KR20070094993A - 인간화 항-ＥｒｂＢ2 항체 및 항-ＥｒｂＢ2 항체를 사용한치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간화 항-ErbB2 항체 및 항-ErbB2 항체, 예를 들면 인간화 항-ErbB2 항체를 사용한 암 치료 방법에 관한 것이다.

인간화 항-ErbB2 항체

Description

인간화 항-ＥｒｂＢ2 항체 및 항-ＥｒｂＢ2 항체를 사용한 치료 방법{Humanized Anti-ErbB2 Antibodies and Treatment with Anti-ErbB2 Antibodies}

도 1A 및 1B는 절단 변이체 분석 및 부위 지시된 돌연변이유발 [Nakamura et al. J. of Virology 67 (10):6179-6191 (1993); and Renz et al. J. Cell Biol. 125 (6):1395-1406 (1994)]에 의해 결정된 바와 같이, ErbB2의 세포외 도메인 (ECD) 내의 22번에서 645번 까지의 잔기의 에피토프 지도화를 도시한 것이다 (시그날 서열을 포함한, 도 1A에 제시된 아미노산 서열; 서열 13). 각종 ErbB2-ECD 절단 또는 점 돌연변이체를, 폴리머라제 연쇄 반응 기술을 사용하여 cDNA로부터 제조하였다. ErbB2 돌연변이체는 포유류 발현 플라스미드에서 gD 융합 단백질로서 발현되었다. 이러한 발현 플라스미드는 삽입된 cDNA의 하단에 위치한 폴리아데닐화 시그날과 SV40 종결부를 갖는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서를 이용한다. 플라스미드 DNA를 293 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염을 수행한지 1일 후에, 상기 세포를, 1％ 투석된 태아 송아지 혈청과 ³⁵S 메티오닌과 ³⁵S 시스테인 각각 25μCi를 함유하는, 메티오닌과 시스테인 무함유 글루코스 저농도 DMEM에서 밤새 대사적으로 표지시켰다. 상등액을 수거하고, 항-ErbB2 모노클로날 항체 또는 대조군 항체를 상기 상등액을 가한 다음, 4℃에서 2 내지 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 복합체를 침전시키고, 이를 10 내지 20％ 트리신 SDS 구배 겔에 적용한 다음 100V에서 전기영동시켰다. 상기 겔을 막 상으로 전기블롯팅하고 자가방사선 사진술로 분석하였다. 도 1B에 도시된 바와 같이, 항-ErbB2 항체 7C2, 7F3, 2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 및 3H4는 각종 ErbB2 ECD 에피토프에 결합된다.

도 2A 및 2B는 MCF7 세포의 rHRGβ1 활성화에 대한 항-ErbB2 모노클로날 항체 2C4 및 7F3의 효과를 도시한 것이다. 도 2A는 티로신 인산화의 HRG 자극의 2C4 또는 7F3 억제에 대한 용량-반응 곡선을 도시한 것이다. 도 2B는 2C4 또는 7F3에 의한 MCF7 세포에 대한 ¹²⁵I-표지된 rHRGβ1_177-244 결합 억제에 대한 용량-반응 곡선을 도시한 것이다.

도 3은 항-ErbB2 모노클로날 항체 2C4 또는 7F3에 의한 인간 종양 세포주의 패널에 대한 특이적 ¹²⁵I-표지된 rHRGβ1_177-244 결합 억제를 도시한 것이다. 모노클로날 항체-대조군은 rHRG 결합을 차단시키지 않는 이소형-매치된 쥐의 모노클로날 항체이다. 비특이적 ¹²⁵I-표지된 rHRGβ1_177-244 결합은 100nM rHRGβ1의 존재하에서 수행된 병행 인큐베이션물로부터 결정하였다. 비특이적 ¹²⁵I-표지된 rHRGβ1_177-244 결합에 대한 값은 시험된 모든 세포주에 대한 전체 값의 1％ 미만이었다.

도 4A 및 4B는 MDA-MB 175 세포 (도 4A) 및 SK-BR-3 세포 (도 4B) 증식에 대 한 모노클로날 항체 2C4 및 4D5의 효과를 도시한 것이다. MDA-MB-175 세포와 SK-BR-3 세포를 96 웰 판에 접종하고 2시간 동안 접착시켜 두었다. 1％ 혈청을 함유하는 배지에서 실험을 수행하였다. 항-ErbB2 항체 또는 배지 단독을 가하고 이 세포를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 연속적으로, rHRGβ1 (1 nM) 또는 배지 단독을 가하고, 세포를 4일 동안 인큐베이션시켰다. 단층을 세척하고 0.5％ 크리스탈 바이올렛으로 염색/고정시켰다. 세포 증식을 결정하기 위하여, 흡광도를 540 nm에서 측정하였다.

도 5A 및 5B는 저수준/정상 수준의 ErbB2를 발현하는 MCF7 세포 (도 5A) 및 고수준의 ErbB2를 발현하는 SK-BR-3 세포 (도 5B)에서 ErbB2와 ErbB3과의 헤레굴린 (HRG) 의존적 연합에 대한 모노클로날 항체 2C4, 헤르셉틴 (등록상표) 항체 또는 항-EGFR 항체의 효과를 도시한 것이다 (하기 실시예 2 참조).

도 6A 및 6B는 본래의 쥐의 모노클로날 항체 2C4 (mu 2C4)의 활성과 키메라 2C4 Fab 단편의 활성을 비교한 것이다. 도 6A는 키메라 2C4 Fab 또는 본래의 쥐의 모노클로날 항체 2C4에 의한 MCF7 세포에 대한 ¹²⁵I-HRG 결합 억제를 도시한 것이다. MCF7 세포를 24-웰 판에 접종하고 (1 x 10⁵개 세포/웰) 2일 동안 약 85％ 밀집도로 성장시켰다. 결합 실험을 문헌 [Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 6B는 문헌 [Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996)]에 기재된 바와 같이 수행된 MCF7 세포에서의 p180 티로신 인산화의 rHRGβ1 활성화 억제를 도시한 것이다.

도 7A 및 7B는 쥐의 모노클로날 항체 2C4의 가변 경쇄 (V_L) (도 7A) 및 가변 중쇄 (V_H) (도 7B) 도메인의 아미노산 서열 (각각 서열 1 및 2); 인간화 2C4 변형물 574의 V_L 및 V_H 도메인의 아미노산 서열 (각각 서열 3 및 4); 및 인간 V_L 및 V_H 콘센서스 골격 (hum κ1, 경 카파 아그룹 I; humIII, 중 아그룹 III)의 아미노산 서열 (각각 서열 5 및 6) 정렬을 도시한 것이다. 별표는 인간화 2C4 변형물 574와 쥐의 모노클로날 항체 2C4 간의 차이 또는 인간화 2C4 변형물 574와 인간 골격 간의 차이를 확인해준다. 상보성 결정 영역 (CDRs)이 괄호안에 있다.

도 8A 내지 8C는 실시예 3에서 ELISA로써 결정된 바와 같이 ErbB2 세포외 도메인 (ECD)에 대한 키메라 Fab 2C4 (Fab.vI) 및 몇몇 인간화 2C4 변이체의 결합을 도시한 것이다.

도 9는 화이트 CDR 골격이 표지된 (L1, L2, L3, H1, H2, H3) 모노클로날 항체 2C4의 V_L 및 V_H 도메인의 리본 다이아그램이다. 인간화 과정 동안 돌연변이유발에 의해 평가된 V_H 측쇄 (실시예 3, 표 2 참조)가 또한 제시된다.

도 10은 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK)의 EGF, TGF-α또는 HRG-매개된 활성화에 대한 모노클로날 항체 2C4 또는 헤르셉틴 (등록상표)의 효과를 도시한 것이다.

도 11은 Calu3 폐 선암 이종조직 이식편 (3+ ErbB2 과발현물)에 대한 항-ErbB2 항체 (단독 또는 조합하여)의 효과를 도시한 막대 그래프이다. 주: 치료는 24일째에 중단하였다.

도 12는 알마르 블루 (Alamar Blue) 검정으로 평가한 바와 같이, MDA-175 세포의 성장에 대한 재조합 인간화 모노클로날 항체 2C4 (rhuMAb 2C4) 또는 헤르셉틴 (등록상표)의 효과를 도시한 것이다.

도 13은 MCF7 이종조직 이식편에 대한 rhuMAb 2C4의 효능을 도시한 것이다.

본 발명은 인간화 항-ErbB2 항체 및 항-ErbB2 항체, 예를 들면 인간화 항-ErbB2 항체를 사용한 암 치료 방법에 관한 것이다.

ErbB 계열의 수용체 티로신 키나제는 세포 성장, 분화 및 생존에 있어 중요한 매개인자이다. 이러한 수용체 계열에는 4가지 별개의 구성원이 포함되는데, 이로는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR 또는 ErbB1), HER2 (ErbB2 또는 p185^neu), HER3 (ErbB3) 및 HER4 (ErbB4 또는 tyro2)가 있다.

erbB1 유전자에 의해 코딩된 EGFR은 인간 악성 종양의 원인이 되는 것으로 연루되어 왔다. 특히, EGFR의 발현 증가가 유방암, 방광암, 폐암, 뇌암, 목암 및 위암 뿐만 아니라 신경교아종에서 관찰되었다. EGFR 수용체 발현 증가는 종종, 자가분비성 (autocrine) 자극 경로에 의해 수용체 활성화를 가져다 주는 동일한 종양 세포에 의해, EGFR 리간드인 형질전환성 성장 인자 알파 (TGF-α)의 생성 증가와 연관이 있다 [Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994)]. EGFR 또는 그의 리간드인 TGF-α및 EGF에 대한 모노클로날 항체가 이러한 악성 종양을 치료하는데 있어서 치료제로서 평가되었다 [Baselga and Mendelsohn, 상기 참조; Masui et al., Cancer Research 44:1002-1007 (1984); and Wu et al., J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995)].

ErbB 계열의 두번째 구성원인 p185^neu는 초기에, 화학적으로 처리된 쥐의 신경아세포종으로부터 형질전환 유전자 생성물로서 동정되었다. 이러한 활성화 형태의 neu 원종양 유전자는 코딩된 단백질의 트랜스멤브레인 영역에서의 점 돌연변이 (발린에서 글루탐산으로의 변이)로부터 비롯된 것이다. neu의 인간 동족체 증폭이 유방암과 난소암에서 관찰되며, 이는 낮은 수준의 예후와 상관이 있다 [Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); 및 미국 특허 제4,968,603호]. 지금까지, 상기 neu 원종양 유전자에서와 유사한 점 돌연변이가 인간 종양에 대해 보고된 바는 없다. ErbB2의 과발현 (자주는 아니지만 일정하게 유전자 증폭으로 인함)이 또한, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 및 방광 암종을 포함한 기타 암종에서 관찰되었다 [King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet: 1:765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams et al., Pathobiology 59:46-52 (1991); and McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990)]. ErbB2는 전립선 암에서 과발현될 수 있다 [Gu et al., Cancer Lett. 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28:827-33 (1997); Ross et al., Cancer 79:2162-70 (1997); and Sadasivan et al., J. Urol. 150:126-31 (1993)].

쥐 p185^neu 및 인간 ErbB2 단백질 생성물에 대해 지시된 항체가 보고된 바 있다. 드레빈 (Drebin)과 그의 동료들은 쥐 neu 유전자 생성물인 p185^neu에 대한 항체를 생성시켰다 [Drebin et al., Cell 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991); and WO 94/22478 참조]. 문헌 [Drebin et al., Oncogene 2:273-277 (1988)]에는 2가지 별개 영역의 p185^neu와 반응성인 항체 혼합물이, 누드 마우스 내로 이식된 neu-형질전환된 NIH-3T3 세포에 대한 상승적 항종양 효과를 가져다 주는 것으로 기재되어 있다 [1998년 10월 20일자로 허여된 미국 특허 제5,824,311호 참조].

문헌 [Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9 (3):1165-1172 (1989)]에는 인간 유방 종양 세포주 SK-BR-3을 사용하는 것을 특징으로 하는 항-ErbB2 항체 패널의 생성 방법이 기재되어 있다. 항체에 대한 노출 후 SK-BR-3 세포의 상대적 세포 증 식은, 72시간 후에 단층을 크리스탈 바이올렛 염색함으로써 결정하였다. 이러한 검정을 사용하여, 세포 증식을 56％ 정도 억제시키는 4D5로 명명된 항체를 이용하여 최대 억제를 이루었다. 상기 패널 내의 기타 항체는 상기 검정에서 보다는 덜한 정도로 세포 증식을 저하시켰다. 항체 4D5는 ErbB2-과발현성 유방 종양 세포주가 TNF-α의 세포독성 효과에 민감하도록 하는 것으로 추가로 밝혀졌다 [1997년 10월 14일자로 허여된 미국 특허 제5,677,171호 참조]. 후지악 (Hudziak) 등의 문헌에서 논의된 항-ErbB2 항체 특징들은 다음 문헌에서 추가로 확인되었다 [Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro 26 (3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11 (3):117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol. 11 (2):979-986 (1991); Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269 (20):14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996); and Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)].

쥐의 항-ErbB2 항체 4D5의 재조합 인간화 변형물 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 또는 헤르셉틴 (등록상표); 미국 특허 제5,821,337호)은 기존의 광범위한 항암 치료를 받아온 ErbB2-과발현성 전이성 유방암 환자에게서 임상적으로 활성을 나타낸 다 [Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)]. 헤르셉틴 (등록상표)은 ErbB2 단백질을 과발현하는 종양이 있는 전이성 유방암 환자를 치료하도록 식품의약청으로부터 1998년 9월 25일자로 판매 승인받았다.

각종 특성을 가진 기타 항-ErbB2 항체가 다음 문헌에 기재되어 있다 [Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); 미국 특허 제5,783,186호; and Klapper et al., Oncogene 14:2099-2109 (1997)].

상동성 스크리닝 결과, 다음 2가지의 다른 ErbB 수용체 계열 구성원을 동정하였다: ErbB3 [미국 특허 제5,183,884호 및 제5,480,968호; 및 Kraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)] 및 ErbB4 [EP Pat Appln No. 599,274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); and Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)]. 이들 수용체 둘 다는 적어도 몇몇 유방암 세포주 상에서의 증가된 발현을 나타낸다.

ErbB 수용체는 일반적으로 세포 중의 각종 조합물에서 발견되고, 헤테로 이량체화가 각종 ErbB 리간드에 대한 다양한 세포성 반응을 증가시키는 것으로 여겨진다 [Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132 (1995)]. EGFR은 다음 6가지 상이한 리간드에 결합된다: 상피 성장 인자 (EGF), 형질전환성 성장 인자 알파 (TGF-α), 암피레굴린, 헤파린-결합성 상피 성장 인자 (HB-EGF), 베타셀룰린 및 에피레굴린 [Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994)]. 단일 유전자의 또다른 스플라이싱으로부터 비롯된 헤레굴린 단백질 계열은 ErbB3 및 ErbB4에 대한 리간드이다. 헤레굴린 계열에는 알파, 베타 및 감마 헤레굴린 [Holmes et al., Science 256:1205-1210 (1992); 미국 특허 제5,641,869; and Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)]; neu 분화 인자 (NDFs), 신경교성 성장 인자 (GGFs); 아세틸콜린 수용체 유도 활성 (ARIA); 및 감각 및 운동 신경단위 유도된 인자 (SMDF)가 포함된다. 고찰을 위해서는, 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. ＆ Cell Neurosci. 7:247-262 (1996) and Lee et al. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995)]. 최근에, 3가지 추가의 ErbB 리간드가 동정되었다: ErbB3 또는 ErbB4에 결합하는 것으로 보고된 뉴레굴린-2 (NRG-2) [Chang et al. Nature 387:509-512 (1997); and Carraway et al. Nature 387:512-516 (1997)]; ErbB4에 결합하는 뉴레굴린-3 [Zhang et al. PNAS (USA) 94 (18):9562-7 (1997)]; 및 ErbB4에 결합하는 뉴레굴린-4 [Harati et al. Oncogene 18:2681-89 (1999)]. HB-EGF, 베타셀룰린 및 에피레굴린이 또한 ErbB4에 결합된다.

EGF와 TGFα는 ErbB2에 결합되어 있지는 않지만, EGF는 EGFR과 ErbB2를 자극하여 헤테로 이량체를 형성시키고, 이는 EGFR을 활성화시켜 상기 헤테로 이량체 내에서의 ErbB2의 인산기 전이반응을 발생시킨다. 이량체화 및(또는) 인산기 전이반응은 ErbB2 티로신 키나제를 활성화시키는 것으로 여겨진다 [Earp et al. 상기 참조]. 마찬가지로, ErbB3이 ErbB2와 함께 발현되는 경우에는, 활성 시그날링 복합체가 형성되고 ErbB2에 대해 지시된 항체가 이 복합체를 파열시킬 수 있다 [Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269 (20):14661-14665 (1994)]. 부가적으로, 헤레굴린 (HRG)에 대한 ErbB3의 친화도는 ErbB2와 함께 발현될 때 보다 높은 친화도 상태로 증가된다. ErbB2-ErbB3 단백질 복합체에 관한 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Levi et al., Journal of Neuroscience 15:1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1431-1435 (1995); and Lewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996)]. ErbB3과 마찬가지로, ErbB4도 ErbB2와 함께 활성 시그날링 복합체를 형성한다 [Carraway and Cantley, Cell 78:5-8 (1994)].

제1 면에서, 본 발명은 ErbB2에 결합하는 항체의 치료 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 발현하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.

EGFR-표적된 약물에 비해, 상기 암을 치료하기 위해 ErbB2에 결합하는 항체를 사용하는데 있어서의 각종 이점이 본원에 고려된다. 특히, EGFR은 간과 피부에서 고도로 발현되고, 이는 약물이 EGFR에 결합되어 있는 경우에 이러한 활성 약물 에 대한 거대한 싱크대를 제공한다. 또한, 키메라 항-EGFR 항체 C225 및 EGFR에 결합되는 소(小)분자 약물 ZD 1839와 같은 기타 EGFR-표적된 약물에 대해서는 피부 독성이 관찰되었다. ErbB2에 결합하는 항체는 이러한 약물 보다는 우수한 안전성 프로필을 갖는 것으로 예상된다.

본원의 치료법에 사용된 항체가 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단하고 (하거나) 모노클로날 항체 2C4의 생물학적 활성을 갖는 경우에는, 추가의 이점이 달성된다. 예를 들면, EGFR-표적된 약물이 EGFR 만을 간섭하긴 하지만, 본원에서 특히 관심있는 항체 (예: 그의 인간화 및(또는) 친화도 성숙된 변이체를 포함한 2C4)는 EGFR/ErbB2, ErbB3/ErbB4 및 ErbB2/ErbB3 헤테로 이량체를 간섭할 것이다. 또한, ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체는 EGFR-표적된 약물에 상보적일 것인데, 이러한 EGFR-표적된 약물들은 서로에 대해 상보적이지 않다.

본 발명은 추가로, ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체의 치료 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 ErbB2 수용체의 과발현을 특징적으로 나타내지 않는 암을 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ErbB2 수용체에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체의 치료 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 호르몬 비의존성 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, (a) ErbB2에 결합하여 ErbB2를 과발현하는 암 세포의 성장을 억제시키는 제1 항체; 및 (b) ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화 를 차단시키는 제2 항체의 치료 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체의 치료 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 결장암, 직장암 및 결장직장암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 암을 치료하는 방법을 제공한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 (특히) 상기 방법에 사용하기 위한 제품을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 용기, 및 그 안에 함유된 조성물 (이러한 조성물은 ErbB2에 결합하는 항체를 포함한다)을 포함하고, 이러한 조성물이 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 발현하는 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 표시해주는 포장 삽입물을 추가로 포함하는 제품을 제공한다.

본 발명은 부가적으로, 용기, 및 그 안에 함유된 조성물 (이러한 조성물은 ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체를 포함한다)을 포함하고, 이러한 조성물이 ErbB2 수용체의 과발현을 특징적으로 나타내지 않는 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 표시해주는 포장 삽입물을 추가로 포함하는 제품에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 용기, 및 그 안에 함유된 조성물 (이러한 조성물은 ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체를 포함한다)을 포함하고, 이러한 조성물이 호르몬 비의존성 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 표시해주는 포장 삽입물을 추가로 포함하는 제품에 관한 것이다.

추가의 양태에서는, (a) ErbB2에 결합하여 ErbB2를 과발현하는 암 세포의 성장을 억제시키는 제1 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 제2 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기를 포함하는 제품이 제공된다.

용기, 및 그 안에 함유된 조성물 (이러한 조성물은 ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체를 포함한다)을 포함하고, 이러한 조성물이 결장암, 직장암 및 결장직장암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 표시해주는 포장 삽입물을 추가로 포함하는 또다른 제품이 제공된다.

본 발명은 부가적으로, ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 인간화 항체; 이러한 인간화 항체와 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물; 및 세포독성제와 결합된 상기 인간화 항체를 포함하는 면역결합체를 제공한다.

더우기, 본 발명은 상기 인간화 항체를 코딩하는 분리된 핵산; 이러한 핵산을 포함하는 벡터; 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포; 및 상기 핵산이 발현되도록 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 숙주 세포 배양물 (예: 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 인간화 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 인간화 항체의 생성 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 결합된, ErbB2에 결합하는 항체를 포함하는 면역결합체; 및 인간에서 ErbB2 발현성 암, 예를 들면 ErbB2 과발현성 암을 치료하기 위한 상기 결합체의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 결합체 중의 항체는 모노클로날 항체 4D5, 예를 들면 인간화 4D5 [및 바람직하게는 huMAb4D5-8 (헤르셉틴 (등록상표))]; 또는 모노클로날 항체 2C4, 예를 들면 인간화 2C4이다. 면역결합체 내의 항체는 본래의 항체 (예를 들면, 본래의 IgG₁ 항체) 또는 항체 단편 (예: F(ab)₂, 디아보디 등)일 수 있다.

I. 정의

"ErbB 수용체"는 ErbB 수용체 계열에 속하는 수용체 단백질 티로신 키나제이고, 이에는 EGFR, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4 수용체, 및 앞으로 동정될 상기 계열의 기타 구성원이 포함된다. 이러한 ErbB 수용체는 일반적으로 ErbB 리간드와 결합할 수 있는 세포외 도메인; 친지성 트랜스멤브레인 도메인; 보존된 세포내 티로신 키나제 도메인; 및 인산화될 수 있는 수 개의 티로신 잔기가 정착되어 있는 카르복실-말단 시그날링 도메인을 포함할 것이다. 상기 ErbB 수용체는 "본래의 서열" ErbB 수용체 또는 그의 "아미노산 서열 변이체"일 수 있다. 바람직하게는, 상기 ErbB 수용체가 본래의 서열 인간 ErbB 수용체이다.

용어 "ErbB1", "상피 성장 인자 수용체" 및 "EGFR"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 예를 들면 문헌 [Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)]에 기재된 바와 같은 본래의 서열 EGFR을 지칭하는데, 이에는 그의 천연 돌연변이체 형태 [예를 들면, 문헌 (Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990))에 기재된 바와 같은 결실 돌연변이체 EGFR]가 포함된다. erbB1은 EGFR 단백질 생성물을 코딩하는 유전자를 지칭한다.

"ErbB2" 및 "HER2"란 표현은 본원에 상호교환적으로 사용되고, 예를 들면 문헌 [Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-8501 (1985) and Yamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986)]에 기재된 인간 HER2 단백질 (유전자 은행 수탁 번호 X03363)을 지칭한다. 용어 "erbB2"는 인간 HER2를 코딩하는 유전자를 지칭하고, "neu "는 쥐 p185^neu를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 바람직한 ErbB2는 본래의 서열 인간 ErbB2이다.

"ErbB3" 및 "HER3"은 예를 들면, 미국 특허 제5,183,884호 및 제5,480,968호 뿐만 아니라 문헌 [Kraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)]에 기재된 바와 같은 수용체 폴리펩티드를 지칭한다.

용어 "ErbB4" 및 "HER4"는, 예를 들면 문헌 [EP Pat Appln No 599,274; Plowman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750 (1993); and Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)]에 기재된 바와 같은 수용체 폴리펩티드 (예를 들면, WO 99/19488 (1999. 4. 22일에 공개됨)에 기재된 바와 같은 그의 이소형을 포함함)를 지칭한다.

"ErbB 리간드"란 ErbB 수용체에 결합하고 (하거나) 이를 활성화시키는 폴리펩티드를 의미한다. 본원에서 특별히 당해 ErbB 리간드는 본래의 서열 인간 ErbB 리간드, 예를 들면 상피 성장 인자 (EGF) [Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)]; 형질전환성 성장 인자 알파 (TGF-알파) [Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)]; 신경초종 또는 각질세포 자가분비성 성장 인자로서 공지되기도 한 암피레굴린 [Shoyab et al., Science 243:1074-1076 (1989); Kimura et al., Nature 348:257-260 (1990); and Cook et al., Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)]; 베타셀룰린 [Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); and Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)]; 헤파린-결합성 상피 성장 인자 (HB-EGF) [Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)]; 에피레굴린 [Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); and Komurasaki et al., Oncogene 15:2841-2848 (1997)], 헤레굴린 [하기 참조]; 뉴레굴린-2 (NRG-2) [Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)]; 뉴레굴린-3 (NRG-3) [Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)]; 뉴레굴린-4 (NRG-4) [Harari et al. Oncogene 18:2681-89 (1999)]; 또는 크립토 (CR-1) [Kannan et al., J. Biol. Chem. 272 (6):3330-3335 (1997)]이다. EGFR과 결합하는 ErbB 리간드에는 EGF, TGF-α, 암피레굴린, 베타셀룰린, HB-EGF 및 에피레굴린이 포함된다. ErbB3과 결합하는 ErbB 리간드에는 헤레굴린이 포함된다. ErbB4와 결합할 수 있는 ErbB 리간드에는 베타셀룰린, 에피레굴린, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 및 헤레굴린이 포함된다.

