ES2245357T3 - Procedimiento mejorado de produccion de toxinas bacterianas. - Google Patents

Abstract

Método para intensificar la producción de la toxina de pertussis o pertactina que comprende el cultivo de una toxina de pertussis o de una bacteria que produzca pertactina en un caldo de cultivo bacteriano, en el cual el ión sulfato es eliminado o reducido del caldo de cultivo bacteriano, método que comprende uno o más de los pasos siguientes: a) adición de una composición a dicho caldo de cultivo bacteriano que forma un complejo sustancialmente insoluble con los iones sulfato; b) suministro de un caldo de cultivo bacteriano que es deficiente en, o posee una concentración reducida de, especies químicas que son convertidas metabólicamente por dicha toxina de pertussis o bacteria productora de pertactina en iones sulfato; y c) suministro de una bacteria mutante de bloqueo de cisteína-de sulfinasa para fabricar la toxina de pertussis o pertactina, y purificación de la toxina de pertussis o pertactina así producida.

Description

Procedimiento mejorado de producción de toxinas bacterianas.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al incremento en la producción de toxinas bacterianas utilizando métodos y composiciones que reducen, o eliminan, la acumulación de inhibidores de expresión de las toxinas intracelulares y extracelulares. En particular, la presente invención se relaciona con métodos y composiciones para reducir o eliminar la acumulación de los inhibidores de expresión de toxinas de las especies Bordetella. Más específicamente, la presente invención se refiere a la producción con un alto rendimiento de la toxina pertussis, pertactina, toxina adenilato ciclasa-hemolisina, hemaglutinina filamentosa y otras toxinas.

La toxina pertussis (PT) es uno de los diversos componentes producidos por B. pertussis virulenta, el microorganismo que provoca la tos ferina. La tos ferina es una infección grave del sistema respiratorio que en cierta época fue responsable de la muerte de 5.000 a 10.000 personas por año en Estados Unidos. Desde la aparición de la vacuna contra la tos ferina el número de muertes relacionadas con la tos ferina se ha reducido a menos de 20 al año. Actualmente, el 50% aproximadamente de todas las infecciones por tos ferina ocurren en niños de menos de 1 año, y solamente el 15% tiene lugar en niños de más de 15 años. Kids Health Org (visitada el 23 de marzo de 2000) <http://kidshealth.org/parent/common/whooping_cough.html>.

La PT es un antígeno protector principal en la vacuna contra la tos ferina. Otros componentes de interés producidos por B. Pertussis son la hemaglutinina filamentosa, toxina termolábil, adenilato ciclasa y similares, los cuales pueden desempeñar también un papel importante como antígenos protectores. La producción a gran escala de estos componentes, útiles como reactivos químicos o de diagnóstico y para la preparación de vacunas, requiere el cultivo a gran escala del microorganismo. Sin embargo, la B. Pertussis es un organismo delicado que se ha comprobado plantea dificultades para crecer en grandes fermentadores. Los métodos más antiguos para el cultivo de la B. Pertussis emplean cultivos en estacionario o en fermentadores. El crecimiento en un cultivo estacionario es una labor intensiva, mientras que el cultivo a escala fermentación requiere una agitación vorticial y aeración superficial. Como resultado, el volumen efectivo del fermentador se reduce y a veces es necesario modificar el fermentador para que crezca la Pertussis. Además, las cantidades de PT producidas durante la fermentación en estas condiciones son variables y a menudo bajas.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.338.670 revela un método para la producción de la B. Pertussis en presencia de una sal de hierro, a saber sulfato ferroso. Aunque el alto contenido en hierro permita un mayor crecimiento bacteriano, suprime la producción de PT. Ajustando el contenido en hierro de los medios modificados de Stainer-Scholte a un 10% de la concentración recomendada se optimizó la producción de PT.

Frohlich y col., 1995, Journal of Biotechnology, 39, 205-219, descubrieron que la composición iónica y la concentración iónica total del medio de cultivo eran factores importantes implicados en la limitación de la productividad en los reactores ventilados utilizados para la producción de la toxina pertussis y demás antígenos generados por Bordatella pertussis. Frohlich y col. sugieren la sustitución del cloruro sódico por glutamato monosódico con el fin de incrementar la producción de células y toxinas.

La presente invención trata de mejorar la producción de PT obtenida a partir de B. Pertussis mediante (1) la introducción de una sal soluble en el caldo de cultivo que secuestre los iones sulfato (SO_{4}^{2-}) y/o (2) el empleo de un mutante que bloquee la cisteína desulfinasa de B. pertussis.

Breve sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que los inhibidores de expresión de las toxinas bacterianas se acumulan en los caldos de cultivo y así reducen significativamente la producción de toxinas. Además, la presente invención se basa en el descubrimiento de que la supresión o eliminación de los inhibidores de expresión de las toxinas puede aumentar significativamente la regulación de la expresión de las toxinas. En la presente invención se describen diversos ejemplos no limitativos que utilizan la especie Bordetella, en particular, B. pertussis y/o B. bronquiséptica para producir la toxina pertussis (PT) y pertactina respectivamente. Sin embargo, se entiende que se pueden alcanzar niveles más altos de toxinas bacterianas en otros sistemas de cultivo bacterianos utilizando las enseñanzas de la presente invención, incluyendo pero sin limitarse a, la toxina adenilato ciclasa-hemolisina y la hemaglutinina filamentosa.

En general, la presente invención se pone de manifiesto mediante la descripción de los métodos y composiciones utilizados para cultivar B. pertussis que elimina, o reduce, la acumulación intracelular y extracelular de inhibidores de la PT, lo que conlleva un rendimiento significativamente mayor de la producción de PT.

En una realización de la presente invención, se describen los métodos y composiciones para preparar nuevos medios de cultivo que mejoran el crecimiento de B. pertussis e impiden o disminuyen la expresión de inhibición de la PT por los aniones sulfato. Las composiciones de estos caldos y con ellos los métodos incluyen, sin limitarse a, la mezcla de un caldo de cultivo de B. pertussis con una cantidad efectiva de una o más sales metálicas solubles que formen complejos básicamente insolubles con los aniones sulfato.

En otra realización de la presente invención se proporcionan los medios de cultivo que favorecen el crecimiento de B. pertussis y que comprenden cierta cantidad de una o más sales solubles que forman complejos básicamente insolubles con los inhibidores de PT, donde dicha cantidad impide o reduce la inhibición de la expresión de la PT. En particular, se revelan unas sales metálicas solubles que forman complejos básicamente insolubles con los aniones sulfato.

Otras realizaciones de la presente invención incluyen los medios de cultivo de B. pertussis así como los métodos de obtención y utilización de los mismos para reducir los inhibidores de PT limitando o eliminando los constituyentes de los caldos que contribuyen a la acumulación del inhibidor de PT. En particular, en una realización de la presente invención, se reduce la concentración de cisteína.

La invención se refiere también a los métodos y composiciones para producir la PT que comprenden el cultivo de B. pertussis en condiciones que eliminen, o reduzcan, la acumulación de los inhibidores de PT en los medios de cultivo, lo que resulta en unos incrementos significativos de la producción de PT, y el aislamiento de la PT del caldo de cultivo.

Aun en otra realización de la presente invención, la producción de PT se intensifica por medio de mutantes de bloqueo de la cisteína desulfinasa de B. pertussis. En una realización de la presente invención, se proporcionan los métodos para producir la PT que comprenden el cultivo de un mutante de bloqueo de la cisteína desulfinasa de B. pertussis en un caldo de cultivo de B. pertussis, y el aislamiento de la PT de dicho caldo de cultivo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Gráfico que muestra el cultivo de B. pertussis (OD 650) así como los cambios en las cantidades de PT ([Ptx]/OD) producidas en función del tiempo de fermentación.

Figura 2: Imagen de una placa agar sangre.

