CN109694871B - 抗人isg15蛋白抗体基因及其应用 - Google Patents

抗人isg15蛋白抗体基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗人ISG15蛋白抗体基因，还公开了由所述基因编码的抗人ISG15蛋白抗体，以及抗人ISG15蛋白抗体的制备方法，以及所述抗体基因在制备检测人ISG15蛋白试剂中的应用。本申请通过调取抗体可变区基因，克隆后质粒转染得到抗人ISG15蛋白的抗体，能够为后续ISG15抗体相关试剂盒等的研究提供研究基础。

Description

抗人ISG15蛋白抗体基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和免疫检测技术，特别是涉及一种抗人ISG15蛋白抗体基因及其应用。
背景技术
固有免疫是人体的第一道防线，当机体受到外来病原体入侵时，人体的固有免疫系统可以很快的发挥作用，并可以产生干扰素。ISG15为干扰素刺激蛋白，当机体受到外来病原体侵袭时，其诱导产生的干扰素可以刺激ISG15的产生。 ISG15具有广泛的抗病毒和抗菌活性，在人体抵抗外来病原体入侵的过程中发挥着十分重要的作用。目前市场中ISG15单克隆抗体较少，所以对ISG15抗体的研究很有必要；ISG15抗体不仅可以推动对ISG15的研究，增加人们对ISG15 的认识，还可以增强人们对相关疾病的探索，所以ISG15抗体有着良好的应用前景。
发明内容
发明目的：基于现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了一种抗人ISG15蛋白抗体基因及其应用。
技术方案：本发明所述的一种抗人ISG15蛋白的抗体基因，其中，编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示，编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
所述的一种抗人ISG15蛋白的抗体基因，其中，编码重链的基因序列如SEQ ID NO:3所示，编码轻链的基因序列如SEQ ID NO:4所示。
由上述抗体基因编码的抗人ISG15蛋白抗体也在本发明的保护范围内。
进一步的，所述抗人ISG15蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)杂交瘤细胞的制备；
(2)抗体基因的调取，通过兼并引物调取抗人ISG15蛋白的基因序列；
(3)将调取的抗体可变区基因克隆进入含有信号肽以及恒定区的pcDNA6 载体中；
(4)将构建好的质粒转染293F细胞，培养1-10天后，收集细胞培液上清；
(5)通过Protein A beads纯化获得抗体。
其中，步骤(2)中，所述兼并引物序列如SEQ ID NO:5-8所示；步骤(3) 中设计的引物序列如SEQ ID NO:9-16所示。
含有上述抗体基因的载体、基因工程菌等也在本发明的保护范围内。
所述抗体基因在制备抗人ISG15蛋白抗体中的应用，所述抗体基因在制备检测人ISG15蛋白试剂中的应用也在本发明的保护范围内。
有益效果：本申请通过调取抗体可变区基因，克隆后质粒转染得到抗人ISG15 蛋白的抗体，能够为后续ISG15抗体相关试剂盒等的研究提供研究基础。
附图说明
图1是实施例4的免疫印迹试验结果；图 1A 中是没有用 beads 孵育的实验结果；图 1B 是 beads 孵育后的实验结果 。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。
pcDNA6载体：购自invitrogen；THP-1细胞：购自ATCC：TIB-202；293F 细胞：购自上海纪宁293F(JN-07260)SF:620218898711；小鼠来源：南京大学模式动物研究所。
实施例1杂交瘤细胞的制备
一、小鼠免疫
(1)人ISG15蛋白为可溶性蛋白，用PBS将蛋白稀释到100μg/ml，在超静台中将其与弗氏佐剂等体积混合，并使混合液乳化。
(2)第一次免疫Balb/c小鼠，采用皮下多点注射，抗原组成为ISG15+CFA，抗原为30μg/只，免疫时间21天。
(3)第二次免疫Balb/c小鼠，采用腹腔注射，抗原组成为ISG15+IFA，抗原为30μg/只，免疫时间21天。
(4)第三次免疫Balb/c小鼠，采用腹腔注射，抗原组成为ISG15+IFA，抗原为30μg/只，免疫时间7天。
(5)第四次免疫Balb/c小鼠，采用尾静脉注射，抗原组成为ISG15，抗原为50μg/只，免疫时间3天。
二、血清效价测定
(1)第三次免疫5天后，采用眼睑取血，并室温静置1h，4℃3500rpm/min 离心10min，收集上层血清。
(2)将抗原稀释到1μg/ml，向酶标板中每孔加入100μl，37℃包被2h。
(3)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(4)封闭：用3％BSA(PBST稀释)，200μl/孔，37℃，2h。
(5)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(6)将收集的血清用抗体稀释液按照1：2500、1：5000、1:10000、1:20000、 1:40000、1:80000、1：160000、1:320000进行稀释，抗体稀释液：含1％BSA的 PSBT。
(7)将上述稀释好的血清加入已经包被蛋白的孔中，每孔100μl，37℃，2h，每个稀释比的抗体都设置一个副孔。
(8)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(9)上二抗，每孔100μl，37℃，1h抗体稀释液：含1％BSA的PSBT。
(10)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(11)加TMB显色液，每孔100μl，避光15-30min。
(12)加2M/L H2SO4,每孔100μl。
(13)测OD450。
(14)选取P/N>2.1的小鼠进行下一步实验，其中P为免疫小鼠血清吸光度， N为未免疫小鼠血清的吸光度。
三、饲养细胞的提取
(1)取一只Balb/c小鼠，并进行脱颈处死，在75％的酒精中浸泡5min。
(2)将小鼠固定，并在超净台中将小鼠腹部皮肤剪开，注意不要剪破覆膜。
(3)用医用注射器吸取5ml DMEM培养基，将其注入小鼠腹腔中，轻轻按压腹部3-5min，然后将DMEM吸出。
(4)将吸出的培养基装入10ml离心管中，1200rpm/min离心3min，弃掉上清。
(5)用5ml的HAT培养基重悬细胞，使得细胞数为2×105个/ml。
