WO1992019720A1 - Souches recombinantes immunogenes de b. anthracis - compositions immunogenes les contenant - Google Patents

Souches recombinantes immunogenes de b. anthracis - compositions immunogenes les contenant Download PDF

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WO1992019720A1
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anthracis
gene
strain
protein
recombinant
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Michèle Mock
Angel Cataldi
Corinne Pezard
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Institut Pasteur
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    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present application relates to recombinant immunogenic and non-toxicogenic strains of Bacillus anthracis and immunogenic compositions containing them.
  • Bacillus anthracis (B. anthracis) is responsible in animals and in humans for anthrax, which exists in cutaneous, respiratory and digestive forms. Severe forms of this disease can lead to the death of the infected person.
  • the pathogenicity of B. anthracis is expressed in two aspects: a toxic effect manifested by the appearance of edema, and a so-called lethal toxic effect which can lead to the death of the infected subject.
  • These effects are attributed to the presence in B. anthracis of three protein factors acting in combination by two. One of the three factors is present in both combinations and is involved in the binding of toxins from B. anthracis to the membrane of the host.
  • EF edematogenic factor
  • LF lethal factor
  • PA protective antigen
  • PA, LF and EF were purified (FISH et al 1968a J. Bacterial 95: 907-917) and the two toxins obtained by combining PA and LF on the one hand, PA and EF on the other hand have been described by LEPPLA et al (1982, PNAS - USA 79-3162-3166).
  • Another plasmid pX02 has been demonstrated in B. anthracis; it includes in particular the DNA sequences coding for the elements of the bacillus capsule.
  • CATALDI et al (Molecular Microbiology 1990 4 (7), 1111-1117) described the construction and the characterization of a strain of B. anthracis devoid of the plasmid pX02 and deprived of the antigen PA by modification of the plasmid pXOl.
  • CATALDI et al used a mobilizable shuttle vector, transferable by conjugation of E. coli to B. anthracis.
  • This vector included on the one hand the gene coding for the protein PA, mutated by deletion of a fragment of size less than 50 bp and on the other hand a reporter DNA cassette carrying a gene for resistance to 1 erythromycin (Erm r ) inserted at the site of the deletion.
  • the vector thus formed was introduced by conjugation into B. anthracis 7702 (Sterne strain) and the transconjugants having undergone homologous recombination between the vector introduced and the plasmid pXOL resulting in the introduction of an inactive pag gene into pXOL in place of the original pag gene, were selected.
  • the construction carried out made it possible to show that the absence of expression of PA is sufficient to completely abolish the lethal character of B. anthracis and also to confirm that PA plays a central role, allowing the penetration of EF or LF in eukaryotic cells.
  • PA is the main component among the factors of toxicity required for protection against B. anthracis and on the other hand that a live vaccine based on Sterne spores is more effective than an acellular preparation of AP.
  • the inventors of the present application have researched and developed immunogenic compositions capable of inducing protective antibodies in animals. Contrary to the case of the recombinant strain PA- of B. anthracis described in the aforementioned article by CATALDI et al, in which the mutation of the plasmid pXOl of B. anthracis related to an element not directly responsible for the toxicity, the inventors have issued the hypothesis that a B. anthracis strain devoid of at least one of its toxicity factors factor responsible for pathogenicity and generally involved in the reaction of production of protective antibodies, could enter in the constitution of an immunogenic and protective composition against B. anthracis.
  • the lethal factor LF is a potent immunogen (MOCK, Annales de 1'INSTITUT PASTEUR)
  • MOCK Annales de 1'INSTITUT PASTEUR
  • the inventors have in particular prepared and characterized a recombinant strain of B. anthracis in which the gene coding for the LF protein is mutated so that it is no longer expressed in the bacteria or so as to be expressed in the form of an inactive truncated protein. They found that the mutation of the plasmid pXOl at the lef gene level did not alter the functions other than those linked to the expression of LF in B. anthracis.
  • the invention therefore relates to a recombinant strain of B. anthracis, characterized by:
  • protective antibody denotes, within the framework of the invention, antibodies capable of conferring protection against virulent strains of B. anthracis, when they are produced in an animal or human host. They are therefore in particular neutralizing antibodies against B. anthracis.
  • the protein responsible for a toxic effect of the B. anthracis strain is called a protein which enters into the composition of a toxin and is necessary for the manifestation of either edema or lethal toxicity even if this effect results from the combination of the activities of several factors.
  • Two proteins correspond in particular to this definition: the EF protein and the LF protein which contribute to the formation of toxins, constituted in this case respectively by the combinations PA + EF and PA + LF.
  • the DNA cassette inserted into the deleted gene is a DNA sequence which makes it possible to verify the integration of the deleted gene into the plasmid pXOl, since this cassette is inserted at the level of the gene deletion site.
  • the mutation of the plasmid pXOl at the level of one of the genes coding for EF or LF is carried out in a particularly advantageous manner thanks to the implementation of an intermediate step involving a vector itself carrying the mutated cya or lef gene which by homologous recombination will make it possible to modify pXOl respectively at the level of the cya or lef gene. It is however understood that any technique making it possible to carry out the desired mutation of the cya gene or of the lef gene can be used, whether it is direct or not.
  • a first family of recombinant B. anthracis strains according to the invention corresponding to the preceding definition, is characterized in that, in addition to the preceding characteristics, the strain is devoid of the plasmid pX02.
  • This plasmid pX02 is in particular necessary for the formation of the B. anthracis capsule and its absence makes it possible to attenuate the virulence of the natural strain.
  • a recombinant strain of B. anthracis is a strain of which the lef gene of the plasmid pXOl, coding for the lethal protein LF is mutated.
  • Such a recombinant strain expresses the toxin formed by the combination PA + EF.
  • the LF protein is no longer expressed or is expressed in the form of an inactive protein.
  • This strain which will be designated in the following by LF strain " has been shown to be a stable strain in animals and capable of inducing protective antibodies against B. anthracis.
  • the inventors have noticed that a deletion at the level of the lef gene under the conditions set out above does not modify the properties of the bacterium apart from the absence of toxicity resulting from the modification at the level of the LF protein and does not is also not lethal to the bacteria.
  • a recombinant strain of B. anthracis which is particularly preferred in the context of the implementation of the invention is therefore characterized in that it is capable of expressing the proteins PA and EF and in that it does not express the LF protein.
  • the invention relates in particular to the strain LF " (RP10) deposited on May 2, 1991 at the CNCM (National Collection of Culture and Microorganisms) under the number 1-1095.
  • the recombinant strains of B. anthracis are characterized in that the mutated pXOl gene is the cya gene coding for the edematogenic protein EF.
  • the plasmid pXOl either does not express the EF protein, or expresses it in an inactive truncated form as regards its toxic nature.
  • a preferred strain EF " is the strain RP9 deposited on May 2, 1991 at the CNCM under the number 1-1094.
  • strains producing only the toxin PA + LF are obtained. Once the lethality of the LF protein can be controlled, these strains can be used for the production of immunogenic compositions.
  • the recombinant strain of B. anthracis entering one of the groups defined above is characterized in that the plasmid pXOl is further mutated at the level of the gene coding for the protein PA, in such a way that this protein is either not expressed in the recombinant strain, or is not functional in the recombinant strain, as regards its role in the toxic activity of the strain by attachment to the cell membranes of the host.
  • the strain formed produces only the EF protein or only the LF protein or one of these proteins accompanied by an inactive PA protein with regard to toxicity. Consequently, the induction of the toxic effect resulting from the penetration of B. anthracis into the cells via the PA protein cannot take place and the toxic effect due to LF or EF cannot be manifested.
  • a strain thus defined deficient in PA, at least in active form is the strain RP8 deposited at the CNCM under the number 1-1093, on May 2, 1991.
  • strains of interest in the context of the invention include a mutation in several of the protein factors involved in the pathogenicity of B. anthracis.
  • these strains can be "doubly mutant” and in this regard, we will mention the strains RP31 (EF + , LF “ , PA “ ), RP4 (LF + , EF “ , PA “ ) and RP42 (PA ⁇ EF “ , LF “ ).
  • the DNA cassette integrated into the recombinant B. anthracis strain at the level of pXO1 carries, according to a first embodiment of the invention, a gene for resistance to an antibiotic and in particular a gene for resistance to anamycin.
  • Other resistances o can be implemented, for example through resistance to erythro-ycine.
  • this cassette is provided with a metabolic marker and its presence in the recombinant strain is verified by a reaction of the enzyme-substrate type.
  • the cassette allows the selection of strains of B. anthracis which have undergone a mutation at pXOl level.
  • the deleted fragment of the gene involved in the toxic activity at pXOl level may consist of all or part of the cya gene or of the lef gene in particular.
  • the size of the deleted fragment is advantageously greater than 0.1 kb if the absence of production of the protein naturally encoded by the gene is sought, without taking into account the part of the gene essential for the expression of this protein.
  • the deleted fragment of the cya gene or of the lef gene is a fragment of at least 0.5 kb, preferably greater than 1 kb.
  • the deletion can relate to the promoter of the cya or lef genes but it also includes the deletion of a part of the coding sequence of the protein in order to avoid in particular any reversion of the deleted gene.
  • recombinant strains of B. anthracis can also be characterized by a mutation of the plasmid pXOl by mutation of the two genes lef or cya, according to what is described above for each of the genes. These strains can be used in the context of the invention for the production of protective antibodies.