Figura 3: Diagrama de barras que muestra el cultivo de B. pertussis (OD 650) y la cantidad de PT (Conc. Ptx) en el sobrenadante del cultivo control (Ctr.), conteniendo el caldo de cultivo moléculas <3.000 KDa (<3K) procedentes de caldos de cultivo usados, y conteniendo el caldo de cultivo moléculas >3.000 KDa (>3K) procedentes de caldos de cultivo usados.

Figura 4A: Gráfico del tiempo de fermentación (horas) con respecto a la concentración de ácido aspártico, treonina, cisteína y lisina (mg/l) y la concentración de arginina, metionina y prolina (mg/l) mostrando los perfiles de los aminoácidos durante la fermentación.

Figura 4B: Gráfico del tiempo (horas) en función del área (mAU*sec) que muestra los cambios en las concentraciones de ácido orgánico en función del tiempo de fermentación.

Figura 5: Diagrama de barras que muestra la concentración de sulfato (\mug/ml) a distintos tiempos de cultivo.

Figura 6: Gráfico que muestra el efecto del incremento de las concentraciones de BaCl_{2} (mM) sobre la cantidad de PT producida (\mug/ml/OD_{650}) para dos cepas de B. pertussis (cepa 1 = CS-87, cepa 2 = ATCC 9797).

Figura 7: Muestra una comparación de la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos transportados del gen cisteína desulfinasa aislado de la cepa BP536 de B. pertussis con la secuencia de B. pertussis (contig 314) encontrada en la base de datos de ADN de The Sanger Centre.

Figura 8a: Muestra gráficamente la producción total de toxina B. pertussis en fermentadores de 20 litros bajo condiciones de limitación de cisteína y medida a una absorbancia de 600 nm.

Figura 8b: Muestra gráficamente la producción de toxina B. pertussis en fermentadores de 20 litros bajo condiciones de limitación de cisteína y medida en mg/ml de toxina por unidad de densidad óptica.

Figura 9: Muestra gráficamente las concentraciones internas y externas de sulfato en las células de B. pertussis en fermentadores de 20 litros bajo condiciones de limitación de cisteína.

Descripción detallada de la invención

Las consecuencias más graves de las infecciones bacterianas resultan a menudo de la expresión de la toxina en el huésped. Como ejemplos no limitativos se incluyen Clostridium tetani, que produce la toxina del tétanos; neurotoxinas producidas por C. botulinum; C. difficile que produce toxinas que provocan colitis pseudomembranosa; Salmonella typhi, que produce las enterotoxinas que provocan gastroenteritis y fiebres tifoideas; Staphylococcus aureus, que puede expresar las toxinas que provocan choques sépticos; y B. pertussis, que produce las toxinas responsables de la tos ferina. Otros géneros toxigénicos de bacterias incluyen, sin limitarse a, Escherichia, Shigella y Vibrio. Afortunadamente se dispone de vacunas que impiden y/o palian los efectos más severos de las toxinas bacterianas. Estas vacunas se componen principalmente de toxinas bacterianas modificadas, de dosis subletales de la toxina purificada y/o un conjunto de homogenados celulares.

Las vacunas de Bordetella pertussis han demostrado ser particularmente efectivas para impedir la tos ferina en recipientes de vacuna. Se ha descubierto que las vacunas contra la pertussis acelular (AP) que contienen la toxina pertussis (PT) sola o en combinación con otros antígenos de B. pertussis son muy efectivas para prevenir infecciones con pertussis. Sin embargo, debido a que la PT y muchos otros antígenos de pertussis se expresan en cantidades por minuto, es importante optimizar las condiciones de cultivo para maximizar las producciones. Al utilizar los medios estándar de Stainer-Scholte (SS), se observó una reducción en la media relación toxina pertussis/densidad óptica (PT/OD_{650}) mediante fermentaciones discontinuas. Para determinar si este fenómeno era debido a una falta de disponibilidad de sustrato o a la inhibición de retroalimentación negativa, se realizaron diversos estudios dirigidos a determinar si los medios gastados contenían factores inhibidores de la expresión de PT y a identificar dichos factores. Se tomaron muestras del sobrenadante de cultivos en varias etapas de fermentación y se realimentaron con componentes de los medios SS que carecían de sales básicas. Estas muestras se utilizaron para iniciar un segundo cultivo y se midieron las relaciones PT/OD_{650} en comparación con medios SS nuevos. Tanto los medios gastados intactos como una fracción de estos medios que contenían moléculas <3.000 kDa inhibían la producción de PT. Los experimentos de líneas cruzadas en Agar Bordet-Gengou (BGA) confirmaron la producción de inhibidor(es) de la actividad hemolítica en bacterias recientemente lineadas. Los geles coloreados con Coomassie mostraron que todos los perfiles de proteínas celulares eran significativamente diferentes en los medios fraccionados en comparación con los medios nuevos, lo que sugiere que los factores inhibidores influían el sistema regulador de dos componentes. Para identificar además este(os) compuesto(s)
inhibidor(es), se realizó un análisis completo del flujo del metabolismo intermedio de B. pertussis, incluyendo análisis HPLC de los aminoácidos y ácidos orgánicos de los medios gastados así como de las enzimas cruciales dentro de estas vías. Se descubrió que el aminoácido que contenía azufre, la metionina y el piruvato se acumulaban durante la fase exponencial tardía del cultivo (hasta 200 mg/l). El examen de todas las fracciones de sobrenadantes por LC-MS sugiere que las vías para el consumo de cisteína conducen a la formación de sulfato. Esto a su vez actuaba como un inhibidor de retroalimentación negativo de la expresión de PT.

Ya que el sulfato actúa como inhibidor de la expresión de PT en B. pertussis, se desarrollaron diversos métodos para reducir o eliminar la acumulación de sulfato intracelular y extracelular a medida que continuaba la fermentación. En una realización de la presente invención, estos métodos incluyen la adición de una cantidad efectiva de una sal soluble que forma una complejo básicamente insoluble con el sulfato. Estas sales solubles incluyen sales de metales alcalinotérreos u otras sales de Pb y Ag. Las sales preferentes de la presente invención son sales de metales alcalinotérreos. En especial, las sales haluro de Ba(II). En particular, la sal de haluro de Ba(II) BaCl_{2} o BaBr_{2}.

El cloruro de bario ha demostrado ser eficaz favoreciendo un incremento de la cantidad de PT producida por B. pertussis. Se observó un incremento de diez veces por unidad OD en el rendimiento de PT cuando la cepa ATCC 9797 ó CS87 de B. pertussis se cultivaba en presencia de BaCl_{2}. En este caso, la cantidad de PT en ausencia de BaCl_{2} era de 0,05 \mug/ml/OD_{650}, comparado con 0,525 \mug/ml/OD_{650} con BaCl_{2}20 mM. Por "cantidad efectiva" de una sal se entiende una cantidad que impida o reduzca la inhibición de la expresión de PT por el sulfato durante la fermentación en comparación con la fermentación en ausencia de sal.

La solubilidad del complejo de sulfato se define por su producto de solubilidad (K_{sp}). El complejo de sulfato se define como "básicamente insoluble" cuando su K_{sp} es de aproximadamente 1\cdot10^{-5} o inferior a 25ºC. Preferentemente, su K_{sp} oscila entre aproximadamente 1\cdot10^{-7} y aproximadamente 1\cdot10^{-10} a 25ºC. En especial el K_{sp} oscila aproximadamente entre 1\cdot10^{-8} y aproximadamente 1\cdot10^{-10} a 25ºC. Los productos de solubilidad que se encuentran dentro de los rangos mencionados anteriormente para los complejos de sulfato seleccionados vienen indicados en la Tabla 1.

