CN102171362B - 用于在富含二氧化碳的空气供应下在液体培养基中生产胸膜炎肺炎放线杆菌毒素apxi或apxiii的过程 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过在支持细菌生长的液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌细菌来生产RTX-毒素ApxI或ApxIII的方法，其特征在于空气经过培养基，其中所述空气具有超过正常大气水平的二氧化碳含量，以增加在RTX-毒素生产期过程中的RTX-毒素生产。

Description

用于在富含二氧化碳的空气供应下在液体培养基中生产胸膜炎肺炎放线杆菌毒素APXI或APXIII的过程
本发明涉及通过在液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)生产RTX-毒素ApxI或ApxIII的方法。 
猪胸膜肺炎，猪中的主要呼吸性疾病，在全世界传播，并且由于过急性死亡、急性病猪的治疗和慢性感染动物销售中的延迟，引起养猪业的重大经济损失。病原体是胸膜炎肺炎放线杆菌。它主要通过动物间的直接接触传染，并且所得到的感染产生从过急性到慢性不等的临床过程。该疾病主要是呼吸道感染，具有高热、严重呼吸性窘迫、咳嗽和厌食的临床体征。该疾病的发作是快速的，并且发病率和死亡率很高。控制胸膜炎肺炎放线杆菌(从现在开始也称为“APP”)感染的方法之一是通过疫苗接种程序。菌苗在过去已用于此类程序中，但因其严重副作用而众所周知。现今基于APP毒素的亚单位疫苗是常用的。 
APP产生所谓的RTX-毒素(RTX代表重复子毒素(repeat-in-toxin))。正是这些RTX-毒素的存在高度促成这种细菌的致病性特征。RTX-毒素已在过去得到广泛综述，并且在文献中得到描述。如通常已知的，并非所有APP血清型都产生所有RTX-毒素。例如，血清型1、5、9和11产生ApxI和ApxII。血清型2、3、4、6和8产生ApxII和ApxIII。血清型10仅产生ApxI，并且血清型7和12仅产生ApxII。针对APP的目前商购可得疫苗基于毒素ApxI、ApxII和ApxIII。最近以来已发现所有APP血清型都产生第4种RTX毒素，目前称为ApxIV(参见EP0875574)。 
目前已知如何通过在液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌来生产RTX-毒素ApxI或ApxIII。特别地，EP 0 453 024已描述了生产ApxI的方法(参见“Example 2”，段落2“Purification andcharacterisation of hemolysin”，子段落“Methods”)和ApxIII(参见“实施例4”，段落2“Purification and characterisationof App macrophage toxin(Mat)”，子段落“Methods”)。应当指出ApxI习惯被称为“HLY”，而ApxIII通常被称为“Mat”(参见Frey等人在″J Gen Microbiol.1993 Aug；139(8)：1723-8″中)。培养基必须支持APP细菌的生长。通常已知如何构成支持细菌生长的培养基。标准培养基最初由Eagle，Ham及其他人在20世纪50年代和60年代开发。他们发现满足生长的基本需要的培养基应包括无机盐、氮源(例如以含氮化合物的形式，例如肽或蛋白质)、碳源和维生素。培养基有利地进行缓冲以阻止其变得太酸或太碱。在这个基本配方内，许多不同构成是可获得的。例如，可以选择动物衍生的组分以提供氨基酸，但也可以选择化学成分限定的氨基酸。对于其他化合物，众多变化也是可能的。事实上，构成支持细菌生长的培养基是相对简单的。然而，生长和/或代谢产物生产的最佳化可以花费一定的开发时间，特别是当不含血清或其他动物衍生的组分的培养基是优选的时。然而，用于改善发酵培养基性能的策略是本领域通常已知的，并且在文献中得到充分描述(参见例如由Kennedy和Krouse在Journal ofIndustrial Microbiology & Biotechnology(1999)23，456-475中的综述文章)。