(6)将上述稀释好的细胞铺入3-5块96孔板中，100μl/孔，至于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。
四、细胞融合
(1)取出免疫后的Balb/c小鼠的脾脏组织，并将脾细胞用基础培养基吹匀，并计数。
(2)将培养好的Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞吹匀，并计数。
(3)将脾细胞与Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞按1：4的比例混合均匀， 1200rpm/min离心3min，弃掉上清。
(4)向上述混合好的细胞中加入1ml PEG1450，此操作要在45s内完成，并将细胞混匀。
(5)立即加入基础培养基阻止PEG1450的促融作用，静置2min，于37℃的培养箱中反应8min。
(6)1200rpm/min离心3min，弃掉上清，用HAT完全培养基将细胞重悬，并加入铺有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔，至于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。
五、杂交瘤细胞的筛选
(1)上述融合细胞培养5天时，用HAT培养基进行半换液，培养7天时，用HAT培养基进行全换液，继续培养10-15天后，对能明显看到细胞的孔进行 ELISA检测。
(2)进行检测前一天对96孔板进行全换液，第二天吸取选好的孔的上清，并1200rpm/min离心3min，收集上清。
(3)将抗原稀释到1μg/ml，向酶标板中每孔加入100μl，37℃包被2h。
(4)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(5)封闭：用3％BSA(PBST稀释)，200μl/孔，37℃，2h。
(6)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(7)将上述收集到的培养基加入已经包被蛋白的孔中，每孔100μl，37℃， 2h，每个培养基都设置一个副孔。
(8)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(9)上二抗，每孔100μl，37℃，1h抗体稀释液：含1％BSA的PSBT。
(10)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(11)加TMB显色液，每孔100μl，避光15-30min。
(12)加2M/L H2SO4,每孔100μl。
(13)测OD450。
(14)选取P/N>2.1的孔进行扩大培养，其中P为免疫小鼠血清吸光度，N 为未免疫小鼠血清的吸光度。
六、杂交瘤细胞的亚克隆
(1)用HT培养基将上述扩大培养的细胞吹匀，并且用等比稀释的方法将细胞稀释到10个/ml、20个/ml、30个/ml。
(2)将上述稀释好的细胞按100μl/孔加入到铺有饲养细胞的96孔板中，使得每孔含有的杂交瘤细胞分别为1个，2个，3个，每个稀释比的细胞设置48 个孔，至于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。
(3)在培养到5天时，对96孔板进行半换液，在培养到10天时，吸取96 孔板的培养基上清，并用上清进行ELISA检测。
(4)将抗原稀释到1μg/ml，向酶标板中每孔加入100μl，37℃包被2h。
(5)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(6)封闭：用3％BSA(PBST稀释)，200μl/孔，37℃，2h。
(7)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(8)将上述收集到的培养基加入已经包被蛋白的孔中，每孔100μl，37℃， 2h，每个上清都设置一个副孔。
(9)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(10)上二抗，每孔100μl，37℃，1h抗体稀释液：含1％BSA的PSBT。
(11)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(12)加TMB显色液，每孔100μl，避光15-30min。
(13)加2M/L H2SO4,每孔100μl。
(14)测OD450。
(15)选取P/N>2.1(阳性孔)的孔进行扩大培养，其中P为免疫小鼠血清吸光度，N为未免疫小鼠血清的吸光度。
(16)按照上述的方法再进行两次亚克隆，直到阳性孔的比例达到95％。
(17)对最后的细胞进行扩大培养，进行细胞保存。
实施例2抗人ISG15蛋白抗体的制备方法
一、抗体基因调取
用10％血清浓度的DMEM在5％CO2，37℃的培养箱中培养实施例1的杂交瘤细胞，对细胞进行传代培养，在细胞传2代后，收细胞于1.5mlEP管中。
1、杂交瘤细胞RNA获取
(1)向EP管中加入500μl TRIzol，在摇床上以750r/min的速度摇15min。
(2)加入100μl三氯甲烷，剧烈振摇100次。
(3)放置5min，在4℃的离心机中，12000g/min离心15min。
(4)离心后吸取190μl上清，并将上清装入新的EP管中，加入190μl异丙醇，剧烈振摇10次。
(5)放置5min，在4℃的离心机中，12000g/min离心10min。
(6)离心后，吸掉上清，并加入1ml 75％乙醇，上下轻轻颠倒EP管，使白色沉淀悬起。
(7)在4℃的离心机中，7600g/min离心5min。
(8)吸掉上清，在常温放置，直到EP管中的白色沉淀变为无色。
(9)向EP管中加入40μl DEPC水，在55℃、750r/min的摇床上振摇15min。
(10)测量RNA的浓度，并吸取1μg RNA进行逆转录。
逆转录条件：
1μgRNA
4μl逆转录酶
ddH2O补至20μl
37℃15min，85℃30s，4℃保存。
(11)向逆转录好的样品中加入80μl ddH2O。
2、目的基因获取
反应体系：
Figure BDA0001946879190000061
反应条件：
Figure BDA0001946879190000062
按照上述条件35个循环之后，最后再延伸6min。
SEQ ID NO:5重链可变区上游引物：
GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT
SEQ ID NO:6重链可变区下游引物：
CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG
SEQ ID NO:7轻链可变区上游引物：
GGGAATTCATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT
SEQ ID NO:8轻链可变区下游引物：
CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA
3、胶回收
(1)将PCR产物进行跑胶纯化，Agarose胶的浓度为2％。
(2)在紫外灯照射下，切下目的条带，放入1.5ml EP管中。
(3)将上述EP管中加入600μl A液，放在75℃的金属浴中加热15-20min。
(4)加入300μl B液，用枪吹吸混匀。
(5)将混合好的样品过柱子，10000r/min离心1min。
(6)加入500μl的洗涤液1，10000r/min离心1min。
(7)加入700μl的洗涤液2，10000r/min离心1min，并重复一次。
(8)将柱子以10000r/min空甩2min。
(9)加35μl ddH2O，静置3min，10000r/min离心1min。
4、PCR产物末端加A反应
(1)在PCR管中配置反应体系
Figure BDA0001946879190000071
(2)72℃反应20min。
(3)冰中静置1～2min。
5、加A DNA片段与T载体的连接转化
(1)在1.5mlEP管中配制下列DNA溶液，全量为5μl
pMD18-T Vector 1μl
加A DNA片段 0.1～0.3pmol
ddH2O 加至总体积5μl
(2)加入5μl连接酶。
(3)16℃反应1h。
(4)将上述反应液加入100μl DH5α大肠杆菌感受态中。
(5)冰浴15min。
(6)42℃热激90s。
(7)冰浴3-5min。
(8)向DH5α中加入1ml无抗生素的LB培养基，37℃、250r/min活化1h。
(9)活化结束后，6000r/min离心3min。
(10)吸去多余上清，EP管中剩余100μl培养基，并将大肠杆菌吹匀，涂到含有氨苄青霉素的LB平板上。
(11)37℃倒置培养，直到平板上长出可见的菌斑。
(12)各挑取6个菌落于加氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃、250r/min条件下培养12小时。
6、小抽质粒
(1)将上述培养的大肠杆菌10000r/min离心1min收菌。
(2)向大肠杆菌沉淀中加入350μl sliution1，吹打使菌混合均匀。
(3)加入350μl sliution2，上下颠倒6-8次。
(4)420μl sliution 3，上下颠倒6-8次。
(5)将上述溶液12000r/min离心15min。
(6)吸取上清并过柱子。
(7)弃掉柱底的废液，加入500μl洗涤液1，12000r/min离心1min。
(8)弃掉柱底的废液，加入750μl洗涤液2，12000r/min离心1min，并重复一次。
(9)弃掉柱底的废液，12000r/min空甩2min。
(10)加入35μl灭菌的ddH2O，静置3min，然后2000r/min离心1min。
(11)所得ddH2O溶液为最终抽取的质粒。
7、将上述抽取的质粒测序，得到重链可变区的基因序列和轻链可变区的基因序列。
SEQ ID NO:1重链可变区的基因序列：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTC CCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGGTATGGCATG TCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCAT TAGTGATGGTGGTAGAAACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATT CACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAGGA GTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATCTATTATTGTGCAAGACATGTCTTGC AGGCCTACTCCTTTGACTTC
SEQ ID NO:2轻链可变区的基因序列：
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACAT CAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTGATGGCAT CACTTATTTCTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTG ATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGC AGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGA GGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTCCGTGGACG
二、抗体可变区基因克隆
1、设计同源重组引物，将上述获得的抗体重链可变区基因克隆含有信号肽和人抗体重链恒定区基因的pcDNA6载体中，轻链可变区基因克隆含有信号肽和人抗体轻链(κ链)恒定区基因的pcDNA6载体中
引物设计如下：
SEQ ID NO:9κ链pcDNA6反向引物上游：
CGGACCGTGGCCGCTCCTTC
SEQ ID NO:10κ链pcDNA6反向引物下游：
GAATTCCACCACACTGGACT
SEQ ID NO:11κ链pcDNA6同源重组上游：
TCCAGTGTGGTGGAATTCGCCACCATGGACTGGACCTG
SEQ ID NO:12κ链pcDNA6同源重组下游：
AGGAGCGGCCACGGTCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGC
SEQ ID NO:13重链pcDNA6反向引物上游：
GCCTCTACAAAGGGCCCTTC
SEQ ID NO:14重链pcDNA6反向引物下游：
GAATTCCACCACACTGGACT
SEQ ID NO:15重链pcDNA6同源重组上游：
TCCAGTGTGGTGGAATTCGCCACCATGGACTGGACCTG
SEQ ID NO:16重链pcDNA6同源重组下游：
AGGGCCCTTTGTAGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGG
2、重链恒定区基因序列扩增体系
Figure BDA0001946879190000091