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TABLA 1 Valores K_{sp} para los complejos de sulfato seleccionados

Complejo	K_{sp} (a 25ºC)^{a}
BaSO_{4}	1,05\cdot10^{-10}
PbSO_{4}	1,82\cdot10^{-8}
SrSO_{4}	3,42\cdot10^{-7}
AgSO_{4}	1,19\cdot10^{-5}
^{a}CRC Handbook of Chemistry and Physics-65^{th} Ed., Weast (ed.), p. B-220 (1984)

Se entiende que los complejos de sulfato mostrados en la Tabla 1 son ejemplos y, como tales, no restringen el alcance de la presente invención. Además, debe observarse que el complejo de sulfato no necesita ser completamente insoluble en el caldo de cultivo. El complejo de sulfato debe ser simplemente lo bastante insoluble como para impedir o reducir la inhibición de la expresión de PT por el sulfato.

Las sales de la presente invención pueden añadirse al medio antes o después de iniciar el cultivo de B. pertussis. Como alternativa, la sal puede mezclarse con los demás componentes del medio antes o después de la adición del agua necesaria para la preparación del caldo, pero antes de introducir las células de B. pertussis.

La cantidad de sal que se puede utilizar en la presente invención para fomentar el incremento de la cantidad de PT producida durante la fermentación puede ser de aproximadamente 0,05 mM a aproximadamente 50 mM, preferentemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM, en especial de aproximadamente 20 mM. Normalmente una cantidad de sal de 10 mM aproximadamente a 20 mM aproximadamente es efectiva para impedir o reducir la inhibición de la expresión de PT por el sulfato. Cualquier especialista en la materia puede determinar qué cantidad óptima de sal impide o reduce eficazmente la inhibición de la expresión de PT en cualquier cepa determinada de B. pertussis sin más que la experimentación de rutina.

En otra realización, los presentes inventores han determinado que regular las concentraciones en los medios de los precursores inhibidores de la toxina puede reducir las concentraciones inhibidoras tanto intracelulares como extracelulares. Por ejemplo, y sin que ello sea una limitación, los presentes inventores han determinado que los inhibidores de PT incluidos, sin limitarse a, sulfitos y sulfatos son producidos como productos finales del metabolismo de la cisteína. Brevemente, la Bordetella metaboliza la cisteína del aminoácido que contiene azufre mediante una vía que implica a la enzima cisteína desulfinasa. Durante el metabolismo de la cisteína, un grupo sulfuro se disocia enzimáticamente de la molécula de cisteína. Este grupo sulfuro luego se metaboliza en sulfitos y sulfatos, que se acumulan dentro de la célula bacteriana y en el entorno extracelular. Como consecuencia, la Bordetella más grandes se cultivan en presencia de cisteína, cuanto mayores sean las concentraciones de sulfato intracelulares y extracelulares menos PT se produce.

Basándose en la relación entre las concentraciones de cisteína de los caldos de cultivo iniciales y las concentraciones finales de sulfato, los presentes inventores desarrollaron la teoría, no limitativa, de que la reducción de las concentraciones iniciales de cisteína resultaría en una menor acumulación intracelular y extracelular de sulfato y, como consecuencia, una menor inhibición de PT. Para evaluar el efecto que concentraciones variables de cisteína tienen sobre la concentración de sulfato, los presentes inventores desarrollaron tres sistemas de cultivo diferentes identificados con las abreviaturas siguientes: LCMSSB, LCMSSFB y LCMSSBa. El sistema de cultivo LCMSSB (limiting cysteine modified Stainer-Scholte batch) consistía en un cultivo por lotes de B. pertussis utilizando los caldos tal como aparecen en la Tabla 2 siguiente. Brevemente, el "modo por lotes" es un proceso por el cual se cultivan microorganismos en un medio de cultivo único, normalmente líquido o semilíquido, sin reponer o intercambiar cantidades significativas de los medios de cultivo gastados o utilizados. En la presente invención, los cultivos en modo por lotes (LCMSSB) fueron incubados aeróbicamente a una temperatura de aproximadamente 35ºC a 37ºC hasta que las densidades ópticas bacterianas alcanzaran unidades de absorbancia >1,0, medida por espectrofotometría a 600 nm según procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica. El segundo sistema de cultivo LCMSSFB (limiting cysteine modified Stainer-Scholte fed batch) se mantuvo utilizando los caldos de cultivo descritos en la Tabla 3. Se observa que no se añadió cisteína a los medios base. En su lugar, se añadió L-cisteína a una velocidad de 20 mg/hora durante todo el período de incubación. El último sistema de cultivo se denominó LCMSSBa (limiting cysteine modified Stainer-Scholte batch plus BaCl_{2}) y se utilizaron los medios base descritos en la Tabla 2.

Los tres sistemas de cultivo fueron inoculados y mantenidos como sigue: los cultivos de Bordetella se incubaron a una temperatura de aproximadamente 35ºC a 37ºC en biorreactores de 20 litros (New Brunswick BioFlo IV® (New Brunswick Scientific, Edison NJ) conectados a un Biocommand AFS v2.0 (New Brunswick Scientific, Edison NJ) que recogió datos de pH, agitación, oxígeno disuelto, temperatura y caudal de aire. Se añadieron, según necesidad, unas bombas adicionales para los agentes antiespumantes y los reactivos de control de pH, tal como es bien conocido por los especialistas en la técnica. El caudal de aire se ajustó a 4,0 litros por minuto, el oxígeno disuelto se mantuvo a un 40% y el pH se mantuvo a aproximadamente 7,2.

Cada biorreactor de 20 litros contenía 11 litros de caldo de prueba y fue inoculado con un litro de cultivo iniciador bacteriano de crecimiento activo. Los cultivos de iniciación de crecimiento activo fueron preparados mediante la inoculación de matraces agitadores que contenían un litro de medio Stainer Scholte (SS), cuya fórmula se describe en las Tablas 5 y 6, con semillas congeladas y se incubaron hasta alcanzar una densidad óptica >1,0 OD_{600} (aproximadamente 20-24 horas).

Se sacaron muestras de los fermentadores inoculados a intervalos de 3-6 horas y se separaron los sobrenadantes de cultivo y gránulos celulares mediante centrifugación. Los sobrenadantes de cultivo se testaron en busca de PT, sulfatos, ácidos orgánicos, aminoácidos y densidad bacteriana. Los gránulos celulares bacterianos fueron analizados para determinar las concentraciones de sulfato interno y PT. Cada sistema de cultivo recibió un(os) suplemento(s) específico(s) cuando las densidades de la población bacteriana del cultivo alcanzaron una absorbancia >1,0 unidades aproximadamente (aproximadamente 12 horas después de la inoculación). Tanto el LCMSSB como el LCMSSBa recibieron 200 ml del suplemento de aminoácidos descrito en la Tabla 4 siguiente además de los 10,0 mg/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O y 5,0 g/l de glutamato monosódico (suplemento FeSO_{4}/glutamato). El cultivo de LCMSSBa recibió también BaCl_{2} 1 mM suficiente para obtener una concentración en caldos de cultivo final BaCl_{2} de 20nM; los cultivos de LCMSSFB recibieron el suplemento de FeSO_{4}/glutamato con aminoácidos adicionales excluyendo cisteína y no BaCl_{2}. Después del suplemento, se incubaron los fermentadores como antes hasta que finalizaron los experimentos.