  • the recombinant strain of B. anthracis is further characterized in that it further comprises a heterologous nucleic acid, if necessary mutated, coding for a determined immunogenic factor, under the control of regulatory elements allowing its expression in B. anthracis.
  • This heterologous gene codes for a so-called immunogenic factor, capable of driving the production of antibodies in a host to which the recombinant B. anthracis is administered.
  • This immunogenic factor can benefit, if appropriate, from the environment provided by B. anthracis in which it is expressed, to lead to the production of neutralizing antibodies.
  • the heterologous factor is immunogenic as such or is constituted by a hapten rendered immunogenic by virtue of its expression within B. anthracis and / or by virtue of its association with a carrier molecule.
  • the recombinant B. anthracis strain behaves as a vector of immunogenicity or as a carrier strain.
  • the heterologous sequence can be transferred into B. anthracis using a plasmid, in particular a replicable and mobilizable conjugation plasmid.
  • the recombinant strains of B. anthracis can be stored and used in the form of spores. Spores represent an interesting mode of conservation because of their transient latent nature. Once administered to the animal or human host these spores germinate to give the recombinant bacteria.
  • the invention also relates to an immunogenic composition allowing the production of neutralizing and protective antibodies against B. anthracis in the host to which it is administered, characterized in that it comprises, as active principle, a recombinant strain of B. anthracis according to the invention, in mixture with an acceptable pharmaceutical vehicle.
  • an immunogenic composition mention may be made of one which would include, as active principle, the strain RP42 or the strain RP9.
  • the invention also relates to a mixed vaccine composition characterized in that it comprises, as active principle, a recombinant strain of B. anthracis of the invention under conditions such that its administration to a determined host allows the production of protective antibodies both against infection with B. anthracis and against the organism from which the heterologous amino acid sequence originates.
  • compositions can be administered by injection or by any mode of administration usually used for vaccination.
  • they can also comprise an adjuvant making it possible to increase the level of the reaction.
  • the doses which can be administered in particular to animals, of these compositions, will be determined according to the animal which it is sought to protect. We considers that the administration of doses ranging from 10 to 100 times, or even more, the dose of Sterne strain used (10 6 strains in mice), can be considered.
  • a recombinant vector in particular chosen from vectors of the conjugative type capable of infecting both Gram-negative and Gram-positive bacteria, in particular E. coli and B. anthracis, stable and not integrative in B. anthracis and comprising at a site which is not essential for its replication, on the one hand a mutated sequence of at least one gene coding for a protein responsible for the toxic effect of the toxins of B.
  • anthracis such so that it does not allow the production of this protein or that this protein is produced in an inactive form with regard to the toxic effect
  • a DNA cassette capable of behaving like a reporter by example by conferring resistance to an antibiotic for example kanamycin or by allowing a metabolic reaction on a given substrate, when this vector is introduced into B. anthracis.
  • a preferred recombinant vector is the vector in which the mutated pXO1 gene is the cya gene. According to another advantageous embodiment of the invention, this recombinant vector comprises the lef gene mutated at the plasmid pXOl level.
  • plasmid pXOl is mutated at the level of two genes, for example at the level of the LF and PA genes, or EF and PA or EF and LF.
  • Vectors which are particularly advantageous for carrying out the invention are the plasmid PMMA110 and the plasmid pCPLUO.
  • the recombinant vector according to the invention can also contain, in addition to the sequences described above, a heterologous DNA coding for a determined immunogenic protein.
  • the invention further relates to a process for the preparation of a recombinant strain of B. anthracis corresponding to the above definitions, comprising the following steps:
  • DNA sequences coding for a protein responsible for the toxic effect of B. anthracis also fall within the scope of the invention, characterized in that they are mutated by deletion under conditions such as the protein for which they code. naturally is not produced or is produced in an inactive truncated form with regard to toxicity, in particular what it is the coding sequences of the lef gene or of the cya gene.
  • the invention also relates to the plasmid pXOl mutated according to what has been defined above at the level of the lef gene or the cya gene.
  • Other advantages and properties of the invention also appear in the figures and examples which follow.
  • Figure 1 diagram of the mutagenesis of the cya gene (A) and the lef gene (B)
  • FIG. 2 proteins contained in different supernatants of B. anthracis cultures analyzed by immunoblot and verification with anti EF (A /), anti LF (B /) or anti PA (C /) immunosera Samples 20 ⁇ g of:
  • the bacterial strains and the plasmids used are listed in Table I.
  • the shuttle conjugation vector between Escherichia coli and Bacillus anthracis is pAT18, used in these experiments to transform B. anthracis. It contains an erythromicin resistance gene capable of being expressed in both Gram negative and Gram positive bacteria.
  • E. coli L broth or L agar media were used to cultivate E. coli (Miller 1972, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory). B anthracis was cultivated routinely in a BHI medium (Difco laboratories) or in a NBY medium for the preparation of spores. An R medium (Ristroph and Ivins 1983, Inf. Imm. 39: 483-486) was used for the production of toxins. Antibiotics were used at the following concentration: ampicillin at 100 ⁇ g / ml in an E. coli culture; kanamycin at 50 ⁇ g / ml and 20 ⁇ g / ml respectively in cultures of E. coli and B. anthracis; erythromycin at 180 ⁇ g / ml and 10 ⁇ g / ml for cultures of E. coli and B. anthracis respectively. DNA techniques
  • pXOL was prepared according to the method of Green et al 1985 (Inf. Imm. 49: 291-297).
  • the preparation of plasmid DNA from E. coli and B. anthracis was carried out according to the method of Birnboim and Doly (Methods for recombinant DNA technology Maniatis et al 1982).
  • the DNA cassette conferring resistance to kanamycin was prepared using the Geneclean kit (Bio 101, La Jolla, California) after electrophoresis on agarose gel.
  • the recombinant shuttle plasmids were transferred by conjugation into B. anthracis 7702 (Sterne strain).
  • the filter conjugation system of Trieu Cuot et al (1987 FEMS Microbiology Letters 48, 289-294) was used according to the description of Cataldi et al. E. coli and B. anthracis were grown in L and BHI media. 5 10 8 E. coli cells and 10 8 B. anthracis cells were mixed, washed to remove the antibiotics and loaded onto a 0.45 ⁇ Millipore filter placed on BHI agar. After 15 hours of incubation at 37 ° C, the cells were resuspended and spread on a selective medium containing the appropriate antibiotics. The resistance of B.
  • anthracis to colicins E3 and D was used to select by donor donors sensitive to E. coli. Plasmid DNA was purified from the transconjugants and used to transform E. coli. Plasmids were tested for absence of rearrangements by analysis with restriction enzymes. Isolation of mutant strains of B. anthracis
  • the mutant strains of B. anthracis were obtained by culture for several generations in the absence of erythromycin but in the presence of kanamycin pcr select the recombination events between the mutated gene containing the cassette and pXOl and to select the strains having lost the recombinant plasmid.
  • all the clones tested resistant to kanamycin all were sensitive to erythromycin and devoid of plasmids.
  • the characterization of the recombinants was completed by preparing the DNA of pXOl and by subcloning the genes inactivated in pUC18 in E. coli.
  • the plasmid DNA was purified from the Kan r -Amp r transformants (kanamycin-resistant to ampicillin-resistant) and tested for the absence of rearrangements, by analysis with restriction enzymes.
  • Adenylate cyclase was tested in culture supernatants of B. anthracis in R media as described by Ladant 1988 (J Biol Chem 263: 2612-2618). The enzymatic activity is expressed in units / ml corresponding to 1 nM / min / ml.
  • B. anthracis spores For the preparation of B. anthracis spores, a colony is streaked on an NBY medium in inclined agar and incubated for 7 days at 30 ° C. Spore formation was checked by microscopic examination. 5ml of sterile distilled water was added to each tube. The spore suspension was transferred to a sterile tube incubated in water at 65 ° C for 30 minutes to kill any bacilli that may exist in this culture. The culture containing at least 90% of spores and 10 8 CFU / ml was collected by centrifugation and suspended in water (1/20 v / v of the original culture). The dilutions of all the spores were spread out for counting viable spores on a BHI agar medium. The set of spores was divided into aliquots in 5 ml and stored at 4 ° C.
  • the aliquots were diluted in physiological water and the dilutions were spread on a BHI agar dish for determination by counting the viability.
  • Uncontaminated female Swiss mice aged 3 to 6 weeks were supplied by the Saint Aubin Les Elboeuf laboratory, France. The animals were fed with sterilized water supplemented with vitamins (pH 3). Mortality was followed by inoculating subcutaneously (se) groups of 10 mice with appropriate dilutions of spore suspension (in a volume of 0.2 ml) obtained from the parental strain or mutants. Virulence was estimated by determining the 50% lethal dose (LD 50) in groups of mice 3 to 10 weeks old by the statistical method. The survival of the bacteria was followed in the tissues of the host by infecting the mice at the level of the right plantar pad (in a volume of 0.1 ml) with large doses of spore suspension coming from the tested strains.