重链恒定区基因序列扩增条件
Figure BDA0001946879190000092
上述反应进行35个循环
3、胶回收目的基因片段
用0.5％Agarose胶分离目的片段。
(1)将PCR产物进行跑胶纯化，Agarose胶的浓度为2％。
(2)在紫外灯照射下，切下目的条带，放入1.5ml EP管中。
(3)将上述EP管中加入600μl A液，放在75℃的金属浴中加热15-20min。
(4)加入300μl B液，用枪吹吸混匀。
(5)将混合好的样品过柱子，10000r/min离心1min。
(6)加入500μl的洗涤液1，10000r/min离心1min。
(7)加入700μl的洗涤液2，10000r/min离心1min，并重复一次。
(8)将柱子以10000r/min空甩2min。
(9)加35μl ddH2O，静置3min，10000r/min离心1min。
4、轻链恒定区基因序列扩增体系：
Figure BDA0001946879190000101
轻链恒定区基因序列扩增条件：
Figure BDA0001946879190000102
上述反应进行35个循环
5、重链可变区基因序列扩增体系
Figure BDA0001946879190000103
6、胶回收重链可变区基因序列片段
用2％Agarose胶分离目的片段
(1)将PCR产物进行跑胶纯化，Agarose胶的浓度为2％。
(2)在紫外灯照射下，切下目的条带，放入1.5ml EP管中。
(3)将上述EP管中加入600μl A液，放在75℃的金属浴中加热15-20min。
(4)加入300μl B液，用枪吹吸混匀。
(5)将混合好的样品过柱子，10000r/min离心1min。
(6)加入500μl的洗涤液1，10000r/min离心1min。
(7)加入700μl的洗涤液2，10000r/min离心1min，并重复一次。
(8)将柱子以10000r/min空甩2min。
(9)加35μl ddH2O，静置3min，10000r/min离心1min。
7、轻链可变区基因序列扩增体系
Figure BDA0001946879190000111
8、胶回收轻链可变区基因序列片段
用2％Agarose胶分离目的片段
(1)将PCR产物进行跑胶纯化，Agarose胶的浓度为2％。
(2)在紫外灯照射下，切下目的条带，放入1.5ml EP管中。
(3)将上述EP管中加入600μl A液，放在75℃的金属浴中加热15-20min。
(4)加入300μl B液，用枪吹吸混匀。
(5)将混合好的样品过柱子，10000r/min离心1min。
(6)加入500μl的洗涤液1，10000r/min离心1min。
(7)加入700μl的洗涤液2，10000r/min离心1min，并重复一次。
(8)将柱子以10000r/min空甩2min。
(9)加35μl ddH2O，静置3min，10000r/min离心1min。
9、将目的基因通过同源重组连接
(1)向一支1.5ml EP管中加入3.5μl重链可变区基因片段，1.5μl重链恒定区基因片段；向另一支1.5ml EP管中加入3.5μl轻链可变区基因片段，1.5μl轻链恒定区基因片段。
(2)向两支EP管中分别加入5μl同源重组酶，并混合均匀。
(3)在50℃的条件下反应30min。
(4)将上述反应液加入100μl DH5α大肠杆菌感受态中。
(5)冰浴15min。
(6)42℃热激90s。
(7)冰浴3-5min。
(8)向DH5α中加入1ml无抗生素的LB培养基，37℃、250r/min活化1h。
(9)活化结束后，6000r/min离心3min。
(10)吸去多余上清，EP管中剩余100μl培养基，并将大肠杆菌吹匀，涂 到含有氨苄青霉素的LB平板上。
(11)37℃倒置培养，直到平板上长出可见的菌斑。
(12)各挑取6个菌落于加氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃、250r/min条件下培养12小时。
10、小抽质粒
(1)将上述培养的大肠杆菌10000r/min离心1min收菌。
(2)向大肠杆菌沉淀中加入350μl slution1，吹打使菌混合均匀。
(3)加入350μl Slution2，上下颠倒6-8次。
(4)420μl Slution 3，上下颠倒6-8次。
(5)将上述溶液12000r/min离心15min。
(6)吸取上清并过柱子。
(7)弃掉柱底的废液，加入500μl洗涤液1，12000r/min离心1min。
(8)弃掉柱底的废液，加入750μl洗涤液2，12000r/min离心1min，重复一次。
(9)弃掉柱底的废液，12000r/min空甩2min。
(10)加入35μl灭菌的ddH2O，静置3min，然后2000r/min离心1min。
(11)所得ddH2O溶液为最终抽取的质粒。
(12)最终获得能够表达抗ISG15蛋白的全抗基因序列。
SEQ ID NO:3重链基因序列：
GCCACCATGGACTGGACCTGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCTGCCACCAGG GTGCACTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCC TGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAG GTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGG TCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGAAACACCTACTATCCAGACAGTGTGA AGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGC AGATGAGGAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATCTATTATTGTGCAAGAC ATGTCTTGCAGGCCTACTCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCAGCCTCTACAAAGGGCCCTTCTGTGTTCCCTCTGGCCCCTTC CTCTAAGTCTACATCTGGCGGAACCGCTGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGA CTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCTTGGAACTCTGGCGCTCTGACCTC CGGCGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGACTGTACTCTCT GTCTTCTGTGGTGACCGTGCCTTCTTCCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCATAAGCCTTCTAACACAAAGGTGGACAAGAAGGTGGA GCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTGA GCTGCTGGGCGGCCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCTCCTAAGCCCAAGGACAC CCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTC TCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGG TGCATAACGCTAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTAC AGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGA AGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTGTACACC CTGCCCCCCTCCAGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTG CCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCA ACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCC GACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGG CAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAA CCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
SEQ ID NO:4轻链基因序列：
GCCACCATGGACTGGACCTGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCTGCCACCAGG GTGCACTCCGATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTC TTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAG TGATGGCATCACTTATTTCTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCT CAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGG TTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTCC GTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGACCGTGGCCG CTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCTAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCA CCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGT CCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCAGCACC CTGACCCTGTCCAAGGCTGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGA GGTGACCCATCAGGGCCTGTCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACAGGG GCGAGTGCTGA
三、真核表达抗ISG15蛋白全抗
(1)用含有10％血清的DMEM培养基在37℃、5％CO2的条件下培养2-3代。
(2)将贴壁培养的细胞消化，用无血清培养基吹下来，并以50万/ml接入125ml 培养瓶中，按1:1000的比例加入抗细胞结团试剂。
(3)观察细胞数量，当细胞长到200-300万/ml时，以40万/ml传代。
(4)用培养瓶将细胞培养3-5代。
(5)当细胞长到200-300万/ml时，以80万/ml的比例转接到500ml培养瓶中，总的无血清培养基为125ml/瓶，在8％CO2浓度，37℃条件下培养。
(6)将细胞培养过夜。
(7)将重链基因质粒与轻链基因质粒按1:1的比例转染细胞。
(8)在8％CO2浓度，37℃条件下培养7-10天。
四、抗体纯化
(1)向纯化柱内加入3ml protein A/G填料，用5ml结合buffer冲洗填料。
(2)将收集到的上清过柱子。
(3)再用10ml结合buffer洗杂，除去非特异性结合。
(4)用20ml洗脱液洗脱抗体，并将洗脱液收集。
(5)用中和液将洗脱液调至pH为中性。
结合buffer：0.15M NaCl 20mM Na2HPO4pH＝7.0
洗脱液：0.1M柠檬酸钠 pH＝3.0
中和液：0.1M NaOH
实施例3间接ELISA检测实施例2制备所得抗体亲和力
(1)将抗原稀释到1μg/ml，向酶标板中每孔加入100μl，37℃包被2h。
(2)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(3)封闭：用3％BSA(PBST稀释)，200μl/孔，37℃，2h。
(4)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(5)将实施例2纯化后的抗体进行稀释，使终浓度分别为：10μg/ml，8μg/ml， 6μg/ml，4μg/ml，0.06μg/ml，0.006μg/ml，0.0006μg/ml，0.00006μg/ml，0μg/ml；抗体稀释液：含1％BSA的PSBT。
(6)将上述稀释好的抗体加入已经包被蛋白的孔中，每孔100μl，37℃，2h，每个稀释比的抗体都设置一个副孔。
(7)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(8)上二抗，每孔100μl，37℃，1h抗体稀释液：含1％BSA的PSBT。
