CZ299702B6 - Protilátka, imunokonjugát, izolovaná nukleová kyselina, vektor, hostitelská bunka, zpusob výroby protilátky a farmaceutický prostredek ji obsahující - Google Patents

Abstract

Protilátka obsahující variabilní težkou (V.sub.H.n.) aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:4 a variabilní lehkou (V.sub.L.n.) aminokyselinovou sekvenciSEQ ID NO:3, imunokonjugát protilátky, izolovaná nukleová kyselina, vektor, hostitelská bunka a zpusob výroby protilátky, farmaceutický prostredek obsahující tuto protilátku. Farmaceutický prostredekse použije pro lécení rakoviny u cloveka, kde rakovina exprimuje receptor epidermálního rustového faktoru (EGFR).

Description

. Oblast techniky.

Předložený vynález se zabývá protilátkou obsahující variabilní těžkou a lehkou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No:4 a SEQ ID No:3 a její použití pro přípravu léčiva pro léčení rakoviny u člověka.

Dosavadní stav techniky

Receptory tyrosinkínáz z ErbB rodiny jsou důležitými prostředky buněčného růstu, diferenciace a přežití. Rodina těchto receptorů zahrnuje čtyři různé členy zahrnující receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR nebo ErbBl), HER2 (ErbB2 nebo pl85^neu), HER3 (ErbB3) a HER4 (ErbB4 nebo tyro2).

EGFR, kódovaný genem, byl záměrně vnesen do lidského tumoru. Zvláště nadměrná exprese EGFR byla pozorována při rakovině prsu, močového měchýře, plic, hlavy, krku a žaludku stejně tak i pří zhoubných nádorech centrálního nervového systému. Nadměrná exprese receptorů je často spojena se zvýšenou produkcí EGFR ligandu, jenž přeměňuje růstový faktor ct(TGF-a) totožných nádorových buněk aje výsledkem aktivace receptoru autokrinním stimulačním řetězcem Baselga a Mendelson Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994). Monoklonální proti25 látky namířené proti EGFR nebo jeho ligandům, TGF-α a EGF, byly vyhodnoceny jako léčebná činidla například při léčbě tumorů.. Viz. Baselga a Mendelson., supra, Masui et al. Cancer Research 44:1002-1007 (1984) a Wu etal. J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995).

Druhým členem Erb B rodiny, pl85^eu, byl původně identifikován jako produkt pozměněného genu z neuroblastomu chemicky léčených krys. Aktivovaná forma neu protoonkogenu je výsledkem bodové mutace (val i nu na glutamovou kyselinu) v transmembránové oblasti kódovaného proteinu. Amplifikace lidského homologu neu je pozorována při rakovině prsu a vaječníku aje vzájemném vztahu ke špatně prognóze (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); a patent US 4 968 603). Zatím nebyly popsány podobné bodové mutace pro tumory. Byla také pozorována nadměrná exprese

ErbB2 (obvykle, ale ne stále kvůli amplifikaci genu) v ostatních tumorech, zahrnující tumory žaludku, sliznice děložní, slinných žláz, plic, ledvin, tračníku, štítné žlázy, slinivky břišní a močového měchýře. Viz. mezi jinými King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al.,

Lancet·. 1:765:767 (1986); Fukushigi et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kem et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Parker et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer., _ 45. _ 57:358-363 (1988); Williams et al., Pathiobiology 59:46-52 (1991); a McCann et al., Cancer, 65:88-92(1990).

ErbB2 může být nadměrně exprimován při rakovině prostaty (Gu et al.„ Cancer Letter, 99:185-9 (1978); Ross etal., Cancer, 79:2162-70 (1997); a Sadasivan etal., J. Urol., 150:126-31 (1993)).

⁵⁰

Byly popsány protilátky namířené proti proteinovým produktům krysího pl85 lidského ErbB2. Drebin a kolegové získali protilátky proti produktu krysího neu genu, pl85. Viz. např. Drebin et al., 1., Cell, 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym., 198:277-290 (1991); a WO 94/22 478. Drebin etal., Oncogene, 2:273-277 (1988) zpráva, kde směs protilátek reagujících se dvěmi odlišnými oblastmi pl85, má za následek synergický účinek proti zhoubnému nádoru na buňkách

-1 CZ Z997UZ B6

NIH-3T3, transformovaných neu, implantovaných do nahé myši. Viz. také patent 5 824 311 vydaný v 20. října, 1998.

Hudztak et al., Mol. Cell. Biol 9(3): 1165-1172 (1989) popisují výrobu skupiny anti-ErB2 . 5 protilátek, které byly charakterizovány použitím buněk lidského zhoubného-nádoru prsu linie - η

SK-BPv-3. Relativní buněčně množení bunčk SK-BR-3 následující vystavení protilátkám bylo J stanoveno barvením krystalovou violetí jednoduché vrstvy buněk po 72 hodinách. Použitím tohoto kvantitativního rozboru byla získána maximální inhibice protilátkou nazývanou 4D5, která inhibovala buněčné množení 56 %. Ostatní protilátky ve skupině snižovaly buněčné množení ío menší měrou v tomto kvantitativním rozboru. U protilátky 4D5 bylo později shledáno, že zvyšuje citlivost buněčné linie zhoubného nádoru prsu ErbB2 k cytotoxíckému účinku TNF-α. Viz. také patent US 5 677 171 vydaný 14. října, 1997. Tito anti-ErbB2 protilátky diskutované v Hudziak et al. jsou dále popsány v Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al,, In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al, Grouth Regulation 1:79-82 (1991); Shepard et al, J. Clin. is Immunol 11(3):117-127 (1991); Kumar et al. Mol Cell Biol 11(2):979-986 (1991); Lewis et al, Cancer Immunol Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al, Oncogene 9:1829-1338 (1994); Vietta et al, Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Slíwkovski et al, J. Biol Chem.

269(20): 14661—14665 (1994); Scott et al, J. Biol Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al,

Proč. Nati Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al, Cancer Research 56:1457-1465 (1996); a Schaefer Oncogene 15:1385-1394(1997).

Rekombinantní humanizovaná verze myší anti-ErbB2 protilátky 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAbHER2 nebo HECEPTIN®, patent US5 821 337je klinicky aktivní u pacientů se nadměrnou expresí metastatické rakoviny prsu, kteří byli podrobeni předchozí léčbě proti rakovině (Baselga et al, J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). HERCEPTÍN® získal marketingové schválení od úřadu pro potravinářství a léčiva 25. září, 1998 pro léčbu pacientů s metacistickou rakovinou prsu, jejíž nádory v nadměrném množství produkuj í ErbB2 protein.

Ostatní antí-ErbB2 protilátky s různými vlastnostmi byly popsány v Tagliabue et al, Int.

J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al, Oncogene 4:543-548 (19989); Maier et al,

Cancer res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al, Molecular Carcinogenesis 3:1350-362 (1990);

Stancovski et al, PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al, Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); W094/00136, Kasprzyk et al, Cancer Research 52:2ΊΊ\-2ΊΊ6 (1992); Hancoc et al, Cancer Res. 51:4557-4580 (1991);

Shawver et al, Cancer Res.. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al, Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al, J. Biol Chem. 267:15160-15167 (1992); patent US 5 783 186 a Klapper et al, Oncogene 14:2099-2109 (1997).

Homologní sereening vedl k identifikaci dvou dalších receptorů z členů rodiny ErbB; ErbB3 (patenty US 5 1.83 884 a US 5 480 968 stejně jako Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)) a ErbB4 (EP 599 274; Plowman et al, Proč. Nati Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); a Plowman et al, Nátuře 366:473-475 (1993)). Oba z těchto receptorů ukazují nadměrnou expresi alespoň v několika buněčných linií rakoviny prsu.

.... .45 —ErbB. receptory se běžně vyskytuj í - v buňkách a heterodimerizace zvyšuje diversitu- buněčných ' * odpovědí k různým druhům ErbB ligandů (Earp et al,. Breast Cancer Research and Treatment.

35:115-132 (1995)). EGFRje vázáno se šesti ligandy; epidermálním růstovým faktorem (EGF), betacelulínem a epiregulinem (Groengen el al, Growth Factors 11:235-257 (1994). Rodina heregulinových proteinů vyplývající z možnosti složení jednotlivých genů jsou ligandy pro ErbB3 a

ErbB4. Heregulinová rodina zahrnuje alfa, beta a gama hereguliny (Holmes et al, Science 256:1205-1210 (1992); patentu US 5 641 869 a Schaefer et al, Oncogene 15:1385-1394 (1997)), neu diferenciační faktory (NDFs), gliové růstové faktory (GGFs), acetylcholinový receptor vyvolávající aktivitu (ARIA) a senzorický a motorický faktor odvozený od neuronu (SMDF).

Pro shrnutí viz. Groenen et al, Growth Factors 11:235-257 (1994), Lemke, G. Molec. & Cell

Neurosci. 7:247-262 (1996) a Lee et al, Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). V poslední době byly

-2CZ Z997UZ B6 objeveny tři další ErbB ligandy: neuroregulin-2 (NRG-2), který zodpovídá za vazbu na ErbB3 nebo ErbB4 (Chang et al., Nátuře 387 509-512 (1997), a Carraway et al., Naiure. 387:512-516 (1997)), neuregulin-3, který váže ErbB4 (Zhang et al., PNAS (USA) 94(18): 9562-7 (1997)), a neuregulin-4. který váže ErbB4 (Harari et al., Oncogene 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, beta. 5 . celulin a epiregulin se také vážou k.ErbB4........... Pokud EGF a TGFa nevážou ErbB4, EGF stimuluje vytvoření heterodimeru z EGFR a ErbB2, který aktivuje EGFR a je výsledkem transforylace ErbB2 v heterodimeru. Dimerizace a/nebo transfosforylace zdá se aktivuje ErbB2 tyrosinkinázu. Viz. Earp et al., supra. Stejně tak pokud ío ErbB3 je společně exprimován s ErbB2, vznikne aktivní signální komplex a protilátky namířené proti ErbB2 jsou schopné tento komplex rozložit (Sliwkowski et al,, J. BioL Chem.

269(20): 14661—14665 (1994)). Navíc afinita ErbB3 kheregulinu (HRG) je zvyšována na vyšší stav afinity pokud je exprimován společně s ErbB2. Viz Leví et al. Journal of Neuroscience . 15:1329-1340 (1995), Morrissey etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92:1431-1435 (1995) a Lewis et al., Cancer Res, 56:1457-1465 (1996) co se týká ErbB2-ErbB3 proteinového komplexu. ErbB4 obdobně jako ErbB3 tvoří aktivní signální komplex s ErbB2 (Carraway aCantley, Cell 78:5-8 (1994).

20, Podstata vynálezu

Z prvního hlediska předložený vynález popisuje použití protilátky, která váže ErbB2, pro přípravu léčiva pro léčení rakoviny u člověka, tam kde rakovina exprimuje receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR).

O různých výhodách použití protilátek, které vážou ErbB2, při léčbě rakoviny, na rozdíl od EGFR cílených léčiv, je pojednáno v tomto dokumentu. Konkrétně jsou EGFR vysoce exprimovány v játrech a kůži, a to poskytuje nesmírný pokles aktivního léčiva tam, kde se léčivo váže k EGFR. Navíc byla pozorována kožní toxicita u dalších EGFR cílových léčiv jakými je napří30 klad chimérická anti-EGFR protilátka C225 a nízkomolekulámí léčivo ZD1839, které váže EGFR. U protilátek, které vážou ErbB2, se očekává, že mají lepší bezpečnostní profil než zmíněná léčiva.

Tam, kde je protilátka použita u léčiva pro léčení rakoviny, blokuje aktivaci ligandu receptorů

ErbB ligandem a/nebo má biologický typický znak monoklonální protilátky 2C4 a tím jsou dosaženy další výhody. Například pokud EGFR cílená léčiva zasahují pouze EGFR, protilátky konkrétního zájmu v tomto dokumentu (tj. 2C4, včetně jejich humanizovaných a/nebo afinitou vybavených variant) budou zasahovat heterodimery EGFR/ErbB2, ErbB3/ErbB4 a ErbB2/ErbB3. Navíc protilátky, které vážou ErbB2 a blokují aktivací ligandu receptorů ErbB budou komple40 mentami k EGFR cíleným léčivům, zatímco EGFR cílená léčiva nejsou navzájem komplementární.

Tento vynález poskytuje použití protilátky, která se váže k ErbB2 a blokuje aktivaci ligandu receptorů ErbB, pro výrobu léčiva pro léčení rakoviny u člověka, tam kde rakovina se rakovina

45____neyyznačuje.nadměmouexpresí.ErbB2receptoru. - - ·- ·-Navíc předložený vynález poskytuje použití protilátky, která se váže k ErbB2 a blokuje aktivaci ligandu receptorů ErbB, pro výrobu léčiva pro léčení na hormonech nezávislé rakoviny u člověka.

Tento vynález poskytuje použití protilátky pro výrobu léčiva pro léčení rakoviny u člověka, kde léčivo obsahuje (a) první protilátku, která se váže k ErbB2 a inhibuje růst rakovinných buněk se nadměrnou expresí ErbB2, a (b) druhou protilátku, která se váže k ErbB2 a blokuje aktivaci ligandu receptorů ErbB.

CZ B6

Tento vynález dále poskytuje použití, ve kterém je rakovina vybrána ze skupiny rakoviny tračníku, rakoviny konečníku a rakoviny tračníku a konečníku, přičemž protilátka se váže k ErbB2 a blokuje aktivaci ligandu receptoru ErbB. ;

. .V dalším provedení, tento .vynález poskytuje výrobek obsahující nádobu a v ní obsaženou směs, -i kde se směs skládá z protilátek, které vážou ErbB2 a dále obsahují obal s příbalovým letákem “Λί označující, že směs může být použita k léčbě rakoviny, která exprimuje receptor epidermálního J růstového faktoru (EGFR). ?

Vynález se navíc týká výrobku obsahujícího nádobku a směs v ní obsaženou, kde tato směs obsahuje protilátku, která váže ErbB2 a blokuje aktivaci ErbB receptoru ligandem a dále obsahuje obalovou příbalový leták označující, že směs může být použita k léčbě rakoviny, kde rakovina není popsána nadměrnou expresí ErbB2 receptoru.

i5 Vynález se také vztahuje k výrobku obsahující nádobu a směs v ní obsaženou, kde směs obsahuje protilátku, která váže ErbB2 a blokuje aktivaci ErbB receptoru ligandem a dále obsahuje příbalový leták označující, že směs může být použita k léčbě na hormonech nezávislé rakoviny.

V dalším provedení je poskytnut výrobek obsahující (a) první nádobu a směs v ní obsaženou, kde směs obsahuje první protilátku, která váže ErbB2 a inhibuje růst rakovinných buněk, které zvýšeně exprimuje ErbB2, a (b) druhou nádobu a směs v ní obsaženou, kde směs obsahuje druhou protilátku, která váže ErbB2 a blokuje aktivaci ErbB receptoru ligandem.

Dále je poskytnut výrobek obsahující nádobu a směs v ní obsaženou, kde směs obsahuje proti25 látku, která váže ErbB2 a blokuje aktivaci ErbB receptoru ligandem a dále obsahuje příbalový leták označující, že směs může být použita k léčbě rakoviny vybrané ze skupiny sestávající z rakoviny tračníku, rakoviny konečníku a rakoviny tračníku a konečníku.

Vynález navíc poskytuje: humanizovanou protilátku, která váže ErbB2 a blokuje aktivaci ErbB receptoru ligandem, směs obsahující humanizovanou protilátku konjugovanou s cytotoxickým činidlem.

Kromě toho vynález poskytuje izolovanou nukleovou kyselinu, kódující humanizovanou protilátku, vektor obsahující nukleovou kyselinu, hostitelskou buňku obsahující nukleovou kyselinu nebo vektor, stejně jako proces produkce humanizované protilátky, obsahující kultivaci hostitelských buněk obsahujících nukleovou kyselinu tak, zeje nukleová kyselina exprimována a popřípadě dále obsahující ozdravné humanizované protilátky z kultury hostitelských buněk (tj. z kultivačního média hostitelských buněk); · ·

Vynález se dále týká imunokonjugátu obsahujícího protilátku, která váže ErbB2 konjugovanou k jedné nebo více molekulám kalicheamicinu a použití takových konjugátů k léčbě rakoviny exprimující ErbB2, tj. rakoviny se nadměrnou expresí ErbB2 u člověka.

Výhodněji je protilátka v konjugátu monoklonální protilátka 4D5, tj. humanizovaná 4D5 .45_ . (a výhodněji huMAb4D5-8. (HERCEPTIN®) nebo monoklonální protilátka 2C4, tj. humanizova- -......

ná 2C4. Protilátka v imunokonjugátu může být intaktní protilátka (tj. intaktní IgGi) nebo kousek protilátky (tj. Fab, Fab(ab)₂, bivalentní protilátka atd.).

Detailní popis výhodných provedení

I. Definice „ErbB receptor“ je receptorový protein tyrosinkinázy, který patří do rodiny ErbB receptoru a zahrnuje EGFR, ErbB2, ErbB3 a ErbB4 receptory a další členy této rodiny, které budou určeny příště. ErbB receptor bude obecně obsahovat extracelulámí doménu, kterou může být vázán

-4CZ 299702 B6 ligand, lipofilní transmembránová doména, konzervovanou intracelulámí doménu tyrosinkinázy a karboxylem zakončenou signální doménu s několika zakotvenými tyrosinovými zbytky, které mohou být fosfory 1 ovány.

ErbB receptor může být původní sekvence“ ErbB receptorů-nebo jeho „obměněná aminokyselinová sekvence“. Výhodněji ErbB recepíor je původní sekvence iidskéno ErbB receptorů.

Výrazy „ErbBl“ receptor epidermálního růstového faktoru“ „EGFR“ jsou zde používány zaměnitelně a vztahují se kEGFR jak je popsáno například vCarpenter et al, Ann. Rev. Biochem.

56:881-914 (1987), zahrnující jejich přírodně se vyskytující mutantní formy (tj. deleění mutanty

EGFR jak je tomu v Humphrey et aí, PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). £róBl se vztahuje k genu kódujícího EGFR proteinový produkt.

Výrazy „ErbB2“ a „HER2“ jsou zde zaměnitelně používány a vztahují se k HER2 proteinu, například popsaného v Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) a Yamamoto et al., Nátuře 319:230-234 (1986) (Genebank vstupní číslo X03363). Výraz „£’róB2“ se vztahuje kgenu kódujícího lidský ErbB2 a „wew“. Se vztahuje kgenu kódujícího krysí p I85^netť. Výhodnější ErbB2 je původní sekvence lidského ErbB2.

Výrazy „ErbB3“ a „HER3“ se vztahují k receptorovému polypeptidu jako je například popsáno v patentech US 5 183 884 a US 5 480 968 stejně tak jako v Kraus et al., PNAS (USA) 86: 9193-9197(1989).

Výrazy „ErbB4“ a „HER4“ se zde vztahují k receptorovému polypeptidu jak je například popsá25 no v EP Pat Appln No. 599 274, Píowman et aí, Proč. Nati. Acad Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993) a Plowman etaí, Nátuře, 366:473-475 (1993), zahrnuj ící jejich izoformy, tj. jakje popsáno v WO 99/19 488, vydaného 22. dubna, 1999.

„ErbB ligandem“ je míněn polypeptid, který váže nebo aktivuje receptor ErbB: Konkrétní zájem je v tomto dokumentu o ErbB ligand, který má původní sekvenci lidského ErbB ligandů, jakým je faktor epidermálního růstu (EGF) (Savage et al, J. Biol Chem. 247:7612-7621 (1972)), faktor proměnlivého růstu a (Marquardt et al, Science 223:1079-1082 (1984)), amfireguíin také znám jako „švanoma“ nebo keratinocytový autokrinový růstový faktor (Shoyab et al, Science, 243:1074-1076 (1989), Klinuta et al, Nátuře 348:257-260 (1990), a Cook et al, Mol Cell

Biol 11:2547-2557 (1991)), betacelulin (Shing et al, Science 259:1604-1607 (1993) a Sasada et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)), heparin vázající epidermální růstový faktor (HB-EGF) (Hígashiyama et al, Science 251:936-939 (1991)), epiregulin (Toyoda et al,

J. Biol/Chem. 970:7495-7500 (1995), a Komurasaki et al, Oncogené 15:2841-2848 (1997)), heregulin (viz. níže), neureglin-2 (Carraway et al, Nátuře 387:512-516 (1997)), neuregulin-3 (Zhang et al, Proč. Nati Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)), neuregulin—4 (Hararí et al, Oncogene 18:2681-89 (1999)) nebo kripto (CR-1) (Kannan et al, J. Biol Chem 272(6):33303335 (1997)). ErbB lígandy, které váží EGFR zahrnují EGF, TGF-α, amfireguíin, betacelulin, HB-EGF a epiregulin, ErbB lígandy, které váží ErbB3 zahrnují hereguliny. ErbB lígandy schopné vázat ErbB4 zahrnují betacelulin, epiregulin, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4

- 45- -ahereguliny. --.....-...... - -- -..............---· „Heregulin“ (HRG) když použit v tomto dokumentu se vztahu k polypeptidu, jenž je kódován produktem heregulinového genu jak jé uvedeno v patentu US 5 641 869 nebo Marchionni et al, Nátuře 362:312-318 (1993).

⁵⁰

Příklady heregulinů zahrnují heregulin-a, heregulin-βΐ, heregulin-p2 a heregulin-p3 (Holmes, et al. Science 256:1205-1210 (1992) a patent US ě. 5 641 869), neu diferenciaění faktor (NDF) (Peleš et al, Cell 69:205-216 (1992)), acetylcholinový receptor indukující aktivitu (ARIA) (Peleš et al, Cell 72:801-815 (1993)), gliové růstové faktory (GGFs) (Marchionni et al, Nátuře

362:312-318 (1993)), senzorický a motorický faktor odvozený od neuronu (SMDF) (Ho et al,

-5CZ 299702 B6

J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)), γ-heregulin (Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Výraz zahrnuje biologicky aktivní fragmenty a/nebo varianty aminokyselinových sekvencí původní sekvence HRG polypeptidu, jakým je EGF-doméně podobný fragment (tj. HRG βΐ 177-244)5 „ErbB hetero-oligomer“ v tomto dokumentuje nekovaientně vázaný oíigomer obsahující alespoň dva různé ErbB reeeptory. Takové komplexy se mohou tvořit pokud buňka exprimující dva nebo více ErbB reeeptoru je vystavena ErbB l igandu a může být izolována imunoprecipitací a analyzována SDS-PAGE, jak je například popsáno v Sliwkovski et al., J. Biol. Chem. 269(20): 14661—

14665 (1994). Příklady takových ErbB hetero-oligomerů zahrnují komplexy EGFR-ErbB2,

ErbB2-ErbB3 A ErbB3-ErbB4. Kromě toho ErbB hetero-oligomer může obsahovat dva nebo více ErbB2 receptorů kombinovaných s různými ErbB reeeptory, jakými například jsou ErbB3, erbB4 nebo EGFR. Další proteiny jako podjednotka cytokinového reeeptoru (tj. gp 130) může být obsažena v hetero-olígomerech.

„Aktivací reeeptoru ErbB ligandem“ je míněna signální transdukce (tj, jež byla způsobena doménou intracelulární kinásy reeeptoru ErbB, která fosforyluje zbytky tyrosinu v ErgB reeeptoru nebo substrátovém polypeptidu) zprostředkovaná ErbB ligandem, který se váže k ErbB heterooligomeru obsahujícím ErbB receptor, o který je zájem. Obecně toto bude vyžadovat navázání

ErbB receptorů v hetero-oligomer, který aktivuje doménu kinázy jednoho nebo více ErbB receptorů v hetero-oligomeru a proto vede k fosfory láci tyrosinového zbytku v jednom nebo více ErbB reeeptoru a/nebo vede k fosfory láci tyrosinového zbytku v doplňkovém polypeptidovém substrátu (substrátech). Aktivace ErbB receptorů může být vyčíslena použitím různých kvantitativních rozborů fosforylace tyrosinu.

Polypeptid „původní sekvence“ je takový, který má stejnou sekvenci aminokyselin jako polypeptid (tj. ErbB receptor nebo ErbB ligand) odvozený od přírodní sekvence. Takové polypeptidy s původní sekvencí mohou být izolovány z přírody nebo mohou být vyrobeny rekombinantním nebo syntetickým způsobem. Tudíž původní sekvence polypeptidu může mít sekvenci amino30 kyselin přírodně se vyskytujícího lidského polypeptidu, myšího polypeptidu nebo polypeptidu z jakéhokoliv dalšího druhu savců.

Výraz „varianta aminokyselinové sekvence“ se vztahuje k polypeptidům majícím do určité míry aminokyselinové sekvence odlišné od původní sekvence polypeptidu. Obvykle varianta amino35 kyselinové sekvence bude mít alespoň okolo 70 % homologie s alespoň jedním receptorem vázajícím doménu původního ErbB ligandu nebo s alespoň jedním ligandem vázajícím doménu původního ErbB reeeptoru a výhodněji budou 80 % homologní, ještě výhodněji 90 % homologní s takovými reeeptory nebo ligandy vázající domény. Varianty aminokyselinové sekvence jsou substituce, delece a/nebo inzerce v určitých pozicích původní aminokyselinové sekvence.

„Homologie“ je definována jako procento zbytků ve variantě aminokyselinové sekvence, které jsou identické po spojení sekvencí a zavedení mezer, je-li nutno, aby se procentuálně dosáhlo maximální homologie. Způsoby a počítačové programy pro spojení jsou známy v dosavadním stavu techniky. Jedním takovým programem je „Align 2“ vyráběný firmou Genetech, lne., který byl. vybaven uživatelskou dokumentací v úřadu autorských práv ve Spojených státech, Washington, DC 20559, 10. prosince 1991.

Výraz „protilátka“ je zde použit v širším slova smyslu a specielně se týká intaktních monoklonálních protilátek, polyklonálních protilátek, multispecifických protilátek (tj. bispecifické protilátky) tvořících se z alespoň dvou intaktních protilátek a fragmentů protilátek, tak dlouho dokud projevují biologickou aktivitu.

Výraz „monoklonální protilátka“ jak je použito v tomto dokumentu se vztahuje k protilátce získané z populace značně homogenních protilátek, tj. jednotlivé protilátky obsažené v populaci jsou identické až na možné přírodně se vyskytující mutace, které mohou být přítomny v minoritním

-6CZ 299702 B6 množství. Monoklonální protilátky jsou vysoce specifické, jsou namířeny proti jedinému antigennímu místu. Kromě toho v porovnání s přípravou polyklonálníeh protilátek, která zahrnuje různé protilátky namířené proti různým determinantám (molekulární oblasti na povrchu antigenů schopné vyvolat tvorbu protilátek), je každá monoklonální protilátka namířena proti jediné deter5. minantě na antigenů. Navíc díky jejich specifítě je možnost výhodně vyrábět-monoklonální protilátky nekontaminované jinými protilátkami. Přívlastek „monoklonální“ naznačuje charakter protilátky, která je získávána ze značně homogenní populace protilátek a není chápána jako vyžadující vytváření protilátky jiným konkrétním způsobem.

io Například, monoklonální protilátky používané v souladu s předloženým vynálezem, mohou být vyrobeny hybridní technologií poprvé popsanou v Kohler et al., Nátuře 256:495 (1975), nebo mohou být vyrobeny metodami rekombinace DNA (viz. např. patent US 4 816 567). „Monoklonální protilátky“ mohou být také izolovány z fagových knihoven obsahujících protilátky s použitím technik v Clackson et al., Nátuře 352:624-628 (1991) a Marks et al., J. Mol. Biol. 222:58115 597(1991).

Monoklonální protilátky v tomto dokumentu především zahrnují „chimérické“ protilátky, ve kterých je podíl těžkých a/nebo lehkých řetězců identický nebo homologní s odpovídajícími sekvencemi v protilátkách odvozených od určitých druhů nebo patřících k určité třídě nebo podtřídě protilátek, zatímco pozůstatek řetězce je identický nebo homologní s odpovídajícími sekvencemi v protilátkách odvozených od jiných druhů nebo patřících k jiné třídě nebo podtřídě protilátek, stejně tak jako fragmentů těchto protilátek, tak dlouho dokud se vyznačují požadovanou biologickou aktivitou (patent US 4 816 567 a Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81:68516855 (1984))., Chimérické protilátky, jež jsou středem zájmu v tomto dokumentu zahrnují „pri25 matizované“ protilátky obsahují variabilní domény antigen vázajících sekvencí odvozených od nelidských primátů (tj. Old World Monkey, Ape atd.) a lidské konstantní oblastí sekvencí.

„Fragmenty protilátek“ obsahují podíl intaktní protilátky, výhodněji obsahují její antigen vázající nebo variabilní oblast. Příklady fragmentů protilátek zahrnují Fab, Fab', F(ab)' a Fv fragmenty, bivalentní protilátky, lineární protilátky, jednořetězcové molekuly protilátek a mu 1tispecifické protilátky tvořené z fragment protilátek.

„Inaktní“ protilátka je taková, která obsahuje antigen vázající variabilní oblast a stejně tak lehlý řetězec konstantní domény (C_L) a těžký řetězec konstantní domény, C_H1, C_H2a C_H3. Konstantní domény mohou být původní konstantní domény (lidské přirozené sekvence konstantních domén) nebo jejich variant aminokyselinových sekvencí. Výhodněji intaktní protilátka má více než jednu efektorovou funkci.

„Efektorová funkce“ protilátky se vztahuje k takovým biologickým aktivitám, které lze přičíst Fc oblasti (původní sekvence Fc oblasti nebo varianta aminokyselinové sekvence Fc oblasti) protilátky. Příklady efektorových funkcí protilátek zahrnují vázání Clq, doplnění podmíněné cytotoxicity, vázání Fc receptorů, protilátkou podmíněnou buňkou zprostředkovanou cytotoxicitu (ADCC), fagocytolýzu, snížení regulace receptorů buněčného povrchu (tj. reeeptory B buněk, BCR) atd.

.45..,............ -......- - - · ··· -

V závislosti na sekvenci aminokyselin konstantních domén těžkých řetězců, intaktní protilátky mohou být přiřazeny k odlišným „třídám“. Existuje pět hlavních tříd intaktních protilátek: IgA, IgD, IgE, ígG a IgM a několik žních může být dále rozděleno v „podtřídy“ (izotypy), tj: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA a IgA2. Konstantní domény těžkých řetězců, které odpovídají různým třídám protilátek jsou nazývány α, δ, ε,γ a μ. Struktury podjednotek a trojrozměrné konfigurace různých tříd imunoglobulinů jsou dobře známy.

„Protilátkou podmíněná buňkou zprostředkovaná cytotoxicita)“ a „(ADCC)“ se vztahují k reakci zprostředkované buňkami, ve které nespecifické cytotoxické buňky, které expriniují Fc reeeptory (FcRs) (tj. přirozené killer buňky, neutrofily a makrofágy) rozpoznávající vazbu protilátky na

-7CZ 299702 B6 cílové buňce a následně způsobují lyži cílové buňky. Hlavní buňky zprostředkovávající ADCC, NK buňky, exprímují pouze FCyUI, zatímco monocyty exprímují FcyRl, FcyRH a RcyRIII. FcR exprese na hematopoietických buňkách je shrnuta v tabulce 3 na straně 464 v Ravetch and Kinet Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Ke stanovení ADCC aktivity molekuly, která je ve středu zájmu, může být proveden in vitro ADCC kvantitativní rozbor, jak je popsáno v patentu US 5 550 362 nebo US 5 821 337.

Užitečné efektorové buňky pro takový kvantativní rozbor obsahují periferní krevní mononukleární buňky (PBMC) a přirozené killer (NK) buňky. Jinak, nebo navíc, může být stanovena ADCC ío aktivita molekuly in vivo na zvířecích modelech tak, jakje popsáno vClynes y, PNAS (USA)

95:652-656(1998).

