JP2015516964A - クロストリジウム・ディフィシル抗原 - Google Patents

クロストリジウム・ディフィシル抗原 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ配列又はＣ．ディフィシル毒素Ｂ配列の残基１５００〜１７００からなるアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる又はそれを含むポリペプチドに基づく組換えクロストリジウム・ディフィシル抗原に関するが；ポリペプチドが、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸残基１８５１〜２７１０及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の間に位置付けられる１つ又は複数のリピート単位（ＲＵ）を含まないという条件である。また、提供するのは、クロストリジウム・ディフィシル感染（ＣＤＩ）の防止／処置／抑制のための前記抗原の使用であって、前記抗原を生成するための方法、前記抗原に結合する抗体を生成するための方法、及びＣＤＩの防止／処置／抑制のための前記抗体の使用を一緒に伴う。

Description

本発明は、クロストリジウム・ディフィシル感染（ＣＤＩ）の予防／処置／抑制のための抗原に関する。また、提供するのは、前記抗原を生成するための方法、前記抗原に結合する抗体を生成するための方法、及びＣＤＩの予防／処置／抑制のための前記抗体の使用である。
クロストリジウム・ディフィシル感染（ＣＤＩ）は、現在、世界中の病院における主要な問題である。細菌は、軽度の自己限定的な下痢から潜在的に生命を脅かす重度の大腸炎まで、いくつかの形態で顕在化する院内の抗生物質関連疾患を起こす。高齢患者は、これらの潜在的に生命を脅かす疾患からのリスクが最も高く、ＣＤＩの発生は、過去１０年にわたり劇的に増加している。２０１０年に、英国において、ＣＤＩの２１，０００を上回る症例があり、２，７００を上回る関連死を伴った。ＣＤＩは、英国National Health Serviceに、年間£５００Mを超える負担をかける。
Ｃ．ディフィシルの種々の株が、多数の方法により分類されうる。最も一般に使用されるものの１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）リボタイピングであり、それにおいて、ＰＣＲを使用し、Ｃ．ディフィシルの１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間スペーサー領域を増幅する。これからの反応産物は、分離株の細菌リボタイプを同定する特徴的なバンドパターンを提供する。毒素タイピングは、別のタイピング方法であって、それにおいて、Ｃ．ディフィシル毒素についてコードするＤＮＡから由来する制限パターンを使用し、株の毒素型を同定する。異なる株の毒素遺伝子の間で観察された制限パターンにおける違いは、また、Ｃ．ディフィシル毒素ファミリー内の配列変動を示している。例えば、毒素型ＩＩＩ毒素Ｂにおける同じ領域と比較し、毒素型０毒素ＢのＣ末端６０kDa領域と約１３%の配列差がある。
Ｃ．ディフィシルの株は、多様な病原性因子を産生し、その間で注目すべきは、いくつかのタンパク質毒素である：毒素Ａ、毒素Ｂ、及び、一部の株において、クロストリジウム・パーフリンジェンスイオタ毒素と同様のバイナリー毒素。毒素Ａは、感染の病理において役割を果たし、腸コロニー形成過程に影響しうる大きなタンパク質細胞毒素／エンテロトキシンである。ＣＤＩの大流行が、毒素Ａ陰性／毒素Ｂ陽性株を伴い報告されており、それは、毒素Ｂが、また、疾患病理において重要な役割を果たすことが可能であることを示す。
毒素Ａ及び毒素Ｂをコードする遺伝子配列（それぞれＭｗ３０８Ｋ及びＭｗ２６９ｋ）が公知である−例えば、Moncrief et al.(1997) Infect. Immun 63: 1105-1108を参照のこと。２つの毒素は、高い配列相同性を有し、遺伝子重複から生じたと考えられる。毒素は、また、共通の構造（図１を参照のこと）、すなわち、Ｎ末端グルコシルトランスフェラーゼドメイン、中央疎水性領域、４つの保存されたシステイン、及びＣ末端リピート単位（ＲＵ）の長いシリーズを共有する。
毒素Ａ及びＢの両方が、多段階機構を介してそれらの作用の機構を発揮し、それらは、その細胞表面上の受容体への結合、内在化を含み、細胞サイトゾル中へのエフェクタードメインの転位及び遊離、ならびに最後に細胞内作用が続く。前記の作用の機構は、Ｒｈｏファミリーの小ＧＴＰａｓｅの不活性化を含む。この点において、毒素は、Ｒｈｏタンパク質のアミノ酸残基上へのグルコース部分（ＵＤＰ−グルコースから）の移動を触媒する。毒素Ａ及びＢは、また、システインプロテアーゼの形態において第２酵素活性を含み、それは、転位後のサイトゾル中へのエフェクタードメインの放出において役割を果たすように見える。Ｃ．ディフィシルのバイナリー毒素は、その標的タンパク質上への、ＮＡＤからのＡＤＰリボース部分の移動を含む機構により細胞アクチンを修飾する。
Ｃ．ディフィシル感染の処置のため現在の治療は、抗生物質、顕著には、メトロニダゾール及びバンコマイシンの使用に頼る。しかし、これらの抗生物質は、全ての場合において効果的ではなく、患者の２０〜３０%は、疾患の再発に苦しむ。主要な懸念は、英国における、より病原性のある株の出現であり、それらは、カナダにおいて２００２年に最初に同定された。これらの株は、ＰＣＲリボタイプ０２７及び毒素型ＩＩＩに属するものを含み、以前に観察された、直接的に起因する３倍を上回る死亡率を伴うＣＤＩを起こす。
新たな治療が、従って、特に緊急に要求される。なぜなら、現在の抗生物質の効力が、減少しているように見えるからである。
１つのアプローチは、毒素Ａ及び／又は毒素Ｂに結合し、その活性を中和する抗体の使用である。これは、これらの毒素を放出しないＣ．ディフィシルの株（いわゆる、非毒素産生株）がＣＤＩを起こさないとの知識に基づいている。例として、動物を免疫化し、それらの血清を採取し、抗体を、患者への投与のために精製することができる−これは、受動免疫化として定義される。別のアプローチにおいて、ＣＤＩを伴う患者又はそのような感染を発生するリスクのある被験者を、毒素Ａ及び／又は毒素Ｂに対して向けられた、循環及び粘膜抗体における増加をもたらす抗原を用いて免疫化することができる−これは、能動免疫化として定義される。
能動免疫化及び受動免疫化の両方のための決定的な要件は、患者又は動物をそれぞれ免疫化するための適した抗原の可用性である。これらは、Ｃ．ディフィシルの適した毒素産生株が培養された培地から精製することができる天然毒素を含むことができる。このアプローチにはいくつかの欠点がある。毒素Ａ及び毒素Ｂの両方が、少量の培養培地中に存在し、有意な喪失を招くことを伴わず、精製することは困難である。このように、世界中のニーズを満たすために必要な量を得るためには、費用がかかり、困難である。また、天然毒素は不安定で、有毒である。
上に言及する問題によって、利用可能なＣ．ディフィシルワクチン候補がほとんどない結果となっている。今日まで、後期段階の開発中のＣＤＩワクチンだけが、天然（即ち、自然に生じる）毒素Ａ及びＢの混合物に基づいており、それらは、化学修飾により広範囲に不活性化されてきた（Salnikova et al 2008, J Pharm Sci 97: 3735-3752）。
天然毒素（及びそれらのトキソイド）の使用への１つの代替物は、毒素Ａ及びＢから由来する組換えフラグメントの設計、開発、及び使用を含む。Ｃ．ディフィシル感染を処置／防止する際での使用のために意図された既存の抗原の例は、毒素Ａ又は毒素ＢのＣ末端リピート単位（ＲＵ）に基づくペプチドを含む−例えば、ＷＯ ００／６１７６２を参照のこと。そのような抗原に伴う問題は、しかし、それらが、不良に免疫原性である（即ち、抗原が、不良な抗体力価を産生する）、又は、より高い抗体力価が産生される場合、抗体は、Ｃ．ディフィシル細胞毒性活性に対して不良な中和効力を実証する（即ち、不十分な中和抗体が産生される）ことである。
従って、当技術分野において、Ｃ．ディフィシル感染（ＣＤＩ）に特異的に対処することが可能である新たなワクチン／治療／治療法についてのニーズがある。このニーズは本発明により対処され、それによって、上記問題の１つ又は複数が解決される。
要するに、本発明は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ及び／又はＢに対して強力な毒素中和応答を誘導することができる抗原を提供する。本発明は、また、組換え抗原を調製するための方法、及び治療的抗体の大規模調製を可能にするための免疫原としてのその使用を提供する。前記抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ及び／又はＢに対して強力な毒素中和応答を誘導することができ、従って、予防的及び／又は治療的適用を有する。
上に言及する通り（例えば、ＷＯ ００／６１７６２を参照のこと）、以前の試験では、毒素Ａ及び／又は毒素ＢのＣ末端、リピート単位（ＲＵ）に基づくワクチン調製物が記載されている。前記ＲＵフラグメントは、不良な毒素中和効果を有し、及び／又は大量に製造するのが困難である。
対照的に、本発明は、毒素Ａ及び／又は毒素Ｂのリピート単位（ＲＵ）の１つ又は複数（例えば、全て）を含まない又は含む毒素Ａ及び／又は毒素Ｂに基づくＣ．ディフィシルポリペプチド抗原を提供する。本発明のポリペプチド抗原は、毒素の中央領域からの１つ又は複数のドメインからなる又はそれを含む。本発明の前記抗原は、良好な毒素中和免疫応答を実証し、及び／又は容易に大量に製造される。
本発明者らは、驚くべきことに、エフェクタードメインとＲＵの領域の間の中央領域からの１つ又は複数のドメインからなる又はそれを含むＣ．ディフィシル抗原ポリペプチド（図１を参照のこと）が、ＲＵの１つ又は複数を含む、対応するＣ．ディフィシル毒素フラグメントと比較した場合、大きく増強された保護（毒素中和）免疫応答を提供することを特定している（表１及び２を参照のこと）。一実施態様において、Ｃ．ディフィシル抗原ポリペプチドは、毒素Ｂフラグメントを含む。
表１及び２中のデータの比較によって、本発明のポリペプチド抗原が、Ｃ．ディフィシル毒素のＣ末端リピート単位の１つ又は複数を含む、対応するポリペプチド（ＴｘＢ２と指定されたポリペプチドにより例示される）のものよりも、大幅により強力な毒素中和免疫応答を誘発することが確認される。より詳細において、１８週間の免疫化期間後、本発明のポリペプチドにより提供される毒素中和免疫応答は、対応するＲＵ含有ポリペプチドにより提供されるものよりも６０倍より高かった。このように、本発明のポリペプチドは、強力な毒素中和免疫応答を誘導する。
これらの知見は、多数の理由のため、驚くべきことである。最も重要なことに、動物が、Ｃ．ディフィシル毒素の中央ドメインフラグメント（残基５１０〜１５３０からなるフラグメント、及び残基１５３０〜１７５０からなるフラグメント）を用いて別々に免疫化された以前の試験では、これらのフラグメントが、毒素中和抗体の産生を誘発しないことが報告された（Kink & Williams (1993) Infect. Immun. 66: 2018-2025）。本試験は、従って、残基５１０〜１５３０内のドメインが、有意な抗体結合構造決定基に寄与しないことを示唆する。また、さらなる試験では、Ｃ．ディフィシルの全体に対して産生された抗体が、全ＲＵ領域単独からなるフラグメントを認識し、Ｃ．ディフィシルの同じ毒素の残基９０１〜１７５０に基づく中央毒素領域からなるフラグメントを認識しなかったことが示されている（Genth et al., (2000) Infect. Immun., 68: 1094-1101）。本試験は、従って、残基９０１〜１７５０内のドメインが、有意な抗体結合構造決定基に寄与しないことを示唆する。さらに、Ｃ．ディフィシル毒素のエフェクタードメイン（残基１〜５４３）への抗体が、強力な免疫応答（簡単な酵素免疫アッセイにより測定される）を誘発することが示されており、前記抗体は、毒素中和活性を有さず、毒素への抗体結合が、毒素中和に対応しないことを示している（Roberts et al.(2012) Infect. Immun., 80: 875-882）。まとめると、従って、エフェクタードメインとリピート領域の間に位置付けられる、Ｃ．ディフィシル毒素の中央ドメインに基づく組換え免疫原が、そのような強力な毒素中和免疫応答を誘導することが可能であることは、極度に驚くべきことである。
本発明の一局面は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａの残基１８５１〜２７１０及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の間のＲＵ単位の１つ又は複数（例えば、全て）ではないという条件で、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ配列の残基１５００〜１７００（例えば、１４５０〜１７５０又は１４００〜１８００）からなるアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、それからなる、又はそれを含むポリペプチドを提供する。一実施態様において、前記ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸残基１８５１〜２７１０及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の配列を欠く。
本発明の別の局面は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａの残基１８５１〜２７１０又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の間のＲＵ単位のいずれかを含まないという条件で、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ配列の残基５４２〜１８５０からなるアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、それからなる、又はそれを含むポリペプチドを提供する。一実施態様において、前記ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸残基１８５１〜２７１０及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の配列を欠く。