TABLA 2 Componentes del medio LCMSSB

Componente	Cantidad (g/l)
Cloruro de sodio	2,5
KH_{2}PO_{4}	0,5
KCl	0,2
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O	0,1
CaCl_{2}	0,02
TRIS Base	1,525
Ácido ascórbico	0,02
Glutatión	0,10
Monoclorhidrato de L-cisteína	0,04
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O	0,0010
Niacina	0,004
Monoclorhidrato de L-arginina	0,40
L-asparagina	0,10
Ácido L- aspártico	0,04
L-histidina	0,03
L-isoleucina	0,10
L-leucina	0,10
Monoclorhidrato de L-lisina	0,08
L-metionina	0,03
L-fenilalanina	0,03
L-serina	0,06
L-treonina	0,04
L-triptófano	0,01
L-valina	0,04

TABLA 3 Componentes del caldo LCMSSFB

Componente	Cantidad (g/l)
Cloruro de sodio	2,5
KH_{2}PO_{4}	0,5
KCl	0,2
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O	0,1
CaCl_{2}	0,02
TRIS Base	1,525
Ácido ascórbico	0,02
Glutatión	0,10
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O	0,0010
Niacina	0,004
Monoclorhidrato de L-arginina	0,40
L-asparagina	0,10
Ácido L- aspártico	0,04
L-histidina	0,03
L-isoleucina	0,10
L-leucina	0,10
Monoclorhidrato de L-lisina	0,08
L-metionina	0,03
L-fenilalanina	0,03
L-serina	0,06
L-treonina	0,04
L-triptófano	0,01
L-valina	0,04

TABLA 4 Componentes del suplemento aminoácido

Componente	Cantidad (g/l)
Monoclorhidrato de L-cisteína	0,05
Monoclorhidrato de L-arginina	0,40
L-asparagina	0,10
Ácido L- aspártico	0,04
L-histidina	0,03
L-isoleucina	0,10
L-leucina	0,10
Monoclorhidrato de L-lisina	0,08
L-metionina	0,03
L-fenilalanina	0,03
L-serina	0,06
L-treonina	0,04
L-triptófano	0,01
L-valina	0,04

Los tres sistemas reducidos de cultivo de cisteína (LCMSSB, LCMSSFB y LCMSSBa) se testaron en paralelo a los medios SS convencionales que tenían las concentraciones de cisteína tal como se establecieron en la técnica anterior. Las concentraciones de PT y de Bordetella bacterianas se describen gráficamente en las Figuras 8a y 8b. De la Fig. 8a se puede observar que las concentraciones celulares máximas de Bordetella se alcanzaron a las 32 horas aproximadamente. El máximo crecimiento era casi idéntico cuando los medios de producción normal de PT se comparan con SS modificado en modo por lotes. La Fig. 8b describe la producción máxima de PT medida en mg/ml de medio de cultivo. Es claramente aparente que se consigue una mejora significativa en la producción global de PT al utilizar cualquiera de los sistemas de cultivo con limitación de cisteína de la presente invención en comparación con los sistemas de cultivo convencionales. Además, la Fig. 9 describe las concentraciones internas y externas de sulfato en células de B. Pertussis en fermentadores de 20 l en condiciones de limitación de cisteína. El sistema de cultivo LCMSSBa mostró tener el mayor aumento en la producción total de PT. Por tanto, tal como teorizan los presentes inventores, la producción de PT puede mejorarse de forma significativa limitando la cantidad de precursor inhibidor en los caldos de cultivo. Además, se pueden realizar aun más mejoras cuando los sistemas de cultivo por limitación del precursor de la presente invención se combinan con los sistemas de eliminación del inhibidor de expresión de la toxina de la presente invención.

Los presentes inventores han demostrado que: 1) los inhibidores específicos de expresión de la toxina que se acumulan en los medios de toxina que producen las bacterias pueden reducir de forma significativa la producción global de toxina; y 2) la eliminación de los inhibidores de expresión de la toxina de los medios de cultivo, o la reducción en la formación de inhibidores de toxina reduciendo los precursores inhibidores en los caldos de cultivo, puede aumentar de forma significativa la producción global de toxina. Por tanto, los presentes inventores teorizaron que el hecho de imposibilitar genéticamente la capacidad del organismo productor de toxinas para producir un inhibidor de expresión de la toxina puede producir incrementos similares en la producción global de la misma. Como consecuencia, todavía en otra realización de la presente invención se proporciona una actividad recombinante de cisteína desulfinasa sin B. pertussis ("mutante de bloqueo") que no produce sulfato en el cultivo y, por tanto, no muestra ninguna inhibición de expresión de PT. Estos mutantes de bloqueo pueden prepararse por cualquiera de diversos métodos. Ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.557.032 y 5.614.396. En general, estos métodos implican la recombinación homóloga de un constructo de ADN con el ADN cromosómico de B. pertussis. La recombinación homóloga es un proceso celular natural bien estudiado que genera la escisión de dos moléculas de ácido nucleico con secuencias idénticas o sustancialmente similares (es decir homólogas), y la unión de ambas moléculas de modo que una región de cada molécula inicial presente se ligue a una región de la otra molécula. (Ver Sedivy, J.M., BioTechnol. 6: 1192-1196 (1988)). La recombinación homóloga es, por tanto, un proceso específico de secuencia por el cual las células pueden transferir una "región" de ADN desde una molécula de ADN a otra. Para la recombinación homóloga que debe ocurrir entre dos moléculas de ADN, las moléculas deben poseer una "región de homología" la una con respecto a la otra. Esta región homóloga debe tener una longitud de al menos dos pares de bases. Dos moléculas de ADN poseen una región de homología cuando una contiene una región cuya secuencia es tan similar a una región en la segunda molécula que puede suceder la recombinación homóloga. Cuando una región particular está flanqueada por dos regiones de homología, entonces pueden ocurrir dos eventos de recombinación, lo que resulta en un intercambio de regiones entre las dos moléculas recombinantes. La recombinación homóloga es catalizada por las enzimas presentes de forma natural en B. pertussis.

En uno de estos métodos, el gen que codifica la cisteína desulfinasa (Figura 7), por ejemplo contenido dentro de un plásmido, está cortado con las enzimas de restricción seleccionadas para cortar dentro del gen de modo tal que una nueva secuencia de ADN que codifica un gen marcador pueda insertarse dentro de la secuencia del gen de cisteína desulfinasa. Este gen marcador servirá para impedir la expresión del gen de cisteína desulfinasa. El gen marcador puede ser cualquier secuencia del ácido nucleico que sea detectable y/o analizable, sin embargo, en una realización preferente, es un gen de resistencia a los antibióticos. El gen marcador puede estar ligado de forma operativamente a su propio promotor o a otro promotor fuerte procedente de cualquier fuente que sea activa o fácilmente activable en B. pertussis. En otra realización, el gen marcador puede transcribirse mediante el gen promotor de cisteína desulfinasa. El gen marcador puede tener una secuencia poli A unida al extremo-3' del gen para terminar la transcripción. Los genes marcadores preferentes incluyen cualquier gen de resistencia a los antibióticos como ermC' (gen de resistencia a la eritromicina), neo (gen de resistencia a la neomicina), amp (gen de resistencia a la ampicilina), kan (gen de resistencia a la kanamicina) y gent (gen de resistencia a la gentamicina).

Después de que la secuencia de ADN haya sido digerida con las enzimas de restricción adecuadas, por ejemplo SplI y SphI o PstI y PvoI, la secuencia del gen marcador se liga dentro de la secuencia de ADN de la cisteína desulfinasa mediante métodos bien conocidos por los especialistas y descritos, por ejemplo, en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Los extremos de los fragmentos de ADN a ligarse deben ser compatibles; esto se consigue cortando todos los fragmentos con las enzimas que generan extremos compatibles, o despuntando los extremos antes de la ligación. El despunte se realiza siguiendo métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando el fragmento Klenow (ADN polimerasa I) u otra ADN polimerasa para rellenar los extremos susceptibles. Este constructo contiene secuencias de ADN que corresponden a unas regiones definidas del gen de cisteína desulfinasa, por ejemplo correspondientes a los extremos 3' y 5' del gen de cisteína desulfinasa, permitiendo la integración del constructo por recombinación homóloga. Este constructo de ADN puede estar ligado dentro de un plásmido que tiene un segundo gen de resistencia a los antibióticos.