  • LD 50 50% lethal dose
  • mice Groups of 5 mice were sacrificed at given intervals and their feet were sectioned, washed in sodium hypochloride solutions (1 min) to kill skin contaminants and with sterile PBS pH 7.2 (1 min ). Then 0.1 ml volumes of the serial dilutions (10 times) were spread on an agar mixture containing trypticase. The colonies were counted after 16 hours of incubation at 37 ° C and the results were expressed as the log 10 of bacterial counts per foot. At the same time the inflammation reaction induced in the plantar pad of infected mice was measured at given intervals using a caliper (Schelltaster, Hessen). RESULTS
  • the genes coding for the LF protein (lef gene) or for the EF protein (cya gene) were inactivated according to the Cataldi technique both by deletion and by insertion of a cassette resistant to kanamycin.
  • the constuction initially carried out in E. coli was transferred by conjugation into the Sterne 7702 strain of B. anthracis.
  • the cya clone and sequence gene was subcloned into E. coli in the plasmid pUC8 (pMM861).
  • the recombinant plasmid pMM861 (Labruyère et al 1990 Bioche istry 29: 4922-4928) coding for the cya locus was subjected to a partial enzymatic digestion at the Hind III site so as to create a Hind III deletion fragment of 1 Kb to inside the cya gene.
  • the plasmid was then cut at its unique BglII site in the gene and the 1 Kb DNA cassette conferring resistance to kanamycin was ligated to the plasmid.
  • the resulting recombinant plasmid pMMA862 was characterized from transformants E. coli Ampr, Kanr.
  • the lef gene is contained in a 3.5 Kb SacI-ClaI fragment of the plasmid pXOl from B. anthracis. This fragment was first cloned into pUCl ⁇ and has allowed to express the lef gene in E. coli cells carrying the corresponding plasmid pCPL11. The 3.5 Kb fragment was then inserted into pAT18 (pCPLlOO). The recombinant plasmid pCPLlOO was subjected to a partial enzymatic digestion with EcoRI so as to create an EcoRI deletion fragment of 0.8 Kb inside the gene.
  • the resulting plasmid was cut at its unique Xhol site inside lef and the Kan r cassette was ligated to the plasmid.
  • the corresponding recombinant plasmid pCPLUO was characterized from the transformants E. coli, Erm r , Kan 1 * .
  • the restriction enzyme profile of pCPLUO showed that the lef gene was mutated as desired.
  • B. anthracis 7702 PMMA110 and pCPLUO carrying respectively the mutated cya and lef genes made it possible to transform E. coli HB101 carrying pRK212.1 for mobilization.
  • the strategy of transformation by the vector developed by Trieu Cuot was used between E. coli and the B. anthracis 7702 strain of Sterne so as to transfer the DNA constructs made in E. coli to B. anthracis by conjugation.
  • the transfer frequencies were low (10 "8 ) of the B. anthracis Kan r , Erm r transconjugants were obtained.
  • the homologous recombination events between PMMA110 or pCPLUO and pXOl were then selected to verify the introduction of the gene Inactive cya or inactive lef gene in pXOl.
  • the transconjugants were cultivated over several generations without erythromycin (Erm) (antibiotic selection for the shuttle plasmid) but in the presence of kanamycin (Kan) (selective for the cassette).
  • the adenylate cyclase activity of the EF component was determined in different strains of B. anthracis (Table 2). No activity was detected in the culture supernatants of the mutant strain EF ", thus confirming 1" cya gene inactivation on pXOl. In the culture supernatant of the mutant strain LF "adenylate cyclase activity was the same (200 u / ml) than the activity usually found in the culture supernatants of strains 7702.
  • the mutant B. anthracis strains were then characterized by immunoblot analysis using a serum directed against PA, EF or LF.
  • the sera were obtained according to the procedure described in Materials and Methods.
  • the three proteins making up the two toxins of B. anthracis, PA, EF and LF are produced in B. anthracis 7702 when the bacteria are cultivated on an R medium under defined conditions.
  • No LF-related components were produced by the LF * mutant strains when PA and EF were produced.
  • no EF-related component was detected in the supernatants of the mutant strains.
  • EF " confirming the absence of adenylate cyclase activity in the culture supernatants of the EF mutants " (Table 2).
  • any components related to PA was detected while LF and EF were still produced.
  • mice were inoculated with different strains of B. anthracis (10 8 , 10 7 or 10 6 spores per mouse) in the right plantar pad. edema in the foot pad was measured with a caliper. results obtained are reported in FIG. 2.
  • the mutant strain LF " was capable of inducing edema of the skin like the strain Sterne 7702. On the contrary, the mutant strains of B. anthracis 7700 PA “ or EF " did not induce edema of the skin. For all strains of B. anthracis, the inflammation reaction increased 2 days after the injection (the mice died in this experiment, the LD 50 in the leg pad was stronger 10 8). When the mice were inoculated with 10 8 spores of strain 7702 Sterne edema was observed for 6 days, with the mutant strain LF 'edema was visible for 2 days only. with strain B.
  • subtilis MSY no inflammation reaction (10 6 , 10 7 or 10 8 spores in suspension) was observed Finally, to verify whether the induction of edema was dependent on bacterial survival in the mouse paw pad infected, a bacterial culture has been This was followed when the mice were inoculated with 10 8 spores of all the strains of B. anthracis tested.
  • pCPLlOO recombinant plasmid pATl ⁇ carrying the 3.5 kb Clal-Sacl DE fragment of PXOl encoding LF.
  • Erm r pCPLUO derivative of pCPLlOO carrying a Kan r cassette of 1.5 kb inserted into the structural gene
  • Erm r pMMA861 recombinant plasmid pUC8 carrying the 3.17 kb EcoRI-BamHI fragment of pXOl coding for EF (Mock 1987)
  • Amp r pMMA862 derivative of pMMA861 carrying the Kan r cassette of 1.5 kb inserted into the structural gene
  • Kan r pMMUO insert of 3.57 kb of pMMA861 DNA cloned into pATl ⁇ Erm r , Kan r B. anthracis 7702 Sterne strain 1939 J Vet Sci Ani
  • the lef gene is inactivated by insertion of the kanamycin resistance cassette (Kan R ).
  • the pag gene is inactivated by insertion of the erythromycin resistance cassette (Erm).
  • the pag gene is inactivated by insertion of the Erm R resistance cassette.
  • the cya gene is inactivated by insertion of the Kan resistance cassette.
  • the cya gene is inactivated by insertion of the Erm R resistance cassette.
  • the lef gene is inactivated by insertion of the Kan R resistance cassette.
  • mice received, subcutaneously, spores of RP42 (PA + , EF “ , LF “ ) and RP9 (PA + , EF + , LF “ ) a control batch of animals receiving nothing.
  • the challenge was achieved by subcutaneous injection of a lethal dose (1.5 ⁇ 10 ° spores) of the Sterne strain.

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Abstract

L'invention concerne une souche recombinante de B. anthracis, caractérisée: par sa capacité à induire chez un hôte animal ou humain, la production d'anticorps protecteurs contre des souches virulentes de B. anthracis, la mutation du plasmide pX01 d'au moins un gène donné codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, cette mutation résultant en: la délétion de tout ou partie de ce gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique et, l'insertion au niveau du site de délétion de ce gène dans pX01, d'une cassette d'ADN permettant la sélection de la souche ainsi modifiée et empêchant la réversion de la souche recombinante, le gène ainsi muté étant alors soit dépourvu de la capacité à produire la protéine responsable de l'effet toxique pour laquelle il code, soit capable de coder pour une protéine tronquée dépourvue de son caractère toxique. L'invention vise aussi l'utilisation d'une telle souche dans des compositions immunogènes

Description

Souches recombinantes immunogènes de
B. anthracis - Compositions immunogènes les contenant
La présente demande concerne des souches recombinantes immunogènes et non toxicogènes de Bacillus anthracis et des compositions immunogènes les contenant.
Bacillus anthracis (B. anthracis) est responsable chez l'animal et chez l'homme, de la maladie du charbon qui existe sous forme cutanée, respiratoire et digestive. Les formes graves de cette maladie peuvent conduire à la mort du sujet infecté. La pathogénicité de B. anthracis s'exprime selon deux aspects : un effet toxique se manifestant par l'apparition d'un oedème, et un effet toxique dit létal pouvant conduire à la mort du sujet infecté. Ces effets sont attribués à la présence dans B. anthracis de trois facteurs protéiques agissant en combinaison par deux. L'un des trois facteurs est présent dans les deux combinaisons et intervient dans la fixation des toxines de B. anthracis sur la membrane de l'hôte. Les deux autres facteurs protéiques constituent les éléments actifs responsables de la manifestation soit de l'effet toxique de type oedème soit de 1'effet toxique à caractère létal. Ces deux facteurs sont appelés respectivement facteur oedématogène (abréviation anglaise : EF) et facteur létal (abréviation anglaise : LF) .
Le facteur responsable de la fixation membranaire est appelé antigène protecteur (abréviation anglaise PA) car on lui avait initialement attribué la capacité de conférer une protection active contre la maladie, lors de tests d'immunisation.
Les trois facteurs PA, LF et EF ont été purifiés (FISH et al 1968a J. Bacterial 95: 907-917) et les deux toxines obtenues par combinaison de PA et LF d'une part, PA et EF d'autre part ont été décrites par LEPPLA et al (1982, PNAS - USA 79-3162-3166).
On savait également que les trois gènes pag, cya et lef codant respectivement pour les facteurs PA, EF et LF sont répartis sur un plasmide pXOl de B. anthracis décrit par MIKESELL P. et al (1983 Infect. Immun 39, 371-376) .
Un autre plasmide pX02 a été mis en évidence chez B. anthracis; il comporte notamment les séquences d'ADN codant pour les éléments de la capsule du bacille.