(9)PBST洗板，每孔350μl，每遍5min，共洗5次。
(10)加TMB显色液，每孔100μl，避光15-30min。
(11)加2M/L H2SO4,每孔100μl。
(12)测OD450。
(13)按照上述实验步骤，将抗原稀释到0.5μg/ml，再重复一次。
(14)得到的两组数据，根据Beatty公式kaff＝(n-1)/[2(n Ab’-Ab)]算得抗体亲和力为1.3×10-10M。
实施例4实施例2制备所得抗体的免疫印迹试验
(1)用两个6cm培养皿培养THP-1。
(2)当细胞长满后，向其中一盘中加IFNβ刺激。
(3)刺激6h后，用两个1.5ml ep管，以6000r/min离心，收集细胞。
(4)向两个1.5ml ep管中分别加入300μl裂解液(裂解液配方： TBS+0.5％NP40+1％PMSF+1％cocktail)。
(5)裂解30min后，超声使细胞破碎。12000r/min离心15min，收集上清。
(6)从两个ep管分别吸取40μl制input样，向剩余的上清中加入适量实施例2 制备所得抗体和beads并在4℃孵育2h。
(7)用洗杂液(洗杂液配方：TBS+0.5％NP40)洗上述beads4-5次，并制IP样。取一块15％的SDS PAGE胶，每孔上样20μl，当蓝色指示带跑出SDS PAGE胶后，进行转膜，转膜条件290mA，30min。
(8)转膜后，用5％牛奶封闭1h。
(9)上一抗(一抗为纯化的目的抗体)，常温2h。
(10)用TBST洗膜6次，每次6min。
(11)上二抗(二抗为抗人恒定区蛋白的抗体)，常温1h。
(12)用TBST洗膜6次，每次6min。
(13)显色。
结果如图1A和图1B所示，图1A中是没有用beads孵育的实验结果，表明 ISG15抗体能够检测到ISG15蛋白；图1B是beads孵育后的实验结果，表明ISG15 抗体与ISG有很高的亲和力，ISG15抗体可以用于免疫共沉淀实验中。
Figure BDA0001946879190000161
Figure BDA0001946879190000171
Figure BDA0001946879190000181
Figure BDA0001946879190000191
Figure BDA0001946879190000201
Figure BDA0001946879190000211
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 抗人ISG15蛋白抗体基因及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 324
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 1
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aggtatggca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagaaa cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga ggagtctgaa gtctgaggac acagccatct attattgtgc aagacatgtc 300
ttgcaggcct actcctttga cttc 324
<210> 2
<211> 306
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 2
gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtgatg gcatcactta tttctattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg 300
tggacg 306
<210> 3
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccaccatgg actggacctg gatcctgttt ctggtggccg ctgccaccag ggtgcactcc 60
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 120
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aggtatggca tgtcttgggt tcgccagact 180
ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagaaa cacctactat 240
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 300
ctgcagatga ggagtctgaa gtctgaggac acagccatct attattgtgc aagacatgtc 360
ttgcaggcct actcctttga cttctggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 420
tctacaaagg gcccttctgt gttccctctg gccccttcct ctaagtctac atctggcgga 480
accgctgctc tgggctgtct ggtgaaggac tacttccctg agcctgtgac agtgtcttgg 540
aactctggcg ctctgacctc cggcgtgcac accttccctg ctgtgctgca gtcctctgga 600
ctgtactctc tgtcttctgt ggtgaccgtg ccttcttcct ctctgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaaccataa gccttctaac acaaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 720
tcctgcgaca agacccacac ctgccctcct tgtcctgctc ctgagctgct gggcggccct 780
tctgtgtttc tgttccctcc taagcccaag gacaccctga tgatctccag gacccccgag 840
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtctcac gaggaccctg aggtgaagtt taactggtac 900
