PL166719B1

PL166719B1 - Sposób otrzymywania szczepionki przeciw pleuropneumonii świń

Info

Publication number: PL166719B1
Application number: PL29383192A
Authority: PL
Inventors: Zygmunt Pejsak; Kazimierz Tarasiuk
Original assignee: Inst Weterynarii
Priority date: 1992-03-12
Filing date: 1992-03-12
Publication date: 1995-06-30
Also published as: PL293831A1

Abstract

1. Sposóbotrt.ymywzniałzczcplonki przeuiwpleuropneumonii świr ząwierzjzcpj s/.czepy Actinobacillus pieuroppeumoniae, zwłaszcza o serotypach 1, 5, 9 na namnażającym podłożu bulionowym z dodatkiem substancji wzrostowej NAD (V nukleotyd dwufostopirydyny) polegający na dodaniu hodowli bulionowej odpowiedniego szczepu Actipobajillus rlcuroppcumopiae (App)jako inokulum, inkubowaniu na wytrząsarce mechanicznej w temperaturze 37°C, ipaktywowapiu formaliną, a następnie potraktowaniu wodorotlenkiem glinu jako adjuwantem, znamienny tym, że bulionową hodowlę bakteryjną jednego ze szczepów App dodaje się do bulionu tryptozowo-sojowego z dodatkami: substancji wzrostowej NAD i świeżego ekstraktu drożdży piwnych, w ilości 8-12% objętości podłoża w zbiorniku fermentora i poddaje się procesowi inkubacji z dodatkiem CO2 w ilości 4-l0% w mieszance z powietrzem przez okres 4-7 godzin, do uzyskania gęstości wynoszącej od 1xl0ao 1x(0y komórek App/ml, następnie zawiesinę iptktywuje się roztworem formaliny w takiej ilości, aby jej końcowa koncentracja wynosiła 0,2-0,3%, po czym miesza się i pozostawia w temperaturze 20-37oC przez okres 1-2 dni, po uzyskaniu pozytywnego wyniku skuteczności inaktywacji, wprowadza się ponownie do fermentora jeden lub kilka szczepów App w równych częściach i po wymieszaniu do uzyskanej zawiesiny bakteryjnej dodaje się kolejno adjuwant w postaci wodorotlenku glinu w ilości 5-15% objętościowych w odniesieniu do zawiesiny, a następnie adjuwant w postaci oleju mineralnego w ilości 5-20% objętościowych w odniesieniu do zawiesiny i po uzyskaniujednorodnej emulsji, dodaje się fenol w celu konserwacjiszczepionki.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania szczepionki przeciw pleuropneumonii świń zawierającej szczepy Actinobacillus pleuropneumoniae zwłaszcza o serotypach 1, 5, 9. Szczepionka znajduje zastosowanie w profilaktyce bardzo groźnej, bakteryjnej choroby układu oddechowego świń - pleuropneumonii. W warunkach polskich główną przyczyną choroby są szczepy Actinobacillus pleuropneumoniae (App) o serotypach 1, 5, 9. Od szczepionki wymaga się dobrych właściwości immunogennych po wcześniejszym przeprowadzeniu kontroli na czystość, jałowość i nieszkodliwość dla zwierząt laboratoryjnych.

Znany sposób otrzymywania szczepionki został spisany bardzo ogólnikowo w austriackim czasopiśmie Wiener Tiererztliche Monatsschrift tom 73 110) strony 334-338, 1986 rok. Jako podłoże namnażające używa się bulion tryptozowy z dodatkiem substancji wzrostowej w ilości 10 mg NAD (V nukleotyd dwufosfopirydyny) na 1000 ml bulionu. Po 18 godzinacn inkubacji w temperaturze 37°C na wytrząsarce mechanicznej, hodowlę Actinobacillus pleuropneumoniae inaktywuje się formaliną w ilości 0,3%. Następnie dodaje się jako adjuwant wodorotlenek glinu w ilości 1%. Gęstość hodowli ustala się na poziomie 2-5xl0⁹ komórek App/ml.