본원에 사용된 경우의 "헤레굴린" (HRG)은 미국 특허 제5,641,869호 또는 문헌 [Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)]에 기재된 바와 같은 헤레굴린 유전자 생성물에 의해 코딩된 폴리펩티드를 지칭한다. 헤레굴린의 예로는 헤레 굴린-α, 헤레굴린-β1, 헤레굴린-β2 및 헤레굴린-β3 [Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992) 및 미국 특허 제5,641,869호]; neu 분화 인자 (NDF) [Peles et al. Cell 69:205-216 (1992)]; 아세틸콜린 수용체 유도 활성 (ARIA) [Falls et al. Cell 72:801-815 (1993)]; 신경교성 성장 인자 (CGFs) [Marchionni et al., Nature, 362;312-318 (1993)]; 감각 및 운동 신경단위 유래된 인자 (SMDF) [Ho et al. J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)]; γ-헤레굴린 [Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)]이 있다. 상기 용어에는 본래 서열 HRG 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편 및(또는) 아미노산 서열 변이체, 예를 들면 그의 EGF-유사 도메인 단편 (예: HRGβ_177-244)이 포함된다.

본원에서 "ErbB 헤테로-올리고머"는 2개 이상의 상이한 ErbB 수용체를 포함하는 비공유적으로 결합된 올리고머이다. 이러한 복합체는 둘 이상의 ErbB 수용체를 발현하는 세포가 ErbB 리간드에 노출되는 경우에 형성될 수 있고, 예를 들면 문헌 [Sliwkowski et al. J. Biol. Chem., 269 (20):14661-14665 (1994)]에 기재된 바와 같이 면역침전에 의해 단리하고 SDS-PAGE로 분석할 수 있다. 이러한 ErbB 헤테로-올리고머의 예로는 EGFR-ErbB2, ErbB2-ErbB3 및 ErbB3-ErbB4 복합체가 있다. 더우기, 이러한 ErbB 헤테로-올리고머는 상이한 ErbB 수용체와 결합된 둘 이상의 ErbB2 수용체, 예를 들면 ErbB3, ErbB4 또는 EGFR을 포함할 수 있다. 사이토킨 수용체 아단위 (예: gp 130)와 같은 기타 단백질이 헤테로-올리고머에 포함될 수 있다.

"ErbB2 수용체의 리간드 활성화"는 당해 ErbB 수용체를 포함하는 ErbB 헤테로-올리고머에 대한 ErbB 리간드 결합에 의해 매개되는 시그날 형질도입 (예를 들면, ErbB 수용체 또는 기질 폴리펩티드에서 ErbB 수용체 인산화 티로신 잔기의 세포내 키나제 도메인에 의해 야기됨)을 의미한다. 일반적으로, 이것은 헤테로-올리고머 내의 하나 이상의 ErbB 수용체의 키나제 도메인을 활성화하는 ErbB 헤테로-올리고머에 대한 ErbB 리간드의 결합에 관련됨으로써 하나 이상의 ErbB 수용체 내의 티로신 잔기의 인산화를 일으키고 (키거나) 또다른 기질 폴리펩티드(들) 내의 티로신 잔기의 인산화를 일으킬 것이다. ErbB 수용체 활성화는 각종 티로신 인산화 검정법을 이용함으로써 정량화될 수 있다.

"본래의 서열" 폴리펩티드는 천연으로부터 유래된 폴리펩티드 (예를 들면, ErbB 수용체 또는 ErbB 리간드)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 그러한 본래 서열 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 본래 서열 폴리펩티드는 천연 인간 폴리펩티드, 쥐 폴리펩티드 또는 임의의 다른 포유류 종으로부터의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

용어 "아미노산 서열 변이체"는 본래 서열 폴리펩티드와 어느 정도 상이한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 아미노산 서열 변이체는 본래의 ErbB 리간드의 하나 이상의 수용체 결합 도메인과 또는 본래 ErbB 수용체의 하나 이상의 리간드 결합 도메인과 약 70％ 이상의 상동률을 가지며, 바람직하게는 그러한 수용체 또는 리간드 결합 도메인과 약 80％ 이상, 더욱 바람직하게 는 약 90％ 이상의 상동률을 가질 것이다. 아미노산 서열 변이체는 본래 아미노산 서열의 아미노산 서열 내 특정 위치에 치환, 결실 및(또는) 삽입을 갖는다.

"상동률"은 필요에 따라 최대 상동률을 달성하기 위하여, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후에 동일한 아미노산 서열 변이체 내의 잔기 비율 (％)로서 정의된다. 정렬 방법 및 이를 위한 컴퓨터 프로그램은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램 중의 하나가 "알라인 (Align) 2" [Genentech, Inc.에 의해 제작되어, 1991년 12월 10일자로 United States Copyright Office (Washington, DC 20559)에 사용자 문서분류 시스템으로 출원됨]이다.

본원에서의 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되는데, 구체적으로 언급하면, 본래의 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 둘 이상의 본래의 항체로부터 형성된 다중 특이적 항체 (예: 이중 특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포괄한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 이러한 집단 내에 포함된 개개의 항체는 미량으로 존재할 수도 있는 가능한 천연의 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 고도로 특이적이다. 더우기, 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 이러한 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않은 채로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 형질을 나타내며, 항체 생성을 어떠한 특정 방법으로 제한하지는 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음으로 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 [미국 특허 제4,816,567호 참조]으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들면 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및(또는) 경쇄의 일정 부분이 특정한 종으로부터 유래된 항체 또는 특정한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 상기 쇄의 나머지 부분이 또다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 뿐만 아니라 목적하는 활성을 나타내는 상기 항체의 단편 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체가 포함된다 [미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]. 본원에서 당해 키메라 항체에는 비-인간 "영장류" (예: Old World Monkey, Ape 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 영장류화 항체가 포함된다.

"항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합성 영역 또는 그의 가변 영역을 포함 하는, 본래 항체의 일정 부분을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아보디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편(들)으로부터 형성된 다중 특이적 항체가 있다.

"본래의" 항체는 항원 결합성 가변 영역 뿐만 아니라 경쇄 불변 영역 (C_L)과 중쇄 불변 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함하는 것이다. 이러한 불변 도메인은 본래의 서열 불변 도메인 (예: 인간 본래의 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 본래 항체가 하나 이상의 작용인자 기능을 갖는다.

항체 "작용인자 기능"은 항체의 Fc 영역 (본래의 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 작용인자 기능의 예로는 C1q 결합성; 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식작용; 세포 표면 수용체 (예: B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 있다.

이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 본래 항체를 상이한 "부류"로 정할 수 있다. 5가지 주 부류의 본래 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중의 몇 개는 추가로 "아부류" (이소형)로 나눌 수 있다: 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불리운다. 상이한 부류의 면역글로불린의 아단위 구조와 3차원 형태는 널리 공지되어 있다.

"항체-의존적 세포 매개된 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcRs)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 [예: 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 마크로파지]가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후에 표적 세포의 분해를 유발시키는 세포 매개된 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 Fc RIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464쪽의 표 3에 요약되어 있다. 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 작용인자 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 부가적으로, 당해 분자의 ADCC 활성은, 예를 들면 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다.

"인간 작용인자 세포"는 하나 이상의 FcRs를 발현하고 작용인자 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 Rc RIII를 발현하고 ADCC 작용인자 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있지만, PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 상기 작용인자 세포는 그의 본래 공급원, 예를 들면 본원에 기재된 바와 같은 PBMCs 또는 혈액으로부터 단리할 수 있다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합되는 수용체를 기재하는 데 사용된다. 바람직한 FcR은 본래 서열 인간 FcR이다. 그러나, 바람직한 FcR 은 IgG 항체와 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, 이것에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 아부류의 수용체가 포함되는데, 이는 이들 수용체의 대립유전자성 변이체와 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체에는 주로 그의 세포질 도메인에서만 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제성 수용체")가 포함된다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-이용된 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제성 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-이용된 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 [M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]. FcRs는 다음 문헌에서 고찰될 수 있다 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]. 앞으로 동정될 것을 포함한 기타 FcRs가 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 상기 용어에는 또한, 모체 IgG를 태아에게 전이시키는 것에 관여하는 신생아 수용체 FcRn이 포함된다 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)].

"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 이러한 보체 활성화 경로는 동종 항원과 복합체를 형성한 분자 (예: 항체)에 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 결합시킴으로써 개시한다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.

"본래의 항체"는 통상적으로, 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로-사량체성 당단백질이다. 각 경쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 디설파이드 연결 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄에 따라 다양하다. 각각의 중쇄와 경쇄는 규칙적으로 격리된 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각 중쇄는 한 말단에서의 가변 도메인 (V_H) 다음에 수 많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (V_L)을 가지고 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기가 경쇄와 중쇄 가변 도메인 간의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정한 부분이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타내고 그의 특정한 항원에 대한 각 특정 항체의 결합성과 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 이러한 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포 적용되는 것은 아니다. 이는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 모두에 있어서 초가변 영역으로 불리우는 3가지 세그먼트에 집중되어 있다. 보다 고도로 보존된 가변 도메인 부분이 골격 영역 (FRs)으로 불리운다. 본래의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FRs를 포함하는데, 크게는 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 몇몇 경우에는 상기 β-시트 구조의 형성부인 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 β-시트 형태를 취한다. 각 쇄에서의 초가변 영역은 FRs에 의해 서로 밀접하게 유지되어 있는데, 기타 쇄로부터의 초가변 영역의 경우에는, 항체의 항원-결합성 부위 형성에 도움이 된다 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적인 관련은 없지만, 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)에 항체가 참여하는 것과 같은 각종 작용인자 기능을 나타낸다.

본원에 사용된 경우의 용어 "초가변 영역"은 항원-결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 이러한 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 [예: 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및(또는) "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 [예: 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]를 포함한다. "골격 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

항체를 파파인 분해시키면, 각각 단일의 항원-결합 부위를 갖고 있는 2개의 동일한 항원-결합 단편 ("Fab" 단편으로 불리움)과 나머지 "Fc" 단편 (이의 명칭은 용이하게 결정화되는 그의 능력을 반영하고 있음)이 생성된다. 펩신 처리하면, 2 개의 항원-결합 부위를 갖고 있고 항원과 가교결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 부위와 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 1개의 중쇄와 1개의 경쇄 가변 영역이 비-공유 결합으로 서로 단단하게 연결되어 있는 이량체로 이루어진다. 이러한 배열에서는, 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 규정한다. 집합적으로 설명하면, 6개의 초가변 영역이 항체에 항원-결합 특이성을 부여해준다. 그러나, 심지어 1개의 가변 도메인 (또는 특정 항원에 특이적인 단지 3개의 초가변 영역을 포함하는 Fv의 절반)이, 전체 항원 부위 보다는 낮은 친화성이긴 하지만 항원을 인식하여 결합할 수 있는 능력을 갖고 있다.

Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 또한 함유하고 있다. 또한, Fab' 단편은 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인들을 포함하여 중쇄 CH1 영역의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가됨으로써 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 하나 이상의 자유 티올 기를 보유하고 있는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래, 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖고 있는 한 쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

모든 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 이들의 불변 영역의 아미노산 서열을 기준으로 하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리우는, 명백하게 별개인 2가 지 유형 중의 하나일 수 있다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 영역을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄로 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 해주는, V_H 및 V_L 영역 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대한 고찰은 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)]을 참조할 수 있다. 항-ErbB2 항체 scFv 단편은 WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호 및 미국 특허 제5,587,458호에 기재되어 있다.

용어 "디아보디"는 동일한 폴리펩티드 쇄 (V_H - V_L) 내에 가변 경쇄 도메인 (V_L)에 연결된 가변 중쇄 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖고 있는 작은 항체 단편을 지칭한다. 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 그 도메인들은 또다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성시킨다. 디아보디는, 예를 들어 문헌 [EP 404 097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 기재되어 있다.

비-인간 (예: 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 가진 마우스, 쥐, 토끼 또는 비-인간 영장류 등의 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 면역글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않은 잔기를 포함할 수도 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 증진시키도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FRs는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한, 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일정 부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일정 부분을 포함할 것이다. 추가의 상세한 내역은 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)].

인간화 항-ErbB2 항체로는 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (헤르셉틴 (등록상표)) [본원에 참조 문헌으로 삽입된 미국 특허 제5,821,337호의 표 3에 기재된 바와 같음]; 인간화 520C9 (WO 93/21319) 및 아래에 기재된 바와 같은 인간화 2C4 항체가 있다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경 성분으로부터 동정하여 분리 및(또는) 회수한 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 용도 또는 치료 용도를 방해할 수도 있는 물질이며, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단 백질성 용질이 포함될 수 있다. 바람직한 양태에서는, 상기 항체를 (1) 로우리 (Lowry) 방법으로 결정된 바와 같이 항체 95 중량％ 초과 수준으로 정제하거나, (2) 스피닝 컵 시퀘네이터 (sequenator)를 사용함으로써 N-말단의 15개 이상의 잔기 또는 내부 아미노산 서열을 수득하기에 충분한 정도로 정제하거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색물을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성이 되도록 하는 수준으로 정제할 것이다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 동일계 항체가 포함되는데, 이는 이러한 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 한가지 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

당해 항원, 예를 들면 ErbB2 항원과 "결합하는" 항체는 이러한 항체가 상기 항원을 발현하는 세포를 표적화하는데 있어서 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도로 상기 항원과 결합할 수 있는 것이다. 이러한 항체가 ErbB2와 결합하는 것인 경우, 이는 통상적으로, 기타 ErbB 수용체와는 달리 ErbB2와 우선적으로 결합할 것이고, EGFR, ErbB3 또는 ErbB4 등의 기타 단백질과는 실제적으로 교차 반응하지 않는 것일 수 있다. 이러한 양태에서는, 이들 비-ErbB2 단백질에 대한 항체의 결합도 (예: 내인성 수용체에 대한 세포 표면 결합도)가 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사선면역침전법 (RIA)에 의해 결정된 바와 같이 10％ 미만일 것이다. 종종, 항-ErbB2 항체는, 예를 들어 문헌 [Schecter et al., Nature 312:513 (1984) and Drebin et al., Nature 312:545-548 (1984)]에 기재된 바와 같이, 쥐 neu 단백질과 실제적으로 교차 반응하지 않을 것이다.

ErbB 수용체의 리간드 활성화를 "차단"시키는 항체는 상기 정의된 바와 같은 활성화를 감소시키거나 방지시키는 것인데, 여기서 상기 항체는 모노클로날 항체 4D5 보다 실질적으로 더 효율적으로, 예를 들면 대략 모노클로날 항체 7F3 또는 2C4 또는 그의 Fab 단편 만큼 효율적으로, 바람직하게는 대략 모노클로날 항체 2C4 또는 그의 Fab 단편 만큼 효율적으로 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시킬 수 있다. 예를 들면, ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체는 ErbB 헤테로-올리고머의 형성을 차단하는데 있어서 4D5 보다 약 50 내지 100％ 더 효율적인 것일 수 있다. ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 것은 어떠한 방법에 의해서든, 예를 들면 ErbB 수용체에 대한 리간드 결합, ErbB 복합체 형성, ErbB 복합체에서의 ErbB 수용체의 티로신 키나제 활성 및(또는) ErbB 수용체 내의 또는 이러한 수용체에 의한 티로신 키나제의 인산화를 방해함으로써 이루어질 수 있다. ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체의 예에는 모노클로날 항체 2C4 및 7F3 (이들은 ErbB2/ErbB3 및 ErbB2/ErbB4 헤테로-올리고머의 HRG 활성화; 및 EGFR/ErbB2 헤테로-올리고머의 EGF, TGF-α, 암피레굴린, HB-EGF 및(또는) 에피레굴린 활성화를 차단시킨다); 및 EGFR, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4를 발현하는 T47D 세포에 대한 EGF와 NDF의 결합을 차단시키는, L26, L96 및 L288 항체 [Klapper et al., Oncogene 14:2099-2109 (1997)]가 포함된다.

지정된 항체의 "생물학적 특징"을 가진 항체, 예를 들면 2C4로 지정된 모노클로날 항체는 이를 동일한 항원 (예: ErbB2)과 결합하는 기타 항체와 구별시키는 항체의 한가지 이상의 생물학적 특징을 보유하고 있는 것이다. 예를 들면, 2C4의 생물학적 특징을 가진 항체는 ErbB2 및 ErbB3 또는 ErbB4를 포함하는 ErbB 헤테로-올리고머의 HRG 활성화를 차단하고; EGFR 및 ErbB2를 포함하는 ErbB 수용체의 EGF, TGF-α, HB-EGF, 에피레굴린 및(또는) 암피레굴린 활성화를 차단하고; MAPK의 EGF, TGF-α 및(또는) HRG 매개된 활성화를 차단하고; 및(또는) 2C4에 의해 결합되는 것과 동일한, ErbB2의 세포외 도메인 내의 에피토프에 결합할 수 있다 (예를 들면, ErbB2에 대한 모노클로날 항체 2C4의 결합을 차단시킨다).

달리 지시되지 않는다면, "모노클로날 항체 2C4"란 표현은 아래 실시예의 쥐의 2C4 항체의 항원 결합성 잔기를 갖거나 또는 이러한 쥐의 2C4 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다. 예를 들면, 모노클로날 항체 2C4는 쥐의 모노클로날 항체 2C4 또는 쥐의 모노클로날 항체 2C4의 항원 결합성 아미노산 잔기를 보유하는 그의 변이체, 예를 들면 인간화 항체 2C4일 수 있다. 인간화 항체 2C4 항체의 예는 아래 실시예 3에 제공되어 있다. 달리 지시되지 않는다면, 본원에 사용된 "rhuMAb 2C4"란 표현은 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 임의로 발현되는 인간 경쇄 및 중쇄 IgG1 (비-A 이인자형) 불변 영역 서열에 융합된, 각각 서열 3 및 4의 가변 경쇄 (V_L) 및 가변 중쇄 (V_H) 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.

달리 지시되지 않는다면, "모노클로날 항체 4D5"란 표현은 쥐의 4D5 항체의 항원 결합성 잔기를 갖거나 이러한 쥐의 4D5 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다 (ATCC CRL 10463). 예를 들면, 모노클로날 항체 4D5는 쥐의 모노클로날 항체 4D5 또는 쥐의 모노클로날 항체 4D5의 항원 결합성 잔기를 보유하는 그의 변이체, 예를 들면 인간화 항체 4D5일 수 있다. 인간화 4D5 항체의 예로는 미국 특허 제5,821,337호에 기재된 바와 같은 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (헤르셉틴 (등록상표))이 있으며, huMAb4D5-8 (헤르셉틴 (등록상표))이 바람직한 인간화 4D5 항체이다.

본원에 사용된 경우의 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 특정 세포, 특히 ErbB 발현성 암 세포의 성장을 억제시키는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 이러한 성장 억제제는 S 상에서의 ErbB 발현성 세포의 비율을 상당히 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예로는 (S 상 이외의 위치에서) 세포 사이클 진행을 차단시키는 제제, 예를 들면 G1 정지와 M-상 정지를 유도하는 제제가 있다. 전통적인 M-상 차단제에는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포 II 억제제, 예를 들면 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1 정지 여파로 S-상 정지를 가져다 주는 제제는 예를 들면, DNA 알킬화제, 예를 들면 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C이다. 추가의 정보가 다음 문헌에 제시되어 있다 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13].

"성장 억제성" 항체의 예는 ErbB2와 결합하여 ErbB2를 과발현하는 암 세포의 성장을 억제시키는 것이다. 바람직한 성장 억제성 항-ErbB2 항체는 약 0.5 내지 30 g/㎖의 항체 농도에서 세포 배양물 중의 SK-BR-3 유방 종양 세포의 성장을 20％ 이상, 바람직하게는 50％ 이상 (예를 들면, 약 50％ 내지 약 100％) 억제시키는데, 이러한 성장 억제는 SK-BR-3 세포를 상기 항체에 노출시킨지 6일 후에 결정한다 [1997년 10월 14일자로 허여된 미국 특허 제5,677,171호 참조]. SK-BR-3 세포 성장 억제 검정은 상기 특허 및 다음에 보다 상세히 기재되어 있다. 바람직한 성장 억제성 항체는 모노클로날 항체 4D5, 예를 들면 인간화 4D5이다.

"세포 사멸을 유도하는" 항체는 생육 가능한 세포를 생육 불능으로 만드는 것이다. 이러한 세포는 일반적으로 특히 상기 세포가 ErbB2 수용체를 과발현하는 경우에 ErbB2 수용체를 발현하는 것이다. 바람직하게는, 상기 세포가 암 세포, 예를 들면 유방암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 타액선암, 폐암, 신장암, 결장암, 갑상선암, 췌장암 또는 방광암 세포이다. 시험관내에서는, 상기 세포가 SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 시험관내 세포 사멸은 항체-의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)에 의해 유도된 세포 사멸을 구별시켜 주는 면역 작용인자 세포 및 보체의 부재 하에서 결정할 수 있다. 따라서, 세포 사멸에 대한 검정법은 열 불활성화 혈청을 사용하고 (즉, 보체의 부재하) 면역 작용인자 세포의 부재 하에서 수행할 수 있다. 해당 분자가 세포 사멸을 유도하는지를 결정하기 위해서, 프로피듐 요오다이드 (PI), 트리판 블루 [Moore et al., Cytotechnology 17:1-11 (1995)] 또는 7AAD의 흡수로써 평가된 바와 같은 막 원형의 상실을 처리되지 않은 세포와 비교해서 평가할 수 있다. 바람직한 세포 사멸-유도성 항체는 BT474 세포에서의 PI 흡수 검 정에서 PI 흡수를 유도하는 것이다 (하기 참조).

"아폽토시스를 유도하는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 분절, 세포 수축, 소포체의 확장, 세포 분절, 및(또는) 막 소포 (아폽토시스체로 불리움)의 형성으로 결정된 바와 같이 계획된 세포 사멸을 유도하는 것이다. 이러한 세포는 통상적으로, ErbB2 수용체를 과발현하는 것이다. 바람직하게는, 상기 세포가 종양 세포, 예를 들면 유방암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 타액선암, 폐암, 신장암, 결장암, 갑상선암, 췌장암, 전립선암 또는 방광암 세포이다. 시험관내에서는, 상기 세포가 SK-BR-3, BT474, Calu 3 세포, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 아폽토시스과 연관된 세포성 사건을 평가하기 위한 각종 방법이 이용 가능하다. 예를 들면, 포스파티딜 세린 (PS) 전위는 아넥신 결합에 의해 측정할 수 있고; DNA 분절은 DNA 래더링 (laddering)을 통하여 평가할 수 있고, DNA 분절에 따른 핵/크로마틴 축합은 저이배체 세포에서의 어떠한 증가에 의해서도 평가할 수 있다. 바람직하게는, 아폽토시스를 유도하는 분자는 BT474 세포를 이용하는 아넥신 결합 검정에 있어서 처리되지 않은 세포와 비교하여 아넥신 결합을 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배 유도하는 분자이다 (하기 참조). 종종, 프로-아폽토시스성 항체는 ErbB 수용체의 ErbB 리간드 활성화를 추가로 차단시키는 것 (예를 들면, 7F3 항체)일 것이며; 즉 그 항체는 모노클로날 항체 2C4와 생물학적 특성을 공유한다. 다른 상황하에서는, 그 항체는 ErbB 수용체의 ErbB 리간드 활성화를 상당히 차단시키지 않는 것 (예를 들면, 7C2)이다. 추가로, 그 항체는 아폽토시스는 유도하면서 S 상의 세포 비율은 크게 감소 시키지 않는 7C2와 유사한 것일 수 있다 (예를 들면, 대조군에 비해 이들 세포 비율을 약 0 내지 10％ 정도만 감소시키는 것이다).

"에피토프 2C4"는 항체 2C4가 결합되는 ErbB2의 세포외 도메인 내의 영역이다. 2C4 에피토프에 결합하는 항체에 대해 스크리닝하기 위하여, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상의 교차-차단성 검정법을 수행할 수 있다. 또다른 방법으로는, 에피토프 지도화를 수행하여, 상기 항체가 ErbB2의 2C4 에피토프 (예를 들면, ErbB2의 약 22번 잔기에서 약 584번 잔기까지의 영역 내의 하나 이상의 잔기; 도 1A-B 참조)에 결합하는지를 평가할 수 있다.

"에피토프 4D5"는 항체 4D5 (ATCC CRL 10463)이 결합되는 ErbB2의 세포외 도메인 내의 영역이다. 이러한 에피토프는 ErbB2의 트랜스멤브레인 도메인에 근접해 있다. 4D5 에피토프에 결합하는 항체에 대해 스크리닝하기 위하여, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상의 교차-차단성 검정법을 수행할 수 있다. 또다른 방법으로는, 에피토프 지도화를 수행하여, 상기 항체가 ErbB2의 4D5 에피토프 (예를 들면, 약 529번 잔기에서 약 625번 잔기까지의 영역 내의 하나 이상의 잔기; 도 1A-B 참조)에 결합하는지를 평가할 수 있다.

"에피토프 3H4"는 항체 3H4가 결합되는 ErbB2의 세포외 도메인 내의 영역이다. 이러한 에피토프는 ErbB2 세포외 도메인의 아미노산 서열 내에 포함되는 약 541번 잔기에서 약 599번 잔기까지를 포함한다 (도 1A-B 참조).

