CN104755099A - 艰难梭菌抗原 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于多肽的重组艰难梭菌(Clostridium difficile)抗原,所述多肽由以下组成或包括以下:具有与由艰难梭菌毒素A序列或艰难梭菌毒素B序列的残基1500-700组成的氨基酸序列的至少80%序列同一性的氨基酸序列;但条件是该多肽不包括位于艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1851-2710之间和/或艰难梭菌毒素B蛋白的残基1853-2366之间的一个或更多个重复单元(RU),该重复单元由以下组成或包括以下:第一氨基酸序列和第二氨基酸。还提供了所述抗原用于艰难梭菌感染(CDI)的预防/治疗/抑制的用途、连同产生所述抗原的方法、用于产生结合所述抗原的抗体的方法、以及所述抗体用于CDI的预防/治疗/抑制的用途。
Description
本发明涉及用于艰难梭菌(Clostridium difficile)感染(CDI)的预防/治疗/抑制的抗原。还提供了用于产生所述抗原的方法、用于产生结合所述抗原的抗体的方法、以及所述抗体用于CDI的预防/治疗/抑制的用途。
目前艰难梭菌感染(CDI)是全世界医院的主要难题。该细菌导致本身表现为从轻微自限性腹泻至可能危及生命的、严重的结肠炎的几种形式的医院的、与抗生素相关的疾病。老年患者最容易处于这些可能危及生命的疾病的风险中且CDI事件在过去10年已显著增加。2010年,英国存在超过21,000例的CDI,其中有超过2,700例相关的死亡。每年CDI花费英国National Health Service超过£500M。
艰难梭菌的各种菌株可通过许多方法来分类。其中最常用的一种是聚合酶链式反应(PCR)核糖体分型(ribotyping),其中PCR用于扩增艰难梭菌的16S-23S rRNA基因的基因间隔区。反应产物由此提供识别分离株的细菌核糖体型(ribotype)的特征性条带图谱。毒素分型(Toxinotyping)是另一种分型方法,其中源自编码艰难梭菌毒素的DNA的限制性图谱用于识别菌株毒素类型(toxinotype)。在不同菌株的毒素基因之间观察到的限制性图谱的差异还表明了艰难梭菌毒素家族内的序列变异。例如,与毒素类型III毒素B中相同区域相比,毒素类型0毒素B的C-末端60kDa区域存在约13%序列差异。
艰难梭菌的菌株产生多种毒性因子,其中以下几种蛋白毒素值得注意:毒素A、毒素B和,在一些菌株中与产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)丝毫毒素(iota toxin)类似的二元毒素。毒素A是在感染的病理学中起作用并可影响肠道定殖过程的大的蛋白细胞毒素/肠毒素。CDI的爆发已报道伴随毒素A阴性/毒素B阳性菌株,其表明毒素B还能够在疾病病理学中起关键作用。
编码毒素A和毒素B(分别Mw 308k和Mw 269k)的基因序列是已知的-参见,例如Moncrief等人(1997)Infect.Immun 63:1105-1108。两种毒素具有高度序列同源性,并被认为起因于基因复制。毒素还共享共同的结构(参见图1),即N-末端葡糖基转移酶结构域、中央疏水区、四个保守的半胱氨酸、和长系列的C-末端重复单元(RU)。
毒素A和B两者经由多步骤机制发挥其作用机制,该多步骤机制包括结合至细胞表面上的受体,内化随后易位并将效应器结构域释放进细胞胞质中,以及最终细胞内作用。所述的作用机制涉及Rho家族的小GTP酶的失活。在这点上,毒素催化葡萄糖部分(来自UDP-葡萄糖)转移至Rho蛋白的氨基酸残基上。毒素A和B还包含半胱氨酸蛋白酶的形式的第二酶的活性,其显示在易位后在效应器功能域释放进入细胞溶质中起作用。艰难梭菌二元毒素通过涉及从NAD将ADP-核糖部分转移至其靶蛋白上的机制修饰细胞肌动蛋白。
目前用于治疗艰难梭菌感染的治疗方法依赖于抗生素,特别是甲硝唑和万古霉素的使用。然而,在所有情况下这些抗生素是无效的并且20%-30%的患者经历该疾病的复发。主要关注的是在英国出现的更强毒株,其于2002年在加拿大首次被确认。这些菌株,包括属于PCR核糖体型027和毒素类型III的那些,导致CDI,伴随直接可归因的多于先前观察到的3倍的死亡率。
由于目前抗生素的效力似乎在下降,因此,特别迫切需要新的疗法。
一种方法是结合毒素A和/或毒素B并中和毒素A和/或毒素B的活性的抗体的使用。这基于不释放这些毒素的艰难梭菌的菌株,所谓非产毒的菌株,不导致CDI的知识。例如,可将动物免疫,收集其血清并纯化抗体用于施用至患者-这被定义为被动免疫。在另一个方法中,有CDI的患者或处于发展此类感染的风险中的受试者可用导致增加循环和针对毒素A和/或毒素B的粘膜抗体的抗原来免疫-这被定义为主动免疫。
对于主动和被动免疫两者的关键需要是用其分别免疫患者或动物的合适的抗原的可用性。这些可包括可从其中已培养艰难梭菌的合适的产毒素菌株的培养基中纯化的天然毒素。该方法存在几个缺点。毒素A和毒素B两者仅以少量存在于培养基中,并且很难纯化而不产生显著损失。因此,其既昂贵又难以获得满足世界范围需要的必需量。此外,天然毒素不稳定并有毒。
以上提及的问题已导致存在很少可用的艰难梭菌疫苗候选物。至今,在后期开发的唯一CDI疫苗基于天然(即天然存在)的毒素A和B的混合物,其已通过化学修饰被广泛地灭活(Salnikova等人2008,J Pharm Sci97:3735-3752)。
天然毒素(及其类毒素)的一种备选用途涉及设计、开发并使用源自毒素A和B的重组片段。旨在用于治疗/预防艰难梭菌感染的现有抗原的实例包括基于毒素A或毒素B的C-末端重复单元(RU)的肽-参见,例如,WO 00/61762。然而,伴随此类抗原的问题在于,其或是弱免疫原性(即抗原产生差的抗体滴度),或,当产生较高的抗体滴度时,该抗体表现出针对艰难梭菌细胞毒性活性的差的中和效力(即产生中和不足的抗体)。
因此,本领域存在对能够特定致力于艰难梭菌感染(CDI)的新疫苗/治疗方法/疗法的需要。本发明通过解决了一个或更多个以上提及的问题而致力于该需要。
总之,本发明提供了能够诱导针对艰难梭菌毒素A和/或B的有效的毒素中和反应的抗原。本发明还提供了用于制备重组抗原的方法、及其作为免疫原能够大规模制备治疗性抗体的用途。所述抗体能够诱导针对艰难梭菌毒素A和/或B的有效的毒素中和反应,并因此具有预防和/或治疗应用。
如以上提及的(参见,例如,WO 00/61762),在先研究描述了基于毒素A和/或毒素B的C-末端重复单元(RU)的疫苗制剂。所述RU片段具有差的毒素中和效应,和/或难以大批量制造。
相比之下,本发明提供了不包含或包括毒素A和/或毒素B的一个或更多个(例如,全部)的重复单元(RU)的基于毒素A和/或毒素B的艰难梭菌多肽抗原。本发明的多肽抗原由以下组成或包含以下:来自毒素的中心区域的一个或更多个结构域。本发明的所述抗原表现出良好的毒素中和性免疫应答和/或容易大批量制造。
本发明人已出人意料地确定了由以下组成或包括以下的艰难梭菌抗原多肽提供与包含一个或更多个RU的相应艰难梭菌毒素片段相比(参照表1和2)被大大提高的保护性(毒素中和性)免疫应答:来自效应器结构域和RU的区域之间的中心区域的一个或更多个功能域(参见图1)。在一个实施方案中,艰难梭菌抗原多肽包含毒素B片段。
表1和2中的数据的比较证实了本发明的多肽抗原引起比基于包括艰难梭菌毒素的一个或更多个C-末端重复单元的相应多肽诱导的毒素中和性免疫应答有效得多的毒素中和性免疫应答(由指定的多肽TxB2示例)。更详细地,18周免疫期后,由本发明的多肽提供的毒素中和性免疫应答比由相应的含RU的多肽提供的毒素中和性免疫应答高60倍更多。因此,本发明的多肽诱导有效的毒素中和性免疫应答。
出于许多理由,这些发现是出人意料的。最重要地,其中动物单独地接种了艰难梭菌毒素的中心结构域片段(由残基510-1530组成的片段,和由残基1530-1750组成的片段)的先前研究报道了这些片段未能引起毒素中和性抗体的产生(Kink & Williams(1993)Infect.Immun.66:2018-2025)。因此,这项研究表明,残基510-1530内的结构域没有贡献有意义的抗体结合结构决定簇。此外,进一步的研究已显示了针对完整艰难梭菌产生的抗体,尽管识别由全部RU区域单独组成的片段,未能识别由基于艰难梭菌相同毒素的残基901-1750的中心毒素区域组成的片段(Genth等人,(2000)Infect.Immun.,68:1094-1101)。因此,这项研究表明,残基901-1750内的结构域没有贡献有意义的抗体结合结构决定簇。此外,虽然针对艰难梭菌毒素的效应器结构域(残基1-543)的抗体已显示引起有效的免疫应答(通过简单的酶免疫分析测量),但所述抗体没有毒素中和活性,显示抗体与毒素的结合并不相应于毒素中和(Roberts等人(2012)Infect.Immun.,80:875-882)。共同地,因此,基于位于效应器结构域和重复区域之间的艰难梭菌毒素的中心结构域的重组免疫原能够诱导此类有效的毒素中和性免疫应答是非常出人意料的。
本发明的一个方面提供了包含以下、由以下组成、或包括以下的多肽:具有与由艰难梭菌毒素A序列的残基1500-1700(例如1450-1750、或1400-1800)组成的氨基酸序列的至少80%序列同一性的氨基酸序列,条件是该多肽不是包含艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366之间的一个或更多个(例如全部)RU单元的多肽。在一个实施方案中,所述多肽缺少艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366的序列。
本发明的另一个方面提供了包含以下、由以下组成、或包括以下的多肽:具有与由艰难梭菌毒素A序列的残基542-1850组成的氨基酸序列的至少80%序列同一性的氨基酸序列,条件是该多肽不包含艰难梭菌毒素A的残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366之间的任何RU单元。在一个实施方案中,所述多肽缺少艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366的序列。
提及艰难梭菌毒素A序列意指天然存在的艰难梭菌毒素A的氨基酸序列(还称为艰难梭菌毒素A参考序列)。本领域技术人员容易理解此类序列的实例,并且仅用于说明的目的,一些更常见的天然存在的毒素A序列在本说明书中而且贯穿文献被确定(参见,例如SEQ ID NOs:1&3)。
贯穿本说明书提及“至少80%序列同一性”被认为与短语“基于”同义,并且可包含至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少97%、至少99%、和100%的序列同一性的一个或更多个。当评估序列同一性时,将具有限定数目的连续氨基酸残基的参考序列与来自本发明的多肽的相应部分的氨基酸序列(具有相同数目的连续的氨基酸残基)进行比对。
在一个实施方案中,多肽氨基酸序列基于(即具有与以下的至少80%序列同一性)艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1500-1700或氨基酸残基1450-1750、或氨基酸残基1400-1800。在另一个实施方案中,多肽氨基酸序列基于艰难梭菌毒素A的氨基酸残基544-1850,诸如氨基酸残基564-1850、氨基酸残基584-1850、氨基酸残基594-1850、氨基酸残基614-1850、氨基酸残基634-1850、氨基酸残基654-1850、氨基酸残基674-1850、氨基酸残基694-1850、氨基酸残基714-1850、氨基酸残基734-1850、氨基酸残基754-1850、氨基酸残基767-1850、氨基酸残基770-1850、氨基酸残基774-1850、氨基酸残基794-1850、氨基酸残基814-1850、氨基酸残基834-1850、氨基酸残基854-1850、氨基酸残基874-1850、氨基酸残基894-1850、氨基酸残基914-1850、氨基酸残基934-1850、氨基酸残基954-1850、氨基酸残基974-1850、氨基酸残基994-1850、氨基酸残基1014-1850、氨基酸残基1034-1850、氨基酸残基1054-1850、氨基酸残基1074-1850、氨基酸残基1094-1850、氨基酸残基1104-1850、氨基酸残基1124-1850、氨基酸残基1131-1850、氨基酸残基1144-1850、氨基酸残基1164-1850、氨基酸残基1184-1850、氨基酸残基1204-1850、氨基酸残基1224-1850、氨基酸残基1244-1850、氨基酸残基1264-1850、氨基酸残基1284-1850、氨基酸残基1304-1850、氨基酸残基1324-1850、氨基酸残基1344-1850、氨基酸残基1450-1750、或氨基酸残基1550-1850;但条件是该多肽不包括艰难梭菌毒素A的残基1851-2710或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366之间的一个或更多个(例如全部)RU单元。在一个实施方案中,所述多肽缺少艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366的序列。仅通过举例,以上氨基酸位置编号可指确定为SEQ ID NO 1和/或3的艰难梭菌毒素A序列。
在一个实施方案中,提供了包含以下或由以下组成的多肽:基于毒素A序列的氨基酸残基542-1850的序列(或其部分)。实例被确定为包含以下或由以下组成的多肽:氨基酸序列SEQ ID 5和6。
在另一个实施方案中,提供了包含以下或由以下组成的多肽:基于毒素A序列的氨基酸残基542-1850的序列(或其部分),其基本上缺少半胱氨酸蛋白酶活性。实例被确定为包含以下或由以下组成的多肽:氨基酸序列SEQ ID 7。