Przedstawiony powyżej sposób nie gwarantuje uzyskania w pełni skutecznej szczepionki. Wynika to z tego że: 1. Stara - 18-h hodowla App zawiera mało materiału otoczkowego (capsular materiał), który odpowiedzialny jest za immunogennośó; 2. Inkubacja hodowli na wytrząsarce mechanicznej nawet przez 18 h nie zapewnia odpowiedniej gęstości zawiesiny bakteryjnej dlatego,

166 719 że do podłoża nie dodaje się ekstraktu drożdży piwnych, a hodowlę prowadzi się bez dodatku CO - wymienione czynniki znacznie poprawiają wzrost App. Przedstawioną gęstość hodowli wynoszącą

O

2-5x10' komórek App/ml uzyskuje się prawdopodobnie poprzez zagęszczanie hodowli drogą wirowania. Dodatek wodorotlenku glinu - jako adjuwantu w tak małej ilości (1% v/v) w nałyn tylko stopniu poprawia immunogenność szczepionki.

Istota sposobu według wynalazku polega na tym, że bulionową hodowlę bakteryjną App, jako inokulum, dodaje się do bulionu tryptozowo-sojowego, jako podłoża namnażającego z dodatkami: substancji wzrostowej MAD, najkorzystniej w ilości 0,008-0,012% objętości podłoża oraz świeżego ekstraktu drożdży piwnych, najkorzystniej w ilości 0,08-0,12% objętości podłoża. Hodowla bakteryjna App winna stanowić 8-12% objętości podłoża w zbiorniku fermentora. Zainokulowane podłoże inkubuje się przez okres 4-7 godzin, w temperaturze 35-38°C, do uzyskania gęstości δ 9 hodowli wynoszącej od 1x10° do 1x10 komórek App/ml. W trakcie inkubacji dodaje się COw ilości 4-10% w mieszance z powietrzem.

Tak postępuje się z każdym z używanych do produkcji szczepionki szczepów App. Hodowle bakteryjne wszystkich szczepów, uzyskane w tych samych warunkach, poddaje się inaktywacji roztworem formaliny w takiej ilości, aby jej końcowa koncentracja wynosiła 0,2-0,3%. Po wymieszaniu pozostawia się w temperaturze 20-37°C przez okres 1-2 dni i następnie sprawdza się skuteczność inaktywacji. Po uzyskaniu pozytywnego wyniku, wprowadza się ponownie do fermentora jeden lub kilka szczepów App w równych częściach. Po wymieszaniu, uzyskuje się zawiesinę bakteryjną, do której dodaje się kolejno adjuwant w postaci wodorotlenku glinu w ilości 5-15% objętości w odniesieniu do zawiesiny, a następnie adjuwant w postaci oleju mineralnego w ilości 5-20% objętości w odniesieniu do zawiesiny. Po uzyskaniu jednorodnej emulsji dodaje się fenol, najkorzystniej w ilości 0,1-0,4% w 50% roztworze wodnym w celu konserwacji szczepionki.

Stwierdzono, że do produkcji szczepionki należy używać wyłącznie młodą 4-7 godzinną ho8 9 dowlę App o gęstości wahającej się od 1x10 do 1x10 komórek App/ml, ponieważ tylko młoda hodowla bakteryjna zapewnia dużą ilość materiału otoczkowego (capsular material) decydującego o dobrych właściwościach immunogennych szczepionki.

Stwierdzono również, że wymienioną wyżej gęstość drobnoustrojów można uzyskać jedynie na drodze wprowadzenia do podłoża namnażającego następujących nie stosowanych dotychczas dodatków: substancji wzrostowej niezbędnej do szybkiego wzrostu bakterii, świeżego ekstraktu drożdży piwnych oraz COwprowadzonego do fermentora, w którym prowadzi się hodowlę. Nie spełnienie któregokolwiek z tych warunków powoduje, że drobnoustroje namnażają się stosunkowo wolno, przez co konieczne staje się wydłużenie czasu inkubacji, co z kolei powoduje obniżenie właściwości immunogennych szczepionki.

O

Zwiększenie koncentracji drobnoustrojów powyżej 1x10° komórek App/ml, powoduje blokadę p

układu odpornościowego. Zmniejszenie koncentracji poniżej 1x10° komórek App/ml jest przyczyną braku dostatecznego pobudzenia układu immunologicznego zwierzęcia.