"에피토프 7C2/7F3"은 7C2 및(또는) 7F3 항체 (각각이 ATCC에 기탁되어 있다, 하기 참조)가 결합되는 ErbB2의 세포외 도메인의 N 말단 영역이다. 7C2/7F3 에피토프에 결합하는 항체에 대해 스크리닝하기 위하여, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상의 교차-차단성 검정법을 수행할 수 있다. 또다른 방법으로는, 에피토프 지도화를 수행하여, 상기 항체가 ErbB2 상의 7C2/7F3 에피토프 (예를 들면, ErbB2의 약 22번 잔기에서 약 53번 잔기까지의 영역 내의 하나 이상의 잔기; 도 1A-B 참조)에 결합하는지를 평가할 수 있다.

"치료"란 용어는 치료학적 처치 및 예방 또는 방지 수단 둘다를 의미한다. 치료가 필요한 대상체에는 질환이 예방되어야 하는 대상체 뿐만 아니라 이미 질환을 앓고 있는 대상체가 포함된다. 그러므로, 본원에서 치료될 포유류는 질환을 가진 것으로 진단될 수 있거나 또는 질환에 걸리기 쉬울 수 있다.

"포유류"는 인간, 가축 및 축산용 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완용 동물, 예를 들면 개, 말, 고양이, 소 등을 포함한 포유류로서 분류된 모든 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.

"장애"에는 항-ErbB2 항체에 의한 치료에 의해 차도가 있는 어떠한 질환도 포함된다. 이에는 해당 포유류가 문제의 장애를 앓게 만드는 병리학적 상태를 포함한 만성 및 급성 장애 또는 질병이 포함된다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비제한적 예로는 양성 및 악성 종양; 백혈병 및 임파계 악성 종양; 신경단위성, 신경교성, 성상세포성, 시상하부 및 기타 선상, 마크로파지성, 상피, 위 및 블라스토 코엘릭 (blastocoelic) 장애; 및 염증, 혈관형성 및 면역학적 장애가 포함된다.

"치료 유효량"이란 용어는 포유류에서 특정 질병이나 장애를 치료하는데 유효한 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우에는, 해당 약물의 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소시키고; 종양 크기를 감소키기며; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제시키고 (즉, 어느 정도는 느리게 하고 바람직하게는 중지시킨다); 종양 전이를 억제시키며 (즉, 어느 정도는 느리게 하고 바람직하게는 중지시킨다); 종양 성장을 어느 정도를 억제시키고 (시키거나) 해당 암과 연관된 한가지 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있다. 해당 약물이 존재하는 암 세포 성장을 방지하고 (하거나) 사멸시킬 수 있는 정도에 따라, 이는 세포 증식억제성 또는 세포독성일 수 있다. 암 치료의 경우에는, 예를 들면 질병 진행 시간 (TTP)을 평가하고 (하거나) 반응률 (RR)을 결정함으로써 효능을 측정할 수 있다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 못한 세포 성장을 특징적으로 나타내는 포유류에서의 생리학적 질환을 지칭하거나 이를 기재한 것이다. 암의 예로는 암종, 임파종, 아세포종, 육종 및 백혈병 또는 임파계 악성 종양이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포암 (예: 상피 편평 세포암), 소(小)세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선종 및 폐의 편평 세포 암종을 포함한 폐암, 복막암, 간암, 위장암을 포함한 위암, 췌장암, 신경교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장 암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐만 아니라 뇌암 및 목암이 포함된다.

"ErbB-발현성 암"은 그의 세포 표면에 존재하는 ErbB 단백질을 갖는 세포를 포함하는 것이다. "ErbB-발현성 암"은 항-ErbB2 항체가 암에 결합하여 암에 대해 치료 효과를 가질 수 있도록, 그의 세포 표면에서 ErbB2를 충분한 정도로 생산하는 것이다.

ErbB 수용체의 "과도한 활성화를 특징으로 나타내는" 암은 암 세포 내의 ErbB 수용체 활성화도가 동일한 조직 유형의 비암성 세포 내의 수용체의 활성화도를 상당히 넘는 것이다. 그러한 과도한 활성화는 ErbB 수용체의 과발현으로부터 및(또는) 암 세포 내에서 ErbB 수용체를 활성화시키기 위해 이용가능한, 정상 수준 보다 훨씬 더 높은 수준의 ErbB 리간드로부터 일어날 수 있다. 그러한 과도한 활성화는 암 세포의 악성 상태를 일으킬 수 있으며 (있거나) 그에 의해 야기될 수 있다. 일부 양태에서, 암은 ErbB 수용체의 그러한 과도한 활성화를 일어나게 하는 ErbB 수용체의 증폭 및(또는) 과발현이 일어나는지는 결정하기 위한 진단 또는 예후 검정을 받을 것이다. 별법으로 또는 부가적으로, 암은 상기 수용체의 과도한 활성화에 기여하는 ErbB 리간드의 증폭 및(또는) 과발현이 암에서 일어나는지는 결정하기 위한 진단 또는 예후 검정을 받을 수 있다. 그러한 암의 일부에서, 수용체의 과도한 활성화는 자가분비성 자극 경로로부터 일어날 수 있다.

"자가분비성" 자극 경로에서는, ErbB 리간드 및 그의 동종 ErbB 수용체 둘다를 생성하는 암 세포에 의해 자기 자극이 일어난다. 예를 들면, 암은 EGFR을 발현 또는 과발현할 수 있으며 또한 EGFR 리간드 (예를 들면, EGF, TGF-α 또는 HB-EGF)를 발현 또는 과발현할 수 있다. 다른 양태에서, 암은 ErbB2를 발현 또는 과발현 할 수 있으며 헤레굴린 (예를 들면, γ-HRG)를 발현 또는 과발현할 수도 있다.

ErbB 수용체를 "과발현하는" 암은 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교해서, 그의 세포 표면에 상당히 높은 수준의 ErbB 수용체 (예: ErbB2)를 갖는 것이다. 이러한 과발현은 유전자 증폭에 의해 야기될 수 있거나 전사 또는 해독 증가에 의해 유발될 수 있다. ErbB 수용체 과발현은 세포 표면 상에 존재하는 ErbB 단백질의 증가 수준을 평가함으로써 (예를 들면, 면역조직화학 (IHC)을 통하여 평가함) 진단 또는 예후 검정에서 결정될 수 있다. 또다른 방법으로는, 또는 부가적으로, 예를 들어 형광성 동일계 하이브리드화 [FISH; WO 98/45479 (1998년 10월에 공개됨) 참조], 서던 블롯팅, 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예를 들면 실시간 정량적 PCR (RT-PCR)을 통하여 세포에서 ErbB-코딩 핵산 수준을 평가할 수 있다. 또한, 혈청과 같은 생물학적 유체 중에서 쉐드 (shed) 항원 (예: ErbB 세포외 도메인)을 측정함으로써 ErbB 수용체 과발현을 연구할 수도 있다 [미국 특허 제4,933,294호 (1990. 6. 12자로 허여됨); WO 91/05264 (1991. 4. 18자로 공개됨); 미국 특허 제5,401,638호 (1995. 3. 28자로 허여됨); 및 문헌 (Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990) 참조]. 상기 검정법들과 별도로, 숙련인은 각종 생체내 검정법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 탐지 가능한 표지 (예: 방사성 동위원소)로 임의로 표지시킨 항체에 환자 신체 내의 세포를 노출시킬 수 있는데, 이러한 항체가 환자 세포에 결합되어 있는 지의 여부는, 예를 들면 방사능에 대해 외부 스캐닝하거나 항체에 노출시키기 이전에 환자로부터 추출한 생검을 분석함으로써 평가될 수 있다.

역으로 말하면, "ErbB 수용체의 과발현을 특징적으로 나타내지 않는" 암은 진단 검정에서, 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교해서 정상적인 수준 보다 높은 수준의 ErbB 수용체를 발현하지 않는 암이다.

ErbB 리간드를 "과발현"하는 암은 동일한 조직 유형의 비암성 세포에 비해 상당히 더 높은 수준의 리간드를 생성시키는 것이다. 이러한 과발현은 유전자 증폭에 의해 야기될 수 있거나 전사 또는 해독 증가에 의해 유발될 수 있다. ErbB 리간드의 과발현은 환자에서, 예를 들면 종양 생검에서의 리간드 (또는 그것을 코딩하는 핵산)의 수준을 평가함으로써 또는 각종 진단학적 검정, 예를 들면 IHC, FISH, 서던 블롯팅, PCR 또는 상기 생체내 검정에 의해 진단학적으로 결정될 수 있다.

"호르몬 비의존성" 암은 그의 증식이, 암 세포에 의해 발현된 수용체에 결합되는 호르몬의 존재에 의존적이지 않은 암이다. 이러한 암은 종양 부위내 또는 종양 부위 근처의 호르몬 농도를 감소시키는 약리학적 또는 외과적 전략에 따른 투여시 임상적 퇴행을 진행하지 않는다. 호르몬 비의존성 암의 예로는 안드로겐 비의존성 전립선암, 에스트로겐 비의존성 유방암, 자궁내막암 및 난소암이 있다. 이러한 암은 호르몬 의존적 종양으로서 양성일 수 있고, 항호르몬 요법 후에 호르몬-민감성 단계로부터 호르몬-불응성 종양으로 진행할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지시키고 (시키거나) 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예: At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예를 들면 작은 분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소적 활성 독소 (이들의 단편 및(또는) 변이체 포함)를 포괄한다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 티오테파 및 사이클로스포스파미드 (CYTOXAN (상표명)) 등의 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판 등의 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파 등의 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로로에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드 등의 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴 등의 니트로스우레아; 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토 조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신 등의 항생물질; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU) 등의 항대사제; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트 등의 폴산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌 등의 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU 등의 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤 등의 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄 등의 항부신제; 프롤린산 등의 폴산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK (등록상표); 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 데카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들면 파클리탁셀 [TAXOL (등록상표), Brisol-Meyers Squibb Oncology, Princeton, NJ] 및 독세탁셀 (TAXOTERE (등록상표), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴 등의 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 있다. 이러한 정의에는 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제시키도록 작용하는 항호르몬제, 예를 들면 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타네 억제성 4(5)-이미다졸, 4-히드록실아목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (Fareston)을 포함한 항에스테로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 루이프롤리드 및 고세렐린 등의 항안드로겐; 및 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

본원에 사용된 용어 "EGFR-표적된 약물"은 EGFR에 결합하여 임의로 EGFR 활성화를 억제하는 치료제에 관한 것이다. 그러한 제제의 예로는 EGFR에 결합하는 항체 및 작은 분자를 포함한다. EGFR에 결합하는 항체의 예로는 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB 8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 제4,943,533호 참조, Mendelsohn et al.) 및 그의 변이체, 예를 들면 키메라화된 225 (C225) 및 재성형된 인간 225 (H225) (WO 96/40210, Imclone Systems Inc.]; 타입 II 돌연변이 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 제5,212,290호); EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체 (미국 특허 제5,891,996호); 및 EGFR에 결합하는 인간 항체 (WO 98/50433, Abgenix)가 있다. 항-EGFR 항체는 세포독성제와 결합되어 있는 면역결합체를 형성할 수 있다 (EP 659,439 A2, Merck Patent GmbH). EGFR에 결합하는 작은 분자의 예로는 ZD1839 (Astra Zeneca), CP-358774 (OSI/Pfizer) 및 AG1478이 있다.

"항혈관형성제"는 혈관의 발생을 차단하거나 어느 정도 방해하는 화합물을 의미한다. 항혈관형성 인자는 예를 들면 혈관형성을 촉진시키는데 관련있는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는 작은 분자 또는 항체일 수 있다. 본원에서 바람직한 항혈관형성 인자는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 결합하는 항체이다.

"사이토킨"은 다른 세포 상에서 세포간 매개자로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반명이다. 그러한 사이토킨의 예로는 임포킨, 모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토킨 중에는 성장 호르몬, 예를 들면 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들면 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α및 -β; 물레리안-억제 물질; 마우스 고난도트로핀 관련 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들면 NGF-β; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGFs), 예를 들면 TGF-α및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들면 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSFs), 예를 들면 마크로파지-CSF (M-CSF); 과립구-마크로파지-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (ILs), 예를 들면 IL-1, IL-1α,IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들면 TNF-α및 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)을 비롯한 기타 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 사이토킨은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물 및 본래 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물로부터의 단백질을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로드럭 (prodrug)"은 모 약물과 비교해서 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고 보다 활성인 모 형태로 효소적 활성화되거나 전환될 수 있는, 제약학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태이다 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]. 본 발명의 프로드럭에는 보다 활성인 세포독성 자유 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트 함유 프로드럭, 티오포스페이트 함유 프로드럭, 설페이트 함유 프로드럭, 펩티드 함유 프로드럭, D-아미노산-변형된 프로드럭, 글리코실화 프로드럭, β-락탐 함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세타미드 함유 프로드럭, 5-플루오로시토신 및 기타 5-플루오로우리딘 프로드럭이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용하기 위한 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예에는 상기 언급된 화학요법제가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

"리포솜"은 약물 (예: 본원에 기재된 항-ErbB2 항체, 및 임의로 화학요법제) 을 포유류에게 전달하는데 유용한 각종 유형의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 이러한 리포솜의 성분은 생물학적 막의 지질 배열과 유사하게, 이층 형성물로 통상 배열된다.

용어 "포장 삽입물"은 치료학적 생성물의 사용에 관한 필요한 조치, 사용량, 투여량, 금기 사항 및(또는) 경고에 관한 정보를 함유하는, 상기 치료학적 생성물의 시판용 포장에 통상 포함된 지시사항을 지칭하는데 사용된다.

"심보호제"는 안트라사이클린 항생물질 및(또는) 항-ErbB2 항체와 같은 약물을 환자에게 투여하는 것과 관련된 심근부전증 (즉, 심근증 및(또는) 울혈성 심장병)를 예방하거나 경감시키는 화합물 또는 조성물이다. 이러한 심보호제는, 예를 들면 자유 라디칼 매개된 심독성 효과를 차단 또는 감소시키고 (시키거나) 산화적-스트레스 상해를 예방 또는 감소시킬 수 있다. 본 발명의 정의에 포괄된 심보호제의 예로는 철-킬레이트제 덱스라족산 (ICRF-187) [Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy 28:1063-1072 (1994)]; 지질 저하제 및(또는) 산화방지제, 예를 들면 프로부콜 [Singal et al. J. Mol. Cell Cardiol. 27:1055-1063 (1995)]; 아미포스틴 [아미노티올 2-[(3-아미노프로필)아미노]에탄티올-디히드로겐 포스페이트 에스테르 (WR-2721로 명명되기도 함), 및 그의 탈인산화 세포내 흡수 형태 (WR-1065로 명명되기도 함)] 및 S-3-(3-메틸아미노프로필아미노)프로필포스포로티오산 (WR-151327) [Green et al., Cancer Research 54:738-741 (1994)]; 디곡신 [Bristow, M.R. In: Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease. New York: Elsevier 191-215 (1980)]; 베타-차단제, 예를 들면 메토프롤올 [Hjalmarson et al., Drugs 47:Suppl 4:31-9 (1994); and Shaddy et al., Am. Heart J. 129:197-9 (1995)]; 비타민 E; 아스코르브산 (비타민 C); 자유 라디칼 스캐빈저, 예를 들면 올레아놀산, 우르솔산 및 N-아세틸시스테인 (NAC); 스핀 트랩핑 화합물, 예를 들면 알파-페닐-3급-부틸 니트론 (PBN) [Paracchini et al., Anticancer Res. 13:1607-1612 (1993)]; 셀레노유기 화합물, 예를 들면 P251 (Elbesen) 등이 있다.

"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원에서 통상 연합되어 있는 한가지 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정 및 분리되는 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 천연상 발견되는 형태나 세팅 이외의 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 것과 같은 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자에는, 예를 들어 해당 핵산 분자가 천연 세포의 것과 상이한 염색체 위치에 있는 항체를 통상 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "조절 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열에는, 예를 들면 프로모터, 임의의 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서 (enhancer)를 이용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때 "작동적으로 연결"된다. 예를 들면, 프레서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA는 이것이 폴리펩티드의 분비에 관여하는 프레단백질로서 발현되는 경우에 상기 폴리펩티드에 대한 DNA와 작동적으로 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향 을 미치는 경우에 상기 코딩 서열과 작동적으로 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 이것이 해독을 촉진하도록 위치된 경우에 코딩 서열과 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비성 리더의 경우에는, 판독 상 내에 연속된다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속되지 않아도 된다. 연결은 편리한 제한 부위에서 연결함으로써 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 실시에 따라서 사용한다.

본원에 사용된 바와 같은 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용되고 이러한 명칭 모두는 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"에는 전이 횟수에 상관없이 이로부터 유래된 1차 대상 세포 및 배양물이 포함된다. 또한, 의도하거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해, 모든 자손이 DNA 성분에 있어서 정확하게 동일하지 않을 수 있다는 것을 인지해야 한다. 최초로 형질전환된 세포에 대해 스크리닝된 바와 동일한 기능이나 생물학적 활성을 가진 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도된 경우, 이는 그 문맥에서 명확해질 것이다.

II. 항-ErbB2 항체의 생성

다음은 본 발명에 따라서 사용된 항체의 예시적 생성 기술에 관한 것이다. 항체 생성에 사용될 ErbB2 항원은, 예를 들면 ErbB2의 세포외 도메인의 가용성 형태, 또는 목적하는 에피토프를 함유하는 그의 부분일 수 있다. 또다른 한편, 이들의 세포 표면에서 ErbB2를 발현하는 세포 [예: ErbB2를 과발현하도록 형질전환된 NIH-3T3 세포; 또는 SK-BR-3 세포 등의 암종 세포주 (Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)]를 사용하여 항체를 생성할 수 있다. 항체 형성에 유용한 기타 형태의 ErbB2가 당해 분야의 숙련인에게 명백할 것이다.

(i) 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 바람직하게는, 관련된 항원과 보조액을 다수 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사함으로써 동물에게서 형성된다. 이기능성 또는 유도체화제, 예를 들면 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 결합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂ 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬기이다)을 사용하여, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소의 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 결합시키는 것이 유용할 수 있다.

상기 단백질 또는 결합체 100 g 또는 5 g (각각 토끼 또는 마우스에 대한 용량임)을 3 용적의 프로인트 완전 보조액과 합한 다음 이 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 상기 항원, 면역원성 결합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 보조액 내의 펩티드 또는 결합체 최초 양의 1/5 내지 1/10을 이용하여 다중 부위에 피하 주사함으로써 상기 동물을 부스터한다. 7일 내지 14일 후에, 상기 동물을 채혈하여 혈청을 대상으로 항체 역가를 검정한다. 역가치가 안정화될 때까지 동물을 부스터시킨다. 바람직하게는, 동일한 항원의 결 합체이긴 하지만, 상이한 단백질과 결합되어 있고 (있거나) 상이한 가교결합체를 통하여 결합된 결합체로 동물을 부스터시킨다. 결합체는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합물로서 만들 수도 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.

(ii) 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되는데, 즉 이러한 집단 내에 포함된 개개의 항체는 미량으로 존재할 수도 있는 가능한 천연의 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 형질이 별개 항체의 혼합물이 아니라는 것을 나타낸다.

예를 들면, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조하거나 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적당한 숙주 동물 (예: 햄스터)을 상기 언급된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질과 특이적으로 결합될 항체를 생성시키거나 생성시킬 수 있는 임파구를 유도한다. 별법으로, 임파구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 적합한 융합 유도제, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 임파구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].

이로써 생성된 하이브리도마 세포를, 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 이나 생존을 억제시키는 하나 이상의 물질을 바람직하게 함유하는 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들면, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우에는, 상기 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결여된 세포의 성장을 억제시키는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 안정적인 고수준 항체 생성을 지지해주며 HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 쥐의 골수종 세포주, 예를 들면 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것 [Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA로부터 입수 가능함], 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 [American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA로부터 입수 가능함]이다. 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종 골수종 세포주가 또한 다음 문헌에 기재되었다 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); and Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 대상으로 하여, 상기 항원에 대한 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법에 의해 결정하거나, 또는 시험관내 결합 검정법, 예를 들면 방사선면역검정법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 검정법 (ELISA)에 의해 결정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들면 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐챠드 분석법으로 결정할 수 있다.

목적하는 특이성, 친화성 및(또는) 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 클론을 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝한 다음 표준 방법으로 성장시킬 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는, 예를 들면 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물 내에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.

상기 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 과정, 예를 들면 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리시키는 것이 적합하다.

상기 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정 (예를 들면, 쥐의 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 사용하여 용이하게 단리 및 서열화한다. 상기 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 위치시킨 다음, 숙주 세포, 예를 들면 이. 콜리 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 항체 단백질을 생성시키지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체 를 합성할 수 있다. 항체를 코딩하는 세균성 DNA에서의 재조합 발현에 관한 문헌에는 다음과 같은 것이 있다 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)].

추가의 양태에서는, 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 발생된 항체 파지 라이브러리로부터 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 단리시킬 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용하여 쥐의 항체와 인간 항체를 각각 분리하는 방법이 기재되어 있다. 다음 공개 문헌에는 연쇄 셔플링에 의한 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생성 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)] 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서 생체내 재조합과 조합 감염 방법이 기재되어 있다 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 단리시키기 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 존립 가능한 대체 방안이다.

상기 DNA는 또한, 예를 들면 상동성 쥐 서열 대신에 인간 중쇄와 경쇄 불변 도메인을 코딩 서열로 대체함으로서 변형시킬 수 있거나 [미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)], 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유적으로 연결함으로써 변형시킬 수 있다.

전형적으로, 항체의 불변 도메인을 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드로 대 체시키거나, 또는 항체의 1개의 항원-결합성 부위의 가변 도메인을 이들 폴리펩티드로 대체시켜, 항원에 대한 특이성을 가진 1개의 항원-결합성 부위와 상이한 항원에 대한 특이성을 가진 또다른 항원-결합성 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.

(iii) 인간화 항체

비인간 항체를 인간화시키는 방법이 당해 분야에 보고되었다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비인간 공급원으로부터 이에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화 과정은 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써, 문헌 [Winter and co-workers, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]의 방법에 따라서 필수적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 본래의 인간 가변 도메인 보다 실질적으로 적은 서열을 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환시킨 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호 참조)이다. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 초가변 영역 잔기와 가능하게는 몇몇 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환되는 인간 항체이다.

인간화 항체를 만드는데 사용될 인간 가변 도메인 (경쇄와 중쇄 둘 다)의 선택은 항원성을 저하시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-피트" 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러 리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 것과 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 골격 영역 (FR)으로서 인정한다 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]. 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 아그룹의 모든 인간 항체의 콘센서스 서열로부터 유래된 특정한 골격 영역을 사용한다. 동일한 골격은 수 개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용할 수도 있다 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)].

항원에 대한 고친화성과 기타 바람직한 생물학적 특성들은 보존하면서 항체를 인간화시키는 것이 또한 중요하다. 바람직한 방법에 따라서 이러한 목적을 달성하기 위해서는, 모 서열과 인간화 서열의 3차원적 모델을 사용하여 모 서열과 각종 개념적 인간화 생성물을 분석하는 방법에 의해 인간화 항체를 제조한다. 3차원적 면역글로불린 모델은 통상 입수 가능하고 당해 분야의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 유망한 3차원 입체 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이들 디스플레이를 검사함으로써, 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 상기 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있는데, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원과 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자와 수입 서열로부터 선택 및 결합하여, 목적하는 항체 특징, 예를 들면 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가를 달성한다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기가, 항원 결합성에 영향을 미치는데 있어서 직접적이고도 가장 실질적으로 관련이 있다.

하기 실시예 3에는 ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 예시적 인간화 항-ErbB2 항체의 생성 방법이 기재되어 있다. 본원에서의 당해 인간화 항체는 거의 쥐 모노클로날 항체 2C4 (또는 그의 Fab 단편) 만큼 효율적으로 MAPK의 EGF, TGF-α 및(또는) HRG 매개된 활성화를 차단시키고 (시키거나) 거의 쥐 모노클로날 항체 2C4 (또는 그의 Fab 단편) 만큼 효율적으로 ErbB2에 결합한다. 본원에서의 인간화 항체는, 예를 들면 인간 가변 중쇄 도메인 내로 혼입된 비인간 초가변 영역 잔기를 포함할 수 있고, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제시된 가변 도메인 넘버링 시스템에 따를 때, 69H, 71H 및 73H로 이루어진 군 중에서 선택된 위치에서 골격 영역 (FR) 치환체를 추가로 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 인간화 항체가 69H, 71H 및 73H의 2개 위치 또는 모든 위치에서 FR 치환체를 포함한다.