gtggatggcg tggaggtgca taacgctaag accaagccta gggaggagca gtacaactcc 960
acctacaggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgctccta tcgagaagac catctccaag 1080
gctaagggcc agcctagaga gccccaggtg tacaccctgc ccccctccag ggaggagatg 1140
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctacccctc cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agtccaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctgtactcc aagctgaccg tggacaagtc caggtggcag 1320
cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1380
aagtccctgt ccctgtcccc cggcaagtga 1410
<210> 4
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccaccatgg actggacctg gatcctgttt ctggtggccg ctgccaccag ggtgcactcc 60
gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 120
atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtgatg gcatcactta tttctattgg 180
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 240
tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 300
agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg 360
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgga ccgtggccgc tccttccgtg 420
ttcatcttcc ctcctagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 480
ctgaacaact tctaccccag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctccag 540
agcggcaaca gccaggagtc cgtgaccgag caggactcca aggacagcac ctactccctg 600
tccagcaccc tgaccctgtc caaggctgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag 660
gtgacccatc agggcctgtc ctcccccgtg accaagtcct tcaacagggg cgagtgctga 720
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggaattcat grasttskgg ytmarctkgr ttt 33
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccaagcttc cagggrccar kggataracg rtgg 34
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggaattcat gragwcacak wcycaggtct tt 32
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccaagctta ctggatggtg ggaagatgga 30
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggaccgtgg ccgctccttc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaattccacc acactggact 20
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tccagtgtgg tggaattcgc caccatggac tggacctg 38
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggagcggcc acggtccgtt tgatttccag cttggtgc 38
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcctctacaa agggcccttc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaattccacc acactggact 20
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tccagtgtgg tggaattcgc caccatggac tggacctg 38
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agggcccttt gtagaggctg aggagactgt gagagtgg 38

Claims (7)

1.一种抗人ISG15蛋白的抗体基因，其特征在于，编码重链可变区的基因序列如SEQ IDNO:1所示，编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种抗人ISG15蛋白的抗体基因，其特征在于，编码重链的基因序列如SEQ ID NO:3所示，编码轻链的基因序列如SEQ ID NO:4所示。
3.权利要求1或2所述抗体基因编码的抗人ISG15蛋白抗体。
4.含有权利要求1或2所述抗体基因的载体。
5.含有权利要求1或2所述抗体基因的基因工程菌。
6.权利要求1或2所述抗体基因在制备抗人ISG15蛋白抗体中的应用。
7.权利要求3所述抗体在制备检测人ISG15蛋白试剂中的应用。
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