„Lidské efektorové buňky“ jsou leukocyty, které exprímují jeden nebo více FcRs a vykonávají efektorové funkci. Výhodněji buňky exprímují alespoň FcylII a vykonávají ADCC efektorové funkci. Příklady lidských leukocytů, které zprostředkovávají ADCC zahrnují periferní krevní mononukleámí buňky (PBMC), přirozené killer (NK) buňky, monocyty, cytotoxické T buňky a neutrofily s tím, že PBMC a NK buňky jsou preferované. Efektorové buňky mohou být izolovány ze svého přirozeného zdroje, tj. z krve nebo z PBMC jakje uvedeno v tomto dokumentu.

Výraz „Fc receptor“ nebo „Fc“jakje použito v tomto dokumentu popisuje receptor, který se váže k Fc oblasti protilátky. Preferovaný FcR je původní sekvence lidského FcR. Navíc preferovaný FcR je tím receptorem, který váže lgG protilátku (gamma receptor) a zahrnuje receptory od FcyRl, FcyRH a FcyRHÍ podtříd, zahrnující alelické varianty a nebo spletené formy těchto receptorů. FcylI receptory zahrnují FcyRlIA (aktivační receptor) a FcylIB (inhibiční receptor), které mají podobné aminokyselinové sekvence, které se liší hlavně svými cytoplazmatickýmí doménami. Aktivační receptor FcyRlIA obsahuje ímunoreceptor, založený na aktivaci motivu tyrosinu (ITAM) v jeho cytoplazmatické doméně. Inhibiční receptor FcyRIIB obsahuje ímunoreceptor, založený na inhibici motivu tyrosinu (ITAM) v jeho cytoplazmatické doméně, (viz. souhrn M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol 15:203-234 (1997)). FcRs jsou shrnuty v Ravetch and Kinet Annu.

Rev. Immunol 9:457-92 (1991), Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994) a de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330—41 (1995). Další FcRs zahrnující ty, které budou poznány v budoucnu, jsou v tomto dokumentu zahrnuty výrazem „FcR“. Výraz také zahrnuje neonatální receptor. FcRn, který je zodpovědný za přenos mateřských IgG na plod (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) a Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

„Doplňkem podmíněná cytotoxícita“ nebo „CDC“ se vztahuje ke schopnosti molekuly zlyzovat cíl v přítomnosti doplňku. Aktivace dráhy doplňkem je zahájena vazbou první složky doplňkového systému (Clq) na molekulu (tj. protilátku), která je v komplexu s antigenem téhož původu. Ke stanovení doplňkové aktivace může být proveden CDC kvantitativní rozbor, jakje například popsáno v Gazzano-Santoro etal„ J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

„Přirozené protilátky“ jsou většinou heterotetramemí glykoproteiny okolo 150 000 Daltonů, skládající se ze dvou identických lehkých (L) a dvou identických těžkých (H) řetězců. Každý lehký řetězec je propojen s těžkým řetězcem jednou kovalentní disulfídickou vazbou, zatímco počet 'disulfídických spojení se různí mezí těžkými řetězci různých imunoglobulinových isotypů. Každý lehký a těžký řetězec má na jednom konci proměnlivou doménu (V_L) následovanou několika konstantními doménami. Každý lehký řetězec má na jednom konci proměnlivou doménu (V_L) a konstantní doménu na konci druhém. Konstantní doména lehkého řetězce je připojena k první konstantní doméně řetězce těžkého a proměnlivá doména lehkého řetězce je připojena k proměn50 livé doméně těžkého řetězce. Předpokládá se že určité aminokyselinové zbytky tvoří rozhraní mezi proměnlivými doménami lehkého a těžkého řetězce.

Výraz „variabilní“ se vztahuje k faktu, že určité části variabilních domén se značně liší v sekvenci mezi protilátkami a jsou použity při vazbě a specifítě té které protilátky k příslušnému antige-8CZ 299702 B6 nu. Nicméně variabilita není rovnoměrně rozdělena ve všech částech variabilních domén protilátek. Je soustředěna do tří segmentů pojmenovaných hypervariabilní oblasti v proměnlivých doménách jak lehkých tak těžkých řetězců. Více konzervované části variabilních domén jsou nazývány jako stavební oblasti (FRs). Každá z variabilních domén přirozených těžkých a lehkých

- řetězců se· skládá ze čtyř FRs, z velké části zaujímající konfiguraci β-listu, spojeného přes tři hypcrvariabilní oblasti, které tvoří spojenou smyčku a v některých příkladech tvoří část struktury β-Iistu. Hypervariabilní oblasti každého řetězce jsou drženy při sobě v těsné blízkosti Frs a s hypervariabilními oblastmi z druhého řetězce jsou jednou příčinou vytvoření antigen vázajícího místa protilátky (viz. Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest 5^th Ed. io Public Health Service, National Institutes of Health, Betheseda, MD. (1991)). Konstantní domény se přímo neúčastní vazby protilátky a antigenu, ale předvádějí různé efektorové funkce jakou je účast protilátky na protilátkou podmíněné buněčné cytotoxicitě (ADCC).

Výraz „hypervariabilní oblast“ se v tomto dokumentu vztahuje k aminokyselinovým zbytkům is protilátek, které zodpovídají za vazbu antigenu. Hypervariabilní oblast běžně obsahuje aminokyselinové zbytky z „oblasti určující komplementaritu“ nebo „CDR“ (tj. zbytky 24-34 (LI), 5056 (L2), a 89-97 (L3) v lehkém řetězci variabilní domény a 31-35 (Hl), 50-65 (H2) a 95-102 (H3) v těžkém řetězci variabilní domény, Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betheseda, MD. (1991) a/nebo zbytky z „hypervariabilní smyčky“ (tj. zbytky 26-32 (LI), 53-55 (L2), a 91-96 (L3) v lehkém řetězci variabilní domény a 26-32 (Hl), 53-55 (H2) a 96-101 (H3) v těžkém řetězci variabilní domény, Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). „Stavební oblast“ nebo „FR“ zbytky jsou takové zbytky variabilních domén jiné než zbytky variabilních domén již definovaných v tomto dokumentu. Papeinová digesce protilátky poskytuje dva identické fragmenty vázající antigen nazývané „Fab“ fragmenty, každý s jediným antigen vázajícím místem a zbytkový „Fc“ fragment, jehož název odráží jeho schopnost snadno krystalizovat. Ošetření pepsinem dává F(ab')2 fragment, který má dvě antigen vázající místa a je stále schopný napříč vázat antigen.

„Fv“ je nej menší možný fragment, který obsahuje kompletní antigen rozpoznávací a antigen vazebné místo. Tato oblast sestává z dimeru variabilní domény, složené z jednoho těžkého a jednoho lehkého řetězce pevně spojených nekovalentní vazbou. Je to v takové konfiguraci, ve které tři hypervariabilní oblasti každé z domény interagují s určitým antigen vázajícím místem na povrchu V_F1-V_L dimeru. Společnost šest hypervariabilních oblastí uděluje protilátce antigen vázající specifitu. Nicméně, dokonce jediná variabilní doména (nebo polovina Fc obsahující pouze tři hypervariabilní oblasti specifické pro antigen) má schopnost rozpoznat a vázat antigen, přestože s nižší afinitou než celé vazebné místo.

Fab fragment také obsahuje konstantní doménu lehkého řetězce a první konstantní doménu (CH1) těžkého řetězce. Fab'fragmenty po přidání pár zbytků na karboxylový konec těžkého řetězce CH1 domény zahrnující jeden nebo více cysteinů ze závěsné oblasti protilátky. Fab-SB je ustanovení v tomto dokumentu, ve kterém cysteinový zbytek konstantní domény nesou alespoň jednu volnou thiolovou skupinu. F(ab')₂ fragmenty protilátky byly původně produkovány jako páiy Fab'fragmentů, které mají závěsné cysteiny mezi sebou. Další chemická spojení fragmentů '45 protilátek jsou také'známa. - - .......

„Lehký řetězec“ protilátek z kteréhokoliv druhu obratlovců může být přiřazen k jednomu ze dvou jasně rozdílných typů nazývaných kappa (k) a lambda (λ), založených na aminokyselinových sekvencích jejich konstantních domén.

„Jednořetězcové Fv“ nebo „scFv“ fragmenty protilátek se skládají z V_H a V_L domén protilátky, kde jsou tyto domény přítomny v jednom polypeptidovém řetězci. Výhodněji F_v polypeptid dále obsahuje polypeptidové propojení mezi V_H a V_L doménami, které umožňuje scFv tvořit požadovanou strukturu k vázání antigenu. Souhrn o scFv viz. Pluckthun in The Pharmacology of

-9CZ 299702 B6

Monoelonal Antibodies 1 vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Anti-ErbB2 protilátky scFv fragmentů jsou popsány v WO93/16185, patent US · 5 571 894 a patent US 5 587 458.

. Výraz „bivalentní protilátky“ se vztahuje k malým fragmentům protilátek s dvěma antigen vázajícími místy, ve kterých fragmenty’ obsahují variabilní těžkou doménu (Vh) spojenou s variabilní lehkou doménou (V_L) v tom samém polypeptidovém řetězci (V_H - V_L). Použitím propojení, které je příliš krátké na to, aby došlo k párování mezi dvěma doménami v rámci jednoho řetězce, jsou domény nuceny se párovat s komplementární doménou jiného řetězce a tvoří tak dvě antigen vázající místa. Bivalentní protilátky jsou plně popsány například v EP 404 097, WO 93/11161a Hollinger et al., Proč. Natí Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

„Humanizované“ formy nelidských protilátek (tj. protilátek hlodavců) jsou chimérické protilátky, které obsahují nejmenší možnou sekvenci odvozenou od nelidského imunogíobulinu. Z největší části jsou humanizované protilátky lidské imunoglobuliny (recipientní protilátka) ve kterých jsou zbytky z hypervariabilní oblasti recipienta nahrazeny zbytky z hypervariabilní oblasti nelidského druhu (donorová protilátka) jako je myš, krysa, králík nebo nelidský primát mající požadovanou specifitu, afinitu a schopnost. V některých případech, stavební oblasti (FR) zbytků lidských imunoglobulinů jsou nahrazeny odpovídajícím zbytkem nelidského původu. Kromě toho humani20 zované protilátky mohou obsahovat zbytky, které není možné nalézt v recipientní protilátce nebo v donorové protilátce. Tyto modifikace jsou dělány pro další vylepšení výkonu protilátky. Většinou humanizované protilátky budou obsahovat v podstatě všechny z alespoň jedné, typicky ze dvou, variabilních domén, ve kteiých jsou všechny nebo v podstatě všechny z hypervariabilních smyček odpovídajících těm nelidským imunoglobulinům a všechny nebo v podstatě všechny FRs jsou tyto sekvence lidských imunoglobulinů. Humanizované protilátky budou také obsahovat alespoň část imunoglobulinové konstantní oblasti (Fc), typicky tu z lidského imunoglobuliny. Pro další detaily viz. Jones et aí, Nátuře 321:522-525 (1986), Riechman et al., Nátuře 332:323-329 (1988) a Presta Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Humanizované anti-ErbB2 protilátky zahrnují huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7, a huMAb4D5-8 (HÉRCEPTIN®) jak je popsáno v tabulce 3 patentu US 5 821 337 speciálně zařazeným odkazem v tomto dokumentu, humanizované 520C9 (WO 93/21 319) a humanizované 2C4 protilátky jsou popsány níže v tomto dokumentu, ,JzoIovaná“ protilátka je taková, která byla označena a oddělena a/nebo zpětně získána ze složek jejího přirozeného prostředí. Kontaminující složky jejího přirozeného prostředí jsou materiály, které by překážely diagnostickým nebo léčebným použitím protilátek a mohou 'zahrnovat enzymy, hormony a další proteinové a neproteinové rozpuštěné látky. Ve výhodném provedení bude protilátka purifikována (l) na více než 95 % hmotnostní protilátky jak je stanoveno v Lowryho metodě a nejvíc výhodné více než 99 % hmotnosti, (2) do určité míiy získat dostačujících alespoň 15 zbytků zakončených naN nebo vnitřních aminokyselinových sekvencí použití, „spinning cup“ sekvenátoru nebo k homogenitě SDS-PAGE za redukčních nebo neredukčních podmínek s použitím „Coomassie blue“ nebo výhodněji barvení stříbrem. Izolovaná protilátka obsahuje proti45 „ _látku insitu uvnitř rekombinantní-.buňky pokud nebude přítomna alespoň jedna část přirozeného prostředí protilátky. Zpravidla však bývá izolovaná protilátka připravována jedním z purifikačních kroků.

Protilátka, „která báze“ antigen o který je zájem, tj. ErbB2 antigen, je jednou ze schopných vázat tento antigen s dostačující afinitou s jakou je protilátka použitelná jako léčebná látka zasahující buňku exprimující daný antigen. Tam kde protilátka, která váže ErbB2, bude běžně přednostně vázat ErbB2 na rozdíl od jiných ErbB receptorů nemůže být tou, která reaguje křížem s ostatními proteiny jakými jsou EGFR, ErbB3 nebo ErbB4. V takových provedeních míra vazby protilátky k takovým ne-ErbB2 proteinům (tj. buněčný povrch vázající endogenní receptor) bude méně než

10 % jak je stanoveno analýzou rozdělování buněk aktivovaných fluorescencí (FACS) nebo

-10CZ 299702 B6 radioimunoprecipitací (RIA). Někdy anti-ErbB2 protilátka nebude dostatečně reagovat křížem s krysím neu proteinem, jak je popsáno v Schecter et al., Nátuře 312-513 (1984) a Drebin et al., Nátuře 312:545-548 (1984).

.5 . Protilátka, která „blokuje“ aktivaci ligandu receptorů ErbB je taková, která snižuje nebo zamezuje takové situaci, která byla v tomto dokumentu zmíněna výše, kde protilátkami je schopná blokovat aktivaci ligandu receptorů ErbB dostatečně efektivněji než monoklonální protilátka 4D5, tj. přibližně tak efektivně jako monoklonální protilátka 7F3 nebo 2C4 nebo jejich Fab fragmenty a výhodněji přibližně tak efektivně jako monoklonální protilátka 2C4 nebo její Fab fragment, io Například protilátka, která blokuje aktivaci ligandu receptorů ErbB může být taková protilátka, která 50 až 100% efektivněji blokuje tvorbu ErbB heterooligomeru než 4D5. Blokování aktivace ligandu receptorů ErbB se může vyskytnout v každém případě, tj. zásahem do: vazby ligandu receptorů ErbB, tvorby komplexu ErbB, tyrosinkinázové aktivity ErbB receptorů v ErbB komplexu a/nebo fosforylaci tyrosinkinázových zbytků v nebo u ErbB receptorů. Příklady protilátek, které blokují aktivaci ligandu ErbB receptorů zahrnují monoklonální protilátky 2C4 a 7F3 (které blokují HRG aktivaci ErbB2/ErbB3 a ErbB2/ErbB4 hetero-oligomerů a EGF, TGF-α, amfiregulinu, ΗΒ-EGF a/nebo aktivaci epiregulinu EGFR/ErbB2 hetero-oligomeru) a L26,L96 a L288 protilátky (Klapper et al., Oncogene 314:2099-2109 (1997)), které blokují vazbu EGF aNDF k T47D buňkám, které exprimují EGFR, ErbB2, ErbB3 a ErbB4.

Protilátka mající „biologický charakteristický znak“ určující protilátky, je taková monoklonální protilátka určující 2C4, která má jeden nebo více biologických charakteristických znaků protilátky, která je rozeznává od ostatních protilátek, které se váží ke stejnému antigenu (tj. ErbB2). Například protilátka s biologickým charakteristickým znakem 2C4 může blokovat aktivaci HRG

ErbB hetero-oligomeru obsahujícím ErbB2 a ErbB3 nebo ErbB4, blokovat aktivaci EGF, TG ία, ΗΒ-EGF, epiregulin a/nebo amfíregulin receptorů ErbB obsahujícím EGFR a ErbB2, blokovat aktivaci MAPK zprostředkovanou EGF, TGFa a/nebo HRG, a/nebo váže stejnou molekulární oblast na povrchu antigenu, schopné vyvolat tvorbu protilátek v extracelulámí doméně ErbB2 jako je vazba zmíněná u 2C4 (tj. která blokuje vazbu monoklonální protilátky 2C4 k ĚrbB2).

Pokud není uvedeno jinak, exprese „monoklonální protilátky 2C4“ se vztahuje k protilátce, která má antigen vázající zbytky myší 2C4 protilátky (popřípadě zbytky odvozené od tohoto antigenu) z příkladů uvedených níže. Například monoklonální protilátka 2C4 může být myší monoklonální protilátka 2C4 nebo její varianta, jako je humanizovaná protilátka 2C4, mající antigen vázající aminokyselinové zbytky myší monoklonální protilátky 2C4. Příklady humanizovaných 2C4 protilátek jsou níže uvedeny v příkladu 3. Pokud není uvedeno jinak, exprese „rhuMAb2C4“ pokud použito v tomto dokumentu se vztahuje k protilátce obsahující variabilní lehké (V_L) a variabilní těžké (V_H) sekvence SEQ ID c. 3 a 4 jednotlivě, vkombinované do lidských lehkých a těžkých IgGl (na alelického typu A) sekvencí konstantních oblastí nepovinně exprimovaných buňkami vajeěníku Čínského křečka.

Pokud není uvedeno jinak, výraz „monoklonální protilátka 4D5“ se vztahuje k protilátce, která má antigen vázající zbytky myší 4D5 protilátky (ATCC CRL 10463) (popřípadě zbytky odvozené od tohoto antigenu). Například monoklonální protilátka 4D5 může být myší monoklonální

-protilátka 4D5 nebo její varianta, jako je humanizovaná protilátka 4D5, mající antigen vázající aminokyselinové zbytky myší monoklonální protilátky 4D5. Ukázkové humanizované protilátky 4D5 zahrnují huMA4D5-l, huMA4D5-2, huMA4D5-3, huMA4D5^t, huMA4D5, huMA4D56, huMA4D5-7 a huMA4D5-8(HERCEPTIN®) jak je uvedeno v patentu US 5 821 337 s tím, že huMA4D5-8 (HERCEPTIN®) je preferovanou protilátkou.

„Inhibiční činidlo růstu“ pokud je použito v tomto dokumentu se vztahuje k látce nebo směsi, která inhibuje růst buněk, hlavně rakovinných buněk exprimuj ících ErbB buď in vitro, nebo in vivo. Takže inhibiční činidlo růstu může být tím, co podstatně snižuje procento ErbB exprimuj ících buněk v S fázi. Příklady inhibičních činidel růstu zahrnují činidla, která blokují vývoj buněě55 ného cyklu (na jiném místě než je S fáze), taková jsou činidla, která indukují zastavení fáze G1 a

-11CZ 299702 B6

M. Klasickými látkami blokujícími M-fázi jsou vincas (vinkristin, vinblastin), taxany a topo II inhibitory jako jsou doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposid a bleomycin. Tato činidla, která zastavují G1 mají také vliv na S-fázi, například činidla alkylující DNA jakými jsou tamoxifen, prednison, dakarbazin, mechlorethamin, cisplatin, methotraxat, 5-fluoruracil a ara-C. Více informací může být získáno v The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn a ísrael, eds., Chapter 1, pojmenovaný „Regulace buněčného cyklu, onkogeny a antineoplaslická léčiva' od ivíurakami etal. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), zvláště str. 13.

Příklady „růst inhibujících“ protilátek jsou takové protilátky, které se váží k ErbB2 a inhibují růst io rakovinných buněk ve zvýšené míře exprimuj ících ErbB2. Výhodné růst inhibuj ící anti-ErbB2 protilátky inhibují růst SK-BR-3 nádorových buněk prsu v buněčné kultuře o více než 20% a výhodněji o více než 50 % (tj. přibližně od 50 do přibližně 100 %) při koncentraci protilátek od přibližně 0,5 do 30 pg/ml, kdy je inhibice růstu určena po šesti dnech po vystavení SK-BR-3 buněk protilátce (viz. patent US 5 677 171 vydaný 14. října, 1997). Kvantitativní rozbor inhibice růstu SK-BR-3 buněk je detailně popsáno v patentu popsaném níže v tomto dokumentu. Výhodnější růst inhibující protilátka je monoklonální protilátka 4D5, tj. humanizovaná 4D5.

Protilátka, která „indikuje smrt buňky“ je taková, která způsobuje to, že životaschopná buňka se stane neživotaschopnou. Tato buňka je většinou taková, že exprimuje ErbB2 receptor a zvláště taková, která zvýšeně exprimuje ErbB2 receptor. Výhodněji je touto buňkou rakovinná buňka, tj. buňka prsu, vaječníku, žaludku, sliznice děložní, slinných žláz, plic, ledviny, tračníku, štítné žlázy, slinivky břišní nebo krve. Buněčná smrt in vitro může být určena nepřítomností doplňkových a imunních efektorových buněk, aby byla rozeznána buněčná smrt indukovaná protilátkou podmíněnou buňkou zprostředkovanou cytotoxicitou (CDC). Proto by měl být kvantitativní rozbor smrti buněk prováděn s použitím séra inaktivovaného teplem (tj, v nepřítomnosti doplňku) a v nepřítomnosti imunních efektorových buněk. Ke stanovení toho, zda protilátka je schopná indukovat buněčnou smrt, ztráta membránové celistvosti je vyčíslena spotřebou propidium jodidu (Pl), tryptanového barviva (Moore etal., Cytotechnology 17:1-11 (1995)) nebo 7AAD může být stanovena vzhledem k neléčeným buňkám. Výhodnější protilátky indukující buněčnou smrt jsou takové, které indukují Pl spotřebu v kvantitativním rozboru spotřeby Pl v BT474 buňkách (viz. níže).

Protilátka, která „indukuje apoptózu je taková protilátka, která indukuje naprogramovanou buněčnou smrt jak je určeno vázáním anexinu V, fragmentací DNA, úbytkem buněk, dilatací endoplazmatického retikula, fragmentací buněk a/nebo tvorbou membránových váčků (nazývaných apoptické seskupení). Touto buňkou obvykle bývá buňka zvýšené exprimuj ící ErbB2 receptor. Výhodnější je buňka, jedná-li se o buňku nádorovou, tj. buňku prsu, vaječníku, žaludku, sliznice děložní, slinných žláz, plic, ledviny, tračníku, štítné žlázy, slinivky břišní nebo krve. In vitro může být buňkou SK-BR-3, BT474, Calu3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 nebo SKOV3 buňka. Různě postupy jsou k dispozici pro vyhodnocení buněčných případů souvisejících s apoptózou. Například translokace fosfatidylserinu (PS) může být měřena vazbou anexinu, DNA fragmenta může být stanovena přes „DNA laddering“, a jademá/chromatinová kondenzace společně s DNA fragmentací může být stanovena zvýšením hypodiploidních buněk. Výhodněji protilátka, která indukuje apoptózu, je tak která má za následek 2 až 50krát, výhodněji 5 až .45. .SOkrát, a ještě výhodněji . 10 až SOkrát vyšší indukci vázání anexinu ve srovnání k neléčeným buňkám v kvantitativním rozboru vázání anexinu používajícím BT474 buňky (viz. níže). Někdy proapoptická protilátka bude tou, která dále blokuje aktivaci ligandu ErbB receptoru ErbB (např. 7F3 protilátka) tj. protilátka sdílí biologický charakteristický znak s monoklonální protilátkou 2C4. V ostatních situacích jde o protilátku, která dostatečně neblokuje aktivaci ErbB ligandu

ErbB receptoru (např. 7C2). Dále protilátka může být obdoba protilátky 7C2, která přestože indukuje apoptózu, neindikuje velký pokles v procentu buněk v S-fázi (tj. ta která indukuje okolo 0 až 10 % poklesu v procentu těchto buněk ve srovnání s kontrolou).

„Epitop 2C4“ je oblast v extracelulámí doméně ErbB2, kam se váže protilátka 2C4. Aby se zjistilo, které protilátky se váží k 2C4 epitopu, běžný kvantitativní rozbor „cross-blocking“ jak,

-12CZ 299702 B6 je popsán v Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lané (1988) může být proveden. Jinak může být také provedeno mapování epitopu, za účelem stanovení, zda se protilátka váže k 2C4 epitopu receptoru ErbB2 (tj. jakýkoliv jeden nebo více zbytků v oblasti přibližně od 22 zbytků do přibližně 584 zbytků ErbB2 včetně, viz. Obrázky

1A-B).....

„Epitop 4D5“ je oblast v extracelulámí doméně ErbB2, kam se váže protilátka 4D5 (ATCC CRL 10463). Tento epitop je blízko transmembránové doméně ErbB2. Aby se zjistilo, které protilátky se váží k 4D5 epitopu, běžný kvantitativní rozbor „cross-blocking“ jak, je popsán ío v Antibodies, A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lané (1988) může být proveden. Jinak může být také provedeno mapování epitopu, za účelem stanovení, zda se protilátka váže k 4D5 epitopu receptoru ErbB2 (tj. jakýkoliv jeden nebo více zbytků, v oblasti přibližně od 541 zbytků do přibližně 599 zbytků extracelulámí domény ErbB2 včetně, viz. obrázky 1 A-B).

„Epitop 7C2/7F3“ je oblast na N konci extracelulámí domény ErbB2, kam se váží protilátky 7C2 a/nebo 7F3 (každá vložena s ATCC, viz. níže). Aby se zjistilo, které protilátky se váží k 7C2/7F3 epitopu, běžný kvantitativní rozbor „cross-blocking“ jak, je popsán v Antibodies, A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lané (1988) může být proveden.

Jinak může být také provedení mapování epitopu, za účelem stanovení, zda se protilátka váze k 7C2/7F3 epitopu receptoru ErbB2 (tj. jakýkoliv jeden nebo více zbytků v oblasti přibližně od 22 zbytků do přibližně 53 zbytků ErbB2, viz. Obrázky 1 A-B).

„Léčba“ se vztahuje jak k terapeutické léčbě tak k profylaktickému nebo preventivnímu měření.

Ti co potřebují léčbu jsou tací, kteří již mají poruchu stejně jako ti, u kterých je nutná prevence proti poruše. Proto u savců, kteří zde budou léčeni, by měla být určena diagnóza ve smyslu savec mající poruchu nebo savec náchylný nebo snadno podléhající dané poruše.

„Savec“ pro účel léčby se vztahuje k jakémukoliv zvířeti klasifikovanému jako savec, zahrnující lidi, domestikovaná a hospodářská zvířata, a zoo, sportovní nebo domácí zvířata jakou jsou psi, koně, kočky, krávy, atd. Výhodnějším savcem je člověk.

„Porucha“ je jakýkoliv stav, který by mohl mít prospěch z léčby protilátkou anti-ErbB2. Toto obsahuje chronické a akutní poruchy nebo nemoci, zahrnující takové patologické stavy, které činí savce náchylným k poruše, o kterou se jedná. Neomezené příklady léčených poruch v tomto dokumentu zahrnují benigní a maligní nádory, leukémie a lymfoidní tumory, neuronové, gliové, astrocytální, hypothalamické a jiné žlázovité, makrofagální, epitheliální, týkající se stromatu a blastocoelické poruchy a zánětlivé, angiogení a imunologické poruchy.

Výraz „léčebně účinné množství“ se vztahuje k množství účinného léčiva pro léčbu nemoci nebo poruchy u savců. V případě rakoviny, léčebně účinné množství léčiva by mělo snížit počet rakovinných buněk, snížit velikost nádoru, inhibovat (tj. do určité míry zpomalit a nejlépe zastavit) pronikání rakovinných buněk do periferních orgánů, inhibovat (tj. do určité míry zpomalit a nejlépe zastavit) nádorové metastáze, inhibovat, do určité míry, růst nádoru, a/nebo do určité míry

45.. .zmírnit jeden nebo více symptomů spojených srakovinou. Do té míry léčivo může předcházet růstu a/nebo zabíjet existující rakovinné buňky a může být cytostatické a/nebo cytotoxické, Při léčbě rakoviny, může být účinnost například měřena stanovením času postupu onemocnění (TTP) a/nebo určením rychlosti odpovědi (RR).

Výraz „rakovina“ a „rakovinný“ se vztahuje nebo popisuje fyziologický stav u savců, který je typicky charakterizován nekontrolovatelným buněčným růstem. Příklady rakoviny zahrnují, ale nejsou omezeny na karcinom, lymfom, blastom, sarkom a leukémii nebo lymfoidní zhoubný nádor. Více speciální příklady těchto rakovin zahrnují rakovinu šupinatých buněk epitelu, plicní rakovinu zahrnující plicní rakovinu malých buněk, plicní rakovinu nemalých buněk, adenokarci55 nom plic a rakovinu šupinatých buněk epitelu plic, rakovinu pobřišnice, hepatocelulámí rakovi-13CZ 299702 B6 nu, rakovinu žaludku, zahrnující gastrointestinální rakovinu, pankreatickou rakovinu, gíioblastom, rakovinu šíje, rakovinu vaječníku, rakovinu jater, rakovinu krve, hepatom, rakovinu prsu, rakovinu tračníku, rakovinu konečníku, rakovinu tračníku a konečníku, endometriální nebo-li rakovinu dělohy, rakovinu slinných žláz, renální rakovinu nebo-li rakovinu ledvin, rakovinu pros- * . táty, vulvovou rakovinu, rakovinu štítné žlázy, hepatickou rakovinu, anální rakovinu, rakovinu i penisu a stejně tak i rakovinu hlavy a krku. j „ErbB exprimující rakovina“ je taková, která se skládá z buněk, které mají přítomný ErbB protein !

na svém buněčném povrchu. „ErbB2 exprimující rakovina“ je taková, která vytváří dostatečné hladiny ErbB2 na povrchu svých buněk, ke kterým se může navíc vázat protilátka anti-ErbB2 a mít tak léčebný účinek vzhledem k rakovině.

Rakovina „charakterizovaná nadměrnou aktivací“ ErbB reeeptoru je taková, ve které míra aktivace ErbB reeeptoru v rakovinných buňkách značně převyšuje hladinu aktivace těchto receptorů v nerakovinných buňkách tkáně stejného typu. Taková nadměrná aktivace je výsledkem nadměrné exprese ErbB reeeptoru a/nebo vyšších než normálních hladin ErbB ligandů, jež jsou k dispozici pro aktivaci ErbB reeeptoru v rakovinných buňkách. Takovou nadměrnou aktivací může způsobit a/nebo být příčinou maligní stav rakovinné buňky. V některých provedeních bude rakovina vystavena diagnostickému nebo prognostickému kvantitativnímu rozboru, aby bylo určeno zda je amplifikace a/nebo nadměrná exprese ErbB reeeptoru přítomna a je výsledkem této nadměrné aktivace ErbB reeeptoru. Nebo navíc může být rakovina vystavena diagnostickému nebo prognostickému kvantitativnímu rozboru, aby bylo určeno zda je amplifikace a/nebo nadměrná exprese ErbB ligandu přítomna v rakovině a připisuje se mu nadměrná aktivace reeeptoru. V podskupině takových rakovin může nadměrná aktivace reeeptoru být výsledkem autokrin podněcované dráhy.

V „autokrin“ podněcované dráze se vyskytuje samostatná stimulace na základě rakovinných buněk produkujících jak ErbB ligand tak jeho analogický receptor. Například rakovina může exprimovat nebo nadměrně exprimovat EGFR a také exprimovat nebo nadměme exprimovat

EGFR ligand (tj. EGF, TGF-α nebo HB-EGF). V jiném provedení rakovina může exprimovat nebo nadměrně exprimovat ErbB2 a také může exprimovat nebo nadměrně exprimovat heregulin (tj.y-HRG).

Rakovina, která „nadměrně exprimuje“ ErbB receptor je taková, která má značně vyšší hladiny

ErbB reeeptoru, jako je ErbB2 na povrchu buněk ve srovnání s nerakovinnými buňkami tkáně stejného typu. Taková nadměrná exprese může být způsobena amplifikací genu nebo zvýšením transkripce nebo translace. Nadměrná exprese ErbB reeeptoru může být stanovena v diagnostickém nebo prognostickém kvantitativním rozboru vyhodnocením zvyšujících se hladin ErbB proteinu přítomném na buněčném povrchu (tj. přes imunohistochemický kvantitativní rozbor,

IHC). Nebo navíc lze změřit hladiny nukleové kyseliny kódující ErbB v buňce, tj. přes fluorescenční in šitu hybridizaci (FISH, viz. WO 98/45 479 vzdaný v říjnu, 1998), Southern blotting nebo techniku polymerázové řetězcové reakce (PCR), stejně tak velmi iychlou PCR RT-PCR).