본원에서 당해 예시적 인간화 항체는 가변 중쇄 상보성 결정 잔기 GFTFTDYTMX (여기서, X는 바람직하게는 D 또는 S (서열 7)임); DVNPNSGGSIYNQRFKG (서열 8); 및(또는) NLGPSFYFDY (서열 9)를 포함하며, 임의로 예를 들면 그 변형이 항체의 친화도를 거의 유지하거나 개선시킨다면 CDR 잔기의 아미노산 변형물을 포함한다. 예를 들면, 당해 항체 변이체는 상기 가변 중쇄 CDR 서열 내에 약 1 내지 약 7개 또는 약 5개의 아미노산 치환부를 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체는, 예를 들면 하기하는 바와 같은 친화도 성숙에 의해 제조될 수 있다. 가장 바람직한 인간화 항체는 서열 4에서의 가변 중쇄 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

인간화 항체는, 예를 들면 이전 단락의 가변 중쇄 도메인 CDR 잔기 이외에, 가변 경쇄 상보성 결정 잔기 KASQDVSIGVA (서열 10); SASYX¹X²X³ (여기서, X¹은 바람직하게는 R 또는 L이고, X²는 바람직하게는 Y 또는 E이고, X³은 바람직하게는 T 또는 S (서열 11)임); 및(또는) QQYYIYPYT (서열 12)를 포함할 수 있다. 그러한 인간화 항체는 임의로 항체의 친화도를 거의 유지하거나 개선시킨다면 상기 CDR 잔기의 아미노산 변형물을 포함한다. 예를 들면, 상기 가변 경쇄 CDR 서열 내에 약 1 내지 약 7개 또는 약 5개의 아미노산 치환부를 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체는, 예를 들면 하기하는 바와 같은 친화도 성숙에 의해 제조될 수 있다. 가장 바람직한 인간화 항체는 서열 3에서의 가변 경쇄 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

본 출원은 ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 친화도 성숙된 항체를 포함한다. 모 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체, 예를 들면 각각 서열 3 및 4의 가변 경쇄 및(또는) 중쇄 서열을 포함하는 것 (즉, 변이체 574)일 수 있다. 친화도 성숙된 항체는 바람직하게는 쥐 2C4 또는 변이체 574의 것 보다 탁월한 친화도 (예를 들면, ErbB2-세포외 도메인 (ECD) ELISA를 이용하여 평가된, 약 2 또는 약 4배 내지 약 100배 또는 약 1000배 개선된 친화도)로 ErbB2 수용체에 결합한다. 치환시키기 위한 예시적 가변 중쇄 CDR 잔기에는 H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 또는 둘 이상의 잔기 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 잔기)의 조합물이 포함된다. 변화시키기 위한 예시적 가변 경쇄 CDR 잔기에는 L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 또는 둘 이상의 잔기 (예를 들 면, 2 내지 3, 4, 5 또는 약 10개 이하의 잔기)의 조합물이 포함된다.

각종 형태의 인간화 항체 또는 친화도 성숙된 항체가 고려된다. 예를 들면, 인간화 항체 또는 친화도 성숙된 항체는 항체 단편, 예를 들면 Fab일 수 있으며, 그것은 임의로 면역결합체를 형성시키기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)과 결합된다. 또다른 한편으로, 인간화 항체 또는 친화도 성숙된 항체는 본래의 항체, 예를 들면 본래의 IgG1 항체일 수 있다.

(iv) 인간 항체

인간화에 대한 대체 방안으로서, 인간 항체를 형성시킬 수 있다. 예를 들면, 면역화시, 내인성 면역글로불린 생성 부재 하의 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자이식성 동물 (예: 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들면, 키메라 및 배선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합성 영역 (J_H) 유전자의 동형 결합성 결실로 인해, 내인성 항체 생성이 완전히 억제된다고 보고된 바 있다. 이러한 배선 돌연변이 마우스에서의 인간 배선 면역글로불린 유전자 배열의 전이로 인해, 항원 챌린지시 인간 항체가 생성될 것이다 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 및 미국 특허 제5,591,669호; 제5,589,369호; 및 제5,545,807호].

별법으로, 파지 디스플레이 기술 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 사용하여 비면역화 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전 자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체와 항체 단편을 생성할 수 있다. 이러한 기술에 따라서, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트상 박테리오파지, 예를 들면 M13 또는 fd의 메이져 또는 마이너 외피 단백질 내로 프레임내 클로닝시키고, 파지 입자 표면 상에 기능성 항체 단편을 디스플레이하였다. 필라멘트상 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 복사물을 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 근거로 한 선택으로 인해, 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 선별된다. 따라서, 상기 파지는 B-세포의 몇몇 특성을 모사한다. 파지 디스플레이는 각종 포맷으로 수행할 수 있다. 이에 대한 고찰은 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조할 수 있다. V-유전자 세그먼트의 몇몇 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리를 작제할 수 있고, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술을 필수적으로 수행하여 다양한 배열의 항원 (자가 항원 포함)에 대한 항체를 단리시킬 수 있다 [미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참조].

상기 논의된 바와 같이, 인간 항체를 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성시킬 수도 있다 [미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조].

인간 항-ErbB2 항체가 미국 특허 제5,772,997호 (1998. 6. 30자 허여됨) 및 WO 97/00271 (1997. 1. 3자 공개됨)에 기재되어 있다.

(v) 항체 단편

항체 단편을 생성하기 위한 각종 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 본래 항체를 단백질 분해적 분해함으로써 유도된 것이었다 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); and Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]. 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성할 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜리로부터 직접적으로 회수할 수 있고, F(ab')₂ 단편을 형성하도록 화학적으로 커플링시킬 수 있다 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 또다른 접근법에 따라서, F(ab')₂ 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리할 수 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 기타 기술이 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다. 기타 양태에서는, 선택된 항체가 단일쇄 Fv 단편 (svFv)이다 [WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호 참조]. 이러한 항체 단편은 또한, 예를 들면 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일 특이적이거나 이중 특이적일 수 있다.

(vi) 이중 특이적 항체

이중 특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가진 항체이다. 예시적 이중 특이적 항체는 ErbB2 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 기타 항체는 ErbB2 결합 부위를 EGFR, ErbB3 및 ErbB4에 대한 결합 부위와 결합시킬 수 있다. 별법으로, 항-ErbB2 아암 (arm)은 백혈구 상의 촉발성 분자, 예를 들면 T-세포 수용체 분자 (예: CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcR), 예를 들면 Fc RI (CD64), Fc RII (CD32) 및 Fc RIII (CD16)에 결합하는 아암과 결합하여, 세포성 방어 기전이 ErbB2-발현성 세포에 초점을 맞추도록 할 수 있다. 이중 특이적 항체를 사용하여, ErbB2를 발현하는 세포에 세포독성제를 국재시킬 수도 있다. 이 항체는 ErbB2-결합 아암 및 세포독성제 (예를 들면, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는방사성 동위원소 햅텐)와 결합하는 아암을 갖고 있다. 이중 특이적 항체는 완전 길이 항체 또는 항체 단편 (예를 들면, F(ab')₂ 이중 특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.

WO 96/16673에는 이중 특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체가 기재되어 있고, 미국 특허 제5,837,234호에는 이중 특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체가 기재되어 있다. 이중 특이적 항-ErbB2/Fcα 항체가 WO 98/02463에 제시되어 있다. 미국 특허 제5,821,337호에는 이중 특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체가 기재되어 있다.

이중 특이적 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 완전한 길이의 이중 특이적 항체의 전통적인 생성 방법은 상이한 특이성을 가진 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 함께 발현시키는 것에 근거하고 있다 [Milstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (quadroma)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키는데, 이들 중의 단지 1개만이 정확한 이중 특이적 구조를 지니고 있다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계로써 수행되는 이러한 정확한 분자의 정제 과정이 오히려 번거로운 단계이며, 생성물 수율은 낮다. 유사한 과정이 문헌 [WO 93/08829; and Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

상이한 접근법에 따라서, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 가진 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이러한 융합은 바람직하게는, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 이러한 융합물의 하나 이상에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물을 코딩하고, 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 이들을 적합한 숙주 유기체 내로 함께 형질감염시킨다. 이로써, 해당 작제에 사용된 동등하지 않은 비율의 3가지 폴리펩티드 쇄가 최적의 수율을 제공하는 양태에서 이들 3가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동등한 비율의 둘 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 가져다 주는 경우나 이러한 비율이 특별한 유의성이 없는 경우에는, 3가지 폴리펩티드 쇄 중의 2개 또는 이들 모두에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터 내에 삽입하는 것이 가능하다.

이러한 접근법의 바람직한 양태에서, 이중 특이적 항체는 하나의 아암에 제1 결합 특이성을 가진 하이브리드 면역글로불린 중쇄와, 다른 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공해줌)을 갖고 있다. 이러한 비대칭 구조가, 바람직하지 못한 면역글로불린 쇄 조합물로부터의 목적하는 이중 특이적 화합물의 분리를 촉진시켜주는 것으로 밝혀졌는데, 이는 면역글로불린 경쇄가 이러한 이중 특이적 분자의 절반에만 존재함으로 인해 용이한 분리 방법을 제공해주기 때문이다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 기재되어 있다. 이중 특이적 항체 생성에 대한 추가의 내용은, 예를 들면 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조할 수 있다.

미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또다른 접근법에 따르면, 항체 분자 쌍 간의 계면을 유전공학적으로 처리하여, 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로 이량체의 비율 (％)을 최대화할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서는, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예: 티로신 또는 트립토판)으로 대체시킨다. 큰 측쇄(들)을 동일하거나 유사한 크기의 "공동"으로 보상하는 것은 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 아미노산 (예: 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체시킴으로써 제2 항체 분자의 계면 상에서 일어난다. 이로써, 기타 바람직하지 못한 최종 생성물 (예: 호모이량체)에 비해 헤테로 이량체의 수율을 증가시키는 기전이 제공된다.

이중 특이적 항체는 가교결합 또는 "이형결합성" 항체를 포함한다. 예를 들 면, 이형결합체 내의 한 항체는 아비딘에 결합될 수 있고 다른 항체는 비오틴에 결합될 수 있다. 그러한 항체는 예를 들면 원치않는 세포로 면역계 세포를 표적화하고 (미국 특허 제4,676,980호) HIV 감염을 치료하기 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안된다. 이형결합성 항체는 통상의 가교 결합법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제는 많은 가교결합 기술과 함께 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.

항체 단편으로부터 이중 특이적 항체를 생성시키기 위한 기술이 당해 분야의 문헌에 보고되었다. 예를 들면, 이중 특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]에는 본래 항체를 단백질 분해적으로 절단하여 F(ab')₂ 단편을 생성시키는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편을, 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지시키기 위해 디티올 복합체 형성제 나트륨 아르세나이트의 존재 하에 환원시킨다. 이어서, 이로써 발생된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중의 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고, 이를 등몰량의 기타 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중 특이적 항체를 형성시킨다. 이로써 생성된 이중 특이적 항체를 선택적인 효소 고정화용 제제로서 사용할 수 있다.

최근의 과학 발달로 인해, 이. 콜리로부터 Fab'-SH 단편을 직접적으로 회수하는 과정이 촉진되었는데, 이러한 단편은 화학적으로 커플링시켜 이중 특이적 항 체를 형성시킬 수 있다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)]에는 완전히 인간화된 이중 특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생성 방법이 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜리로부터 개별적으로 분비시키고, 시험관내에서 직집적으로 화학적 커플링시켜 이중 특이적 항체를 형성시켰다. 이로써 형성된 이중 특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포와 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있었을 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 임파구의 용균 활성을 촉발시킬 수 있었다.

재조합 세포 배양물로부터 이중 특이적 항체 단편을 직접적으로 제조 및 단리하는 각종 기술이 또한 보고되었다. 예를 들면, 이중 특이적 항체는 루이신 지퍼 (zipper)를 사용하여 생성하였다 [Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터 상기 루이신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2가지 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 이러한 항체 호모-이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 다음, 재산화시켜 항체 헤테로 이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 또한 항체 호모-이량체를 생성하는데 활용할 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아보디" 기술은 이중 특이적 항체 단편을 제조하는 또다른 기전을 제공해주었다. 이러한 단편은 너무 짧아 동일한 쇄 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성시키지 못하는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H와 V_L 도메인은 또다른 단편의 상보적 V_L과 V_H 도메인과 쌍을 형성하게 됨으로써, 2개의 항원 결합성 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 이중 특이적 항체 단편을 제조하는 또다른 전략이 또한 다음 문헌에 보고되었다 [Grubber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)].

2가 이상의 항체가 고려된다. 예를 들면, 삼중 특이적 항체를 제조할 수 있다 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].

(vii) 기타 아미노산 서열 변형물

본원에 기재된 항-ErbB2 항체의 아미노산 서열 변형물(들)이 고려된다. 예를 들면, 이러한 항체의 결합 친화도 및(또는) 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항-ErbB2 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오티드를 변화를 상기 항-ErbB2 항체 핵산에 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변형에는, 예를 들면 항-ErbB2 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및(또는) 잔기로의 삽입 및(또는) 잔기의 치환이 포함된다. 최종 작제물에 도달하기 위한 어떠한 결실, 삽입 및 치환의 조합도 가능한데, 단 최종 작제물은 목적하는 특징을 보유해야 한다. 상기 아미노산 변화는 또한, 항-ErbB2 항체의 해독 후 과정을 변형시킬 수 있는데, 예를 들면 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.

돌연변이 유발에 바람직한 위치인, 항-ErbB2 항체의 특정 잔기 또는 영역을 동정하는데 유용한 방법이 문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불리운다. 여기서는, 표적 잔기 또는 잔기 그룹을 동정하고 (예를 들면, 하전된 잔기, 예를 들면 arg, asp, his, lys 및 glu), 이를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시킴으로써, 상기 아미노산과 ErbB2 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 이러한 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 부위들은, 추가의 또는 기타 변이체를 치환 부위에 또는 치환 부위 대신에 도입함으로써 정련된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정되긴 하지만, 돌연변이 자체의 성질은 예정될 필요가 없다. 예를 들면, 소정의 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해서, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발을 수행하고, 발현된 항-ErbB2 항체 변이체를 대상으로 하여, 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입물에는 길이가 1개의 잔기에서 수 백개 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합물 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입물이 포함된다. 말단 삽입물의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항-ErbB2 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체가 포함된다. 항-ErbB2 항체 분자의 기타 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예: ADEPT용 효소)에 대한 항-ErbB2 항체의 N- 또는 C-말단의 융합물이 포함된다.

또다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기로써 대체된, 항-ErbB2 항체 분자 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환적 돌연변이 유발에 가장 큰 관심을 끄는 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변형도 또한 고려된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환부"란 표제 하에 표 1에 제시되어 있다. 이러한 치환으로 생물학적 활성이 변하게 되면, 표 1에서 "예시적 치환부"로 명명되거나 아미노산 부류를 참조하여 다음에 추가로 기재된 바와 같은 보다 실재적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물을 스크리닝하게 된다.

<표 1>

본래의 잔기	예시적 치환기	바람직한 치환기
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; asp; lys; arg	gln
Asp (D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
Gln (Q)	asn; glu	asn
Glu (E)	asp; gln	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; 노르루이신	leu
Leu (L)	노르루이신; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	Thr	thr
Thr (T)	Ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; 노르루이신	leu

생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하 여 다음 그룹으로 구분된다:

(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다.

항-ErbB2 항체의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 항체에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다 (특히, 상기 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예: 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환한 것과 관련이 있다. 일반적으로, 이로써 생성된, 추가의 개발을 위해 선택된 변이체(들)은 이들을 생성시킨 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 지닐 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성시키는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용하는 친화도 성숙화 과정을 포함한다. 간략하게 언급하면, 몇 개의 초가변 영역 부위 (예: 6 내지 7개 부위)를 돌연변이시켜 각 부위에 가능한 모든 아미노산 치환부를 생성시킨다. 이로써 생성된 항체 변이체는, 각 입자 내에 포장된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 필라멘트상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 이와 같이 파지 디스플레이된 변이체를 대상으로 하여, 본원에 기재된 바와 같이 이들의 생물학적 활성 (예: 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형에 적합한 후보 초가변 영역 부위를 동정하기 위해서는, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여, 실질적으로 항원 결합성에 기인되는 초가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 상기 항체와 인간 ErbB2 간의 접촉점을 동정하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기와 이에 이웃하는 잔기가 본원에서 검토된 기술에 따라서 치환하기 위한 후보이다. 이러한 변이체가 일단 생성되면, 변이체 패널을 대상으로 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 한가지 이상의 관련 검정법에서 탁월을 특성을 나타내는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.

항체의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 항체 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.

항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.

항체로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

항-ErbB2 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조된다. 이들 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 방법 (천연의 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항-ErbB2 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 변형물의 올리고뉴클레오티드 매개된 (또는 부위 지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조 방법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들면, 본 발명의 항체의 항원-의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 향상시키도록, 당해 항체를 작용인자 기능에 대해 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 상기 항체의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환부를 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으 로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내에 도입함으로써, 이러한 영역에서 쇄간 디설파이드 결합을 형성시킬 수 있다. 이로써 생성된 호모-이량체성 항체는 개선된 내부 이행 능력 및(또는) 증가된 보체 매개된 세포 사멸성과 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) and Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]. 향상된 항종양 활성을 가진 호모-이량체성 항체는 또한, 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 헤테로-이기능성 가교결합제를 사용하여 제조할 수도 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 가진 항체를 유전공학적으로 처리함으로써, 향상된 보체 용균성과 ADCC 능력을 가질 수 있다 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)].

항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 구제 (salvage) 수용체 결합성 에피토프를 상기 항체 (특히 항체 단편) 내로 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "구제 수용체 결합성 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 것에 관여하는 IgG 분자 (예: IgG₁, IgG₂, IgG₃, 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 의미한다.

(viii) 목적하는 특성을 가진 항체를 스크리닝함

항체 생성 기술은 상기 언급되어 있다. 경우에 따라, 특정한 생물학적 특징을 가진 항체를 추가로 선택할 수 있다.

ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체를 동정하기 위해서, 이러한 ErbB 수용체를 발현하는 세포에 ErbB 리간드 결합을 차단시키는 상기 항체의 능력 (예를 들면, 당해 ErbB 수용체가 ErbB 헤테로-올리고머를 형성시키도록 해주는 또다른 ErbB 수용체와 연계됨)을 결정할 수 있다. 예를 들면, ErbB 헤테로-올리고머의 ErbB 수용체를 천연적으로 발현하거나 발현하도록 형질감염된 세포를 상기 항체와 함께 인큐베이션시킨 다음, 표지된 ErbB 리간드에 노출시킨다. 이어서, ErbB 헤테로-올리고머 내의 ErbB 수용체에 대한 리간드 결합을 차단시키는 항-ErbB2 항체의 능력을 평가할 수 있다.

예를 들면, 항-ErbB2 항체에 의한 MCF7 유방 종양 세포주에 대한 HRG 결합 억제는, 필수적으로 다음 실시예 1에 기재된 바와 같은 24-웰 평판 포맷에서 얼음 상의 단층 MCF7 배양물을 사용하여 수행할 수 있다. 항-ErbB2 모노클로날 항체를 각 웰에 가하고 30분 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 이어서, ¹²⁵I-표지된 rHRG 1_177-224 (25pm)을 가할 수 있고, 인큐베이션을 4 내지 16시간 동안 지속할 수 있다. 용량 반응 곡선을 제조할 수 있고, 당해 항체에 대한 IC₅₀ 값을 산정할 수 있다. 한 양태에서는, ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체가, 상기 검정에서 MCF7 세포에 대한 HRG 결합을 억제시키기 위한, 약 50 nM 이하, 보다 바람직하게는 10 nM 이하의 IC₅₀을 가질 것이다. 상기 항체가 Fab 단편과 같은 항체 단편인 경우에는, 상기 검정에서 MCF7 세포에 대한 HRG 결합을 억제시키기 위한 IC₅₀이 약 100 nM 이하, 보다 바람직하게는 50 nM 이하일 수 있다.

별법으로 또는 부가적으로, ErbB 헤테로-올리고머에 존재하는 ErbB 수용체의 ErbB 리간드 자극된 티로신 인산화를 차단시키는 항-ErbB2 항체의 능력을 평가할 수 있다. 예를 들면, ErbB 수용체를 내생적으로 발현하거나 이들을 발현하도록 형질감염된 세포를 상기 항체와 함께 인큐베이션시킨 다음, 항-포스포티로신 모노클로날 (이는 탐지 가능한 표지와 임의로 결합된다)을 사용하여 ErbB 리간드-의존적 티로신 인산화 활성에 대해 검정한다. 미국 특허 제5,766,863호에 기재된 키나제 수용체 활성화 검정법이 또한, ErbB 수용체 활성화를 결정하고 항체에 의한 상기 활성을 차단시키는데 이용 가능하다.

한 양태에서는, 필수적으로 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이 MCF7 세포에서 p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 억제시키는 항체를 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, MCF7 세포를 24-웰 평판에 평판 배양하고, ErbB2에 대한 모노클로날 항체를 각 웰에 가한 다음, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킬 수 있으며; 그 후, rHRGβ1_177-244을 각 웰에 가하여 최종 농도가 0.2 nM이 되도록 하며, 인큐베이션을 8분 동안 지속시킬 수 있다. 배지를 각 웰로부터 탈기시킬 수 있고, 100 ㎕의 SDS 샘플 완충액 (5％ SDS, 25 nM DTT 및 20 mM 트리스-HCl, pH 6.8)을 부가함으로써 반응을 중지시킬 수 있다. 각 샘플 (25 ㎕)를 4 내지 12％ 구배 겔 (Novex) 상에서 전기영동시킨 다음, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 전기영동적으로 옮길 수 있다. 안티포스포티로신 (1 ㎍/㎖) 면역블롯을 현상할 수 있고, M_r ∼180,000에서의 우세 반응성 밴드 세기를 반사 밀도측정법으로 정량화할 수 있다. 선택된 항 체는 바람직하게는, 본 검정에서 p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 대조군의 약 0 내지 35％ 수준으로 상당히 억제할 것이다. 반사 밀도측정법으로 결정한 바와 같은 p180 티로신 인산화의 HRG 자극 억제에 대한 용량-반응 곡선을 작성할 수 있고, 당해 항체에 대한 IC₅₀를 산정할 수 있다. 한 양태에서는, ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체가, 본 검정에서 p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 억제시키기 위한, 약 50 nM 이하, 보다 바람직하게는 10 nM 이하의 IC₅₀을 가질 것이다. 상기 항체가 Fab 단편과 같은 항체 단편인 경우에는, 본 검정에서 p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 억제시키기 위한 IC₅₀이 약 100 nM 이하, 보다 바람직하게는 50 nM 이하일 수 있다.

예를 들어, 문헌 [Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)]에 필수적으로 기재된 바와 같이, MDA-MB-175 세포에 대한 항체의 성장 억제성 효과를 평가할 수 있다. 이러한 검정법에 따라서, MDA-MB-175 세포를 항-ErbB2 모노클로날 항체 (10 ㎍/㎖)로 4일 동안 처리할 수 있고, 크리스탈 바이올렛으로 염색할 수 있다. 항-ErbB2 항체와 인큐베이션시킨 결과, 모노클로날 항체 2C4에 의해 디스플레이된 바와 유사한 상기 세포주에 대한 성장 억제 효과가 나타날 수 있다. 추가의 양태에서는, 외인성 HRG가 이러한 억제를 상당히 역전시키지 않을 것이다. 바람직하게는, 상기 항체는 외인성 HRG의 존재 및 부재하에서, MDA-MB-175 세포의 세포 증식을 모노클로날 항체 4D5 보다 더 큰 정도로 억제시킬 수 있다 (임의로는, 모노클로날 항체 7F3 보다 큰 정도로 억제시킬 수 있다).

한 양태에서는, 당해 항-ErbB2 항체가 실시예 2에 기재된 바와 같은 동시-면역침전 실험에서 결정한 바와 같이 MCF7 및 SK-BR-3 세포 모두에서 ErbB3과 ErbB2의 헤레굴린 의존적 연합을, 모노클로날 항체 4D5 보다 실질적으로 더 효율적으로, 바람직하게는 모노클로날 항체 7F3 보다 실질적으로 더 효율적으로 차단시킬 수 있다.

성장 억제성 항-ErbB2 항체를 동정하기 위해서는, ErbB2를 과발현하는 암 세포의 성장을 억제시키는 항체에 대해 스크리닝할 수 있다. 한 양태에서는, 선택된 성장 억제성 항체가, 약 0.5 내지 30 g/㎖의 항체 농도에서 세포 배양물 중의 SK-BR-3 세포의 성장을 약 20 내지 100％, 바람직하게는 약 50 내지 100％ 억제시킬 수 있다. 이러한 항체를 동정하기 위해서, 미국 특허 제5,677,171호에 기재된 SK-BR-3 검정법을 수행할 수 있다. 이러한 검정법에 따라서, SK-BR-3 세포를 10％ 태아 소 혈청, 글루타민 및 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 F12와 DMEM 배지의 1:1 혼합물에서 성장시킨다. 이러한 SK-BR-3 세포를 35㎜ 세포 배양 디쉬 (2 ㎖/35 ㎜ 디쉬)에서 20,000개 세포로 평판 배양시킨다. 디쉬 당 0.5 내지 30 g/㎖의 항-ErbB2 항체를 가한다. 6일 후, 전자 COULTER (상표명) 세포 계수기를 사용하여, 처리되지 않은 세포와 비교하여 세포 수를 계수한다. SK-BR-3 세포의 성장을 약 20 내지 100％ 또는 약 50 내지 100％ 억제시키는 항체를 성장 억제성 항체로서 선택할 수 있다.

세포 사멸을 유도하는 항체를 선별하기 위해서, 예를 들어 PI, 트립판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 나타나는 바와 같은 막 원형의 상실을 대조군과 비교하여 평가할 수 있다. 바람직한 검정법은 BT474 세포를 사용하는 PI 흡수 검정법이다. 이러한 검정법에 따라서, BT474 세포 [이는 American Type Culture Collection (Rockville, MD)로부터 수득할 수 있다]를 10％ 열 불활성화 FBS (Hyclone) 및 2mM L-글루타민이 보충된 둘베코 변형된 이글 배지 (D-MEM):함스 F-12 (50:50)에서 배양한다 (따라서, 이러한 검정법은 보체와 면역 작용인자 세포의 부재하에서 수행한다). 상기 BT474 세포를 100 x 20㎜ 디쉬에 3 x 10⁶/디쉬 밀도로 접종하고, 밤새 부착되도록 두었다. 이어서, 상기 배지를 꺼내고, 신선한 배지 단독으로 대체하거나 10g/㎖의 적당한 모노클로날 항체를 함유하는 배지로 대체시킨다. 상기 세포를 3일 동안 인큐베이션시킨다. 각 처리를 수행한 후, 단층을 PBS로 세척하고 트립신 처리함으로써 탈착시킨다. 이어서, 세포를 4℃에서 5분 동안 1200 rpm으로 원심분리시키고, 펠릿을 3 ㎖ 빙냉된 Ca^{2 +} 결합 완충액 (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂)에 재현탁시킨 다음, 35㎜ 스트레이너-캡핑된 12 x 75 튜브 내로 등분하여 (튜브 당 1 ㎖, 처리 그룹 당 3 튜브) 세포 덩어리를 제거한다. 이어서, 튜브에 PI (10 g/㎖)를 공급한다. FACSCAN (상표명) 유동 세포계수기와 FACSCONVERT (상표명) CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 결정된 바와 같이 통계학적 유의적 수준의 세포 사멸을 유도하는 항체를 세포 사멸 유도성 항체로서 선별할 수 있다.

