JPH03191865A - ｃ‐ｅｒｂＢ‐２癌遺伝子産物をイムノアッセイする乳癌の血清診断法とそのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、ヒト血清中のｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子産物
の存在またはその量を検定あるいは測定する方法及びそ
うした検定に有用なキットに関する。

この発明のキットは、ヒト腺癌特に乳癌、胃癌等の診断
のために用いｊ・ることかできる。

〈従来の技術〉 癌はＤＮＡの異常による細胞増殖の病気であり、なんら
かの異常によって細胞の癌化に寄与する遺伝子が発見さ
れ、癌遺伝子と呼ばれている。

現在約５０種類の癌遺伝子が知られているが、約１０年
前までは、癌細胞の中で、どのような遺伝子が細胞の癌
化に作用しているのかほとんど知識がなかったが、近年
のこの分野の目覚ましい研究成果は、癌遺伝子の癌診断
・治療薬への応用を促進している。今日癌遺伝子は（１
）増殖因子群（２）受容体群（３）非受容体型チロンン
キナーゼ群（４）情報モジュレータ−群（ｒａｓ）（５
）核内タンパク群などに分類されている。今日これらの
遺伝子が細胞表面から核内への増殖ングナル伝達系とし
て大きなネットワークを形成していること、そしてこれ
らの伝達系の狂いが細胞の癌化に関与する重要な過程で
あると考えられている。

このような癌遺伝子と細胞の癌化のかかわりが明らかに
なり、特定の癌遺伝子がある種の癌で効率に発現してい
ることから、癌マーカーとして癌遺伝子あるいは、その
癌遺伝子産物の検出が、癌の診断に応用できるのではな
いかという研究が注目されている。

本発明者らはヒト癌原遺伝子ｅｒｂＢ−２（以下ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２と略記する）を発見しく仙波憲太部ら　ＰＮ
ＡＳ　８２６４９７、１９８５．山本雅ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ　３１９２３０．１９８６）、その遺伝子の機能につ
いて分子生物学的あるいは免疫学的方法を用いて鋭意研
究を進めてきている。ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２は、ヒトの
第１７染色体長腕ｑ２１領域に位置し、その遺伝子が発
現しているタンパク質は分子！１１８５ＫＤでチロシン
キナーゼ活性を有する受容体型膜タンパク質である（秋
山徹ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３２．１６４４．１９８６
）。ｃ−ｅｒｂＢ−２は核酸ハイブリダイゼーションと
遺伝子クローニングの方法でｖ−ｅｒｂＢときわめて相
同性の高い遺伝子として発現された（仙波憲太部ら、前
出、山本雅ら、前出）。ｖ−ｅｒｂＢはトリ赤芽球症ウ
ィルスＡＥＶ（ａｖｉａｎ　ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ
ｏｓｉｓｖｉｒｕｓ）のもつ癌遺伝子であり、この遺伝
子に対応する細胞性遺伝子は上皮増殖因子受容体（ＥＧ
Ｆレセプターと略記）である。ヒトＥＧＦレセプターは
第７染色体短腕ｑｌｌ−１３に位置しているａｃ−ｅｒ
ｂＢ−２はＥＧＦレセプターの遺伝子とは明らかに異な
っているが、ＥＧＦレセプターｍＲＮＡがｉｏ、ＯＫｂ
と５．６Ｋｂであり、一方ｃ−ｅｒｂＢ−２のｍＲＮ＾
は４　、６ＫｂでｃＤＮ＾のクローンの解析から１２５
５アミノ酸残基からなり、ＥＧＦレセプター類似のタン
パク質をコードしている（山本雅ら、　Ｎａｔｕｒｅ前
出）。ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物はＥＧＦレセプター
との構造上の類似性からなんらかの増殖因子に対するレ
セプターであると考えられている。

ｃ−ｅｒｂＢ−２はｌ’ｅｉｎｂｅｒｇらの報告したラ
ットのｎｅｕ　（Ｓｈｉｈ、Ｃら、　　Ｎａｔｕｒｅ　
２９Ｇ　２８１．１９８１．）、ｖＩｌｒｉｃｈらのＨ
ＥＲ２（Ｓｌａｍｏｎ　Ｄ、Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　
２３５１７７．１９８７）などと同一の遺伝子である。