El constructo puede entonces ser transfectado dentro de B. pertussis por métodos conocidos, por ejemplo por electroporación o por apareamiento con células transfectadas de E. coli. La criba de las células se lleva a cabo cultivando las células en presencia de concentraciones en otros casos letales de uno o más antibióticos que corresponden a los genes de resistencia a los antibióticos presentes. Estas células que sobreviven habrán integrado el constructo de bloqueo. Se puede utilizar un plásmido de no-replicación de modo que las células seleccionadas no sólo tendrían el constructo de plásmidos. Para confirmar la integración del constructo de bloqueo se puede emplear un Southern Blot del ADN de B. pertussis con una secuencia designada para hibridizar solamente la secuencia del marcador y/o la parte de la cisteína desulfinasa que se bloquea. Como alternativa o además, el ADN puede amplificarse por PCR con sondas que corresponden a los extremos 3' y 5' del gen de cisteína desulfinasa. Finalmente, se puede testar la actividad de la cisteína desulfinasa.

En otra realización, la B. pertussis se cultiva en presencia de secuencias de nucleótidos que son antisentido a la secuencia de codificación del gen de cisteína desulfinasa. En esta realización, las secuencias de nucleótidos son recogidas por la B. pertussis, se hibridizan al gen de codificación de la cisteína desulfinasa, e inhiben la traslación del gen. También se pueden emplear las secuencias modificadas del nucleótido que interactúan con las bases del gen para formar enlaces covalentes y así inhibir la traslación. Ver la Patente de Estados Unidos Nº 6.015.676.

Ejemplos de nucleótidos antisentido al gen de cisteína desulfinasa incluyen cualquier nucleótido de al menos 8 bases, preferentemente de 10 a 15 bases, que son complementarios de la región de codificación de la Figura 7. Los ejemplos incluyen:

GATTGCTGAT (SEC. ID. NO. 1)

TAGATGGGGC (SEC. ID. NO. 2)

En la presente invención se pueden utilizar diversos caldos para cultivar la B. pertussis. Como ejemplos de medios, sin limitación, se incluyen los caldos modificados GMAR y Stainer Scholte. Los componentes de los caldos modificados GMAR y Stainer Scholte se muestran en las Tablas 2 y 3 respectivamente.

TABLA 5 Componentes del medio Stainer Scholte^{b}

Componente	Cantidad (g/l)
Sal monosódica de ácido L-glutámico	10,72
L-prolina	0,24
Cloruro de sodio	2,5
KH_{2}PO_{4}	0,5
KCl	0,2
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O	0,1
CaCl_{2}	0,02
TRIS Base	1,525
Ácido ascórbico	0,02
Glutatión	0,10
L-cisteína	0,04
Ácido nicotínico	0,004
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O	0,010
^{b} Procedente de: Hewlett y Wolff, J. Bacteriol. 127: 890-898 (1976)

TABLA 6 Componentes del medio modificado GMAR

Componente	Cantidad (g/l)
Sal monosódica de Ácido L-glutámico	10,7
L-prolina	0,24
Cloruro de sodio	2,50
KH_{2}PO_{4}	0,50
KCl	0,20
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O	0,10
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O	0,02
TRIS Base	1,52
Ácido ascórbico	0,02
Glutatión, reducido	0,10
L-cisteína	0,04
Niacina	0,004

TABLA 6 (continuación)

Componente	Cantidad (g/l)
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O	0,001
Monoclorhidrato de L-arginina	0,40
L-asparagina	0,10
Ácido L- aspártico	0,04
Monoclorhidrato de L-cisteína	0,10
L-histidina	0,03
L-isoleucina	0,10
L-leucina	0,10
Monoclorhidrato de L-lisina	0,08
L-metionina	0,03
L-fenilalanina	0,03
L-serina	0,06
L-treonina	0,04
L-triptófano	0,01
L-valina	0,04

La toxina PT producida por los métodos de la presente invención puede purificarse siguiendo el método descrito por Sekura y col., J. Biol. Chem. 258: 14647-14651 (1983). Brevemente, el método de Sekura utiliza dos pasos cromatográficos consecutivos para purificar la PT. El primer paso implica la cromatografía en columna de azul Affi-gel. El segundo paso implica la cromatografía en columna de fetuina-agarosa. El método de purificación de PT de Sekura y col. permite la purificación rutinaria y rápida de la PT en cantidades relativamente importantes (en exceso de 10 mg). Como alternativa, la PT puede purificarse utilizando una columna de afinidad de péptidos. Esta columna se describe a continuación, en el Ejemplo 1. En esta realización, la PT es adsorbida en la columna, lavada con un tampón (por ejemplo, 50 mM de TRIS HCl, pH = 6,2), y se eluye entonces la PT con MgCl_{2} 4 M. Se elimina el MgCl_{2} por diálisis para dar una PT sustancialmente pura.

Una vez esta invención ha sido descrita en términos generales, se entenderá la misma por referencia a los ejemplos siguientes, que se proporcionan aquí con el único propósito de ilustración y no pretenden ser limitativos salvo que se especifique de otro modo.

Ejemplo 1 Materiales y Métodos

Organismos: Para la mayoría de estos estudios se utilizó la cepa salvaje CS87 de B. pertussis. Esta cepa procedía de China y fue llevada al National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) en National Institutes of Health (NIH). Además, varias cepas de BP se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA), incluida, sin limitarse a, la ATCC número 10380, ambas adecuadas para preparar los mutantes de bloqueo de cisteína desulfinasa descritos aquí. Se almacenaron los organismos a -70ºC o se conservaron en BGA (BBL, Inc. Rockville, MD) en un incubador húmedo mantenido a 37ºC.

El medio utilizado para cultivar las células era similar al definido descrito por Stainer y Scholte. J. Gen. Microbiol. 63: 211-220 (1970). Un litro de medio contenía: 10,7 g de glutamato monosódico, 0,24 g de prolina, 2,5 g de NaCl, 0,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,2 g de KCl, 0,1 g de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O, 20 mg de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 1,52 g de Tris, 20 mg de ácido ascórbico, 100 mg de glutatión, 40 mg de cisteína y 4 mg de niacina. Las sales, el glutamato y la prolina se prepararon como formulación basal y se esterilizaron en el autoclave. El resto del medio (suplemento) se preparó en forma concentrada (100 veces) y se esterilizó por filtración. El pH final del caldo se encontraba entre 7,2 y 7,5. En algunos experimentos se añadieron 10 mg/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O. Los organismos se cultivaron en matraces Erlenmeyer de triple pantalla en un incubador vibratorio de New Brunswick Innova Modelo 4300 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) mantenido a 37ºC o en un New Brunswick 20 L BioFlo IV (New Brunswick Scientific) con funcionamiento en modo por lotes y con un volumen útil de 12 l. Se conectó el reactor a un AFS Bio Command v.2.0 (New Brunswick Scientific), que recogía los datos de pH, agitación, oxígeno disuelto, temperatura, caudal de aire y bombas adicionales para el mantenimiento del antiespumante y el pH. El caudal de aire en el fermentador se estableció en 0,125 vvm y la temperatura se controló a 36,5ºC en todos los experimentos. El oxígeno disuelto (DO) se mantuvo al 40% gracias a una cascada de agitación de 150 a 1.000 rpm. El pH se controló a 7,2 mediante adición de H_{3}PO_{4}al 50%.

El reactor fue tratado por lotes con aproximadamente 11 l del medio definido y se inoculó con una semilla de crecimiento activo (1 l), para un volumen total de trabajo de 12 l. Se extrajeron muestras por el orificio de muestreo de reesterilización cada 3 a 6 horas. Para el análisis de los metabolitos extracelulares, se filtró el sobrenadante con un filtro Millex-GV de 0,2 \mum (Millipore Co. Bedford, MA) y se almacenó a -20ºC.

El crecimiento del cultivo se midió por densidad óptica a 650 nm (OD_{650}) mediante un Shimadzu UV Spec 120 (Shimadzu, Columbia, MD). Se comprobó la pureza del cultivo por coloración gram y en placas sobre BGA (BBL, Inc. Rockville, MD) y agar de soja tripticasa (TSA; BBL, Inc.). Un cultivo puro de B. pertussis mostraría coloración gram-negativa de todos los organismos, crecimiento sobre agar BGA y no crecimiento sobre agar TSA.