Les gènes pag, cya et lef ont été clones et séquences. Ces résultats ont été rapportés respectivement par WELKOS et al, 1988 dans Gène, 69: 287-300, par ESCUYER et al, 1988 dans Gène, 71: 293-298, et par BRAGG et al, 1989, Gène, 81: 45-54.
En outre CATALDI et al (Molecular Microbiology 1990 4(7), 1111-1117) ont décrit la construction et la caractérisation d'une souche de B. anthracis dépourvue du plasmide pX02 et dépourvue de 1'antigène PA par modification du plasmide pXOl.
Pour réaliser cette construction CATALDI et al ont utilisé un vecteur navette mobilisable, transférable par conjugaison de E. coli à B. anthracis. Ce vecteur comportait d'une part le gène codant pour la protéine PA, muté par délétion d'un fragment de taille inférieure à 50 bp et d'autre part une cassette d'ADN reporteur portant un gène de résistance à 1•érythromycine (Ermr) insérée au niveau du site de la délétion.
Le vecteur ainsi formé était introduit par conjugaison dans B. anthracis 7702 (Souche Sterne) et les transconjugants ayant subi une recombinaison homologue entre le vecteur introduit et le plasmide pXOl aboutissant à l'introduction d'un gène pag inactif dans pXOl à la place du gène pag d'origine, ont été sélectionnés.
Selon les auteurs de la publication, la construction réalisée a permis de montrer que l'absence d'expression de PA est suffisante pour abolir totalement le caractère létal de B. anthracis et aussi de confirmer que PA joue un rôle central, permettant la pénétration de EF ou de LF dans les cellules eucaryotes.
Selon les auteurs de cet article publié, des recherches complémentaires sont nécessaires pour donner des informations sur l'expression du caractère pathogène de B. anthracis et sur les éléments susceptibles d'intervenir dans 1'immunisation contre ce bacille.
Des données sur PA pouvant apparaître contradictoires étaient en effet disponibles dans 1•art antérieur, établissant d'une part que PA est le composant principal parmi les facteurs de la toxicité, requis pour la protection contre B. anthracis et d'autre part qu'un vaccin vivant à base de spores de souche Sterne est plus efficace qu'une préparation acellulaire de PA.
A partir de là les auteurs ont conclu à la nécessité de clarifier le rôle des composants des toxines ou d'autres antigènes pour rechercher quelle pourrait être une protection efficace contre des souches virulentes de B. anthracis.
D'après une autre publication (M. MOCK Annales de 1'INSTITUT PASTEUR, Décembre 1990) des analyses d'échantillons de sérum de patients infectés par B. anthracis ont permis de mettre en évidence des anticorps dirigés contre PA, EF et LF, ce dernier facteur déclenchant la réponse la plus importante. La conclusion de l'article est que LF est un immunogène puissant.
Les données disponibles tant sur la pathogénicité de B. anthracis que sur les éléments intervenant dans l'immunisation n'ont pas permis jusqu'à présent de réellement déterminer ce que pourrait être une composition vaccinante protectrice contre B. anthracis.
Les résultats connus jusqu'à présent permettaient d'envisager qu'une telle composition pouvait contenir des souches de B. anthracis vivantes. Cependant les résultats décrits dans les articles cités ci-dessus ne permettaient pas de définir dans quelles conditions ces souches devaient être utilisées pour tirer le bénéfice de leurs composants supposés immunogènes (en particulier LF selon l'article de MOCK) sachant que PA était reconnu comme jouant un rôle central parmi les facteurs de la toxicité, afin de déclencher la réponse immunitaire protectrice chez l'animal ou chez l'homme, ces souches étant en outre, non toxiques et stables chez l'hôte.
Les inventeurs de la présente demande ont recherché et mis au point des compositions immunogènes capables d'induire des anticorps protecteurs chez l'animal. Contrairement au cas de la souche recombinante PA- de B. anthracis décrite dans 1'article précité de CATALDI et al, dans lequel la mutation du plasmide pXOl de B. anthracis portait sur un élément non directement responsable de la toxicité, les inventeurs ont émis l'hypothèse selon laquelle une souche de B. anthracis dépourvue d'au moins l'un de ses facteurs de toxicité facteur responsable de la pathogénicité et généralement impliqué dans la réaction de production d'anticorps protecteurs, pourrait entrer dans la constitution d'une composition immunogène et protectrice contre B. anthracis.
En dépit de la constatation selon laquelle le facteur létal LF serait un immunogène puissant (MOCK, Annales de 1'INSTITUT PASTEUR) , les inventeurs ont notamment préparé et caractérisé une souche recombinante de B. anthracis dans laquelle le gène codant pour la protéine LF est muté de façon à ne plus être exprimé dans la bactérie ou de façon à s'exprimer sous la forme d'une protéine tronquée inactive. Ils ont constaté que la mutation du plasmide pXOl au niveau gène lef n'altérait pas les fonctions autres que celles liées à l'expression de LF dans B. anthracis.
De même ils ont montré qu'une mutation du gène cya responsable du second effet toxique, pouvait conduire à la production de souches de B. anthracis recombinantes intéressantes pour la préparation de vaccins.
En conséquence une modification des composants de la toxicité de B. anthracis conduisant à leur disparition ou à leur inactivation n'altère pas la potentialité de souches de B. anthracis d'être immunogènes et de protéger contre 1'infection par ce bacille.
L'invention concerne donc une souche recombinante de B. anthracis, caractérisée par :
- sa capacité à induire chez un hôte animal ou humain, la production d'anticorps protecteurs contre des souches virulentes de B. anthracis,
- la mutation d'au moins un gène donné sur le plasmide pXOl codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, cette mutation résultant en :
. la délétion de tout ou partie de ce gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique et, 1'insertion au niveau du site de délétion de ce gène dans pXOl, d'une cassette d'ADN permettant la sélection de la souche ainsi modifiée et empêchant la réversion de la souche recombinante, le gène ainsi muté étant alors soit dépourvu de la capacité à produire la protéine responsable de l'effet toxique pour laquelle il code, soit capable de coder pour une protéine tronquée dépourvue de son caractère toxique.
Le terme "anticorps protecteur" désigne dans le cadre de l'invention des anticorps capables de conférer une protection contre les souches virulentes de B. anthracis, lorsqu'ils sont produits chez un hôte animal ou humain. Ce sont donc en particulier des anticorps neutralisants vis à vis de B. anthracis.
On appelle protéine responsable d'un effet toxique de la souche B. anthracis, une protéine qui entre dans la composition d'une toxine et est nécessaire à la manifestation soit d'un oedème soit de la toxicité létale même si cet effet résulte de la combinaison des activités de plusieurs facteurs. Deux protéines répondent en particulier à cette définition : la protéine EF et la protéine LF qui contribuent à la formation des toxines, constituées respectivement dans ce cas par les combinaisons PA + EF et PA + LF.
La cassette d'ADN insérée dans le gène délété est une séquence d'ADN qui permet de vérifier l'intégration du gène délété dans le plasmide pXOl, puisque cette cassette est insérée au niveau du site de délétion du gène.
La délétion d'au moins une partie du gène codant pour la protéine à effet toxique empêche que la souche recombinante ainsi obtenue ne retrouve son état naturel d'origine par réversion, et par conséquent puisse à nouveau exprimer la protéine codée par le gène en question ou la produise sous une forme active.
La mutation du plasmide pXOl au niveau de 1'un des gènes codant pour EF ou LF est réalisée de façon particulièrement avantageuse grâce à la mise en oeuvre d'une étape intermédiaire faisant intervenir un vecteur portant lui même le gène cya ou lef muté qui par recombinaison homologue permettra de modifier pXOl respectivement au niveau du gène cya ou lef. Il est cependant entendu que toute technique permettant de procéder à la mutation recherchée du gène cya ou du gène lef peut être utilisée, qu'elle soit directe ou non.
Une première famille de souches recombinantes B. anthracis selon 1'invention répondant à la définition précédente, est caractérisée en ce que outre les caractéristiques précédentes, la souche est dépourvue du plasmide pX02. Ce plasmide pX02 est en particulier nécessaire à la formation de la capsule de B. anthracis et son absence permet d'atténuer la virulence de la souche naturelle.
On peut citer parmi les souches dépourvues de ce plasmide la souche Sterne 7702 décrite dans l'article de CATALDI et al (Molec. Microbiology 1990 4(7), 1111- 1117 et Sterne 1939 Onderstepoort J Vet Sci Ani Indust 13: 313-317).
Selon un premier mode de réalisation avantageux de l'invention, une souche recombinante de B. anthracis est une souche dont le gène lef du plasmide pXOl, codant pour la protéine létale LF est muté. Une telle souche recombinante exprime la toxine formée par la combinaison PA + EF. Dans ce cas la protéine LF n'est plus exprimée ou est exprimée sous forme d'une protéine inactive. Cette souche qui sera désignée dans la suite par souche LF" s'est avérée être une souche stable chez l'animal et capable d'induire des anticorps protecteurs contre B. anthracis.
Les inventeurs ont remarqué qu'une délétion au niveau du gène lef dans les conditions exposées ci- dessus, ne modifie pas les propriétés de la bactérie en dehors de l'absence de toxicité résultant de la modification au niveau de la protéine LF et n'est en outre pas létale pour la bactérie.