Sposób według wynalazku jest bliżej wyjaśniony w przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolejnych kolb zawierających 2000 ml bulionu tryptozowo-sojowego z dodatkiem 0,01% substancji wzrostowej NAD i 0,1% świeżego ekstraktu drożdży piwnych, dodano oddzielnie 200 ml czystej hodowli bulionowej każdego serotypu App 1, 5, 9. Zainokulowany poszczególnymi serotypami bulion wprowadzono oddzielnie do fermentora i inkubowano w temperaturze 37'C z dodatkiem 5% CO, przez 6 godzin. Gęstość hodowli poszczególnych serotypów App określono fc α metodą płytkową Kocha i wynosiła ona 7,5x10° komórek App/1 ml. Czystość poszczególnych kultur bakteryjnych sprawdzono sporządzając preparaty mikroskopowe. Do hodowli poszczególnych serotypów, w których nie stwierdzono zanieczyszczeń obcą florą bakteryjną, dodano formalinę w takiej ilości, aby jej końcowa koncentracja wynosiła 0,2%. Po wymieszaniu pozostawiono przez okres 2 dni w temperaturze 37'C. Następnie sprawdzano skuteczność inaktywacji poszczególnych hodowli. Przy pozytywnym wyniku, wprowadzano do fermentora w równych częściach szczepy App o serotypach 1, 5, 9. Po wymieszaniu uzyskano zawiesinę bakteryjną, do której dodano kolejno adjuwant w postaci wodorotlenku glinu w ilości 10% objętościowych w odniesieniu do zawiesiny, a następnie adjuwant w postaci oleju mineralnego w ilości 15% objętościowych w odniesieniu do zawiesiny. Utworzoną serię szczepionki konserwowano przez dodanie do znajdującej się w ferraentorze zawiesiny bakteryjnej 0,3% fenolu w 50% roztworze wodnym.

166 719

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,(00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania szczepionki przeciw pleuropneumonii świń zawierającej szczepy Actinobacillus pleuropneumomiae, zwłaszcza o serotypach 1, 5, 9 na namnażającym podłożu bulionowym z dodatkiem substancji wzrostowej NAD (V nukleotyd dwufosfopirydyny) polegający na dodaniu hodowli bulionowej odpowiedniego szczepu Actinobacillus pleuropneumoniae (App) jako inokulum, inkubowaniu na wytrząsarce mechanicznej w temperaturze 37*C, inaktywowaniu formaliną a następnie potraktowaniu wodorotlenkiem glinu jako adjuwantem, znamienny tym, że bulionową hodowlą bakteryjną jednego ze szczepów App dodaje się do bulionu tryptozowo-sojowego z dodatkami: substancji wzrostowej NAD i świeżego ekstraktu drożdży piwnych, w ilości 8-12% objętości podłoża w zbiorniku fermentora i poddaje się procesowi inkubacji z dodatkiem CO, w ilości 4-10% w mieszance z powietrzem przez okres 4-7 godzin, do uzyskania gęstości wynoszącej od 1x108 1x10) komórek App/ml, następnie zawiesinę inaktywuje się roztworem formaliny w takiej ilości, aby jej końcowa koncentracja wynosiła 0,2-0,3%, po czym miesza się i pozostawia w temperaturze 20-37’C przez okres 1-2 dni, po uzyskaniu pozytywnego wyniku skuteczności inaktywacji, wprowadza się ponownie do fermentora jeden lub kilka szczepów App w równych częściach i po wymieszaniu do uzyskanej zawiesiny bakteryjnej dodaje się kolejno adjuwant w postaci wodorotlenku glinu w ilości 5-15% objętościowych w odniesieniu do zawiesiny, a następnie adjuwant w postaci oleju mineralnego w ilości 5-20% objętościowych w odniesieniu do zawiesiny i po uzyskaniu jednorodnej emulsji, dodaje się fenol w celu konserwacji szczepionki.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodaje się 0,008-0,012% objętości podłoża substancji wzrostowej NAD i 0,08-0,12% objętości podłoża świeżego ekstraktu drożdży piwnych.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodaje się fenol w ilości 0,1-0,4% w 50% roztworze wodnym.