此类最佳化构成发酵实验室内的常规实验部分。在APP培养的情况下，NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)固有地构成培养基的部分，因为APP是NAD依赖性的。如果没有NAD，那么培养基将不支持胸膜炎肺炎放线杆菌细菌生长，并且因此不能被视为在本申请和附加权利要求含义中用于支持APP生长的液体培养基。用于支持细菌生长的液体培养基，或构成此类培养基的组分，可从各个公司商购得到，例如Sigma Aldrich、Quest International、Oxoid、Becton Dickinson、Pharmacia、VGD Inc、Mediatech、Invitrogen、Marcor、IrvinScientific等。 
尽管现有技术提供了通过培养APP生产RTX-毒素ApxI和ApxIII 的方法，但需要改善生产得率。迄今为止，改善生产得率的尝试主要针对APP培养静止期中的毒素生产率，因为已知最大限度RTX-毒素生产在高细胞密度时发生，因此在指数生长期结束时发生(参见例如Microbial Pathogenesis 37(2004)29-33)。这些尝试未导致总体生产得率的显著改善。然而，令人惊讶的是，申请人发现当空气在胸膜炎肺炎放线杆菌的所述RTX-毒素的生产期过程中(因此在APP细菌的生长和/或静止期过程中)经过培养基时，其中所述空气具有超过正常大气水平的二氧化碳含量，RTX-毒素生产得到显著增加。事实上，一般已知在平板上在细菌菌落培养过程中使用增加的二氧化碳水平(参见例如US 6,019,984：实施例″Bacterial Strains and GrowthConditions″)。然而，这涉及细菌菌落的培养，所述细菌随后用于接种发酵罐。在这个阶段时，仅发生细菌其自身的生长，不发生RTX毒素的生产(至少不以显著水平)。一旦将APP细菌置于液体培养基中以朝向适合于RTX毒素生产的高细胞密度生长，现有技术就教导免除增加的二氧化碳水平。这当然与上文提及的现有技术教导一致：在发酵罐中的最大限度Apx生产仅在高细胞密度下发生，因此在指数生长期结束时发生。在这个阶段时，细胞生长已结束并且完全不再变动(plays no roll)，并且因此二氧化碳先前被视为不是重要的。此外，APP细菌其自身在形成RTX-毒素时生产二氧化碳。因此，有目的的将二氧化碳加入培养基中被认为甚至抑制毒素生产。这些事实解释了为何二氧化碳从未被认为是关于RTX-毒素生产得率的刺激因子。然而，为何二氧化碳的确刺激ApxI和ApxIII生产的原因仍不明了，特别是因为二氧化碳似乎对RTX-毒素ApxII的生产水平没有正面作用。 
应当指出存在使得空气能够经过培养基的许多技术。常用概念是经由使空气以气泡的形式在某处漏出到培养基内(即在培养基表面下)的装置使空气通过。此类装置可能具有一个单喷嘴或多个喷嘴，依赖于是否希望建立培养基中的(近)平衡状态，并且如果希望，那么这个平衡应多快确定。在任何情况下，使空气经过培养基与使用空气的顶部空间且仅仅主要依赖于扩散形成对比。已发现此类技术提供不充 足的结果。在本发明背景下的“空气”意指包含通常存在于大气空气中的一种或多种气态组分的气态介质，所述气态组分例如氧、氮、二氧化碳、氦、氖、氩、氙、氡等。“关于二氧化碳的正常大气水平”是空气总体积的0,04％体积CO2”。 
在一个实施方案中，空气在胸膜炎肺炎放线杆菌细菌的指数生长期过程中通过。与现有技术中已描述的形成对比，指数生长期看起来是RTX-毒素总体生产期的部分的时期(紧接静止期)。令人惊讶的是，申请人发现在指数生长期过程中使二氧化碳通过提供非常显著刺激的RTX-毒素生产，从而使得即使在这个时期结束时，发酵罐中也存在经济上相关量的毒素。因此，这个实施方案提供了在指数生长期结束时或在静止期早期结束发酵的选项。重要优点是它可以节省大量生产时间以及可以减少最终产物中的脂多糖量。 