Une souche recombinante de B. anthracis particulièrement préférée dans le cadre de la mise en oeuvre de l'invention est donc caractérisée en ce qu'elle est capable d'exprimer les protéines PA et EF et en ce qu'elle n'exprime pas la protéine LF.
A cet égard l'invention concerne en particulier la souche LF" (RP10) déposée le 2 Mai 1991 à la CNCM (Collection Nationale de Culture et de Microorganismes) sous le numéro 1-1095.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention les souches recombinantes de B. anthracis sont caractérisées en ce que le gène muté de pXOl est le gène cya codant pour la protéine oedématogène EF.
Dans ce cas le plasmide pXOl soit n'exprime pas la protéine EF, soit l'exprime sous une forme tronquée inactive s'agissant de son caractère toxique.
Une souche EF" préférée est la souche RP9 déposée le 2 Mai 1991 à la CNCM sous le numéro 1-1094.
On obtient en particulier des souches produisant uniquement la toxine PA + LF. Dès lors que le caractère létal de la protéine LF peut être contrôlé, ces souches peuvent être utilisées pour la production de compositions immunogènes.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la souche recombinante de B. anthracis entrant dans l'un des groupes ci-dessus définis, est caractérisée en ce que le plasmide pXOl est en outre muté au niveau du gène codant pour la protéine PA, de façon telle que cette protéine soit n'est pas exprimée dans la souche recombinante, soit n'est pas fonctionnelle dans la souche recombinante, s'agissant de son rôle dans 1'activité toxique de la souche par fixation aux membranes cellulaires de l'hôte.
Conformément à ce mode de réalisation, la souche formée produit uniquement la protéine EF ou uniquement la protéine LF ou l'une de ces protéines accompagnées d'une protéine PA inactive s'agissant de la toxicité. En conséquence 1'induction de 1•effet toxique résultant de la pénétration de B. anthracis dans les cellules par 1'intermédiaire de la protéine PA ne peut avoir lieu et l'effet toxique dû à LF ou EF ne peut se manifester.
Une souche ainsi définie déficiente en PA, du moins sous forme active est la souche RP8 déposée à la CNCM sous le n°1-1093, le 2 Mai 1991.
D'autres souches intéressantes dans le cadre de l'invention, comportent une mutation au niveau de plusieurs des facteurs protéiques impliqués dans la pathogénicité des B. anthracis. En particulier ces souches peuvent être "doublement mutantes" et à cet égard on citera les souches RP31 (EF+, LF", PA") , RP4 (LF+, EF", PA") et RP42 (PA\ EF", LF") .
De telles souches peuvent donc être également intéressantes pour la production de vaccins.
La cassette d'ADN intégrée dans la souche B. anthracis recombinante au niveau de pXOl porte, selon un premier mode de réalisation de l'invention, un gène de résistance à un antibiotique et notamment un gène de résistance à la anamycine. D'autres résistances o peuvent être mises en oeuvre, par exemple par le biais de la résistance à l'érythro ycine.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, cette cassette est pourvue d'un marqueur métabolique et sa présence dans la souche recombinante est vérifiée par une réaction du type enzyme-substrat.
Quelle que soit sa nature la cassette permet la sélection des souches de B. anthracis ayant subi une mutation au niveau de pXOl.
Le fragment délété du gène impliqué dans l'activité toxique au niveau de pXOl peut être constitué par tout ou partie du gène cya ou du gène lef en particulier. La taille du fragment délété est avantageusement supérieure à 0,1 kb si l'on recherche l'absence de production de la protéine naturellement codée par le gène et ce sans tenir compte de la partie du gène indispensable à l'expression de cette protéine.
De façon avantageuse le fragment délété du gène cya ou du gène lef est un fragment d'au moins 0,5 kb de préférence supérieur à 1 kb. La délétion peut concerner le promoteur des gènes cya ou lef mais elle comprend aussi la délétion d'une partie de la séquence codante de la protéine afin d'éviter notamment toute réversion du gène délété.
Il est entendu que des souches recombinantes de B. anthracis peuvent également être caractérisées par une mutation du plasmide pXOl par mutation des deux gènes lef ou cya, selon ce qui est décrit plus haut pour chacun des gènes. Ces souches peuvent être mises en oeuvre dans le cadre de l'invention pour la production d*anticorps protecteurs.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la souche recombinante de B. anthracis est encore caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un acide nucléique héterologue le cas échéant muté, codant pour un facteur déterminé immunogène, sous le contrôle d'éléments de régulation permettant son expression dans B. anthracis.
Ce gène héterologue code pour un facteur dit immunogène, capable de conduire la production d'anticorps chez un hôte chez lequel B. anthracis recombinante est administrée. Ce facteur immunogène peut bénéficier le cas échéant de 1'environnement apporté par B. anthracis dans lequel il est exprimé, pour conduire à la production des anticorps neutralisants.
En d'autres termes le facteur héterologue est immunogène en tant que tel ou est constitué par un haptène rendu immunogène du fait de son expression au sein de B. anthracis et/ou du fait de son association à une molécule porteuse. Dans ce cas la souche recombinante de B. anthracis se comporte comme un vecteur de 1•immunogénicité ou une souche porteuse.
De façon intéressante on pourra donc associer dans B. anthracis les séquences nucléotidiques mutées du plasmide pXOl avec un acide nucléique héterologue codant pour toute séquence d'acides aminés susceptible de présenter un intérêt en médecine vétérinaire ou humaine du point de vue de la vaccination.
La séquence héterologue peut être transférée dans B. anthracis au moyen d'un plasmide, notamment d'un plasmide de conjugaison réplicable et mobilisable.
A la suite de son intégration dans B. anthracis cette séquence peut être maintenue sur ce plasmide exogène ou au contraire intégrée par exemple dans l'ADN plasmidique de pXOl dans des conditions n'affectant pas les caractéristiques de la souche recombinante modifiée selon ce qui précède au niveau de sa toxicité. De façon avantageuse les souches recombinantes de B. anthracis peuvent être conservées et utilisées sous forme de spores. Les spores représentent en effet un mode de conservation intéressant du fait de leur caractère transitoirement latent. Une fois administrées à l'hôte animal ou humain ces spores germent pour donner la bactérie recombinante.
L'invention a également pour objet une composition immunogène permettant la production d'anticorps neutralisants et protecteurs vis à vis de B. anthracis chez l'hôte auquel elle est administrée, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif une souche recombinante de B. anthracis selon l'invention, en mélange avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
A titre d'exemple de composition immunogène, on peut citer celle qui comprendrait, à titre de principe actif, la souche RP42 ou la souche RP9.
L'invention vise aussi une composition de vaccin mixte caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, une souche recombinante de B. anthracis de l'invention dans des conditions telles que son administration à un hôte déterminé permet la production d'anticorps protecteurs à la fois contre une infection par B. anthracis et contre 1'organisme dont est issue la séquence d'acides aminés héterologue.
De telles compositions peuvent être administrées par injection ou par tout mode d'administration habituellement utilisé pour la vaccination.
De façon avantageuse elles peuvent également comporter un adjuvant permettant d'augmenter le niveau de la réaction.
Les doses administrables en particulier chez l'animal, de ces compositions, seront déterminées en fonction de l'animal que l'on cherche à protéger. On estime que l'administration de doses allant de 10 jusqu'à 100 fois, voire plus, la dose de souche Sterne utilisée (106 souches chez la souris) , peut être envisagée.
Entre également dans le cadre de 1•invention un vecteur recombinant, notamment choisi parmi les vecteurs de type conjugatif capable d'infecter à la fois des bactéries Gram-négatives et des bactéries Gram-positives en particuler E. coli et B. anthracis, stable et non intégratif chez B. anthracis et comprenant en un site non essentiel pour sa réplication, d'une part une séquence mutée d'au moins un gène codant pour une protéine responsable de 1'effet toxique des toxines de B. anthracis, de telle façon qu'elle ne permet pas la production de cette protéine ou que cette protéine est produite sous une forme inactive s'agissant de l'effet toxique, et d'autre part une cassette d'ADN susceptible de se comporter comme un reporteur, par exemple en conférant une résistance à un antibiotique par exemple la kanamycine ou en permettant une réaction métabolique sur un substrat donné, lorsque ce vecteur est introduit chez B. anthracis.
Un vecteur recombinant préféré est le vecteur dans lequel le gène muté de pXOl est le gène cya. Selon un autre mode de réalisation intéressant de l'invention, ce vecteur recombinant comporte le gène lef muté au niveau plasmide pXOl.
D'autres vecteurs recombinants utilisables sont caractérisés en ce que le plasmide pXOl est muté au niveau de deux gènes, par exemple au niveau des gènes LF et PA, ou EF et PA ou EF et LF.
Des vecteurs particulièrement intéressants pour la réalisation de l'invention sont le plasmide PMMA110 et le plasmide pCPLUO. Le vecteur recombinant selon l'invention peut également contenir outre les séquences précédemment décrites, un ADN héterologue codant pour une protéine immunogène déterminée.
L'invention concerne de plus un procédé pour la préparation d'une souche recombinante de B. anthracis répondant aux définitions ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
- la modification de souches déterminées de B. anthracis par un vecteur recombinant tel que ci- dessus décrit dans des conditions permettant l'intégration de la séquence mutée du gène cya ou de la séquence mutée du gène lef ainsi que de la cassette reporteur au niveau du plasmide pXOl et le cas échéant de l'acide nucléique héterologue, de façon telle que la séquence cya mutée ou la séquence lef mutée est insérée par recombinaison homologue dans pXOl respectivement au niveau du gène cya ou du gène lef d'origine,
- la récupération des souches B. anthracis recombinantes, après élimination du vecteur recombinant non intégré dans pXOl.