Análisis de los aminoácidos: El análisis y la cuantificación de los aminoácidos se realizó por cromatografía líquida a alta presión en fase inversa (RP-HPLC) utilizando una derivatización precolumna en línea, tal como es la columna AminoQuant (Hewlett-Packard Co., Wilmington, DE). Los ácidos primarios fueron derivatizados por el reactivo OPA (10 mg/ml de o-ftalaldehído, 10 mg/ml de ácido 3-mercaptopropiónico en tampón borato 0,4 M), mientras que los aminoácidos secundarios fueron derivatizados por el reactivo FMOC (2,5 mg/ml de 9-fluorenilmetilcloroformato en acetonitrilo). Para los aminoácidos primarios, la fase móvil se componía de acetato de sodio/trietanolamina/ tetrahidrofurano (pH 7,2 \pm 0,05) y se detectaron a 338 nm. Los aminoácidos secundarios fueron eluidos con una fase móvil de acetato de sodio/metanol/ acetonitrilo (pH 7,2 \pm 0,05) y se detectaron a 262 nm. La identificación de cada aminoácido se realizó con un conjunto de estándares de aminoácidos (Hewlett-Packard) a distintas concentraciones (110, 250, y 1.000 pmol/\mul). Para estos análisis se utilizó HPLC Modelo HP-1050 (Hewlett-Packard) junto con el software HP ChemStation (Hewlett-Packard, v. 2.0).

Detección y cuantificación del ácido orgánico: se detectaron los ácidos orgánicos utilizando HPLC Modelo HP-1050 (Hewlett-Packard) junto con el software HP ChemStation v.2.0 y equipado de una columna BioRad Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Burlingame, CA) que tenía una fase gaseosa móvil de H_{2}SO_{4}4 mM. La columna fue equilibrada a 35ºC y el caudal isocrático era de 0,6 ml/min. La detección se realizó a 215 nm. La identificación de cada ácido orgánico se realizó mediante la inyección de un Estándar de Análisis de Ácido Orgánico Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories), que se componía de una mezcla de oxalato de sodio, citrato de sodio, maleato de sodio, succinato de sodio, formato de sodio, y acetato de sodio. Se valoró el piruvato mediante reemplazo del estándar de ácido orgánico por 2,5 g/l de piruvato.

Cada uno de los ácidos orgánicos se cuantificó utilizando kits enzimáticos y según el protocolo recomendado por el fabricante, como sigue: Ácido cítrico, kit 139-076 de Boehringer-Mannheim (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN); ácido succínico, kit 176-281 de Boehringer-Mannheim (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN); ácido fórmico, kit 979-732 de Boehringer-Mannheim (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN); ácido acético, kit 148-261 de Boehringer-Mannheim (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN); ácido oxálico, kit 755-699 de Boehringer-Mannheim (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN); y piruvato, kit 726-UV de Sigma (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO).

Ensayo Cuantitativo ELISA de PT: Se sensibilizaron placas microtituladas (Nunc-Immuno Plate IIF, Vangard International, Neptune, NJ) adicionando 0,1 ml por pocillo de fetuina (Sigma Chemical Co.) a 0,2 \mug/ml en carbonato sódico 0,1 M, pH 9,6, y se incubaron durante toda la noche a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cinco veces con una solución que contenía NaCl al 0,9%, Brij 35 0,05%, acetato de sodio 10 mM a un pH 7,0, y azida 0,02%. Las muestras que contenían la PT fueron diluidas en PBS con Brij 35 0,5%, se añadieron a la placa y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron de nuevo las placas como anteriormente y el anticuerpo monoclonal a PT (20,6) fue diluido con PBS. Ibsen y col., Infect. Immun. 61: 2408-2418 (1993). Se lavaron de nuevo las placas y el anticuerpo secundario, IgG e IgM cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Tago Inc., Burlingame, CA) fue diluido en PBS-Brij, se añadió a las placas y se incubó luego durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas como anteriormente y se añadió fosfato de p-nitrofenilo (Sigma Phosphatase Substrate 104) (1 mg/ml) en solución 0,1 M de dietanolamina, 1 mM de MgCl_{2}, 0,1 mM de ZnCl_{2} y azida 0,02%, a un pH 9,8. Se incubaron las placas a 37ºC durante 1 hora y se determinó la absorbancia a 405 nm mediante un lector de placas microtituladas Dynex Modelo MRX (Dynex Technologies, Inc., Chantilly, VA). Para cada placa se generó una curva estándar utilizando una PT purificada (North American Vaccine, Inc.) diluida en un 0,1% de BSA y un 0,1% de glicerol en PBS. La concentración de PT procedente de las muestras de cultivo se calculó a partir de la curva estándar.

Determinaciones de sulfato: Las concentraciones de sulfato dentro del caldo se determinaron mediante los métodos de Melnicoff y col. El ensayo fue adaptado a un ensayo con microplacas. Melnicoff y col., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 14: 377-386 (1976).

Clonación del gen similar nifS de B. pertussis: Se amplificó el fragmento de ADN que contenía el gen similar a nifS mediante un Ciclador Térmico Perkin-Elmer 480. La mezcla de reacción (50 \mul) contenía: 20 ng de ADN cromosómico de B. pertussis purificado, 0,2 \muM de cada cebador (cebador delantero: 5' ATG AGC AAT CGC CCC ATC TAC 3' (SEC. ID. NO. 3); cebador inverso: 5' CAC TAT TTG GTC GGT CGG 3' (SEC. ID. NO. 4), 2 mM de MgCl_{2}, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 400 \muM cada dNTP, y 2,5 unidades de AmpliTaq Gold (Perkin Elmer, Branchburg, NJ). Las condiciones fueron como sigue: primer ciclo, 2 min a 94ºC; 35 ciclos consecutivos a 94ºC (2 min), 42ºC (1 min), 72ºC (2 min); y con un tiempo de incubación final a 72ºC de 8 min. El producto PCR se purificó con gel con un gel de agarosa 1% y se ligó dentro de pCR®II-TOPO (Invitrogen, Calrsbad, CA) aplicando las condiciones recomendadas por el fabricante de pBPfilS. El plásmido pBPfilS se transformó en la cepa de E. coli TOPF' (Invitrogen) y los transformantes fueron seleccionados en medios de agar LB-amp. La secuenciación se realizó por medio de un secuenciador Automatizado de Applied Biosystems PRISM Modelo 310 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) utilizando las recomendaciones del fabricante y del kit de secuenciación.

Construcción de una cepa de B. pertussis que contiene una mutación nula en el gen de BP similar a filS: El plásmido pBPfilS fabricado según las enseñanzas de la presente invención se cortó con SplI y SphI así como por despunte de los extremos con el fragmento Klenow de ADN polimerasa (Boehringer Mannheim). El plásmido cortado se purificó con gel y un gen resistente a la eritromicina de extremos cortados (ermC') o luciferasa fue ligado dentro del constructo plásmido. Klugman y col., Infect. Immun. 57: 2066-2071 (1989). Los transformantes de DH5 fueron identificados como siendo resistentes a 100 \mug de eritromicina por ml. El plásmido construido fue re-aislado mediante columnas Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA) y el injerto mutado fue aislado por corte del plásmido con BamHI y XhoI. El injerto se purificó con gel y se ligó dentro del sitio BamHI y XhoI del plásmido pSS1129 para fabricar pBP\DeltafilS. Stibitz, J. Bacteriol. 180: 2484-2492 (1998). Esto se transformó en la cepa SM10 de E. coli y los transformantes se utilizaron para aparearse con la cepa BP536 de B. pertussis tal como lo describe Stibitz. "Use of Conditionally Counterselectable Suicide Vectors for Allelic Exchange", in Bacterial Pathogenesis, Clark and Bavoil (eds.), pp. 301-308 (1997). Los aislados de B. pertussis que contienen el gen nulo BpfilS dentro del cromosoma fueron seleccionados en función de su resistencia a gentamicina, estreptomicina y/o eritromicina o a la actividad luciferasa sobre agar BGA.