Ｃ．ディフィシル毒素Ａ配列への参照は、自然に生じるＣ．ディフィシル毒素Ａ（また、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ参照配列として言及される）のアミノ酸配列を意味する。そのような配列の例は、当業者により容易に理解され、単に例示目的のために、より一般の自然に生じる毒素Ｂ配列の一部が、本明細書において（例えば、配列番号１＆３を参照のこと）ならびに文献全体を通して同定される。
本明細書全体を通した「少なくとも８０%の配列同一性」への参照は、語句「に基づく」と同義と考えられ、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９３%、少なくとも９５%、少なくとも９７%、少なくとも９９%、及び１００%配列同一性の１つ又は複数を包含しうる。配列同一性を評価する場合、定義された数の連続アミノ酸配列を有する参照配列を、本発明のポリペプチドの対応する部分からのアミノ酸配列（同じ数の連続アミノ酸残基を有する）を伴い整列させる。
一実施態様において、ポリペプチドアミノ酸配列は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸残基１５００〜１７００又はアミノ酸残基１４５０〜１７５０、又はアミノ酸残基１４００〜１８００に基づく（即ち、少なくとも８０%の配列同一性を有する）。別の実施態様において、ポリペプチドアミノ酸配列は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸残基５４４〜１８５０、例えばアミノ酸残基５６４〜１８５０、アミノ酸残基５８４〜１８５０、アミノ酸残基５９４〜１８５０、アミノ酸残基６１４〜１８５０、アミノ酸残基６３４〜１８５０、アミノ酸残基６５４〜１８５０、アミノ酸残基６７４〜１８５０、アミノ酸残基６９４〜１８５０、アミノ酸残基７１４〜１８５０、アミノ酸残基７３４〜１８５０、アミノ酸残基７５４〜１８５０、アミノ酸残基７６７〜１８５０、アミノ酸残基７７０〜１８５０、アミノ酸残基７７４〜１８５０、アミノ酸残基７９４〜１８５０、アミノ酸残基８１４〜１８５０、アミノ酸残基８３４〜１８５０、アミノ酸残基８５４〜１８５０、アミノ酸残基８７４〜１８５０、アミノ酸残基８９４〜１８５０、アミノ酸残基９１４〜１８５０、アミノ酸残基９３４〜１８５０、アミノ酸残基９５４〜１８５０、アミノ酸残基９７４〜１８５０、アミノ酸残基９９４〜１８５０、アミノ酸残基１０１４〜１８５０、アミノ酸残基１０３４〜１８５０、アミノ酸残基１０５４〜１８５０、アミノ酸残基１０７４〜１８５０、アミノ酸残基１０９４〜１８５０、アミノ酸残基１１０４〜１８５０、アミノ酸残基１１２４〜１８５０、アミノ酸残基、アミノ酸残基１１３１〜１８５０、アミノ酸残基１１４４〜１８５０、アミノ酸残基１１６４〜１８５０、アミノ酸残基１１８４〜１８５０、アミノ酸残基１２０４〜１８５０、アミノ酸残基１２２４〜１８５０、アミノ酸残基１２４４〜１８５０、アミノ酸残基１２６４〜１８５０、アミノ酸残基１２８４〜１８５０、アミノ酸残基１３０４〜１８５０、アミノ酸残基１３２４〜１８５０、アミノ酸残基１３４４〜１８５０、アミノ酸残基１４５０〜１７５０又はアミノ酸残基１５５０〜１８５０などであるが；ポリペプチドが、Ｃ．ディフィシル毒素Ａの残基１８５１〜２７１０又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の間のＲＵ単位の１つ又は複数（例えば、全て）を含まないという条件である。一実施態様において、前記ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸残基１８５１〜２７１０及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の配列を欠く。例だけにより、上のアミノ酸位置のナンバリングは、配列番号１及び／又は３として同定されたＣ．ディフィシル毒素Ａ配列を指しうる。
一実施態様において、ポリペプチドを提供し、それは、毒素Ａ配列のアミノ酸残基５４２〜１８５０（又はその部分）に基づく配列を含む又はそれからなる。例は、アミノ酸配列配列番号５及び６を含む又はそれからなるポリペプチドとして同定される。
別の実施態様において、ポリペプチドを提供し、それは、システインプロテアーゼ活性を実質的に欠く毒素Ａ配列のアミノ酸残基５４２〜１８５０（又はその部分）に基づく配列を含む又はそれからなる。例は、アミノ酸配列配列番号７を含む又はそれからなるポリペプチドとして同定される。
別の実施態様において、ポリペプチドを提供し、それは、毒素Ａ配列のアミノ酸残基７７０〜１８５０（又はその部分）に基づく配列を含む又はそれからなる。例は、アミノ酸配列配列番号８を含む又はそれからなるポリペプチドとして同定される。
別の実施態様において、ポリペプチドを提供し、それは、毒素Ａ配列のアミノ酸残基１１３０〜１８５０（又はその部分）に基づく配列を含む又はそれからなる。例は、アミノ酸配列配列番号９を含む又はそれからなるポリペプチドとして同定される。
本発明の関連する局面は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａの残基１８５１〜２７１０又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の間のＲＵ単位の１つ又は複数（例えば、いずれか）を含むという条件で、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ配列の残基１５００〜１７００（例えば、１４５０〜１７５０又は１４００〜１８００）からなるアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、それからなる、又はそれを含むポリペプチドを提供する。一実施態様において、前記ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸残基１８５１〜２７１０及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の配列を欠く。
本発明の別の局面において、ポリペプチドが、Ｃ．ディフィシル毒素Ａの残基１８５１〜２７１０又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の間のＲＵ単位の１つ又は複数（例えば、いずれか）を含まないという条件で、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ配列の残基５４３〜１８５２からなるアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、それからなる、又はそれを含むポリペプチドを提供する。一実施態様において、前記ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸残基１８５１〜２７１０及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の配列を欠く。
Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ配列への参照は、自然に生じるＣ．ディフィシル毒素Ｂ（また、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ参照配列として言及される）のアミノ酸配列を意味する。そのような配列の例は、当業者により容易に理解され、単に例示目的のために、より一般の自然に生じる毒素Ｂ配列の一部が、本明細書において（例えば、配列番号２＆４を参照のこと）ならびに文献全体を通して同定される。
一実施態様において、ポリペプチドアミノ酸配列は、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂのアミノ酸残基１５００〜１７００もしくはアミノ酸残基１４５０〜１７５０、又はアミノ酸残基１４００〜１８００に基づいている（即ち、それと少なくとも８０%の配列同一性を有する）。別の実施態様において、ポリペプチドアミノ酸配列は、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂのアミノ酸残基５４４〜１８５２、例えばアミノ酸残基５６４〜１８５２、アミノ酸残基５８４〜１８５２、アミノ酸残基５９４〜１８５２、アミノ酸残基６１４〜１８５２、アミノ酸残基６３４〜１８５２、アミノ酸残基６５４〜１８５２、アミノ酸残基６７４〜１８５２、アミノ酸残基６９４〜１８５２、アミノ酸残基７１４〜１８５２、アミノ酸残基７３４〜１８５２、アミノ酸残基７５４〜１８５２、アミノ酸残基７６７〜１８５２、アミノ酸残基７７０〜１８５２、アミノ酸残基７７４〜１８５２、アミノ酸残基７９４〜１８５２、アミノ酸残基８１４〜１８５２、アミノ酸残基８３４〜１８５２、アミノ酸残基８５４〜１８５２、アミノ酸残基８７４〜１８５２、アミノ酸残基８９４〜１８５２、アミノ酸残基９１４〜１８５２、アミノ酸残基９３４〜１８５２、アミノ酸残基９５４〜１８５２、アミノ酸残基９７４〜１８５２、アミノ酸残基９９４〜１８５２、アミノ酸残基１０１４〜１８５２、アミノ酸残基１０３４〜１８５２、アミノ酸残基１０５４〜１８５２、アミノ酸残基１０７４〜１８５２、アミノ酸残基１０９４〜１８５２、アミノ酸残基１１０４〜１８５２、アミノ酸残基１１２４〜１８５２、アミノ酸残基１１３１〜１８５２、アミノ酸残基１１４４〜１８５２、アミノ酸残基１１６４〜１８５２、アミノ酸残基１１８４〜１８５２、アミノ酸残基１２０４〜１８５２、アミノ酸残基１２２４〜１８５２、アミノ酸残基１２４４〜１８５２、アミノ酸残基１２６４〜１８５２、アミノ酸残基１２８４〜１８５２、アミノ酸残基１３０４〜１８５２、アミノ酸残基１３２４〜１８５２、アミノ酸残基１３４４〜１８５２、アミノ酸残基１４５０〜１７５０又はアミノ酸残基１５５０〜１８００、アミノ酸残基１４５０〜１７５０又はアミノ酸残基１５５０〜１８５０などであるが；ポリペプチドが、Ｃ．ディフィシル毒素Ａの残基１８５１〜２７１０又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の間のＲＵ単位の１つ又は複数（例えば、全て）を含まないという条件である。一実施態様において、前記ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸残基１８５１〜２７１０及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の配列を欠く。例だけにより、上のアミノ酸位置のナンバリングは、配列番号２及び／又は４として同定されたＣ．ディフィシル毒素Ｂ配列を指しうる。
一実施態様において、ポリペプチドを提供し、それは、毒素Ｂ配列のアミノ酸残基５４３〜１８５２（又はその部分）に基づく配列を含む又はそれからなる。例は、アミノ酸配列配列番号１０又は１１を含む又はそれからなるポリペプチドとして同定される。
別の実施態様において、ポリペプチドを提供し、それは、システインプロテアーゼ活性を実質的に欠く、毒素Ｂ配列のアミノ酸残基５４３〜１８５２（又はその部分）に基づく配列を含む又はそれからなる。例は、アミノ酸配列配列番号１２を含む又はそれからなるポリペプチドとして同定される。
別の実施態様において、ポリペプチドを提供し、それは、毒素Ｂ配列のアミノ酸残基７６７〜１８５２（又はその部分）に基づく配列を含む又はそれからなる。例は、アミノ酸配列配列番号１３を含む又はそれからなるポリペプチドとして同定される。
他の実施態様において、ポリペプチドを提供し、それは、毒素Ｂ配列のアミノ酸残基１１４５〜１８５２（又はその部分）に基づく配列を含む又はそれからなる。例は、アミノ酸配列配列番号１４を含む又はそれからなるポリペプチドとして同定される。
別の実施態様において、ポリペプチドを提供し、それは、毒素Ｂ配列のアミノ酸残基１３５０〜１８５２（又はその部分）に基づく配列を含む又はそれからなる。例は、アミノ酸配列配列番号１５を含む又はそれからなるポリペプチドとして同定される。
本発明の抗原ポリペプチドは、システインプロテアーゼ活性を実質的に欠きうる。別の（又は同じ）の実施態様において、抗原は、グルコシルトランスフェラーゼ活性を実質的に欠く。例えば、前記活性（活性）を提供するアミノ酸配列は、本発明の抗原から非存在でありうる（例えば、欠失させうる）。あるいは、そのような活性を提供するために必須の重要アミノ酸残基を、改変又は欠失してもよい。毒素Ａのシステインプロテアーゼ活性を実質的に低下させるためのアミノ酸改変の例は、システイン７００をアラニンへ、ヒスチジン６５５をアラニンへ、アスパラギン酸５８９をアスパラギンへ、又はこれらの変異の複数の組み合わせである。毒素Ｂのシステインプロテアーゼ活性を実質的に低下させるためのアミノ酸改変の例は、システイン６９８をアラニンへ、ヒスチジン６５３をアラニンへ、アスパラギン酸５８７をアスパラギンへ、又はこれらの変異の複数の組み合わせである。毒素Ａのグルコシルトランスフェラーゼ活性を実質的に低下させるためのアミノ酸改変の例は、アスパラギン酸２８５をアラニンへ、アスパラギン酸２８７をアラニンへ、又は両方の変異の組み合わせである。毒素Ｂのグルコシルトランスフェラーゼ活性を実質的に低下させるためのアミノ酸改変の例は、アスパラギン酸２８６をアラニンへ、アスパラギン酸２８８をアラニンへ、又は両方の変異の組み合わせである。これらの酵素活性は、天然毒素Ａ及び／又は毒素Ｂに存在し、前記毒素のＮ末端ドメインと関連付けられる（図１、ならびに／あるいは配列番号１、２、３、及び４を参照のこと）。