Entrent également dans le champ de 1'invention les séquences d'ADN codant pour une protéine responsable de l'effet toxique de B. anthracis, caractérisées en ce qu'elles sont mutées par délétion dans des conditions telles que la protéine pour laquelle elles codent naturellement n'est pas produite ou est produite sous une forme tronquée inactive s'agissant de la toxicité, en particulier ce qu'il s'agit des séquences codantes du gène lef ou du gène cya.
L'invention vise également le plasmide pXOl muté selon ce qui a été défini précédemment au niveau du gène lef ou du gène cya. D'autres avantages et propriétés de l'invention apparaissent également dans les figures et les exemples qui suivent.
Figure 1 : schéma de la mutagénèse du gène cya (A) et du gène lef (B)
Figure 2 : protéines contenues dans différents surnageants de cultures de B. anthracis analysé par immunoblot et vérification avec des immunosérums anti EF (A/) , anti LF (B/) ou anti PA (C/) Echantillons 20 μg de :
1/7702 souche de B. anthracis 2/ EF" souche de B. anthracis 3/ PA" souche de B. anthracis 4/ LF" souche de B. anthracis
E X E M P L E S
I - CONSTRUCTION DE SOUCHES MUTANTES
MATERIELS ET METHODES
Souches bactériennes, plasmides et milieux de cultures
Les souches bactériennes et les plasmides utilisés sont répertoriés dans le tableau I. Le vecteur de conjugaison navette entre Escherichia coli et Bacillus anthracis est pAT18, utilisé dans ces expériences pour transformer B. anthracis. Il contient un gène de résistance à 1'érythromicine capable de s'exprimer à la fois dans les bactéries Gram négatives et les bactéries Gram positives.
Des milieux L broth ou L agar ont été utilisés pour cultiver E. coli (Miller 1972, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory) . B anthracis a été cultivé en routine dans un milieu BHI (Difco laboratories) ou dans un milieu NBY pour la préparation des spores. Un milieu R (Ristroph et Ivins 1983, Inf. Imm. 39:483-486) a été mis en oeuvre pour la production de toxines. Les antibiotiques ont été utilisés à la concentration suivante : ampicilline à 100 μg/ml dans une culture de E. coli; kanamycine à 50 μg/ml et 20 μg/ml respectivement dans des cultures de E. coli et de B. anthracis; érythromycine à 180 μg/ml et 10 μg/ml pour des cultures de E. coli et de B. anthracis respectivement. Techniques ADN
pXOl a été préparé conformément à la méthode de Green et al 1985 (Inf. Imm. 49: 291-297). La préparation de l'ADN plasmidique de E. coli et de B. anthracis a été réalisée selon la méthode de Birnboim et Doly (Methods for recombinant DNA technology Maniatis et al 1982) . La cassette d'ADN conférant la résistance à la kanamycine a été préparée en utilisant le kit Geneclean (Bio 101, La Jolla, Californie) après électrophorèse sur gel d'agarose.
Procédure de conjugaison
Les plasmides navettes recombinants ont été transférés par conjugaison dans B. anthracis 7702 (souche Sterne) . Le système de conjugaison par filtres de Trieu Cuot et al (1987 FEMS Microbiology Letters 48, 289-294) a été utilisé conformément à la description de Cataldi et al. E. coli et B. anthracis ont été cultivés dans des milieux L et BHI. 5 108 cellules de E. coli et 108 cellules de B. anthracis ont été mélangées, lavées pour éliminer les antibiotiques et chargées sur un filtre Millipore de 0,45 μ placé sur de l'agar BHI. Après 15 heures d'incubation à 37°C, les cellules ont été resuspendues et étalées sur un milieu sélectif contenant les antibiotiques appropriés. La résistance de B. anthracis aux colicines E3 et D a été utilisée pour sélectionner par comptage les donneurs sensibles à E. coli. L'ADN plasmidique a été purifié des transconjugants et utilisé pour transformer E. coli. Les plasmides ont été testés pour vérifier 1'absence de réarrangements, par analyse avec des enzymes de restriction. Isolement de souches mutantes de B. anthracis
Les souches mutantes de B. anthracis ont été obtenues par culture pendant plusieurs générations en l'absence d'érythromycine mais en présence de kanamycine pcr sélectionner les événements de recombinaison entre le gène muté contenant la cassette et pXOl et pour sélectionner les souches ayant perdu le plasmide recombinant. Parmi tous les clones testés résistants à la kanamycine, tous étaient sensibles à 1'érythromycine et dépourvus de plasmides. La caractérisation des recombinants a été complétée en préparant l'ADN de pXOl et en sous-clonant les gènes inactivés dans pUC18 dans E. coli. L'ADN plasmidique a été purifié à partir des transformants Kanr-Ampr (résistants à la kanamycine-résistants à l'ampicilline) et testé pour l'absence de réarrangements, par analyse avec des enzymes de restriction.
Test adénylate cyclase
L'adénylate cyclase a été testée dans des surnageants de culture de B. anthracis dans des milieux R comme décrits par Ladant 1988(J Biol Chem 263:2612-2618). L'activité enzymatique est exprimée en unité/ml correspondant à 1 nM/min/ml.
Analyse protéigue
Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide 8% en présence de SDS a été réalisée selon la description de Laemmli 1970. Les gels ont été soit colorés avec le bleu de coomassie soit soumis à une analyse en immunoblot (Towbin et al 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354) . Des western blot ont été effectués avec un sérum obtenu à partir de lapins immunisés soit avec la protéine EF62 soit avec la protéine LF de B. anthracis purifiée à partir du gel. Les protéines immunodétectées ont été visualisées en utilisant la protéine A marquée avec 1251 et par autoradiographie avec des films à rayon X.
Préparation des spores
Pour la préparation de spores de B. anthracis, on strie une colonie sur un milieu NBY en gélose inclinée et on incube pendant 7 jours à 30°C. La formation des spores a été contrôlée par examen au microscope. 5ml d'eau distillée stérile ont été ajoutés à chaque tube. La suspension de spores a été transférée dans un tube stérile incubée dans de l'eau à 65°C pendant 30 minutes pour tuer tous les bacilles pouvant exister dans cette culture. La culture contenant au moins 90% de spores et 108 CFU/ml a été collectée par centrifugation et suspendue dans l'eau (1/20 v/v de la culture d'origine). Les dilutions de l'ensemble des spores ont été étalées pour comptage de spores viables sur un milieu agar BHI. L'ensemble des spores a été divisé en parties aliquotes en 5 ml et conservé à 4°C.
Avant chaque expérience d'infection, les parties aliquotes ont été diluées dans de l'eau physiologique et les dilutions ont été étalées sur une boîte d'agar BHI pour détermination par comptage de la viabilité.
Les spores de B. subtilis ont été préparées de la même manière. Infection des souris
Des souris suisses femelles âgées de 3 à 6 semaines, non contaminées ont été fournies par le laboratoire Saint Aubin Les Elboeuf, France. Les animaux ont été nourris avec de 1'eau stérilisée complétée par des vitamines (pH 3) . La mortalité a été suivie en inoculant par voie sous-cutanée (se) des groupes de 10 souris avec des dilutions appropriées de suspension de spores (dans un volume de 0,2 ml) obtenues à partir de la souche parentale ou des mutants. La virulence a été estimée en déterminant la dose létale à 50% (LD 50) sur des groupes de souris âgées de 3 à 10 semaines par la méthode statistique. La survie des bactéries a été suivie dans les tissus de l'hôte en infectant les souris au niveau du coussinet plantaire droit (dans un volume de 0,1 ml) avec de fortes doses de suspension de spores provenant des souches testées. Des groupes de 5 souris ont été sacrifiés à intervalles donnés et leurs pieds ont été sectionnés, lavés dans des solutions d*hypochlorure de sodium (1 min) pour tuer les contaminants de la peau et avec du PBS stérile pH 7,2 (1 min) . Ensuite des volumes de 0,1 ml des dilutions en série (10 fois) ont été étalés sur un mélange gélose contenant de la trypticase. Les colonies ont été comptées après 16 heures d'incubation à 37°C et les résultats ont été exprimés sous la forme du log 10 des comptages bactériens par pied. En même temps la réaction d'inflammation induite dans le coussinet plantaire des souris infectées a été mesurée à intervalles donnés en utilisant un pied à coulisse (Schelltaster, Hessen) . RESULTATS
Construction des souches mutantes de B. anthracis déficientes en toxine EF ou en toxine LF
Les gènes codant pour la protéine LF (gène lef) ou pour la protéine EF (gène cya) ont été inactivés conformément à la technique de Cataldi à la fois par délétion et par insertion d'une cassette résistante à la kanamycine. La constuction réalisée initialement dans E. coli a été transférée par conjugaison dans la souche Sterne 7702 de B. anthracis. Le gène cya clone et séquence (Mock et all988 Gène 64:277-284) a été souscloné dans E. coli dans le plasmide pUC8 (pMM861) .