Varios: Todos los materiales fueron comprados a Sigma Chemical Co. y/o del mayor grado disponible. La proteína total fue cuantificada mediante Coomassie Protein Assay® (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Se utilizó IgG humano como estándar. La cepa BP536 de Bordetella pertussis, mutante espontáneo resistente a la estreptomicina de la cepa BP338, utilizada en los experimentos de transformación, fue obtenida por el Dr. Scott Stibitz en el Centro para la Investigación y Evaluación Biológica, United States Food and Drug Administration (Stibitz, S. y M-S. Yang. 1991. J. Bact. 173: 4288-4296). El mutante de bloqueo transformado de B. pertussi derivado de la misma se denominó cepa BP536pWY y se ha depositado en la American Type Culture Collection, (Manassas, VA) de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest. Todos los métodos empleados son todos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Ver por ejemplo: Methods in Molecular Biology, vol. XX, B.D. Shepard and M.S. Gilmore (eds) (1995); DNA Sequencing, L. Alphey. Bios Scientific Publishers (1997); Diagnostic and Molecular Microbiology: Principles and Applications, D.H. Persing, T.F. Smith, F.C. Tenover and T.J. White (eds) (1993) American Society for Microbiology; Molecular Biology, D. Freifelder (ed) (1987) Jones and Bartlett Publishers; and Molecular Biology of the Gene, J.D. Watson, N.H. Hopkins, J.W. Roberts, J.A. Steiz and A.M. Weiner (eds) (1987) The Bengerman/Cummings Publishing Company, Inc.

Resultados

Detección del(de los) inhibidor(es) de producción de PT en los caldos de cultivo de BP: Se tomaron muestras en varios momentos durante la fase de crecimiento de los cultivos de BP. Se controlaron las muestras en cuanto al crecimiento de BP midiendo el OD_{650} y en cuanto a la producción de PT mediante ELISA. Los resultados se calcularon como PT en microgramos/por ml/OD_{650} con el fin de aproximarse a la cantidad de PT producida por célula. Como se muestra en la Figura 1, la cantidad de PT producida por célula cayó drásticamente a medio camino durante el ciclo de crecimiento. Aunque la B. pertussis continuara creciendo en fase logarítmica, pareció que la producción de PT disminuía casi hasta su total eliminación. Esto sugirió que un inhibidor de la producción de PT estaba siendo generado durante las fases tempranas del cultivo y que después de alcanzar la concentración inhibidora, la producción de PT cesó. Para probar esta hipótesis, el sobrenadante del cultivo procedente del cultivo de B. pertussis cultivado hasta la fase estacionaria fue liofilizado y reconstituido con los medios de crecimiento sin sales básicas. Esta mezcla se utilizó entonces para cultivar un segundo cultivo de B. pertussis y se comparó con los caldos originales utilizados para B. pertussis. Se recogieron muestras y se sometieron a prueba como anteriormente. El crecimiento de B. pertussis en cada uno de los dos caldos fue similar al de OD_{650} y alcanzó aproximadamente los mismos niveles. Sin embargo, la cantidad total de PT producida en la mezcla reconstituida era drásticamente menor en comparación con la cantidad producida en los caldos originales. Un demostración más visual de esta inhibición, y de que este inhibidor afecta también la producción de adenilato ciclasa, causa de hemolisis sobre una placa con agar sangre, se muestra en la Figura 2. Se realizó una línea inicial de B. pertussis en una placa de BGA y se dejo crecer durante 48 horas. Entonces se realizaron líneas transversales secundarias y la placa de agar fue incubada durante 48 horas más. Se puede ver que una zona de no hemolisis radia de la línea de crecimiento inicial. La caracterización del inhibidor empezó por filtrar los caldos de cultivo gastados con un filtro 3.000 MWCO que retuvo tanto el permeato como el filtrado. Ambos fueron liofilizados y reconstituidos como anteriormente. La Figura 3 muestra los resultados de B. pertussis cultivada en estas mezclas comparado con los caldos de GMAR. La producción de PT fue inhibida por la mezcla de permeato lo que sugirió que el inhibidor tenía un peso molecular inferior a 3.000.

Análisis del aminoácido y del ácido orgánico: El análisis tanto del aminoácido como del ácido orgánico se realizó en muestras tomadas en distintos momentos durante el desarrollo de un cultivo típico de B. pertussis con el fin de determinar si la subida y/o la regulación del incremento en estos compuestos tenía correlación con la regulación de la inhibición de la producción de PT. Estos datos vienen indicados en las Figuras 4a y 4b. Debe observarse que la caída en la producción de PT ocurre aproximadamente a medio camino de la fase de crecimiento, típicamente a las 20 horas. Tres compuestos aparecen y siguen aumentando su concentración alrededor de este período de tiempo: metionina, cisteína y ácido pirúvico. La subida de metionina parece ocurrir primero, seguido de la de la cisteína y la del ácido pirúvico. Muchas vías unen el metabolismo de la metionina a la cisteína. Sin embargo, pocas vías generan piruvato a partir de cisteína. Se muestran estas tres vías en Leninger, A.L., Biochemistry, Worth Publishers, pp. 441 (1970). En cada una de estas vías se elimina el grupo sulfuro de la cisteína y el piruvato se genera así uniéndose al desarrollo de cada uno de estos compuestos uno con respecto al otro así como a un incremento de sulfatos dentro de los caldos.

Producción de sulfato dentro del cultivo de B. pertussis: Se determinó la concentración de sulfato en cada una de las muestras de cultivo y se comparó con el crecimiento (OD_{650}) de B. pertussis y el tiempo. La Figura 5 ilustra los resultados de estas determinaciones en las mismas muestras utilizadas para generar los datos en la Figura 4. Los datos demuestran que en un momento aproximado cuando la metionina, la cisteína y finalmente el piruvato aumentaban en su concentración, existía asimismo un incremento importante en la producción de sulfato.

Crecimiento de B. pertussis y producción de PT en presencia de BaCl_{2}: El ión sulfato es un modulador de B. pertussis desde la fase virulenta hasta la fase avirulenta. Esta modulación se regula por las proteínas BvgS y BvgA que son los elementos de una gran familia de moléculas reguladoras de dos componentes. Aunque se sepa hace un tiempo que la adición de sulfato extraño regularía hacia abajo la producción de algunos de los factores virulentos incluida la PT (Weiss and Hewlett, Ann. Rev. Microbiol. 40: 661-686 (1986)), la identificación del compuesto o compuestos que interactúan con este sistema era desconocida. Con el fin de determinar si la posible generación de sulfato procedente del catabolismo de la cisteína o de otra fuente durante el desarrollo del crecimiento de B. pertussis podía afectar la producción de PT, se buscó una forma para inactivar o eliminar del cultivo la influencia del sulfato. El bario en forma de BaCl_{2} es muy soluble en agua (1,8 M a 25ºC y 2,8 M a 100ºC), mientras que el BaSO_{4} es muy insoluble (10,7 \muM a 25ºC y 17,7 \muM a 100ºC). Esta diferencia de solubilidad se ha utilizado a menudo para precipitar el sulfato fuera de la solución para otras medidas. Se añadieron distintas concentraciones de BaCl_{2} a los caldos de cultivo y se compararon el crecimiento y la producción de PT en el cultivo. Estos datos están indicados en la Figura 5. La adición de BaCl_{2} a ambas concentraciones incrementó la producción de PT por célula en ambas cepas de B. pertussis en comparación con los caldos normales, aunque más en la cepa 9797. Debe observarse también que se podía ver un precipitado visible acumulándose con el tiempo en el cultivo, probablemente BaSO_{4}. Estos datos sugieren que el inhibidor de retroacción negativa de PT dentro del cultivo es el sulfato.

