierząt. Nie zanotowano znaczących zmian w ECG od rozpoczęcia do zakończenia badania. Ponadto, nie były widoczne różnice pomiędzy grupami.

P r z y k ł a d 9

Zwiększanie dawki

Pacjentom z rakiem podaje się pierwszą dawkę rhuMAb 2C4 na jednym z pięciu poziomów dawek (0,05, 0,5, 2,0, 4,0 lub 10 mg/kg; 6 osobników na poziom dawki), po którym następują 4 tygodnie bez podawania. W 5 tygodniu pacjenci otrzymują cztery razy taką samą dawkę, po czym następuje następny okres 4 tygodni bez podawania. Pacjentów z pełną odpowiedzią, częściową odpowiedzią lub stabilną chorobą wybiera się do rozszerzonych badań.

P r z y k ł a d 10

Terapia nawracającego lub opornego na leczenie raka gruczołu krokowego

RhuMAb 2C4 jest pełnej długości humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym (wytwarzanym przez komórki CHO), skierowanym przeciw ErbB2. RhuMAb 2C4 blokuje ErbB2 połączony z innym przedstawicielami rodziny ErbB, dzięki czemu rozpoczyna się wewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnałów na szlaku ErbB. W przeciwieństwie do HERCEPTIN^®, rhuMAb 2C4 nie tylko hamuje wzrost nowotworów, w których zachodzi nadekspresją ErbB2, ale również blokuje wzrost nowotworów wymagających przekazywania sygnałów zależnego od ligandów ErbB.

RhuMAb 2C4 jest wskazane jako pojedynczy czynnik do leczenia pacjentów z opornym na leczenie hormonem (niezależnym od androgenów) rakiem gruczołu krokowego. Główne cele pod względem skuteczności obejmują całkowitą przeżywalność w porównaniu z najlepszym dostępnym leczeniem (Mitoksantron/Prednizon) przy stosowaniu jako pojedynczy czynnik oraz bezpieczeństwo. Wtórne cele pod względem skuteczności obejmują: czas do postępu choroby, szybkość odpowiedzi, jakość życia, ból i/lub czas trwania odpowiedzi. RhuMAb 2C4 podaje się dożylnie (IV) co tydzień lub co trzy tygodnie w dawkach odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, dopóki choroba postępuje. Przeciwciało dostarcza się w postaci płynnego wielodawkowego preparatu (20 ml wypełnienia o stężeniu 20 mg/ml lub wyższym).

RhuMAb 2C4 jest również wskazane w kombinacji z chemioterapią do leczenia opornego na leczenie hormonem (niezależnego od androgenów) raka gruczołu krokowego. Główne cele pod względem skuteczności obejmują całkowitą przeżywalność w porównaniu z chemioterapią oraz bezpieczeństwo. Wtórne cele pod względem skuteczności obejmują: czas do postępu choroby, szybkość odpowiedzi, jakość życia, ból i/lub czas trwania odpowiedzi. RhuMAb 2C4 podaje się dożylnie (IV) co tydzień lub co trzy tygodnie w dawkach odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, dopóki choroba postępuje.

PL 203 326 B1

Przeciwciało dostarcza się w postaci płynnego wielodawkowego preparatu (20 ml wypełnienia o stężeniu 20 mg/ml lub wyższym).

Przykłady leków, które można łączyć z przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2 (które blokuje aktywację receptora ErbB2 przez ligand) w leczeniu raka gruczołu krokowego (np. niezależnego od androgenów raka gruczołu krokowego) obejmują inhibitor transferazy farnezylowej, czynnik przeciwangiogenny (np. przeciwciało skierowane przeciw VEGF), lek ukierunkowany na EGFR (np. C225 lub ZD1839), inne przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 (np. hamujące wzrost przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, takie jak HERCEPTIN^®, lub przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, które indukuje apoptozę, takie jak 7C2 lub 7F3, włącznie z ich wariantami humanizowanymi i/lub otrzymanymi przez dojrzewanie powinowactwa), cytokinę (np. IL-2, IL-12, G-CSF lub GM-CSF), antyandrogen (taki jak flutamid lub octan cyproteronu), leuprolid, suramina, czynnik chemioterapeutyczny, taki jak winblastyna, estramustyna, mitoksantron, liarozol (czynnik blokujący metabolizm kwasu retinolowego), cyklofosfamid, antybiotyki antracyklinowe, takie jak doksorubicyna, taksan (np. paklitaksel lub docetaksel) lub metotreksat, bądź jakąkolwiek kombinację powyższych, taką jak winblastyna/estramustyna lub cyklofosfamid/doksorubicyna/metotreksat, prednizon, hydrokortyzon lub ich kombinacje. Można podawać standardowe dawki tych różnych leków, np. 40 mg/m²/wk docetakselu (TAZOTERE^®); 6 (AUC) karboplatyny i 200 mg/m² paklitakselu (TAXOL^®).