Le plasmide recombinant pMM861 (Labruyère et al 1990 Bioche istry 29:4922-4928) codant pour le locus cya a été soumis à une digestion enzymatique partielle au niveau du site Hind III de façon à créer un fragment de délétion Hind III de 1 Kb à l'intérieur du gène cya. Le plasmide a ensuite été coupé en son site BglII unique dans le gène et la cassette d'ADN de 1 Kb conférant la résistance à la kanamycine a été liguée au plasmide. Le plasmide recombinant résultant pMMA862 a été caractérisé à partir de transformants E. coli Ampr, Kanr. Les profils de la préparation plasmidique pMMA862 obtenus avec les enzymes de restriction ont montré que le gène cya était muté conformément à ce que 1•on souhaitait. Ensuite un fragment de 4,2 Kb EcoRI-BamHI du plasmide pMMA862 a été inséré dans le plasmide navette mobilisable pATlδ (Ermr) (pMMAHO) .
La mutagénèse du gène lef a été réalisée de façon similaire. Le gène lef est contenu dans un fragment Sacl-Clal de 3,5 Kb du plasmide pXOl de B. anthracis. Ce fragment a été tout d'abord clone dans pUClδ et a permis d'exprimer le gène lef dans des cellules E. coli portant le plasmide correspondant pCPLll. Le fragment de 3,5 Kb a ensuite été inséré dans pAT18 (pCPLlOO) . Le plasmide recombinant pCPLlOO a été soumis à une digestion enzymatique partielle avec EcoRI de façon à créer un fragment de délétion EcoRI de 0,8 Kb à l'intérieur du gène. Le plasmide résultant a été coupé à son site Xhol unique à l'intérieur de lef et la cassette Kanr a été liguée au plasmide. Le plasmide recombinant correspondant pCPLUO a été caractérisé à partir des transformants E. coli, Ermr, Kan1*. Le profil des enzymes de restriction de pCPLUO a montré que le gène lef était muté comme on le souhaitait.
Les gènes inactivés ont ensuite été transférés dans B. anthracis 7702 : PMMA110 et pCPLUO portant respectivement les gènes mutés cya et lef ont permis de transformer E. coli HB101 portant pRK212.1 pour la mobilisation. La stratégie de transformation par le vecteur développé par Trieu Cuot a été utilisée entre E. coli et la souche B. anthracis 7702 de Sterne de façon à transférer les constructions d'ADN faites dans E. coli, vers B. anthracis par conjugaison.
Bien que les fréquences de transfert aient été faibles (10"8) des transconjugants B. anthracis Kanr, Ermr ont été obtenus. Les événements de recombinaison homologue entre PMMA110 ou pCPLUO et pXOl ont ensuite été sélectionnés pour vérifier 1'introduction du gène cya inactif ou du gène lef inactif dans pXOl. Pour cela, les transconjugants ont été cultivés sur plusieurs générations sans érythromycine (Erm) (antibiotique de sélection pour le plasmide navette) mais en présence de kanamycine (Kan) (sélectif pour la cassette) . Tous les clones testés conformément à cette procédure étaient sensibles à Erm et résistants à Kan, montrant la perte de PMMAllO ou de pCPLUO et 1»intégration de la cassette Kanr dans pXOl. Les souches B. anthracis présumées recombinantes EF" ou LF" portant respectivement pXOl-cya" ou pXOl-lef" ont été d'abord caractérisées selon la technique décrite dans la partie Matériels et Méthodes par analyse avec les enzymes de restriction puis par le test de 1•adénylate cyclase et des expériences d'immunoblot.
Production des toxines PA, LF et EF dans les surnageants de culture des souches mutantes de B. anthracis
L'activité adénylate cyclase du composant EF a été déterminée dans différentes souches de B. anthracis (tableau 2) . Aucune activité n'a été détectée dans les surnageants de culture de la souche mutante EF", confirmant ainsi 1»inactivation du gène cya sur pXOl. Dans le surnageant de culture de la souche mutante LF", l'activité adénylate cyclase était la même (200 u/ml) que 1'activité trouvée habituellement dans les surnageants de culture des souches 7702.
Les souches mutantes B. anthracis étaient ensuite caractérisées par analyse immunoblot en utilisant un sérum dirigé contre PA, EF ou LF. Les sérums ont été obtenus conformément à la procédure décrite dans Matériels et Méthodes. Comme le montre la figure 2, les trois protéines composant les deux toxines de B. anthracis, PA, EF et LF sont produites dans B. anthracis 7702 lorsque les bactéries sont cultivées sur un milieu R dans des conditions définies. Aucun composant apparenté à LF n'a été produit par les souches mutantes LF* alors que PA et EF étaient produites. De plus aucun composant apparenté à EF n'a été détecté dans les surnageants des souches mutantes EF", confirmant l'absence d'activité adénylate cyclase dans les surnageants de culture des mutants EF" (tableau 2) . Dans les surnageants de culture des mutants PA", aucun composant apparenté à PA n'a été détecté alors que LF et EF étaient encore produites.
Virulence des différentes souches de B. anthracis dans les souris
Des groupes de 10 souris suisses ont été inoculés se avec des doses croissantes de différentes souches de B. anthracis, et la mortalité a été suivie pendant 15 jours. La souche 7700 correspondant à la souche Sterne 7702 dépourvue du plasmide pXOl codant pour les toxines était totalement avirulente (LD 50 109) , comme le sont les souches mutantes PA" obtenues par Cataldi. L'inactivation de EF a infléchi de façon significative la LD 50 par une unité 1,0 log (LD 50 107 spores par souris contre 106 spores par souris pour la souche 7702 Sterne) . Ceci indique que 1•expression de la virulence était partiellement affectée par 1'absence de l'adénylate cyclase. Au contraire la létalité était totalement abolie en l'absence du facteur létal puisque les souches de B. anthracis mutantes LF" étaient avirulentes (LD 50 109) . La souche mutante LF" totalement avirulente mais produisant néanmoins la toxine de l'oedème (PA + EF) pouvait induire l'oedème de la peau après injections sous-cutanées, alors que les souches mutantes PA" ou EF" n'induisaient pas d'oedème. Il était important de vérifier in vivo cette propriété et pour cela des souris ont été inoculées avec différentes souches de B. anthracis (108, 107 ou 106 spores par souris) dans le coussinet plantaire droite. L'intensité de l'oedème dans le coussinet plantaire a été mesurée avec un pied à coulisse. Les résultats obtenus sont rapportés à la figure 2. La souche mutante LF" était capable d'induire l'oedème de la peau comme la souche Sterne 7702. Au contraire les souches mutantes de B. anthracis 7700 PA" ou EF" n'induisaient pas l'oedème de la peau. Pour toutes les souches de B. anthracis, la réaction d'inflammation s'est accrue 2 jours après l'injection (les souris sont mortes dans cette expérience, la LD 50 se dans le coussinet des pattes était plus forte que 108) . Lorsque les souris étaient inoculées avec 108 spores de la souche 7702 Sterne un oedème était observé pendant 6 jours, avec la souche mutante LF' l'oedème était visible pendant 2 jours seulement. Avec la souche B. subtilis MSY aucune réaction d'inflammation (106, 107 ou 108 spores en suspension) n'était observée. Finalement pour vérifier si 1•induction de 1'oedème était dépendante de la survie bactérienne dans le coussinet de la patte des souris infectées, une culture bactérienne a été suivie lorsque les souris étaient inoculées avec 108 spores de toutes les souches de B. anthracis testées.
Pour toutes les souches B. anthracis, le log 10 du comptage bactérien par patte décroissait rapidement 24 heures après l'injection par plus de 1,0 unité log et restait stable pendant 10 jours. Ceci indiquait que l'induction de l'oedème n'était pas corrélée avec la survie bactérienne au point de l'inoculation. Lorsque les souris étaient inoculées avec une suspension de 108 spores de B. subtilis, le log 10 du comptage bactérien décroissait de façon significative. Les spores étaient détruites 5 jours après l'infection. Ces données ont démontré que la souche de B. anthracis (même à la souche 7700) survivait plus longtemps que la souche B. subtilis dans les tissus de l'hôte.
FEUILLE DE REMPLACEMENT TABLEAU 1 :
Souches bactériennes et plasmides utilisés
Souches bactériennes Souches Plasmides Caractéristiques
B. nthracis 7702 pXOl PA+EF+LF+
B.anthracis 7700 Nalr
B.anthracis RP8 PA" pXOl-pag 322 PA"EF+LF* Ermr
B.anthracis RP9 EF" pXOl-cya 303 PA+EF+LF" Kanr
B.anthracis RP10 pXOl-lef 238 PA+EF+LF" Kanr
LF" E.COli HB101 ppRRKK221122..11 Ampr
E.COli JM105 B.Subtilis SMY Plasmides pAT18 : plasmide navette pXOl, Erm1* (Trieu Cuot et al, 1987) pCPLlOO : plasmide recombinant pATlδ portant le fragment 3,5 kb Clal-Sacl DE PXOl codant pour LF. Ermr pCPLUO : dérivé de pCPLlOO portant une cassette Kanr de 1,5 kb insérée dans le gène de structure
LF délété d'un fragment 0,8 kb EcoRI Kanr.