本発明の抗原ポリペプチドは、天然Ｃ．ディフィシル毒素のグリコシルトランスフェラーゼ（エフェクター）ドメイン（アミノ酸残基１〜５４２毒素Ａ；アミノ酸残基１〜５４３毒素Ｂ）を実質的に欠きうる。一実施態様において、抗原ポリペプチドは、天然Ｃ．ディフィシル毒素の機能的なグリコシルトランスフェラーゼ（エフェクター）ドメイン（アミノ酸残基１〜５４２毒素Ａ；アミノ酸残基１〜５４３毒素Ｂ）を欠く。別の（又は同じ）実施態様において、抗原は、天然Ｃ．ディフィシル毒素のシステインプロテアーゼドメイン（アミノ酸残基５４３〜７７０毒素Ａ；５４４〜７６７毒素Ｂ）を実質的に欠く。一実施態様において、抗原ポリペプチドは、天然Ｃ．ディフィシル毒素の機能的なシステインプロテアーゼドメイン（アミノ酸残基５４３〜７７０毒素Ａ；アミノ酸残基５４４〜７６７毒素Ｂ）を欠く。一実施態様において、抗原ポリペプチドは、天然Ｃ．ディフィシル毒素の機能的な転位ドメイン（アミノ酸残基７７０〜１８５０毒素Ａ；アミノ酸残基７６７〜１８５２毒素Ｂ）を含む又はそれからなる。一実施態様において、抗原ポリペプチドは、天然Ｃ．ディフィシル毒素の完全な又は完全長の転位ドメイン（アミノ酸残基７７０〜１８５０毒素Ａ；アミノ酸残基７６７〜１８５２毒素Ｂ）を含む又はそれからなる。一実施態様において、抗原ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ配列の残基８５０〜１３３０、又は１５００〜１８００、又は６６０〜１２５５、又は１２５６〜１８５２、又は５４３〜１６９２からなるアミノ酸配列あるいはＣ．ディフィシル毒素Ｂ配列の残基６６０〜１１００又は１１００〜１６１０からなるアミノ酸配列を含まない。
前記アミノ酸残基ナンバリングは、任意の毒素Ａ又は毒素Ｂ毒素型、例えば、本明細書において列挙する参照毒素Ａ及び／又は毒素Ｂ毒素型配列番号の任意の１つ又は複数を指す。したがって、前記アミノ酸残基ナンバリングは、本明細書において列挙する任意の特定の毒素Ａ及び／又は毒素Ｂ参照配列（それと少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９３%、少なくとも９５%、少なくとも９７%、又は少なくとも９９%を有するアミノ酸配列変異体を含む）を指しうる。
本発明の抗原ポリペプチドは、抗原の１つの部分が、毒素Ａ及び／又は毒素Ｂの中央ドメインから由来し、抗原の第２部分が、Ｃ．ディフィシルの細菌表面層タンパク質成分（ＳＬＰ）のドメイン（又はそのフラグメント）に基づく、キメラを含む。前記ドメインの包含は、本発明者らにより同定されており、いくつかの利点を付与する。そのようなＳＬＰドメインは、本発明の抗原ポリペプチドの可溶性発現を促進する。また、これらのＳＬＰドメインはＣ．ディフィシル起源であるため、免疫化の前に、コンストラクトから切断し、次に除去することは不必要である。実際に、本発明者らは、そのようなドメインへの抗体は、インタクトなＣ．ディフィシル細菌を認識し、細菌のコロニー形成のプロセスを防止する又は遅くすることにより、追加の治療的利益をもたらすと考える。そのようなＣ．ディフィシルのＳＬＰドメインの例は、Ｃ．ディフィシル遺伝子ＣＤ２７６７（又はそのフラグメント）からのポリペプチド産物を含む又はそれからなるポリペプチドに基づく。特定の例として、参照は、Ｃ．ディフィシル遺伝子ＣＤ２７６７のポリペプチド産物のアミノ酸残基２７〜４０１（又はその部分）に基づくポリペプチドフラグメントに作られる−例えば、アミノ酸配列配列番号１６からなる又はそれを含むポリペプチドを参照のこと。そのようなドメインは、例えば、本発明のポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に位置付けられうる。
例えば、本発明の一実施態様において、ポリペプチド抗原を提供し、それは、ＣＤ ２７６７ポリペプチド（例えば、その残基２７〜４０１に基づく）及び本明細書において上に定義する通りのＣ．ディフィシル毒素ポリペプチド（例えば、中央ドメイン）からなる又はそれを含む。
別の実施態様において、ポリペプチド抗原を提供し、それは、ＣＤ ２７６７ポリペプチド（例えば、その残基２７〜４０１に基づく）及び毒素Ａ配列のアミノ酸残基７７０〜１８５０（又はその部分）からなる又はそれを含むアミノ酸配列に基づくＣ．ディフィシル毒素ポリペプチドからなる又はそれを含む。
別の実施態様において、ポリペプチド抗原を提供し、それは、ＣＤ ２７６７ポリペプチド（例えば、その残基２７〜４０１に基づく）及び毒素Ａ配列のアミノ酸残基５４２〜１８５０（又はその部分）からなる又はそれを含むアミノ酸配列に基づくＣ．ディフィシル毒素ポリペプチドからなる又はそれを含む。例は、アミノ酸配列配列番号１７を含む又はそれからなるポリペプチドとして同定される。
本発明の関連する実施態様において、抗原を提供し、それは、毒素Ｂ配列のアミノ酸残基７６７〜１８５２（又はその部分）を伴うＣＤ ２７６７ポリペプチド残基２７〜４０１（又はその部分）のキメラからなる。配列番号１８を参照のこと。
本発明の別の実施態様において、ポリペプチド抗原を提供し、それは、ＣＤ ２７６７ポリペプチド（例えば、その残基２７〜４０１に基づく）及び毒素Ｂ配列のアミノ酸残基５４３〜１８５２（又はその部分）からなる又はそれを含むアミノ酸配列に基づくＣ．ディフィシル毒素ポリペプチドからなる又はそれを含む。
本発明の抗原ポリペプチドは、ＳＰＬへ追加的に（又は代わりに）、他の融合タンパク質パートナーを含み、可溶性発現を促進しうる。融合タンパク質パートナーは、抗原コンストラクトのＮ又はＣ末端で付着されうるが、しかし、通常は、Ｎ末端に置かれる。融合パートナーの例は、ＮｕｓＡ、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、小さなユビキチン様分子（Ｓｕｍｏタグ）である。精製の間に融合タンパク質パートナーの除去を促進するために、固有のプロテアーゼ部位を、融合タンパク質パートナーと融合タンパク質自体の間に挿入してもよい。そのようなプロテアーゼ部位は、トロンビン、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、PreScission（商標）、Sumo（商標）についてのものを含みうる。あるいは、融合タンパク質パートナーの除去は、融合タンパク質パートナーと融合タンパク質自体の間のインテイン配列の包含を介して達成されうる。インテインは、自己切断タンパク質であり、刺激（例えば、低下したｐＨ）に応答して、インテインと抗原コンストラクトの間の接合部での自己スプライシングが可能であり、このように、特異的プロテアーゼの添加についての必要性を排除する。インテインの例は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（ＲｅｃＡ）、及びパイロコッカス・ホリコシ（ＲａｄＡ）から由来するドメインを含む（Fong et al. (2010) Trends Biotechnol. 28: 272-279）。
精製を促進するために、本発明の抗原は、１つ又は複数の精製タグを含み、特定のクロマトグラフィー工程（例えば、金属イオンキレート、親和性クロマトグラフィー）が精製プロセスに含まれることを可能にしうる。そのような精製タグは、例えば、リピートヒスチジン残基（例えば、６〜１０のヒスチジン残基）、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、及びストレプトアビジンを含みうる。これらのタグは、本発明のポリペプチド抗原のＮ及び／又はＣ末端で付着されうる。そのようなタグの除去を精製の間に促進するために、プロテアーゼ部位及び／又はインテイン（上の例）を、ポリペプチドと精製タグの間に挿入してもよい。本発明の毒素Ａ及びＢ由来抗原のための発現コンストラクトの例を、配列番号１７、１８、１９、及び２０に示す。
このように、本発明の典型的な抗原コンストラクト（Ｎ末端から開始する）は、以下を含みうる：
− 第１精製タグ
− 任意の融合タンパク質パートナー（発現を促進するため）及び／又は任意のＳＬＰ
− 第１（好ましくは特異的な）プロテアーゼ配列又はインテイン配列
− 毒素Ａ及び／又はＢ抗原配列
− 任意の第２（好ましくは特異的な）プロテアーゼ配列又はインテイン配列
− 任意の第２精製タグ。
第１及び第２精製タグは、同じ又は異なりうる。同様に、第１及び第２のプロテアーゼ／インテイン配列は、同じ又は異なりうる。第１及び第２選択肢は、好ましくは、異なっており、選択的で制御可能な切断／精製を可能にする。
一実施態様において、本発明の抗原は、キメラであり、中央ドメイン毒素Ａ及び／又はＢに基づく毒素抗原配列との併用において、Ｃ．ディフィシル表面タンパク質の部分又はドメインからなる。
したがって、一実施態様において、本発明のポリペプチドは、以下を含みうる（Ｎ末端から開始する）：
− 第１精製タグ
− 第１（好ましくは特異的な）プロテアーゼ配列又はインテイン配列
− 毒素Ａ又はＢ及びＳＬＰのキメラである抗原配列
− 任意の第２（好ましくは特異的な）プロテアーゼ配列又はインテイン配列
− 任意の第２精製タグ。
スペーサーを導入し、精製タグをポリペプチドから遠ざけてもよい−これは、親和性精製カラム媒質への結合効率を増加するのを助けうる。スペーサーは、精製タグの（直ぐ）後又は融合タンパク質パートナー成分とポリペプチド自体の残分の間に配置されうる。同様に、スペーサーを用いて、融合タンパク質パートナー及び／又はＳＬＰをＣ．ディフィシル毒素成分から遠ざけてもよい。典型的なスペーサー配列は、直線状又はアルファ−ヘリックス構造のいずれかを与えるための１０〜４０の間のアミノ酸残基からなりうる。
したがって、一実施態様において、本発明のポリペプチドは、以下を含みうる（Ｎ末端から開始する）：
− 第１精製タグ
− 任意の第１スペーサー配列
− 融合タンパク質パートナー（発現を促進するため）及び／又はＳＬＰ
− 任意の第２スペーサー配列
− （好ましくは特異的な）プロテアーゼ配列又はインテイン配列
− 毒素Ａ及び／又はＢ由来の抗原配列
− 任意の第２（好ましくは特異的な）プロテアーゼ配列又はインテイン配列
− 任意の第３スペーサー配列
− 任意の第２精製タグ。
本発明のコンストラクトをコードする遺伝子を、ＰＣＲにより、Ｃ．ディフィシルのゲノムＤＮＡから生成し、標準的な方法により配列決定し、完全性を確実にしうる。あるいは及び好ましくは、遺伝子を合成し、発現宿主（例えば、大腸菌、バチルス・メガテリウム）についての最適なコドンバイアスを提供しうる。このように、本発明は、本発明の上記ポリペプチドをコードする、対応する核酸配列を提供する。
したがって、本発明の第２局面は、本発明の上記ポリペプチド抗原の１つ又は複数を発現するための方法を提供し、前記方法は以下を含む：
１）宿主細胞において前記ポリペプチド抗原の１つまたは複数をコードする核酸配列を提供すること、それにおいて、前記核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている；及び
２）宿主細胞中で核酸配列を発現すること。
本発明の抗原ペプチドは、多くの方法において、ヒト又は動物での使用のためのワクチンとして製剤化されうる。例えば、製剤は、分子内架橋を導入するための薬剤を用いた処理を含みうる。そのような薬剤の１つの例は、ホルムアルデヒドであり、それは、例えば、本発明の抗原ポリペプチドと、１〜２４時間の間にわたりインキュベートされうる。あるいは、より長いインキュベーション時間、例えば、２、４、６、８、又は１０日間までを用いてもよい。そのような薬剤を用いた処理に続き、本発明の抗原を、適したアジュバントと組み合わせてもよく、それは、抗原がヒト又は動物での使用のために意図されているか否かに依存して異なりうる。
ヒト又は動物のワクチン製剤は、本発明のポリペプチドを含みうる。このように、一実施態様において、本発明のワクチン製剤手順は、以下の工程を含む：
− 本発明の組換えポリペプチドを、適した緩衝液系中で提供すること
− 場合により（好ましくは）、前記混合物を、トキソイド化成分（例えばホルムアルデヒドなど）を用いて処理すること
− 場合により、ポリペプチドを新たな緩衝系に移すこと
− ポリペプチドを、１つ又は複数の適したアジュバント及び、場合により、他の賦形剤と組み合わせること。
したがって、本発明の第３局面は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ及び／又は毒素Ｂに結合する抗体の生成における使用のための、本発明の上記ポリペプチドの１つ又は複数を提供する。一実施態様において、前記抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ及び／又は毒素Ｂに結合し、それを中和する。
動物の免疫化のために、個々のＣ．ディフィシル毒素又は組み合わせについて特異的な抗体を産生するために、本発明のＣ．ディフィシル組換え抗原ポリペプチドを、別々に又は組み合わせにおいて、同時に又は連続的のいずれかで、免疫原として使用してもよい。例えば、２つ又はそれ以上の組換え抗原を、一緒に混合し、単一の免疫原として使用してもよい。あるいは、Ｃ．ディフィシル毒素抗原（例えば、毒素Ａ由来）を、第１動物群での最初の免疫原として別々に使用してもよく、別のＣ．ディフィシル毒素抗原（例えば、毒素Ｂ由来）を、第２動物群に別々に使用してもよい。別々の免疫化により産生された抗体を、組み合わせ、Ｃ．ディフィシル毒素に対して向けられた抗体組成物をもたらしうる。動物／獣医学的使用のための適したアジュバントの非限定的な例は、フロイント（完全及び不完全形態）、ミョウバン（リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム）、サポニン及びその精製成分Ｑｕｉｌ Ａを含む。
本発明の第４（ワクチン）局面は、（例えば、哺乳動物、例えば人間などにおける）ＣＤＩの防止、処置、又は抑制における使用のための、本発明の上記ポリペプチド抗原の１つ又は複数を提供する。言い換えると、本発明は、（例えば、哺乳動物、例えば人間などにおける）ＣＤＩの防止、処置、又は抑制のための方法を提供し、前記方法は、被験者（例えば、哺乳動物、例えば人間など）への、本発明の上記ポリペプチドの１つ又は複数の治療的に効果的な量の投与を含む。