P r z y k ł a d 11

Terapia przerzutowego raka sutka

RhuMAb 2C4 jest wskazane jako pojedynczy czynnik do leczenia pacjentów z przerzutowym rakiem sutka. Główne cele pod względem skuteczności obejmują szybkość odpowiedzi oraz bezpieczeństwo. Wtórne cele pod względem skuteczności obejmują: całkowitą przeżywalność, czas do postępu choroby, jakość życia i/lub czas trwania odpowiedzi. RhuMAb 2C4 podaje się dożylnie (IV) co tydzień lub co trzy tygodnie w dawkach odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, dopóki choroba postępuje. Przeciwciało dostarcza się w postaci płynnego wielodawkowego preparatu (20 ml wypełnienia o stężeniu 20 mg/ml lub wyższym).

RhuMAb 2C4 jest również wskazane w kombinacji z chemioterapią do leczenia pacjentów z przerzutowym rakiem sutka, w którym nie zachodzi nadekspresją ErbB2. Główne cele pod względem skuteczności obejmują całkowitą przeżywalność w porównaniu z samą chemioterapią oraz bezpieczeństwo. Wtórne cele pod względem skuteczności obejmują: czas do postępu choroby, szybkość odpowiedzi, jakość życia i/lub czas trwania odpowiedzi. RhuMAb 2C4 podaje się dożylnie (IV) co tydzień lub co trzy tygodnie w dawkach odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, dopóki choroba postępuje. Przeciwciało dostarcza się w postaci płynnego wielodawkowego preparatu (20 ml wypełnienia o stężeniu 20 mg/ml lub wyższym).

Przykłady leków, które można łączyć z przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2 (które blokuje aktywację receptora ErbB2 przez ligand) w leczeniu raka sutka (np. przerzutowego raka sutka, którego nie charakteryzuje nadekspresją ErbB2) obejmują czynniki chemioterapeutyczne, takie jak antybiotyki antracyklinowe (np. doksorubicynę), cyklofosfamid, taksan (np. paklitaksel lub docetaksel), nawelbinę, kselod, mitomycynę C, związki platyny, oksaliplatynę, gemcytabinę lub kombinacje dwóch lub więcej z nich, takie jak doksorubicyna/cyklofosfamid, inne przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 (np. hamujące wzrost przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, takie jak HERCEPTIN, lub przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, które indukuje apoptozę, takie jak 7C2 lub 7F3, włącznie z ich wariantami humanizowanymi i/lub otrzymanymi przez dojrzewanie powinowactwa), antyestrogen (np. tamoksyfen), inhibitor transferazy farnezylowej, czynnik przeciwangiogenny (np. przeciwciało skierowane przeciw VEGF), lek ukierunkowany na EGFR (C225 lub ZD1839), cytokinę (np. IL-2, IL-12, G-CSF lub GM-CSF) lub kombinacje powyższych. Można podawać standardowe dawki tych dodatkowych leków.