在另一个实施方案中,提供了包含以下或由以下基于毒素A序列的氨基酸残基770-1850的序列(或其部分)组成的多肽。实例被确定为包含以下或由以下氨基酸序列SEQ ID 8组成的多肽。
在另一个实施方案中,提供了包含以下或由以下组成的多肽:基于毒素A序列的氨基酸残基1130-1850的序列(或其部分)。实例被确定为包含以下或由以下组成的多肽:氨基酸序列SEQ ID 9。
本发明的相关方面提供了包含以下、由以下组成、或包括以下的多肽:具有与由艰难梭菌毒素B序列的残基1500-1700(例如1450-1750、或1400-1800)组成的氨基酸序列的至少80%序列同一性的氨基酸序列,条件是该多肽包含艰难梭菌毒素A的残基1851-2710或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366之间的一个或更多个(例如任何)RU单元。在一个实施方案中,所述多肽缺少艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366的序列。
在本发明的另一个方面提供了包含以下、由以下组成、或包括以下的多肽:具有与由艰难梭菌毒素B序列的残基543-1852组成的氨基酸序列的至少80%序列同一性的氨基酸序列,条件是该多肽不包含艰难梭菌毒素A的残基1851-2710或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366之间的一个或更多个(例如任何)RU单元。在一个实施方案中,所述多肽缺少艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366的序列。
提及艰难梭菌毒素B序列意指天然存在的艰难梭菌毒素B的氨基酸序列(还称为艰难梭菌毒素B参考序列)。本领域技术人员容易理解此类序列的实例,并且仅用于说明的目的,一些更常见的天然存在的毒素B序列在本说明书中(参见,例如SEQ ID NO:2&4)而且贯穿文献被确定。
在一个实施方案中,多肽氨基酸序列基于(即具有与以下的至少80%序列同一性)艰难梭菌毒素B的氨基酸残基1500-1700或氨基酸残基1450-1750、或氨基酸残基1400-1800。在另一个实施方案中,多肽氨基酸序列基于艰难梭菌毒素B的氨基酸残基544-1852,诸如氨基酸残基564-1852、氨基酸残基584-1852、氨基酸残基594-1852、氨基酸残基614-1852、氨基酸残基634-1852、氨基酸残基654-1852、氨基酸残基674-1852、氨基酸残基694-1852、氨基酸残基714-1852、氨基酸残基734-1852、氨基酸残基754-1852、氨基酸残基767-1852、氨基酸残基770-1852、氨基酸残基774-1852、氨基酸残基794-1852、氨基酸残基814-1852、氨基酸残基834-1852、氨基酸残基854-1852、氨基酸残基874-1852、氨基酸残基894-1852、氨基酸残基914-1852、氨基酸残基934-1852、氨基酸残基954-1852、氨基酸残基974-1852、氨基酸残基994-1852、氨基酸残基1014-1852、氨基酸残基1034-1852、氨基酸残基1054-1852、氨基酸残基1074-1852、氨基酸残基1094-1852、氨基酸残基1104-1852、氨基酸残基1124-1852、氨基酸残基1131-1852、氨基酸残基1144-1852、氨基酸残基1164-1852、氨基酸残基1184-1852、氨基酸残基1204-1852、氨基酸残基1224-1852、氨基酸残基1244-1852、氨基酸残基1264-1852、氨基酸残基1284-1852、氨基酸残基1304-1852、氨基酸残基1324-1852、氨基酸残基1344-1852、氨基酸残基1450-1750或氨基酸残基1550-1800、氨基酸残基1450-1750或氨基酸残基1550-1850;但条件是该多肽不包括艰难梭菌毒素A的残基1851-2710或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366之间的一个或更多个(例如全部)RU单元。在一个实施方案中,所述多肽缺少艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366的序列。仅通过举例,以上氨基酸位置编号可指确定为SEQ ID NO:2和/或4的艰难梭菌毒素B序列。
在一个实施方案中,提供了包含以下或由以下组成的多肽:基于毒素B序列的氨基酸残基543-1852的序列(或其部分)。实例被确定为包含以下或由以下组成的多肽:氨基酸序列SEQ ID 10或11。
在另一个实施方案中,提供了包含以下或由以下组成的多肽:基于毒素B序列的氨基酸残基543-1852的序列(或其部分),其基本上缺少半胱氨酸蛋白酶活性。实例被确定为包含以下或由以下组成的多肽:氨基酸序列SEQ ID 12。
在另一个实施方案中,提供了包含以下或由以下组成的多肽:基于毒素B序列的氨基酸残基767-1852的序列(或其部分)。实例被确定为包含以下或由以下组成的多肽:氨基酸序列SEQ ID 13。
在另一个实施方案中,提供了包含以下或由以下组成的多肽:基于毒素B序列的氨基酸残基1145-1852的序列(或其部分)。实例被确定为包含以下或由以下组成的多肽:氨基酸序列SEQ ID 14。
在另一个实施方案中,提供了包含以下或由以下组成的多肽:基于毒素B序列的氨基酸残基1350-1852的序列(或其部分)。实例被确定为包含以下或由以下组成的多肽:氨基酸序列SEQ ID 15。
本发明的抗原多肽可基本上缺乏半胱氨酸蛋白酶活性。在另一个(或同一个)实施方案中,抗原基本上缺乏葡糖基转移酶活性。例如,提供所述一种或多种活性的氨基酸序列可不存在(例如,缺失)于本发明的抗原中。备选地,对于提供此类活性必不可少的关键的氨基酸残基,可被修饰或缺失。基本上减少毒素A的半胱氨酸蛋白酶活性的氨基酸修饰的实例是半胱氨酸700至丙氨酸、组氨酸655至丙氨酸、天门冬氨酸589至天冬酰胺或这些突变的多于一个的组合。基本上减少毒素B的半胱氨酸蛋白酶活性的氨基酸修饰的实例是半胱氨酸698至丙氨酸、组氨酸653至丙氨酸、天门冬氨酸587至天冬酰胺或这些突变的多于一个的组合。基本上减少毒素A的葡糖基转移酶活性的氨基酸修饰的实例是天门冬氨酸285至丙氨酸、天门冬氨酸287至丙氨酸、或两种突变的组合。基本上减少毒素B的葡糖基转移酶活性的氨基酸修饰的实例是天门冬氨酸286至丙氨酸、天门冬氨酸288至丙氨酸、或两种突变的组合。这些酶活性存在于天然毒素A和/或毒素B中,并与所述毒素的N末端结构域相关(参见图1,和/或SEQID 1、2、3和4)。
本发明的抗原多肽可基本上缺乏天然艰难梭菌毒素的葡糖基转移酶(效应器)结构域(氨基酸残基1-542毒素A;氨基酸残基1-543毒素B)。在一个实施方案中,抗原多肽缺乏天然艰难梭菌毒素的功能性葡糖基转移酶(效应器)结构域(氨基酸残基1-542毒素A;氨基酸残基1-543毒素B)。在另一个(或相同)实施方案中,抗原基本上缺乏天然艰难梭菌毒素的半胱氨酸蛋白酶结构域(氨基酸残基543-770毒素A;544-767毒素B)。在一个实施方案中,抗原多肽缺乏天然艰难梭菌毒素的功能性半胱氨酸蛋白酶结构域(氨基酸残基543-770毒素A;氨基酸残基544-767毒素B)。在一个实施方案中,抗原多肽包含以下或由以下组成:天然艰难梭菌毒素的功能性易位结构域(氨基酸残基770-1850毒素A;氨基酸残基767-1852毒素B)。在一个实施方案中,抗原多肽包含以下或由以下组成:天然艰难梭菌毒素的完整或全长易位结构域(氨基酸残基770-1850毒素A;氨基酸残基767-1852毒素B)。在一个实施方案中,抗原多肽不包括由艰难梭菌毒素B序列的残基850-1330、或1500-1800、或660-1255、或1256-1852、或543-1692组成的氨基序列或由艰难梭菌毒素B序列的残基660-1100或1100-1610组成的氨基酸序列。
所述氨基酸残基编号指任何毒素A或毒素B毒素类型,例如本说明书列举的任何一个或更多个参考毒素A和/或毒素B毒素类型SEQ ID NO。因此,所述氨基酸残基编号可指本说明书中列举的任何特定的毒素A和/或毒素B参考SEQ ID NO,包括具有与其的至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少97%、或至少99%的氨基酸序列变体。
本发明的抗原多肽包括嵌合体,其中所述抗原的一部分源自毒素A和/或毒素B的中心结构域,且所述抗原的第二部分基于艰难梭菌的细菌表层蛋白(surface layer protein)组分(SLP)的结构域(或其片段)。所述结构域的包含已由本发明人确定赋予若干优点。此类SLP结构域促进本发明的抗原多肽的可溶性表达。此外,由于这些SLP结构域是艰难梭菌起源,在免疫接种之前从构建体裂解并除去其不是必要的。实际上,本发明人相信,针对此类结构域的抗体识别完整艰难梭菌细菌并通过预防或减缓细菌定殖的过程提供另外的治疗益处。此类艰难梭菌SLP结构域的实例基于包含以下或由以下组成的多肽:来自艰难梭菌基因CD 2767(或其片段)的多肽产物。通过具体示例的方式,提及基于艰难梭菌基因CD 2767(或其部分)的多肽产物的氨基酸残基27-401的多肽片段-参见,例如由以下组成或包含以下的多肽:氨基酸序列SEQ ID 16。此类结构域可,例如,定位在本发明的多肽的N-末端和/或C-末端。
例如,在本发明的一个实施方案中,提供了由以下组成或包含以下的多肽抗原:CD 2767多肽(例如基于其残基27-401)和如以上定义的艰难梭菌毒素多肽(例如中心结构域)。
在另一个实施方案中,提供了由以下组成或包含以下的多肽抗原:CD2767多肽(例如基于其残基27-401)和基于由以下组成或包含以下的氨基酸序列的艰难梭菌毒素多肽:毒素A序列的氨基酸残基770-1850(或其部分)。
在另一个实施方案中,提供了由以下组成或包含以下的多肽抗原:CD2767多肽(例如基于其残基27-401),和基于由以下组成或包含以下的氨基酸序列的艰难梭菌毒素多肽:毒素A序列的氨基酸残基542-1850(或其部分)。实例被确定为包含以下或由以下组成的多肽:氨基酸序列SEQ ID17。
在本发明的相关的实施方案中,并且提供了由CD 2767多肽残基27-401(或其部分)与毒素B序列的氨基酸残基767-1852(或其部分)的嵌合体组成的抗原。参见SEQ ID 18。
在本发明的另一个实施方案中,提供了由以下组成或包含以下的多肽抗原:CD 2767多肽(例如基于其残基27-401)和基于由以下组成或包含以下的氨基酸序列的艰难梭菌毒素多肽:毒素B序列的氨基酸残基543-1852(或其部分)。
可另外(或可选地)至SPL的本发明的抗原多肽,包含其他融合蛋白伴侣,以促进可溶性表达。融合蛋白伴侣可附着在抗原构建体的N-末端或C-末端,但通常放置在N-末端。融合伴侣的实例是:NusA、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、小泛素样分子(Sumo-标签)。为了在纯化过程中方便地除去融合蛋白伴侣,可在融合蛋白伴侣和融合蛋白本身之间插入独特的蛋白酶位点。此类蛋白酶位点可包括用于凝血酶、Xa因子、肠激酶、PreScissionTM、SumoTM的那些。可选地,融合蛋白伴侣的除去可经由在融合蛋白伴侣和融合蛋白本身之间包含内含肽序列来实现。内含肽是自我裂解蛋白,并响应于刺激(例如降低的pH),能够在内含肽和抗原构建体之间的接合点处自我剪接,因此消除对另外的特定蛋白酶的需要。内含肽的实例包括源自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(RecA)、和热球菌Pyrococcus horikoshii(RadA)结构域(Fong等人(2010)TrendsBiotechnol.28:272-279)。
为了便于纯化,本发明的抗原可包括一个或更多个纯化标签以使得特定层析步骤(例如,金属离子螯合、亲和层析)被包括在纯化工艺中。此类纯化标签可,例如,包括:重复组氨酸残基(例如6-10个组氨酸残基)、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶;和链霉亲和素。这些标签可附着在本发明的多肽抗原的N-末端和/或C-末端。为了便于在纯化过程中除去此类标签,可在多肽和纯化标签之间插入蛋白酶位点和/或内含肽(以上实例)。本发明的毒素A和B衍生的抗原的表达构建体的实例示于SEQ ID 17、18、19和20中。
因此,本发明的典型的抗原构建体(从N-末端开始)可包含:
-第一纯化标签
-任选的融合蛋白伴侣(方便表达)和/或任选的SLP
-第一(优选特异性的)蛋白酶序列或内含肽序列
-毒素A和/或B抗原序列
-任选的第二(优选特异性的)蛋白酶序列或内含肽序列
-任选的第二个纯化标签
第一和第二纯化标签可相同或不同。类似地,第一和第二蛋白酶/内含肽序列可相同或不同。第一和第二选项优选地不同,使选择性的和可控的裂解/纯化成为可能。
在一个实施方案中,本发明的抗原是嵌合体,并且由艰难梭菌表面蛋白的部分或结构域连同基于毒素A和/或B的中心结构域的毒素抗原序列组成。
因此,在一个实施方案中,本发明的多肽可包括(从N-末端开始):
-第一纯化标签
-第一(优选特异性的)蛋白酶序列或内含肽序列
-是毒素A或B与SLP的嵌合体的抗原序列
-任选的第二(优选特异性的)蛋白酶序列或内含肽序列
-任选的第二个纯化标签
间隔子可被引入以使纯化标签与多肽保持距离-这可有助于增加对亲和纯化柱媒质的结合效力。可在纯化标签之后(立即)或在融合蛋白伴侣组分和该多肽本身的剩余部分之间放置间隔子。类似地,间隔子可应用使得融合蛋白伴侣和/或SLP与艰难梭菌毒素组分保持距离。典型的间隔子序列可由10-40之间的氨基酸残基组成,得到线性或α-螺旋结构。