Lze také studovat nadměrnou expresi ErbB reeeptoru ztraceného antigenu (tj. ErbB extracelulární doménu) v buněčných tekutinách, jakými je sérum (viz. např. patent US 4 993 294 vydaný 12.

. -45- -června, 1990, WO 91/05 264 publikací 18. dubna, 1991, patent US 5 401 638, vydaný 28.března, ‘

1995 a Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Kromě výše zmíněných kvantitativních rozborů, různé in vivo kvantativní rozbory jsou k dispozici kvalifikovaným doktorům.

Například lze vystavit buňky v těle pacienta protilátce, která je vhodně označená detegovatelnou značkou, např. radioaktivním izotopem a navázání protilátky na buňky pacienta může být vyhod50 nocena, např. externím snímáním radioaktivity nebo analyzováním biopsie získané od pacienta předem vystavenému protilátce.

Naopak rakovina, která není „charakterizována nadměrnou expresí ErbB2 reeeptoru“ je taková, která v diagnostickém kvantitativním rozboru neexprimuje vyšší než normální hladiny ErbB2 reeeptoru ve srovnání s nerakovinnými buňkami tkáně stejného typu.

-14CZ 299702 B6

Rakovina, která „nadměrně exprimuje“ ErbB ligand je taková, která produkuje podstatně vyšší hladiny tohoto ligandu ve srovnání s nerakovinnými buňkami tkáně stejného typu. Taková nadměrná exprese může být způsobena amplifikací genu nebo zvýšením transkripce nebo trans5 láce. Nadměrná exprese ErbB ligandumůže být určena diagnosticky vyhodnocením hladin ligandu (nebo nukieové kyseliny, která ho kóduje) u pacienta, např. v biopsii nádoru nebo různými diagnostickými kvantitativními rozbory, jakými jsou IHC, FISH, southem blotting, PCR nebo in vivo kvantitativní rozbory popsané výše.

„Na hormonech nezávislá“ rakovina je taková, ve které její rozšiřování nezávisí na přítomnosti hormonu, který váže receptor exprimovaný buňkami při rakovině. Takové rakoviny se nepodrobují klinické regresi před vedením farmakologické nebo chirurgické strategie, která snižuje koncentraci hormonu v tumoru nebo v jeho blízkosti. Příklady na hormonech nezávislých rakovin zahrnují na androgenu nezávislou rakovinu prostaty, na estrogenu nezávislou rakovinu prsu, endometriální rakovinu a rakovinu vaječníku. Takové rakoviny mohou začít jako tumory závislé na hormonech a vyvinout se z nádorů ve stádiu na hormonech citlivých do stadia na hormonech necitlivých následovaných antihormonální léčbou.

Výraz „cytotoxické činidlo“ je chemická sloučenina použitelná při léčbě rakoviny. Příklady chemoterapeutických činidel zahrnují alkylační činidla jako thiotepa, cyklofosfamid (CYTOXAN™), alkylsulfonáty jako busulfan, improsulfam a piposulfam, aziridiny jako benzodopa, karboquon, meturedopa a uredopa, ethyleniminy a methylameliny, nitrogenmustardy jako chlorambucíl, chloranfazin, cholofosfamid, estramustin, ifosfamid, mechlorethamin, oxid hydrochloridu, melfalan, novembichin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uráčil mustard, nitro25 močoviny jako karmustin, chlotozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin, antibotika jako aklacinomysiny, aktinomycyn, anthramycin, azaserin, bleomyciny, aktinomycin, kalicheamicin, karabicin, karminomycin, carzinofilin, chromomyciny, daktinomycin, daunorubicin, 6diazo-5-oxo-L-norleucin, doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, mercelomycin, mytomyciny, mykofenolová kyselina, noglamycin, olivomyciny, peplomycin, potfiromycin, puro30 mycin, kvelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin, antimetabolity jako methotrexat a 5-fluoruracil (5-FU), analogy kyseliny listové jako denopterin, methotrexat, pteropterin, trimetrexát, analogy purinu jako fludarabin, 6-merkaptopurin, thiaminpurin, thioguanin, analogy pyrimidinujako ancitabin, azacidi, 6-azauridin, karmofur, cytarabin, dideoxyurídin, doxifluoridin, 5-FU, androgeny jako kalusteron, dromostanolon35 propionát, epitiastanol, mepitiostan, testolakton, anti-adrenaliny jako aminogluethimid, mitotan, trilostan, doplňovač kyseliny listové jako froliniová kyselina, aceglaton, aldofosfamidglykozid, aminolevulová kyselina, amsakrinbestrabucil, bisantren, edatraxát, defofamin, demekolcin, diazoquan, elfonithin, eliptinumacetát, etóglucid, nitrát galia, hydroxýmočovina, Iěntinan, lonidamin, mitoguazon, mitoxantron, mopidamol, nitrkrin, pentostatin, fenamet, pirarubicin, podofi40 linová kyselina, 2-ethylhydrazid, prokarbazin, PSK, razoxan, sizofiran, spirogermanium, tenuazoniová kyselina triazoquan, 2,2',2''-trichlorethylenamin, urethan, vindesin, dakarbazin, manomustin, mitobronitol, mitolactol, pipobroman, gacytosin, arabinozid („Ara-C“), cyklofosfamid, thiotepa, taxany, např. pakíitaxel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), docetaxel (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France), chlorambucíl, gemcitabin, 645 · · - thioguanin; merkaptopurin,- methotrexat, analogy platiny’ jako 'je’cisplatin' a karbóplatin, vinblastin, platina, etoposid (VP-16), ifosfamid, mytomycin C, mitoxantron, vinkristin, vinorelbin, nevelbin, novantron, teniposid, daunomycin, aminopterin, xeloda, ibandronát, CPT-11, inhibitor topoisomerázy RFS 2000, difluormethylornithin (DMFO), réti nová kyselina, esperamiciny, kepecitabin a farmaceuticky přijatelné soli, kyseliny nebo deriváty výše zmíněných sloučenin.

Také jsou v této definici zahrnuta antihormální činidla, která se účastní regulace nebo inhibují působení hormonů na tumory jako jsou anti-estrogeny zahrnující například tamoxifen, raloxifen, aromatázu inhibující 4(5)-ímidazoly, 4-hydroxytamofeny, trioxyfeny, keoxyfeny, LY117018, onapriston a toremifen (Fareston) a anti-androgeny jako flutamid, nilutamid, bicalutamid, leuprolid a goserelin a farmaceuticky přijatelné soli, kyseliny nebo deriváty jakékoliv výše zmí55 něné sloučeniny.

-15CZ 299702 B6

Jak je použito v tomto dokumentu, výraz „EGFR-cílená léčiva“ se vztahuje k terapeutickému činidlu, které se váže k EGFR a popřípadě inhibuje jeho aktivaci. Příklady takových činidel ji zahrnují protilátky a malé molekuly, které se váží k EGFR. Příklady protilátek, které se váží l k EGFR zahrnují Mab 579 (ATCC CRL HB 8506), Mab 455’(ATCC CRL HB 8507), Mab 255 j (ATCC CRL Í-IB 8508), Mab 528 (ATCC CRL HB 8509) (viz. patent US č. 4 943 533 \|l

Mendelson et alf a jejich varianty jako chimerizované 225 (C225) a přestavěný lidský 225 f (H225) (viz. WO 96/40 210, Imclone Systems, ínc.), protilátky, které váží mutanty EGFR typu II f (patent US 5 212 290), humanizované a chimérické protilátky, které váží EGFR jak je popsáno ' ío v patentu US 5 891 996 a lidské protilátky, které váží EGFR (viz. WO 98/50 433, Abgenix).

Anti-EGFR protilátka může být spojena s cytotoxickým činidlem, takže se vytvoří imunokonjugát (viz. např. EP 659 439 A2, Merc Patent Gmbh). Příklady malých molekul, které se váží k EGFR zahrnují ZDI 839 (Astra Zenca), CP-358774 (OSI/Pfizer) a AG1478.

„Anti-angiogenní činidlo“ se vztahuje k sloučenině, která blokuje nebo interaguje s určitým stupněm vývinu krevních váčků. Tímto anti-angíogenním činidlem může být například malá molekula nebo protilátka, která se váže k receptorů růstového faktoru který zodpovídá za iniciaci angiogeneze (vývoj krevních cév). Výhodný anti-angiogenní faktor v tomto dokumentu je protilátka, která se váže k vaskulámímu endoteliálnímu růstovému faktoru (VEGF).

Výraz „cytokin“ je obecně použitelný výraz pro proteiny uvolňované jedinou buněčnou populací, která ovlivňuje jinou buňku jako intercelulární mediátor. Příklady takových cytokinů jsou lymfokiny, monokiny a tradiční polypeptidové hormony. Zahrnovaný mezi cytokiny jsou růstové hormony jako lidský růstový hormon, N-methionyl lidský růstový hormon a bovinový růstový hormon, parathyroidní hormon, thyroxin, insulin, proinsulin, relaxin, prorelaxin, glykoproteinové hormony jako hormon stimulující růst misku obsahující vajíčko ve vaječníků a aktivuje buňky vytvářející sperma (FSH), hormon stimulující štítnou žlázu (TSH) a hormon stimulující vývoj žlutého tělíska (LH) hepatický růstový hormon, prolaktin, placentální laktogen, faktor odumírání zhoubného nádoru a a β, mulerian inhibující sekvence, s myším gonádotropininem propojený peptid, inhibin, aktivin, vaskulámí endotheliální faktor, integrin, thrombopoietin (TPO), faktory nervového růstu jako jsou NGF-β, růstový faktor krevních destiček, transformující růstové faktory (TGFs) jako TGF-α a TGF-β, insulinu podobný růstový faktor-I a II, erythropoietin (EPO), osteoínduktivní faktory, interferony jako interferon-α, -β a -γ, kolonie stimulující faktory (CSFs) jako makrofág-CSF (M-CSF), granulocyt-makrofág-CSF (GM-CSF) a granulocyt-CSF (G-CSF), interleukiny (11$) jako jsou IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, ILM, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL9, IL-10, IL-11,

IL-12, faktor nekrózy zhoubného nádoru jako jsou TNF-α nebo TNF-β a ostatní polypeptidové faktory zahrnující LIF a kit ligand (KL). Jak je použito v tomto dokumentu výraz cytokin zahrnuje proteiny z přírodních zdrojů nebo rekombinantní buněčné kultury a biologicky aktivní ekvivalenty přírodních sekvencí cytokinů.

Výraz „proléčivo“ jak je použito v této přihlášce se vztahuje k prekursoru nebo derivátu z farmaceuticky aktivní látky, která je méně toxická k buňkám zhoubného nádoru ve srovnání se základ- 45 - ním léčivem a je schopné být enzymaticky aktivováno nebo přeměněno na aktivnější základní formu. Viz. např. Wilman „Prodrugs in Cancer Chemotherapy“ Biochemical Society Transaction, . 14 pp., 375-382, 615^th Meeting Belfast (1986) a Stella et al., „Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,“ Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Proléčiva tohoto vynálezu zahrnují, ale nejsou omezena na fosfát obsahující proléčiva, thiofosfát obsahující proléčiva, sulfát obsahující proléčiva, peptid obsahující proléčiva, β-laktam obsahující proléčiva, volitelně substituovaný fenoxyacetamid obsahující proléčiva nebo volitelně substituovaný fenylacetamid obsahující proléčiva, 5-fluorouridin a ostatní 5-fluorouridinová proléčiva, která mohou být přeměněna v aktivnější necytotoxická léčiva. Příklady

-16CZ 299702 B6 cytotoxických léčiv, které mohou být odvozena ve formu proléčiva pro použití v tomto vynálezu, ale nejsou na ně omezena, jsou výše popsaná činidla.

„Liposom“ je malý váček složený z různých typů lipidů, fosfolipidů a/nebo surfaktantů, který je užitečný pro dodání léčiva (jako jsou anti-ErbB2 protilátky popsané v tomto dokumentu popřípadě chenioíerapcuíické činidlo) savci. Složky íiposomu jsou běžně seřazeny do dvouvrstevného seskupení, podobnému seřazení lipidů v biologických membránách.

Výraz „příbalový leták“ je použit ve vztahu k instrukcím tradičně zahrnutých v obchodních bale10 nich terapeutických výrobků, které obsahují informace o indikaci, použití, dávkování, podávání, kontradikcích a/nebo varování, týkající se použití těchto terapeutických produktů.

„Kardioprotektant“ je sloučenina nebo směs, která zabraňuje nebo snižuje dysfunkci myokardu (např. kardiomyopatie a/nebo městnavé selhání srdce) spojených s podáváním léčiva, jako jsou anthracyklinová antibiotika a/nebo anti-ErbB2 protilátky pacientovi. Kardioprotektant může například blokovat nebo snižovat kardiotoxické účinky volných radikálů a/nebo zabraňovat nebo snižovat poškození oxidativního stresu. Příklady kardioprotektantů zahrnutých do předložené definice obsahují železo vyvažující činidlo dexrazoxan (ICRF-187) (Seifert et al. The Annals of Pharmacology2frAQ63-\WT2 (1994)), lipidy snižující činidlo a/nebo antioxidantjakoje probukol (Singal et al J. Mol Cell Cardiol. 27:1055-1063 (1995)), amifostin (ester aminothiol 2-[(3aminopropyl)amino]ethanethiol dihydrogenfosfátu) také pojmenovaný WR-2721 ajeho defosforylovaná forma pro buněčnou spotřebu zvaná WR-1065) a S-3-(3-ethylaminopropylaminó)propylfosforothiová kyselina (WR-151327), viz. Green et al, The Cancer Research 54:738-741 (1994)), digoxin (Bristow, M. R. In: Bristow MR, ed. et al Drug-Induced Heart Disease New

York: Elsevier 191-215 (1980)), beta-blokující látky jako je metoprolol (Hjalmarson etal. Drugs 47:Suppl4:31—9 (1994)), a Shaddy et al Am. Heart J. 129:197-9 (1995)), vitamin E, kyselina askorbová (vitamin C), látky ničící volné radikály jako je oleanová kyselina, ursolová kyselina a N-acetylcystein (NAC), spin zachytávající sloučeniny jako alfa-fenyltertbutylnitron (PBN), (Paracchini et al And Cancer Res. 13:1607-1612 (1993)), selenoorganické sloučeniny jako P251 (Elbesen) a další.

„Izolovaná“ molekula nukleové kyseliny, která je identifikována jako oddělená od alespoň jedné kontaminující molekuly nukleové kyseliny, se kterou je běžně spojená v přírodním zdroji nukleové kyseliny protilátky. Izolovaná molekula nukleové kyseliny je jiná než ve formě nebo v pro35 středí, ve kterém je nacházena v přírodě. Izolované molekuly nukleové kyseliny jsou proto odlišné od izolované molekuly nukleové kyseliny tak, jak existuje v přirozených buňkách. Nicméně izolovaná molekula nukleové kyseliny se skládá z nukleové kyseliny obsažené v buňkách, které • běžně exprimují protilátku tak, kde je například íiíólékula nukleové kyseliny v jiné chromozomální poloze než u přirozených buněk.

Exprese „kontrolních sekvencí“ se vztahuje k DNA sekvencím nutným pro expresi operabilně spojené kódující sekvence v určitém hostitelském organismu. Kontrolní sekvence, které jsou vhodné pro prokaryota například zahrnují promotorovou, popřípadě operátorovou sekvenci a ribozomální vazebné místo. Eukaryotické buňky jsou známy tím, že používají promotory, poly-..45., -adenylační signály-a zesilovače transkripce: - - - ......... - ------ — .

Nukleová kyselina je „operabilně spojená“ pokud je umístěna, do funkční spojitosti s jinou sekvencí nukleové kyseliny. Například DNA prosekvence nebo sekreční iniciátor je operabilně spojen s DNA pro polypeptid pokud je exprimován jako preprotein, který se účastní sekrece tohoto polypeptidu, promotor nebo zesilovač transkripce je operabilně spojen s kódující sekvencí pokud je ovlivňována transkripcí sekvence nebo ribozomální vazebné místo je operabilně spojeno škodující sekvencí pokud je umístěna tak, aby usnadnila translaci. Obecně „operabilně spojen“ znamená, že spojované DNA sekvence jsou sousedící a v případě sekrečního iniciátoru jsou sousedící a v čtecí fázi. Nicméně zesilovače transkripce nemusí být sousedící. Spojení je

-17CZ 299702 Bó provedeno 1 igací ve vhodných restrikčních místech. Pokud taková místa neexistují, jsou použity syntetické oligonukleotídové adaptery nebo linkery v souladu s obvyklými postupy.

Jak je použito v tomto dokumentu výrazy „buňka“, „buněčná linie“ a „buněčná kultura“ jsou | použity zaměnitelně a všechna tato ustanovení zahrnují progeny. Proto tedy slova „transformace“ a „transformované buňky zahrnují primární vystavenou buňku a kultury odvozené od těchto buněk, bez ohledu na počet přenosů. Je tím také rozuměno, že všechny progeny nemusí být | přesně identické s DNA obsahem, vzhledem k chtěným nebo nechtěným mutacím. Jsou zahrnuty mutantní progeny, které mají stejnou funkci nebo biologickou aktivitu, pro kterou byly zkoumány io v původně transformovaných buňkách. Kde budou myšlena odlišná ustanovení, to bude jasné z kontextu.

II. Produkce anti-ErbB2 protilátek . Následuje popis vzorových postupů pro přípravu protilátek použitých s ohledem na předložený vynález. ErbB2 antigen používaný pro přípravu protilátek může být např. rozpustná forma extracelulární domény ErbB2 nebo jeho část, obsahující požadovaný epitop. Nebo buňky exprimující na svém povrchu ErbB2 (např. NIH-3T3 buňky transformované tak, aby zvýšeně exprimovaly ErbB2 nebo rakovinná buněčná linie jako je SK-BR-3, viz. Stancovski etal. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)) může být použita k výrobě protilátek. Ostatní formy ErbB2 užitečné pro výrobu protilátek budou zřejmé odborníkům.

(i) Polyklonální protilátky

Polyklonální protilátky jsou preferovaně získány ze zvířat několikanásobnými podkožními (sc) nebo nitropobřišnicovými (ip) injekcemi náležitých antigenů a podpůrných látek. Může být užitečné připojit náležitý antigen k proteinu, který je imunogenní v tom druhu, který má být imunizován. Např. „keyhole hemocyanin“ z přílipky, sérum albumin, hovězí thyroglobulin nebo sójový inhibitor trypsinu a bifunkční nebo odvozená činidla, například ester ‘ malemidobenzoylsulfosukcimidu (připojeném přes zbytky cysteinu), N-hydroxysukcimid (přes zbytky lysinu), glutaraldehyd, anhydrid jantarový, SOCI₂ nebo R1NONR, kde R a R1 jsou různé alkylskupiny.

Zvířata jsou imunizována proti antigenů, imunogenním konjugátům nebo derivátům kombi35 nováním např. 100 nebo 5 μΐ proteinu nebo konjugátu (pro králíky nebo popřípadě myši) s objemy Freundova kompletního podpůrného činidla a injektování roztoku nitrokožně na několika místech. O jeden měsíc později jsou zvířata povzbuzena 1/5 nebo 1/10 původního množství peptidu nebo konjugátu v Fřeundově kompletním podpůrném činidle podkožní injekcí na několika místech. Po sedmi až 14 dnech jsou zvířata vykrvácena a sérum je podro40 beno kvantitativnímu rozboru titraci protilátek. Zvířata jsou povzbuzována dokud titr není přímka. Výhodněji jsou zvířata povzbuzena konjugátem stejného antigenů, ale připojeného k jinému proteinu a/nebo přes křížově vázající činidlo. Konjugáty mohou být také vyrobeny v rekombinantní buněčné kultuře jako proteinové směsi. Také lze vhodně využít agregaěních činidel jako je kamenec ke zvýšení imunitní odpovědi.

45- ----- - ...... .· - ... ' (ii) Monoklonální protilátky

Monoklonální protilátky jsou získány z populace dosti homogenních protilátek, např. jednotlivé protilátky obsažené v populaci jsou identické s výjimkou přirozeně se vyskytujících mutací, které j mohou být přítomny v menších množstvích. Proto přívlastek „monoklonální“ neoznačuje charakter protilátky jako směsi oddělených protilátek.

Například monoklonální protilátky mohou být vyrobeny použitím hybridomové techniky poprvé popsané v Kohler et al. Nátuře, 256:495 (1975) nebo mohou být vyrobeny metodami rekom55 binantní DNA (patent US 4 816 567).

-18CZ 299702 B6

Vhybridomové technice je myši nebo jiné vhodné hostitelské zvíře, jako křeček, imunizováno jak bylo popsáno výše pro vyvolání lymfocytů, které produkují nebojsou schopné produkovat protilátky, které se budou specificky vázat k proteinu použitému pro imunizaci. Nebo mohou být lymfocyty imunizovány in vitro. Lymfocyty jsou potom spojeny s buňkami myelomu a vytvoří tak s použitím vhodného spojovacího činidla, jakým je polyethyíengíykol hybridní buňky (Goding, u Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, pp. 59-103 (Academie Press,

1986) ).

ío Hybridní buňky takto připravené jsou vysety a nechány růst ve vhodném kultivačním médiu, které výhodně obsahuje jednu nebo více sloučenin, které inhibují růst nebo přežití rodičovských buněk myelomu, které nefúsovaly. Například, pokud rodičovské buňky myelomu postrádají enzym hypoxanthmguanínfosforybosyltransferázu (HGPRT nebo HPRT), kultivační médium pro hybridy typicky bude obsahovat hypoxanthin, aminopterin a thymidin (HAT medium), jehož lát15 ky zabraňují růstu HGPRT-deficientních buněk.

Výhodnější buňky myelomu jsou takové, které se účinně spojují, napomáhají stabilní produkci protilátek na vysoké úrovni selektováním protilátku vyrábějících buněk a jsou citlivé k médiu jako je HAT médium. Mezi těmito výhodnějšími liniemi buněk myelomu jsou buňky myelomu myší linie jako ty, které byly odvozeny od MOPC-21 a MPC-11 myších tumorů získané z Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califomia USA a SP-2 nebo X63-Ag8-653 buňky získané od the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Linie Buněk lidského myelomu a myšího-lidského heteromyelomu byly také popsány při výrobě lidských monoklonálních protilátek (Rozbor J. Immunol., 133:3001 (1984) a Brodeur et. al. Monoclonal

Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, lne. New York,

1987) ).

Kultivační médium, ve kterém byly hybridní buňky pěstovány byl podroben kvantitativnímu rozboru výroby monoklonálních protilátek namířených proti antigenů. Výhodněji vazebná specifita monoklonálních protilátek produkovaných hybridními buňkami byla stanovena imunoprecipitací nebo in vitro vazebným kvantitativním rozborem, jakým je radioimuno logický kvantitativní rozbor (RIA) nebo kvantitativní rozbor s pomocí enzymu navázanému k absorbentu (ELISA).

Vazebná afinita monoklonální protilátky může být například stanovena Scatchardovou analýzou od Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Potom co byly poznány hybridní buňky, které produkují protilátky požadované specifity, afinity a/nebo aktivity, klony mohou být subklonovány postupy omezeného ředění a pěstovány standard40 nimi metodami (Goding Monoclonal Antibodies.Principles and Practice, pp, 59:103 (Academie Press, 1986)). Vhodná kultivační média pro tento účel zahrnují například D-MEM nebo RPMI1640 médium. Kromě toho hybridní buňky mohou být pěstovány in vivo jako ascitní nádory ve zvířeti.

-Monoklonální protilátky uvolňované subklony jsou vhodně odděleny od kultivačního média, ascitní tekutiny nebo séra běžnými postupy purifíkace protilátek jako například protein A-Sepharóza, hydroxyapatitová chromatografie, gelová elektroforéza, dialýza nebo afínitní chromatografie.

DNA kódující monoklonální protilátky je snadno izolována a sekvenována použitím běžných postupů (např. použitím oligonukleotidových sond, které jsou schopné se specificky vázat ke genům kódujícím těžké a lehké řetězce myších protilátek). Hybridní buňky slouží jako výhodné zdroje této DNA. Jednou izolovaná DNA může být umístěna do expresních vektorů, které jsou pak transfektovány do hostitelských buněk jakými jsou buňky E. Coli, opičí COS buňky, buňky vaječníku Křečka čínského (CHO) nebo buňky myelomu, které jinak neprodukují protein, za úče-19CZ 299702 B6 lem získání syntézy monoklonálních protilátek v rekombinantních hostitelských buňkách. j

Souhrnné články týkající se rekombinantní exprese v bakteriích s DNA kódující protilátky | zahrnují Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) a Pluckthuin, Immunol. 3

Revs., 130:151-188(1992). j

V dalším provedení inonoklonální protilátky nebo fragmenty protilátek mohou být izolovány 1 z knihoven fága obsahující protilátku použitím postupů popsaných v McCafferty et al, Nátuře, J

348:552-554 (1990). Clackson et al, Nátuře, 352:624-628 (1991) a Marks et al, J. Mol Biol 1

222:581-597 (1991) popisují izolaci myších a lidských protilátek popřípadě použití fágových (0 knihoven. Následné publikace popisují výrobu lidských protilátek s vysokou afinitou (nM rozsah) řetězcovým mícháním (Marks et al, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), stejně jako kombinační infekce a rekombinace in vivo jako postup na konstrukci velmi obsáhlé fágové knihovny (Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Proto jsou tyto postupy realizovatelné alternativy k tradičním postupům izolace monoklonálních protilátek hybridními postu15 py získání monoklonálních protilátek.

DNA může být také modifikována například substitucí kódující sekvence pro lidský těžký řetězec a lehký řetězec konstantních domén v místě homologních myších sekvencí (patent US 4 816 567 a Morrison et al, Proč. Nati Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984) nebo kovalentním propojením imu20 noglobulin kódující sekvence s úplnou nebo částečnou sekvencí kódující neimunoglobulinovy peptid.

. Typicky jsou takové neimunoglobulinovými peptidy nahrazeny konstantními doménami protilátky nebo jsou nahrazeny variabilními doménami antigen vazebného místa protilátky a vzniknou tak chimérické bivalentní protilátky obsahující jedno antigen vazebné místo mající specifitu k antigenů a další antigen vazebné místo mající specifitu k jinému antigenů.

(iii) Humanizované protilátky

Postupy na humanizaci nelidských protilátek byly popsány v dosavadním stavu techniky.

Výhodněji má humanizovaná protilátka jeden nebo více aminokyselinových zbytků zavedených z jiného zdroje, který není lidský. Tyto nelidské aminokyselinové zbytky jsou často označovány jako „importní“ zbytky, které jsou typicky vzaty z „importní“ variabilní domény. Humanizace může být v podstatě provedena následujícím postupem Winter a kol. (Joneset al, Nátuře,

321:5 22-525 (1986), Riechman et al, Nátuře, 332:323-327 (1988), Verhoyen et al, Science,

239:1534-1536 (1988)) nahrazením sekvence hypervariabilní oblasti za odpovídající sekvenci lidské protilátky. Proto tyto „humanizované“ protilátky jsou chimérické protilátky (patent US 4 816 567), kde v podstatě méně než intaktní lidská variabilní doména bylá nahrazena odpovídající sekvencí z nelidského druhu. V praxí humanizované protilátky jsou typicky lidské protilátky, ve kterých zbytky některých hypervariabilních oblastí a pravděpodobně některé FR zbytky jsou nahrazeny zbytky z obdobných míst v protilátce hlodavců.

Volba lidských variabilních domén jak lehkých tak těžkých používaná při výrobě humanizovaných protilátek je velmi důležitá při snížení antigenicity. Podle takzvaného „nejlépe vyhovujícího _ _ . 45------postupu, sekvence -variabilní domény-v protilátce hlodavce je zkoumána oproti veškerým knihov-’.......

nám známých lidských sekvencí variabilní domény. Lidská sekvence, která je nejbližší k té z hlodavců je pak přijata jako lidská stavební oblast (FR) pro humanizovanou protilátku (Sims et al, J Immunol, 151:2296 (1993), Chotia et al, J. Mol Biol, 196:901 (1987)). Další postupy :

používající určité stavební oblastí odvozené od shodné sekvence všech lidských protilátek určité j podskupiny lehkých nebo těžkých řetězců. Stejná stavba může být použita pro několik různých humanizovaných protilátek (Carter et al, Proč. Nati Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992), Presta et ?

al, J. Immunol, 151:2623 (1993)). ;

Je dále důležité, že protilátky budou humanizovány se zadržením vysoké afinity pro antigen a další příznivé biologické vlastnosti. K dosažení tohoto cíle podle výhodnější metody, humani-20CZ 299702 Bó zované protilátky jsou připraveny procesem analýzy rodičovských sekvencí a různých pojmových humanizovaných produktů použitím trojrozměrných modelů rodičovských a humanizovaných sekvencí. Trojrozměrné imunoglobulinové modely jsou běžně dostupné a jsou odborníkům známé. Počítačové programy jsou dostupné, ilustrují a ukazují pravděpodobnou trojrozměrnou konformační strukturu vybrané kandidátské imunoglobulinové sekvence. Prozkoumání těchto projevů dovoluje analýzu pravděpodobné role těchto zbytků ve fungováni kandidátských imunoglobulinových sekvencí, tj. analýzu zbytků. Které ovlivňují schopnost kandidátských imunoglobulinů vázat se ke svým antigenům. Tímto způsobem, FR zbytky mohou být vybrány a spojeny z příjemce a importní sekvence, takže požadovaná protilátka charakterizovaná jako io nárůst afinity k cílovému antigenu je dosažena. Obecně zbytky hypervariabilních oblastí jsou přímo a v podstatě nejvíce zainteresované v ovlivňování vazby antigenu.

Příklad 3 níže popisuje výrobu ukázkové humanizované protilátky anti-ErbB2, která váže a blokuje aktivaci ligandem receptoru ErbB. Humanizovaná protilátka ve středu zájmu tohoto doku15 mentu blokuje EGF, TGF-α a/nebo HRG zprostředkovanou aktivaci MAPK v podstatě tak účinně, jako myší monoklonální protilátka 2C4 (nebo její Fab fragment). Humanizovaná protilátka v tomto dokumentu může např. obsahovat nelidské zbytky hypervariabilních oblastí vložených do lidské variabilní těžké domény a může dále obsahovat nahrazenou stavební oblast (FR) v pozici vybrané ze skupiny sestávající 69H, 71H a 73H využívající výčet systému variabilní domény vysvětleného v Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betheseda MD. (1991). V jediném provedení humanizovaná protilátka obsahuje FR záměny ve dvou nebo všech pozicích 69H, 71H a 73H.

Humanizovaná protilátka ve středu zájmu tohoto dokumentu obsahuje variabilní těžkou doménu komplementárně určenou zbytky GFTFTDYTMX, kde X je výhodněji D nebo S (SEQ ID NO:7), DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO:8) a/nebo NLGPSFYFDY (SEQ ID NO:9), popřípadě obsahující aminokyselinové modifikace CDR zbytků, např. kde modifikace podstatně udržují nebo zlepšují afinitu protilátky. Například varianta protilátky ve středu zájmu může mít přibližně od 1 do sedmi aminokyselinových záměn ve výše zmíněné variabilní těžké CDR sekvenci. Tako30 vé varianty protilátek můžou být připravena afinitní maturací, např. jak bude popsáno níže. Nejvýhodnější humanizovaná protilátka obsahuje aminokyselinovou sekvenci variabilní těžké domény v SEQ ID NO;4.

Humanizovaná protilátka může obsahovat zbytky komplementárně určující variabilní lehkou doménu KASQDVSIGVA (SEQ ID NO:10), SASYX1X2X3, kde XI je výhodněji R nebo L, X2 je výhodněji Y nebo E a X3 je výhodněji T nebo S (SEQ ID NO:11) a/nebo QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12), např. kromě zbytků těžkých CDR variabilních domén v předchozím odstavci. Takové humanizované protilátky popřípadě obsahují aminokyselinové modifikace výše zmíněných CDR zbytků, např. kde modifikace podstatně udržují nebo zlepšují afinitu protilátky.