RhuMAb 2C4 jest dodatkowo wskazane w kombinacji z HERCEPTIN^® do leczenia pacjentów z przerzutowym rakiem sutka, w którym zachodzi nadekspresją ErbB2. Główne cele pod względem skuteczności obejmują szybkość odpowiedzi oraz bezpieczeństwo. Wtórne cele pod względem skuteczności obejmują: czas do postępu choroby, całkowitą przeżywalność w porównaniu z samą HERCEPTIN'^®, jakość życia i/lub czas trwania odpowiedzi. RhuMAb 2C4 podaje się dożylnie (IV) co tydzień lub co trzy tygodnie w dawkach odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, dopóki choroba postępuje. Przeciwciało dostarcza się w postaci płynnego wielodawkowego preparatu (20 ml wypełnienia o stężeniu 20 mg/ml lub wyższym). HERCEPTIN^® podaje się IV jako początkową dawkę uderzeniową 4 mg/kg,

PL 203 326 B1 następnie utrzymuje się tygodniową dawkę 2 mg/kg. HERCEPTIN^® dostarcza się w postaci zliofilizowanego proszku. Każda fiolka HERCEPTIN^® zawiera 440 mg HERCEPTIN^®, 9,9 mg chlorowodorku L-histydyny, 6,4 mg L-histydyny, 400 mg diwodzianu α-α-trehalozy i 1,8 mg polysorbate 20. Przez rozpuszczenie 20 ml bakteriostatycznej wody do iniekcji (BWFI) zawierającej 1,1% alkohol benylowy jako środek konserwujący otrzymuje się 21 ml wielodawkowego roztworu zawierającego 21 mg/ml HERCEPTIN^® o pH około 6,0.

P r z y k ł a d 12

Terapia raka płuc

RhuMAb 2C4 jest wskazane jako pojedynczy czynnik do leczenia stadium Illb lub IV nie-drobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Główne cele pod względem skuteczności obejmują szybkość odpowiedzi oraz bezpieczeństwo. Wtórne cele pod względem skuteczności obejmują: całkowitą przeżywalność, czas do postępu choroby, jakość życia i/lub czas trwania odpowiedzi. RhuMAb 2C4 podaje się dożylnie (IV) co tydzień lub co trzy tygodnie w dawkach odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, dopóki choroba postępuje. Przeciwciało dostarcza się w postaci płynnego wielodawkowego preparatu (20 ml wypełnienia o stężeniu 20 mg/ml lub wyższym).

RhuMAb 2C4 jest również wskazane w kombinacji z chemioterapią do leczenia pacjentów z przerzutowym nie-drobnokomórkowym rakiem płuc. Główne cele pod względem skuteczności obejmują całkowitą przeżywalność w porównaniu z terapią standardową oraz bezpieczeństwo. Wtórne cele pod względem skuteczności obejmują: czas do postępu choroby, szybkość odpowiedzi, jakość życia i/lub czas trwania odpowiedzi. RhuMAb 2C4 podaje się dożylnie (IV) co tydzień lub co trzy tygodnie w dawkach odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, dopóki choroba postępuje. Przeciwciało dostarcza się w postaci płynnego wielodawkowego preparatu (20 ml wypełnienia o stężeniu 20 mg/ml lub wyższym).

Przykłady dodatkowych leków, które można łączyć z przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2 (które wiąże się z ErbB2 i blokuje aktywację receptora ErbB2 przez ligand) w leczeniu raka płuc obejmują czynniki chemioterapeutyczne, takie jak karboplatynę, taksan (np. paklitaksel lub docetaksel), gemcytabinę, nawelbinę, cisplatynę, oksaliplatynę lub kombinacje dwóch lub więcej z nich, takie jak karboplatyna/docetaksel, inne przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 (np. hamujące wzrost przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, takie jak HERCEPTIN^®, lub przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, które indukuje apoptozę, takie jak 7C2 lub 7F3, włącznie z ich wariantami humanizowanymi i/lub otrzymanymi przez dojrzewanie powinowactwa), inhibitor transferazy farnezylowej, czynnik przeciwangiogenny (np. przeciwciało skierowane przeciw VEGF), lek ukierunkowany na EGFR (C225 lub ZD1839), cytokinę (np. IL-2, IL-12,G-CSF lub GM-CSF) lub kombinacje powyższych.