因此,在一个实施方案中,本发明的多肽可包括(从N-末端开始):
-第一纯化标签
-任选的第一间隔子序列
-融合蛋白伴侣(方便表达)和/或SLP
-任选的第二间隔子序列
-(优选特异性的)蛋白酶序列或内含肽序列
-毒素A和/或B衍生的抗原序列
-任选的第二(优选特异性的)蛋白酶序列或内含肽序列
-任选的第三间隔子序列
-任选的第二个纯化标签
编码本发明的构建体的基因可通过PCR从艰难梭菌基因组DNA中产生并通过标准方法测序以确保完整性。可选地并优选地可合成提供用于表达宿主(例如大肠杆菌(E.coli),巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium))的最佳密码子偏倚的基因。因此,本发明提供了编码本发明的上述多肽的相应核酸序列。
因此,本发明的第二个方面,提供了用于表达一种或更多种本发明的上述多肽抗原的方法,所述方法包括:
1)提供在宿主细胞中编码一种或更多种所述多肽抗原的核酸序列,其中所述核酸序列可操作地连接至启动子;以及
2)在宿主细胞中表达所述核酸序列
本发明的抗原多肽可被配制为用于在许多方面用于人或动物的疫苗。例如,配制可包括用引入的分子内交联试剂处理。此类试剂的一个实例是甲醛,例如,其可与本发明的抗原多肽在1-24小时之间温育。可选地,例如,可应用长达2、4、6、8或10天的较长温育时间。用此类试剂处理后,本发明的抗原可与合适的佐剂组合,所述佐剂可取决于是否将抗原意图为人或动物使用而不同。
人或动物的疫苗制剂可包含本发明的多肽。因此,在一个实施方案中,本发明的疫苗配制过程包括以下步骤:
-以合适的缓冲系统提供本发明的重组多肽
-任选地(优选地)用类毒组分(toxoiding component)诸如甲醛处理所述混合物
-任选地将多肽转移至新的缓冲系统
-将多肽与一种或更多种合适的佐剂和任选地其他赋形剂组合
因此,本发明的第三方面提供了一种或更多种本发明的上述多肽,用于在产生结合艰难梭菌毒素A和/或毒素B的抗体中使用。
在一个实施方案中,所述抗体结合并中和艰难梭菌毒素A和/或毒素B。
对动物的免疫,可使用本发明的艰难梭菌重组抗原多肽单独地或组合地或同时或顺序地作为免疫原,以产生特异性针对单独或组合的艰难梭菌毒素的抗体。例如,两个或更多个重组抗原可混合在一起并用作单一免疫原。可选地,艰难梭菌毒素抗原(例如毒素A衍生的)可单独用作对第一动物组的第一免疫原,且另一个艰难梭菌毒素抗原(例如毒素B衍生的)可单独地用在第二动物组。由单独免疫产生的抗体可被组合以产生针对艰难梭菌毒素的抗体组合物。用于动物/兽医使用的合适的佐剂的非限制性实例包括弗氏(完全和不完全的形式)、明矾(磷酸铝或氢氧化铝)、皂素和其纯化的组分Quil A。
本发明的第四个(疫苗)方面提供了一种或更多种本发明的上述多肽抗原,用于在预防、治疗或抑制CDI中使用(例如,在哺乳动物诸如人中)。换言之,本发明提供了用于预防、治疗或抑制CDI(例如在哺乳动物诸如人中)的方法,所述方法包括向受试者(例如哺乳动物诸如人)施用治疗有效量的一种或更多种本发明的上述多肽。
通过示例的方式,基于毒素A的抗原(任何A毒素类型)可单独应用或与基于毒素B的抗原(任何B毒素类型)组合应用。类似地,基于毒素B的抗原(任何B毒素类型)可单独应用或与基于毒素A的抗原(任何A毒素类型)组合应用。所述抗原可以以顺序或同时的方式进行施用。本发明的疫苗应用还可包括组合使用(例如,在前、顺序或随后施用)一种或更多种抗原,诸如艰难梭菌抗原(例如,非毒素抗原;或艰难梭菌细菌诸如已被灭活或减毒的细菌),以及任选地一种或更多种医院感染的抗原(例如来自引起医院内感染的细菌的抗原,特别是表面抗原;和/或引起医院内感染的细菌,诸如已被灭活或减毒的细菌)。引起医院内感染的细菌的实例包括以下一种或更多种:大肠杆菌,肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonae),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)诸如MRSA、军团菌(Legionella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),肠杆菌属种(Enterobacter spp)、柠檬酸杆菌属种(Citrobacter spp)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),不动杆菌属种(Acinetobacter spp)诸如鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii),洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia),和肠球菌(Enterococcus)诸如耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistant Enterococcus)(VRE)。
在一个实施方案中,所述疫苗应用可预防性地应用,例如在患者进入医院(或类似的治疗设施)之前治疗患者,有助于预防医院获得性感染。可选地,所述疫苗应用可作为常规事务施用于易受伤害的患者。
本发明的一个相关的疫苗方面提供了一种或更多种抗体(包含以下或由以下组成:完整IgG和/或Fab和/或F(ab’)2片段),其结合至本发明的一种或更多种上述多肽,用于在预防、治疗或抑制CDI中使用(例如,在哺乳动物诸如人中)。换言之,本发明提供了用于预防、治疗或抑制CDI(例如在哺乳动物诸如人中)的方法,所述方法包括向受试者(例如哺乳动物诸如人)施用治疗有效量的一种或多种所述抗体。
通过示例的方式,抗基于毒素A的抗原(任何A毒素类型)的抗体可单独应用或与抗基于毒素B的抗原(任何B毒素类型)的抗体组合应用。类似地,抗基于毒素B的抗原(任何B毒素类型)的抗体可单独应用或与抗基于毒素A的抗原(任何A毒素类型)的抗体组合应用。所述抗体可以以顺序或同时的方式进行施用。本发明的疫苗应用还可包括组合使用(例如,在前、顺序或随后施用)一种或更多种结合以下抗原的抗体:诸如艰难梭菌抗原(例如,非毒素抗原;或艰难梭菌细菌),以及任选地一种或更多种结合一种或更多种医院内感染抗原(例如来自引起医院内感染的细菌的抗原,特别是表面抗原;和/或引起医院内感染的细菌)的抗体。引起医院内感染的细菌的实例包括以下一种或更多种:大肠杆菌,肺炎克雷伯氏菌,金黄色葡萄球菌诸如MRSA、军团菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、肠杆菌属种、柠檬酸杆菌属种、嗜麦芽寡养单胞菌,不动杆菌属种诸如鲍氏不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、和肠球菌诸如耐万古霉素肠球菌(VRE)。
在一个实施方案中,所述疫苗应用可,例如,在患者进入医院(或类似的处理设施)后预防性地应用。可选地,所述疫苗应用可与一种或更多种抗生素组合向患者施用。
在一个实施方案中,所述抗体已通过用一种或更多种本发明的上述抗原免疫动物(例如哺乳动物诸如人,或非人动物诸如山羊或绵羊)来产生。
在一个实施方案中,本发明的抗体(基本上)不结合艰难梭菌毒素A和/或毒素B的重复区域。
对于制备人(或非人动物)使用的疫苗,活性免疫原性成分(不论这些是本发明的抗原和/或与其结合的本发明的相应抗体)可与是药学上可接受的并与活性成分相容的载体或赋形剂混合。合适的载体和赋形剂包括,例如,水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外,如果需要,疫苗可包含增强疫苗效力的少量的辅助物质,诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、和/或佐剂。
疫苗还可以包括一种或更多种佐剂。在本发明的范围内的佐剂的一个非限制性实例是氢氧化铝。佐剂的其他非限制性实例包括但不限于:N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637,称为nor-MDP)、N-乙酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷基氧基)-乙胺(CGP 19835A,称为MTP-PE)、和RIBI,其包含以2%角鲨烯/Tween80乳液从细菌提取的三种组分,单磷酰脂质A,海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
通常,疫苗制备为可注射的液体溶液或悬浮液。当然,还可制备适合于在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。制品还可被乳化,或将肽包封于脂质体或微胶囊中。
疫苗通常通过常规途径例如静脉内、皮下、腹膜内或粘膜途径来施用。可通过非肠道注射,例如,皮下或肌内注射进行施用。
疫苗以与用量配方(dosage formulation)相容的方式并以预防上和/或治疗上有效的量来施用。待施用的量,通常在5微克至250微克抗原/剂的范围内,取决于待治疗的受试者、受试者的免疫系统合成抗体的能力、以及所需保护的程度。所需施用的活性成分的精确的量可取决于医生的判断,并且对于每个受试者可能是特定的。
可以以单剂量方案或任选地以多剂量方案给予疫苗。多剂量方案是以下的方案:其中接种的初次过程可用1-6个单独剂量,随后在需要的随后时间间隔处给予其他剂量以维持和/或加强免疫应答,例如,在1-4个月时给予第二剂量,并且如果需要,在数月后给予随后剂量。给药方案还将至少部分地由个体的需要并取决于医师的判断来确定。
在一个实施方案中,体积X(例如1-6ml)的包含10-500μg本发明的多肽的缓冲溶液与等体积X(即1-6ml)的佐剂(例如弗氏完全佐剂)混合以形成乳液。与佐剂混合进行数分钟,以确保稳定的乳液。然后,用所述乳液(例如1-10ml)进行初次免疫(例如肌内(i.m.)注射)。并列的,体积X(例如1-6ml)的包含10-500μg本发明的多肽的缓冲溶液与等体积X(即1-6ml)的佐剂(例如弗氏不完全佐剂)混合以形成乳液。与佐剂混合进行数分钟,以确保稳定的乳液。然后用所述乳液(例如1-10ml)按月进行随后的免疫接种(例如,2、3、4、5或6)(例如肌内注射)。抗体滴度通常在各所述每月接种后约2周的期间通过取样来测试,并且当已达到最佳抗体滴度时进行抗体收获。
此外,包含免疫原性抗原的疫苗可连同以下的其他免疫调节剂来施用:例如,免疫球蛋白、抗生素、白细胞介素(例如,IL-2、IL-12)、和/或细胞因子(例如,IFNγ)。
适合于与本发明一起使用的另外的制剂包括微胶囊、栓剂,以及,在某些情况下,口服制剂或适于分配为气雾剂的制剂。对于栓剂,传统的粘合剂和载体可包括,例如,聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)或甘油三酯;此类栓剂可由包含约0.5%至10%,包括,例如,约1%-2%的范围内的活性成分的混合物形成。
本发明的抗原还可具有用作配体用于亲和层析程序中使用的用途。在此类程序中,本发明的抗原可共价地固定于基质,诸如琼脂糖,例如用溴化氰活化的琼脂糖。然后此类亲和柱可用于从抗血清或免疫球蛋白的部分纯化的溶液通过使其通过该柱并然后洗脱结合的IgG级分(例如通过低pH)来纯化抗体。随着已除去非特异性抗体和其他蛋白,洗脱级分中的几乎所有抗体将针对本发明的抗原。这些亲和纯化的IgG级分具有作为免疫治疗剂和作为诊断试剂两种应用。对于免疫治疗剂,亲和纯化的抗体使得能够施用更低的剂量,使不良副作用的可能性更小。对于诊断剂,亲和纯化的试剂常常产生改进的特异性和更少的假阳性结果。
定义
艰难梭菌是梭菌属(Clostridium)的革兰氏阳性细菌的物种。
艰难梭菌感染(CDI)意指影响人和动物并且导致从轻度自限性腹泻至危及生命状况的一系列症状诸如伪膜性结肠炎和细胞毒性巨结肠的细菌感染。在这种疾病中,艰难梭菌代替了一些正常肠道菌群,并开始产生攻击和损害肠上皮细胞的细胞毒素。人CDI的主要风险因素包括:接受广谱抗生素,是超过65岁,以及正在住院治疗。
艰难梭菌毒素A是约300kDa大小的细胞毒素/肠毒素蛋白家族。毒素A具有起破坏哺乳动物细胞的细胞骨架导致细胞死亡作用的N-末端区域内的酶活性。在艰难梭菌的菌株内存在许多毒素A的天然存在的变体,其称为“毒素类型”。毒素A的各种毒素类型在其通常<10%整体的一级序列内具有变异。合适的毒素A序列的实例包括SEQ ID NO:1和3。
艰难梭菌毒素B是约270kDa大小的细胞毒素蛋白家族,其与毒素A相似但显著更多细胞毒性。如同毒素A,毒素B具有起破坏哺乳动物细胞的细胞骨架导致细胞死亡作用的N-末端区域内的酶活性。在艰难梭菌的菌株内存在许多毒素B的天然存在的变体,其称为“毒素类型”。毒素B的各种毒素类型在其多达15%整体的一级序列内具有变异。合适的毒素B序列的实例包括SEQ ID NO:2和4。
艰难梭菌重复单元是在毒素A和B的C-末端内包含由vonEichel-Streiber和Sauerborn(1990;Gene 30:107-113)首次确定的重复基序的区域。在毒素A的情况下,存在31个短重复序列和7个长重复序列,其中各重复序列由β发夹接着是环组成。毒素B由类似的结构组成,但具有更少的重复序列。毒素A的重复单元被包含在残基1850-2710内,且毒素B的那些重复单元在残基1852-2366内。重复区域在受体结合中起作用。受体结合区域(即其定义了毒素的结构结合袋)在长重复区域周围出现聚集以形成“结合模块“。
毒素A和B的中心结构域被认为在毒素易位进入哺乳动物细胞中起作用。毒素A的中心结构域基于残基542-1849,且毒素B的那些中心结构域基于残基543-1851。毒素A和B的中心结构域区域中,第一结构域是半胱氨酸蛋白酶,其在毒素的效应器结构域(其包含葡糖基转移酶活性)的内化中起作用。