Například varianta protilátky ve středu zájmu může být přibližně od jedné do sedmi nebo pěti aminokyselinových záměn ve výše zmíněné lehké CDR sekvenci. Taková protilátka může být připravena afinitní maturací, tj. jak je popsáno níže. Nejvýhodnější humanizovaná protilátka obsahuje aminokyselinovou sekvenci variabilní lehké domény SEQ ID NO:3.

45. . . . .... ' ' '

Předložená přihláška také uvažuje o afinitně vyzrálých protilátkách, které vážou ErbB2 a blokují aktivaci Iigandu receptoru ErbB. Rodičovská protilátka může být lidská protilátka nebo humanizovaná protilátka, tj. taková obsahující variabilní lehkou a/nebo těžkou sekvenci SEQ IDNO:3 nebo popřípadě 4 (tj. varianta 574). Afinitně vyzrálá protilátka se výhodněji váže k ErbB2 recep50 toru s lepší afinitou než kmyší 2C4 nebo variantě 574 (tj. přibližně dvakrát nebo čtyřikrát až lOOkrát nebo lOOOkrát zlepšená afinita, tj. jak stanoveno použitím ErbB2 extracelulámí doménu (ECD) EHS A). Příklady zbytků variabilních lehkých CDR pro úpravu zahrnují L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 nebo kombinace dvou nebo více (tj. od dvou do tří, čtyř, pěti a výš do přibližně deseti těchto zbytků).

';í í

|l

-21 CZ 299702 B6

Jsou uvažovány různé formy humanizovaných protilátek nebo afinitně vyzrálých protilátek. j

Například humanizovaná protilátka nebo afinitně vyzrálá protilátka mohou být fragmentem J protilátky jako je Fab, který je popřípadě spojen s jedním nebo více cytotoxickými činidly aby byl vytvořen imunokonjugát. Jinak humanizovaná protilátka nebo afinitně vyzrálá protilátka | mohou být intaktní protilátky, jako je intaktní IgG l protilátka, “j (iv) Lidské protilátky ’

Další alternativou humanizace mohou být tvořeny lidské protilátky. Např. je nyní možné produ- j kovat transgenní zvířata (např. myši), která jsou schopná po imunizaci produkovat všechny mož- ?

nosti lidských protilátek v nepřítomnosti endogenní imunoglobulinové produkce. Například bylo popsáno, že homozygotní delece v genu v oblasti spojení těžkého řetězce protilátky v chimérické a zárodeční linii myši je výsledkem kompletní inhibice endogenní produkce protilátek. Přenosem struktury genu imunoglobulinu lidské zárodečné linie do těchto zárodečných linií mutantní myši bude mít za následek výrobu lidských protilátek po vyvolání antigenem. Viz. např. Jakobovits et al, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993), Jakobovits etal, Nátuře, 362:255-258 (1993),

Bruggerman et al., Year Inlmmuno., 7:33 (1993) a patent US 5 591 669, US 5 589 369 a US 5 545 807.

Jinak technologie projevů fága (McCafferty et al., Nátuře, 348:552-553 (1990)) může být použita k produkcí lidských protilátek a fragmentů protilátek in vitro z možností genu pro variabilní (V) domény imunoglobulinu z neimunizovaného dárce. Podle této technologie geny domény V protilátky jsou klonovány v rámci do buď majoritního, nebo minoritního genu pro protein obalu vláknitého fága, jakým je Ml 3 nebo fd a následně se na povrchu této virové částice ukáže funkční fragment protilátky. Protože vláknitá částice obsahuje kopii jednořetězcové DNA genomu fága, selekce založená na funkčních vlastnostech protilátky bude také selekcí genu kódujícího protilátky projevující se těmito vlastnostmi. Proto tedy fág napodobuje některé vlastnosti B-buněk. Ukázání fága může být provedeno různými úpravami, pro jejich souhrn viz.

Johnson, Kevin S. a Chiswell, David J., Current Opinion in síructuralBiology 3:564-571 (1993).

Rada zdrojů segmentů V genu může být použita pro ukázání fága. Clackson et al., Nátuře 352:624-628 (1991) izoloval odlišnou strukturu anti-oxazolonových protilátek z náhodné kombinatoriální knihovny V genů může získaných ze sleziny imunizované myši. Zásoba V genů z imunizovaných lidských dárců může být sestrojena a protilátky k odlišným strukturám antigenů (zahrnujíc jejich vlastní antigeny) mohou být izolovány v podstatě následujícím technikou popsanou Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) nebo Griffith et al, EMBO J 12:725-734 (1993). Viz také patent US 5 565 332 a US 5 573 905.

Lidské anti-ErbB2 protilátky mohou být také vyrobeny in vitro aktivovanými B buňkami (viz. patent US 5 567 610 a US 5 229 275).

Lidské anti-ErbB2 protilátky jsou popsány v patentu US 5 772 997 vydaného 30. června, 1998 i a WO 97/00 271 publikovaného 3. ledna, 1,997. j (v) Bispecifické protilátky 3

;......... ..... i

Bispecifické protilátky jsou protilátky, které mají vazebné specifity pro alespoň dva různé 4 epitopy. Ukázkové bispecifické protilátky se mohou vázat ke dvěma různým epitopům proteinu ErbB2. Jiné takové protilátky mohou spojovat vazebná místa pro ErbB2 s vazebným místem pro \

EGFR, ErbB3 a/nebo ErbB4. Jinak anti-ErbB2 rameno může být spojeno s ramenem, které se j váže k aktivační molekule na leukocytu jako je receptorová molekula T-buňky (tj. CD2 nebo CD3) nebo Fc receptory pro IgG (FcyR), jako jsou FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) a FCyRIII (CDló), aby se mohlo zaměřit na mechanismus buněčné obrany před ErbB2 exprimujícími buňkami. Bispecifické protilátky mohou být použity k zabránění šíření cytotoxických činidel k buňkám, které exprimují ErbB2. Tyto protilátky mají ErbB2 vazebné rameno a rameno, které .i se váže k cytotoxickému činidlu (tj. saporin, anti-interferon-a, vinka alkaloid, ricin-A-řetězec,

-22CZ 299702 B6 methotrexát nebo radioaktivní izotop hapten. Bispecifické protilátky mohou být připraveny jako protilátky plné délky nebo fragmenty protilátek (tj. F(ab')₂ bispecifické protilátky).

WO 96/16 673 popisuje bispecifickou anti-ErbB2 /anti-FcyRIII protilátku a patent US 5 837 234 popisuje bispecifickou protilátku antíErbB2 /anti FcyRI. Bispecifická protilátka antí-ErbB2/Fca je ukázána v WO 98/02 463, Patent US 5 821 337 ukazuje bispecifickou protilátku anti-ErbB2 /anti-CD3.

Způsoby výroby bíspecifických protilátek je znám odborníkům. Tradiční produkce bispecific10 kých protilátek plné délky je založena na koexpresi dvou párů lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinu, kde tyto dva řetězce mají různou specifitu (Millstein et al., Nátuře, 305:537-539 (1983)). Kvůli náhodné směsí lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinu, tyto hybridomy (kvadromy) produkují teoreticky možnou směs 10 různých molekul protilátky, ze které má pouze jedna správnou bispecifickou strukturu. Purifikace správné molekuly, je většinou získávána pomocí afinitní chromatografie, což je metoda poměrně nešikovná a výtěžky produktu jsou nízké. Podobné postupy jsou uveřejněny ve WO 93/08 829 a v Traunecker et al., EMBO J, 10:36553659(1991).

Podle odlišného postupu jsou variabiln í domény protilátek s požadovanými vazebnými specifíci20 tami (protílátka-antigen kombinační místa) fúzovány s konstantními doménovými sekvencemi imunoglobulinu. Fúze probíhá přednostně s konstantní doménou imunoglobulinového těžkého řetězce, obsahující nejméně část pantu, CH2 a CH3 oblasti. Preferovány jsou ty případy, kdy je první konstantní oblast těžkého řetězce (CH1) obsahující místo nezbytné k vazbě lehkého řetězce přítomna alespoň v jedné z fúzí. DNA kódující fúze imunoglobulinového těžkého řetězce a, pokud se to vyžaduje, i imunoglobulinového lehkého řetězce jsou vloženy do samostatných expresních vektorů a s těmito vektory přeneseny do vhodných hostitelských organismů. Toto zajišťuje velkou flexibilitu v regulaci vzájemných podílů tří polypeptidických fragmentů v různých případech, kdy nestejné poměry tří polypeptidických řetězců používaných při konstrukci zajišťují optimální výtěžek. Je také možné vložit kódující sekvence pro dva nebo všechny tři polypeptidícké řetězce do jednoho expresního vektoru pokud je exprese nejméně dvou polypeptidických řetězců poměrově stejná a se stejně vysokým výtěžkem nebo když jsou mezi nimi jen zanedbatelné rozdíly.

V předkládané práci jsou bispecifické protilátky vytvořeny z hybridního imunoglobulinového těžkého řetězce s primární vazebnou specifitou na jednom rameni a z hybridního imunoglobulinového páru složeného z těžkého a lehkého řetězce (zajišťující sekundární vazebnou specifitu) na druhém rameni. Bylo zjištěno, že asymetrická struktura umožňuje separaci požadovaných bispecifických sloučenin z nechtěných kombinací imunoglóbulinových řetězců, tak např. přítomnost imunoglobulinového lehkého řetězce pouze v jedné části bispecifické molekuly zajišťuje jedno40 duchý způsob separace. Tato metoda je uveřejněna ve WO 94/04 690. Další informace o tvorbě bíspecifických protilátek viz. např., Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Podle jiného postupu popsaného v patent US 5 731 168, může být propojení dvojice molekul protilátky zkonstruováno tak, aby bylo maximalizováno procento heterodimerů získaných .45. . -Z rekombinantní buněčné kultury. Požadované propojení se skládá nejméně z části C_H3 domény konstantní domény protilátky. V této metodě je jeden nebo více krátkých aminokyselinových postranních řetězců z propojení první molekuly protilátky vyměněn za delší postranní řetězce (např. tyrosinu nebo tryptofanu). Na povrchu druhé molekuly se v místě propojení vytvoří nahrazením delších postranních řetězců aminokyselin kratšími (např. alaninem nebo threoninem), kompenzační „výdutě“, identické nebo podobné velikosti k rozměrům delších postranních řetězců aminokyselin na povrchu první molekuly. Toto zajišťuje mechanismus pro zvýšení výtěžku heterodimerů oproti jiným nechtěným koncovým produktům jako jsou třeba homodimery.

Bispecifické protilátky zahrnují síťované nebo „heterokonjugované“ protilátky. Například jedna z protilátek heterokonjugátu může být konjugována savidinem, jiným níže je biotin. Takové

-23CZ 299702 B6 protilátky byly např. navrženy aby cíleně označovaly buňky imunitního systému jako nechtěné (Patent US 4 676 980) a také byly navrženy pro léčbu HIV infekce (WO 91/00 360, WO 92/20 373 a EP 03 089). Heterokonjugované protilátky mohou být vyráběny pomocí jakýchkoli běžných síťovacích metod. Vhodná síťovací činidla jsou velmi dobře známa a jsou uveřejně5 na v patentu.US 4 676 980 spolu s několika síťovacími technikami.

Techniky pro přípravu bispecifických protilátek z fragmentů protilátek byly v literatuře již také popsány. Například mohou být bispecifické protilátky vyrobeny pomocí chemického síťování. Brennan et aí, Science, 229:81 (1985) popisuje postup, kde jsou intaktní protilátky proteolyticky štěpeny za vzniku F(ab')₂ fragmentů. Tyto fragmenty jsou redukovány v přítomnosti dithiol komplexotvomého činidla arzenitu sodného, stabilizující vicinální dithioly a bránící formaci disulfidu. Vzniklé Fab' fragmenty jsou pak přeměněny na trinitrobenzoát deriváty (TNB). Jeden z Fab' derivátů je pak přeměněn zpět na Fab'—thiol redukcí merkaptoethylaminem a je smíchán s ekvimolámím objemem jiného Fab' derivátu a formuje bispecifickou protilátku. Produkované bispe15 cifické protilátky mohou být použity jako činidla pro selektivní imobilizaci enzymů.

Současný pokrok usnadnil přímé získávání Fab'-SH fragmentů zE. coli, které mohou být chemicky párovány za vznik bispecifických protilátek. Shalaby et aí, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) popisují produkci plně humanizované F(ab')₂ molekuly bispecifické protilátky. Každý

Fab' fragment byl získáván odděleně z E. coli a byl dále použit k přímému chemickému párování in vitro, aby došlo k tvorbě bispecifické protilátky. Bispecifícká protilátka takto formovaná se byla schopna navázat do těch buněk, které nadprodukovaly Erb B2 receptor, a do normálních lidských T buněk a dále byla schopna spustit lytickou aktivitu lidských cytotoxických lymfocytů namířenou proti buňkám tumoru prsní žlázy.

Popsány byly i další různé techniky přípravy a izolace fragmentů bispecifických protilátek přímo z rekombinantních buněčných kultur. Například byly bispecifické protilátky získány díky leucinovým zipům. Kostelny etaí, J. Immunoí, 148 (5), 1547-1553 (1992). Peptidy obsahující leuctnové zipy z proteinů Jun a Fos byly propojeny k Fab'ěástem dvou různých protilátek pomocí genové fúze. Homodimery protilátky byly redukovány v pantové oblasti a vytvořily monomery, pak byly znovu oxidovány, aby z nich vznikly heterodimery. Tato metoda může být použita i k produkci homodimerů protilátek. Bivalentní technologie popsaná v Hollinger et aí, Proč. Natí Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) zajistila alternativní mechanismus tvorby fragmentů bispecifíckých protilátek. Fragmenty obsahují variabilní doménu (Vh) těžkého řetězce spojenou s variabilní doménou (V_L) lehkého řetězce spojením, které je tak krátké, že nedovoluje, aby se párovaly dvě domény na témže řetězci. A dále, V_H a V_L domény jednoho fragmentu jsou nuceny ktomu, aby se přednostně párovaly s komplementárními V_H a V_L doménami jiného fragmentu, atak formovaly dvě antigen vazebná místa. Uvedena byla i jiná metoda tvorby fragmentů bispecifických protilátek, využívající dimerů jednoduchých řetězců Fv (sFv). Viz Gruber et aí,

J. Immunoí, 152:5368 (1994).

Uvažuje se i o protilátkách s více než dvěmi vazebnými místy. Například mohou být připraveny tri specifické protilátky. Tutt et aí, J. Immunoí, 147:60 (1991).

(vii) Jiné modifikace v sekvencích aminokyselin

Zvažovány jsou modifikace v sekvenci aminokyselin u zde popsaných anti-Erb B2 protilátek. Například může být požadováno zdokonalení jejich vazebné afinity a/nebo jiné biologické vlastnosti protilátky. Varianty aminokyselinové sekvence anti-Erb B2 protilátky jsou připravovány vložením vhodných nukleotidových změn do nukleové kyseliny anti-Erb B2 protilátky nebo peptidovou syntézou. Takové modifikace zahrnují například delece a/nebo inserce a/nebo substituce zbytků v aminokyselinové sekvenci anti-Erb B2 protilátky. Jakákoli kombinace delece, inserce a substituce je vytvořena tak, aby dospěla do finálního konstruktu a zajišťuje to, že finální konstrukt obsahuje všechny požadované charakteristiky. Aminokyselinové změny mohou také

-24CZ 299702 B6 pozměnit posttranslační procesy anti-Erb B2 protilátky, jako třeba změnu v počtu glykózylovaných míst.

Užitečná metoda pro identifikaci konkrétních zbytků nebo oblastí anti-Erb B2 protilátky, které jsou preferovaná místa pro mutagenezi, se nazývá „alaninová prohledávací mutageneze“ popsaná vCunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Zde jsou zbytek nebo skupina požadovaných zbytků (např. zbytky od Arg, Asp, His, Glu) identifikovány a vyměněny neutrálními nebo negativně nabitými aminokyselinami (nejlépe alaninem či polyalaninem), aby došlo k ovlivnění vzájemné interakce aminokyselin s Erb B2 antigenem. Tato aminokyselinová místa io vykazující funkční citlivost k substitucím jsou pak vylepšena vložením dalších variant. Takže zatímco místo pro vložení aminokyselinové sekvenční varianty je předem určeno, povaha mutací samo sebou nemusí být předem určena. Například pro analýzu výskytu mutace v daném místě je alaninové skenování nebo náhodná mutageneze naváděna k cílovému kodonu nebo regionu a exprimované varianty anti-Erb B2 protilátky na obrazovce vykazuj požadovanou aktivitu.

.

Inserce do aminokyselinové sekvence zahrnují amino- a/nebo karboxyl-terminální fúzi pohybující se v délce od jednoho zbytku až po polypeptid obsahující stovky či více aminokyselinových zbytků, dále také intrasekvenční inserce jednoduchého nebo vícenásobného aminokyselinového zbytku. Příklady koncové inserce zahrnují inserci anti-Erb B2 protilátky na N-terminální methio20 nyl zbytek nebo na protilátku fúzovanou s cytotoxickým polypeptidem. Jiné inserění varianty molekuly anti-Erb B2 protilátky zahrnují fúzi N- a C-konce anti-Erb B2 protilátky na enzym (např. na ADEPT) nebo polypeptid který zvyšuje poločas rozpadu protilátky v séru.

Jiným typem varianty je aminokyselinová substituční varianta. Tyto varianty mají nejméně jeden aminokyselinový zbytek v molekule anti-Erb B2 protilátky nahrazený jiným zbytkem. Místa největšího zájmu pro substituční mutagenezi zahrnují hypervariabilní oblasti, ovšem zvažovány jsou také FR změny. Klasické substituce jsou uvedeny ve sloupci „preferované substituce“ v tabulce 1. Pokud takové substituce způsobí i změnu v biologické aktivitě, pak mohou být vloženy více podstatné změny, nazvané „exemplární substituce“ v tabulce 1 nebo níže v odkazech popsané třídy aminokyselin a pak sledovány produkty.

Tabulka 1

Původní zbytek		Ukázkové substituce	Preferované substituce.
A)a(Á)	val; leu; ile	val
Aíg(R)	lys;,gln; asn		jýs
Asn (N)	gin; his; asp, lýs; arg	gin
Ašp(D)	glu; asn		glu
Cýs(C)	sér, ala	ser
Gln(Q)	asn; glu	asn
:gíu(é)	a$p;gln		asp - - ......
Gly(G)	ala	ala
HisíH)	asn; gin; lys; arg	arg.
’Μύ	leu; val··, nwv, ála; phe; noríeucme	leu
Leu(L)	norleucine; ile; vál; met; ala; phe	ile
Lys(K)	.arg;’gin; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe(F)	leu;: val; ile; ála; týr	tyr ;

-25CZ 299702 B6

Výrazné modifikace biologických vlastností protilátky jsou spojené s výběrem substitucí, které se výrazně liší ve svém účinku na udržování (a) struktury základní kostry polypeptidického řetězce v oblasti substituce např. konformaei helixu či skládacího listu, (á) náboje nebo hydrofobicity molekuly na cílovém místě, (c) velikosti postranního řetězce. Přirozeně se vyskytující zbytky jsou rozděleny do skupin založených na obecných vlastnostech postranního řetězce:

(1) hydrofobní: norieucin, met, ala, val, leu, ile;

(2) neutrální hydrofilní: cys, ser, thr;

(3) kyselé; asp, glu;

(4) bazické: asn, gin, his, lys, arg;

(5) zbytky, které ovlivňují orientaci řetězce: gly, pro; a (6) aromatické: trp, tyr, phe.

Méně klasické substituce s sebou nesou změny v těchto třídách, přeřazování z jedné do druhé.

Jakýkoliv cysteinový zbytek, který se podílí na udržování správné konformace anti-Erb B2 protilátky, může být také substituován, většinou serinem, aby se zlepšila oxidační stabilita molekul a předešlo se zbytečnému nesprávnému párování. A obráceně mohou být cystěinové vazby přidány k protilátce pro zvýšení její stability (zejména tam, kde je protilátka pouze fragmentem např. Fv fragmentem).

Obzvláště požadovaným typem substitučních variant jsou ty, které jsou substituovány jedním nebo více zbytky hypervariabilní oblasti rodičovské protilátky (např. humanizovaná nebo lidská protilátka). Obecně pak mají varianty vybrané pro další zlepšování vylepšené biologické vlastnosti relativně vzhledem k rodičovské protilátce, od které byly odvozeny. Pohodlná metoda tvor25 by těchto substitučních variant zahrnuje afinitní maturaci využívající fágového působení. Několik míst hypervariabilní oblasti (např. místa 6-7) jsou mutována tak, aby byly vytvořeny všechny možné amino substituce v každém místě. Takto získané varianty protilátky se projeví monovalentním chováním, lišící se od fágových filamentámích partikulí tím, že jsou to fúze ke gen III produktu M13 fága, zabalené ve fágových partikulí. Fágově se projevující varianty jsou pak testovány na jejich biologickou aktivitu (např. vazebnou aktivitu) jak zde bylo popsáno. V souladu s identifikací možných míst pro modifikaci v hypervariabilní oblasti může být provedena alanin skenovací mutageneze, aby byly identifikovaly zbytky hypervariabilní oblasti, výrazně přispívající k vazbě protilátky. Alternativně nebo i navíc může být výhodné analyzovat krystalovou strukturu komplexu protilátka-protilátka, aby se identifikovala kontaktní místa mezi protilát35 kou a lidským Erb B2. Tyto kontaktní a okolní zbytky jsou kandidáty na substituci, jak zde bylo v technikách podrobně popsáno. Pokud jsou jednou tyto varianty vytvořeny, skupina variant se stává předmětem pozorování, jak zde bylo popsáno, a protilátky s lepšími vlastnostmi v jednom či více relevantních testech mohou být vybrány pro další vylepšování.

Jiný typ aminokyselinové varianty protilátky mění původní glykosylační vzorec protilátky. Změnou je míněna delece jedné nebo více karbohydrátových složek protilátky a/nebo adice jednoho či více glykosylačních míst, které nejsou na protilátce přítomny.

Glykosylace protilátek je typicky buď N-, nebo O- glykosylace. N-glykosylace je zprostředko45 vána vazbou karbohydrátové složky na postranní řetězec asparaginového zbytku. Tripeptidické sekvence asparagin-X-serin a asparagin-X-threonin, kde X je jakákoli aminokyselina kromě prolinu, jsou rozpoznávací sekvence pro enzymatickou vazbu karbohydrátové složky na postranní řetězec asparaginového zbytku. Proto přítomnost obou těchto tripeptidových sekvencí v polypeptidu vytváří potencionální glykosylační místo.

O-glykosylace je zprostředkována vazbou jednoho z cukrů N- acetylgalaktosaminu, galaktózy nebo xylózy na hydroxyaminovou kyselinu, většinou serin nebo threonin, použit může být i 5-hydroxyproIin nebo 5-hydroxy lysin.

-26CZ 299702 B6

Adice glykosylačních míst na protilátku je pohodlně uskutečněna změnou aminokyselinové sek- j vence tak, že obsahuje jednu nebo více tripeptidických sekvencí, jak bylo popsáno výše pro Nglykosylaci. Tato změna může být provedena díky adici nebo substituci jednoho či více serino. ,5_ . vých..čt threoninových zbytků na původní protilátku(platí pro O-glykosylaci). , - . - · í

Molekuly nukleových kyselin kódující aminokyselinové sekvence variant anti-Erb B2 protilátky jsou připravovány řadou poměrně známých technik. Tyto techniky zahrnují, ale nejsou zde j vyjmenovány zdaleka všechny, izolaci z přírodního materiálu (v případě přirozeně se objevují- 1 cích aminokyselinových sekvenčních variant) nebo přípravu pomocí mutageneze, zprostředkované oligonukleotidem, PCR nebo kazetové mutageneze dříve připravované varianty nebo nevariantí verzi anti-Erb B2 protilátky.

Může být požadováno, aby byla protilátka tohoto vynálezu modifikována s ohledem na její úči15 nek, např. aby byla podpořena antigen závislá, buňkami zprostředkovaná, cytotoxicita (ADCC) a/nebo na komplementu závislá cytotoxicita (CDC) prolátky. Toho může být dosaženo vložením jedné nebo více aminokyselinových substitucí do Fc oblasti, a tak je umožněna tvorba meziřetězcových disulfidických vazeb v této oblasti. Takto vytvořená homodimerická protilátka může zlepšovat internalizační schopností a/nebo zvyšovat komplementem zprostředkovaný buněčný killing a antigen závislou buněčnou cytotoxicitu (ADCC). Viz Caron et aí, J. Exp, Med.

176:1191-1995 (1992) a Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Homodimerické protilátky se zlepšenou antitumorovou aktivitou mohou být připraveny za použití heterobifunkčního síťovadla, jak bylo popsáno v Wolff et aí, Cancer Research 53:256.0-2565 (1993). Alternativně může být vytvořena protilátka obsahující dvojmo Fc oblasti a může tak zlepšovat komplemen25 tovou lysi a ADCC schopnosti. Viz Stevenson et aí, Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Pro zvýšení životnosti protilátky v séru lze inkorporovat náhradní receptor-vazebné epitopy na protilátku (zvláště na fragment protilátky), jak je například popsáno v patentu US 5 739 277.

Termínem „náhradní receptor-vazebný epitop“, jaký zde byl použit, je nazván epitop Fc oblasti na IgG molekule (např. IgGi, IgG₂, IgGj nebo IgGi), který je zodpovědný za zvýšení životnosti IgG molekul.

(viii) Vyhodnocování protilátek s požadovanými vlastnostmi

Techniky pro tvorbu protilátek byly popsány výše. Tak se mohou dále selektovat protilátky s požadovanými biologickými vlastnostmi. * i

Aby byla identifikována protilátka,-která blokuje aktivaci ligandu Erb B receptoru, muší se nej- 1 dříve určit schopnost protilátky blokovat Erb B ligand, vázající se k buňkám exprimující Erb B | receptor (např. v konjugaci s jiným Erb B receptorem, s kterým sledovaný Erb B receptor tvoří j

Erb B hetero-oligomer). Například buňky přirozeně exprimující (nebo po transfekci exprimující)

Erb B receptory .Erb B hetero-oligomerů mohou být inkubovány s protilátkami a pak vystaveny Erb B ligandům uchyceným na nosiči. Pak může být vyhodnocena schopnost anti-Erb B . protilátky blokovat ligand vázající se k Erb B receptoru Erb B hetero-oligomerů.

Například inhibice HRG vázající se k MCF7 buňkám tumoru prsu pomocí anti-Erb B protilátek může být provedeno za použití jednovrstevných MCF7 buněčných kultur na ledu na v podstatě 3 dobře zaočkovaných miskách, jak je popsáno níže v příkladu 1. Anti-Erb B monoklonální í protilátky se přidají do každé misky a jsou inkubovány 30 min. Pak je přidán ^l25I-značený rHRGpl 177-224 (25 pm) a inkubace pokračuje dalších 4 až 16 hodin. Vytvořeny tak mohou být j křivky odpovědí na dávku a může se spočítat hodnota IC₅o pro danou protilátku. V jednom provedení bude mít protilátka blokující aktivaci ligandu Erb receptoru hodnotu Ic₅o pro inhibici HRG vážící se k MČF buňkám tohoto testu hodnotu 50 nebo méně nM, nejlépe hodnoty 10 či j méně nM. Tam, kde je protilátkou fragment protilátky, jako třeba Fab fragment, může být hod- ¹

-27CZ 299702 B6 nota Ic₅₀ pro inhibici HRG vážící se k MCF buňkám tohoto testu například 100 a méně nM, více j vyhovující jsou hodnoty 50 nM a méně. j

Alternativně nebo navíc může být odhadnuta schopnost anti-Erb B2 protilátek blokovat Erb B 1

5. ligand stimulovaný tyrosinovou fosforylací Erb B receptorů přítomného v Erb B hetero-oligomeru. Tak například buňky, endogenně exprimujíeí Erb B receptory, nebo buňky, které schopnost exprese získaly transfekcí, jsou ínkubovány s protilátkou a pak testovány na Erb B ligand depen- '1 dentní tyrosin fosforylační aktivitu za pomoci anti-fosfotyrosin monoklonálních protilátek (které $ jsou vhodně napojeny na zjistitelnou značku). Zkouška aktivace kinázového receptorů popsaná v patentu US 5 766 863 je také dostupná pro zjištění aktivace Erb B receptorů a blokování této aktivity protilátkou.

V jednom provedení může je hledána protilátka, která inhibuje HRG stimulaci p 180 tyrosinové fosforylace v MCF7 buňkách v podstatě tak, jak bude popsáno níže v příkladu 1. Například mohou být MCF7 buňky kultivovány na 24 dobře zaoěkovaných miskách a ke každé misce mohou být přidány monoklonální protilátky Erb B2 a inkubovány 30 min při pokojové teplotě; potom může být přidán na každou misku rHRGpl 177-224 do finální koncentrace 0,2 nM a inkubace může pokračovat dalších 8 min. Médium je pak z každé misky vysáto a reakce je zastavena přidáním 100 μΐ SDS testovacího pufru (5% SDS, 25 mM DTT, 25 mM Tris-HCl, pH6,8).

Každý vzorek (25 μΐ) je analyzován pomocí elektroforézy na 4 až 12% gradientovém gelu (Novex) a pak elektroforeticky přenesen na difluorid polyvinylidenovou membránu. Antifosfotyrosinové bloty (lpg/ml) se nechají vyvíjet a pak je kvantifikována intenzita predominantního reaktivního pásu v oblasti M_r 180 000 pomocí reflektantní denzitometrie. Vybraná protilátka bude podle očekávání výrazně inhibovat HRG stimulaci pl 80 tyrosin fosforylace na asi 0 až

35 % kontrolního vzorku. Křivka odpovědi na dávku pro inhibici HRG stimulace pl80 tyrosin fosforylace je určena také pomocí reflektantní denzitometrie, a tak spočítána hodnota IC50 dané protilátky. V jednom provedení má protilátka, která blokuje ligandovou aktivaci Erb B receptorů,

IC50 hodnotu pro HRG stimulaci pl80 tyrosin fosforylace v tomto testu asi 50 nM či méně nebo nejlépe 10 nM čí méně. Tam, kde je protilátkou fragment, jako třeba Fab fragment, je hodnota

IC50 pro HRG stimulaci pl 80 tyrosin fosforylace např. 100 nM ci méně, nejlépe 50 nM ěi méně.

Také se dají odhadnout růstové inhibiční efekty protilátky na MDA-MB-175 buňky, např. popsané v Schafer et al._} Oncogene 15:1385-1394 (1997). Podle tohoto testuje na MDA-MB-175 buňky působeno anti-Erb B2 monoklonální protilátkou (10 μg/ml) po 4 dny a barveny jsou krystal violetí. Inkubace s anti-Erb B2 monoklonální protilátkou ukáže růstový inhibiční efekt na tuto buněčnou linii podobný efektu účinku monoklonální protilátky 2C4. Exogenní HRG z dalšího příkladu neobrací výrazně tuto inhibici. Požaduje se, aby byla protilátka schopna inhibovat buněčnou proliferaci MDA-MB-175 buněk ještě ve větší míře než monoklonální protilátka 4D5 ·* (a ještě tepe ve větší míře než monoklonální protilátka 7F3), v obou případech za přítomnosti i _ř nepřítomnosti exogenního HRG. ''

V jednom případu může anti-Erb B2 monoklonální protilátka blokovat heregulin-dcpendentní s asociaci Erb B2 s Erb3 v MCF7 i SK-BR-3 buňkách, jak bylo prokázáno v koimunoprecipitačních pokusech např. v příkladu 2, podstatně účinněji než monoklonální protilátka 4D5 a ještě ·

45- -podstatněji účinněji než monoklonální protilátka 7F3. Pro identifikaci růstových inhibicních anti-Erb B2 protilátek jsou vybrány protilátky, které inhibují růst rakovinných buněk produkujících ve velké míře Erb B2. V jednom příkladu je vybraná růstová inhibiční protilátka schopna inhibovat růst SK-BR-3 buněk v buněčné kultuře o 20 až

100 %, požadováno je 5 až 100 % při koncentraci protilátky asi 0,5 až 30 μβ/ιηΐ. K identifikaci takovýchto protilátek je proveden test s SK-BR-3 buňkami popsaný v patentu US 5 677 171.