P r z y k ł a d 13

Terapia raka okrężnicy i odbytnicy

RhuMAb 2C4 jest wskazane jako pojedynczy czynnik do leczenia przerzutowego raka okrężnicy i odbytnicy. Główne cele pod względem skuteczności obejmują szybkość odpowiedzi oraz bezpieczeństwo. Wtórne cele pod względem skuteczności obejmują: całkowitą przeżywalność, czas do postępu choroby, jakość życia i/lub czas trwania odpowiedzi. RhuMAb 2C4 podaje się dożylnie (IV) co tydzień lub co trzy tygodnie w dawkach odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, dopóki choroba postępuje. Przeciwciało dostarcza się w postaci płynnego wielodawkowego preparatu (20 ml wypełnienia o stężeniu 20 mg/ml lub wyższym).

RhuMAb 2C4 jest również wskazane w kombinacji z chemioterapią do leczenia pacjentów z przerzutowym rakiem okrężnicy i odbytnicy. Główne cele pod względem skuteczności obejmują całkowitą przeżywalność w porównaniu z terapią standardową oraz bezpieczeństwo. Wtórne cele pod względem skuteczności obejmują: czas do postępu choroby, szybkość odpowiedzi, jakość życia i/lub czas trwania odpowiedzi. RhuMAb 2C4 podaje się dożylnie (IV) co tydzień lub co trzy tygodnie w dawkach odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, dopóki choroba postępuje. Przeciwciało dostarcza się w postaci płynnego wielodawkowego preparatu (20 ml wypełnienia o stężeniu 20 mg/ml lub wyższym).

Przykłady czynników chemioterapeutycznych stosowanych do leczenia raka okrężnicy i odbytnicy, które można łączyć z przeciwciałem, które wiąże się z ErbB2 i blokuje aktywację receptora ErbB2 przez ligand obejmują 5-fluorouracyl (5-FU), leukoworynę (LV), CPT-11, lewamisol lub kombinację którychkolwiek dwóch lub więcej z nich, np. F-FU/LV/CPT-11. Można podawać standardowe dawki takich czynników chemioterapeutycznch. Inne leki, które można łączyć z przeciwciałem

PL 203 326 B1 skierowanym przeciw ErbB2 w leczeniu raka okrężnicy i odbytnicy, obejmują inhibitor transferazy farnezylowej, czynnik przeciwangiogenny (np. przeciwciało skierowane przeciw VEGF), lek ukierunkowany na EGFR (np. C225 lub ZD1839), cytokinę (np. IL-2, IL-12, G-CSF lub GM-CSF), inne przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 (np. hamujące wzrost przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, takie jak HERCEPTIN^®, lub przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, które indukuje apoptozę, takie jak 7C2 lub 7F3, włącznie z ich wariantami humanizowanymi i/lub otrzymanymi przez dojrzewanie powinowactwa) lub kombinacje powyższych.

LISTA SEKWENCJI

<110>	Genencech, Inc.
<120>	Humanizowane przeciwciała skierowane	przeciw	ErbB2 i
	leczenie przeciwciałami skierowanymi	przeciw	ErbB2
<130>	P1467R2PCT
<141>	2000-06-23
<150>	US 60/141,316
<151>	1999-06-25
<160>	13
<210>
<211>	107
<212>	PRT