Ermr pMMA861 : plasmide recombinant pUC8 portant le fragment 3,17 kb EcoRI-BamHI de pXOl codant pour EF (Mock 1987) Ampr pMMA862 : dérivé de pMMA861 portant la cassette Kanr de 1,5 kb insérée dans le gène de structure
EF délété du fragment HindIII fragment Ampr
Kanr pMMUO : insérât de 3,57 kb d'ADN de pMMA861 clone dans pATlδ Ermr, Kanr B.anthracis 7702 souche Sterne 1939 J Vet Sci Ani
Indust 13: 313-317
B.anthracis 7700 souche dérivée de 7702 dépourvue de pXOl
B.anthracis RP8 souche dérivée de 7702 E.coli HB101 Trieu Cuot et al, 19δ7 FEMS
Microbiol Letters 4δ: 289-294
E.coli JM105 Yannish-Perron et al, 19δ5 Gène
33: 103-109
TABLEAU 2 :
Activité adénylate cyclase dans les différents surnageants de culture de B. anthracis
Souches Activité Adénylate cyclase nmol/min/ml surnageant
Mutant EF" 0
Mutant PA" 300
Mutant LF" 200
Souche Sterne 7702 200
Construction de souches doublement mutantes de B. anthracis
Ces souches ont été construites selon les techniques décrites dans les pages précédentes. Elles produisent un seul des composants PA, EF ou LF. Méthodes
Les dénominations des souches et leurs caractéristiques sont les suivantes :
- RP31 : EF+ LF" PA"
Le gène lef est inactivé par insertion de la cassette de résistance à la kanamycine (KanR) .
Le gène pag est inactivé par insertion de la cassette de résistance à 1'érythromycine (Erm) .
- RPA4 : LF+ EF" PA"
Le gène pag est inactivé par insertion de la cassette de résistance ErmR.
Le gène cya est inactivé par insertion de la cassette de résistance Kan .
- RP42 : PA+ EF" LF*
Le gène cya est inactivé par insertion de la cassette de résistance ErmR.
Le gène lef est inactivé par insertion de la cassette de résistance KanR.
Ces trois souches ont été caractérisées biochimiquement par analyse des protéines contenues dans leurs surnageants de culture (selon la méthode de Western Blot) .
II - EXPERIENCES D'IMMUNOPROTECTION
Des expériences ont été entreprises chez la souris, dans le but d'étudier le pouvoir immunoprotecteur des souches mutantes. Les animaux ont reçu, par voie sous-cutanée, des spores de RP42 (PA+, EF", LF") et de RP9 (PA+, EF+, LF") un lot témoin d'animaux ne recevant rien.
Au bout de 40 jours, le challenge a été réalisé par injection en voie sous cutanée d'une dose létale (1,5.10° spores) de la souche Sterne.
Le pourcentage des animaux survivants a été déterminé :
90% et 85% des animaux ayant reçu respectivement RP42 et RP9 ont survécu à l'injection de la dose létale de la souche Sterne, alors que l'on n'observe aucune protection parmi le groupe témoin.
Ces premiers résultats sont significatifs et indiquent que les souches construites sont capables d'induire une immunoprotection active chez la souris.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Souche recombinante de B. anthracis, caractérisée par :
- sa capacité à induire chez un hôte animal ou humain, la production d'anticorps protecteurs contre des souches virulentes de B. anthracis,
- la mutation sur le plasmide pXOl d'au moins un gène donné codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, cette mutation résultant en :
. la délétion de tout ou partie de ce gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique et, l'insertion au niveau du site de délétion de ce gène dans pXOl, d'une cassette d'ADN permettant la sélection de la souche ainsi modifiée et empêchant la réversion de la souche recombinante, le gène ainsi muté étant alors soit dépourvu de la capacité à produire la protéine responsable de l'effet toxique pour laquelle il code, soit capable de coder pour une protéine tronquée dépourvue de son caractère toxique.
2. Souche recombinante de B. anthracis selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est dépourvue du plasmide pX02, en particulier en ce qu'il s'agit de la souche STERNE 7702.
3. Souche recombinante de B. anthracis selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le gène muté de pXOl est le gène lef codant pour la protéine létale LF.
4. Souche recombinante de B. anthracis selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le gène muté de pXOl est le gène cya codant pour la protéine oedématogène EF.
5. Souche recombinante de B. anthracis selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est capable d'exprimer les protéines PA et EF et en ce qu'elle n'exprime pas la protéine LF.
6. Souche recombinante de B. anthracis selon 1'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le plasmide pXOl est en outre muté au niveau du gène codant pour la protéine de PA, de façon telle que la protéine PA soit n'est pas exprimée dans la souche recombinante, soit n'est pas fonctionnelle dans la souche recombinante.
7. Souche recombinante de B. anthracis selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est doublement mutée au niveau du plasmide pXOl.
8. Souche recombinante de B. anthracis selon la revendication 7 , caractérisée en ce que les gènes lef et pag sont inactivés, et notamment en ce qu'il s'agit de la souche RP31.
9. Souche recombinante de B. anthracis selon la revendication 7, caractérisée en ce que les gènes pag et cya sont inactivés, et notamment en ce qu'il s'agit de la souche RP4.
10. Souche recombinante de B. anthracis selon la revendication 7, caractérisée en ce que les gènes cya et lef sont inactivés, et notamment en ce qu'il s'agit de la souche RP42.
11. Souche recombinante de B. anthracis selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la cassette d'ADN porte un gène de résistance à un antibiotique par exemple la kanamycine ou un marqueur métabolique.
12. Souche recombinante de B. anthracis selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le fragment délété du gène de pXOl est un fragment d'au moins 0,1 kb de préférence 1 kb, suffisant pour empêcher la production de la protéine pour laquelle il code naturellement.
13. Souche recombinante de B. anthracis selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un acide nucléique héterologue le cas échéant muté, codant pour un facteur déterminé immunogène ou susceptible de l'être, sous le contrôle d'éléments de régulation permettant son expression dans B. anthracis.
14. Souche recombinante de B. anthracis selon la revendication 13 ,caractérisée en ce que l'acide nucléique héterologue est porté par le plasmide pXOl.
15. Souche recombinante de B. anthracis selon 1'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de spores.
16. Souche recombinante selon la revendication 2 ou 4, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche RP9 déposée le 2 Mai 1991 à la CNCM sous le numéro 1-1094.
17. Souche recombinante selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche RP10 déposée le 2 Mai 1991 à la CNCM sous le numéro 1-1095.
18. Souche recombinante selon la revendication 1 ou la revendication 2,caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche RP8 déposée le 2 Mai 1991 à la CNCM sous le numéro 1-1093.
19. Composition immunogène, permettant la production d'anticorps neutralisants et protecteurs vis à vis de B. anthracis chez l'hôte auquel elle est administrée, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif une souche recombinante de B. anthracis selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, 16 à 18 en mélange avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
20. Composition de vaccin mixte, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, une souche recombinante de B. anthracis selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, dans des conditions telles que son administration à un hôte déterminé permet la production d'anticorps protecteurs à la fois contre une infection par B. anthracis et contre 1'organisme dont est issue la séquence d'acides aminés héterologue.
21. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 19 ou 20, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, des souches RP42 ou RP9.
22. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisée en ce qu'elle comprend un adjuvant.
23. Vecteur recombinant, notamment choisi parmi les vecteurs de type conjugatif capable d'infecter à la fois des bactéries Gram-négatives et des bactéries Gram-positives en particuler E. coli et B. anthracis, stable et non intégratif chez B. anthracis et comprenant en un site non essentiel pour sa réplication, d'une part une séquence mutée d'au moins un gène codant pour une protéine responsable de 1•effet toxique des toxines de B. anthracis, de telle façon qu'elle ne permet pas la production de cette protéine ou que cette protéine est produite sous une forme inactive s'agissant de 1'effet toxique et d•autre part une cassette d'ADN susceptible de se comporter comme un reporteur, par exemple en conférant une résistance à un antibiotique par exemple la kanamycine ou en permettant une réaction métabolique sur un substrat donné, lorsque ce vecteur est introduit chez B. anthracis.
24. Vecteur recombinant selon la revendication 23, caractérisé en ce que le gène muté de pXOl est le gène lef.
25. Vecteur recombinant selon la revendication 23, caractérisé en ce que le gène muté de pXOl est le gène çya.
26. Vecteur recombinant selon la revendication 23, caractérisé en ce que le plasmide pXOl est muté au niveau de deux gènes, et notamment au niveau des gènes LF et PA ou, EF et PA ou, EF et LF.
27. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 23 à 26, caractérisé en ce qu'il contient en outre un ADN héterologue codant pour une protéine immunogène déterminée.
28. Séquence d'ADN codant pour une protéine responsable de l'effet toxique de B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle est mutée par délétion dans des conditions telles que la protéine n'est pas produite ou est produite sous une forme tronquée inactive, la mutation de la séquence étant en particulier située au niveau du gène lef ou du gène cya.
29. Procédé pour la préparation d'une souche recombinante de B. anthracis selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 16 à 18 comprenant les étapes suivantes :
- la modification de souches déterminées de B. anthracis par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 23 à 25 ou 27 dans des conditions permettant l'intégration de la séquence mutée du gène cya ou de la séquence mutée du gène lef ainsi que de la cassette reporteur et le cas échéant de l'acide nucléique héterologue au niveau du plasmide pXOl de façon telle que la séquence cya mutée ou la séquence lef mutée est insérée par recombinaison homologue dans pXOl respectivement au niveau du gène cya ou du gène lef d'origine, la récupération des souches B. anthracis recombinantes, après élimination de la fraction du vecteur recombinant non intégré dans pXOl.
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