在另一个实施方案中，其中培养基进行缓冲(即加入当酸或碱加入溶液中时使溶液酸度中的改变降到最低的物质)，通过使用碳酸氢盐进行缓冲(即含有HCO3 -离子的盐)。通过使用碳酸氢盐缓冲液，看起来可以非常有效地抵消过量二氧化碳的固有pH降低效应。很明显，使用此类缓冲液，例如碳酸氢钠或另一种碱金属碳酸氢盐缓冲液，将几乎立即达到培养基中的(近)平衡状态。 
在另外一个实施方案中，经由恒流使空气经过培养基。事实上，可以设计使气体经过培养基的许多不同方法。具有极高二氧化碳含量(高达例如90％)的脉动流是其中之一。然而，我们发现用恒流可以获得非常良好的结果。用此类恒流，可以在空气中使用中等二氧化碳水平。这提供了缓冲液将能够更好地在任何时候使pH维持在平衡值周围的有利作用。应当指出恒流不一定意指总体二氧化碳添加在时间中的某些点时不中断。例如，在培养过程中流的短暂中断不排除在中断前和后，流是恒定的。在一个实施方案中，空气在胸膜炎肺炎放线杆菌细菌的指数生长期过程中连续通过，即在指数生长期过程中，流不中断。 
在一个实施方案中，二氧化碳含量可高达10％v/v。在这个实施 方案中，空气中二氧化碳的最大限度体积含量是10％。超过这个水平，可能缓冲液将不能以高速度在所有时间提供平衡。这可能负面影响RTX-毒素生产得率。在一个优选实施方案中，二氧化碳含量是5％v/v。用这个二氧化碳含量已达到良好结果，并且从经济观点来看，这是二氧化碳优选量，因为此类混合物以极低价格商购可得。 
在其中RTX-毒素是ApxI的一个实施方案中，培养基含有硼葡萄糖酸钙。事实上，通常已知ApxI操纵子的转录活性通过将钙加入生长培养基中得到增强(参见：Microbiol Pathogenesis 37(2004)29-33)。当使用硼葡萄糖酸(2，3-二羟基-3-[2-羟基-5-(羟甲基)-1，3，2-二氧硼戊烷(dioxaborolan)-4-基]丙酸)络合钙离子时，已发现几个优点。首先，看起来可以预防或至少显著减少在下游加工中一般遇到的钙盐沉淀问题，特别是趋于变得淤塞的滤器。其次，看起来当与使用其他络合剂例如EDTA的现有技术方法比较时，可以以显著增加的水平生产ApxI。很明显，通过使用这种特定络合剂，从而使得培养基含有络合硼葡萄糖酸钙(即，2，3-二羟基-3-[2-羟基-5-(羟甲基)-1，3，2-二氧硼戊烷-4-基]丙酸钙)也称为D-葡萄糖酸，具有硼酸的环状4，5-酯，钙盐2∶1)，可以预防钙离子与其他阴离子的大量沉淀，与此同时钙离子仍可用于增强胸膜炎肺炎放线杆菌的ApxI操纵子的转录活性。 
尽管不是本发明所需的，但培养基可以不含动物衍生的组分。许多现有技术方法的缺点是它们依赖于含有动物衍生组分的培养基例如Columbia肉汤的使用。现有技术中提及的其他动物衍生的组分是例如Columbia Broth Modified或Brain Heart Infusion肉汤。如通常已知的，动物组分的使用具有某些严重缺陷。首先，化学组成在生产批次之间可以相当大地不同。此外，动物起源的补充剂可能被传染物质污染。主要担心是在人或动物中引起TSE的朊病毒的存在。可以仅仅选择不含动物组分的培养基(通常被称为“ACF”培养基)。以这个含义的“动物组分”意指像这样存在于动物中(例如，血液或蛋白质)或衍生自此类组分的任何组分(例如衍生自血液的经修饰的血清，或 衍生自蛋白质的氨基酸)。然而，申请人发现当与含有动物衍生的组分的培养基比较时，即使当钙浓度处于足够水平时，使用此类ACF培养基，ApxI生产效率低得多。不受理论束缚，伴随血清的使用，关于钙盐沉淀的问题不是如此严重(由于形成钙离子的可溶性络合物的试剂的存在)。在任何情况下，当硼葡萄糖酸用于络合钙离子时，可以获得显著的ApxI得率增加，令人惊讶地导致甚至高于可用常规含血清培养基获得的得率。 
材料与方法
细菌菌株和培养基