<2i3>Mysz domowa <400> 1

Asp 1

Thr

Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

His

Lys

Ile 10

Met

Ser

Thr

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Ser 20

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gln

Asp

Val

Ser 30

Ile

Gly

Val

Ala

Trp 35

Tyr

Gln

Gln

Arg

Pro 40

Gly

Gln

Ser

Pro

Lys 45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ser 50

Ala

Ser

Tyr

Arg

Tyr 55

Thr

Gly

Val

Pro

Asp 60

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile 75

Ser

Ser

Val

Gln

Ala 80

Glu

Asp

Leu

Ala

Val 85

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln 90

Tyr

Tyr

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

100 105

Ile Lys <210> 2 <211> 119 <212> PRT <2i3> Mysz domowa

<400> 2 Glu Val 1

Gln

Leu

Gln 5

Gln

Ser

Gly

Pro

Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Thr Ser

Val

Lys

Ile 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Thr 30

Asp Tyr

Thr

Met

Asp 35

Trp

Val

Lys

Gln

Ser 40

His

Gly

Lys

Ser

Leu 45

Glu Trp

Ile

Gly

Asp

Val

Asn

Pro

Asn

Ser

Gly

Gly

Ser

Ile

Tyr

55 60

PL 203 326 B1

Asn

Gin

Arg

Phe

Lys 65

Gly

Lys

Ala

Ser

Leu 70

Thr

Val

Asp

Arg

Ser 75

Ser

Arg

Ile

Val

Tyr 80

Met

Glu

Leu

Arg

Ser 85

Leu

Thr

Phe

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Asn

Leu 100

Gly

Pro

Ser

Phe

Tyr 105

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

110 115 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <2ΐ3> sztuczne

<400> 3

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser Leu 10

Ser Ala

Ser

Val 15

Asp 1

Ile

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala Ser 25

Gin Asp

Val

Ser 30

Ile

Gly

Val

Ala

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro Gly 40

Lys Ala

Pro

Lys 45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ser 50

Ala

Ser

Tyr

Arg

Tyr Thr 55

Gly Val

Pro

Ser 60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp Phe 70

Thr Leu

Thr

Ile 75

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Δ Cr·,

Phe

Ala

Πν,ν-

Gin

Gin

80

Λ j- j. 85

i J- i- -r>

90

Tyr

Tyr

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin Gly

Thr Lys

Val

Glu

100 105

Ile Lys <210> 4 ο i ι τ τ η '-ώΙΙΧ <212> PRT <2ΐ3> sztuczne <220>

<22ΐ> sztuczne <222> 1-119 <223> Fab 574 VH <400> 4

Glu Val.Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Giy 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Glv Gly Ser Ile Tyr 50 55 ’ ’ 60

PL 203 326 B1

Asn

Gin

Arg

Phe

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Leu 70

Ser

Val

Asp

Arg

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Asn

Leu 100

Gly

Pro

Ser

Phe

Tyr 105

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

110 115 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <2ΐ3> sztuczne

<400> 5

Ala

Ser

Val 15

Asp 1

Ile

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser 30

Asn

Tyr

Leu

Ala

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala 50

Ala

Ser

Ser

Leu

Glu 55

Ser

Gly

Val

Pro

Ser 60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro 80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr 85

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 90

Tyr

Aśn

Ser'

Leu

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

100 105

Ile Lys <210> 6 <211> 119 <212> PRT <2ΐ3> sztuczne

<400> 6

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu

Val Gin Pro Gly 15

Glu 1

Val

Gin

Leu

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

20

25

30

Ser

Tyr

Ala

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

35

40

45

Glu

Tipi

Val

Ala

Val

Ile

Ser

Gly

Asp

Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

50

55

60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

PL 203 326 B1

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Gly

Arg 100

Val

Gly

Tyr

Ser

Leu 105

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly 110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val 115

Thr

Val

Ser

Ser

<210> 7 <211> 10 <212> PRT <2ΐ3> Mysz domowa <220>

^<22ΐ^> niepewne <222> ίο <223> nieznany aminokwas <400> -7

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Xaa 15 10

<210>	8
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Mysz domowa
<400>	3

Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gin Arg Phe

10 15

Lys Gly <210> 9 <211> 10 <212> ERT .

<2i3>Mysz domowa <400> 9

Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Mysz domowa <400> 10

Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser Ile Gly Val Ala 15 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT' <2i3> Mysz domowa <220>

<221> niepewne <222> 5-7 <223>nieznany aminokwas <400> 11

Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa

PL 203 326 B1

<210>	12
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Mysz domowa
<400>	12