例として、毒素Ａベース抗原（任意のＡ毒素型）を、単独で、又は毒素Ｂベース抗原（任意のＢ毒素型）との組み合わせにおいて用いてもよい。同様に、毒素Ｂベース抗原（任意のＢ毒素型）を、単独で、又は毒素Ａベース抗原（任意のＡ毒素型）との組み合わせにおいて用いてもよい。前記抗原は、連続的な又は同時の様式において投与されうる。本発明のワクチン適用は、さらに、１つ又は複数の抗原、例えばＣ．ディフィシル抗原など（例えば、非毒素抗原；又はＣ．ディフィシル細菌、例えば、不活化又は弱毒化されている細菌など）、及び、場合により、１つ又は複数の院内感染抗原（例えば、院内感染を起こす細菌からの抗原、顕著には、表面抗原；及び／又は院内感染を起こす細菌、例えば不活化又は弱毒化されている細菌など）などの組み合わせた使用（例えば、先の、連続的な、又はその後の投与）を含んでもよい。院内感染を起こす細菌の例は、以下の１つ又は複数を含む：大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、例えばＭＲＳＡなど、レジオネラ、シュードモナス・エルジノーサ、セラチア・マルセッセンス、エンテロバクター属、シトロバクター属、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、アシネトバクター属、例えばアシネトバクター・バウマニなど、バークホルデリア・セパシア、及びエンテロコッカス、例えばバンコマイシン耐性エンテロコッカス（ＶＲＥ）など。
一実施態様において、前記ワクチン適用を、予防的に用い、例えば、患者が病院（又は同様の処置施設）に入る前に、患者を処置し、院内感染を防止してもよい。あるいは、前記ワクチン適用を、ルーチンの事項として、脆弱な患者に投与してもよい。
本発明の関連ワクチンの局面は、（例えば、哺乳動物、例えば人間などにおける）ＣＤＩの防止、処置、又は抑制における使用のための、本発明の１つ又は複数の上記ポリペプチドに結合する１つ又は複数の抗体（全ＩｇＧ及び／又はＦａｂ及び／又はＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む又はそれからなる）を提供する。言い換えると、本発明は、（例えば、哺乳動物、例えば人間などにおける）ＣＤＩの防止、処置、又は抑制のための方法を提供し、前記方法は、被験者（例えば、哺乳動物、例えば人間など）への、前記抗体（又は抗体）の治療的に効果的な量の投与を含む。
例として、抗毒素Ａベース抗原（任意のＡ毒素型）抗体を、単独で、又は抗毒素Ｂベース抗原（任意のＢ毒素型）抗体との組み合わせにおいて用いてもよい。同様に、抗毒素Ｂベース抗原（任意のＢ毒素型）抗体を、単独で、又は抗毒素Ａベース抗原（任意のＡ毒素型）抗体との組み合わせにおいて用いてもよい。前記抗体は、連続的な又は同時の様式において投与されうる。本発明のワクチン適用は、さらに、抗原、例えばＣ．ディフィシル抗原など（例えば、非毒素抗原；又はＣ．ディフィシル細菌）に結合する１つ又は複数の抗体、及び、場合により、１つ又は複数の院内感染抗原（例えば、院内感染を起こす細菌からの抗原、顕著には、表面抗原；及び／又は院内感染を起こす細菌）に結合する１つ又は複数の抗体の組み合わせた使用（例えば、先の、連続的な、又はその後の投与）を含んでもよい。院内感染を起こす細菌の例は、以下の１つ又は複数を含む：大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、例えばＭＲＳＡなど、レジオネラ、シュードモナス・エルジノーサ、セラチア・マルセッセンス、エンテロバクター属、シトロバクター属、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、アシネトバクター属、例えばアシネトバクター・バウマニなど、バークホルデリア・セパシア、及びエンテロコッカス、例えばバンコマイシン耐性エンテロコッカス（ＶＲＥ）など。
一実施態様において、前記ワクチン適用は、例えば、一度、患者が、病院（又は同様の処置施設）に入った場合、予防的に用いてもよい。あるいは、前記ワクチン適用は、患者に、１つ又は複数の抗生物質との組み合わせにおいて投与してもよい。
一実施態様において、前記抗体は、本発明の上記抗原の１つ又は複数を用いた、動物（例えば、哺乳動物、例えば人間など、又は非ヒト動物、例えばヤギもしくはヒツジなど）の免疫化により生成されてきた。
一実施態様において、本発明の抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ及び／又は毒素Ｂのリピート領域に（実質的に）結合しない。
ヒト（又は非ヒト動物）使用のためのワクチンの調製のために、活性な免疫原性成分（これらが、本発明の抗原及び／又はそれに結合する本発明の対応する抗体であるかを問わず）を、担体又は賦形剤と混合してもよく、それらは、医薬的に許容可能である及び活性成分と適合する。適した担体及び賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、又は同様のもの、及びそれら組み合わせを含む。また、所望の場合、ワクチンは、ワクチンの有効性を増強する、少量の補助物質（例えば湿潤又は乳化薬剤、ｐＨ緩衝薬剤、及び／又はアジュバントなど）を含みうる。
ワクチンは、さらに、１つ又は複数のアジュバントを含みうる。本発明の範囲を伴うアジュバントの１つの非限定的な例は、水酸化アルミニウムである。アジュバントの他の非限定的な例は、しかし、限定されないが、以下を含む：Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ノルＭＤＰとして言及される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとして言及される）、及びＲＩＢＩ、それらは、２%スクアレン／ツイーン８０エマルジョン中の細菌、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート、及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）から抽出された３つの成分を含む。
典型的には、ワクチンは、注射剤として、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして調製される。もちろん、注射の前に、液体中の溶液、又は懸濁液のために適した固体形態が、また、調製されうる。調製物は、また、乳化されうる、あるいは、ペプチドは、リポソーム又はマイクロカプセル中にカプセル化されうる。
ワクチン投与は、一般的に、従来の経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、又は粘膜経路）による。投与は、非経口注射、例えば、皮下又は筋肉内注射によりうる。
ワクチンを、投薬製剤と適合する様式で、予防的及び／又は治療的に効果的であるような量で投与する。投与される量は、一般的に、１用量あたり５マイクログラム〜２５０マイクログラムの範囲の抗原であり、処置すべき被験者、抗体を合成する被験者の免疫系の能力、及び所望の保護の程度に依存する。投与するために要求される活性成分の厳密な量は、開業医の判断に依存しうる、及び、各々の患者に特別でありうる。
ワクチンは、単一用量スケジュールにおいて、又は、場合により、複数用量スケジュールにおいて与えてもよい。複数用量スケジュールは、ワクチン接種の一次コースが、１〜６の別々の用量、それに続く、免疫応答を維持及び／又は強化するために要求されるその後の時間間隔で与えられる他の用量（例えば、第２用量について１〜４ヶ月目）、及び、必要な場合、数ヶ月後のその後の用量でありうるものである。投薬レジメンは、また、少なくとも部分的には、個人の必要性により決定され、開業医の判断に依存しうる。
一実施態様において、１０〜５００μgの本発明のポリペプチドを含む容積Ｘ（例えば、１〜６ml）の緩衝溶液を、等容積Ｘ（即ち、１〜６ml）のアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）と混合し、エマルジョンを形成する。アジュバントと混合することが、数分間にわたり行われ、安定なエマルジョンを確実にする。一次免疫化を、次に、前記エマルジョン（例えば、１〜１０ml）を用いて実施する（例えば、筋肉内注射）。並行して、１０〜５００μgの本発明のポリペプチドを含む容積Ｘ（例えば、１〜６ml）の緩衝溶液を、等容積Ｘ（即ち、１〜６ml）のアジュバント（例えば、フロイント不完全アジュバント）と混合し、エマルジョンを形成する。アジュバントと混合することが、数分間にわたり行われ、安定なエマルジョンを確実にする。その後の免疫化（例えば、２、３、４、５、又は６）を、次に、前記エマルジョン（例えば、１〜１０ml）を用いて、毎月ベースで実施する（例えば、筋肉内注射）。抗体力価は、典型的には、前記の毎月の免疫化の各々の後、約２週間の期間でのサンプリングによりテストし、抗体収集を、最適な抗体力価が達成されている場合に実施する。
また、免疫原性抗原を含むワクチンは、他の免疫調節薬剤、例えば、免疫グロブリン、抗生物質、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）、及び／又はサイトカイン（例えば、ＩＦＮガンマ）との併用において投与してもよい。
本発明との使用のために適した追加製剤は、マイクロカプセル、坐剤、及び、一部の場合において、経口製剤、又はエアロゾルとしての分布のために適した製剤を含む。坐剤については、従来の結合剤及び担体は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含みうる；そのような坐剤は、約０．５%〜１０%の範囲（例えば、約１%〜２%を含む）の活性成分を含む混合物から形成されうる。
本発明の抗原は、また、親和性クロマトグラフィー手順における使用のためのリガンドとしての使用を有しうる。そのような手順において、本発明の抗原を、マトリクス、例えばセファロースなどの上に、例えば、臭化シアン活性化セファロースを使用し、共有結合的に固定化しうる。そのような親和性カラムを次に使用し、それらを、カラムを通じて通過させ、次に結合したＩｇＧ画分を溶出する（例えば、低ｐＨによる）ことにより抗血清又は免疫グロブリンの部分的に精製された溶液から抗体を精製してもよい。溶出画分中の抗体のほぼ全てが、本発明の抗原に対して向けられ、非特異的な抗体及び他のタンパク質が除去される。これらの親和性精製されたＩｇＧ画分は、診断における免疫療法としての及び試薬としての両方の適用を有する。免疫療法のために、親和性精製された抗体によって、低用量を投与することを可能にし、有害な副作用の可能性を低くする。診断のために、親和性精製された薬剤は、しばしば、改善された特異性及びより少ない偽陽性結果を与える。
定義
クロストリジウム・ディフィシルは、クロストリジウム属のグラム陽性菌の種である。
クロストリジウム・ディフィシル感染（ＣＤＩ）は、ヒト及び動物に影響を与え、軽度の自己限定的な下痢から生命を脅かす状態（例えば偽膜性大腸炎及び細胞毒性巨大結腸など）までの広範囲の症状を招く、細菌感染を意味する。この疾患において、Ｃ．ディフィシルは、正常腸細菌叢の一部を置き換え、腸上皮を攻撃し、損傷する細胞毒を産生することを開始する。ヒトＣＤＩについての一次リスク因子は、広域抗生物質を受けること、６５歳以上であること、及び入院することを含む。
クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは、サイズが約３００kDaのタンパク質細胞毒素／エンテロトキシンのファミリーである。毒素Ａは、Ｎ末端領域内に酵素活性を有し、それは、哺乳動物細胞の細胞骨格を破壊するように作用し、細胞死を起こす。自然に生じる毒素Ａの多数の変異体が、「毒素型」と呼ばれるクロストリジウム・ディフィシルの株内にある。毒素Ａの種々の毒素型は、それらの一次配列内に、通常、全体の＜１０%の変動を有する。適した毒素Ａ配列の例は、配列番号１及び３を含む。
クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂは、サイズが約２７０kDaのタンパク質細胞毒のファミリーであり、それらは、毒素Ａと同様であるが、しかし、有意により細胞毒性である。毒素Ａと同様に、毒素Ｂは、Ｎ末端領域内に酵素活性を有し、それは、哺乳動物細胞の細胞骨格を破壊するように作用し、細胞死を起こす。自然に生じる毒素Ｂの多数の変異体が、「毒素型」と呼ばれるＣ．ディフィシルの株内にある。毒素Ｂの種々の毒素型は、それらの一次配列内に、全体の＜１５%までの変動を有する。適した毒素Ｂ配列の例は、配列番号２及び４を含む。
Ｃ．ディフィシルリピート単位は、von Eichel-Streiber and Sauerborn(1990; Gene 30: 107-113)により最初に同定されたリピートモチーフを含む毒素Ａ及びＢのＣ末端内の領域である。毒素Ａの場合において、３１の短いリピート及び７つの長いリピート配列があり、各々のリピートは、βヘアピンからなり、ループが続く。毒素Ｂは、同様の構造からなり、しかし、より少ないリピートを伴う。毒素Ａのリピート単位は、残基１８５０〜２７１０内に含まれ、毒素Ｂについてのリピート単位は、残基１８５２〜２３６６内である。リピート領域は、受容体結合において役割を果たす。受容体結合領域（即ち、毒素の構造的結合ポケットを定義する）は、長いリピート領域周辺にクラスター化し、「結合モジュール」を形成すると思われる。
毒素Ａ及びＢの中央ドメインは、哺乳動物細胞中への毒素の転位において役割を果たすと考えられる。毒素Ａの中央ドメインは、残基５４２〜１８４９に基づき、毒素Ｂについての中央ドメインは、残基５４３〜１８５１に基づく。毒素Ａ及びＢの中央ドメイン領域の内、最初のドメインは、システインプロテアーゼであり、それは、毒素のエフェクタードメイン（グルコシルトランスフェラーゼ活性を含む）の内在化において役割を果たす。
毒素型は、しばしば、Ｃ．ディフィシルの株を分類するために使用される。毒素タイピングは、毒素遺伝子を用いて得られた制限パターンを特徴付ける方法に基づく。毒素Ａ及びＢの毒素型は、一次アミノ酸配列により、これらのタンパク質毒素の変異体を表す。一実施態様において、Ｃ．ディフィシル毒素は、毒素型０からＸＶの１つより選択される。好ましい毒素型（プラス、例えば、リボタイプ、及び株）を、直ぐ下の表に列挙する。列挙する毒素型は、純粋に例示的であり、本発明に限定することを意図しない。