아폽토시스를 유도하는 항체를 선별하기 위해서, BT474 세포를 사용하는 아넥신 결합 검정을 이용할 수 있다. BT474 세포를 배양하고, 이를 상기 문단에서 논의된 바와 같이 디쉬에 접종한다. 이어서, 상기 배지를 꺼내고, 신선한 배지 단독으로 대체하거나 10 g/㎖의 모노클로날 항체를 함유하는 배지로 대체시킨다. 상기 세포를 3일 동안 인큐베이션시킨 후, 단층을 PBS로 세척하고 트립신 처리함으로써 탈착시킨다. 이어서, 세포를 원심분리시키고, Ca^{2 +} 결합 완충액에 재현탁시킨 다음, 세포 사멸 검정에 대해 상기 언급된 바와 같이 튜브 내로 등분한다. 이어서, 튜브에 표지된 아넥신 (예: 아넥신 V-FTIC) (1 ㎍/㎖)를 공급한다. FACSCAN (상표명) 유동 세포계수기와 FACSCONVERT (상표명) CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. 대조군과 비교하여 통계학적 유의적 수준의 아넥신 결합을 유도하는 항체를 아폽토시스 유도성 항체로서 선별한다.

아넥신 결합 검정 이외에도, BT474 세포를 사용하는 DNA 염색 검정법이 이용 가능하다. 이러한 검정법을 수행하기 위해서, 상기 두 문단에서 기재된 바와 같이 당해 항체로 처리시킨 BT474 세포를 37 ℃에서 2시간 동안 9 ㎍/㎖ HOECHST 33342 (상표명)와 함께 인큐베이션시킨 다음, MODFIT LT (상표명) 소프트웨어 (Verity Software House)를 사용하는 EPICS ELITE (상표명) 유동 세포계수기 (Coulter Corporation) 상에서 분석한다. 처리되지 않은 세포 보다 2배 이상 (바람직하게는 3배 이상) 아폽토시스성 세포의 비율 (100％ 이하의 아폽토시스성 세포)의 변화를 유도하는 항체가 이 검정법을 이용하여 프로-아폽토시스성 항체로서 선별될 수 있다.

당해 항체에 의해 결합된 ErbB2 상의 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝 하기 위하여, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상의 교차-차단 검정을 수행할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 에피토프 지도화를 당해 분야에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다 (본원의 도 1A 및 1B 참조).

(ix) 면역결합체

본 발명은 또한 항체가 세포독성제, 예를 들면 화학요법제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 작은 분자 독소 또는 효소적 활성 독소, 및 그의 단편 및(또는) 변이체), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성결합체)에 결합된 면역결합체에 관한 것이다.

그러한 면역결합체를 발생시키는데 유용한 화학요법제는 위에 기재되어 있다. 항체 및 하나 이상의 작은 분자 독소, 예를 들면 칼리케아미신, 메이탄신 (미국 특허 제5,208,020호), 트리코텐 및 CC1065의 결합체가 고찰된다.

본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, 항체는 하나 이상의 메이탄신 분자 (예를 들면, 항체 분자 당 약 1 내지 약 10개의 메이탄신 분자)에 결합된다. 메이탄신은, 예를 들면 May-SH3으로 환원될 수 있는 May-SS-Me로 전환될 수 있으며 변형된 항체와 반응하여 메이탄시노이드-항체 면역결합체를 형성할 수 있다 [Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)].

또다른 당해 면역결합체는 1개 이상의 칼리케아미신 분자에 결합된 항-ErbB2를 포함한다. 이중 가닥 DNA를 생산할 수 있는 칼리케아미신 계열의 항생물질은 피코몰 이하의 농도에서 파괴된다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체 로는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ₁ ^I 이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 [본원에 참고로 인용된 Hinman et al. Cancer Research 53:3336-3342 (1993) and Lode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1988); 및 미국 특허 제5,714,586호; 5,712,374호; 5,264,586호; 및 5,773,001호 참조].

사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 있다 [1993. 10. 28에 공개된 WO 93/21232 참조].

본 발명은 또한 항체와 핵분해 활성을 가진 화합물 (예를 들면, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성되는 면역결합체를 포함한다.

방사성결합된 항-ErbB2 항체의 생산에 각종 방사성 동위원소가 이용될 수 있다. 그 예로는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소가 있다.

항체와 세포독성제와의 결합체는 각종 이기능성 단백질 커플링제, 예를 들면 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이 미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예: 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예: 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al. Scence 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DPTA)는 항체에 대한 방사성 뉴클레오티드의 결합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다 (WO 94/11026 참조). 링커는 세포내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산 불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커가 사용될 수 있다 (Chari et al. Cancer Research 52:127-131 참조].

별법으로, 항-ErbB 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질이, 예를 들면 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.

또다른 양태에서는, 당해 항체를 종양 예비표적화에 이용하기 위하여 "수용체" (예: 스트렙타비딘)에 결합시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 결합체를 환자에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환계로부터 결합되어 있지 않은 결합체를 제거한 후, 세포독성제 (예: 방사성 핵종)에 결합되는 "리간드" (예: 아비딘)를 투여한다.

(x) 항체 의존적 효소 매개된 프로드럭 치료법 (ADEPT)

본 발명의 항체는, 프로드럭 (예: 펩티딜 화학요법제; WO 81/01145 참조)을 활성 항암제로 전환시키는 프로드럭 활성화 효소에 당해 항체를 결합시킴으로써, ADEPT에 사용할 수도 있다 [예를 들면, WO 88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호 참조].

ADEPT에 유용한 면역결합체의 효소 성분에는, 이를 보다 활성이고 세포독성인 형태로 전환시키는 방식으로 프로드럭 상에서 작용할 수 있는 효소가 포함된다.

본 발명의 방법에 유용한 효소에는 포스페이트 함유 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 알칼린 포스파타제; 설페이트 함유 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 아릴설파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암제인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들면, 세라티아 프로테아제, 더모리신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 및 카텝신 (예: 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물 절단성 효소, 예를 들면, β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 이들의 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 각각 자유 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들면, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또다른 한편, 당해 분야에서 "아브자임 (abzyme)"으로서 공지되기도 하는, 효소적 활성을 지닌 항체를 사용하여 본 발명의 프로드럭을 자유 활성 약물로 전환시킬 수 있다 [Massey, Nature 328:457-458 (1987)]. 항체-아브자임 결합체는 아브자임을 종양 세포 집단에 전달하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.

본 발명의 효소는 상기 논의된 헤테로-이기능성 가교결합 시약을 사용하는 것과 같이, 당해 분야에 널리 공지된 기술에 의해 항-ErbB2 항체에 공유 결합시킬 수 있다. 또다른 한편, 본 발명의 효소의 적어도 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합성 영역을 포함하는 융합 단백질은, 당해 분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제할 수 있다 [Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)].

(xi) 기타 항체 변형물

항체의 기타 변형물이 본원에 고려된다. 예를 들면, 항체를 각종 비단백질 함유 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중의 하나에 연결할 수 있다. 당해 항체는 또한, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노-캡슐) 또는 마크로에멀젼에서, 예를 들면, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합 반응 (예를 들면, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐)에 의해 제조된 미소캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술이 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)]에 기재되어 있다.

본원에 기재된 항-ErbB2 항체는 면역리포솜으로서 제제화될 수도 있다. 당해 항체를 함유하는 리포솜은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 WO 97/38731 (1997. 10.23자로 공개됨)]에 기재된 방법으로 제조한다. 순환 시간에 증진된 리포솜이 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.

특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜을 일정한 공극 크기의 필터를 통하여 압출시켜, 목적하는 직경을 지닌 리포솜을 생성시킨다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 디설파이드 교환 반응을 통하여 문헌[Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포솜에 결합시킬 수 있다. 화학요법제가 이러한 리포솜에 임의로 함유된다 [Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)].

III. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

본 발명은 또한 인간화 항-ErbB2 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 그 핵산을 함유하는 벡터 및 숙주 세포, 및 그 항체를 생산하기 위한 재조합 기술을 제공한다.

항체의 재조합 생산을 위해, 그것을 코딩하는 핵산을 단리하고 추가의 클로 닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터 내로 삽입한다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 이용함으로써 (예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열화된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분에는, 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다: 시그날 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.

(i) 시그날 서열 성분

본 발명의 항-ErbB2 항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드의 시그날 서열과의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 바람직하게 선택되는 이종 시그날 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 시그날 펩티다제에 의해 절단되는) 것이여야 한다. 본래의 항-ErbB2 항체 시그날 서열을 인식하지 않고 이를 프로세싱하지 않는 원핵성 숙주 세포의 경우에는, 시그날 서열을, 예를 들면 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정한 장독소 II 리더의 군 중에서 선택된 원핵성 시그날 서열로 치환시킨다. 효모 분비를 위해서는, 본래의 시그날 서열을, 예를 들면 효모 인버타제, α 인자리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더) 또는 산 포스파타제 리더, 씨, 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 시그날로 치환시킬 수 있다. 포유류 세포 발현에서는, 포유류 시그날 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비성 리더, 예를 들면 단순 포진 gD 시그날도 이용가능하다.

그러한 전구체 영역에 대한 DNA는 항-ErbB2 항체를 코딩하는 DNA에 판독 프레임 내에서 연결된다.

(ii) 복제 기점 성분

발현 벡터와 클로닝 벡터 모두는 이 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제할 수 있게 해주는 핵산 서열을 함유하고 있다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는, 상기 서열이, 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 복제될 수 있게 해주는 것이고, 이에는 복제 기점 또는 자율 복제 서열이 포함된다. 이러한 서열은 각종 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점이 대부분의 그람-음성 세균용으로 적합하고, 2 μ플라스미드 기점은 효모용으로 적합하며, 각종 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)이 포유류 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유류 발현 벡터에는 필요하지 않다 (SV40 기점은 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있다).

(iii) 선별 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 또한 선별성 마커로 명명되는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생물질 또는 기타 독소, 예를 들면 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여해주거나, (b) 보조영양 결핍을 보충해주거나, 또는 (c) 복합 배지로부터는 입수 가능하지 않은 중요한 영양소를 공급해주는 단백질을 코딩한다 (예를 들면, 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자).

선별 도식의 한 예는 숙주 세포의 성장을 억제하는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환되는 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하므로, 선별 섭생을 생존시킨다. 이러한 우점적 선별의 예들은 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 이용하고 있다.

포유류 세포용으로 적합한 선별성 마커의 또다른 예는 항-ErbB2 항체 핵산을 채택하는데 적격인 세포의 동정을 가능케 해주는 것인데, 예를 들면 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.

예를 들면, DHRF 선별 유전자로 형질전환시킨 세포는 먼저, DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 상기 형질전환체 모두를 배양함으로써 이를 동정한다. 야생형 DHFR이 이용되는 경우에 적당한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.

별법으로, 항-ErbB2 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또다른 선별성 마커, 예를 들면, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH))를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환시키거나 또는 공동-형질전환시킨 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는, 아미노글리코시드성 항생물질, 예를 들면 카나마이신, 네오마이신 또는 G418와 같은 선별성 마커용 선별제를 함유하는 배지에서 세포 성장시킴으로써 선별할 수 있다 (미국 특허 제4,965,199호 참조).

효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하 는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39, 1979]. trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 돌연변이체 효모 균주, 예를 들면 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별성 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85:12, 1977]. 이때, 효모 숙주 세포 게놈 내에 trp1 병변이 존재하는 것은, 트립토판 부재하에서의 성장에 의한 형질전환을 탐지하는데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍성 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하고 있는 공지된 플라스미드로써 보충된다.

또한, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 송아지 키모신의 대규모 생산을 위한 발현계는 케이. 락티스에 대해 보고되었다 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]. 클루이베로마이세스의 산업용 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 선택에 적합한 다중 복사 발현 벡터도 또한 기재되어 있다 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)].

(iv) 프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 항-ErbB2 항체 핵산에 작동적으로 연결되는 프로모터를 함유한다. 원핵성 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터계, 알칼린 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터계 및 하이브리드 프로모터, 예를 들면 tac 프로모터가 있다. 그러나, 다른 공지된 세균성 프로모터도 적합하다. 세균계에 사용하기 위한 프로모터는 항-ErbB2 항체를 코딩하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가르노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.

진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 실제적으로 모든 진핵성 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 하단에 위치한 AT-풍부 영역을 갖고 있다. 많은 유전자의 전사 개시 부위로부터 70 내지 80개 염기 상단에 발견된 또다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 모든 뉴클레오티드일 수 있다)이다. 대부분의 진핵성 유전자의 3' 말단에는 AATAAA 서열이 있는데, 이는 폴리 A 테일을 코딩 서열의 3' 말단에 첨가하기 위한 시그날일 수 있다. 이들 서열 모두는 진핵생물 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주와 사용하기에 적합한 프로모팅 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소, 예를 들면 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.

성장 조건에 의해 조절되는 부가의 전사 이점을 갖고 있는 유도성 프로모터인 기타 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연계된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 활용에 관여하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서가 또한 효모 프로모터와 유리하게 사용된다.

포유류 숙주 세포 중의 벡터로부터의 항-ErbB2 항체 전사는, 폴리오마 바이러스, 전염성 상피종 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들면, 아데노바이러스 2), 소의 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻은 프로모터; 이종 포유류 프로모터, 예를 들면 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터; 열-쇽 프로모터에 의해 조절될 수 있지만, 단 이러한 프로모터들은 숙주 세포계와 적합성이어야 한다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 함유하기도 하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 인간 사이토메갈로바이러스의 인접 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 벡터로서 소의 유두종 바이러스를 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 인간 β-인터페론 cDNA를 마우스 세포에서 발현시키는 것에 관해서는 문헌 [Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)]을 참조하면 된다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스 장 말단 반복체를 프로모터로서 사용할 수도 있다.

(v) 인핸서 요소 성분

보다 고등 진핵생물에 의해 본 발명의 항-ErbB2 항체를 코딩하는 DNA를 전사하는 것은 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 현재, 많은 인 핸서 서열이 포유류 유전자로부터 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 당 업자는 진핵성 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그의 예에는 복제 기점의 후기 측면 (bp 100-270) 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기 측면 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 진핵성 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)]을 참조하면 된다. 이러한 인핸서는 항-ErbB2 항체 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에 존재하지만, 바람직하게는 상기 프로모터로부터의 5' 부위에 위치하는 벡터 내로 스플라이싱할 수 있다.

(vi) 전사 종결 성분

진핵성 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 기타 다세포 유기체로부터 핵 형성된 세포)에 사용된 발현 벡터는 또한 전사를 종결하고 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵성 또는 바이러스성 DNA 또는 cDNA의 5' 및 종종 3' 비해독 영역으로부터 통상 입수할 수 있다. 이들 영역은 항-ErbB2 항체 코딩 mRNA의 비해독 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 유용한 전사 종결 성분 중의 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다 [WO 94/11026 및 본원에 기재된 발현 벡터를 참조하면 된다].

(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환

본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝하거나 발현시키는데 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 상기 언급된 바와 같은 고등 진핵 세포이다. 이 목적에 적합한 원핵생물에는 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면 장내세균, 예를 들면 에세리히아, 예를 들면 이. 콜리, 엔테로박터, 에르위니아, 클레브시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들면 살로넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 또는 세라티아, 예를 들면 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬겔라, 및 바실러스, 예를 들면 비. 서브틸리스 및 비. 리체니포르미스 (예를 들면, 1989. 4. 12에 공개된 DD 266,710에 기재된 B. licheniformis 41P), 슈도모나스, 예를 들면 피. 아에루기노사 및 스트렙토마이세스가 포함된다. 한가지 바람직한 이. 콜리 클로닝 숙주는 이. 콜리 294 (ATCC 31,446)이지만, 이. 콜리 B, 이. 콜리 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜리 W3110 (ATCC 27,325)와 같은 기타 균주도 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시일 뿐이다.

원핵생물 이외에도, 필라멘트상 진균 또는 효모와 같은 진핵성 미생물이 항-ErbB2 항체 코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵성 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용되고 있는 것은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 빵효모이다. 그러나, 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들면 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. Wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 월티 (K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 더모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus), 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)(EP 183,070), 칸디다 (Candida), 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa), 솨니오마이세스, 예를 들면 솨니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) 및 필라멘트상 진균, 예를 들면 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들면 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니거 (A. niger)와 같은 수 많은 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 입수 가능하고 본원에서 사용된다.

글리코실화 항-ErbB2 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수 많은 바쿨로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 애집티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) 숙주 세포와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용 가능한 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 형질감염을 위한 이러한 각종 바이러스성 균주, 예를 들면 오토그라파 칼리포니카 (Autographa califonica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 입수 가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따른 바이러스로서 본원에 사용될 수 있다.

목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 활용할 수도 있다.

그러나, 가장 큰 관심은 척추동물 세포에 있으며, 척추동물 세포를 배양물 (조직 배양물)에서 증식시키는 것이 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 몽키 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (293 세포 또는 현탁 배양물에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포; Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); 갓난 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국산 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 몽키 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 그린 몽키 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)이다.

숙주 세포를 상기 언급된 항-ErbB2 항체 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시킨 다음, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 경우에 따라 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양한다.

(viii) 숙주 세포를 배양함

본 발명의 항-ErbB2 항체를 제조하기 위해 사용되는 숙주 세포는 각종 배지에서 배양될 수 있다. 함스 F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘베코 변형 이글즈 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 입수 가능한 배지가 상기 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 등록 제30,985호]에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 상기 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중의 어떠한 것에도 필요에 따라, 호르몬 및(또는) 기타 성장 인자 (예를 들면, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예를 들면, HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생물질 (예를 들면, 젠타마이신 (상표명) 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원을 보충할 수 있다. 기타 어떠한 필수 보충물도, 당 업계에 공지되어 있는 적당한 농도로 포함시킬 수 있다. 온도, pH 등의 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 미리 사용된 것이며, 이는 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다.

(ix) 항-ErbB2 항체의 정제

재조합 기술을 이용할 때, 항체는 주변세포질 공간 내에서 세포내로 생산되거나 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내로 생산된다면, 첫번째 단 계로서, 원심분리 또는 한외여과에 의해 숙주 세포 또는 용해된 파편인 미립형 세포 부스러기를 제거한다. 이. 콜리의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차에 대해서는 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]을 참조하면 된다. 간단하게 설명하면, 세포 페이스트를 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 부스러기는 원심분리에 의해 제거한다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 그러한 발현계로부터의 상등액을 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 장치와 같은 시판되는 단백질 농축액 여과기를 사용하여 농축시킨다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제를 임의의 상기 단계에서 포함시켜 단백질분해를 억제할 수 있고 또한 항생물질을 포함시켜 외래 오염물의 성장을 방지할 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들면 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 단백질 A의 친화성 리간드로서의 적합성은 항체에 존재하는 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A를 이용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제할 수 있다 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 [Guss et al., EMBO J 5:1567-1575 (1986)]. 친화성 리간드가 부착될 매트릭스로는 대부분 아가로스가 사용되지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기공 조절된 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스 보다 더 신속한 유속 및 더 단축된 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX (상표명) (J.T. Baker; Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라서 이온 교환 컬럼 상에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE (상표명) 상에서의 크로마토그래피, 또는 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산 암모늄 침전과 다른 단백질 정제 기술이 이용될 수도 있다.

임의의 예비 정제 단계(들) 이후에, 당해 항체 및 오염물질을 함유하는 혼합물에 대해 약 2.5 내지 4.5의 pH에서 용출 완충액을 이용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 실시할 수 있으며, 바람직하게는 저염 농도 (예를 들면, 약 0-0.25 M 염)로 수행된다.

IV. 제약학적 제제

본 발명에 따라서 사용된 항체의 치료학적 제제는, 목적하는 순도를 가진 항체를 임의의 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합함으로써, 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장되도록 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용된 투여량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이에는 인산염, 시트르산염 및 기타 유기 산 등의 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제 (예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사 메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨 등의 당; 나트륨 등의 염 형성 역이온; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN, PLURONICS (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등의 비이온성 계면활성제가 포함된다. 바람직한 동결건조된 항-ErbB2 항체 제제가 본원에 참조 문헌으로 삽입된 WO 97/04801에 기재되어 있다.

본원의 제제는 또한, 치료받는 특정한 징후에 대해 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 대해 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖고 있는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들면, EGFR, ErbB2 (예: ErbB2 상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체), ErbB3, ErbB4 또는 혈관 내피 인자 (VEGF)와 결합되는 항체를 하나의 제제 내에 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 당해 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토킨, 성장 억제제, 항호르몬제, EGFR-표적된 약물, 항혈관형성제, 및(또는) 심보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는, 의도한 목적에 유효한 양으로 조합하여 존재한다.

활성 성분은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 미소에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에서, 예를 들면 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미소캡슐과 폴리(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐을 각각 코아세르베이션 (coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합반응에 의해 제조된 미소캡슐 내에 포획될 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.

지속 방출형 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출형 제제의 적합한 예에는 당해 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면 LUPRON DEPOT (상표명) (락트산-글리콜산 공중합체와 루이프롤리드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균성이어야만 한다. 이는 멸균성 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 수행된다.

V. 항-ErbB2 항체에 의한 치료

본 발명에 따라서, 항-ErbB2 항체를 사용하여 각종 질병 또는 장애를 치료할 수 있다는 것이 고려된다. 질환이나 장애의 예에는 양성 또는 악성 종양; 백혈병 및 임파계 악성 종양; 기타 장애, 예를 들면 신경단위성, 신경교성, 성상세포성, 시상하부, 선상, 마크로파지성, 상피, 위, 블라스토코엘릭 (blastocoelic), 염증, 혈관형성 및 면역학적 장애가 포함된다.

일반적으로, 치료하고자 하는 질병 또는 장애는 암이다. 본원에서 치료하고자 하는 암의 예에는 암종, 임파종, 아세포종, 육종 및 백혈병 또는 임파계 악성 종양이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포암 (예: 상피 편평 세포암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선종 및 폐의 편평 세포 암종을 포함한 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암을 포함한 위암, 췌장암, 신경교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장 암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐만 아니라 뇌암 및 목암이 포함된다.

이러한 암은 일반적으로 ErbB2 발현성 세포를 포함할 것이므로, 본원에서의 항-ErbB2 항체가 이러한 암과 결합할 수 있다. 암이 ErbB2 수용체의 과발현을 특징적으로 나타낼 수 있긴 하지만, 본 출원은 ErbB2 과발현성 암인 것으로 고려되지 않는 암의 치료 방법도 또한 제공한다. 암에서의 ErbB2 발현을 결정하기 위한, 각종의 진단/예후 검정이 이용 가능하다. 한 양태에서는, ErbB2 과발현을 IHC, 예를 들어 HERCEPTEST (등록상표) (Dako)를 사용하여 분석할 수도 있다. 종양 생검으로부터의 파라핀 봉매된 조직 절편을 IHC 검정시키고, 다음과 같은 ErbB2 단백질 염색 강도 기준에 일치시킬 수 있다:

스코어 0

어떠한 염색도 관찰되지 않거나 종양 세포의 10％ 미만에서 막 염색이 관찰된다.

스코어 1+

종양 세포의 10％ 이상에서 희미하게 인지 가능한 막 염색이 탐지된다. 이러한 세포는 이들의 막 일부에서만 염색된다.

스코어 2+

종양 세포의 10％ 이상에서 약한 수준 내지는 중간 수준의 막 염색이 관찰된다.

스코어 3+

종양 세포의 10％ 이상에서 중간 내지는 강한 수준의 막 염색이 관찰된다.

ErbB2 과발현 평가에 대한 0 또는 1+ 스코어를 나타내는 종양은 ErbB2를 과발현하지 않는 것을 특징적으로 나타낼 수 있는 반면, 2+ 또는 3+ 스코어를 나타내는 종양은 ErbB2를 과발현하는 것을 특징적으로 나타낼 수 있다.

별법으로 또는 부가적으로, FISH 검정, 예를 들면 INFORM (상표명) (공급원: Ventana, Arizona) 또는 PATHVISION (상표명) (Vysis, Illinois)를 포르말린-고정되고 파라핀-봉매된 종양 조직 상에서 수행하여 해당 종양에서 ErbB2를 과발현하는 정도 (있을 경우)를 결정할 수 있다.

한 양태에서는, 암이 EGFR을 발현하는 (과발현할 수도 있는) 것일 수 있다. EGFR을 발현/과발현할 수 있는 암의 예에는 편평 세포암 (예: 상피 편평 세포암); 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선종 및 폐의 편평 세포 암종을 포함한 폐암; 복막암; 간세포암; 위장암을 포함한 위암; 췌장암; 신경교아종; 경부암; 난소암; 간암; 방광암; 간암; 유방암; 결장암; 직장암; 결장직장암; 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장 암; 전립선암; 음문암; 갑상선암; 간 암종; 항문 암종, 음경 암종 뿐만 아니라 뇌암 및 목암이 포함된다.