Podle tohoto testu jsou SK-BR-3 buňky pěstovány v poměru 1 : 1 směsi s F12 a DMEM médiem obohaceným o 10% fetální bovinní sérum, glutamin a penicilín streptomycin. 20 000 SK-BR-3 buněk bylo kultivováno na 35mm kultivačních miskách (2ml/35mm miska). Na každou z misek

-28CZ 299702 B6 bylo přidáno 0,5 až 30 pg/ml anti-Erb B2 protilátky. Po šesti dnech byl počet ošetřených a neošetřených buněk přepočítán na elektronickém COULTER™ počitadle. Ty protilátky, které inhibují růst SK-BR-3 buněk o 20 až 100 % nebo 50 až 100 % byly selektovány jako růstové inhibiční protilátky.

•5 ...

Protilátky, které indukují buněčnou smrt, ztrátu membránové integrity indikovanou např. Pí, absorpcí ttypanové modři či 7AAD, mohou být selektovány odhadem relativně vůči kontrole. Požadovaný test je test absorpce PI využívající BT474 buňky. Podle tohoto testu jsou BT474 buňky (které byly získány v American Type Culture Collection (Rockville, MD) kultivovány na io Dulbecco modifikovaném eagle médiu (D-MEM):Ham's F—12 (50:50) obohaceném o 10% teplem-inaktivovaný FBS (Hyclone) a 2 mM L-glutamin. (Tato zkouška je prováděna v nepřítomnosti komplementu a imunitních efektorových buněk). BT474 buňky jsou vysety v hustotě 3xl0⁶ na misku o rozměrech 100 x 20 mm a přes noc nechány růst. Médium je pak vyměněno za samotné čerstvé médium nebo médium obsahující 10 pg/rnl příslušné protilátky. Buňky jsou pak kulti15 vovány 3 dny. Podle tohoto provedení jsou jednovrstevné membrány vymyty PBS a odděleny trypsinizací. Buňky jsou pak 5 min centr i fugo vány (1200 rpm, 4 °C), pelet resuspehdován ve 3 ml ledového Ca²⁺ vazebného pufru (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCI₂) rozdělen do 35 mm zkumavek s proděravělými uzávěry (l ml na zkumavku, 3 zkumavky na skupinu), aby došlo k oddělení buněčných sraženin. Do zkumavek je pak přidán ΡΪ (10 pg/ml).

Vzorky jsou analyzovány za pomoci FACSCAN™ průtokového cytometru a FACSCONVERT™ CellQuest softwaru (Becton Dickinson). Protilátky, které indukují statisticky významnou hladinu buněčné smrti určené pomocí PI absorpce mohou být selektovány jako buněčné smrt indukující protilátky.

Pro selekci protilátek indukující apoptosu je dostupný anexin vazebný test využívající BT474 buňky. BT474 buňky jsou kultivovány a vysévány na misky stejně jako bylo popsáno v předchozím odstavci. Médium pak bylo vyměněno za samotné čerstvé médium nebo médium obsahující 10pg/ml příslušné protilátky. Během třídenní inkubační doby byly jednovrstevné membrány vymyty PBS a odděleny trypsinizací. Buňky pak byly 5 min centrifugovány, resuspendovány ledovém Ca²⁺ vazebného pufru a rozděleny do zkumavek tak, jak bylo popsáno výše v případě testu na buněčnou smrt, Do zkumavek pak byl přidán označený anexin (např. anexin-V-FTIC) (1 pg/ml). Vzorky byly analyzovány za pomoci FACSCAN™ průtokového cytometru a FACSCONVERT™ CellQuest softwaru (Becton Dickinson). Protilátky, které indukují statisticky významnou hladinu vazby anexinu vzhledem ke kontrole jsou selektovány jako apoptosu

-indukující protilátky.

Vedle anexin vazebného testu je dostupný ještě DNA barvicí test, využívající BT474 buňky. Podle tohoto testu jsou BT474 buňky ošetřeny danou protilátkou popsanou v předchozích dvou paragrafech a inkubovány 2 h s 9 pg/ml HOECHST 33342™ v 37 °C a pak analyzovány na EPICSELITE™ průtokovém cytometru (Coulter Corporation) používající MODFÍT LT™ software (Verity Software Hause). Protilátky, které indukují změnu v procentu apoptických buněk, který je dvou či vícenásobný (nejlépe 3 a vícenásobný) než u buněk takto neošetřených (až 100 % apoptických buněk) mohou být selektovány jako pro-apoptotícké protilátky tohoto pokusu.

'

Pro odlišení protilátek, které se váží na epitop na Erb B2 vazbu se provádí rutinní křížení— blokující test, popsaný v Antibodies, A laboratory Mamtal, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lané (1988). Navíc nebo alternativně mohou být k mapování epitopu použity metody zmíněné v technikách (viz., např. obr. 1A a 1B).

(ix.) Imunokonjugáty

Vynález se také týká imunokonjugátů obsahující protilátku konjugovanou s cytotoxickým činidlem jako je chemoterapeutické činidlo, toxin (např. malá molekula toxinu nebo enzymaticky

-29CZ 299702 B6 aktivního bakteriálního, houbového, rostlinného nebo živočišného původu, včetně jejich fragmentů a/nebo variant) nebo radioizotop (např. radiokonjugát).

Chemoterapeutická činidla, potřebná při výrobě imunokonjugátů byla popsána výše. Konjugáty . protilátky s jednou nebo více· malým i molekulami toxinů, jako je kalicheamici, maytansin· (Patent US 5 208 020), trichoetheri a zvažován je i Cl 065.

V jednom provedení vynálezu je protilátka konjugována k jedné nebo více molekulám maytansinu (např. cca od 1 do 10 maytansinových molekul na molekulu protilátky). Maytansin může být io např. přeměněn na May-SS-Me, který muže být redukován na May-SH3 a znovu reaguje s modifikovanou protilátkou (Chari et al, Cancer Research 52: 127-131 (1992) pro tvorbu imunokonjugátu maytansinoid-protilátka.

Jiný požadovaný imunokonjugát obsahuje anti-Erb B2 protilátku konjugovanou s jednou nebo více kalicheamicinových molekul. Rodina kalicheamcinových antibiotik je schopna tvořit dvouřetězcóvé zlomy v subpikomolárních koncentracích. Strukturní analogy kaltcheamicinu, které mohou být také použity, zahrnují γ,¹, α2^ι, α3’ N-acetyl-γΛ PSAG a Θ¹] (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) a Lodě et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)). Viz také zde v odkazech předložené patenty US 5 714 586; 5 712 374; 5 264 586 a 5 773 001.

Enzymaticky aktivní toxiny a jejich fragmenty, které mohou být použity, zahrnují diptheriální A řetězec, nevazebné aktivní fragmenty diptheriálního toxinu, exotoxinový A řetězec (z Pseudomonas aeruginosa), ricínový A řetězec, abrinový A řetězec, modeccinový A řetězec, alfa-sarcin, proteiny zAleurites fordii, dianthinové proteiny, proteiny (PAPI, PAPII a PAP-S), momordica charantia inhibotorcurcin, crotin, sapaonaria officinatis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, fenomycin, enomycin a tricotheceny. Viz např. WO 93/21 232 publikovaný 28. října 1993.

Tento vynález dále uvažuje o imunokonjugátu vytvořeném z protilátky a sloučeniny s nukleolytickou aktivitou (např. ribonukleázy nebo DNA endonukleázy jako je deoxyribonukleáza;

Dnáza).

Pro produkci radiokonjugovaných anti-Erb B2 protilátek je dostupná řada radioaktivních izotopů. Příklady zahrnují At²¹¹,1¹³¹,1¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re^t88, Srn¹⁵³, Bi²¹², P³² a radioaktivní izotopy Lu.

Konjugáty protilátky a cytotoxického činidla mohou být produkovány pomocí řady bifunkčních činidel párujících proteiny, jako je N-sukcinimidyl-3-(2-pyridy ldithiol) propionát (SPDP), sukcinimidyl-4_(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylát, iminothiolan (IT), bifunkční deriváty imidoesterů (jako je dimethyl adipimidát HCL), aktivní estery (jako je disukcinimidyl suberát), aldehydy (jako je glutaraldehyd), bis-azido sloučeniny (jako bis (p-azidobenzoyl)40 hexanediamin), bis-diazonium deriváty (jako bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamin), diisokyanáty (jako tolyen 2,6-diisokyanát) a bis—aktivní fluorové sloučeniny (jako je 1,5—difluoro—

2,4-dinitrobenzen). Například ricinový imunotoxin může být připraven podle návodu v Vietta et aí, Science 238: 1098 (1987). Uhlíkem-14 značená l-isothiokyanotobenzyl-3-methyldiethylentriaminepentaoctová kyselina (MX-DTPA) je příkladné chelatační činidlo pro konjuga45.. _.ci radionukleotidu na protilátku. Viz WO 94/11026. Linker je „štěpitelný“ a usnadňuje uvolnění' cytotoxického jedu do buňky. Může to například být linker labilní v kyselém prostředí, linker senzitivní kpeptidázám, dimethyl linker nebo linker obsahující disulfid (Chari et aí, Cancer Resesach 52: 127-131 (1992)).

Alternativně ktomu může být vytvořen fúzovaný protein obsahující anti-Erb B2 protilátku a cytotoxické činidlo, např. rekombinantními technikami nebo peptidovou syntézou. ^V

V dalším případě může být protilátka konjugována k „receptoru“ (jako streptavidin) a použita při zaměřování tumorových buněk, kdy je konjugát protilátka-receptor podáván pacientovi, což má

-30CZ 299702 B6

J za následek oddělení vyvázaného konjugátu z oběhu za pomoci čistícího činidla a pak je podán j „ligand“ (např. avidin), který je konjugován na cytotoxické činidlo (např. radionukleotid). 4 (x.) Na protilátkách závislá a enzymem zprostředkovaná terapie (ADEPT) ' ' '

Protilátky předkládaného vynálezu mohou byl použity při ADEPT terapii konjugací protilátky na ’ enzym aktivující prolék, který mění prolék (např. peptidy 1 chemoterapeutické činidlo, viz '

WO 81/01 145) na aktivní lék proti rakovině. Viz např. WO 88/07 378 a patent US 4 975 278.

to Enzymový komponenta imunokonjugátu užívaná v ADEPT terapii zahrnuje jakýkoli enzym schopný účinkovat na prolék takovým způsobem, že ho přeměňuje na jeho aktivní cytotoxickou formu.

Enzymy, které jsou používané v této metodě zahrnují, ale nejsou jimi limitovány, alkalin fosfatá15 zu používanou pro přeměnu proléku obsahující fosfát na volný lék; arylsulfatáza používaná pro přeměnu proléku obsahující sulfát na volný lék; cytosin deaminázu používanou pro přeměnu netoxického 5-fluorcytosinu na lék proti rakovině, 5-fluoruracil; proteázy, jako serratia proteáza, thermolysin, subtilísin, karboxypeptidázý a kathepsiny (jako je kathepsín B a L), které se používají pro přeměnu proléku obsahující peptid na volný lék; D-alanyl karboxypeptidázý, používané pro přeměnu proléku obsahující D-aminokyselinových substituentů na volný lék; enzymy štěpící karbohydráty, jako je β-galaktosidáza a neuraminidáza, používané pro přeměnu glykosylovaného proléku na volný lék; β-laktamáza používaná pro přeměnu proléku odvozených od β-laktamů na volné léky; a penicilinové amidázy, jako je penicilín V amidáza nebo penicilín G amidáza, používané pro přeměnu léků odvozených od substituentů jejich dusíku z aminoskupiny za fenoxy25 acetylované nebo fenylacetylové skupiny na volné léky. Alternativně mohou být protilátky s enzymatickou aktivitou, známé také jako „abzymy“, používány na přeměnu proléku vynálezu na volné aktivní léky (viz např. Massey, Nátuře 328: 457—458 (1987)). Konjugáty protilátkaabzym mohou být připraveny tak, jak zde bylo popsáno v případě dodání abzymu k populaci tumorových buněk.

Enzymy tohoto vynálezu se mohou kovalentně vázat na anti-Erb B2 protilátky díky dobře známým technikám v této oblasti, jako je užití heterobifunkčních síťovacích činidel probíraných výše. Alternativně mohou být konstruovány fúzované proteiny obsahující nejméně vazebnou část antigenu tohoto vynálezu napojenou na přinejmenším funkčně aktivní část enzymu vynálezu, za pomoci dobře známých technik v této oblasti využívající rekombinantní DNA (viz. např.

Neuberg et ctí, Nátuře, 312:604-608 (1984).

(xi) Jiné modifikace protilátek

Zvažovány jsou zde i další možné modifikace protilátek. Například může být protilátka připojena na jeden z řady neproteinových polymerů, např. polyethylen glykol, polypropylen glykol, polyxyalkyteny nebo kopolymeiy polyethylen glykolu a polypropylen glykolu. Protilátky mohou být uzavřeny do mikrokapslí připravených např. koacervačními technikami nebo interfaciální polymerací (např. hydroxymethylcelulosové nebo želatinové mikrokapsle Či poly-methylmethacylá.45. .tové mikrokapsle), do koloidních transportních systémů léků'(např. do liposomů, albuminových mikrokuliček, mikroemulzí, nanopartikulí a nanokapslí) nebo mohou být uzavřeny do makroemulzí. Takovéto techniky jsou popsány v Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th edition,

Oslo, A., Ed., (1980).

•i

Anti-Erb B2 protilátky zde popsané mohou být vytvářeny i jako imunoliposomy. Liposomy <

obsahující protilátku jsou připraveny metodami známými v této oblasti, např. popsané v Epsteín et al, Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA,

77:4030 (1980); US č. 4 485 045 a US 4 544 545; a WO 97/38731 publikovaný 23. října 1997.

Liposomy se zlepšeným oběhovým časem jsou popsány v patentu US 5 013 556.

Částečně mohou být používané liposomy vyráběny metodou reverzní fázové evaporace za pomoci 1 ipidické sloučeniny obsahující fosfatidylcholin, cholesterol a fosfatidylethanolamin odvozený od PEG (PEG-PE). Liposomy jsou převedeny přes filtry definované porové velikosti, aby byly získány pouze liposomy s požadovanými parametry. Fab' fragmenty protilátky předkládaného . .. .5 . vynálezu jsou připojeny k liposomům popsaných v Martin et al; J. Biol; Chem. 257:286-288 (192) díky disulfidické výměnné reakci. Chemoterapeutické činidlo je vhodným způsobem vloženo do liposomu. Viz Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

III. Vektory, hostitelské buňky a rekombinantní metody

Vynález také zajišťuje izolovanou nukleovou kyselinu kódující humanizovanou anti-Erb B2 protilátku, vektory a hostitelské buňky obsahující rekombinantní nukleovou kyselinu a rekombinantní techniky zajišťující produkci protilátky.

Při rekombinantní produkci protilátky je kódující nukleová kyselina izolována a vložena do replikujícího se vektoru k dalšímu klonování (amplifikací DNA) a expresi. DNA kódující monoklonální protilátku je izolována a klasickými metodami sekvenována (např. pomocí oligonukleotidových sond, které jsou schopné navázat se specificky na geny kódující těžký a lehký řetězec protilátky). Vektorů je dostupných velké množství. Vektory musí obsahovat nejméně tyto (a navíc možno i další) komponenty: signální sekvenci, počátek replikace, jeden či více markerových genů, enhancer, promotor a transkripění terminátor.

(i) Signální sekvence

Anti-Erb B2 protilátka daného vynálezu není produkována pouze přímo pomocí rekombinantní DNA, ale i za pomoci fúzovaného polypeptidu s heterologním polypeptidem, který j,e signální sekvencí, nebo pomocí jiného polypeptidu, který má specifické místo štěpení na N-konci maturovaného proteinu nebo polypeptidu. Heterologní signální sekvence, která je vybírána přednostně, je rozpoznávána a zpracovávána (např. štěpena signální peptidázou) hostitelskou buňkou. Pro prokaryotickou hostitelskou buňku, která přirozenou signální sekvenci anti-Erb B2 protilátky nepoznává a ani nezpracovává, je signální sekvence vyměněna za vybranou prokaryotní signální sekvenci, např. ze skupiny bazických fosfatáz, penicilináz, Ipp nebo termostabilních vedoucích peptidů z enterotoxinu II. U kvasinek může být přirozený signál vyměněn za např. vedoucí peptid kvasinkové invertázy, vedoucí peptid a faktoru (včetně vedoucích peptidů a faktorů Saccharo35 myces a Kluyveromyces) nebo vedoucí peptid kyselé fosfatázy, vedoucí peptid glukoamylázy C.albicans nebo signální peptid popsaný v WO 90/13 646. U exprese savčích buněk jsou dostupné savčí signální sekvence, stejně jako virové sekreční vedoucí peptidy, např. signální peptid herpes simplex gD, '

DNA takovéto prekurzorové oblasti je ligována ve stejném čtecím rámci jako má DNA anti-Erb B2 protilátka.

(ii) Počátek replikace . ..-45.. -Jak expresní, tak klonovací vektory obsahují sekvenci nukleové kyseliny, která umožňuje vektoru, aby se mohly v jedné nebo více hostitelských buňkách replikovat. Obecně je v klonovacích vektorech tato sekvence pouze jedna a pomáhá vektoru replikovat se nezávisle na chromozomální DNA. Zahrnuje replikační počátky nebo autonomně se replikující sekvence. Tyto sekvence jsou známé u řady bakterií, kvasinek a virů. Počátek replikace u plazmidu pBR322 je vhodný pro většinu gramnegativních bakterií, replikační počátek 2 μ plazmidu je vhodný pro kvasinky a různé virové replikační počátky (z SV40, polyomaviru, adenoviru, VSV nebo BPV) se používají pro klonovací vektory u savčích buněk. Obecně replikační počátek není důležitý u expresních savčích vektorů (používán je vždy jen SV40 počátek, protože obsahuje časný promotor).

(iii) Selekční gen

-32CZ 299702 B6

Expresní a ktonovací vektory obsahují selekční gen, také nazývaný selekční markér. Typické selekční geny kódují proteiny, které: (a) udělují rezistenci k antibiotikům nebo jiným toxinům, např. ampicilinu, neomycinu, methotrexátu nebo tetracyklinu, (b) komplementují auxotrofní deficience nebo (c) pomáhají dodávat limitační živiny nedostupné v komplexním médiu, např. gen . kódující D-alanin racemázu pro Bacily. ..... .....

Jeden z příkladů selekce využívá sloučeninu, která zastavuje růst hostitelské buňky. Tyto buňky jsou pak úspěšně transformovány heterologním genem který produkuje protein udělující kultuře rezistenci k antibiotikům a tak tyto vybrané buňky přežijí. U příkladů, kde se používá tato domi10 nantní selekce, se využívají léky např. neomycin, mykofenolová kyselina, hygromycin.

Jiný příklad vhodných selekčních markérů pro savčí buňky jsou ty, které umožňují identifikaci buněk, schopných inkorporovat nukleovou kyselinu anti-Erb B2 protilátky do své buňky. Jsou to např. DHFR, thymidinkináza, metal lothionetn-I a -ΓΙ, přednostně geny primátů pro metallo15 thionein, adenosindeaminázu, omithindekarboxylázu atd.

Například buňky transformované DHFR selekčním genem jsou identifikovány nejdříve při kultivaci transformantů v kultivačním médiu, které obsahuje methotrexát (Mtx-kompetitivní antagonista DHFR). Tam, kde je použít DHFR, je selektována buněčná linie ovárií z křečíka (CHO), která vykazuje ztrátu DHFR aktivity.

Podobně mohou být hostitelské buňky (částečně divoké typy, které obsahují endogenní DHFR) transformovány nebo kotransformovány DNA selekčními sekvencemi kódujícími anti-Erb B2 protilátku, divoký typ DHFR proteinu a jiné selekční markéry, jako je aminoglykosid-3 -fosfo25 transferáza (AHP) a pak selektovány na buněčný růst v médiu obsahující selekční činidlo pro selekční markér, např. aminoglykosidická antibiotika (kanamycin, neomycin nebo G418). Viz patent US 4 965 199.

Vhodný selekční gen pro kvasinky je trp 1 gen, přítomný na kvasinkovém Yrp7 plazmidu (Stinchcomb et al., Nátuře, 282:39 (1979)). Trp 1 gen zajišťuje selekci pro mutantní kmeny kvasinek, které nejsou schopné růst bez tryptofanu, např. ATCC č. 44076 nebo PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). Poškození v genu trp 1 v genomu hostitelské kvasinky zajišťuje vhodné prostředí pro detekci transformace pomocí růstu bez tryptofanu. Podobně Leu2 deficientní kvasinkové kmeny (ATCC 20 622 nebo 38 626) jsou komplementovány známými plazmidy nesoucími gen Leu2.

I 'rl

Navíc mohou být vektory, odvozené od 1,6 pm kruhového plazmidu pKDl, použity kotransfor- $ mači kvasinek Kluyveromycetes. Podobně byl popsán expresní systém pro produkci telecího ;

chymosinu ve velkém u kvasinky KJactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Popsá40 . ny byly i stabilní multikopiové expresní vektory pro sekreci maturovaného rekombinantního lids- ] kého sérum albuminu průmyslovými kmeny rodu Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology,

9:968-975 (1991).

(vi) Promotor

Expresní a klonovací vektory většinou obsahují promotor, který je rozpoznáván hostitelským organismem a je vhodně připojen na nukleovou kyselinu anti-Erb B2 protilátky. Promotory vhodné pro prokaryotické buňky jsou phoA promotor, β-laktamázový a laktózový promotorový systém, promotorový systém bazické fosfatázy či tryptofanu (trp) a hybridní promotory jako tře50 ba tac promotor. I další známé promotory jsou vhodné. Promotory pro použití v bakteriálních i systémech také musí obsahovat Shine-Dalgamo sekvenci (S.D.), vhodně připojenou na DNA ^Ί kódující anti-Erb B2 protilátku.

Známé jsou též promotory u eukaryot. Hypoteticky mají všechny eukaryotické geny oblast bohatou na AT cca 25 až 30 bází nad místem transkripčního startu. Jiná sekvence, 70 až 80 bází

-33CZ 299702 B6 nad transkripčním startem, přítomná u mnoha genů, obsahuje CNCAAT oblast, kde N je jakýkoliv nukleotid. Na 3' konci většiny eukaryotických genů je AATAAA sekvence, která slouží jako signál pro připojení polyA konce na 3' konec kódující sekvence. Všechny tyto sekvence jsou vhodně vloženy do eukaryotních expresních vektorů.

Příklady vhodných promotorových sekvencí pro kvasinky jsou promotory: 3-tósťoglycerátkinázy nebo jiných glykolytických enzymů, např. enolázy, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy, hexokinázy, pyruvátdekarboxylázy, fosfofruktokinázy, glukosa-6-fosfátisomerázy, 3-fosfoglycerátmutázy, pyruvátkinázy, triosafosfátisomerázy, fosfoglukosoisomerázy a glukokinázy.

io

Jiné kvasinkové promotory, které jsou inducibilní, mají další výhodu transkripční kontroly růstových podmínek. Jsou to promotorové oblasti alkoholdehydrogenázy 2, isocytochromu C, kyselé fosfatázy, degradativních enzymů spojených s metabolismem dusíku, metallothioneinu, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy a enzymů zodpovědných za využití maltózy a galaktózy. Vhodné vektory a promotory u kvasinkové exprese jsou dále popsány v EP 73 657. Také jsou spolu s promotory výhodně použity enhancery.

Transkripce anti-Erb B2 protilátky vektorů savčích hostitelských buněk je kontrolována např. promotory získanými z genomů virů jako je polyomavirus, fowlpox virus, adenovirus (jako je

Adenovirus 2), bovinní papiloma virus, ptačí sarkoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, virus hepatitidy-B a přednostně simian virus 40 (SV40), dále z heterologních savčích promotorů, např. aktinového promotoru nebo imunoglobulinových promotorů, dále z promotorů proteinů tepelného šoku. Takovéto promotory jsou kompatibilní s hostitelskými buňkami systému.

Rané a pozdní promotory viru SV 40 jsou pohodlně získávány jako restrikční fragmenty, které také obsahují virový SV40 replikační počátek. Velmi raný promotor lidského cytomegaloviru je pohodlně získáván jako HindUl E restrikční fragment. Systém pro expresi DNA v savčích hostitelských buňkách za použití bovinního papiloma viru jako vektoru je popsán v patentu US 4 601978, K expresi lidského β-interferonu cDNA v myších buňkách pod kontrolou thymidinkinázového promotoru z herpex simplex viru viz také Reyes et al, Nátuře, 297:598-601 (1982). Podobně může být použita dlouhá terminální repetice rouš sarkoma viru.

(v) Enhancer

Transkripce DNA kódující anti-Erb B2 protilátky tohoto vynálezu u vyšších eukaryot je často zvyšována vkládáním enhanceru do vektoru. Mnoho enhancerů je nyní známo ze savčích genů (pro globin, elastázu, albumin, α-fetoprotein a insulin). Většinou se ale využívají enhancery z virů eukarýotických buněk. Jsou to například SV 40 anhancery z pozdní oblasti replikaěního počátku (bp 100-270), cytomegalovirový enhancer raného promotoru, polyoma enhancer z pozd40 ní oblasti replikačního počátku a adenovirové enhancery. K enhancerovým elementům pro aktivaci eukaryotických promotorů viz také Yaniv, Nátuře 297:17-18 (1982). Enhancer je připojen k vektoru v pozici 5' nebo 3' na kódující sekvenci anti-Erb B2 protilátky, ale přednostně je umísťován do 5' oblasti promotoru.

(vř) Transkripční terminátor

Expresní vektory používané u eukaryotických hostitelských buněk (u kvasinek, hub, hmyzu, rostlin, zvířat, lidí nebo jaderných buněk z jiných vícebuněčných organismů) také obsahují sekvence nezbytné pro terminaci transkripce a pro stabilizaci mRNA. Tyto sekvence jsou běžně dostupné na 5' a příležitostně i na 3'netranslatovaných oblastech eukaryotických nebo virových DNA nebo cDNA. Tyto oblasti obsahují nukleotidové částí, přepisované jako polyadenylované fragmenty v netranslatovaných částech mRNA, kódující anti-Erb B2 protilátku. Jedním z používaných transkripěních terminátorů je polyadenylační oblast bovinního růstového faktoru. Viz WO 94/11 026 a zde popsaný expresní vektor.

-34CZ 299702 B6 (vii) Selekce a transformace hostitelských buněk j

Vhodné hostitelské buňky pro klonování a expresi DNA u daných vektorů jsou prokaryotické, j

-kvasinkové buňky nebo buňky vyšších· eukaryot, popsaných výše. Vhodnými prokaryotickými ή buňkami jsou cubakterie, jak grampozitivní, iak gramnegativní organismy, např. Entěrobacteria- ;

ceae jako Escherichia, např. Escherichia coli, Enterobacter Erwin ια, Klebsiella, Próteus,

Salmonella, např. Salmonella typhimurium, Serratia, např. Serratia tnarcescans a Shigella, stejně 3 jako bacily, jako Bacilus subtilis a B. licheniformis (např. B. licheniformis 4IP popsaný v DD266 ío 710, publikovaný 12. dubna 1989), Pseudomonas, např. Pseudomonas aeruginosa a Streptomyces. Přednostní klonovací hostitel je E. coli 294 (ATCC 31 446), vhodné jsou i další kmeny jako A. coZ/B, A. coZZ X1776 (ATCC 31 537) a A. coli W3110 (ATCC 27 325). Tyto příklady jsou spíše ukázkové, vhodných organismů je více.

Vedle prokaryot jsou vhodnými expresními a klonovaeími hostiteli pro vektory kódující antiErb B2 protilátku eukaryotiětí mikrobi, jako jsou filamentámí houby nebo kvasinky. Nejběžněji používaným hostitelským organismem je mezi nižšími eukaryotickými organizmy Sacharomyces cerevisiae nebo běžná pekařská kvasinka. I některé jiné kmeny, rody a druhy jsou běžně dostupné * a zde používaní jako hostitelé. Např. Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, např. K.

' lactis, K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC. 16 045), K wickeramii (ATCC 24 178),

K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906), K. thermotolerans a K. marxianusyyarrovia (EP 402 226); Pichia pasloris (EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwaniomyces jako je Schwaniomyces occidentalis a filamentámí houby jako je např. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium a Aspergillus jako je

A. nidulans, A. niger.

Vhodné hostitelské buňky pro expresi glykosylované anti-Erb B2 protilátky jsou odvozené od vícebuněčných organismů. Neobratlovčí buňky zahrnují rostlinné a hmyzí buňky. Bylo identifikováno několik druhů a variant bakulovirů a příslušných hmyzích hostitelských buněk z hostitels30 kých organismů jako je Spodoptera fungiperda (housenka), Aedes aegypti (komár), Aedes albpictus (komár), Drosophila melanogaster (octomilka) a Bombyx moři. Řada transfekčních virových kmenů je veřejně dostupná, např. L-l varianta Autographa californica NPV a Bm-5 kmen Bombyx moři NPV a tyto viry mohou být používány jako viry zde popsané podle předloženého vynálezu, zejména pro transfekci do hostitelských buněk Spodoptera frugiperda.

. .

Rostlinné buněčné kultury bavlny, kukuřice, brambor, sójových bobů, petúnií, rajčat a tabáku mohou být použity jako hostitelské organismy.

Ovšem největší zájem je o obratlovci buňky a rozmnožování obratlovcích buněk (tkáňových kultur) se stalo rutinní metodou. Příklady používaných savčích buněčných linií jsou opičí ledvinové buněčné CV1 linie transformované SV 40 (COS-7, ATCC CRL 1651); lidské embryonální ledvinové buněčné linie (293 nebo 293 buňky subklonované pro růst vsuspenzní kultuře,

Graham et al, J. Gen. Virol 36:59 (1977)); ledvinové buněčné linie mláďat křečka (BHK, ATCC CCL 10); ovariální buněčné linie křečíka/- -DHFR (CHO, Urlaub et al, Proč. Nati Acad. Sci.

. .45.. ..USA 77:4216 (1980)); myší Sertoliho-buňky (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));..........

ledvinové opičí buňky (CV1 ATCC CC1 70); ledvinové buňky kočkodana afrického (VERO-76,

ATCC CRL-1587); lidské buňky cervikálního karcinomu (HELA, ATCC CCL 2); pst ledvinové buňky (MDCK, ATCC CCL 34); krysí jatemí buňky (BRL 3 A, ATCC CRL 1442); lidské plicní buňky (W138, ATCC CCL 75); lidské jatemí buňky (Hep G2, HB 8065); myší buňky tumoru j prsní žlázy (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI buňky (Mather et al, Annals N.Y. Acad. Sci. ;

383:44-68 (1982)); MRC 5 buňky; FS4 buňky; lidské buněčné linie hepatomu (Hep G2).

Pro produkci jsou hostitelské buňky transformovány shora popsanými expresními nebo klonova- čími faktory a pak kultivovány v běžných živných médiích modifikovaných vhodně pro indukci promotorů, selekci transformantů nebo amplifíkaci genů kódující požadované sekvence.

-35CZ 299702 B6 (viii) Kultivace hostitelských buněk

Hostitelské buňky používané k produkci anti-Erb B2 protilátky tohoto vynálezu jsou kultivovány 5 v.řadě médií. Komerčně dostupná média jako je Ham'sF10 (Sigma), základní minimální médium ((MEM), (Sigma)), RMI-1640 (Sigma) a Dulbecco Eagie modifikované médium ((DMEM), (Sigma)) jsou vhodné pro kultivaci hostitelských buněk. Navíc mohou být pro kultivaci hostitelských buněk použita i jakákoli média popsaná v Ham et al., Meth. Enz, 58:44 (1979), Bames et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patent US 4 767 704; US 4 657 866; US 4 927 762; US 4 560 io 655 nebo US 5 122 469; WO 90/03 430; WO 87/00 195 nebo Patent US Re'. 30 935, Jakékoli z médií mohou být obohaceny, pokud je to nezbytné, o hormony a/nebo jiné růstové faktory (jako je insulin, transferin nebo epidermální růstový faktor), soli (jako je chlorid sodný, vápník, hořčík, fosfát), pufry (HEPES), nukleotidy (adenosin a thymidin), antibiotika (jako je GENTAMÝCIN ), stopové prvky (definované jako anorganické sloučeniny přítomné většinou i ve finálních 15 koncentracích v mikromolámích hodnotách) a glukózu nebo jiný ekvivalentní zdroj energie.