「抗体」は、最も広い意味において使用され、それらが所望の生物学的活性を示す限り、ポリクローナル抗体及び抗体フラグメントを具体的にカバーする。例えば、抗体は、少なくとも１つ又は２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書において、ＶＨＣとして略される）、及び少なくとも１つ又は２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書において、ＶＬＣとして略される）を含むタンパク質である。ＶＨＣ及びＶＬＣ領域は、超可変領域中にさらに細分することができ、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれ、より保存された領域を伴い散在し、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲が、厳密に定義されている（Kabat, E.A., et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991、及びChothia, C. et al, J. MoI. Biol. 196: 901-917, 1987を参照のこと、それらは、本明細書において、参照により組み入れられる）。好ましくは、各々のＶＨＣ及びＶＬＣは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、以下の順番において、アミノ末端からカルボキシ末端まで配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
抗体のＶＨＣ又はＶＬＣ鎖は、重又は軽鎖定常領域の全て又は部分をさらに含むことができる。一実施態様において、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、それにおいて、免疫グロブリン重及び軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合により相互接続されている。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１成分（ＣＩｑ）を含む、宿主組織又は因子への抗体の結合を媒介する。用語「抗体」は、型ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびに、それらのサブタイプ）のインタクトな免疫グロブリンを含み、それにおいて、免疫グロブリンの軽鎖は、型カッパ又はラムダでありうる。
用語抗体は、本明細書において使用する通り、また、Ｃ．ディフィシルの毒素（例えば、毒素Ａ又はＢ）に結合する抗体の部分を指す（例えば、１つ又は複数の免疫グロブリン鎖が、完全長ではないが、しかし、毒素に結合する分子）。用語抗体内に包含される結合部分の例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬＣ、ＶＨＣ、ＣＬ、及びＣＨｌドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨＣ及びＣＨｌドメインからなるＦｃフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬＣ及びＶＨＣドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ｄＡｂフラグメント（Ward et al, Nature 341: 544-546, 1989）、それはＶＨＣドメインからなる；及び（ｖｉ）例えば、可変領域の抗原結合部分に結合する十分なフレームワークを有する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。軽鎖可変領域の抗原結合部分及び重鎖可変領域の抗原結合部分（例えば、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬＣ及びＶＨＣ）を、組換え方法を使用し、ＶＬＶ及びＶＨＣ領域が対合し、一価分子（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Bird et al.(1988) Science lAl-ATi-Alβ；及びHuston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85: 5879-5883を参照のこと）を形成する単一タンパク質鎖として、それらを作製することを可能にする合成リンカーにより連結することができる。そのような単鎖抗体（ならびにラクダ）が、また、用語抗体内に包含される。これらは、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、その部分を、有用性について、インタクトな抗体と同じ様式でスクリーニングする。
用語「フラグメント」は、対応する参照配列の（に基づく）少なくとも７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、２７０、２９０、３１０、３３０、３５０連続アミノ酸残基を典型的に有するペプチドを意味する。
用語「変異体」は、参照ポリペプチド配列（例えば、Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドアミノ酸配列、及び／又は融合タンパク質パートナーアミノ酸配列、及び／又はＳＬＰアミノ酸参照配列）と、少なくとも８０、好ましくは、少なくとも８５、より好ましくは、少なくとも９０パーセントのアミノ酸配列相同性を有するペプチド又はペプチドフラグメントを意味する。配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として作用し、それに、テスト配列を比較してもよい。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テスト配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要である場合、サブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。配列比較アルゴリズムは、次に、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列と比べたテスト配列についてのパーセンテージ配列同一性を算出する。
多様な配列アラインメント方法のいずれかを使用し、パーセント同一性を決定することができる。限定を伴わず、包括的方法、局所的方法、及びハイブリッド方法、例えばセグメントアプローチ方法などを含む。パーセント同一性を決定するためのプロトコールは、当業者の範囲内のルーチン手順である。包括的方法では、分子の開始から末端まで配列を整列させ、個々の残基対のスコアを加えることにより、及びギャップペナルティを課すことにより最善のアラインメントを決定する。非限定的な方法は、例えば、以下を含む：ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、例えば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照のこと；及び反復改善、例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)を参照のこと。局所的方法では、入力配列の全てにより共有される１つ又は複数の保存モチーフを同定することにより、配列を整列させる。非限定的な方法は、例えば、以下を含む：Ｍａｔｃｈボックス、例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)；Ｇｉｂｂｓサンプリング、例えば、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)を参照のこと；Ａｌｉｇｎ−Ｍ、例えば、Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics: 1428-1435 (2004)を参照のこと。
このように、パーセント配列同一性を、従来の方法により決定する。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-19, 1992を参照のこと。簡単には、２つのアミノ酸配列を整列させ、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１、及びHenikoff and Henikoff (ibid.)の「ｂｌｏｓｕｍ６２」スコアリングマトリクスを使用し、下に示す通りにアラインメントスコアを最適化する（アミノ酸を標準的な１文字コードにより示す）。
配列同一性を決定するためのアラインメントスコア
パーセント同一性を、次に、以下の通りに算出する：
実質的に相同なポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するとして特徴付けられる。これらの変化は、好ましくは、軽微な性質であり、それは、保存的アミノ酸置換（下を参照のこと）及びポリペプチドのフォールディング又は活性に有意に影響しない他の置換；典型的には、１〜約３０アミノ酸の小さな欠失；及び小さなアミノ又はカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基など、約２０〜２５残基までの小さなリンカーペプチド、又は親和性タグである。
保存的アミノ酸置換
塩基性： アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性： グルタミン酸
アスパラギン酸
極性： グルタミン
アスパラギン
疎水性： ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族： フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小型： グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン
２０の標準的アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、及びα−メチルセリンなど）を、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基について置換してもよい。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、及び天然ではないアミノ酸を、クロストリジウムのポリペプチドアミノ酸残基について置換してもよい。本発明のポリペプチドは、また、非天然アミノ酸残基を含みうる。
非天然アミノ酸は、限定はされないが、以下を含む：トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノ−プロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシ−プロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチル−トレオニン、ヒドロキシ−エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ−システイン、ニトロ−グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニル−アラニン、４−アザフェニル−アラニン、及び４−フルオロフェニルアラニン。いくつかの方法が、当技術分野において、非天然アミノ酸残基をタンパク質中に取り込むために公知である。例えば、インビトロのシステムを用いることができ、それにおいて、ナンセンス変異が、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを使用して抑制される。アミノ酸を合成し、ｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法が、当技術分野において公知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写及び翻訳を、大腸菌Ｓ３０抽出物ならびに商業的に利用可能な酵素及び他の試薬を含む無細胞システムにおいて行う。タンパク質をクロマトグラフィーにより精製する。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991；Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991；Chung et al., Science 259: 806-9, 1993；及びChung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993を参照のこと。第２の方法において、翻訳を、ゼノパス卵母細胞において、変異ｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションにより行う（Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996）。第３の方法内で、大腸菌細胞を、置き換えられるべき天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の非存在において及び所望の非天然アミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在において培養する。非天然アミノ酸が、その天然対応物の場所においてポリペプチド中に組み入れられる。Koide et al., Biochem. 33: 7470-6, 1994を参照のこと。天然アミノ酸残基を、インビトロ化学修飾により、非天然種に変換することができる。化学修飾を部位特異的変異誘発と組み合わせ、置換の範囲をさらに拡大することができる（Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993）。