毒素类型经常用于分类艰难梭菌的菌株。毒素分型基于表征用毒素基因获得的限制性图谱的方法。毒素A和B的毒素类型表示由这些毒素蛋白的一级氨基酸序列的变体。在一个实施方案中,艰难梭菌毒素选自毒素类型0至ⅩⅩ的一种。优选的毒素类型(加核糖体型和菌株实例)直接列于下表。列出的毒素类型仅是为了说明,并非意图限制本发明。
“抗体”以最广泛的含义来使用,并且具体包含多克隆抗体和抗体片段,只要其展现出期望的生物学活性。例如,抗体是包括至少一个或两个重(H)链可变区(本文缩写为VHC),以及至少一个或两个轻(L)链可变区(本文缩写为VLC)的蛋白。VHC和VLC区可进一步细分为称为“互补决定区”(“CDR”)的高变区,散布于称为“框架区”(FR)的更保守的区域内。框架区和CDR的范围已被精确定义(参见,Kabat,E.A.等人Sequences of Proteinsof Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242,1991,以及Chothia,C.等人,J.Mol.Biol.196:901-917,1987,其通过引用并入本文)。优选地,每个VHC和VLC包括以以下顺序从氨基末端至羧基末端排列的三个CDR和四个FR:FRI、CDR1、FR2、CDR2、FR3,CDR3,FR4。
抗体的VHC或VLC链还可包括重链或轻链恒定区的全部或一部分。在一个实施方案中,抗体是两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的四聚体,其中免疫球蛋白重链和轻链通过,例如,二硫键相互连接。重链恒定区包括三个结构域,轻链恒定区包括一个结构域CL。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。
抗体的恒定区通常介导抗体结合至宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。术语“抗体”包括型IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及其亚型)的完整免疫球蛋白,其中免疫球蛋白的轻链可以是型κ或λ。
如本文所用术语抗体,还指结合至艰难梭菌的毒素(例如毒素A或B)的抗体的一部分,例如,其中一个或更多个免疫球蛋白链不是全长,但其结合毒素的分子。涵盖在术语抗体内的结合部分的实例包括(i)Fab片段,由VLC、VHC、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab')2片段,包括通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VHC和CH1结构域组成的Fc片段;(iv)由抗体的单臂的VLC和VHC结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989),其由VHC结构域组成;和(vi)分离的互补决定区(CDR),其具有足够的框架以结合例如可变区的抗原结合部分。轻链可变区的抗原结合部分和重链可变区的抗原结合部分,例如,Fv片段的两个结构域VLC和VHC可使用重组方法通过合成的连接子连接,所述合成的连接子使得其可作为单个蛋白链制备,在该单个蛋白链中VLC和VHC区配对以形成单价分子(称为单链Fv(ScFv);参见,例如,Bird等人(1988)Science IAI-ATi-Alβ;以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.ScL USA 85:5879-5883)。这种单链抗体(以及骆驼抗体(camelid))还涵盖在术语抗体内。这些是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的,并且以与完整抗体相同的方式筛选这些部分的效用。
术语“片段”意指典型地具有(基于)相应的参考序列的至少70个、90个、110个、130个、150个、170个、190个、210个、230个、250个、270个、290个、310个、330个、350个连续氨基酸残基的肽。
术语“变体”意指具有与参考多肽序列(例如,艰难梭菌毒素多肽氨基酸序列,和/或融合蛋白伴侣氨基酸序列,和/或SLP氨基酸参考序列)至少80%、优选地至少85%、更优选地至少90%氨基酸序列同源性的肽或肽片段。对于序列比较,通常一个序列作为参考序列,测试序列可与其比较。当使用序列比较算法时,将测试序列和参考序列输入计算机中,若需要则随后指定坐标,并指定序列算法程序参数。然后,序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
各种序列比对方法的任一种可用于确定百分比同一性,包括但不限于,全局方法、局部方法和杂交方法(hybrid methods),诸如,例如,区段逼近方法(segment approach methods)。确定百分比同一性的方案是本领域技术人员的知识范围之内常规方法。全局方法从分子的开始至末端对齐序列并通过合计单个残基对的评分及通过施加空位罚分确定最佳比对。非限定性方法包括例如CLUSTALW,参见,例如Julie D.Thompson等人,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of Progressive Multiple SequenceAlignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penalties andWeight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994);以及迭代优化,参见,例如,Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracy ofMultiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed byReference to Structural Alignments,264(4)J.Mol.Biol.823-838(1996)。局部方法通过确定由所有输入序列共有的一个或更多个保守基序对齐序列。非限定性方法包括例如,例如,匹配盒(Match-box),参见,例如,Eric Depiereuxand Ernest Feytmans,Match-Box:A Fundamentally New Algorithm for theSimultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS501-509(1992);Gibbs采样(Gibbs sampling),参见,例如,C.Ε,Lawrence等人,Detecting Subtle Sequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy forMultiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993);Align-M,参见,例如,Ivo Van Walle等人,Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignmentof Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。
因此,序列同一性百分比通过常规方法确定。参见,例如,Altschul等人,Bull.Math.Bio.48:603-16,1986以及Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-19,1992。简言之,将两个氨基酸序列对齐以使用空位开放罚分10,空位延伸罚分1,和Henikoff和Henikoff(ibid.)的“blosum 62”评分矩阵优化比对评分,如下图所示(氨基酸通过标准单字母代码表示)。
比对评分用于确定序列同一性
然后同一性百分比计算为:
相同匹配的总数
_____________________________x 100
[较长序列的长度加上引入到较长
序列以对齐两个序列的空位数目]
基本上同源的多肽表征为具有一个或更多个氨基酸取代、缺失或添加。优选次要性质的这些改变,即不显著影响多肽的折叠或活性的保守的氨基酸取代(见下文)和其他取代;小型(small)缺失,通常1个至约30个氨基酸;和小的氨基或羧基末端延伸,诸如氨基末端甲硫氨酸残基,多达约20-25个残基小接头肽,或亲和标签。
保守的氨基酸取代
除了20个标准氨基酸,非标准氨基酸(诸如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可取代本发明的多肽的氨基酸残基。非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、和非天然氨基酸的有限的数目可取代梭菌多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可包括非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括,但不限于,反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟基乙基半胱氨酸、羟基乙基高(hydroxyethylhomo)-半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、2-哌啶酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯基丙氨酸、3-氮杂苯基-丙氨酸、4-氮杂苯基-丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。几种方法是本领域已知用于将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质中。例如,可采用体外系统,其中无义突变使用化学氨基酰化的抑制性tRNA来抑制。用于合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是本领域已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译在包括大肠杆菌S30提取物和商购可得的酶和其他试剂的无细胞系统种进行。通过色谱法纯化蛋白。参见,例如,Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991;Ellman等人,Methods Enzymol.202:301,1991;Chung等人,Science 259:806-9,1993;以及Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中,翻译在非洲爪蟾卵母细胞中通过显微注射突变mRNA和化学氨基酰化的抑制性tRNA来进行(Turcatti等人,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法内,在缺乏天然氨基酸,该天然氨基酸被代替(例如,苯丙氨酸)并且在期望的非天然存在的氨基酸(例如,2-氮杂苯基丙氨酸、3-氮杂苯基丙氨酸、4-氮杂苯基丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸)的存在下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸掺入多肽代替其天然对应物。参见,Koide等人,Biochem.33:7470-6,1994。可通过体外化学修饰将天然存在的氨基酸残基转化为非天然存在的种类。化学修饰可与位点定向诱变组合以进一步扩展取代的范围(Wynn和Richards,Protein Sci.2:395-403,1993)。
非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸、和非天然氨基酸的有限的数目可取代本发明的多肽的氨基酸残基。
本发明的多肽中的必需氨基酸可根据本领域已知的方法,诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变来确定(Cunningham和Wells,Science 244:1081-5,1989)。生物相互作用的位点还可通过结构的物理分析来测定,如通过以下此类技术测定的:如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记、连同推定的接触位点氨基酸的突变。参见,例如,de Vos等人,Science 255:306-12,1992;Smith等人,J.Mol.Biol.224:899-904,1992;Wlodaver等人,FEBS Lett.309:59-64,1992。必需氨基酸的身份还可从与本发明的多肽的相关组分(例如,易位或蛋白酶组分)的同源性的分析来推断。
可做出多个氨基酸取代并使用以下已知的诱变和筛选的方法来测试:诸如由Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:21526,1989)公开的那些方法。简言之,这些作者公开了同时随机化多肽中的两个或更多个位置,选择功能性多肽,并然后测序诱变的多肽以确定在每个位置上可允许取代的谱的方法。可使用的其他方法包括噬菌体展示(例如,Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991;Ladner等人,美国专利号5,223,409;Huse,WIPO出版物WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,Gene 46:145,1986;Ner等人,DNA 7:127,1988).