Všechny další doplňky jsou zahrnuty při podávání patřičných koncentrací, které určí odborníci. Kultivační podmínky jako je teplota, pH apod. jsou nastaveny podobnéjako u předchozích pokusů pro selekci exprese a budou zřejmé pro odborníky, (ix) Purifikace anti-Erb B2

Při použití rekombinantních technik je protilátka produkována intracelulámě, do periplazmatického prostoru, nebo přímo do média. Pokud je protilátka produkována intracelulámě, je v prvním kroku nejprve centrifugaeí nebo ultrafiltrací odstraněn buněčný odpad, buď hostitelské buňky nebo lysované fragmenty. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) popisuje metodu pro izolaci protilátek, které jsou produkovány do periplazmatického prostoru E. coli. V krátkosti, buněčná suspenze je rozmrazována na ledu v přítomnosti octanu sodného (pH 3,5), EDTA a fenyl methy lsulfonylfluoridu (PMSF) asi 30 min. Buněčný odpad je odstraněn pomocí centrifugace. Tam, kde je protilátka produkována do média, jsou supematanty z expresních systémů kon30 centrovány za použití komerčně dostupného proteinového filtru, např. Amicon nebo Millipore Pellicon ultrafiItrační jednotky. K předchozím krokům je možné přidat inhibitor proteázy, jako např. PMSF, aby došlo k inhibici proteolýzy a antibiotika, aby se předešlo růstu náhodných kontaminant.

Prostředek protilátky připravený z buněk je čištěn za pomoci např. hydroxylapatítové chromatografie, gelové elektroforézy, dialýzy a afinitní chromatografie, což je nejvíce preferovaná metoda. Vhodnost proteinu A jako afinitního ligandu závisí na druhu a isotypu jakékoli imunoglobulinoé Fc domény· která je přítomná v protilátce. Protein A může být použit k purifikaci protilátek, které mají základ v lidských γ 1, γ2 nebo y4 řetězcích (Lindmark et al., J. Immunol Meth. 62:1-13 (1983)). Protein G se doporučuje pro všechny myší isotypy a pro lidský y3 (Guss et al., EMBO J.

5:1567-1575 (1986)). Pojivém, ke které je afinitní Íigand připojen, je většinou agaróza, ale dostupná jsou i jiná pojivá. Mechanicky stabilní pojivá, jako je zkontrolované pórované sklo nebo poly(styrenedivinyl)benzen, umožňují vyšší rychlost toku a kratší dobu zpracování než u agarózy. Pokud protilátka obsahuje C_H3 doménu, pak se k purifikaci používá Bakerbond ABX™

.. 45. -. pryskyřice (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ). -Jiné techniky pro purifikaci proteinů,jako třeba frakcionace na iontoměniči, precipitace ethanolem, reverzní fázová HPLC, chromatografie na silika gelu, chromatografie na heparin SEPHAROSE™, chromatografie na anion či kation výměnné pryskyřici (jako je sloupec polyasparagové kyseliny), chromatofokusace, SDS-PAGE a precipitace sulfátem amonným, jsou dostupné a závisí na získávání protilátky.

Podle následujících předběžných purifikačních kroků je směs obsahující danou protilátku a kontaminanty podrobena kyselé hydrofobně vazebné chromatografii využívající eluční pufr o pH mezi 2,5 až 4,5, přednostně prováděné při nízkých koncentracích solí (např. od 0 až 0,25M).

IV. Farmaceutické přípravky

-36CZ 299702 B6

Terapeutické přípravky protilátek používaných podle předkládaného vynálezu jsou upraveny pro skladování smícháním protilátky požadovaného stupně čistoty s vhodným farmaceuticky přijatelným nosičem, pomocnou látkou nebo stabilizérem (Remingtonů Pharmaceutical Sciences 16^lh edition, Oslo, A. Ed. (1980)), ve·formě lyofilizo váných přípravků nebo vodných roztoků.'Vhodné nosiče, pomocné látky nebo síabilizéry jsou netoxické pro recipienta v podaných dávkách a koncentracích a obsahují pufr jako je fosfát, citrát nebo ostatní organické kyseliny; antioxidanty včetně kyseliny askorbové a methioninu; konzervační látky (jako octadecyldimethylbenzyl amonium chlorid; hexamethonium chlorid; benzalkonium chlorid; benzethonium chlorid; fenol, butyl nebo benzoyl a alkohol; alkyl parabeny jako je methyl nebo propyl paraben; katechol; resorcinol; cyklohexanol; 3-pentanol a m-kresol); nízkomolekulámí peptidy (s méně než 10 zbytky); proteiny, jako je sérum albumin, gelatin nebo imunoglobulíny; hydrofílni polymery jako je polyvinylpyrrolidon; aminokyseliny jako glycin, glutamin, asparagin, histidin, arginin nebo lysin; monosacharidy, disacharidy a jiné karbohydráty včetně glukózy, mannózy nebo dextrinů; chelatační činidla jako třeba EDTA; cukry jako např. sacharóza, mannitol, trehaloza nebo sorbitol; soli tvořící krystalovou mřížku jako je sodík; kovové komplexy (např. Ζη-protenové komplexy); a/nebo neionogení povrchově aktivní látky jako je TWEEN^T, PLURONICS™ nebo pólyethylenglykol (PEG). Preferované lyofilizované přípravky anti-Erb B2'protilátky jsou také popsány v WO 97/04 801, zvlášť vloženého v odkazech.

Přípravky v tomto vynálezu mohou také obsahovat, pokud je to nezbytné, více než jednu aktivní sloučeninu u některých léčených indikací, přednostně se používají ty, které mají doplňkové aktivity a nemají vedlejší účinky na ostatní složky. Například může být požadováno další zajištění protilátky, která se váže na lék, cíleně působící na EGFR, anti-angiogenická činidla a/nebo kardioprotektanty. Takové molekuly jsou vhodně nakombinovány v množství, které účinkuje podle určeného záměru.

Aktivní složky mohou být uzavřeny do mikrokapslí, připravených např. koacervaěními technikami nebo interfaciální polymeraci, např. hydroxymethylcelulosové nebo želatinové mikro30 kapsle a poly-(methylmethacylát)mÍkrokapsle nebo v koloidních transportních systémech (např. liposomech, albuminových mikrokuličkách, mikroemulzích, nanopartikulích a nanokapslích) . nebo v makroemulzích. Takovéto techniky jsou popsány v Remington ů Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Oslo, A.Ed. (1980).

Prostředky, které se uvolňují trvale jsou také připravovány. Vhodné příklady prostředků, které se uvolňují trvale, jsou semipermeabilní matrice z pevných hydrofobních polymerů obsahující proti látku, kde matrice zaujímá určitý tvar, např. filmu či mikrokapsle. Vhodné příklady prostředků, které se uvolňují trvale; zahrnují polyestery, hydrogély (např. poly(2-hydroxyethyl-methakrylát) nebo poly(vinylalkohol)), polyaktidy (patent US 3 773 919), kopolymery L-glutamové kyseliny a γ ethyl-L-glutamátu, nedegradovatelný ethylenvinyl acetát, kopolymery degradovatelné kyseliny a kyseliny glykolové, jako je LUPRON DEPOT™ (jsou to injektovatelné míkrokuličky složené zkopolymeru kyseliny mléěné+glykolové kyseliny a leuprolid acetátu) a poly-D-(-)-3hydroxymáselné kyseliny.

- -45----Prostředky pro podávání in vivo musí být sterilní; Toho je dosaženo filtrací přes sterilní filtrační' membrány.

IV. Léčba pomocí anti-Erb B2 protilátek so V předkládaném vynálezu je zvažováno, že anti-Erb B2 protilátky mohou být použity k léčbě různých chorob a poruch. Příklady těchto nemocí zahrnuj í benigní nebo maligní tumory, leukémie a lymfoidní malignace, jiné choroby jako neurální, gliové, astrocytální, hypothalamické, glandulámí, makrofágové, epiteliální, stromální, blastocoelické, zánětlivé, cévní a imunologické poruchy.

-37CZ 299702 B6

Obecně je léčenou chorobou nebo poruchou rakovina. Příklady zde léčených různých typů rakovin zahrnují, ale nejsou zdaleka vyjmenovány všechny, karcinom, lymfom, blastom, sarkom a leukémie nebo lymfoidní malignacie. Podrobněji je to rakovina skvamosních buněk (např, epiteliální rakovina skvamosních buněk), rakovina plic včetně rakoviny plicních sklípků, rakoviny .5 větších plicních buněk, adenokarcinomu plic a skvamosního karcinomu plic, rakovina pobřišnice, rakovina jatém ích buněk, rakovina žaludku a zažívacího ústrojí, rakovina slinivky břišní, gíioblastom, rakovina děložního krčku, rakovina vaječníků, rakovina jater, rakovina žlučníku, hepatom, rakovina prsu, rakovina tlustého střeva, rakovina konečníku, rakovina prostaty, rakovina chlopní, rakovina štítné žlázy, jatemí karcinom, anální karcinom, karcinom penisu a také rako10 vina krku či hlavy.

Rakovina většinou obsahuje Erb B2 buňky, takže zde uvedená anti-Erb B2 protilátka je schopná na rakovinné buňky navázat. Přestože je většina rakovinných buněk charakterizována nadměrnou expresní Erb B2 receptorů, aplikace podle tohoto vynálezu dále zajišťuje metodu pro léčbu rako15 viny, u které není zjištěna nadměrná exprese Erb B2 receptorů. Pro určení Erb B2 exprese u rakovinných buněk je dostupná řada diagnostických nebo prognostických testů. V jednom z nich je Erb B2 nadměrná exprese analyzována metodou IHC, např. za pomoci HERCEPTEST® (Dako). Tkáňové části z tumorové biopsie ukotvené na parafinu jsou podrobeny IHC testu, který je vyhodnocen podle barevné intenzity Erb B2 proteinu:

Body 0

Žádné zabarvení se neobjevilo neboje barvení membrány pozorováno u méně než 10 % nádorových buněk.

Body 1+

Nezřetelné/sotva znatelné zabarvení membrány je pozorováno u méně než 10 % nádorových buněk. Buňky jsou obarveny pouze na části membrány.

Body 2+

Slabé až střední úplné zabarvení membrány je pozorováno u více než 10 % nádorových buněk. Body 3+

Střední až silné úplné zabarvení membrány je pozorováno u více než 10 % nádorových buněk.

Ty nádory, kde je v hodnocení Erb B2 nadměrné exprese skóre 0 až 1+, jsou charakterizovány jako buňky, které neexprimují nadměrně Erb B2 receptor, zatímco nádory se skóre 2+ a 3+jsou charakterizovány jako Erb B2 receptor nadměme exprimující buňky.

Podobně a nebo ještě navíc může být proveden FISH test jako třeba INFORM™ (prodejce

Ventana, Arizona) nebo PATHVISIOTsf (Vysis, Illinois). Provádí se na nádorových tkáních fixovaných formalínem a ukotvených na parafínu a určuje se míra nadměrné exprese Erb B2 receptorů (pokud tam nějaká vůbec je). V jednom z provedení rakovinné buňky exprímují (a mohou i nadměrně) EGFR. Typy rakovin, kde může docházet k této expresi/nadměrné expresi EGFR, jsou: rakovina skvamosních buněk (např. epiteliální rakovina skvamosních buněk), rako45 vina plic včetně rakoviny plicních sklípků, rakoviny větších plicních buněk, adenokarcinomu plic a skvamosního karcinomu plic, rakovina pobřišnice, rakovina jatemích buněk, rakovina žaludku a zažívacího ústrojí, rakovina slinivky břišní, glioblastom, rakovina děložního krčku, rakovina vaječníků, rakovina jater, rakovina žlučníku, hepatom, rakovina prsu, rakovina tlustého střeva, rakovina konečníku a tračníku, rakovina děložní sliznice nebo močového měchýře, rakovina slin50 né žlázy, rakovina ledvin nebo renální rakovina, rakovina prostaty, rakovina chlopní, rakovina štítné žlázy, jatemí karcinom, anální karcinom, karcinom penisu, a také rakovina krku či hlavy.

Podle tohoto vynálezu léčená rakovina je charakterizována nadměrnou aktivací Erb B receptorů, např. EGFR. Tato nadměrná aktivace je přisuzována nadměrné expresi nebo zvýšené produkci

Erb B receptorů nebo Erb B ligandu. V jednom provedení vynálezu je proveden diagnostický

-38CZ 299702 B6 nebo prognostický test na určení, jestli je rakovina pacienta charakterizována nadměrnou aktivací Erb B receptorů. Například je možné určit genovou amplifikaci a/nebo nadměrnou expresi Erb B receptorů v rakovinných buňkách. Dostupná je řada testů, která tuto genovou amplifikaci a/nebo nadměrnou expresí Erb B receptorů v rakovinných buňkách určuje, např. IHC, FISH a další shora vysvětlené antigenní testy. Podobně nebo ještě navíc jsou podle známých metod určeny hladiny Erb B liganuu, např. TGF-α, vyskytujícího se v rakovinných buňkách nebo přidruženého k nádoru. Takovéto metody detekují protein a/nebo jeho nukleovou kyselinu v testovaném vzorku.

V jednom z provedení jsou hladiny Erb B ligandu určeny pomocí imunohistochemie (IHC); viz např. Scher et al. Clin Cancer Research 1:545-550 (1995). Podobně nebo ještě navíc je možno ío odhadnout hladiny nukleové kyseliny kódující Erb B ligand v testovaném vzorku, např. pomocí technik FíSH, southem blotting nebo PCR.

Navíc může být odhadnuta míra genové amplifikace nebo nadměrné exprese Erb B receptorů čí Erb B ligandu pomocí in vivo diagnostickými testy, např. podáním molekuly (např. protilátky), která se váže k detekované molekule a sama je značena (např. radioaktivním izotopem), kdy je pak tato molekula externě sledována přímo na pacientovi díky značené sondě.

Tam, kde je léčená rakovina nezávislá na hormonech, je možno odhadnout expresi hormonu (např. androgenu) a/nebo jeho známého receptorů v nádoru pomocí řady dostupných testů, např, jak bylo popsáno výše. Podobně nebo ještě navíc může být u pacienta diagnostikována forma rakoviny nezávislá na hormonech v případě, kdy i po delší době nedochází k požadované odezvě na antiandrogenovou terapii.

V některých příkladech je pacientovi podáván imunokonjugát obsahující anti-Erb B2 protilátku navázanou na cytotoxické činidlo. V lepším případě je imunokonjugát a/nebo Erb B2 protein, na který je navázán, pohlcen buňkou, což má za následek vzrůst terapeutické účinnosti imuno konjugátu v zabíjení rakovinných buněk, na které se váže. V dalším z požadovaných modelů cytotoxické činidlo ničí nebo narušuje nukleovou kyselinu. Příklady těchto cytotoxických činidel jsou maytansinoidy, kalicheamiciny, ribonukleázy a DNA endonukleázy.

Anti Erb B2 protilátky nebo imunokonjugáty jsou podávány lidským pacientům známými způsoby jako je podání žilou, např. jako Bolusova injekce nebo dlouhodobější infuze, injekce do svalu, injekce do pobřišnice, míchy, pod kůži, do kloubu, do pojivové tkáně, do pouzder, orální, lokální nebo inhalační podání. Preferováno je podávání podkožní nebo injekcí do žíly.

S podáváním anti-Erb B2 protilátky může být spojen i jiný terapeutický režim. Kombinované podávání zahrnuje spolupodávání oddělených prostředků nebo jednoho farmaceutického prostředku a po sobě jdoucího podávání obou a udržuje se určitá časová prodleva potřebná k současnému projevu biologické aktivity obou (nebo všech) aktivních činidel prostředku.

V jednom z provedení je pacient léčen pomocí dvou různých anti-Erb B2 protilátek. Pacient je nejprve léčen první anti-Erb B2 protilátkou, která blokuje aktivaci ligandu Erb B2 receptorů, nebo protilátkou, která má biologickou vlastnost monoklonální protilátky 2C4, stejně tak jako druhá anti-Erb B2 protilátka, která je růstovým inhibitorem (např. HERCEPTIN®), nebo

45. . . anti-Erb B2 protilátkou, která indukuje apoptózu buněk nadměme exprimujících' Erb B2 (např. 7C2, 7F3 nebo jejich humanizované varianty). Většinou vykazují tyto kombinované terapie synergický terapeutický efekt. Tak například může být pacient léčen nejprve pomocí látky HERCEPTIN® a poté látkou rhuMAb2C4, pokud pacient dobře neodpovídá na terapii pomocí látky HERCEPTIN®. V jiném případě je pacient léčen nejprve látkou rhuMAb2C4 a teprve pak podstoupí HERCEPTIN® terapii. V dalším případě je pacient léčen oběma terapiemi rhuMAb2C4 a HERCEPTIN® zároveň.

Požadováno může být také kombinované podávání anti-Erb B2 protilátky nebo protilátek s protilátkou namířenou přímo proti nějakému jinému nádorovému antigenu. Tento typ protilátek se

-39CZ 299702 B6 .

může vázat např. na EGFR, Erb B3, Erb B4 nebo na vaskulámí endotheliální růstový faktor (VEGF).

V jednom z provedení zahrnuje léčba podle předloženého vynálezu kombinované podávání anti-Erb B2 protilátky (nebo protilátek) a· jedno nebo více chemoterapeutickýchčinidel nebo růstových inhibicních činidel, včetně podávání koktejlů různých chemoterapeutik. Přednostně používaná chemoterapeutická činidla zahrnují taxany (např. paclitaxel, docetaxel) a/nebo antracyklinová antibiotika. Příprava a schéma podávání takovýchto chemoterapeutických činidel se řídí podle návodu výrobce neboje určeno empiricky odbornými lékaři-praktiky. Příprava a schéma podáván takovýchto chemoterapeutických činidel je také popsána v Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

Protilátka může být kombinována s antihormonálními sloučeninami, např. s anti-estrogenem jako je tamoxifen, antiprogesteronem jako je onapriston (viz EP 606 812) nebo antiandrogenem jako je flutamid, a to v přiměřených dávkách. Pokud je léčena rakovina nezávislá na hormonech, může být pacient nejdříve podroben antihormální terapii a poté, co se rakovina stane na hormonech závislou, přejde se k podávání anti-Erb B2 protilátky (a vhodně i dalších zde popsaných činidel) pacientovi.

Někdy může být vhodné spolupodávat pacientovi kardioprotektanty (pro prevenci nebo snížení myokardiálních poruch spojených s terapií) nebo jeden ěi více cytokinů. Může být také podáváno lék ničící EGFR nebo anti-angiogenní činidlo. Vedle těchto dvou shora uvedených terapií lze navíc podrobit pacienta chirurgickému odstranění rakovinných buněk a/nebo radiační terapii.

Zde popsané anti-Erb B2 protilátky mohou být kombinovány se shora uvedenými léčivy ničící EGFR, které vykazují doplňující a potenciálně synergický terapeutický efekt.

Vhodné dávky jakýchkoli shora uvedených spolupodávaných činidel jsou ty, co se v současné době používají a mohou být sníženy vzhledem ke kombinovanému účinku (spoluúěinku) činidla a anti-Erb B2 protilátky.

Pro prevenci nebo léčbu nemoci bude vhodná dávka protilátky záviset na typu choroby, jak bylo definováno shora, vážnosti a průběhu choroby, jestli je protilátka podávána preventivně nebo terapeuticky, na předchozí terapii, na pacientově klinické anamnéze a odpovědi na protilátku a na uvážení ošetřujícího lékaře. Protilátka je vhodně podána buď najednou, nebo v léčebných sériích.

V závislosti na typu a vážnosti choroby se pohybuje počáteční dávka protilátky v rozmezí 1 gg/kg až 15 mg/kg (např. 0,1 až 20 mg/kg), podávaná jednou nebo vícekrát nebo podaná kontinuální infuzi. Typická denní dávka se pohybuje od 1 pg/kg áž lOO mg/kg nebo více, v závislosti na výše zmíněných faktorech. Při opakovaném podávání během několika dní nebo déle, v závislosti na fyzickém stavu, je léčba udržována až do té doby, než se objeví požadovaný útlum symptomů choroby. Vhodná dávka protilátky se bude pohybovat mezi 0,05 až 10 mg/kg. Tak může být podávána pacientovi jedna nebo více dávek těchto hodnot 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg nebo 10 mg/kg (nebo jejich kombinace). Takovéto dávky mohou být podávány přerušovaně, např. každý týden nebo každé tři týdny (např. tak, aby pacient dostal dvě až asi ..dvacet, např. asi-šest dávek anti-Erb B2 protilátky). Podání počáteční vyšší vstupní dávky je následována podáním jedné nebo více nižších dávek. Příkladný režim dávek zahrnuje podání počáteční vstupní dávky v hodnotě 4 mg/kg, následuje týdenní udržovací dávka 2 mg/kg anti-Erb B2 protilátky. Ovšem i jiné dávkové režimy jsou použitelné. Postup v této terapii je snadno pozorovatelný za pomoci běžných technik a testů.

Vedle podávání proteinu protilátky pacientovi se v současné aplikaci zvažuje podání protilátky genovou terapií. Toto podání nukleové kyseliny kódující protilátku je obsaženo ve výrazu „podání terapeutických účinných dávek protilátky“. Viz např. WO 96/07321 publikovaná 14. března 1996 zabývající se genovou terapií pro produkci intracelulámích protilátek.

-40CZ 299702 B6

Existují dva hlavní přístupy ktomu, jak dostat nukleovou kyselinu (obsaženou vhodně ve vektoru) do pacientových buněk: in vivo a ex vivo. Při in vivo transportu je nukleová kyselina přímo vstříknuta do těla pacienta, většinou v místě, kde je protilátka potřeba. Při ex vivo léčbě jsou pacientovy buňky odděleny, nukleová kyselina přenesena do těchto izolovaných buněk . . a modifikované buňky jsou podány pacientovi buď přímo, nebo uzavřené'do porézní membrány, která je implantována pacientovi (viz např. patenty US 4 892 538 a u'S 5 283 187). Existuje řada dostupných technik pro přenos nukleových kyselin do živých buněk. Techniky se liší zejména v tom, jestli je nukleová kyselina přenesena in vitro nebo in vivo do buněk daného hostitele. Vhodné techniky pro přenos nukleové kyseliny do savčích buněk in vitro zahrnují použití io liposomů, elektroporaci, mikroinjekci, buněčnou fúzi, DEAE-dextran, metodu srážení kalcium fosfátem atd. Běžně využívaným vektorem pro přenos genu ex vivo)e retrovirus.

Nejpoužívanější metodou pro přenos nukleové kyseliny do savčích buněk in vivo zahrnují v současnosti virové vektory (jako je adenovirus, Herpes simplex I virus nebo AA virus) nebo systémy na lipidickém základě (používané lipidy nebo lipidem zprostředkované transportní systémy genu jsou DOTMA, DOPE a DC-Chol). V některých situacích je potřeba zajistit zdroj nukleové kyseliny s činidlem, které ničí cílenou buňku, jako je specifická protilátka pro povrchový membránový protein na cílové buňce, ligand pro receptor na cílové buňce atd. Tam, kde jsou použity liposomy, se proteiny, vážící se na povrchový membránový protein spojený s endocytó20 zou, požívají na ničení buněk a/nebo usnadňování absorpce, např. kapsidových proteinů nebo jejich fragmentů z určitého buněčného typu, protilátek pro proteiny, které podstupují vstřebávání během cyklu a proteinů, které přesně zamíří vnitřní umístění a usnadňují vnitrobuněčný poločas života. Technika receptorem zprostředkované endocytózy je popsaná např. v Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)a Wagner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:3410-3414, (1990)). Pro souhrn současné známých postupu markingových genů a léčebných genů viz.

Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Viz, také WO 93/25 673 a odkazy citované v tomto dokumentu.

VI. Výrobek

V dalším provedení tohoto vynálezu, je poskytnuta výrobek obsahující materiály užitečné pro léčbu poruch popsaných výše. Výrobek obsahuje nádobku a na ní štítek nebo příbalový leták připojený k nádobce. Vhodné nádobky zahrnují například lahve, ampulky, injekční stříkačky atd. Nádobky mohou být tvořeny z různých materiálů jako je sklo nebo plast. Nádobka uchovává směs, která je účinná pro léčbu stavů a může mít sterilní přístupný vstup (například nádobkou může být sáček s nitrožilním roztokem, nebo ampulka mající propichovací uzávěr podkožní injekční jehlou). Alespoň jedno aktivní činidlo ve směsi je anti-ErbB2 protilátka. Štítek nebo příbalový leták označuje, že směs je používána pro léčbu vybraných stavů, jako je rakovina.

V jednom provedení štítek nebo příbalový leták označuje, že směs obsahující protilátku, která váže ErbB2 může být použita k léčbě rakoviny, která exprimuje ErbB receptor vybraný ze skupiny obsahující receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR), ErbB3 a ErbB4, výhodněji EGFR. Navíc štítek nebo příbalový leták může označovat, že léčený pacient je takový, který má rakovinu, charakterizovanou nadměrnou aktivací ErbB receptorů vybraného z EGFR, ErbB3 nebo ErbB4. Například rakovina může být taková, která nadměrně exprimuje jeden z těchto

45... .receptorů a/nebo která nadměrně-exprimuje ErbB ligand (jako je TGF-α). Štítek nebo příbalový leták může také označovat, že sloučenina může být použita k léčbě rakoviny, kde rakovina není charakterizována nadměrnou expresí ErbB2 receptorů. Například zatímco předložená inzerce pro HERCEPTIN* označuje, že protilátka je používána k léčbě pacientů s metastatickou rakovinou prsu, jejíž tumory nadměrně exprimují ErbB2 protein, příbalový leták může v tomto dokumentu označovat, že protilátka nebo směs je používána k léčbě rakoviny bez ohledu na míru nadměrné exprese ErbB2. V dalším provedení příbalový leták může označovat, že protilátka nebo směs je používána k léčbě rakoviny prsu (tj. metastatické rakoviny prsu), na hormonech nezávislou rakoviny, rakoviny prostaty, (tj. na androgenu nezávislé rakoviny prostaty), rakoviny plic (tj. rakoviny plic nemalých buněk), rakoviny tračníku, rektální nebo tračníkové a rektální rakoviny nebo jakékoliv další nemoci nebo poruchy popsané v tomto dokumentu. Kromě toho

-41 CZ 299702 B6 výrobek může obsahovat (a) první nádobku se směsí v ní obsaženou, ve které směs obsahuje první protilátku, která váže ErbB2 a inhibuje růst rakovinných buněk, která nadměrně exprimují ErbB2 a (b) druhou nádobku se směsí v ní obsaženou, ve které směs obsahuje druhou protilátku, která váže ErbB2 a blokuje aktivaci ligandu ErbB receptoru. Výrobek v tomto provedení vynálezu může dále obsahovat příbalový leták označující, že první a druhá směs protilátky může být použita k léčbě rakoviny. Navíc příbalový leták může uživateli směsi (obsahující protilátku, která váže ErbB2 a blokuje aktivaci ligandu receptoru ErbB) dát instrukce jak, kombinovat léčbu protilátkou a jakýchkoliv podpůrných terapií popsaných v předešlé sekci (tj. chemoterapeutická činidla, EGFR cílená léčiva, anti-angiogenní činidla, antihormonální sloučeniny, kardioprotek10 tanty a/nebo cytokiny). Jinak nebo navíc může dále výrobek obsahovat druhou (nebo třetí) nádobku obsahující farmaceuticky přijatelnou sůl, jako je bakteriostatická voda pro injektaci (BWFI), fosfátem pufrovaný roztok, Ringer roztok a dextrózový roztok. Může dále obsahovat další materiály vyžadované z obchodního a uživatelského hlediska, zahrnující další pufry, ředidla, jehly a injekční stříkačky.

¹⁵

Vil. Neterapeutické použití anti-ErbB2 protilátky

Protilátky (tj' humanizované anti-ErbB2 protilátky) vynálezu mají další neterapeutické aplikace.

Například protilátky mohou být použity jako na afinitně purifikační činidla. Při tomto procesu jsou protilátky imobilizovány na pevnou fázi jako je sephadexová pryskyřice nebo filtrační papír, použitím postupů odborníkům dobře známých. Imobilizované protilátky jsou spojeny se vzorkem obsahujícím ErbB2 protein (nebo jeho fragment), kteiý má být purifikován a potom je nosič promýt vhodným rozpouštědlem, které odstraní v podstatě všechen materiál ve vzorku kromě

ErbB2 proteinu, který je navázán na imobílizovanou protilátku. Nakonec je nosič promýt jiným vhodným rozpouštědlem, jako je glycinový pufr, pH 5, který uvolní ErbB2 protein z protilátky.

Anti-ErbB2 protilátky mohou být také použity jako diagnostické kvantitativní rozbory pro ErbB2 protein, tj. detekují jeho expresi v určitých buňkách, tkáních a v séru.

Pro diagnostické aplikace bude typicky protilátka značena detekovatelnou částí. Početné značky jsou k dispozici a obecně jsou rozděleny do následujících kategorií:

(a) Radioizotopy jako 35S, 14C, 1251, 3H a 1311. Protilátka může být značena radioizotopem použitím techniky popsané například v Current Protocols in Immunology,

Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed Wiley Interscien, New York, Pubs. (1991) a radioaktivita může být měřena použitím seintilačního počítače.

(b) Fluorescenční značky jako jsou řídce se vyskytující cheláty (cheláty europia) nebo fluorescein a jeho deriváty, rhodamin a jeho deriváty, dansyl, Lissamin, fýkoerythrin a Texaská červeň jsou k dispozicí. Fluorescentní značky mohou být připojeny k proti40 látce použitím technik popsaných například Current Protocols in Immunology, supra.

Fluorescence může být vyčíslena použitím fluorimetru.

(c) Různé značky enzym-substrát jsou k dispozici a patent US 4 275 149 poskytuje některé z nich. Enzymy obecně katalyzují chemické změny chromogenního substrátu, které mohou být měřeny použitím různých metod. Například enzym může.katalyzovat barev'45' nou změnu v substrátu, která může být měřena spektrofotometrieky. Nebo enzym může pozměnit fluorescenci nebo chemiluminiscenci substrátu. Techniky vyčíslení změny ve fluorescenci jsou popsány výše. Chemiluminíscentní substrát se stane elektronicky excitovaným chemickou reakcí a může potom emitovat světlo, které může být měřeno (použitím například chemiluminometru) nebo daruje energii fluorescentnímu akceptoru.

Příklady enzymatických značek zahrnují luciferázy (tj. luciferáza světlušek a luciferáza bakterií, patent US 4 737 456), luciferin, 2,3-dihydroftalazinediony, malátdehydrogenáza, ureáza, peroxidáza jako křenová peroxidáza (HRPO), alkalická fosfatáza, β-galaktosidáza, glukoamyláza, lysozym, sacharidoxidáza (tj. glukózaoxidáza, glakatooxidáza a glukóza-6-fosfátdehydrogenáza), heterocyklické oxidázy (jako urikáza a xantinoxi-42CZ 299702 B6 ďáza), laktoperoxidáza, mikroperoxidáza a podobně. Techniky na připojení enzymů k protilátkám jsou popsány v O'SulIivan et cií, Methods for Preparation of Enzyme- j

Antibody Conjugates for use in Enzyme ímmunoassay, in Methods in Enzym (ed $

J. Lango & H. Van Vunakis), Academie Press, New York, 73:147-166, (1981), j .

Příklady enzym-substrát spojení zahrnuje například:

(i) křenová peroxidáza (HRPO) s hydrogenperoxidázou jako substrát, kde hydrogenoperoxidáza oxiduje barevný prekursor (například orthofenylendiamin (ODP) nebo 3,3', 5,5'-tetra10 methylbenzidinhydrochloríd (TMB)), (ii) alkalická fosfatáza (AP) s para-nitrofenylfosfátem jako chromatogenním substrátem a (iii) β-galaktosidáza (β-D-Gal) s chromogenním substrátem (například p-nitrofenyl-β-galaktosidáza.