限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、非天然アミノ酸、及び天然ではないアミノ酸を、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基について置換してもよい。
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸を、当技術分野において公知の手順、例えば部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989）などに従って同定することができる。生物学的相互作用の部位は、また、構造の物理的分析により決定することができ、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光学的親和性標識（推定接触部位アミノ酸の変異と併用において）などの技術により決定される通りである。例えば、de Vos et al., Science 255: 306-12, 1992;Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992；Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、また、本発明のポリペプチドの関連成分（例えば、転位成分又はプロテアーゼ成分）との相同性の分析から推測することができる。
複数のアミノ酸置換を作製し、変異誘発及びスクリーニングの公知の方法、例えばＲeidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989)により開示されるものなどを使用してテストすることができる。簡単には、これらの著者は、ポリペプチド中の２つ又はそれ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次に変異誘発されたポリペプチドを配列決定し、各位置での許容可能な置換のスペクトルを決定するための方法を開示する。使用することができる他の方法は、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991；Ladner et al., 米国特許第５，２２３，４０９号；Huse, ＷＩＰＯ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９２／０６２０４）及び領域特異的変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986;Ner et al., DNA 7: 127, 1988）を含む。
毒素中和は、哺乳動物細胞に対する毒素Ａ又はＢのいずれかの細胞毒性作用を防止するための物質の能力を意味する。毒素中和活性についてのアッセイにおいて、固定量の毒素を、種々の濃度の中和物質（例えば、抗体）と混合し、混合物を、固定時間にわたり、哺乳動物細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞）とインキュベートする。中和力価は、いくつかの方法により測定しうる：
（ａ）毒素Ａ又はＢのいずれかの細胞毒性効果から細胞を完全に保護する物質（血清、抗体、精製ＩｇＧ）の希釈。これらの細胞毒性効果は、細胞の円形化により明白であり、エンドポイントは、顕微鏡方法により定量化しうる。
（ｂ）毒素Ａ又はＢのいずれかの細胞毒性効果から細胞の５０%を保護する（ＥＤ５０力価）物質（血清、抗体、精製ＩｇＧ）の希釈。ＥＤ５０力価を、細胞の完全性の測定を与える色素（例えば、クリスタルバイオレット）の使用により評価しうる。滴定データを、４又は５パラメーターロジスティック曲線へ適合することによって、ＥＤ５０力価の正確な推定が提供される。ＥＤ５０推定は、一般的には、顕微鏡ベースの方法よりも正確であり、血清及び精製抗体の毒素中和能力の定量的推定を提供する。
毒素中和力価は、毒素Ａ又は毒素Ｂの固定濃度の存在において測定され、それは、２４インキュベーション期間にわたり細胞死を誘導するために要求されるものの倍数に設定される。典型的には、毒素Ａの最終濃度を５０ng/mlに、毒素Ｂを０．５〜２ng/mlの間に設定しうる。毒素Ａと毒素Ｂの間の濃度における差は、毒素Ｂの有意により高い特異的細胞毒性活性を反映する。このように、１０００単位/mlの血清溶液の抗体についてのＥＤ５０力価は、１０００倍希釈で、抗体溶液が、毒素Ａ又はＢ細胞毒性活性の５０%を中和することが可能であることを示す。血清中での力価に関して、毒素中和力価≧１０００単位/mlが、強力な中和活性として見なされうる。
高度に精製されたＩｇＧ溶液については、中和活性は、また、毒素Ａ又はＢ細胞毒性活性の５０%を中和するために要求されるＩｇＧの濃度（μg/ml）として表現されうる。この場合において、力価値≦１０μg/ml ＩｇＧは、強力な中和活性として見なされうる。
Ｃ．ディフィシル表面タンパク質（ＳＬＰ）は、細菌細胞壁に関連付けられる、それらのタンパク質を意味する。２９のＣ．ディフィシル表面（細胞壁タンパク質）の例を、Fagan et al.(2011) J. Medical Microbiol. 60: 1225-1228の表１に与え、それらは、本明細書により、その全体において、それへの参照により、組み入れられる。
種々のドメイン境界でのアミノ酸残基を示す、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ及びＢの構造を例示する。 チオレドキシンとの融合タンパク質としての毒素Ｂ組換えフラグメント残基７６７〜１８５２の精製を例示する。左手の図は、ＴｘＢ３の４〜１２%ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。カラムＣ２−Ｃ８は、部分的に精製されたフラグメントを伴うレーンを示す。 チオレドキシンとの融合タンパク質としての毒素Ａ組換えフラグメント残基５４２〜１８５０の精製を例示する。 ＣＤ２７６７（残基２７〜４０１）の発現及び精製。固定化金属イオン親和性クロマトグラフィーによるＣＤ２７６７（残基２７〜４０１）の精製。キー：カラム添加、Ｌ；フロースルー画分、ＦＴ；溶出された精製ＣＤ２７６７ポリペプチド、Ｅ１。ＣＤ２７６７ポリペプチドの強いバンドは、その高い溶解性を例示している。 毒素Ａ（残基５４３〜１８５１）を伴うＣＤ２７６７（残基２７〜４０１）からなる融合タンパク質の発現及び精製。融合タンパク質を、全タンパク質の約２%での可溶性ポリペプチド（レーンＣ１及びＣ２中の上バンド）として発現させた。Ｃ１及びＣ２は、全発現タンパク質の可溶性画分の二つ組を表す。 毒素Ａ及び毒素Ｂの抗体媒介性中和（Ｖｅｒｏ細胞ＥＤ５０アッセイにより測定された通り）。精製された毒素Ａ（５０ng/ml）の細胞毒性効果を防止するための、毒素Ａ（残基５４３〜１８５１）（●）への抗血清の種々の希釈の能力を、細胞生存率を測定するためのクリスタルバイオレット染色を使用して評価した。低下した吸光度は、細胞の完全性の欠如を示す。毒素Ｂ（残基７６７〜１８５２）抗血清（▼）による中和を、毒素Ｂを２ng/mlで使用して評価した。各々の抗血清は、３頭のヒツジの免疫化から得られたプールであった。
実施例
実施例１ − チオレドキシンとの融合タンパク質としての毒素Ｂフラグメント組換えフラグメント残基７６７〜１８５２の発現及び精製（Ｈｉｓ６ＴｒｘＴｘＢｃｅｎｔｒａｌ）
発現
２００μg/mlアンピシリン及び０．４%グルコースを補充したＬ−ブロス（１００ml）に、グリセロール凍結物（プラスミドｐＥＴ５９Ｈｉｓ６ＴｒｘＴｘＢｃｅｎｔｒａｌを持つＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌）からの掻き取りを用いて接種し、３０℃及び１８０rpmで一晩維持した。一晩培養物を、２００μg/mlアンピシリン及び０．２%グルコースを補充したテリフィックブロス（２．５Lバッフルなしフラスコ中の４×１L）について、２．５%接種物として使用した。培養物を、オービタルシェーカーを用い（１８０rpm）、６００nmでの吸光度０．６まで、３７℃に維持した。培養物の温度を１６℃まで低下させ、タンパク質発現を１mM ＩＰＴＧの添加により誘導した。培養物を、以前の通りに、オービタルシェーカーを用い、１６℃で一晩維持した。細胞ペースト（６０g）を遠心分離（Sorvall RC3BP遠心機、H6000Aローター、２０分間にわたる４０００g）により収集した。
Ｈｉｓ６ＴｒｘＴｘＢｃｅｎｔｒａｌの固定化ニッケル親和性精製
細胞（６０ｇ）を緩衝液（ｐＨ８、２０mM Ｔｒｉｓ、５０mM ＮａＣｌ）中に再懸濁し、超音波処理を使用した溶解に供した。ライセートを遠心分離（Sorvall RC5C遠心機、SS-34ローター、２０，０００g、２０分間）により清浄化し、飽和溶液を伴う１Ｍ硫酸アンモニウムに作製した。溶液を氷上で１時間にわたり保存し、結果として得られた沈殿物を、遠心分離（Heraeus Multifuge X3R遠心機、４０００g、４℃）により採取した。沈殿物を２５０mlの低イミダゾール緩衝液（ｐＨ７．５、５０mM Ｈｅｐｅｓ、０．５M ＮａＣｌ、２０mMイミダゾール）中に再懸濁し、３０mlニッケルカラム（φ２６mm）に流速３ml/分で適用した。カラムを、低イミダゾール緩衝液を用いて洗浄し、結合したタンパク質を、０〜１００%高イミダゾール緩衝液（ｐＨ７．５、５０mM Ｈｅｐｅｓ、０．５M ＮａＣｌ、０．５Mイミダゾール）からの勾配を使用して溶出した。画分を、４〜１２% ＮｕＰＡＧＥビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で、クマシー染色を用いて分析した。部分的に精製された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、図２に示す。
実施例２ − 毒素Ａフラグメント組換えフラグメント残基５４２〜１８５０の発現及び精製（ＴｘＡＣＰＤ）
１００μg/mlアンピシリン及び０．２%グルコースを補充したＬ−ブロス（１００ml）に、グリセロール凍結物（プラスミドｐＥＴ５９ＴｘＡＣＰＤｃｅｎｔｒａｌを持つＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌）を用いて接種した。培養物を、６００nmでの吸光度０．６まで維持した（３７℃、１８０rpm）。１００ml培養物を、２００μg/mlアンピシリン及び０．２%グルコースを補充したテリフィックブロス（４×０．７５L）について、２%接種物として使用した。培養物を、オービタルシェーカーを用い（１８０rpm）、６００nmでの吸光度０．６まで、３７℃に維持した。培養物の温度を１６℃まで低下させ、タンパク質発現を、１時間後に、１mM ＩＰＴＧの添加により誘導した。培養物を、以前の通りに、オービタルシェーカーを用い、１６℃で一晩維持した。細胞ペースト（３７g）を遠心分離（Sorvall RC3BP遠心機、Ｈ６０００Ａローター、４０００g、２０分間）により収集し、−８０℃で保存した。
細胞（３７g）を２６０ml緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ、５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ８）を用いて再懸濁し、超音波処理を使用した溶解に供した。ライセートを遠心分離（３０，０００g、２０分間）により清浄化し、清浄化したライセートを氷上で穏やかに撹拌し、１３０mlの飽和硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ８）を加え、混合物を３３%飽和までもたらした。混合物を１５〜２０分間にわたり氷上に放置し、濁った白色沈殿物が形成することを許した。沈殿物を、遠心分離（３０，０００g、１５分間）により収集し、７０ml「低イミダゾール緩衝液」（ｐＨ７．５、５０mM Ｈｅｐｅｓ、０．５M ＮａＣｌ、２０mMイミダゾール、５%グリセロール）中に再懸濁した。溶液を、３０mlニッケルカラム（φ２６mm）に流速２ml/分で適用した。カラムを、フロースルーのＵＶ吸光度がベースラインレベル付近へ戻るまで、２ml/分で洗浄した。結合材料を、１００%「高イミダゾール」緩衝液（ｐＨ７．５、５０mM Ｈｅｐｅｓ、０．５M ＮａＣｌ、０．５Mイミダゾール、１５%グリセロール）までの１６０ml勾配（２ml/分）を用いて、カラムから溶出させた。画分を、４〜１２%ＮｕＰＡＧＥビス−トリスポリアクリルアミドゲル上で分析し、最も高い量の発現コンストラクトを含むものをプールした。
Ｈｉｓ６Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎタグの切断に、第１の固定化ニッケルカラムからのコンストラクトを含むタンパク質溶液（１８ml、１．５mg/ml）を室温で解凍し、制限グレードのトロンビン（３０U）を加え、混合物を、室温〜２０℃で、１６〜１８時間にわたりインキュベートした。
タンパク質混合物を、１ml/分で、緩衝液Ａ（５０mM ＨＥＰＥＳ、０．５M ＮａＣｌ、２０%グリセロール、ｐＨ７．５）を用いて平衡化した３０ml（φ２６mm）ニッケル荷電キレート化セファロースカラムからなるカラム上に添加した。カラムを、３０mlの緩衝液Ａを用いて洗浄した。結合タンパク質を、４%（５０ml）、８%（５０ml）、及び、最後に、１００%緩衝液Ｂ（５０mM ＨＥＰＥＳ、０．５M ＮａＣｌ、０．５Mイミダゾール、２０%グリセロール、ｐＨ７．５）への勾配（１２０ml）を使用して溶出した。精製画分を含む画分をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析し、最も純粋なコンストラクトを含む画分をプールし、保存緩衝液（ｐＨ７．５、５０mM Ｈｅｐｅｓ、０．５M ＮａＣｌ、２０%グリセロール）中で透析した。
精製ＴｘＡＣＰＤコンストラクトのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析及びウエスタンブロット分析