使用生产ApxI的胸膜炎肺炎放线杆菌菌株，血清型10，下文称为APP 10，和生产ApxII和ApxIII，即血清型2的菌株，下文称为APP 2，执行研究。在所有情况下，使用Columbia Blood Agar BASE(BAB)平板(可从Becton，Dickinson USA获得)重建这些菌株的工作种子。所使用的液体培养基是Columbia肉汤(可从Becton，Dickinson USA获得)或不含动物组分的培养基(称为“ACF”)。后面一种培养基含有K2HPO4(14.6g/l)和NaH2PO4(3.6g/l)的混合物作为缓冲液，以及NaNO3(0.2g/l)、50％葡萄糖溶液(10ml)、酵母提取物15g/l(可从Becton Dickinson获得)、微量元素(例如，如Handbook of Microbiological Media，第3版，Ronald Atlas，CRC Press，2004中提及的2.5ml溶液SL-10)和10mM氨基酸溶液(含有所有20种氨基酸，除色氨酸外)。测试的可替代不含动物组分的培养基(称为“ACF-alt”)含有半胱氨酸.HCl(0.1g/l)、NaNO3(0.5g/l)，KCl(0.1g/l)、微量元素(如上)、50％葡萄糖溶液(10ml)和10mM氨基酸溶液(如上)、HEPES缓冲液(6g/l；例如可从Sigma Aldrich获得)和酵母提取物(10g/l)。 
这些培养基用于预培养和发酵中。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0.01％)用于预培养和发酵中。所有培养基通过0.22μm过滤进行灭菌。在用于发酵之前，培养基在85℃下加热1分钟。 
培养
预培养 
APP菌株的工作种子在Columbia BAB平板上铺展开，并且在约24小时过程中在37℃下进行温育。挑选几个菌落以接种包含75mlColumbia肉汤的500mL瓶。使瓶在约6小时过程中在37℃下在搅动下温育，以形成预培养物。用这些预培养物，执行几种发酵。 
在SIXFORS发酵罐中的培养 
在含有约400mL培养基的SIXFORS发酵槽(Infors AG，瑞士)中，加入约20mL预培养物作为接种物。培养温度是37℃，pH＝7.2±0.1(通过加入4N氢氧化钠或4N乙酸)，并且充气(aereation)是以50％pO2。发酵器培养在约24小时后停止 
在Biostat发酵罐中的培养 
在含有10L培养基的Biostat C发酵器(B.Braun Biotech，德国)中，加入500mL APP预培养物作为接种物。应用与SIXFORS发酵罐中相同的设置。然而，对于空气/CO2 95/5 v/v气体混合物，通过维持1vvm(＝气体体积/培养基体积/分钟)恒气流，增加二氧化碳水平。这导致具有约5％pCO2的充气设置。发酵器培养在指数期结束时停止，在约8.5小时后。 
在中试工厂规模下的培养 
中试工厂实验在100l可分批灭菌发酵罐中执行。搅拌器轴配备3个六叶片Rushton涡轮推进器。使发酵罐充满75升培养基，并且用3升预培养物进行接种。温度维持在37℃下，通过自动pH控制器使用20％(w/v)NaOH和8N乙酸使pH维持在7.3下。标准培养在CO2顶部空间超压(500mbar)下执行，并且推进器以250rpm恒速旋转。氧压力不受控制。对于喷射CO2培养实验，培养基用NaHCO3补充至10mM的终浓度，并且用富含0.014vvm CO2的0.25vvm空气恒定气流充气。这导致约5％的pCO2。在APP 10菌株的情况下，培养基补充有25mMCaCl2，并且充气是以50％pO2。 
分析
在每次实验结束时，从发酵罐中无菌取出细菌细胞培养物样品， 以测定在648nm下的光密度，以及ApxI、ApxII和/或ApxIII水平(ELISA；单位/ml)和任选地LPS水平(LAL测定法；单位*105/ml)。 
结果 
用菌株APP 2在中试工厂规模下执行第一次实验，以研究经过培养基的二氧化碳的作用(“喷射”CO2实验)。所使用的培养基是Columbia肉汤。结果在表1中描述。给出2次实验(exp 1和exp 2)的结果。 
表1 
 培养方法   时间(小时)   OD648   ApxII   APxIII   LPS
 标准，exp1   12   1.35   44   130   0.36
 标准，exp2   11   1.47   77   146   0.32
 喷射CO2，exp1   5   1.42   52   242   0.34
 喷射CO2，exp2   5   1.86   38   287   0.09