Gin Gin Tyr Tyr

' Ile 5

Tyr

Pro

Tyr

Thr

<210> 13

<211> 645 <212> PRT

<2i3> ludzkie

<400> 13

MeC Glu

Leu

Ala

Ala

Leu

Cys

Arg

Trp

Gly

Leu

Leu

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Leu Pro

Pro

Gly

Ala

Ala

Ser

Thr

Gin

Val

Cys

Thr

Gly

Thr

Asp

20

25

30

MeC Lys

Leu

Aręt

Leu

Pro

Ala

Ser

Pro

Glu

Thr

His

Leu

Asp

MeC

35

40

45

Leu Arg

His

Leu

Tyr

Gin

Gly

Cys

Gin

Val

Val

Gin

Gly

Asn

Leu

50

55

60

Glu Leu

Thr

Tyr

Leu

Pro

Thr

Asn

Ala

Ser

Leu

Ser

Phe

Leu

Gin

65

70

75

Asp Ile

Gin

Glu

Val

Gin

Gly

Tyr

Val

Leu

Ile

Ala

His

Asn

Gin

80

85

90

Val Arg

Gin

Val

Pro

Leu

Gin

Arg

Leu

Arg

Ile

Val

Arg

Gly

Thr

95

100

105

Gin Leu

Phe

Glu

Δ c?t~>

Asn

rr *· J' *

.Ala

Leu

Ala

Val

Lau

Asp

Asn

r-1 . . wij

110

115

120

Asp Pro

Leu

Asn

Asn

Thr

Thr

Pro

Val

Thr

Gly

Ala

Ser

Pro

Gly

125

130

135

Gly Leu

Arg

Glu

Leu

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Glu

Ile

Leu

Lys

140

145

150

Gly Gly

Val

Leu

Ile

Gin

Arg

Asn

Pro

Gin

Leu

Cys

Tyr

Gin

Asp

155

160

165

Thr Ile

Leu

Trp

Lys

Asp

Ile

Phe

His

Lys

Asn

Asn

Gin

Leu

Ala

170

175

180

Leu Thr

Leu

Ile

Asp

Thr

Asn

Arg

Ser

Arg

Ala

Cys

His

Pro

Cys

185

190

195

Ser Pro

Met

Cys

Lys

Gly

Ser

Arg

Cys

Trp

Gly

Glu

Ser

Ser

Glu

200

205

210

Asp Cys

Gin

Ser

Leu

Thr

Arg

Thr

Val

Cys

Ala

Gly

Gly

Cys

Ala

215

220

225

Arg Cys

Lys

fil \r

Pro

Leu

Pro

Thr

A <?rł

—

His

Glu

Gin

230

235

240

PL 203 326 B1

Ala Ala Gly Cys Thr 245

Leu His Phe Asn His 260

Leu Val Thr Tyr Asn 275

Glu Gly Arg Tyr Thr 290

Tyr Asn Tyr Leu Ser 305

Pro Leu His Asn Gin 320

Cys Glu Lys Cys Ser 335

Gly Met Glu His Leu 350

Ile Gin Glu Phe Ala 365

Phe Leu Pro Glu Ser 380

Pro Leu Gin Pro-Glu 395

Ile Thr Gly Tyr Leu 410

Asp Leu Ser Val Phe ' ' 425

Leu His Asn Gly Ala 440

Ser Trp Leu Gly Leu ' 455

Ala Leu Ile His His 470

Pro Trp Asp Gin Leu 485

Thr Ala Ash Arg Pro 500

Cys His..Gin Leu Cys 515

Thr Gin Cys Val Asn 530

Val Glu Glu Cys Arg 545

Asn Ala Arg His Cys

Gly	Pro	Lys	His	Ser 250
Ser	Gly	Ile	Cys	Glu 265
Thr	Asp	Thr	Phe	Glu 280
Phe	Gly	Ala	Ser	Cys 295
Thr	Asp	Val	Gly	Ser 310
Glu	Val	Thr	Ala	Glu 325
Lys	Pro	Cys	Ala	Arg 340
Arg	Glu	Val	Arg	Ala 355
Gly	Cys	Lys	Lys	Ile 370
Phe	Asp	Gly	Asp	Pro 385
Gin	Leu	Gin	Val	Phe 400
Tyr	Ile	Ser	Ala	Trp 415
Gin	Asn	Leu	Gin	Val 430
Tyr	Ser	Leu	Thr	Leu 445
Arg	Ser	Leu	Arg	Glu 460
Asn	Thr	His	Leu	Cys 475
Phe	Arg	Asn	Pro	His 490
Glu	Asp	Glu	Cys	Val 505
Ala	Arg	Gly	His	Cys 520
Cys	Ser	Gin	Phe	Leu 535
Val	Leu	Gin	Gly	Leu 550
Leu	Pro	Cys	His	Pro