精製タンパク質溶液を、５mM ＤＴＴを補充した４×ＬＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液と１：１で混合した。サンプルを９５℃で５分間にわたり加熱し、デュプリケートで（５及び１０μl）、４〜１２%ＮｕＰＡＧＥビス−トリスポリアクリルアミドゲル上に添加した。ゲルを、ＭＥＳ泳動緩衝液中で、２００Vで４５分間にわたり泳動した。ゲルの１つの部分を、クマシー染色に供し、他を、転写緩衝液中のニトロセルロース膜上に４０Vで１時間にわたりブロットした。メンブレンを、０．１%Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を補充したトリス緩衝生理食塩水中の５%スキムミルクを用いて、４０分間にわたりブロックした。メンブレンを、４０分間にわたり、１%スキムミルクＴＢＳＴ中で１：２５，０００希釈したヒツジ抗毒素Ａ抗体を用いてインキュベートした。ストック抗体濃度は、５０mg/mlであった。メンブレンを、４×１５分間にわたりＴＢＳＴ中で洗浄した。ロバ抗ヒツジ抗体アルカリホスファターゼコンジュゲートを、１%スキムミルクＴＢＳＴ中の１：１０，０００の希釈で、メンブレンに適用した。溶液を、以前の通り、４０分間にわたり、穏やかな撹拌を伴いメンブレン上に放置した。メンブレンを、以前の通りに、ＴＢＳＴを用いて洗浄し、ブロットを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ一工程試薬を使用して展開した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを図３に示す。
実施例３ − Ｃ．ディフィシルタンパク質ＣＤ２７６７の残基２７〜４０１の発現及び精製
Ｃ．ディフィシルタンパク質ＣＤ２７６７の残基２７〜４０１をコードする合成遺伝子を、宿主（例えば大腸菌など）中での発現のために最適化されたそのコドンバイアスを用いて、商業的に合成した。遺伝子をｐＥＴ２８ａ発現ベクター中に挿入し、標準的な分子生物学手順を使用して、ＢＬ２１大腸菌発現株中に形質転換した。大腸菌発現株を成長させ、タンパク質発現を、カナマイシンをアンピシリンの代わりに使用したことを除き、本質的に実施例１において記載する通り、ＩＰＴＧを用いて誘導した。細胞ペレットは、直接的に使用した又は−２０℃で凍結した。
タンパク質抽出のために、細胞を解凍し、０．５M ＮａＣｌ及び２０mMのイミダゾールを含む５０mMトリスＨＣｌ ｐＨ８．０緩衝液中に再懸濁し、超音波処理し（６×３０秒、各々の後に３０秒間冷却を伴う）、次に４７０００×gで２０分間にわたり遠心分離した。Ｈｉｓ６タグ付き残基２７〜４０１ ＣＤ２７６７ポリペプチドを、次に、上清液から、固定化金属イオン（Ｎｉ）親和性クロマトグラフィーを使用することにより精製した。カラムへのサンプルの適用及び洗浄は、上のＴｒｉｓ／ＮａＣｌ／イミダゾール緩衝液中であった。精製コンストラクトを、次に、同じ緩衝液中の０．５Mイミダゾールまでの勾配を用いて溶出した。
ＣＤ２７６７（残基２７〜４０１）ポリペプチドが、＞９０%純度のタンパク質として、単一の精製工程により得られ、約４７kDaの強いバンドとしてＳＤＳ ＰＡＧＥ上に出現した（図４）。タンパク質フラグメントは、２８０nmでの吸光度により測定された通りの＞１２０mg/ml又はブラッドフォードタンパク質アッセイ（標準としてウシ血清アルブミン）により測定された通りの＞１６７mg/mlに濃縮することができた。これらのアッセイの両方が、ＣＤ２７６７（残基２７〜４０１）ポリペプチドの極度に高い溶解性及び組換え融合タンパク質内の成分を増強する溶解性としてのその潜在的な有用性を例示する。
実施例４ − Ｃ．ディフィシルタンパク質ＣＤ２７６７の残基２７〜４０１を伴う融合タンパク質としての毒素Ａ又はＢのいずれかの組換えフラグメントの発現及び精製
Ｎ末端がＣ．ディフィシルタンパク質ＣＤ２７６７の残基２７〜４０１からなり、Ｃ末端が毒素Ｂフラグメントの組換えフラグメント残基７６７〜１８５２からなる融合タンパク質をコードする合成遺伝子が、宿主（例えば大腸菌など）における発現のために最適化された、そのコドンバイアスを用いて商業的に合成されうる。Ｎ末端がＣ．ディフィシルタンパク質ＣＤ２７６７の残基２７〜４０１からなり、Ｃ末端が毒素Ａフラグメントの組換えフラグメント残基７７０〜１８５０からなる融合タンパク質をコードする合成遺伝子が、同様に得られうる。これら及び他の融合タンパク質は、精製を促進するために組み込まれた種々の精製タグ（６ヒスチジン）を伴う発現ベクターを用いて組み込まれうる。そのような発現コンストラクトの例を、ＣＤ２７６７（残基２７〜４０１）及び毒素Ａ（残基５４２〜１８５０）からなる配列番号１９に示す。
上のコンストラクトの発現及び精製は、実施例１及び２に概説したものと同様の方法により試みてもよく、毒素Ａ（残基５４３〜１８５１）へのＮ末端融合としてのＣＤ２７６７（残基２７〜４０１）からなるコンストラクトの発現を、図５に示す。ここで、毒素ＡフラグメントへのＣＤ２７６７ドメインの付加によって、それは、全可溶性タンパク質の２%として可溶性になり、発現可能になる。大腸菌中での発現後、コンストラクトの精製は、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー及び他のクロマトグラフィー方法（例えばイオン交換クロマトグラフィーなど）によりもたらされる。
実施例５ − 動物の免疫化のための本発明の抗原の製剤化
濃度０．５〜２mg/ml（名目上は１mg/ml）の精製されたＣ．ディフィシル抗原を、適した緩衝液（例えば、１５０mM ＮａＣｌを含む１０mM Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．４）に対して透析し、次にホルムアルデヒドを最終濃度０．２%まで加え、７日間までにわたり３５℃でインキュベートした。インキュベーション後、ホルムアルデヒドは、場合により、適した緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に対する透析により除去されうる。
ヒツジについて、１０〜５００μgの間の上のＣ．ディフィシル抗原を含む２mlの緩衝溶液を、２．６mlのフロイントアジュバントと混合し、エマルジョンを形成する。アジュバントと混合することが、数分間にわたり行われ、安定なエマルジョンを確実にする。アジュバントの完全形態を、一次免疫化のために、不完全フロイントアジュバントを、全てのその後の追加免疫のために使用する。
実施例６ − 本発明の抗原への抗体の生成
多数の従来の因子が、最適な体液性抗体応答を達成するために、抗血清の調製の間に考慮に入れられる。これらは、動物の品種；アジュバントの選択；免疫化部位の数及び位置；免疫原の量；ならびに用量の数及びその間の間隔を含む。これらのパラメータの従来の最適化を用いて、６g/リットルの血清を超える特異的抗体レベルを得るためのルーチンである。
ヒツジについて、フロイントアジュバントを用いた抗原のエマルジョンを、実施例５に記載する通りに調製した。アジュバントの完全形態を、一次免疫化のために、不完全フロイントアジュバントを、全てのその後の追加免疫のために使用する。約４．２mlの抗原／アジュバント混合物を使用し、各々のヒツジを、筋肉内注射により免疫化し、頸部及び全ての上肢を含む６つの部位にわたり拡大した。これを、２８日毎に繰り返した。血液サンプルを、各々の免疫後１４日目に採取した。
異なる抗原への毒素中和免疫応答の比較のために、３頭のヒツジを、１抗原あたりに使用した。それらは、同一のプロトコール及び１免疫化あたり同じタンパク質用量を使用して、上の通りに免疫化した。
実施例７ − インビトロ細胞アッセイを使用した、毒素への抗血清の中和効力の評価
Ｃ．ディフィシル毒素に対する抗血清の毒素中和活性を、Ｖｅｒｏ細胞を使用した細胞毒性アッセイにより測定した。固定量の精製Ｃ．ディフィシル毒素Ａ又は毒素Ｂのいずれかを、抗体の種々の希釈物と混合し、３０分間にわたり３７℃でインキュベートし、次に、９６ウェル組織培養プレート上で成長しているＶｅｒｏ細胞に適用した。毒素Ａ及びＢの両方が、２４〜７２時間の期間にわたり、Ｖｅｒｏ細胞の特徴的な円形化をもたらす細胞毒性活性を持つ。中和抗体の存在において、この活性は阻害され、抗体調製物の中和力は、毒素Ａ又はＢのいずれかの指定量の効果を中和するために要求される希釈により評価されうる。
種々の組換えＣ．ディフィシル毒素Ｂ抗原へのヒツジ抗体の中和活性を実証するデータを、表１及び２に示す。これらの実験において、ヒツジ抗体の種々の希釈物を、最終濃度０．５ng/mlで毒素Ｂと混合し、３０分間にわたり３７℃でインキュベートし、次に、上の通りにＶｅｒｏ細胞に適用し、３７℃でインキュベートし、２４〜７２時間の期間にわたりモニターした。毒素Ｂの細胞毒性効果に対して細胞を完全に保護する抗体希釈を算出した。
表１は、本発明の抗原の中和力価を示す。表２は、リピート領域のみからなる抗原を使用して得られた力価を示す。
まとめると、表１及び表２のデータは、リピートドメインのみを含むフラグメントと比較し、毒素中和免疫応答を誘発する、本発明の抗原の優れた能力を示す。
抗体毒素中和力価を、また、クリスタルバイオレットを用いた細胞染色に基づく比色アッセイにより推定した（Rothman (1986) J. Clin. Pathol. 39: 672-676）。Ｖｅｒｏ細胞を、９６ウェル細胞培養プレート中で、コンフルエントまで成長させた。これらのアッセイを、上に記載する通り、５０ng/ml及び２ng/mlの抗体混合物中の最終濃度の毒素Ａ及び毒素Ｂをそれぞれ使用して実施した。一晩のインキュベーション後、細胞を、２００μlのダルベッコのＰＢＳ（Sigma）を用いて穏やかに洗浄し、それは、細胞を、７０μlの氷冷エタノールを用いて２分間にわたり固定する前に、注意深く除去した。エタノールを次に除去し、７０μlのクリスタルバイオレット（エタノール中の１% ｗ／ｖ；Ｐｒｏ−Ｌａｂ）を固定細胞に加え、３０分間にわたり２２℃でインキュベートした。プレートを次に、脱イオン水中の浸漬により注意深く洗浄し、過剰の染料を除去し、３７℃で乾燥させ、次に、２００μlの５０%（ｖ／ｖ）エタノールを加えた。プレートを次に、４９２nmで読み取る前に、振盪インキュベーター（３００rpm）中で２時間にわたり３７℃でインキュベートした。ＥＤ５０値は、４又は５ｐｌ非線形回帰モデルを使用し、結果として得られた毒素中和曲線から由来した（図４）。このように、ＥＤ５０力価は、アッセイにおいて５０%毒素中和エンドポイントを達成するために要求される血清又は抗体の希釈である。公知のＩｇＧ濃度の抗体溶液を使用する場合、力価を、また、５０%毒素中和エンドポイントを達成するために要求されるＩｇＧの濃度として表現してもよい。
表３は、毒素Ａ及び毒素Ｂの両方の中央ドメインを使用して生成された血清についての、クリスタルバイオレット方法を使用して得られた毒素中和ＥＤ５０力価を示す。両方のフラグメントについて、１０００単位/mlを超える毒素中和ＥＤ５０力価を、それらのそれぞれの血清について得た（また、図６を参照のこと）。
ヒツジ抗毒素Ｂ（残基７６７〜１８５２）ＩｇＧ溶液について得られた毒素中和ＥＤ５０力価の値を、表４に示す。毒素Ｂの種々の毒素型に対する中和力価を、その交差中和効力を評価するために、このフラグメント抗血清について得た。毒素Ｂの各々の精製毒素型を、アッセイにおいて、毒性について標準化し、２４時間のインキュベーション期間中に細胞死を起こす１６×最小毒素濃度の固定濃度で保持した。中和効力は、上の毒素Ｂ濃度の５０%中和のために要求されるμg/ml ＩｇＧで表現される。中和力価における４倍未満の差が観察され、それは、良好な交差中和効力を示している。
実施例８ − ＣＤＩを処置するための本発明の組換え抗原を使用して生成された抗血清のインビボでの効力の評価
組換え抗原を使用して、ＣＤＩをインビボで処置するための、生成された抗血清の効力を実証するために、シリアンハムスターを、Ｃ．ディフィシルの毒素の１つ又は複数に対して中和活性を有する抗体を用いて受動的に免疫化する。処理製剤の効力を評価するために、ハムスターに、Ｃ．ディフィシルを用いた負荷後６時間から負荷後２４０時間までの種々の時点で、静脈内に又は腹腔内経路により抗体を与える。
受動的免疫化の前に、ハムスターに、広域抗生物質（例えば、クリンダマイシン）を投与し、１２〜７２時間後に、Ｃ．ディフィシル胞子を用いて口から負荷する。動物を、次に、Ｃ．ディフィシル関連疾患の症状について、１５日間までにわたりモニターする。コントロールの非免疫化動物は、疾患の徴候（例えば、下痢、腫れた腹部、無気力、乱れた毛並み）を発生し、ヒツジ抗体を用いて処置されたものは、正常に見える又は統計的に有意な低下した疾患の発生率を示す。
実施例９ − 本発明のペプチド／ペプチドフラグメントによるワクチン接種
ワクチンは、本発明のペプチド／ペプチドフラグメントにより表され、現在の適正製造基準により調製される。そのような慣行を使用して、本発明のペプチド／ペプチドフラグメントは、商業的に利用可能である水酸化アルミニウムのアジュバント（例えば、Alhydrogel）に結合されうる。ワクチンは、通常、毒素Ａ及び毒素Ｂから由来する、本発明の抗原の組み合せを含みうるが、しかし、また、毒素Ａ又はＢ抗原のいずれかを含みうる。ワクチンは、また、細菌又はウイルス起源の他の抗原との組み合わせてにおいて、毒素Ａ及びＢ抗原を含みうる。
本発明の精製Ｃ．ディフィシル毒素Ａ及び／又は毒素Ｂ抗原は、最終濃度０．２%でのホルムアルデヒドを用いて処理し、２４時間までにわたり３５℃でインキュベートしてもよい（実施例５に記載される通り）。
本発明の抗原に加えて、典型的なワクチン組成物は、以下を含む：
Ａ）緩衝液（例えば、５〜２０mMの間の及びｐＨ７．０〜７．５の間のＨｅｐｅｓ緩衝液）；
Ｂ）ワクチンを生理学的に等張にする塩成分（例えば、１００〜１５０mMの間のＮａＣｌ）；
Ｃ）アジュバント（例えば、ワクチン用量あたり１００〜７００μgの間の最終アルミニウム濃度での水酸化アルミニウム）；及び
Ｄ）保存剤（例えば、０．０１%でのチメロサール又は０．０１%でのホルムアルデヒド）。
そのようなワクチン組成物は、ヒトに、多様な異なる免疫化計画（例えば以下など）により投与される：
１． 皮下投与された０．５ml中の単一用量（例えば、本発明の２０μg吸着フラグメント）。
２． ０及び４週目に投与された０．５ml中の２用量（例えば、本発明の１０μg吸着フラグメント）。