根据这些结果，通过使二氧化碳以超过正常大气压的水平经过培养基，ApxIII生产得率可以几乎加倍，这变得明确。就ApxII水平而言未观察到绝对增加。在指数生长期结束(这是表1的每次实验结束)时的LPS浓度并无显著不同。但因为ApxIII水平高达2倍，所以在最终产物中LPS量/ApxIII剂量最大限度将是用标准设置获得的产物的那种的约一半。 
第二次实验也在中试工厂规模下执行，但现在用菌株APP 10，以研究经过培养基的二氧化碳(“喷射”CO2实验)对ApxI生产的作用。所使用的培养基是Columbia肉汤。结果在表2中描述。再次，给出2次实验(exp 1和exp 2)的结果。 
表2 
  培养方法   时间(小时)   OD648   ApxI   LPS
  标准，exp1   12   2.99   520   4.10
  标准，exp2   11   3.11   643   6.10
  喷射CO2，exp1   6   3.08   1074   3.36
  喷射CO2，exp2   5   2.99   1774   5.48
[0036] 如由表2变得明确的，对于ApxI，可以获得可比较结果。 
在第三次实验中，如上所述使用ACF培养基研究经过培养基的二氧化碳的作用。第一次培养在SIXFORS发酵罐中执行，没有额外二氧化碳经过培养基。第二次培养在Biostat C发酵罐中执行，如上所述有额外二氧化碳经过培养基。由于在Biostat发酵罐中可以稍微更好地控制条件的事实，预期所有事物等同，Apx毒素得率将比在SIXFORS发酵罐中高约2倍(最大限度3倍)。结果在表3中描述。 
表3 
  培养方法   时间(小时)   OD660   ApxIII
  ACF，无喷射CO2   7   4.00   1003
  ACF，喷射CO2   4.75   3.13   4575
因为Biostat发酵罐中的ApxIII水平高约4又1/2倍，可以得出结论引入培养基的二氧化碳以及当使用ACF培养基时，对Apx生产得率具有正面作用。 
在用菌株APP 10在SIXFORS发酵罐中执行的第四次实验中，我们研究是否可以以硼葡萄糖酸盐络合物(代替未络合的钙)的形式加入钙。硼葡萄糖酸盐浓度在40、50和70mM之间变化。培养在指数生长期结束时停止。结果在表4中描述。 
表4 
Figure BDA0000053095540000091
根据结果，可以得出结论钙可以以硼葡萄糖酸钙络合物的形式存在，以获得足够的ApxI水平。关于这个的优点是钙沉淀物不再负面影响培养基的下游加工(特别是过滤作用)。较高浓度的硼葡萄糖酸盐看起来负面影响生产得率。 

Claims (7)

1.通过在支持细菌生长的液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌细菌来生产RTX-毒素ApxI或ApxIII的方法，其特征在于空气在所述RTX-毒素的生产期过程中经过所述培养基，其中所述空气具有超过正常大气水平的二氧化碳含量，且不超过10％v/v。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述空气在所述胸膜炎肺炎放线杆菌的指数生长期过程中通过。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中对所述培养基进行缓冲，其特征在于所述培养基通过使用碳酸氢盐进行缓冲。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于所述空气经由恒流经过所述培养基。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于所述空气在所述胸膜炎肺炎放线杆菌细菌的指数生长期过程中连续通过。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于所述二氧化碳含量是5％v/v。
7.根据权利要求1的方法，其中所述RTX-毒素是ApxI，其特征在于所述培养基含有硼葡萄糖酸钙。
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