본원에서 치료하고자 하는 암은 ErbB 수용체, 예를 들면, EGFR의 과도한 활성화를 특징적으로 나타내는 것일 수 있다. 이러한 과도한 활성화는 ErbB 수용체 또는 ErbB 리간드의 과발현 또는 생성 증가로부터 비롯된 것일 수 있다. 본 발명의 한 양태에서는, 진단 또는 예후 검정을 수행하여, 환자의 암이 ErbB 수용체의 과도한 활성화를 특징적으로 나타내는지를 결정할 것이다. 예를 들면, ErbB 유전자 증폭 및(또는) 암에서의 ErbB 수용체의 과발현을 결정할 수 있다. 이러한 증폭/과발현을 결정하기 위한 각종 검정이 당해 분야에서 입수 가능하고 이에는 상기 언급된 IHC, FISH 및 세드 항원 검정이 포함된다. 또다른 한편 또는 부가적으로, 종양 내 또는 종양과 연합된 ErbB 리간드 (예: TGF-α)의 수준은 공지된 과정에 따라서 결정할 수 있다. 이러한 검정은 시험하고자 하는 샘플 내에서 이를 코딩하는 단백질 및(또는) 핵산을 탐지할 수 있다. 한 양태에서는, 종양 내의 ErbB 리간드 수준을 면역조직화학 (IHC)을 사용하여 결정할 수 있다 [Scher et al. Clin. Cancer Research i:545-550 (1995)]. 또다른 한편 또는 부가적으로, 예를 들면, FISH, 서던 블롯팅 또는 PCR 기술을 통하여, 시험하고자 하는 샘플 중의 ErbB 리간드 코딩 핵산 수준을 평가할 수 있다.

또한, ErbB 수용체 또는 ErbB 리간드 과발현 또는 증폭은 예를 들어, 탐지하 고자 하는 분자와 결합되고 탐지 가능한 표지 (예: 방사성 동위원소)로 표지된 분자 (예: 항체)를 투여한 다음, 표지의 위치를 알아보기 위해 환자를 외적으로 스캐닝함으로써, 생체내 진단 검정을 이용하여 평가할 수 있다.

치료하고자 하는 암이 호르몬 비의존성 암인 경우에는, 종양 내에서의 호르몬 (예: 안드로겐) 및(또는) 이의 동족체 수용체의 발현을, 상기 언급된 바와 같이 이용 가능한 각종 검정을 사용하여 평가할 수 있다. 또다른 한편 또는 부가적으로, 환자가 항안드로겐 치료법에 더 이상 반응하지 않는다는 점에서 상기 환자는 호르몬 비의존성 암을 지닌 것으로 진단할 수 있다.

특정 양태에서는, 세포독성제와 결합된 항-ErbB2 항체를 포함하는 면역결합체를 환자에게 투여한다. 바람직하게는, 면역결합체 및(또는) 이것에 결합된 ErbB2 단백질이 세포내로 도입되면, 이 단백질에 결합되는 암 세포의 사멸에 대한 면역결합체의 치료학적 효능이 증진된다. 바람직한 양태에서는, 세포독성제가 암 세포 중의 핵산을 표적으로 하거나 이를 방해한다. 이러한 세포독성제의 예에는 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제가 포함된다.

항-ErbB2 항체 또는 면역결합체는 공지된 방법, 예를 들면 정맥내 투여, 예를 들면 거환으로서 또는 일정 기간에 걸쳐 연속적으로 주입하거나, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액낭내, 포막내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 따라서 인간 환자에게 투여된다. 상기 항체의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.

기타 치료학적 섭생을 항-ErbB2 항체의 투여와 병행할 수 있다. 병행 투여 방법에는 별개의 제제나 단일 제약학적 제제를 사용하여 함께 투여하는 방법과, 어떠한 순서로든 연속해서 투여하는 방법이 포함되는데, 후자 방법에서는 바람직하게 시간 간격이 있긴 하지만, 양 (또는 모든) 활성 성분이 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘한다.

한가지 바람직한 양태에서는, 환자를 두가지의 상이한 항-ErbB2 항체로 치료한다. 예를 들면, ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 제1 항-ErbB2 항체 또는 모노클로날 항체 2C4의 생물학적 특성을 가진 항체 뿐만 아니라 성장 억제성인 제2 항-ErbB2 항체 (예를 들면, 헤르셉틴 (등록상표)) 또는 ErbB2-과발현 세포의 아폽토시스를 유도하는 항-ErbB2 항체 (예: 7C2, 7F3 또는 그의 인간화 변이체)로 환자를 치료할 수 있다. 헤르셉틴 (등록상표)으로 환자를 치료하고, 그후에 예를 들어 환자가 헤르셉틴 (등록상표) 요법에 반응하지 않을 때 rhuMAb 2C4로 치료할 수 있다. 또다른 양태에서는 환자를 rhuMAb 2C4로 먼저 치료한 다음 헤르셉틴 (등록상표) 요법을 실시할 수 있다. 또다른 양태에서는, 환자를 rhuMAb 2C4 및 헤르셉틴 (등록상표)으로 동시에 치료할 수 있다.

항-ErbB2 항체(들)의 투여를 또다른 종양 관련 항원에 대해 지시된 항체의 투여와 병행하는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 경우에 있어서 기타 항체는, 예를 들어 EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)와 결합할 수 있다.

한 양태에서는, 본 발명의 치료법이 항-ErbB2 항체 (또는 항체)와, 하나 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제와의 병행 투여를 포함하는데, 이에는 상이한 화 학요법제들의 칵테일을 함께 투여하는 것이 포함된다. 바람직한 화학요법제에는 탁산 (예: 파클리탁셀 및 독세탁셀) 및(또는) 안트라사이클린 항생물질이 포함된다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케쥴은 제조업자의 지시에 따르거나 당해 분야의 숙련인에 의해 실험적으로 결정된 바에 따라서 이용될 수 있다. 이러한 화학요법에 대한 제조 및 투여 스케쥴이 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다.

항체는 항호르몬성 화합물, 예를 들면 타목시펜 등의 항에스트로겐 화합물; 오나프리스톤 등의 항프로게스테론 (EP 616 812 참조); 또는 플루타미드 등의 항안드로겐 화합물과 조합 (상기 분자에 대해 공지된 투여량을 사용함)될 수 있다. 치료하고자 하는 암이 호르몬 비의존성 암인 경우에는, 환자가 기존에 항호르몬 요법을 받은 적이 있었을 것이며, 암이 호르몬 비의존성이 된 후에, 당해 항-ErbB2 항체 (및 임의로 본원에 기재된 기타 제제)를 상기 환자에게 투여할 수 있다.

종종, 심보호제 (본 치료와 연관된 심근부전증을 예방하거나 경감시키기 위함) 또는 하나 이상의 사이토킨을 환자에게 함께 투여하는 것이 유익할 수도 있다. 상기 치료학적 섭생 이외에도, 환자를 대상으로 암 세포 제거 수술을 수행하고 (하거나) 방사선 요법을 수행할 수 있다.

본원에서 항-ErbB2 항체는 정의 단락에서 위에 논의된 것과 같은 EGFR-표적된 약물과 함께 투여될 수도 있으며, 이로 인해 잠재적으로 상승적인 치료 효과가 달성된다.

함께 투여되는 상기 제제에 적합한 투여량은 현재 사용되는 양이고, 이는 상 기 제제와 항-ErbB2 항체의 조합 작용 (상승 작용)으로 인해 낮출 수 있다.

질병을 예방하거나 치료하기 위해서는, 항체의 적당한 투여량이 상기 정의된 바와 같은 치료받고자 하는 질병의 유형, 항체를 예방 목적으로 투여하든 치료 목적으로 투여하든지 간에 해당 질병의 중증도와 경과, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응도, 및 담당의의 재량에 따라서 결정될 것이다. 항체는 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료 전반에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다. 해당 질병의 유형과 중증도에 따라서, 환자에게 투여하기 위한 초기 용량은 항체 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏ (예: 0.1 내지 20 ㎎/㎏)이며, 이는 하나 이상을 별개로 투여하든 연속적으로 주입하든 상관이 없다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서, 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상의 범위내일 것이다. 질병 상태에 따라서 수 일 또는 그 이상에 걸쳐 반복하여 투여하는 경우에는, 목적하는 질병 증상 억제가 이루어질 때까지 치료를 지속적으로 수행한다. 항체의 바람직한 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ 중 하나 이상의 투여량 (또는 그의 임의의 병행 투여량)이 환자에게 투여될 수 있다. 그러한 용량은 간헐적으로, 예를 들면 매주 또는 3주 마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 항-ErbB2 항체가 환자에게 약 2 내지 약 20가지, 예를 들어 약 6가지 용량으로 투여된다). 초기에 높은 용량을 투여하고, 이어서 1가지 이상의 더 적은 용량을 투여할 수 있다. 예시적인 투여량 섭생은 항-ErbB2 항체 약 4 ㎎/㎏을 초기에 투여한 다음, 매주 약 2 ㎎/㎏의 용량을 지속적으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여량 섭생도 유용할 수 있다. 이러 한 치료법의 진행 과정은 통상적인 기술과 검정법에 의해 용이하게 모니터한다.

항체 단백질을 환자에게 투여하는 것과는 별개로, 본원은 항체를 유전자 치료법에 의해 투여하는 것을 고려한다. 항체를 코딩하는 핵산 투여는 "치료 유효량의 항체를 투여하는"이란 표현으로 포괄된다. 예를 들면, 세포내 항체를 생성시키는 유전자 치료법의 사용에 관한 WO 96/07321 (1996. 3. 14에 공개됨)을 참조할 수 있다.

환자의 세포 내로 핵산 (임의로 벡터 내에 함유됨)을 주입하기 위한 두 가지 주요 접근법이 있다 (생체내 및 생체외). 생체내 전달의 경우에는, 통상 항체가 요구되는 부위에 항체를 환자에게 직접 주사한다. 생체외 치료인 경우에는, 환자의 세포를 꺼낸 다음, 이들 단리된 세포 내로 핵산을 도입하고, 이와 같이 변형된 세포를 환자에게 직접적으로 투여하거나, 또는 예를 들어, 환자에게 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화시킴으로써 투여한다 [미국 특허 제4,892,538호; 및 제5,283,187호]. 핵산을 살아있는 세포에 도입하는데 이용 가능한 각종 기술이 있다. 이러한 기술은 시험관내의 배양된 세포 내로 전이되는가, 아니면 의도된 숙주의 세포 내에 생체내 전이되는지에 따라서 다양하다. 핵산을 시험관내에서 포유류 세포에 전이시키는데 적합한 기술에는 리포솜의 사용, 전기천공, 미소주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등이 포함된다. 이러한 유전자의 생체외 전달에 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전이 기술에는 바이러스성 벡터 (예: 아데노바이러스, 단순 포진 I 바이러스, 또는 아데노 관련 바이러스) 및 지질-이용 시스템 ( 유전자의 지질 매개된 전이에 유용한 지질은 예를 들면, DOTMA, DOPE, 및 DC-Chol이다)을 이용한 트랜스펙션이 포함된다. 몇몇 상황하에서는, 특정 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등의 표적 세포를 표적으로 하는 제제를 상기 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 이용된 경우에는, 세포내 이입과 연관된 세포 표면 막 단백질과 결합되는 단백질을 표적화 및(또는) 흡수 촉진에 사용할 수 있는데, 예를 들면, 특정한 세포 유형에 대해 친화성인 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 사이클링시 내부이행을 진행하는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국재를 표적으로 하고 세포내 반감기를 증진시키는 단백질이다. 수용체 매개된 세포내 이입 기술이, 예를 들면, 문헌 [Wu et al. J. Biol.Chem. 262:4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 마킹 및 유전자 치료법 프로토콜에 대한 고찰은 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992); WO 93/25673 및 이러한 특허에서 인용된 참조문헌].

VI. 제품

본 발명의 또다른 양태에서는, 상기 언급된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 이러한 제품은 용기와, 이러한 용기 상에 또는 이러한 용기와 연관된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들면 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 이러한 용기는 유리나 플라스틱과 같은 각종 재료로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 해당 질환을 치료하는데 유효한 조성물 을 보유하고 있으며, 멸균성 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 이러한 용기는 피하 주사 바늘로 꿰뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 백 또는 바이알일 수 있다). 이러한 조성물 중의 하나 이상의 활성제가 항-ErbB2 항체이다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은 해당 조성물이 선택된 질환, 예를 들면 암을 치료하는데 사용된다는 것을 지시해준다. 한 양태에서는, 이러한 표지 또는 포장 삽입물이, ErbB2와 결합되는 항체를 포함하는 조성물이 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), ErbB3 및 ErbB4, 바람직하게는 EGFR로 이루어진 군 중에서 선택된 ErbB 수용체를 발현하는 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 지시해준다. 또한, 상기 표지 또는 포장 삽입물은, 치료받고자 하는 환자가 EGFR, ErbB3 또는 ErbB4 중에서 선택된 ErbB 수용체의 과도한 활성화를 특징적으로 나타내는 암을 앓고 있는 환자라는 것을 지시해준다. 예를 들면, 이러한 암은 이들 수용체들 중의 하나를 과발현하고 (하거나) ErbB 리간드 (예: TGF-α)를 과발현하는 것일 수 있다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은, 당해 조성물이 ErbB2 수용체의 과발현을 특징적으로 나타내지 않는 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 지시해준다. 예를 들면, 헤르셉틴 (등록상표)에 대한 포장 삽입물은, 그 항체가 ErbB2 단백질을 과발현하는 종양의 전이성 유방암을 지닌 환자를 치료하는데 사용된다는 것을 지시하고 있는 반면, 본원에서의 포장 삽입물은 항체 또는 조성물이 ErbB2 과발현도에 무관하게 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 지시해준다. 기타 양태에서는, 포장 삽입물이, 항체 또는 조성물이 유방암 (예를 들면, 전이성 유방암); 호르몬 비의존성 암, 전립선암 (예를 들면, 안드로겐 비의존성 전립선 암); 폐암 (예를 들면, 비-소세포 폐암); 결장암, 직장암 또는 결장직장암; 또는 본원에 기재된 기타 질병 또는 장애를 치료하는데 사용될 수도 있다는 것을 지시할 수 있다. 또한, 당해 제품은 (a) ErbB2에 결합하여 ErbB2를 과발현하는 암 세포의 성장을 억제시키는 제1 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 제2 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 이러한 본 발명의 양태에서의 제품은 상기 제1 및 제2 항체 조성물이 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 표시해주는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 포장 삽입물은 조성물 (ErbB2에 결합하여 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체를 포함함)의 사용자에게, 그 항체를 이전 단락에 기재된 임의의 보조제 (예를 들면, 화학요법제, EGFR-표적된 약물, 항혈관형성제, 항호르몬성 화합물, 심보호제 및(또는) 사이토킨)과 함께 복합 요법으로 사용할 수 있다는 것을 지시해줄 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 당해 제품은 제약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면 세균증식 억제성 주사용수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업용 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질 (기타 완충제, 희석제, 여과제, 바늘 및 주사기 포함)을 추가로 포함할 수 있다.

VII. 항-ErbB2 항체에 대한 비치료학적 용도

본 발명의 항체 (예: 인간화 ErbB2 항체)는 추가의 비치료학적 용도를 갖는다.

예를 들면, 당해 항체는 친화 정제용 제제로서 사용될 수 있다. 이러한 과 정에서는, 상기 항체를 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여, 세파덱스 수지 또는 여과지 상에 고정화시킨다. 이와 같이 고정화된 항체를, 정제하고자 하는 ErbB2 단백질 (또는 그의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 상기 지지체를 적합한 용매로 세척하는데, 이는 상기 고정화된 항체와 결합되는 ErbB2 단백질을 제외하고는 샘플 중의 거의 모든 물질을 제거시킬 것이다. 최종적으로, 상기 지지체를 또다른 적합한 용매 (예: pH 5.0의 글리신 완충액)으로 세척하는데, 이는 상기 항체로부터 ErbB2 단백질을 방출시킬 것이다.

항-ErbB2 항체가 ErbB2 단백질에 대한 진단 검정, 예를 들면 특정 세포, 조직 또는 혈청에서의 그의 발현을 탐지하는데 유용할 수도 있다.

진단 적용하는 경우에는, 당해 항체가 전형적으로, 탐지 가능한 잔기로 표지될 것이다. 일반적으로 다음 범주로 나눌 수 있는 수 많은 표지가 시판중이다:

(a) ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I 등의 방사성 동위원소. 상기 항체를, 예를 들면 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 상기 방사성 동위원소로 표지시킬 수 있고, 신틸레이션 계수를 이용하여 방사능을 결정할 수 있다.

(b) 희토류 킬레이트 (에우로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드 등의 형광성 표지가 시판중이다. 이러한 형광성 표지는, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 참조]에 기재된 기술을 사용하여 상기 항체에 결합시킬 수 있다. 형광계를 이용하여 형광을 정량화할 수 있다.

(c) 각종 효소-기질 표지가 시판중이며, 미국 특허 제4,275,149호는 이들 중의 몇몇을 논의하고 있다. 상기 효소는 일반적으로 각종 기술을 사용하여 측정할 수 있는 색소생성 기질의 화학적 변화를 촉매한다. 예를 들면, 상기 효소는 기질의 색상 변화를 촉매할 수 있는데, 이는 분광광도 측정법으로 측정할 수 있다. 또다른 한편, 효소는 기질의 형광성 또는 화학발광성을 변화시킬 수 있다. 형광성 변화를 정량화하는 기술이 상기 언급되어 있다. 화학발광성 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음, 측정될 수 있는 (예를 들어, 화학발광계를 사용하여 측정함) 빛을 방사하거나 형광 수용체로 에너지를 기증할 수 있다. 효소 표지의 예로는 루시퍼라제 (예: 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균성 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제 (예: 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)), 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예: 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예: 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 있다. 항체에 효소를 결합시키는 방법이 문헌 [O'Sullivan et a., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone ＆ H.Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.

효소-기질 결합물의 예에는 다음이 포함된다:

(i) 기질로서의 수소 퍼옥시다제와 서양고추냉이 퍼옥시다제와의 결합물 (여기서, 상기 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예: 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킨다);

(ii) 색소생성 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트와 알칼린 포스파타제 (AP)와의 결합물; 및

(iii) 색소생성 기질 (예: p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광생성 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제와 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와의 결합물.

수 많은 기타 효소-기질 결합물이 당해 분야의 숙련인에게 입수 용이하다. 이들에 대한 일반적인 고찰은 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참조할 수 있다.

종종, 상기 표지를 항체와 간접적으로 결합시킨다. 당해 분야의 숙련인은 이를 달성하기 위한 각종 기술을 잘 알고 있을 것이다. 예를 들면, 항체를 바이오틴과 결합시킨 다음, 상기 언급된 표지의 3가지 광범위한 범주 중의 어느 하나를 아비딘과 결합시킬 수 있느데, 이와 반대의 순서도 가능하다. 바이오틴은 아비딘과 선택적으로 결합되므로, 표지를 이러한 간접 방식으로 항체와 결합시킬 수 있다. 또다른 방법으로는, 표지와 항체의 간접 결합을 달성하기 위하여, 항체를 작은 합텐 (예: 디곡신)과 결합시키고, 상기 언급된 상이한 유형의 표지 중의 하나를 항-합텐 항체 (예: 항-디곡신 항체)와 결합시킨다. 이로써, 표지와 항체의 간접적 인 결합을 달성할 수 있다.

본 발명의 또다른 양태에서는, 항-ErbB2 항체를 표지시킬 필요가 없고, 그의 존재는 ErbB2 항체와 결합되는 표지된 항체를 사용하여 탐지할 수 있다.

본 발명의 항체는 공지된 어떠한 검정 방법, 예를 들면 경쟁적 결합 검정, 직접적 및 간접적 샌드위치 검정, 및 면역침전 검정에서 이용할 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodis: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)].

면역조직화학에 대해서는, 종양 샘플이 신선하거나 동결된 것일 수 있거나, 또는 이를 파라핀에 봉매시키고 포르말린 등의 방부제와 함께 파라핀에 고정시킬 수 있다.

당해 항체를 또한, 생체내 진단 검정에 사용할 수도 있다. 일반적으로, 이러한 항체는 방사성핵종 (예: ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³H, ³²P 또는 ³⁵S)로 표지시켜, 면역신티오그래프를 사용하여 종양의 위치를 확인할 수 있다. 편의상, 본 발명의 항체는 키트, 즉 진단 검정의 수행에 대해 지시해주는 예정량의 시약의 포장된 조합체 내에 제공될 수 있다. 항체를 효소로 표지시킨 경우에는, 키트가 이러한 효소에 의해 요구되는 기질과 조인자 (예: 탐지 가능한 발색단 또는 형광단을 제공해주는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 안정화제, 완충제 (예: 차단용 완충제 또는 용해용 완충제) 등의 기타 첨가제가 포함될 수 있다. 각종 시약의 상대적 양은 해당 검정의 민감도를 실질적으로 최적화시켜 주는 시약의 용액 중 농도 를 제공하도록 광범위하게 다양할 수 있다. 특히, 시약은, 해리시 적당한 농도를 갖는 시약 용액을 제공해줄 부형제를 포함한, 통상 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있다.

VIII. 물질의 기탁

다음의 하이브리도마 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA; ATCC)에 기탁하였다:

항체 명칭 ATCC 번호 기탁일

7C2 ATCC HB-12215 1996. 10. 17

7F3 ATCC HB-12216 1996. 10. 17

4D5 ATCC CRL 10463 1990. 5. 24

2C4 ATCC HB-12697 1999. 4. 8

본 발명의 추가의 내역이 다음의 비제한적 실시예로써 예시된다. 명세서 내의 인용 문헌 전문이 본원에 참조 문헌으로써 삽입되어 있다.

실시예 1

모노클로날 항체 2 C4 의 생성 및 특징화

ErbB2의 세포외 도메인과 특이적으로 결합되는 쥐의 모노클로날 항체 2C4, 7F3 및 4D5를 문헌 [Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990)]에 기재된 바와 같이 생성시켰다. 간략하게 언급하면, 문헌 [Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:7158-7163 (1987)]에 기재된 바와 같이 생성된 NIH 3T3/HER2-3₄₀₀ 세포 (대략 1 x 10⁵개 ErbB2 분자/세포를 발현함)를 25 mM EDTA를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 수거하고, 이를 사용하여 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. 0, 2, 5 및 7주째에 상기 마우스에게 0.5 ㎖ PBS 중의 10⁷개 세포를 복강내 주사하였다. ³²P-표지된 ErbB2로 면역침전된 항혈청을 가진 마우스에게 맥아 아글루티닌-세파로스 (WGA) 정제된 ErbB2 막 추출물을 9주 및 13주째에 복강내 주사하였다. 이어서, ErbB2 제제 0.1 ㎖를 정맥내 주사한 다음, 비장 세포를 마우스 골수종 주 X63-Ag8.653과 융합시켰다.

하이브리도마 상등액을 대상으로 하여, ELISA 및 방사선면역침전법에 의해 ErbB2-결합성에 대해 스크리닝하였다.

모노클로날 항체 4D5, 7F3 및 2C4에 의해 결합된 ErbB2 에피토프를 경쟁적 결합 분석법에 의해 결정하였다 [Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990)]. 형광성을 정량화하기 위한 판덱스 (PANDEX) (상표명) 스크린 기계를 사용하여 본래의 세포 상에서 직접적으로 형광 측정함으로써 항체에 대한 교차-차단 연구를 수행하였다. 각각의 모노클로날 항체를, 확립된 과정 [Wofsy et al., Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel and Schiigi (eds.). San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)]을 이용하여 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)와 결합시켰다. NIH 3T3/HER2-3₄₀₀ 세포의 밀집성 단층을 트립신으로 처리하고, 1회 세척한 다음, 0.5％ 소 혈청 알부민 (BSA)과 0.1％ NaN₃를 함유하는 찬 PBS에 1.75 x 10⁸ 세포/㎖로 재현탁시켰다. 1％ 라텍스 입자 (IDC, Portland, OR)의 최종 농도로 가하여 판덱스 (상표명) 평판 막이 막히는 현상을 저하시켰다. 현탁액 중의 세포 20 ℓ와 20 ℓ의 정제된 모노클로날 항체 (100 g/㎖ 내지 0.1 g/㎖)를 판덱스 (상표명) 평판 웰에 가하고 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 20 ℓ중의 예정된 희석율의 FITC-표지된 모노클로날 항체를 각 웰에 가하고, 30분 동안 인큐베이션시키고, 세척한 다음, 판덱스 (상표명)에 의해 형광성을 정량화하였다. 모노클로날 항체는, 무관한 모노클로날 항체 대조군과 비교해서 각각이 기타 항체의 결합을 50％ 이상 차단시키는 경우에 에피토프를 공유하는 것으로 간주되었다. 이 실험에서는, 모노클로날 항체 4D5, 7F3 및 2C4가 각각 에피토프 I, G/F 및 F로 할당되었다.

모노클로날 항체 2C4, 7F3 및 4D5의 성장 억제 특징은 유방 종양 세포주 SK-BR-3을 사용하여 평가하였다 [Hudziak et al., Molec. Cell. Biol. 9 (3):1165-1172 (1989)]. 간략하게 언급하면, SK-BR-3 세포를 0.25％ (vol/vol) 트립신을 사용하여 탈착시키고 완전 배지에 4 x 10⁵ 세포/㎖의 밀도로 현탁시켰다. 100ℓ의 등취량 (4 x 10⁴개 세포)을 96-웰 미세희석판 내로 평판 배양하고, 세포가 부착되도록 한 다음, 배지 단독 또는 모노클로날 항체를 함유하는 배지 100ℓ (최종 농도 5g/㎖)를 가하였다. 72시간 후, 상기 평판을 PBS (pH 7.5)로 2회 세척하고, 크리스탈 바이올렛 (메탄올 중의 0.5％)로 염색한 다음, 문헌 [Sugarman et al., Science 230:943-945 (1985)]에 기재된 바와 같이 상대적 세포 증식에 대해 분석하였다. 모노클로날 항체 2C4 및 7F3는, 모노클로날 항체 4D5를 사용하여 달성된 약 56％ 억제도에 비해, SK-BR-3 상대적 세포 증식을 각각 약 20％ 및 약 38％ 억제하였다.