このようなチロシンキナーゼ活性を有する増殖因子受容
体の過剰発現が癌の診断の有力なマーカーである可能性
が十分に考えられる。この見地から本発明者らは、手術
時の摘出癌組織からＤＮＡを調製し、ｃ−ｅｒｂＢ−２
遺伝子に特異的なりＮＡとのハイブリッド形成法により
、この予測の確認実験を行った。その結果、ヒトｃ−ｅ
ｒｂＢ−２遺伝子は乳癌、胃癌等の腺上皮癌の２割程に
増幅が見られた。このことは、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２が
腺癌の発症、進展に寄与しており、腺癌の診断に重要な
情報を提供することを意味している。ｃ−ｅｒｂＢ−２
の腫瘍組織での異常発現はＤＮＡ検出法でもコピー数増
大の診断法を得ることが出来るが、この方法は癌診断法
としては一般的でなく、得られる情報もＤＩＩＡレベル
のものに限定されている。癌遺伝子の増幅はコピー数の
増加が大きい場合は、インサイツハイブリダイゼーンヨ
ン（ｉｎ　５ｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）で
も検出可能であるが、用途が限定されている。そこで、
本発明者らは、既にヒトｃ−ｅｒｂＢ２の遺伝子産物に
対するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を作製
し、乳癌や胃癌等の診断、治療への応用研究を行ってき
た。ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物に対するモノクローナ
ル抗体ＳＶ２−６１．ＳＶ２−６１７は平成１年７月１
０日に特許出願しており、これら抗体を産生ずるハイブ
リドーマは、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れているＣ３Ｖ２〜６１゜微工研菌寄第１０１６２号、
ＳＶ２−６１　ｒ同１０７７６号）これら抗体は、免疫
組織染色、ウェスタンプロット法、ドーｌドブロット法
、フローサイトメトリー法、等の免疫学的手法でｃ−ｅ
ｒｂＢ−２遺伝子産物の検出を可能にし、診断に有力な
手段として実用化されている。しかし、これらの免疫学
的手法では、腫瘍組織、癌細胞レベルでの診断であり、
得られる情報は正確ではあるが、簡便性に欠けている。

一般に受容体型のタンパク質は、その全体もしくはその
部が可溶性受容体として血清中もしくは体液中に遊離し
て存在していること力月Ｌ−２受容体などで知られてお
り、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物が受容体全体あるいは
可溶性レセプターとして血清中に存在していれば血清診
断の形で簡便で、迅速な癌の新規な診断法とすることが
できる。

〈発明が解決しようとしている問題点〉従ってこの発明
の目的は、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２の遺伝子産物を血清あ
るいはその他の体液から簡便な酵素免疫測定法（ＥＩＡ
と以下略記する）を用いて検出する方法とそのキットを
提供することである。

く問題点を解決するための手段〉 血清中の微量の特定のタンパク質を高感度に定量する方
法としてＢｅｒｓｏｎとＹａｌｏｎが開発した放射免疫
測定法（Ｒ１Ａ法）とＥＩＡ法があるが、ＲＩＡ法は放
射性同位元素を使用するので、種々の不都合があり、実
際的な使用は、ＥＩＡ法が主流になっている。

ＥＩＡ法は、［酵素活性を標識として抗原抗体反応を追
跡し、これから抗原または抗体の量を定量する方法」と
広く定義される。ＥＩＡ法に用いられる測定システムに
ついては、遠藤雄−・官井潔、蛋白質・核酸・酵素３１
１３〜２６．１９８７に詳述されている。

本発明者らは、これらシステム構成要素の中でサンドチ
ッチＥ１＾と呼ばれる二抗体による抗原の検出法により
血清中のｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物の検出を可能にす
る抗体システムの構築に成功した。