毒素中和意指物质预防毒素A或B对哺乳动物细胞起细胞毒性作用的能力。在测定毒素中和活性中,固定量的毒素与各种浓度的中和物质(例如抗体)混合且将混合物应用至并与哺乳动物细胞系(例如Vero细胞)温育持续固定的时间。中和滴定度可通过以下几种方法来测量:
(a)稀释完全保护细胞免受毒素A或B的细胞毒性效应的物质(血清、抗体、纯化的IgG)。这些细胞毒性效应通过细胞变圆是明显的,并且端点可以通过显微镜方法来定量。
(b)稀释保护50%的细胞(ED50滴度)免受毒素A或B的细胞毒性效应的物质(血清、抗体、纯化的IgG)。ED50滴度可通过使用给出了细胞完整性的测量的染料(例如结晶紫)来评估。4-或5-参数对数曲线的拟合滴定数据提供了ED50滴度的精确估计,通常比基于显微镜的方法更精确的ED50估计提供了血清和纯化的抗体的毒素中和能力的定量估计。
在被设置为诱导细胞死亡超过24个温育周期需要的多个浓度的固定浓度的毒素A或毒素B的存在下测量毒素中和滴度。通常,毒素A的终浓度可设置为50ng/ml且毒素B的终浓度可设置为在0.5-2ng/ml之间。毒素A和毒素B之间的浓度差异反映了毒素B的显著较高的特异性细胞毒活性。因此,1000个单位/ml的血清溶液的抗体的ED50滴度指示在1000倍稀释时,抗体溶液能够中和50%的毒素A或B的细胞毒活性。关于血清中的滴度,≥1000个单位/ml的毒素中和滴度可被视为有效的中和活性。
对于高度纯化的IgG溶液,中和活性还可表示为中和50%的毒素A或B细胞毒活性需要的IgG的浓度(μg/ml)。在这种情况下,滴度值10≤μg/mlIgG可被认为是有效的中和活性。
艰难梭菌表面蛋白(SLP)意指与细菌细胞壁相关的那些蛋白。29种艰难梭菌表面(细胞壁蛋白)的实例在Fagan等人(2011)J.Medical Microbiol.60:1225-1228的表1中给出,其在此通过引用以其整体并入。
附图
图1示出了显示在不同结构域边界处的氨基酸残基的艰难梭菌毒素A和B的结构。
图2示出了毒素B重组片段残基767-1852作为与硫氧还蛋白的融合蛋白的纯化。左侧图显示TxB3的4-12%SDS-PAGE分析。列C2-C8显示具有部分纯化的片段的泳道。
图3示出了毒素A重组片段残基542-1850作为与硫氧还蛋白的融合蛋白的纯化。
图4.CD2767(残基27-401)的表达和纯化。CD2767(残基27-401)通过固定化金属离子亲和层析的纯化。关键:柱负载,L;流穿级分,FT;洗脱的纯化的CD2767多肽,E1。CD2767多肽的强条带说明其高溶解性。
图5.由CD2767(残基27-401)与毒素A(残基543-1851)组成的融合蛋白的表达和纯化。融合蛋白以总蛋白的约2%表达为可溶性多肽(泳道C1和C2中的顶部条带)。C1和C2表示总表达的蛋白的可溶性级分的重复。
图6.通过Vero细胞ED50测定测量的抗体介导的毒素A和毒素B的中和。针对毒素A(残基543-1851)的不同稀释度的抗血清(●)防止纯化的毒素A(50ng/ml)的细胞毒性效应的能力使用结晶紫染色以测量细胞生活力来评估。减少的吸光度表示缺乏细胞完整性。由毒素B(残基767-1852)抗血清(▼)的中和使用2ng/ml的毒素B来评估。每个抗血清是从免疫3只绵羊获得的池。
实施例
实施例1-毒素B片段重组片段残基767-1852作为具有硫氧还蛋白(His6TrxTxBcentral)的融合蛋白的表达和纯化
表达
将补充了200μg/ml氨苄青霉素和0.4%葡萄糖的L-肉汤(100ml)与来自甘油冷冻液(携带质粒pET59His6TrxTxBcentral的BL21(DE3)大肠杆菌)的刮取物(scrape)温育并在30℃和180rpm下保持过夜。将过夜培养物用作补充了200μg/ml氨苄青霉素和0.2%葡萄糖的Terrific肉汤(在2.5L无挡板的培养瓶中的4x 1L)的2.5%接种体。在37℃下以轨道震摇(180rpm)保持培养物至在600nm处0.6的吸光度。将培养物的温度降低至16℃,并以加入1mM IPTG诱导蛋白表达。在16℃下以轨道震摇保持培养物过夜,如前。通过离心收获细胞团(60g)(Sorvall RC3BP离心机,H6000A转子,4000g,持续20分钟)。
His
6
TrxTxBcentral的固定化镍亲和纯化
将细胞(60g)重悬浮于缓冲液(pH 8,20mM Tris,50mM NaCl)中,并使用超声处理进行溶解。通过离心使溶解产物澄清(Sorvall RC5C离心机,SS-34转子,20,000g,20分钟),并使用硫酸铵饱和溶液补足至1M硫酸铵。将溶液在冰上保存1小时,并通过离心收集所得的沉淀物(HeraeusMultifuge X3R离心机,4000g,4℃)。将沉淀物重悬于250ml低咪唑缓冲液(pH 7.5,50mM Hepes,0.5M NaCl,20mM咪唑)中,并以3ml/min的流速应用至30ml镍柱用低咪唑缓冲液洗涤柱并使用从0-100%梯度的高咪唑缓冲液洗(pH7.5,50mM Hepes,0.5M NaCl,0.5M咪唑)脱结合的蛋白。用考马斯亮蓝染色分析在4-12%NuPAGE Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上的级分。部分纯化的级分的SDS PAGE显示于图2中。
实施例2-毒素A片段重组片段残基542-1850(TxACPD)的表达和纯化
将补充了100μg/ml氨苄青霉素和0.2%葡萄糖的L-肉汤(100ml)与甘油冷冻液(携带质粒pET59TxACPDcentral的BL21(DE3)大肠杆菌)温育。将培养物保持(37℃,180rpm)至600nm处0.6的吸光度。将100ml培养物用作补充了200μg/ml氨苄青霉素和0.2%葡萄糖的Terrific肉汤(4x 0.75L)的2%接种体。在37℃下以轨道震摇(180rpm)保持培养物至在600nm处0.6的吸光度。将培养物的温度降低至16℃,并在加入1mM IPTG后1小时诱导蛋白表达。在16℃下以轨道震摇保持培养物过夜,如前。通过离心收获细胞团(37g)(Sorvall RC3BP离心机,H6000A转子,4000g,20分钟),并存储于-80℃。
将细胞(37g)重悬浮于260ml缓冲液(20mM Tris,50mM NaCl,pH 8)中,并使用超声处理进行溶解。通过离心(30,000g,20分钟)使溶解产物澄清,并在冰上温和地搅动该澄清的溶解产物,同时加入130ml的饱和的硫酸铵溶液(pH 8)以使混合物达到33%饱和度。将混合物在冰上放置15-20分钟,使浑浊的白色沉淀物形成。通过离心(30,000g,15分钟)收获沉淀物,并重悬于70ml“低咪唑”缓冲液(pH7.5,50mM Hepes,0.5M NaCl,20mM咪唑,5%甘油)中。将溶液以2ml/min的流速应用至30ml镍柱以2ml/min洗涤柱直到流穿的UV吸光度恢复至接近基线水平。用160ml梯度(2ml/min)至100%“高咪唑”缓冲液(pH 7.5,50mM Hepes,0.5M NaCl,0.5M咪唑,15%甘油)从柱上洗脱结合的材料。在4-12%NuPAGE Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上分析级分,并且混合包含最高量表达构建体的那些。
为了裂解His6Thioredoxin标签,来自第一固定化镍柱的包含构建体的蛋白溶液(18ml,1.5mg/ml)在室温下解冻并加入限制等级凝血酶(30U),且将混合物在室温~20℃下温育16-18小时。
将蛋白混合物以1ml/min负载至由30ml镍螯合琼脂糖柱(nickel charged chelating Sepharose column)组成的柱上,该柱用缓冲液A(50mM HEPES,0.5M NaCl,20%甘油,pH 7.5)平衡。用30ml缓冲液A洗涤柱。然后使用4%(50ml)、8%(50ml)且终梯度(120ml)至100%的缓冲液B(50mM HEPES,0.5M NaCl,0.5M咪唑,20%甘油,pH 7.5)洗脱结合的蛋白。包含纯化的级分的级分通过SDS PAGE来分析,并混合包含最纯的构建体的级分,并透析进入存储缓冲液(pH 7.5,50mM Hepes,0.5M NaCl,20%甘油)中。
纯化的TxACPD构建体的SDS PAGE分析和蛋白质印迹分析
将纯化的蛋白溶液以1:1与补充了5mM DTT的4x LDS-PAGE上样缓冲液混合。将样品95℃下加热五分钟并以一式二份(5和10μl)加载在4-12%NuPAGE Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上。凝胶在MES电泳缓冲液中200V下进行电泳45分钟。凝胶的一部分经历考马斯亮蓝染色,且其他部分在转移缓冲液中在40V下1小时印迹至硝酸纤维素膜上。将膜用补充了0.1%吐温20的tris缓冲的盐水(TBST)中的5%脱脂牛奶封闭40分钟。膜与以1:25,000以1%脱脂牛奶TBST稀释的绵羊抗-毒素A抗体温育40分钟。贮备抗体浓度为50mg/ml。以TBST洗涤膜4x 15分钟。将驴抗绵羊抗体碱性磷酸酶偶联物以1%脱脂牛奶TBST以1:10,000的稀释度应用至膜。溶液在膜上温和搅拌放置40分钟,如以前。如以前,用TBST洗涤膜,并且使用NBT/BCIP一步试剂显影印迹。SDS PAGE和蛋白印迹显示于图3中。
实施例3-艰难梭菌蛋白CD2767的残基27-401的表达和纯化
编码艰难梭菌蛋白CD2767的残基27-401的合成的基因用其在宿主诸如大肠杆菌中最佳表达的密码子偏好性被商业上合成。使用标准分子生物学程序将该基因掺入进pET28a表达载体并转化进入BL21大肠杆菌表达菌株中。大肠杆菌表达菌株生长并用IPTG诱导蛋白表达,基本上如实施例1中所述,除了使用卡那霉素代替氨苄青霉素。细胞沉淀物或直接使用或冷冻于-20℃。
对于蛋白提取,将细胞解冻并重悬于包含0.5M NaCl和20mM咪唑的50mM TrisHCl pH8.0缓冲液中,超声处理(6x 30秒伴随每次处理后30秒冷却),且然后以47000x g离心20分钟。然后从上清液中通过使用固定化金属离子(Ni)亲和层析纯化His6-标签的残基27-401CD2767多肽。将样品应用至柱并以上述Tris/NaCl/咪唑缓冲液洗涤。然后用相同缓冲液中的梯度至0.5M咪唑洗脱纯化的构建体。
CD2767(残基27-401)多肽通过单一纯化步骤获得为>90%纯的蛋白,并表现为SDS PAGE上的约47kDa的强条带(图4)。蛋白片段可浓缩至当通过280nm处的吸光测量时的>120mg/ml,或至当通过Bradford蛋白测定法测量时的>167mg/ml(牛血清白蛋白作为标准)。这两种试验说明了CD2767(残基27-401)多肽的非常高的溶解度以及其作为重组融合蛋白内增强溶解度的组分的潜在的有用性。
实施例4-毒素A或B重组片段作为与艰难梭菌蛋白CD2767的残基27-401的融合蛋白的表达和纯化
编码其中N-末端由艰难梭菌蛋白CD2767的残基27-401组成且C-末端由毒素B片段重组片段残基767-1852组成的融合蛋白的合成的基因可用其在宿主诸如大肠杆菌中最佳表达的密码子偏好性被商业上合成。编码其中N-末端由艰难梭菌蛋白CD2767的残基27-401组成且C-末端由毒素A片段重组片段残基770-1850组成的融合蛋白的合成的基因可被类似地获得。这些和其他融合蛋白可用具有被掺入以促进纯化的各种纯化标签(6组氨酸)的表达载体掺入。此类表达构建体的实例示于SEQ ID 19中,其由CD2767(残基27-401)和毒素A(残基542-1850)组成。
可通过如实施例1和2中概述的那些方法类似的方法开始进行以上构建体的表达和纯化,并且由CD2767(残基27-401)作为与毒素A(残基543-1851)N-末端融合组成的构建体的表达示于图5中。这里,CD2767结构域添加至毒素A片段赋予其为2%的总可溶性蛋白的可溶性和可表达性。在大肠杆菌中表达后,构建体的纯化受到固定化金属离子亲和层析和其他层析方法诸如离子交换层析的影响。
实施例5-用于免疫接种动物的本发明的抗原的制剂
针对合适的缓冲液(例如包含150mM NaCl的10mM Hepes缓冲液pH7.4)透析以0.5—2mg/ml之间的浓度(通常1mg/ml)的纯化的艰难梭菌抗原,并且然后加入甲醛至0.2%的终浓度,并35℃下温育长达7天。温育后,可任选地通过针对合适的缓冲液,例如磷酸盐缓冲盐水的透析除去甲醛。
对于绵羊,包含10和500μg之间的以上艰难梭菌抗原的2ml缓冲溶液与2.6ml弗氏佐剂混合以形成乳液。与佐剂混合进行数分钟,以确保稳定的乳液。佐剂的完整形式用于初次免疫且不完全弗氏佐剂用于所有后续加强(boost)。
实施例6-针对本发明的抗原的抗体的产生
在抗血清的制备期间,考虑一些常规因素以达到最佳的体液抗体应答。这些包括:动物品种、选择佐剂、免疫部位的数量和位置、免疫原的数量、和剂量之间的数目和时间间隔。这些参数的常规优化是常规的以过量6g/升的血清获得特异性抗体水平。
对于绵羊,制备具有弗氏佐剂的抗原的乳液,如实施例5中所述。佐剂的完整形式用于初次免疫且不完全弗氏佐剂用于所有后续加强。约4.2ml的抗原/佐剂混合物用于通过肌内注射并遍布6个部位包括颈部和所有的上肢免疫每只绵羊。每28天重复这个步骤。每次免疫后第14天采集血液样品。
对不同抗原的毒素中和免疫应答的比较,每种抗原使用3只绵羊。将其如上使用同一方案和相同蛋白剂量/免疫进行免疫。
实施例7-使用体外细胞测定评估抗血清对毒素的中和效力
针对艰难梭菌毒素的抗血清的毒素中和活性通过使用Vero细胞的细胞毒性测定法测量。固定量的纯化的艰难梭菌毒素A或毒素B与各种稀释度的抗体混合,在37℃下温育30分钟,并且然后应用至在96-孔组织培养板上生长的Vero细胞。毒素A和B两者具有导致Vero细胞在24-72h时期内的特征性修圆的细胞毒活性。在中和抗体的存在下,该活性被抑制,并且抗体制品的中和强度可通过中和指定量的毒素A或B的效应需要的稀释度来评估。
数据显示绵羊抗体对各种重组艰难梭菌毒素B抗原的中和活性示于表1和2。在这些实验中,不同稀释度的绵羊抗体与终浓度0.5ng/ml的毒素B混合,并在37℃下温育30min,并且然后应用至如以上的Vero细胞,并在37℃下温育,且在24-72h的时期内监测。计算完全保护细胞免受毒素B的细胞毒性效应的抗体稀释度。
表1显示了本发明的抗原的中和滴度,且表2显示了使用仅由重复区域组成的抗原获得的滴度。
共同地,与仅包含重复结构域的片段相比,表1和表2中的数据显示了本发明的抗原引起毒素中和免疫应答的优异能力。
抗体毒素中和滴度还通过基于用结晶紫染色细胞的比色测定来估计(Rothman(1986)J.Clin.Pathol.39:672-676)。Vero细胞在96孔细胞培养板中生长至汇合。这些测定如以上描述使用终浓度的毒素A和毒素B分别在50ng/ml和2ng/ml的抗体混合物中进行。温育过夜后,细胞用200μ1的Dulbecco's-PBS(Sigma)温和地洗涤,将Dulbecco's-PBS小心地除去,然后将细胞用70μl冰冷的乙醇固定2分钟。然后除去乙醇,并且加入70μl结晶紫(在乙醇中1%w/v;Pro-Lab)以固定细胞并在22℃下温育30分钟。然后将板通过浸没在去离子水中小心地洗涤,以除去过量的染料,在37℃下干燥,并然后加入200μl的50%(v/v)乙醇。然后板在震荡培养箱(300rpm)中在37℃下温育2h,然后在492nm处读数。ED50值源自使用4-pl或5-pl非线性回归模型所得到的毒素中和曲线(图4)。因此,ED50滴度是实现测定中的50%毒素中和终点所需的血清或抗体的稀释度。如果使用了已知的IgG浓度的抗体溶液,滴度还可表示为实现50%毒素中和终点所需的IgG的浓度。
表3示出了使用用于使用毒素A和毒素B两者的中心结构产生的血清的结晶紫方法获得的毒素中和ED50滴度。对于两种片段,其各自的血清获得过量1000个单位/ml的毒素中和ED50滴度(还参见图6)。
由绵羊抗毒素B(残基767-1852)IgG溶液获得的毒素中和ED50滴度值示于表4中。由该片段抗血清获得了针对毒素B的各种毒素类型的中和滴度以评估其交叉中和效力。毒素B的各纯化的毒素类型被标准化为测定中的毒性,并保持在导致细胞在24小时温育时期内死亡的16x最低毒素浓度的固定浓度。中和效力表示为中和以上毒素B浓度的50%所需的μg/mlIgG。观察到中和滴度中小于4倍的差异,其表示良好的交叉中和效力。
实施例8-体内评估使用本发明的重组抗原产生的抗血清用于治疗CDI的效力
为了证明使用重组抗原产生的抗血清对体内治疗CDI的效力,用具有针对艰难梭菌的一种或更多种毒素的中和活性的抗体被动免疫叙利亚仓鼠(Syrian hamsters)。为了评估治疗制剂的效力,在挑战艰难梭菌后从6小时至挑战后240小时的不同时间静脉内或通过腹膜内途径给予仓鼠抗体。
在被动免疫仓鼠前,施用广谱抗菌素(例如克林霉素),并且12-72h后经口服挑战艰难梭菌孢子。然后对动物与艰难梭菌相关疾病的症状监视长达15天。对照、未免疫的动物发展疾病的迹象(例如腹泻、腹水病、嗜睡、皱皮),而用绵羊抗体处理的那些表现正常或显示统计上显著减少的发病率。
实施例9-由本发明的肽/肽片段接种
由本发明的肽/肽片段呈现的疫苗通过当前良好生产实践来制备。使用此类实践,本发明的肽/肽片段可结合至商购可得的氢氧化铝佐剂(例如,铝胶(Alhydrogel))。疫苗通常将包含源自毒素A和毒素B的本发明的抗原的组合,但还可包含或毒素A或B抗原。疫苗还可包含与细菌或病毒来源的其他抗原组合的毒素A和B抗原。
本发明的纯化的艰难梭菌毒素A和/或毒素B抗原可用0.2%的终浓度下的甲醛处理,并在35℃下温育长达24小时(如实施例5中所述)。
除了本发明的抗原,典型的疫苗组合物包含:
A)缓冲液(例如,在5和20mM之间并且pH在7.0和7.5之间的Hepes缓冲液;
B)使疫苗生理上等渗的盐组分(例如在100和150mM之间的NaCl);
C)佐剂(例如,铝终浓度在100和700μg之间/疫苗剂量的氢氧化铝);和
D)防腐剂(例如0.01%下的硫柳汞或0.01%下的甲醛)。
将此类疫苗组合物通过以下各种不同的免疫方案施用至人:诸如:
1.以0.5ml皮下施用的单剂量(例如,20μg本发明的吸附的片段)。
2.以0.5ml在0和4周时施用的两个剂量(例如,10μg本发明的吸附的片段)。
3.以0.5ml在0、2和12周时施用的三个剂量(例如,10μg本发明的吸附的片段)。
这些接种方案赋予针对暴露于艰难梭菌毒素的同源血清型的保护水平。
实施例10-使用本发明的抗原产生的抗体的临床应用
三个实施例用于说明使用本发明的抗原产生的全身性绵羊抗体产品在患有不同严重程度的CDI的患者中的治疗价值。
轻度CDI
一名67岁老年男子在严重的心肌梗死后进入冠心病监护病房。虽然使得恢复顺利,他发展轻微的腹泻而无任何其他迹象或症状。因为在医院已存在近CDI发作,将粪便样品立即送往化验,并发现包含毒素A和毒素B两种。隔离至具有其特有卫生间的单人间后,他接受了静脉注射250mg的绵羊F(ab’)2,然后两天后第二次注射。他的腹泻迅速停止,并使他完全康复而无需甲硝唑或万古霉素。
具有复发风险的严重CDI
一名81岁女子在其家里跌倒并遭受了左髋部骨折。将她立即送往医院,并且髋部被成功固定。其虚弱的状况阻止早日出院,并且数天后,其发展了排痰性咳嗽,因此给予其广谱抗生素。另外八天后,她发展严重腹泻伴随腹痛和压痛,并且由适当的粪便测试诊断为CDI。当时还存在感染包括明显提高的白细胞计数和伴随脱水的显著液体损失的全身性表现的证据。患者立即开始口服万古霉素,并且,同时,接受首次五个日常注射250mg基于绵羊F(ab’)2的静脉注射产品。存在CDI的迹象和症状以及实验室表现的迅速解决。然而,为了避免她的CDI在停止万古霉素后复发的风险,她继续治疗另外两周抗体疗法的口服形式。她未经历复发。
伴随并发症的严重CDI
一名87岁老年女子当处于在长期护理设施中时发展支气管肺炎。当地的全科医师对她开始具有立即益处的抗生素疗法的过程。然而,在停止抗生素八天后,她经历了严重的腹泻。她的状况开始恶化,需要入院,在医院通过ELISA测试在其粪便中检测到了毒素A。此时,她病得非常严重,伴随循环衰竭的证据,并且停止腹泻。认为后者由于麻痹性肠梗阻和中毒性巨结肠的组合,并且认为必需紧急全结肠切除术。由于此类手术与超过60%的死亡率相关,她接受静脉替代疗法连同两个安瓿(500mg)的抗体产物的内含物。当四小时之后她被送进手术室时,她的全身状况已显著改善,并且她幸免于手术。
表1-通过用本发明的重组毒素B衍生的抗原(TxBcentral;残基767-1852)免疫绵羊获得的中和滴度
表2-通过用表示重复区域的重组毒素B衍生的抗原(TxB2,残基1756-2366)免疫绵羊获得的中和滴度
表3.通过用重组抗原毒素B(残基767-1852)和毒素A(残基543-1851)免疫绵羊获得的中和ED50滴度
对于每种抗原,每月给予3只绵羊中的每只5个100μg剂量,并且在第18周时分析血清。源自14周样品的ELISA滴度,表示给出了0.5A450高于背景的信号的血清稀释度(来自3只动物的池),并且是重复测定的平均值。对于结晶紫ED50测定,使用了2ng/ml的固定浓度下的毒素B和50ng/ml的毒素A。
表4.使用针对重组毒素B(残基767-1852)产生的血清抗血清针对各种毒素B毒素类型的中和ED50滴度
评估针对毒素B(残基767-1852)(毒素类型0序列)的抗体中和其他毒素B毒素类型的能力。在细胞测定中各自滴定纯化的毒素B毒素类型(0、3、5和10),并使用导致细胞在24小时温育时期内死亡的16x最低毒素浓度的固定浓度。中和效力表示为中和以上毒素B浓度的50%所需的μg/ml IgG。
SED ID NO
SEQ ID NO:1-艰难梭菌毒素A(毒素类型O)
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SEQ ID NO:2-艰难梭菌毒素B(毒素类型O)
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SEQ ID NO:3-艰难梭菌毒素A(毒素类型3)
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SEQ ID NO:4-艰难梭菌毒素B(毒素类型3)