모노클로날 항체 2C4, 4D5 및 7F3를 대상으로 하여, MCF7 세포의 전세포 용해물로부터 M_r 180,000 범위 내의 단백질의 HRG-자극된 티로신 인산화를 억제시키는 그의 능력에 대해 평가하였다 [Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996)]. MCF7 세포는 공지된 모든 ErbB 수용체를 발현하지만, 비교적 낮은 수준으로 발현하는 것으로 보고되어 있다. ErbB2, ErbB3 및 ErbB4는 거의 동일한 분자 크기를 나타내기 때문에, 전세포 용해물이 웨스턴 블롯 분석으로 평가된 경우에 단백질이 티로신 인산화되는지를 식별하는 것은 가능하지 않다.

그러나, 이들 세포는 HRG 티로신 인산화 검정에 대해서는 동일한데, 이는 외생적으로 가해진 HRG의 부재하에서 이용된 검정 조건 하에서는, 이들 세포가 M_r 180,000 범위 내에서 탐지 가능하지 않은 수준 정도로 낮은 티로신 인산화 단백질을 나타내기 때문이다.

MCF7 세포를 24-웰 평판에 평판 배양하고, ErbB2에 대한 모노클로날 항체를 각 웰에 가하며, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 다음, rHRG 1_177-244을 최종 농도가 0.2 nM이 되도록 각 웰에 가하고, 인큐베이션을 8분 동안 지속시켰다. 배지를 각 웰로부터 조심스럽게 탈기시키고, 100ℓ의 SDS 샘플 완충액 (5％ SDS, 25mM DTT 및 25 mM 트리스-HCl, pH 6.8)을 가함으로써 반응을 중지시켰다. 각 샘플 (25ℓ)을 4 내지 12％ 구배 겔 (Novex) 상에서 전기영동시킨 다음, 폴리비닐리덴 디플 루오라이드 막으로 전기영동적으로 옮겼다. 안티포스포티로신 (UBI로부터의 4G10; 1g/㎖로 사용됨) 면역블롯을 현상하고, M_r 약 180,000에서의 우세 반응성 밴드 세기를 문헌 [Holmes et al. Science 256:1205-1210 (1992); Silwkowski et al., J. Biol. Chem. 269:14661-14665 (1994)]에 기재된 바와 같이 반사 밀도측정법으로 정량화하였다.

모노클로날 항체 2C4, 7F3 및 4D5는 M_r 180,000에서 HRG-유도된 티로신 인산화 시그날의 생성을 상당히 억제하였다. 그러나, HRG의 부재하에서는, 이들 항체중 어떠한 것도 M_r 180,000 범위에서 단백질의 티로신 인산화를 자극할 수 없었다. 또한, 이들 항체는 EGFR [Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990)], ErbB3 또는 ErbB4와 교차 반응하지 않았다. 항체 2C4 및 7F3은 p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 대조군에 비해 <25％ 정도로 상당히 억제시켰다. 모노클로날 항체 4D5는 티로신 인산화의 HRG 자극을 대략 50％ 정도 차단시킬 수 있었다. 도 2A는 반사 밀도측정법으로 결정된 바와 같은, p180 티로신 인산화의 HRG 자극 억제에 대한 2C4 또는 7F3의 용량-반응 곡선을 도시한 것이다. 4-파라미터 피트를 사용한 이들 억제 곡선의 펑가로 인해, 2C4와 7F3에 대한 IC₅₀를 각각 2.8 ±0.7 nM 및 29.0 ±4.1 nM 얻었다.

항-ErbB2 항체에 의한 MCF7 유방 종양 세포주에 대한 HRG 결합 억제는 24-웰-평판 포맷으로 얼음 상의 단층 배양물을 사용하여 수행하였다 [Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996)]. 항-ErbB2 모노클로날 항체를 각 웰에 가 하고, 30분 동안 인큐베이션시켰다. ¹²⁵I-표지된 rHRGβ1_177-244 (25pm)을 가하고, 인큐베이션을 4 내지 16시간 동안 지속시켰다. 도 2B는 2C4 또는 7F3에 의한 MCF7 세포에 대한 HRG 결합 억제에 대한 용량-반응 곡선을 제공한다. 각종 농도의 2C4 또는 7F3를 ¹²⁵I-표지된 rHRGβ1의 존재하에서 MCF7 세포와 함께 인큐베이션시켰는데, 억제 곡선이 도 2B에 도시되어 있다. 이들 데이타를 분석한 결과, 2C4 및 7F3에 대한 IC₅₀은 각각 2.4±0.3 nM 및 19.0±7.3 nM이었다. 2C4 및 7F3에 대한 약 74％의 최대 억제도는 티로신 인산화 데이타와 일치한다.

MCF7 세포 상에서 관찰된 항-ErbB2 항체의 효과가 일반적인 현상인지를 결정하기 위하여, 인간 종양 세포주를 2C4 또는 7F3와 함께 인큐베이션시키고, 특이적 ¹²⁵I-표지된 rHRGβ1 결합도를 결정하였다 [Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996)]. 이러한 연구로부터의 결과가 도 3에 도시되어 있다. ¹²⁵I-표지된 rHRGβ1 결합은 모든 세포주에서 2C4 또는 7F3에 의해 상당히 억제될 수 있었는데, 단 ErbB2를 거의 발현하지 않거나 전혀 발현하지 않는 것으로 보고된 유방암 세포주 MDA-MB-468은 제외된다. 나머지 세포주는 ErbB2를 발현하는 것으로 보고되었는데, ErbB2 발현 수준은 이들 세포주들 간에 광범위하다. 실제로, 시험된 세포주에서의 ErbB2 발현 범위는 2차수 이상 다양하다. 예를 들면, BT-20, MCF7 및 Caov3은 대략 10⁴개 ErbB2 수용체/세포를 발현하는 반면, BT-474 및 SK-BR-3은 대략 10⁶개 ErbB2 수용체/세포를 발현한다. 이 세포내의 광범위한 ErbB2 발현 및 상기 데이타를 보면, ErbB2 및 ErbB3 또는 ErbB4 사이의 상호작용 그 자체가 혈장 막 표면 상에서 일어나는 고 친화성 상호작용이라는 결론을 얻게 된다.

외인성 rHRGβ1의 존재하 또는 부재하에서 MDA-MB-175 및 SK-BR-3 세포에 대한 모노클로날 항체 2C4 및 4D5의 성장 억제 효과를 평가하였다 [Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)]. MDA-MB-175 세포에서의 ErbB2 수준은 정상적인 유방 상피 세포에서 발견된 수준 보다 4 내지 6배 정도 더 높고, ErbB2-ErbB4 수용체는 MDA-MB-175 세포에서 인산화된 구성성 티로신이다. MDA-MB-175 세포를 항-ErbB2 모노클로날 항체 2C4 및 4D5 (10 ㎍/㎖)로 4일 동안 처리하였다. 크리스탈 바이올렛 염색 검정에서는, 2C4와 인큐베이션시킨 결과, 이러한 세포주 상에서 강력한 성장 억제 효과가 나타났다 (도 4A). 외인성 HRG가 이러한 억제를 상당히 반전시키지 않았다. 또다른 한편, 2C4는 ErbB2 과발현성 세포주 SK-BR-3에 대한 억제 효과를 전혀 나타내지 않았다 (도 4B). 모노클로날 항체 2C4는 외인성 HRG의 존재하 및 부재하 모두에서, 모노클로날 항체 4D5 보다 더 큰 정도로 MDA-MB-175 세포의 세포 증식을 억제할 수 있었다. 4D5에 의한 세포 증식 억제는 ErbB2 발현 수준에 의존적이다 [Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993)]. SK-BR-3 세포에서 66％의 최대 억제가 탐지될 수 있었다 (도 4B). 그러나, 이러한 효과는 외인성 HRG에 의해 극복될 수 있었다.

실시예 2

ErbB2 와 ErbB3 과의 HRG 의존적 연합이 모노클로날 항체 2 C4 에 의해 차단된다

ErbB2과 연합하는 ErbB3의 능력을 공-면역침전 실험에서 시험하였다. 1.0 x 10⁶개 MCF7 또는 SK-BR-3 세포를, 10％ 태아 송아지 혈청 (FBS)과 10mM HEPES, pH 7.2를 함유하는 50:50 DMEM/함스 F12 배지 중의 6웰 조직 배양 판에 접종하고, 밤새 부착시켜 두었다. 실험을 시작하기에 앞서 상기 세포를 무혈청 성장 배지에서 2시간 동안 굶주리게 하였다.

상기 세포를 인산염 완충 식염수 (PBS)로 간단히 세척한 다음, 10mM HEPES를 함유하는 0.2％ w/v 소 혈청 알부민 (BSA), RPMI 배지에서 희석된 지시된 항체 100nM와 함께 인큐베이션시키거나, 또는 결합성 완충액 단독 (대조군)과 함께 인큐베이션시켰다. 실온에서 1시간 후, HRG를 5 nM의 최종 농도로 가하여 웰의 절반이 되도록 한다 (+). 유사한 용적의 결합성 완충액을 다른 웰 (-)에 가하였다. 인큐베이션을 대략 10분 동안 지속하였다.

상등액을 탈기시켜 제거하고, 세포를, 0.2mM PMSF, 10㎍/㎖ 레우펩틴 및 10TU/㎖ 아프로티닌을 함유하는, RPMI, 10mM HEPES, pH 7.2, 1.0％ v/v TRITON X-100 (상표명), 1.0％ w/v CHAPS (용해 완충액)에서 용해시켰다. 이러한 용해물은 원심분리시킴으로써 불용성 물질을 제거하였다.

ErbB2를, 친화성 겔 (Affi-Prep 10, Bio-Rad)에 공유적으로 커플링된 모노클로날 항체를 사용하여 면역침전시켰다. 이러한 항체 (Ab-3, Oncogene Sciences)는 세포질 도메인 에피토프를 인식한다. 대략 8.5 ㎍의 고정화 항체를 함유하는 겔 슬러리 10㎕를 각 용해물을 가함으로써 면역침전을 수행하였고, 샘플을 실온에서 2시간 동안 혼합시켜 두었다. 이어서, 겔을 원심분리하여 수집하였다. 이러한 겔을 용해 완충액을 사용하여 배치식으로 3회 세척하여, 결합되어 있지 않은 물질을 제거하였다. 이어서, SDS 샘플 완충액을 가한 다음, 샘플을 비등수조에서 간단하게 가열하였다.

상등액을 4 내지 12％ 폴리아크릴아미드 겔 상에서 수행하고 니트로셀룰로스 막 상으로 전기블롯팅하였다. 이러한 블롯을, 그의 세포질 도메인 에피토프에 대한 폴리클로날 항체로 프로빙함으로써 ErbB3의 존재를 평가하였다 (c-17, Santa Cruz Biotech). 상기 블롯을 화학발광성 기질 (ECL, Amersham)을 사용하여 가시화하였다.

MCF7 및 SK-BR-3 세포 각각에 대해, 도 5A 및 5B의 대조군 레인에 도시된 바와 같이, 상기 세포가 HRG로 자극된 경우에만, ErbB3이 ErbB2 면역침전물에 존재하였다. 이러한 세포를 먼저 모노클로날 항체 2C4와 함께 인큐베이션시킨 경우에는, ErbB3 시그날이 MCF7 세포에서 사라지거나 (도 5A, 레인 2C4 +) SK-BR-3 세포에서 실질적으로 감소되었다 (도 5B, 레인 2C4 +). 도 5A 내지 5B에 도시된 바와 같이, 모노클로날 항체 2C4는, 헤르셉틴 (등록상표) 보다 실질적으로 더 효율적으로, MCF7 세포와 SK-BR-3 세포 모두에서 ErbB3과 ErbB2의 헤레굴린 의존적 연합을 차단시킨다. 헤르셉틴 (등록상표)과의 예비인큐베이션은 MCF7 용해물에서의 ErbB3 시그날을 감소시켰지만, SK-BR-3 용해물로부터 함께 침전된 ErbB3의 양에는 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다. EGF 수용체에 대한 항체 (Ab-1, Oncogene Sciences)와의 예비인큐베이션은, 어느 한 세포주에서 ErbB2과 함께 면역침전되는 ErbB3의 능력에는 전혀 영향을 끼치지 않았다.

실시예 3

인간화 2 C4 항체

쥐의 모노클로날 항체 2C4의 가변 도메인을 먼저, 마우스/인간 키메라 Fab 단편을 생성시키는 벡터 내로 클로닝시켰다. 제조업자의 지시에 따라서 스트라젠 RNA 추출용 키트를 사용하여, 상기 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 단리하였다. 가변 도메인을 RT-PCR에 의해 증폭시키고, 겔 정제한 다음, 기존에 보도된 바와 같이[Carter et al. PNAS (USA) 89:4285 (1992); 및 미국 특허 제5,821,337호] 인간 카파 불변 도메인과 인간 C_H1 도메인을 함유하는 pUC119-이용된 플라스미드의 유도체 내로 삽입하였다. 이로써 생성된 플라스미드를, Fab 편을 발현하기 위해 이. 콜라이 균주 16C9 내로 형질전환시켰다. 배양물의 성장, 단백질 발현 유도 및 Fab 단편의 정제를 기존에 보고된 바와 같이 수행하였다 [Werther et al. J. Immunol. 157:4986-4995 (1996); Presta et al. Cancer Research 57:4593-4599 (1997)].

MCF7 세포에 대한 ¹²⁵I-HRG 결합을 억제하고 MCF7 세포에서 p180 티로신 인산화의 rHRG 활성화를 억제하는 능력에 대해 알아보기 위해, 정제된 키메라 2C4 Fab 단편을 쥐의 모 항체 2C4와 비교하였다. 도 6A에 도시된 바와 같이, 키메라 2C4 Fab 단편은 인간 유방암 세포주 MCF7 상의 고친화성 ErbB2-ErbB3 결합 부위의 형성을 파열시키는데 상당히 유효하다. 본래의 쥐의 2C4에 대해 산정된 상대적 IC₅₀ 값 은 4.0 ±0.4 nM인 반면, Fab 단편에 대한 값은 7.7 ±1.1 nM이다. 도 6B에 도시된 바와 같이, 1가 키메라 2C4 Fab 단편은 HRG-의존적 ErbB2-ErbB3 활성화를 파열시키는데 극히 유효하다. 본래의 쥐의 모노클로날 항체 2C4에 대해 산정된 IC₅₀ 값은 6.0±2 nM인 반면, Fab 단편에 대한 값은 15.0 ±2 nM이다.

키메라 클론의 DNA 서열화에 의해, CDR 잔기를 동정할 수 있었다 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institudes of Health, Bethesda, MD (1991)] (도 7A 및 B). 올리고뉴클레오티드 부위 지시된 돌연변이유발을 이용하여, 이들 CDR 영역 6개 모두를, 기존에 보고된 바와 같이 [Presta et al., Cancer Research 57:4593-4599 (1997)] 플라스미드 VX4 상에 함유된 완전한 인간 골격 (V_L 카파 아그룹 I 및 V_H 아그룹 III) 내로 도입하였다. 이로써 생성된 "CDR-스왑"으로부터의 단백질을 상기 언급된 바와 같이 발현 및 정제하였다. 결합성 연구를 수행하여 두 변형물을 비교하였다. 간략하게 언급하면, NUNC MAXISORP (상표명) 판을 50mM 탄산염 완충액, pH 9.6에서 4℃ 하에 밤새, ErbB2 세포외 도메인 (ECD; WO 90/14357에 기재된 바와 같이 생성됨) 1 ㎍/㎖으로 피복한 다음, 실온에서 1시간 동안 ELISA 희석액 (0.5％ BSA, 0.05％ 폴리소르베이트 20, PBS)로 차단시켰다. ELISA 희석액 중의 일련의 샘플 희석물을 상기 판 상에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 Fab 단편을 바이오티닐화 쥐의 항-인간 카파 항체 (ICN 634771)로 탐지한 다음 스트렙타비딘-결합된 서양고추냉이 퍼옥시다제 (Sigma)로 탐지하고, 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (Kirkegaard ＆ Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)를 사용하여 탐지하였다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 도 8A에 도시된 바와 같이, 모든 결합이 CDR-스왑 인간 Fab 단편의 작제시 상실되었다.

인간화 Fab의 결합을 복원하기 위하여, 주형으로서 CDR-스왑으로부터의 DNA를 사용하여 돌연변이체를 작제하였다. 컴퓨터 생성 모델을 사용하여 (도 9), 이들 돌연변이를, 변화가 CDR 입체 배치나 항체-항원 계면에 영향을 줄 수도 있는 위치에서 인간 골격 영역 잔기가 이들의 쥐의 대응물로 변하도록 고안하였다. 돌연변이체가 표 2에 제시되어 있다.

<표 2>

인간화 2C4 FR 돌연변이 지정

돌연변이체 번호	골격 영역 (FR) 치환기
560	ArgH71Val
561	AspH73Arg
562	ArgH71Val, AspH73Arg
568	ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly
569	ArgH71Val, AspH73Arg, PheH67Ala
570	ArgH71Val, AspH73Arg, AsnH76Arg
571	ArgH71Val, AspH73Arg, LeuH78Val
574	ArgH71Val, AspH73Arg, IleH69Leu
56869	ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly, PheH67Ala

각종 돌연변이체에 대한 결합 곡선이 도 8A 내지 C에 도시되어 있다. 변화물 ArgH71Val, ArgH73Arg, 및 IleH69Leu를 갖는 인간화 Fab 변형물 574는 최초의 키메라키메라ab 단편의 수준으로 결합성을 복원시킨 것으로 보인다. 인간화 항체의 결합을 추가로 정련하거나 향상시키기 위해, 부가의 FR 및(또는) CDR 잔기, 예를 들면 L2, L54, L55, L56, H35 및(또는) H48을 변형시킬 수 있다 (예: 다음과 같 이 치환된다: IleL2Thr; ArgL54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser; 및 ValH48Ile). 별법으로 또는 부가적으로, 그의 친화성 및(또는) 기타 생물학적 활성을 추가로 개선시키거나 정련시키기 위해, 인간화 항체를 친화도 성숙시킬 수 있다 (상기 참조).

인간화 2C4 변형물 574를, 파지 디스플레이 방법을 이용하여 친화도 성숙시켰다. 간략하게 언급하면, 인간화 2C4.574 Fab를 geneIII 융합물로서 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝하였다. M13KO7 헬퍼 파지로 감염시킴으로써 파지 입자를 도입한 경우에는, 이러한 융합으로, 파지 테일-섬유 단백질 geneIII의 N-말단 상에 Fab를 디스플레이할 수 있었다 [Baca et al. J. Biol Chem. 272:10678 (1997)].

상기 동정된 6개의 CDR 각각에 대해 개별적인 라이브러리를 작제하였다. 이들 라이브러리에서는, 컴퓨터 생성 모델 (도 9)을 사용하여 ErbB2에 대한 결합에서 잠재적으로 유의적인 것으로서 동정된 CDR에서의 아미노산을, 이들의 코돈으로서 "NNS"를 함유하는 올리고를 사용하여 무작위 처리하였다. 이어서, 상기 라이브러리를, 모든 차단 용액 대신 사용된 0.2％ TWEEN 20 (등록상표)(MPBST)를 갖는 PBS 중의 3％ 분유로 NUNC MAXISORP™판 상에서 피복된 ErbB2 ECD에 대해 패널시켰다. 패닝 라운드 3, 4 및 5에서, 2C4.574 보다 더 높은 친화도를 지닌 파지를 선별하기 위해, 가용성 ErbB2 ECD 또는 가용성 Fab 2C4.574를 경쟁상대로서 세척 단계 동안에 가한다. 세척 시간을 실온에서 1시간 연장하였다.

패닝 5라운드 후, 개개의 클론을 파지-ELISA에 의해 다시 분석하였다. 개개의 클론을 코스타르 96웰 U자 바닥형 조직 배양판에서 성장시키고, 헬퍼 파지를 가 함으로써 파지를 유도하였다. 밤새 성장시킨 후, 이. 콜라이 세포를 펠릿화하고, 파지 함유 상등액을 96웰 판에 형질감염시키는데, 여기서 상기 파지를 실온에서 1시간 동안 MPBST로 차단시켰다. ErbB2 ECD로 피복된 NUNC MAXISORP (상표명) 판을 상기와 같이 MPBST로 또한 차단하였다. 차단된 파지를 상기 판 상에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 파지를, MPBST에서 1:5000으로 희석된 서양고추냉이 퍼옥시다제-결합된 항-M13 모노클로날 항체 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. 27-9421-01)를 사용하여 탐지한 다음, 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘을 사용하여 탐지하였다. 흡광도를 450nm에서 판독하였다.

가장 큰 시그날을 제공해주는 각 라이브러리로부터의 48개 클론을 DNA 서열화하였다. 가장 자주 생성된 서열을 갖는 클론을, 가용성 Fab의 발현을 허용해주는 상기 기재된 벡터 내로 서브클로닝시켰다. 이들 Fab를 유도하고, 단백질 정제한 다음, 정제된 Fab를 대상으로 하여, 상기 언급된 바와 같이 ELISA에 의한 결합에 대해 분석하고, 이러한 결합을 출발 인간화 2C4.574 변형물의 것과 비교하였다.

개개의 CDR에서 관심있는 돌연변이체를 동정한 후, 이들의 각종 조합체인 추가 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 작제 및 시험하였다. 574에 비해 개선된 결합을 제공해주는 돌연변이체가 표 3에 기재되어 있다.

<표 3>

2C4.574의 친화도 성숙화로부터 유도된 돌연변이체의 지정

돌연변이체 명칭	574로부터의 변화	돌연변이체/574*
H3.A1	serH99trp, metH34leu	0.380
L2.F5	serL50trp, tyrL53gly, metH34leu	0.087
H1.3.B3	thrH28gln, thrH30ser, metH34leu	0.572
L3.G6	tyrL92pro, ileL93lys, metH34leu	0.569
L3.G11	tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly, metH34leu	0.561
L3.29	tyrL92phe, tyrL96ans, metH34leu	0.552
L3.36	tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro, metH34leu	0.215
654	serL50trp, metH34leu	0.176
655	metH34ser	0.542
659	serL50trp, metH34ser	0.076
L2.F5.H3.A1	serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, serH99trp	0.175
L3.G6.H3.A1	tyrL92pro, ileL93lys, metH34leu, serH99trp	0.218
H1.3.B3.H3.A1	thrH28gln, thrH30ser, metH34leu, serH99trp	0.306
L3.G11.H3.A1	tyrL92ser, ileL93Arg, tyrL94gly, metH34leu, serH99trp	0.248
654.H3.A1	serL50trp, metH34leu, serH99trp	0.133
654.L3.G6	serL50trp, metH34leu, tyrL92pro, ileL93lys	0.213
654.L3.29	serL50trp, metH34leu, tyrL92phe, tyrL96asn	0.236
654.L3.36	serL50trp, metH35leu, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro	0.141
* ErbB2-ECD ELISA에서 표준 곡선의 중간-OD를 제공하는데 필요한 574의 양에 대한 표준 곡선의 중간-OD를 제공하는데 필요한 돌연변이체의 양의 비율. 1.0 미만의 수치는 돌연변이체가 574 결합보다는 더 우수하게 ErbB2와 결합하는 것을 지시해준다.

다음 돌연변이체를 또한 작제하였으며, 현재 평가중에 있다:

659.L3.G6 serL50trp, metH34ser, tyrL92pro, ileL93lys

659.L3.G11 serL50trp, metH34ser, tyrL92ser, ileL93arg,

tyrL94gly

659.L3.29 serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL96asn

*659.L3.36 serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL94leu,

tyrL96pro

L2F5.L3G6 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92pro,

ileL93lys

L2F5.L3G11 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92ser,

ileL93arg, tyrL94gly

L2F5.L29 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe,

tyrL96asn

L2F5.L36 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe,

tyrL94leu, tyrL96pro

L2F5.L3G6.655 serL50trp, tyrL53gly, metH35ser, tyrL92pro,

ileL93lys

L2F5.L3G11.655 serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92ser,

ileL93arg, tyrL94gly

L2F5.L29.655 serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92phe,

tyrL96asn

L2F5.L36.655 serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92phe,

tyrL94leu, tyrL96pro

상동성 스캔에 의해 제시된 다음의 돌연변이체가 현재 작제중이다:

678 thrH30ala

679 thrH30ser

680 lysH64arg

681 leuH96val

682 thrL97ala

683 thrL97ser

684 tyrL96phe

685 tyrL96ala

686 tyrL91phe

687 thrL56ala

688 glnL28ala

689 glnL28glu

H34에서의 바람직한 아미노산은 메티오닌일 것이다. 이러한 위치에서의 산화가 발견된 경우에는, 루이신으로 변할 수도 있다.

AsnH52 및 asnH53이 결합에 상당히 바람직한 것으로 밝혀졌다. 이들 잔기가 알라닌 또는 아스파르트산으로 변하게 되면, 결합이 현저하게 저하되었다.

인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 갖는 인간화 변형물 574의 가변 경쇄 및 중쇄 도메인을 포함하는 본래의 항체를 제조하였다 [미국 특허 제5,821,337호 참조]. 이러한 본래의 항체는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 생성된다. 상기 분자가 본원에서 rhuMAb 2C4로 명명된다.