測定対象となるｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物は前述のよ
うに、１２５５のアミノ酸残基からなる１８５ＫＤの分
子量を持つタンパク質である。ｃ−ｅｒｂＢ−２受容体
は、６５３アミノ酸基が細胞外にあり、５８０アミノ酸
残基が細胞内に存在している。細胞外領域のＥＧＦレセ
プターとの相同性は４４％である。ｃ−ｅｒｂＢ−２遺
伝子産物の測定システムを構築するためには、ｃ−ｅｒ
ｂＢ−２遺伝子産物が必要であり、主に次に挙げる方法
で種々の検討を試みた。まず、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパ
ク質を発現している癌細胞ＭＫＮ−７（文献：Ｓ、Ｆｕ
ｋｕｓｈｉｇｅら。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、Ｍａｒ、　９５５．　＋９８６゜東京大学医科学研
究所制癌部より入手）を可溶化して単離する方法、ｃ−
ｅｒｂＢ−２遺伝子をマウス由来の線維芽細胞ＮＩＨ３
Ｔ３（ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１６５８）に導入した５
ｖ−ｔｔ株（微工研菌寄１０１９７号）、Ａ４１５株（
東京大学医科学研究所制癌部から入手）を可溶化して単
離する方法、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の細胞外ドメイン
部分をＮＩＨ３Ｔ３に導入したＥＸ−５株（東京大学医
科学研究所制癌部分から入手）の細胞培養液を利用する
方法等を検討し、ＥＸ−５株が可溶性のｃ−ｅｒｂＢ−
２遺伝子産物を培養上清中に産生じていることを見出し
、この発明を完成した。すなわち、この発明はヒトｃ−
ｅｒｂＢ−２遺伝子産物を対応抗原とし、固相化した抗
体と酵素標識した抗体とでサンドイッチ型に検出する測
定システムとそのキットを提供する。

く作用〉 測定システム及びキットの構成要素は、ｃ−ｅｒｂＢ２
遺伝子産物をそれぞれ別のエピトープで認識するモノク
ローナル抗体を一方は固相に吸着させたものと、他方は
酵素標識したものとその酵素基質による発色のための試
薬類と対照の標準抗原として、細胞株ＥＸ−５が産生ず
る可溶性のｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物から成る。

〈発明の効果〉 この発明により、ヒト乳癌患者血清中にｃ−ｅｒｂＢ２
遺伝子産物が存在すること、および健常人には検出され
ないことが見出された。この発明により、ｃ−ｅｒｂＢ
−２遺伝子を発現している腺癌特に乳癌、胃癌などは簡
便に血清を検査するだけで、迅速に診断することを可能
にする。乳癌では予後不良とＣｅｒｂＢ−２のコピー数
の増加に関係があることが知られているので、血清中の
ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物の量の測定により予後の診
断が可能になるものと思われる。

〈実施例〉 以下、この発明を実施例にもとづき、より具体的に説明
する。なお、この発明は下記実施例に限定されるもので
はない。

実施例１ ｃｍｅｒｂＢ−２遺伝子産物のＥＩＡ測定法とそのキッ
ト。

Ｅｌ＾測定用９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク
社イムノプレートＭａｘｉＳｏｒｐ）に１ｔｔｇ／ｌ＋
Ｑの濃度の精製モノクローナル抗体９０６（オンコジー
ンサイエンス社カタログナンバー０Ｐ１４．文献Ｖａｎ
　ｄｅ　ＶｉｊｖｅｒＭ、Ｊ、ら、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｊｏｕｎａ！　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３１
９１２３９．　＋９８８）を１００μｇずつ各ウェルに
加え、４℃で一夜放置し、抗体をマイクロプレートに固
定する。

０．０５％トウィーン２０を含むＰＢＳ（以下洗浄液と
略記する）で３回洗浄した後、５％ＢＳＡ牛血清（アル
ブミン）を含むＰＢＳを２００μｇずつ各ウェルに加え
室温で２時間ブロッキングを行う、、３回洗浄液で洗浄
後、測定用の試料を１００μσずつ各ウェルに加え、４
℃で一晩放置する。３回洗浄液で洗浄後、ビオチン化し
た１０μｇ／ｍＱモ／　’）　ｏ　−−１−７Ｌ、抗体
ＳＶ２−６１７を１００μρずつ各ウェルに加え、室温
で２時間放置する。