３． ０、２、及び１２週目に投与された０．５ml中の３用量（例えば、本発明の１０μg吸着フラグメント）。
これらのワクチン接種計画は、Ｃ．ディフィシル毒素の相同血清型への暴露に対して、保護のレベルを付与する。
実施例１０ − 本発明の抗原を使用して産生された抗体の臨床的使用
３つの例は、それらのＣＤＩにおける７０の異なる程度を伴う患者において、本発明の抗原を使用して産生された、全身性ヒツジ抗体産物の治療的価値を例示するために役立つ。
軽度ＣＤＩ
６７歳の男性が、重度の心筋梗塞に続き、冠動脈治療室に入院する。無事に回復する一方で、彼は、任意の他の徴候又は症状を伴わない軽度の下痢を発生する。病院においてＣＤＩの最近のエピソードがあったため、糞便サンプルを、テストのために直ちに送り、毒素Ａ及び毒素Ｂの両方を含むことが見出される。専用トイレのある個室に隔離後、彼は、２５０mgのヒツジＦ（ａｂ’）２を静脈内に受け、第２の注射が２日後に続いた。彼の下痢は、直ぐに止まり、彼は、メトラニダゾール（ｍｅｔｒａｎｉｄａｚｏｌｅ）又はバンコマイシンのいずれかの必要性を伴わず、完全回復する。
再発のリスクを伴う重度ＣＤＩ
年齢８１歳の女性が、彼女の家庭で転倒し、骨折した左股関節を持続した。彼女は直ぐに病院に入院し、股関節は成功裏にピン固定される。彼女の虚弱な状態は、早期退院を妨げ、数日後、彼女は湿性咳を発生し、そのために、彼女は、広域抗生物質を与えられた。さらに８日後、彼女は、腹痛及び圧痛を伴う多量の下痢を発生し、ＣＤＩが、適切な糞便テストにより診断される。その時、また、感染の全身所見（著しく上昇した白血球数を含む）、及び脱水を伴う有意な体液喪失の証拠がある。患者は、直ぐに、経口バンコマイシンを開始し、同時に、２５０mgのヒツジＦ（ａｂ’）２ベース産物の１日５回注射の第１回目を静脈内に受ける。ＣＤＩの徴候及び症状ならびに検査室所見の迅速な消散がある。しかし、バンコマイシンの中止に続く、彼女のＣＤＩの再発のリスクを避けるために、彼女は、さらに２週間にわたり、抗体療法の経口形態で処置され続ける。彼女は、再発を経験しない。
合併症を伴う重度ＣＤＩ
８７歳の女性が、長期介護施設に居住しながら、気管支肺炎を発生する。地元の一般開業医は、彼女に、即時の利益を伴う抗生物質治療のコースを開始する。しかし、抗生物質を止めた後８日目、彼女は、重度の下痢を経験する。彼女の状態が悪化し始め、毒素Ａが、彼女の糞便中で、ＥＬＩＳＡテストにより検出される病院への入院が必要となる。この時までに、彼女は極度に病気であり、循環不全の証拠を伴い、彼女の下痢は止まっている。後者は、麻痺性イレウス及び中毒性巨大結腸の組み合わせに起因することが見出されており、緊急全結腸切除が必須であると考えられる。そのような手術は、６０%を超える死亡率と関連付けられるため、彼女は、抗体産物の２つのアンプル（５００mg）の内容物と一緒に静脈内補充療法を受ける。彼女が４時間後に手術室に運ばれる時までに、彼女の全身状態は有意に改善しており、彼女は手術後に生存する。
各々の抗原について、１００μgの５用量を、毎月、３頭のヒツジの各々に与え、血清を１８週目に分析した。ＥＬＩＳＡ力価は、１４週サンプルから由来し、バックグラウンドを上回る０．５ Ａ４５０のシグナルを与えた血清希釈（３頭の動物からのプール）を表し、二回測定値の平均値である。クリスタルバイオレットＥＤ５０アッセイのために、毒素Ｂを、固定濃度２ng/mlで、毒素Ａを５０ng/mlで使用した。
毒素Ｂ（残基７６７〜１８５２）（毒素型０配列）への抗体を、他の毒素Ｂ毒素型を中和するためのそれらの能力について評価した。精製された毒素Ｂ毒素型（０、３、５、及び１０）を、各々、細胞アッセイにおいて滴定し、２４時間のインキュベーション期間において細胞死を起こす１６×最小毒素濃度の固定濃度で使用した。中和効力は、上の毒素Ｂ濃度の５０%中和のために要求されるμg/ml ＩｇＧで表現する。
配列番号

Claims (21)

  1. Ｃ．ディフィシル毒素Ａ配列又はＣ．ディフィシル毒素Ｂ配列の残基１５００〜１７００からなるアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる又はそれを含むポリペプチド、
    ただし、該ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸残基１８５１〜２７１０及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１８５３〜２３６６の間に位置付けられる１つ又は複数のリピート単位（ＲＵ）を含まない。
  2. ポリペプチドが、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ配列又はＣ．ディフィシル毒素Ｂ配列の残基１４５０〜１７５０からなるアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる又はそれを含む、請求項１記載のポリペプチド。
  3. ポリペプチドが、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ配列又はＣ．ディフィシル毒素Ｂ配列の残基１４００〜１８００からなるアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる又はそれを含む、請求項１又は請求項２記載のポリペプチド。
  4. ポリペプチドが、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸残基１８５１〜２７１０及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂのアミノ酸残基１８５３〜２３６６により提供されるアミノ酸配列を含まない、請求項１〜３のいずれか一項記載のポリペプチド。
  5. ポリペプチドが、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ配列の残基１３３０〜１８５０又は７７０〜１８５０又は５４２〜１８５０からなるアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる又はそれを含む、請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチド。
  6. ポリペプチドが、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ配列の残基１１４５〜１８５２又は７６７〜１８５２又は５４３〜１８５２からなるアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる又はそれを含む、請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチド。
  7. ポリペプチドが、さらに、細菌表面層タンパク質、ＮｕｓＡ、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、ユビキチン様ペプチドの１つ又は複数より選択される第２アミノ酸配列、及び前記第２アミノ酸配列のいずれかのフラグメントを含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のポリペプチド。
  8. 第２アミノ酸配列が、Ｃ．ディフィシル表面層タンパク質を含む、請求項７記載のポリペプチド。
  9. Ｃ．ディフィシル表面層タンパク質が、ＣＤ ２７６７ペプチド、例えば、ＣＤ ６７６７ペプチドのアミノ酸残基２７〜４０１と少なくとも８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる又はそれを含むペプチドからなる又はそれを含む、請求項８記載のポリペプチド。
  10. Ｃ．ディフィシル毒素Ａに及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂに結合する抗体を生成する方法における抗原としての使用のための、請求項１〜９のいずれか一項記載のポリペプチドであって；
    好ましくは、該抗体が、全ＩｇＧ、Ｆａｂ抗体、又はＦ（ａｂ’）２抗体を含む、ポリペプチド。
  11. Ｃ．ディフィシル毒素Ａに及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂに結合する抗体を単離するためのインビトロ方法であって、該方法が、
    ａ）表面上に（例えば、カラム内のマトリクス上に）、請求項１〜７のいずれか一項記載の１つ又は複数のＣ．ディフィシルポリペプチドを固定化すること；
    ｂ）固定化したポリペプチドを、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ及び／又は毒素Ｂに結合する抗体を含む溶液と接触させること；
    ｃ）該抗体を、該ポリペプチドに結合することを可能にし、それにより、抗体及びポリペプチドの結合複合体を形成させること；
    ｄ）いかなる非結合抗体又はタンパク質も洗い流すこと；ならびに
    ｅ）結合抗体を表面から溶出し、それにより、親和性精製された抗体を提供することを含む方法。
  12. Ｃ．ディフィシル毒素Ａに及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂに結合する抗体であって、該抗体が、請求項８又は請求項９記載の方法により入手可能であり、該抗体が、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ又は毒素Ｂのエフェクタードメインに実質的に結合しない、ならびに／あるいはＣ．ディフィシル毒素Ａ又は毒素ＢのＲＵに実質的に結合しない；好ましくは、該抗体が、全ＩｇＧ、Ｆａｂ抗体、又はＦ（ａｂ’）２抗体を含む、抗体。
  13. 抗体が、Ｃ．ディフィシル毒素Ａの残基１３５０〜１８５０又は１１３０〜１８５０又は７７０〜１８５０又は５４２〜１１８５により及び／又はＣ．ディフィシル毒素Ｂの残基１３５０〜１８５２又は１１４５〜１８５２又は７６７〜１８５２又は５４３〜１８５２により提示されるエピトープに結合する、請求項１２記載の抗体。
  14. 哺乳動物（例えば、ヒト）におけるＣＤＩの防止、処置、又は抑制における使用のための、請求項１〜９のいずれか一項記載のポリペプチド及び／又は請求項１２もしくは請求項１３記載の抗体。
  15. 哺乳動物（例えば、ヒト）においてＣＤＩを防止、処置、又は抑制するための方法であって、該方法が、該ヒトに、治療的に効果的な量の請求項１〜９のいずれか一項記載のポリペプチド及び／又は請求項１２もしくは請求項１３記載の抗体を投与することを含む方法。
  16. 請求項１５記載の方法であって、ポリペプチドが、Ｃ．ディフィシル非毒素抗原、不活化もしくは弱毒化された全細胞Ｃ．ディフィシル細菌、及び／又はＣ．ディフィシル細胞抽出物より選択される１つ又は複数の追加抗原；ならびに
    ａ．場合により、１）院内感染を起こす細菌からの抗原、及び２）院内感染を起こす不活化もしくは弱毒化された全細胞細菌より選択される１つ又は複数の抗原；ならびに
    ｂ．場合により、１つ又は複数の抗生物質、例えば、院内感染を起こす細菌に対して効果的な抗生物質など
    との組み合わせ治療の部分として投与される方法。
  17. 請求項１５記載の方法であって、抗体が、Ｃ．ディフィシル非毒素抗原に結合する抗体、及び全細胞Ｃ．ディフィシル細菌に結合する抗体より選択される１つ又は複数の追加抗体；ならびに
    ａ．場合により、１）院内感染を起こす細菌からの抗原に結合する抗体、及び２）院内感染を起こす全細胞細菌に結合する抗体より選択される１つ又は複数の抗体；ならびに
    ｂ．場合により、１つ又は複数の抗生物質、例えば、院内感染を起こす細菌に対して効果的な抗生物質など
    との組み合わせ治療の部分として投与される方法。
  18. 請求項１４記載の使用のためのポリペプチドであって、該使用が、Ｃ．ディフィシル非毒素抗原、不活化もしくは弱毒化された全細胞Ｃ．ディフィシル細菌、及び／又はＣ．ディフィシル細胞抽出物より選択される１つ又は複数の追加抗原；ならびに
    ａ．場合により、１）院内感染を起こす細菌からの抗原、及び２）院内感染を起こす不活化もしくは弱毒化された全細胞細菌より選択される１つ又は複数の抗原；ならびに
    ｂ．場合により、１つ又は複数の抗生物質、例えば、院内感染を起こす細菌に対して効果的な抗生物質など
    との組み合わせ治療の部分としての該ポリペプチドの投与を含む、ポリペプチド。
  19. 請求項１４記載の使用のための抗体であって、該使用が、Ｃ．ディフィシル非毒素抗原に結合する抗体、及び全細胞Ｃ．ディフィシル細菌に結合する抗体より選択される１つ又は複数の追加抗体；ならびに
    ａ．場合により、１）院内感染を起こす細菌からの抗原に結合する抗体、及び２）院内感染を起こす全細胞細菌に結合する抗体より選択される１つ又は複数の抗体；ならびに
    ｂ．場合により、１つ又は複数の抗生物質、例えば、院内感染を起こす細菌に対して効果的な抗生物質など
    との組み合わせ治療の部分としての該抗体の投与を含む抗体。
  20. 患者サンプルにおけるＣ．ディフィシル感染の存在又は非存在を確認するためのインビトロ免疫アッセイ方法における請求項１２又は請求項１３記載の抗体の使用であって、Ｃ．ディフィシル感染の存在は、該サンプル中に存在するＣ．ディフィシル毒素Ａ及び／又はＢへの該抗体の結合を検出することにより確認され、該サンプル中に存在するＣ．ディフィシル毒素Ａ及び／又はＢへの該抗体の結合を検出できないことによって、Ｃ．ディフィシル感染の非存在が確認される使用。
  21. 患者サンプルにおけるＣ．ディフィシル感染の存在又は非存在を確認するためのインビトロ免疫アッセイ方法における請求項１〜９のいずれか一項記載のポリペプチドの使用であって、Ｃ．ディフィシル感染の存在は、該サンプル中に存在する抗体への前記融合タンパク質の結合を検出することにより確認され、該サンプル中に存在する抗体への前記融合タンパク質の結合を検出できないことによって、Ｃ．ディフィシル感染の非存在が確認される使用。
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