Četné další spojení enzym-substrát jsou k dispozici odborníkům. Pro jejich všeobecný přehled viz. patent US 4 275 149 a US 4 318 980.

Někdy je znaěka nepřímo připojená k protilátce. Odborníci jsou si vědomi různých technik k dosažení tohoto cíle. Například protilátka může být propojena s biotinem a jednou ze tří roz20 sáhlých kategorií značek zmíněných výše může být spojena s avidinem nebo více versa. Biotin se selektivně váže na avidín a proto může být značka spojena s protilátkou nepřímým způsobem.

Neboje k dosažení nepřímého spojení značky a protilátky protilátka spojena s malým haptenem (například digoxin) a jedna z různých typů značek uvedených výše je spojena s anti-hapten protilátkou (například anti-digoxin protilátka). Takto může být docíleno nepřímé spojení značky s protilátkou.

V dalším provedení vynálezu je nutné označit anti-ErbB2 protilátku, aby šlo detekovat její přítomnost použitím značené protilátky, která se váže k ErbB2 protilátce.

Protilátky předloženého vynálezu mohou být použity v jakémkoliv známém kvantitativním rozboru, jako je kvantitativní rozbor kompetentivního vázání, přímý a nepřímý „sandwich“ kvantitativní rozbor a imunoprecipitaění kvantitativní -rozbor. Zola, Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, lne. 1987).

Pro imunohistochemii vzorek tumoru může být čerstvý nebo zmražený nebo může zakotvený v parafinu a fixován konzervačním činidlem jakým je například formalin. .

Protilátky mohou být také použity v in vivo diagnostických kvantitativních rozborech. Obecně je protilátka značena radionuklidem (jako je Hlín, 99Tc, 14C, 1311, 1251, 3H, 32P nebo 35S), takže tumor může být lokalizován použitím imunoscintiografie. Je otázkou praktičností, kdy by měla protilátka předloženého vynálezu být dodávána ve formě kitu, tj. zabalená kombinace činidel v předurčených množstvích s instrukcemi pro provedení diagnostického kvantitativního rozboru. Kde je protilátka značená enzymem, kit bude zahrnovat substráty a kofaktory vyžadované enzymem (například prekursor substrátu, který poskytuje detekovatelný chromofor nebo fluorofor). Navíc mohou být zahrnuty další přísady jako stabilizátory, pufry (například blokující pufr nebo lyzační pufr) a podobně. Relativní množství různých složek se mohou široce různit, aby poskytly koncentrace složek v roztoku takové, jaké dostatečně optimalizují citlivost kvantitativního rozboru. Zvláště složky mohou být dodávány jako vysušené pudry, většinou lyofilizované, zahrnující inertní substance k přenosu léčebné látky, které po naředění budou poskytovat složky roztoku mající vhodné koncentrace.

-43CZ Z997UZ B6

Vílí. Skladování materiálů

Následující hybridní buněčné linie byly uskladněny American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

Ustanovení protilátky	ATCC č.	Datum uskladnění
7C2	ATCC HB-12215	17. října, 1996
7F3	ATCC HB-12216	17. října, 1996
4D5	ATCC CRL 10463	24. května, 1990
2C4	ATCC HB-12697	8. dubna, 1999

Další detaily vynálezu jsou ilustrovány na následujících neomezených příkladech. Veškeré citace jsou v přesném popisu jasně včleněny do tohoto dokumentu odkazem.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1A a 1B znázorňuje mapování zbytků 22-645 molekulární oblastí na povrchu antigenu schopné vyvolat tvorbu protilátek v extracelulární doméně (ECD) ErbB2 (sekvence amino20 kyselin, zahrnující signální sekvenci, viz. obrázek 1A, SEQ ID NO:13) jak zjištěno analýzou zkracování mutanty a cíleně řízenou mutagenezí (Nakamura et al., J. of Virology 67(10): 6179-6191 (1993), a Renz et al., J. Cell. Biol. 125(6):1395-1406 (1994)). Různá zkrácení ErbB2-EDCD nebo bodové mutace byly připraveny z cDNA s použitím technologie polymerázové řetězové reakce. ErbB2 mutanti byly exprimováni jako gD fúzní proteiny v savčím expresním plazmidu. Tento expresní plazmíd využívá zesilovač transkripce promotoru cytomegaloviru s SV40 signály terminace a polyadenylace lokalizované po směru od vložené cDNA. Plazmidová DNA byla transfekována do 293 buněk. Jeden den po transfekci, byly buňky metabolicky označeny kultivací přes noc v médiu DMEM s nízkou koncentrací glukózy bez methioninu a cysteinu a obsahující 1 % dialyzované hovězí očkovací látky a 24 pCi jak ³⁵S methioninu, tak ³⁵S cysteinu. Supernatanty byly odděleny a jak anti-ErbB2 monoklonální protilátky tak kontrolní protilátky byly přidány k supematantu a inkubovány 2 až 4 hodiny při 4°C. Komplexy byly vysráženy, naneseny na 10 až 20% Tricin SDS gradientový gel a podrobeny elektroforéze při 100 V. Gel byl elektroblotací převeden na membránu a autoradiograficky analyzován. Jak je ukázáno na obrázku 1B, anti-ErbB2 protilátky 7C2, 7F3,

2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 A 3H4 vážou různé ErbB2-ECD molekulární oblasti na povrchu antigenu schopné vyvolat tvorbu protilátek.

Obrázek 2A á 2B ukazuje účinek anti-ErbB2 monokíonálních protilátek 2C4 a 7F3 na aktivaci rHRGpi buněk MCF7. Obrázek 2A ukazuje křivky dávkové odezvy 2C4 nebo 7F3 inhibiee HRG stimulace fosforylace tyrosinu. Obrázek 2B ukazuje křivky dávkové odezvy inhibiee ^,25I-znaěeného rHRGpl 177-244 vázající se k M.CF7 buňkám přes 2C4 nebo 7F3.

Obrázek 3 znázorňuje specifický ¹²⁵I-znacený rHRGpl 177-244 vázající se ke skupině linií buněk lidských nádorů přes anti-ErbB2 monoklonální protilátky 2C4 nebo 7F3. Monoklonální kontrolní protilátky jsou druhově odpovídající myší monoklonální protilátky, které neblokují rHRG vazbu. Nespecifická vazba ¹²⁵I- značeného rRHGpl 177-244 byla určena z paralelní inkubace provedené v přítomnosti 100 mM rJIRGp 1. Hodnoty nespecifické vazby ¹²⁵I- značeného rHRGp 1177-244 byly menší než 1 % ze všech testovaných buněčných linií.

Obrázky 4A a 4B ukazují účinek monokíonálních protilátek 2C4 a 4D5 na množení buněk MDA-MB-175 (obrázek 4A) a SK-BŘ-3 (obrázek 4B). MDA-MB-175 a SK-BR-3 buňky byly vysety na destičky a ponechány 2 hodiny k přilnutí. Pokus byl prováděn v médiu obsahujícím l % protilátky. Anti-ErbB2 protilátky nebo samotné médium bylo přidáno a buňky byly inkubovány 2 hodiny při 37 °C. Nástedně byl přidán rHRGfl (lnM) nebo samotné médium a

-44CZ 299702 B6 buňky byly inkubovány 4 dny. Jednoduchá vrstva buněk byla smyta a barvením 0,5% kiystalovou violetí fixována. Pro určení buněčného množení byla měřena absorbance při 540 nm.

Obrázky 5A a 5B ukazují účinek monoklonální protilátky 2C4, HERCEPTIN® protilátky nebo

5. anti-EGFR protilátky na heregulin podmíněný asociací ErbB2- s ErbB3 v buňkách MCF7 exprimující nízkou/normáiní hladinu ErbB2 (obrázek 5A) a SK-BR-3 buňky exprimující vysoké hladiny ErbB (obrázek 5B), viz. příklad 2 níže.

Obrázky 6 A a 6B srovnávají aktivitu intaktní myší monoklonální protilátky 2C4 (mu 2C4) io a chimérický 2C4 Fab fragment. Obrázek 6A znázorňuje inhibici vazby ¹²⁵1- HRG k MCF7 chimérickou 2C4 Fáb nebo intaktní myší monoklonální protilátkou 2C4. MCF7 buňky byly vysety na 24-jamkové destičky (1 x 10⁵ buněk/jamku) a nechány růst do okolo 85 % shluknutí po dva dny. Následné experimenty byly provedeny jak je popsáno v Lewis et al., Cancer Research

56:1457-1465 (1996).

¹⁵

Obrázky 7A a 7B znázorňují polohy aminokyselinových sekvencí různě lehkých (V_L) a různě těžkých (V_H) domén myší monoklonální protilátky 2C4 (SEQ ID č. 1 a 2 v tomto pořadí), V_L a V_H domény humanizované 2C4 verze 574 (SEQ ID č. 3 a 4 v tomto pořadí) a lidské V_L a V_H shodné stavby (hum kI, lehká podskupina kappa I, humlll, těžká podskupina III) (SEQ ID č. 5 a 6 v tomto pořadí). Hvězdičky označují rozdíly mezi humanizovanou 2C4 verze 574 a myší monoklonální protilátkou 2C4 nebo mezi humanizovanou 2C4 verze 574 a lidskou stavbou. Doplnění určující oblasti (CDRs) jsou v závorkách.

Obrázek 8A az C naznačuje vazbu chimérické Fab 2C4 (Fab. V l) a několik humanizovaných

2C4 variant k ErbB2 extracelulární doméně (ECD) jak bylo určeno analýzou ELISA v příkladu 3.

Obrázek 9 je stužkovitý diagram V_L a V_H domén monoklonální protilátky 2C4 s bíle značenou CDR páteří (Ll, L2, L3, Hl, H2, H3). V_H postranní řetězce zhodnocené mutagenezí během humanizace (viz. příklad 3, tabulka 2) jsou také ukázány.

³⁰

Obrázek 10 znázorňuje účinek monoklonální protilátky 2C4 nebo HERCEPTINU® na EGF, TGF-α nebo HRG mitogenem zprostředkované aktivaci proteinkinázy aktivované (MAPK).

Obrázek 11 je sloupcový graf ukazující účinek protilátky anti-ErbB2 (samotné nebo v kombina35 cí) na Calu3 xenoimplantát adenokarcinomu plic (3+ErbB2 nadměrný expresor). Poznámka: léčba byla zastavena v 24. dnu,

Obrázek 12 znázorňuje účinek rekombinantní'humanizované rhoňókloriální protilátky 2C4 (rhuMAb 2C4) nebo HERCEPTINU® na růst buněk MDA-175 jak bylo vyhodnoceno „Alamar

Blue“ kvantitativním rozborem.

Obrázek 13 znázorňuje účinnost rhuMAb 2C4 proti MCF7 xenoimplantátu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba a charakterizace monoklonální protilátky 2C4

Myší monoklonální protilátka 2C4, 7F3 a 4D5, které specificky vážou extracelulární doménu ErbB2 byly vyrobeny jak je popsáno v Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990). Stručně, NIH 3T3/HER2-3₄oo buňky (exprimující přibližně 1x105 ErbB2 molekul/buňku) vyrobených jak je popsáno v Hudziak et al. Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 84:7158-7163 (1987)

-45CZ 299702 Bó byly shromážděny solném roztoku ve fosfátovém pufru (PBS) obsahujícím 25mM EDTA a použity k imunizaci BALB/c myši. Myši byly dány injekce i.p. 107 buněk v 0,5 ml PBS v týdnech 0,2,5 a 7. Myš se sérem obsahujícím protilátky, které imunoprecitipovaly s 32P-znaěeným ErbB2 byl podán i.p. injekcemi pšeničného zárodečného aglutin-sepharóze (WGA) přečištěný ErbB2 membránový extrakt v týdnu 9 a 13. To bylo následováno i.v. injekcí 0,1 ml ErbB2 přípravy a buňky sleziny byly fušovány s myší linií buněk myelomu X63-Ag8.653.

Hybridní supernatanty byly podrobeny analýze na ErbB2 technikou EL1SA a radioimunoprecipitací. ErbB2 epitopy navázané na monoklonální protilátky 4D5, 7F3 a 2C4 byly určeny io analýzou kompetetivní vazby (Fendly et al Cancer Research 50:1550-1558 (1990)). Byly provedeny studie křížových blokací na protilátkách přímou fluorescencí na intaktn í buňky s použitím PANDEXTM Screen Machine na vyčíslení fluorescence. Každá monoklonální protilátka byla spojena s izothiokyanátem fluorescinu (FITC) používající zavedené postupy (Wofsy et al,

Selected Methods in Cellular Immunology, p.287, Mishel and Schiigi (eds. San Francisko: W. J.

Freeman Co. (1980)). Stékající jednoduché vrstvy N1H 3T3/HER2-3₄₀₀ buněk byly podrobeny působení trypsinu, jednou promyty a resuspendovány na 1,75x106 bunek/ml ve studeném PBS obsahující 0,5% séra hovězího albuminu (BSA) a 0,1 % NaN₃. Konečná koncentrace 1% latexových částeček (IDC, Portland, OR) byly přidány na snížení překážejících deskových membrán PANDEX . Buňky v suspenzi 20 μΙ a 20 μΐ purifikovaných protilátek (100 μΙ/ml do

0,1 gg/ml) bylo přendáno do PANDEX™ kultivačních destiček a bylo inkubováno na ledu min. Předem určený roztok FlTC-značených monoklonálních protilátek v 20 μΐ byl přidán do každé destičky, inkubován 30 minut, promyt a fluorescence byla vyčíslena PANDEX™. Monoklonální protilátky byly považovány, že mají sdílený epitop, pokud každá zablokovaná vazba z druhé 50% nebo více ve srovnání s vedlejší kontrolou monoklonální protilátek. V tomto pokusu monoklonální protilátky 4D5, 7F3 a 2C4 byly určeny epitopy G/F a popřípadě F.

Znaky inhibice růstu monoklonálními protilátkami 4D5, 7F3 a 2C4 stanoveny použitím buněčné linie tumoru prsu SK-BR-3 (viz Hudziak et al, Mol Cell Biol. 9(3):1165-1172 (1989)). Stručně, SK-BR-3 buňky byly odděleny použitím 0,25 % (obj./obj.) trypsinu a suspendovány v kompletním médiu na denzitu 4x105 buněk na ml. Díky 100μ1 (4x105) bylo umístěno na 96-jamkové destičky, buňky byly ponechány přilnout a 100μ1 média obsahujícího monoklonální protilátku (konečná koncentrace 5 μΙ/ml) bylo pak přidáno. Po 72 hodinách byly jamky vymyty dvakrát PBS (pH 7,5) obarveny krystalovou violetí (0,5% v methanolu) a analyzováno relativní množení buněk jak je popsáno v Sugaman et al, Science 230:943-945 (1985). Monoklonální protilátky 2C4 a 7F3 inhibovaly SK-BR-3 relativní množení buněk okolo 20 až 38 % ve srovnání s 56% inhibici dosaženou monoklonální protilátkou 4D5.

Monoklonální protilátky 2C4, 4D5 a 7F3 byly vyčísleny podle své schopnosti inhibovat fosforylací tyrosinu u proteinů stimulovaných HRG v rozmezí molekulové hmotnosti 180 000 z celého buněčného íyzátu buněk MCF7 (Lewis et al, Cancer Research 56:1457-1465 (1996)). MCF7 buňky jsou popisovány jako exprimující ErbB receptory, ale jen ve velmi malých hodnotách. I když ErbB2, ErbB3 a ErbB4 mají shora identickou molekulární velikost, není možné rozeznat, u kterého proteinu je tyrosin fosfoiylovaný, když byl lyzát všech buněk vyhodnocen Western blotting analýzou.

Nicméně tyto buňky jsou ideální pro kvantitativní rozbor HGR fosforylace tyrosinu, protože za podmínek kvantitativní rozboru v nepřítomnosti exogenně přidaných HGR, ukazují tyto buňky nízké nedetekovatelné hodnoty proteinů s fosfory 1 ováným tyrosinem v rozmezí molekulární hmotnosti 180 000.

MCF7 buňky byly umístěny na 24-jamkovou destičku a do každé jamky k ErbB2 byly přidány monoklonální protilátky a inkubovány 30 minut při pokojové teplotě. Pak byl přidán rHRGpl 177-244 do každé jamky na konečnou koncentraci 0,2 nM a bylo pokračováno v inkubaci po 8 minut. Média byla opatrně odsáta z každé jamky a reakce byly zastaveny přidáním 100μ1

-46CZ 299702 B6

SDS testovacího pufru (5% SDS, 25 mM DTT a 25 mM Tris-HCI, pH 6,8). Každý vzorek (25 μΐ) byl podroben elektroforéze v 4 až 12% gradientním gelu (Novex) a pak elektroforeticky přenesen na polyvinylidendifluorídovou membránu. Antifosfotyrosinové (4G10 z UBI použitého při Ιμΐ/ml) imunobloty byly vyvolány a byla vyčíslena intenzita predominantního reaktivního > - 5 - proužku při molekulové hmotnosti 180ΌΟ0 reflaktančnídensitometrií jak již bylo dříve popsáno (Hoimes et aí, Science 256:1205-1210 (1992); a Sliwkowski et aí, J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665(1994)).

Monoklonální protilátky 2C4, 7F3 a 4D5 významně inhibovaly tvorbu signálu HRG-indukované ío fosforylace tyrosinu o molekulové hmotnosti 180 000. V nepřítomnosti HRG, nebyla žádná z protilátek schopná stimulovat fosforylaci tyrosinu v proteinu o molekulové hmotnosti 180 000.

Také tyto protilátky nereagovaly křížovými vazbami s EGFR (Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990), ErbB3 nebo ErbB4. Protilátky 2C4 a 7F3 významně inhibovaly stimulaci fosforylace tyrosinu p 180 do 25% kontroly. Monoklonální protilátka 4D5 byla schopná blokovat

HRG stimulaci fosforylace tyrosinu 50%. Obrázek 2A ukazuje křivky odpovědí na dávku 2C4 a 7F3 inhibici HRG stimulace fosforylace tyrosinu pl80 jak bylo určeno reflaktantní densitomet-, rií. Vyhodnocení této inhibiční křivky používající 4 parametrovou fit poskytlo výtěžek IC₅₀ 2,8+0,7 nM a 29,0+4,1 nM na 2C4 a 7F3.

Inhibice HRG vázající se k MCF7 liniím buněk rakoviny prsu vlivem anti-ErbB2 protilátek byla provedena s jednovrstevnou kulturou na ledě v 24-jamkových destičkách (Lewis et aí, Cancer Research 56:1457-1465 (1996)), Anti-ErbB2 monoklonální protilátky byly přidány do každé jamky a inkubovány 30 minut. 1251 značený rHRGpl 177-244 (25pm) byl přidán a bylo pokračováno v inkubaci po 4 až 16 hodin. Obrázek 2B poskytuje křivky odpovědi na dávku 2C4 a 7F3 inhi25 biče HRG vázající se k MCF7 buňkám. Různé koncentrace 2C4 a 7F3 byly inkubovány s MCF7 buňkami v přítomnosti 1251 značeného rHRGpl ₁₇₇_244 a inhibiční křivky jsou ukázány na Obrázku 2B. Analýzy těchto dat poskytly IC_5O 2,4+0,3 nM a 19,0+0,3 nM na 2C4 a 7F3. Maximální inhibice 74% pro 2C4 A 7F3 byly v souladu s daty fosforylace tyrosinu.

K určení, zda účinek anti-ErbB32 protilátek pozorovaný na MCF7 buňkách byl obecným jevem, byly linie buněk lidského tumoru inkubovány s 2C4 a 7F3 a přiměřeným množstvím specificky navázaného 1251 značeného rHRGpl ₁₇₇_₂44 bylo určeno (Lewis et al., Cancer Research 56: 1457-1465 (1996)). Výsledky této analýzy jsou ukázány na obrázku 3. Vazba 1251 značeného rHRGpl 177-244 může být významně inhibována buď 2C4, nebo 7F3 ve všech buněčných liniích * 35 s výjimkou linie buněk rakoviny prsu MDA-MB-468, o kterých je známo, že exprimují málo nebo žádný ErbB2. Zbývající linie buněk, o kterých je známo, že exprimují ErbB2, s hladinou ErbB2 široce se lišící mezi těmito liniemi buněk. Ve skutečnosti rozmezí exprese ErbB2 se v liniích testovaných buněk lišilo více než o 2 řády. Například BT-20, MCF7 a Caov3 exprimují 104 ErbB2 receptor/buňku, kdežto BT-474 a SK-BR-3 exprimují 104 ErbB2 receptor/bufiku.

Vzhledem k širokému rozmezí ErbB2 exprese v těchto buňkách a dat uvedených výše, bylo usouzeno, že interakce mezi ErbB2 a ErbB3 nebo ErbB4, je sama vysoce afinitní interakcí, ke které dochází na povrchu plazmatické membrány. Účinky protilátek 2C4 a 4D5 na inhibici růstu na MDA-MB-175 a SK-BR-3 buňky v přítomnosti nebo nepřítomnosti exogenního rHRGpl bylo stanoveno (Schaefer etaí, Oneogene 15:1385-1394 (1997)). Hladiny ErbB2 v MDA-MB45 175 buňkách jsou 4-6 vyšší než hladiny nalezené v normálních epiteliálních buňkách rakoviny a tyrosin ErbB2-ErbB4 receptor je konstitutivně fosforylován v MDA-MB-175 buňkách. MDAMB-175 buňky byly ošetřeny anti-ErbB2 monoklonálními protilátkami 2C4 a 4D5 (10 μg/ml) po 4 dny. V kvantitativním rozboru barvením krystalovou violetí, inkubace 2C4 ukázala silný inhibiční účinek na tuto linii buněk (obrázek 4A). Exogenní HRG významně nezměnily tuto inhibici. Na druhou stranu 2C4 neukázala žádný inhibiční účinek na ErbB2 nadměrně exprimující linii buněk SK-BR-3 (obrázek 4B). Monoklonální protilátka 2C4 byla schopná inhibovat množení buněk MDA-MB-175 ve větší míře než monoklonální protilátka 4D5, jak v přítomnosti tak nepřítomnosti exogenní HRG. Inhibice buněčného množení 4D5 je závislá na ErbB2 exprimované hladině (Lewis etaí, Cancer Immunoí Immunother. 37:255-263 (1993)). Maximální inhibice

-47CZ 2W7W2 B6 % v SK-BR-3 buňkách mohla být detekována (obrázek 4B). Nicméně tento účinek mohl podlehnout exogenním HGR.

Příklad 2

Na HGR závislá asociace ErbB2 s ErbB3 je blokována monoklonální protilátkou 2C4

Schopnost ErbB3 asociovat s ErbB2 byla testována ve společném imunoprecitipačním pokusu.

1,0 x 10,6 MCF7 nebo SK-BR-3 buněk bylo vyseto na šest kultivačních destiček v 50:50

DMEM/Hanťs F12 médiu obsahující 10% zárodečného hovězího séra (FBS) a 10 mM HEPES, pH 7,2 (růstové médium) a necháno přilnout přes noc. Buňky byly vyhladověny po 2 hodiny v růstovém médiu bez séra před začátkem pokusu.

Buňky byly krátce promyty solným roztokem s fosfátovým pufrem (PBS) a pak inkubovány s buď 100 nM značené protilátky zředěné v 0,2% hmotnost/obj. hovězího séra albuminu (BSA), RPMI médiu s 10 mM HEPES, pH 7,2 (vazebný pufr), nebo se samotným vazebným pufrem (kontrola). Po jedné hodině při pokojové teplotě, HRG byl přidán v konečné koncentraci 5nM do poloviny jamek (+). Podobný objem vazebného pufru byl přidán k dalším jamkám (-). V inkuba20 ci bylo pokračováno dalších přibližně 10 minut.

Supematanty byly odstraněny odsátím a buňky byly lyžovány v RPMI, 10 mM HEPES, pH 7,2, 1,0% obj./obj. Triton X-100TM, 1,0% hmotn./obj. CHAPS (lyzační pufr) obsahující 0,2mM PMSF, 10 pg/ml leupeptinu a 10 TU/ml aprotinu. Lyzáty byly přečištěny od nerozpustného materiálu centrifugách

ErbB2 byl imunoprecitipován použitím monoklonální protilátky kovalentně navázané k afmitnímu gelu (Affi-Prep 10, Βίο-Rad). Tato protilátka (Ab-3, Oncogene Sciences) rozeznává cytoplazmatické domény epitopu. Imunoprecitipace byla provedena přidáním 10 μΐ gelové hmoty obsahující přibližně 8,5 μΐ mobilizované protilátky ke každému lyzátu a vzorky byly ponechány se míchat při pokojové teplotě dvě hodiny. Gely byly usazeny centrifugách Gely byly vsádkově promyty třikrát lyzačním pufrem, aby byl odstraněn nenavázaný materiál. SDS testovací pufr byl pak přidán a vzorky byly krátce zahřátý ve vroucí vodní lázni.

Supematanty byly nechány běžet na 4 až 12% polyakrylamidovém gelu a elektroblottovány na nitrocelulózovou membránu. Přítomnost ErbB3 byla stanovena testováním blotů s polyklonální protilátkou proti její cytoplazmatické doméně epitopu (c-l 7, Santa Cruz Biotech). Bloty byly vizualizovány chemiluminiscenčním substrátem (ECL, Amersham).

Jak je ukázáno v kontrolních pruzích obrázků 5A a 5B pro MCF7 a SK-BR-3 buňky, ErbB2 byl přítomen v ErbB2 imunoprecitipátu pouze, když byly buňky stimulovány HRG. Pokud byly buňky nejdříve inkubovány s monoklonální protilátkou 2C4, ErbB3 signál byl v MCF7 buňkách zrušen (obrázek 5A, dráha 2C4 +) nebo v podstatě snížen v SK-BR-3 buňkách (obrázek 5B, dráha 2C4 +). Jak je ukázáno na obrázcích 5A-5B monoklonální protilátka 2C4 blokuje na heregulinu závislou asociaci ErbB3 s ErbB2 jak v MCF7, tak SK-BR-3 buňkách v podstatě účinněji než HERCEPTIN®. Předcházející inkubace s HERCEPTINEM® snižuje ErbB signál v MCF7 lyzátech, ale má malý nebo žádný účinek na množství ErbB2 společně precitipovaného z SK-BR-3 lyzátů. Předcházející inkubace s protilátkou proti EGF receptorů (Ab-1, Oncogene Science) neměla žádný účinek na schopnost ErbB3 společně imunoprecitipovat s ErbB2 v kterékoliv buněčné linii.

-48CZ 299702 B6

Příklad 3

Humanizované 2C4 protilátky . Různé domény myší monoklonální protilátky 2C4 byly nejdříve klonovány do vektoru, který umožňuje produkci myšího/lidského chimérického Fab fragmentu. Byla izolovaná totální RNA z hybridních buněk použitím Stratagene RNA extrakčního kitu podle návodů výrobce. Variabilní domény byly amplifikovány RT-PCR. Přečištěny na gelu a vloženy do derivátu plazmidu pUC119 obsahující kappa konstantní doménu a lidskou C_H1 doménu jak bylo dříve popsáno ío Carter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992), a patent US 5 821 337). Výsledný plazmid byl transformován do buněk E. Coli kmen 16C9 pro expresi Fab fragmentu. Růst kultur, indukce proteinové exprese a purifikace Fab fragmentu byly dříve popsány (Werther et al.,

J. Immunol, 157:4986-4995 (1996) a Presta et al., Cancer Research, 57:4593-4599 (1997)).

Purifikované chimérické 2C4 Fab fragmenty byly srovnány smyší protilátkou 2C4 na základě kjejí schopnosti vázat 125I-HGR k MCF7 buňkám a inhibovat aktivaci rHGR fosforylace tyrosinu v pl 80 v MCF7 buňkách. Jak je ukázáno na obrázku 6A, chimérický 2C4 Fab fragment je velmi účinný při rozrušení tvorby vysoce vazebného místa ErbB2-ErbB3 na linii lidských buněk rakoviny prsu, MCF7. Relativní IC₅₀ hodnota vyčíslená pro intaktní myší 2C4 je

4,0+0,4 nM, zatímco hodnota pro Fab fragment je 7,7+1,1 nM. Jak je ilustrováno na obrázku 6B, monovalentní chimérický 2C4 Fab fragment je velmi účinný při rozrušení na HRG závislé aktivace ErbB2-ErbB3. IC₅o hodnota vypočtená pro intaktní myší monoklonální protilátku 2C4 je 6,0+2 nM, zatímco hodnota pro Fab fragment je 15,0+2 nM.

DNA sekvenování chimérického klonu dovolilo identifikaci CDR zbytků (Rabat et aí, Sequences of Protein of Immunological Interest 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betheseda, MD. (1991)) (obrázky 7A a B). Použitím oligouukleotid řízené mutageneze, bylo všech šest CDR oblastí zavedeno do kompletní lidské stavby (V_L kappa podskupina I a V_H podskupina III) obsažená na plazmidu VX4 jak bylo již dříve popsáno (Presta et al.,

Cancer Research, 57:4593-4599 (1997)). Protein z výsledné „CDR-výměny“ byl exprimován a purifíkován viz. výše. Byly provedeny vazebné analýzy pro srovnání dvou verzí. Stručně, NUNC MAXISORPTM destička byla zahřáta s 1 mg/ml ErbB2 extracelulámí domény (ECD, vyrobené a popsané v WO 90/14 357) v 50 mM karbonátového pufru, pH 9,6, přes noc při 4 °C a pak zablokována ÉLISA ředidlem (0,5% BSA, polysorbát 20, PBS) při pokojové teplotě po 1 hodinu.

Mnohonásobně naředěné vzorky v ELISA ředidlech byly inkubovány na destičkách po 2 hodiny. Po promytí, navázané Fab fragmenty s biotynyl ovanou myší anti-lidskou kappa protilátkou byly následně detekovány streptavidinem spojeným s křenovou peroxidázou (Sigma) a použitím 3,3',5,5'“tetramethylbenzidin (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) jako substrátem. Absorbance byla měřena při 540 nm. Jak je ukázáno na obrázku 8A, všechny vazby zanikly konstrukcí CDR-výměně lidského Fab fragmentu.

Kobnově vazeb humanizovaných Fab, byly zkonstruováni mutanti použitím DNA z CDRvýměny jako substrátu. Použitím počítačem vytvořeného modelu (obrázek 9), byly navrženy tyto mutace na změnu stavební oblasti na myších protějšků v pozicích, kde by změna mohla ovlivnit

CDR konformaci nebo povrch proti látka—anti gen. Mutanti jsou ukázáni v tabulce 2.

-49CZ 299702 B6

Tabulka 2

Mutant č.	Substituce ve stavební oblasti (FR)
560	ArgH71Val'
561.	AspH73Arg
562	ArgH71Val„AspH73Arg
568	ArgH71 Val, ÁspH73Args AlaH4§Gly
569	AigH71Val, AspH73Arg. Phell67Ala
570	AigH7l Val, AspH73Arg, AšnH76Afg
571	ArgH7l Val, AspH73Arg,LeuH78Val
574	ArgH71 Val, AspH73 Arg, IleH69Leu
56869	ArgH? 1 Val, AspH73Aig, AlaH49Gly, PhcH67Ala

Vazebné křivky pro různé mutanty jsou ukázány na obrázcích 8A-C. Humanizované Fab verze 574 se změnami ArgH71Val, AspH73Arg a IleH69Leu vypadají, že mají odstraněny vazby ve srovnání s originálním chimérickým 2C4 Fab fragmentem. Navíc FR a/nebo CDR zbytky jako jsou L2, L54, L55, L56, H35 a/nebo H48, mohou být modifikovány (tj. nahrazeny, jak následuje - IleL2Thr, ArgL54Leu, ThrL55Glu, AspH35Ser a ValH48Ile) v souladu s dalším zlepšením nebo zvýšením aktivity humanizované protilátky. Jinak nebo navíc humanizovaná protilátka může být afinitně vyzrálá za účelem dále zlepšovat a vylepšovat její afinitu a/ňebo další ío biologické vlastnosti.