その後洗浄液で３回洗浄し、ベルオキシンダーゼ標識ア
ビジン（ストレプトアビジン　ヒオヂン化ホースラディ
ノユ　ペルオキンダーゼ複合体、アマーンヤム社）を１
０００倍に希釈したらのを］Ｄｏμρずつ各ウェルに加
え、洗浄液で５回洗浄後基質の＾ＢＴＳ（２，２’−八
ｚｉｎｏ−ｄｉ−３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏ
ｌｉｎｅ　　５ｕｌｐｈ。

ｎａｔｅ）と過酸化水素水（ＨｔＯりを加え、３０分か
ら１時間後にＥＩＡ用マ子マイクロプレートリーダー光
度（ＯＤ）を測定する。本発明のキットは次のものがら
構成される。

洗浄液は測定時に０．０５％トウィーン２０を含むＰＢ
Ｓを調製して用いる。本発明の測定法により、細胞株Ｅ
Ｘ−５の培養上清を２段階ずつ希釈して測定した時の標
準曲線を図１に示す。ＥＸ−５の希釈段階でほぼ直線的
に吸光度が、減少している。

実施例２ 各種の乳癌細胞株ＹＭＢ−１，ＹＭＢ−１−Ｅ、ＺＲ−
７５−１，ＭＤＡＭＢ−４５３，ＭＤＡ−１７５〜１．
（いずれも東京大学医科学研究所制癌部で入手）胃癌細
胞株ＭＫＮ−７（前出）、マウス線維芽細胞株！１１）
＋３７３（前出）、陰唇癌細胞株Ａ４３１（東京大学医
科学研究所制癌部で人手：文献５ｏｒｋｉｎ　Ａ。

Ｄ、ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　１７５１９２．１９８８）の培養上清を試
料に測定した。その結果は表２のようになった。

実施例３ 乳癌患者血清のＥＩＡ測定 本発明の測定法により乳癌患者血清を試料にｃ−ｅｒＢ
−２遺伝子産物が血清中に検出されるがどうが測定した
。結果は表３に示すように１２検体中で５例にはっきり
した陽性反応を検出した。

明らかにウェスタンプロット法でｃ−ｅｒｂＢ−２が検
出される細胞株ＹＭＢ−１，ＹＭＢ−１−Ｅ、ＭＤＡ−
ＭＢ−４５３，ＭＫＮ−７で本発明のＥｌ＾キットで、
高値が得られた。

れなかった。

４、図の簡単な説明 第１図は、ＥＸ５細胞の培養上清を二段階希釈した検体
をこの発明の測定方法を用いて測定した吸光度曲線を示
す。縦軸は吸光度（△Ｏ，Ｄ、）、横軸は希釈率である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子産物を測定する方法であ
   って以下の事項からなる方法：ｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝
   子産物に対する特異的精製抗体を固相支持体に結合し、
   血清等の検体中のｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子産物を選択
   的に抗体と結合して捕捉し、ビオチン標識した第２のモ
   ノクローナル抗体とアビジン・ビオチン複合体法とその
   基質を用いることにより発色させる酵素免疫測定法 ２、固相に用いるモノクローナルが９Ｇ６であり、酵素
   標識したモノクローナル抗体がＳＶ２−６１γである特
   許請求第１項の測定方法 ３、ＳＶ２−６１γにペルオキシダーゼ、アルカリホス
   ファターゼなどの酵素を標識し、発色させることを特徴
   とする特許請求第１項の測定方法 ４、対照とする陽性コントロールが細胞株ＥＸ−５の上
   清あるいはそのｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子産物を精製し
   たものであることを特徴とする特許請求範囲第１項の測
   定方法。 ５、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物の測定に必要な抗体、
   対照試料、発色試薬などが組み込まれた血清診断用のキ
   ット。