Clonación de un gen de desulfinasa de cisteína sulfinato a partir de BP: Una de las posibles enzimas responsables de la eliminación del sulfuro de la cisteína, genes similares al nifS, ha sido clonada y caracterizada a partir de E. coli. Mihara y col., J. Biol. Chem. 272: 22417-22424 (1997). Utilización esta secuencia, se buscó una homología en la base de datos del genoma parcial de B. pertussis. Se encontró un marco de lectura abierto que demostraba una gran homología con los genes nifS y se sintetizaron los cebadores PCR apropiados. Se generó un producto de PCR de tamaño apropiado utilizando el ADN cromosómico de B. pertussis, se clonó en un vector de clonación TA pCR®II-TOPO y se secuenció por métodos conocidos de los especialistas en la técnica (Figura 7).

Síntesis y purificación del péptido: Se sintetizó un péptido que contenía la secuencia GGGDGSFSGFGDGSFSG
FG-OH (SEC. ID. NO. 5) mediante un Dispositivo de Secuenciación de Proteínas de la Universidad Rockefeller utilizando la química de NMP t-butoxicarbonilo sobre un sintetizador de péptidos ABI 430A (Applied Biosystems, Foster City, CA). El péptido se desprotegió y se eliminó de la resina mediante tratamiento con HF en presencia de anisol (0ºC/1 h). La purificación preparatoria del péptido se realizó con una columna C-18 (2,14 ID x 30 cm) (Dynamax-Rainin, Woburn, MA). El péptido fue cuantificado por análisis del aminoácido PTC mediante un sistema Waters Picotag (Waters, Milford, MA). El péptido sintetizado se eluyó de la columna C-18 como un pico compuesto por un 95% del perfil de elución total. La composición del aminoácido del péptido purificado concordaba bien con la secuencia que se había utilizado para sintetizar el péptido.

Construcción de la columna de afinidad del péptido: Se activó una Superose® 6B según el método descrito por Brandt y col., Biochim. Biophys. Acta 386: 196-202 (1975). Brevemente, un 50% de mezcla de gel de Superose® 6B prelavado en 0,1 M de NaHPO_{4}, a pH 8,0, fue tratado con una solución 250 mM de p-benzoquinona en etanol para producir una concentración final del 20% de etanol y 50 mM de p-benzoquinona. Se agitó suavemente la suspensión durante 1 hora a temperatura ambiente. La Superose® 6B activada se lavó entonces bien en un embudo de vidrio sinterizado de disco grueso con 2 volúmenes cada vez con un 20% de etanol, H_{2}O desionizada, 1 M NaCl, y de nuevo con H_{2}O desionizada. La Superose® 6B activada fue aspirada a una torta compacta, se añadió un volumen de una solución que contenía 2 mg/ml del péptido en NaHPO_{4}0,1 M, a pH 8,0, y la mezcla fue sometida a rotación de extremo a extremo durante 24 horas a 4ºC. Se añadió entonces etanolamina 1,0 M, pH 8,0, y la rotación continuó durante 1 hora a temperatura ambiente. La matriz de gel se lavó entonces bien con H_{2}O desionizada, 1,0 M NaCl en NaHPO_{4}0,1 M, pH 7,0. Partes alícuotas de la solución inicial de péptido y del sobrenadante fueron retenidas directamente después del paso de acoplamiento y se midió la A_{280} con un Shimadzu UV Spec 120 (Shimadzu, Columbia, MD) para determinar la incorporación del péptido a la Superose® 6B.

Claims (17)

1. Método para intensificar la producción de la toxina de pertussis o pertactina que comprende el cultivo de una toxina de pertussis o de una bacteria que produzca pertactina en un caldo de cultivo bacteriano, en el cual el ión sulfato es eliminado o reducido del caldo de cultivo bacteriano, método que comprende uno o más de los pasos siguientes:

a)

adición de una composición a dicho caldo de cultivo bacteriano que forma un complejo sustancialmente insoluble con los iones sulfato;

b)

suministro de un caldo de cultivo bacteriano que es deficiente en, o posee una concentración reducida de, especies químicas que son convertidas metabólicamente por dicha toxina de pertussis o bacteria productora de pertactina en iones sulfato; y

c)

suministro de una bacteria mutante de bloqueo de cisteína-desulfinasa para fabricar la toxina de pertussis o pertactina,

y purificación de la toxina de pertussis o pertactina así producida.

2. Utilización de una composición capaz de formar un complejo sustancialmente insoluble con los iones sulfato para incrementar la producción de la toxina de pertussis o pertactina por una bacteria que produce la toxina de pertussis o pertactina.

3. Utilización de un medio de cultivo bacteriano que es deficiente en, o posee una concentración reducida de, especies químicas que son convertidas metabólicamente por la bacteria que produce la toxina de pertussis o pertactina en iones sulfato, para incrementar la producción de toxina de pertussis o pertactina por la bacteria.

4. Utilización de una bacteria mutante de bloqueo de cisteína-desulfinasa para la producción de la toxina de pertussis o pertactina.

5. Método o utilización según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha composición es una sal metálica soluble.

6. Método o utilización según la reivindicación 1 ó 3, caracterizado porque dicha especie química que es convertida metabólicamente en el ión sulfato es cisteína.

7. Método o utilización según la reivindicación 1 ó 3, caracterizado porque en dicho caldo de cultivo bacteriano que es deficiente en, o posee una concentración reducida de, especies químicas que se convierten metabólicamente en iones sulfato, comprende además una sal metálica soluble que forma un complejo sustancialmente insoluble con los iones sulfato.

8. Método o utilización según la reivindicación 1 ó 4, caracterizado porque dicha bacteria mutante de bloqueo cisteína-desulfinasa es una Bordetella pertussis o Bordetella bronchiseptica recombinante.

9. Método para cultivar B. pertussis, que comprende el cultivo de B. pertussis en presencia de una cantidad efectiva de una o más sales metálicas solubles que forman un complejo sustancialmente insoluble con el sulfato.

10. Medio de cultivo que soporta el crecimiento de B. pertussis, que comprende B. pertussis y una cantidad de una o más sales metálicas solubles que forman un complejo sustancialmente insoluble con sulfato, caracterizado porque dicha cantidad impide o reduce la inhibición de expresión de la toxina de pertussis (PT) por el sulfato.

11. Método para producir la PT que comprende el cultivo de B. pertussis en un medio de cultivo de B. pertussis que comprende una cantidad efectiva de una sal metálica soluble que forma un complejo sustancialmente insoluble con el sulfato, y aislamiento de la PT del caldo de cultivo.

12. Método según la reivindicación 9 u 11, o medio de cultivo según la reivindicación 10, caracterizado porque la sal metálica soluble es un haluro de Ba (II).

13. Método o utilización según la reivindicación 5, 9 u 11, o medio de cultivo según la reivindicación 10, caracterizado porque la sal metálica soluble es BaCl_{2} o BaBr_{2}.

14. Método o utilización según la reivindicación 5, 9 ó 11, o medio de cultivo según la reivindicación 10, caracterizado porque la sal metálica soluble es una sal soluble de Pb (II), Sr (II) o Ag (II).

15. Mutante de bloqueo de cisteína-desulfinasa de B. pertussis.

16. Método para producir la PT que comprende el cultivo de un mutante de bloqueo cisteína-desulfinasa de B. pertussis en un caldo de cultivo de B. pertussis, y aislamiento de la PT del caldo de cultivo.

17. Método para incrementar la producción de PT, que comprende el cultivo de un mutante de bloqueo cisteína-desulfinasa de B. pertussis, por el cual se produce una cantidad incrementada de PT comparada con cuando se emplea un mutante de bloqueo no-cisteína-desulfinasa.