실시예 4

모노클로날 항체 2 C4 는 MAPK 의 EGF , TGF -α또는 HRG 매개된 활성화를 차단시킨다

많은 성장 인자 수용체는 미토겐 활성화 단백질 키나제 (MAPK) 경로를 통하여 신호를 보낸다. 이들 이중 특이성 키나제는, 궁극적으로 암 세포 분열을 촉발 시키는 시그날 형질도입 경로에서의 주요 종점 중의 하나이다. MAPK의 EGF, TGF-α또는 HRG 활성화를 억제시키는 모노클로날 항체 2C4 또는 헤르셉틴 (등록상표)의 능력을 다음 방식으로 평가하였다.

MCF7 세포 (10⁵개 세포/웰)을 12-웰 세포 배양판 중의 혈청 함유 배지에 평판 배양하였다. 그 다음날, 상기 세포 배지를 꺼내고, 0.1％ 혈청을 함유하는 신선한 배지를 각 웰에 가하였다. 이어서, 이러한 과정을 그 다음날 반복하고, 검정에 앞서, 상기 배지를 무혈청 결합성 완충액으로 대체시켰다 [Jones et al. J. Biol. Chem. 273:11667-74 (1998); and Schaefer et al. J. Biol. Chem. 274:859-66 (1999)]. 세포를 실온으로 평형시킨 다음, 200 nM 헤르셉틴 (등록상표) 또는 모노클로날 항체 2C4와 함께 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 15분 동안 1nM EGF, 1nM TGF-α 또는 0.2nM HRG로 처리하였다. 세포 배지를 탈기시킨 다음, 1％ DTT를 함유하는 0.2㎖ SDS-PAGE 샘플 완충액을 가함으로써 상기 반응을 중지시켰다. 기존에 보고된 바와 같이 [Jones et al. J. Biol. Chem. 273:11667-74 (1998)] 항-활성 MAPK 항체 (Promega)를 사용하여 웨스턴 블롯팅함으로써 MAPK 활성화를 평가하였다.

도 10에 도시된 바와 같이, 모노클로날 항체 2C4는 헤르셉틴 (등록상표) 보다 높은 수준으로, MAPK의 EGF, TGF-α또는 HRG 매개된 활성화를 상당히 차단시킨다. 이들 데이타는 모노클로날 항체 2C4가, EGFR 또는 ErbB3과의 연합에 사용되는 ErbB2의 표면과 결합되므로 시그날링 수용체 복합체의 형성을 방지시킨다는 것을 제시해준다.

모노클로날 항체 2C4는 헤레굴린 (HRG)-의존적 Akt 활성화를 억제시키는 것으로 또한 밝혀졌다. P13 키나제 시그날 형질도입 경로의 활성화는 세포 생존에 중요하다 [Carraway et al., J. Biol. Chem. 270:7111-6 (1995)]. 종양 세포에서는, P13 키나제 활성화가 침입성 표현형에 특정 역할을 할 수도 있다 [Tan et al., Cancer Research 59:1620-1625 (1999)]. 이러한 생존 경로는 주로, 세린/트레오닌 키나제 AKT에 의해 매개된다 [Bos et al., Trends Biochem Sci. 20:441-442 (1995)]. ErbB2와 ErbB3 또는 EGFR 간에 형성된 복합체는 헤레굴린 또는 EGF에 각각 반응하여 이들 경로를 개시시킬 수 있다 [Olayioye et al., Mol. ＆ Cell Biol. 18:5042-51 (1998); Karunagaran et al., EMBO Journal. 15:254-264 (1996); and Krymskaya et al. Am. J. Physiol. 276:LL246-55 (1999)]. MCF7 유방암 세포를 2C4와 함께 인큐베이션시키면, 헤레굴린-매개된 AKT 활성화가 억제된다. 더우기, 헤레굴린 첨가 부재하에 존재하는 AKT 활성화의 기본 수준이 2C4를 가함으로써 추가로 감소된다. 이들 데이타는 2C4가 P13 키나제의 ErbB 리간드-활성화를 억제시킬 수 있고, 이러한 억제로 인해 아폽토시스가 유발될 수 있다는 것을 제시해준다. 아폽토시스에 대한 민감도 증가는, 화학요법의 독성 효과에 대한 종양 세포의 민감도 증가로 명백히 나타날 수 있다.

따라서, 모노클로날 항체 2C4는 다음의 두가지 주요 시그날 형질도입 경로를 통하여 리간드 개시된 ErbB 시그날링을 억제시킨다: MAPK 키나제 (주요 증식 경로) 및 P13 키나제 (주요 생존/항아폽토시스성 경로).

실시예 5

생체내에서 모노클로날 항체 2 C4 와 헤르셉틴 (등록상표)의 배합물

폐 선종 세포주 Calu-3을 사용한 이종조직 이식편을 사용하여, 종양 성장을 억제시키는 항-HER2 모노클로날 항체 단독 또는 배합물의 효능을 평가하였다. 암컷 NCR 누드 마우스에게 0.1㎖ 중의 20 x 10⁶개 세포를 피하 접종하였다. 매주 2회씩 종양을 측정하고, 종양 결절이 100 ㎣에 도달하게 되면, 동물을 7개 처리 그룹으로 무작위로 나누었다. 처리 그룹은 다음과 같다:

(a) 대조구 모노클로날 항체, MAb 1766;

(b) 헤르셉틴 (등록상표), 10 ㎎/㎏;

(c) 모노클로날 항체 7C2, 10 ㎎/㎏;

(d) 모노클로날 항체 2C4, 10 ㎎/㎏;

(e) 헤르셉틴 (등록상표) 및 7C2, 각각 10 ㎎/㎏;

(f) 헤르셉틴 (등록상표) 및 2C4, 각각 10 ㎎/㎏; 및

(g) 모노클로날 항체 2C4 및 7C2, 각각 10 ㎎/㎏.

동물을 24일까지 매주 2회 처리하였다. 38일까지 종양 용적을 매주 2회 측정하였다.

도 11에서의 막대 그래프에 도시된 바와 같이, Calu-3 종양 보유 마우스를 2C4 또는 헤르셉틴 (등록상표)로 처리하면, 종양의 성장이 상당히 억제되었다. 헤르셉틴 (등록상표)과 2C4의 배합물 또는 헤르셉틴 (등록상표)와 7C2의 배합물은 단 독으로 투여된 어느 하나의 모노클로날 항체보다 탁월하다.

실시예 6

결장직장암을 모노클로날 항체 2 C4 로 치료함

HCA-7, LS174T 또는 CaCo-2 등의 인간 결장직장 세포주를 문헌 [Sheng et al. J. Clin. Invest. 99:2254-2259 (1997)]에 기재된 바와 같이 무흉선 누드 마우스에 피하 이식하였다. 종양이 대략 100 ㎣ 용적으로 정착되면, 복강내 주사함으로써 매주 2회 투여된 모노클로날 항체 2C4 10 내지 50 ㎎/㎏으로 동물 그룹을 처리하였다. 모노클로날 항체 2C4는 생체내에서 결장직장 이종조직 이식편의 성장을 억제한다.

실시예 7

유방암을 인간화 2 C4 로 치료함

과발현되지 않은 인간 유방암 세포에 대한 rhuMAb 2C4 또는 헤르셉틴 (등록상표)의 효과. ErbB2를 3일 알마르 블루 검정에서 평가하였다 [Ahmed, S.A. J. Immunol. Methods 170:211-224 (1994); and Page et al. Int. J. Oncol. 3:473-47691994)]. 이러한 검정에 사용된 세포는 ErbB2를 1+ 수준으로 발현하는 MDA-175 인간 유방암 세포이었다. 도 12에 도시된 바와 같이, 유방암 세포주 MDA-175의 성장은 헤르셉틴 (등록상표) 치료에 비해, rhuMAb 2C4의 첨가에 의해 용량-의존적 방식으로 상당히 억제된다.

에스트로겐 수용체 양성 (ER+)이고 ErbB2를 낮은 수준으로 발현하는 MCF7 이종조직 이식편에 대한 rhuMAb 2C4의 효능을 평가하였다. 에스트로겐이 보충된 암 컷 마우스를 사용하였다. rhuMAb 2C4를 매주 30 ㎎/㎏의 용량으로 투여하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, rhuMAb 2C4는 생체내에서 유방암 종양 성장을 억제하는데 유효하며, 여기서 유방암은 ErbB2의 과발현을 특징적으로 나타내지 않는다.

실시예 8

2 C4 의 약력학 , 대사 및 독성

rhuMAb 2C4는 인간 혈청에서 안정하였다. 생물학적 매트릭스 내에 복합체 또는 응집체가 형성되었다는 어떠한 증거도 관찰되지 않았다. 마우스에서는, rhuMAb 2C4가 헤르셉틴 (등록상표) 보다 신속하게 클리어되었다. 약력학 연구 결과는, rhuMAb 2C4 약 2 내지 6 ㎎/㎏을 매주 투여하면, 현재 투여되고 있는 헤르셉틴 (등록상표)과 유사한 혈청 농도가 생성되어야 한다는 것을 지시해준다. 생성된 혈청 2C4 노출은 시험관내에서 결정된 IC₅₀을 상당해 초과해야 한다.

시노몰구스 (cynomolgus) 원숭이 (그룹당 2마리 숫컷과 2마리 암컷)에서 독성 연구를 수행하였다. rhuMAb 2C4를 4주 동안 매주 2회씩 0, 10, 50 또는 100㎎/㎏으로 정맥내 투여하였다. 독성 연구 측정치에는 체중 (-2, -1주 및 그 후부터는 매주); 식품 소비량 (정량적, 매일); 혈압, 심전도 (ECG) 및 체온 평가에 따른 물리적 검사 (-2, -1 및 2 및 4주, 두 번째 투여한 주 이후부터 투여한지 4시간 후); 심장 초음파 평가치 (처음 1주 투여시와 연구 종결 4주시 수행함); 임상 병리학 (기준 및 2주 및 4주말); 요검사 (기준 및 2주 및 4주말); 항체 분석용 샘플링 (기준 및 2주 및 4주말); 및 부검 및 조직병리학 분석이 포함된다.

모든 그룹에서 모든 동물이 연구 끝까지 생존하였다. 상당한 임상적 관찰 내용이나 그룹 들간의 차이점이 전혀 인지되지 않았다. 부검 결과, 어떠한 동물로부터의 기관에서도 유의적인 총체적 이상이 관찰되지 않았다. 상기 동물로부터의 조직에서도 현미경에 의한 유의적 이상이 전혀 관찰되지 않았다. 연구 시작부터 연구 완료시까지 ECG의 유의적 변화가 전혀 관찰되지 않았다. 또한, 그룹 들간의 차이점도 발견되지 않았다.

실시예 9

용량 단계적 확대

암 환자에게 rhuMAb 2C4의 제1 용량을 5가지 용량 수준 (0.05, 0.5, 2.0, 4.0 또는 10㎎/㎏; 용량 수준당 6명 피검자) 중의 하나로 투여한 다음, 4주간 세척한다. 매주 5명 환자에게 매주 4회씩 동일한 용량을 투여한 다음, 추가의 4주 동안 세척한다. 완전한 반응, 부분 반응 또는 안정한 감소를 나타낸 환자가 연장 연구에 적합하다.

실시예 10

재발되거나 불응성인 전이성 전립선 암의 치료법

rhuMAb 2C4는 ErbB2에 대해 지시된 완전한 길이의 인간화 모노클로날 항체 (CHO 세포에서 생성됨)이다. rhuMAb 2C4는 ErbB2와 기타 ErbB 계열 구성원과의 연합을 차단함으로써 ErbB 경로를 통한 세포내 시그날링을 억세시킨다. 헤르셉틴 (등록상표)와는 달리, rhuMAb 2C4는 ErbB2 과발현성 종양의 성장을 억제할 뿐만 아니라 ErbB 리간드-의존적 시그날링을 요구하는 종양의 성장을 차단시킨다.

rhuMAb 2C4는 호르몬 불응성 (안드로겐 비의존성) 전립선 암 환자의 치료에 대한 단일 제제로서 지시된다. 효능에 대한 1차적인 종점에는, 단일 제제로서 사용될 때 입수가 가장 용이한 (미토크산트롬/프레드니손) 것과 비교해서 전체 생존율과 안전성이 포함된다. 2차적인 효능 종점에는 진행을 감소시키는 시간, 반응률, 삶의 질, 고통 및(또는) 반응 기간이 포함된다. rhuMAb 2C4는 병의 진행이 감소될 때까지, 매주 또는 3주마다 각각 2 또는 4 ㎎/㎏으로 정맥내 투여한다. 상기 항체는 다회분 용량 액상 제제 (20 ㎎/㎏ 이상 농도의 20 ㎖ 충진물)으로서 공급된다.

rhuMAb 2C4는 호르몬 불응성 (안드로겐 비의존성) 전립선 암 환자의 치료를 위한 화학요법과 조합하여 지시되기도 한다. 효능에 대한 1차적인 종점에는 화학요법과 비교해서 전체 생존율과 안전성이 포함된다. 2차적인 효능 종점에는 진행을 감소시키는 시간, 반응률, 삶의 질, 고통 및(또는) 반응 기간이 포함된다. rhuMAb 2C4는 병의 진행이 감소될 때까지, 매주 또는 3주마다 각각 2 또는 4 ㎎/㎏으로 정맥내 투여한다. 상기 항체는 다회분 용량 액상 제제 (20 ㎎/㎏ 이상 농도의 20㎖ 충진물)으로서 공급된다.

전립선 암 (예; 안드로겐 비의존성 전립선 암)을 치료하기 위하여 항-ErbB2 항체 (이는 ErbB2 수용체의 리간드 활성화를 차단시킨다)과 조합될 수 있는 약물의 예에는 파르네실 트랜스퍼라제 억제제; 항혈관형성제 (예: 항-VEGF 항체); EGFR-표적된 약물 (예: C225 또는 ZD 1839); 또다른 항-ErbB2 항체 (예: 성장 억제성 항-ErbB2 항체, 예를 들면 헤르셉틴 (등록상표), 또는 아폽토시스를 유도시키는 항- ErbB2 항체, 예를 들면 7C2 또는 7F3 (그의 인간화 및(또는) 친화도 성숙된 변이체를 포함함)); 사이토킨 (예: IL-2, IL-12, G-CSF 또는 GM-CSF); 항-안드로겐 (예: 플루타미드 또는 시트로테론 아세테이트); 레우프롤리드; 수라민; 화학요법제, 예를 들면 빈블라스틴, 에스트라무스틴, 미토크산트론, 리아로졸 (레티노산 대사-차단제), 사이클로포스파미드, 안트라사이클린 항생물질, 예를 들면 독소루비신, 탁산 (예: 파클리탁셀 또는 도세탁셀) 또는 메토트렉세이트, 또는 상기 물질의 조합물, 예를 들면 빈블라스틴/에스트라무스틴 또는 사이클로포스파미드/독소루비신/메토트렉세이트; 프레드니손; 하이드로코르티존; 또는 이들의 조합물이 포함된다. 이들 각종의 약물에 대한 표준 용량을 투여할 수 있는데, 예를 들면 40 ㎎/㎡/주 도세탁셀 (TAXOTERE)(등록상표); 6 (AUC) 카보플라틴; 및 200 ㎎/㎡ 파클리탁셀 (TAXOL)(등록상표)이다.

실시예 11

전이성 유방암의 치료법

rhuMAb 2C4는 ErbB2를 과발현하지 않는 전이성 유방암 환자의 치료에 대한 단일 제제로서 지시된다. 효능에 대한 1차적인 종점에는 반응률과 안전성이 포함된다. 2차적인 효능 종점에는 전체 생존율, 진행을 감소시키는 시간, 삶의 질, 및(또는) 반응 기간이 포함된다. rhuMAb 2C4는 병의 진행이 감소될 때까지, 매주 또는 3주마다 각각 2 또는 4 ㎎/㎏으로 정맥내 투여한다. 상기 항체는 다회분 용량 액상 제제 (20 ㎎/㎏ 이상 농도의 20 ㎖ 충진물)으로서 공급된다.

rhuMAb 2C4는 ErbB2를 과발현하지 않는 전이성 유방암 환자의 치료를 위한 화학요법과 조합하여 지시되기도 한다. 효능에 대한 1차적인 종점에는 화학요법 단독과 비교해서 전체 생존율과 안전성이 포함된다. 2차적인 효능 종점에는 진행을 감소시키는 시간, 반응률, 삶의 질, 및(또는) 반응 기간이 포함된다. rhuMAb 2C4는 병의 진행이 감소될 때까지, 매주 또는 3주마다 각각 2 또는 4㎎/㎏으로 정맥내 투여한다. 상기 항체는 다회분 용량 액상 제제 (20㎎/㎏ 이상 농도의 20㎖ 충진물)으로서 공급된다.

유방 암 (예; ErbB2 과발현을 특징적으로 나타내지 않는 전이성 유방 암)을 치료하기 위하여 항-ErbB2 항체 (이는 ErbB2 수용체의 리간드 활성화를 차단시킨다)과 조합될 수 있는 약물의 예에는 화학요법제, 예를 들면 안트라사이클린 항생물질 (예: 독소루비신), 사이클로포스파미드, 탁산 (예: 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 나벨빈, 제롤다, 미토마이신 C, 백금 화합물, 옥살리플라틴, 겜시타빈 또는 이들 둘 이상의 조합물, 예를 들면 독소루비신/사이클로포스포미드; 또다른 항-ErbB2 항체 (예: 성장 억제성 항-ErbB2 항체, 예를 들면 헤르셉틴 (등록상표), 또는 아폽토시스를 유도시키는 항-ErbB2 항체, 예를 들면 7C2 또는 7F3 (그의 인간화 및(또는) 친화도 성숙된 변이체를 포함함)); 항-에스트로겐 (예: 타목시펜); 파르네실 트랜스퍼라제 억제제; 항혈관형성제 (예: 항-VEGF 항체); EGFR-표적된 약물 (예: C225 또는 ZD 1839); 사이토킨 (예: IL-2, IL-12, G-CSF 또는 GM-CSF); 또는 이들의 조합물이 포함된다. 이러한 부가의 약물에 대한 표준 투여량을 사용할 수 있다.

rhuMAb 2C4는 ErbB2를 과발현하지 않는 전이성 유방암 환자의 치료를 위한 헤르셉틴 (등록상표)과 조합하여 부가적으로 지시된다. 효능에 대한 1차적인 종점에는 반응률과 안전성이 포함된다. 2차적인 효능 종점에는 진행을 감소시키는 시간, 헤르셉틴 (등록상표) 단독과 비교한 전체 생존률, 삶의 질, 및(또는) 반응 기간이 포함된다. rhuMAb 2C4는 병의 진행이 감소될 때까지, 매주 또는 3주마다 각각 2 또는 4 ㎎/㎏으로 정맥내 투여한다. 상기 항체는 다회분 용량 액상 제제 (20㎎/㎏ 이상 농도의 20 ㎖ 충진물)으로서 공급된다. 헤르셉틴 (등록상표)는 초기에는 4 ㎎/㎏으로 정맥내 투여된 다음, 매주 2 ㎎/㎏ 용량을 일정하게 투여된다. 헤르셉틴 (등록상표)는 동결건조된 분말로서 제공된다. 헤르셉틴 (등록상표)의 각 바이알은 440㎎ 헤르셉틴 (등록상표), 9.9 ㎎ L-히스티딘 HCl, 6.4 ㎎ L-히스티딘, 400 ㎎ α-α-트레할로스 이수화물, 및 1.8 ㎎ 폴리소르베이트 20을 함유한다. 방부제로서 1.1％ 벤질 알코올을 함유하는 주사용수 (BWFI) 20 ㎖로 재구성하면, 대략 6.0의 pH에서 21㎎/㎖ 헤르셉틴 (등록상표)을 함유하는 다회분 용제 21㎖가 생성되었다.

실시예 12

폐암의 치료법

rhuMAb 2C4는 단계 IIIb 또는 IV 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자의 치료에 대한 단일 제제로서 지시된다. 효능에 대한 1차적인 종점에는 반응률과 안전성이 포함된다. 2차적인 효능 종점에는 전체 생존율, 진행을 감소시키는 시간, 삶의 질, 및(또는) 반응 기간이 포함된다. rhuMAb 2C4는 병의 진행이 감소될 때까지, 매주 또는 3주마다 각각 2 또는 4 ㎎/㎏으로 정맥내 투여한다. 상기 항체는 다회분 용 량 액상 제제 (20 ㎎/㎏ 이상 농도의 20 ㎖ 충진물)으로서 공급된다.

rhuMAb 2C4는 전이성 비-소세포 폐암 환자의 치료를 위한 화학요법과 조합하여 지시되기도 한다. 효능에 대한 1차적인 종점에는 표준 치료법 단독과 비교해서 전체 생존율과 안전성이 포함된다. 2차적인 효능 종점에는 진행을 감소시키는 시간, 반응률, 삶의 질, 및(또는) 반응 기간이 포함된다. rhuMAb 2C4는 병의 진행이 감소될 때까지, 매주 또는 3주마다 각각 2 또는 4 ㎎/㎏으로 정맥내 투여한다. 상기 항체는 다회분 용량 액상 제제 (20 ㎎/㎏ 이상 농도의 20 ㎖ 충진물)으로서 공급된다.

폐암을 치료하기 위하여 항체 (이는 ErbB2와 결합되고 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시킨다)과 조합될 수 있는 부가의 약물의 예에는 화학요법제, 예를 들면 카보플라틴, 탁산 (예: 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 겜시타빈, 나벨빈, 시스플라틴 또는 이들의 조합물, 예를 들면 카보플라틴/도세탁셀; 또다른 항-ErbB2 항체 (예: 성장 억제성 항-ErbB2 항체, 예를 들면 헤르셉틴 (등록상표), 또는 아폽토시스를 유도시키는 항-ErbB2 항체, 예를 들면 7C2 또는 7F3 (그의 인간화 및(또는) 친화도 성숙된 변이체를 포함함)); 파르네실 트랜스퍼라제 억제제; 항혈관형성제 (예: 항-VEGF 항체); EGFR-표적된 약물 (예: C225 또는 ZD 1839); 사이토킨 (예: IL-2, IL-12, G-CSF 또는 GM-CSF); 또는 이들의 조합물이 포함된다.

실시예 13

결장직장암의 치료법

rhuMAb 2C4는 전이성 결장직장암 환자의 치료에 대한 단일 제제로서 지시된 다. 효능에 대한 1차적인 종점에는 반응률과 안전성이 포함된다. 2차적인 효능 종점에는 전체 생존율, 진행을 감소시키는 시간, 삶의 질, 및(또는) 반응 기간이 포함된다. rhuMAb 2C4는 병의 진행이 감소될 때까지, 매주 또는 3주마다 각각 2 또는 4 ㎎/㎏으로 정맥내 투여한다. 상기 항체는 다회분 용량 액상 제제 (20 ㎎/㎏ 이상 농도의 20 ㎖ 충진물)으로서 공급된다.

rhuMAb 2C4는 전이성 결장직장암 환자의 치료를 위한 화학요법과 조합하여 지시되기도 한다. 효능에 대한 1차적인 종점에는 표준 치료법 단독과 비교해서 전체 생존율과 안전성이 포함된다. 2차적인 효능 종점에는 진행을 감소시키는 시간, 반응률, 삶의 질 및(또는) 반응 기간이 포함된다. rhuMAb 2C4는 병의 진행이 감소될 때까지, 매주 또는 3주마다 각각 2 또는 4 ㎎/㎏으로 정맥내 투여한다. 상기 항체는 다회분 용량 액상 제제 (20 ㎎/㎏ 이상 농도의 20 ㎖ 충진물)으로서 공급된다.

결장직장암을 치료하기 위하여 항체 (이는 ErbB2와 결합되고 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시킨다)과 조합될 수 있는 화학요법제의 예에는 5-플루오로우라신 (5-FU), 레우코보린 (LV), CPT-11, 레바미솔 또는 이들의 둘 이상의 조합물, 예를 들면 5-FU/LV/CPT-11이 포함된다. 이러한 화학요법제에 대한 표준 투여량을 사용할 수 있다. 결장직장암을 치료하기 위해 항-ErbB2 항체와 조합될 수 있는 기타 약물에는 파르네실 트랜스퍼라제 억제제; 항혈관형성제 (예: 항-VEGF 항체); EGFR-표적된 약물 (예: C225 또는 ZD 1839); 사이토킨 (예: IL-2, IL-12, G-CSF 또는 GM-CSF); 또다른 항-ErbB2 항체 (예: 성장 억제성 항-ErbB2 항체, 예를 들면 헤 르셉틴 (등록상표), 또는 아폽토시스를 유도시키는 항-ErbB2 항체, 예를 들면 7C2 또는 7F3 (그의 인간화 및(또는) 친화도 성숙된 변이체를 포함함)); 또는 이들의 조합물이 포함된다.

본 발명은 인간화 항-ErbB2 항체 및 항-ErbB2 항체, 예를 들면 인간화 항-ErbB2 항체를 사용한 암 치료 방법을 제공한다.

<110> Genentech, Inc. <120> Humanized Anti-ErbB2 Antibodies and Treatment with Anti-ErbB2 Antibodies <130> P1467R2PCT.1 <140> PCT/US00/17366 <141> 2000-06-23 <150> US 60/141,316 <151> 1999-06-25 <160> 13 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 1 Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 Ile Lys <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30 Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys 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Claims (3)

1. 서열 3의 가변 경쇄 아미노산 서열 및 서열 4의 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 인간화 ErbB2 항체.
2. 제1항에 있어서, 본래의(intact) IgG1 항체인 인간화 ErbB2 항체.
3. 제1항의 인간화 ErbB2 항체를 포함하는, 인간의 암 치료용 제약 조성물.

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