Asp Cys Leu Ala Cys 255

Leu His Cys Pro Ala 270

Ser Met Pro Asn Pro 285

Val Thr Ala Cys Pro 300

Cys Thr Leu Val Cys 315

Asp Gly Thr Gin Arg 330

Val Cys Tyr Gly Leu 345

Val Thr Ser Ala Asn 360

Phe Gly Ser Leu Ala 375

Ala Ser Asn Thr Ala 390

Glu Thr Leu Glu Glu 405

Pro Asp Ser Leu Pro 420

Ile Arg Gly Arg Ile 435

Gin Gly Leu Gly Ile 450

Leu Gly Ser Gly Leu 465

Phe Val His Thr Val 480

Gin Ala Leu Leu His 495

Gly Glu Gly Leu Ala 510

Trp Gly Pro Gly Pro 525

Arg Gly Gin Glu Cys 540

Pro Arg Glu Tyr Val 555

Glu Cys Gin Pro Gin

PL 203 326 B1

560 565 570

Asn

Gly

Ser

Val

Thr 575

Cys

Phe

Gly

Pro

Glu 580

Ala

Asp

Gin

Cys

Val 585

Ala

Cys

Ala

His

Tyr 590

Lys

Asp

Pro

Pro

Phe 595

Cys

Val

Ala

Arg

Cys 600

Pro

Ser

Gly

Val

Lys 605

Pro

Asp

Leu

Ser

Tyr 610

Met

Pro

Ile

Trp

Lys 615

Phe

Pro

Asp

Glu

Glu 620

Gly

Ala

Cys

Gin

Pro 625

Cys

Pro

Ile

Asn

Cys 630

Thr

His

Ser

Cys

Val

Asp

Leu

Asp

Asp

Lys

Gly

Cys

Pro

Ala

Glu

635 640 645

Claims (18)

1. Przeciwciało, które zawiera sekwencję aminokwasową w sekwencji SEQ ID numer: 4 ciężkiej domeny zmiennej (VH) i sekwencję aminokwasową w sekwencji SEQ ID numer: 3 lekkiej domeny zmiennej (VL).

2. Przeciwciało, według zastrz. 1, znamienne tym, że jest nienaruszonym przeciwciałem IgGl.

3. Przeciwciało, według zastrz. 1, znamienne tym, że jest fragmentem przeciwciała.

4. Przeciwciało, według zastrz. 1, znamienne tym, że jest fragmentem Fab przeciwciała.

5. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciała zdefiniowane w zastrz. 1 oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że stanowi roztwór wodny.

7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że jest kompozycją zliofilizowaną.

8. Koniugat, znamienny tym, że zawiera przeciwciała zdefiniowane w zastrz. 1 skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym.

9. Izolowany kwas nukleinowy kodujący przeciwciało zdefiniowane w zastrz. 1.

10. Wektor zawierający kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz. 9.

11. Komórka gospodarza zawierająca wektor zdefiniowany w zastrz. 10.

12. Komórka gospodarza według zastrz. 11, znamienna tym, że jest komórką ssaczą.

13. Komórka gospodarza według zastrz. 12, znamienna tym, że jest komórką jajnika chomika Chińskiego(CHO).

14. Sposób wytwarzania przeciwciała, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza zawierającej kwas nukleinowy kodujący przeciwciało zdefiniowane w zastrz. 1, tak że zachodzi ekspresja kwasu nukleinowego i produkcja przeciwciała.

15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że ponadto obejmuje odzyskiwanie przeciwciała z hodowli komórek gospodarza.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że ponadto obejmuje odzyskiwanie przeciwciała z medium hodowlanego hodowli komórek gospodarza.

17. Sposób według zastrz. 14 albo 15, albo 16, znamienny tym, że komórką gospodarza jest komórka jajnika chomika Chińskiego(CHO).

18. Sposób według zastrz. 14 albo 15, albo 16, albo 17, znamienny tym, że ponadto obejmuje mieszanie odzyskanego przeciwciała z farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem, zaróbką lub stabilizatorem do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej zawierającej to przeciwciało.