Humanizovaná 2C4 verze 574 byla afinitně vyzrálá použitím postupu fág projevu. Stručně, humanizovaná 2C4.574Fab byla klonována do vektoru projevu, fága jako fúze genu III. Pokud jsou fágové částice indukovány infekcí s M13K07 pomocníkem fága, tato fúze dovoluje Fab, aby byl zobrazen na N-koncí vláknitého ocásku fága v genu III (Bača et al., J. Biol. Chem.

, 272:10678(1997)).

Byly sestrojeny jednotlivé knihovny pro každou zCDRs definovaných výše. V těchto knihovnách, měly aminokyseliny CDEs, které byty identifikovány použitím model tvořícího ''20 'počítače (obrázek 9) jako potenciálně významné pro vazbu EřbB’27 stejnou šanci na výběr z oligonukleotidů obsahující „NNS“ na jejich kodonech. Knihovny pak byly umístěny proti ErbB2 ECD obalu na NUNC MAXISORP™ destičkách s 3% sušeným mlékem v PBS s 0,2 % TWEEN 20 (MPBST) použitých na místě všech blokujících roztoků. Aby byl selektován fág s vyššími afinitami než ten z 2C4.574 v sériích 3,4 a 5, rozpustné ErbB2 ECD nebo rozpustné

Fab 2C4.574 byly přidány během promývacích kroků jako konkurenti. Promývací časy byly prodlouženy na 1 hodinu při pokojové teplotě.

Po pěti sériích, byly jednotlivé klony izolovány fag-ELISA. Jednotlivé klony byly pěstovány v 96-jamkových kultivačních destičkách se spodní stranou tvaru U a fágy byly indukovány přidáním pomocného fága. Po nárůstu během noci byly E. Coli buňky peletovány a supematant obsahující fága byl přenesen do 96-jamkových destiček, kde byl fág blokován MPBST po dobu hodiny při pokojové teplotě. NUNC MAXISORP destičky obalené ErbB2 ECD byly také blokovány MPBST jak je zmíněno výše. Blokované fágy byly inkubovány na destičkách hodiny. Po byl promytí navázaný fág detekován použitím křenové peroxidázy spojené

-50CZ 299702 B6 s anti-Ml3 monoklonální protilátkou (Amersham Pharmacia Biotech, lne. 27-9421-01) a zředěné 1:5000 vMPBST, následující 3,3', 5,5-tetramethylbenzidin substrátem. Absorbance byla měřena při 450 nm.

48 klonů z každé knihovny, které poskytly nejvyšší signály byly podrobeny DNA sekvenování.

Tyto klony, jejichž sekvence se vyskytly nejčastěji byly subklonovány do výše popsaného vektoru. Který umožňuje expresí rozpustných Fab. Tyto Fab byly indukovány, od proteinu vyčištěny a vazby puntíkovaných Fab byly analyzovány ELISA analýzou jak bylo popsáno výše a vazby byly srovnány s humanizovanou verzí 2C4.574 na počátku.
Po zajímavých mutacích v jednotlivých CDRs byly dodatečně identifikovány mutanti, kteří byly různými kombinacemi těch, které byly zkonstruovány a testovány viz. výše. Mutanti, kteří poskytly zlepšené vázání vzhledem k 574 jsou popsány v tabulce 3,
Tabulka 3
Ustanovení mutantů odvozených od afínitně vyzrálých 2C4.574
Jméno mutanta	Záměna za 574	Mutant/574*
H3.A)	serH99trp, melH341eu	03.80
L2.F5	scrL50lrp, tyrL53gly, metH34]cu	0,087
HL3.B3	thrH28gln;thrH30ser, metH341eu	0.572
L3.G6	iyrL92pro, i)eL93íys, metH341cq	0.569
L3.G11	tyrL92ser.. ileL93arg, tyrL94gly, melH341eu	0.561
L3.29	tyrL92phe, tyrL9óasn, meiH341ěu	0.552
L3.36	tyřL92phe, tyrL941eu, iýrL96próř métH34Iéu	0:215
654	serL50irp, mélH341eu	0176
655	mětH34ser	0.542-
659	serLóOtrp, metH34scř	0.076
L2.F5.H3.AI	sěrLŠOttp, iyrL53gÍy,.metH34]eurseřH99trp	Q.Í75
L3G6.H3.Ai	tyrL92pro, i ÍéL93lysř metH34]eu, serH99trp	0218
HL3.B3H3.AI	thrB28glh, thrH3Óseř, mělH34Íeu, sěrH99trp	0.306
L3G1L.H3.A1	lyrL92s'er, ileL93arg; tyiL94gIý, meiH34Ieu, serH99trp	0.248'
65LH3A1	serL50trp, meiH34leu, serH99irp	0;133
654L3.G6	'serL50trpř nx:(H341eu, ryrL9'2pro, ileL93iys	0.213 '
654X3.29	serL50lrp,. metH34leu, lyíL92phe>tyrL96asn	0.236
654.L3.36	serL50trp, métH3'51eu, tyrL92phe, iýrL941eu,· tyrL96pro	0.141

Poměr množství potřebného mutanta poskytujícího střední OD standardní křivky k množství 574 potřebného k poskytnutí střední OD standardní křivky v ErbB2 - ECD ELISA. Čísla menší než 1.0 naznačují, že mutant váže ErbB2 2krát lépe než ho váže 574.

-51 CZ 299702 B6 i

Následující mutanti byly také zkonstruováni a jsou v současnosti ohodnocovány.

659.L3.G6 serLSOtrp, me(H34ser,tyrL92pro,iléL931ys

659.L3.GI 1 serL50trp, metH34ser, tyrL92$er,iLL93arg, íyrL94gly

659.L3.29

659.L336

L2F5L3GÓ

L2F5.L3G 11

L2F5.L29

L2F5.L36

L2F5.L3G6.655

L2F5.L3G1 L655

L2F5.L29.655

L2F5.L36.655 serLSOíip, me{H34ser, íyrL92phe,'tyrL96asn serL50trp, metH34ser; tyrL92phe jyrL94Ieu, tyrL96pro serL50trp, tyrL53g!y, meiH34leu, tyřL92pTo₍ ileL931ys serLSOlrp, tyrL53gly, meiH34Íeu, tyrl,92ser, ileL93arg, tyrL94g!y serL50irp, íýřL53glý, me(H34leu, íyrL92phe, tyrL96asn $erL50trp, tyrL53gly, metH341eiií tyrL92phe, tyrL941eu, tyrL96ptó scrL50lrp,tyrL53gly, metH35ser_t4ⁱyrL92pro_í ;jÍeL931ýs^; serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, iýrL92šeř, ileL93arg, tyrL94gly. SérLSOfrp, tyrL53gIy, řrteíH34.seř, týrL92phe, tyrL96asn scrL50trp, lyrL53gly, metH34ser, tyrL92phe,. lyrL94leu, lyrL96pró

Následující mutanti navržení homologním skenem jsou v současnosti konstruováni.

678	thrHSOála
679	ihrH30ser
680	lysH64arg
681	JeuH96val
682	thrL97ala
683	ihrL97ser
684 685	tyrI9óphe tyrL96álá
686 687 Zoo	tyrL9lphe ihrL56ala rtíííT ΟΌλΙχ
OOQ 689	gjnLz8ala ;gínL28£lu-

Výhodnou aminokyselinou v H34 by měl být methionin. Změna na leucin může být provedena pokud bylo zjištěno, že na této pozici probíhá oxidace.

AsnH52 a asnH53 byly shledány jako silně výhodné pro vázání. Pozměnění těchto zbytků na alanin nebo aspartamovou kyselinu podstatně snižuje vázání.

Intaktní protilátka obsahující variabilní lehké a těžké domény humanizované verze 574 s lidským IgG těžkým řetězcem konstantní oblasti byla připravena (viz. patent US 5 821 337). Intaktní protilátka je produkována buňkami vaječníku Čínského křečka. Tato molekula je v tomto dokumentu ustanovena jako rhuMAb2C4.

-52CZ 299702 B6 $

Příklad 4 J ΐ

n

Monoklonální protilátka 2C4 blokuje EGF, TGF-α nebo HRG zprostředkovanou aktivaci .jj

MAPK. ' 1 ⁵ , i

Mnoho receptorů růstového faktoru signalizuje přes dráhu mitogen-aktivované proteinkinázy (MAPK). Tyto dvojitě specifitní kinázy jsou jedním z klíčových koncových bodů v signální ;

. transdukční dráze, která nakonec spouští dělení rakovinných buněk. Schopnost monoklonální protilátky 2C4 nebo HERCEPTINU® inhibovat EGF, TGF-α nebo HRG aktivaci MAPK byla ío ustanovena následujícím způsobem.

MC7 buňky (105 buněk/jamku) byly umístěny do séra obsahujícího média ve 12 jamkách kultivačních destiček. Následující den byla buněčná média odstraněna a čerstvá média obsahující 0,1% sérum byla přidána do každé z jamek. Tento krok byl opakován následující den, před kvantitativním rozborem byla média odstraněna vazebným pufrem neobsahující sérum (Jones elai, J. Biol. Chem., 273:11667-74 (1998) a Shefer et ai, J. Biol. Chem., 274:859-66 (1999)).

Buňky byly ponechány, aby vytvořily rovnováhu při pokojové teplotě a pak byly inkubovány 30 minut s 0,5 ml 200nM HERCEPINU® nebo monoklonální protilátky 2C4. Buňky byly ošetřeny 1 nM EGF, 1 nM TGF-α nebo 0,2 nM HRG 15 minut. Reakce byla zastavena odsátím buněč20 ného média a pak přidáním 0,2 mM HRG 15 minut. Reakce byla zastavena odsátím buněčného média a pak přidáním 0,2 ml SDS-PAGE testovacího pufru obsahujícího 1% DTT. MAPK aktivace byla ustanovena Western blottingem použitím anti-aktívní MAPK protilátky (Promega) jak bylo dříve popsáno (Jones et al., J, Biol. Chem., 273:11667-74 (1998)).

Jak ukazuje obrázek 10, monoklonální protilátka 2C4 podstatně blokuje EGF, TGF-α a HRG zprostředkovanou aktivaci MAPK ve větší míře než HERPECTIN®. Tato data naznačují, že monoklonální protilátka 2C4 se váže k povrchu ErbB2, který je používán pro svou asociaci s buď EGFR, nebo ErbB3 a proto zabraňuje tvorbě komplexu signálního receptoru.

' Monoklonální protilátka 204 také dokázala inhibovat heregulin (HRG)-závisIou aktivaci. Aktivace signální transdukční dráhy PI3 kinázy je důležitá pro přežití buněk (Carraway et al., J. Biol.

Chem., 270:7111-6 (1995)). V buňkách tumoru, PI3 aktivace kinázy může hrát roli v útočném fenotypu (Tan et al., Cancer Research. 59:1620-1625 (1999)). Silnější dráha je nejdříve přeměněna serin/threonin kinázou AKT (Bos et al., Trends Biochem Sci. 20:44M42 (1995)). Komple35 xy vytvořené mezi ErbB2 a buď ErbB3, nebo EGFR mohou iniciovat tyto dráhy jako odpověď na heregulin nebo EGF (Olayioye etai, Mol. &Cell. Biol. 18:5042-51 (1998)), Karunagaran etai,

EMBO Journal. 15:254-264 (1996), a Kiymskaya et al., Am. J. Phyziol. 276:L246-55 (1999)).

Inkubace MCF7 buněk rakoviny prsu s 2C4 inhibuje heregulinem zprostředkovanou AKT aktivaci. Navíc základní hladina AKT aktivace se vyskytuje v přítomnosti přídavku heregulinu a je dále snižována přidáním 2C4. Tato data ukazují, že 2C4 může inhibovat aktivaci PI3 kinázy ErbB ligandem a že taková inhibice může vést k apoptóze.

Proto monoklonální protilátka inhibuje ligandem iniciovanou ErbB signalizaci přes dvě hlavní signální dráhy - MAPkinázy (hlavní prolíferační dráha) a PI3 kinázy (hlavní dráha pro přežití/45 anti-apoptózová dráha).

Příklad 5 . Kombinace monoklonální protilátky 2C4 a HERCEPTINU® in vivo

Xenoimplantátový model používající linie buněk plicního adenokarcinomu, Calu-3 bylý použity pro ustanovení účinnosti anti-HER2 monoklonálních protilátek, samotných nebo v kombinaci, k potlačení růstu tumoru. Samičky NCR nahé myši byly inokulovány podkožně s20 x 10 6

-53CZ 299702 B6 buňkami v 0,1 ml. Měření tumoru bylo děláno dvakrát za týden a když tumorový hrbolek dosáhl objemu 100 mm³, zvířata byla náhodně rozdělena do 7 léčebných skupin. Léčba skupin byla:

(a) kontrola monoklonálních protilátek MAbl 766, (b) HERCEPT1N®, 10 mg/kg ......_..... . ......

(c) monoklonální protilátka 7C2, 10 mg/kg (d) monoklonální protilátka 2C4, 10 mg/kg (e) HERCEPTIN® a 7C2, každá 10 mg/kg (f) HERCEPTfN® a 2C4, každá 10 mg/kg (g) Monoklonální protilátky 2C4 a 7C2, každá 10 mg/kg io

Zvířata byla léčena dvakrát týdně, do týdne 24. Objemy tumorů byly měřeny dvakrát za týden do dne 38.

Jak je ukázáno na sloupcovém grafu na obrázku 11, léčba Calu-3 a tumory nesoucích myší s 2C4 nebo HERCEPTINEM® podstatně inhibovaly růst tumorů. Kombinace HERCEPTINU® a 2C4 nebo HERCEPTINU® a 7C2 byla silně nadprůměrná ve srovnání k monoklonálním protilátkám podávaným samostatně.

Příklad 6

Lidské linie buněk tračníku a konečníku jako jsou HCA-7, LS174T nebo CaCo-2 byly implantovány do nahé myši bez brzlíku jak bylo popsáno v Sheng et al., J. Clin. Invest 99: 2254-2259 (1997). Jakmile tumory dosáhly 100 mm³ v objemu, skupiny zvířat byly léčeny 10 až

50 mg/kg monoklonální protilátky 2C4 podávané dvakrát týdně injekcí do nitropobřišnicové dutiny. Monoklonální protilátka 2C4 potlačovala růst kolorektálních xenoimplantátů in vivo.

Příklad 7

Léčba rakoviny prsu humanizovanými protilátkami 2C4

Účinek rhuMAb 2C4 nebo HERCEPTINU® na buňky rakoviny prsu, které neexprimují ErbB2 byly ustanoveny v 3 denním „Almar Blue“ kvantitativním rozboru (Ahmed, S. A. J. Immwiol.

Methods 170:211-224 (1994) a Page et al., Int. J. Oncol. 3:473—476 (1994)). Buňky použité při tomto kvantitativním· rozboru byly MDA-175 lidské buňky rakoviny prsu, které exprimovaly ErbB2 v hladině 1+. Jak je ukázáno na obrázku 12, růst této linie buněk rakoviny prsu, MDA-175 je podstatně inhibo.ván na,dávce závislým způsobem přidáním rhuMAb-2C4 ve srovnání s léčbou HERCEPTINEM®.

⁴⁰

Účinnost rhuMAb 2C4 proti MCF7 xenoimplantátům, což jsou pozitivní receptory estrogenů(ErbB+) a exprimují nižší hladiny ErbB2 byl ustanoven. Byly použity samičky myší obohacených estrogenem. RhuMAb 2C4 byla podávána v dávce 30 mg/kg každý týden. Jak je ukázáno na obrázku 13 rhuMAb-2C4 byla účinná v inhibování růstu tumoru rakoviny .prsu invivo, kde rakovina prsu nebyla charakterizována jako nadměrně exprimuj ící ErbB2.

Příklad 8

Farmakokinetika, Metabolismus a Toxikologie 2C4

RhuMAb 2C4 byla stabilní v lidském séru. Nebyl pozorován žádný důkaz o agregátech nebo tvorbě komplexů v biologických matricích. V myši se rhuMAb 2C4 odbourával rychleji než

-54CZ 299702 B6

HERCEPTIN®. Farmakokinetické analýzy ukazují, že podání rhuMAb 2C4 okolo 2 až 6 mg/ml týdně by mělo odpovídat koncentracím podobným HERCEPTINU® jak byl dříve podáván.

Vystavení výslednému sérum 2C4 by mělo značně přesáhnout IC50 určené in vitro.

..5 - Toxikologícká analýza byla provedena na opicích makak (2 samečkové a 2 samičky ve skupině) rhuMAb 2C4 byla podávána nitrožilně 0, 10, 50 nebo lOOmg/kg dvakrát týdně po 4 týdny. Měření toxikologické analýzy zahrnovalo tělesnou hmotnost (-2, -1 týdny a potom týdně), konzumaci potravy (kvalitativně, denně), tělesné zkoušky se stanovením krevního tlaku, elektrokardiogram (ECG) a tělesnou teplotu (-2, -1 týdny a týdny 2 a 4,4 hodiny po dávce následovaná io ten týden druhou dávkou), srdeční hodnocení ultrazvukem (následující po první dávce v týdnu 1 a na konci analýzy, týden 4), klinická patologie (základní na konci týdne 2 a 4), analýza moči (základní na konci týdne 2 a 4) analýza vzorků protilátky (základní na konci týdne 2 a 4) stejně tak jako nekropsie a histopatologická analýza.

Všechna zvířata ve všech skupinách přežila do konce analýzy. Žádné významná klinická pozorování nebo rozdíly mezi skupinami nebyly zaznamenány. Výsledky nekropsie neukázaly žádné závažné nepřípustné anomálie v orgánech od žádného zvířete. Žádné významné mikroskopické

- abnormality nebyly pozorovány v žádné tkáni žádného ze zvířat. Žádné významné změny v ECG nebyly zaznamenávány k doplnění analýzy. Navíc žádné rozdíly mezi jednotlivými skupinami nebyly pozorovány.

Příklad 9

Eskalace dávky

Pacientům s rakovinou je podávána první dávka rhuMAb 2C4 v jedné z pěti hladin dávek (0,05, 0,5 2,0, 4,0 nebo 10 mg/kg, 6 předmětů pro hladinu dávky), následována vymýváním po 4 týdny. Týden 5 je pacientům dávána stejná dávka 4krát týdně následovaná dále 4 týdenním vymýváním. Pacienti s kompletní odezvou, částečnou odezvou nebo stabilní nemocí byli schopní dalších analýz.

Příklad 10

Léčba zpětného zhoršení nebo neustupující metastatické rakoviny prostaty

RhuMAb 2C4 je plné délky, humanizovaná monoklonální protilátka (produkována CHO buňkami) namířená proti ErbB2. RhuMAb 2C4 blokuje spojené ErbB2 s jinými členy rodiny ErbB a proto inhibuje mezibuněčné signály přes ErbB dráhu. Naproti tomu HERCEPTIN®, rhuMAb 2C4 nejen že inhibují růst tumoru nadměrně produkujících ErbB2, ale také blokují růst tumorů, které vyžadují na ErbB-ligandu závislý signál.

RhuMAb 2C4 je označena jako jedno činidlo na léčbu pacientů s hormonální neustupující (na androgenu nezávislou) rakovinou prostaty. Primární koncové body pro účinnost zahrnují celkové přežití ve srovnání s nejlépe dostupnou péčí (Mitoxantron, Prednison), pokud jsou použita jako samostatná činidla a bezpečnost. Sekundární účinnost koncových bodů zahrnuje: čas na postup nemoci, míra odpovědí, kvalita života, bolest/nebo trvání odpovědi. RhuMAb 2C4 je podáván nitrožilně (IV) týdně nebo každé tři týdny při 2 nebo 4 mg/kg, v tomto pořadí až do konce postupu nemoci. Protilátka je dodávána jako multidávková tekutá sestava (20 ml doplněno na koncentraci 20 mg/ml nebo vyšší koncentraci).

Příklady léčiv, která mohou být kombinována s anti-ErbB2 protilátkou (která blokuje aktivaci ligandu ErbB2 receptorů) k léčení rakoviny prostaty (tj. na androgenu nezávislé rakoviny prostaty) zahrnující inhibitor famesyltransferázy, anti-angiogenní činidlo (tj. anti-VEGF proti-55CZ 299702 B6 látku), EGFR-cílené léčivo (tj. C225 nebo ZDI839), další anti-ErbB2 protilátka (tj. růst inhibující protilátka jako je HERCEPTIN® nebo anti-ErbB2 protilátka, která indukuje apoptózu jako 7C2 nebo 7F3, zahrnující její humanizované a/nebo afmitně vyzrálé varianty), cytokin (tj. IL-l, IL-2, G-CSF nebo GM-CSF), anti-androgen (jako flutamid nebo kyproteronacetát), leuprolid,

5. suramin,. chemoterapeutické činidlo jako je vinblastin, estramustin, mitoxantron, liarozol (činidlo blokující metabolismus kyseliny retinové), cyklofosfamid, antraciklinová antibiotika jako doxorubicin, taxan (tj. paclitaxel nebo docetaxel) nebo methotrexát nebo jakákoliv kombinace výše zmíněného, jako je vinblastin/estramustín nebo cyklofosfamid/doxorubicin/methotrexat, prednison, hydrokortizon nebo jejich kombinace. Standardní dávky pro tato různá léčiva mohou být ío podávány, tj. 40 mg/m²/týden docetaxel (TAXOTER®, 6(AUC)karboplatina a 200 mg/m² paclitaxel (TAXOL®).

Příklad 11

Léčba metastatické rakoviny prsu

RhuMAb 2C4 je označen jako jednoduché činidlo pro léčení pacientů s metastatickou rakovinou prsu, jejichž tumory neexprimují ErbB2. Primární koncové body zahrnují celkové přežití ve srovnání se samotnou chemoterapií a bezpečnost. Sekundární účinnost koncových bodů zahrnuje: rychlost postupu nemoci, rychlost odpovědi, kvalitu života a/nebo trvání odpovědi. RhuMAb 2C4 je podáván nitrožilně (IV) týdně, nebo každé tři týdny při 2 nebo 4 mg/kg, v tomto pořadí až do konce postupu nemoci. Protilátka je dodávána jako multidávková tekutá sestava (20 ml doplněno na koncentraci 20 mg/ml nebo vyšší koncentraci).

Příklady léčiv, která mohou být kombinována s anti-ErbB2 protilátkou (která blokuje aktivaci ligandu ErbB2 receptorů) k léčení rakoviny prsu (tj. metastatickou rakovinu prsu, která není charakterizována nadměrnou expresí ErbB2) zahrnuje chemoterapeutická činidla jako antracyklinová antibiotika (tj. doxorubicin), cyklofosfamid, taxan (tj. paclitaxel nebo docetaxel), nevelbin, xeloda, mitomycin C, sloučeniny platiny, oxiplatina, gemcitabin nebo kombinace dvou nebo více takových látek jako je doxorubicin/cyklofosfamid, další anti-ErbB2 protilátka (tj. růst inhibující protilátka jako je HERCEPTIN® nebo anti-ErbB2 protilátka, která indukuje apoptózu jako 7C2 nebo 7F3, zahrnující její humanizované a/nebo afinitně vyzrálé varianty), antiestrogeny (tj. tamoxifen), inhibitor fenyltransferázy, anti-angiogení činidlo (tj. anti-VEGF protilátka)

EGFR-cílená léčiva (tj. C225 nebo ZD1839, cytokin (tj. IL-1, IL-2, G-CSF nebo GM-CSF) nebo kombinace výše zmíněného. Mohou být použity standardní dávky pro tato dodatečná léčiva.

RhuMAb 2C4 je dodatečně indikován s HERCEPTINEM® pro léčbu pacientů s metastatickou rakovinou prsu, jejichž tumory nadměrně exprimují ErbB2. Primární koncové body zahrnují rychlost odpovědi a bezpečnost. Sekundární účinnost koncových bodů zahmuje:rychlost postupu nemoci, celkové přežití ve srovnání s HERCEPTINEM® samotným, kvalitu života a/nebo trvání odpovědi. RhuMAb 2C4 je pod nitrožilně (IV) týdně nebo každé tři týdny při 2 nebo 4 mg/kg, v tomto pořadí až do konce postupu nemoci. Protilátka je dodávána jako multidávková tekutá sestava (20 ml doplněno na koncentraci 20 mg/ml nebo vyšší koncentraci). HERCEPTIN® je podáván IV v počáteční dávce 4 mg/kg následuje týdenní udržení dávky na 2 mg/kg. HERCEPTIN® je dodáván jako lyofilyzovaný prášek. Každá ampule HERCEPTINU® obsahuje 440 mg HERCEPTINU®, 9,9 mg L-histidinu HCÍ, 6,4 mg L-histidinu, 400 mg a-a.dihydrátu trehalózy a 1,8 mg polysorbátu 20. Opětovné ustavení s 20 ml bakteriostatické vody pro injekce (BWFI) obsahující 1,1 % benzylalkoholu jako konzervačního činidla poskytne 21 ml multidávkového roztoku obsahující 21 mg/ml HERCEPTINU® při pH okolo 6.

Příklad 12

Léčba plicní rakoviny

-56CZ 299702 B6

RhuMAb 2C4 je označen jako jednoduché činidlo pro léčení stádia íllb nebo IV nemalých buněk plicní rakoviny (NSCLC). Primární koncové body zahrnují rychlost odpovědi a bezpečnost.

Sekundární účinnost koncových bodů zahrnuje: celkové přežití, rychlost postupu nemoci, dobu

- 5 trvání odpovědi a/nebo kvalitu života.- RhuMAb-2C4 je podáván nitrožilně (IV) týdně nebo každé tři týdny při 2 nebo 4 mg/kg, v tomto pořadí až do konce postupu nemoci. Protilátka je dodávána jako multidávková tekutá sestava (20 ml doplněno na koncentraci 20 mg/ml nebo vyšší koncentraci).

RhuMAb 2C4 je také označen jako jednoduché činidlo pro léčení pacientů s metastatickou plicní rakovinou nemalých buněk. Primární koncové body zahrnují celkové přežití ve srovnání se standardní léčbou a bezpečností. Sekundární účinnost koncových bodů zahrnuje: čas postupu nemoci, rychlost odpovědi, kvalitu života a/nebo trvání odpovědi. RhuMAb 2C4 je podáván nitrožilně (IV) týdně nebo každé tri týdny při 2 nebo 4 mg/kg, v tomto pořadí až do konce postupu nemoci. Protilátka je dodávána jako multidávková tekutá sestava (20 ml doplněno na koncentraci 20 mg/ml nebo vyšší koncentraci).

Příklady léčiv, která mohou být kombinována s anti-ErbB2 protilátkou (která blokuje aktivaci ligandu ErbB2 reeeptoru) k léčení rakoviny plic zahrnuje chemoterapeutická činidla jako karboplatina, taxan (tj. paclitaxel nebo docataxel), gemciabin, nevelbin, cisplatina, oxaplatin nebo kombinace výše zmíněných látek jako je karboplatin/docetaxel, další anti-ErbB2 protilátka (tj. růst inhibující protilátka jako je HERCEPTÍN® nebo anti-ErbB2 protilátka, která indukuje, apoptózu jako 7C2 nebo 7F3, zahrnující její humanizované a/nebo afinitně vyzrálé varianty), inhibitor fenyltransferázy, anti-angiogenní činidlo (tj. anti-VEGF protilátka) EGFR-cílená léčiva (tj, C225 nebo ZDI839), cytokin (tj. IL-1, IL—2, G-CSF nebo GM-CSF) nebo kombinace výše zmíněného.

Příklad 13

Léčba rakoviny tračníku a konečníku

RhuMAb 2C4 je označen jako jednoduché činidlo pro léčení metastatické rakoviny tračníku a konečníku. Primární koncové body zahrnují rychlost odpovědi a bezpečnost. Sekundární účin35 nost koncových bodů zahrnuje: celkové přežití, rychlost postupu nemoci, kvalitu života a/nebo dobu trvání odpovědi. RhuMAb 2C4 je podáván nitrožilně (IV) týdně nebo každé tři týdny při 2 nebo 4 mg/kg, v tomto pořadí až do konce postupu nemoci. Protilátka je dodávána jako multidávková tekutá sestava (20 ml doplněno na koncentraci 20 mg/ml nebo vyšší koncentraci).

RhuMAb 2C4 je také označen jako jednoduché činidlo, pro léčení pacientů s metastatickou rakovinou tračníku a konečníku; Primární koncové body zahrnují rychlost odpovědi a bezpečnost. Sekundární účinnost koncových bodů zahrnuje: celkové přežití, čas postupu nemoci, kvalitu života a/nebo trvání odpovědi. RhuMAb 2C4 je podáván nitrožilně (IV) týdně nebo každé tři týdny při 2 nebo 4 mg/kg, v tomto pořadí až do konce postupu nemoci. Protilátka je dodávána jako multidávková tekutá sestava (20 ml doplněno na koncentraci 20 mg/ml nebo vyšší koncentraci).

Příklady léčiv, používaná pro léčbu rakoviny tračníku a konečníku, která mohou být kombinována s protilátkou, která blokuje aktivaci ligandu ErbB2 reeeptoru zahrnuje 5-fluoruracil (5-FU), leucovorin (LV), CPT-11, levamisol nebo kombinace výše zmíněných látek tj. 5-FU/LV/CPT11. Standardní dávky takových chemoterapeutických činidel mohou být podávána. Další léčiva mohou být kombinována s anti-ErbB2 protilátkou pro léčbu rakoviny tračníku a konečníku zahrnující inhibitor fenyltransferázy, anti-angiogenní činidlo (tj. anti-VEGF protilátka), EGFRcílená léčiva (tj. C225 nebo ZDI839), cytokin (tj. IL-1, IL-2, G-CSF nebo GM-CSF) další anti55 ErbB2 protilátka (tj. růst inhibující protilátka jako je HERCEPTÍN® nebo anti-ErbB2 protilátka,

-57CZ 299702 Bó která indukuje apoptózu jako 7C2 nebo 7F3, zahrnující humanizované a/nebo afinitně vyzrálé varianty) nebo kombinace výše zmíněného.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   10 1. Protilátka obsahující variabilní těžkou (V_H) aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:4 a variabilní lehkou (V_L) aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3..
2. 2* Protilátka podle nároku 1, která je intaktní IgGi protilátka.

   15
3. 3. Protilátka podle nároku 1, která je fragmentem protilátky.
4. 4. Protilátka podle nároku 3, která je Fab fragmentem.
5. 5. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku některého

   20 z nároků 1 až 4 a farmaceutický přijatelný nosič.
6. 6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyznačující se t í m , že je ve formě vodného roztoku.

   25
7. 7. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyznačující se t í m , že je ve formě lyofilizátu.
8. 8. Imunokonjugát obsahující protilátku podle některého z nároků 1 až 4 spojený s cytotoxickým činidlem.
9. 9. Izolovaná nukleová kyselina kódující protilátku podle některého z nároků 1 až 4.
10. 10. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 9.

    35
11. 11. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 10.
12. 12. Hostitelská buňka podle nároku 11, která je savčí buňka.
13. 13. Hostitelská buňka podle nároku 12, která je buňka vaječníku čínského křečka.
14. 14. Způsob přípravy protilátky, vyznačující se tí m , že se kultivuje hostitelská buňka obsahující nukleovou kyselinu kódující protilátku podle některého z nároků 1 až 4 tak, že nukleová kyselina se exprimuje za vzniku protilátky.

    45
15. 15. Způsob podle nároku 14, v y z n a č u j í c í se tí m, že se dále zpětně získává protilátka z kultury hostitelské buňky.
16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že protilátka se zpětně získává z kultivačního média hostitelské buňky.
17. 17. Způsob podle některého z nároků 14 až 16, vy z n ač u j í c í se tím, že se jako hostitelská buňka použije buňka vaječníku čínského křečka.
18. 18. Způsob podle některého z nároků 14 až 17, vy z n ač uj í c í se t í m, že se dále smíchá zpětně získaná protilátka s farmaceuticky přijatelným nosičem, excipientem nebo stabilizerem za vzniku farmaceutického prostředku obsahujícího protilátku.