MSLVNRKQLEKMANVRFRVQEDEYVAILDALEEYHNMSENTVVEKYLKLKDINSLTDIYIDTYKKSGRNKALKKFKEYLVTEVLELKNNNLTPVEKNLHFVWIGGQINDTAINYINQWKDVNSDYNVNVFYDSNAFLINTLKKTIVESATNDTLESFRENLNDPRFDYNKFYRKRMEIIYDKQKNFINYYKTQREENPDLIIDDIVKIYLSNEYSKDIDELNSYIEESLNKVTENSGNDVRNFEEFKGGESFKLYEQELVERWNLAAASDILRISALKEVGGVYLDVDMLPGIQPDLFESIEKPSSVTVDFWEMVKLEAIMKYKEYIPGYTSEHFDMLDEEVQSSFESVLASKSDKSEIFSSLGDMEASPLEVKIAFNSKGIINQGLISVKDSYCSNLIVKQIENRYKILNNSLNPAISEDNDFNTTTNAFIDSIMAEANADNGRFMMELGKYLRVGFFPDVKTTINLSGPEAYAAAYQDLLMFKEGSMNIHLIEADLRNFEISKTNISQSTEQEMASLWSFDDARAKAQFEEYKKNYFEGSLGEDDNLDFSQNTVVDKEYLLEKISSLARSSERGYIHYIVQLQGDKISYEAACNLFAKTPYDSVLFQKNIEDSEIAYYYNPGDGEIQEIDKYKIPSIISDRPKIKLTFIGHGKDEFNTDIFAGLDVDSLSTEIETAIDLAKEDISPKSIEINLLGCNMFSYSVNVEETYPGKLLLRVKDKVSELMPSISQDSIIVSANQYEVRINSEGRRELLDHSGEWINKEESIIKDISSKEYISFNPKENKIIVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLAECEINVISNIDTQVVEGRIEEAKSLTSDSINYIKNEFKLIESISDALYDLKQQNELEESHFISFEDILETDEGFSIRFIDKETGESIFVETEKAIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDATHEVNTLNAAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKVVELVSTALDETIDLLPTLSEGLPVIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLTAATTAIITSSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELILRDKATKVVDYFSHISLAESEGAFTSLDDKIMMPQDDLVISEIDFNNNSITLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHLSIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGEFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPVITTEYIREKLSYSFYGSGGTYALSLSQYNMNINIELNENDTVVVIDVDNVVRDVTIESDKIKKGDLIENILSKLSIEDNKIILDNHEINFSGTLNGGNGFVSLTFSILEGINAVIEVDLLSKSYKVLISGELKTLMANSNSVQQKIDYIGLNSELQKNIPYSFMDDKGKENGFINCSTKEGLFVSELSDVVLISKVYMDNSKPLFGYCSNDLKDVKVITKDDVIILTGYYLKDDIKISLSFTIQDENTIKLNGVYLDENGVAEILKFMNKKGSTNTSDSLMSFLESMNIKSIFINSLQSNTKLILDTNFIISGTTSIGQFEFICDKDNNIQPYFIKFNTLETKYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVIISPNIYTDEINITPIYEANNTYPEVIVLDTNYISEKINININDLSIRYVWSNDGSDFILMSTDEENKVSQVKIRFTNVFKGNTISDKISFNFSDKQDVSINKVISTFTPSYYVEGLLNYDLGLISLYNEKFYINNFGMMVSGLVYINDSLYYFKPPIKNLITGFTTIGDDKYYFNPDNGGAASVGETIIDGKNYYFSQNGVLQTGVFSTEDGFKYFAPADTLDENLEGEAIDFTGKLTIDENVYYFGDNYRAAIEWQTLDDEVYYFSTDTGRAFKGLNQIGDDKFYFNSDGIMQKGFVNINDKTFYFDDSGVMKSGYTEIDGKYFYFAENGEMQIGVFNTADGFKYFAHHDEDLGNEEGEALSYSGILNFNNKIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGISIINDGKYYFNDSGIMQIGFVTINNEVFYFSDSGIVESGMQNIDDNYFYIDENGLVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFDPETKKAYKGINVIDDIKYYFDENGIMRTGLITFEDNHYYFNEDGIMQYGYLNIEDKTFYFSEDGIMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID NO:5-艰难梭菌毒素A 542-1850(毒素类型O)
LSEDNGVDFNKNTALDKNYLLNNKIPSNNVEEAGSKNYVHYIIQLQGDDISYEATCNLFSKNPKNSIIIQRNMNESAKSYFLSDDGESILELNKYRIPERLKNKEKVKVTFIGHGKDEFNTSEFARLSVDSLSNEISSFLDTIKLDISPKNVEVNLLGCNMFSYDFNVEETYPGKLLLSIMDKITSTLPDVNKNSITIGANQYEVRINSEGRKELLAHSGKVVINKEEAIMSDLSSKEYIFFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIESSIGDYIYYEKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSVRFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDVNGNLLDNIQLDHTSQVNTLNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQLVNLISNAVNDTINVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAATVASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLSESKKYGPLKTEDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPSISSHIPSLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENDGTRLLDSIRDLYPGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEIRNKLSYSFDGAGGTYSLLLSSYPISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKDVLSKIDINKNKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISNLSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNDSTLEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNESVYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVEFICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVVVEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYGIDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWSTEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIEFNL
SEQ ID NO:6-艰难梭菌毒素A 542-1850(毒素类型3)
LSEDNGVDFNKNTALDKNYLLNNKIPSNNVEEAGSKNYVHYIIQLQGDDISYEATCNLFSKNPKNSIIIQRNMNESAKSYFLSDDGESILELNKYRIPERLKNKEKVKVTFIGHGKDEFNTSEFARLSVDSLSNEISSFLDTIKLDISPKNVEVNLLGCNMFSYDFNVEETYPGKLLLSIMDKITSTLPDVNKDSITIGANQYEVRINSEGRKELLAHSGKWINKEEAIMSDLSSKEYIFFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIESSIGDYIYYEKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSVRFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDVNGNLLDNIQLDHTSQVNTLNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQLVNLISNAVNDTINVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAATVASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLSESKEYGPLKTEDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPYISSHIPSLSVYSAIGIKTENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENNGTKLLDSIRDLYPGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNTKIKLDKDTRNFIMPTITTDEIRNKLSYSFDGAGGTYSLLLSSYPISMNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGNLIEDVLSKIDINKNKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISNLSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNGSTLEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNESVYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLNNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVEFICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVVVEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYGIDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWS
TEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIESNL
SEQ ID NO:7-艰难梭菌毒素A 542-1850(毒素类型O)半胱氨酸蛋白酶阴性
LSEDNGVDFNKNTALDKNYLLNNKIPSNNVEEAGSKNYYHYIIQLQGDDISYEATCNLFSKNPKNSIIIQRNMNESAKSYFLSDDGESILELNKYRIPERLKNKEKVKVTFIGHGKDEFNTSEFARLSVDSLSNEISSFLDTIKLDISPKNVEVNLLGANMFSYDFNVEETYPGKLLLSIMDKITSTLPDVNKNSITIGANQYEVRINSEGRKELLAHSGKWINKEEAIMSDLSSKEYIFFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIESSIGDYIYYEKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSVRFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDVNGNLLDNIQLDHTSQVNTLNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQLVNLISNAVNDTINVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAATVASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLSESKKYGPLKTEDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPSISSHIPSLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENDGTRLLDSIRDLYPGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEIRNKLSYSFDGAGGTYSLLLSSYPISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKDVLSKIDINKNKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISNLSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNDSTLEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNESVYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVEFICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVVVEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYGIDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWSTEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIEFNL
SEQ ID NO:8-艰难梭菌毒素A 770-1850
MSDLSSKEYIFFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIESSIGDYIYYEKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSVRFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDVNGNLLDNIQLDHTSQVNTLNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQLVNLISNAVNDTINVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAATVASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLSESKKYGPLKTEDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHIVTGNIDHFFSSPSISSHIPSLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENDGTRLLDSIRDLYPGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEIRNKLSYSFDGAGGTYSLLLSSYPISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKDVLSKIDINKNKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISNLSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNDSTLEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNESVYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVEFICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVVVEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYGIDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWSTEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIEFNL
SEQ ID NO:9-艰难梭菌毒素A 1130-1850
SESKKYGPLKTEDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPSISSHIPSLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENDGTRLLDSIRDLYPGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEIRNKLSYSFDGAGGTYSLLLSSYPISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKDVLSKIDINKNKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISNLSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNDSTLEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNESVYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVEFICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVVVEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYGIDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVINPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWSTEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIEFNL
SEQ ID NO:10-艰难梭菌毒素B(毒素类型O)543-1852
LGEDDNLDFSQNIVVDKEYLLEKISSLARSSERGYIHYIVQLQGDKISYEAACNLFAKTPYDSVLFQKNIEDSEIAYYYNPGDGEIQEIDKYKIPSIISDRPKIKLTFIGHGKDEFNTDIFAGFDVDSLSTEIEAAIDLAKEDISPKSIEINLLGCNMFSYSINVEETYPGKLLLKVKDKISELMPSISQDSIIVSANQYEVRINSEGRRELLDHSGEWINKEESIIKDISSKEYISFNPKENKITVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLTECEINVISNIDTQIVEERIEEAKNLTSDSINYIKDEFKLIESISDALCDLKQQNELEDSHFISFEDISETDEGFSIRFINKETGESIFVETEKTIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDTTHEVNTLNAAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKVVELVSTALDETIDLLPTLSEGLPIIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLTTATTAIITSSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELVLRDKATKVVDYFKHVSLVETEGVFTLLDDKIMMPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHLSIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGEFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREKLSYSFYGSGGTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNVVRDVTIESDKIKKGDLIEGILSTLSIEENKIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNSNHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDVVLISKVYMDDSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYYLKDDIKISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDESGVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFVNFLQSNIKFILDANFIISGTTSIGQFEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVVISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKINVNINDLSIRYVWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFTPSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNL
SEQ ID NO:11-艰难梭菌毒素B(毒素类型3)543-1852
LGEDDNLDFSQNTVVDKEYLLEKISSLARSSERGYIHYIVQLQGDKISYEAACNLFAKTPYDSVLFQKNIEDSEIAYYYNPGDGEIQEIDKYKIPSIISDRPKIKLTFIGHGKDEFNTDIFAGLDVDSLSTEIETAIDLAKEDISPKSIEINLLGCNMFSYSVNVEETYPGKLLLRVKDKVSELMPSISQDSIIVSANQYEVRINSEGRRELLDHSGEWINKEESIIKDISSKEYISFNPKENKIIVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLAECEINVISNIDTQVVEGRIEEAKSLTSDSINYIKNEFKLIESISDALYDLKQQNELEESHFISFEDILETDEGFSIRFIDKETGESIFVETEKAIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDATHEVNTLNAAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKVVELVSTALDETIDLLPTLSEGLPVIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLTAATTAIITSSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELILRDKATKVVDYFSHISLAESEGAFTSLDDKIMMPQDDLVISEIDFNNNSITLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHLSIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGEFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPVITTEYIREKLSYSFYGSGGTYALSLSQYNMNINIELNENDTWVIDVDNVVRDVTIESDKIKKGDLIENILSKLSIEDNKIILDNHEINFSGTLNGGNGFVSLTFSILEGINAVIEVDLLSKSYKVLISGELKTLMANSNSVQQKIDYIGLNSFLQKNIPYSFMDDKGKENGFINCSTKEGLFVSELSDVVLISKVYMDNSKPLFGYCSNDLKDVKVITKDDVIILTGYYLKDDIKISLSFTIQDENTIKLNGVYLDENGVAEILKFMNKKGSTNTSDSLMSFLESMNIKSIFINSLQSNTKLILDTNFIISGTTSIGQFEFICDKDNNIQPYFIKFNTLETKYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVIISPNIYTDEINITPIYEANNTYPEVIVLDTNYISEKINININDLSIRYVWSNDGSDFILMSTDEENKVSQVKIRFTNVFKGNTISDKISFNFSDKQDVSINKVISTFTPSYYVEGLLNYDLGLISLYNEKFYINNFGMMVSGLVYINDSLYYFKPPIKNL
SEQ ID NO:12-艰难梭菌毒素B 543-1852半胱氨酸蛋白酶阴性
LGEDDNLDFSQNIVVDKEYLLEKISSLARSSERGYIHYIVQLQGDKISYEAACNLFAKTPYDSVLFQKNIEDSEIAYYYNPGDGEIQEIDKYKIPSIISDRPKIKLTFIGHGKDEFNTDIFAGFDVDSLSTEIEAAIDLAKEDISPKSIEINLLGANMFSYSINVEETYPGKLLLKVKDKISELMPSISQDSIIVSANQYEVRINSEGRRELLDHSGEWINKEESIIKDISSKEYISFNPKENKITVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIFLEEKVMLTECEINVISNIDTQIVEERIEEAKNLTSDSINYIKDEFKLIESISDALCDLKQQNELEDSHFISFEDISETDEGFSIRFINKETGESIFVETEKTIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDTTHEVNTLNAAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKVVELVSTALDETIDLLPTLSEGLPIIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLTTATTAIITSSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELVLRDKATKVVDYFKHVSLVETEGVFTLLDDKIMMPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHLSIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWFTGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGEFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREKLSYSFYGSGGTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNVVRDVTIESDKIKKGDLIEGILSTLSIEENKIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNSNHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDVVLISKVYMDDSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYYLKDDIKISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDESGVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFVNFLQSNIKFILDANFIISGTTSIGQFEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVVISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKINVNINDLSIRYVWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFTPSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNL
SEQ ID NO:13-艰难梭菌毒素B 767-1852
SIIKDISSKEYISFNPKENKITVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLTECEINVISNIDTQIVFERIEEAKNLTSDSINYIKDEFKLIESISDALCDLKQQNELEDSHFISFEDISETDEGFSIRFINKETGESIFVETEKTIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDTTHEVNTLNAAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKVVELVSTALDETIDLLPTLSEGLPIIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLTTATTAIITSSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELVLRDKATKVVDYFKHVSLVETEGVFTLLDDKIMMPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHLSIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGEFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREKLSYSFYGSGGTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNVVRDVTIESDKIKKGDLIEGILSTLSIEENKIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNSNHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDVVLISKVYMDDSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYYLKDDIKISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDESGVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFVNFLQSNIKFILDANFIISGTTSIGQFEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVVISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKINVNINDLSIRYVWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFTPSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNL
SEQ ID NO:14-艰难梭菌毒素B 1145-1852
MPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHLSIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGEFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREKLSYSFYGSGGTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNVVRDVTIESDKIKKGDLIEGILSTLSIEENKIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNSNHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDVVLISKVYMDDSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYYLKDDIKISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDESGVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFVNFLQSNIKFILDANFIISGTTSIGQFEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVVISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKINVNINDLSIRYVWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFTPSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNL
SEQ ID NO:15-艰难梭菌毒素B 1350-1852
NVVRDVTIESDKIKKGDLIEGILSTLSIEENKIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNSNHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDVVLISKVYMDDSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYYLKDDIKISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDESGVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFVNFLQSNIKFILDANFIISGTTSIGQFEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVVISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKINVNINDLSIRYVWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFTPSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNL
SEQ ID NO:16-来自艰难梭菌CD2767的氨基酸残基27401的蛋白结构域
SNDKEMRAAWISTVYNLDWPKTKNNEAKQKKEYTDLLDKLKSVGINTAVVQVRPKSDALYKSNINPWSEYLTGTQGKDPGYDPLPFLIEEAHKRGMEFHAWFNPYRITMADESIDKLPANHPAKKNPSWVVKHGNKYYYDPGLPEVRKYIVDSIAEVVQNYDIDGVHFDDYFYPGVSFNDTATYQKYGKGQNKDDWRRENVNTLLRDVKASIKSIKPNVVFGVSPAGIWRNKSSDPTGSDTSGNESYVGTYADTRAWIKQGLIDYVVPQLYWPIGLKAADYSKLVAWWANEVKGTNVDLYIGQGIYKQGQSSYGGQNIAKEIVQQVTLNRKYSEIKGSMYFSAKDIANSTSIQKDLKSLYSSSEEPVTPPSNVKV
SEQID NO:17-表达构建体中的CD2767(27401)毒素A(5421850)-融合蛋白
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSNDKEMRAAWISTVYNLDWPKTKNNEAKQKKEYTDLLDKLKSVGINTAVVQVRPKSDALYKSNINPWSEYLTGTQGKDPGYDPLPFLIEEAHKRGMEFHAWFNPYRITMADESIDKLPANHPAKKNPSWVVKHGNKYYYDPGLPEVRKYIVDSIAEVVQNYDIDGVHFDDYFYPGVSFNDTATYQKYGKGQNKDNWRRENVNTLLRDVKASIKSIKPNVVFGVSPAGIWRNKSSDPTGSDTSGNESYVGTYADTRAWIKQGLIDYVVPQLYWPIGLKAADYSKLVAWWANEVKGTNVDLYIGQGIYKQGQSSYGGQNIAKEIVQQVTLNRKYSEIKGSMYFSAKDIANSTSIQKDLKSLYSSSEEPVTPPSNVKVAAAPFTLSEDNGVDFNKNTALDKNYLLNNKIPSNNVEEAGSKNYVHYIIQLQGDDISYEATCNLFSKNPKNSIIIQRNMNESAKSYFLSDDGESILELNKYRIPERLKNKEKVKVTFIGHGKDEFNTSEFARLSVDSLSNEISSFLDTIKLDISPKNVEVNLLGSNMFSYDFNVEETYPGKLLLSIMDKITSTLPDVNKNSITIGANQYEVRINSEGRKELLAHSGKWINKEEAIMSDLSSKEYIFFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIESSIGDYIYYEKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSVRFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDVNGNLLDNIQLDHTSQVNTLNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQLVNLISNAVNDTINVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAATVASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLSESKKYGPLKTEDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPSISSHIPSLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENDGTRLLDSIRDLYPGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEIRNKLSYSFDGAGGTYSLLLSSYPISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKDVLSKIDINKNKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISNLSNIIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNDSTLEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNESVYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVEFICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVVVEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYGIDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWSTEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIEFNL
SEQ ID NO:18-表达构建体中的CD2767(27401)毒素6(767-1852)-融合蛋白
SNDKEMRAAWISTVYNLDWPKTKNNEAKQKKEYTDLLDKLKSVGINTAVVQVRPKSDALYKSNINPWSEYLTGTQGKDPGYDPLPFLIEEAHKRGMEFHAWFNPYRITMADESIDKLPANHPAKKNPSWVVKHGNKYYYDPGLPEVRKYIVDSIAEVVQNYDIDGVHFDDYFYPGVSFNDTATYQKYGKGQNKDDWRRENVNTLLRDVKASIKSIKPNVVFGVSPAGIWRNKSSDPTGSDTSGNESYVGTYADTRAWIKQGLIDYVVPQLYWPIGLKAADYSKLVAWWANEVKGTNVDLYIGQGIYKQGQSSYGGQNIAKEIVQQVTLNRKYSEIKGSMYFSAKDIANSTSIQKDLKSLYSSSEEPVTPPSNVKVSIIKDISSKEYISFNPKENKITVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLTECEINVISNIDTQIVEERIEEAKNLTSDSINYIKDEFKLIESISDALCDLKQQNELEDSHFISFEDISETDEGFSIRFINKETGESIFVETEKTIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDTTHEVNTLNAAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKVVELVSTALDETIDLLPTLSEGLPIIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLTTATTAIITSSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELVLRDKATKVVDYFKHVSLVETEGVFTLLDDKIMMPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHLSIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGEFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREKLSYSFYGSGGTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNVVRDVTIESDKIKKGDLIEGILSTLSIEENKIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNSNHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDVVLISKVYMDDSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYYLKDDIKISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDESGVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFVNFLQSNIKFILDANFIISGTTSIGQFEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVVISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKINVNINDLSIRYVWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFTPSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNL
SEQ ID NO:19-在构建体:6His硫氧还蛋白-TxACPD中的毒素A(残基542-1850;TxACPD)
MGSSHHHHHHSHMASDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLARALVPRGSVTSLYKKAGSAAAPFTLSEDNGVDFNKNTALDKNYLLNNKIPSNNVEEAGSKNYVHYIIQLQGDDISYEATCNLFSKNPKNSIIIQRNMNESAKSYFLSDDGESILELNKYRIPERIKNKEKVKVTFIGHGKDEFNTSEFARLSVDSLSNEISSFLDTIKLDISPKNVEVNLLGSNMFSYDFNVEETYPGKLLLSIMDKITSTLPDVNKNSITIGANQYEVRINSEGRKEILAHSGKWINKEEAIMSDLSSKEYIFFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIESSIGDYIYYEKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSVRFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDVNGNLLDNIQLDHTSQVNTLNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQLVNLISNAVNDTINVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAATVASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLSESKKYGPLKTEDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPSISSHIPSLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENDGTRLLDSIRDLYPGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEIRNKLSYSFDGAGGTYSLLLSSYPISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKDVLSKIDINKNKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISNLSNIIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNDSTLEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNESVYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVEFICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVVVEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYGIDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWSTEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIEFNL
SEQ ID 20-在构建体:6His硫氧还蛋白-TxBc中的毒素B(残基767-1852;TxBc)
MGSSHHHHHHSHMASDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLARALVPRGSVTSLYKKAGSAAAPFTSIIKDISSKEYISFNPKENKITVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLTECEINVISNIDTQIVEERIEEAKNLTSDSINYIKDEFKLIESISDALCDLKQQNELEDSHFISFEDISETDEGFSIRFINKETGESIFVETEKTIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDTTHEVNTLNAAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKVVELVSTALDETIDLLPTLSEGLPIIATIIDGVSLGAAIKELSFTSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLTTATTAIITSSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELVLRDKATKVVDYFKHVSLVETEGVFTLLDDKIMMPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHLSIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGEFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREKLSYSFYGSGGTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNVVRDVTIESDKIKKGDLIEGILSTLSIEENKIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNSNHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDVVLISKVYMDDSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYYLKDDIKISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDESGVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFVNFLQSNIKFILDANFIISGTTSIGQFEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVVISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKINVNINDLSIRYVWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFTPSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNLKGGRADPAFLYKVVSAWSHPQFEK
Claims (21)
1.一种多肽,所述多肽由以下组成或包含以下:具有与由艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素A序列或艰难梭菌毒素B序列的残基1500-1700组成的氨基酸序列的至少80%序列同一性的氨基酸序列;
条件是,所述多肽不包含位于在艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366之间的一个或更多个重复单元(RU)。
2.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽由以下组成或包括以下:具有与由艰难梭菌毒素A序列或艰难梭菌毒素B序列的残基1450-1750组成的氨基酸序列的至少80%序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多肽,其中所述多肽由以下组成或包括以下:具有与由艰难梭菌毒素A序列或艰难梭菌毒素B序列的残基1400-1800组成的氨基酸序列的至少80%序列同一性的氨基酸序列。
4.根据任一项前述权利要求所述的多肽,其中所述多肽不包含由艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的氨基酸残基1853-2366提供的氨基酸序列。
5.根据任一项前述权利要求所述的多肽,其中所述多肽由以下组成或包括以下:具有与由艰难梭菌毒素A序列的残基1330-1850或770-1850或542-1850组成的氨基酸序列的至少80%序列同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-4的任一项所述的多肽,其中所述多肽由以下组成或包括以下:具有与由艰难梭菌毒素B序列的残基1145-1852或767-1852或543-1852组成的氨基酸序列的至少80%序列同一性的氨基酸序列。
7.根据任一项前述权利要求所述的多肽,其中所述多肽还包含选自以下的一个或更多个的第二氨基酸序列:细菌表层蛋白、NusA、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、泛素样肽、以及任何所述第二氨基酸序列的片段。
8.根据权利要求7所述的多肽,其中所述第二氨基酸序列包括艰难梭菌表层蛋白。
9.根据权利要求8所述的多肽,其中所述艰难梭菌表层蛋白由以下组成或包括以下:CD 2767肽,例如由以下组成或包括以下的肽:具有与CD6767肽的氨基酸残基27-401的至少80%序列同一性的氨基酸序列。
10.根据任一项前述权利要求所述的多肽,用于在产生结合于艰难梭菌毒素A和/或艰难梭菌毒素B的抗体的方法中用作抗原;
优选地其中所述抗体包括完整IgG、Fab抗体或F(ab’)2抗体。
11.一种用于体外分离结合于艰难梭菌毒素A和/或艰难梭菌毒素B的抗体的方法,所述方法包括
a)在表面上(例如在柱内的基质上)固定一种或更多种根据权利要求1-7的任一项的艰难梭菌多肽;
b)使所固定的多肽与包含结合于艰难梭菌毒素A和/或毒素B的抗体的溶液接触;
c)允许所述抗体结合于所述多肽,由此形成抗体和多肽的结合复合物;
d)洗去任何未结合的抗体或蛋白质;以及
e)从所述表面洗脱结合的抗体,由此提供亲和纯化的抗体。
12.一种结合于艰难梭菌毒素A和/或艰难梭菌毒素B的抗体,其中所述抗体是通过根据权利要求8或权利要求9的方法可获得的,并且其中所述抗体基本上不与艰难梭菌毒素A或毒素B的效应器结构域结合,和/或基本上不与艰难梭菌毒素A或毒素B的RU结合;
优选地其中所述抗体包括完整IgG、Fab抗体或F(ab’)2抗体。
13.根据权利要求12所述的抗体,其中所述抗体与由以下呈递的表位结合:艰难梭菌毒素A的残基1350-1850或1130-1850或770-1850或542-1185和/或艰难梭菌毒素B的残基1350-1852或1145-1852或767-1852或543-1852。
14.根据权利要求1-9的任一项所述的多肽和/或根据权利要求12或权利要求13所述的抗体,用于在预防、治疗或抑制哺乳动物(例如,人)中的CDI中使用。
15.一种用于预防、治疗或抑制哺乳动物(例如,人)中的CDI的方法,所述方法包括向所述人施用治疗有效量的根据权利要求1-9的任一项的多肽和/或根据权利要求12或权利要求13的抗体。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述多肽作为与选自以下的一种或更多种另外的抗原的组合治疗的一部分被施用:艰难梭菌非毒素抗原、灭活的或减毒的完整细胞艰难梭菌细菌、和/或艰难梭菌细胞提取物;以及
a.任选地选自以下的一种或更多种抗原:1)来自导致医院内感染的细菌的抗原,以及2)导致医院内感染的灭活的或减毒的完整细胞细菌;以及
b.任选地一种或更多种抗生素,诸如针对导致医院内感染的细菌有效的抗生素。
17.根据权利要求15所述的方法,其中所述抗体作为与选自以下的一种或更多种另外的抗体的组合治疗的一部分被施用:结合于艰难梭菌非毒素抗原的抗体、以及结合于完整细胞艰难梭菌细菌的抗体;以及
a.任选地选自以下的一种或更多种抗体:1)结合于来自导致医院内感染的细菌的抗原的抗体,以及2)结合于导致医院内感染的完整细胞细菌的抗体;以及
b.任选地一种或更多种抗生素,诸如针对导致医院内感染的细菌有效的抗生素。
18.根据权利要求14使用的多肽,其中所述使用包括施用所述多肽作为与选自以下的一种或更多种另外的抗原的组合治疗的一部分:艰难梭菌非毒素抗原、灭活的或减毒的完整细胞艰难梭菌细菌、和/或艰难梭菌细胞提取物;以及
a.任选地选自以下的一种或更多种抗原:1)来自导致医院内感染的细菌的抗原,以及2)导致医院内感染的灭活的或减毒的完整细胞细菌;以及
b.任选地一种或更多种抗生素,诸如针对导致医院内感染的细菌有效的抗生素。
19.根据权利要求14使用的抗体,其中所述使用包括施用所述抗体作为与选自以下的一种或更多种另外的抗体的组合治疗的一部分:结合于艰难梭菌非毒素抗原的抗体、以及结合于完整细胞艰难梭菌细菌的抗体;以及
a.任选地选自以下的一种或更多种抗体:1)结合于来自导致医院内感染的细菌的抗原的抗体,以及2)结合于导致医院内感染的完整细胞细菌的抗体;以及
b.任选地一种或更多种抗生素,诸如针对导致医院内感染的细菌有效的抗生素。
20.根据权利要求12或权利要求13的抗体在用于确定患者样品中艰难梭菌感染的存在或不存在的体外免疫测定方法中的用途,其中艰难梭菌感染的存在通过检测所述抗体与所述样品中存在的艰难梭菌毒素A和/或毒素B的结合来确定,并且其中未能检测到所述抗体与所述样品中存在的艰难梭菌毒素A和/或毒素B的结合确定艰难梭菌感染的不存在。
21.根据权利要求1-9的任一项的多肽在用于确定患者样品中艰难梭菌感染的存在或不存在的体外免疫测定方法中的用途,其中艰难梭菌感染的存在通过检测所述融合蛋白与所述样品中存在的抗体的结合来确定,并且其中未能检测到所述融合蛋白与所述样品中存在的抗体的结合确定艰难梭菌感染的不存在。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113329766A (zh) * | 2018-11-16 | 2021-08-31 | 马特里瓦克斯公司 | 艰难梭菌多组分疫苗 |
CN114126644A (zh) * | 2019-05-21 | 2022-03-01 | 加利福尼亚大学董事会 | 艰难梭菌的疫苗组合物 |
WO2023011267A1 (zh) * | 2021-08-04 | 2023-02-09 | 河北医科大学第二医院 | 一种艰难梭菌特异性抗原肽 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2867375T3 (es) | 2010-09-03 | 2021-10-20 | Valneva Austria Gmbh | Polipéptido aislado de las proteínas de la toxina A y la toxina B de C. difficile y sus usos |
GB201206070D0 (en) * | 2012-04-04 | 2012-05-16 | Health Prot Agency | Clostridium difficile antigens |
CA2915279A1 (en) | 2013-06-14 | 2014-12-18 | Sanofi Pasteur Inc. | Compositions and methods of immunizing against c. difficile |
BR112017024443A2 (pt) * | 2015-05-15 | 2018-10-23 | Sanofi Pasteur Inc | métodos para imunização contra clostridium difficile |
CN109311950A (zh) * | 2016-03-21 | 2019-02-05 | 儿童医学中心公司 | 用于抑制wnt信号传导的组合物和方法 |
WO2019143552A1 (en) * | 2018-01-16 | 2019-07-25 | Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods for inhibiting wnt signaling |
WO2020231930A1 (en) * | 2019-05-11 | 2020-11-19 | The Texas A&M University System | Protein inhibitors of clostridium difficile toxin b |
WO2023143559A1 (en) * | 2022-01-30 | 2023-08-03 | Westlake University | Tfpi binding polypeptides and uses thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000061762A1 (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Techlab, Inc. | RECOMBINANT TOXIN A/TOXIN B VACCINE AGAINST $i(CLOSTRIDIUM DIFFICILE) |
WO2008014733A1 (de) * | 2006-08-02 | 2008-02-07 | Johannes Gutenberg-Universität Mainz | Arzneimittel gegen lct-vergiftungen |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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HUE024962T2 (en) | 2004-02-06 | 2016-02-29 | Univ Massachusetts | Antibodies to Clostridium difficile toxins and their uses |
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MX339253B (es) | 2010-04-15 | 2016-05-18 | Progenics Pharm Inc | Anticuerpos para el tratamiento de infeccion y enfermedad asociadas con clostridium dificile. |
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GB201206070D0 (en) * | 2012-04-04 | 2012-05-16 | Health Prot Agency | Clostridium difficile antigens |
-
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2016
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000061762A1 (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Techlab, Inc. | RECOMBINANT TOXIN A/TOXIN B VACCINE AGAINST $i(CLOSTRIDIUM DIFFICILE) |
WO2008014733A1 (de) * | 2006-08-02 | 2008-02-07 | Johannes Gutenberg-Universität Mainz | Arzneimittel gegen lct-vergiftungen |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
A.ROBERTS ET AL: "Development and evaluation of an voine antibody-based platform for treatment of clostridium difficile infection", 《INFECTION AND IMMUNITY》 * |
GENTH H ET AL: "New method to generate enzymatically deficient Clostridium difficile toxin B as an antigen for immunization", 《INFECTION AND IMMUNITY,AMERICAN SOCIETY FOR MACROBILOGY,USA》 * |
JOHN A. KINK ET AL: "Antibodies to Recombinant Clostridium difficile Toxins A and B Are an Effective Treatment and Prevent Relapse of C. difficile-Associated Disease in a Hamster Model of Infection", 《INFECTION AND IMMUNITY》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113329766A (zh) * | 2018-11-16 | 2021-08-31 | 马特里瓦克斯公司 | 艰难梭菌多组分疫苗 |
CN114126644A (zh) * | 2019-05-21 | 2022-03-01 | 加利福尼亚大学董事会 | 艰难梭菌的疫苗组合物 |
WO2023011267A1 (zh) * | 2021-08-04 | 2023-02-09 | 河北医科大学第二医院 | 一种艰难梭菌特异性抗原肽 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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